ES3026543T3 - Sample nucleic acid measurement test kit, reagent, and application thereof - Google Patents

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Feifei Chen
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Shanchen Wang
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Abstract

Se proporciona un reactivo, un método y un kit de prueba para medir el ácido nucleico de la muestra. Se utiliza una solución de extracción de ácido nucleico fuertemente alcalina (con un pH de 10,5 a 12,5) para extraer el ácido nucleico de la muestra; se añade directamente el ácido nucleico extraído a una solución de reacción de PCR (con un pH de 8,0 a 9,0) para su neutralización; simultáneamente, se lleva a cabo la amplificación y medición del ácido nucleico. La presente invención permite medir el ácido nucleico en diferentes tipos de muestras, como sangre, plasma sanguíneo, sangre completa, secreciones del tracto genital, esputo u orina. En la presente invención, el ácido nucleico extraído de la muestra se neutraliza en una solución de reacción de PCR en lugar de neutralizarse durante la extracción, lo que mejora eficazmente la eficiencia de la extracción y la amplificación de PCR, y mejora sustancialmente la precisión y la sensibilidad de la medición del ácido nucleico de la muestra. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Kit de ensayo de medición de ácido nucleico en muestras, reactivo y su aplicación
Campo de la invención
La presente invención pertenece al campo de la biociencia y biotecnología, se refiere en particular a un método para neutralizar una solución de ácido nucleico en muestras.
Antecedentes de la invención
Con el rápido desarrollo de la tecnología de biología molecular, ésta se ha ampliado a diversos campos tales como la biología, medicina, botánica, genética y zoología. Como gran avance de la tecnología de biología molecular, la tecnología de reacción en cadena de la polimerasa (PCR,polymerase chain reaction)tiene una alta sensibilidad, especificidad y rapidez, y se ha utilizado ampliamente en el diagnóstico de enfermedades humanas y animales (tales como el diagnóstico prenatal, el cribado neonatal y la detección de enfermedades metabólicas genéticas), detección forense, análisis de parentesco, identificación de la pureza de semillas, reproducción asistida por marcadores moleculares, cartografía genética y detección de organismos modificados genéticamente, etc.
La detección utilizando la tecnología de PCR implica principalmente tres aspectos: extracción de ácido nucleico, amplificación de ácidos nucleicos y detección de productos de amplificación. La calidad y la cantidad de ácido nucleico extraído suelen afectar directamente al éxito de la reacción PCR. Por lo tanto, una gran cantidad de métodos de detección basados en la PCR (tales como PCR fluorescente, secuenciación de ADN y secuenciación de ARN, etc.) requieren la extracción y purificación de moléculas de ácido nucleico ADN y/o ARN en muestras biológicas (tales como suero, plasma, sangre completa, orina, secreción vaginal, saliva, heces, hisopo de algodón, células epiteliales exfoliadas, tejido reciente y sección tisular en parafina, etc.) antes de la amplificación.
La extracción y purificación de ácidos nucleicos en muestras biológicas ha sido un proceso largo y tedioso durante mucho tiempo, lo que ha ralentizado seriamente la velocidad de detección. Especialmente en lo que se refiere a cantidades extremadamente pequeñas de muestras biológicas, la baja recuperación de extracción de ADN traza en la muestra a través de métodos de extracción convencionales de ácidos nucleicos, es la causa principal del escaso efecto de amplificación por PCR posterior. Por lo tanto, el establecimiento de un método rápido de extracción de ADN es crucial para mejorar la eficacia de la detección por PCR.
Existen muchos métodos de extracción de acuerdo con las distintas naturalezas de los ácidos nucleicos. Uno de los métodos relativamente habituales es el método de ebullición basado en Chelex-100, es decir, el método de ebullición de Chelex-100. En este método de ebullición, Chelex-100 es una resina química quelante de iones compuesta por copolímero de estireno y divinilbenceno, en donde su solución en suspensión en condiciones de ambiente básico (pH de 10 a 14) y a 100 °C, puede provocar la rotura de la membrana celular y liberar el ADN del núcleo después de la desnaturalización, y Chelex-100 puede unir cationes polivalentes con alta selectividad, eliminar los iones metálicos polivalentes de las muestras y los tampones, y evitar la degradación del molde de ácido nucleico en el proceso de ebullición. Asimismo, puede eliminar eficazmente ácidos nucleicos no orgánicos, ofrece ventajas como economía, sencillez, alta eficacia, etc., y puede reducir la pérdida de ácido nucleico en el proceso de extracción, y se ha utilizado ampliamente en la extracción de ácido nucleico de los materiales de pruebas forenses, tales como rastros de sangre, placa tisular, mancha seminal, pelo y huesos.
Un informe de investigación de Walshet al.(1991) desvela el uso de Chelex 100 como medio de extracción de ADN para la tipificación basada en PCR a partir de material forense.
El método de ebullición de Chelex-100 comprende principalmente tres etapas: concentrar muestras biológicas; añadir una solución de lisis y hervir a alta temperatura; centrifugar a alta velocidad para obtener el sobrenadante, que es la solución de ácido nucleico extraído. En el método de ebullición, además de Chelex-100, la solución de lisis contiene NaOH o KOH, para garantizar que su pH se mantenga a 10-14. Esto también hace que la solución de ácido nucleico extraído mantenga una fuerte alcalinidad. Si esta fuerte alcalinidad no se neutraliza y para la reacción de amplificación la solución de ácido nucleico se mezcla directamente con la solución de reacción PCR, se producirá una reacción de amplificación por PCR ineficaz. Para resolver este problema, en la solicitud de patente china CN201110295395.9, después de la adición de la solución de lisis y la ebullición a alta temperatura, se añadió tampón Tris-HCl (pH de 6,8 a 7,5) 200 mM para la neutralización, disminuyendo así el pH de la solución de ácido nucleico extraído. Sin embargo, cuando el ácido nucleico de la muestra biológica se extrae con este método, para la neutralización, la solución de neutralización debe añadirse manualmente y la etapa de la operación es algo engorrosa, y si el operario olvida añadir la solución de neutralización, se reducirá la eficacia de amplificación de la PCR, que afectará al resultado de la detección.
Asimismo, otro método de extracción de ácidos nucleicos habitualmente utilizado es el método de lisis alcalina. La solicitud de patente china CN201210242862.6 utiliza una solución fuerte alcalina (tal como una solución de NaOH o KOH) para provocar la lisis de las células de una muestra biológica a alta temperatura, liberar el ácido nucleico y, a continuación, añadir un tampón ácido para la neutralización y centrifugar para obtener la solución de ácido nucleico extraído. De manera similar, cuando el ácido nucleico de la muestra biológica se extrae con este método, para la neutralización, la solución de neutralización debe añadirse manualmente y la etapa de la operación es algo engorrosa, y si el operario olvida añadir la solución de neutralización, se reducirá la eficacia de amplificación de la PCR, que afectará al resultado de la detección.
Por otro lado, la solicitud de patente WO 2005/123960 desvela la lisis alcalina de las células a pH 11, seguida de análisis directo con la ayuda de dilución en una mezcla de qRT-PCR (PCR cuantitativa en tiempo real) donde el pH se ajusta con un tampón Tris a pH 8,3.
El uso de neutralización directa de muestras extraídas alcalinas también se describe en Chomczynskiet al.(2006).
Independientemente de que se utilice el método de ebullición de Chelex-100 o el método de lisis alcalina, cuando en la técnica anterior, el ácido nucleico de la muestra se extrae y se detecta, existe un problema: la detección de ADN del VHB (virus de la hepatitis B), que puede existir en la muestra clínica de sangre o plasma, que se toma como ejemplo, y la solución fuerte alcalina de extracción de ácido nucleico se utiliza para extraer el ácido nucleico en la muestra clínica de sangre o plasma, para obtener la solución de ácido nucleico extraído, y después se añaden de 2 a 5 pl de la solución de ácido nucleico extraído a aproximadamente 35 pl de la solución de reacción PCR para mezclar, porque el volumen de la solución de ácido nucleico extraído añadida es pequeño, por lo que tiene poco efecto en la solución de reacción PCR mezclada. Sin embargo, cuando el volumen de la solución de ácido nucleico extraído añadida es grande, por ejemplo, se añaden 20 pl de la solución de ácido nucleico extraído a 20 pl de solución de reacción PCR para mezclar, aunque el volumen total sigue siendo de 40 pl, la proporción de volumen de la solución de ácido nucleico extraído aumenta considerablemente, lo que afecta a la solución de reacción PCR mezclada, dando lugar a un valor de pH elevado, afectando así a la eficacia de la reacción de amplificación por PCR posterior, y reduciendo la sensibilidad y precisión de la detección del ácido nucleico de la muestra.
Asimismo, después de extraer el ácido nucleico de la muestra mediante la solución de lisis de ácido nucleico básica débil convencional, cuando el volumen de la solución de ácido nucleico extraído que se añade a la solución de reacción PCR es bajo (normalmente de 2 a 5 pl), aunque puede detectarse ácido nucleico en la muestra, la sensibilidad de la detección es baja; sin embargo, cuando el volumen de la solución de ácido nucleico extraído añadida es grande, por ejemplo, se añaden 20 pl de la solución de ácido nucleico extraído a 20 pl de la solución de reacción PCR para mezclar, en donde la eficacia de la solución de lisis de ácido nucleico de base débil para extraer el ácido nucleico de la muestra es deficiente, y el gran volumen de solución de ácido nucleico añadido es probable que contenga más impurezas e inhibidores para la reacción de amplificación por PCR, lo que puede dar lugar a que la reacción de amplificación por PCR no pueda continuar normalmente, o aunque la reacción de amplificación por PCR pueda continuar, se reducirán la sensibilidad y la precisión de detección del ácido nucleico de la muestra.
Sumario de la invención
En relación con las deficiencias del estado de la técnica, la presente invención proporciona un método para neutralizar una solución de ácido nucleico en muestras. La invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjuntas. En el presente documento se describe además que para extraer el ácido nucleico de una muestra, el método utiliza una solución fuerte alcalina de extracción de ácido nucleico, y después, el ácido nucleico extraído de la muestra se añade a la solución de reacción PCR para su neutralización, y la amplificación y detección del ácido nucleico se realizan simultáneamente, de modo que no sea necesaria una etapa de neutralización del ácido nucleico extraído de la muestra, con lo que se ahorrará mucho tiempo de detección y también es conveniente para el procesamiento semiautomático o totalmente automático, mejorando la eficacia de la reacción de amplificación por PCR, aumentando la sensibilidad de la detección de ácidos nucleicos de la muestra y mejorando la precisión de la detección de ácidos nucleicos.
Dado que los componentes del suero, plasma, sangre completa, esputo, orina, secreción del aparato genital, lágrimas, heces, tejido reciente, líquido cefalorraquídeo y sección tisular en parafina, son muy complejos, si se detecta directamente el ácido nucleico de la muestra, la detección se verá interferida por otros componentes, por lo que algunas muestras deben tratarse previamente y conservarse, y después se detectan los ácidos nucleicos de la muestra extraída.
Para muestras diferentes, sus métodos de tratamiento previo son diferentes, por ejemplo, la sangre completa contiene eritrocitos, por lo que cuando se extrae el ácido nucleico, puede tratarse con una solución de lisis eritrocitaria habitual y, a continuación, el ácido nucleico de la muestra se extrae utilizando la solución de extracción de ácido nucleico descrita en el presente documento; el esputo contiene una gran cantidad de mucina e impurezas, por lo que cuando se extrae el ácido nucleico, la muestra se trata previamente: después de la licuefacción con NaOH, la mucina se elimina normalmente con citrato de sodio, N-acetil-L-cisteína (NALC) o ditiotreitol (DTT) al 0,5 % y, a continuación, se extrae el ácido nucleico de la muestra utilizando la solución de extracción de ácido nucleico descrita en el presente documento; el tejido reciente se trata previamente con las siguientes etapas: primero se lava el tejido con solución salina fisiológica, después se aplasta o tritura, se añade proteinasa K para la digestión, y después, para extraer el ácido nucleico de la muestra, se utiliza la solución de extracción de ácido nucleico descrita en el presente documento; la sección tisular en parafina se trata previamente con las siguientes etapas: primero se desparafina la sección tisular con un agente desparafinante tal como xileno, después, se añade proteinasa K para la digestión, y después, para extraer el ácido nucleico de la muestra, se utiliza la solución de extracción de ácido nucleico descrita en el presente documento.
En el presente documento también se describe un reactivo de detección de ácido nucleico en muestras, que comprende una solución de extracción de ácidos nucleicos y una solución de reacción PCR, comprendiendo la solución de extracción de ácidos nucleicos un hidróxido de metal alcalino de 10 mM a 100 mM, Tris-HCl de 1 mM a 25 mM, Chelex-100 del 2 % al 5 % (p/v), EDTA del 0,1 % al 0,4 % (p/v), el pH de la solución de extracción de ácido nucleico es de 10,5 a 12,5; y la solución de reacción PCR comprende Tris-HCl de 5 mM a 75 mM y el pH de la solución de reacción PCR es de 8,0 a 9,0.
Preferentemente, el hidróxido de metal alcalino es NaOH o KOH.
En el presente documento también se describe un reactivo de detección de ácido nucleico en muestras, que comprende además una solución de concentración.
El método para neutralizar una solución de ácido nucleico en muestras de la presente invención, puede comprender una etapa de concentración para concentrar una muestra para obtener la muestra concentrada antes de la etapa de extracción utilizando una solución de concentración, después, en la etapa de extracción, extraer el ácido nucleico de la muestra concentrada utilizando la solución de extracción de ácido nucleico.
Preferentemente, la solución de concentración comprende del 2,5 % al 4,5 % (p/p) de NaCl y del 10 % al 13 % (p/v) de PEG6000.
Preferentemente, el pH de la solución de reacción PCR es de 8,1 a 8,7.
Más preferentemente, el pH de la solución de reacción PCR es de 8,1 a 8,5.
Más preferentemente, el pH de la solución de reacción PCR es de 8,1.
Además, en el presente documento se describe el uso del reactivo de detección de ácido nucleico en muestras para detectar ácido nucleico del VHB.
Preferentemente, el ácido nucleico de la muestra es del VHB, del gen B27 humano, del VPH 6/11, de la TB (tuberculosis) o ácido nucleico del CMVH (citomegalovirus humano).
El ácido nucleico de la muestra puede comprender ácido nucleico del VHB; en la solución de extracción de ácidos nucleicos, la concentración del hidróxido de metal alcalino puede ser de 25 mM, la concentración de Tris-HCl puede ser de 1 mM y la concentración de Chelex-100 puede ser del 2 % (p/v) y la concentración de EDTA puede ser del 0,1 % (p/v), el pH de la solución de extracción de ácido nucleico puede ser de 11,5; en la solución de la reacción PCR, la concentración de Tris-HCl puede ser de 10 mM y el pH de la solución de reacción PCR puede ser de 8,1.
En el presente documento también se describe un método de detección de ácido nucleico en muestras, que comprende: (1) extraer ácido nucleico de una muestra utilizando una solución de extracción de ácido nucleico para obtener una solución de ácido nucleico de muestra; (2) mezclar la solución de ácido nucleico de muestra obtenida en (1) con la solución de reacción PCR para obtener una solución mixta, y utilizar la solución mixta para realizar la reacción de amplificación y detectar ácido nucleico en la muestra, en donde la solución de extracción de ácido nucleico comprende un hidróxido de metal alcalino de 10 mM a 100 mM, Tris-HCl de 1 mM a 25 mM, Chelex-100 del 2 % al 5 % (p/v), EDTA del 0,1 % al 0,4 % (p/v), el pH de la solución de extracción de ácido nucleico es de 10,5 a 12,5; y la solución de reacción PCR comprende Tris-HCl de 5 mM a 75 mM y el pH de la solución de reacción PCR es de 8,0 a 9,0; y el pH de la solución mixta es de 8,0 a 9,0.
Además, en el presente documento se describe dicho método de detección de ácido nucleico en muestras: El hidróxido de metal alcalino puede ser NaOH o KOH.
Antes de la etapa (1), la muestra puede concentrarse con una solución de concentración.
La solución de concentración puede comprender del 2,5 % al 4,5 % (p/p) de NaCl y del 10 % al 13 % (p/v) de PEG6000. El pH de la solución de reacción PCR puede ser de 8,1 a 8,7.
El pH de la solución de reacción PCR puede ser de 8,1 a 8,5.
El pH de la solución de reacción PCR puede ser de 8,1.
El ácido nucleico de la muestra puede comprender ácido nucleico del VHB, del gen B27 humano, del VPH 6/11, de la TB o del CMVH.
El ácido nucleico de la muestra puede comprender ácido nucleico del VHB; en la solución de extracción de ácidos nucleicos, la concentración de hidróxido de metal alcalino puede ser de 25 mM, la concentración de Tris-HCl puede ser de 1 mM, la concentración de Chelex-100 puede ser del 2 % (p/v) y la concentración de EDTA puede ser del 0,1 % (p/v), el pH de la solución de extracción de ácido nucleico puede ser de 11,5; en la solución de la reacción PCR, la concentración de Tris-HCl puede ser de 10 mM y el pH de la solución de reacción PCR puede ser de 8,1.
En el presente documento también se describe un kit de detección de ácido nucleico en muestras, que comprende una solución de extracción de ácidos nucleicos y una solución de reacción PCR, comprendiendo la solución de extracción de ácidos nucleicos un hidróxido de metal alcalino de 10 mM a 100 mM, Tris-HCl de 1 mM a 25 mM, Chelex-100 del 2 % al 5 % (p/v), EDTA del 0,1 % al 0,4 % (p/v), el pH de la solución de extracción de ácido nucleico es de 10,5 a 12,5; y la solución de reacción PCR comprende Tris-HCl de 5 mM a 75 mM y el pH de la solución de reacción PCR es de 8,0 a 9,0.
Además, en el presente documento se describe dicho kit de detección de ácido nucleico en muestras: El hidróxido de metal alcalino puede ser NaOH o KOH.
El kit de detección de ácidos nucleicos puede comprender además una solución de concentración.
La solución de concentración puede comprender NaCl del 2,5 % al 4,5 % (p/p) y PEG6000 del 10 % al 13 % (p/v).
El pH de la solución de reacción PCR puede ser de 8,1 a 8,7.
El pH de la solución de reacción PCR puede ser de 8,1 a 8,5.
El pH de la solución de reacción PCR puede ser de 8,1.
El ácido nucleico de la muestra puede comprender ácido nucleico del VHB, del gen B27 humano, del VPH 6/11, de la TB o del CMVH.
El ácido nucleico de la muestra puede comprender ácido nucleico del VHB; en la solución de extracción de ácidos nucleicos, la concentración de hidróxido de metal alcalino puede ser de 25 mM, la concentración de Tris-HCl puede ser de 1 mM, la concentración de Chelex-100 puede ser del 2 % (p/v) y la concentración de EDTA puede ser del 0,1 % (p/v), el pH de la solución de extracción de ácido nucleico puede ser de 11,5; en la solución de la reacción PCR, la concentración de Tris-HCl puede ser de 10 mM y el pH de la solución de reacción PCR puede ser de 8,1.
En el presente documento también se describe el uso del kit de detección de ácido nucleico para detectar en una muestra ácido nucleico del VHB, del gen B27 humano, del VPH 6/11, deMycobacterium tuberculosiso de citomegalovirus humano.
El efecto beneficioso: en primer lugar, a la solución fuerte alcalina de extracción de ácido nucleico se le añade una determinada cantidad de la muestra, se extrae el ácido nucleico de la muestra y, a continuación, se añade la solución de ácido nucleico extraído de la muestra a la solución de reacción PCR (el valor del pH es inferior al de la solución de extracción de ácido nucleico) para su neutralización, y se realiza la amplificación y detección del ácido nucleico de la muestra, eliminando así la necesidad de neutralizar la solución de ácido nucleico extraído de la muestra durante la extracción de ácido nucleico de la muestra, ahorrando así de manera eficaz tiempo de detección, reduciendo las posibilidades de que aumenten los errores manuales debidos a las numerosas etapas, facilitando el procesamiento semiautomático o totalmente automático, y también aumentando la eficacia de la amplificación por PCR de los ácidos nucleicos de la muestra y aumentando la sensibilidad y precisión de la detección de los ácidos nucleicos de la muestra. Tomando la detección de ADN del VHB, que puede estar presente en una muestra clínica de sangre o plasma, por ejemplo, el método descrito en el presente documento mejora la solución de extracción de ácido nucleico y la solución de reacción PCR de la técnica anterior, y utiliza la solución de extracción de ácido nucleico descrita en el presente documento (pH de 10,5 a 12,5) para extraer el ácido nucleico de la muestra clínica de sangre o plasma y obtener la solución de ácido nucleico extraído de la muestra, y la solución de ácido nucleico extraído de la muestra se añade a la solución de reacción PCR (pH de 8,0 a 9,0) como se describe en el presente documento para su mezcla. Independientemente de que la solución de ácido nucleico extraído de la muestra añadida sea de 2-5 pl o de 20 pl, el pH de la solución de reacción PCR mixta no se verá afectado, es decir, se mantendrá en el intervalo de pH adecuado, para no afectar a la eficacia de la reacción de amplificación por PCR posterior, y también aumentar la sensibilidad y precisión de la detección del ácido nucleico de muestra. Asimismo, en comparación con la extracción del ácido nucleico de la muestra utilizando la solución de lisis de ácido nucleico básica débil convencional, el uso de la solución de extracción de ácido nucleico descrito en el presente documento puede mejorar la eficacia de extracción del ácido nucleico de muestra y reducir las impurezas y los inhibidores de la reacción PCR, que puedan estar presentes en la solución de ácido nucleico extraído de la muestra. Además, cuando la solución de extracción de ácido nucleico descrita en el presente documento se utiliza junto con la solución de reacción PCR descrita en el presente documento, cuando el volumen de la solución de ácido nucleico extraído de la muestra que se añade a la solución de reacción PCR es pequeño (normalmente de 2 a 5 jl), el ácido nucleico de la muestra puede detectarse y tiene una alta sensibilidad de detección; cuando el volumen de la solución de ácido nucleico extraído de la muestra que se añade es grande, si se añaden 20 j l de la solución de ácido nucleico extraído de la muestra a 20 j l de la solución de reacción PCR para mezclar, el ácido nucleico de muestra se detecta con gran sensibilidad y precisión.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra los resultados de la detección por PCR fluorescente de diferentes concentraciones de muestras positivas al VHB cuando el pH de la solución de reacción de la PCR es de 8,1.
La figura 2 muestra los resultados de la detección por PCR fluorescente de diferentes concentraciones de muestras positivas al VHB cuando el pH de la solución de reacción de la PCR es de 8,9.
La figura 3 muestra los resultados de la detección por PCR fluorescente cuando la concentración de muestras positivas al VHB es de 20 Ul/ml y se cambia el pH de la solución de reacción PCR, siendo los valores de pH de 8,1, 8,3, 8,5, 8,7 y 8,9, respectivamente.
Descripción detallada
Para extraer el ácido nucleico de la muestra, en primer lugar, a la solución fuerte alcalina de extracción de ácido nucleico se le añade una determinada cantidad de la muestra, las células o los virus de la muestra se someten a lisis y se libera el ácido nucleico que llevan las células o los virus, realizándose así la extracción, en donde el pH de la solución de ácido nucleico extraído de la muestra es relativamente alto, y afectará a la reacción de amplificación por PCR posterior del ácido nucleico, e incluso hará que no se inicie la reacción de amplificación del ácido nucleico. Para ello, con objeto de reducir este efecto, la solución de ácido nucleico extraído de la muestra, se añade a la solución de reacción<p>C<r>con un pH inferior para su neutralización, y también se llevan a cabo la amplificación y la detección del ácido nucleico de la muestra, eliminando así la etapa de neutralizar el ácido nucleico extraído de la muestra durante la extracción del ácido nucleico de la muestra, ahorrando de manera eficaz tiempo de detección, reduciendo la posibilidad de que aumenten los errores manuales debidos a las numerosas etapas, facilitando el tratamiento semiautomático o totalmente automático, aumentando la eficacia de la reacción de amplificación por PCR del ácido nucleico de la muestra, y aumentando la sensibilidad y precisión de la detección de los ácidos nucleicos de la muestra.
Para extraer el ácido nucleico de la muestra, la solución de extracción de ácido nucleico puede seleccionarse de una alta concentración de una solución fuerte alcalina o de una solución fuerte alcalina que contenga Chelex-100, y la solución de extracción de ácido nucleico tiene un pH de 10,5 a 12,5, de manera que el ácido nucleico de la muestra pueda extraerse un modo eficaz. La alta concentración de solución fuerte alcalina puede seleccionarse de solución de hidróxido de metal alcalino de 0,05 M a 0,6 M, por ejemplo, solución de NaOH o solución de KOH de 0,05 M a 0,6 M; y una solución fuerte alcalina que contenga Chelex-100 incluye hidróxido de metal alcalino de 10 mM a 100 mM, Tris-HCl de 1 mM a 25 mM, Chelex-100 del 2 % al 5 % y EDTA del 0,1 % al 0,4 %, y el hidróxido de metal alcalino puede ser NaOH o KOH.
Asimismo, cuando la concentración de la molécula de ácido nucleico diana que va a detectarse en la muestra es relativamente baja, es preferible añadir la muestra a la solución de concentración para concentrarla antes de la extracción del ácido nucleico y, a continuación, extraer el ácido nucleico de la muestra concentrada utilizando la solución de extracción de ácido nucleico descrita en el presente documento. Como primer ejemplo específico de la solución de concentración, la solución de concentración puede incluir del 2,5 % al 4,5 % de NaCl y del 10 % al 13 % de PEG6000. Además, en el presente documento se describe, como segundo ejemplo específico de la solución de concentración, que la solución de concentración puede incluir un 20 % de PEG8000, y un 13,5 % de NaCl.
Después de extraer el ácido nucleico de la muestra utilizando la solución de extracción de ácido nucleico descrita en el presente documento, la solución de ácido nucleico extraído de la muestra se añade a una solución de reacción PCR con un pH inferior en una proporción de volumen adecuada, y el pH de la solución de ácido nucleico extraído de la muestra se reduce a un nivel adecuado para realizar una reacción de amplificación por PCR. En la presente invención, el pH de la solución de reacción PCR es de 8,0 a 9,0, y si el valor es demasiado alto o demasiado bajo, esto afectará a la eficacia de la reacción de amplificación por PCR y reducirá la sensibilidad y precisión de la detección. La solución de reacción PCR puede incluir Tris-HCl, KC1, dNTP (desoxirribonucleósidos trifosfato) y Mg2+, etc., en donde el Tris-HCl puede sustituirse por un sistema tampón tal como Tris-Acetato o Tris-Borato, y cuando la solución de reacción PCR se mezcla con la solución de ácido nucleico extraído de la muestra, la concentración de Tris-HCl puede ser de 5 mM a 75 mM. Asimismo, para realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico, la solución de reacción PCR puede incluir además una ADN polimerasa, tal como la enzima Taq, cebadores y un colorante fluorescente tal como SYBR Green o una sonda fluorescente tal como una sonda TaqMan, una sonda de dos híbridos, una sonda baliza molecular o una sonda MGB(minor groove binding,de unión al surco menor). Por supuesto, a la solución de reacción PCR, puede añadirse una ADN polimerasa, un colorante fluorescente o una sonda fluorescente, únicamente cuando se requiera una reacción de amplificación de ácido nucleico.
Además para reducir la amplificación inespecífica, que puede producirse durante la amplificación por PCR, a la solución de reacción PCR puede añadirse un anticuerpo contra la enzima Taq y el anticuerpo puede unirse al sitio activo de la enzima Taq, haciendo así que la enzima Taq no pueda actuar, y únicamente en la fase de desnaturalización, el anticuerpo contra la enzima Taq se inactiva a alta temperatura y no puede unirse al sitio activo de la enzima Taq, de manera que la enzima Taq pueda desempeñar un papel catalítico para sintetizar una nueva cadena de ADN.
Cuando el ácido nucleico de la muestra se extrae con la solución de extracción de ácido nucleico descrita en el presente documento y el ácido nucleico de la muestra se detecta a través de la reacción de amplificación por PCR, previamente se selecciona un fragmento específico de ADN o ARN en el ácido nucleico de la muestra y después, de acuerdo con dicho fragmento de ADN o<a>R<n>, se diseña al menos un par de cebadores específicos. Si se realiza amplificación por PCR fluorescente, puede añadirse un colorante fluorescente, tal como SYBR Green, o se diseña al menos una sonda fluorescente de acuerdo con el fragmento específico de ADN o ARN seleccionado, de modo que el fragmento específico de ADN o ARN de la muestra se detecta de acuerdo con la intensidad de fluorescencia producida durante la amplificación.
Ejemplo 1: Reactivo de detección de ácido nucleico
En este ejemplo, el reactivo de detección de ácido nucleico en muestras, incluye una solución de extracción de ácido nucleico y una solución de reacción PCR, y las composiciones de las mismas son las siguientes:
La solución de extracción de ácido nucleico es: NaOH de 10 mM a 100 mM, Tris-HCl de 1 mM a 25 mM, Chelex-100 del 2 % al 5 % (p/v), EDTA del 0,1 % al 0,4 % (p/v), pH = de 10,5 a 12,5.
La solución de reacción PCR (pH = de 8,0 a 9,0) incluye Tris-HCl de 5 mM a 75 mM y además incluye dNTP (desoxirribonucleósidos trifosfato), KC1, Mg2+ y un par de cebadores. Cuando se utiliza detección por PCR fluorescente, la solución de reacción PCR incluye además un colorante fluorescente tal como SYBR Green o una sonda fluorescente tal como TaqMan, por ejemplo, una sonda fluorescente TaqMan. La solución de reacción PCR puede incluir además una mezcla enzimática. Por supuesto, la mezcla enzimática y la solución de reacción PCR pueden conservarse por separado, y la mezcla enzimática se añade a la solución de reacción PCR cuando se requiere una reacción de amplificación de ácido nucleico. Cuando el ácido nucleico de la muestra de ensayo es ADN, la mezcla enzimática comprende principalmente una ADN polimerasa, y la ADN polimerasa puede seleccionarse de ADN polimerasa de Taq(Thermusaquat/cus),(abreviada como enzima Taq), Vent ADN polimerasa, Deep ADN polimerasa, ADN polimerasa de Pfu(Pyrococcus fur/osus),ADN polimerasa de Tgo(Thermococcus gorgonar/us)y ADN polimerasa de KOD1(Thermococcus kodakaraens/scepa KOD1), etc. Se prefiere utilizar la enzima Taq. Cuando el ácido nucleico de la muestra de ensayo es ARN, la mezcla enzimática incluye principalmente la transcriptasa inversa del VLMM (virus de la leucemia murina de Moloney), la enzima Taq y el inhibidor de RNasa. Cuando la ADN polimerasa seleccionada es la enzima Taq, la mezcla enzimática puede incluir además un anticuerpo contra la enzima Taq, independientemente de que el ácido nucleico de la muestra de ensayo sea ADN o ARN.
Por ejemplo, el reactivo de detección de ácido nucleico en la muestra comprende además una solución de concentración: del 2,5 % al 4,5 % (p/v) de NaCl y del 10 % al 13 % (p/v) de PEG6000.
Cuando se va a detectar el virus de la hepatitis B (VHB) en muestras de suero o plasma, la solución de concentración es: NaCl al 2,5 % (p/v), PEG6000 al 10 % (p/v); la solución de extracción de ácidos nucleicos es: NaOH 25 mM, Tris-HCl 1 mM, Chelex-100 al 2 % (p/v), EDTA al 0,1 % (p/v), pH=11,5; solución de reacción PCR (pH 8,1), en donde la solución de reacción PCR incluye Tris-HCl 10 mM, y también incluye KC1, dNTP (desoxirribonucleósidos trifosfato), Mg, BSA (seroalbúmina bovina), cebadores y una sonda TaqMan, por ejemplo, también incluye la enzima Taq.
Cuando se va a detectar el gen B27 humano en una muestra de sangre completa, la solución de concentración es: NaCl al 2,5 % (p/v), PEG6000 al 13 % (p/v); la solución de extracción de ácidos nucleicos es: NaOH 25 mM, Tris-HCl 10 mM, Chelex-100 al 3 % (p/v), EDTA al 0,1 % (p/v), pH=12,0; la solución de reacción PCR tiene un pH de 8,8, en donde la solución de reacción PCR incluye Tris-HCl 5 mM y también incluye KC1, dNTP (desoxirribonucleósidos trifosfato), Mg, BSA (seroalbúmina bovina), cebadores y una sonda TaqMan, por ejemplo, también incluye la enzima Taq.
Cuando se va a detectar el virus del papiloma humano de tipo 6/11 (VPH 6/11) en muestras de secreción del aparato genital, la solución de extracción de ácidos nucleicos es: NaOH 10 mM, Tris-HCl 10 mM, Chelex-100 al 2% (p/v), EDTA al 0,1 % (p/v), pH=10,5; la solución de reacción PCR tiene un pH de 9,0, en donde la solución de reacción PCR incluye Tris-HCl 75 mM y también incluye KC1, dNTP (desoxirribonucleósidos trifosfato), Mg2+, BSA (seroalbúmina bovina), cebadores y una sonda TaqMan, por ejemplo, también incluye solución de enzima Taq.
Cuando se va a detectarMycobacter/um tuberculosis(TB) en la muestra de esputo, la solución de concentración es: NaCl al 2,5 % (p/v), PEG6000 al 10 % (p/v); la solución de extracción de ácidos nucleicos es: NaOH 25 mM, Tris-HCl 25 mM; Chelex-100 al 2 % (p/v); EDTA al 0,2 % (p/v), pH = 11,5; la solución de reacción PCR tiene un pH de 8,0, en donde la solución de reacción PCR incluye Tris-HCl 50 mM y también incluye KC1, dNTP (desoxirribonucleósidos trifosfato), Mg2+, BSA (seroalbúmina bovina), cebadores y una sonda TaqMan, por ejemplo, también incluye la enzima Taq.
Cuando se va a detectar citomegalovirus humano (CMVH) en muestras de orina, la solución de concentración es: NaCI al 4,5 % (p/v), PEG6000 al 13 % (p/v); la solución de extracción de ácidos nucleicos es: NaOH 100 mM, Tris-HCl 10 mM; Chelex-100 al 5 % (p/v), EDTA al 0,4 % (p/v), pH=12,5; la solución de reacción PCR tiene un pH de 8,9, en donde la solución de reacción PCR incluye Tris-HCl 10 mM y también incluye KC1, dNTP (desoxirribonucleósidos trifosfato), Mg, BSA (seroalbúmina bovina), cebadores y una sonda TaqMan, por ejemplo, también incluye la enzima Taq.
El hidróxido de sodio (NaOH) de la solución de extracción de ácido nucleico anterior, puede sustituirse por otro hidróxido de metal alcalino tal como hidróxido de potasio (KOH).
Ejemplo 2: Etapa de extracción de ácido nucleico en muestras
La siguiente extracción de ácido nucleico en muestras se lleva a cabo utilizando el reactivo de detección de ácido nucleico del Ejemplo 1, y de acuerdo con la muestra, puede clasificarse en los siguientes dos métodos de extracción de ácido nucleico en muestras:
Esquema 1:
1. Se toman 200 pl de la muestra que se va a someter a ensayo, se añaden 200 pl de la solución de concentración, y después de agitar y mezclar, se centrifuga a 12.000 rpm durante 10 min;
2. Se desecha el sobrenadante y se añaden 50 pl de solución de extracción de ácidos nucleicos al precipitado; 3. Después de agitar y mezclar, se lleva a un baño María o a un baño seco a 100 °C durante 10 min, después de centrifugar a 12.000 rpm durante 10 min, se toma el sobrenadante, que es la solución de ácido nucleico que se extrae de la muestra para la amplificación por PCR, o se conserva a -20 °C± 5 °C para su uso futuro.
Esquema 2:
1. Se toman 100 pl de la muestra que se va a someter a ensayo y después de agitar y mezclar, se centrifuga a 12.000 rpm durante 10 min, se desecha el sobrenadante y se añaden 50 pl de la solución de extracción de ácidos nucleicos al precipitado;
2. Después de agitar y mezclar, se lleva a un baño María o a un baño seco a 100 °C durante 10 min, después de centrifugar a 12.000 rpm durante 10 min, se toma el sobrenadante, que es la solución de ácido nucleico que se extrae de la muestra para la amplificación por PCR, o se conserva a -20 °C± 5 °C para su uso futuro.
En la práctica, las etapas específicas de extracción de ácidos nucleicos son ligeramente diferentes dependiendo de la muestra utilizada para la detección y del sujeto en el que se vayan a detectar. Por ejemplo, cuando se va a detectar el virus de la hepatitis B (VHB) en muestras de suero o plasma, su etapa de extracción de ácidos nucleicos es la del esquema 1 del presente ejemplo; cuando se va a detectar el gen B27 humano en la muestra de sangre completa, su etapa de extracción de ácidos nucleicos es la del esquema 1 del presente ejemplo; cuando se va a detectar el virus del papiloma humano de tipo 6/11 (VPH 6/11) en una muestra de secreción del aparato genital, su etapa de extracción de ácidos nucleicos es la del esquema 2 del presente ejemplo; cuando se va a detectar la bacteriaMycobacterium tuberculosis(TB) en la muestra de esputo, su etapa de extracción de ácidos nucleicos es la del esquema 1 del presente ejemplo; cuando lo que se va a detectar es citomegalovirus humano (CMVH) en la muestra de orina, su etapa de extracción de ácidos nucleicos es la del esquema 1 del presente ejemplo.
Ejemplo 3: Detección por PCR fluorescente
El sistema de detección por PCR consistió en 40 pl, la solución de reacción PCR se dispensó en tubos de reacción de PCR en partes por persona, y se transfirió a la zona de procesamiento de las muestras. Se añadieron respectivamente de 4 a 20 pl de la solución de ácido nucleico que se extrajo de la muestra del Ejemplo 2 a los tubos de reacción correspondientes y éstos se taparon herméticamente y se llevaron a una zona de detección para la amplificación por PCR. Cada tubo de reacción se colocó en un termociclador en un orden determinado, y se establecieron el programa de detección por PCR y la fluorescencia de detección para la amplificación por PCR con fluorescencia.
Cuando se va a detectar el virus de la hepatitis B (VHB) en muestras de suero o plasma, se preparan 40 pl de un sistema de detección por PCR, en el que la solución de ácido nucleico que se extrae de la muestra es de 20 pl y la solución de reacción por PCR es de 20 pl.
Cuando se va a detectar el gen B27 humano en la muestra de sangre completa, el sistema de detección por PCR es de 40 pl, en el que la solución de ácido nucleico que se extrae de la muestra es de 4 pl y la solución de reacción por PCR es de 36 pl.
Cuando se va a detectar el virus del papiloma humano de tipo 6/11 (VPH 6/11) en muestras de secreción del aparato genital, el sistema de detección por<p>C<r>es de 40 pl, en donde la solución de ácido nucleico que se extrae de la muestra es de 4 pl y la solución de reacción por PCR es de 36 pl.
Cuando se va a detectarMycobacterium tuberculosis(TB) en la muestra de esputo, el sistema de detección por PCR es de 40 jl, en donde la solución de ácido nucleico que se extrae de la muestra es de 10 |jl y la solución de reacción por PCR es de 30 jl.
Cuando se va a detectar citomegalovirus humano (CMVH) en una muestra de orina, el sistema de detección por PCR es de 40 jl, en donde la solución de ácido nucleico que se extrae de la muestra es de 4 j l y la solución de reacción por PCR es de 36 jl.
Ejemplo 4: Muestra clínica de detección del VHB
El tipo de muestra es suero o plasma, y se toma como ejemplo la detección del virus de la hepatitis B (VHB). De acuerdo con el reactivo de detección de ácido nucleico, el método de extracción de ácidos nucleicos y la detección por PCR fluorescente del Ejemplo 1, Ejemplo 2 y Ejemplo 3, se detectaron 20 muestras clínicas confirmadas clínicamente como positivas o negativas.
Método de control: se añaden 50 j l de la muestra que se va a someter a ensayo a 50 j l de solución de extracción de ácidos nucleicos (NaCl 2 M, Tris-HCl (pH 8,1) 50 mM, mercaptoetanol al 1 % (v/v), Chelex-100 al 5 % (p/v), pH 8,59), se agita y se mezcla durante 15 seg, se lleva a un baño María o a un baño seco a 100 °C durante 10 min y después se centrifuga a 12.000 rpm durante 10 min y se toman respectivamente 4 j l y 20 j l del sobrenadante para la amplificación por PCR. El sistema de reacción PCR incluye una solución de reacción PCR (que contiene tampón de PCR TAKARA, dNTP (desoxirribonucleósidos trifosfato), Mg2+, cebadores y una sonda TaqMan, pH 9,05) y la enzima Taq. La sensibilidad de detección de este método de control fue de 500 Ul/ml.
La tabla 1 muestra los resultados de la detección del VHB en muestras de suero o plasma, donde "+" indica un resultado positivo y "-" un resultado negativo.
T l 1: R l l i n l VHB n m r r l m
Los resultados experimentales muestran que en las 20 muestras de detección, se detectaron 11 casos positivos y 9 casos negativos al VHB con el reactivo de detección de ácido nucleico, el método de extracción de ácidos nucleicos y la detección por PCR fluorescente utilizados en el presente documento. Para el método de control, cuando se utilizaron 4 |jl del sobrenadante para la detección, se detectaron 10 casos positivos y 10 casos negativos al VHB, y una de las detecciones de control no coincidía con la información de la muestra clínica; cuando se utilizaron 20 j l del sobrenadante para la detección, todos los resultados de detección de las 20 muestras de ensayo fueron negativos, debido a que el pH del reactivo de extracción de ácido nucleico en el método de control no era altamente alcalino en relación con el método utilizado en el presente documento, y la eficiencia de extracción de ácido nucleico no era alta. Asimismo, cuando la cantidad de muestra se aumentó a 20 jl, la sustancia inhibidora de la amplificación por PCR también aumentó posiblemente en consecuencia.
Ejemplo 5: Efecto del pH de la solución de reacción PCR sobre la sensibilidad de la detección del VHB
De acuerdo con el reactivo de detección de ácido nucleico, el método de extracción de ácidos nucleicos y la detección por PCR fluorescente del Ejemplo 1, Ejemplo 2 y Ejemplo 3, se detectaron las muestras positivas al VHB: muestras positivas al VHB de alta concentración se diluyeron en serie respectivamente para obtener una serie de muestras positivas al VHB de baja concentración, las concentraciones variaban entre 1000 Ul/ml, 500 Ul/ml, 250 Ul/ml, 100 Ul/ml, 50 Ul/ml y 20 Ul/ml, respectivamente.
El pH de la solución de reacción de la PCR se ajustó a 8,1, y los resultados de la detección por PCR fluorescente de estas muestras positivas al VHB se muestran en la figura 1. Los resultados mostraron que las seis muestras de baja concentración positivas al VHB presentaban curvas de amplificación de tipo S evidentes y se detectaron de forma estable.
Cuando el pH de la solución de reacción PCR se ajustó a 8,9, los resultados de la detección por PCR fluorescente de estas muestras positivas al VHB se muestran en la figura 2. Los resultados mostraron que en las seis muestras de baja concentración positivas al VHB, las muestras positivas a concentraciones de 1000 Ul/ml, 500 Ul/ml y 250 Ul/ml se detectaron de forma estable, mientras que las muestras positivas a concentraciones de 100 Ul/ml, 50 Ul/ml y 20 Ul/ml no pudieron detectarse de forma estable. Puede observarse que cuando el pH de la solución de reacción PCR que se utiliza en el presente documento era de 8,9, su sensibilidad de detección era de 250 Ul/ml, que también fue superior a 500 Ul/ml en el método de control.
Asimismo, para las muestras positivas al VHB con una concentración de 20 Ul/ml, el pH de la solución de reacción PCR se ajustó a 8,1, 8,3, 8,5, 8,7 y 8,9, respectivamente, y los resultados de la detección por PCR fluorescente se muestran en la figura 3. Los resultados mostraron que la eficacia de amplificación de las muestras positivas al VHB con una concentración de 20 Ul/ml aumentaba significativamente con la disminución del pH de la solución de reacción PCR. Cuando el pH era de 8,1, la eficacia de amplificación fue la mejor. Los resultados también mostraron que cuando los valores de pH de las soluciones de reacción PCR eran de 8,1, 8,3, 8,5 y 8,7 respectivamente, podían detectarse muestras positivas de 20 Ul/ml, aunque la eficacia de la amplificación, la linealidad y los valores de fluorescencia de la curva de amplificación de tipo S a pH de 8,1, 8,3 y 8,5 respectivamente fueron significativamente mejores que los de pH 8,7; la eficacia de la amplificación, la linealidad y los valores de fluorescencia de la curva de amplificación de tipo S a pH 8,1 fueron significativamente mejores que los de los valores de pH 8,3 y 8,5. Puede observarse que en el caso de que las demás condiciones de detección fueran las mismas, el cambio de los valores de pH puede tener una gran influencia sobre la eficacia de la amplificación, la linealidad y los valores de fluorescencia de una curva de amplificación S, mientras que el aumento de la eficacia de amplificación y de los valores de fluorescencia de la curva de amplificación de tipo S puede aumentar la sensibilidad de la detección, por lo que la sensibilidad de detección a valores de pH de 8,1, 8,3 y 8,5 es significativamente mejor que a pH 8,7; la sensibilidad de detección a pH 8,1 es significativamente mejor que a los valores de pH 8,3 y 8,5. Esto significa que mientras el valor del pH disminuye gradualmente, la sensibilidad de detección aumenta gradualmente.
En la detección de ADN del VHB en suero o plasma, los presentes inventores descubrieron inesperadamente que cuando el pH de la solución de reacción PCR se ajustaba de 8,9 a 8,7, de 8,7 a 8,3-8,5 y de 8,3 a 8,1, se obtenía un efecto de amplificación inesperado, mejorando así significativamente la precisión de la detección.
Ejemplo 6: Detección del gen B27 humano en muestras clínicas
La detección clínica con sangre completa como tipo de muestra toma como ejemplo la detección del gen B27 humano. De acuerdo con el reactivo de detección de ácido nucleico, el método de extracción de ácidos nucleicos y la detección por PCR fluorescente del Ejemplo 1, Ejemplo 2 y Ejemplo 3, se detectaron 13 muestras clínicas confirmadas clínicamente como positivas o negativas.
Método de control: se trataron previamente 500 j l de muestra de sangre completa con lisado eritrocitario (NH<4>Cl 15 mM, NaHCO<3>1 mM, EDTA-2Na 0,1 mM), y después de la centrifugación, se eliminó el sobrenadante y se conservó el precipitado; se añadieron 100 j l de solución de extracción de ácidos nucleicos (Tris-HCl (pH 8,0) 100 mM, Chelex-100 al 5 %, EDTA (pH 8,0) 10 mM, NaCl 50 mM, SDS al 2 % (p/v), pH 8,2) al precipitado, se agitó y se mezcló durante 15 segundos, se sometió a un baño María o a un baño seco a 100 °C durante 10 min, después se centrifugó a 12.000 rpm durante 10 min y se tomaron 4 |jl del sobrenadante para la amplificación por PCR. El sistema de reacción PCR incluye una solución de reacción PCR (que contiene tampón de PCR TAKARA, dNTP (desoxirribonucleósidos trifosfato), Mg2+, cebadores y una sonda TaqMan, pH 9,05) y la enzima Taq.
La Tabla 2 muestra los resultados de detección del gen B27 humano en muestras de sangre completa, donde "+" indica un resultado positivo y "-" un resultado negativo.
T l 2: R l l i n l n B27 h m n n m r n r m l
Los resultados experimentales muestran que en las 13 muestras de ensayo, se detectaron 6 genes B27 humanos positivos y 7 genes B27 humanos negativos utilizando el reactivo de detección de ácido nucleico, el método de extracción de ácido nucleico y detección por PCR fluorescente descritos en el presente documento. Con el método de control, se detectaron 5 genes B27 humanos positivos y 8 genes B27 humanos negativos y una de las detecciones de control no concordaba con la información de la muestra clínica.
Ejemplo 7: Muestra clínica para la detección del VPH6/11
La detección clínica con secreciones del aparato genital como tipo de muestra toma como ejemplo la detección del virus del papiloma humano de tipo 6/11 (VPH 6/11). De acuerdo con el reactivo de detección de ácido nucleico, el método de extracción de ácidos nucleicos y la detección por PCR fluorescente del Ejemplo 1, Ejemplo 2 y Ejemplo 3, se detectaron 15 muestras clínicas confirmadas clínicamente como positivas o negativas.
Método de control: se añadieron 50 j l de la muestra que se va a someter a ensayo a 50 j l de solución de extracción de ácidos nucleicos (NaCl 2 M, Tris-HCl (pH 8,0) 50 mM, mercaptoetanol al 1 % (v/v), Chelex-100 al 5 % (p/v), pH 8,59), se agitó y se mezcló durante 15 seg, se sometió a un baño María o a un baño seco a 100 °C durante 10 min, después se centrifugó a 10.000 rpm durante 5 min y se tomaron 4 j l del sobrenadante para la amplificación por PCR. El sistema de reacción PCR incluye una solución de reacción PCR (que contiene tampón de<p>C<r>TAKARA, dNTP (desoxirribonucleósidos trifosfato), Mg2+, cebadores y una sonda TaqMan, pH 9,05) y una enzima Taq.
La tabla 3 muestra los resultados de la detección del VPH en muestras de secreción del aparato genital, donde "+" indica un resultado positivo y "-" un resultado negativo.
T l ^ : R l l i n l n l VPH n m r r i n l r ni l
Los resultados experimentales muestran que en las 15 muestras de ensayo, se detectaron 10 muestras positivas y 5 muestras negativas al ácido nucleico del VPH con el reactivo de detección de ácido nucleico, el método de extracción de ácido nucleico y la detección por PCR fluorescente utilizados en el presente documento; con el método de control se detectaron 8 muestras positivas y 7 negativas, y 2 del grupo de control no concordaban con la información de la muestra clínica.
Ejemplo 8: Muestra clínica para la detección de TB
La detección clínica con esputo como tipo de muestra toma como ejemplo la detección de la bacteriaMycobacterium tuberculosis(TB). De acuerdo con el reactivo de detección de ácido nucleico, los métodos de extracción de ácidos nucleicos y la detección por PCR fluorescente del Ejemplo 1, Ejemplo 2 y Ejemplo 3, se detectaron 10 muestras clínicamente confirmadas como positivas o negativas.
Método de control: se añadieron 500 pl de muestra de esputo a 5 ml de solución de NaOH 1 M, y después se licuó y agitó durante 30 min, se centrifugó a 14.000 durante 5 minutos, se eliminó el sobrenadante y se conservó el precipitado; 50 pl de solución de extracción de ácidos nucleicos (SDS al 0,1 % (p/v), NP40 al 1 % (v/v), Tween-20 1 % (v/v), Chelex-100 al 15 % (p/v), pH 5,02) se añadieron al precipitado, se agitó y se mezcló durante 15 segundos, se sometió a un baño María o a un baño seco a 100 °C durante 30 min, después se centrifugó a 12.000 rpm durante 10 min y se tomaron 10 pl del sobrenadante para la amplificación por PCR.
El sistema de reacción PCR incluye una solución de reacción PCR (que contiene tampón de PCR TAKARA, dNTP (desoxirribonucleósidos trifosfato), Mg2+, cebadores y una sonda TaqMan, pH 9,05) y una enzima Taq.
La tabla 4 muestra los resultados de la detección de TB en muestras de esputo, donde "+" indica un resultado positivo y "-" un resultado negativo.
Tabla 4: Resultados de la detección de TB en muestras de es uto
Los resultados experimentales muestran que en las 10 muestras de ensayo, se detectaron 5 muestras positivas y 5 muestras negativas a TB, con el reactivo de detección de ácido nucleico, el método de extracción de ácido nucleico y la detección por PCR fluorescente utilizados en el presente documento; con el método de control detectaron 4 muestras positivas y 6 negativas, y el resultado de una muestra del control no concordaba con la información de la muestra clínica.
Ejemplo 9: Muestra clínica para la detección de CMVH
La detección clínica con orina como tipo de muestra toma como ejemplo la detección de citomegalovirus humano (CMVH). De acuerdo con el reactivo de detección de ácido nucleico, el método de extracción de ácidos nucleicos y la detección por PCR fluorescente del Ejemplo 1, Ejemplo 2 y Ejemplo 3, se detectaron 10 muestras clínicas confirmadas clínicamente como positivas o negativas.
Método de control: se recogieron 250 pl de la muestra de orina que se va a someter a ensayo, se centrifugó a 14.000 durante 5 min, se eliminó el sobrenadante y se conservó el precipitado; se añadieron 250 pl de solución de extracción de ácidos nucleicos (Tris-HCl (pH 8,0) 100 mM, Chelex-100 al 5 %, EDTA (pH 8,0) 10 mM, NaCl 50 mM, SDS al 2 % (p/v), pH 8,2) al precipitado, se agitó y se mezcló durante 15 segundos, se sometió a un baño María o a un baño seco a 100 °C durante 10 min y después se centrifugó a 13.000 rpm durante 10 minutos, y se tomaron 4 pl del sobrenadante para la amplificación por PCR. El sistema de reacción PCR incluye una solución de reacción PCR (que contiene tampón de PCR TAKARA, dNTP (desoxirribonucleósidos trifosfato), Mg, cebadores y una sonda TaqMan, pH 9,05) y una enzima Taq.
La Tabla 5 muestra los resultados de la detección de CMVH en muestras de orina, donde "+" indica un resultado positivo y "-" un resultado negativo.
Tabla 5: Resultados de la detección de CMVH en muestras de orina
Los resultados experimentales muestran que en las 10 muestras de ensayo, se detectaron 5 muestras positivas y 5 muestras negativas al ácido nucleico del CMVH con el reactivo de detección de ácido nucleico, el método de extracción de ácido nucleico y la detección por PCR fluorescente utilizados en el presente documento; con el método de control se detectaron 5 muestras positivas y 5 muestras negativas; los dos resultados de detección fueron concordantes.
Ejemplo 10: Resultado de la detección de sensibilidad
De acuerdo con el reactivo de detección de ácido nucleico, el método de extracción de ácido nucleico y la detección por PCR fluorescente del Ejemplo 1, Ejemplo 2 y Ejemplo 3, se detectaron muestras estándar positivas al VHB, al gen B27 humano, al VPH, a la T<b>y al CMVH: las muestras estándar positivas se diluyeron respectivamente, se diluyeron respectivamente según la Tabla 6, y cada concentración se repite 8 veces. Los resultados de detección se muestran en la Tabla 6, en la que "+" indica un resultado positivo y "-" indica inferior a un límite inferior de la detección del reactivo.
Tabla 6 Resultados de la detección de sensibilidad
Los resultados anteriores muestran que la sensibilidad de detección del VHB es de 20 UI/ml, la sensibilidad de detección del gen B27 humano es de 5 ng/reacción, la sensibilidad de detección del VPH6/11 es de 250 copias/ml, la sensibilidad de detección de la TB es de 5 bacterias/ml y la sensibilidad de detección del HCMV es de 500 copias/ml.
En el presente documento también se describen los siguientes puntos (no de acuerdo con la invención):
1. Un reactivo de detección de ácido nucleico en muestras que comprende una solución de extracción de ácido nucleico y una solución de reacción PCR, en donde la solución de extracción de ácido nucleico comprende un hidróxido de metal alcalino de 10 mM a 100 mM, Tris-HCl de 1 mM a 25 mM, Chelex-100 del 2 % al 5 % (p/v), EDTA del 0,1 % al 0,4 % (p/v), el pH de la solución de extracción de ácido nucleico es de 10,5 a 12,5; y la solución de reacción PCR incluye Tris-HCl de 5 mM a 75 mM, el pH de la solución de reacción PCR es de 8,0 a 9,0. 2. El reactivo de detección de ácido nucleico en muestras de acuerdo con el punto 1, en donde el hidróxido de metal alcalino es NaOH o KOH.
3. El reactivo de detección de ácido nucleico en muestras de acuerdo con el punto 1, en donde el reactivo de detección de ácido nucleico en muestras comprende además una solución de concentración que comprende del 2,5 % al 4,5 % (p/p) de NaCl y del 10 % al 13 % de PEG6000 (p/v).
4. El reactivo de detección de ácido nucleico en muestras de acuerdo con el punto 1, en donde el pH de la solución de reacción PCR es de 8,1 a 8,7.
5. El reactivo de detección de ácido nucleico en muestras de acuerdo con el punto 4, en donde el pH de la solución de reacción PCR es de 8,1 a 8,5.
6. El reactivo de detección de ácido nucleico en muestras de acuerdo con el punto 5, en donde el pH de la solución de reacción PCR es de 8,1.
7. Uso del reactivo de detección de ácido nucleico en muestras de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 6, para detectar ácido nucleico del VHB.
8. Un kit de detección de ácido nucleico en muestras, que comprende una solución de extracción de ácido nucleico y una solución de reacción PCR, en donde la solución de extracción de ácido nucleico comprende un hidróxido de metal alcalino de 10 mM a 100 mM, y Tris-HCl de 1 mM a 25 mM, Chelex-100 del 2 % al 5 % (p/v), EDTA del 0,1 % al 0,4 % (p/v), el pH de la solución de extracción de ácido nucleico es de 10,5 a 12,5; la solución de reacción PCR incluye Tris-HCl de 5 mM a 75 mM, el pH de la solución de reacción PCR es de 8,0 a 9,0.
9. El kit de detección de ácido nucleico en muestras de acuerdo con el punto 8, en donde el hidróxido de metal alcalino es NaOH o KOH.
10. El kit de detección de ácido nucleico en muestras de acuerdo con el punto 8, en donde el kit de detección de ácido nucleico en muestras comprende además una solución de concentración que comprende del 2,5 % al 4,5 % (p/p) de NaCl y del 10 % al 13 % (p/v) de PEG6000.
11. El kit de detección de ácido nucleico en muestras de acuerdo con el punto 8, en donde el pH de la solución de reacción PCR es de 8,1 a 8,7.
12. El kit de detección de ácido nucleico en muestras de acuerdo con el punto 8, en donde el pH de la solución de reacción PCR es de 8,1 a 8,5.

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Un método para neutralizar una solución de ácido nucleico en muestras, cuyo método comprende:
(1) extraer ácido nucleico de una muestra utilizando una solución de extracción de ácido nucleico para obtener una solución de ácido nucleico de muestra;
(2) añadir la solución de ácido nucleico de la muestra a una solución de reacción PCR para su neutralización y obtener una solución mixta,
en donde el pH de la solución de extracción de ácido nucleico es de 10,5 a 12,5, y el pH de la solución de reacción PCR es de 8,0 a 9,0, y
en donde la solución de extracción de ácido nucleico comprende un hidróxido de metal alcalino de 10 mM a 100 mM, Tris-HCl de 1 mM a 25 mM, Chelex-100 del 2 % al 5 % (p/v), EDTA del 0,1 % al 0,4 % (p/v).
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la solución de reacción PCR incluye Tris-HCl de 5 mM a 75 mM.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el hidróxido de metal alcalino es NaOH o KOH.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la solución de reacción PCR incluye Tris-HCl de 50 mM a 75 mM.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el método comprende una etapa de concentración para concentrar una muestra para obtener la muestra concentrada antes de la etapa (1) utilizando una solución de concentración, después, en la etapa (1), extraer el ácido nucleico de la muestra concentrada utilizando la solución de extracción de ácido nucleico.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la solución de concentración comprende del 2,5 % al 4,5 % (p/p) de NaCl y del 10 % al 13 % de PEG6000 (p/v).
7. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el pH de la solución de reacción PCR es de 8,1 a 8,7.
8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el pH de la solución de reacción PCR es de 8,1 a 8,5.
9. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el pH de la solución de reacción PCR es de 8,1.
10. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico en muestras es de VHB, B27 humano, VPH 6/11, TB o CMVH.
11. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde en la etapa (2), la solución de ácido nucleico en la muestra y la solución de reacción PCR se mezclan para su neutralización en el tubo de ensayo de la PCR, después, el tubo de ensayo de la PCR se coloca en un termociclador.
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