ES3029064T3 - Digital imaging system and method - Google Patents

Abstract

Un sistema y método para adquirir imágenes de objetos distribuidos dentro de una muestra fijada a una superficie de un portaobjetos, teniendo la muestra una altura desigual con respecto a la superficie del portaobjetos utilizando una cámara que tiene una lente objetivo con un eje óptico que forma un ángulo no ortogonal con la superficie del portaobjetos, incluyendo el método la adquisición de una primera pluralidad de imágenes de una primera porción lineal de la muestra; la evaluación de un enfoque de objetos dentro de la porción lineal de la muestra capturados en la primera pluralidad de imágenes; y la adquisición de una segunda pluralidad de imágenes de la primera porción lineal o de una segunda porción lineal de la muestra diferente de la primera, en donde la altura de la lente objetivo con respecto a la superficie del portaobjetos varía durante la adquisición de la segunda pluralidad de imágenes en función del enfoque evaluado de los objetos capturados en la primera pluralidad de imágenes. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Sistema y método de formación de imágenes digitales

DATOS DE SOLICITUD RELACIONADA CAMPO DE LA DIVULGACIÓN

[0001] Esta divulgación está dirigida en general a sistemas y métodos para adquirir imágenes digitales de muestras fijadas a la superficie de un portaobjetos, tales como muestras citológicas (celulares) que tienen un espesor que excede la profundidad de campo del generador de imágenes.

ANTECEDENTES

[0002] La citología es una rama de la biología que estudia la formación, la estructura y la función de las células. En el ámbito del laboratorio, los citólogos, citotecnólogos y otros profesionales médicos realizan diagnósticos médicos del estado de un paciente basándose en el examen visual de una muestra de células del paciente, a la que en este documento se hace referencia como muestra "citológica". Una técnica citológica típica es la prueba de Papanicolaou, en la que se raspan células del cuello uterino de una mujer y se analizan para detectar la presencia de células anormales, un precursor de la aparición del cáncer de cuello uterino. Las técnicas citológicas también se utilizan para detectar células anormales y enfermedades en otras partes del cuerpo humano.

[0003] Las técnicas citológicas se emplean ampliamente porque la recolección de muestras de células para análisis es generalmente menos invasiva que los procedimientos patológicos quirúrgicos tradicionales, como las biopsias, mediante las cuales una muestra de tejido sólido, denominada en este documento como una muestra "patológica", se extirpa del paciente utilizando agujas de biopsia especializadas que tienen estiletes trasladables accionados por resorte, cánulas fijas y similares. Las muestras de células se pueden obtener del paciente mediante una variedad de técnicas que incluyen, por ejemplo, raspando o frotando un área, o utilizando una aguja para aspirar líquidos corporales de la cavidad torácica, la vejiga, el canal espinal u otra área apropiada. La muestra de células adquirida generalmente se coloca en una solución conservante y posteriormente se extrae de la solución y se transfiere a un portaobjeto de vidrio. Se aplica un fijador a la muestra de células para garantizar que las células permanezcan en su lugar en el portaobjetos de vidrio para facilitar la tinción y el examen posteriores.

[0004] En general, es deseable que las células en el portaobjetos tengan una distribución espacial adecuada, de modo que se puedan examinar células individuales. Normalmente se prefiere una sola capa de células. Por consiguiente, la preparación de una muestra citológica a partir de una muestra líquida que contiene muchas células (por ejemplo, decenas de miles) normalmente requiere que las células se separen primero entre sí mediante dispersión mecánica, cizallamiento líquido u otras técnicas de modo que se pueda recolectar una monocapa delgada de células y depositarla en el portaobjetos. De esta manera, el citotecnólogo puede discernir más fácilmente la presencia de células anormales en la muestra del paciente. Las células también se pueden contar para garantizar que se haya evaluado una cantidad adecuada de células.

[0005] Se describen ciertos métodos y aparatos para generar una monocapa delgada de células a partir de un recipiente de muestra líquida y luego transferir esta capa delgada a un "portaobjetos de muestra" que sea ventajoso para el examen visual, en las patentes de EE. UU. N.° 5,143,627, 5,240,606, 5,269,918, 5,282,978, 6,562,299, 6,572,824 y 7,579,190. Según un método divulgado en estas patentes, las células de un paciente suspendidas en un líquido conservante y almacenadas en un recipiente de muestra se dispersan utilizando un colector de muestra giratorio insertado en el recipiente. Se aplica un vacío controlado al colector de muestra para extraer el líquido a través de un filtro de malla del mismo hasta que se recoge una cantidad deseada y una distribución espacial de células contra el filtro. A continuación, el colector de muestra se retira del recipiente de muestra y la parte del filtro se imprime contra un portaobjeto de vidrio para transferir las células recogidas al portaobjetos en sustancialmente la misma distribución espacial que se recogieron. Los aparatos fabricados según las enseñanzas de una o más de estas patentes han tenido éxito comercial, como el procesador ThinPrep® 2000 (portaobjetos de muestra procesados a partir de muestras de pacientes de uno en uno) y el procesador ThinPrep® 5000 (lote de portaobjetos de muestra procesados a partir de muestras de pacientes), que fabrica y vende Hologic, Inc., con sede en Marlborough, Massachusetts. Se hace referencia adicional a las patentes de EE. UU. N° 7,556,777, y 7,771,662.

[0006] Una vez que se ha preparado un portaobjeto con una muestra, un citotecnólogo puede inspeccionar visualmente la muestra, normalmente bajo aumento, y con o sin varias fuentes de iluminación. Adicionalmente, o alternativamente, se utilizan sistemas de obtención de imágenes de portaobjetos automatizados para ayudar en el proceso de inspección citológica. Por ejemplo, un sistema de obtención de imágenes de portaobjetos automatizado puede capturar una imagen de todas, o sustancialmente todas, las células individuales dentro de una muestra citológica fijada al portaobjetos, y realizar una evaluación preliminar de las células utilizando técnicas de procesamiento de imágenes para dirigir al citotecnólogo a las células potencialmente más relevantes en el portaobjetos para una inspección minuciosa. Se describen ejemplos de dichos sistemas de obtención de imágenes en las patentes de EE. UU. N.° 7,587,078, 6,665,060, 7,006,674, 7,369,304 y 7,590,492. Ya sea mediante la inspección del portaobjetos de la muestra real bajo aumento o de imágenes ampliadas de la muestra, el citotecnólogo suele clasificar la muestra como "normal" o "anormal", donde una muestra anormal normalmente cae en una de las categorías principales definidas por el Sistema Bethesda para informar el diagnóstico citológico cervical/vaginal.

[0007] Sin embargo, los sistemas y métodos anteriores para adquirir imágenes digitales de muestras biológicas presentan una serie de deficiencias. Por un lado, los sistemas y métodos anteriores presentan tiempos de adquisición lentos debido al tiempo necesario para detenerse y enfocar mientras se escanea toda la muestra. Además, los sistemas y métodos anteriores que no se detienen para enfocar normalmente proporcionan solo un único plano de enfoque a lo largo de la muestra. Las muestras biológicas, incluidas tanto las muestras citológicas como las patológicas, son en realidad tridimensionales (es decir, tienen una profundidad). Por lo tanto, debido al alto aumento y las aperturas focales necesarias para obtener imágenes digitales de muestras biológicas, la profundidad de campo de las imágenes es muy limitada. En consecuencia, las partes de una muestra que se encuentren fuera de la profundidad de campo en el plano focal estarán desenfocadas o no serán visibles en la imagen. Para obtener imágenes digitales enfocadas a múltiples profundidades diferentes de la muestra, se debe ajustar el plano de enfoque, por ejemplo, moviendo la muestra o la cámara, o ajustando una lente de enfoque. Sin embargo, esto requiere un escaneo adicional de la muestra para cada plano de enfoque, o requiere detenerse periódicamente para volver a enfocar, lo que ralentiza aún más el tiempo de adquisición.

[0008] Muchos de los problemas anteriores de los sistemas de imágenes de la técnica anterior se abordan y resuelven mediante los sistemas y métodos de imágenes divulgados y descritos en la publicación de solicitud de PCT WO 2020/091965A2 (PCT/US19/55458, solicitada el 9 de octubre de 2019). Aspectos clave de los sistemas y métodos de obtención de imágenes divulgados en el documento WO 2020/091965A2 se describen y analizan a continuación, e incluyen la capacidad de capturar imágenes de células a distintas profundidades dentro de la muestra enfocada con un solo paso de escaneo de una cámara que tiene un objetivo de lente que está inclinado con respecto a la superficie del portaobjetos para capturar imágenes dentro de un rango focal que incluye todo el espesor de la muestra. Sin embargo, un problema particular que surge con algunas muestras de portaobjetos y que no se aborda en el documento WO 2020/091965A2, es cuando el espesor de la muestra, es decir, la altura de la muestra en relación con la superficie del portaobjetos, no es uniforme debido, por ejemplo, a un cubreobjetos no uniforme u otros aspectos de la preparación original del portaobjetos. Cuando esto ocurre, algunas de las células (posiblemente una cantidad sustancial) en la muestra estarán fuera del rango focal. Por lo tanto, más mejoras en los sistemas y técnicas de obtención de imágenes descritos en el documento WO 2020/091965A2 serían útiles para solucionar este problema de celdas desenfocadas. El documento US 2015/309299 A1 describe un aparato de obtención de imágenes que comprende una platina de muestra, una unidad de obtención de imágenes, un primer mecanismo de movimiento configurado para realizar un movimiento relativo entre la platina y la unidad de obtención de imágenes, y un mecanismo de inclinación configurado para inclinar un plano focal en un lado del objeto de la unidad de obtención de imágenes relativamente con respecto a un eje paralelo a una dirección de movimiento del primer mecanismo de movimiento. Además, una unidad de cálculo está configurada para hacer que la unidad de obtención de imágenes obtenga imágenes de una primera región del objeto mientras hace que el primer mecanismo de movimiento funcione, adquiera información sobre la primera región en función de un resultado de la obtención de imágenes y calcule una tendencia de enfoque del objeto.

[0009] El documento US 2019/101739 A1 describe un aparato de escaneo digital que comprende al menos un procesador configurado para ajustar una altura de la lente objetivo durante el escaneo de una muestra y para identificar una pluralidad de valores Z verdaderos, donde cada valor Z verdadero indica, para uno respectivo de la pluralidad de búferes de imagen adquiridos, una posición de distancia de la lente objetivo en la que el plano de imagen del sensor de imágenes tiene un contraste máximo. Si una diferencia entre el valor Z verdadero para un primer búfer de imagen y el valor Z previsto para dicho primer búfer de imagen excede un umbral predeterminado, entonces se identifica que el primer búfer de imagen necesita ser escaneado nuevamente.

[0010] El documento US 2018/295254 A1 describe un método para operar un aparato de escaneo de imágenes, donde, cada vez que se adquiere una nueva franja de la superficie del objeto, las líneas de escaneo que forman la nueva franja se pueden utilizar para obtener al menos una medida que indica que la superficie del primer objeto es irregular. El valor de ancho de franja se establece en función de la al menos una medida, de modo que el valor de ancho de franja se establece cada vez que se adquiere una nueva franja.

[0011] El documento US 2014/300724 A1 describe un método para evaluar la calidad de una imagen de portaobjetos de microscopio, donde se identifica la distancia más grande de cualquier punto de enfoque desde la superficie de mejor ajuste y se compara con un valor de distancia máxima predeterminado. Si la distancia más grande es mayor de la distancia máxima, es muy probable que la imagen de portaobjetos virtual tenga partes desenfocadas y necesite volver a escanearse y se designa como que necesita una inspección manual.

SUMARIO

[0012] De acuerdo con un primer aspecto de las invenciones divulgadas, se divulga un método para adquirir imágenes de objetos distribuidos dentro de una muestra fijada a una superficie de un portaobjetos utilizando una cámara que tiene una lente objetivo con un eje óptico que forma un ángulo no ortogonal con la superficie del portaobjetos, teniendo la muestra una altura desigual con respecto a la superficie del portaobjetos, donde el método incluye (i) adquirir una primera pluralidad de imágenes de una primera porción lineal de la muestra; (ii) evaluar un enfoque de objetos dentro de la porción lineal de la muestra capturados en la primera pluralidad de imágenes, incluyendo determinar si un número total de objetos desenfocados excede un número umbral y determinar una mejor altura de enfoque de la muestra a lo largo de la primera porción lineal; (iii) calcular una curva de altura de enfoque z de la mejor altura de enfoque de la muestra a lo largo de la primera porción lineal; (iv(a)) si el número total de objetos desenfocados en la primera pluralidad de imágenes excede el número umbral, entonces volver a tomar imágenes de la primera porción lineal de la muestra para adquirir una segunda pluralidad de imágenes, donde una altura de la lente objetivo con respecto a la superficie del portaobjetos varía durante la adquisición de la segunda pluralidad de imágenes con base en la curva de altura de enfoque z; y (iv(b)) si el número total de objetos desenfocados en la primera pluralidad de imágenes no excede el número umbral, entonces adquirir una segunda pluralidad de imágenes de una segunda porción lineal de la muestra directamente adyacente a la primera porción lineal, donde una altura de la lente objetivo con respecto a la superficie del portaobjetos varía durante la adquisición de la segunda pluralidad de imágenes con base en la curva de altura de enfoque z.

[0013] Opcionalmente, una altura de la lente objetivo con respecto a la superficie del portaobjetos puede ser sustancialmente constante durante la adquisición de la primera pluralidad de imágenes.

[0014] En diversas formas de realización, evaluar el enfoque de los objetos capturados en la primera pluralidad de imágenes incluye determinar las alturas respectivas de los objetos desenfocados con respecto a la superficie del portaobjetos, y si los respectivos objetos desenfocados están ubicados a una altura con respecto a la superficie del portaobjetos que está fuera de un rango de enfoque de la lente objetivo durante la adquisición en la primera pluralidad de imágenes. Preferiblemente, evaluar el enfoque de los objetos en la primera pluralidad de imágenes incluye determinar si los respectivos objetos desenfocados están ubicados a una altura con respecto a la superficie del portaobjetos que sea más alta que una altura máxima o más baja que una altura mínima, respectivamente, de un rango de enfoque de la lente objetivo durante la adquisición en la primera pluralidad de imágenes.

[0015] En diversas formas de realización, evaluar el enfoque de los objetos en la primera pluralidad de imágenes incluye determinar las ubicaciones respectivas de los objetos desenfocados dentro de la primera porción lineal.

[0016] En diversas formas de realización, una o ambas de la cámara y el portaobjetos se mueven en relación con la otra durante la adquisición de las imágenes, en donde la altura de la lente del objetivo en relación con la superficie del portaobjetos se varía aumentando y/o disminuyendo una altura de la cámara en relación con la superficie del portaobjetos como una función de una posición lineal de la cámara con respecto a una ubicación longitudinal de la primera o segunda porción lineal respectiva. En particular, la altura de la lente del objetivo en relación con la superficie del portaobjetos se puede variar moviendo el portaobjetos verticalmente en relación con la cámara, o moviendo la cámara verticalmente en relación con el portaobjetos, o ambos, durante la adquisición de las imágenes.

[0017] En diversas formas de realización, cuando se adquiere la segunda pluralidad de imágenes de la primera porción lineal, el método incluye además evaluar un enfoque de los objetos capturados en la segunda pluralidad de imágenes; y adquirir una tercera pluralidad de imágenes de la segunda porción lineal, donde la altura de la lente objetivo con respecto a la superficie del portaobjetos varía durante la adquisición de la tercera pluralidad de imágenes en función del enfoque evaluado de los objetos capturados en la segunda pluralidad de imágenes.

[0018] En diversas formas de realización, evaluar el enfoque de los objetos capturados en la primera pluralidad de imágenes puede incluir determinar si un número total de objetos desenfocados excede un número umbral.

[0019] En una forma de realización preferida, evaluar el enfoque de los objetos en la primera pluralidad de imágenes incluye determinar si los respectivos objetos desenfocados están ubicados a una altura relativa a la superficie del portaobjetos que sea mayor que una altura máxima o menor que una altura mínima, respectivamente, de un rango de enfoque de la lente del objetivo durante la adquisición en la primera pluralidad de imágenes, así como determinar las ubicaciones respectivas de los objetos desenfocados dentro de la porción lineal respectiva.

[0020] En una forma de realización preferida, uno o ambos de la cámara y el portaobjetos se mueven lateralmente con relación al otro durante la adquisición de las respectivas primera y segunda pluralidades de imágenes, donde la altura de la lente objetivo con relación a la superficie del portaobjetos se varía aumentando y/o disminuyendo una altura de la cámara con relación a la superficie del portaobjetos como una función de una posición lineal de la cámara con respecto a una ubicación longitudinal de la respectiva porción lineal. Nuevamente, la altura de la lente objetivo con relación a la superficie del portaobjetos se puede variar moviendo el portaobjetos verticalmente con relación a la cámara, o moviendo la cámara verticalmente con relación al portaobjetos, o ambos, durante la adquisición de las imágenes.

[0021] De acuerdo con un aspecto adicional de las invenciones descritas, se proporciona un sistema para adquirir imágenes de objetos distribuidos dentro de una muestra fijada a una superficie de un portaobjetos, teniendo la muestra una altura desigual con respecto a la superficie del portaobjetos, incluyendo el sistema una cámara que tiene una lente objetivo con un eje óptico, donde la cámara está posicionada de tal manera que el eje óptico forma un ángulo no ortogonal con la superficie del portaobjetos. El sistema incluye además un procesador de imágenes acoplado operativamente con la cámara, y el sistema está configurado para llevar a cabo el método de acuerdo con el primer aspecto de la invención.

[0022] En una forma de realización, la altura de la lente objetivo con respecto a la superficie del portaobjetos es sustancialmente constante durante la adquisición de la primera pluralidad de imágenes.

[0023] En una forma de realización, el procesador de imágenes evalúa el enfoque de los objetos capturados en la primera pluralidad de imágenes al menos en parte determinando las alturas respectivas de los objetos desenfocados en relación con la superficie del portaobjetos.

[0024] En una forma de realización, el procesador de imágenes evalúa el enfoque de los objetos en la primera pluralidad de imágenes al menos en parte determinando si los respectivos objetos desenfocados están ubicados a una altura relativa a la superficie del portaobjetos que está fuera de un rango de enfoque de la lente del objetivo durante la adquisición en la primera pluralidad de imágenes.

[0025] En una forma de realización, el procesador de imágenes evalúa el enfoque de los objetos en la primera pluralidad de imágenes al menos en parte determinando si los respectivos objetos desenfocados están ubicados a una altura relativa a la superficie del portaobjetos que sea mayor que una altura máxima o menor que una altura mínima, respectivamente, de un rango de enfoque de la lente del objetivo durante la adquisición en la primera pluralidad de imágenes.

[0026] En una forma de realización, el procesador de imágenes evalúa el enfoque de los objetos en la primera pluralidad de imágenes al menos en parte determinando las ubicaciones respectivas de los objetos desenfocados dentro de la primera porción lineal.

[0027] En varias formas de realización, uno o ambos, la cámara y el portaobjetos, están configurados preferiblemente para moverse lateralmente con respecto al otro durante la adquisición de las imágenes.

[0028] Sin limitación, en una forma de realización, la altura de la lente objetivo con respecto a la superficie del portaobjetos se varía aumentando y/o disminuyendo una altura de la superficie del portaobjetos con respecto a la cámara como una función de una posición lineal de la cámara con respecto a una ubicación longitudinal de la respectiva primera o segunda porción lineal. En una misma o en otra forma de realización, la altura de la lente objetivo con respecto a la superficie del portaobjetos se varía aumentando y/o disminuyendo una altura de la cámara con respecto a la superficie del portaobjetos como una función de una posición lineal de la cámara con respecto a una ubicación longitudinal de la respectiva primera o segunda porción lineal.

[0029] La segunda pluralidad de imágenes puede adquirirse de la primera o segunda porción lineal. En una forma de realización, la segunda pluralidad de imágenes se adquiere de la primera porción lineal, estando configurado además el procesador de imágenes para evaluar un enfoque de los objetos capturados en la segunda pluralidad de imágenes; y hacer que la cámara adquiera una tercera pluralidad de imágenes de la segunda porción lineal, donde la altura de la lente del objetivo con respecto a la superficie del portaobjetos varía durante la adquisición de la tercera pluralidad de imágenes en función del enfoque evaluado de los objetos capturados en la segunda pluralidad de imágenes. Sin limitación, la segunda porción lineal puede estar directamente adyacente a la primera porción lineal.

[0030] Otros aspectos y características adicionales de las formas de realización descritas se harán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada en vista de los dibujos adjuntos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0031] Los aspectos anteriores y otros aspectos de las formas de realización se describen con más detalle con referencia a los dibujos adjuntos, donde los números de referencia similares se refieren a elementos similares y la descripción de elementos similares será aplicable para todas las formas de realización descritas siempre que sea relevante, y en los que:

La figura 1 muestra un portaobjeto de muestra para su uso en un sistema automatizado de imágenes digitales;

La figura 2 es una sección transversal de un área de muestra del portaobjetos de la figura 1;

La figura 3 es una tabla de los resultados de un estudio de alturas relativas del contenido celular;

Las figuras 4A y 4B son un mapa de enfoque 3D y un mapa de calor, respectivamente, que representan alturas relativas del contenido celular en una muestra;

La figura 5 es un diagrama esquemático que ilustra un patrón de escaneo serpenteante utilizado por un generador de imágenes digitales para escanear un portaobjeto de muestra, según una forma de realización. La figura 6 es un diagrama esquemático que ilustra un ángulo de inclinación de un generador de imágenes con respecto a un portaobjeto;

La figura 7 es un gráfico que representa una operación de fusión de enfoque;

Las figuras 8A-8C son vistas en sección transversal de un área de muestra que representa una trayectoria celular, un área cubierta por un escaneo volumétrico y un área cubierta por un escaneo volumétrico con un seguimiento de curva Z;

Las figuras 9A y 9B son imágenes de una muestra adquirida sin seguimiento de la curva Z y con seguimiento de la curva Z, respectivamente; y

La figura 10 es un diagrama de flujo de un método para adquirir imágenes de una muestra utilizando el seguimiento de curva Z.

DESCRIPCION DETALLADA

[0032] La aparición de los sistemas de obtención de imágenes digitales de portaobjetos (WSI) revolucionará los campos de la patología y la citología. La capacidad de obtener imágenes de portaobjetos completos de alta calidad rápidamente será un paso vital en un flujo de trabajo clínico exitoso, especialmente para aplicaciones de detección de alto volumen como la prueba de Pap. Los portaobjetos de citología con base líquida presentan una monocapa casi visual al revisor, pero la citología es inherentemente tridimensional. Estos portaobjetos pueden ser un desafío para WSI debido a la profundidad focal del material estrechamente yuxtapuesto que puede ser un orden de magnitud mayor que la profundidad de campo (DOF) de un objetivo de microscopio de alta potencia. Por este motivo, los portaobjetos de citología son más difíciles de obtener que los portaobjetos de tejido histológico. Los portaobjetos con cubreobjetos de película también pueden aumentar el requisito de profundidad de escaneo debido a la curvatura a lo largo de la región de puntos celulares del portaobjetos. Como tal, la distancia entre los objetos de interés en una muestra citológica y el portaobjetos de vidrio al que está fijada la muestra puede variar en gran medida, en relación con la DOF del objetivo del microscopio. La mayoría de los sistemas WSI actuales requieren escaneos repetidos para cubrir múltiples planos focales a fin de obtener imágenes de calidad, lo que aumenta enormemente el tiempo de obtención de imágenes. Por lo tanto, obtener imágenes de alta calidad de enfoque para portaobjetos de citología de manera eficiente es un desafío. En este documento se describen sistemas y métodos para escanear de manera eficiente dichos portaobjetos para obtener imágenes enfocadas de alta calidad.

[0033] Con referencia a la Fig. 1, se muestra una forma de realización ejemplar de un portaobjeto de microscopio 102. El portaobjetos de microscopio 102 es una placa de vidrio rectangular 110 (u otro material adecuado) que tiene un área de identificación de portaobjetos 112, un área de muestra 114 y marcas fiduciales 116. El portaobjetos de microscopio 102 puede ser un portaobjeto de microscopio de tamaño estándar que es de aproximadamente 75 mm por 25 mm, u otro tamaño adecuado. El portaobjetos de microscopio 102 puede tener esquinas biseladas para facilitar la manipulación y el posicionamiento del portaobjetos 102. El área de muestra 114 puede ser un círculo que tiene un diámetro de hasta aproximadamente 22 mm. Se puede obtener una imagen de toda el área de muestra 114 en el portaobjetos de microscopio 102. El área de identificación de portaobjetos 112 puede tener una longitud de hasta aproximadamente 25-28 mm. La porción de identificación de portaobjetos 112 puede estar impresa con un código de barras, un número de identificación y/u otra información. El área de muestra 114 se deja como un área libre del portaobjetos de vidrio 102. Las marcas fiduciales 116 pueden ser utilizadas por un generador de imágenes como puntos de referencia en el portaobjetos 102 para determinar la ubicación y/o la orientación del portaobjetos 102 y sus características con respecto al generador de imágenes. Una muestra 119 que incluye una pluralidad de objetos distribuidos dentro de un volumen tridimensional se fija al portaobjetos 102, generalmente dentro del área de muestra 114, pero en algunos casos la muestra puede extenderse fuera del área de muestra 114. El volumen tridimensional de la muestra 119 tiene una longitud (l), un ancho (w) y un espesor o profundidad (d). El espesor (d) define un eje z con respecto a la superficie del portaobjetos 102. La muestra 119 puede ser cualquier muestra adecuada, como una muestra citológica en la que los objetos son células, una muestra de tejido sólido en la que los objetos son estructuras de tejido, etc.

[0034] Como se muestra en la figura 1, se puede utilizar un cubreobjetos 115 para cubrir la muestra 119 en el área de muestra 114. El cubreobjetos 115 para la muestra es lo suficientemente transparente para adquirir imágenes de la muestra 119 a través del cubreobjetos 115. En otras palabras, el cubreobjetos 115 no impide que un generador de imágenes adquiera imágenes a través del cubreobjetos 115. El cubreobjetos 115 funciona para preservar la muestra 119 y protegerla de la contaminación y de contaminar otros objetos, y también mantiene la muestra 119 plana y en su lugar. El cubreobjetos 115 tiene un grosor 117.

[0035] Como se muestra en la Fig. 2, la muestra 119 dispuesta entre el portaobjetos de vidrio 110 y el cubreobjetos 115 tiene un grosor 120. Las células 122 están dispersas por toda la capa de muestra a varias profundidades o posiciones del eje z. Una muestra puede tener un grosor que, sobre toda la muestra, exceda la profundidad de campo de la óptica utilizada para adquirir imágenes de los objetos (tales como células 122) en la muestra. Esto puede suceder especialmente en muestras citológicas basadas en líquido donde se recogen células individuales. El cubreobjetos 115 colocado sobre la parte superior de la muestra 119 puede estar hecho de vidrio o plástico, y se adhiere al portaobjetos 110 con una fina capa de adhesivo. Se ha observado que las células tienden a flotar en el adhesivo, lo que hace que se eleven por encima del vidrio 110. Además, el cubreobjetos 115 no siempre es perfectamente plano y a menudo presenta ondulaciones, protuberancias y huecos. Esto provoca un grosor inconsistente del adhesivo, lo que a su vez hace que la distancia de las células al sustrato de vidrio 110, y por lo tanto a la lente del objetivo, varíe, a veces más del que la profundidad de campo puede admitir. En el presente documento se describe un método y un sistema de obtención de imágenes digitales para escanear de manera eficiente portaobjetos de citología que resuelve el problema de digitalizar una muestra que, en un campo de visión determinado, es más gruesa que la profundidad de campo de la lente del objetivo.

[0036] Debido a que las células pueden estar suspendidas en el medio de montaje y también pueden apilarse, los portaobjetos de citología son inherentemente tridimensionales. Dado que un objetivo de microscopio tiene una profundidad de campo (DOF) tan pequeña, no se pueden capturar todas las células enfocadas en una sola imagen. De hecho, las células individuales pueden ser más gruesas que una sola DOF. Una lente de objetivo de microscopio de 40X con NA 0,75 tiene una profundidad de campo de menos de 2 micrones. Los portaobjetos de citología con cubreobjetos de película flexible (plástico) pueden requerir incluso más profundidad de escaneo (es decir, adquisición de imágenes) debido a la curvatura a lo largo de la región de puntos celulares. Para capturar imágenes de calidad de todas las células en un portaobjetos de citología (como un portaobjetos ThinPrep), se requieren rangos de enfoque mucho más amplios.

[0037] En un ejemplo, se escanearon 23 portaobjetos ThinPrep Pap en un microscopio controlado por ordenador con una cámara digital (Hologic ThinPrep Integrated Imager) para recopilar datos de profundidad de preparación de células. Primero, se escaneó el área de la mancha celular utilizando una platina XY controlada por computadora. En cada ubicación, se capturó una pila de imágenes en un amplio rango (> 40 micras) de altura Z. Cada imagen se dividió en pequeñas regiones (35 micras cuadradas) y se evaluó la métrica de puntuación de enfoque de Brenner para cada nivel en la pila Z. Se determinó el enfoque óptimo para ese elemento. Al enfocarse en las marcas fiduciales impresas en el portaobjetos, se determinó el plano general del portaobjetos de vidrio y se restó de los datos de enfoque para determinar las alturas relativas del contenido celular.

[0038] La tabla de la Fig. 3 presenta un sumario de los datos obtenidos de estos 23 portaobjetos. La tabla muestra que la profundidad celular promedia de los portaobjetos ThinPrep fue de 11,09 micras para los portaobjetos con un cubreobjetos de vidrio y de 23,6 micras para los portaobjetos con cubreobjetos de película. En algunos casos, la profundidad celular puede ser superior a 40 micras. Nótese que incluso con cubreobjetos de vidrio, las variaciones locales en la altura celular dentro de un portaobjetos ascienden a hasta 7 veces la profundidad de campo del objetivo del microscopio. Se creó y revisó un mapa de enfoque de la gráfica de superficie para cada portaobjetos. En las Figs. 4A y 4B se muestra un ejemplo para un portaobjetos con cubreobjetos de película, que muestra el efecto de la curvatura sobre la extensión de la región de puntos celulares. En particular, para el ejemplo mostrado en las Figs. 4A y 4B, las células en la porción media de la muestra están más cerca del portaobjetos de vidrio, mientras que las células alrededor de los bordes de la muestra están más cerca del cubreobjetos.

[0039] Como se muestra en la Fig. 5, durante la obtención de imágenes, la platina de deslizamiento XY mueve el portaobjetos 102 para escanear el campo de visión de una cámara sobre toda el área de la muestra 114 (o un área predeterminada de toda la muestra real 119, por ejemplo, si la muestra real 119 cubre un área diferente que el área de la muestra 114 y el límite de la muestra real 119 se determina previamente). La platina de deslizamiento XY mueve el portaobjetos 102 en una trayectoria serpenteante de ida y vuelta para capturar microimágenes de una franja, fila o porción lineal de la muestra 119 en cada pasada. Para capturar una franja, la platina de deslizamiento XY mueve continuamente el portaobjetos 102 y la cámara se activa mediante la platina de deslizamiento XY para capturar una imagen cuando se alcanza cada punto de activación según la posición del codificador de la platina. Se utiliza una cámara de muy alta velocidad para que el movimiento relativo entre el portaobjetos y la cámara sea continuo. A velocidades tan altas, la adquisición de imágenes a lo largo de una porción lineal del portaobjetos puede denominarse "escaneo" de la fila. Se utiliza una trayectoria serpenteante, de modo que el inicio de cada franja sucesiva está cerca del final de la franja anterior, para minimizar el tiempo requerido para escanear toda la muestra 119. A medida que el portaobjetos 102 se mueve a lo largo de una franja, la cámara captura microimágenes de la muestra 119. Es decir, el generador de imágenes captura una pluralidad de imágenes que cubren toda el área de la muestra de acuerdo con un patrón de escaneo, como el que se muestra en la Figura 5. El patrón de escaneo incluye una pluralidad de porciones lineales representadas por las flechas horizontales 130 en la Figura 5. La muestra se divide en una pluralidad de zonas de enfoque, representadas por los cuadrados 132 en la Figura 5. Como tal, cada porción lineal 130 a lo largo de la cual se adquieren imágenes incluye una pluralidad de zonas de enfoque 132. Cada porción lineal 130 puede incluir de 30 a 70 zonas de enfoque. En otro ejemplo, en lugar de mover el portaobjetos 102, se mueve la cámara a lo largo del patrón de escaneo mientras el portaobjetos 102 permanece estacionario. Independientemente de si se mueve el portaobjetos 102 o la cámara, el portaobjetos 102 se mueve con relación a la cámara.

[0040] La mayoría de los sistemas WSI actuales escanean un solo plano focal a la vez. Un escáner típico completa un escaneo de 15 x 15 mm en 1 minuto. A este ritmo, escanear una región de puntos de celdas ThinPrep circulares a una profundidad de 14 planos focales llevaría al menos 26 minutos. Para aumentar drásticamente el rendimiento de un digitalizador de portaobjetos, algunos sistemas están diseñados con un ángulo de inclinación entre la lente del objetivo y el portaobjetos de vidrio. Con este enfoque, la profundidad de campo se puede utilizar para digitalizar simultáneamente capas distintas, cada una a profundidades ligeramente diferentes. Luego, las capas se pueden agrupar en una sola capa compuesta y enfocada en una operación llamada fusión de enfoque, que implica elegir la capa (o parte de una capa) que exhiba el mejor enfoque y unir esas regiones bien enfocadas. Con este enfoque, el portaobjetos se puede mover continuamente debajo de la lente del objetivo sin detenerse para enfocar. Las diversas capas se digitalizan y fusionan, y se puede construir un sistema que esencialmente realiza el enfoque posterior a la adquisición. La única limitación de este sistema es la profundidad de campo del objetivo, que a su vez se traduce en el espesor máximo de la muestra que se puede fotografiar. La clara ventaja de este sistema es que no es necesario detener ni enfocar.

[0041] El uso de un método de escaneo volumétrico de plano inclinado reduce significativamente el tiempo de adquisición para escanear el área completa de contenido celular. Una lámina ThinPrep Pap se puede completar en aproximadamente 2,5 minutos. Como se muestra en la Figura 6, la óptica de imágenes y la cámara 202 están inclinadas con respecto a la lámina 102. La región de la imagen en un borde del marco de la cámara adquiere imágenes más cercanas al vidrio de la lámina que la región en el otro borde del marco de la cámara. En un ejemplo, un ángulo de inclinación de 48 miliradianes y un ancho de marco de imagen en la lámina de 0,5 mm proporciona una profundidad de escaneo de 0,5 x sin(0,048), que es de 24 micras.

[0042] Como se muestra mejor en la Fig. 6, el eje óptico 204 de la lente objetivo está inclinado en un ángulo de inclinación 206 con respecto a la ortogonalidad del plano del portaobjetos 102 en la dirección de escaneo(véasela Fig. 5). En otras palabras, el eje óptico resultante 204 de la cámara y la óptica en la superficie del portaobjetos no es ortogonal al plano del portaobjetos 102. Como se describe con más detalle en el documento WO 2020/091965A2, el ángulo de inclinación 206 permite que el generador de imágenes obtenga imágenes volumétricas de la muestra 119 en el portaobjetos 102 (es decir, imágenes que se extienden hasta la profundidad de una muestra 119). En otras palabras, las microimágenes incluyen una imagen enfocada de características a diferentes profundidades de la muestra 119 en el portaobjetos 102, en lugar de solo un único plano de enfoque en el caso de una imagen tomada en un ángulo ortogonal de la muestra 119. Una estación de obtención de imágenes puede estar configurada para adquirir microimágenes en las que cada una de las microimágenes incluye al menos una parte de una profundidad del portaobjetos 102 subyacente a la superficie del portaobjetos 102. Si se utiliza un cubreobjetos 115 en el portaobjetos 102, la estación de obtención de imágenes puede estar configurada para adquirir microimágenes en las que cada una de las microimágenes incluye al menos una parte de una profundidad del cubreobjetos 115.

[0043] A medida que la cámara se mueve continuamente, se activa para obtener una nueva imagen cada vez que se ha movido 1/14 de su propio ancho. Se utiliza una cámara de velocidad muy alta (>100 fps). Estas imágenes superpuestas se pueden cortar y volver a ensamblar para obtener las 14 imágenes del plano focal, como se muestra en la Fig. 7, y como se describe con más detalle en el documento WO 2020/091965. Para optimizar el espacio de almacenamiento, los planos focales se combinan en una única imagen con profundidad de campo ampliada mediante la selección de píxeles enfocados de los distintos planos. El procesamiento de la imagen se realiza en tiempo real mediante aceleración de hardware de GPU.

[0044] Si bien los cubreobjetos no son perfectamente planos, su variación en cuanto a su planitud es gradual. Esto significa que el cubreobjetos puede formar una protuberancia en el centro del portaobjetos, o tal vez a partir de múltiples ondas a lo largo de la superficie del portaobjetos, pero no hay cambios abruptos en la distancia entre el cubreobjetos y el vidrio subyacente. Por ejemplo, un cubreobjetos perfectamente plano 115 se muestra en la Fig. 8A, mientras que los cubreobjetos que tienen superficies onduladas o irregulares se muestran en las Figs. 8B y 8C.

[0045] Esta brecha de cambio lento permite que un sistema de imágenes enfocadas después de la adquisición tenga una profundidad de campo efectiva mucho mayor que la proporcionada por la óptica sola. Básicamente, a medida que se escanea el portaobjetos, generalmente utilizando un patrón de trama de ida y vuelta (como se muestra en la Figura 5), al final de cada pasada (antes de invertir la dirección de escaneo para interrogar la siguiente fila o franja), se analizan las capas recogidas y se determina el enfoque óptimo durante la operación de fusión de enfoque. A medida que el material biológico se desplaza hacia arriba, siguiendo el cubreobjetos ondulado, la capa en la que se encontró el mejor enfoque en la franja anterior se puede utilizar para predecir el mejor patrón de enfoque para la siguiente franja que se escaneará. Los objetos individuales de interés se encuentran durante la fusión de enfoque y se anota su profundidad. Luego, cada fila se utiliza para predecir el mejor enfoque para la siguiente fila.

[0046] Al detectar regiones desenfocadas al final de una pasada, se puede volver a escanear la pasada a una altura diferente en la que esas regiones desenfocadas estén ahora enfocadas. Las alturas de enfoque resultantes se pueden utilizar para informar la siguiente pasada, lo que, a su vez, minimiza la cantidad de veces que se requiere volver a escanear la pasada.

[0047] La ventaja de un sistema de este tipo es que se puede lograr un rendimiento mucho mayor (tiempos de escaneo más cortos) en virtud del hecho de que no es necesario detenerse y enfocar; ni tampoco es necesario volver atrás y volver a escanear las regiones desenfocadas. En lugar de eso, el sistema simplemente escanea hacia adelante y hacia atrás hasta que ha digitalizado (y combinado el enfoque) toda la muestra. Mientras se desplaza, la lente del objetivo se mueve hacia arriba y hacia abajo de acuerdo con el mapa de enfoque que se le proporcionó de la pasada anterior, todo diseñado para mantener los objetos de interés dentro de la profundidad de campo de modo que todos estén enfocados a pesar de su distancia variable desde la superficie del portaobjetos de vidrio.

[0048] Para manejar el rango de profundidad celular total más grande que se encuentra en portaobjetos con cubreobjetos de película, la óptica de formación de imágenes se puede accionar en el eje Z para seguir la curvatura, como se muestra en las figuras 8A-8C. La trayectoria celular 802 ondula y generalmente está inclinada. El escaneo volumétrico que utiliza la cámara inclinada como se describió anteriormente proporciona una región escaneada más gruesa 804 que un escaneo que se realiza a una sola profundidad de enfoque, pero no proporciona imágenes enfocadas de una porción inferior 806 y una porción superior 808 de la trayectoria celular 802. El escaneo volumétrico con seguimiento de curva Z 810 captura toda la trayectoria celular 802 de la muestra. La profundidad celular local en el área del tamaño del campo de visión de la cámara está dentro de la profundidad de escaneo del plano inclinado, pero en distancias más largas, puede ser necesaria una variación mayor en la profundidad de enfoque.

[0049] Un método de escaneo de seguimiento de curvas minimiza los errores de enfoque local, proporcionando imágenes WSI de mayor calidad. El portaobjetos utilizado para crear las imágenes de las figuras 9A y 9B tiene una profundidad de enfoque Z de más de 40 micras. En la figura 9A se muestra un escaneo volumétrico sin seguimiento de curvas Z. En la figura 9B se muestra un escaneo volumétrico con seguimiento de curvas Z. La imagen de la figura 9B es más clara y está más enfocada que la imagen de la figura 9A.

[0050] Con referencia ahora a la Fig. 10, se describirá un método 500 para adquirir imágenes de objetos distribuidos dentro de una muestra fijada a una superficie de un portaobjetos. En particular, las imágenes se adquieren utilizando un escaneo volumétrico con un seguimiento de curva Z para una muestra que tiene una altura desigual con respecto a la superficie del portaobjetos y que tiene un espesor que excede la profundidad de campo de la óptica. En el primer paso 502 del método 500, se toman muestras de ubicaciones discretas en el portaobjetos de la muestra para determinar una altura de enfoque inicial (Z). A continuación, en el paso 504, se adquieren varias imágenes a lo largo de una primera porción lineal de la muestra utilizando la altura de enfoque inicial determinada en el paso 502 para cada zona de enfoque en la primera porción lineal. La altura de enfoque inicial permanece constante a lo largo de la primera porción lineal, lo que significa que la altura de la lente del objetivo con respecto a la superficie del portaobjetos es sustancialmente constante durante la adquisición de las imágenes en la primera porción lineal de la muestra en el paso 504. Cada fila, o porción lineal, de la muestra incluye una pluralidad de zonas de enfoque.

[0051] Por ejemplo, con referencia a la Fig. 5, cada cuadrado a lo largo de una porción lineal puede ser una zona de enfoque. Cada porción lineal que se va a escanear con el generador de imágenes puede incluir, por ejemplo, 30-70 zonas de enfoque. Alternativamente, en lugar de utilizar una altura de enfoque sustancialmente constante como en el paso 504, las ubicaciones discretas muestreadas en el paso 502 se pueden utilizar para determinar una curva z para la primera porción lineal, y las imágenes a lo largo de la primera porción lineal se pueden adquirir siguiendo esa curva z. Como tal, la lente del objetivo se mueve hacia arriba y hacia abajo a lo largo del eje z en relación con el portaobjetos de acuerdo con la curva z durante la adquisición de las imágenes a lo largo de la primera porción lineal.

[0052] A continuación, en el paso 506, para cada zona de enfoque en la porción lineal que se acaba de escanear, se determina el mejor enfoque evaluando si los objetos capturados en las imágenes están enfocados. La evaluación incluye determinar si los objetos desenfocados se encuentran en la muestra a una altura relativa a la superficie del portaobjetos que está fuera de un rango de enfoque de la lente objetivo. La evaluación también puede incluir la identificación de objetos desenfocados en función de sus ubicaciones relativas a lo largo de la porción lineal de la muestra. Es decir, para cada zona de enfoque a lo largo de la porción lineal, se evalúan las imágenes para determinar qué plano focal tiene el mejor enfoque. Como se muestra en la Fig. 7, utilizando la adquisición de imágenes con ángulo de inclinación, se capturan imágenes en 12 planos focales a la vez. Por ejemplo, si se descubre que el mejor enfoque está en el plano focal superior o inferior (plano focal 1 o 12), entonces puede ser necesario mover la posición del eje z de la lente objetivo con respecto al portaobjetos hacia arriba o hacia abajo, respectivamente, para obtener una imagen con un mejor enfoque. Además, si se descubre que el mejor enfoque está en el plano focal más superior o más inferior, entonces puede ser necesario mover la posición del eje z de la lente del objetivo con respecto al portaobjetos hacia arriba o hacia abajo, respectivamente, durante la adquisición de la imagen en la siguiente porción lineal adyacente de la muestra.

[0053] Si hay demasiados objetos fuera de foco (es decir, el número de objetos fuera de foco supera un número umbral predeterminado), se ajusta la altura de enfoque (Z) para cada uno de los objetos fuera de foco y se vuelve a escanear la porción lineal de acuerdo con la nueva curva de altura de enfoque en el paso 508. Cuando la cámara sigue una curva de altura de enfoque, la posición del eje z de la lente objetivo con respecto a la superficie del portaobjetos varía aumentando y/o disminuyendo una altura de la cámara con respecto a la superficie del portaobjetos en función de la ubicación relativa de la cámara a lo largo de la porción lineal de la muestra. La posición del eje z de la lente objetivo con respecto al portaobjetos puede cambiar de una zona de enfoque a la siguiente a lo largo de una porción lineal de la muestra. En una forma de realización, el portaobjetos 110 se mueve hacia arriba y hacia abajo mientras que la posición del eje z de la lente objetivo permanece estacionaria. En una forma de realización alternativa, la lente objetivo se mueve hacia arriba y hacia abajo mientras que la posición del eje z del portaobjetos permanece constante.

[0054] Si la mayoría o la totalidad de las zonas de enfoque están enfocadas, entonces, en el paso 510, los siguientes valores para cada zona de enfoque se calculan en función del mejor enfoque para cada zona de enfoque en la fila actual. Algunas de las zonas de enfoque para la siguiente fila pueden moverse hacia arriba (es decir, de modo que la posición z está más cerca del cubreobjetos y más lejos del portaobjetos de vidrio) para rastrear objetos de interés que estén más cerca del cubreobjetos, mientras que algunas de las zonas de enfoque pueden moverse hacia abajo para la siguiente fila para rastrear objetos de interés que estén más cerca del portaobjetos de vidrio. A continuación, en el paso 512, se escanea la siguiente porción lineal utilizando la curva de enfoque calculada en el paso 510. Los pasos 506-512 se repiten para cada porción lineal en la muestra hasta que se obtienen imágenes de toda la muestra. Es decir, después de que se adquieren imágenes para cada porción lineal de la muestra, se evalúa el enfoque de los objetos en esas imágenes (paso 506). En función de la evaluación, se determina una curva de enfoque para la siguiente porción lineal de la muestra (paso 510) y se utiliza para adquirir imágenes de objetos en la siguiente porción lineal (paso 512), que está directamente adyacente a la porción lineal que se acaba de escanear. Alternativamente, si la evaluación del enfoque revela que demasiados objetos están desenfocados, se ajusta la curva de enfoque y se escanea nuevamente la misma porción lineal utilizando la curva de enfoque ajustada (paso 508).

[0055] Aunque se han mostrado y descrito formas de realización particulares, se debe entender que la descripción anterior no pretende limitar el alcance de estas formas de realización, y que dicha divulgación se proporciona únicamente con fines explicativos e ilustrativos. Por lo tanto, se pueden realizar diversos cambios y modificaciones a las formas de realización divulgadas sin apartarse del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Método para adquirir imágenes de objetos (122) distribuidos dentro de una muestra (119) fijada a una superficie de un portaobjetos (102) utilizando una cámara (202) que tiene una lente objetivo (202) con un eje óptico (204) que forma un ángulo no ortogonal con la superficie del portaobjetos (102), teniendo la muestra (119) una altura desigual con respecto a la superficie del portaobjetos, comprendiendo el método:

adquirir una primera pluralidad de imágenes de una primera porción lineal de la muestra (119);

evaluar un enfoque de objetos (122) dentro de la primera porción lineal (130) de la muestra (119) capturada en la primera pluralidad de imágenes, incluyendo determinar si un número total de objetos desenfocados excede un número umbral y determinar una mejor altura de enfoque de la muestra (119) a lo largo de la primera porción lineal (130);

calcular una curva de altura de enfoque z (810) de la mejor altura de enfoque de la muestra (119) a lo largo de la primera porción lineal (130);

si el número total de objetos desenfocados en la primera pluralidad de imágenes excede el número umbral, entonces se vuelve a tomar imagen de la primera porción lineal (130) de la muestra (119) para adquirir una segunda pluralidad de imágenes, donde una altura de la lente objetivo con respecto a la superficie del portaobjetos varía durante la adquisición de la segunda pluralidad de imágenes en base a la curva de altura de enfoque z (810); y

si el número total de objetos desenfocados en la primera pluralidad de imágenes no excede el número umbral, entonces se adquiere una segunda pluralidad de imágenes de una segunda porción lineal (130) de la muestra (119) directamente adyacente a la primera porción lineal (130), donde una altura de la lente objetivo con respecto a la superficie del portaobjetos varía durante la adquisición de la segunda pluralidad de imágenes en base a la curva de altura de enfoque z (810).

2. Método según la reivindicación 1, donde la altura de la lente objetivo con respecto a la superficie del portaobjetos (102) es sustancialmente constante durante la adquisición de la primera pluralidad de imágenes.

3. Método según la reivindicación 1 o 2, donde evaluar el enfoque de los objetos capturados en la primera pluralidad de imágenes comprende determinar las alturas respectivas de los objetos desenfocados en relación con la superficie del portaobjetos.

4. Método según la reivindicación 3, donde evaluar el enfoque de los objetos en la primera pluralidad de imágenes comprende determinar si los respectivos objetos desenfocados están ubicados a una altura relativa a la superficie del portaobjetos que está fuera de un rango de enfoque de la lente objetivo durante la adquisición en la primera pluralidad de imágenes.

5. Método según la reivindicación 3 o 4, donde evaluar el enfoque de los objetos en la primera pluralidad de imágenes comprende determinar si los respectivos objetos desenfocados están ubicados a una altura relativa a la superficie del portaobjetos que es mayor que una altura máxima o menor que una altura mínima, respectivamente, de un rango de enfoque de la lente objetivo durante la adquisición en la primera pluralidad de imágenes.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde la evaluación del enfoque de los objetos en la primera pluralidad de imágenes incluye determinar las ubicaciones respectivas de los objetos desenfocados dentro de la primera porción lineal (130).

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde una o ambas de la cámara (202) y el portaobjetos (102) se mueven lateralmente con relación a la otra durante la adquisición de las imágenes.

8. Método según la reivindicación 7, donde la altura de la lente objetivo (202) con respecto a la superficie del portaobjetos se varía aumentando y/o disminuyendo una altura de la superficie del portaobjetos en relación a la cámara en función de una posición lineal de la cámara con respecto a una ubicación longitudinal de la porción lineal respectiva (130).

9. Método según la reivindicación 7, donde la altura de la lente objetivo (202) con respecto a la superficie del portaobjetos se varía aumentando y/o disminuyendo una altura de la cámara (202) con respecto a la superficie del portaobjetos en función de una posición lineal de la cámara (202) con respecto a una ubicación longitudinal de la primera o segunda porción lineal respectiva (130).

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde la segunda pluralidad de imágenes se adquiere de la segunda porción lineal, comprendiendo además el método

evaluar un enfoque de los objetos capturados en la segunda pluralidad de imágenes, incluyendo determinar si un número total de objetos desenfocados excede un número umbral y determinar una mejor altura de enfoque de la muestra (119) a lo largo de la siguiente porción lineal (130);

calcular una segunda curva de altura de enfoque z (810) de la mejor altura de enfoque de la muestra a lo largo de la segunda porción lineal (130); y

adquirir una tercera pluralidad de imágenes de una tercera porción lineal (130), estando la tercera porción lineal (130) directamente adyacente a la segunda porción lineal (130), donde una altura de la lente objetivo (202) con relación a la superficie del portaobjetos varía durante la adquisición de la tercera pluralidad de imágenes con base en la segunda curva de altura de enfoque z (810).

11. Sistema para adquirir imágenes de objetos (122) distribuidos dentro de una muestra (119) fijada a una superficie de un portaobjetos (102), teniendo la muestra (119) una altura desigual con respecto a la superficie del portaobjetos, comprendiendo el sistema:

una cámara (202) que tiene una lente objetivo (202) con un eje óptico (204), donde la cámara (202) está posicionada de tal manera que el eje óptico (204) forma un ángulo no ortogonal con la superficie del portaobjetos (102);

un procesador de imágenes acoplado operativamente con la cámara (202);caracterizado por el hecho de queel sistema está configurado para realizar el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.