ES3029080T3

ES3029080T3 - Neoantigen identification using hotspots

Info

Publication number: ES3029080T3
Application number: ES18866639T
Authority: ES
Inventors: Brendan Bulik-Sullivan; Thomas Boucher; Roman Yelensky
Original assignee: Seattle Project Corp
Current assignee: Seattle Project Corp
Priority date: 2017-10-10
Filing date: 2018-10-10
Publication date: 2025-06-23
Anticipated expiration: 2038-10-10
Also published as: WO2019075112A1; AU2018348165A1; US11264117B2; JP7712970B2; JP2020536553A; US20190279742A1; CA3078744A1; AU2025275134A1; EP3694532A1; KR20260039788A; IL326470A; CN111465989A; JP7227237B2; US20220148681A1; IL273799A; IL273799B1; KR20200087143A; TWI816702B; EP4576103A2; TW201923637A

Abstract

Un método para identificar neoantígenos con probabilidad de presentarse en la superficie de las células tumorales de un sujeto. Las secuencias peptídicas de neoantígenos tumorales se obtienen secuenciando las células tumorales del sujeto. La secuencia peptídica de cada neoantígeno se asocia con uno o más bloques k-mer de una pluralidad de bloques k-mer de los datos de secuenciación de nucleótidos del sujeto. Las secuencias peptídicas y los bloques k-mer asociados se introducen en un modelo de presentación con aprendizaje automático para generar probabilidades de presentación de los neoantígenos tumorales. Cada probabilidad de presentación representa la probabilidad de que un neoantígeno sea presentado por un alelo del MHC en la superficie de las células tumorales del sujeto. Se selecciona un subconjunto de neoantígenos en función de las probabilidades de presentación. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Identificación de neoantígenos utilizando regiones clave

Antecedentes

Las vacunas terapéuticas y la terapia con células T basadas en neoantígenos tumorales específicos son muy prometedoras como inmunoterapia personalizada del cáncer de nueva generación. 1 - 3 Los cánceres con una elevada carga mutacional, como el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) y el melanoma, son dianas especialmente atractivas para este tipo de terapia, dada la probabilidad relativamente mayor de generación de neoantígenos. 4,5 Las primeras pruebas demuestran que la vacunación basada en neoantígenos puede provocar respuestas de células T6 y que la terapia de células T dirigida a neoantígenos puede causar la regresión del tumor en determinadas circunstancias en pacientes seleccionados.7 Tanto el MHC de clase I como el MHC de clase II influyen en las respuestas de células T70-71.

Sin embargo, la identificación de neoantígenos y de células T que reconocen neoantígenos se ha convertido en un reto fundamental para evaluar las respuestas tumorales 77,110, examinar la evolución de los tumores111 y diseñar la próxima generación de terapias personalizadas112. Las técnicas actuales de identificación de neoantígenos son lentas y laboriosas 84,96, o bien insuficientemente precisas 87,91- 93. Aunque recientemente se ha demostrado que las células T que reconocen neoantígenos son un componente principal de las TIL84,96,113,114 y circulan en la sangre periférica de pacientes con cáncer107, los métodos actuales para identificar células T reactivas a neoantígenos presentan alguna combinación de las tres limitaciones siguientes: (1) se basan en muestras clínicas difíciles de obtener, como TIL97,98 o leucaféresis107 (2) requieren el cribado de bibliotecas de péptidos poco prácticas95 o (3) se basan en multímeros MHC, que en la práctica pueden estar disponibles sólo para un pequeño número de alelos MHC.

Además, se han propuesto métodos iniciales que incorporan el análisis basado en mutaciones mediante secuenciación de nueva generación, la expresión génica del ARN y la predicción de la afinidad de unión al MHC de los péptidos neoantígenos candidatos 8. Sin embargo, estos métodos propuestos pueden fallar a la hora de modelar la totalidad del proceso de generación de epítopos, que contiene muchas etapas (por ejemplo, transporte TAP, escisión proteasomal, unión MHC, transporte del complejo péptido-MHC a la superficie celular y/o reconocimiento TCR para MHC-I; endocitosis o autofagia, escisión a través de proteasas extracelulares o lisosomales (por ejemplo, catepsinas), competencia con el péptido CLIP para la unión HLA catalizada por HLA-DM, transporte del complejo péptido-MHC a la superficie celular y/o reconocimiento TCR para MHC-II) además de la expresión génica y la unión MHC9. Por consiguiente, es probable que los métodos existentes adolezcan de un valor predictivo positivo (VPP) reducido. (FIG. 1A)

De hecho, los análisis de los péptidos presentados por las células tumorales realizados por múltiples grupos han demostrado que <5 % de los péptidos que se predice que se presentarán utilizando la expresión génica y la afinidad de unión al MHC se pueden encontrar en el MHC de la superficie tumoral10,11 (FIG. 1B). Esta baja correlación entre la predicción de la unión y la presentación del MHC se vio reforzada por observaciones recientes sobre la falta de mejora de la exactitud predictiva de los neoantígenos de unión restringida para la respuesta a los inhibidores de puntos de control en comparación con el número de mutaciones por sí solo.12

Este bajo valor predictivo positivo (VPP) de los métodos existentes para predecir la presentación presenta un problema para el diseño de vacunas basadas en neoantígenos y para la terapia de células T basada en neoantígenos. Si las vacunas se diseñan utilizando predicciones con un VPP bajo, es poco probable que la mayoría de los pacientes reciban un neoantígeno terapéutico y aún menos probable que reciban más de uno (incluso suponiendo que todos los péptidos presentados sean inmunogénicos). Del mismo modo, si las células T terapéuticas se diseñan basándose en predicciones con un VPP bajo, es poco probable que la mayoría de los pacientes reciban células T que sean reactivas a los neoantígenos tumorales, y el coste en tiempo y recursos físicos de identificar los neoantígenos predictivos mediante técnicas de laboratorio posteriores a la predicción puede ser excesivamente elevado. Por lo tanto, es poco probable que la vacunación con neoantígenos y la terapia con células T con los métodos actuales tengan éxito en un número considerable de sujetos con tumores. (FIG. 1C)

Además, los enfoques anteriores generaron neoantígenos candidatos utilizando únicamente mutaciones de acción cis, y en gran medida no tuvieron en cuenta fuentes adicionales de neo-ORF, incluyendo mutaciones en factores de empalme, que se producen en múltiples tipos de tumores y conducen a un empalme aberrante de muchos genes13, y mutaciones que crean o eliminan sitios de escisión de proteasas.

Por último, los enfoques estándar para el análisis del genoma y el transcriptoma del tumor pueden pasar por alto mutaciones somáticas que dan lugar a neoantígenos candidatos debido a condiciones subóptimas en la construcción de bibliotecas, la captura del exoma y el transcriptoma, la secuenciación o el análisis de datos. Del mismo modo, los enfoques estándar de análisis tumorales pueden promover inadvertidamente artefactos de secuencia o polimorfismos de línea germinal como neoantígenos, lo que conduce a un uso ineficiente de la capacidad de la vacuna o al riesgo de autoinmunidad, respectivamente.

Estado de la técnica

El documento US2017/212984A1 divulga métodos para identificar neoantígenos de un tumor de un sujeto que probablemente se presenten en la superficie celular del tumor y/o que probablemente sean inmunogénicos a partir de secuencias peptídicas tumorales mediante aprendizaje automático. La publicación"Direct identification of clinically relevant neoepitopes presented on native human melanoma tissue by mass spectrometry" de Bassani-Sternberget al, NATURE COMMUNICATIONS, vol. 7, 21 de noviembre de 2016 (2016-11-21), divulga el uso de la espectrometría de masas para la identificación directa de neoepítopos.

Compendio

En el presente documento se describe un enfoque optimizado para identificar y seleccionar neoantígenos para vacunas personalizadas contra el cáncer, para terapia con células T, o para ambas cosas. En primer lugar, se abordan enfoques optimizados de análisis del exoma tumoral y del transcriptoma para la identificación de neoantígenos candidatos mediante secuenciación de nueva generación (NGS). Estos métodos se basan en enfoques estándar para el análisis de tumores NGS con el fin de garantizar el avance de los neoantígenos candidatos de mayor sensibilidad y especificidad, en todas las clases de alteración genómica. En segundo lugar, se presentan enfoques novedosos para la selección de neoantígenos de alto VPP con el fin de superar el problema de la especificidad y garantizar que los neoantígenos avanzados para la inclusión en vacunas y/o como dianas para la terapia de células T tengan más probabilidades de provocar inmunidad antitumoral. Estos enfoques incluyen, dependiendo de la realización, modelos de regresión estadística entrenada o de aprendizaje profundo no lineal que modelan conjuntamente los mapeos péptido-alelo, así como los motivos por alelo para péptidos de múltiples longitudes, compartiendo la fuerza estadística a través de péptidos de diferentes longitudes. Estos modelos de aprendizaje profundo también utilizan parámetros que describen la presencia o ausencia de regiones clave de presentación en bloques k-mer asociados a secuencias peptídicas para determinar la probabilidad de presentación de los péptidos. Los modelos de aprendizaje profundo no lineales en particular se pueden diseñar y entrenar para tratar diferentes alelos MHC en la misma célula como independientes, abordando así los problemas con los modelos lineales que los harían interferir entre sí. Por último, se abordan consideraciones adicionales para el diseño y la fabricación de vacunas personalizadas basadas en neoantígenos, y para la producción de células T personalizadas específicas de neoantígenos para la terapia con células T.

El modelo aquí descrito supera hasta en un orden de magnitud a los predictores más avanzados entrenados en afinidad de unión y a los primeros predictores basados en datos peptídicos de EM. Al predecir con mayor fiabilidad la presentación de los péptidos, el modelo permite una identificación más rápida y rentable de las células T específicas de antígenos neoantigénicos o tumorales para una terapia personalizada mediante un proceso clínicamente práctico que utiliza volúmenes limitados de sangre periférica del paciente, criba pocos péptidos por paciente y no depende necesariamente de los multímeros del MHC. Sin embargo, en otra realización, el modelo aquí divulgado puede utilizarse para permitir una identificación más rápida y rentable de células T específicas de antígenos tumorales utilizando multímeros MHC, disminuyendo el número de péptidos unidos a multímeros MHC que deben examinarse para identificar células T específicas de antígenos neoantígenos o tumorales

El rendimiento predictivo del modelo aquí descrito en el conjunto de datos de neoepítopos TIL y la tarea prospectiva de identificación de células T reactivas a neoantígenos demuestran que ahora es posible obtener predicciones de neoepítopos terapéuticamente útiles modelando el procesamiento y la presentación de HLA. En resumen, este trabajo ofrece una identificación práctica de antígenos in silico para la inmunoterapia dirigida a antígenos, acelerando así el progreso hacia la curación de los pacientes.

Breve descripción de las diversas vistas de los dibujos

Estas y otras características, aspectos y ventajas de la presente invención se entenderán mejor con respecto a la siguiente descripción y los dibujos adjuntos, donde:

La FIG. 1A muestra los enfoques clínicos actuales para la identificación de neoantígenos.

La FIG. 1B muestra que <5 % de los péptidos ligados previstos se presentan en las células tumorales.

La FIG. 1C muestra el impacto del problema de especificidad en la predicción de neoantígenos.

La FIG. 1D muestra que la predicción de la unión no es suficiente para la identificación del neoantígeno.

La FIG. 1E muestra la probabilidad de presentación del MHC-I en función de la longitud del péptido.

La FIG. 1F muestra un espectro peptídico de ejemplo generado a partir del estándar de rango dinámico de Promega.

La FIG. 1G muestra cómo la adición de características aumenta el valor predictivo positivo del modelo.

La FIG. 2A es una vista general de un entorno para identificar probabilidades de presentación de péptidos en pacientes, de acuerdo con una realización.

Las FIG. 2B y 2C ilustran un método de obtención de información de presentación, de acuerdo con una realización.

La FIG. 3 es un diagrama de bloques de alto nivel que ilustra los componentes lógicos informáticos del sistema de identificación de presentaciones, según una realización.

La FIG. 4 ilustra un ejemplo de conjunto de datos de entrenamiento, según una realización.

La FIG. 5 ilustra un ejemplo de modelo de red en asociación con un alelo MHC.

La FIG. 6A ilustra un ejemplo de modelo de red NNH() compartido por alelos MHC, según una realización. La FIG. 6B ilustra un ejemplo de modelo de red NNH() compartido por alelos MHC, según otra realización. La FIG. 7 ilustra la generación de una probabilidad de presentación para un péptido en asociación con un alelo MHC utilizando un modelo de red de ejemplo.

La FIG. 8 ilustra la generación de una probabilidad de presentación para un péptido en asociación con un alelo MHC utilizando modelos de red de ejemplo.

La FIG. 9 ilustra la generación de una probabilidad de presentación para un péptido en asociación con alelos MHC utilizando modelos de red de ejemplo.

La FIG. 10 ilustra la generación de una probabilidad de presentación para un péptido en asociación con alelos MHC utilizando modelos de red de ejemplo.

La FIG. 11 ilustra la generación de una probabilidad de presentación para un péptido en asociación con alelos MHC utilizando modelos de red de ejemplo.

La FIG. 12 ilustra la generación de una probabilidad de presentación para un péptido en asociación con alelos MHC utilizando modelos de red de ejemplo.

La FIG. 13A ilustra una distribución de frecuencias de muestra de la carga de mutaciones en pacientes con NSCLC.

La FIG. 13B ilustra el número de neoantígenos presentados en vacunas simuladas para pacientes seleccionados en base a un criterio de inclusión de si los pacientes satisfacen una carga mínima de mutación, de acuerdo con una realización.

La FIG. 13C compara el número de neoantígenos presentados en vacunas simuladas entre pacientes seleccionados asociados con vacunas que incluyen subconjuntos de tratamiento identificados basándose en modelos de presentación y pacientes seleccionados asociados con vacunas que incluyen subconjuntos de tratamiento identificados a través de modelos actuales de vanguardia, de acuerdo con una realización.

La FIG. 13D compara el número de neoantígenos presentados en vacunas simuladas entre pacientes seleccionados asociados con vacunas que incluyen subconjuntos de tratamiento identificados basándose en un único modelo de presentación por alelo para HLA-A*02:01 y pacientes seleccionados asociados con vacunas que incluyen subconjuntos de tratamiento identificados basándose en ambos modelos de presentación por alelo para HLA-A*02:01 y HLA-B*07:02. La capacidad de la vacuna se fija en v=20 epítopos, según una realización.

La FIG. 13E compara el número de neoantígenos presentados en vacunas simuladas entre pacientes seleccionados en función de la carga de mutación y pacientes seleccionados por puntuación de utilidad de expectativas, de acuerdo con una realización.

La FIG. 14 se comparan los valores predictivos positivos (VPP) con una recuperación del 40 % de diferentes versiones del modelo MS y enfoques anteriores para modelar péptidos29 presentados por HLA en tumores humanos, cuando cada modelo se prueba en el conjunto de pruebas que comprende cinco muestras de prueba retenidas diferentes, cada muestra de prueba comprende una muestra de tumor retenida con una proporción de 1:2500 de péptidos presentados y no presentados.

La FIG. 15A compara los valores medios de predicción positiva (VPP) a través de la recuperación de un modelo de presentación que utiliza parámetros de regiones clave de presentación y un modelo de presentación que no utiliza parámetros de regiones clave de presentación, cuando los modelos se prueban en cinco muestras de prueba retenidas.

La FIG. 15B compara las curvas de precisión y recuperación de un modelo de presentación que utiliza parámetros de regiones clave de presentación y un modelo de presentación que no utiliza parámetros de regiones clave de presentación, cuando los modelos se prueban con una muestra de prueba 0 retenida. La FIG. 15C compara las curvas de precisión y recuperación de un modelo de presentación que utiliza parámetros de regiones clave de presentación y un modelo de presentación que no utiliza parámetros de regiones clave de presentación, cuando los modelos se prueban con una muestra de prueba 1 retenida. La FIG. 15D compara las curvas de precisión y recuperación de un modelo de presentación que utiliza parámetros de regiones clave de presentación y un modelo de presentación que no utiliza parámetros de regiones clave de presentación, cuando los modelos se prueban con una muestra de prueba 2 retenida. La FIG. 15E compara las curvas de precisión y recuperación de un modelo de presentación que utiliza parámetros de regiones clave de presentación y un modelo de presentación que no utiliza parámetros de regiones clave de presentación, cuando los modelos se prueban con una muestra de prueba 3 retenida. La FIG. 15F compara las curvas de precisión y recuperación de un modelo de presentación que utiliza parámetros de regiones clave de presentación y un modelo de presentación que no utiliza parámetros de regiones clave de presentación, cuando los modelos se prueban con una muestra de prueba 4 retenida. La FIG. 16 compara la proporción de péptidos que abarcan mutaciones somáticas reconocidas por las células T para los 5, 10, 20 y 30 péptidos mejor clasificados identificados por un modelo de presentación que utiliza parámetros de regiones clave de presentación y por un modelo de presentación que no utiliza parámetros de regiones clave de presentación, para un conjunto de prueba que comprende muestras de prueba tomadas de pacientes con al menos una respuesta de células T preexistente.

La FIG. 17A muestra la detección de respuestas de células T a grupos de péptidos neoantígenos específicos de nueve pacientes.

La FIG. 17B muestra la detección de respuestas de células T a péptidos neoantígenos específicos individuales de cuatro pacientes.

La FIG. 17C muestra imágenes de ejemplo de los pocillos ELISpot del paciente CU04.

La FIG. 18A muestra los resultados de experimentos de control con neoantígenos en donantes sanos con HLA compatible.

La FIG. 18B muestra los resultados de experimentos de control con neoantígenos en donantes sanos con HLA compatible.

La FIG. 19 muestra la detección de respuestas de células T al control positivo de PHA para cada donante y cada expansión in vitro representada en la FIG. 17A.

La FIG. 20A muestra la detección de respuestas de células T a cada péptido neoantígeno individual específico del paciente en el grupo N.° 2 para el paciente CU04.

La FIG. 20B muestra la detección de respuestas de células T a péptidos neoantígenos individuales específicos del paciente para cada una de las tres visitas del paciente CU04 y para cada una de las dos visitas del paciente 1-024-002, ocurriendo cada visita en un punto temporal diferente.

La FIG. 20C muestra la detección de respuestas de células T a péptidos neoantígenos individuales específicos del paciente y de grupos de péptidos de neoantígenos específicos del paciente para cada una de las dos visitas del paciente CU04 y para cada una de las dos visitas del paciente 1-024-002, ocurriendo cada visita en un punto temporal diferente.

La FIG. 21 muestra la detección de respuestas de células T a los dos grupos de péptidos neoantígenos específicos del paciente y a los controles negativos de DMSO para los pacientes de la FIG. 17A.

La FIG. 22 compara el rendimiento predictivo de un modelo de presentación que utiliza parámetros de regiones clave de presentación con un modelo de presentación que no utiliza parámetros de regiones clave de presentación, al predecir la presentación de neoepítopos por moléculas MHC de clase II.

La FIG. 23 muestra un método para secuenciar TCR de células T de memoria neoantígeno-específicas de la sangre periférica de un paciente con NSCLC.

La FIG. 24 muestra modalidades ilustrativas de TCR para introducir un TCR en células receptoras.

La FIG. 25 muestra una secuencia ilustrativa de nucleótidos del esqueleto del constructo P526 para clonar TCR en sistemas de expresión para el desarrollo de terapias.

La FIG. 26 muestra una secuencia de construcción ilustrativa para la clonación del TCR neoantígeno-específico del paciente, TCR clonotipo 1 en sistemas de expresión para el desarrollo de terapias.

La FIG. 27 muestra una secuencia de construcción ilustrativa para la clonación del TCR neoantígeno-específico del paciente, clonotipo 3 en sistemas de expresión para el desarrollo de terapias.

La FIG. 28 es un diagrama de flujo de un método para proporcionar un tratamiento neoantígeno-específico personalizado a un paciente, de acuerdo con una realización.

La FIG. 29 ilustra un ejemplo de ordenador para implementar las entidades mostradas en las FIGS. 1 y 3. Descripción detallada

I. Definiciones

En general, los términos utilizados en las reivindicaciones y en la memoria descriptiva deben interpretarse en el sentido en que los entiende una persona con conocimientos técnicos ordinarios. A continuación se definen algunos términos para mayor claridad. En caso de conflicto entre el significado simple y las definiciones proporcionadas, se utilizarán las definiciones proporcionadas.

Tal y como se utiliza en el presente, el término "antígeno" es una sustancia que induce una respuesta inmunitaria.

Tal como se utiliza en el presente, el término "neoantígeno" es un antígeno que tiene al menos una alteración que lo hace distinto del antígeno parental de tipo salvaje correspondiente, por ejemplo, mediante una mutación en una célula tumoral o una modificación postraduccional específica de una célula tumoral. Un neoantígeno puede incluir una secuencia polipeptídica o una secuencia nucleotídica. Una mutación puede incluir una indelación con o sin cambio de marco, una sustitución con cambio de sentido o sin sentido, una alteración del sitio de empalme, un reordenamiento genómico o una fusión génica, o cualquier alteración genómica o de expresión que dé lugar a un neoORF. Una mutación también puede incluir una variante de empalme. Las modificaciones postraduccionales específicas de una célula tumoral pueden incluir la fosforilación aberrante. Las modificaciones postraduccionales específicas de una célula tumoral también pueden incluir un antígeno empalmado generado por el proteasoma. Véase Liepe et al., A large fraction of HLA class I ligands are proteasome-generated spliced peptides; Science. 2016 Oct 21;354(6310):354-358.

Tal como se utiliza en el presente, el término "neoantígeno tumoral" es un neoantígeno presente en la célula o tejido tumoral de un sujeto, pero no en la célula o tejido normal correspondiente del sujeto.

Como se utiliza en el presente, el término "vacuna basada en neoantígenos" es una construcción de vacuna basada en uno o más neoantígenos, por ejemplo, una pluralidad de neoantígenos.

Como se utiliza en el presente, el término "neoantígeno candidato" es una mutación u otra aberración que da lugar a una nueva secuencia que puede representar un neoantígeno.

Como se utiliza en el presente, el término "región codificante" es la o las porciones de un gen que codifican proteínas.

Como se utiliza en el presente, el término "mutación codificante" es una mutación que se produce en una región codificante.

Como se utiliza en el presente, el término "ORF" significa marco abierto de lectura.

Como se utiliza en el presente, el término "NEO-ORF" es un ORF específico de un tumor que surge de una mutación u otra aberración como el empalme.

Como se utiliza en el presente, el término "mutación con cambio de sentido" es una mutación que causa una sustitución de un aminoácido por otro.

Como se utiliza en el presente, el término "mutación sin sentido" es una mutación que causa una sustitución de un aminoácido por un codón de terminación.

Como se utiliza en el presente, el término "mutación de cambio de marco" es una mutación que causa un cambio en el marco de la proteína.

Como se utiliza en el presente, el término "indel" es una inserción o deleción de uno o más ácidos nucleicos.

Como se usa en el presente, la expresión porcentaje de "identidad", en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que tienen un porcentaje específico de nucleótidos o residuos de aminoácidos que son iguales, cuando se comparan y alinean para lograr la máxima correspondencia, medida utilizando uno de los algoritmos de comparación de secuencias que se describen a continuación (por ejemplo, BLASTP y BLASTN u otros algoritmos disponibles para personas del oficio de nivel medio) o mediante inspección visual. Dependiendo de la aplicación, el porcentaje de «identidad» puede existir en una región de la secuencia que se está comparando, por ejemplo, en un dominio funcional, o, alternativamente, existir en toda la longitud de las dos secuencias que se van a comparar.

Para la comparación de secuencias, una secuencia actúa por lo general como secuencia de referencia y las secuencias de prueba se comparan con esta. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, se ingresan secuencias de prueba y referencia en un ordenador, se designan coordenadas de subsecuencia, de ser necesario, y se designan los parámetros del programa de algoritmo de secuencias. El algoritmo de comparación de secuencias luego calcula el porcentaje de identidad de secuencia de las secuencias de prueba con respecto a la secuencia de referencia, en función de los parámetros de programa designados. Alternativamente, la similitud o disimilitud de secuencias puede establecerse por la presencia o ausencia combinada de determinados nucleótidos o, en el caso de secuencias traducidas, aminoácidos en posiciones de secuencia seleccionadas (por ejemplo, motivos de secuencia).

Se puede realizar la alineación óptima de secuencias para la comparación, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), por el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), por el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. EE. UU. 85:2444 (1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), o mediante inspección visual (ver en general Ausubel et al., infra).

Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y similitud de secuencia es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). El software para llevar a cabo los análisis con BLAST se encuentra disponible al público a través del National Center for Biotechnology Information.

Como se utiliza en el presente documento, el término "no detenida o de lectura" es una mutación que provoca la eliminación del codón de parada natural.

Como se utiliza en el presente, el término "epítopo" es la porción específica de un antígeno típicamente unido por un anticuerpo o receptor de células T.

Como se utiliza en el presente, el término "inmunogénico" es la capacidad de provocar una respuesta inmunitaria, por ejemplo, a través de células T, células B o ambas.

Como se utiliza en el presente, el término "afinidad de unión HLA»« afinidad de unión MHC" significa afinidad de unión entre un antígeno específico y un alelo MHC específico.

Como se utiliza en el presente, el término "cebo" es una sonda de ácido nucleico utilizada para enriquecer una secuencia específica de ADN o ARN de una muestra.

Como se utiliza en el presente, el término "variante" es una diferencia entre los ácidos nucleicos de un sujeto y el genoma humano de referencia utilizado como control.

Como se utiliza en el presente, el término "llamada de variante" es una determinación algorítmica de la presencia de una variante, normalmente a partir de la secuenciación.

Como se utiliza en el presente, el término "polimorfismo" es una variante de la línea germinal, es decir, una variante que se encuentra en todas las células portadoras de ADN de un individuo.

Como se utiliza en el presente, el término "variante somática" es una variante que surge en células no germinales de un individuo.

Como se utiliza en el presente, el término "alelo" es una versión de un gen o una versión de una secuencia genética o una versión de una proteína.

Como se utiliza en el presente, el término "tipo HLA" es el complemento de los alelos del gen HLA.

Como se utiliza en el presente, el término "descomposición mediada por sinsentido" o "NMD" es la degradación de un ARNm por una célula debido a un codón de parada prematuro.

Como se utiliza en el presente, el término "mutación troncal" es una mutación que se origina al principio del desarrollo de un tumor y está presente en una parte sustancial de las células del tumor.

Como se utiliza en el presente, el término "mutación subclonal" es una mutación que se origina más tarde en el desarrollo de un tumor y está presente sólo en un subconjunto de las células del tumor.

Como se utiliza en el presente, el término "exoma" es un subconjunto del genoma que codifica proteínas. Un exoma puede ser el conjunto de exones de un genoma.

Como se utiliza en el presente, el término "regresión logística" es un modelo de regresión para datos estadísticos binarios en el que el logit de la probabilidad de que la variable dependiente sea igual a uno se modela como una función lineal de las variables dependientes.

Como se utiliza en el presente, el término "red neuronal" es un modelo de aprendizaje automático para la clasificación o la regresión que consiste en múltiples capas de transformaciones lineales seguidas de no linealidades a nivel de elemento, normalmente entrenadas mediante descenso de gradiente estocástico y retropropagación.

Como se utiliza en el presente, el término "proteoma" es el conjunto de todas las proteínas expresadas y/o traducidas por una célula, grupo de células o individuo.

Como se utiliza en el presente, el término "peptidoma" es el conjunto de todos los péptidos presentados por MHC-I o MHC-II en la superficie celular. El peptidoma puede referirse a una propiedad de una célula o de un conjunto de células (por ejemplo, el peptidoma tumoral, es decir, la unión de los peptidomas de todas las células que componen el tumor).

El término "ELISPOT" significa Ensayo inmunoabsorbente enzimático puntual por sus siglas en inglés, que es un método común para monitorear las respuestas inmunitarias en humanos y animales.

Como se utiliza en el presente, el término "dextrámeros" se refiere a los multímeros de péptido-MHC basados en dextrano utilizados para la tinción de células T antígeno-específicas en citometría de flujo.

Como se utiliza en el presente, el término "multímeros MHC" es un complejo péptido-MHC que comprende múltiples unidades monoméricas péptido-MHC.

Como se utiliza en el presente, el término "tetrámeros MHC" es un complejo péptido-MHC que comprende cuatro unidades monoméricas péptido-MHC.

Como se utiliza en el presente, el término "tolerancia o tolerancia inmunitaria" es un estado de no respuesta inmunitaria a uno o más antígenos, por ejemplo, autoantígenos.

Como se utiliza aquí, el término "tolerancia central" es una tolerancia afectada en el timo, ya sea mediante la eliminación de clones de células T autorreactivas o mediante la promoción de clones de células T autorreactivas para que se diferencien en células T reguladoras inmunosupresoras (Tregs).

Como se utiliza en el presente, el término "tolerancia periférica" es una tolerancia que se ve afectada en la periferia por la regulación a la baja o la anergización de las células T autorreactivas que sobreviven a la tolerancia central o la promoción de estas células T para que se diferencien en Tregs.

El término "muestra" puede incluir una sola célula o múltiples células o fragmentos de células o una alícuota de fluido corporal, tomada de un sujeto, por medios que incluyen venopunción, excreción, eyaculación, masaje, biopsia, aspirado con aguja, muestra de lavado, raspado, incisión quirúrgica o intervención u otros medios conocidos en la técnica.

El término "sujeto" abarca una célula, tejido u organismo, humano o no humano, ya sea in vivo, ex vivo o in vitro, masculino o femenino. El término sujeto incluye a los mamíferos, incluido el ser humano.

El término "mamífero" abarca seres humanos y no humanos e incluye, entre otros, seres humanos, primates no humanos, animales caninos, felinos, murinos, bovinos equinos y porcinos.

El término "factor clínico" se refiere a una medida de una afección de un sujeto, por ejemplo, la actividad o gravedad de una enfermedad. "Factor clínico" engloba todos los marcadores del estado de salud de un sujeto, incluidos los marcadores ajenos a la muestra, y/u otras características de un sujeto, como, entre otros, la edad y el sexo. Un factor clínico puede ser una puntuación, un valor o un conjunto de valores que pueden obtenerse a partir de la evaluación de una muestra (o población de muestras) de un sujeto o de un sujeto en unas condiciones determinadas. Un factor clínico también puede predecirse mediante marcadores y/u otros parámetros como los sustitutos de la expresión génica. Los factores clínicos pueden incluir el tipo de tumor, el subtipo de tumor y los antecedentes de tabaquismo.

Abreviaturas: MHC: complejo de histocompatibilidad mayor; HLA: antígeno leucocitario humano, o locus del gen MHC humano; NGS: secuenciación de próxima generación;; VPP: Valor predictivo positivo; TSNA: neoantígeno tumor-específico; FFPE: fijados con formalina e incluidos en parafina; NMD: desintegración mediada por el sinsentido; NSCLC: cáncer de pulmón de células no pequeñas; CD: célula dendrítica.

Se debe señalar que, tal como se usan en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen las formas plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

Los términos que no se definan directamente en el presente documento tendrán el significado que se les atribuye comúnmente en la técnica de la invención. Determinados términos se discuten en el presente para proporcionar orientación adicional al profesional en la descripción de las composiciones, dispositivos, métodos y similares de aspectos de la invención, y cómo hacerlos o usarlos. Se comprenderá que lo mismo puede decirse de más de una manera. Por lo tanto, se puede utilizar un lenguaje alternativo y sinónimos para uno o más de los términos aquí tratados. No debe atribuirse ninguna importancia al hecho de que un término se elabore o discuta en este documento. Se proporcionan algunos sinónimos o métodos, materiales y similares sustituibles. La mención de uno o varios sinónimos o equivalentes no excluye el uso de otros sinónimos o equivalentes, a menos que se indique explícitamente. El uso de ejemplos, incluidos los ejemplos de términos, tiene únicamente fines ilustrativos y no limita el alcance y el significado de los aspectos de la invención aquí expuestos.

II. Métodos de identificación de neoantígenos

En el presente documento se describen métodos para identificar neoantígenos de células tumorales de un sujeto que es probable que se presenten en una superficie de las células tumorales. El método incluye la obtención de datos de secuenciación de nucleótidos del exoma, transcriptoma y/o genoma completo de las células tumorales así como de las células normales del sujeto. Estos datos de secuenciación de nucleótidos se utilizan para obtener una secuencia peptídica de cada neoantígeno en un conjunto de neoantígenos. El conjunto de neoantígenos se identifica comparando los datos de secuenciación de nucleótidos de las células tumorales y los datos de secuenciación de nucleótidos de las células normales. Específicamente, la secuencia peptídica de cada neoantígeno del conjunto de neoantígenos comprende al menos una alteración que la hace distinta de la correspondiente secuencia peptídica de tipo salvaje identificada a partir de las células normales del sujeto. El método incluye además la codificación de la secuencia peptídica de cada neoantígeno del conjunto de neoantígenos en un vector numérico correspondiente. Cada vector numérico incluye información que describe los aminoácidos que componen la secuencia peptídica y las posiciones de los aminoácidos en la secuencia peptídica. El método comprende además asociar la secuencia peptídica de cada uno de los neoantígenos con uno o más bloques k-mer de una pluralidad de bloques k-mer de los datos de secuenciación nucleotídica del sujeto;. El método comprende además la introducción de los vectores numéricos y los bloques k-mer asociados en un modelo de presentación de aprendizaje automático para generar una probabilidad de presentación para cada neoantígeno del conjunto de neoantígenos. Cada probabilidad de presentación representa la probabilidad de que el neoantígeno correspondiente sea presentado por alelos MHC en la superficie de las células tumorales del sujeto El modelo de presentación de aprendizaje automático comprende una pluralidad de parámetros y una función. La pluralidad de parámetros se identifica basándose en un conjunto de datos de entrenamiento. El conjunto de datos de entrenamiento comprende, para cada muestra de una pluralidad de muestras, una etiqueta obtenida por espectrometría de masas que mide la presencia de péptidos unidos a al menos un alelo del MHC de un conjunto de alelos del MHC identificados como presentes en la muestra, secuencias peptídicas de entrenamiento codificadas como vectores numéricos que incluyen información que describe los aminoácidos que componen los péptidos y las posiciones de los aminoácidos en los péptidos, y, para cada una de las secuencias peptídicas de entrenamiento de la muestra, asociaciones entre la secuencia peptídica de entrenamiento y uno o más bloques k-mer de una pluralidad de bloques k-mer de los datos de secuenciación de nucleótidos de las secuencias peptídicas de entrenamiento. La función representa una relación entre el vector numérico y los bloques k-mer asociados recibidos como entrada por el modelo de presentación de aprendizaje automático y la probabilidad de presentación generada como salida por el modelo de presentación de aprendizaje automático basado en el vector numérico, los bloques k-mer asociados y la pluralidad de parámetros. El método incluye además seleccionar un subconjunto del conjunto de neoantígenos, basándose en las probabilidades de presentación, para generar un conjunto de neoantígenos seleccionados, y devolver el conjunto de neoantígenos seleccionados.

En algunas realizaciones, la introducción del vector numérico en el modelo de presentación de aprendizaje automático comprende la aplicación del modelo de presentación de aprendizaje automático a la secuencia peptídica del neoantígeno para generar una puntuación de dependencia para cada uno de los alelos MHC. La puntuación de dependencia para un alelo MHC indica si el alelo MHC presentará el neoantígeno, basándose en los aminoácidos particulares en las posiciones particulares de la secuencia peptídica. En otras realizaciones, la introducción del vector numérico en el modelo de presentación de aprendizaje automático comprende además la transformación de las puntuaciones de dependencia para generar una probabilidad por alelo correspondiente para cada alelo MHC que indica una probabilidad de que el alelo MHC correspondiente presente el neoantígeno correspondiente, y la combinación de las probabilidades por alelo para generar la probabilidad de presentación del neoantígeno. En algunas realizaciones, la transformación de las puntuaciones de dependencia modela la presentación del neoantígeno como mutuamente excluyente a través de los alelos MHC. En realizaciones alternativas, la introducción del vector numérico en el modelo de presentación de aprendizaje automático comprende además la transformación de una combinación de las puntuaciones de dependencia para generar la probabilidad de presentación. En tales realizaciones, la transformación de la combinación de las puntuaciones de dependencia modela la presentación del neoantígeno como interferente entre los alelos del MHC.

En algunas realizaciones, el conjunto de probabilidades de presentación se identifica además por una o más características de no interacción alélica. En tales realizaciones, el método comprende además aplicar el modelo de presentación de aprendizaje automático a los rasgos alélicos que no interactúan para generar una puntuación de dependencia para los rasgos alélicos que no interactúan. La puntuación de dependencia indica si la secuencia peptídica del neoantígeno correspondiente se presentará en función de las características de no interacción del alelo. En algunas realizaciones, la una o más características de no interacción alélica comprende los valores que indican uno de presencia o ausencia de una región clave de presentación para cada bloque k-mer de la secuencia peptídica de cada neoantígeno.

En algunas realizaciones, el método comprende además combinar la puntuación de dependencia para cada alelo MHC con la puntuación de dependencia para las características de no interacción del alelo, transformar la puntuación de dependencia combinada para cada alelo MHC para generar una probabilidad por alelo para cada alelo MHC, y combinar las probabilidades por alelo para generar la probabilidad de presentación. La probabilidad por alelo de un alelo del MHC indica la probabilidad de que el alelo del MHC presente el neoantígeno correspondiente. En realizaciones alternativas, el método comprende además combinar las puntuaciones de dependencia para los alelos MHC y la puntuación de dependencia para las características de no interacción de los alelos, y transformar las puntuaciones de dependencia combinadas para generar la probabilidad de presentación.

En algunas realizaciones, los alelos MHC incluyen dos o más alelos MHC diferentes.

En algunas realizaciones, las secuencias peptídicas comprenden secuencias peptídicas que tienen longitudes distintas de 9 aminoácidos.

En algunas realizaciones, la codificación de la secuencia peptídica comprende codificar la secuencia peptídica utilizando un esquema de codificación de un solo punto.

En algunas realizaciones, la pluralidad de muestras comprende al menos una de líneas celulares diseñadas para expresar un único alelo MHC, líneas celulares diseñadas para expresar una pluralidad de alelos MHC, líneas celulares humanas obtenidas o derivadas de una pluralidad de pacientes, muestras tumorales frescas o congeladas obtenidas de una pluralidad de pacientes, y muestras de tejido frescas o congeladas obtenidas de una pluralidad de pacientes.

En algunas realizaciones, el conjunto de datos de entrenamiento comprende además al menos uno de los datos asociados con mediciones de afinidad de unión péptido-MHC para al menos uno de los péptidos, y datos asociados con mediciones de estabilidad de unión péptido-MHC para al menos uno de los péptidos.

En algunas realizaciones, el conjunto de probabilidades de presentación se identifica además por los niveles de expresión de los alelos MHC en el sujeto, medidos por ARN-seq o espectrometría de masas.

En algunas modalidades, el conjunto de similitudes de presentación se identifican además mediante características que comprenden al menos una afinidad prevista entre un neoantígeno en el conjunto de neoantígenos y los alelos MHC, y la estabilidad prevista del complejo de péptido-MHC codificado.

En algunas realizaciones, el conjunto de probabilidades numéricas se identifica además por características que comprenden al menos una de las secuencias C-terminal que flanquean la secuencia peptídica codificada con neoantígeno dentro de su secuencia proteica de origen, y las secuencias N-terminal que flanquean la secuencia peptídica codificada con neoantígeno dentro de su secuencia proteica de origen.

En algunas realizaciones, la selección del conjunto de neoantígenos seleccionados comprende la selección de neoantígenos que tienen una mayor probabilidad de presentarse en la superficie de la célula tumoral en relación con los neoantígenos no seleccionados, basándose en el modelo de presentación aprendido por la máquina.

En algunas realizaciones, la selección del conjunto de neoantígenos seleccionados comprende la selección de neoantígenos que tienen una mayor probabilidad de ser capaces de inducir una respuesta inmunitaria específica del tumor en el sujeto en relación con los neoantígenos no seleccionados, basándose en el modelo de presentación de aprendizaje automático.

En algunas realizaciones, la selección del conjunto de neoantígenos seleccionados comprende la selección de neoantígenos que tienen una mayor probabilidad de ser capaces de ser presentados a células T ingenuas por células presentadoras de antígenos (APC) profesionales en relación con neoantígenos no seleccionados, basándose en el modelo de presentación. En tales realizaciones, la APC es opcionalmente una célula dendrítica (DC).

En algunas realizaciones, la selección del conjunto de neoantígenos seleccionados comprende la selección de neoantígenos que tienen una menor probabilidad de ser objeto de inhibición a través de la tolerancia central o periférica en relación con los neoantígenos no seleccionados, basándose en el modelo de presentación de aprendizaje automático.

En algunas realizaciones, la selección del conjunto de neoantígenos seleccionados comprende la selección de neoantígenos que tienen una menor probabilidad de ser capaces de inducir una respuesta autoinmune al tejido normal en el sujeto en relación con los neoantígenos no seleccionados, basándose en el modelo de presentación de aprendizaje automático.

En algunas realizaciones, la una o más células tumorales se seleccionan del grupo que consiste en: cáncer de pulmón, melanoma, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de riñón, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer testicular, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de páncreas, cáncer cerebral, linfoma de células B, leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, leucemia linfocítica crónica y leucemia linfocítica de células T, cáncer de pulmón de células no pequeñas y cáncer de pulmón de células pequeñas.

En algunas realizaciones, el método comprende además generar un resultado para construir una vacuna personalizada contra el cáncer a partir del conjunto de neoantígenos seleccionados. En tales realizaciones, la salida para la vacuna personalizada contra el cáncer puede comprender al menos una secuencia peptídica o al menos una secuencia nucleotídica que codifica el conjunto de neoantígenos seleccionados.

En algunas realizaciones, el modelo de presentación de aprendizaje automático es un modelo de red neuronal. En tales realizaciones, el modelo de red neuronal puede incluir una pluralidad de modelos de red para los alelos MHC, cada modelo de red asignado a un alelo<m>H<c>correspondiente de los alelos MHC e incluyendo una serie de nodos dispuestos en una o más capas. En tales realizaciones, el modelo de red neuronal puede entrenarse actualizando los parámetros del modelo de red neuronal, actualizándose conjuntamente los parámetros de al menos dos modelos de red para al menos una iteración de entrenamiento. En algunas realizaciones, el modelo de presentación de aprendizaje automático puede ser un modelo de aprendizaje profundo que incluye una o más capas de nodos.

En algunas realizaciones, los alelos MHC son alelos MHC de clase I.

También se divulgan aquí sistemas informáticos que comprenden un procesador informático y una memoria que almacena instrucciones de programas informáticos. Cuando las instrucciones del programa informático son ejecutadas por el procesador del ordenador, las instrucciones hacen que el procesador del ordenador lleve a cabo cualquiera de los métodos discutidos anteriormente.....

III. Identificación de mutaciones tumorales específicas en neoantígenos

También se divulgan aquí métodos para la identificación de ciertas mutaciones (por ejemplo, las variantes o alelos que están presentes en las células cancerosas). En particular, estas mutaciones pueden estar presentes en el genoma, transcriptoma, proteoma o exorna de las células cancerosas de un sujeto con cáncer, pero no en el tejido normal del sujeto.

Las mutaciones genéticas en los tumores pueden considerarse útiles para la orientación inmunológica de los tumores si dan lugar a cambios en la secuencia de aminoácidos de una proteína exclusiva del tumor. Las mutaciones útiles incluyen: (1) mutaciones no sinónimas que dan lugar a aminoácidos diferentes en la proteína; (2) mutaciones de lectura en las que se modifica o elimina un codón de terminación, lo que da lugar a la traducción de una proteína más larga con una nueva secuencia específica del tumor en el extremo C; (3) mutaciones en el sitio de empalme que conducen a la inclusión de un intrón en el ARNm maduro y, por tanto, a una secuencia de proteína específica del tumor única; (4) reordenamientos cromosómicos que dan lugar a una proteína quimérica con secuencias específicas del tumor en la unión de 2 proteínas (es decir, fusión de genes); (5) mutaciones o deleciones de cambio de marco que dan lugar a un nuevo marco abierto de lectura con una nueva secuencia proteica específica del tumor. Las mutaciones también pueden incluir uno o más indel sin cambio de marco, una sustitución con cambio de sentido o sin sentido, una alteración del sitio de empalme, un reordenamiento genómico o una fusión génica, o cualquier alteración genómica o de expresión que dé lugar un neoORF.

Los péptidos con mutaciones o polipéptidos mutados que surgen, por ejemplo, de mutaciones en el lugar de empalme, cambios de marco, cambios de lectura o fusión de genes en células tumorales pueden identificarse secuenciando ADN, ARN o proteínas en células tumorales frente a células normales.

También las mutaciones pueden incluir mutaciones tumorales específicas previamente identificadas. Las mutaciones tumorales conocidas pueden consultarse en la base de datos Catalogue of Somatic Mutations in Cancer (COSMIC).

Existen diversos métodos para detectar la presencia de una mutación o alelo concreto en el ADN o ARN de un individuo. Los avances en este campo han proporcionado un genotipado SNP a gran escala preciso, fácil y barato. Por ejemplo, varias técnicas se han descrito incluyendo hibridización dinámica específico del alelo (DASH), electroforesis en gel diagonal de matrices de microplacas (MADGE), pirosecuenciación, ligadura específica de oligonucleótidos, el sistema TaqMan, así como diversas tecnologías de "chip" de ADN, como los chips SNP de Affymetrix. Estos métodos utilizan la amplificación de una región genética diana, normalmente mediante PCR. Aún otros métodos, basados en la generación de pequeñas moléculas de señalización mediante escisión invasiva seguida de espectrometría de masas o sondas de candado inmovilizadas y amplificación por círculo rodante. A continuación se resumen varios de los métodos conocidos en la técnica para detectar mutaciones específicas.

Los medios de detección basados en la PCR pueden incluir la amplificación multiplex de una pluralidad de marcadores simultáneamente. Por ejemplo, es bien conocido en la técnica seleccionar cebadores de PCR para generar productos de PCR que no se solapen en tamaño y puedan analizarse simultáneamente. Alternativamente, es posible amplificar diferentes marcadores con cebadores que estén marcados diferencialmente y, por tanto, cada uno de ellos pueda ser detectado diferencialmente. Por supuesto, los medios de detección basados en la hibridación permiten la detección diferencial de múltiples productos PCR en una muestra. Se conocen otras técnicas que permiten realizar análisis multiplex de una pluralidad de marcadores.

Se han desarrollado varios métodos para facilitar el análisis de polimorfismos de un solo nucleótido en el ADN genómico o el ARN celular. Por ejemplo, se puede detectar un polimorfismo de una sola base utilizando un nucleótido especializado resistente a la exonucleasa, como se describe, por ejemplo, en Mundy, C. R.(patente estadounidense N.° 4,656,127). Según el método, se permite que un cebador complementario a la secuencia alélica inmediatamente 3' al sitio polimórfico se hibride a una molécula diana obtenida de un animal o humano en particular. Si el sitio polimórfico de la molécula diana contiene un nucleótido complementario al derivado nucleotídico particular resistente a la exonucleasa presente, dicho derivado se incorporará al extremo del cebador hibridado. Dicha incorporación hace que el cebador sea resistente a la exonucleasa, permitiendo así su detección. Dado que se conoce la identidad del derivado de la muestra resistente a las exonucleasas, la comprobación de que el cebador se ha vuelto resistente a las exonucleasas revela que el nucleótido o nucleótidos presentes en el sitio polimórfico de la molécula diana son complementarios a los del derivado nucleotídico utilizado en la reacción. Este método tiene la ventaja de que no requiere la determinación de grandes cantidades de datos de secuencias extrañas.

Se puede utilizar un método basado en la solución para determinar la identidad de un nucleótido de un sitio polimórfico. Cohen, D. et al. (Patente francesa 2,650,840; Solicitud PCT N.° WO91/02087). Como en el método Mundy de la patente estadounidense N.° 4.656.127, se emplea un cebador que es complementario a secuencias alélicas inmediatamente 3' a un sitio polimórfico. El método determina la identidad del nucleótido de ese sitio utilizando derivados de dideoxinucleótidos marcados que, si son complementarios al nucleótido del sitio polimórfico, se incorporarán a la terminación del cebador. En Goelet, P. et al. se describe un método alternativo, conocido como análisis genético de bits o GBA. (Solicitud PCT N.° 92/15712). El método de Goelet, P. et al. utiliza mezclas de terminadores marcados y un cebador complementario a la secuencia 3' de un sitio polimórfico. De este modo, el terminador marcado que se incorpora está determinado por, y es complementario a, el nucleótido presente en el sitio polimórfico de la molécula diana que se está evaluando. A diferencia del método de Cohen et al. (Patente francesa 2,650,840; Solicitud PCT N.° WO91/02087) el método de Goelet, P. et al. puede ser un ensayo en fase heterogénea, en el que el cebador o la molécula diana se inmovilizan en una fase sólida.

Se han descrito varios procedimientos de incorporación de nucleótidos guiados por cebadores para analizar sitios polimórficos en el ADN (Komher, J. S. et al., Nucl. Acids. Res. 17:7779-7784 (1989); Sokolov, B. P., Nucl. Acids Res. 18:3671 (1990); Syvanen, A.-C., et al., Genomics 8:684-692 (1990); Kuppuswamy, M. N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (Estados Unidos) 88:1143-1147 (1991); Prezant, T. R. et al., Hum. Mutat. 1:159-164 (1992); Ugozzoli, L. et al., GATA 9:107-112 (1992); Nyren, P. et al., Anal. Biochem. 208:171-175 (1993)). Estos métodos difieren de la GBA en que utilizan la incorporación de desoxinucleótidos marcados para discriminar entre bases en un sitio polimórfico. En un formato de este tipo, dado que la señal es proporcional al número de desoxinucleótidos incorporados, los polimorfismos que se producen en series del mismo nucleótido pueden dar lugar a señales proporcionales a la longitud de la serie (Syvanen, A.-C., et al., Amer. J. Hum. Genet. 52:46-59 (1993)).

Varias iniciativas obtienen información de secuencias directamente de millones de moléculas individuales de ADN o ARN en paralelo. Las tecnologías de secuenciación por síntesis de una sola molécula en tiempo real se basan en la detección de nucleótidos fluorescentes a medida que se incorporan a una cadena naciente de ADN que es complementaria a la plantilla que se está secuenciando. En un método, los oligonucleótidos de 30-50 bases de longitud se anclan covalentemente en el extremo 5' a cubreobjetos de vidrio. Estos filamentos anclados cumplen dos funciones. En primer lugar, actúan como sitios de captura para las cadenas molde diana si las plantillas están configuradas con colas de captura complementarias a los oligonucleótidos unidos a la superficie. También actúan como cebadores para la extensión de cebadores dirigida a la plantilla que constituye la base de la lectura de secuencias. Los cebadores de captura funcionan como un sitio de posición fija para la determinación de la secuencia utilizando múltiples ciclos de síntesis, detección y escisión química del coloranteligante para eliminar el colorante. Cada ciclo consiste en la adición de la mezcla de polimerasa/nucleótido marcado, el lavado, la obtención de imágenes y la separación del colorante. En un método alternativo, la polimerasa se modifica con una molécula donante fluorescente y se inmoviliza en un portaobjetos de vidrio, mientras que cada nucleótido se codifica por colores con una molécula receptora fluorescente unida a un gamma-fosfato. El sistema detecta la interacción entre una polimerasa marcada con fluorescencia y un nucleótido modificado con fluorescencia a medida que el nucleótido se incorpora a la cadena de novo. También existen otras tecnologías de secuenciación por síntesis.

Para identificar las mutaciones puede utilizarse cualquier plataforma adecuada de secuenciación por síntesis. Como se ha descrito anteriormente, en la actualidad existen cuatro grandes plataformas de secuenciación por síntesis: los secuenciadores genómicos de Roche/454 Life Sciences, el analizador 1G de Illumina/Solexa, el sistema SOLiD de Applied BioSystems y el sistema Heliscope de Helicos Biosciences. Las plataformas de secuenciación por síntesis también han sido descritas por Pacific BioSciences y VisiGen Biotechnologies. En algunas realizaciones, una pluralidad de moléculas de ácido nucleico que están siendo secuenciadas están unidas a un soporte (por ejemplo, un soporte sólido). Para inmovilizar el ácido nucleico en un soporte, se puede añadir una secuencia de captura/sitio de cebado universal en el extremo 3' y/o 5' de la plantilla. Los ácidos nucleicos pueden unirse al soporte hibridando la secuencia de captura con una secuencia complementaria unida covalentemente al soporte. La secuencia de captura (también denominada secuencia de captura universal) es una secuencia de ácido nucleico complementaria a una secuencia unida a un soporte que puede servir a la vez de cebador universal.

Como una alternativa a una secuencia de captura, un miembro de un par de acoplamiento (como, por ejemplo, anticuerpo/antígeno, receptor/ligando, o el par avidina-biotina descrito en, por ejemplo, la solicitud de patente estadounidense N.° 2006/0252077) puede enlazarse a cada fragmento a capturar en una superficie recubierta con un segundo miembro respectivo de ese par de acoplamiento.

Tras la captura, la secuencia puede analizarse, por ejemplo, mediante detección/secuenciación de molécula única, como se describe en los Ejemplos y en la Patente estadounidense N.° 7,283,337, incluida la secuenciación por síntesis dependiente de la plantilla. En la secuenciación por síntesis, la molécula unida a la superficie se expone a una pluralidad de nucleótidos trifosfatos marcados en presencia de polimerasa. La secuencia de la plantilla viene determinada por el orden de los nucleótidos marcados incorporados en el extremo 3' de la cadena en crecimiento. Esto puede hacerse en tiempo real o de forma escalonada. Para el análisis en tiempo real, se pueden incorporar diferentes etiquetas ópticas a cada nucleótido y utilizar múltiples láseres para la estimulación de los nucleótidos incorporados.

La secuenciación también puede incluir otras técnicas y plataformas de secuenciación paralela masiva o secuenciación de próxima generación (NGS). Ejemplos adicionales de técnicas y plataformas de secuenciación masiva en paralelo son Illumina HiSeq o MiSeq, Thermo PGM o Proton, Pac Bio RS II o Sequel, Gene Reader de Qiagen y Oxford Nanopore MinlON. Pueden utilizarse otras tecnologías de secuenciación masiva paralela similares a las actuales, así como futuras generaciones de estas tecnologías.

Se puede utilizar cualquier tipo de célula o tejido para obtener muestras de ácido nucleico para su uso en los métodos aquí descritos. Por ejemplo, una muestra de ADN o ARN puede obtenerse de un tumor o de un fluido corporal, por ejemplo, sangre, obtenida mediante técnicas conocidas (por ejemplo, venopunción) o saliva. Alternativamente, las pruebas de ácidos nucleicos pueden realizarse en muestras secas (por ejemplo, pelo o piel). Además, se puede obtener una muestra para secuenciación de un tumor y otra muestra de tejido normal para secuenciación, donde el tejido normal es del mismo tipo de tejido que el tumor. Se puede obtener una muestra para secuenciación de un tumor y otra muestra de tejido normal para secuenciación, donde el tejido normal es un tipo de tejido distinto relativo al tumor.

Los tumores pueden incluir uno o más de cáncer de pulmón, melanoma, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de riñón, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer testicular, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de páncreas, cáncer cerebral, linfoma de células B, leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, leucemia linfocítica crónica y leucemia linfocítica de células T, cáncer de pulmón de células no pequeñas y cáncer de pulmón de células pequeñas.

Alternativamente, puede utilizarse la espectrometría de masas de proteínas para identificar o validar la presencia de péptidos mutados unidos a proteínas del MHC en células tumorales. Los péptidos pueden eliminarse con ácido a partir de células tumorales o de moléculas HLA inmunoprecipitadas del tumor e identificarse mediante espectrometría de masas.

IV. Neoantígenos

Los neoantígenos pueden incluir nucleótidos o polipéptidos. Por ejemplo, un neoantígeno puede ser una secuencia de ARN que codifica para una secuencia polipeptídica. Por lo tanto, los neoantígenos útiles en las vacunas pueden incluir secuencias nucleotídicas o secuencias polipeptídicas.

En el presente se divulgan péptidos aislados que comprenden mutaciones tumorales específicas identificadas por los métodos divulgados en el presente, péptidos que comprenden mutaciones tumorales específicas conocidas y polipéptidos mutantes o fragmentos de los mismos identificados por los métodos divulgados en el presente. Los péptidos neoantígenos pueden describirse en el contexto de su secuencia codificante, donde un neoantígeno incluye la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, ADN o ARN) que codifica la secuencia polipeptídica relacionada.

Uno o más polipéptidos codificados por una secuencia nucleotídica de neoantígeno pueden comprender al menos uno de los siguientes: una afinidad de unión con MHC con un valor IC50 inferior a 1000nM, para péptidos MHC Clase I una longitud de 8-15, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, o 15 aminoácidos, presencia de motivos de secuencia dentro o cerca del péptido que promuevan la escisión del proteasoma, y presencia o motivos de secuencia que promuevan el transporte<t>A<p>. Para los péptidos MHC Clase II de longitud 6-30, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 aminoácidos, presencia de motivos de secuencia dentro o cerca del péptido que promuevan la escisión por proteasas extracelulares o lisosomales (por ejemplo, catepsinas) o unión HLA-DM catalizada por HLA.

Uno o más neoantígenos pueden presentarse en la superficie de un tumor.

Uno o más neoantígenos pueden ser inmunogénicos en un sujeto que tenga un tumor, por ejemplo, capaces de provocar una respuesta de células T o una respuesta de células B en el sujeto.

Uno o más neoantígenos que inducen una respuesta autoinmune en un sujeto pueden excluirse de la consideración en el contexto de la generación de vacunas para un sujeto que tiene un tumor.

El tamaño de al menos una molécula peptídica neoantígénica puede comprender, entre otros, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 11, aproximadamente 12, aproximadamente 13, aproximadamente 14, aproximadamente 15, aproximadamente 16, aproximadamente 17, aproximadamente 18, aproximadamente 19, aproximadamente 20, aproximadamente 21, aproximadamente 22, aproximadamente 23, aproximadamente 24, aproximadamente 25, aproximadamente 26, aproximadamente 27, aproximadamente 28, aproximadamente 29, aproximadamente 30, aproximadamente 31, aproximadamente 32, aproximadamente 33, aproximadamente 34, aproximadamente 35, aproximadamente 36, aproximadamente 37, aproximadamente 38, aproximadamente 39, aproximadamente 40, aproximadamente 41, aproximadamente 42, aproximadamente 43, aproximadamente 44, aproximadamente 45, aproximadamente 46, aproximadamente 47, aproximadamente 48, aproximadamente 49, aproximadamente 50, aproximadamente 60, aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90, aproximadamente 100, aproximadamente 110, aproximadamente 120 o más residuos de moléculas de amino, y cualquier intervalo que se derive de estos. En modalidades específicas, las moléculas peptídicas neoantigénicas son iguales o menores que 50 aminoácidos.

Los péptidos y polipéptidos neoantigénicos pueden tener: para MHC Clase I 15 residuos o menos de longitud y normalmente constan de entre unos 8 y unos 11 residuos, particularmente 9 o 10 residuos; para MHC Clase II, 6-30 residuos, inclusive.

Si se desea, se puede diseñar un péptido más largo de varias maneras. En un caso, cuando se predicen o se conocen las probabilidades de presentación de los péptidos en los alelos HLA, un péptido más largo podría consistir en cualquiera de ellos: (1) péptidos individuales presentados con una extensión de 2-5 aminoácidos hacia los extremos N- y C-terminal de cada producto génico correspondiente; (2) una concatenación de algunos o todos los péptidos presentados con secuencias extendidas para cada uno. En otro caso, cuando la secuenciación revele una secuencia neoepitópica larga (>10 residuos) presente en el tumor (por ejemplo, debido a un desplazamiento de marco, a una lectura cruzada o a la inclusión de un intrón que dé lugar a una secuencia peptídica nueva), un péptido más largo consistiría en: (3) todo el tramo de nuevos aminoácidos específicos del tumor, evitando así la necesidad de una selección computacional o basada en pruebas in vitro del péptido más corto con mayor presencia de HLA. En ambos casos, el uso de un péptido más largo permite el procesamiento endógeno por parte de las células del paciente y puede conducir a una presentación más eficaz del antígeno y a la inducción de respuestas de células T.

Los péptidos y polipéptidos neoantigénicos pueden presentarse en una proteína HLA. En algunos aspectos, los péptidos y polipéptidos neoantigénicos se presentan en una proteína h La con mayor afinidad que un péptido de tipo salvaje. En algunos aspectos, un péptido o polipéptido neoantigénico puede tener una IC50 de al menos menos menos de 5000 nM, al menos menos menos de 1000 nM, al menos menos menos de 500 nM, al menos menos menos de 250 nM, al menos menos menos de 200 nM, al menos menos menos de 150 nM, al menos menos de 100 nM, al menos menos de 50 nM o menos.

En algunos aspectos, los péptidos y polipéptidos neoantigénicos no inducen una respuesta autoinmune y/o invocan tolerancia inmunológica cuando se administran a un sujeto.

También se proporcionan composiciones que comprenden al menos dos o más péptidos neoantigénicos. En algunas realizaciones, la composición contiene al menos dos péptidos distintos. Al menos dos péptidos distintos pueden derivarse del mismo polipéptido. Por polipéptidos distintos se entiende que el péptido varía en longitud, secuencia de aminoácidos o ambos. Los péptidos se derivan de cualquier polipéptido del que se sepa o se haya descubierto que contiene una mutación específica del tumor. Los polipéptidos adecuados de los que pueden derivarse los péptidos neoantigénicos pueden encontrarse, por ejemplo, en la base de datos COSMIC. COSMIC recopila información exhaustiva sobre mutaciones somáticas en el cáncer humano. El péptido contiene la mutación específica del tumor. En algunos aspectos, la mutación específica del tumor es una mutación impulsora de un tipo de cáncer concreto.

Los péptidos y polipéptidos neoantigénicos que tienen una actividad o propiedad deseada pueden modificarse para proporcionar determinados atributos deseados, por ejemplo características farmacológicas mejoradas, mientras se aumenta o al menos se retiene sustancialmente toda la actividad biológica del péptido no modificado para unirse a la molécula de MHC deseada y activar la célula T apropiada. Por ejemplo, los péptidos y polipéptidos neoantigénicos pueden estar sujetos a diversos cambios, tales como sustituciones, ya sean conservadoras o no conservadoras, donde tales cambios podrían proporcionar determinadas ventajas en su uso, tales como una unión al MHC, estabilidad o presentación mejorada. Por sustituciones conservadoras se entiende la sustitución de un residuo de aminoácido por otro que sea biológica y/o químicamente similar, por ejemplo, un residuo hidrófobo por otro, o un residuo polar por otro. Las sustituciones incluyen combinaciones como Gly, Ala; Val, Ile, Leu, Met; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; y Phe, Tyr. El efecto de las sustituciones de un único aminoácido también se puede analizar mediante el uso de D-aminoácidos. Dichas modificaciones pueden realizarse mediante procedimientos de síntesis peptídica bien conocidos, como se describe, por ejemplo, en Merrifield, Science 232:341-347 (1986), Barany & Merrifield, The Peptides, Gross & Meienhofer, eds. (<n>.Y., Academic Press), pp. 1-284 (1979); y Stewart & Young, Solid Phase Peptide Synthesis, (Rockford, III. , Pierce), 2d Ed. (1984).

Las modificaciones de péptidos y polipéptidos con diversos aminoácidos miméticos o aminoácidos no naturales pueden ser especialmente útiles para aumentar la estabilidad del péptido y el polipéptido in vivo. La estabilidad puede evaluarse de varias maneras. Por ejemplo, se han utilizado peptidasas y diversos medios biológicos, como plasma y suero humanos, para comprobar la estabilidad. Véase, por ejemplo, Verhoef et al., Eur. J. Drug Metab Pharmacokin. 11:291-302 (1986). La semivida de los péptidos puede determinarse convenientemente utilizando un ensayo con 25 % de suero humano (v/v). El protocolo suele ser el siguiente. El suero humano mezclado (tipo<a>B, no inactivado por calor) se deslipida por centrifugación antes de su utilización. A continuación, el suero se diluye al 25 % con medio de cultivo tisular RPMI y se utiliza para comprobar la estabilidad del péptido. A intervalos de tiempo predeterminados, se extrae una pequeña cantidad de solución de reacción y se añade a ácido tricloracético acuoso al 6 % o a etanol. La muestra de reacción turbia se enfría (4 grados C) durante 15 minutos y luego se centrifuga para precipitar las proteínas séricas. A continuación, se

determina la presencia de los péptidos mediante HPLC en fase inversa utilizando condiciones cromatográficas específicas para la estabilidad.

Los péptidos y polipéptidos pueden modificarse para proporcionar atributos deseados distintos de la mejora de

la semivida sérica. Por ejemplo, la capacidad de los péptidos para inducir la actividad CTL puede potenciarse

mediante la unión a una secuencia que contenga al menos un epítopo capaz de inducir una respuesta de

células T auxiliares. Los conjugados inmunogénicos péptidos/auxiliares T pueden unirse mediante una

molécula espaciadora. El espaciador suele estar compuesto por moléculas neutras relativamente pequeñas,

como aminoácidos o miméticos de aminoácidos, que están prácticamente descargados en condiciones fisiológicas. Los espaciadores se seleccionan típicamente de, por ejemplo, Ala, Gly, u otros espaciadores

neutros de aminoácidos no polares o aminoácidos polares neutros. Se entenderá que el espaciador opcionalmente presente no necesita estar compuesto de los mismos residuos y, por tanto, puede ser un hetero

u homo oligómero. Cuando está presente, el espaciador suele tener al menos uno o dos residuos, más habitualmente de tres a seis residuos. Alternativamente, el péptido puede unirse al péptido ayudante T sin espaciador.

Un péptido neoantigénico puede unirse al péptido T auxiliar directamente o a través de un espaciador en el

extremo amino o carboxi del péptido. El extremo amino del péptido neoantigénico o del péptido T auxiliar puede

estar acilado. Los péptidos T auxiliares ilustrativos incluyen el toxoide tetánico 830-843, la gripe 307-319, el circumsporozoito de la malaria 382-398 y 378-389.

Las proteínas o péptidos pueden prepararse mediante cualquier técnica conocida por los expertos en la técnica,

que incluye la expresión de proteínas, polipéptidos o péptidos a través de técnicas de biología molecular

estándar, el aislamiento de proteínas o péptidos de fuentes naturales, o la síntesis química de proteínas o

péptidos. Las secuencias de nucleótidos y proteínas, polipéptidos y péptidos correspondientes a diversos genes

se divulgaron previamente y pueden encontrarse en bases de datos computarizadas conocidas por los expertos

en la técnica. Una de dichas bases de datos es las bases de datos Genbank y GenPept del Centro Nacional

de Información Biotecnológica ubicadas en el sitio web de los Institutos Nacionales de Salud. Las regiones codificantes de genes conocidos pueden amplificarse y/o expresarse mediante el uso de las técnicas que se

describen en la presente descripción o como sabrían los expertos en la técnica. Alternativamente, los expertos

en la técnica conocen diversas preparaciones comerciales de proteínas, polipéptidos y péptidos.

En otro aspecto, un neoantígeno incluye un ácido nucleico (por ejemplo, un polinucleótido) que codifica un

péptido neoantígeno o una parte del mismo. El polinucleótido puede ser, por ejemplo, ADN, ADNc,PNA, CNA,

ARN (por ejemplo, ARNm), ya sea monocatenario y/o bicatenario, o formas nativas o estabilizadas de polinucleótidos, como, por ejemplo, polinucleótidos con un esqueleto de fosforotiato, o combinaciones de los

mismos, y puede o no contener intrones. Otro aspecto proporciona un vector de expresión capaz de expresar

un polipéptido o una porción del mismo. Los vectores de expresión para diferentes tipos de células son bien

conocidos en la técnica y pueden seleccionarse sin experimentación excesiva. Por lo general, el ADN se inserta

en un vector de expresión, como un plásmido, con la orientación adecuada y el marco de lectura correcto para

su expresión. Si es necesario, el ADN puede unirse a las secuencias nucleotídicas de control regulador transcripcional y traslacional adecuadas reconocidas por el huésped deseado, aunque dichos controles suelen

estar disponibles en el vector de expresión. A continuación, el vector se introduce en el huésped mediante

técnicas estándar. Se pueden encontrar orientaciones al respecto, por ejemplo, en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.

IV. Composiciones de vacunas

También se divulga en el presente documento una composición inmunogénica, por ejemplo, una composición

de vacuna, capaz de suscitar una respuesta inmunitaria específica, por ejemplo, una respuesta inmunitaria

específica de tumor. Las composiciones vacunales comprenden típicamente una pluralidad de neoantígenos,

por ejemplo, seleccionados mediante un método descrito en el presente documento. Las composiciones

vacunales también pueden denominarse vacunas.

Una vacuna puede contener entre 1 y 30 péptidos, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 1 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 péptidos diferentes, 6, 7, 8, 9, 1011, 12, 13 o 14 péptidos diferentes,

o 12, 13 o 14 péptidos diferentes. Los péptidos pueden incluir modificaciones postraduccionales. Una vacuna

puede contener entre 1 y 100 o más secuencias nucleótidas, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,

18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 4 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 7 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94,95, 96, 97, 98, 99, 100 o más secuencias nucleótidas diferentes, 6, 7, 8, 9, 1011, 12, 13 o 14 secuencias nucleótidas diferentes, o 12, 13 o 14 secuencias

de nucleótidos diferentes. Una vacuna puede contener entre 1 y 30 secuencias neoantígenas, 2, 3, 4, 5, 6, 7,

8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37,

38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66,

67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94,95, 96, 97, 98, 99, 100 o más secuencias neoantígenas diferentes, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13 o 14 secuencias neoantígenas diferentes, o 12, 13 o 14 secuencias neoantígenas diferentes.

En una realización, se seleccionan diferentes péptidos y/o polipéptidos o secuencias de nucleótidos que los codifican de modo que los péptidos y/o polipéptidos sean capaces de asociarse con diferentes moléculas MHC, tales como diferentes moléculas MHC de clase I y/o diferentes moléculas MHC de clase II. En algunos aspectos, una composición vacunal comprende una secuencia codificante para péptidos y/o polipéptidos capaces de asociarse con las moléculas MHC de clase I y/o MHC de clase II más frecuentes. Por lo tanto, las composiciones vacunales pueden comprender diferentes fragmentos capaces de asociarse con al menos 2 moléculas MHC de clase I y/o moléculas MHC de clase II preferidas, al menos 3 preferidas o al menos 4 preferidas.

La composición de la vacuna puede ser capaz de suscitar una respuesta específica de células T citotóxicas y/o una respuesta específica de células T auxiliares.

Una composición de vacuna puede comprender además un adyuvante y/o un portador. A continuación se dan ejemplos de adyuvantes y portadores útiles. Una composición puede asociarse a un portador, como por ejemplo una proteína o una célula presentadora de antígeno, como por ejemplo una célula dendrítica (DC) capaz de presentar el péptido a una célula T.

Los adyuvantes son cualquier sustancia cuya mezcla en una composición vacunal aumenta o modifica de otro modo la respuesta inmunitaria a un neoantígeno. Los portadores pueden ser estructuras de andamiaje, por ejemplo un polipéptido o un polisacárido, al que se puede asociar un neoantígeno. Opcionalmente, los adyuvantes se conjugan de forma covalente o no covalente.

La capacidad de un adyuvante para aumentar la respuesta inmunitaria a un antígeno se manifiesta típicamente por un aumento significativo o sustancial de una reacción mediada por el sistema inmunitario, o por una reducción de los síntomas de la enfermedad. Por ejemplo, un aumento de la inmunidad humoral se manifiesta típicamente por un aumento significativo del título de anticuerpos contra el antígeno, y un aumento de la actividad de las células T se manifiesta típicamente por un aumento de la proliferación celular, de la citotoxicidad celular o de la secreción de citocinas. Un adyuvante también puede alterar una respuesta inmunitaria, por ejemplo, cambiando una respuesta principalmente humoral o Th en una respuesta principalmente celular o Th.

Los adyuvantes adecuados incluyen, entre otros, 1018 ISS, alumbre, sales de aluminio, Amplivax, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, GM-CSF, IC30, IC31, Imiquimod, ImuFact IMP321, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, JuvImmune, LipoVac, MF59, lípido monofosforilo A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, sistema de vectores PepTel, micropartículas PLG, resiquimod, SRL172, virosomas y otras partículas similares a virus, YF-17D, trampa de VEGf , R848, betaglucano, Pam3Cys, estimulón QS21 de Aquila (Aquila Biotech, Worcester, Mass., EE.UU.), derivado de saponina, extractos de micobacterias e imitadores sintéticos de la pared celular bacteriana, y otros adyuvantes patentados como Ribi's Detox. Quil o Superfos. Los adyuvantes como el Freund incompleto o el GM-CSF son útiles. Anteriormente se han descrito varios adyuvantes inmunológicos (por ejemplo, MF59) específicos para células dendríticas y su preparación (Dupuis M, et al., Cell Immunol. 1998; 186(1):18-27; Allison A C; Dev Biol Stand. 1998; 92:3-11). También pueden utilizarse citocinas. Varias citocinas se han relacionado directamente con su influencia en la migración de células dendríticas a los tejidos linfoides (por ejemplo, TNF-alfa), acelerando la maduración de las células dendríticas en células presentadoras de antígenos eficientes para los linfocitos T (por ejemplo, GM-CSF, IL-1 e IL-4) (Patente estadounidense N.° 5,849,589, específicamente incorporados en la presente mediante referencia en su totalidad) y actuando como inmunoadyuvantes (por ejemplo, IL-12) (Gabrilovich D I, et al., J Immunother Emphasis Tumor Immunol. 1996 (6):414-418).

También se ha observado que los oligonucleótidos inmunoestimuladores CpG potencian los efectos de los adyuvantes en el contexto de las vacunas. También pueden utilizarse otras moléculas de unión a TLR, como las de unión a ARN TLR 7, TLR 8 y/o TLR 9.

Otros ejemplos de adyuvantes útiles incluyen, entre otros, CpGs químicamente modificados (p. ej. CpR, Idera), Poly(I:C)(p. ej. polii:CI2U), ADN o ARN bacteriano no CpG, así como pequeñas moléculas inmunoactivas y anticuerpos como ciclofosfamida, sunitinib, bevacizumab, celebrex, NCX-4016, sildenafilo, tadalafilo, vardenafilo, sorafinib, XL-999, CP-547632, pazopanib, ZD2171, AZD2171, ipilimumab, tremelimumab y SC58175, que pueden actuar terapéuticamente y/o como adyuvantes. Las cantidades y concentraciones de adyuvantes y aditivos pueden ser determinadas fácilmente por el artesano experto sin experimentación indebida. Otros adyuvantes son los factores estimulantes de colonias, como el factor estimulante de colonias de macrófagos granulocitos (GM-CSF, sargramostim).

Una composición de vacuna puede comprender más de un adyuvante diferente. Además, una composición terapéutica puede comprender cualquier sustancia adyuvante que incluya cualquiera de las anteriores o combinaciones de las mismas. También se contempla que una vacuna y un adyuvante puedan administrarse juntos o por separado en cualquier secuencia apropiada.

Un portador (o excipiente) puede estar presente independientemente de un adyuvante. La función de un portador puede ser, por ejemplo, aumentar el peso molecular de un mutante en particular para aumentar la actividad o la inmunogenicidad, conferir estabilidad, aumentar la actividad biológica o aumentar la semivida sérica. Además, un portador puede ayudar a presentar los péptidos a las células T. Un portador puede ser cualquier portador adecuado conocido por el experto en la materia, por ejemplo una proteína o una célula presentadora de antígeno. Una proteína portadora puede ser, entre otras, la hemocianina de lapa, proteínas séricas como la transferrina, la albúmina de suero bovina, la albúmina de suero humana, la tiroglobulina o la ovoalbúmina, inmunoglobulinas u hormonas como la insulina o el ácido palmítico. Para la inmunización de seres humanos, el portador es generalmente un portador fisiológicamente aceptable para los seres humanos y seguro. Sin embargo, el toxoide tetánico y/o el toxoide diftérico son portadores adecuados. Alternativamente, el portador puede ser dextranos, por ejemplo sefarosa.

Los linfocitos T citotóxicos (CTL) reconocen un antígeno en forma de péptido unido a una molécula MHC en lugar del antígeno extraño intacto. La propia molécula MHC se encuentra en la superficie celular de una célula presentadora de antígeno. Por lo tanto, la activación de los CTL es posible si está presente un complejo trimérico de antígeno peptídico, molécula MHC y APC. En consecuencia, puede mejorar la respuesta inmunitaria si no sólo se utiliza el péptido para la activación de los CTL, sino si además se añaden APC con la respectiva molécula MHC. Por lo tanto, en algunas realizaciones, una composición de vacuna contiene además al menos una célula presentadora de antígeno.

Los neoantígenos también pueden incluirse en plataformas de vacunas basadas en vectores virales, como vaccinia, viruela aviar, alfavirus autorreplicantes, marabavirus, adenovirus (véase, por ejemplo, Tatsis et al, Adenoviruses, Molecular Therapy (2004) 10, 616-629), o lentivirus, incluidos, entre otros, lentivirus de segunda, tercera o híbridos de segunda/tercera generación y lentivirus recombinantes de cualquier generación diseñados para dirigirse a tipos celulares o receptores específicos(véase, por ejemplo, Hu et al., Immunization Delivered by Lentiviral Vectors for Cancer and Infectious Diseases, Immunol Rev. (2011) 239(1): 45-61, Sakuma et al ., Lentiviral vectors: basic to translational, Biochem J. (2012) 443(3):603-18, Cooper et al., Rescue of splicingmediated intron loss maximizes expression in lentiviral vectors containing the human ubiquitin C promoter, Nucl. Acids Res. (2015) 43 (1): 682-690, Zufferey et al., Self-Inactivating Lentivirus Vector for Safe and Efficient In Vivo Gene Delivery, J. Virol. (1998) 72 (12): 9873-9880). Dependiendo de la capacidad de empaquetamiento de las plataformas de vacunas basadas en vectores virales antes mencionadas, este enfoque puede suministrar una o más secuencias de nucleótidos que codifican uno o más péptidos neoantígenos. Las secuencias pueden estar flanqueadas por secuencias no mutadas, pueden estar separadas por enlazadores o pueden ir precedidas de una o más secuencias dirigidas a un compartimento subcelular (véase, por ejemplo, Gros et al., Prospective identification of neoantigen-specific lymphocytes in the peripheral blood of melanoma patients, Nat Med. (2016) 22 (4):433-8, Stronen et al., Targeting of cancer neoantigens with donor-derived T-cell receptor repertoires, Science. (2016) 352 (6291):1337-41, Lu et al., Efficient identification of mutated cancer antigens recognized by T-cells associated with durable tumor regressions, Clin Cancer Res. (2014) 20( 13):3401-10). Una vez introducidas en el huésped, las células infectadas expresan los neoantígenos y, por tanto, provocan una respuesta inmunitaria del huésped (por ejemplo, CTL) contra el péptido o los péptidos. Los vectores Vaccinia y los métodos útiles en los protocolos de inmunización se describen, por ejemplo, en la patente estadounidense N.° 4,722,848. Otro vector es el BCG (Bacille Calmette Guerin). Los vectores BCG se describen en Stover et al. (Nature 351:456-460 (1991)). Una amplia variedad de otros vectores vacunales útiles para la administración terapéutica o la inmunización de neoantígenos, por ejemplo, vectores de Salmonella typhi, y similares, serán evidentes para los expertos en la materia a partir de la descripción del presente documento.

IV.A. Consideraciones adicionales para el diseño y la fabricación de vacunas

IV.A.1. Determinación de un conjunto de péptidos que cubren todos los subclones tumorales

Los péptidos troncales, es decir, aquellos presentados por todos o la mayoría de los subclones tumorales, tendrán prioridad para su inclusión en la vacuna.53 Opcionalmente, si no hay péptidos troncales que se prevea que se presenten y sean inmunogénicos con alta probabilidad, o si el número de péptidos troncales que se prevé que se presenten y sean inmunogénicos con alta probabilidad es lo suficientemente pequeño como para que se puedan incluir péptidos no troncales adicionales en la vacuna, entonces se pueden priorizar más péptidos estimando el número y la identidad de los subclones tumorales y eligiendo péptidos para maximizar el número de subclones tumorales cubiertos por la vacuna.54

IV.A.2. Priorización de neoantígenos

Una vez aplicados todos los filtros de neoantígenos anteriores, es posible que aún haya más neoantígenos candidatos para la inclusión en la vacuna de los que la tecnología de vacunas pueda soportar. Además, es posible que persista la incertidumbre sobre varios aspectos del análisis de neoantígenos y que existan compensaciones entre las distintas propiedades de los neoantígenos candidatos a vacunas. Así, en lugar de filtros predeterminados en cada etapa del proceso de selección, se puede considerar un modelo- integrado que sitúa los neoantígenos candidatos en un espacio con al menos los siguientes ejes y optimiza la selección utilizando un enfoque integrador.

. Riesgo de autoinmunidad o tolerancia (riesgo de línea germinal) (normalmente se prefiere un menor riesgo de autoinmunidad)

. Probabilidad de artefacto de secuenciación (normalmente se prefiere una menor probabilidad de artefacto)

. Probabilidad de inmunogenicidad (normalmente se prefiere una mayor probabilidad de inmunogenicidad)

. Probabilidad de presentación (normalmente se prefiere una mayor probabilidad de presentación)

. Expresión génica (normalmente se prefiere una expresión más alta)

. Cobertura de genes HLA (un mayor número de moléculas HLA implicadas en la presentación de un conjunto de neoantígenos puede disminuir la probabilidad de que un tumor escape al ataque inmunitario mediante la regulación a la baja o la mutación de moléculas HLA)

. Cobertura de las clases HLA (cubrir tanto HLA-I como HLA-II puede aumentar la probabilidad de respuesta terapéutica y disminuir la probabilidad de escape tumoral)

V. Métodos terapéuticos y de fabricación

También se proporciona un método para inducir una respuesta inmune específica de tumor en un sujeto, vacunar contra un tumor, tratar y/o aliviar un síntoma de cáncer en un sujeto administrando al sujeto uno o más neoantígenos tales como una pluralidad de neoantígenos identificados usando métodos divulgados en el presente documento.

En algunos aspectos, a un sujeto se le ha diagnosticado cáncer o está en riesgo de desarrollarlo. Un sujeto puede ser un ser humano, un perro, un gato, un caballo o cualquier animal en el que se desee obtener una respuesta inmunitaria específica contra un tumor. Un tumor puede ser cualquier tumor sólido tal como mama, ovario, próstata, pulmón, riñón, gástrico, colon, testicular, cabeza y cuello, páncreas, cerebro, melanoma y otros tumores de órganos tisulares y tumores hematológicos, tales como linfomas y leucemias, que incluye leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, leucemia linfocítica crónica, leucemia linfocítica de células T y linfomas de células B.

Un neoantígeno puede administrarse en una cantidad suficiente para inducir una respuesta CTL.

Un neoantígeno puede administrarse solo o en combinación con otros agentes terapéuticos. El agente terapéutico es, por ejemplo, un agente quimioterapéutico, radiación o inmunoterapia. Puede administrarse cualquier tratamiento terapéutico adecuado para un cáncer concreto.

Además, puede administrarse a un sujeto un agente antiinmunosupresor/inmunoestimulador, como un inhibidor de puntos de control. Por ejemplo, al sujeto se le puede administrar además un anticuerpo anti-CTLA o anti-PD-1 o anti-PD-L1. El bloqueo de CTLA-4 o PD-L1 mediante anticuerpos puede potenciar la respuesta inmunitaria frente a las células cancerosas del paciente. En particular, el bloqueo de CTLA-4 se ha mostrado eficaz cuando se sigue un protocolo de vacunación.

Se puede determinar la cantidad óptima de cada neoantígeno que debe incluirse en una composición vacunal y el régimen de dosificación óptimo. Por ejemplo, un neoantígeno o su variante puede prepararse para inyección intravenosa (i.v.), inyección subcutánea (s.c.), inyección intradérmica (i.d.), inyección intraperitoneal (i.p.), inyección intramuscular (i.m.). Los métodos de inyección incluyen s.c., i.d., i.p., i.m. e i.v. Los métodos de inyección de ADN o ARN incluyen i.d., i.m., s.c., i.p. e i.v. Los expertos en la materia conocen otros métodos de administración de la composición vacunal.

Una vacuna puede compilarse de modo que la selección, el número y/o la cantidad de neoantígenos presentes en la composición sean específicos del tejido, del cáncer y/o del paciente. Por ejemplo, la selección exacta de los péptidos puede guiarse por los patrones de expresión de las proteínas parentales en un tejido determinado. La selección puede depender del tipo específico de cáncer, el estado de la enfermedad, los regímenes de tratamiento anteriores, el estado inmunitario del paciente y, por supuesto, el haplotipo HLA del paciente. Además, una vacuna puede contener componentes individualizados, según las necesidades personales del paciente concreto. Algunos ejemplos son la variación de la selección de neoantígenos en función de la expresión del neoantígeno en el paciente concreto o los ajustes para tratamientos secundarios tras una primera ronda o esquema de tratamiento.

Para que una composición se utilice como vacuna contra el cáncer, los neoantígenos con autopéptidos normales similares que se expresan en cantidades elevadas en los tejidos normales pueden evitarse o estar presentes en cantidades bajas en una composición descrita en el presente documento. Por otro lado, si se sabe que el tumor de un paciente expresa cantidades elevadas de un determinado neoantígeno, la composición farmacéutica respectiva para el tratamiento de este cáncer puede estar presente en cantidades elevadas y/o se puede incluir más de un neoantígeno específico para este neoantígeno en particular o vía de este neoantígeno.

Las composiciones que comprenden un neoantígeno pueden administrarse a un individuo que ya padece cáncer. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones se administran a un paciente en una cantidad suficiente para provocar una respuesta CTL eficaz frente al antígeno tumoral y para curar o al menos detener parcialmente los síntomas y/o complicaciones. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como "dosis terapéuticamente eficaz". Las cantidades eficaces para este uso dependerán, por ejemplo, de la composición, la manera de administración, la etapa y gravedad de la enfermedad que se trata, el peso y el estado de salud general del paciente y el criterio del médico que la prescribe. Hay que tener en cuenta que, por lo general, las composiciones pueden emplearse en estados graves de la enfermedad, es decir, en situaciones que ponen en peligro o pueden poner en peligro la vida, especialmente cuando el cáncer ha hecho metástasis. En tales casos, en vista de la minimización de sustancias extrañas y la naturaleza relativamente no tóxica de un neoantígeno, es posible y puede ser considerado deseable por el médico tratante administrar excesos sustanciales de estas composiciones.

Para uso terapéutico, la administración puede comenzar en el momento de la detección o extirpación quirúrgica de los tumores. A continuación, se aumentan las dosis hasta que, al menos, los síntomas disminuyen sustancialmente y durante un tiempo más.

Las composiciones farmacéuticas (por ejemplo, composiciones de vacunas) para el tratamiento terapéutico están destinadas a la administración parenteral, tópica, nasal, oral o local. Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse por vía parenteral, por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intradérmica o intramuscular. Las composiciones pueden administrarse en el lugar de la escisión quirúrgica para inducir una respuesta inmunitaria local contra el tumor. En el presente documento se describen composiciones para administración parenteral que comprenden una solución del neoantígeno y composiciones vacunales disueltas o suspendidas en un portador aceptable, por ejemplo, un portador acuoso. Pueden utilizarse diversos portadores acuosos, por ejemplo, agua, agua tamponada, solución salina al 0,9 %, glicina al 0,3 %, ácido hialurónico y similares. Estas composiciones pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales y bien conocidas, o pueden filtrarse estérilmente. Las soluciones acuosas resultantes pueden envasarse para su uso tal cual, o liofilizarse, combinándose la preparación liofilizada con una solución estéril antes de su administración. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares aceptables desde el punto de vista farmacéutico según se requiera para acercarse a condiciones fisiológicas, tales como agentes amortiguadores y de ajuste de pH, agentes ajustadores de tonicidad, agentes humectantes y similares, por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, monolaurato sorbitán, oleato trietanolamina, etc.

Los neoantígenos también pueden administrarse mediante liposomas, que los dirigen a un tejido celular concreto, como el tejido linfoide. Los liposomas también son útiles para aumentar la semivida. Los liposomas incluyen emulsiones, espumas, micelas, monocapas insolubles, cristales líquidos, dispersiones de fosfolípidos, capas laminares y similares. En estas preparaciones, el neoantígeno a administrar se incorpora como parte de un liposoma, solo o junto con una molécula que se une, por ejemplo, a un receptor prevalente entre las células linfoides, como los anticuerpos monoclonales que se unen al antígeno CD45, o con otras composiciones terapéuticas o inmunogénicas. De este modo, los liposomas rellenos con un neoantígeno deseado pueden dirigirse al sitio de las células linfoides, donde los liposomas liberan entonces las composiciones terapéuticas/inmunogénicas seleccionadas. Los liposomas pueden formarse a partir de lípidos estándar formadores de vesículas, que generalmente incluyen fosfolípidos neutros y cargados negativamente y un esterol, como el colesterol. La selección de lípidos suele guiarse por la consideración de, por ejemplo, el tamaño del liposoma, la labilidad ácida y la estabilidad de los liposomas en el torrente sanguíneo. Existen diversos métodos para preparar liposomas, como se describe, por ejemplo, en Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng.

9; 467 (1980), Patente estadounidense N.° 4,235,871; 4,501,728; 4,501,728; 4,837,028; y 5,019,369.

Para dirigirse a las células inmunitarias, un ligando que se incorpore al liposoma puede incluir, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos para determinantes de la superficie celular de las células del sistema inmunitario deseadas. Una suspensión liposomal puede administrarse por vía intravenosa, local, tópica, etc. en una dosis que varía según, entre otras cosas, la forma de administración, el péptido que se administra y la fase de la enfermedad que se trata.

Con fines terapéuticos o de inmunización, también pueden administrarse al paciente ácidos nucleicos que codifican un péptido y, opcionalmente, uno o más de los péptidos descritos en el presente documento. Se utilizan convencionalmente varios métodos para administrar los ácidos nucleicos al paciente. Por ejemplo, el ácido nucleico puede suministrarse directamente, como "ADN desnudo". Este enfoque se describe, por ejemplo, en Wolff et al., Science 247: 1465-1468 (1990) así como en las Patentes estadounidenses N.° 5,580,859 y 5,589,466. Los ácidos nucleicos también pueden administrarse mediante entrega balística como se describe, por ejemplo, en U.S. Pat. N.° 5,204,253. Pueden administrarse partículas compuestas únicamente de ADN. Alternativamente, el ADN puede adherirse a partículas, como partículas de oro. Los métodos de administración de secuencias de ácido nucleico pueden incluir vectores virales, vectores de ARNm y vectores de ADN con o sin electroporación.

Los ácidos nucleicos también pueden suministrarse complejados con compuestos catiónicos, como lípidos catiónicos. La administración de genes mediados por lípidos se describe, por ejemplo, en 9618372WOAWO 96/18372; 9324640WOAWO 93/24640; Mannino & Gould-Fogerite, BioTechniques 6(7): 682- 691 (1988); Patente estadounidense N.° 5.279.833 Rose la Patente estadounidense N.° 5,279,833; 9106309WOAWO 91/06309; y Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 84: 7413-7414 (1987).

Un medio de administración de ácidos nucleicos utiliza construcciones de minigenes que codifican uno o múltiples epítopos. Para crear una secuencia de ADN que codifique los epítopos CTL seleccionados (minigén) para su expresión en células humanas, se traducen inversamente las secuencias de aminoácidos de los epítopos. Se utiliza una tabla de uso de codones humanos para guiar la elección del codón para cada aminoácido. Estas secuencias de ADN que codifican epítopos están directamente unidas, creando una secuencia polipeptídica continua. Para optimizar la expresión y/o la inmunogenicidad, se pueden incorporar elementos adicionales al diseño del minigén. Ejemplos de secuencia de aminoácidos que podrían traducirse inversamente e incluirse en la secuencia del minigén incluyen: linfocito T ayudante, epítopos, una secuencia líder (señal) y una señal de retención del retículo endoplásmico. Además, la presentación de MHC de los epítopos CTL puede mejorarse incluyendo secuencias sintéticas (por ejemplo, poli-alanina) o naturales adyacentes a los epítopos CTL. La secuencia del minigén se convierte en ADN mediante el ensamblaje de oligonucleótidos que codifican las hebras positiva y negativa del minigén. Los oligonucleótidos superpuestos (de 30-100 bases de longitud) se sintetizan, fosforilan, purifican y recuecen en condiciones adecuadas mediante técnicas bien conocidas. Los extremos de los oligonucleótidos se unen utilizando ADN ligasa T4. Este minigén sintético, que codifica el polipéptido del epítopo CTL, puede clonarse a continuación en un vector de expresión deseado.

El ADN plasmídico purificado puede prepararse para inyección utilizando diversas formulaciones. La más sencilla es la reconstitución del ADN liofilizado en solución salina estéril de tampón fosfato (PBS). Se han descrito diversos métodos y pueden aparecer nuevas técnicas. Como ya se ha indicado, los ácidos nucleicos se formulan convenientemente con lípidos catiónicos. Además, los glicolípidos, los liposomas fusogénicos, los péptidos y los compuestos denominados colectivamente protectores, interactivos y no condensantes (PINC) también podrían formar complejos con el ADN plasmídico purificado para influir en variables como la estabilidad, la dispersión intramuscular o el tráfico a órganos o tipos celulares específicos.

También se divulga un método de fabricación de una vacuna tumoral, que comprende realizar las etapas de un método divulgado en el presente documento; y producir una vacuna tumoral que comprende una pluralidad de neoantígenos o un subconjunto de la pluralidad de neoantígenos.

Los neoantígenos aquí divulgados pueden fabricarse mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, un método de producción de un neoantígeno o un vector (por ejemplo, un vector que incluye al menos una secuencia que codifica uno o más neoantígenos) divulgado en el presente documento puede incluir el cultivo de una célula huésped en condiciones adecuadas para expresar el neoantígeno o el vector en el que la célula huésped comprende al menos un polinucleótido que codifica el neoantígeno o el vector, y purificar el neoantígeno o el vector. Los métodos estándar de purificación incluyen técnicas cromatográficas, electroforéticas, inmunológicas, de precipitación, diálisis, filtración, concentración y cromatoenfoque.

Las células huésped pueden incluir una célula de ovario de hámster chino (CHO), una célula NS0, una levadura o una célula HEK293. Las células hospedadoras pueden transformarse con uno o más polinucleótidos que comprenden al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica un neoantígeno o vector divulgado en el presente documento, opcionalmente en el que el polinucleótido aislado comprende además una secuencia promotora unida operablemente a la al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica el neoantígeno o vector. En determinadas realizaciones, el polinucleótido aislado puede ser ADNc.

VI. Identificación de neoantígenos

VI.A. Identificación de candidatos a neoantígenos.

Se han descrito y aplicado métodos de investigación para el análisis NGS del exoma y los transcriptomas tumorales y normales en el espacio de la identificación de neoantígenos. 6,14,15 El ejemplo siguiente considera determinadas optimizaciones para una mayor sensibilidad y especificidad para la identificación de neoantígenos en el entorno clínico. Estas optimizaciones pueden agruparse en dos áreas, las relacionadas con los procesos de laboratorio y las relacionadas con el análisis de datos NGS.

VI.A.1. Optimización de procesos de laboratorio

Las mejoras del proceso que aquí se presentan abordan los retos del descubrimiento de neoantígenos de alta precisión a partir de muestras clínicas con bajo contenido tumoral y pequeños volúmenes, extendiendo los conceptos desarrollados para la evaluación fiable de genes controladores del cáncer en paneles de cáncer 16 dirigidos al entorno del exoma completo y el transcriptoma necesario para la identificación de neoantígenos. En concreto, estas mejoras incluyen:

1. Dirigido a una cobertura media única profunda (>500x) a través del exoma tumoral para detectar mutaciones presentes con baja frecuencia de alelos mutantes debido al bajo contenido tumoral o al estado subclonal.

2. Objetivo de cobertura uniforme en todo el exoma tumoral, con <5 % de bases cubiertas en <100 x, de modo que se pasen por alto el menor número posible de neoantígenos, por ejemplo:

a. Utilización de sondas de captura basadas en ADN con sonda individual QC17

b. Inclusión de cebos adicionales para las regiones poco cubiertas

3. Objetivo de cobertura uniforme en todo el exoma normal, donde <5 % de las bases están cubiertas en <20 x para que el menor número posible de neoantígenos permanezcan sin clasificar para el estado somático/de línea germinal (y por lo tanto no utilizables como TSNAs)

4. Para minimizar la cantidad total de secuenciación necesaria, las sondas de captura de secuencias se diseñarán únicamente para las regiones codificantes de los genes, ya que el ARN no codificante no puede dar lugar a neoantígenos. Entre las optimizaciones adicionales se incluyen:

a. suplementarias para genes HLA, ricos en GC y poco captados por la secuenciación estándar del exorna 18

b. exclusión de genes que se prevé que generen pocos o ningún neoantígeno candidato, debido a factores como una expresión insuficiente, una digestión subóptima por el proteasoma o características inusuales de la secuencia.

5. El ARN tumoral también se secuenciará a gran profundidad (>100M lecturas) para permitir la detección de variantes, la cuantificación de la expresión génica y de variantes de empalme ("isoformas") y la detección de fusiones. El ARN de las muestras FFPE se extraerá mediante enriquecimiento basado en sondas19, con las mismas sondas o similares utilizadas para capturar exomas en el ADN.

VI.A.2. Optimización del análisis de datos NGS

Las mejoras en los métodos de análisis abordan la sensibilidad y especificidad subóptimas de los enfoques comunes de llamada de mutaciones en investigación, y consideran específicamente las personalizaciones relevantes para la identificación de neoantígenos en el entorno clínico. Estas incluyen:

1. Utilizar el genoma humano de referencia HG38 o una versión posterior para el alineamiento, ya que contiene múltiples regiones MHC ensambladas que reflejan mejor el polimorfismo de la población, en contraste con las anteriores versiones del genoma.

2. Superación de las limitaciones de los llamadores de variantes individuales 20 mediante la fusión de resultados de distintos programas.5

a. Las variantes de un solo nucleótido y las indels se detectarán a partir de ADN tumoral, ARN tumoral y ADN normal con un conjunto de herramientas que incluyen: programas basados en comparaciones de ADN tumoral y normal, como Strelka 21 y Mutect 22; y programas que incorporan ADN tumoral, ARN tumoral y ADN normal, como UNCeqR, que es particularmente ventajoso en muestras de baja pureza 23.

b. Los indels se determinarán con programas que realizan reensamblaje local, como Strelka y ABRA 24.

c. Los reordenamientos estructurales se determinarán utilizando herramientas específicas como Pindel 25 o Breakseq 26.

3. Para detectar y evitar el intercambio de muestras, se compararán las llamadas de variantes de muestras del mismo paciente en un número determinado de sitios polimórficos.

4. Se realizará un filtrado exhaustivo de las llamadas artefactuales, por ejemplo, mediante:

a. Eliminación de variantes encontradas en ADN normal, potencialmente con parámetros de detección relajados en casos de baja cobertura, y con un criterio de proximidad permisivo en caso de indels

b. Eliminación de variantes por baja calidad cartográfica o baja calidad de base 27.

c. Eliminación de variantes procedentes de artefactos de secuenciación recurrentes, aunque no se observen en la correspondiente normal 27. Los ejemplos incluyen variantes detectadas principalmente en una hebra.

d. Eliminación de variantes detectadas en un conjunto de controles no relacionados 27

5. Llamada precisa de HLA a partir de exoma normal utilizando uno de seq2HLA 28, ATHLATES 29 u Optitype y también combinando datos de secuenciación de exoma y ARN 28. Otras posibles optimizaciones incluyen la adopción de un ensayo específico para la tipificación de HLA, como la secuenciación de ADN de lectura larga 30, o la adaptación de un método para unir fragmentos de ARN con el fin de mantener la continuidad 31.

6. La detección robusta de neo-ORF derivados de variantes de empalme específicas del tumor se realizará ensamblando transcritos a partir de datos de ARN-seq utilizando CLASS 32, Bayesembler 33, StringTie 34 o un programa similar en su modo guiado por referencia (es decir, utilizando estructuras de transcrito conocidas en lugar de intentar recrear los transcritos en su totalidad a partir de cada experimento). Aunque Cufflinks 35 se utiliza habitualmente para este fin, con frecuencia produce un número inverosímilmente elevado de variantes de empalme, muchas de ellas mucho más cortas que el gen completo, y puede fallar en la recuperación de controles positivos simples. Se determinarán las secuencias codificantes y el potencial de desintegración mediada por el sinsentido con herramientas como SpliceR36 y MAMBA37, y se reintroducirán secuencias mutantes. La expresión génica se determinará con una herramienta como Cufflinks35 o Express (Roberts y Pachter, 2013). Se determinarán los recuentos y/o niveles relativos de expresión específicos de tipo salvaje y mutante con herramientas desarrolladas para estos fines, como ASE38 o HTSeq39. Las etapas de filtrado potenciales incluyen:

a. Eliminación de los neo-ORF candidatos considerados insuficientemente expresados.

b. Eliminación de los neo-ORF candidatos que se prevé que desencadenen una desintegración mediada por no sentido (NMD).

7. Los neoantígenos candidatos observados sólo en el ARN (por ejemplo, los neoORF) que no puedan verificarse directamente como tumor-específicos se clasificarán como probablemente tumor-específicos según parámetros adicionales, por ejemplo considerando:

a. Presencia de mutaciones en el sitio de empalme o desplazamiento del marco de acción cis en el ADN tumoral

b. Presencia de una mutación que corrobora sólo el ADN tumoral en un factor de empalme. Por ejemplo, en tres experimentos publicados de forma independiente con SF3B1 mutante R625, los genes que mostraban las mayores diferencias de empalme eran concordantes, a pesar de que en un experimento se examinaron pacientes con melanoma uveal 40, en el segundo una línea celular de melanoma uveal 41 y en el tercero pacientes con cáncer de mama 42.

c. Para isoformas de empalme nuevas, presencia de lecturas de empalme "nuevas" que lo corroboren en los datos RNASeq.

d. En el caso de nuevos reordenamientos, la presencia de lecturas de yuxtaexón corroborantes en el ADN tumoral que están ausentes en el ADN normal

e. Ausencia en compendios de expresión génica como GTEx43 (lo que hace menos probable el origen germinal)

8. Complementar el análisis basado en la alineación del genoma de referencia comparando las lecturas ensambladas de ADN tumoral y normal (o k-mers de dichas lecturas) directamente para evitar errores y artefactos basados en la alineación y la anotación (por ejemplo. para variantes somáticas que surgen cerca de variantes de línea germinal o indels de contexto de repetición)

En las muestras con ARN poliadenilado, se evaluará la presencia de ARN viral y microbiano en los datos de ARN-seq mediante ARN CoMPASS44 o un método similar, con vistas a la identificación de factores adicionales que puedan predecir la respuesta de los pacientes.

VI.B. Aislam iento y detección de péptidos HLA

El aislamiento de las moléculas de péptidos HLA se realizó mediante métodos clásicos de inmunoprecipitación (IP) tras la lisis y solubilización de la muestra de tejido 55-58. Se utilizó un lisado clarificado para la IP específica de HLA.

La inmunoprecipitación se realizó utilizando anticuerpos acoplados a perlas en las que el anticuerpo es específico para las moléculas HLA. Para una inmunoprecipitación pan-Clase I HLA, se utiliza un anticuerpo pan-Clase I CR, para Clase II HLA - DR, se utiliza un anticuerpo HLA-DR. El anticuerpo se une covalentemente a las perlas de NHS-sefarosa durante la incubación de una noche. Después de la unión covalente, las perlas se lavaron y se alicuotaron para IP.59, 60 Las inmunoprecipitaciones también pueden realizarse con anticuerpos que no están unidos covalentemente a las perlas. Normalmente, esto se hace utilizando sefarosa o perlas magnéticas recubiertas con proteína A y/o proteína G para mantener el anticuerpo en la columna. A continuación se enumeran algunos anticuerpos que pueden utilizarse para enriquecer selectivamente el complejo MHC/péptido.

El lisado de tejido clarificado se añade a las perlas de anticuerpos para la inmunoprecipitación. Tras la inmunoprecipitación, las perlas se retiran del lisado y éste se almacena para experimentos adicionales, incluidas IP adicionales. Las perlas IP se lavan para eliminar la unión no específica y el complejo HLA/péptido se eluye de las perlas utilizando técnicas estándar. Los componentes de proteína se eliminan de los péptidos mediante una columna de centrifugación de peso molecular o fraccionamiento C18. Los péptidos resultantes se llevan a sequedad mediante evaporación SpeedVac y en algunos casos se almacenan a -20C antes del análisis MS.

Los péptidos desecados se reconstituyen en un tampón HPLC adecuado para cromatografía de fase inversa y se cargan en una columna HPLC microcapilar C-18 para la elución en gradiente en un espectrómetro de masas Fusion Lumos (Thermo). Los espectros MS1 de masa/carga (m/z) del péptido se recogieron en el detector Orbitrap a alta resolución, seguidos de barridos MS2 de baja resolución recogidos en el detector de trampa de iones tras la fragmentación HCD del ion seleccionado. Además, los espectros MS2 pueden obtenerse utilizando métodos de fragmentación CID o ETD o cualquier combinación de las tres técnicas para obtener una mayor cobertura de aminoácidos del péptido. Los espectros MS2 también pueden medirse con precisión de masa de alta resolución en el detector Orbitrap.

Los espectros MS2 de cada análisis se buscan en una base de datos de proteínas utilizando Comet 61,62 y la identificación de péptidos se puntúa utilizando Percolator 63-65. La secuenciación adicional se realiza con PEAKS studio (Bioinformatics Solutions Inc.) y pueden utilizarse otros motores de búsqueda o métodos de secuenciación, como la coincidencia espectral y la secuenciación de novo 75.

VI.B.1. Estudios del lím ite de detección de la MS en apoyo de la secuenciación exhaustiva de péptidos HLA.

Utilizando el péptido YVYVADVAAK se determinó cuáles son los límites de detección utilizando diferentes cantidades de péptido cargadas en la columna de LC. Las cantidades de péptido ensayadas fueron 1 pmol, 100 fmol, 10 fmol, 1 fmol y 100 amol. (Tabla 1) Los resultados se muestran en la FIG. 1f . Estos resultados indican que el límite más bajo de detección (LoD) está en el rango de los attomoles (10-18), que el rango dinámico abarca cinco órdenes de magnitud y que la relación señal/ruido parece suficiente para la secuenciación en rangos bajos de femtomoles (10-15).

VII. Modelo de presentación

VII.A. Visión general del sistema

La FIG. 2A es una vista general de un entorno 100 para identificar probabilidades de presentación de péptidos en pacientes, de acuerdo con una realización. El entorno 100 proporciona el contexto para introducir un sistema de identificación de presentación 160, que a su vez incluye un almacén de información de presentación 165.

El sistema de identificación de presentación 160 es uno o modelos informáticos, incorporados en un sistema informático como se discute más adelante con respecto a la FIG. 29, que recibe secuencias peptídicas asociadas con un conjunto de alelos MHC y determina probabilidades de que las secuencias peptídicas sean presentadas por uno o más del conjunto de alelos MHC asociados. El sistema de identificación de presentación 160 puede aplicarse tanto a alelos MHC de clase I como de clase II. Esto es útil en diversos contextos. Un caso de uso específico para el sistema de identificación de presentación 160 es que sea capaz de recibir secuencias de nucleótidos de neoantígenos candidatos asociados con un conjunto de alelos MHC de células tumorales de un paciente 110 y determinar probabilidades de que los neoantígenos candidatos sean presentados por uno o más de los alelos MHC asociados del tumor y/o induzcan respuestas inmunogénicas en el sistema inmunitario del paciente 110. Aquellos neoantígenos candidatos con altas probabilidades según lo determinado por el sistema 160 pueden seleccionarse para su inclusión en una vacuna 118, de tal manera que se puede provocar una respuesta inmunitaria antitumoral del sistema inmunitario del paciente 110 que proporciona las células tumorales. Además, las células T con TCR que responden a neoantígenos candidatos con altas probabilidades de presentación pueden producirse para su uso en terapia de células T, provocando así también una respuesta inmunitaria antitumoral del sistema inmunitario del paciente 110.

El sistema de identificación de presentaciones 160 determina las probabilidades de presentación a través de uno o más modelos de presentación. En concreto, los modelos de presentación generan probabilidades de que determinadas secuencias peptídicas se presenten para un conjunto de alelos MHC asociados, y se generan basándose en la información de presentación almacenada en el almacén 165. Por ejemplo, los modelos de presentación pueden generar probabilidades de si una secuencia peptídica "YVYVADVAAK" se presentará para el conjunto de alelos HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-B*07:02, HLA-B*08:03, HLA-C*01:04 en la superficie celular de la muestra. La información de presentación 165 contiene información sobre si los péptidos se unen a diferentes tipos de alelos del MHC, de modo que esos péptidos son presentados por alelos del MHC, lo que en los modelos se determina en función de las posiciones de los aminoácidos en las secuencias peptídicas. El modelo de presentación puede predecir si una secuencia peptídica no reconocida se presentará en asociación con un conjunto asociado de alelos del MHC basándose en la información de presentación 165. Como ya se ha mencionado, los modelos de presentación pueden aplicarse tanto a los alelos MHC de clase I como a los de clase II.

VII.B. Información sobre la presentación

La FIG. 2 ilustra un método de obtención de información de presentación, de acuerdo con una realización. La información de presentación 165 incluye dos categorías generales de información: información que interactúa con el alelo e información que no interactúa con el alelo. La información que interactúa con el alelo incluye información que influye en la presentación de secuencias peptídicas que dependen del tipo de alelo del MHC. La información que no interactúa con el alelo incluye información que influye en la presentación de secuencias peptídicas que son idependientes del tipo de alelo del MHC.

VII.B.1. Información sobre la interacción alélica

La información de interacción de alelos incluye principalmente secuencias peptídicas identificadas que se sabe que han sido presentadas por una o más moléculas MHC identificadas de humanos, ratones, etc. Notablemente, esto puede incluir o no datos obtenidos a partir de muestras tumorales. Las secuencias peptídicas presentadas pueden identificarse a partir de células que expresan un único alelo del MHC. En este caso, las secuencias peptídicas presentadas se obtienen generalmente de líneas celulares unialélicas que se diseñan para expresar un alelo MHC predeterminado y que posteriormente se exponen a la proteína sintética. Los péptidos que se presentan en el alelo del MHC se aíslan mediante técnicas como la elución ácida y se identifican mediante espectrometría de masas. La FIG. 2B muestra un ejemplo de esto, donde el péptido de ejemplo YEMFNDKS<q>R<a>PDDKMF, presentado en el alelo MHC predeterminado HLA-DRB1* 12:01, se aísla e identifica mediante espectrometría de masas. Dado que en esta situación los péptidos se identifican a través de células diseñadas para expresar una única proteína MHC predeterminada, se conoce definitivamente la asociación directa entre un péptido presentado y la proteína MHC a la que estaba unido.

Las secuencias peptídicas presentadas también pueden obtenerse de células que expresan múltiples alelos del MHC. Normalmente, en los seres humanos, una célula expresa 6 tipos diferentes de moléculas MHC-I y hasta 12 tipos diferentes de moléculas MHC-II. Dichas secuencias peptídicas presentadas pueden identificarse a partir de líneas celulares multialélicas diseñadas para expresar múltiples alelos MHC predeterminados. Dichas secuencias peptídicas presentadas también pueden identificarse a partir de muestras de tejido, ya sea de muestras de tejido normal o de muestras de tejido tumoral. En este caso en particular, las moléculas MHC pueden inmunoprecipitarse a partir de tejido normal o tumoral. Los péptidos que se presentan en los alelos MHC múltiples pueden ser aislados de manera similar mediante técnicas como la elución ácida y se identifican mediante espectrometría de masas. La FIG. 2C muestra un ejemplo de esto, donde los seis péptidos de ejemplo, YEMFNDKSF, HROEIFSHDFJ, FJIEJFOESS, NEIOREIREI, JFKSIFEMMSJDSSUIFLKSJFIEIFJ y KNFLENFIESOFI, se presentan en alelos MHC de clase I identificados HLA-A*01:01, HLA-A*02:01, HLA-B*07:02, HLA-B*08:01, y alelos MHC de clase II HLA-DRB1* 10:01, HLA-DRB1:11:01 y se aíslan e identifican mediante espectrometría de masas. En contraste con las líneas celulares de alelo único, la asociación directa entre un péptido presentado y la proteína del MHC a la que estaba unido puede ser desconocida, ya que los péptidos unidos se aíslan de las moléculas del MHC antes de ser identificados.

La información que interactúa con los alelos también puede incluir la corriente iónica de la espectrometría de masas, que depende tanto de la concentración de complejos péptido-molécula MHC como de la eficacia de ionización de los péptidos. La eficacia de ionización varía de un péptido a otro en función de la secuencia. En general, la eficacia de ionización varía de un péptido a otro en aproximadamente dos órdenes de magnitud, mientras que la concentración de los complejos péptido-MHC varía en un intervalo mayor que ese.

La información sobre la interacción alélica también puede incluir mediciones o predicciones de la afinidad de unión entre un alelo MHC dado y un péptido dado. (72, 73, 74) Uno o varios modelos de afinidad pueden generar tales predicciones. Por ejemplo, volviendo al ejemplo mostrado en la FIG. 1D, la información de presentación 165 puede incluir una predicción de afinidad de unión de 1000nM entre el péptido YEMFNDKSF y el alelo de clase I HLA-A*01:01. Pocos péptidos con IC50 > 1000nm son presentados por el MHC, y valores inferiores de IC50 aumentan la probabilidad de presentación. La información de presentación 165 puede incluir una predicción de afinidad de unión entre el péptido KNFLENFIESOFI y el alelo de clase II HLA-DRB1:11:01.

La información sobre la interacción alélica también puede incluir mediciones o predicciones de la estabilidad del complejo MHC. Uno o varios modelos de estabilidad que pueden generar tales predicciones. Es más probable que los complejos péptido-MHC más estables (es decir, complejos con vidas medias más largas) se presenten en un número elevado de copias en las células tumorales y en las células presentadoras de antígenos que se encuentran con el antígeno de la vacuna. Por ejemplo, volviendo al ejemplo mostrado en la FIG. 2C, la información de presentación 165 puede incluir una predicción de estabilidad de una vida media de 1h para la molécula de clase I HLA- A*01:01. La información de presentación 165 también puede incluir una predicción de estabilidad de una vida media para la molécula de clase II HLA-DRB1:11:01.

La información sobre la interacción alélica también puede incluir la velocidad medida o prevista de la reacción de formación del complejo péptido-MHC. Los complejos que se forman a mayor velocidad tienen más probabilidades de presentarse en la superficie celular a alta concentración.

La información de interacción alélica también puede incluir la secuencia y la longitud del péptido. Las moléculas MHC de clase I suelen preferir presentar péptidos con longitudes comprendidas entre 8 y 15 péptidos. El 60 80 % de los péptidos presentados tienen una longitud de 9. Las moléculas MHC de clase II suelen preferir presentar péptidos con longitudes comprendidas entre 6 y 30 péptidos.

La información de interacción alélica también puede incluir la presencia de motivos de secuencia quinasa en el péptido codificado con el neoantígeno, y la ausencia o presencia de modificaciones postraduccionales específicas en el péptido codificado con el neoantígeno. La presencia de motivos quinasa afecta a la probabilidad de modificación postraduccional, que puede potenciar o interferir con la unión al MHC.

La información de interacción alélica también puede incluir los niveles de expresión o actividad de las proteínas implicadas en el proceso de modificación postraduccional, por ejemplo, las quinasas (según las mediciones o predicciones de RNA seq, espectrometría de masas u otros métodos).

La información sobre la interacción alélica también puede incluir la probabilidad de presentación de péptidos con una secuencia similar en células de otros individuos que expresen el alelo del MHC concreto, evaluada mediante proteómica de espectrometría de masas u otros medios.

La información de interacción alélica también puede incluir los niveles de expresión del alelo MHC concreto en el individuo en cuestión (por ejemplo, medidos mediante ARN-seq o espectrometría de masas). Los péptidos que se unen más fuertemente a un alelo del MHC que se expresa a niveles altos tienen más probabilidades de ser presentados que los péptidos que se unen más fuertemente a un alelo del MHC que se expresa a un nivel bajo.

La información que interactúa con el alelo también puede incluir la probabilidad global independiente de la secuencia peptídica codificada por el neoantígeno de presentación por el alelo particular de MHC en otros individuos que expresan el alelo particular del MHC.

La información de interacción alélica también puede incluir la probabilidad global independiente de la secuencia peptídica de presentación por alelos MHC de la misma familia de moléculas (por ejemplo, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQ, HLA-DR, HLA-DP) en otros individuos. Por ejemplo, las moléculas HLA-C se expresan típicamente a niveles más bajos que las moléculas HLA-A o HLA-B, y en consecuencia, la presentación de un péptido por HLA-C es a priori menos probable que la presentación por HLA-A o HLA-B. Por otro ejemplo, HLA-DP se expresa típicamente a niveles más bajos que HLA-DR o HLA-DQ; en consecuencia, la presentación de un péptido por HLA-DP es a priori menos probable que la presentación por HLA-DR o HLA-DQ.

La información que interactúa con el alelo también puede incluir la secuencia proteica del alelo MHC concreto.

Cualquier información que no interactúe con el alelo MHC enumerada en la siguiente sección también puede modelarse como información que interactúe con el alelo MHC.

VII.B.2. Información sobre alelos que no interactúan

La información que no interactúa con el alelo puede incluir secuencias C-terminales que flanquean el péptido codificado por el neoantígeno dentro de su secuencia de proteína fuente. En el caso del MHC-I, las secuencias flanqueantes C-terminales pueden influir en el procesamiento proteasomal de los péptidos. Sin embargo, la secuencia de flanqueo C-terminal es escindida del péptido por el proteasoma antes de que el péptido sea transportado al retículo endoplásmico y se encuentre con los alelos del MHC en las superficies de las células. En consecuencia, las moléculas MHC no reciben información sobre la secuencia de flanqueo C-terminal y, por lo tanto, el efecto de la secuencia de flanqueo C-terminal no puede variar en función del tipo de alelo m Hc . Por ejemplo, volviendo al ejemplo mostrado en la FIG. 2C, la información de presentación 165 puede incluir la secuencia de flanqueo C-terminal FOEIFNDKSLDKFJI del péptido presentado FJIEJFOESS identificada a partir de la proteína fuente del péptido.

La información sobre alelos que no interactúan también puede incluir mediciones de cuantificación de ARNm. Por ejemplo, los datos de cuantificación de ARNm pueden obtenerse de las mismas muestras que proporcionan los datos de entrenamiento de espectrometría de masas. Como se describe más adelante en referencia a la FIG. 13H, la expresión de ARN se identificó como un fuerte predictor de la presentación del péptido. En una realización, las mediciones de cuantificación de ARNm se identifican a partir de la herramienta de software RSEM. La aplicación detallada de la herramienta informática RSEM puede consultarse en Bo Li y Colin N. Dewey. RSEM: cuantificación precisa de transcritos a partir de datos de RNA-Seq con o sin genoma de referencia. BMC Bioinformatics, 12:323, agosto de 2011. En una realización, la cuantificación del ARNm se mide en unidades de fragmentos por kilobase de transcripción por millón de lecturas mapeadas (FPKM).

La información sobre alelos que no interactúan también puede incluir las secuencias N-terminales que flanquean al péptido dentro de su secuencia proteica de origen.

La información de no interacción alélica también puede incluir el gen fuente de la secuencia peptídica. El gen fuente puede definirse como la familia de proteínas Ensembl de la secuencia peptídica. En otros ejemplos, el gen fuente puede definirse como el ADN fuente o el ARN fuente de la secuencia peptídica. El gen fuente puede, por ejemplo, representarse como una cadena de nucleótidos que codifican para una proteína, o alternativamente representarse de forma más categórica basándose en un conjunto nombrado de secuencias conocidas de ADN o ARN que se sabe que codifican proteínas específicas. En otro ejemplo, la información de no interacción alélica también puede incluir el transcrito o isoforma fuente o conjunto de transcritos o isoformas fuente potenciales de la secuencia peptídica extraída de una base de datos como Ensembl o RefSeq.

La información de no interacción alélica también puede incluir el tipo de tejido, el tipo de célula o el tipo de tumor de las células de origen de la secuencia peptídica.

La información de no interacción alélica también puede incluir la presencia de motivos de escisión de proteasas en el péptido, opcionalmente ponderada según la expresión de las proteasas correspondientes en las células tumorales (medida por ARN-seq o espectrometría de masas). Es menos probable que se presenten péptidos que contengan motivos de escisión de proteasas, porque serán degradados más fácilmente por las proteasas y, por tanto, serán menos estables dentro de la célula.

La información sobre alelos que no interactúan también puede incluir la tasa de recambio de la proteína fuente medida en el tipo de célula apropiado. Una tasa de recambio más rápida (es decir, una vida media más baja) aumenta la probabilidad de presentación; sin embargo, el poder predictivo de esta característica es bajo si se mide en un tipo celular distinto.

La información sobre alelos que no interactúan también puede incluir la longitud de la proteína de origen, considerando opcionalmente las variantes de empalme específicas ("isotermas") más expresadas en las células tumorales según las mediciones de ARN-seq o espectrometría de masas del proteoma, o según las predicciones de la anotación de mutaciones de empalme germinales o somáticas detectadas en los datos de secuencias de ADN o ARN.

La información de no interacción alélica también puede incluir el nivel de expresión del proteasoma, inmunoproteasoma, timoproteasoma u otras proteasas en las células tumorales (que puede medirse mediante ARN-seq, espectrometría de masas del proteoma o inmunohistoquímica). Diferentes proteasomas tienen diferentes preferencias de sitios de escisión. Se dará más peso a las preferencias de escisión de cada tipo de proteasoma en proporción a su nivel de expresión.

La información de no interacción alélica también puede incluir la expresión del gen fuente del péptido (por ejemplo, medida por ARN-seq o espectrometría de masas). Entre las posibles optimizaciones se incluye el ajuste de la expresión medida para tener en cuenta la presencia de células estromales y linfocitos infiltrados en el tumor dentro de la muestra tumoral. Es más probable que se presenten péptidos procedentes de genes de mayor expresión. Los péptidos de genes con niveles de expresión indetectables pueden excluirse de la consideración.

La información de no interacción alélica también puede incluir la probabilidad de que el ARNm fuente del péptido codificado por el neoantígeno esté sujeto a una descomposición mediada por el sinsentido, tal y como predice un modelo de descomposición mediada por el sinsentido, por ejemplo, el modelo de Rivas et al, Science 2015.

La información de no interacción alélica también puede incluir la expresión típica específica de tejido del gen fuente del péptido durante varias etapas del ciclo celular. Es probable que los genes que se expresan a un nivel bajo en general (según las mediciones de ARN-seq o proteómica por espectrometría de masas) pero que se sabe que se expresan a un nivel alto durante fases específicas del ciclo celular produzcan más péptidos presentados que los genes que se expresan de forma estable a niveles muy bajos.

La información sobre alelos que no interactúan también puede incluir un catálogo exhaustivo de características de la proteína de origen, tal y como figura, por ejemplo, en uniProt o PDB http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do. Estas características pueden incluir, entre otras: las estructuras secundarias y terciarias de la proteína, la localización subcelular 11, términos de ontología genética (GO). Específicamente, esta información puede contener anotaciones que actúan a nivel de la proteína, por ejemplo, longitud 5' UTR, y anotaciones que actúan a nivel de residuos específicos, por ejemplo, motivo de hélice entre los residuos 300 y 310. Estas características también pueden incluir motivos de giro, motivos de hoja y residuos desordenados.

La información de no interacción alélica también puede incluir características que describan las propiedades del dominio de la proteína fuente que contiene el péptido, por ejemplo: estructura secundaria o terciaria (por ejemplo, hélice alfa frente a lámina beta); Empalme alternativo.

La información de no interacción alélica también puede incluir asociaciones entre una secuencia peptídica del neoantígeno y uno o más bloques k-mer de una pluralidad de bloques k-mer de un gen fuente del neoantígeno (tal como está presente en los datos de secuenciación nucleotídica del sujeto). Durante el entrenamiento del modelo de presentación, estas asociaciones entre la secuencia peptídica del neoantígeno y los bloques k-mer de los datos de secuenciación nucleotídica del neoantígeno se introducen en el modelo, y son utilizadas en parte por el modelo para aprender los parámetros del modelo que representan la presencia o ausencia de una región clave de presentación para los bloques k-mer asociados con las secuencias peptídicas de entrenamiento. Luego, durante el uso del modelo posterior al entrenamiento, se introducen en el modelo asociaciones entre una secuencia peptídica de prueba y uno o más bloques k-mer de un gen fuente de secuencia peptídica de prueba, y los parámetros aprendidos por el modelo durante el entrenamiento permiten al modelo de presentación hacer predicciones más precisas sobre la probabilidad de presentación de la secuencia peptídica de prueba.

En general, los parámetros del modelo que representan la presencia o ausencia de una región clave de presentación para un bloque k-mer representan la propensión residual a que el bloque k-mer dé lugar a péptidos presentados, después de controlar todas las demás variables (por ejemplo, la secuencia del péptido, la expresión del ARN, los aminoácidos que suelen encontrarse en los péptidos de unión a HLA, etc.). Los parámetros que representan la presencia o ausencia de una región clave de presentación para un bloque kmer pueden ser un coeficiente binario (por ejemplo, 0 o 1), o un coeficiente analógico a lo largo de una escala (por ejemplo, entre 0 y 1, ambos inclusive). En cualquier caso, un coeficiente mayor (por ejemplo, más cercano a 1 o 1) representa una mayor probabilidad de que el bloque k-mer dé lugar a péptidos presentados controlando otros factores, mientras que un coeficiente menor (por ejemplo, más cercano a 0 o 0) representa una menor probabilidad de que el bloque k-mer dé lugar a péptidos presentados. Por ejemplo, un bloque k-mer con un coeficiente de región clave bajo podría ser un bloque k-mer de un gen con alta expresión de ARN, con aminoácidos comúnmente encontrados en péptidos de unión a HLA, donde el gen fuente da lugar a muchos otros péptidos presentados, pero donde los péptidos presentados raramente se ven en el bloque k-mer. Dado que otras fuentes de presencia de péptidos ya pueden ser tenidas en cuenta por otros parámetros (por ejemplo, la expresión de ARN sobre una base de bloque k-mer o mayor, comúnmente encontrada en los péptidos de unión a HLA), estos parámetros de regiones clave proporcionan información nueva y separada que no "cuenta doble" la información captada por otros parámetros.

La información de no interacción alélica también puede incluir la probabilidad de presentación de péptidos de la proteína fuente del péptido en cuestión en otros individuos (tras ajustar el nivel de expresión de la proteína fuente en esos individuos y la influencia de los diferentes tipos de HLA de esos individuos).

La información sobre alelos que no interactúan también puede incluir la probabilidad de que el péptido no sea detectado o esté sobrerrepresentado por espectrometría de masas debido a sesgos técnicos.

La expresión de varios módulos/vías génicas medida por un ensayo de expresión génica como RNASeq, micromatriz(es), panel(es) dirigido(s) como Nanostring, o representantes únicos/múltiples de módulos génicos medidos por ensayos como RT-PCR (que no necesitan contener la proteína fuente del péptido) que son informativos sobre el estado de las células tumorales, el estroma o los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL).

La información de no interacción alélica también puede incluir el número de copias del gen fuente del péptido en las células tumorales. Por ejemplo, a los péptidos de genes sujetos a deleción homocigota en células tumorales se les puede asignar una probabilidad de presentación de cero.

La información sobre alelos que no interactúan también puede incluir la probabilidad de que el péptido se una a la TAP o la afinidad de unión medida o prevista del péptido a la TAP. Los péptidos que tienen más probabilidades de unirse al TAP, o los péptidos que se unen al TAP con mayor afinidad tienen más probabilidades de ser presentados por el MHC-I.

La información sobre alelos que no interactúan también puede incluir el nivel de expresión de TAP en las células tumorales (que puede medirse mediante ARN-seq, espectrometría de masas del proteoma, inmunohistoquímica). En el caso del MHC-I, los niveles de expresión de TAP más elevados aumentan la probabilidad de presentación de todos los péptidos.

La información alelo-no-interactiva también puede incluir la presencia o ausencia de mutaciones tumorales, incluyendo, entre otros:

i. Mutaciones impulsoras en genes impulsores del cáncer conocidos como EGFR, KRAS, ALK, RET, ROS1, TP53, CDKN2A, CDKN2B, NTRK1, NTRK2, NTRK3

ii. En los genes que codifican las proteínas implicadas en la maquinaria de presentación de antígenos (Ej, B2M, HLA-A, HLA-B, HLA-C, TAP-1, TAP-2, TAPBP, CALR, CNX, ERP57, HLA-DM, HLA-DMA, HLA-DMB, HLA-DO, HLA-DOA, HLA-DOBHLA-DP, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQ, HLA-DQA1, HLA-DQA2, HLA-DQB1, HLA-DQB2, HLA-DR, HLA-DRA, HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5 o cualquiera de los genes que codifican componentes del proteasoma o inmunoproteasoma). Los péptidos cuya presentación depende de un componente de la maquinaria de presentación de antígenos que está sujeto a una mutación de pérdida de función en el tumor tienen una menor probabilidad de presentación.

Presencia o ausencia de polimorfismos funcionales de la línea germinal, incluidos, entre otros:

i. En los genes que codifican las proteínas implicadas en la maquinaria de presentación de antígenos (Ej, B2M, HLA-A, HLA-B, HLA-C, TAP-1, TAP-2, TAPBP, CALR, CNX, ERP57, HLA-DM, HLA-DMA, HLA-DMB, HLA-DO, HLA-DOA, HLA-DOBHLA-DP, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQ, HLA-DQA1, HLA-DQA2, HLA-DQB1, HLA-DQB2, HLA-DR, HLA-DRA, HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5 o cualquiera de los genes que codifican componentes del proteasoma o inmunoproteasoma).

La información de no interacción alélica también puede incluir el tipo de tumor (por ejemplo, NSCLC, melanoma).

La información sobre alelos que no interactúan también puede incluir la funcionalidad conocida de los alelos HLA, reflejada, por ejemplo, por los sufijos de los alelos HLA. Por ejemplo, el sufijo N en el nombre del alelo HLA-A*24:09N indica un alelo nulo que no se expresa y, por lo tanto, es poco probable que presente epítopos; la nomenclatura completa de los sufijos de los alelos HLA se describe en https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/nomenclature/suffixes.html.

La información de no interacción alélica también puede incluir el subtipo de tumor clínico (por ejemplo, cáncer de pulmón escamoso frente a no escamoso).

La información no relacionada con los alelos también puede incluir el historial de tabaquismo.

La información sobre alelos que no interactúan también puede incluir antecedentes de quemaduras solares, exposición al sol o exposición a otros mutágenos.

La información de no interacción alélica también puede incluir la expresión típica del gen fuente del péptido en el tipo de tumor o subtipo clínico relevante, opcionalmente estratificado por mutación conductora. Es más probable que se presenten genes que suelen expresarse a niveles elevados en el tipo de tumor correspondiente.

La información sobre alelos no interactuantes también puede incluir la frecuencia de la mutación en todos los tumores, o en tumores del mismo tipo, o en tumores de individuos con al menos un alelo MHC compartido, o en tumores del mismo tipo en individuos con al menos un alelo MHC compartido.

En el caso de un péptido específico de un tumor mutado, la lista de características utilizadas para predecir una probabilidad de presentación también puede incluir la anotación de la mutación (por ejemplo, cambio de sentido, cambio de lectura, cambio de marco, fusión, etc.) o si se prevé que la mutación provoque una desintegración mediada por el sinsentido (NMD). Por ejemplo, a los péptidos de segmentos proteicos que no se traducen en las células tumorales debido a mutaciones homocigóticas de parada precoz se les puede asignar una probabilidad de presentación de cero. La NMD provoca una disminución de la traducción del ARNm, lo que disminuye la probabilidad de presentación.

VII.C. Sistema de identificación de la presentación

La FIG. 3 es un diagrama de bloques de alto nivel que ilustra los componentes lógicos informáticos del sistema de identificación de presentaciones 160, según una realización. En esta realización de ejemplo, el sistema de identificación de presentación 160 incluye un módulo de gestión de datos 312, un módulo de codificación 314, un módulo de entrenamiento 316 y un módulo de predicción 320. El sistema de identificación de presentaciones 160 también se compone de un almacén de datos de entrenamiento 170 y un almacén de modelos de presentación 175. Algunas realizaciones del sistema de gestión de modelos 160 tienen módulos diferentes a los descritos aquí. Del mismo modo, las funciones pueden distribuirse entre los módulos de una manera diferente a la descrita aquí.

VII.C.1. Módulo de gestión de datos

El módulo de gestión de datos 312 genera conjuntos de datos de entrenamiento 170 a partir de la información de presentación 165. Cada conjunto de datos de entrenamiento contiene una pluralidad de instancias de datos, en las que cada instancia de datos i contiene un conjunto de variables independientes zi que incluyen al menos una secuencia peptídica presentada o no presentada pi, uno o más alelos MHC asociados ai asociados con la secuencia peptídica pi, y una variable dependiente yi que representa información que el sistema de identificación de presentación 160 está interesado en predecir para nuevos valores de las variables independientes.

En una implementación particular a la que se hace referencia en el resto de la especificación, la variable dependiente yi es una etiqueta binaria que indica si el péptido pi fue presentado por uno o más alelos MHC asociados ai. Sin embargo, se aprecia que en otras implementaciones, la variable dependiente yi puede representar cualquier otro tipo de información que el sistema de identificación de presentación 160 esté interesado en predecir en función de las variables independientes zi. Por ejemplo, en otra aplicación, la variable dependiente yi también puede ser un valor numérico que indique la corriente de iones de espectrometría de masas identificada para la instancia de datos.

La secuencia peptídica pi para la instancia de datos i es una secuencia de ki aminoácidos, en la que ki puede variar entre instancias de datos i dentro de un rango. Por ejemplo, ese intervalo puede ser 8-15 para MHC clase I o 6-30 para MHC clase II. En una realización específica del sistema 160, todas las secuencias peptídicas pi en un conjunto de datos de entrenamiento pueden tener la misma longitud, por ejemplo 9. El número de aminoácidos de una secuencia peptídica puede variar en función del tipo de alelos del MHC (por ejemplo, alelos MHC en humanos, etc.). Los alelos MHC ai para la instancia de datos i indican qué alelos Mh C estaban presentes en asociación con la secuencia peptídica correspondiente pi.

El módulo de gestión de datos 312 también puede incluir variables adicionales de interacción alélica, como la afinidad de unión bi y la estabilidad si junto con las secuencias peptídicas pi y los alelos MHC asociados ai contenidos en los datos de entrenamiento 170. Por ejemplo, los datos de entrenamiento 170 pueden contener predicciones de afinidad de unión bi entre un péptido pi y cada una de las moléculas MHC asociadas indicadas en ai. Como otro ejemplo, los datos de entrenamiento 170 pueden contener predicciones de estabilidad si para cada uno de los alelos MHC indicados en ai.

El módulo de gestión de datos 312 también puede incluir variables de no interacción alélica wi, como secuencias de flanqueo C-terminal y medidas de cuantificación de ARNm junto con las secuencias peptídicas pi.

El módulo de gestión de datos 312 también identifica las secuencias peptídicas que no presentan los alelos MHC para generar los datos de entrenamiento 170. Generalmente, esto implica identificar las secuencias "más largas" de la proteína de origen que incluyen secuencias peptídicas presentadas antes de la presentación. Cuando la información de presentación contiene líneas celulares de ingeniería, el módulo de gestión de datos 312 identifica una serie de secuencias peptídicas en la proteína sintética a la que se expusieron las células que no se presentaron en los alelos MHC de las células. Cuando la información de presentación contiene muestras de tejido, el módulo de gestión de datos 312 identifica las proteínas fuente de las que proceden las secuencias peptídicas presentadas, e identifica una serie de secuencias peptídicas en la proteína fuente que no se presentaron en los alelos MHC de las células de la muestra de tejido.

El módulo de gestión de datos 312 también puede generar artificialmente péptidos con secuencias aleatorias de aminoácidos e identificar las secuencias generadas como péptidos que no se presentan en los alelos del MHC. Esto puede lograrse generando aleatoriamente secuencias peptídicas permite al módulo de gestión de datos 312 generar fácilmente grandes cantidades de datos sintéticos para péptidos que no se presentan en los alelos MHC. Dado que, en realidad, los alelos del MHC presentan un pequeño porcentaje de secuencias peptídicas, es muy probable que las secuencias peptídicas generadas sintéticamente no hayan sido presentadas por alelos del MHC, aunque estuvieran incluidas en proteínas procesadas por las células.

La FIG. 4 ilustra un ejemplo de conjunto de datos de entrenamiento 170A, según una realización. Específicamente, las primeras 3 instancias de datos en los datos de entrenamiento 170A indican información de presentación de péptidos de una línea celular de un solo alelo que involucra el alelo HLA-C*01:03 y 3 secuencias de péptidos QCEIOWAREFLKEIGJ, FIEUHFWI, y FEWRHRJTRUJR. La cuarta instancia de datos en los datos de entrenamiento 170A indica información peptídica de una línea celular de alelos múltiples que involucra los alelos HLA-B*07:02, HLA-C*01:03, HLA-A*01:01y una secuencia peptídica QIEJOEIJE. La primera instancia de datos indica que la secuencia peptídica QCEIOWARE no fue presentada por el alelo HLA-DRB3:01:01. Como se ha comentado en los dos párrafos anteriores, las secuencias peptídicas marcadas negativamente pueden ser generadas aleatoriamente por el módulo de gestión de datos 312 o identificadas a partir de la proteína fuente de los péptidos presentados. Los datos de entrenamiento 170A también incluyen una predicción de afinidad de unión de 1000nM y una predicción de estabilidad de una semivida de 1h para el par secuencia peptídica-alelo. Los datos de entrenamiento 170A también incluyen variables que no interactúan con el alelo, como la secuencia de flanqueo C-terminal del péptido FJELFISBOSJFIE, y una medida de cuantificación de ARNm de 102 TPM. La cuarta instancia de datos indica que la secuencia peptídica QIEJOEIJE fue presentada por uno de los alelos HLA-B*07:02, HLA-C*01:03, o HlA-A*01:01. Los datos de entrenamiento 170A también incluyen predicciones de afinidad de unión y predicciones de estabilidad para cada uno de los alelos, así como la secuencia de flanqueo C-terminal del péptido y la medida de cuantificación de ARNm para el péptido.

VII.C.2. Módulo de codificación

El módulo de codificación 314 codifica la información contenida en los datos de entrenamiento 170 en una representación numérica que puede utilizarse para generar uno o más modelos de presentación. En una realización, el módulo de codificación 314 codifica secuencias de una sola vez (por ejemplo, secuencias peptídicas o secuencias de flanqueo C-terminal) sobre un alfabeto predeterminado de 20 letras de aminoácidos. Específicamente, la secuencia de péptidos de aminoácidos pi con ki está representada como una fila de vector de elementos 20ki, donde un único elemento entre pi20(j-1)+1, pi20(j-1)+2, ..., pi20j que se corresponde al alfabeto del aminoácido en le posición j-th de la secuencia peptídica que tiene un valor de 1. En caso contrario, el resto de elementos tienen valor 0. Por ejemplo, para un alfabeto dado {A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y}, la secuencia peptídica EAF de 3 aminoácidos para el caso de datos i puede representarse por el vector fila de 60 elementos pi =[000 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0]. La secuencia de flanqueo C-terminal ci puede codificarse de forma similar a la descrita anteriormente, así como la secuencia proteica dh para los alelos MHC, y otros datos de secuencia en la información de presentación.

Cuando los datos de entrenamiento 170 contienen secuencias de diferentes longitudes de aminoácidos, el módulo de codificación 314 puede codificar aún más los péptidos en vectores de igual longitud añadiendo un carácter PAD para ampliar el alfabeto predeterminado. Por ejemplo, esto puede realizarse rellenando a la izquierda las secuencias peptídicas con el carácter PAD hasta que la longitud de la secuencia peptídica alcance la secuencia peptídica con la mayor longitud en los datos de entrenamiento 170. Así, cuando la secuencia peptídica de mayor longitud tiene kmax aminoácidos, el módulo de codificación 314 representa numéricamente cada secuencia como un vector fila de(20+1)- kmax elementos. A modo de ejemplo, para el alfabeto ampliado {PAD, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y} y una longitud máxima de aminoácidos de kmax=5, la misma secuencia peptídica de ejemplo EAF de 3 aminoácidos puede representarse mediante el vector fila de 105 elementos pi =[1 000 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10 0 0 00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0]. La secuencia de flanqueo C-terminal ci u otros datos de secuencia pueden codificarse de forma similar a la descrita anteriormente. Así, cada variable independiente o columna de la secuencia peptídica pi o ci representa la presencia de un aminoácido concreto en una posición determinada de la secuencia.

Aunque el método anterior de codificación de datos de secuencias se describió en referencia a secuencias que tienen secuencias de aminoácidos, el método puede extenderse de forma similar a otros tipos de datos de secuencias, como datos de secuencias de ADN o ARN, y similares.

El módulo de codificación 314 también codifica el uno o más alelos MHC ai para el caso de datos i como un vector de filas de m elementos, en el que cada elemento h=1, 2, ..., m corresponde a un único alelo MHC identificado. Los elementos correspondientes a los alelos MHC identificados para la instancia de datos i tienen un valor de 1. En caso contrario, el resto de elementos tienen valor 0. Por ejemplo, los alelos HLA-B*07:02 y HLA-DRB1*10:01 para un caso de datos i correspondiente a una línea celular de alelos múltiples entre m=4 tipos de alelos MHC únicos identificados {HLA-A*01:01, HLA-C*01:08, HLA-B*07:02, HLA-DRB1* 10:01 } pueden representarse mediante el vector fila de 4 elementos ai=[0 01 1], en el que a3i=1 y a4i=1. Aunque el ejemplo se describe aquí con 4 tipos de alelos MHC identificados, el número de tipos de alelos MHC puede ser de cientos o miles en la práctica. Como se ha comentado anteriormente, cada instancia de datos i suele contener como máximo 6 tipos de alelos MHC diferentes en asociación con la secuencia peptídica pi.

El módulo de codificación 314 también codifica la etiqueta yi para cada instancia de datos i como una variable binaria que tiene valores del conjunto de {0, 1}, en el que un valor de 1 indica que el péptido xi fue presentado por uno de los alelos MHC asociados ai y un valor de 0 indica que el péptido xi no fue presentado por ninguno de los alelos MHC asociados ai. Cuando la variable dependiente yi representa la corriente iónica de espectrometría de masas, el módulo de codificación 314 puede escalar adicionalmente los valores utilizando diversas funciones, como la función logarítmica que tiene un rango de (-“ , ~) para valores de corriente iónica entre [0, ~).

El módulo de codificación 314 puede representar un par de variables de interacción alélica xhi para el péptido pi y un alelo MHC asociado h como un vector de filas en el que las representaciones numéricas de las variables que interactúan con el alelo se concatenan una tras otra. Por ejemplo, el módulo de codificación 314 puede representar xhi como un vector de filas igual a [pi], [pi bhi], [pi shi], o [pi bhi shi], donde bhi es la predicción de la afinidad de unión por péptido pi y alelo h MHC asociado, y similarmente para shi para estabilidad. Alternativamente, una o más combinaciones de variables de interacción alélica pueden almacenarse individualmente (por ejemplo, como vectores o matrices individuales).

En un caso, el módulo de codificación 314 representa la información de afinidad de unión incorporando valores medidos o previstos para la afinidad de unión en las variables de interacción alélica xhi.

En un caso, el módulo de codificación 314 representa la información de estabilidad de unión incorporando valores medidos o previstos para la estabilidad de unión en las variables de interacción alélica xhi,

En un caso, el módulo de codificación 314 representa la información sobre la tasa de enlace incorporando valores medidos o previstos para la tasa de enlace en las variables de interacción alélica xhi.

En una instancia, para péptidos presentados por las moléculas MHC de clase I, el módulo que codifica 314 representa longitud de péptido como un vector

Tk=[1(Lk=8) 1(Lk=9) 1(Lk=10) 1(Lk=11)

1(Lk=12) 1(Lk=13) 1(Lk=14) 1(Lk=15)]

donde 1 es la función indicadora, y Lk denota la longitud del péptido pk. El vector Tk puede incluirse en las variables de interacción alélica xhi. En otra instancia, para péptidos presentados mediante moléculas MHC de clase II, el módulo codificante 314 representa una longitud de péptido como un vector

Tk=[1(Lk=6) 1(Lk=7) 1(Lk=8) 1(Lk=9) 1(Lk=10) 1(Lk=11)

1(Lk=12) 1(Lk=13) 1(Lk=14) 1(Lk=15) 1(Lk=16) 1(Lk=17) 1(Lk=18) 1(Lk=19) 1(Lk=20) 1(Lk=21)

1(Lk=22) 1(Lk=23) 1(Lk=24) 1(Lk=25) 1(Lk=26) 1(Lk=27) 1(Lk=28) 1(Lk=29) 1(Lk=30)]

donde 1 es la función indicadora, y Lk denota la longitud del péptido pk. El vector Tk puede incluirse en las variables de interacción alélica xhi.

En una instancia , el módulo de codificación 314 representa la información de expresión del ARN de los alelos del MHC incorporando los niveles de expresión basados en ARN-seq de los alelos del MHC en las variables que interactúan con los alelos xhi.

Del mismo modo, el módulo de codificación 314 puede representar las variables alelo-no interactuantes wi como un vector de filas en el que las representaciones numéricas de las variables alelo-no interactuantes se concatenan una tras otra. Por ejemplo, wi puede ser un vector de filas igual a [ci] o [ci mi wi] en el que wi es un vector de filas que representa cualquier otra variable alelo-no interactuante además de la secuencia de flanqueo C-terminal del péptido pi y la medida de cuantificación de ARNm mi asociada al péptido. Alternativamente, una o más combinaciones de variables alélicas no interactuantes pueden almacenarse individualmente (por ejemplo, como vectores o matrices individuales).

En un caso, el módulo de codificación 314 representa la tasa de recambio de la proteína fuente para una secuencia peptídica incorporando la tasa de recambio o vida media en las variables alelo-no interactuante wi.

En un caso, el módulo de codificación 314 representa la longitud de la proteína fuente o isoforma incorporando la longitud de la proteína en las variables alelo-no interactuante wi.

En un caso, el módulo de codificación 314 representa la activación del inmunoproteasoma incorporando la expresión media de las subunidades del proteasoma específicas del inmunoproteasoma, incluidas las subunidades p1i, p2i, p5i en las variables alelo-no-interactuantes wi.

En un caso, el módulo de codificación 314 representa la abundancia de ARN-seq de la proteína fuente del péptido o gen o transcripción de un péptido (cuantificada en unidades de FPKM, TPM mediante técnicas como RSEM) puede ser incorporando la abundancia de la proteína fuente en las variables alelo-no-interactuante wi.

En un caso, el módulo de codificación 314 representa la probabilidad de que el transcrito de origen de un péptido sufra una desintegración mediada por el sinsentido (NMD, nonsense-mediated decay) según lo estimado por el modelo de, por ejemplo, Rivas et. al. Science, 2015 incorporando esta probabilidad en las variables de no interacción alélica wi.

En un caso, el módulo de codificación 314 representa el estado de activación de un módulo génico o vía evaluado mediante ARN-seq, por ejemplo, cuantificando la expresión génica de la vía en unidades de TPM utilizando, por ejemplo, RSEM para cada uno de los genes de la vía y calculando a continuación un resumen estadístico, por ejemplo, la media, de todos los genes de la vía. La media puede incorporarse a las variables alelo-no interactuantes wi.

En un caso, el módulo de codificación 314 representa el número de copia del gen fuente incorporando el número de copia en las variables alelo-no interactuante wi.

En un caso, el módulo de codificación 314 representa la afinidad de unión a TAP incluyendo la afinidad de unión a TAP medida o prevista (por ejemplo, en unidades nanomolares) en las variables alelo-no interactuante wi.

En un caso, el módulo de codificación 314 representa los niveles de expresión de TAP incluyendo los niveles de expresión de TAP medidos por ARN-seq (y cuantificados en unidades de TPM mediante, por ejemplo, RSEM) en las variables de no interacción alélica wi.

En un caso, el módulo de codificación 314 representa las mutaciones tumorales como un vector de variables indicadoras (es decir, dk = 1 si el péptido pk procede de una muestra con una mutación KRAS G12D y 0 en caso contrario) en las variables de no interacción alélica wi.

En un caso, el módulo de codificación 314 representa los polimorfismos de la línea germinal en los genes de presentación de antígenos como un vector de variables indicadoras (es decir, dk = 1 si el péptido pk procede de una muestra con un polimorfismo de línea germinal específico en el TAP). Estas variables indicadoras pueden incluirse en las variables que no interactúan con los alelos wi.

En un caso, el módulo de codificación 314 representa el tipo de tumor como un vector codificado de un solo punto de longitud sobre el alfabeto de tipos de tumores (por ejemplo, NSCLC, melanoma, cáncer colorrectal, etc.). Estas variables codificadas con un solo punto pueden incluirse en las variables sin interacción alélica wi.

En un caso, el módulo de codificación 314 representa los sufijos de los alelos MHC tratando los alelos HLA de 4 dígitos con sufijos diferentes. Por ejemplo, HLA-A*24:09N se considera un alelo diferente de HLA-A*24:09 a efectos del modelo. Alternativamente, la probabilidad de presentación por un alelo MHC con sufijo N puede fijarse en cero para todos los péptidos, porque los alelos HLA que terminan en el sufijo N no se expresan.

En un caso, el módulo de codificación 314 representa el subtipo de tumor como un vector codificado de una sola longitud sobre el alfabeto de subtipos de tumores (por ejemplo, adenocarcinoma de pulmón, carcinoma de células escamosas de pulmón, etc.). Estas variables codificadas con un solo punto pueden incluirse en las variables sin interacción alélica wi.

En un caso, el módulo de codificación 314 representa el historial de tabaquismo como una variable indicadora binaria (dk = 1 si el paciente tiene antecedentes de tabaquismo, y 0 en caso contrario), que puede incluirse en las variables de no interacción alélica wi. Alternativamente, el historial de tabaquismo puede codificarse como una variable codificada de un solo punto de longitud sobre un alfabeto de severidad de tabaquismo. Por ejemplo, el hábito de fumar puede valorarse en una escala de 1 a 5, en la que 1 indica no fumador y 5 indica fumador empedernido actual. Dado que el historial de tabaquismo es principalmente relevante para los tumores de pulmón, cuando se entrena un modelo en múltiples tipos de tumores, esta variable también se puede definir para que sea igual a 1 si el paciente tiene un historial de tabaquismo y el tipo de tumor es tumores de pulmón y cero en caso contrario.

En un caso, el módulo de codificación 314 representa el historial de quemaduras solares como una variable indicadora binaria (dk = 1 si el paciente tiene antecedentes de quemaduras solares graves, y 0 en caso contrario), que puede incluirse en las variables de no interacción alélica wi. Dado que el historial de quemaduras solares graves es principalmente relevante para los melanomas, cuando se entrena un modelo en múltiples tipos de tumores, esta variable también se puede definir para que sea igual a 1 si el paciente tiene un historial de quemaduras solares graves y el tipo de tumor es melanoma y cero en caso contrario.

En un caso, el módulo de codificación 314 representa la distribución de los niveles de expresión de un gen o transcripción particular para cada gen o transcripción en el genoma humano como estadísticas de resumen (por ejemplo, media, mediana) de la distribución de los niveles de expresión utilizando bases de datos de referencia como TCGA. En concreto, para un péptido pk en una muestra con melanoma de tipo tumoral, no sólo el nivel medido de expresión génica o de transcripción del gen o transcripción de origen del péptido pk en las variables que no interactúan con el alelo wi sino también la media y/o mediana de la expresión génica o del transcrito del gen o transcrito de origen del péptido pk en melanomas medidos por TCGA.

En un caso, el módulo de codificación 314 representa el tipo de mutación como una variable codificada de un solo punto de longitud sobre el alfabeto de tipos de mutación (por ejemplo, cambio de sentido, cambio de marco, inductor de NMD, etc.). Estas variables codificadas con un solo punto pueden incluirse en las variables sin interacción alélica wi.

En un caso, el módulo de codificación 314 representa las características a nivel de proteína de la proteína como el valor de la anotación (por ejemplo, longitud 5' UTR) de la proteína fuente en las variables alelo-nointeractuante wi. En otro caso, el módulo de codificación 314 representa anotaciones a nivel de residuo de la proteína fuente para el péptido pi mediante la inclusión de una variable indicadora, que es igual a 1 si el péptido pi se solapa con un motivo de hélice y 0 en caso contrario, o que es igual a 1 si el péptido pi está completamente contenido dentro de un motivo helicoidal en las variables alelo-no interactuantes wi. En otro caso, una característica que representa la proporción de residuos en el péptido pi que están contenidos en una anotación de motivo helicoidal puede incluirse en las variables alelo-no interactuante wi.

En un caso, el módulo de codificación 314 representa el tipo de proteínas o isoformas en el proteoma humano como un vector indicador ok que tiene una longitud igual al número de proteínas o isoformas en el proteoma humano, y el elemento correspondiente oki. es 1 si el péptido pk procede de la proteína i y 0 en caso contrario.

En un caso, el módulo de codificación 314 representa el gen fuente G=gen(pi) del péptido pi como una variable categórica con L categorías posibles, donde L denota el límite superior del número de genes fuente indexados 1, 2, ..., L.

En un caso, el módulo de codificación 314 representa el tipo de tejido, el tipo de célula, el tipo de tumor o el tipo de histología tumoral T=tejido(pi) del péptido pi como una variable categórica con M categorías posibles, donde M denota el límite superior del número de tipos indexados 1, 2, ..., M. Los tipos de tejido pueden incluir, por ejemplo, tejido pulmonar, tejido cardíaco, tejido intestinal, tejido nervioso, y similares. Los tipos de células pueden incluir células dendríticas, macrófagos, células T CD4 y similares. Los tipos de tumores pueden incluir adenocarcinoma de pulmón, carcinoma de células escamosas de pulmón, melanoma, linfoma no Hodgkin y similares.

El módulo de codificación 314 también puede representar el conjunto global de variables zi para el péptido pi y un alelo MHC h asociado como un vector de filas en el que las representaciones numéricas de las variables que interactúan con el alelo xi y las variables que no interactúan con el alelo wi se concatenan una tras otra. Por ejemplo, el módulo de codificación 314 puede representar zhi como un vector fila igual a [xhi wi] o [wi xhi].

VIII. Módulo de entrenamiento

El módulo de entrenamiento 316 construye uno o más modelos de presentación que generan probabilidades de si las secuencias peptídicas serán presentadas por alelos del MHC asociados con las secuencias peptídicas. Específicamente, dada una secuencia peptídica pk y un conjunto de alelos MHC ak asociados con la secuencia peptídica pk, cada modelo de presentación genera una estimación uk que indica una probabilidad de que la secuencia peptídica pk sea presentada por uno o más de los alelos MHC asociados ak.

VIII.A. Vista general

El módulo de entrenamiento 316 construye los modelos de presentación uno más basados en los conjuntos de datos de entrenamiento almacenados en el almacén 170 generados a partir de la información de presentación almacenada en 165. En general, independientemente del tipo específico de modelo de presentación, todos los modelos de presentación capturan la dependencia entre las variables independientes y las variables dependientes en los datos de entrenamiento 170 de tal forma que se minimiza una función de pérdida. Específicamente, la pérdida de función (yieS, uieS; 0) representa discrepancias entre valores de variables yieS dependientes para una o más instancias de datos S en los datos de entrenamiento 170 y las similitudes estimadas uieS para las instancias de datos S generadas por el modelo de presentación. En una implementación particular a la que se hace referencia a lo largo del resto de la especificación, la función de pérdida (yieS, uieS; 0) es la función de verosimilitud logarítmica negativa dada por la ecuación (1a) como sigue:

liyies.Uies'.o) = ^ ( y ¡ io g u ¡ ( i - y ¡ ) i o g ( i - u ¡ ) ) . (1a)

les

Sin embargo, en la práctica, puede utilizarse otra función de pérdida. Por ejemplo, cuando se hacen predicciones para la corriente iónica de la espectrometría de masas, la función de pérdida es la pérdida cuadrática media dada por la ecuación 1b como sigue:

i (yies.UieS;0) = ^ ( l l y ¡ - “ ¡IID. ( ib )

les

El modelo de presentación puede ser un modelo paramétrico en el que uno o más parámetros 0 especifican matemáticamente la dependencia entre las variables independientes y las variables dependientes. Normalmente, varios parámetros de modelos de presentación de tipo paramétrico que minimizan la función de pérdida (yieS, uieS; 0) se determinan mediante algoritmos de optimización numérica basados en gradientes, como algoritmos de gradiente por lotes, algoritmos de gradiente estocástico y similares. Alternativamente, el modelo de presentación puede ser un modelo no paramétrico en el que la estructura del modelo se determina a partir de los datos de entrenamiento 170 y no se basa estrictamente en un conjunto fijo de parámetros.

VIII.B. Modelos Por alelos

El módulo de entrenamiento 316 puede construir los modelos de presentación para predecir las probabilidades de presentación de los péptidos por alelo. En este caso, el módulo de entrenamiento 316 puede entrenar los modelos de presentación basándose en instancias de datos S en los datos de entrenamiento 170 generados a partir de células que expresan alelos MHC únicos.

En una implementación, el módulo de entrenamiento 316 modela la probabilidad de presentación estimada uk para el péptido pk para un alelo específico h mediante:

u ¡J = Pr(pfc presentado;alelo MHC h) =

donde la secuencia peptídica xhk denota las variables codificadas de interacción alélica para el péptido pk y el correspondiente alelo del MHC h,f() es cualquier función, y en lo sucesivo se denominará función de transformación para facilitar la descripción. Además, gh() es cualquier función, se denomina en el presente documento función de dependencia por comodidad de descripción, y genera puntuaciones de dependencia para las variables que interactúan con el alelo xhk basándose en un conjunto de parámetros 0 h determinados para el alelo MHC h. Los valores para el conjunto de parámetros 0 h para cada alelo MHC h pueden determinarse minimizando la función de pérdida con respecto a 0 h, donde i es cada instancia en el subconjunto S de datos de entrenamiento 170 generados a partir de células que expresan el único alelo MHC h.

La salida de la función de dependencia gh(xhk;0h) representa una puntuación de dependencia para el alelo MHC h que indica si el alelo MHC h presentará el neoantígeno correspondiente basándose en al menos las características de interacción alélica xhk, y en particular, basándose en posiciones de aminoácidos de la secuencia peptídica del péptido pk. Por ejemplo, la puntuación de dependencia para el alelo MHC h puede tener un valor alto si es probable que el alelo MHC h presente el péptido pk, y puede tener un valor bajo si la presentación no es probable. La función de transformación f() transforma la entrada, y más concretamente, transforma la puntuación de dependencia generada por gh(xhk;0h) en este caso, en un valor apropiado para indicar la probabilidad de que el péptido pk sea presentado por un alelo del MHC.

En una implementación particular referida a lo largo del resto de la especificación, f() es una función que tiene el rango dentro de [0, 1] para un rango de dominio apropiado. En un ejemplo, f ( ) es la función expit dada por:

exp (z)

/ ( z ) = T T lX p Í ) . (4)

Como otro ejemplo, f( ) también puede ser la función tangente hiperbólica dada por:

f ( z ) = tanh(z) (5)

cuando los valores del dominio z son iguales o superiores a 0. Alternativamente, cuando se hacen predicciones para la corriente de iones de espectrometría de masas que tienen valores fuera del rango [0, 1],f() puede ser cualquier función como la función de identidad, la función exponencial, la función logarítmica y similares.

Así, la probabilidad por alelo de que una secuencia peptídica pk sea presentada por un alelo h del MHC puede generarse aplicando la función de dependencia gh() para el alelo h del MHC a la versión codificada de la secuencia peptídica pk para generar la puntuación de dependencia correspondiente. La puntuación de dependencia puede transformarse mediante la función de transformación f( ) para generar una probabilidad por alelo de que la secuencia peptídica pk sea presentada por el alelo h del MHC.

VIII.B.1 Funciones de dependencia para variables de interacción alélica

En una implementación particular a la que se hace referencia a lo largo de la especificación, la función de dependencia gh() es una función afín dada por:

ah(xih;Oh) = x ih eh. (6)

que combina linealmente cada variable de interacción alélica en xhk con un parámetro correspondiente en el conjunto de parámetros 0 h determinado para el alelo h del MHC asociado.

En otra implementación particular a la que se hace referencia a lo largo de la especificación, la función de dependencia gh() es una función de red dada por:

gh(x lh;Oh) = N N h(x¡l ;Oh). (7)

representado por un modelo de red NNh() que tiene una serie de nodos dispuestos en una o varias capas. Un nodo puede estar conectado a otros nodos mediante conexiones cada una de las cuales tiene un parámetro asociado en el conjunto de parámetros 0 h. Un valor en un nodo particular puede ser representado como una suma de los valores de los nodos conectados al nodo particular ponderado por el parámetro asociado mapeado por una función de activación asociada con el nodo particular. En contraste con la función afín, los modelos de red son ventajosos porque el modelo de presentación puede incorporar la no linealidad y procesar datos que tienen diferentes longitudes de secuencias de aminoácidos. Específicamente, mediante el modelado no lineal, los modelos de red pueden captar la interacción entre aminoácidos en distintas posiciones de una secuencia peptídica y cómo esta interacción afecta a la presentación del péptido.

En general, los modelos de red NNh() pueden estructurarse como redes feed-forward, tales como redes neuronales artificiales (ANN), redes neuronales convolucionales (CNN), redes neuronales profundas (DNN), y/o redes recurrentes, tales como redes de memoria a largo plazo (LSTM), redes recurrentes bidireccionales, redes recurrentes bidireccionales profundas, y similares.

En un caso referido a lo largo del resto de la memoria descriptiva, cada alelo MHC en h=1,2,..., m se asocia con un modelo de red separado, y NNh() denota la(s) salida(s) de un modelo de red asociado con el alelo MHC h..

La FIG. 5 ilustra un ejemplo de modelo de red NN3() en asociación con un alelo MHC arbitrario h=3. Como se muestra en la FIG. 5, el modelo de red NN3() para el alelo MHC h=3 incluye tres nodos de entrada en la capa l=1, cuatro nodos en la capa l=2, dos nodos en la capa l=3, y un nodo de salida en la capa l=4. El modelo de red NN3() se asocia con un conjunto de diez parámetros 03(1), 03(2), ..., 03(10). El modelo de red NN3() recibe valores de entrada (instancias de datos individuales que incluyen datos de secuencias polipeptídicas codificadas y cualquier otro dato de entrenamiento utilizado) para tres variables de interacción alélica x3k(1), x3k(2) y x3k(3) para el alelo MHC h=3 y da como salida el valor NN3(x3k). La función de red también puede incluir uno o más modelos de red, cada uno de los cuales toma como entrada diferentes variables de interacción alélica.

En otro caso, los alelos MHC identificados h=1, 2, ..., m se asocian con un único modelo de red NNH(), y NNh() denota una o más salidas del modelo de red único asociado con el alelo MHC h. En tal caso, el conjunto de parámetros 0 h puede corresponder a un conjunto de parámetros para el modelo de red único y, por lo tanto, el conjunto de parámetros 0 h puede ser compartido por todos los alelos MHC.

La FIG. 6A ilustra un ejemplo de modelo de red NNH() compartido por los alelos MHC h=1,2, ...,m. Como se muestra en la FIG. 6A, el modelo de red NNH()i ncluye m nodos de salida, cada uno correspondiente a un alelo MHC. El modelo de red NN3() recibe las variables que interactúan con el alelo x3k para el alelo MHC h=3 y emite m valores que incluyen el valor NN3(x3k) correspondiente al alelo MHC h=3.

En aún otro caso, el modelo de red único NNH() puede ser un modelo de red que produce una puntuación de dependencia dadas las variables de interacción alélica xhk y la secuencia de proteína codificada dh de un alelo h del MHC. En tal caso, el conjunto de parámetros 0h puede corresponder de nuevo a un conjunto de parámetros para el modelo de red único y, por lo tanto, el conjunto de parámetros 0h puede ser compartido por todos los alelos MHC. Así, en tal caso, NNh() puede denotar la salida del modelo de red única NNH() dadas las entradas [xhk dh] al modelo de red única. Este modelo de red es ventajoso porque las probabilidades de presentación de péptidos para alelos del MHC desconocidos en los datos de entrenamiento pueden predecirse simplemente identificando su secuencia proteica.

La FIG. 6B ilustra un ejemplo de modelo de red NNH() compartido por alelos MHC. Como se muestra en la FIG. 6B, el modelo de red NNH() recibe las variables de interacción alélica y la secuencia proteica del alelo MHC h=3 como entrada, y emite una puntuación de dependencia NN3(x3k) correspondiente al alelo MHC h=3.

En aún otro caso, la función de dependencia gh() puede expresarse como:

<dh(xkh-,>eh)<= g 'h(x kh-,>e'h)<+ 0%>

donde g'h(xhk;0'h) es la función afín con un conjunto de parámetros 0'h, la función de red, o similar, con un parámetro de sesgo 0hO en el conjunto de parámetros para las variables de interacción alélica para el alelo MHC que representa una probabilidad basal de presentación para el alelo MHC h.

En otra implementación, el parámetro de sesgo 0hO puede compartirse en función de la familia de genes del alelo h del MHC. Es decir, el parámetro de sesgo 0ho para el alelo h del MHC puede ser igual a 0gen(h)O, donde gen(h) es la familia de genes del alelo MHC h. Por ejemplo, los alelos MHC de clase I HLA-A*02:01, HLA-A*02:02 y HLA-A*02:03 pueden asignarse a la familia de genes "HLA-A", y el parámetro de sesgo 0hO para cada uno de estos alelos MHC puede ser compartido. Como otro ejemplo, los alelos MHC de clase II HLA-DRB1:10:01, HLA-DRB1:11:01 y HLA-DRB3:01:01 pueden asignarse a la familia de genes "HLA-DRB", y el parámetro de sesgo 0h0 para cada uno de estos alelos MHC puede ser compartido.

Volviendo a la ecuación (2), como ejemplo, la probabilidad de que el péptido pk sea presentado por el alelo MHC h=3, entre m=4 alelos MHC diferentes identificados utilizando la función de dependencia afín gh(), puede generarse mediante:

“ i! = / ( * 3 • Os).

donde x3k son las variables identificadas que interactúan con el alelo para el alelo MHC h=3, y 03 son el conjunto de parámetros determinados para el alelo MHC h=3 mediante la minimización de la función de pérdida.

Como otro ejemplo, la probabilidad de que el péptido pk sea presentado por el alelo MHC h=3, entre m=4 alelos MHC diferentes identificados utilizando funciones de transformación de red separadas gh(), puede generarse mediante:

“ fe = f(N N 3(x%,e3)),

donde x3k son las variables identificadas que interactúan con el alelo para el alelo MHC h=3, y 03 son el conjunto de parámetros determinados para el modelo de red NN3() asociado al alelo MHC h=3.

La FIG. 7 ilustra la generación de una probabilidad de presentación para el péptido pk en asociación con el alelo MHC h=3 utilizando un modelo de red de ejemplo NN3(). Como se muestra en la FIG. 7, el modelo de red NN3() recibe las variables de interacción alélica x3k para el alelo MHC h=3 y genera la salida NN3(x3k). La salida se mapea mediante la función f() para generar la probabilidad de presentación estimada uk.

VIII.B.2. Por alelo con variables que no interactúan con alelos

En una implementación, el módulo de entrenamiento 316 incorpora variables de no interacción alélica y modela la probabilidad de presentación estimada uk para el péptido pk mediante:

(pk presentado) = f ( gw(w k; 0W) gh(x lh; 0h)'), (8)

donde wk denota las variables alelo-no interactuantes codificadas para el péptido pk, gw() es una función para las variables alelo-no interactuantes wk basada en un conjunto de parámetros 0w determinados para las variables alelo-no interactuantes. En concreto, los valores para el conjunto de parámetros 0h para cada alelo h del MHC y el conjunto de parámetros 0w para las variables que no interactúan con los alelos pueden determinarse minimizando la función de pérdida con respecto a 0h y 0w, donde i es cada instancia del subconjunto S de datos de entrenamiento 170 generados a partir de células que expresan alelos MHC únicos.

La salida de la función de dependencia gw(wk;0w) representa una puntuación de dependencia para las variables alelo no interactuantes que indica si el péptido pk será presentado por uno o más alelos del MHC en función del impacto de las variables de no interacción de los alelos. Por ejemplo, la puntuación de dependencia de las variables alelo no interactuantes puede tener un valor alto si el péptido pk está asociado a una secuencia de flanqueo C-terminal que se sabe que influye positivamente en la presentación del péptido pk y puede tener un valor bajo si el péptido pk está asociado a una secuencia de flanqueo C-terminal que se sabe que afecta negativamente a la presentación del péptido pk.

Según la ecuación (8), la probabilidad por alelo de que una secuencia peptídica pk sea presentada por un alelo h del MHC puede generarse aplicando la función gh() para el alelo h del MHC a la versión codificada de la secuencia peptídica pk para generar la puntuación de dependencia correspondiente para variables que interactúan con alelos. La función gw() para las variables alélicas que no interactúan también se aplica a la versión codificada de las variables alélicas que no interactúan para generar la puntuación de dependencia de las variables alélicas que no interactúan. Ambas puntuaciones se combinan y la puntuación combinada se transforma mediante la función de transformación f( ) para generar una probabilidad por alelo de que la secuencia peptídica pk sea presentada por el alelo h del MHC.

Alternativamente, el módulo de entrenamiento 316 puede incluir variables de no interacción alélica wk en la predicción añadiendo las variables alelo-no interactuantes wk a las variables que interactúan con los alelos xhk en la ecuación (2). Así, la probabilidad de presentación puede venir dada por:

u¡J = Pr(p fc presentado;alelo h) = f {j3h{[xh wk\ ’ ^hS). (9)

VIII.B.3 Funciones de dependencia para variables alélicas no interactuantes

De manera similar a la función de dependencia gh() para las variables que interactúan con los alelos, la función de dependencia gw() para las variables que no interactúan con los alelos puede ser una función afín o una función de red en la que se asocia un modelo de red separado a las variables que no interactúan con los alelos wk.

En concreto, la función de dependencia gw()es una función afín dada por:

gw(w k;Ow) = w k -0 w.

que combina linealmente las variables que no interactúan con los alelos en wk con un parámetro correspondiente en el conjunto de parámetros 0w.

La función de dependencia gw() también puede ser una función de red dada por:

aw{wk;Ow) = NNw(wk;0 w).

representado por un modelo de red NNw() que tiene un parámetro asociado en el conjunto de parámetros 0w. La función de red también puede incluir uno o más modelos de red, cada uno de los cuales toma como entrada diferentes variables de no interacción alélica.

En otro caso, la función de dependencia gw() para las variables alelo-no interactuantes puede venir dada por:

gw(wk;Ow) = g 'w(wk;0 'w) h(mfc; 0 , (10)

donde g'w(wk;0'w) es la función afín, la función de red con el conjunto de parámetros alelos no interactuantes 0'w, o similares, mk es la medida de cuantificación de ARNm para el péptido pk, h( ) es una función que transforma la medida de cuantificación, y 0wm es un parámetro del conjunto de parámetros para variables alelo no interactuantes que se combina con la medida de cuantificación de ARNm para generar una puntuación de dependencia para la medida de cuantificación de ARNm. En una realización particular a la que se hace referencia a lo largo del resto de la especificación, h () es la función logarítmica, sin embargo en la práctica h () puede ser cualquiera de una variedad de funciones diferentes.

En aún otro caso, la función de dependencia gw() para las variables alelo-no interactuantes puede venir dada por:

gw {w k; ow) = g 'w {wk; o'w) o°w ok, (11)

donde g'w(wk;0'w) es la función afín, la función de red con el conjunto de parámetros de no interacción alélica 0'w, o similar, ok es el vector indicador descrito en la Sección VII.C.2 que representa proteínas e isoformas en el proteoma humano para el péptido pk, y 0woes un conjunto de parámetros en el conjunto de parámetros para variables de no interacción alélica que se combina con el vector indicador. En una variación, cuando la dimensionalidad de ok y el conjunto de parámetros 0wo son significativamente altos, se puede añadir a la función de pérdida un término de regularización de parámetros, como X • ||0° ||, donde INI representa la norma L1, la norma L2, una combinación o similar, al determinar el valor de los parámetros. El valor óptimo del hiperparámetro A puede determinarse mediante métodos adecuados.

L

gw{wk\Ow) = g 'w(wk;0 'w) ^ l ( g e n ( p k) = l) • Qlw, (12)

i=i

donde g'w(wk;0'w) es la función afín, la función de red con el conjunto de parámetros alelos no interactuantes 0'w, o similares,

1(gen(pk=l))

es la función indicadora que es igual a 1 si el péptido pk procede del gen fuente l, tal como se ha descrito anteriormente en referencia a las variables de no interacción alélica, y 0wl es un parámetro que indica la "antigenicidad" del gen fuente l. En una variación, cuando L es significativamente alto, y por lo tanto, el número de parámetros 0wl=1, 2, ..., L son significativamente altos, un término de regularización de parámetros, como X - ||0¡J|, donde || || representa la norma L1, la norma L2, una combinación, o similar, puede añadirse a la función de pérdida cuando se determina el valor de los parámetros. El valor óptimo del hiperparámetro A puede determinarse mediante métodos adecuados.

M L

gw(wk;Ow) = g 'W(w k;0 'w) ^ ^ l ( g e n ( p fc) = í,te jido(pfc) = m) • 0 ^ , (12b) m=l(=1

donde g'w(wk;0'w) es la función afín, la función de red con el conjunto de parámetros de no interacción alélica 0'w, o similares,

1(gen(pk)=l,

tejido(pk)=m) es la función indicadora que equivale a 1 si el péptido pk procede del gen de origen l y si el péptido pk procede del tipo de tejido m, tal como se ha descrito anteriormente en referencia a las variables de no interacción alélica, y 0wlm es un parámetro que indica la antigenicidad de la combinación del gen de origen l y el tipo de tejido m. En concreto, la antigenicidad del gen l para el tipo de tejido m puede denotar la propensión residual de las células del tipo de tejido m a presentar péptidos del gen l tras controlar la expresión del ARN y el contexto de la secuencia peptídica.

En una variación, cuando L o M es significativamente alto, y por lo tanto, el número de parámetros 0wlm=1, 2, ..., LM son significativamente altos, un término de regularización de parámetros, como X- ||0{J?||, donde || || representa la norma L1, la norma L2, una combinación, o similar, puede añadirse a la función de pérdida cuando se determina el valor de los parámetros. El valor óptimo del hiperparámetro A puede determinarse mediante métodos adecuados. En otra variación, se puede añadir un término de regularización de parámetros a la función de pérdida cuando se determina el valor de los parámetros, de forma que los parámetros para el mismo gen fuente no difieran significativamente entre tipos de tejido. Por ejemplo, un término de penalización como:

donde 0*, es la antigenicidad media entre tipos de tejido para el gen fuente l, puede penalizar la desviación estándar de la antigenicidad entre diferentes tipos de tejido en la función de pérdida.

L M

9w{wk\0 w) = g 'w{wk-,e'w) ^ l (g e n e ( p fc) = l) -Q lw ^ l( lo c (p fc) = m) ■ O™ (12c)

(=1 m=l

1(gene(pk=l))

es la función indicadora que equivale a 1 si el péptido pk procede del gen fuente l, tal como se ha descrito anteriormente en referencia a las variables de no interacción alélica, y 0wl es un parámetro que indica la "antigenicidad" del gen fuente l , y

1 (loc(pk=m))

es la función indicadora que es igual a 1 si el péptido pk procede de la localización proteómica m, y 0™ es un parámetro que indica hasta qué punto la localización proteómica m es una "región clave" de presentación. En una realización, una localización proteómica puede comprender un bloque de n péptidos adyacentes de la misma proteína, donde n es un hiperparámetro del modelo determinado mediante métodos apropiados como la validación cruzada de búsqueda en cuadrícula.

En la práctica, los términos adicionales de cualquiera de las ecuaciones (10), (11), (12a), (12b) y (12c) pueden combinarse para generar la función de dependencia gw() para variables alélicas no interactuantes. Por ejemplo, el término h () que indica la medición de la cuantificación del ARNm en la ecuación (10) y el término que indica la antigenicidad del gen fuente en la ecuación (12) pueden sumarse junto con cualquier otra función afín o de red para generar la función de dependencia para las variables alélicas que no interactúan.

Volviendo a la ecuación (8), como ejemplo, la probabilidad de que el péptido pk sea presentado por el alelo MHC h=3, entre m=4 alelos MHC diferentes identificados utilizando las funciones de transformación afines gh(), g2(), puede generarse mediante:

donde wk son las variables alelo-no interactuantes identificadas para el péptido pk y 0w son el conjunto de parámetros determinados para las variables alelo-no interactuantes.

Como otro ejemplo, la probabilidad de que el péptido pk sea presentado por el alelo MHC h=3, entre m=4 alelos MHC diferentes identificados utilizando funciones de transformación de red gh(), gw(), puede generarse mediante:

u3k = f{N N w(w k;Ow) NN3(xk;03))

donde wk son las variables alelo-interactuantes identificadas para el péptido pk y 0w son el conjunto de parámetros determinados para variables alelo-no interactuantes.

La FIG. 8 ilustra la generación de una probabilidad de presentación para el péptido pk en asociación con el alelo MHC h=3 utilizando modelos de red de ejemplo NN3() y NNw(). Como se muestra en la FIG. 8, el modelo de red NN3() recibe las variables de interacción alélica x3k para el alelo MHC h=3 y genera la salida NN3(x3k). El modelo de red NNw() recibe las variables alelo-no interactuantes wk para el péptido pk y genera la salida NNw(wk). Las salidas se combinan y se mapean mediante la función f( ) para generar la probabilidad de presentación estimada uk.

VIII.C. Modelos de alelos múltiples

El módulo de entrenamiento 316 también puede construir los modelos de presentación para predecir las probabilidades de presentación de los péptidos en un entorno de alelos múltiples en el que están presentes dos o más alelos del MHC. En este caso, el módulo de entrenamiento 316 puede entrenar los modelos de presentación basándose en instancias de datos S en los datos de entrenamiento 170 generados a partir de células que expresan alelos MHC únicos, células que expresan alelos MHC múltiples o una combinación de estos.

VIII.C.1. Ejemplo 1: Máximo de modelos por alelo

En una implementación, el módulo de entrenamiento 316 modela la probabilidad de presentación estimada uk para el péptido pk en asociación con un conjunto de múltiples alelos H del MHC como una función de las probabilidades de presentación ukheH determinadas para cada uno de los alelos MHC h en el conjunto H determinado sobre la base de células que expresan alelos únicos, como se ha descrito anteriormente junto con las ecuaciones (2)-(11). Específicamente, la probabilidad de presentación uk puede ser cualquier función de ukheH . En una implementación, como se muestra en la ecuación (12), la función es la función máxima, y la probabilidad de presentación uk puede determinarse como el máximo de las probabilidades de presentación para cada alelo MHC h en el conjunto H.

uk = Pr(pfc presentado;alelos H ) = max(u|JeH).

VIII.C.2. Ejemplo 2,1: Modelos de función de suma

En una implementación, el módulo de entrenamiento 316 modela la probabilidad de presentación estimada uk para el péptido pk mediante:

donde los elementos ahk son 1 para los múltiples alelos H del MHC asociados a la secuencia peptídica pk y xhk denota las variables codificadas de interacción alélica para el péptido pk y los alelos MHC correspondientes. Los valores para el conjunto de parámetros 0h para cada alelo h del MHC pueden determinarse minimizando la función de pérdida con respecto a 0h donde i es cada instancia del subconjunto S de datos de entrenamiento 170 generados a partir de células que expresan alelos MHC únicos y/o células que expresan alelos MHC múltiples. La función de dependencia gh puede tener la forma de cualquiera de las funciones de dependencia gh introducidas anteriormente en la sección VIII.B.1.

Según la ecuación (13), la probabilidad de presentación de que una secuencia peptídica pk sea presentada por uno o más alelos h MHC puede generarse aplicando la función de dependencia gh() a la versión codificada de la secuencia peptídica pk para cada uno de los alelos H MHC con el fin de generar la puntuación correspondiente para las variables de interacción alélica. Las puntuaciones de cada alelo h del MHC se combinan y se transforman mediante la función de transformación f( ) para generar la probabilidad de presentación de que la secuencia peptídica pk sea presentada por el conjunto de alelos H MHC .

El modelo de presentación de la ecuación (13) es diferente del modelo por alelo de la ecuación (2), en el sentido de que el número de alelos asociados para cada péptido pk puede ser superior a 1. En otras palabras, más de un elemento en ahk puede tener valores de 1 para los múltiples alelos H MHC asociados con la secuencia peptídica pk.

Como un ejemplo, la probabilidad de que el péptido pk sea presentado por los alelos MHC h=2, h=3, entre m=4 alelos MHC diferentes identificados utilizando las funciones de transformación afines gh(), puede generarse mediante:

donde x2k, x3k son las variables identificadas de interacción alélica para los alelos MHC h=2, h=3, y 02, 03 son el conjunto de parámetros determinados para los alelos MHC h=2, h=3.

Como otro ejemplo, la probabilidad de que el péptido pk sea presentado por el alelo MHC h=2, h=3, entre m=4 alelos MHC diferentes identificados utilizando funciones de transformación de red gh(), gw(), puede generarse mediante:

u k = f{N N 2(xk2;e 2)+ N N 3(xk3;e 3)),

donde NN2(), NN3() son los modelos de red identificados para los alelos MHC h=2, h=3, y 02, 03 son el conjunto de parámetros determinados para los alelos MHC h=2, h=3.

La FIG. 9 ilustra la generación de una probabilidad de presentación para el péptido pk en asociación con alelos MHC h=2, h=3 utilizando modelos de red de ejemplo NN2() y NN3(). Como se muestra en la FIG. 9, el modelo de red NN2() recibe las variables de interacción alélica x2k para el alelo MHC h=2 y genera la salida NN2(x2k) y el modelo de red NN3() recibe las variables de interacción alélica x3k para el alelo MHC h=3 y genera la salida NN3(x3k). Las salidas se combinan y se mapean mediante la función f( ) para generar la probabilidad de presentación estimada uk.

VIII.C.3. Ejemplo 2,2: Modelos de función de suma con variables alélicas no interactivas

</>m

uk = Pr(pk presentado) = f9w{wk\e w) ^ a£ • gh(xkh;

h=l

donde wk denota las variables alelo-no interactuantes codificadas para el péptido pk. Específicamente, los valores para el conjunto de parámetros 0h para cada alelo h del MHC y el conjunto de parámetros 0w para las variables que no interactúan con los alelos pueden determinarse minimizando la función de pérdida con respecto a 0h y 0w, donde i es cada instancia del subconjunto S de datos de entrenamiento 170 generados a partir de células que expresan alelos MHC únicos y/o células que expresan múltiples alelos MHC. La función de dependencia gw puede tener la forma de cualquiera de las funciones de dependencia gw introducidas anteriormente en la sección VIII.B.3.

Así, según la ecuación (14), la probabilidad de presentación de que una secuencia peptídica pk sea presentada por uno o más alelos H MHC puede generarse aplicando la función gh() a la versión codificada de la secuencia peptídica pk para cada uno de los alelos H MHC con el fin de generar la puntuación de dependencia correspondiente para las variables de interacción alélica h para cada alelo MHC. La función gw() para las variables alélicas que no interactúan también se aplica a la versión codificada de las variables alélicas que no interactúan para generar la puntuación de dependencia de las variables alélicas que no interactúan. Las puntuaciones se combinan y la puntuación combinada se transforma mediante la función de transformación f( ) para generar una probabilidad de presentación de que la secuencia peptídica pk sea presentada por alelos MHC H.

En la presentación del modelo por alelo de la ecuación (14), en el sentido de que el número de alelos asociados para cada péptido pk puede ser superior a 1. En otras palabras, más de un elemento en ahk puede tener valores de 1 para los múltiples alelos H MHC asociados con la secuencia peptídica pk.

Como un ejemplo, la probabilidad de que el péptido pk sea presentado por el alelo MHC h=2, h=3, entre m=4 alelos MHC diferentes identificados utilizando funciones de transformación afines gh(), gw(), puede generarse mediante:

uk = f { w k Ow x $ 02 x ^ 03),

uk = f{N N w(w k;Ow) NN2(xk;e 2) NN3(xk;03))

La FIG. 10 ilustra la generación de una probabilidad de presentación para el péptido pk en asociación con alelos MHC h=2, h=3 utilizando modelos de red de ejemplo NN2(), NN3(), y NNw(). Como se muestra en la FIG.

10, el modelo de red NN2() recibe las variables de interacción alélica x2k para el alelo MHC h=2 y genera la salida NN2(x2k). El modelo de red NN3() recibe las variables de interacción alélica x3k para el alelo MHC h=3 y genera la salida NN3(x3k). El modelo de red NNw() recibe las variables alelo-no interactuantes wk para el péptido pk y genera la salida NNw(wk). Las salidas se combinan y se mapean mediante la función f( ) para generar la probabilidad de presentación estimada uk.

Alternativamente, el módulo de entrenamiento 316 puede incluir variables de no interacción alélica wk en la predicción añadiendo las variables alelo-no interactuantes wk a las variables que interactúan con los alelos xhk en la ecuación (15). Así, la probabilidad de presentación puede venir dada por:

uk = Pr(p* presentado) = • gh([x k w*]; Bh) (15)

Vft=i

VIII.C.4. Ejemplo 3.1: Modelos con probabilidades implícitas por alelo

En otra implementación, el módulo de entrenamiento 316 modela la probabilidad de presentación estimada uk para el péptido pk mediante:

uk = Pr(pk presentado)

donde los elementos ahk son 1 para los múltiples alelos MHC h e H asociado a la secuencia peptídica pk, u'kh es una probabilidad de presentación implícita por alelo para el alelo h del MHC, el vector v es un vector en el que el elemento vh corresponde a ahk • u'kh, s () es una función que asigna los elementos de v y r ( ) es una función de recorte que recorta el valor de la entrada en un rango determinado. Como se describe a continuación con más detalle, s () puede ser la función sumatoria o la función de segundo orden, pero se aprecia que en otras realizaciones, s () puede ser cualquier función, como la función máxima. Los valores para el conjunto de parámetros 0 para las probabilidades implícitas por alelo pueden determinarse minimizando la función de pérdida con respecto a 0 donde i es cada instancia del subconjunto S de datos de entrenamiento 170 generados a partir de células que expresan alelos MHC únicos y/o células que expresan alelos MHC múltiples.

La probabilidad de presentación en el modelo de presentación de la ecuación (17) se modela como una función de las probabilidades de presentación implícitas por alelo u'kh que corresponden cada una al péptido de probabilidad pk sea presentado por un alelo MHC individual h.La probabilidad implícita por alelo se diferencia de la probabilidad de presentación por alelo de la sección VIII.B en que los parámetros para las probabilidades implícitas por alelo pueden aprenderse de configuraciones de alelos múltiples, en las que se desconoce la asociación directa entre un péptido presentado y el alelo MHC correspondiente, además de configuraciones de alelo único. Así, en un entorno de alelos múltiples, el modelo de presentación puede estimar no sólo si el péptido pk será presentado por un conjunto de alelos H del MHC, sino que también puede proporcionar probabilidades individuales u'kheH que indican qué alelo del MHC h presentó con mayor probabilidad el péptido pk. Una ventaja de esto es que el modelo de presentación puede generar las probabilidades implícitas sin datos de entrenamiento para células que expresan alelos MHC únicos.

En una implementación particular referida a lo largo del resto de la especificación, r() es una función que tiene el rango [0, 1]. Por ejemplo, r() puede ser la función clip:

r(z ) = min (max(z, 0), 1),

donde el valor mínimo entre z y 1 se elige como probabilidad de presentación uk. En otra implementación, r() es la función tangente hiperbólica dada por:

r(z ) = tanh(z)

cuando los valores del dominio z son iguales o superiores a 0.

VIII.C.5. Ejemplo 3.2: Modelo de suma de funciones

En una implementación concreta, s () es una función sumatoria, y la probabilidad de presentación viene dada por la suma de las probabilidades de presentación implícitas por alelo:

uk Pr(p fc presentado)

En una implementación, la probabilidad de presentación implícita por alelo para el alelo h del MHC se genera mediante:

< h = f ( a h ( x kh;Oh)) , (18)

tal que la probabilidad de presentación se estima mediante:

uk = Pr(pfc presentado)

Según la ecuación (19), la probabilidad de presentación de que una secuencia peptídica pk sea presentada por uno o más alelos h MHC puede generarse aplicando la función gh() a la versión codificada de la secuencia peptídica pk para cada uno de los alelos H MHC con el fin de generar la puntuación de dependencia correspondiente para las variables de interacción alélica. Cada puntuación de dependencia se transforma primero mediante la función f() para generar probabilidades de presentación implícitas por alelo u'kh. Las probabilidades por alelo u'kh se combinan, y la función de recorte puede aplicarse a las probabilidades combinadas para recortar los valores en un intervalo [0, 1] y generar la probabilidad de presentación de que la secuencia peptídica pk sea presentada por el conjunto de alelos H del MHC. La función de dependencia gh puede adoptar la forma de cualquiera de las funciones de dependencia gh introducidas anteriormente en la sección VIII.B.1.

uk = r ( / ( * £ • 02) f(x% • 03)),

uk = r ( f(N N 2 (<x>$;Q2) ) f(N N 3 (x%; 03))),

La FIG. 11 ilustra la generación de una probabilidad de presentación para el péptido pk en asociación con alelos MHC h=2, h=3 utilizando modelos de red de ejemplo<n>N2() y NN3(). Como se muestra en la FIG. 9, el modelo de red NN2() recibe las variables de interacción alélica x2k para el alelo MHC h=2 y genera la salida NN2(x2k) y el modelo de red NN3( ) recibe las variables de interacción alélica x3k para el alelo MHC h=3 y genera la salida NN3(x3k). Cada salida se mapea mediante la función f() y se combina para generar la probabilidad de presentación estimada uk.

En otra implementación, cuando las predicciones se hacen para el logaritmo de las corrientes de iones de espectrometría de masas, r() es la función logarítmica y f( ) es la función exponencial.

VIII.C.6. Ejemplo 3.3: Modelos de suma de funciones con variables sin interacción alélica

<K h>=<f ( d h ( x kh->,<eh)>+<gw(w k->,<ew)^>, (20) tal que la probabilidad de presentación se genera mediante:

uk = Pr(pk presentado)

para incorporar el impacto de las variables alélicas que no interactúan en la presentación del péptido.

Según la ecuación (21), la probabilidad de presentación de que una secuencia peptídica pk sea presentada por uno o más alelos H MHC puede generarse aplicando la función gh() a la versión codificada de la secuencia peptídica pk para cada uno de los alelos H MHC con el fin de generar la puntuación de dependencia correspondiente para las variables de interacción alélica h para cada alelo MHC. La función gw() para las variables alélicas que no interactúan también se aplica a la versión codificada de las variables alélicas que no interactúan para generar la puntuación de dependencia de las variables alélicas que no interactúan. La puntuación de las variables alélicas que no interactúan se combina con cada una de las puntuaciones de dependencia de las variables alélicas que interactúan. Cada una de las puntuaciones combinadas se transforma mediante la función f( ) para generar las probabilidades implícitas de presentación por alelo. Las probabilidades implícitas se combinan, y la función de recorte puede aplicarse a las salidas combinadas para recortar los valores en un intervalo [0,1] y generar la probabilidad de presentación de que la secuencia peptídica pk sea presentada por los alelos H de MHC. La función de dependencia gw puede adoptar la forma de cualquiera de las funciones de dependencia gw introducidas anteriormente en la sección VIII.B.3.

uk = r ( f(N N w(w k;Ow) NN2(xk;02)) f(N N w(w k;Ow) NN3(xk;03) ))

La FIG. 12 ilustra la generación de una probabilidad de presentación para el péptido pk en asociación con alelos MHC h=2, h=3 utilizando modelos de red de ejemplo NN2(), NN3(), y NNw(). Como se muestra en la FIG.

12, el modelo de red NN2() recibe las variables de interacción alélica x2k para el alelo MHC h=2 y genera la salida NN2(x2k). El modelo de red NNw() recibe las variables alelo-no interactuantes wk para el péptido pk y genera la salida NNw(wk). Las salidas se combinan y se asignan mediante la función f(). El modelo de red NN3() recibe las variables de interacción alélica x3k para el alelo MHC h=3 y genera la salida NN3(x3k), que se combina de nuevo con la salida NNw(wk) del mismo modelo de red NNw() y se mapea mediante la función f(). Ambas salidas se combinan para generar la probabilidad de presentación estimada uk.

En otra implementación, la probabilidad de presentación implícita por alelo para el alelo h del MHC se genera mediante:

< h = f ( 9h{[xkh wk\, 0ft)) . (22)

tal que la probabilidad de presentación se genera mediante:

VIII.C.7. Ejemplo 4: Modelos de segundo orden

En una implementación, s () es una función de segundo orden, y la probabilidad de presentación estimada uk para el péptido pk viene dada por:

uk = Pr(p k presentado)

donde los elementos u'kh son la probabilidad de presentación implícita por alelo para el alelo h de MHC. Los valores para el conjunto de parámetros 0 para las probabilidades implícitas por alelo pueden determinarse minimizando la función de pérdida con respecto a 0 donde i es cada instancia del subconjunto S de datos de entrenamiento 170 generados a partir de células que expresan alelos MHC únicos y/o células que expresan alelos MHC múltiples. Las probabilidades implícitas de presentación por alelo pueden tener cualquier forma mostrada en las ecuaciones (18), (20) y (22) descritas anteriormente.

En un aspecto, el modelo de la ecuación (23) puede implicar que existe un péptido de posibilidad pk sea presentado por dos alelos MHC simultáneamente, en la que la presentación por dos alelos HLA es estadísticamente independiente.

Según la ecuación (23), la probabilidad de presentación de que una secuencia peptídica pk sea presentada por uno o más alelos H de MHC puede generarse combinando las probabilidades implícitas de presentación por alelo y restando la probabilidad de que cada par de alelos del MHC presente simultáneamente el péptido pk de la suma para generar la probabilidad de presentación de que la secuencia peptídica pk sea presentada por los alelos H de MHC.

Como un ejemplo, la probabilidad de que el péptido pk sea presentado por los alelos HLA h=2, h=3, entre m=4 alelos HLA diferentes identificados utilizando las funciones de transformación afines gh(), puede generarse mediante:

uk = f{x% • 02) f(x% • 03) - f{x% • 02) • f(x% • 03),

donde x2k, x3k son las variables identificadas de interacción alélica para los alelos HLA h=2, h=3, y 02, 03 son el conjunto de parámetros determinados para los alelos HLA h=2, h=3.

Como otro ejemplo, la probabilidad de que el péptido pk sea presentado por el alelo HLA h=2, h=3, entre m=4 alelos HLA diferentes identificados utilizando funciones de transformación de red gh(), gw(), puede generarse mediante:

donde NN2(), NN3() son los modelos de red identificados para los alelos HLA h=2, h=3, y 02, 03 son el conjunto de parámetros determinados para los alelos HLA h=2, h=3.

IX. Ejemplo 5: Módulo de predicción

El módulo de predicción 320 recibe datos de secuencia y selecciona neoantígenos candidatos en los datos de secuencia utilizando los modelos de presentación. En concreto, los datos de secuencia pueden ser secuencias de ADN, secuencias de ARN y/o secuencias de proteínas extraídas de células de tejido tumoral de pacientes. El módulo de predicción 320 procesa los datos de secuencia en una pluralidad de secuencias peptídicas pk con 8-15 aminoácidos para MHC-I o 6-30 aminoácidos para MHC-II. Por ejemplo, el módulo de predicción 32o puede procesar la secuencia dada "IEFROEIFJEF en tres secuencias peptídicas que tengan 9 aminoácidos "IEFROEIFJ," "EFROEIFJE" y "FROEIFJEF." En una modalidad, el módulo de predicción 320 puede identificar neoantígenos candidatos que son secuencias peptídicas mutadas comparando datos de secuencia extraídos de células de tejido normal de un paciente con los datos de secuencia extraídos de células de tejido tumoral del paciente para identificar porciones que contienen una o más mutaciones.

El módulo de predicción 320 aplica uno o más de los modelos de presentación a las secuencias peptídicas procesadas para estimar las probabilidades de presentación de las secuencias peptídicas. Específicamente, el módulo de predicción 320 puede seleccionar una o más secuencias de péptidos neoantígenos candidatos que probablemente se presenten en moléculas HLA tumorales aplicando los modelos de presentación a los neoantígenos candidatos. En una implementación, el módulo de predicción 320 selecciona secuencias neoantígeno candidatas que tienen probabilidades de presentación estimadas por encima de un umbral predeterminado. En otra implementación, el modelo de presentación selecciona las v secuencias de neoantígenos candidatos que tienen las probabilidades de presentación estimadas más altas (donde v es generalmente el número máximo de epítopos que pueden administrarse en una vacuna). Una vacuna que incluya los neoantígenos candidatos seleccionados para un paciente determinado puede inyectarse en el paciente para inducir respuestas inmunitarias.

X. Ejemplo 6: Módulo de selección de pacientes

El módulo de selección de pacientes 324 selecciona un subconjunto de pacientes para el tratamiento con vacunas y/o terapia de células T en función de si los pacientes satisfacen los criterios de inclusión. En una realización, los criterios de inclusión se determinan basándose en las probabilidades de presentación de los neoantígenos candidatos del paciente generadas por los modelos de presentación. Al ajustar los criterios de inclusión, el módulo 324 de selección de pacientes puede ajustar el número de pacientes que recibirán la vacuna y/o la terapia de células T en función de sus probabilidades de presentación de neoantígenos candidatos. Específicamente, un criterio de inclusión estricto da como resultado un menor número de pacientes que serán tratados con la vacuna y/o la terapia de células T, pero puede dar como resultado una mayor proporción de pacientes tratados con la vacuna y/o la terapia de células T que reciben un tratamiento eficaz (por ejemplo, 1 o más neoantígenos específicos del tumor (TSNA) y/o 1 o más células T que responden al neoantígeno). Por otro lado, unos criterios de inclusión menos estrictos dan lugar a un mayor número de pacientes que serán tratados con la vacuna y/o con la terapia de células T, pero pueden dar lugar a una menor proporción de pacientes tratados con la vacuna y/o con la terapia de células T que reciban un tratamiento eficaz. El módulo de selección de pacientes 324 modifica los criterios de inclusión en función del equilibrio deseado entre la proporción objetivo de pacientes que recibirán tratamiento y la proporción de pacientes que reciben un tratamiento eficaz.

En algunas realizaciones, los criterios de inclusión para la selección de los pacientes que recibirán el tratamiento vacunal son los mismos que los criterios de inclusión para la selección de los pacientes que recibirán el tratamiento con células T. Sin embargo, realizaciones alternativas, los criterios de inclusión para la selección de los pacientes que recibirán el tratamiento vacunal pueden diferir de los criterios de inclusión para la selección de los pacientes que recibirán el tratamiento con células T. En las siguientes Secciones X.A y X.B se analizan los criterios de inclusión para la selección de pacientes que recibirán tratamiento vacunal y los criterios de inclusión para la selección de pacientes que recibirán terapia con células T, respectivamente.

X.A. Selección de pacientes para el tratamiento con vacunas

En una realización, los pacientes se asocian con un subconjunto de tratamiento correspondiente de v neoantígenos candidatos que pueden incluirse potencialmente en vacunas personalizadas para los pacientes con capacidad de vacunación v. En una realización, el subconjunto de tratamiento para un paciente son los neoantígenos candidatos con las probabilidades de presentación más altas determinadas por los modelos de presentación. Por ejemplo, si una vacuna puede incluir v=20 epítopos, la vacuna puede incluir el subconjunto de tratamiento de cada paciente que tenga las probabilidades de presentación más altas determinadas por el modelo de presentación. Sin embargo, se aprecia que en otras realizaciones, el subconjunto de tratamiento para un paciente puede determinarse basándose en otros métodos. Por ejemplo, el subconjunto de tratamiento para un paciente puede seleccionarse aleatoriamente a partir del conjunto de neoantígenos candidatos para el paciente, o puede determinarse en parte basándose en los modelos actuales del estado de la técnica que modelan la afinidad de unión o la estabilidad de las secuencias peptídicas, o en alguna combinación de factores que incluyan las probabilidades de presentación a partir de los modelos de presentación y la información de afinidad o estabilidad relativa a esas secuencias peptídicas.

En una realización, el módulo de selección de pacientes 324 determina que un paciente satisface los criterios de inclusión si la carga de mutación tumoral del paciente es igual o superior a una carga de mutación mínima. La carga de mutación tumoral (TMB) de un paciente indica el número total de mutaciones no sinónimas en el exoma del tumor. En una implementación, el módulo de selección de pacientes 324 puede seleccionar a un paciente para el tratamiento con vacunas si el número absoluto de TMB del paciente es igual o superior a un umbral predeterminado. En otra implementación, el módulo de selección de pacientes 324 puede seleccionar a un paciente para el tratamiento con vacunas si el TMB del paciente se encuentra dentro de un percentil umbral entre los TMB determinados para el conjunto de pacientes.

En otra realización, el módulo de selección de pacientes 324 determina que un paciente satisface los criterios de inclusión si una puntuación de utilidad del paciente basada en el subconjunto de tratamientos del paciente es igual o superior a una puntuación de utilidad mínima. En una implementación, la puntuación de utilidad es una medida del número estimado de neoantígenos presentados del subconjunto de tratamiento.

El número estimado de neoantígenos presentados puede predecirse modelando la presentación de neoantígenos como una variable aleatoria de una o más distribuciones de probabilidad. En una implementación, la puntuación de utilidad para el paciente i es el número esperado de neoantígenos candidatos presentados del subconjunto de tratamiento, o alguna función del mismo. Por ejemplo, la presentación de cada neoantígeno puede modelarse como una variable aleatoria Bernoulli, en la que la probabilidad de presentación (éxito) viene dada por la probabilidad de presentación del neoantígeno candidato. En concreto, para un subconjunto de tratamiento Si de v neoantígenos candidatos pi1 , pi2, ..., piv, cada uno con las mayores probabilidades de presentación ui1, ui2, . , uiv, la presentación del candidato a neoantígeno pij viene dada por la variable aleatoria Aij, en la que:

P(AlJ = 1) = utj, P{Atj = 0) = 1 - uy . (24)

El número esperado de neoantígenos presentados viene dado por la suma de las probabilidades de presentación de cada candidato a neoantígeno. En otras palabras, la puntuación de utilidad para el paciente i puede expresarse como:

utili

El módulo de selección de pacientes 324 selecciona un subconjunto de pacientes con puntuaciones de utilidad iguales o superiores a una utilidad mínima para el tratamiento con vacunas.

En otra implementación, la puntuación de utilidad para el paciente i es la probabilidad de que se presente al menos un número umbral de neoantígenos k. En un caso, el número de neoantígenos presentados en el subconjunto de tratamiento Si de candidatos a neoantígeno se modela como una variable aleatoria binomial de Poisson, en la que las probabilidades de presentación (éxitos) vienen dadas por las probabilidades de presentación de cada uno de los epítopos. Específicamente, el número de neoantígenos presentados para el paciente i puede venir dado por la variable aleatoria Ni, en la que:

V

Ni = ^ A i j ~PBD(ui l ,u i2, . , u iv). (26)

J=i

donde PBD() denota la distribución Binomial de Poisson. La probabilidad de que se presente al menos un número umbral de neoantígenos k viene dada por la suma de las probabilidades de que el número de neoantígenos Ni presentados sea igual o superior a k. En otras palabras, la puntuación de utilidad para el paciente i puede expresarse como:

k

uti\l (Sl) = P[Nl > k ] = 'Y j P[Nl = m ]. (27)

m= 1

El módulo de selección de pacientes 324 selecciona un subconjunto de pacientes con la puntuación de utilidad iguales o superiores a una utilidad mínima para el tratamiento con vacunas.

En otra implementación, la puntuación de utilidad para el paciente i es el número de neoantígenos en el subconjunto de tratamiento Si de neoantígenos candidatos que tienen afinidad de unión o afinidad de unión predicha por debajo de un umbral fijo (por ejemplo, 500nM) a uno o más de los alelos HLA del paciente. En una instancia, el umbral fijo es un rango de 1000nM a 10nM. Opcionalmente, la puntuación de utilidad puede contar sólo aquellos neoantígenos detectados como expresados mediante ARN-seq.

En otra implementación, la puntuación de utilidad para el paciente i es el número de neoantígenos en el subconjunto de tratamiento Si de candidatos a neoantígeno que tienen afinidad de unión a uno o más de los alelos HLA de ese paciente en o por debajo de un percentil umbral de afinidades de unión para péptidos aleatorios a ese alelo HLA. En un caso, el percentil umbral está comprendido entre el percentil 10 y el percentil 0,1. Opcionalmente, la puntuación de utilidad puede contar sólo aquellos neoantígenos detectados como expresados mediante ARN-seq.

Se aprecia que los ejemplos de generación de puntuaciones de utilidad ilustrados con respecto a las ecuaciones (25) y (27) son meramente ilustrativos, y el módulo de selección de pacientes 324 puede utilizar otras estadísticas o distribuciones de probabilidad para generar las puntuaciones de utilidad.

X.B. Selección de pacientes para la terapia con células T

En otra realización, en lugar o además de recibir tratamiento vacunal, los pacientes pueden recibir terapia de células T. Al igual que el tratamiento con vacunas, en las realizaciones en las que un paciente recibe terapia con células T, el paciente puede estar asociado a un subconjunto de tratamiento correspondiente de v neoantígenos candidatos, como se ha descrito anteriormente. Este subconjunto de v neoantígenos candidatos a tratamiento puede utilizarse para la identificación in vitro de células T del paciente que respondan a uno o más de los v neoantígenos candidatos. A continuación, estas células T identificadas pueden expandirse e infundirse en el paciente para una terapia personalizada con células T.

Los pacientes pueden ser seleccionados para recibir terapia con células T en dos momentos diferentes. El primer punto es después de que se haya previsto el subconjunto de tratamiento de v neoantígenos candidatos para un paciente utilizando los modelos, pero antes del cribado in vitro de células T que sean específicas para el subconjunto de tratamiento previsto de v neoantígenos candidatos. El segundo punto es tras el cribado in vitro de las células T que son específicas para el subconjunto de tratamiento previsto de v neoantígenos candidatos.

En primer lugar, los pacientes pueden ser seleccionados para recibir terapia de células T después de que se haya previsto el subconjunto de v neoantígenos candidatos al tratamiento para el paciente, pero antes de la identificación in vitro de células T del paciente que sean específicas para el subconjunto previsto de v neoantígenos candidatos. Específicamente, debido a que el cribado in vitro de células T neoantígenoespecíficas del paciente puede ser caro, puede ser deseable seleccionar sólo pacientes para cribado de células T neoantígeno-específicas si es probable que los pacientes tengan células T neoantígeno-específicas. Para seleccionar a los pacientes antes de la etapa de cribado de células T in vitro, se pueden utilizar los mismos criterios que se emplean para seleccionar a los pacientes para el tratamiento con vacunas. Específicamente, en algunas realizaciones, el módulo de selección de pacientes 324 puede seleccionar a un paciente para recibir terapia de células T si la carga de mutación tumoral del paciente es igual o superior a una carga de mutación mínima como se ha descrito anteriormente. En otra realización, el módulo de selección de pacientes 324 puede seleccionar a un paciente para recibir terapia de células T si una puntuación de utilidad del paciente basada en el subconjunto de tratamiento de v neoantígenos candidatos para el paciente es igual o superior a una puntuación de utilidad mínima, como se ha descrito anteriormente.

En segundo lugar, además de o en lugar de seleccionar a los pacientes para recibir terapia de células T antes de la identificación in vitro de células T del paciente que sean específicas para el subconjunto previsto de v neoantígenos candidatos, los pacientes también pueden seleccionarse para recibir terapia de células T después de la identificación in vitro de células T que sean específicas para el subconjunto previsto de v neoantígenos candidatos al tratamiento. Específicamente, un paciente puede ser seleccionado para recibir terapia de células T si se identifica al menos una cantidad umbral de TCR específicos de neoantígeno para el paciente durante el cribado in vitro de las células T del paciente para el reconocimiento de neoantígenos. Por ejemplo, un paciente puede seleccionarse para recibir terapia de células T sólo si se identifican al menos dos TCR específicos de neoantígeno para el paciente, o sólo si se identifican TCR específicos de neoantígeno para dos neoantígenos distintos.

En otra realización, un paciente puede ser seleccionado para recibir terapia de células T sólo si al menos una cantidad umbral de neoantígenos del subconjunto de tratamiento de v neoantígenos candidatos para el paciente son reconocidos por los TCR del paciente. Por ejemplo, un paciente puede ser seleccionado para recibir terapia de células T sólo si al menos un neoantígeno del subconjunto de tratamiento de v neoantígenos candidatos para el paciente son reconocidos por los TCR del paciente. En otras realizaciones, un paciente puede ser seleccionado para recibir terapia de células T sólo si al menos una cantidad umbral de TCRs para el paciente se identifican como neoantígenos específicos de péptidos neoantígenos de una clase de restricción HLA particular. Por ejemplo, un paciente puede seleccionarse para recibir terapia de células T sólo si al menos un TCR del paciente se identifica como neoantígeno específico de HLA clase I restringido a péptidos neoantígenos.

En incluso más realizaciones, un paciente puede ser seleccionado para recibir terapia de células T sólo si al menos una cantidad umbral de péptidos neoantígenos de una clase de restricción HLA particular son reconocidos por los TCR del paciente. Por ejemplo, un paciente puede ser seleccionado para recibir terapia de células T sólo si al menos un péptido neoantígeno restringido HLA clase I es reconocido por los TCR del paciente. Como otro ejemplo, un paciente puede ser seleccionado para recibir terapia de células T sólo si al menos dos péptidos neoantígenos restringidos HLA clase II son reconocidos por los TCRs del paciente. También se puede utilizar cualquier combinación de los criterios anteriores para seleccionar a los pacientes que recibirán la terapia de células T tras la identificación in vitro de las células T que son específicas del subconjunto de tratamiento previsto de v neoantígenos candidatos para el paciente.

XI. Ejemplo 7: Resultados de la experimentación con ejemplos de selección de pacientes

La validez de los métodos de selección de pacientes descritos en la Sección X se comprueba realizando la selección de pacientes en un conjunto de pacientes simulados, cada uno asociado a un conjunto de prueba de neoantígenos candidatos simulados, en el que se sabe que un subconjunto de neoantígenos simulados se presenta en los datos de espectrometría de masas. Específicamente, cada neoantígeno candidato simulado en el conjunto de prueba se asocia con una etiqueta que indica si el neoantígeno se presentó en un conjunto de datos de espectrometría de masas HLA-A*02:01 y HLA-B*07:02 de la línea celular JY de alelos múltiples del conjunto de datos Bassani-Stemberg (conjunto de datos "D1") (los datos se pueden encontrar en www.ebi.ac.uk/pride/archive/projects/PXD0000394). Como se describe con más detalle a continuación en relación con la FIG. 13A, un número de neoantígenos candidatos para los pacientes simulados se muestrean a partir del proteoma humano basándose en la distribución de frecuencia conocida de la carga de mutaciones en pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC).

Los modelos de presentación por alelo para los mismos alelos HLA se entrenan utilizando un conjunto de entrenamiento que es un subconjunto de los datos de espectrometría de masas de alelo único HLA-A*02:01 y HLA-B*07:02 del conjunto de datos del IEDB (conjunto de datos "D2") (los datos se pueden encontrar en http://www.iedb.org/doc/mhc_ligand_full.zip). Específicamente, el modelo de presentación para cada alelo fue el modelo por alelo mostrado en la ecuación (8) que incorporaba las secuencias flanqueantes N-terminal y C-terminal como variables alelo-no-interactuantes, con funciones de dependencia de red gh() y gw(), y la función expit f(). El modelo de presentación para el alelo HLA-A*02:01 genera una probabilidad de presentación de que un péptido dado se presente en el alelo HLA-A*02:01, dada la secuencia del péptido como variable que interactúa con el alelo, y las secuencias flanqueantes N-terminal y C-terminal como variables que no interactúan con el alelo. El modelo de presentación para el alelo HLA-B*07:02 genera una probabilidad de presentación de que un péptido dado se presente en el alelo HLA-B*07:02, dada la secuencia del péptido como variable que interactúa con el alelo, y las secuencias flanqueantes N-terminal y C-terminal como variables que no interactúan con el alelo.

Como se expone en los siguientes ejemplos y con referencia a las FIGS. 13A-13E, se aplican varios modelos, como los modelos de presentación entrenados y los modelos actuales de vanguardia para la predicción de la unión a péptidos, al conjunto de prueba de neoantígenos candidatos para cada paciente simulado con el fin de identificar diferentes subconjuntos de tratamiento para los pacientes en función de las predicciones. Los pacientes que satisfacen los criterios de inclusión se seleccionan para el tratamiento con vacunas, y se asocian a vacunas personalizadas que incluyen epítopos en los subconjuntos de tratamiento de los pacientes. El tamaño de los subconjuntos de tratamiento varía en función de las distintas capacidades de las vacunas. No se introduce ninguna superposición entre el conjunto de entrenamiento utilizado para entrenar el modelo de presentación y el conjunto de prueba de neoantígenos candidatos simulados.

En los siguientes ejemplos, se analiza la proporción de pacientes seleccionados que tienen al menos un cierto número de neoantígenos presentados entre los epítopos incluidos en las vacunas. Esta estadística indica la eficacia de las vacunas simuladas para administrar neoantígenos potenciales que provoquen respuestas inmunitarias en los pacientes. Específicamente, se presenta un neoantígeno simulado en un conjunto de prueba si el neoantígeno se presenta en el conjunto de datos de espectrometría de masas D2. Una elevada proporción de pacientes con neoantígenos presentados indica un potencial de éxito del tratamiento mediante vacunas de neoantígenos al inducir respuestas inmunitarias.

XI.A. Ejemplo 7A: Distribución de frecuencias de la carga de mutaciones en pacientes con cáncer NSCLC

La FIG. 13A ilustra una distribución de frecuencias de muestra de la carga de mutaciones en pacientes con NSCLC. La carga de mutaciones y las mutaciones en diferentes tipos de tumores, incluido el NSCLC, pueden consultarse, por ejemplo, en el atlas del genoma del cáncer (TCGA)(https://cancergenome.nih.gov). El eje x representa el número de mutaciones no sinónimas en cada paciente, y el eje y representa la proporción de pacientes de la muestra que tienen el número dado de mutaciones no sinónimas. La distribución de frecuencias de la muestra en la FIG. 13A muestra un rango de 3-1786 mutaciones, en el que el 30 % de los pacientes tienen menos de 100 mutaciones. Aunque no se muestra en la FIG. 13A, las investigaciones indican que la carga de mutaciones es mayor en los fumadores que en los no fumadores, y que la carga de mutaciones puede ser un fuerte indicador de la carga de neoantígenos en los pacientes.

Como se ha explicado al principio de la sección XI, cada uno de los pacientes simulados se asocia a un conjunto de prueba de neoantígenos candidatos. El conjunto de prueba para cada paciente se genera muestreando una carga de mutación mi de la distribución de frecuencia mostrada en la FIG. 13A para cada paciente. Para cada mutación, se selecciona aleatoriamente una secuencia de 21 péptidos del proteoma humano para representar una secuencia mutada simulada. Se genera un conjunto de prueba de secuencias candidatas a neoantígeno para el paciente i identificando cada secuencia peptídica (8, 9, 10, 11)-mer que abarque la mutación en el 21-mer. Cada candidato a neoantígeno está asociado a una etiqueta que indica si la secuencia candidata a neoantígeno estaba presente en el conjunto de datos de espectrometría de masas D1. Por ejemplo, las secuencias candidatas a neoantígeno presentes en el conjunto de datos D1 pueden asociarse con una etiqueta "1", mientras que las secuencias no presentes en el conjunto de datos D1 pueden asociarse con una etiqueta "0" Como se describe con más detalle a continuación, las FIGS. 13B a 13E ilustran los resultados experimentales sobre la selección de pacientes basada en los neoantígenos presentados de los pacientes del conjunto de prueba.

XI.B. Ejemplo 7B: Proporción de pacientes seleccionados con presentación de neoantígeno en función de la carga de mutación Criterios de inclusión

La FIG. 13B ilustra el número de neoantígenos presentados en vacunas simuladas para pacientes seleccionados en base a un criterio de inclusión de si los pacientes satisfacen una carga mínima de mutación. Se identifica la proporción de pacientes seleccionados que tienen al menos un determinado número de neoantígenos presentados en la prueba correspondiente.

En la FIG. 13B, el eje x indica la proporción de pacientes excluidos del tratamiento vacunal en función de la carga mínima de mutaciones, como indica la etiqueta "N.° mínimo de mutaciones". Por ejemplo, un punto de datos en 200 "N.° mínimo de mutaciones" indica que el módulo de selección de pacientes 324 seleccionó sólo el subconjunto de pacientes simulados que tienen una carga de mutación de al menos 200 mutaciones. Como otro ejemplo, un punto de datos en 300 "N.° mínimo de mutaciones" indica que el módulo de selección de pacientes 324 seleccionó una proporción menor de pacientes simulados que tienen al menos 300 mutaciones. El eje y indica la proporción de pacientes seleccionados que están asociados con al menos un cierto número de neoantígenos presentados en el conjunto de prueba sin ninguna capacidad vacunal v. Específicamente, el gráfico superior muestra la proporción de pacientes seleccionados que presentan al menos 1 neoantígeno, el gráfico central muestra la proporción de pacientes seleccionados que presentan al menos 2 neoantígenos, y el gráfico inferior muestra la proporción de pacientes seleccionados que presentan al menos 3 neoantígenos.

Como se indica en la FIG. 13B, la proporción de pacientes seleccionados con neoantígenos presentados aumenta significativamente con una mayor carga de mutación. Esto indica que la carga de mutación como criterio de inclusión puede ser eficaz para seleccionar a los pacientes en los que las vacunas neoantígenas tienen más probabilidades de inducir respuestas inmunitarias satisfactorias.

XI.C. Ejemplo 7C: Comparación de la presentación de vacunas identificadas mediante modelos de presentación frente a modelos de vanguardia

La FIG. 13C compara el número de neoantígenos presentados en vacunas simuladas entre pacientes seleccionados asociados con vacunas que incluyen subconjuntos de tratamiento identificados basándose en modelos de presentación y pacientes seleccionados asociados con vacunas que incluyen subconjuntos de tratamiento identificados a través de modelos actuales de vanguardia. El gráfico de la izquierda supone una capacidad limitada de vacunas v=10, y el de la derecha, una capacidad limitada de vacunas v=20. Los pacientes se seleccionan en función de las puntuaciones de utilidad que indican el número esperado de neoantígenos presentados.

En la FIG. 13C, las líneas continuas indican los pacientes asociados con vacunas que incluyen subconjuntos de tratamiento identificados basándose en modelos de presentación para los alelos HLA-A*02:01 y HLA-B*07:02. El subconjunto de tratamiento para cada paciente se identifica aplicando cada uno de los modelos de presentación a las secuencias del conjunto de prueba, e identificando los v neoantígenos candidatos que tienen las mayores probabilidades de presentación. Las líneas punteadas indican los pacientes asociados con vacunas que incluyen subconjuntos de tratamiento identificados en base a los modelos actuales de vanguardia NETMHCpan para el alelo único HLA-A*02:01. Los detalles de la implementación de NETMHCpan se detallan en http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan. El subconjunto de tratamiento para cada paciente se identifica aplicando el modelo NETMHCpan a las secuencias del conjunto de prueba, e identificando los v neoantígenos candidatos que tienen las afinidades de unión estimadas más altas. El eje x de ambos gráficos indica la proporción de pacientes excluidos del tratamiento con vacunas en función de las puntuaciones de utilidad esperada que indican el número esperado de neoantígenos presentados en los subconjuntos de tratamiento identificados en función de los modelos de presentación. La puntuación de utilidad esperada se determina como se describe en referencia a la ecuación (25) en la Sección X. El eje y indica la proporción de pacientes seleccionados que presentan al menos un cierto número de neoantígenos (1, 2 o 3 neoantígenos) incluidos en la vacuna.

Como se indica en la FIG. 13C, los pacientes asociados con vacunas que incluyen subconjuntos de tratamiento basados en modelos de presentación reciben vacunas que contienen neoantígenos presentados en una tasa significativamente mayor que los pacientes asociados con vacunas que incluyen subconjuntos de tratamiento basados en modelos de vanguardia. Por ejemplo, como se muestra en el gráfico de la derecha, el 80 % de los pacientes seleccionados asociados a vacunas basadas en modelos de presentación reciben al menos un neoantígeno presentado en la vacuna, en comparación con sólo el 40 % de los pacientes seleccionados asociados a vacunas basadas en los modelos actuales más avanzados. Los resultados indican que los modelos de presentación aquí descritos son eficaces para seleccionar neoantígenos candidatos para vacunas que probablemente provoquen respuestas inmunitarias para el tratamiento de tumores.

XI.D. Ejemplo 7D: Efecto de la cobertura HLA en la presentación de neoantígenos para vacunas identificadas mediante modelos de presentación

La FIG. 13D compara el número de neoantígenos presentados en vacunas simuladas entre pacientes seleccionados asociados con vacunas que incluyen subconjuntos de tratamiento identificados basándose en un único modelo de presentación por alelo para HLA-A*02:01 y pacientes seleccionados asociados con vacunas que incluyen subconjuntos de tratamiento identificados basándose en ambos modelos de presentación por alelo para HLA-A*02:01 y HLA-B*07:02. La capacidad de la vacuna se fija en v=20 epítopos. Para cada experimento, los pacientes se seleccionan en función de las puntuaciones de utilidad esperadas determinadas en función de los distintos subconjuntos de tratamiento.

En la FIG. 13D, las líneas continuas indican los pacientes asociados con vacunas que incluyen subconjuntos de tratamiento basándose en ambos modelos de presentación HLA para los alelos HLA-A*02:01 y HLA-B*07:02. El subconjunto de tratamiento para cada paciente se identifica aplicando cada uno de los modelos de presentación a las secuencias del conjunto de prueba, e identificando los v neoantígenos candidatos que tienen las mayores probabilidades de presentación. Las líneas punteadas indican los pacientes asociados a vacunas que incluyen subconjuntos de tratamiento basados en un modelo de presentación única para alelos HLA HLA-A*02:01. El subconjunto de tratamiento para cada paciente se identifica aplicando el modelo de presentación para el único alelo HLA a las secuencias del conjunto de prueba, e identificando los candidatos de neoantígeno v que tienen las mayores probabilidades de presentación. Para los gráficos de líneas continuas, el eje x indica la proporción de pacientes excluidos del tratamiento con vacunas según las puntuaciones de utilidad esperada para los subconjuntos de tratamiento identificados por ambos modelos de presentación. Para los gráficos de líneas punteadas, el eje x indica la proporción de pacientes excluidos del tratamiento con vacunas según las puntuaciones de utilidad esperada para los subconjuntos de tratamiento identificados por el modelo de presentación único. El eje y indica la proporción de pacientes seleccionados que presentan al menos un determinado número de neoantígenos (1, 2 o 3 neoantígenos).

Como se indica en la FIG. 13D, los pacientes asociados con vacunas que incluyen subconjuntos de tratamiento identificados por modelos de presentación para ambos alelos HLA presentan neoantígenos en una tasa significativamente mayor que los pacientes asociados con vacunas que incluyen subconjuntos de tratamiento identificados por un único modelo de presentación. Los resultados indican la importancia de establecer modelos de presentación con una elevada cobertura de alelos HLA.

XI. E. Ejemplo 7E: Comparación de la presentación de neoantígenos Presentación de neoantígenos en pacientes seleccionados por la carga de mutación frente al número esperado de neoantígenos presentados

La FIG. 13E compara el número de neoantígenos presentados en vacunas simuladas entre pacientes seleccionados en función de la carga de mutación y pacientes seleccionados por puntuación de utilidad de expectativas. Las puntuaciones de utilidad esperada se determinan basándose en subconjuntos de tratamiento identificados por modelos de presentación que tienen un tamaño de v=20 epítopos.

En la FIG. 13E, las líneas continuas indican los pacientes seleccionados en función de la puntuación de utilidad esperada asociada a las vacunas, incluidos los subconjuntos de tratamiento identificados por los modelos de presentación. El subconjunto de tratamiento para cada paciente se identifica aplicando los modelos de presentación a las secuencias del conjunto de prueba, e identificando los v = 20 neoantígenos candidatos que tienen las mayores probabilidades de presentación. La puntuación de utilidad esperada se determina en función de las probabilidades de presentación del subconjunto de tratamiento identificado según la ecuación (25) de la sección X. Las líneas punteadas indican los pacientes seleccionados en función de la carga de mutación asociada a las vacunas, incluyendo también los subconjuntos de tratamiento identificados mediante modelos de presentación. El eje x indica la proporción de pacientes excluidos del tratamiento con vacunas en función de las puntuaciones de utilidad esperada para los gráficos de líneas continuas, y la proporción de pacientes excluidos en función de la carga de mutaciones para los gráficos de líneas discontinuas. El eje y indica la proporción de pacientes seleccionados que reciben una vacuna que contiene al menos un determinado número de neoantígenos presentados (1,2 o 3 neoantígenos).

Como se indica en la FIG. 13E, los pacientes seleccionados en función de las puntuaciones de utilidad de las expectativas reciben una vacuna que contiene neoantígenos presentados en mayor proporción que los pacientes seleccionados en función de la carga de mutación. Sin embargo, los pacientes seleccionados en función de la carga de mutación reciben una vacuna que contiene neoantígenos presentados en mayor proporción que los pacientes no seleccionados. Por lo tanto, la carga de mutación es un criterio eficaz de selección de pacientes para el éxito del tratamiento con la vacuna neoantígena, aunque las puntuaciones de utilidad de las expectativas son más eficaces.

XII. Ejemplo 8: Evaluación de un modelo entrenado en espectrometría de masas a partir de datos de espectrometría de masas Held-Out

Dado que la presentación de péptidos HLA por parte de las células tumorales es un requisito clave para la inmunidad antitumoral 91,96,97, se generó un gran conjunto de datos integrado (N=74 pacientes) de muestras de tumores humanos y tejido normal con secuencias de péptidos HLA de clase I emparejadas, tipos de HLA y ARN-seq del transcriptoma (Métodos) con el objetivo de utilizar estos y los datos disponibles públicamente92,98,99 para entrenar un novedoso modelo de aprendizaje profundo100 para predecir la presentación de antígenos en el cáncer humano. Las muestras se eligieron entre varios tipos de tumores de interés para el desarrollo de inmunoterapia y en función de la disponibilidad de tejido. La espectrometría de masas identificó una media de 3704 péptidos por muestra a nivel de péptido FDR<0,1 (rango 344-11 301). Los péptidos seguían la distribución de longitud característica de la clase I de HLA: longitudes de 8-15aa, con una longitud modal de 9 (56 % de los péptidos). En consonancia con informes anteriores, MHCflurry90 predijo que la mayoría de los péptidos (mediana del 79 %) se unirían al menos a un alelo HLA del paciente en el umbral de afinidad estándar de 500 nM, pero con una variabilidad sustancial entre las muestras (por ejemplo, el 33 % de los péptidos de una muestra tenían afinidades predichas >500 nM). El umbral de "aglutinante fuerte" comúnmente utilizado 101 de 50nM capturó una mediana de sólo el 42 % de los péptidos presentados. La secuenciación del transcriptoma produjo una media de 131 M de lecturas únicas por muestra y el 68 % de los genes se expresaron a un nivel de al menos 1 transcrito por millón (TPM) en al menos una muestra, lo que pone de relieve el valor de un conjunto de muestras amplio y diverso para observar la expresión de un número máximo de genes. La presentación de péptidos por el HLA estaba fuertemente correlacionada con la expresión de ARNm. Se observaron diferencias sorprendentes y reproducibles entre genes en la tasa de presentación del péptido, más allá de lo que podrían explicar las diferencias en la expresión o la secuencia del ARN por sí solas. Los tipos de HLA observados coincidían con los esperados para muestras procedentes de un grupo de pacientes de ascendencia predominantemente europea.

Utilizando estos datos y los datos de péptidos HLA disponibles públicamente92,98,99, se entrenó un modelo de red neuronal (NN) para predecir la presentación de antígenos HLA. Para aprender modelos alelo-específicos a partir de datos de espectrometría de masas de tumores en los que cada péptido podría haber sido presentado por cualquiera de los seis alelos HLA, se desarrolló una nueva arquitectura de red capaz de aprender conjuntamente los mapeos alelo-péptido y los motivos de presentación alelo-específicos (Métodos). Para cada paciente, los puntos de datos con etiqueta positiva eran péptidos detectados mediante espectrometría de masas, y los puntos de datos con etiqueta negativa eran péptidos del proteoma de referencia (SwissProt) que no se detectaron mediante espectrometría de masas en esa muestra. Los datos se dividieron en conjuntos de entrenamiento, validación y prueba (Métodos). El conjunto de entrenamiento consistió en 142.844 péptidos presentados por HLA (FDR<~0,02) de 101 muestras (69 descritas recientemente en este estudio y 32 publicadas previamente). El conjunto de validación (utilizado para la detención temprana) consistió en 18.004 péptidos presentados de las mismas 101 muestras. Para las pruebas se utilizaron dos conjuntos de datos de espectrometría de masas: (1) Un conjunto de prueba de muestras tumorales consistente en 571 péptidos presentados de 5 muestras tumorales adicionales (2 de pulmón, 2 de colon, 1 de ovario) que se mantuvieron fuera de los datos de entrenamiento, y (2) un conjunto de prueba de línea celular de un solo alelo consistente en 2128 péptidos presentados de ventanas de localización genómica (bloques) adyacentes a, pero distintas de, las localizaciones de los péptidos de un solo alelo incluidos en los datos de entrenamiento (ver Métodos para detalles adicionales sobre las divisiones de entrenamiento/prueba).

Los datos de entrenamiento identificaron modelos predictivos para 53 alelos HLA. En contraste con trabajos anteriores92,104 estos modelos capturaron la dependencia de la presentación HLA en cada posición de secuencia para péptidos de múltiples longitudes. El modelo también aprendió correctamente las dependencias críticas de la expresión del ARN del gen y la propensión de presentación específica del gen, con la abundancia de ARNm y la propensión de presentación aprendida por gen combinándose independientemente para producir una diferencia de hasta ~60 veces en la tasa de presentación entre los genes de menor expresión y menos propensos a la presentación y los de mayor expresión y más propensos a la presentación. Se observó además que el modelo predecía la estabilidad medida de los complejos HLA/péptido en IEDB88 (p<1e-10 para 10 alelos), incluso después de controlar la afinidad de unión predicha (p<0,05 para 8/10 alelos probados). Colectivamente, estas características constituyen la base para mejorar la predicción de los péptidos inmunogénicos HLA de clase I.

Se evaluó el rendimiento de este modelo NN como predictor de la presentación HLA en los conjuntos de pruebas de espectrometría de masas retenidas. Específicamente, la FIG. 14 compara los valores predictivos positivos (VPP) al 40 % de recuperación de diferentes versiones del Modelo MS y un enfoque recientemente publicado para modelar péptidos eluidos de la espectrometría de masas (MixMHCPred), cuando cada modelo se prueba en las cinco muestras de prueba diferentes retenidas. La FIG. 14 también muestra el VPP medio con un 40 % de recuerdo de los modelos para las cinco muestras de prueba.

Los modelos probados en la FIG. 14 son (de izquierda a derecha): "Modelo MS completo": el modelo NN completo descrito en los Métodos; "Modelo MS, sin secuencia de flanqueo": idéntico al modelo NN completo, pero sin la secuencia de flanqueo; "MS Model, No Flanking Sequence or Per-Gene Parameters": idéntico al modelo NN completo, pero sin la secuencia de flanqueo ni los parámetros por gen; "Modelo MS sólo péptidos, todas las longitudes entrenadas conjuntamente": idéntico al modelo NN completo, salvo que las únicas características utilizadas son la secuencia peptídica y el tipo HLA; "Peptide-Only MS Model, Each Length Trained Separately": para este modelo, la estructura del modelo fue la misma que la del modelo MS de sólo péptidos, excepto que se entrenaron modelos separados para 9 y 10mers; "Modelo lineal de MS sólo péptido (con ensamblaje)": idéntico al modelo de MS sólo péptido con cada longitud de péptido entrenada por separado; excepto que en lugar de modelar la secuencia peptídica mediante redes neuronales, se utilizó un ensamblaje de modelos lineales entrenados mediante el mismo procedimiento de optimización utilizado para el modelo completo y descrito en los Métodos; "MixMHCPred 1.1" es MixMHCPred con la configuración por defecto; "Afinidad de unión" es MHCflurry 1.2.0.

El "Modelo MS completo", el "Modelo MS, sin secuencia de flanqueo", el "Modelo MS, sin secuencia de flanqueo ni parámetro por gen", el "Modelo MS de sólo péptidos, todas las longitudes entrenadas conjuntamente", el "Modelo MS de sólo péptidos, todas las longitudes entrenadas por separado" y el "Modelo MS lineal de sólo péptidos" son todos modelos de redes neuronales entrenados con datos de espectrometría de masas como se ha descrito anteriormente. Sin embargo, cada modelo se entrena y se prueba utilizando características diferentes de una muestra. El modelo "MixMHCPred 1.1" y el modelo "Afinidad de unión" son enfoques anteriores para modelar péptidos presentados por HLA104. En la comparación sólo se utilizaron péptidos de 9 y 10 porque MixMHCPred no modela actualmente péptidos de longitudes distintas a 9 y 10. Los últimos 5 modelos ("Peptide-Only MS Model, all Lengths Trained Jointly" hasta "Afinidad de unión") tienen las mismas entradas: secuencia peptídica y tipos HLA, únicamente. En concreto, ninguno de los últimos 5 modelos utiliza la abundancia de ARN para hacer predicciones.

El modelo de sólo péptidos con mejores resultados ("Modelo MS de sólo péptidos, todas las longitudes entrenadas conjuntamente") alcanza un VPP medio de 0,41 con una recuperación del 40 %, mientras que el modelo de sólo péptidos con peores resultados entrenado en los datos de espectrometría de masas ("Modelo MS lineal de sólo péptidos") alcanza un VPP medio de sólo el 28 % (sólo ligeramente superior al VPP medio de MixMHCPred 1.1 con un 18 %), lo que pone de relieve el valor de un modelado Nn mejorado de las secuencias peptídicas. Tenga en cuenta que MixMHCPred 1.1 se entrena con datos diferentes a los del modelo lineal de MS de sólo péptidos, pero tiene muchas de las mismas características de modelado (por ejemplo, es un modelo lineal, en el que los modelos para cada longitud de péptido se entrenan por separado).

En general, el modelo NN logró una predicción significativamente mejorada de la presentación del péptido HLA, con un VPP hasta 9 veces mayor que la afinidad de unión estándar expresión génica en el conjunto de pruebas de tumores. La gran ventaja del VPP del modelo NN basado en MS persistió en varios umbrales de recuperación y fue estadísticamente significativa (p< 10-6 para todas las muestras tumorales). El valor predictivo positivo de la afinidad de unión estándar expresión génica para la presentación del péptido HLA alcanzó tan sólo el 6 %, en línea con estimaciones previas 87,93. No obstante, cabe destacar que este VPP del ~ 6 % sigue representando un enriquecimiento >100 veces con respecto a la prevalencia de referencia, ya que sólo se detecta una pequeña proporción de los péptidos presentados (por ejemplo, ~1 de cada 2500 en el conjunto de datos de prueba de MS tumoral).

Al comparar un modelo reducido entrenado con datos de espectrometría de masas que sólo utiliza el tipo de HLA y la secuencia peptídica como entradas con el modelo completo de EM, se determinó que el ~ 30 % de la ganancia en VPP sobre la predicción de afinidad de unión procedía del modelado de características extrínsecas al péptido (abundancia de ARN, secuencia flanqueante, parámetros por gen) que pueden capturarse con espectrometría de masas pero no con ensayos de afinidad de unión. El otro ~ 70 % de la ganancia procedía de la mejora del modelado de la secuencia peptídica. No fue sólo la naturaleza del conjunto de datos de entrenamiento (péptidos presentados por HLA), sino la arquitectura general del modelo lo que contribuyó a la mejora del rendimiento, ya que también superó a enfoques anteriores de modelado de péptidos presentados por HLA104 en tumores humanos. La nueva arquitectura del modelo permitió el aprendizaje de modelos aleloespecíficos a través de un proceso de entrenamiento de extremo a extremo que no requiere la asignación ex ante de péptidos a supuestos alelos de presentación utilizando predicciones de afinidad de unión o enfoques de agrupamiento duro104-106. Es importante destacar que también evitó imponer restricciones reductoras de la precisión a los submodelos alelo-específicos como prerrequisito para la deconvolución, como la linealidad o la consideración por separado de la longitud de cada péptido104. El modelo completo supera a varios modelos simplificados y enfoques publicados anteriormente que imponen estas restricciones.

XIII. Ejemplo 9: Resultados de la experimentación, incluido el modelado de regiones clave de presentación

Para evaluar específicamente el beneficio de utilizar parámetros de regiones clave de presentación en el modelado de la presentación HLA, se comparó el rendimiento de un modelo de presentación de red neuronal que incorpora parámetros de regiones clave de presentación con el rendimiento de un modelo de presentación de red neuronal que no incorpora parámetros de regiones clave de presentación. La arquitectura de la red neuronal base era la misma para ambos modelos y era idéntica al modelo de presentación descrito anteriormente en la Sección VII. En resumen, los modelos incluían parámetros de secuencias peptídicas y de aminoácidos flanqueantes, datos de transcripción de secuenciación de ARN (TPM), datos de familias de proteínas, identificación por muestra y tipos h LA-A, B, C. Para cada modelo se utilizaron conjuntos de 5 redes. El modelo que incluía los parámetros de las regiones clave de presentación utilizaba la Ecuación 12c descrita anteriormente en la Sección VIII.B.3., con un tamaño de bloque proteómico por gen de 10, y longitudes de péptido de 8-12.

Los dos modelos se compararon realizando experimentos con el conjunto de datos de espectrometría de masas descrito en la Sección XII. En concreto, se excluyeron cinco muestras del entrenamiento y la validación del modelo con el fin de evaluar de forma equitativa los modelos competidores. Las muestras restantes se dividieron aleatoriamente en un 90 % para el entrenamiento del modelo y en un 10 % para la validación del entrenamiento.

La FIG. 15A compara los valores medios de predicción positiva (VPP) a través de la recuperación del modelo de presentación que utilizó parámetros de regiones clave de presentación y el modelo de presentación que no utilizó parámetros de regiones clave de presentación, cuando los modelos se probaron en las cinco muestras de prueba retenidas. El modelo que incorporó parámetros de regiones clave de presentación superó al modelo que no incorporó parámetros de regiones clave de presentación en cada una de las muestras individualmente, con una precisión media media de 0,82 con parámetros de regiones clave de presentación y de 0,77 sin parámetros de regiones clave de presentación.

Las FIGS. 15B-F comparan las curvas de precisión y recuperación del modelo de presentación que utilizó parámetros de regiones clave de presentación y el modelo de presentación que no utilizó parámetros de regiones clave de presentación, cuando los modelos se probaron en cada una de las cinco muestras de prueba retenida.

XIV. Ejemplo 10: Evaluación de los parámetros de las regiones clave de presentación para la identificación de epítopos de células T

También se comprobó directamente la ventaja de utilizar parámetros de regiones clave de presentación para modelizar la presentación HLA con el fin de identificar epítopos de células T CD8 tumorales humanas (es decir, dianas de inmunoterapia). Definir un conjunto de datos de prueba apropiado para esta evaluación es un reto, ya que el conjunto de datos de prueba debe contener péptidos que sean reconocidos tanto por las células T como presentados por el HLA en la superficie de la célula tumoral. Además, la evaluación formal del rendimiento requiere no sólo péptidos de etiquetado positivo (es decir, reconocidos por las células T), sino también un número suficiente de péptidos de etiquetado negativo (es decir, probados pero no reconocidos). Los conjuntos de datos de espectrometría de masas abordan la presentación del tumor pero no el reconocimiento de las células T; por el contrario, los ensayos de cebado o de células T posteriores a la vacunación abordan el reconocimiento de las células T pero no la presentación del tumor.

Para obtener un conjunto de datos adecuado, recopilamos epítopos de células T CD8 publicados de 5 estudios recientes que cumplían los criterios requeridos: el estudio A96 examinó TIL en 9 pacientes con tumores gastrointestinales e informó del reconocimiento por parte de las células T de 12/1053 mutaciones SNV somáticas analizadas mediante IFN-y ELISPOT utilizando el método de minigénesis en tándem (TMG) en DC autólogas. El estudio B84 también utilizó TMG e informó del reconocimiento de células T de 6/574 SNV por linfocitos circulantes CD8+PD-1+ de 5 pacientes con melanoma. El estudio C97 evaluó las TIL de 3 pacientes con melanoma mediante estimulación peptídica pulsátil y halló respuestas a 5/381 mutaciones SNV probadas. El estudio D108 evaluó TIL de una paciente con cáncer de mama utilizando una combinación de ensayos TMG y pulsación con péptidos epítopo mínimos e informó del reconocimiento de 2/62 SNV. El estudio E160 evaluó los TIL en 17 pacientes del Instituto Nacional del Cáncer con 52 TSNA. El conjunto de datos combinados incluía 4843 SNV analizados de 33 pacientes, incluidos 75 TSNA con respuestas de células T preexistentes. De manera importante, dado que el conjunto de datos estaba compuesto en gran parte por el reconocimiento de neoantígenos por parte de los linfocitos que infiltran el tumor, el éxito de la predicción en este conjunto de datos demuestra que el modelo tiene la capacidad de identificar no sólo neoantígenos capaces de cebar a las células T, como en la sección anterior, sino también neoantígenos presentados a las células T por los tumores.

Para simular la selección de antígenos para la inmunoterapia personalizada, se clasificaron las mutaciones somáticas por orden de probabilidad de presentación utilizando dos métodos: (1) el modelo MS que incluye la característica de región clave (como se describe en la ecuación 12c con un tamaño de bloque n=10), y (2) el modelo MS tradicional sin la característica de región clave. Dado que las capacidades de las inmunoterapias antígeno-específicas están limitadas en el número de especificidades a las que se dirigen (por ejemplo, las vacunas personalizadas actuales codifican ~10- 20 mutaciones6, 81-82), se compararon los métodos predictivos contando el número de respuestas de células T preexistentes en los 5, 10, 20 o 30 péptidos mejor clasificados para cada paciente. Los resultados se representan en la FIG. 16.

Específicamente, la FIG. 16 compara la proporción de péptidos que abarcan mutaciones somáticas reconocidas por las células T para los 5, 10, 20 y 30 péptidos mejor clasificados identificados por un modelo de presentación que utiliza parámetros de regiones clave de presentación y por un modelo de presentación que no utiliza parámetros de regiones clave de presentación, para un conjunto de prueba que comprende muestras de prueba tomadas de pacientes con al menos una respuesta de células T preexistente. Como se ilustra en la FIG. 16, el modelo con la característica de región clave funcionó de forma comparable al modelo sin la característica, en el que ambos modelos predijeron 45 y 31 respuestas de células T en los 20 y 10 péptidos mejor clasificados, respectivamente. Sin embargo, el modelo de regiones clave mostró una mejora al predecir los 30 y 5 péptidos principales, donde el modelo de regiones clave incluyó 6 y 4 respuestas de células T más, respectivamente.

XIII.A. Datos

Obtuvimos las llamadas de mutación, los tipos de HLA y los datos de reconocimiento de células T de la información suplementaria de Gros et al.84, Tran et al.140, Stronen et al.141, Zacharakis et al., y Ko§aloglu-Yalgin et al.160.

Para el análisis a nivel de mutación (FIG. 16), los puntos de datos etiquetados positivamente para Gros et al., Tran et al., Zacharakis et al108., y Ko§aloglu-Yalgin et al.160 fueron mutaciones reconocidas por las células T del paciente tanto en el ensayo TMG como en los ensayos de péptido-pulsante de epítopo mínimo. Los puntos de datos con etiqueta negativa fueron todas las demás mutaciones probadas en ensayos TMG. Para Stronen et al, las mutaciones etiquetadas positivas eran mutaciones abarcadas por al menos un péptido reconocido, y los puntos de datos negativos eran todas las mutaciones probadas pero no reconocidas en los ensayos de tetrámeros. Para los datos de Gros, Tran y Zacharakis, las mutaciones se clasificaron sumando las probabilidades de presentación o tomando la afinidad de unión mínima de todos los péptidos que abarcaban la mutación, ya que el ensayo TMG de 25 polímeros mutados prueba el reconocimiento por parte de las células T de todos los péptidos que abarcan la mutación. Para los datos de Stronen, las mutaciones se clasificaron sumando las probabilidades de presentación o tomando la afinidad de unión mínima de todos los péptidos con mutaciones probados en los ensayos de tetrámeros. La lista completa de mutaciones y características está disponible en la Tabla suplementaria 1.

Para el análisis a nivel de epítopo, los puntos de datos etiquetados positivamente fueron todos los epítopos mínimos reconocidos por las células T de los pacientes en los ensayos de péptido-pulsado o tetrámeros, y los puntos de datos negativos fueron todos los epítopos mínimos no reconocidos por las células T en los ensayos de péptido-pulsado o tetrámeros y todos los péptidos que abarcan mutaciones de los TMG probados que no fueron reconocidos por las células T de los pacientes. En el caso de Gros et al, Tran et al y Zacharakis et al, se eliminaron del análisis los péptidos epitópicos mínimos que abarcaban mutaciones reconocidas en el análisis TMG y que no se probaron mediante ensayos de péptido-pulsión, ya que el estado de reconocimiento de células T de estos péptidos no se determinó experimentalmente.

XV. Ejemplo 11: Identificación de células T reactivas a neoantígenos en pacientes con cáncer

Este ejemplo demuestra que una predicción mejorada puede permitir la identificación de neoantígenos a partir de muestras rutinarias de pacientes. Para ello, se analizaron biopsias tumorales FFPE de archivo y 5-30 ml de sangre periférica de 9 pacientes con NSCLC metastásico sometidos a terapia anti-PD(L)1 (Tabla suplementaria 2: Datos demográficos e información sobre el tratamiento de N=9 pacientes estudiados en las FIG. 17A-C. Los campos clave incluyen el estadio y el subtipo de tumor, la terapia anti-PD1 recibida y el resumen de los resultados de la NGS). La secuenciación del exoma completo del tumor, la secuenciación del transcriptoma del tumor y la secuenciación del exoma normal emparejado dieron como resultado una media de 198 mutaciones somáticas por paciente (SNVs y short indel), de las cuales una media de 118 fueron expresadas (Métodos, Tabla Suplementaria 2). El modelo MS completo se aplicó para priorizar 20 neoepítopos por paciente para su análisis frente a respuestas de células T antitumorales preexistentes. Para centrar el análisis en las probables respuestas CD8, los péptidos priorizados se sintetizaron como epítopos mínimos de 8-11 polímeros (Métodos) y, a continuación, se cultivaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) con los péptidos sintetizados en cultivos cortos de estimulación in vitro (EIV) para expandir las células T reactivas al neoantígeno (Tabla suplementaria 3). Al cabo de dos semanas se evaluó la presencia de células T antígeno-específicas mediante IFN-gamma ELISpot frente a los neoepítopos priorizados. En siete pacientes para los que se disponía de suficientes PBMC, también se realizaron experimentos por separado para deconvolver total o parcialmente los antígenos específicos reconocidos. Los resultados se muestran en las FIG. 17A-C y 18A-21.

La FIG. 17A muestra la detección de respuestas de células T a grupos de péptidos neoantígenos específicos de nueve pacientes. Para cada paciente, los neoantígenos previstos se combinaron en 2 grupos de 10 péptidos cada uno según la clasificación del modelo y cualquier homología de secuencia (los péptidos homólogos se separaron en grupos diferentes). A continuación, para cada paciente, las PBMC expandidas in vitro para el paciente se estimularon con los 2 grupos de péptidos neoantígenos específicos del paciente en IFN-gamma ELISpot. Los datos de la FIG. 17A se presentan como unidades formadoras de manchas (SFU) por 105 células chapadas con el fondo (controles negativos DMSO correspondientes) sustraído. Las mediciones de fondo (controles negativos DMSO) se muestran en la FIG. 21. Se muestran las respuestas de pocillos individuales (pacientes 1-038-001, CU02, CU03 y 1-050-001) o réplicas con media y desviación estándar (todos los demás pacientes) frente a los grupos de péptidos cognados N.° 1 y N.° 2 para los pacientes 1-038-001, 1-050-001, 1 001-002, Cu04, 1-024-001, 1-024-002 y CU05. Para los pacientes CU02 y Cu03, el número de células permitió realizar pruebas únicamente contra el grupo de péptidos específicos N.° 1. Las muestras con valores >2 veces por encima del fondo se consideraron positivas y se designan con una estrella (los donantes sensibles incluyen los pacientes 1-038-001, CU04, 1-024-001, 1-024-002 y CU02). Los donantes que no responden son los pacientes 1-050-001, 1-001-002, CU05 y CU03. La FIG. 17c muestra fotografías de pocillos ELISpot con PBMC expandidas in vitro del paciente CU04, estimuladas en ELISpot IFN-gamma con control negativo DMSO, control positivo PHA, grupo de péptidos neoantígenos específicos de CU04 N.° 1, péptido específico de CU04 1, péptido específico de CU046 y péptido específico de CU048.

Las FIG. 18A-B representan los resultados de experimentos de control con neoantígenos de pacientes en donantes sanos con HLA compatible. Los resultados de estos experimentos verifican que las condiciones de cultivo in vitro sólo expandieron las células T de memoria preexistentes cebadas in vivo, en lugar de permitir el cebado de novo in vitro.

La FIG. 19 muestra la detección de respuestas de células T al control positivo de PHA para cada donante y cada expansión in vitro representada en la FIG. 17A. Para cada donante y cada expansión in vitro de la FIG.

17A, las PBMC del paciente expandidas in vitro se estimularon con PHA para conseguir la máxima activación de células T. Los datos de la FIG. 19 se presentan como unidades formadoras de manchas (SFU) por 105 células chapadas con el fondo (controles negativos DMSO correspondientes) sustraído. Se muestran las respuestas de pocillos individuales o réplicas biológicas para los pacientes 1-038-001, 1-050-001, 1-001-002, CU04, 1-024-001, 1-024-002, CU05 y Cu03. No se realizaron pruebas con PHA para el paciente CU02. Las células del paciente CU02 se incluyeron en los análisis, ya que una respuesta positiva frente al conjunto de péptidos n.° 1 (FIG. 17A) indicaba la existencia de células T viables y funcionales. Como se muestra en la FIG.

17A, los donantes que respondieron a los grupos de péptidos incluyen a los pacientes 1-038-001, CU04, 1 024-001 y 1-024-002. Como también se muestra en la FIG. 17A, los donantes que no respondieron a los grupos de péptidos incluyen a los pacientes 1-050-001, 1-001-002, CU05 y CU03.

La FIG. 20A muestra la detección de respuestas de células T a cada péptido neoantígeno individual específico del paciente en el grupo N.° 2 para el paciente CU04. La FIG. 20A también muestra la detección de respuestas de células T al control positivo de p Ha para el paciente CU04. (Estos datos de control positivo también se muestran en la FIG. 19) Para el paciente CU04, las PBMC expandidas in vitro para el paciente se estimularon en IFN-gamma ELISpot con péptidos neoantígenos individuales específicos del paciente del grupo N.° 2 para el paciente CU04. Las PBMC expandidas in vitro del paciente también se estimularon en el ELISpot de IFN-gamma con PHA como control positivo. Los datos de la se presentan como unidades formadoras de manchas (SFU) por 105 células chapadas con el fondo (controles negativos DMSO correspondientes) sustraído.

La FIG. 20B muestra la detección de respuestas de células T a péptidos neoantígenos individuales específicos del paciente para cada una de las tres visitas del paciente CU04 y para cada una de las dos visitas del paciente 1-024-002, ocurriendo cada visita en un punto temporal diferente. Para ambos pacientes, las PBMC expandidas in vitro para el paciente se estimularon en IFN-gamma ELISpot con péptidos neoantígenos individuales específicos del paciente. Para cada paciente, los datos de cada visita se presentan como unidades formadoras de puntos (SFU) acumuladas (añadidas) por 105 células enplacadas con el fondo (controles DMSO correspondientes) sustraído. Los datos del paciente CU04 se muestran como SFU acumulativo sustraído del fondo de 3 visitas. Para el paciente CU04, se muestra el SFU sustraído del fondo para la visita inicial (T0) y las visitas posteriores 2 meses (T0 2 meses) y 14 meses (T0 14 meses) después de la visita inicial (T0). Los datos del paciente 1-024-002 se muestran como SFU acumulativo sustraído del fondo de 2 visitas. Para el paciente 1-024-002, se muestran los SFU sustraídos del fondo para la visita inicial (T0) y una visita posterior 1 mes (T0 1 mes) después de la visita inicial (T0). Las muestras con valores >2 veces superiores al fondo se consideraron positivas y se designan con una estrella.

La FIG. 20C muestra la detección de respuestas de células T a péptidos neoantígenos individuales específicos del paciente y de grupos de péptidos de neoantígenos específicos del paciente para cada una de las dos visitas del paciente CU04 y para cada una de las dos visitas del paciente 1-024-002, ocurriendo cada visita en un punto temporal diferente. Para ambos pacientes, las PBMC expandidas in vitro para el paciente se estimularon en IFN-gamma ELISpot con péptidos neoantígenos individuales específicos del paciente así como con grupos de péptidos de neoantígenos específicos del paciente. Específicamente, para el paciente CU04, las PBMC expandidas in vitro para el paciente CU04 fueron estimuladas en IFN-gamma ELISpot con péptidos neoantígenos individuales 6 y 8 específicos de CU04, así como con grupos de péptidos neoantígenos específicos de CU04, y para el paciente 1-024-002, las PBMC expandidas in vitro para el paciente 1-024-002 fueron estimuladas en IFN-gamma ELISpot con el péptido neoantígeno individual 16 específico del 1-024-002, así como con grupos de péptidos neoantígenos específicos de 1-024-002. Los datos de la FIG. 20C se presentan como unidades formadoras de manchas (SFU) por 105 células chapadas con el fondo (controles DMSO correspondientes) sustraído para cada réplica técnica con media y rango. Los datos del paciente CU04 se muestran como SFU sustraído del fondo de 2 visitas. Para el paciente CU04, se muestran los SFU sustraídos del fondo para la visita inicial (T0; triplicados técnicos) y una visita posterior 2 mes (T0 2 meses; triplicados técnicos) después de la visita inicial (T0). Los datos del paciente 1-024-002 se muestran como SFU sustraído del fondo de 2 visitas. Para el paciente 1-024-002, se muestran las SFU sustraídas del fondo para la visita inicial (T0; triplicados técnicos) y una visita posterior 1 mes (T0 1 mes; duplicados técnicos, excepto para la muestra estimulada con grupos de péptidos neoantígenos específicos del paciente 1-024-002) después de la visita inicial (T0).

La FIG. 21 muestra la detección de respuestas de células T a los dos grupos de péptidos neoantígenos específicos del paciente y a los controles negativos de DMSO para los pacientes de la FIG. 17A. Para cada paciente, las PBMC expandidas in vitro para el paciente se estimularon con los dos grupos de péptidos neoantígenos específicos del paciente en IFN-gamma ELISpot. Para cada donante y cada expansión in vitro, las PBMC de pacientes expandidas in vitro también se estimularon en IFN-gamma ELISpot con DMSO como control negativo. Los datos de la FIG. 21 se presentan como unidades formadoras de manchas (SFU) por 105 células en placa con fondo (controles negativos DMSO correspondientes) incluidos para los grupos de péptidos neoantígenos específicos de pacientes y los controles DMSO correspondientes. Se muestran las respuestas de pocillos individuales (1-038-001, CU02, CU03 y 1-050-001) o promedios con desviación estándar de duplicados biológicos (todas las demás muestras) frente a los grupos de péptidos cognados N.° 1 y N.° 2 para los pacientes 1-038-001, 1-050-001, 1-001-002, CU04, 1-024-001, 1-024-002 y CU05. Para los pacientes CU02 y CU03, el número de células permitió realizar pruebas únicamente contra el grupo de péptidos específicos N.° 1. Las muestras con valores >2 veces por encima del fondo se consideraron positivas y se designan con una estrella (los donantes sensibles incluyen los pacientes 1-038-001, CU04, 1-024-001, 1-024-002 y CU02). Los donantes que no responden son los pacientes 1-050-001, 1-001-002, CU05 y CU03.

Como ya se ha comentado brevemente en relación con las FIGS. 18A-B, para verificar que las condiciones de cultivo in vitro sólo expandían las células T de memoria cebadas in vivo preexistentes, en lugar de permitir el cebado de novo in vitro, se realizaron una serie de experimentos de control con neoantígenos en donantes sanos con HLA compatible. Los resultados de estos experimentos se muestran en las FIGS. 18A-B y en la Tabla suplementaria 5. Los resultados de estos experimentos confirmaron la ausencia de cebado de novo y la ausencia de una respuesta de células T neoantígeno-específica detectable en donantes sanos mediante la técnica de cultivo EIV.

Por el contrario, se identificaron células T reactivas a neoantígenos preexistentes en la mayoría (5/9, 56 %) de los pacientes analizados con grupos de péptidos específicos del paciente (FIG. 17A y 19-21) utilizando IFN-gamma ELISpot. De los 7 pacientes en los que el número de células permitió realizar pruebas completas o parciales de péptidos neoantígenos cognados individuales, 4 pacientes respondieron al menos a uno de los péptidos neoantígenos probados, y todos estos pacientes tuvieron una respuesta de grupo correspondiente (FIG. 17B). Los 3 pacientes restantes analizados con neoantígenos individuales (pacientes 1-001-002, 1-050 001 y CU05) no tuvieron respuestas detectables frente a péptidos individuales (datos no mostrados), confirmando la falta de respuesta observada en estos pacientes frente a grupos de neoantígenos (FIG. 17A). Entre los 4 pacientes que respondieron, se dispuso de muestras de una sola visita para 2 pacientes con respuesta (pacientes 1-024-001 y 1-038-001), mientras que se dispuso de muestras de múltiples visitas para los otros 2 pacientes con respuesta (CU04 y 1-024-002). Para los 2 pacientes con muestras de múltiples visitas, las unidades formadoras de manchas (SFU) acumuladas (añadidas) de 3 visitas (paciente CU04) o 2 visitas (paciente 1-024-002) se muestran en la FIG. 17B y desglosadas por visita en la FIG. 20B. También se dispuso de muestras adicionales de PBMC de las mismas visitas para los pacientes 1-024-002 y CU04, y la repetición del cultivo EIV y ELISpot confirmó las respuestas a los neoantígenos específicos del paciente (FIG. 20C).

En general, entre los pacientes en los que se identificó al menos un neoepítopo reconocido por células T, como muestra la respuesta a un conjunto de 10 péptidos en la FIG. 17A, el número de neoepítopos reconocidos fue de una media de al menos 2 por paciente (mínimo de 10 epítopos identificados en 5 pacientes, contando un conjunto reconocido que no se pudo deconvolver como 1 péptido reconocido). Además de analizar la respuesta a IFN-gamma mediante ELISpot, los sobrenadantes de cultivo también se analizaron para granzima B mediante ELISA y para TNF-alfa, IL-2 e IL-5 mediante el ensayo multiplex de citocinas MSD. Las células de 4 de los 5 pacientes con ELISpots positivos secretaban 3 o más analitos, incluida la granzima B (Tabla Suplementaria 4), lo que indica polifuncionalidad de las células T neoantígeno-específicas. Es importante destacar que, dado que el método combinado de predicción y EIV no dependía de un conjunto limitado de multímeros MHC disponibles, las respuestas se probaron ampliamente a través de alelos HLA restrictivos. Además, este enfoque identifica directamente el epítopo mínimo, a diferencia del cribado de minigenes en tándem, que identifica las mutaciones reconocidas y requiere una etapa de deconvolución separado para identificar los epítopos mínimos. En general, el rendimiento de la identificación de neoantígenos fue comparable a los mejores métodos anteriores96 que analizaban TIL frente a todas las mutaciones con muestras de aféresis, mientras que el cribado de sólo 20 péptidos sintéticos con una rutina de 5 a 30 ml de sangre total.

XV.A. Péptidos

Los péptidos recombinantes liofilizados, fabricados a medida, se adquirieron a JPT Peptide Technologies (Berlín, Alemania) o Genscript (Piscataway, NJ, EE. UU.) y se reconstituyeron a 10-50 mM en DMSO estéril (VWR International, Pittsburgh, PA, EE.UU.), se alicuotaron y se almacenaron a -80 °C.

XV.B. Células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC)

Las PBMC criopreservadas con tipificación HLA procedentes de donantes sanos (seronegativos confirmados para el VIH, el VHC y el VHB) se compraron de Precision for Medicine (Gladstone, NJ, EE. UU.) o Cellular Technology, Ltd.(Cleveland, OH, EE. UU.) y almacenado en nitrógeno líquido hasta su uso. Las muestras de sangre fresca se adquirieron a Research Blood Components (Boston, MA, EE.UU.), los leucopaks a AllCells (Boston, MA, EE. UU.) y las PBMC se aislaron mediante gradiente de densidad Ficoll-Paque (GE Healthcare Bio, Marlborough, MA, Ee . UU.) antes de su crioconservación. Los pacientes PBMC se procesaron en centros de procesamiento clínicos locales de acuerdo con los procedimientos operativos estándar (POE) clínicos locales y los protocolos aprobados por el CEI. Los CEI que dieron su aprobación fueron Quorum Review IRB, Comitato Etico Interaziendale A.O.U. San Luigi Gonzaga di Orbassano, y Comité Ético de la Investigatción del Grupo Hospitalario Quirón en Barcelona.

Brevemente, las PBMC se aislaron mediante centrifugación en gradiente de densidad, se lavaron, se contaron y se criopreservaron en CryoStor CS10 (STEMCELL Technologies, Vancouver, BC, V6A 1B6, Canadá) a 5 x 106 células/ml. Las células crioconservadas se enviaron en criopuertos y se almacenaron en LN2 a su llegada. Los datos demográficos de los pacientes figuran en la Tabla suplementaria 2. Las células criopreservadas se descongelaron y lavaron dos veces en OpTmizer T-cell Expansión Basal Médium (Gibco, Gaithersburg, MD, EE.UU.) con Benzonase (EMD MiNipore, Billerica, MA, EE.<u>U.) y una vez sin Benzonase. El recuento de células y la viabilidad se evaluaron utilizando el módulo y los reactivos Guava ViaCount en el citómetro Guava easyCyte HT (EMD Millipore). A continuación, las células se volvieron a suspender en concentraciones y medios adecuados para realizar los ensayos (véanse las secciones siguientes).

XV.C. Cultivos de estimulación in vitro (EIV)

Las células T preexistentes de muestras de donantes o pacientes sanos se expandieron en presencia de péptidos afines e IL-2 en un enfoque similar al aplicado por Ott et al.81 Brevemente, las PBMC descongeladas se dejaron en reposo durante la noche y se estimularon en presencia de grupos de péptidos (10 pM por péptido, 10 péptidos por grupo) en medio de expansión de células T ImmunoCult™-XF(STEMCELL Technologies) con 10 Ul/ml de rhIL-2 (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN) durante 14 días en placas de cultivo tisular de 24 pocillos. Las células se sembraron a 2 x 106 células/pocillo y se alimentaron cada 2-3 días sustituyendo 2/3 del medio de cultivo. Una muestra de un paciente mostró una desviación del protocolo y debe considerarse como un posible falso negativo: El paciente CU03 no produjo un número suficiente de células tras la descongelación y se sembraron células a 2 x 105 células por grupo de péptidos (10 veces menos que por protocolo).

XV.D. IFN vEnsavo ELISpot (Enzyme Linked Immunospot)

La detección de células T productoras de IFNy se realizó mediante el ensayo ELISpot 142. Brevemente, se cosecharon PBMC (ex vivo o tras la expansión in vitro), se lavaron en RPMI sin suero (VWR International) y se cultivaron en presencia de controles o péptidos afines en OpTmizer T-cell Expansion Basal Medium (ex vivo) o en ImmunoCult™-XF T-cell Expansion Medium (cultivos expandidos) en placas ELISpot Multiscreen (EMD Millipore) recubiertas con anticuerpo de captura anti IFNy humano (Mabtech, Cincinatti, OH, EE. UU.). Tras 18 horas de incubación en un incubador humidificado al 5 % de CO2 a 37 °C, se retiraron las células de la placa y se detectó el IFNy unido a la membrana utilizando un anticuerpo de detección anti IFNy humano (Mabtech), el complejo de peroxidasa Vectastain Avidin (Vector Labs, Burlingame, CA, EE. UU.) y el sustrato AEC (BD Biosciences, San Jose, CA, EE. UU.). Las placas ELISpot se dejaron secar, se almacenaron protegidas de la luz y se enviaron a Zellnet Consulting, Inc., Fort Lee, NJ, EE. u U.) para su evaluación estandarizada143. Los datos se presentan como unidades formadoras de manchas (SFU) por número de células sembradas.

XV.E. Granzima B ELISA v ensayo multiplex MSD

La detección de IL-2, IL-5 y TNF-alfa secretados en sobrenadantes ELISpot se realizó utilizando un ensayo de 3 multiplex MSD U-PLEX Biomarker assay (número de catálogo K15067L-2). Los ensayos se realizaron siguiendo las instrucciones del fabricante. Las concentraciones de los analitos (pg/ml) se calcularon utilizando diluciones seriadas de estándares conocidos para cada citocina. Para la representación gráfica de los datos, los valores inferiores al intervalo mínimo de la curva estándar se representaron iguales a cero. La detección de granzima B en sobrenadantes ELISpot se realizó utilizando el ELISA DuoSet® de granzima B (R & D Systems, Minneapolis, MN) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, los sobrenadantes ELISpot se diluyeron 1:4 en diluyente de muestra y se analizaron junto con diluciones seriadas de estándares de Granzima B para calcular las concentraciones (pg/ml). Para la representación gráfica de los datos, los valores inferiores al intervalo mínimo de la curva estándar se representaron iguales a cero.

XV.F. Experimentos de control negativo para el ensayo EIV - Neoantígenos de líneas celulares tumorales ensayadas en donantes sanos

La FIG. 18A ilustra experimentos de control negativo para el ensayo EIV de neoantígenos de líneas celulares tumorales analizadas en donantes sanos. Las PBMC de donantes sanos se estimularon en cultivo EIV con grupos de péptidos que contenían péptidos de control positivos (exposición previa a enfermedades infecciosas), neoantígenos HLA emparejados procedentes de líneas celulares tumorales (no expuestos) y péptidos derivados de patógenos para los que los donantes eran seronegativos. Las células expandidas se analizaron posteriormente mediante IFN<y>ELISpot (105 células/pocillo) tras la estimulación con DMSO (controles negativos, círculos negros), PHA y péptidos de enfermedades infecciosas comunes (controles positivos, círculos rojos), neoantígenos (no expuestos, círculos celestes) o péptidos de VIH y VHC (se confirmó que los donantes eran seronegativos, azul marino, A y B). Los datos se muestran como unidades formadoras de puntos (SFU) por 105 células sembradas. Se muestran replicados biológicos con media y SEM. No se observaron respuestas a los neoantígenos ni a los péptidos derivados de agentes patógenos a los que los donantes no habían estado expuestos (seronegativos).

XV.G. Experimentos de control negativo para el ensayo EIV - Neoantígenos de pacientes analizados en Donantes sanos

La FIG. 18A ilustra experimentos de control negativo para el ensayo EIV de neoantígenos de pacientes probados para la reactividad en donantes sanos. Evaluación de las respuestas de las células T en donantes sanos a grupos de péptidos neoantígenos compatibles con HLA. Panel izquierdo: Se estimularon PBMC de donantes sanos con controles (DMSO, CEF y p Ha ) o péptidos neoantígenos derivados de pacientes con HLA compatible en ELISpot de IFN-gamma ex vivo. Los datos se presentan como unidades formadoras de puntos (SFU) por 2 x 105 células chapadas en pocillos por triplicado. Panel derecho: Las PBMC de donantes sanos tras el cultivo EIV, expandidas en presencia del grupo de neoantígenos o del grupo de CEF, se estimularon en ELISpot de IFN-gamma con controles (DMSO, CEF y PHA) o con el grupo de péptidos de neoantígenos derivados de pacientes con HLA compatible. Los datos se presentan como<s>F<u>por 1 x 105 células sembradas en pocillos por triplicado. No se observan respuestas a neoantígenos en donantes sanos.

XV.H. Tabla suplementaria 3: Péptidos probados para el reconocimiento de células T en pacientes con NSCLC

Detalles sobre los péptidos neoantígenos probados para los N=9 pacientes estudiados en las FIG. 17A-C (Identificación de células T reactivas a neoantígenos en pacientes con NSCLC). Los campos clave incluyen la mutación de origen, la secuencia del péptido y las respuestas observadas del grupo y del péptido individual. La columna "restricción_más_probable" indica qué alelo es más probable que presente cada péptido según el modelo. También se incluyen los rangos de estos péptidos entre todos los péptidos mutados para cada paciente, calculados con la predicción de afinidad de unión (Métodos).

Hubo cuatro péptidos altamente clasificados por el modelo MS completo y reconocidos por las células T CD8 que tenían afinidades de unión predichas bajas o que fueron clasificados bajos por la predicción de afinidad de unión.

Para tres de estos péptidos, esto se debe a diferencias en la cobertura HLA entre el modelo y MHCflurry 1.2.0. Se predice que el péptido YEHEDVKEA es presentado por HLA-B*49:01, que no está cubierto por MHCflurry 1.2.0. Del mismo modo, se predice que los péptidos SSAAAPFPL y FVSTSDIKSM son presentados por HLA-C*03:04, que tampoco está cubierto por MHCflurry 1.2.0. El predictor en línea NetMHCpan 4.0 (BA), un predictor de afinidad de unión panespecífica que en principio cubre todos los alelos, clasifica a SSAAAPFPL como una unión fuerte a HLA-C*03:04 (23,2nM, clasificado 2° para el paciente 1-024-002), predice una unión débil de FVSTSDIKSM a HLA-C*03:04 (943.4nM, puesto 39 para el paciente 1-024-002) y una unión débil de YEHEDVKEA a HLA-B*49:01 (3387,8nM), pero una unión más fuerte a HLA-B*41:01 (208,9nM, puesto 11 para el paciente 1-038-001), que también está presente en este paciente pero no está cubierto por el modelo. Así, de estos tres péptidos, FVSTSDIKSM no habría sido detectado por la predicción de afinidad de unión, SSAAAPFPL habría sido capturado, y la restricción HLA de YEHEDVKEA es incierta.

Los cinco péptidos restantes para los que se deconvolvió una respuesta de células T específica del péptido procedían de pacientes en los que el alelo de presentación más probable determinado por el modelo también estaba cubierto por MHCflurry 1.2.0. De estos cinco péptidos, 4/5 tenían afinidades de unión predichas superiores al umbral estándar de 500 nM y se clasificaron entre los 20 primeros, aunque con clasificaciones algo inferiores a las del modelo (los péptidos DENITTIQF, QDVSVQVER, EVADAATLTM, DTVEYPYTSF fueron clasificados 0, 4, 5, 7 por el modelo respectivamente frente a 2, 14, 7, y 9 por MHCflurry). El péptido GTKKDVDVLK fue reconocido por las células T CD8 y clasificado como 1 por el modelo, pero tenía un rango 70 y una afinidad de unión predicha de 2169 nM por MHCflurry.

En general, 6/8 de los péptidos reconocidos individualmente que obtuvieron una clasificación alta con el modelo MS completo también obtuvieron una clasificación alta utilizando la predicción de afinidad de unión y tenían una afinidad de unión predicha <500 nM, mientras que 2/8 de los péptidos reconocidos individualmente se habrían pasado por alto si se hubiera utilizado la predicción de afinidad de unión en lugar del modelo MS completo.

XV.I. Tabla suplementaria 4: MSD Cytokine Multiplex y ensayos ELISA en sobrenadantes ELISpot de péptidos neoantígenos de NSCLC

Los analitos detectados en los sobrenadantes de pocillos ELISpot positivos (IFNgamma) se muestran para granzima B (ELISA), TNFalfa, IL-2 e IL-5 (MSD). Los valores se muestran como media de pg/ml a partir de réplicas técnicas. Los valores positivos aparecen en cursiva. Granzima B ELISA: Los valores >1,5 veces por encima del fondo DMSO se consideraron positivos. Ensayo U-Plex MSD: Los valores >1,5 veces por encima del fondo DMSO se consideraron positivos.

XV.J. Tabla suplementaria 5: Neoantígeno y epítopos de enfermedades infecciosas en Experimentos de control EIV

Los detalles sobre el neoantígeno de la línea celular tumoral y los péptidos virales probados en los experimentos de control EIV mostrados en las FIG. 18A-B. Los campos clave incluyen la línea celular o el virus de origen, la secuencia peptídica y el alelo HLA de presentación previsto.

XV.K. Datos

El conjunto de datos de péptidos MS utilizado para entrenar y probar el modelo de predicción (FIG. 16) está disponible en el MassIVE Archive (massive.ucsd.edu), número de acceso MSV000082648. Péptidos neoantígenos analizados mediante ELISpot (FIG. 17A-C y 18A-B) se incluyen en el manuscrito (Tablas suplementarias 3 y 5).

XVI. Métodos de los Ejemplos 8 a 11

XVI.A. Espectrometría de masas

XVI.A.1. Especímenes

Las muestras de tejido congelado archivadas para el análisis por espectrometría de masas se obtuvieron de fuentes comerciales, como BioServe (Beltsville, MD), ProteoGenex (Culver City, CA), iSpecimen (Lexington, MA) e Indivumed (Hamburgo, Alemania). También se recogió prospectivamente un subconjunto de muestras de pacientes del Hopital Marie Lannelongue (Le Plessis-Robinson, Francia) en el marco de un protocolo de investigación aprobado por el Comité de Protection des Personnes, Ile-de-France VII.

XVI.A.2. Inmunoprecipitación HLA

El aislamiento de las moléculas de péptidos HLA se realizó mediante métodos establecidos de inmunoprecipitación (IP) tras la lisis y solubilización de la muestra de tejido 87.124- 126. Se pulverizó tejido fresco congelado (CryoPrep; Covaris, Woburn, MA), se añadió tampón de lisis (1 % CHAPS, 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, inhibidores de proteasa y fosfatasa, pH=8) para solubilizar el tejido y la solución resultante se centrifugó a 4C durante 2 h para separar los restos. El lisado clarificado se utiliza para la IP específica de HLA. La inmunoprecipitación se realizó como se ha descrito anteriormente utilizando el anticuerpo W6/32127. El lisado se añade a las perlas de anticuerpos y se rota a 4C durante la noche para la inmunoprecipitación. Tras la inmunoprecipitación, se retiraron las perlas del lisado. Las perlas IP se lavaron para eliminar la unión no específica y el complejo HLA/péptido se eluyó de las perlas con ácido acético 2N. Los componentes de proteína se eliminaron de los péptidos mediante una columna de centrifugación de peso molecular. Los péptidos resultantes se llevaron a sequedad mediante evaporación SpeedVac y se almacenaron a -20C antes del análisis MS.

XVI.A.3. Secuencia peptídica

Los péptidos desecados se reconstituyeron en tampón A de HPLC y se cargaron en una columna microcapilar C-18 de HPLC para la elución en gradiente hacia el espectrómetro de masas. Se utilizó un gradiente de 0-40 %B (disolvente A - ácido fórmico al 0,1 %, disolvente B - ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo al 80 %) en 180 minutos para eluir los péptidos en el espectrómetro de masas Fusion Lumos (Thermo). Los espectros MS1 de masa/carga (m/z) del péptido se recogieron en el detector Orbitrap a con resolución 120.000, seguidos de barridos 20 MS2 de baja resolución recogidos en el detector Orbitrap o en el de trampa de iones tras la fragmentación HCD del ion seleccionado. La selección de iones MS2 se realizó utilizando el modo de adquisición dependiente de los datos y la exclusión dinámica de 30 segundos tras la selección MS2 de un ion. El control automático de ganancia (AGC) para las exploraciones MS1 se fijó en 4x105 y para las exploraciones MS2 en 1x104. Para la secuenciación de péptidos HLA, se pueden seleccionar los estados de carga 1, 2 y 3 para la fragmentación MS2.

Los espectros MS2 de cada análisis se buscaron en una base de datos de proteínas utilizando Comet 128.129 y la identificación de péptidos se puntuaron utilizando Percolator 130- 132.

XVI.B. Aprendizaje automático

XVI.B.1. Codificación de datos

Para cada muestra, los puntos de datos de entrenamiento eran todos los péptidos de 8 a 11 polímeros (inclusive) del proteoma de referencia que correspondían exactamente a un gen expresado en la muestra. El conjunto de datos de entrenamiento global se formó concatenando los conjuntos de datos de entrenamiento de cada muestra de entrenamiento. Se eligieron las longitudes 8-11 ya que este rango de longitudes captura el ~95 % de todos los péptidos HLA de clase I presentados; sin embargo, añadir las longitudes 12-15 al modelo podría lograrse utilizando la misma metodología, a costa de un modesto incremento en las demandas computacionales. Los péptidos y la secuencia flanqueante se vectorizaron utilizando un esquema de codificación de un solo punto. Los péptidos de longitudes múltiples (8-11) se representaron como vectores de longitud fija aumentando el alfabeto de aminoácidos con un carácter de almohadilla y rellenando todos los péptidos hasta la longitud máxima de 11. La abundancia de ARN de la proteína fuente de los péptidos de entrenamiento se representó como el logaritmo de la estimación de transcritos por millón (TPM) a nivel de isoterma obtenida a partir de RSEM133. Para cada péptido, el TPM por péptido se calculó como la suma de las estimaciones del TPM por isoterma para cada una de las isotermas que contienen el péptido. Los péptidos de genes expresados a 0 TPM se excluyeron de los datos de entrenamiento, y en el momento de la prueba, a los péptidos de genes no expresados se les asigna una probabilidad de presentación de 0. Por último, cada péptido se asignó a una ID de familia de proteínas Ensembl, y cada ID de familia de proteínas Ensembl única correspondió a un intercepto de propensión de presentación por gen (véase la siguiente sección).

XVI.B.2. Especificación de la arquitectura del modelo

El modelo de presentación completa tiene la siguiente forma funcional:

(Ecuación 1) Pr(péptido i presentado) = X5T=iaíc' Pr(péptido i presentado mediante alelo a),

donde k indexa los alelos HLA en el conjunto de datos, que van de 1 a m, y alk es una variable indicadora cuyo valor es 1 si el alelo k está presente en la muestra de la que se deriva el péptido i y 0 en caso contrario. Obsérvese que, para un péptido i determinado, todos los alk menos 6 como máximo (los 6 correspondientes al tipo HLA de la muestra de origen del péptido i) serán cero. La suma de probabilidades se recorta a 1 - e, con e = 10“ 6 por ejemplo.

Las probabilidades de presentación por alelo se modelan como sigue:

Pr(péptido í presentado mediante alelo a) = sigmoide|WNa (péptido;) NWflanquente (flanqueante;)<NNARNQog(TPMi))>^muestra(i) ^proteína(i)} ,

donde las variables tienen los siguientes significados: sigmoid es la función sigmoidea (también conocida como expit), peptide¡ es la secuencia de aminoácidos intermedia del péptido i codificada en una sola etapa, NNa es una red neuronal con activación lineal de última capa que modela la contribución de la secuencia peptídica a la probabilidad de presentación, flanking; es la secuencia flanqueante del péptido i en su proteína de origen, NNfianking es una red neuronal con activación lineal de última capa que modela la contribución de la secuencia flanqueante a la probabilidad de presentación, TPM¡ es la expresión de los ARNm de origen del péptido i en unidades de TPM, es la muestra (es decir, el número de muestras), es la expresión de los ARNm de origen del péptido i en unidades de TPM, sample(í) es la muestra (es decir, paciente) de origen del péptido i,asampie(;) es un intercepto por muestra, protein(i) es la proteína de origen del péptido i, y ^ protein(i) es un intercepto por proteína (es decir, la propensión de presentación por gen).

Para los modelos descritos en la sección de resultados, las redes neuronales componentes tienen las siguientes arquitecturas:

Cada una de las NNa es un nodo de salida de un perceptrón multicapa (MLP) de una capa oculta con dimensión de entrada 231 (11 residuos x 21 caracteres posibles por residuo, incluido el carácter de almohadilla), anchura 256, activaciones de unidad lineal rectificada (ReLU) en la capa oculta, activación lineal en la capa de salida y un nodo de salida por alelo HLA a en el conjunto de datos de entrenamiento.

N%anking es un MLP de una capa oculta con dimensión de entrada 210 (5 residuos de secuencia de flanqueo N-terminal 5 residuos de secuencia de flanqueo C-terminal x 21 caracteres posibles por residuo, incluido el carácter de almohadilla), anchura 32, activaciones de unidad lineal rectificada (ReLU) en la capa oculta y activación lineal en la capa de salida.

NN<rna>es un MLP de una capa oculta con dimensión de entrada 1, anchura 16, activaciones de unidad lineal rectificada (ReLU) en la capa oculta y activación lineal en la capa de salida.

Nótese que algunos componentes del modelo (p. ej., NNa), dependen de un alelo HLA particular, pero muchos componentes (WWflanqueante, NNarn, amuestra(Q, (Voteínam) no lo requieren. El primero se denomina "alelointeractuante" y el segundo "alelo-no-interactuante". Las características a modelar como alelo-interactuante o no-interactuante se eligieron en base al conocimiento biológico previo: el alelo HLA ve el péptido, por lo que la secuencia del péptido debería modelarse como alelo-interactuante, pero no se transmite ninguna información sobre la proteína fuente, la expresión del ARN o la secuencia flanqueante a la molécula HLA (ya que el péptido se ha separado de su proteína fuente en el momento en que se encuentra con el HLA en el retículo endoplásmico), por lo que estas características deberían modelarse como alelo-no-interactuante. El modelo se implementó en Keras v2.0.4134 y Theano v0.9.0135.

El modelo MS peptídico utilizó el mismo procedimiento de deconvolución que el modelo MS completo (Ecuación 1), pero las probabilidades de presentación por alelo se generaron utilizando modelos reducidos por alelo que sólo consideran la secuencia peptídica y el alelo HLA:

Pr(péptido i presentado mediante alelo a) = sigmoide{NNa (péptido;)}.

El modelo de MS peptídica utiliza las mismas características que la predicción de afinidad de unión, pero las ponderaciones del modelo se entrenan en un tipo de datos diferente (es decir, datos de espectrometría de masas frente a datos de afinidad de unión HLA-péptido). Por lo tanto, la comparación del rendimiento predictivo del modelo de MS peptídica con el modelo de MS completa revela la contribución de las características no peptídicas (es decir, abundancia de ARN, secuencia flanqueante, ID del gen) al rendimiento predictivo global, y la comparación del rendimiento predictivo del modelo de MS peptídica con los modelos de afinidad de unión revela la importancia de la mejora del modelado de la secuencia peptídica para el rendimiento predictivo global.

XVI.B.3. Formar/validar/probar divisiones

Nos aseguramos de que ningún péptido apareciera en más de uno de los conjuntos de entrenamiento/validación/prueba utilizando el siguiente procedimiento: en primer lugar, eliminando todos los péptidos del proteoma de referencia que aparecen en más de una proteína y, a continuación, particionando el proteoma en bloques de 10 péptidos adyacentes. Cada bloque se asignó de forma única a los conjuntos de entrenamiento, validación o prueba. De este modo, ningún péptido aparece en más de uno de los conjuntos de entrenamiento, validación y prueba. El conjunto de validación sólo se utilizó para la detención temprana. Los datos de la prueba de muestras tumorales de las FIG. 14-16 representan péptidos del conjunto de prueba (es decir, péptidos de los bloques de péptidos adyacentes asignados de forma única al conjunto de prueba) de cinco muestras tumorales que se mantuvieron totalmente fuera de los conjuntos de entrenamiento y validación.

XVI.B.4. Entrenamiento de modelos

Para el entrenamiento del modelo, todos los péptidos se modelaron como independientes y la pérdida por péptido es la función de pérdida de probabilidad logarítmica negativa de Bernoulli (también conocida como pérdida logarítmica). Formalmente, la contribución del péptido i a la pérdida global es

Pérdida(í) = - log(Bemoulli(y£ | Pr(péptido i presentado))),

donde y l es la etiqueta del péptido i; es decir, y¡ = 1 si se presenta el péptido 0 en caso contrario, y Bemoulli(y | p)denota la probabilidad Bernoulli del parámetro p e [0 ,1]dado el vector de observación binaria i.i.d. y. El modelo se entrenó minimizando la función de pérdida.

Para reducir el tiempo de entrenamiento, el equilibrio de clases se ajustó eliminando aleatoriamente el 90 % de los datos de entrenamiento etiquetados negativamente, lo que dio como resultado un equilibrio de clases global del conjunto de entrenamiento de un péptido presentado por cada ~2000 péptidos no presentados. Los pesos del modelo se inicializaron mediante el procedimiento uniforme Glorot procedure61 y se entrenaron utilizando el optimizador estocástico ADAM62 con parámetros estándar en GPU Nvidia Maxwell TITAN X. Se utilizó un conjunto de validación formado por el 10 % de los datos totales para la detención anticipada. El modelo se evaluó en el conjunto de validación cada trimestre y el entrenamiento del modelo se detuvo tras el primer trimestre en el que la pérdida de validación (es decir, la log-verosimilitud negativa de Bernoulli en el conjunto de validación) no disminuyó.

El modelo de presentación completa era un conjunto de 10 réplicas del modelo, con cada réplica entrenada independientemente en una copia barajada de los mismos datos de entrenamiento con una inicialización aleatoria diferente de los pesos del modelo para cada modelo dentro del conjunto. En el momento de la prueba, las predicciones se generaron tomando la media de las probabilidades resultantes de las réplicas del modelo.

XVI.B.5. Logos de motivo

Los logotipos de los motivos se generaron utilizando la API Python weblogolib v3.5.0138. Para generar logotipos de afinidad de unión, se descargó el archivo mhc_ligand_full.csv de la base de datos de epítopos inmunitarios (IEDB88) en julio de 2017 y se retuvieron los péptidos que cumplían los siguientes criterios: medición en unidades nanomolares (nM), fecha de referencia posterior a 2000, tipo de objeto igual a "péptido lineal" y todos los residuos del péptido extraídos del alfabeto canónico de 20 letras de aminoácidos. Los logos se generaron utilizando el subconjunto de los péptidos filtrados con afinidad de unión medida por debajo del umbral de unión convencional de 500 nM. Para los pares de alelos con muy pocos ligantes en IEDB, no se generaron logotipos. Para generar logotipos que representaran el modelo de presentación aprendido, se predijeron predicciones del modelo para 2.000.000 de péptidos aleatorios para cada alelo y cada longitud de péptido. Para cada alelo y cada longitud, los logotipos se generaron utilizando los péptidos clasificados en el 1 % superior (es decir, los 20.000 mejores) por el modelo de presentación aprendido. Es importante destacar que estos datos de afinidad de unión de la IED<b>no se utilizaron para entrenar o probar el modelo, sino únicamente para comparar los motivos aprendidos.

XVI.B.6. Predicción de la afinidad de unión

Predijimos las afinidades de unión péptido-MHC utilizando el predictor de afinidad de unión de MHCflurry v1.2.0139, un predictor de afinidad de unión HLA clase I de código abierto y compatible con GPU con un rendimiento comparable al de la familia de modelos NetMHC. Para combinar las predicciones de afinidad de unión para un único péptido a través de múltiples alelos HLA, se seleccionó la afinidad de unión mínima. Para combinar las afinidades de unión a través de múltiples péptidos (es decir, con el fin de clasificar las mutaciones abarcadas por múltiples péptidos mutados como en la FIG. 16), se seleccionó la afinidad de unión mínima a través de los péptidos. Para el umbral de expresión de ARN en el conjunto de datos de células T, se utilizaron datos de ARN-seq coincidentes con el tipo de tumor de TCGA para el umbral en TPM>1. Todos los conjuntos de datos originales de células T se filtraron en TPM>0 en las publicaciones originales, por lo que no se utilizaron los datos de RNA-seq de TCGA para filtrar en TPM>0.

XVI.B.7. Predicción de presentación

Para combinar las probabilidades de presentación de un único péptido a través de múltiples alelos HLA, se identificó la suma de las probabilidades, como en la Ecuación 1. Para combinar las probabilidades de presentación a través de múltiples péptidos (es decir, con el fin de clasificar las mutaciones abarcadas por múltiples péptidos como en la FIG. 16), se identificó la suma de las probabilidades de presentación. Probabilísticamente, si la presentación de los péptidos se considera i.i.d. Variables aleatorias Bernoulli, la suma de las probabilidades corresponde al número esperado de péptidos mutados presentados:

" i

E[#neoantígenos presentados que abarcan mutación í ] = ^ Pr[epitope j presented],

J = í

donde Pr[epitope j presented] se obtiene aplicando el modelo de presentación entrenado al epítopo j, y denota el número de epítopos mutados que abarcan la mutación i. Por ejemplo, para un SNV i distante de las terminaciones de su gen fuente, hay 8 períodos 8-mers, 9-spanning 9-mers, 10 spanning 10-mers y 11 de período 11-mers, para un total de = 38 períodos de epítopos mutados.

XVI.C. Secuenciación de próxima generación

XVI.C.1. Especímenes

Para el análisis del transcriptoma de los tumores resecados congelados, se obtuvo ARN de las mismas muestras de tejido (tumor o normal adyacente) que las utilizadas para los análisis de EM. Para el análisis del exoma y el transcriptoma del neoantígeno en pacientes en tratamiento con anti-PD1, se obtuvo ADN y ARN de biopsias tumorales FFPE de archivo. Se utilizó sangre normal adyacente emparejada o PBMC para obtener ADN normal para la tipificación del exoma normal y HLA.

XVI.C.2. Extracción de ácidos nucleicos y construcción de bibliotecas

El ADN normal/de la línea germinal derivado de la sangre se aisló utilizando columnas Qiagen DNeasy (Hilden, Alemania) siguiendo los procedimientos recomendados por el fabricante. El ADN y el ARN de las muestras de tejido se aislaron utilizando los kits de aislamiento de ADN/ARN Allprep de Qiagen siguiendo los procedimientos recomendados por el fabricante. El ADN y el ARN se cuantificaron por fluorescencia Picogreen y Ribogreen (Molecular Probes), respectivamente las muestras con un rendimiento de >50 ng se pasaron a la construcción de bibliotecas. Las bibliotecas de secuenciación de ADN se generaron mediante cizallamiento acústico (Covaris, Woburn, MA) seguido del kit de preparación de bibliotecas ADN Ultra II (NEB, Beverly, MA) siguiendo los protocolos recomendados por los fabricantes. Las bibliotecas de secuenciación de ARN tumoral se generaron mediante fragmentación por calor y construcción de bibliotecas con ARN Ultra II (NEB). Las bibliotecas resultantes se cuantificaron mediante Picogreen (Molecular Probes).

XVI.C.3. Captura del exoma completo

El enriquecimiento de exones para las bibliotecas de secuenciación tanto de ADN como de ARN se realizó utilizando xGEN Whole Exome Panel (Integrated DNA Technologies). Se utilizaron de uno a 1,5 |jg de ADN normal o de ADN tumoral o bibliotecas derivadas de ARN como entrada y se dejaron hibridar durante más de 12 horas, seguidas de purificación con estreptavidina. Las bibliotecas capturadas se amplificaron mínimamente mediante PCR y se cuantificaron con NEBNext Library Quant Kit (NEB). Las bibliotecas capturadas se agruparon en concentraciones equimolares y se agruparon utilizando el c-bot (Illumina) y se secuenciaron en un HiSeq4000 (Illumina) a 75 bases de extremo pareado con una cobertura media única de >500x exorna tumoral, >100x exorna normal y >100M reads transcriptoma tumoral.

XVI.C.4. Análisis

Las lecturas del exorna (tumor FFPE y normales emparejadas) se alinearon con el genoma humano de referencia (hg38) utilizando BWA-MEM144 (v. 0.7.13-r1126). Las lecturas de ARN-seq (FFPE y muestras de tejido tumoral congelado) se alinearon con el genoma y los transcritos de GENCODE (v. 25) utilizando STAR (v. 2.5.1b). La expresión del ARN se cuantificó utilizando RSEM133 (v. 1.2.31) con los mismos transcritos de referencia. Se utilizó Picard (v. 2.7.1) para marcar las alineaciones duplicadas y calcular las métricas de alineación. Para las muestras tumorales FFPE, tras la recalibración de la puntuación de calidad de la base con GATK145 (v. 3.5-0), se determinaron las variantes de sustitución e indel cortas utilizando exomas emparejados tumor-normal con FreeBayes146 (1.0.2). Los filtros incluían la frecuencia alélica >4 %; la calidad media de las bases >25, la calidad cartográfica mínima de las lecturas de apoyo 30, y el recuento de lecturas alternativas en < normal =2 con cobertura suficiente obtenida. Las variantes también deben detectarse en ambas cadenas. Se excluyeron las variantes somáticas presentes en regiones repetitivas. La traducción y anotación se realizaron con snpEff147 (v. 4.2) utilizando transcritos RefSeq. Las variantes no sinónimas y no detenidas verificadas en los alineamientos del ARN tumoral se adelantaron a la predicción de neoantígenos. Se utilizó Optitype148 1.3.1 para generar los tipos HLA.

XVI.C.5. Las FIG. 18A-B: Líneas celulares tumorales y normales emparejadas para experimentos de control EIV

Las líneas celulares tumorales H128, H122, H2009, H2126, Colo829 y sus líneas celulares de control compatibles con donantes normales BL128, BL2122, BL2009, BL2126 y Colo829BL se adquirieron en ATCC (Manassas, VA) y se cultivaron hasta alcanzar 1083-1084 células según las instrucciones del vendedor, después se congelaron para la extracción de ácidos nucleicos y la secuenciación. El procesamiento NGS se realizó en general como se ha descrito anteriormente, excepto que MuTect149 (3.1-0) se utilizó únicamente para la detección de mutaciones de sustitución. Los péptidos utilizados en los ensayos de control EIV se enumeran en la Tabla suplementaria 5.

XVI.D. Presentación Modelización de regiones clave para moléculas MHC de clase II

También evaluamos el rendimiento del modelo aquí divulgado para la presentación de péptidos HLA de clase II cuando se utilizaban parámetros de regiones clave de presentación y cuando no se utilizaban parámetros de regiones clave de presentación. Mientras que los complejos de clase I presentan proteínas citosólicas y se encuentran en la superficie de todas las células nucleadas humanas, los complejos de clase II se encuentran principalmente en las células presentadoras de antígenos y son los principales responsables de la presentación de proteínas extracelulares (exógenas). También existen diferencias entre las clases I y II en sus mecanismos de unión y en la longitud de los péptidos.

Para evaluar el rendimiento del modelo divulgado en el presente para la presentación de péptidos HLA de clase II cuando se utiliza la característica de región clave de presentación y cuando no se utiliza la característica de región clave de presentación, se obtuvieron datos publicados de espectrometría de masas de clase II para dos líneas celulares, cada una de las cuales expresaba un único alelo HLA de clase I. Una línea celular expresaba HLA-DRB1*15:01 y la otra expresaba HLA-Dr B5*01:01150. Estas dos líneas celulares se utilizaron como datos de entrenamiento. Para los datos de prueba, se obtuvieron datos de espectrometría de masas de clase II de una línea celular distinta que expresaba tanto HLA-DRB1*15:01 como HLA-DRB5*1:01.151 No se disponía de datos de secuenciación de<a>R<n>de las líneas celulares de entrenamiento ni de prueba, por lo que se sustituyeron por datos de secuenciación de ARN de una línea de células B distinta, B72122192.

Los conjuntos de péptidos se dividieron en conjuntos de entrenamiento, validación y prueba siguiendo el mismo procedimiento que para los datos HLA de clase I, salvo que para los datos de clase II se incluyeron péptidos con longitudes entre 9 y 20. Los datos de entrenamiento incluían 330 péptidos presentados por HLA-DRB1*15:01, y 103 péptidos presentados por HLA-DRB5*01:01. El conjunto de datos de prueba incluía 223 péptidos presentados por HlA-DRB1*15:01 o HLA-DRB5*01:01 junto con 4708 péptidos no presentados. El modelo de presentación utilizado para generar los resultados representados en la FIG. 22 es el modelo de predicción de presentación MHC clase II divulgado en el presente documento. El modelo de presentación era un conjunto de 10 modelos entrenados en el conjunto de datos de entrenamiento para predecir la presentación del péptido HLA de clase II. La arquitectura y los procedimientos de entrenamiento de estos modelos fueron idénticos a los utilizados para predecir la presentación de clase I, con la excepción de que los modelos de clase II tomaron como entrada secuencias de péptidos una codificada en caliente y rellenada con cero hasta una longitud de 20 en lugar de 11. La FIG. 22 compara el rendimiento predictivo del modelo de presentación que utilizó parámetros de regiones clave de presentación con el modelo de presentación que no utilizó parámetros de regiones clave de presentación, al predecir la presentación de neoepítopos por moléculas MHC de clase II.

Específicamente, la FIG. 22 representa curvas receiver operating characteristic (ROC) para estas dos versiones del modelo de presentación. El modelo de puntos conflictivos mejoró el rendimiento, alcanzando un área bajo la curva ROC (ROC AUC) de 0,96, mientras que el modelo sin puntos conflictivos arrojó un ROC AUC de sólo 0,93.

XVII. Ejemplo 12: Secuenciación de TCR de células T de memoria específica de neoantígenos de sangre periférica de un paciente NSCLC

La FIG. 23 muestra un método para secuenciar TCR de células T de memoria neoantígeno-específicas de la sangre periférica de un paciente con NSCLC. Células mononucleares de sangre periférica (PBMC) del paciente CU04 con NSCLC (descrito anteriormente en relación con las FIGS. 17A-21) tras la incubación ELISpot. Específicamente, como se discutió anteriormente, las PBMC expandidas in vitro de 2 visitas del paciente CU04 fueron estimuladas en IFN-gamma ELISpot con los péptidos neoantígenos individuales específicos de CU04 (FIG. 20C), con el grupo de péptidos neoantígenos específicos de CU04 (FIG. 20C), y con el control negativo DMSO (FIG. 21). Tras la incubación y antes de añadir el anticuerpo de detección, las PBMC se transfirieron a una nueva placa de cultivo y se mantuvieron en una incubadora durante la realización del ensayo ELISpot. Los pocillos positivos (sensibles) se identificaron a partir de los resultados ELISpot. Como se muestra en la FIG.

20, los pocillos positivos identificados incluyen los pocillos estimulados con el péptido neoantígeno 8 individual específico de CU04 y los pocillos simulados con el conjunto de péptidos neoantígenos específicos de CU04. Las células de estos pocillos positivos y de los pocillos de control negativo (DMSO) se combinaron y se tiñeron para CD137 con anticuerpos marcados magnéticamente para su enriquecimiento mediante columnas de aislamiento magnético Miltenyi.

Las fracciones de células T enriquecidas con CD137 y agotadas, aisladas y expandidas como se ha descrito anteriormente, se secuenciaron utilizando el enfoque de perfiles inmunitarios TCR emparejados con resolución de célula única de 10x Genomics. En concreto, las células T vivas se dividieron en emulsiones unicelulares para la posterior generación de ADNc unicelular y el perfilado del TCR de longitud completa (5' UTR a través de la región constante, asegurando el emparejamiento alfa y beta). Un enfoque utiliza un oligo de cambio de plantilla con código de barras molecular en el extremo 5' de la transcripción, un segundo enfoque utiliza un oligo de región constante con código de barras molecular en el extremo 3', y un tercer enfoque acopla un promotor de ARN polimerasa al extremo 5' o 3' de un TCR. Todos estos enfoques permiten la identificación y deconvolución de pares de TCR alfa y beta a nivel unicelular. Los transcritos de ADNc con código de barras resultantes se sometieron a un flujo de trabajo enzimático y de construcción de bibliotecas optimizado para reducir el sesgo y garantizar una representación precisa de los clonotipos dentro del conjunto de células. Las bibliotecas se secuenciaron en los instrumentos MiSeq o HiSeq4000 de Illumina (150 ciclos paired-end) para una profundidad de secuenciación objetivo de entre cinco mil y cincuenta mil lecturas por célula. Las secuencias de ácido nucleico del TCR resultantes se muestran en la Tabla suplementaria 6. La presencia de las cadenas TCRa y TCRb descritas en la Tabla Suplementaria 6 se confirmó mediante un enfoque de secuenciación de TCR ortogonal basado en anchor-PCR (Archer). Este enfoque particular tiene la ventaja de utilizar un número limitado de células como entrada y menos manipulaciones enzimáticas en comparación con la secuenciación del TCR basada en 10x Genomics.

Los resultados de la secuenciación se analizaron utilizando el software 10x y fármacos de prueba bioinformáticos personalizados para identificar pares de cadenas alfa y beta de receptores de células T (TCR), como también se muestra en la Tabla suplementaria 6. La tabla suplementaria 6 enumera además las regiones variable alfa y beta (V), de unión (J), constante (C) y de diversidad beta (D), y la secuencia de aminoácidos CDR3 de los clonotipos de TCR más prevalentes. Los clonotipos se definieron como pares de cadenas alfa y beta de secuencias únicas de aminoácidos CDR3. Los clonotipos se filtraron por pares de cadenas alfa y beta individuales presentes en una frecuencia superior a 2 células para obtener la lista final de clonotipos por péptido diana en el paciente CU04 (Tabla suplementaria 6).

En resumen, utilizando el método descrito anteriormente con respecto a la FIG. 23, se identificaron las células T CD8+ de memoria de la sangre periférica del paciente CU04, que son neoantígeno-específicas para los neoantígenos tumorales del paciente CU04 identificados como se discutió anteriormente con respecto al Ejemplo 10 en la Sección XIV. Se secuenciaron los TCR de estas células T neoantígeno-específicas identificadas. Y además, se identificaron los TCR secuenciados que son neoantígeno-específicos para los neoantígenos tumorales del paciente CU04 identificados por los modelos de presentación anteriores.

XVIII. Ejemplo 13: Uso de células T de memoria específicas del neoantígeno para la terapia con células T

Una vez identificadas las células T y/o TCR que son neoantígeno-específicas para los neoantígenos presentados por el tumor de un paciente, estas células T y/o TCR neoantígeno-específicas identificadas pueden utilizarse para la terapia con células T en el paciente. Específicamente, estas células T y/o TCR neoantígenoespecíficas identificadas pueden utilizarse para producir una cantidad terapéutica de células T neoantígenoespecíficas para su infusión en un paciente durante la terapia con células T. En las Secciones XVII.A. y XVII.B.

se tratan dos métodos para producir una cantidad terapéutica de células T específicas de neoantígeno para su uso en terapia celular T en un paciente. El primer método comprende expandir las células T específicas de neoantígeno identificadas a partir de una muestra de paciente (Sección XVII.A.). El segundo método comprende la secuenciación de los TCR de las células T neoantígeno-específicas identificadas y la clonación de los TCR secuenciados en nuevas células T (Sección XVII.B.). También pueden utilizarse métodos alternativos para producir células T específicas de neoantígenos para su uso en terapia celular T que no se mencionan explícitamente en el presente documento para producir una cantidad terapéutica de células T específicas de neoantígenos para su uso en terapia celular T. Una vez obtenidas las células T neoantígenoespecíficas mediante uno o más de estos métodos, estas células T neoantígeno-específicas pueden infundirse en el paciente para la terapia con células T.

XVIII.A. Identificación y expansión de células T de memoria de una muestra de paciente para terapia de células T

Un primer método para producir una cantidad terapéutica de células T específicas de neoantígeno para su uso en terapia celular T en un paciente comprende expandir células T específicas de neoantígeno identificadas a partir de una muestra de paciente.

Específicamente, para expandir las células T específicas de neoantígeno a una cantidad terapéutica para su uso en la terapia de células T en un paciente, se identifica un conjunto de péptidos neoantígeno que tienen más probabilidades de ser presentados por las células cancerosas de un paciente utilizando los modelos de presentación descritos anteriormente. Además, se obtiene del paciente una muestra que contiene células T. La muestra del paciente puede comprender sangre periférica del paciente, linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) o células de ganglios linfáticos.

En las realizaciones en las que la muestra del paciente comprende la sangre periférica del paciente, se pueden utilizar los siguientes métodos para expandir las células T neoantígeno-específicas hasta una cantidad terapéutica. En una realización, puede llevarse a cabo el cebado. En otra realización, las células T ya activadas pueden identificarse utilizando uno o más de los métodos descritos anteriormente. En otra realización, se puede llevar a cabo tanto el cebado como la identificación de células T ya activadas. La ventaja de cebar e identificar células T ya activadas es maximizar el número de especificidades representadas. La desventaja de cebar e identificar células T ya activadas es que este enfoque es difícil y requiere mucho tiempo. En otra realización, se pueden aislar células neoantígeno-específicas que no estén necesariamente activadas. En tales realizaciones, también puede llevarse a cabo la expansión específica o inespecífica de antígeno de estas células neoantígeno-específicas. Tras la recogida de estas células T cebadas, éstas pueden someterse a un protocolo de expansión rápida. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las células T cebadas pueden someterse al protocolo de expansión rápida de Rosenberg (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2978753/, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2305721/)153, 154.

En las realizaciones en las que la muestra del paciente comprende TIL del paciente, se pueden utilizar los siguientes métodos para expandir las células T neoantígeno-específicas hasta una cantidad terapéutica. En una realización, los TIL específicos de neoantígeno se pueden clasificar ex vivo por tetrámeros/multímeros y, a continuación, los TIL clasificados se pueden someter a un protocolo de expansión rápida como el descrito anteriormente. En otra realización, puede llevarse a cabo la expansión neoantígeno-no específica de los TIL, después los TIL neoantígeno-específicos pueden clasificarse por tetrámeros, y después los TIL clasificados pueden someterse a un protocolo de expansión rápida como el descrito anteriormente. En otra realización, el cultivo específico de antígeno puede realizarse antes de someter las TIL al protocolo de expansión rápida. (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4607110/, https://onlinelibrary.wiley.com/doi/pdf/10.1002/eji.201545849)155, 156.

En algunas realizaciones, puede modificarse el protocolo de expansión rápida de Rosenberg. Por ejemplo, puede añadirse anti-PD1 y/o anti-41BB al cultivo de TIL para simular una expansión más rápida. (https://jitc.biomedcentral.com/articles/10.1186/s40425-016-0164-7)157.

XVIII.B. Identificación de células T específicas de neoantígeno, secuenciación de TCR de células T específicas de neoantígeno identificadas, y clonación de TCR secuenciada en nuevas células T.

Un segundo método para producir una cantidad terapéutica de células T específicas de neoantígeno para su uso en terapia celular T en un paciente comprende la identificación de células T específicas de neoantígeno a partir de una muestra de paciente, la secuenciación de los TCR de las células T específicas de neoantígeno identificadas y la clonación de los TCR secuenciados en células T nuevas.

En primer lugar, se identifican las células T específicas de neoantígeno a partir de una muestra de paciente y se secuencian los TCR de las células T neoantígeno-específicas identificadas. La muestra del paciente de la que se pueden aislar las células T puede comprender una o más de sangre, ganglios linfáticos o tumores. Más concretamente, la muestra del paciente de la que se pueden aislar células T puede comprender una o más de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC), células infiltrantes de tumores (TIL), células tumorales disociadas (DTC), células T cebadas in vitro, y/o células aisladas de ganglios linfáticos. Estas células pueden ser frescas y/o congeladas. Las PBMC y las células T cebadas in vitro pueden obtenerse de pacientes con cáncer y/o de sujetos sanos.

Una vez obtenida la muestra del paciente, ésta puede expandirse y/o cebarse. Pueden aplicarse varios métodos para expandir y cebar la muestra del paciente. En una realización, las PBMC frescas y/o congeladas pueden simularse en presencia de péptidos o minigenes en tándem. En otra realización, las células T aisladas frescas y/o congeladas pueden simularse y cebarse con células presentadoras de antígenos (APC) en presencia de péptidos o minigenes en tándem. Algunos ejemplos de APC son los linfocitos B, los monocitos, las células dendríticas, los macrófagos o las células presentadoras de antígenos artificiales (como células o perlas que presentan moléculas HLA y coestimuladoras relevantes, revisadas en https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2929753). En otra realización, las PBMC, TIL y/o células T aisladas pueden estimularse en presencia de citoquinas (por ejemplo, IL-2, IL-7 y/o IL-15). En otra realización, los TIL y/o las células T aisladas pueden estimularse en presencia de un estímulo máximo, citocinas y/o células alimentadoras. En tales realizaciones, las células T pueden aislarse por marcadores de activación y/o multímeros (por ejemplo, tetrámeros). En otra realización, las TIL y/o células T aisladas pueden estimularse con marcadores estimuladores y/o coestimuladores (por ejemplo, anticuerpos CD3, anticuerpos CD28, y/o perlas (por ejemplo, DynaBeads). En otra realización, las DTCs pueden expandirse utilizando un protocolo de expansión rápida sobre células alimentadoras a altas dosis de IL-2 en medio rico.

A continuación, se identifican y aíslan las células T neoantígeno-específicas. En algunas realizaciones, las células T se aíslan de una muestra de paciente ex vivo sin expansión previa. En una realización, los métodos descritos anteriormente con respecto a la Sección XVI. pueden utilizarse para identificar células T neoantígenoespecíficas a partir de una muestra de paciente. En una realización alternativa, el aislamiento se lleva a cabo mediante el enriquecimiento de una población celular particular por selección positiva, o el agotamiento de una población celular particular, por selección negativa. En algunas realizaciones, la selección positiva o negativa se logra incubando las células con uno o más anticuerpos u otro agente de unión que se unen específicamente a uno o más marcadores de superficie expresados o expresados (marcador+) a un nivel relativamente más alto (marcadoralto) en las células seleccionadas positiva o negativamente, respectivamente.

En algunas realizaciones, las células T se separan de una muestra de PBMC mediante selección negativa de marcadores expresados en células no T, como células B, monocitos u otros glóbulos blancos, como CD14. En algunos aspectos, se utiliza una etapa de selección CD4+ o CD8+ para separar las células T auxiliares CD4+ de las citotóxicas CD8+. Dichas poblaciones de CD4+ y CD8+ pueden clasificarse en subpoblaciones mediante selección positiva o negativa para marcadores expresados o expresados en un grado relativamente mayor en una o más subpoblaciones de células T sin modificar, de memoria y/o efectoras.

En algunas realizaciones, las células CD8+ se enriquecen aún más o se eliminan de las células madre ingenuas, de memoria central, de memoria efectoras y/o de memoria central, por ejemplo mediante selección positiva o negativa basada en antígenos de superficie asociados con la subpoblación respectiva. En algunas realizaciones, el enriquecimiento para células T de memoria central (MTC) se lleva a cabo para aumentar la eficacia, como para mejorar la supervivencia a largo plazo, la expansión y/o el injerto tras la administración, que en algunos aspectos es particularmente robusto en dichas subpoblaciones. Véase Terakura et al. (2012) Blood. 1:72-82; Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9):689-701. En algunas realizaciones, la combinación de células T CD8+ enriquecidas con MTC y células T CD4+ mejora aún más la eficacia.

En algunas realizaciones, las células T con memoria están presentes en los subconjuntos CD62L+ y CD62L- de los linfocitos CD8+ de la sangre periférica. Las PBMC pueden enriquecerse o eliminarse de las fracciones CD62L-CD8+ y/o CD62L+CD8+, por ejemplo utilizando anticuerpos anti-CD8 y anti-CD62L.

En algunas realizaciones, el enriquecimiento para células T de memoria central (MTC) se basa en la expresión superficial positiva o alta de CD45R<o>, CD62L, CCR7, CD28, CD3, y/o CD 127; en algunos aspectos, se basa en la selección negativa para células que expresan o expresan altamente CD45RA y/o granzima B. En algunos aspectos, el aislamiento de una población CD8+ enriquecida para células MTC se lleva a cabo por depleción de células que expresan CD4, CD14, CD45RA, y selección positiva o enriquecimiento para células que expresan CD62L. En un aspecto, el enriquecimiento para células T de memoria central (TCM) se lleva a cabo comenzando con una fracción negativa de células seleccionadas en base a la expresión de CD4, que se somete a una selección negativa en base a la expresión de CD14 y CD45RA, y a una selección positiva en base a CD62L. Tales selecciones en algunos aspectos se llevan a cabo simultáneamente y en otros aspectos se llevan a cabo secuencialmente, en cualquier orden. En algunos aspectos, la misma etapa de selección basada en la expresión de CD4 utilizado en la preparación de la población o subpoblación de células CD8+ también se utiliza para generar la población o subpoblación de células CD4+, de modo que tanto las fracciones positivas como las negativas de la separación basada en CD4 se conservan y utilizan en etapas posteriores de los métodos, opcionalmente tras uno o más etapas de selección positivas o negativas adicionales.

En un ejemplo particular, una muestra de PBMC u otra muestra de glóbulos blancos se somete a una selección de células CD4+, en la que se retienen tanto las fracciones negativas como las positivas. A continuación, la fracción negativa se somete a una selección negativa basada en la expresión de CD14 y CD45RA o ROR1, y a una selección positiva basada en un marcador característico de las células T de memoria central, como CD62L o CCR7, donde las selecciones positiva y negativa se llevan a cabo en cualquier orden.

Las células T CD4+ auxiliares se clasifican en sin modificar, de memoria central y efectoras mediante la identificación de poblaciones celulares que tienen antígenos de superficie celular. Los linfocitos CD4+ pueden obtenerse por métodos estándar. En algunas realizaciones, los linfocitos T CD4+ ingenuos son linfocitos T CD4+ CD45RO-, CD45RA+, CD62L+. En algunas realizaciones, las células CD4+ de memoria central son CD62L+ y CD45RO+. En algunas realizaciones, las células efectoras CD4+ son CD62L- y CD45RO-.

En un ejemplo, para enriquecer las células CD4+ mediante selección negativa, un cóctel de anticuerpo monoclonal por lo general incluye anticuerpos para CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR y CD8. En algunas realizaciones, el anticuerpo o compañero de unión está unido a un soporte sólido o matriz, como una perla magnética o paramagnética, para permitir la separación de las células para la selección positiva y/o negativa. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las células y las poblaciones celulares se separan o aíslan utilizando técnicas de separación inmunomagnéticas (o de afinidad magnética) (revisado en Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Protocolos de investigación de metástasis, Vol. 2: Comportamiento celular in vitro e in vivo, p 17-25 Editado por: S. A. Brooks y U. Schumacher Humana Press Inc., Totowa, N.J.).

En algunos aspectos, la muestra o composición de células a separar se incuba con material pequeño, magnetizable o que responde magnéticamente, como partículas o micropartículas que responden magnéticamente, como perlas paramagnéticas (por ejemplo, como Dynabeads o MACS beads). El material con respuesta magnética, p. ej., la partícula, generalmente está unido directa o indirectamente a un compañero de unión, p. ej., un anticuerpo, que se une específicamente a una molécula, p. ej., un marcador de superficie, presente en la célula, células o población de células que se desea separar, p. ej., que se desea seleccionar negativa o positivamente.

En algunas realizaciones, la partícula o perla magnética comprende un material magnéticamente sensible unido a un miembro de unión específico, como un anticuerpo u otro compañero de unión. Hay muchos materiales magnéticamente sensibles bien conocidos que se utilizan en los métodos de separación magnética. Entre las partículas magnéticas adecuadas se incluyen las descritas en Molday, Patente estadounidense N.° 4,452,773, y en la Memoria descriptiva de Patente Europea EP 452342 B Partículas de tamaño coloidal, como las descritas en Owen Patente estadounidense Partículas de tamaño coloidal, tal como las descritas en Owen, Patente estadounidense N.° 4,795,698, y Liberti et al., Patente estadounidense N.° 5,200,084 son otros ejemplos.

Por lo general, la incubación se lleva a cabo en condiciones en las que los anticuerpos o las moléculas de unión, como los anticuerpos secundarios u otros reactivos, que se unen específicamente a dichos anticuerpos o moléculas de unión, que están adheridos a la partícula o perla magnética, se unen específicamente a las moléculas de la superficie celular si están presentes en las células de la muestra.

En algunos aspectos, la muestra se coloca en un campo magnético, y aquellas células que tengan partículas magnéticamente sensibles o magnetizables adheridas serán atraídas por el imán y separadas de las células no etiquetadas. Para la selección positiva, se retienen las células que son atraídas por el imán; para la selección negativa, se retienen las células que no son atraídas (células no etiquetadas). En algunos aspectos, se realiza una combinación de selección positiva y negativa durante la misma etapa de selección, en la que las fracciones positivas y negativas se retienen y se siguen procesando o se someten a otras etapas de separación.

En algunas realizaciones, las partículas magnéticamente sensibles están recubiertas de anticuerpos primarios u otros enlaces, anticuerpos secundarios, lectinas, enzimas o estreptavidina. En determinadas realizaciones, las partículas magnéticas se adhieren a las células mediante un recubrimiento de anticuerpos primarios específicos para uno o más marcadores. En algunas realizaciones, las células, en lugar de las perlas, se marcan con un anticuerpo primario o un compañero de unión y, a continuación, se añaden partículas magnéticas recubiertas de anticuerpos secundarios específicos del tipo celular u otro compañero de unión (por ejemplo, estreptavidina). En determinadas realizaciones, las partículas magnéticas recubiertas de estreptavidina se utilizan junto con anticuerpos primarios o secundarios biotinilados.

En algunas realizaciones, las partículas con respuesta magnética se dejan adheridas a las células que se van a incubar, cultivar y/o manipular posteriormente; en algunos aspectos, las partículas se dejan adheridas a las células para su administración a un paciente. En algunas realizaciones, las partículas magnetizables o que responden magnéticamente se retiran de las células. Los métodos para eliminar partículas magnetizables de las células son conocidos e incluyen, por ejemplo, el uso de anticuerpos no marcados competidores, partículas magnetizables o anticuerpos conjugados con enlazadores escindibles, etc. En algunas realizaciones, las partículas magnetizables son biodegradables.

En algunas realizaciones, la selección basada en la afinidad se lleva a cabo mediante selección celular activada magnéticamente (MACS) (Miltenyi Biotech, Auburn, California). Los sistemas MACS (Magnetic Activated Cell Sorting) son capaces de seleccionar células de gran pureza con partículas magnetizadas adheridas a ellas. En determinadas realizaciones, el MACS funciona en un modo en el que las especies no diana y diana se eluyen secuencialmente tras la aplicación del campo magnético externo. Es decir, las células adheridas a las partículas magnetizadas se mantienen en su lugar mientras se eluyen las especies no adheridas. A continuación, una vez completado esta primera etapa de elución, las especies que quedaron atrapadas en el campo magnético y no pudieron ser eluidas se liberan de alguna manera para que puedan ser eluidas y recuperadas. En determinadas realizaciones, las células T no grandes se marcan y se eliminan de la población heterogénea de células.

En determinadas realizaciones, el aislamiento o separación se lleva a cabo utilizando un sistema, dispositivo o aparato que realiza uno o más de las etapas de aislamiento, preparación celular, separación, procesamiento, incubación, cultivo y/o formulación de los métodos. En algunos aspectos, el sistema se utiliza para llevar a cabo cada una de estas etapas en un entorno cerrado o estéril, por ejemplo, para minimizar los errores, la manipulación por parte del usuario y/o la contaminación. En un ejemplo, el sistema es un sistema como el descrito en la Solicitud Internacional de Patente, Número de Publicación Wo 2009/072003, o US 20110003380 A1.

En algunas realizaciones, el sistema o aparato lleva a cabo una o más, por ejemplo, todas, de las etapas de aislamiento, procesamiento, ingeniería y formulación en un sistema integrado o autónomo, y/o de forma automatizada o programable. En algunos aspectos, el sistema o aparato incluye un ordenador y/o un programa informático en comunicación con el sistema o aparato, que permite a un usuario programar, controlar, evaluar el resultado de y/o ajustar diversos aspectos de las etapas de procesamiento, aislamiento, ingeniería y formulación.

En algunos aspectos, la separación y/u otras etapas se llevan a cabo utilizando el sistema CliniMACS (Miltenyi Biotic), por ejemplo, para la separación automatizada de células a escala clínica en un sistema cerrado y estéril. Los componentes pueden incluir un microordenador integrado, una unidad de separación magnética, una bomba peristáltica y varias válvulas de pellizco. En algunos aspectos, el ordenador integrado controla todos los componentes del instrumento y dirige el sistema para realizar procedimientos repetidos en una secuencia estandarizada. En algunos aspectos, la unidad de separación magnética incluye un imán permanente móvil y un soporte para la columna de selección. La bomba peristáltica controla el caudal en todo el conjunto de tubos y, junto con las válvulas de pinzamiento, garantiza el flujo controlado de tampón a través del sistema y la suspensión continua de las células.

En algunos aspectos, el sistema CliniMACS utiliza partículas magnetizables acopladas a anticuerpos que se suministran en una solución estéril no pirogénica. En algunas realizaciones, después de etiquetar las células con partículas magnéticas, las células se lavan para eliminar el exceso de partículas. A continuación, se conecta una bolsa de preparación celular al conjunto de tubos, que a su vez está conectado a una bolsa que contiene tampón y a una bolsa de recogida de células. El juego de tubos consta de tubos estériles premontados, que incluyen una precolumna y una columna de separación, y son de un solo uso. Una vez iniciado el programa de separación, el sistema aplica automáticamente la muestra celular en la columna de separación. Las células marcadas quedan retenidas en la columna, mientras que las no marcadas se eliminan mediante una serie de lavados. En algunas realizaciones, las poblaciones celulares para su uso con los métodos aquí descritos no están etiquetadas y no se retienen en la columna. En algunas realizaciones, las poblaciones celulares para su uso con los métodos aquí descritos están etiquetadas y se retienen en la columna. En algunas realizaciones, las poblaciones celulares para su uso con los métodos aquí descritos se eluyen de la columna tras la eliminación del campo magnético, y se recogen dentro de la bolsa de recogida de células.

En determinadas realizaciones, la separación y/u otras etapas se llevan a cabo utilizando el sistema CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec). En algunos aspectos, el sistema CliniMACS Prodigy está equipado con una unidad de procesamiento celular que permite el lavado y fraccionamiento automatizado de las células mediante centrifugación. El sistema CliniMACS Prodigy también puede incluir una cámara integrada y un software de reconocimiento de imágenes que determina el punto final óptimo de fraccionamiento celular discerniendo las capas macroscópicas del producto celular de origen. Por ejemplo, la sangre periférica puede separarse automáticamente en capas de eritrocitos, glóbulos blancos y plasma. El sistema CliniMACS Prodigy también puede incluir una cámara de cultivo celular integrada que realiza protocolos de cultivo celular como, por ejemplo, diferenciación y expansión celular, carga de antígenos y cultivo celular a largo plazo. Los puertos de entrada permiten la extracción y reposición estéril de los medios, y las células pueden controlarse mediante un microscopio integrado. Véase, por ejemplo, Klebanoff et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 651-660, Terakura et al. (2012) Blood. 1:72-82, yWang et al. (2012) J. Immunother. 35(9):689-701.

En algunas realizaciones, una población celular descrita en el presente documento se recoge y enriquece (o agota) mediante citometría de flujo, en la que las células teñidas para múltiples marcadores de superficie celular se transportan en una corriente fluídica. En algunas realizaciones, una población celular descrita en el presente documento se recoge y enriquece (o agota) mediante clasificación a escala preparativa (FACS). En determinadas realizaciones, una población celular descrita en el presente documento se recoge y se enriquece (o agota) mediante el uso de chips de sistemas microelectromecánicos (MEMS) en combinación con un sistema de detección basado en FACS (véase, por ejemplo, WO 2010/033140, Cho et al. (2010) Lab Chip 10, 1567-1573; y Godin et al. (2008) J Biophoton. 1(5):355-376. En ambos casos, las células pueden marcarse con múltiples marcadores, lo que permite aislar subconjuntos de células T bien definidos y de gran pureza.

En algunas realizaciones, los anticuerpos o socios de unión están marcados con uno o más marcadores detectables, para facilitar la separación para la selección positiva y/o negativa. Por ejemplo, la separación puede basarse en la unión a anticuerpos marcados con fluorescencia. En algunos ejemplos, la separación de células basada en la unión de anticuerpos u otros socios de unión específicos para uno o más marcadores de la superficie celular se lleva a cabo en una corriente fluídica, como por ejemplo mediante la clasificación de células activada por fluorescencia (FACS), incluyendo chips a escala preparativa (FACS) y/o sistemas microelectromecánicos (MEMS), por ejemplo, en combinación con un sistema de detección citométrica de flujo. Estos métodos permiten una selección positiva y negativa basada en múltiples marcadores simultáneamente.

En algunas realizaciones, los métodos de preparación incluyen etapas para congelar, por ejemplo, criopreservar, las células, ya sea antes o después del aislamiento, incubación y/o modificación. En algunas realizaciones, la etapa de congelación y posterior descongelación elimina los granulocitos y, en cierta medida, los monocitos de la población celular. En algunas realizaciones, las células se suspenden en una solución de congelación, por ejemplo, tras una etapa de lavado para eliminar el plasma y las plaquetas. En algunos aspectos puede utilizarse cualquiera de las diversas soluciones y parámetros de congelación conocidos. Un ejemplo consiste en utilizar PBS que contenga un 20 % de DMSO y un 8 % de albúmina sérica humana (HSA), u otros medios de congelación celular adecuados. A continuación, esto puede diluirse 1:1 con medio de manera que la concentración final de DMSO y HSA sea del 10 % y 4 %, respectivamente. Otros ejemplos son los medios de congelación Cryostor®, CTL-Cryo™ ABC y similares. A continuación, las células se congelan a -80 grados C a una velocidad de 1 grado por minuto y se almacenan en la fase de vapor de un tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido.

En algunas realizaciones, los métodos proporcionados incluyen etapas de cultivo, incubación, cultivo y/o ingeniería genética. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se proporcionan métodos para la incubación y/o ingeniería de las poblaciones celulares agotadas y composiciones iniciadoras del cultivo.

Así, en algunas realizaciones, las poblaciones celulares se incuban en una composición iniciadora de cultivos. La incubación y/o ingeniería puede llevarse a cabo en un recipiente de cultivo, como una unidad, cámara, pocillo, columna, tubo, conjunto de tubos, válvula, vial, placa de cultivo, bolsa u otro recipiente para el cultivo o cultivo de células.

En algunas realizaciones, las células se incuban y/o cultivan antes o en relación con la ingeniería genética. Las etapas de incubación pueden incluir el cultivo, la estimulación, la activación y/o la propagación. En algunas realizaciones, las composiciones o las células se incuban en presencia de condiciones estimulantes o de un agente estimulante. Dichas condiciones incluyen aquellas diseñadas para inducir la proliferación, expansión, activación y/o supervivencia de las células de la población, para imitar la exposición al antígeno y/o para preparar las células para la ingeniería genética, como por ejemplo para la introducción de un receptor de antígeno recombinante.

Las condiciones pueden incluir uno o más de los medios particulares, temperatura, contenido de oxígeno, contenido de dióxido de carbono, tiempo, agentes, por ejemplo, nutrientes, aminoácidos, antibióticos, iones, y/o factores estimulantes, tales como citoquinas, quimioquinas, antígenos, socios de unión, proteínas de fusión, receptores solubles recombinantes, y cualquier otro agente diseñado para activar las células.

En algunas realizaciones, las condiciones o agentes estimulantes incluyen uno o más agentes, por ejemplo, ligando, que es capaz de activar un dominio de señalización intracelular de un complejo TCR. En algunos aspectos, el agente activa o inicia la cascada de señalización intracelular TCR/CD3 en una célula T. Dichos agentes pueden incluir anticuerpos, como los específicos para un componente del TCR y/o receptor coestimulador, por ejemplo, anti-CD3, anti-CD28, por ejemplo, unidos a un soporte sólido como una perla, y/o una o más citocinas. Opcionalmente, el método de expansión puede comprender además la etapa de añadir anticuerpos anti-CD3 y/o anti CD28 al medio de cultivo (por ejemplo, a una concentración de al menos aproximadamente 0,5 ng/ml). En algunas realizaciones, los agentes estimulantes incluyen IL-2 y/o IL-15, por ejemplo, una concentración de IL-2 de al menos unas 10 unidades/ml.

En algunos aspectos, la incubación se lleva a cabo de acuerdo con técnicas como las descritas en la Patente estadounidense N.° 6.040.177 a Riddell et al. Klebanoff et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 651-660, Terakura et al. (2012) Blood. 1:72-82, y/o Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9):689-701.

En algunas realizaciones, las células T se expanden añadiendo a la composición iniciadora del cultivo células alimentadoras, como células mononucleares de sangre periférica no divididas (PBMC), (por ejemplo, de forma que la población resultante de células contenga al menos unas 5, 10, 20 o 40 o más células alimentadoras PBMC por cada linfocito T de la población inicial que se va a expandir); e incubando el cultivo (por ejemplo, durante un tiempo suficiente para expandir el número de células T). En algunos aspectos, las células alimentadoras que no se dividen pueden comprender células alimentadoras PBMC irradiadas con rayos gamma. En algunas realizaciones, las PBMC se irradian con rayos gamma en el rango de aproximadamente 3000 a 3600 rads para prevenir la división celular. En algunas realizaciones, las células alimentadoras PBMC se inactivan con Mytomicin C. En algunos aspectos, las células alimentadoras se añaden al medio de cultivo antes de la adición de las poblaciones de células T.

En algunas realizaciones, las condiciones de estimulación incluyen una temperatura adecuada para el crecimiento de linfocitos T humanos, por ejemplo, al menos unos 25 grados Celsius, generalmente al menos unos 30 grados, y generalmente a o alrededor de 37 grados Celsius. Opcionalmente, la incubación puede comprender además la adición de células linfoblastoides (LCL) no divididas transformadas por el VEB como células alimentadoras. El LCL puede irradiarse con rayos gamma en el rango de unos 6000 a 10.000 rads. Las células alimentadoras LCL en algunos aspectos se proporcionan en cualquier cantidad adecuada, como una proporción de células alimentadoras LCL a linfocitos T iniciales de al menos aproximadamente 10:1.

En algunas realizaciones, las células T específicas de antígeno, como las células T CD4+ y/o CD8+ específicas de antígeno, se obtienen estimulando linfocitos T ingenuos o específicos de antígeno con antígeno. Por ejemplo, se pueden generar líneas o clones de células T específicas para antígenos del citomegalovirus aislando células T de sujetos infectados y estimulando las células in vitro con el mismo antígeno.

En algunas realizaciones, las células T neoantígeno-específicas se identifican y/o aíslan tras la estimulación con un ensayo funcional (por ejemplo, ELISpot). En algunas realizaciones, las células T neoantígenoespecíficas se aíslan clasificando las células polifuncionales mediante tinción intracelular de citoquinas. En algunas realizaciones, las células T neoantígeno-específicas se identifican y/o aíslan utilizando marcadores de activación (por ejemplo, CD137, CD38, CD38/HLA-DR doble positivo, y/o CD69). En algunas realizaciones, las células T CD8+, asesinas naturales, células T de memoria y/o células T CD4+ neoantígeno-específicas se identifican y/o aíslan utilizando multímeros de clase I o clase II y/o marcadores de activación. En algunas realizaciones, las células T CD8+ y/o CD4+ específicas de neoantígeno se identifican y/o aíslan utilizando marcadores de memoria (por ejemplo, CD45RA, CD45RO, CCR7, CD27 y/o CD62L). En algunas realizaciones, las células proliferantes se identifican y/o aíslan. En algunas realizaciones, las células T activadas se identifican y/o aíslan.

Tras la identificación de las células T neoantígeno-específicas de una muestra de paciente, se secuencian los TCR neoantígeno-específicos de las células T neoantígeno-específicas identificadas. Para secuenciar un TCR neoantígeno-específico, primero hay que identificar el TCR. Un método de identificación de un TCR neoantígenoespecífico de una célula T puede incluir el contacto de la célula T con un multímero HLA (por ejemplo, un tetrámero) que comprende al menos un neoantígeno; y la identificación del TCR mediante la unión entre el multímero HLA y el TCR. Otro método de identificación de un TCR neoantígeno-específico puede incluir la obtención de una o más células T que comprenden el TCR; la activación de la una o más células T con al menos un neoantígeno presentado en al menos una célula presentadora de antígeno (APC); y la identificación del TCR mediante la selección de una o más células activadas por interacción con al menos un neoantígeno.

Tras la identificación del TCR neoantígeno-específico, se puede secuenciar el TCR. En una realización, los métodos descritos anteriormente con respecto a la Sección XVI. pueden utilizarse para secuenciar TCR. En otra realización, el TCRa y el TCRb de un TCR pueden secuenciarse en bloque y luego emparejarse en función de la frecuencia. En otra realización, los TCR pueden secuenciarse y emparejarse utilizando el método de Howie et al., Science Translational Medicine 2015 (doi: 10.1126/scitranslmed.aac5624). En otra realización, los TCR pueden secuenciarse y emparejarse utilizando el método de Han et al., Nat Biotech 2014 (PMID 24952902, doi 10.1038/nbt.2938). En otra realización, las secuencias TCR emparejadas pueden obtenerse utilizando el método descrito por https://www.biorxiv.org/content/early/2017/05/05/134841 y https://patents.google.com/patent/US20160244825A1A158, 159

En otra realización, se pueden producir poblaciones clonales de células T mediante dilución limitante y, a continuación, se pueden secuenciar los TCRa y TCRb de las poblaciones clonales de células T. En otra realización, las células T se pueden clasificar en una placa con pocillos de forma que haya una célula T por pocillo y, a continuación, se pueden secuenciar y emparejar los TCRa y TCRb de cada célula T de cada pocillo.

A continuación, una vez identificadas las células T específicas del antígeno a partir de una muestra de paciente y secuenciados los TCR de las células T neoantígeno-específicas identificadas, los TCR secuenciados se clonan en nuevas células T. Estas células T clonadas contienen receptores neoantígenos específicos, por ejemplo, contienen dominios extracelulares que incluyen TCR. También se proporcionan poblaciones de dichas células y composiciones que las contienen. En algunas realizaciones, las composiciones o poblaciones están enriquecidas para tales células, como en las que las células que expresan los TCRs constituyen al menos el 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o más del 99 por ciento del total de células en la composición o células de un cierto tipo como células T o células CD8+ o CD4+. En algunas realizaciones, una composición comprende al menos una célula que contiene un TCR divulgado en el presente documento. Entre las composiciones se encuentran las composiciones y formulaciones farmacéuticas para la administración, como por ejemplo para la terapia celular adoptiva. También se proporcionan métodos terapéuticos para administrar las células y composiciones a sujetos, por ejemplo, pacientes.

Por lo tanto, también se proporcionan células modificadas genéticamente que expresan TCR. Las células son generalmente células eucariotas, como las de mamíferos, y típicamente son células humanas. En algunas realizaciones, las células se derivan de la sangre, médula ósea, linfa u órganos linfoides, son células del sistema inmunitario, como células de la inmunidad innata o adaptativa, por ejemplo, células mieloides o linfoides, incluyendo linfocitos, típicamente células T y/o células NK. Otras células ilustrativas son las células madre, como las células madre multipotentes y pluripotentes, incluidas las células madre pluripotentes inducidas (iPSC). Las células suelen ser células primarias, como las aisladas directamente de un sujeto y/o aisladas de un sujeto y congeladas. En algunas realizaciones, las células incluyen uno o más subconjuntos de células T u otros tipos celulares, como poblaciones de células T completas, células CD4+, células CD8+ y subpoblaciones de las mismas, como las definidas por función, estado de activación, madurez, potencial de diferenciación, expansión, recirculación, localización y/o capacidades de persistencia, especificidad antigénica, tipo de receptor antigénico, presencia en un órgano o compartimento particular, perfil de secreción de marcadores o citocinas y/o grado de diferenciación. Con referencia al sujeto a tratar, las células pueden ser alogénicas y/o autólogas. Entre los métodos se encuentran los disponibles en el mercado. En algunos aspectos, como en el caso de las tecnologías disponibles en el mercado, las células son pluripotentes y/o multipotentes, como las células madre, por ejemplo las células madre pluripotentes inducidas (iPSC). En algunas realizaciones, los métodos incluyen aislar células del sujeto, prepararlas, procesarlas, cultivarlas y/o diseñarlas, como se describe en el presente documento, y reintroducirlas en el mismo paciente, antes o después de la crioconservación. Entre los subtipos y subpoblaciones de linfocitos T y/o de linfocitos T CD4+ y/o CD8+ se encuentran los linfocitos T ingenuos (TN), los linfocitos T efectores (TEFF), los linfocitos T de memoria y sus subtipos, como los linfocitos T de memoria de células madre (TSCM), los linfocitos T de memoria central (TCM), los linfocitos T de memoria efectores (TEM) o los linfocitos T de memoria efectores diferenciados terminalmente, los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL), linfocitos T inmaduros, linfocitos T maduros, linfocitos T auxiliares, linfocitos T citotóxicos, linfocitos T invariantes asociados a mucosas (MALT), linfocitos T reguladores (Treg) naturales y adaptativos, linfocitos T auxiliares, como linfocitos TH1, linfocitos TH2, linfocitos TH3, linfocitos TH17, linfocitos TH9, linfocitos TH22, linfocitos T auxiliares foliculares, linfocitos T alfa/beta y linfocitos T delta/gamma.

En algunas realizaciones, las células son células asesinas naturales (NK). En algunas realizaciones, las células son monocitos o granulocitos, por ejemplo, células mieloides, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas, mastocitos, eosinófilos y/o basófilos.

Las células pueden modificarse genéticamente para reducir la expresión o eliminar los TCR endógenos. Tales modificaciones se describen en Mol Ther Nucleic Acids. diciembre 2012; 1(12): e63; Blood. 11 de agosto de 2011;118(6):1495-503; Blood. 14 de junio de 2012; 119(24); 5697- 5705; Torikai, Hiroki et al "HLA and TCR Knockout by Zinc Finger Nucleases: Toward "off-the-Shelf" Allogeneic T-Cell Therapy for CD19+ Malignancies.." Blood 116.21 (2010): 3766; Blood. 18 de enero de 2018;131(3):311 -322. doi: 10.1182/blood-2017-05-787598; y WO2016069283, que se incorporan mediante referencia en su totalidad.

Las células pueden modificarse genéticamente para promover la secreción de citocinas. Dichas modificaciones se describen en Hsu C, Hughes MS, Zheng Z, Bray RB, Rosenberg SA, Morgan RA. Los linfocitos T humanos primarios modificados genéticamente con un gen IL-15 optimizado en codones resisten la apoptosis inducida por la retirada de citocinas y persisten a largo plazo en ausencia de citocinas exógenas. J Immunol.

2005;175:7226-34; Quintarelli C, Vera JF, Savoldo B, Giordano Attianese GM, Pule M, Foster AE, Coexpression of cytokine and suicide genes to enhance the activity and safety of tumor-specific cytotoxic T lymphocytes. Blood. 2007;110:2793-802; y Hsu C, Jones SA, Cohen CJ, Zheng Z, Kerstann K, Zhou J, Cytokine-independent growth and clonal expansion of a primary human CD8+ T-cell clone following retroviral transduction with the IL-15 gene. Blood. 2007; 109:5168- 77.

Se ha demostrado que la falta de coincidencia entre los receptores de quimiocinas de las células T y las quimiocinas segregadas por el tumor explica el tráfico subóptimo de células T en el microentorno tumoral. Para mejorar la eficacia de la terapia, las células pueden modificarse genéticamente para aumentar el reconocimiento de las quimiocinas en el microentorno tumoral. Ejemplos de tales modificaciones se describen en Moon, EKCarpenito, CSun, JWang, LCKapoor, VPredina, J Expression of a functional CCR2 receptor enhances tumor localization and tumor eradication by retargeted human T-cells expressing a mesothelinspecific chimeric antibody receptor.Clin Cancer Res. 2011; 17: 4719-4730; and.Craddock, JALu, ABear, APule, MBrenner, MKRooney, CM et al. Enhanced tumor trafficking of GD2 chimeric antigen receptor T-cells by expression of the chemokine receptor CCR2b.J Immunother. 2010; 33: 780-788.

Las células pueden modificarse genéticamente para potenciar la expresión de receptores costimuladores/ potenciadores, como CD28 y 41BB.

Los efectos adversos de la terapia con células T pueden incluir el síndrome de liberación de citoquinas y la depleción prolongada de células B. La introducción de un interruptor de suicidio/seguridad en las células receptoras puede mejorar el perfil de seguridad de una terapia celular. En consecuencia, las células pueden modificarse genéticamente para incluir un interruptor de suicidio/seguridad. El interruptor de suicidio/seguridad puede ser un gen que confiere sensibilidad a un agente, por ejemplo, un fármaco, a la célula en la que se expresa el gen, y que hace que la célula muera cuando la célula entra en contacto con el agente o se expone a él. En Protein Cell se describen interruptores suicidas/de seguridad ilustrativos. ago 2017; 8(8): 573-589. El interruptor de suicidio/seguridad puede ser HSV-TK. El interruptor de suicidio/seguridad puede ser una citosina daminasa, una purina nucleósido fosforilasa o una nitrorreductasa. El interruptor de suicidio/seguridad puede ser RapaCIDe™, descrito en la solicitud de patente estadounidense Pub. N.° US20170166877A1. El sistema de suicidio/interruptor de seguridad puede ser CD20/Rituximab, descrito en Haematologica. Septiembre de 2009;94(9): 1316-1320. Estas referencias se incorporan mediante referencia en su totalidad.

El TCR puede introducirse en la célula receptora como un receptor dividido que se ensambla sólo en presencia de una pequeña molécula heterodimerizante. Estos sistemas se describen en Science. 2015 Oct 16; 350(6258): aab4077, y en la Patente estadounidense N.° 9,587,020, que se incorporan a la presente mediante referencia.

En algunas realizaciones, las células incluyen uno o más ácidos nucleicos, por ejemplo, un polinucleótido que codifica un TCR divulgado en el presente documento, en donde el polinucleótido se introduce mediante ingeniería genética, y de ese modo expresan TCR recombinantes o genéticamente modificados como se divulga en el presente documento. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos son heterólogos, es decir, normalmente no están presentes en una célula o muestra obtenida de la célula, como una obtenida de otro organismo o célula, que por ejemplo, no se encuentra normalmente en la célula que se está modificando y/o en un organismo del que deriva dicha célula. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos no son de origen natural, como un ácido nucleico que no se encuentra en la naturaleza, incluyendo uno que comprende combinaciones quiméricas de ácidos nucleicos que codifican varios dominios de múltiples tipos de células diferentes.

Los ácidos nucleicos pueden incluir una secuencia de nucleótidos de codón optimizado. Sin estar vinculados a una teoría o mecanismo concreto, se cree que la optimización de codones de la secuencia de nucleótidos aumenta la eficiencia de traducción de los transcritos de ARNm. La optimización de codones de la secuencia de nucleótidos puede implicar la sustitución de un codón nativo por otro codón que codifique el mismo aminoácido, pero que pueda ser traducido por el ARNt que está más fácilmente disponible dentro de una célula, aumentando así la eficiencia de la traducción. La optimización de la secuencia de nucleótidos también puede reducir las estructuras secundarias del ARNm que interferirían con la traducción, aumentando así la eficiencia de la traducción.

Puede utilizarse un constructo o vector para introducir el TCR en la célula receptora. En el presente documento se describen construcciones ilustrativas. Los polinucleótidos que codifican las cadenas alfa y beta del TCR pueden estar en una única construcción o en construcciones separadas. Los polinucleótidos que codifican las cadenas alfa y beta pueden estar operablemente unidos a un promotor, por ejemplo, un promotor heterólogo. El promotor heterólogo puede ser un promotor fuerte, por ejemplo, EF1alfa, CMV, PGK1, Ubc, beta actina, promotor CAG, y similares. El promotor heterólogo puede ser un promotor débil. El promotor heterólogo puede ser un promotor inducible. Los promotores inducibles ilustrativos incluyen, entre otros, TRE, NFAT, GAL4, LAC y similares Otros sistemas ilustrativos de expresión inducible se describen en la patente estadounidense N.° 5,514,578; 6,245,531; 7,091,038 y la patente europea N.° 0517805, que se incorporan mediante referencia en su totalidad.

La construcción para introducir el TCR en la célula receptora también puede comprender un polinucleótido que codifica un péptido señal (elemento péptido señal). El péptido señal puede promover el tráfico de superficie del TCR introducido. Los péptidos señal ilustrativos incluyen, entre otros, el péptido señal CD8, péptidos señal de inmunoglobulina, donde ejemplos específicos incluyen GM-CSF e IgG kappa. Estos péptidos señal se describen en Trends Biochem Sci. octubre 2006;31(10):563-71. Epub 21 de agosto de 2006 ; y An, et al. “Construction of a New Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor and the Anti-Leukemia Function Study of the Transduced T-cells.” Oncotarget 7.9 (2016): 10638-10649. PMC. Web. 16 de agosto 2018; que se incorporan al presente documento por referencia.

En algunos casos, por ejemplo, casos en los que las cadenas alfa y beta se expresan a partir de una única construcción o marco de lectura abierto, o casos en los que se incluye un gen marcador en la construcción, la construcción puede comprender una secuencia de omisión ribosomal. La secuencia de omisión ribosómica puede ser un péptido 2A, por ejemplo, un péptido P2A o T2A. Los péptidos P2A y T2A ilustrativos se describen en Scientific Reports volumen 7, número de artículo: 2193 (2017), que se incorpora en la presente mediante referencia en su totalidad. En algunos casos, se introduce un sitio de escisión FURIN/PACE aguas arriba del elemento 2A. Los sitios de escisión FURIN/PACE se describen, por ejemplo, en http://www.nuolan.net/substrates.html. El péptido de escisión también puede ser un sitio de escisión del factor Xa. En los casos en los que las cadenas alfa y beta se expresan a partir de un único constructo o marco de lectura abierto, el constructo puede incluir un sitio interno de entrada del ribosoma (IRES).

La construcción puede comprender además uno o más genes marcadores. Los genes marcadores illustrativos incluyen, entre otros, GFP, luciferasa, HA, lacZ. El marcador puede ser un marcador seleccionable, como un marcador de resistencia a antibióticos, un marcador de resistencia a metales pesados o un marcador de resistencia a biocidas, como es conocido por los expertos en la materia. El marcador puede ser un marcador de complementación para su uso en un hospedador auxotrófico. En Gene se describen marcadores de complementación y hospedadores auxotróficos ilustrativos. 24 de enero de 2001;263(1- 2. 159-69) Dichos marcadores pueden expresarse a través de un IRES, una secuencia de cambio de marco, un enlazador peptídico 2A, una fusión con el TCR o expresarse por separado a partir de un promotor independiente.

Los vectores o sistemas ilustrativos para la introducción de TCR en células receptoras incluyen, entre otros, virus adenoasociados, adenovirus, adenovirus vaccinia modificada, virus de Ankara (MVA), adenovirus retrovirus, adenovirus virus de Sendai, adenovirus virus Vaccinia, vacuna Replicon contra alfavirus (VEE), oligonucleótido antisentido, Bifidobacterium longum, CRISPR-Cas9, E. coli, Flavivirus, Pistola genética, Herpesvirus, Virus del herpes simple, Lactococcus lactis, Electroporación, Lentivirus, Lipofección, Listeria monocytogenes, Virus del sarampión, Virus Vaccinia Ankara modificado (MVA), Electroporación de ARNm, ADN desnudo/plasmídico, ADN desnudo/plasmídico adenovirus, ADN desnudo/plasmídico virus Vaccinia Ankara modificado (MVA), ADN desnudo/plasmídico transferencia de ARN, ADN desnudo/plasmídico virus Vaccinia, ADN desnudo/plasmídico virus de la estomatitis vesicular, virus de la enfermedad de Newcastle, No viral, PiggyBac™ (PB) Transposón, sistemas basados en nanopartículas, Poliovirus, Poxvirus, Poxvirus virus Vaccinia, Retrovirus, Transferencia de ARN, Transferencia de ARN ADN desnudo/plasmídico, Virus ARN, Saccharomyces cerevisiae, Salmonella typhimurium, Virus del bosque Semliki, virus Sendai, Shigella dysenteriae, virus Simian, siRNA, transposón de la Bella Durmiente, Streptococcus mutans, virus Vaccinia, replicón del virus de la encefalitis equina venezolana, virus de la estomatitis vesicular y Vibrio cholera.

En realizaciones preferidas, el TCR se introduce en la célula receptora a través de virus adenoasociados (AAV), adenovirus, CRISPR-CAS9, herpesvirus, lentivirus, lipofección, electroporación de ARNm, transposón PiggyBac™ (PB), retrovirus, transferencia de ARN o transposón Sleeping Beauty.

En algunas realizaciones, un vector para introducir un TCR en una célula receptora es un vector viral. Los vectores virales ilustrativos incluyen vectores adenovirales, vectores virales adenoasociados (AAV), vectores lentivirales, vectores virales herpes, vectores retrovirales y similares. Dichos vectores se describen en el presente documento.

En la FIG. 24 se muestran ejemplos de construcciones de TCR para introducir un TCR en células receptoras. En algunas realizaciones, una construcción de TCR incluye, desde la dirección 5'-3', las siguientes secuencias polinucleotídicas: una secuencia promotora, una secuencia de péptido señal, una secuencia de TCR p variable (TCRpv), una secuencia de TCR p constante (TCRpc), un péptido de escisión (por ejemplo, P2A), una secuencia de péptido señal, una secuencia de TCR a variable (TCRav) y una secuencia de TCR a constante (TCRac). En algunas realizaciones, las secuencias TCRpc y TCRac de la construcción incluyen una o más regiones murinas, por ejemplo, secuencias constantes murinas^ completas o intercambios de aminoácidos humanos murinos como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, la construcción incluye además, a 3' de la secuencia TCRac, una secuencia peptídica de escisión (por ejemplo, T2A) seguida de un gen informador. En una realización, la construcción incluye, desde la dirección 5'-3', las siguientes secuencias polinucleotídicas: una secuencia promotora, una secuencia peptídica señal, una secuencia TCR p variable (TCRpv), una secuencia TCR p constante ((TCRpc) que contiene una o más regiones murinas, un péptido de escisión (por ejemplo, P2A), una secuencia peptídica señal, una secuencia TCR a variable (TCRav), y una secuencia TCR a constante (TCRac) que contiene una o más regiones murinas, un péptido de escisión (por ejemplo, T2A), y un gen informador.

La FIG. 25 muestra una secuencia ilustrativa de nucleótidos del esqueleto del constructo P526 para clonar TCRs en sistemas de expresión para el desarrollo de terapias.

La FIG. 26 muestra una secuencia de construcción ilustrativa para la clonación del TCR neoantígeno-específico del paciente, clonotipo 1 en sistemas de expresión para el desarrollo de terapias.

También se proporcionan ácidos nucleicos aislados que codifican TCR, vectores que comprenden los ácidos nucleicos y células huésped que comprenden los vectores y los ácidos nucleicos, así como técnicas recombinantes para la producción de los TCR.

Los ácidos nucleicos pueden ser recombinantes. Los ácidos nucleicos recombinantes pueden construirse fuera de las células vivas uniendo segmentos de ácido nucleico naturales o sintéticos a moléculas de ácido nucleico que puedan replicarse en una célula viva, o productos de replicación de las mismas. A efectos del presente documento, la replicación puede ser in vitro o in vivo.

Para la producción recombinante de un TCR, el ácido o ácidos nucleicos que lo codifican pueden aislarse e insertarse en un vector replicable para su posterior clonación (es decir, amplificación del ADN) o expresión. En algunos aspectos, el ácido nucleico puede producirse por recombinación homóloga, por ejemplo como se describe en la Patente estadounidenses N.° 5,204,244, incorporada en mediante referencia en su totalidad. En la técnica se conocen muchos vectores diferentes. Los componentes del vector generalmente incluyen uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor, y una secuencia de terminación de la transcripción, por ejemplo como se describe en la Patente estadounidense N.° 5,534,615, incorporada mediante referencia en su totalidad.

Los vectores o construcciones ilustrativos adecuados para expresar un TCR, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo incluyen, por ejemplo, la serie pUC (Fermentas Life Sciences), la serie pBluescript (Stratagene, LaJolla, CA), la serie pET (Novagen, Madison, WI), la serie pGEX (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) y la serie pEX (Clontech, Palo Alto, CA). Los vectores bacteriófagos, como AGTlO, AGTl 1, AZapII (Stratagene), AEMBL4 y ANMl 149, también son adecuados para expresar un TCR divulgado en el presente documento.

XIX. Diagrama de flu jo general de tratamiento

La FIG. 28 es un diagrama de flujo de un método para proporcionar un tratamiento neoantígeno-específico personalizado a un paciente, de acuerdo con una realización. En otras realizaciones, el método puede incluir etapas diferentes y/o adicionales a los mostrados en la FIG. 28. Además, las etapas del método se pueden realizar en diferentes órdenes que el orden descrito en conjunción con la FIG. 28 en varias realizaciones. Los modelos de presentación se entrenan 2801 utilizando datos de espectrometría de masas como se ha descrito anteriormente. Se obtiene una muestra del paciente 2802. En algunas realizaciones, la muestra del paciente comprende una biopsia tumoral y/o la sangre periférica del paciente. La muestra del paciente obtenida en la etapa 2802 se secuencia para identificar los datos que se introducirán en los modelos de presentación para predecir las probabilidades de que se presenten los péptidos de antígeno tumoral de la muestra del paciente. Las probabilidades de presentación de los péptidos de antígenos tumorales de la muestra del paciente obtenida en la etapa 2802 se predicen 2803 utilizando los modelos de presentación entrenados. Los neoantígenos de tratamiento se identifican 2804 para el paciente basándose en las probabilidades de presentación previstas. A continuación, se obtiene otra muestra del paciente 2805. La muestra del paciente puede comprender sangre periférica del paciente, linfocitos infiltrantes de tumores (TIL), linfa, células de ganglios linfáticos y/o cualquier otra fuente de células T. La muestra del paciente obtenida en la etapa 2805 se analiza 2806 in vivo en busca de células T neoantígeno-específicas.

En este punto del proceso de tratamiento, el paciente puede recibir terapia con células T y/o un tratamiento con vacunas. Para recibir un tratamiento vacunal, se identifican los neoantígenos para los que las células T del paciente son específicas 2814. A continuación, se crea una vacuna que incluye los neoantígenos identificados 2815. Finalmente, se administra la vacuna 2816 al paciente.

Para recibir la terapia de células T, las células T neoantígeno-específicas se someten a expansión y/o se modifican genéticamente nuevas células T neoantígeno-específicas. Para expandir las células T neoantígenoespecíficas para su uso en terapia celular T, las células simplemente se expanden 2807 y se infunden 2808 en el paciente.

Para diseñar genéticamente nuevas células T específicas del neoantígeno para terapia celular, se secuencian los TCR de las células T específicas del neoantígeno identificadas in vivo 2809. A continuación, estas secuencias de TCR se clonan 2810 en un vector de expresión. A continuación, el vector de expresión 2810 se transfecta 2811 en nuevas células T. Las células T transfectadas se expanden 2812. Y finalmente, las células T expandidas se infunden 2813 en el paciente.

Un paciente puede recibir tanto terapia con células T como terapia con vacunas. En una realización, el paciente recibe primero una terapia con vacunas y después recibe una terapia con células T. Una ventaja de este enfoque es que la terapia vacunal puede aumentar el número de células T específicas del tumor y el número de neoantígenos reconocidos por niveles detectables de células T.

En otra realización, un paciente puede recibir una terapia de células T seguida de una terapia de vacuna, en la que el conjunto de epítopos incluidos en la vacuna comprende uno o más de los epítopos a los que se dirige la terapia de células T. Una ventaja de este enfoque es que la administración de la vacuna puede promover la expansión y persistencia de las células T terapéuticas.

XX. Ordenador de ejemplo

La FIG. 29 ilustra un ejemplo de ordenador 2900 para implementar las entidades mostradas en las FIGS. 1 y 3. El ordenador 2900 incluye al menos un procesador 2902 acoplado a un chipset 2904. El chipset 2904 incluye un concentrador de controlador de memoria 2920 y un concentrador de controlador de entrada/salida (E/S) 2922. Una memoria 2906 y un adaptador de gráficos 2912 están acoplados al concentrador controlador de memoria 2920, y una pantalla 2918 está acoplada al adaptador de gráficos 2912. Un dispositivo de almacenamiento 2908, un dispositivo de entrada 2914 y un adaptador de red 2916 están acoplados al concentrador controlador de E/S 2922. Otras realizaciones del ordenador 2900 tienen arquitecturas diferentes.

El dispositivo de almacenamiento 2908 es un medio de almacenamiento no transitorio legible por ordenador, como un disco duro, una memoria de sólo lectura en disco compacto (CD-ROM), un DVD o un dispositivo de memoria de estado sólido. La memoria 2906 contiene instrucciones y datos utilizados por el procesador 2902. La interfaz de entrada 2914 es una interfaz de pantalla táctil, un ratón, un trackball u otro tipo de dispositivo señalador, un teclado o alguna combinación de los mismos, y se utiliza para introducir datos en el ordenador 2900. En algunas realizaciones, el ordenador 2900 puede estar configurado para recibir entradas (por ejemplo, comandos) de la interfaz de entrada 2914 a través de gestos del usuario. El adaptador gráfico 2912 muestra imágenes y otra información en la pantalla 2918. El adaptador de red 2916 acopla el ordenador 2900 a una o más redes informáticas.

El ordenador 2900 está adaptado para ejecutar módulos de programa informático para proporcionar la funcionalidad descrita en el presente documento. Tal y como se utiliza aquí, el término "módulo" se refiere a la lógica del programa informático utilizado para proporcionar la funcionalidad especificada. Así, un módulo puede implementarse en hardware, firmware y/o software. En una realización, los módulos de programa se almacenan en el dispositivo de almacenamiento 2908, se cargan en la memoria 2906, y son ejecutados por el procesador 2902.

Los tipos de ordenadores 2900 utilizados por las entidades de la FIG. 1 pueden variar dependiendo de la realización y de la potencia de procesamiento requerida por la entidad. Por ejemplo, el sistema de identificación de presentaciones 160 puede ejecutarse en un único ordenador 2900 o en múltiples ordenadores 2900 que se comuniquen entre sí a través de una red, como en una granja de servidores. Los ordenadores 2900 pueden carecer de algunos de los componentes descritos anteriormente, como los adaptadores gráficos 2912 y las pantallas 2918.

Referencias

1. Desrichard, A., Snyder, A. & Chan, T. A. Cáncer Neoantigens and Applications for Immunotherapy. Clin. Cáncer Res. Off J. Am. Chem. Cancer Res. (2015). doi:10.1158/1078-0432.CCR-14-3175

2. Schumacher, T. N. & Schreiber, R. D. Neoantigens in cancer immunotherapy. Science 348, 69- 74 (2015)).

3. Gubin, M. M., Artyomov, M. N., Mardis, E. R. & Schreiber, R. D. Tumor neoantigens: building a framework for personalized cancer immunotherapy. J. Clin. Invest. 125, 3413-3421 (2015).

4. Rizvi, N. A. et al. Cancer immunology. Mutational landscape determines sensitivity to PD-1 blockade in non-small cell lung cancer. Science 348, 124-128 (2015).

5. Snyder, A. et al. Genetic basis for clinical response to CTLA-4 blockade in melanoma. N. Engl. J. Med.

371, 2189-2199 (2014).

6. Carreno, B. M. et al. Cancer immunotherapy. A dendritic cell vaccine increases the breadth and diversity of melanoma neoantigen-specific T-cells. Science 348, 803-808 (2015).

7. Tran, E. et al. Cancer immunotherapy based on mutation-specific CD4+ T-cells in a patient with epithelial cancer. Science 344, 641-645 (2014).

8. Hacohen, N. & Wu, C. J.-Y. Solicitud de patente estadounidense: 0110293637 - COMPOSITIONS AND METHODS OF IDENTIFYING TUMOR SPECIFIC NEOANTIGENS. (A1). at <http://appft1.uspto.gov/netacgi/nph-Parser?Sect1=PTO1&Sect2=HITOFF&d=PG01&p=1&u=/netahtml/PTO/srchnum.html&r=1&f=G&l=50&s1=20 110293637.PGNR.>

9. Lundegaard, C., Hoof, I., Lund, O. & Nielsen, M. State of the art and challenges in sequence based T-cell epitope prediction. Immunome Res. 6 Suppl 2, S3 (2010).

10. Yadav, M. et al. Predicting immunogenic tumour mutations by combining mass spectrometry and exome sequencing. Nature 515, 572-576 (2014).

11. Bassani-Sternberg, M., Pletscher-Frankild, S., Jensen, L. J. & Mann, M. Mass spectrometry of human leukocyte antigen class I peptidomes reveals strong effects of protein abundance and turnover on antigen presentation. Mol. Cell. Proteomics MCP 14, 658-673 (2015).

12. Van Allen, E. M. et al. Genomic correlates of response to CTLA-4 blockade in metastatic melanoma. Science 350, 207-211 (2015).

13. Yoshida, K. & Ogawa, S. Splicing factor mutations and cancer. Wiley Interdiscip. Rev. RNA 5, 445-459 (2014).

14. Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive molecular profiling of lung adenocarcinoma. Nature 511, 543-550 (2014).

15. Rajasagi, M. et al. Systematic identification of personal tumor-specific neoantigens in chronic lymphocytic leukemia. Blood 124, 453-462 (2014).

16. Downing, S. R. et al. United States Patent Application: 0120208706 - OPTIMIZATION OF MULTIGENE ANALYSIS OF TUMOR SAMPLES. (A1). at <http://appft1.uspto.gov/netacgi/nph-Parser?Sect1=PTO1&Sect2=HITOFF&d=PG01&p=1&u=/netahtml/PTO/srchnum.html&r=1&f=G&l=50&s1=20 120208706.PGNR.>

17. Target Capture for NextGen Sequencing - IDT. at <http://www.idtdna.com/pages/products/nextgen/target-capture>

18. Shukla, S. A. et al. Comprehensive analysis of cancer-associated somatic mutations in class I HLA genes. Nat. Biotechnol. 33, 1152-1158 (2015).

19. Cieslik, M. et al. The use of exome capture RNA-seq for highly degraded RNA with application to clinical cancer sequencing. Genome Res. 25, 1372-1381 (2015).

20. Bodini, M. et al. The hidden genomic landscape of acute myeloid leukemia: subclonal structure revealed by undetected mutations. Blood 125, 600-605 (2015).

21. Saunders, C. T. et al. Strelka: accurate somatic small-variant calling from sequenced tumor-normal sample pairs. Bioinforma. Oxf. Engl. 28, 1811-1817 (2012).

22. Cibulskis, K. et al. Sensitive detection of somatic point mutations in impure and heterogeneous cancer samples. Nat. Biotechnol. 31, 213-219 (2013).

23. Wilkerson, M. D. et al. Integrated RNA and DNA sequencing improves mutation detection in low purity tumors. Nucleic Acids Res. 42, e107 (2014).

24. Mose, L. E., Wilkerson, M. D., Hayes, D. N., Perou, C. M. & Parker, J. S. ABRA: improved coding indel detection via assembly-based realignment. Bioinforma. Oxf. Engl. 30, 2813-2815 (2014).

25. Ye, K., Schulz, M. H., Long, Q., Apweiler, R. & Ning, Z. Pindel: a pattern growth approach to detect break points of large deletions and medium sized insertions from paired-end short reads. Bioinforma. Oxf. Engl. 25, 2865-2871 (2009).

26. Lam, H. Y. K. et al. Nucleotide-resolution analysis of structural variants using BreakSeq and a breakpoint library. Nat. Biotechnol. 28, 47-55 (2010).

27. Frampton, G. M. et al. Development and validation of a clinical cancer genomic profiling test based on massively parallel DNA sequencing. Nat. Biotechnol. 31, 1023-1031 (2013).

28. Boegel, S. et al. HLA typing from RNA-Seq sequence reads. Genome Med. 4, 102 (2012).

29. Liu, C. et al. ATHLATES: accurate typing of human leukocyte antigen through exome sequencing. Nucleic Acids Res. 41, e142 (2013).

30. Mayor, N. P. et al. HLA Typing for the Next Generation. PloS One 10, e0127153 (2015).

31. Roy, C. K., Olson, S., Graveley, B. R., Zamore, P. D. & Moore, M. J. Assessing long-distance RNA sequence connectivity via RNA-templated DNA-DNA ligation. eLife 4, (2015).

32. Song, L. & Florea, L. CLASS: constrained transcript assembly of RNA-seq reads. BMC Bioinformatics 14 Suppl 5, S14 (2013).

33. Maretty, L., Sibbesen, J. A. & Krogh, A. Bayesian transcriptome assembly. Genome Biol. 15, 501 (2014).

34. Pertea, M. et al. StringTie enables improved reconstruction of a transcriptome from RNA-seq reads. Nat. Biotechnol. 33, 290-295 (2015).

35. Roberts, A., Pimentel, H., Trapnell, C. & Pachter, L. Identification of novel transcripts in annotated genomes using RNA-Seq. Bioinforma. Oxf. Engl. (2011). doi:10.1093/bioinformatics/btr355

36. Vitting-Seerup, K., Porse, B. T., Sandelin, A. & Waage, J. spliceR: an R package for classification of alternative splicing and prediction of coding potential from RNA-seq data. BMC Bioinformatics 15, 81 (2014).

37. Rivas, M. A. et al. Human genomics. Effect of predicted protein-truncating genetic variants on the human transcriptome. Science 348, 666-669 (2015).

38. Skelly, D. A., Johansson, M., Madeoy, J., Wakefield, J. & Akey, J. M. A powerful and flexible statistical framework for testing hypotheses of allele-specific gene expression from RNA-seq data. Genome Res. 21, 1728-1737 (2011).

39. Anders, S., Pyl, P. T. & Huber, W. HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinforma. Oxf. Engl. 31, 166-169 (2015).

40. Furney, S. J. et al. SF3B1 mutations are associated with alternative splicing in uveal melanoma. Cancer Discov. (2013). doi:10.1158/2159-8290.CD-13-0330

41. Tran, E. et al. A chemical genetics approach for the functional assessment of novel cancer genes. Cancer Res. (2015). doi:10.1158/0008-5472.CAN-14-2930

42. Maguire, S. L. et al. SF3B1 mutations constitute a novel therapeutic target in breast cancer. J. Pathol.

235, 571-580 (2015).

43. Carithers, L. J. et al. A Novel Approach to High-Quality Postmortem Tissue Procurement: The GTEx Project. Biopreservation Biobanking 13, 311-319 (2015).

44. Xu, G. et al. RNA CoMPASS: a dual approach for pathogen and host transcriptome analysis of RNA-seq datasets. PloS One 9, e89445 (2014).

45. Andreatta, M. & Nielsen, M. Gapped sequence alignment using artificial neural networks: application to the MHC class I system. Bioinforma. Oxf. Engl. (2015). doi:10.1093/bioinformatics/btv639

46. J0 rgensen, K. W., Rasmussen, M., Buus, S. & Nielsen, M. NetMHCstab - predicting stability of peptide-MHC-I complexes; impacts for cytotoxic T lymphocyte epitope discovery. Immunology 141, 18-26 (2014). 47. Larsen, M. V. et al. An integrative approach to CTL epitope prediction: a combined algorithm integrating MHC class I binding, TAP transport efficiency, and proteasomal cleavage predictions. Eur. J. Immunol. 35, 2295-2303 (2005).

48. cytotoxic T-cell epitopes: insights obtained from improved predictions of proteasomal cleavage. Immunogenetics 57, 33-41 (2005).

49. Boisvert, F.-M. et al. A Quantitative Spatial Proteomics Analysis of Proteome Turnover in Human Cells. Mol. Cell. Proteomics 11, M111.011429-M111.011429 (2012).

50. Duan, F. et al. Genomic and bioinformatic profiling of mutational neoepitopes reveals new rules to predict anticancer immunogenicity. J. Exp. Med. 211,2231-2248 (2014).

51. Janeway's Immunobiology: 9780815345312: Medicine & Health Science Books @ Amazon.com. at <http://www.amazon.com/Janeways-Immunobiology-Kenneth-Murphy/dp/0815345313>

52. Calis, J. J. A. et al. Properties of MHC Class I Presented Peptides That Enhance Immunogenicity. PLoS Comput. Biol. 9, e1003266 (2013).

53. Tran, E. et al. Intratumor heterogeneity in localized lung adenocarcinomas delineated by multiregion sequencing. Science 346, 256-259 (2014)

54. Walter, M. J. et al. Clonal architecture of secondary acute myeloid leukemia. N. Engl. J. Med. 366, 1090 1098 (2012).

55. Hunt DF, Henderson RA, Shabanowitz J, Sakaguchi K, Michel H, Sevilir N, Cox AL, Appella E, Engelhard VH. Characterization of peptides bound to the class I MHC molecule HLA-A2.1 by mass spectrometry. Science 1992. 255: 1261-1263.

56. Zarling AL, Polefrone JM, Evans AM, Mikesh LM, Shabanowitz J, Lewis ST, Engelhard VH, Hunt DF. Identification of class I MHC-associated phosphopeptides as targets for cancer immunotherapy. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Oct 3;103(40):14889-94.

57. Bassani-Sternberg M, Pletscher-Frankild S, Jensen LJ, Mann M. Mass spectrometry of human leukocyte antigen class I peptidomes reveals strong effects of protein abundance and turnover on antigen presentation. Mol Cell Proteomics. Marzo de 2015;14(3):658-73. doi: 10.1074/mcp.M114.042812.

58. Abelin JG, Trantham PD, Penny SA, Patterson AM, Ward ST, Hildebrand WH, Cobbold M, Bai DL, Shabanowitz J, Hunt DF. Complementary IMAC enrichment methods for HLA-associated phosphopeptide identification by mass spectrometry. Nat Protoc. 2015 Sep;10(9):1308-18. doi: 10.1038/nprot.2015.086. Epub 2015Aug 6

59. Barnstable CJ, Bodmer WF, Brown G, Galfre G, Milstein C, Williams AF, Ziegler A. Production of monoclonal antibodies to group A erythrocytes, HLA and other human cell surface antigens-new tools for genetic analysis. Cell. 1978 May;14(1):9-20.

60. Goldman JM, Hibbin J, Kearney L, Orchard K, Th'ng KH. HLA-DR monoclonal antibodies inhibit the proliferation of normal and chronic granulocytic leukaemia myeloid progenitor cells. Br J Haematol. 1982 Nov;52(3):411-20.

61. Eng JK, Jahan TA, Hoopmann MR. Comet: an open-source MS/MS sequence database search tool. Proteomics. enero de 2013;13(1):22-4. doi: 10.1002/pmic.201200439. Epub 2012 Dec 4.

62. Eng JK, Hoopmann MR, Jahan TA, Egertson JD, Noble WS, MacCoss MJ. A deeper look into Comet--implementation and features. J Am Soc Mass Spectrom. Noviembre 2015;26(11):1865-74. doi: 10.1007/s13361-015-1179-x. Epub 2015 jun 27.

63. Lukas Kall, Jesse Canterbury, Jason Weston, William Stafford Noble and Michael J. MacCoss. Semisupervised learning for peptide identification from shotgun proteomics datasets. Nature Methods 4:923 - 925, November 2007

64. Lukas Kall, John D. Storey, Michael J. MacCoss and William Stafford Noble. Assigning confidence measures to peptides identified by tandem mass spectrometry. Journal of Proteome Research, 7(1):29-34, January 2008

65. Lukas Kall, John D. Storey and William Stafford Noble. Nonparametric estimation of posterior error probabilities associated with peptides identified by tandem mass spectrometry. Bioinformatics, 24(16):i42-i48, August 2008

66. Bo Li and C. olin N. Dewey. RSEM: cuantificación precisa de transcritos a partir de datos de RNA-Seq con o sin genoma de referencia. BMC Bioinformatics, 12:323, August 2011

67. Hillary Pearson, Tariq Daouda, Diana Paola Granados, Chantal Durette, Eric Bonneil, Mathieu Courcelles, Anja Rodenbrock, Jean-Philippe Laverdure, Caroline Coté, Sylvie Mader, Sébastien Lemieux, Pierre Thibault, and Claude Perreault. MHC class I-associated peptides derive from selective regions of the human genome. The Journal of Clinical Investigation, 2016,

68. Juliane Liepe, Fabio Marino, John Sidney, Anita Jeko, Daniel E. Bunting, Alessandro Sette, Peter M. Kloetzel, Michael P. H. Stumpf, Albert J. R. Heck, Michele Mishto. A large fraction of HLA class I ligands are proteasome-generated spliced peptides. Science, 21, October 2016.

69. Mommen GP., Marino, F., Meiring HD., Poelen, MC., van Gaans-van den Brink, JA., Mohammed S., Heck AJ., and van Els CA. Sampling From the Proteome to the Human Leukocyte Antigen-DR (HLA-DR) Ligandome Proceeds Via High Specificity. Mol Cell Proteomics 15(4): 1412-1423, April 2016.

70. Sebastian Kreiter, Mathias Vormehr, Niels van de Roemer, Mustafa Diken, Martin Lower, Jan Diekmann, Sebastian Boegel, Barbara Schrors, Fulvia Vascotto, John C. Castle, Arbel D. Tadmor, Stephen P. Schoenberger, Christoph Huber, Ozlem Türeci, and Ugur Sahin. Mutant MHC class II epitopes drive therapeutic immune responses to caner. Nature 520, 692-696, April 2015.

71. Tran E., Turcotte S., Gros A., Robbins P.F., Lu Y.C., Dudley M.E., Wunderlich J.R., Somerville R.P., Hogan K., Hinrichs C.S., Parkhurst M.R., Yang J.C., Rosenberg S.A. Cancer immunotherapy based on mutation-specific CD4+ T-cells in a patient with epithelial cancer. Science 344(6184) 641-645, May 2014. 72. Andreatta M., Karosiene E., Rasmussen M., Stryhn A., Buus S., Nielsen M. Accurate pan-specific prediction of peptide-MHC class II binding affinity with improved binding core identification. Immunogenetics 67(11-12) 641-650, November 2015.

73. Nielsen, M., Lund, O. NN-align. An artificial neural network-based alignment algorithm for MHC class II peptide binding prediction. BMC Bioinformatics 10:296, September 2009.

74. Nielsen, M., Lundegaard, C., Lund, O. Prediction of MHC class II binding affinity using SMM-align, a novel stabilization matrix alignment method. BMC Bioinformatics 8:238, July 2007.

75. Zhang, J., et al. PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification. Molecular & Cellular Proteomics. 11(4):1-8. 1/2/2012.

76. Snyder, A. et al. Genetic basis for clinical response to CTLA-4 blockade in melanoma. N. Engl. J. Med.

371, 2189-2199 (2014).

77. Rizvi, N. A. et al. Cancer immunology. Mutational landscape determines sensitivity to PD-1 blockade in non-small cell lung cancer. Science 348, 124-128 (2015).

78. Gubin, M. M., Artyomov, M. N., Mardis, E. R. & Schreiber, R. D. Tumor neoantigens: building a framework for personalized cancer immunotherapy. J. Clin. Invest. 125, 3413-3421 (2015).

79. Schumacher, T. N. & Schreiber, R. D. Neoantigens in cancer immunotherapy. Science 348, 69-74 (2015).

80. Carreno, B. M. et al. Cáncer immunotherapy. A dendritic cell vaccine increases the breadth and diversity of melanoma neoantigen-specific T-cells. Science 348, 803-808 (2015).

81. Ott, P. A. et al. An immunogenic personal neoantigen vaccine for patients with melanoma. Nature 547, 217-221 (2017).

82. Sahin, U. et al. Personalized RNA mutanome vaccines mobilize poly-specific therapeutic immunity against cancer. Nature 547, 222-226 (2017).

83. Tran, E. et al. T-Cell Transfer Therapy Targeting Mutant KRAS in Cancer. N. Engl. J. Med. 375, 2255 2262 (2016).

84. Gros, A. et al. Prospective identification of neoantigen-specific lymphocytes in the peripheral blood of melanoma patients. Nat. Med. 22, 433-438 (2016).

85. The problem with neoantigen prediction. Nat. Biotechnol. 35, 97-97 (2017).

86. Vitiello, A. & Zanetti, M. Neoantigen prediction and the need for validation. Nat. Biotechnol. 35, 815-817 (2017).

87. Bassani-Sternberg, M., Pletscher-Frankild, S., Jensen, L. J. & Mann, M. Mass spectrometry of human leukocyte antigen class I peptidomes reveals strong effects of protein abundance and turnover on antigen presentation. Mol. Cell. Proteomics MCP 14, 658-673 (2015).

88. Vita, R. et al. The immune epitope database (IEDB) 3.0. Nucleic Acids Res. 43, D405-412 (2015). 89. Andreatta, M. & Nielsen, M. Gapped sequence alignment using artificial neural networks: application to the MHC class I system. Bioinforma. Oxf. Engl. 32, 511-517 (2016).

90. O'Donnell, T. J. et al. MHCflurry: Open-Source Class I MHC Binding Affinity Prediction. Cell Syst. (2018). doi:10.1016/j.cels.2018.05.014

91. Bassani-Sternberg, M. et al. Direct identification of clinically relevant neoepitopes presented on native human melanoma tissue by mass spectrometry. Nat. Commun. 7, 13404 (2016).

92. Abelin, J. G. et al. Mass Spectrometry Profiling of HLA-Associated Peptidomes in Mono-allelic Cells Enables More Accurate Epitope Prediction. Immunity 46, 315-326 (2017).

93. Yadav, M. et al. Predicting immunogenic tumour mutations by combining mass spectrometry and exome sequencing. Nature 515, 572-576 (2014).

94. Stranzl, T., Larsen, M. V., Lundegaard, C. & Nielsen, M. NetCTLpan: pan-specific MHC class I pathway epitope predictions. Immunogenetics 62, 357-368 (2010).

95. Bentzen, A. K. et al. Large-scale detection of antigen-specific T-cells using peptide-MHC-I multimers labeled with DNA barcodes. Nat. Biotechnol. 34, 1037-1045 (2016).

96. Tran, E. et al. Immunogenicity of somatic mutations in human gastrointestinal cancers. Science 350, 1387-1390 (2015).

97. Stronen, E. et al. Targeting of cancer neoantigens with donor-derived T-cell receptor repertoires. Science 352, 1337-1341 (2016).

98. Trolle, T. et al. The Length Distribution of Class I-Restricted T-cell Epitopes Is Determined by Both Peptide Supply and MHC Allele-Specific Binding Preference. J. Immunol. Baltim. Md 1950196, 1480-1487 (2016). 99. Di Marco, M. et al. Unveiling the Peptide Motifs of HLA-C and HLA-G from Naturally Presented Peptides and Generation of Binding Prediction Matrices. J. Immunol. Baltim. Md 1950199, 2639-2651 (2017).

100. Goodfellow, I., Bengio, Y. & Courville, A. Deep Learning. (MIT Press, 2016).

101. Sette, A. et al. The relationship between class I binding affinity and immunogenicity of potential cytotoxic T-cell epitopes. J. Immunol. Baltim. Md 1950153, 5586-5592 (1994).

102. Fortier, M.-H. et al. The MHC class I peptide repertoire is molded by the transcriptome. J. Exp. Med. 205, 595-610 (2008).

103. Pearson, H. et al. MHC class I-associated peptides derive from selective regions of the human genome. J. Clin. Invest. 126, 4690-4701 (2016).

104. Bassani-Sternberg, M. et al. Deciphering HLA-I motifs across HLA peptidomes improves neo-antigen predictions and identifies allostery regulating HLA specificity. PLoS Comput. Biol. 13, e1005725 (2017).

105. Andreatta, M., Lund, O. & Nielsen, M. Simultaneous alignment and clustering of peptide data using a Gibbs sampling approach. Bioinforma. Oxf. Engl. 29, 8-14 (2013).

106. Andreatta, M., Alvarez, B. & Nielsen, M. GibbsCluster: unsupervised clustering and alignment of peptide sequences. Nucleic Acids Res. (2017). doi:10.1093/nar/gkx248

107. Gros, A. et al. Prospective identification of neoantigen-specific lymphocytes in the peripheral blood of melanoma patients. Nat. Med. 22, 433-438 (2016).

108. Zacharakis, N. et al. Immune recognition of somatic mutations leading to complete durable regression in metastatic breast cancer. Nat. Med. 24, 724-730 (2018).

109. Chudley, L. et al. Harmonisation of short-term in vitro culture for the expansion of antigen-specific CD8+ T-cells with detection by ELISPOT and HLA-multimer staining. Cancer Immunol. Immunother. 63, 1199-1211 (2014).

110. Van Allen, E. M. et al. Genomic correlates of response to CTLA-4 blockade in metastatic melanoma. Science 350, 207-211 (2015).

111. Anagnostou, V. et al. Evolution of Neoantigen Landscape during Immune Checkpoint Blockade in Non-Small Cell Lung Cancer. Cancer Discov. 7, 264-276 (2017).

112. Carreno, B. M. et al. Cancer immunotherapy. A dendritic cell vaccine increases the breadth and diversity of melanoma neoantigen-specific T-cells. Science 348, 803-808 (2015).

113. Stevanovic, S. et al. Landscape of immunogenic tumor antigens in successful immunotherapy of virally induced epithelial cancer. Science 356, 200-205 (2017).

114. Pasetto, A. et al. Tumor- and Neoantigen-Reactive T-cell Receptors Can Be Identified Based on Their Frequency in Fresh Tumor. Cancer Immunol. Res. 4, 734-743 (2016).

115. Gillette, M. A. & Carr, S. A. Quantitative analysis of peptides and proteins in biomedicine by targeted mass spectrometry. Nat. Methods 10, 28-34 (2013).

116. Boegel, S., Lower, M., Bukur, T., Sahin, U. & Castle, J. C. A catalog of HLA type, HLA expression, and neo-epitope candidates in human cancer cell lines. Oncoimmunology 3, e954893 (2014).

117. Johnson, D. B. et al. Melanoma-specific MHC-II expression represents a tumour-autonomous phenotype and predicts response to anti-PD-1/PD-L1 therapy. Nat. Commun. 7, 10582 (2016).

118. Robbins, P. F. et al. A Pilot Trial Using Lymphocytes Genetically Engineered with an NY-ESO-1-Reactive T-cell Receptor: Long-term Follow-up and Correlates with Response. Clin. Cancer Res. 21, 1019-1027 (2015).

119. Snyder, A. et al. Genetic basis for clinical response to CTLA-4 blockade in melanoma. N. Engl. J. Med.

371, 2189-2199 (2014).

120. Calis, J. J. A. et al. Properties of MHC class I presented peptides that enhance immunogenicity. PLoS Comput. Biol. 9, e1003266 (2013).

121. Duan, F. et al. Genomic and bioinformatic profiling of mutational neoepitopes reveals new rules to predict anticancer immunogenicity. J. Exp. Med. 211,2231-2248 (2014).

122. Glanville, J. et al. Identifying specificity groups in the T-cell receptor repertoire. Nature 547, 94-98 (2017).

123. Dash, P. et al. Quantifiable predictive features define epitope-specific T-cell receptor repertoires. Nature 547, 89-93 (2017).

124. Hunt, D. F. et al. Pillars article: Characterization of peptides bound to the class I MHC molecule HLA-A2.1 by mass spectrometry. Science 1992. 255: 1261-1263. J. Immunol. Baltim. Md 1950179, 2669-2671 (2007).

125. Zarling, A. L. et al. Identification of class I MHC-associated phosphopeptides as targets for cáncer immunotherapy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 14889-14894 (2006).

126. Abelin, J. G. et al. Complementary IMAC enrichment methods for HLA-associated phosphopeptide identification by mass spectrometry. Nat. Protoc. 10, 1308-1318 (2015).

127. Barnstable, C. J. et al. Production of monoclonal antibodies to group A erythrocytes, HLA and other human cell surface antigens-new tools for genetic analysis. Cell 14, 9-20 (1978).

128. Eng, J. K., Jahan, T. A. & Hoopmann, M. R. Comet: an open-source MS/MS sequence database search tool. Proteomics 13, 22-24 (2013).

129. Eng, J. K. et al. A deeper look into Comet--implementation and features. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 26, 1865-1874 (2015).

130. Kall, L., Storey, J. D., MacCoss, M. J. & Noble, W. S. Assigning significance to peptides identified by tandem mass spectrometry using decoy databases. J. Proteome Res. 7, 29-34 (2008).

131. Kall, L., Storey, J. D. & Noble, W. S. Non-parametric estimation of posterior error probabilities associated with peptides identified by tandem mass spectrometry. Bioinforma. Oxf. Engl. 24, i42-48 (2008).

132. Kall, L., Canterbury, J. D., Weston, J., Noble, W. S. & MacCoss, M. J. Semi-supervised learning for peptide identification from shotgun proteomics datasets. Nat. Methods 4, 923-925 (2007).

133. Li, B. & Dewey, C. N. RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC Bioinformatics 12, 323 (2011).

134. Chollet, F. & others. Keras. (2015).

135. Bastien, F. et al. Understanding the difficulty of training deep feedforward neural networks. Proc. Thirteen. Int. Conf. Artif. Intell. Stat. 249-256 (2010).

136. Glorot, X. & Bengio, Y. Understanding the difficulty of training deep feedforward neural networks. in Proceedings of the Thirteenth International Conference on Artificial Intelligence and Statistics 249-256 (2010).

137. Kingma, D. & Ba, J. Adam: A method for stochastic optimization. ArXiv Prepr. ArXiv14126980 (2014).

138. Schneider, T. D. & Stephens, R. M. Sequence logos: a new way to display consensus sequences. Nucleic Acids Res. 18, 6097-6100 (1990).

139. Rubinsteyn, A., O'Donnell, T., Damaraju, N. & Hammerbacher, J. Predicting Peptide-MHC Binding Affinities With Imputed Training Data. biorxiv (2016). doi:https://doi.org/10.1101/054775

140. Tran, E. et al. Immunogenicity of somatic mutations in human gastrointestinal cancers. Science 350, 1387-1390 (2015).

141. Stronen, E. et al. Targeting of cancer neoantigens with donor-derived T-cell receptor repertoires. Science 352, 1337-1341 (2016).

142. Janetzki, S., Cox, J. H., Oden, N. & Ferrari, G. Standardization and validation issues of the ELISPOT assay. Methods Mol. Biol. Clifton NJ 302, 51-86 (2005).

143. Janetzki, S. et al. Guidelines for the automated evaluation of Elispot assays. Nat. Protoc. 10, 1098-1115 (2015).

144. Li, H. & Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinforma. Oxf. Engl. 25, 1754-1760 (2009).

145. DePristo, M. A. et al. A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data. Nat. Genet. 43, 491-498 (2011).

146. Garrison, E. & Marth, G. Haplotype-based variant detection from short-read sequencing. arXiv (2012).

147. Cingolani, P. et al. A program for annotating and predicting the effects of single nucleotide polymorphisms, SnpEff: SNPs in the genome of Drosophila melanogaster strain w1118; iso-2; iso-3. Fly (Austin) 6, 80-92 (2012).

148. Szolek, A. et al. OptiType: precisión HLA typing from next-generation sequencing data. Bioinforma. Oxf. Engl. 30, 3310-3316 (2014).

149. Cibulskis, K. et al. Sensitive detection of somatic point mutations in impure and heterogeneous cancer samples. Nat. Biotechnol. 31, 213-219 (2013).

150. Scholz, E. M. et al. Human Leukocyte Antigen (HLA)-DRB1*15:01 and HLA-DRB5*01:01 Present Complementary Peptide Repertoires. Front. Immunol. 8, 984 (2017).

151. Ooi, J. D. et al. Dominant protection from HLA-linked autoimmunity by antigen-specific regulatory T-cells. Nature 545, 243-247 (2017).

152. Karosiene, E. et al. NetMHCIIpan-3.0, a common pan-specific MHC class II prediction method including all three human MHC class II isotypes, HLA-DR, HLA-Dp and HLA-DQ. Immunogenetics 65, 711-724 (2013).

153. Dudley ME, Gross CA, Langhan MM, et al. CD8+ enriched “young” tumor infiltrating lymphocytes can mediate regression of metastatic melanoma. Clinical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research. 2010;16(24):6122-6131. doi:10.1158/1078-0432.CCR-10-1297.

154. Dudley ME, Wunderlich JR, Shelton TE, Even J, Rosenberg SA. Generation of Tumor-Infiltrating Lymphocyte Cultures for Use in Adoptive Transfer Therapy for Melanoma Patients. Journal of immunotherapy (Hagerstown, Md : 1997). 2003;26(4):332-342.

155. Cohen CJ, Gartner JJ, Horovitz-Fried M, et al. Isolation of neoantigen-specific T cells from tumor and peripheral lymphocytes. The Journal of Clinical Investigation. 2015;125(10):3981-3991. doi:10.1172/JCI82416.

156. Kelderman, S. , Heemskerk, B. , Fanchi, L. , Philips, D. , Toebes, M. , Kvistborg, P. , Buuren, M. M., Rooij, N. , Michels, S. , Germeroth, L. , Haanen, J. B. and Schumacher, N. M. (2016), Antigen-specific TIL therapy for melanoma: A flexible platform for personalized cancer immunotherapy. Eur. J. Immunol., 46: 1351-1360. doi:10.1002/eji.201545849.

157. Hall M, Liu H, Malafa M, et al. Expansion of tumor-infiltrating lymphocytes (TIL) from human pancreatic tumors. Journal for Immunotherapy of Cancer. 2016;4:61. doi:10.1186/s40425-016-0164-7.

158. Briggs A, Goldfless S, Timberlake S, et al. Tumor-infiltrating immune repertoires captured by single-cell barcoding in emulsion. bioRxiv. 2017. doi.org/10.1101/134841.

159. US Patent Application No. 20160244825A1.

160. Ko§aloglu-Yalgin, Z. et al. Predicting T cell recognition of MHC class I restricted neoepitopes. J. OncoImmunology, 1-15 (2018).

Tabla sulementaria 1

Tabla suplementaria 2

Tabla sulementaria 2

Tabla sulementaria 3

Tabla suplementaria 3

Tabla sulementaria 3

Tabla suplementaria 3

Tabla sulementaria 3

Tabla suplementaria 3

Tabla sulementaria 3

Tabla suplementaria 3

Tabla sulementaria 3

Tabla sulementaria 4

Tabla suplementaria 5

Tabla sulementaria 6

Tabla su lementaria 6

Tabla suplementaria 6

Longitud total BETA V(D)J

MDTWLVCWAIFSLLKAGLTEPEVTQTPSHQVTQMGQEVILRCVPISNHLYFYWYRQILGQKVEFLVSFYNNEISEKSEIFDDQFSV MSIGLLCCVAFSLLWASPVNAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHNSMYWYRQDPGMGLRLIYYSASEGTTDKGEVPNG MLLLLLLLGPGSGLGAVVSQHPSRVICKSGTSVKIECRSLDFQATTMFWYRQFPKQSLMLMATSNEGSKATYEQGVEKDKFLINH MGTSLLCWVVLGFLGTDHTGAGVSQSPRYKVTKRGQDVALRCDPISGHVSLYWYRQALGQGPEFLTYFNYEAQQDKSGLPND MGIRLLCRVAFCFLAVGLVDVKVTQSSRYLVKRTGEKVFLECVQDMDHENMFWYRQDPGLGLRLIYFSYDVKMKEKGDIPEGYS

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para identificar uno o más neoantígenos de una o más células tumorales de un sujeto que es probable que se presenten en una superficie de las células tumorales, el método comprende las etapas de:

obtener al menos uno de los datos de secuenciación de nucleótidos del exorna, transcriptoma o del genoma completo de las células tumorales y de las células normales del sujeto, en donde los datos de secuenciación de nucleótidos se utiliza para obtener datos que representan secuencias peptídicas de cada uno de un conjunto de neoantígenos identificados al comparar los datos de secuenciación del nucleótido de las células tumorales y los datos de secuenciación del nucleótido de células normales, en donde la secuencia peptídica de cada neoantígeno comprende al menos una alteración que la hace diferente de la secuencia peptídica sin modificar correspondiente identificada de las células normales del sujeto;

codificar la secuencia peptídica de cada uno de los neoantígenos en un vector numérico correspondiente, cada vector numérico incluye información relativa a una pluralidad de aminoácidos que componen la secuencia peptídica y un conjunto de posiciones de los aminoácidos en la secuencia peptídica;

asociar la secuencia peptídica de cada uno de los neoantígenos con uno o más bloques k-mer de una pluralidad de bloques k-mer de los datos de secuenciación nucleotídica del sujeto;

introducir los vectores numéricos y uno o más bloques k-mer asociados, mediante un procesador informático, en un modelo de presentación de aprendizaje automático para generar un conjunto de probabilidades de presentación para el conjunto de neoantígenos, representando cada probabilidad de presentación del conjunto la probabilidad de que un neoantígeno correspondiente sea presentado por uno o más alelos MHC en la superficie de las células tumorales del sujeto, comprendiendo el modelo de presentación de aprendizaje automático:

una pluralidad de parámetros identificados al menos sobre la base de un conjunto de datos de entrenamiento que comprende:

para cada muestra de una pluralidad de muestras, una etiqueta obtenida por espectrometría de masas que mide la presencia de péptidos unidos a al menos un alelo del MHC en un conjunto de alelos del MHC identificados como presentes en la muestra; para cada una de las muestras, secuencias peptídicas de entrenamiento codificadas como vectores numéricos que incluyen información relativa a una pluralidad de aminoácidos que componen los péptidos y un conjunto de posiciones de los aminoácidos en los péptidos; y

para cada una de las muestras, para cada una de las secuencias peptídicas de entrenamiento de la muestra, asociaciones entre la secuencia peptídica de entrenamiento y uno o más bloques k-mer de una pluralidad de bloques k-mer de los datos de secuenciación de nucleótidos de las secuencias peptídicas de entrenamiento, en donde un subconjunto de la pluralidad de parámetros representa la presencia o ausencia de una región clave de presentación para el uno o más bloques k-mer; y

una función que representa una relación entre el vector numérico y el uno o más bloques k-mer recibidos como entrada y la probabilidad de presentación generada como salida basada en el vector numérico, el uno o más bloques k-mer y los parámetros;

seleccionar un subconjunto del conjunto de neoantígenos basándose en el conjunto de probabilidades de presentación para generar un conjunto de neoantígenos seleccionados; y

que devuelve el conjunto de neoantígenos seleccionados.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la introducción del vector numérico en el modelo de presentación de aprendizaje automático comprende:

aplicar el modelo de presentación de aprendizaje automático a la secuencia peptídica del neoantígeno para generar una puntuación de dependencia para cada uno de los uno o más alelos de MHC que indique si el alelo de MHC presentará el neoantígeno basándose en los aminoácidos particulares en las posiciones particulares de la secuencia peptídica.

3. El método de la reivindicación 2, en donde la introducción del vector numérico en el modelo de presentación de aprendizaje automático comprende además:

(A) transformar las puntuaciones de dependencia para generar una probabilidad por alelo correspondiente para cada alelo MHC que indique una probabilidad de que el alelo MHC correspondiente presente el neoantígeno correspondiente; y

combinar las probabilidades por alelo para generar la probabilidad de presentación del neoantígeno, opcionalmente, en donde la transformación de las puntuaciones de dependencia modela la presentación del neoantígeno como mutuamente excluyente a través de los uno o más alelos MHC; o

(B) transformar una combinación de las puntuaciones de dependencia para generar la probabilidad de presentación, en donde la transformación de la combinación de las puntuaciones de dependencia modela la presentación del neoantígeno como interferente entre uno o más alelos MHC.

4. El método de la reivindicación 2 o de la reivindicación 3, en donde el conjunto de probabilidades de presentación se identifica además por al menos una o más características de no interacción alélica, y que comprende además:

aplicar el modelo de presentación aprendido por la máquina a las características de no interacción con el alelo para generar una puntuación de dependencia para las características de no interacción con el alelo que indique si la secuencia peptídica del neoantígeno correspondiente se presentará basándose en las características de no interacción con el alelo.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, que además comprende:

(A) combinar la puntuación de dependencia para cada alelo MHC en el uno o más alelos MHC con la puntuación de dependencia para las características de no interacción de los alelos;

transformar las puntuaciones de dependencia combinadas de cada alelo MHC para generar una probabilidad por alelo de cada alelo MHC que indique la probabilidad de que el alelo MHC correspondiente presente el neoantígeno correspondiente; y combinar las probabilidades por alelo para generar la probabilidad de presentación; (B) combinar las puntuaciones de dependencia para cada uno de los alelos MHC y la puntuación de dependencia para las características de no interacción de los alelos; y

transformar las puntuaciones de dependencia combinadas para generar la probabilidad de presentación.

6. El método de la reivindicación 4 o de la reivindicación 5, en donde la al menos una o más características de no interacción alélica comprende asociaciones entre la secuencia peptídica del neoantígeno y uno o más bloques k-mer de una pluralidad de bloques k-mer de los datos de secuenciación nucleotídica del neoantígeno.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde:

(A) los uno o más alelos MHC incluyen dos o más alelos MHC diferentes;

(B) las secuencias peptídicas comprenden secuencias peptídicas que tienen longitudes distintas de 9 aminoácidos;

(C) la codificación de la secuencia peptídica comprende codificar la secuencia peptídica utilizando un esquema de codificación de un solo disparo;

(D) la pluralidad de muestras comprende al menos una de:

a) una o más líneas celulares diseñadas para expresar un único alelo MHC;

b) una o más líneas celulares diseñadas para expresar una pluralidad de alelos MHC; c) una o más líneas celulares humanas obtenidas o derivadas de una pluralidad de pacientes;

d) muestras tumorales frescas o congeladas obtenidas de una pluralidad de pacientes; y

e) muestras tisulares frescas o congeladas obtenidas de una pluralidad de pacientes;

y/o

(E) el conjunto de datos de entrenamiento comprende además al menos uno de:

a) datos asociados con mediciones de afinidad de unión péptido-MHC para al menos uno de los péptidos; y

b) datos asociados con mediciones de estabilidad de unión péptido-MHC para al menos uno de los péptidos

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde:

(A) el conjunto de probabilidades de presentación se identifica además por al menos los niveles de expresión de uno o más alelos MHC en el sujeto, medidos por ARN-seq o espectrometría de masas;

(B) el conjunto de probabilidades de presentación se identifica además por características que comprenden al menos una de:

a) afinidad prevista entre un neoantígeno del conjunto de neoantígenos y uno o más alelos MHC; y

b) estabilidad prevista del complejo péptido-MHC codificado por el neoantígeno; y/o (C) el conjunto de probabilidades numéricas se identifica además por características que comprenden al menos una de:

a) las secuencias C-terminales que flanquean la secuencia peptídica codificada por el neoantígeno dentro de su secuencia proteica de origen; y

b) las secuencias N-terminales que flanquean la secuencia de péptido codificado por el neoantígeno dentro de su secuencia de proteína fuente

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde la selección del conjunto de neoantígenos seleccionados comprende seleccionar neoantígenos que tienen

(A) El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde la selección del conjunto de neoantígenos seleccionados comprende seleccionar neoantígenos que tienen

(B) El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde la selección del conjunto de neoantígenos seleccionados comprende seleccionar neoantígenos que tienen

(C) una mayor probabilidad de poder ser presentado a células T sin tratamiento previo por células presentadoras de antígenos (APC) profesionales en relación con neoantígenos no seleccionados según el modelo de presentación, opcionalmente en el que la APCes una célula dendrítica (CD); (D) una menor probabilidad de ser objeto de inhibición a través de la tolerancia central o periférica en relación con neoantígenos no seleccionados basados en el modelo de presentación aprendido por máquina; y/o

(E) una menor probabilidad de ser capaz de inducir una respuesta autoinmune al tejido normal en el sujeto en relación con neoantígenos no seleccionados basada en el modelo de presentación aprendido por máquina.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1a 9, en donde:

(A) la una o más células tumorales se seleccionan del grupo que consiste en: cáncer de pulmón, melanoma, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de riñón, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer testicular, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de páncreas, cáncer cerebral, linfoma de células B, leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, leucemia linfocítica crónica y leucemia linfocítica de células T, cáncer de pulmón de células no pequeñas y cáncer de pulmón de células pequeñas; y/o

(B) el método comprende además generar un resultado para construir una vacuna personalizada contra el cáncer a partir del conjunto de neoantígenos seleccionados, opcionalmente en el que el resultado para la vacuna personalizada contra el cáncer comprende al menos una secuencia peptídica o al menos una secuencia nucleotídica que codifica el conjunto de neoantígenos seleccionados.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde el modelo de presentación aprendido por máquina es un modelo de red neuronal.

12. El método de la reivindicación 11, en donde el modelo de red neuronal incluye una pluralidad de modelos de red para los alelos MHC, cada modelo de red asignado a un alelo MHC correspondiente de los alelos MHC y que incluye una serie de nodos dispuestos en una o más capas, opcionalmente en donde el modelo de red neuronal se entrena actualizando los parámetros del modelo de red neuronal, y en el que los parámetros de al menos dos modelos de red se actualizan conjuntamente para al menos una iteración de entrenamiento.

El método de la reivindicación 11 o de la reivindicación 12, en donde el modelo de presentación aprendido por máquina es un modelo de aprendizaje profundo que incluye una o más capas de nodos.

14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en donde el uno o más alelos MHC son alelos MHC de clase I.

15. Un sistema informático que comprende:

un procesador de ordenador;

una memoria que almacena instrucciones de programa informático que, al ser ejecutadas por el procesador informático, hacen que éste:

obtenga de datos que representen secuencias peptídicas de cada uno de un conjunto de neoantígenos de las células tumorales de un sujeto;

asocie la secuencia peptídica de cada uno de los neoantígenos con uno o más bloques k-mer de una pluralidad de bloques k-mer de los datos de secuenciación nucleotídica del sujeto;

introduzca los vectores numéricos y uno o más bloques k-mer asociados, en un modelo de presentación aprendido por máquina para generar un conjunto de probabilidades de presentación para el conjunto de neoantígenos, representando cada probabilidad de presentación del conjunto la probabilidad de que un neoantígeno correspondiente sea presentado por uno o más alelos MHC en la superficie de las células tumorales del sujeto, comprendiendo el modelo de presentación aprendido por máquina:

para cada muestra de una pluralidad de muestras, una etiqueta obtenida por espectrometría de masas que mide la presencia de péptidos unidos a al menos un alelo del MHC en un conjunto de alelos del MHC identificados como presentes en la muestra;

para cada una de las muestras, secuencias peptídicas de entrenamiento codificadas como vectores numéricos que incluyen información relativa a una pluralidad de aminoácidos que componen los péptidos y un conjunto de posiciones de los aminoácidos en los péptidos; y

para cada una de las muestras, para cada una de las secuencias peptídicas de entrenamiento de la muestra, asociaciones entre la secuencia peptídica de entrenamiento y uno o más bloques k-mer de bloques k-mer de los datos de secuenciación de nucleótidos de las secuencias peptídicas de entrenamiento,

en donde un subconjunto de la pluralidad de parámetros representa la presencia o ausencia de un punto caliente de presentación para el uno o más bloques kmer; y

una función que representa una relación entre el vector numérico y el uno o más bloques k-mer recibidos como entrada y la probabilidad de presentación generada como salida basada en el vector numérico, el uno o más bloques kmer y los parámetros;

devolver el conjunto de neoantígenos seleccionados.