ES3029416T3 - Chromosome interaction markers - Google Patents
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Abstract
Un proceso para analizar las interacciones cromosómicas relacionadas con la inmunoterapia del cáncer. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Marcadores de interacción cromosómica
Campo de la invención
La invención se refiere a la inmunoterapia.
Antecedentes de la invención
El cáncer constituye una importante carga de enfermedad en todo el mundo. Cada año, a decenas de millones de personas en todo el mundo se les diagnostica cáncer y más de la mitad de los pacientes finalmente mueren a causa de esta enfermedad. En muchos países, el cáncer ocupa la segunda causa más común de muerte, después de las enfermedades cardiovasculares. Con una mejora significativa en el tratamiento y la prevención de las enfermedades cardiovasculares, el cáncer se ha convertido o pronto se convertirá en la principal causa de muerte en muchas partes del mundo. Como las personas mayores son más susceptibles al cáncer y el envejecimiento de la población continúa en muchos países, el cáncer seguirá siendo un importante problema de salud en todo el mundo.
Si bien el propósito principal del sistema inmunológico es combatir infecciones causadas por agentes externos extraños como los patógenos, también tiene la importante función de atacar y eliminar las células cancerosas. La inmunoterapia contra el cáncer generalmente funciona ayudando al sistema inmunitario de alguna manera a combatir las células cancerosas.
El documento WO2019/086898 divulga un proceso para analizar regiones cromosómicas e interacciones relacionadas con la inmunorrespuesta.
Wang et al., 2020, vol 19, no. 1, 2 de mayo de 2020 'The biomarkers of hyperprogressive disease in PD-1/PD-L1 blockage therapy' revelan que los inhibidores de los puntos de control inmunitarios, como los anticuerpos PD-1/PD-L1 y los anticuerpos contra el antígeno 4 de los linfocitos T citotóxicos, son eficaces para pacientes con diversos tipos de cáncer.
Sumario de la invención
Los inventores han identificado firmas de conformación cromosómica que definen estados del sistema inmunológico que son relevantes para la terapia del cáncer. Esto aclara el papel de esta modalidad en la regulación del sistema inmunológico y permite una "lectura" de cómo responderá el sistema inmunológico de un paciente a la inmunoterapia. También ha permitido identificar ciertos tipos de población respondedora para los cuales la inmunoterapia no es apropiada y, de hecho, puede ser muy dañina. Este análisis a nivel de la arquitectura 3D del genoma definida por las interacciones cromosómicas ofrece lecturas muy tempranas de la respuesta del paciente a la inmunoterapia, permitiendo tomar decisiones en etapas tempranas de la enfermedad en cuanto a las terapias más apropiadas. Según la invención, se ha comprobado que la detección de las interacciones cromosómicas relevantes es sólida y funciona en diferentes inmunoterapias y tipos de cáncer.
Los marcadores identificados son consistentes con desregulaciones en células T, células NK (asesinas naturales), macrófagos, células B y células dendríticas (DC) mostrando el papel jugado por la configuración específica a nivel celular del sistema inmune adaptativo e innato en pacientes individuales como parte de la interacción cáncerhuésped que define la progresión de la enfermedad (hiperprogresores) y la capacidad de respuesta a la inmunoterapia.
Por consiguiente, la invención proporciona un método para determinar cómo responde un individuo a la inmunoterapia para el cáncer que comprende detectar la presencia o ausencia en el individuo de:
- todas las interacciones cromosómicas representadas por las secuencias de sonda que se muestran en la Tabla 8c para determinar así si el individuo responderá a la inmunoterapia; y/o
- todas las interacciones cromosómicas representadas por la secuencia de sonda que se muestra en la Tabla 2.a3 para determinar así si el individuo es un hiperprogresor en quien la inmunoterapia acelerará la enfermedad.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra un método preferido para tipificar interacciones cromosómicas, basado esencialmente en el método EpiSwitch.
La figura 2 muestra el perfil predictivo y pronóstico basal del paciente y muestra datos de respuesta a PD-L1 (Avelumab en cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) de segunda línea (2L). Para el gráfico superior de cada una de las figuras 2a, 2b y 2c, el eje vertical muestra la probabilidad de supervivencia de 0,00 a 1,00 y el eje horizontal muestra el tiempo de 0 a 1200, siendo los valores p para las líneas de puntos <0,0001, 0,76 y <0,0001 en las figuras 2a, 2b y 2c respectivamente. La tabla inferior de cada figura muestra el número de personas en riesgo correspondiente a cada línea de los gráficos a lo largo del tiempo de 0 a 1200.
La figura 3 se relaciona con la validación de los marcadores de respuesta anti-PD-L1 de EpiSwitch en una cohorte independiente de 21 pacientes en distintos tipos de cáncer y terapias con inhibidores de puntos de control.
La figura 4 muestra la alta concordancia entre las llamadas basales de EpiSwitch, la expresión de PD-L1 y la respuesta clínica observada.
La figura 5 muestra datos de un conjunto de entrenamiento para un modelo de 11 marcadores basado en 80 pacientes con NSCLC que son una mezcla de 1L, 2L de avelumab (54) y 2L de Pembrolizumab (36).
La figura 6 muestra datos para un conjunto de prueba del modelo de 11 marcadores basado en 38 pacientes con NSCLC que son una mezcla de 1L, 2L de avelumab (27) y 2L de Pembrolizumab (11).
Las figuras 7 y 8 muestran datos de un segundo conjunto de pruebas para el Estudio observacional de Malasia que analiza una combinación de inhibidores de puntos de control y tumores.
La figura 9 muestra llamadas longitudinales en muestras asiáticas ciegas.
La figura 10 muestra las llamadas de EpiSwitch reales para los pacientes muestreados en múltiples puntos de tiempo.
Las figuras 11 y 12 muestran la selección de muestras y los detalles de los pacientes para el trabajo relacionado con los hiperprogresores.
La figura 13 muestra la selección del marcador de conformación cromosómica EpiSwitch con las ubicaciones genéticas asociadas.
Las figuras 14 y 15 muestran el análisis de las vías de localización genética.
La figura 16 muestra el conjunto de entrenamiento para hiperprogresores.
La figura 17 muestra el conjunto de pruebas para hiperprogresores.
La figura 18 muestra el PCA logístico (análisis de componentes principales) del conjunto de entrenamiento para hiperprogresores. Los cuadrados muestran H y los círculos muestran S.
La figura 19 muestra el PCA logístico del conjunto de entrenamiento con muestras de prueba previstas para hiperprogresores. Los cuadrados muestran H y los círculos oscuros muestran S.
La figura 20 muestra el PCA logístico del conjunto de entrenamiento con PFS como etiqueta para los hiperprogresores. Los cuadrados muestran H y los círculos muestran S.
La Figura 21 muestra el ACP logístico del conjunto de entrenamiento con OS como etiqueta para los hiperprogresores. Los cuadrados muestran H y los círculos muestran S.
La figura 22 muestra una matriz de confusión y estadísticas. El modelo de entrenamiento es de 78 pacientes. 30 fueron NR (no respondedores). 39 fueron R (respondedores). 9 fueron SD (enfermedad estable).
La figura 23 muestra una matriz de confusión y estadísticas. El conjunto de prueba está formado por 24 pacientes.
8 eran NR, 12 eran R y 4 eran SD.
La figura 24 muestra una matriz de confusión y estadísticas. El conjunto de prueba son 128 pacientes.
La figura 25 muestra la importancia de la variable global para diferentes marcadores. De arriba a abajo se muestran los resultados para (i) obd189_q65-q67_p65, (ii) obd189_q53_q55_p53, (iii) obd189_q81_q83_p81, (iv) obd148_q893_q895_p893, (v) obd189_q49_q51_p49, (vi) obd189_q29_q31_p31, (vii) obd189_q57_q59_p57, (viii) obd189_q05_q07_p05. El eje horizontal muestra las características del modelo superior. El eje vertical muestra valores que van de 0 a 20.
La figura 26 muestra las ubicaciones genéticas de los marcadores.
La figura 27 muestra las vías asociadas con los genes de la figura 26.
Descripción de las Tablas
La Tabla 1 muestra el conjunto de marcadores universales y cómo cada marcador se relaciona con la respuesta (R) o la falta de respuesta (NR) a la inmunoterapia.
La Tabla 2 muestra el conjunto de marcadores para la detección de hiperprogresores y cómo cada marcador se relaciona con la hiperprogresión (HS) o la estabilidad (S).
La Tabla 3 muestra las moléculas de puntos de control inmunitario que pueden ser atacadas y/o moduladas por la inmunoterapia.
Las Tablas 4 a 6 proporcionan ejemplos de inmunoterapias contra el cáncer para las que se puede determinar el estado de respuesta y también son las terapias que se pueden administrar al individuo en función del resultado de la determinación del estado de respuesta de acuerdo con la invención. Estas tablas también muestran los cánceres preferidos.
En la Tabla 7 se muestran los marcadores relevantes para las pruebas realizadas en el Ejemplo 2 para desarrollar el conjunto de marcadores que se muestra en la Tabla 8.
La Tabla 8 muestra el conjunto de marcadores universales y cómo cada marcador se relaciona con la respuesta (R) o la falta de respuesta (NR) a la inmunoterapia.
La Tabla 9 proporciona datos de pacientes para el Ejemplo 2. Los pacientes que se muestran con un asterisco (*) fueron estudiados en la segunda pantalla descrita en el Ejemplo 2.
Descripción detallada de la invención
Términos utilizados en el presente documento
El método de la invención puede denominarse en el presente documento el "proceso" de la invención.
Las interacciones cromosómicas que se tipifican pueden denominarse en el presente documento "marcadores", "CCS", "firma de conformación cromosómica", "interacción epigenética" o "marcadores EpiSwitch".
La palabra "tipo" se interpretará según el contexto, pero generalmente se referirá a la detección de si una interacción cromosómica específica está presente o ausente. La tipificación generalmente se realizará mediante la determinación física de si está presente la interacción cromosómica.
La palabra "respondedor" se utiliza para referirse a la respuesta a la inmunoterapia y cubre tanto los aspectos relacionados con la capacidad de respuesta a la inmunoterapia (el conjunto de marcadores universales) como la detección de hiperprogresores. El término "grupo de respuesta" abarca los cuatro grupos diferentes analizados en el presente documento:
- respondedor a la inmunoterapia
- no respondedor a la inmunoterapia
- hiperprogresor cuando se le administra inmunoterapia
- enfermedad estable (no hiperprogresora) cuando se administra inmunoterapia.
Las interacciones cromosómicas que se tipifican en el método de la invención se definen en las Tablas 2 y 8. Las interacciones cromosómicas que se tipifican en el método de la invención se definen con más detalle en la Tabla 1. Se definen por medio de las secuencias de sonda que detectan el producto ligado elaborado mediante un método EpiSwitch (véase la Figura 1). También se definen por los números de posición de la interacción que están dentro del nombre de la sonda y también se definen por las secuencias de cebadores que permiten la detección de la secuencia ligada.
Las interacciones epigenéticas relevantes para la invención
Las interacciones cromosómicas que se tipifican en la invención son típicamente interacciones entre regiones distales de un cromosoma, siendo dichas interacciones dinámicas y alterándose, formándose o rompiéndose dependiendo del estado de la región del cromosoma. Ese estado reflejará cómo interactúa el sistema inmunológico con la inmunoterapia administrada y en qué grupo de respuesta se encuentra el individuo.
La interacción cromosómica puede, por ejemplo, reflejar si está siendo transcrita o reprimida. Se ha comprobado que las interacciones cromosómicas específicas de los "grupos" de respondedores, tal como se definen en el presente documento, son estables, por lo que constituyen un medio fiable para medir las diferencias entre grupos (por ejemplo, que reflejen respuestas diferentes a la inmunoterapia).
Las interacciones cromosómicas específicas de los grupos respondedores estarán normalmente presentes antes o en las primeras fases del proceso de una enfermedad, por ejemplo en comparación con otros marcadores epigenéticos como la metilación o los cambios en la unión de las proteínas histonas. De este modo, el procedimiento de la invención es capaz de proporcionar información valiosa sobre el modo en que reaccionará el sistema inmune en una fase temprana. Esto permite una intervención temprana (por ejemplo un tratamiento) que, en consecuencia, será más eficaz y también permite tomar decisiones tempranas sobre el tipo de tratamiento que es apropiado para el paciente y qué tratamientos no se deben utilizar. Las interacciones cromosómicas también reflejan el estado actual del individuo y, por lo tanto, pueden utilizarse para evaluar cambios en el estado de la enfermedad. Además, hay poca variación en las interacciones cromosómicas relevantes entre individuos del mismo grupo.
Las interacciones cromosómicas que se detectan en la invención podrían verse afectadas por cambios en la secuencia de ADN subyacente, por factores ambientales, metilación del ADN, transcritos de ARN antisentido no codificantes, carcinógenos no mutagénicos, modificaciones de las histonas, remodelación de la cromatina e interacciones locales específicas del ADN. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que las interacciones cromosómicas tal como se definen en el presente documento son una modalidad reguladora en sí mismas y no tienen una correspondencia uno a uno con ningún marcador genético (cambio de secuencia de ADN) ni con ningún otro marcador epigenético.
Los cambios que conducen a las interacciones cromosómicas pueden verse afectados por cambios en la secuencia de ácido nucleico subyacente que en sí mismos no afectan directamente a un producto génico o al modo de expresión génica. Dichos cambios pueden ser, por ejemplo, SNP dentro y/o fuera de los genes, fusiones genéticas y/o deleciones de ADN intergénico, microARN y a Rn no codificante. Por ejemplo, se sabe que aproximadamente el 20 % de los SNP se encuentran en regiones no codificantes, por lo que el proceso descrito también es informativo en situaciones no codificantes. Normalmente, las regiones del cromosoma que se unen para formar la interacción están separadas por menos de 5 kb, 3 kb, 1 kb, 500 pares de bases o 200 pares de bases en el mismo cromosoma.
El proceso de la invención
El procedimiento de la invención comprende un sistema de tipificación para detectar interacciones cromosómicas relacionadas con el estado de respondedor. Se puede utilizar cualquier método de tipificación adecuado, por ejemplo, un método en el que se detecte la proximidad de los cromosomas en la interacción y/o en el que se detecte un marcador que refleje el estado de interacción cromosómica. El método de tipificación puede realizarse utilizando el sistemaEpiSwitch™ mencionado en el presente documento, que por ejemplo puede llevarse a cabo mediante un método que comprende las siguientes etapas (por ejemplo sobre ADN y/o una muestra del sujeto): (i) reticular regiones de cromosomas que se han unido en una interacción cromosómica;
(ii) aislar opcionalmente el ADN reticulado de dicho locus cromosómico;
(iii) someter el ADN reticulado a escisión; y
(iv) ligar los ácidos nucleicos presentes en la entidad reticulada para derivar ácidos nucleicos ligados con secuencia de ambas regiones que formaron una interacción cromosómica.
La detección de este ácido nucleico ligado permite determinar la presencia o ausencia de una interacción cromosómica particular. Por tanto, el ácido nucleico ligado actúa como marcador de la presencia de la interacción cromosómica. Preferiblemente, el ácido nucleico ligado se detecta mediante PCR o un método basado en sonda, incluyendo un método qPCR.
En el método, los cromosomas pueden reticularse mediante cualquier medio adecuado, por ejemplo mediante un agente de reticulación, que normalmente es un compuesto químico. En un aspecto preferido, las interacciones se reticulan utilizando formaldehído, pero también pueden reticularse mediante cualquier aldehído, o éster de ácido-N-hidroxisuccinimida D-biotinoil-e-aminocaproico o éster de ácido-N-hidroxisuccinimida Digoxigenina-3-O-metilcarbonil-e-aminocaproico. El para-formaldehído puede reticular cadenas de ADN que están separadas por 4 angstroms. Preferiblemente las interacciones cromosómicas ocurren en el mismo cromosoma. Normalmente, las interacciones cromosómicas ocurren con una separación de entre 2 y 10 angstroms.
La reticulación es preferiblementein vitro. Laescisión se realiza preferiblemente mediante digestión de restricción con una enzima, tales como Taql. La ligadura puede formar bucles de ADN.
Cuando se utiliza la PCR (reacción en cadena de la polimerasa) para detectar o identificar el ácido nucleico ligado, el tamaño del producto PCR producido puede ser indicativo de la interacción cromosómica específica que está presente y, por lo tanto, puede utilizarse para identificar el estado del locus. En aspectos preferidos se utilizan los cebadores que se muestran en cualquier tabla en el presente documento incluida, por ejemplo se utilizan los pares de cebadores que se muestran en la Tabla 2 o 8 (correspondientes a la interacción cromosómica que se está detectando). Se pueden utilizar los cebadores que se muestran en la Tabla 1. También se pueden utilizar homólogos de dichos cebadores o pares de cebadores, que pueden tener al menos un 70% de identidad con la secuencia original.
Cuando se utiliza una sonda para detectar o identificar el ácido nucleico ligado, esto se hace generalmente mediante apareamiento de bases basado en Watson-Crick entre la sonda y el ácido nucleico ligado. Se pueden utilizar secuencias de sonda como las que se muestran en cualquiera de las tablas en el presente documento incluidas, por ejemplo, las secuencias de sonda que se muestran en las Tablas 2 o 8 (que corresponden a la interacción cromosómica que se está detectando). Se pueden utilizar secuencias de sonda como las que se muestran en la Tabla 1. También pueden utilizarse homólogos de dichas secuencias de sonda, que pueden tener al menos un 70 % de identidad con la secuencia original.
La tipificación según el proceso de la invención se puede realizar en múltiples puntos de tiempo, por ejemplo para monitorear la progresión de la enfermedad. Esto puede ocurrir en uno o más puntos de tiempo definidos, por ejemplo, en al menos 1, 2, 5, 8 o 10 puntos de tiempo diferentes. Las duraciones entre al menos 1, 2, 5 u 8 de los puntos de tiempo pueden ser de al menos 5, 10, 20, 50, 80 o 100 días. Normalmente hay tres puntos de tiempo con una diferencia de al menos 50 días.
El individuo que será examinado y/o tratado
El individuo que se prueba en el método de la invención es preferiblemente un eucariota, animal, ave o mamífero. Lo más preferible es que el individuo sea un ser humano. El individuo puede ser hombre o mujer. En el caso de un individuo humano, normalmente tiene 65 años o más.
La invención incluye detectar y tratar grupos particulares en una población, que normalmente difieren en su estado de respuesta, por ejemplo su respuesta a la inmunoterapia. Los inventores han descubierto que las interacciones cromosómicas difieren entre estos grupos, y la identificación de estas diferencias permitirá a los médicos categorizar a sus pacientes como parte de un grupo particular de la población. Por lo tanto, la invención proporciona a los médicos un proceso de personalización de la medicina para un individuo en función de sus interacciones cromosómicas epigenéticas. Dichas pruebas pueden utilizarse para seleccionar cómo tratar posteriormente al paciente, por ejemplo, el tipo de medicamento que se le administrará. El proceso de la invención puede llevarse a cabo para seleccionar un tratamiento para un individuo, por ejemplo, si se administrará o no al individuo cualquier tratamiento específico mencionado en el presente documento.
El individuo que se prueba en el proceso de la invención puede haber sido seleccionado de alguna manera, por ejemplo con base en un factor de riesgo, síntoma o característica física. El individuo puede haber sido seleccionado en función de tener un síntoma de cáncer y/o estar en las primeras etapas de cáncer.
El individuo puede ser susceptible a cualquier cáncer mencionado en el presente documento y/o puede necesitar cualquier terapia mencionada en el presente documento. El individuo puede estar recibiendo cualquiera de las terapias mencionadas en el presente documento. En particular, el individuo puede tener, o sospecharse que tiene, cáncer, por ejemplo cualquier cáncer específico mencionado en el presente documento.
Tipos de cáncer
El cáncer que es relevante para la invención puede incluir cualquier cáncer mencionado en el presente documento, y preferiblemente es melanoma, cáncer de pulmón, carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), linfoma difuso de células B grandes, cáncer de hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer de próstata, cáncer de mama, leucemia, leucemia mieloide aguda, cáncer de páncreas, cáncer de tiroides, cáncer nasal, cáncer de cerebro, cáncer de vejiga, cáncer de cuello uterino, linfoma no Hodgkin, cáncer de ovario, cáncer colorrectal o cáncer de riñón. El cáncer puede ser uno que pueda tratarse mediante inmunoterapia, por ejemplo, cualquier inmunoterapia específica mencionada en el presente documento.
Tipos de inmunoterapia
La invención se refiere a la determinación de la respuesta a la inmunoterapia, y en particular si el individuo responde a la inmunoterapia y/o si es hiperprogresor en quien la inmunoterapia provocará una aceleración de la enfermedad.
Preferiblemente, la respuesta que se determina es a una terapia que comprende una molécula o célula que es relevante para el sistema inmunológico, tal como una composición que comprende un anticuerpo o célula inmune (por ejemplo, una célula T o una célula dendrítica) o cualquier sustancia terapéutica mencionada en el presente documento. Puede ser una respuesta a una sustancia que modula o estimula el sistema inmunológico, tal como una terapia con vacunas. La inmunoterapia puede modular, bloquear o estimular un punto de control inmunológico y, por lo tanto, puede apuntar o modular PD-L1, PD-L2 o CTLA4 o cualquier otra molécula de punto de control inmunológico divulgada en el presente documento y, por lo tanto, es preferiblemente una terapia de punto de control inmunológico. Preferiblemente, la respuesta es la capacidad de respuesta a una terapia con anticuerpos o a cualquier terapia específica divulgada en el presente documento. La terapia puede ser una terapia combinada, por ejemplo, cualquier terapia combinada específica divulgada en el presente documento.
En una realización, la respuesta es a un inhibidor de PD-1 o un inhibidor de PD-L1, incluido un anticuerpo específico para PD-1 o PD-L1. PD-1 es “proteína de muerte celular programada” y PD-L1 es “ ligando de muerte programada 1”.
El término "anticuerpo" incluye todos los fragmentos y derivados de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse al antígeno objetivo, por ejemplo, scFV o Fab de cadena simple.
La terapia puede ser monoterapia o terapia combinada, por ejemplo con moduladores de puntos de control inmunológico (preferiblemente inhibidores) para PD-1 y/o su ligando, PD-L1. La terapia podría comprender la administración de al menos un modulador de punto de control inmunológico, por ejemplo tal como se describe en el presente documento, tal como en cualquier tabla, figura o ejemplo. La terapia podría ser una combinación de un anti-PD-1 o anti-PD-L1 combinado con otro fármaco que se dirija a un punto de control como CTLA4 (Ipilimumab/Yervoy) o moléculas pequeñas. Los inhibidores de PD-1 podrían ser pembrolizumab (Keytruda) o nivolumab (Opdivo). El modulador de PD-L1 o agente terapéutico podría ser Atezolizumab (Tecentriq), Avelumab (Bavencio), Durvalumab (Imfinzi), CA-170, Ipilimumab, Tremelimumab, Nivolumab, Pembrolizumab, Pidilizumab, BMS935559, GVAXMPDL3280A, MEDI4736, MSB0010718C, MDX-1105/BMS-936559, AMP-224, MEDI0680. La terapia puede comprender la administración de agentes que se dirijan a y/o modulen el interferón gamma o la vía JAK-START
El agente terapéutico puede ser cualquiera de dichos agentes descritos en cualquier tabla en el presente documento o puede apuntar a cualquier 'objetivo' descrito en el presente documento, incluida cualquier proteína descrita en el presente documento. Se entiende que cualquier agente que se divulgue en una combinación debe considerarse también como divulgado para su administración individual.
Hiperprogresores
La hiperprogresión del cáncer puede ser reconocida de manera sencilla por un experto en la materia, y es preferiblemente un aumento en la progresión de la enfermedad del cáncer tras la administración de inmunoterapia y/o una respuesta adversa a la inmunoterapia en un individuo con cáncer. Se puede medir utilizando cualquier parámetro adecuado para la enfermedad, como por ejemplo un aumento de dos veces en el tamaño del tumor. Normalmente se trata de un aumento de más del 50% en la carga tumoral dentro de los 60 días posteriores a la administración de inmunoterapia. En un aspecto, los hiperprogresores pueden definirse como aquellos que tienen menos de 60 días libres de progresión después de la administración de inmunoterapia y/o una supervivencia general de menos de 150 días después de la inmunoterapia.
Elección del tratamiento
Con base en los resultados de las pruebas realizadas mediante el método de la invención se pueden tomar decisiones acerca de qué tratamientos se administrarán o no al individuo.
Si se determina que una persona responde a la inmunoterapia, se le podría administrar cualquier inmunoterapia mencionada en el presente documento. En un aspecto, si se descubre que un individuo no responde, se le puede administrar una terapia combinada, tal como cualquier terapia combinada enumerada en el presente documento. Normalmente, una terapia combinada comprende un anticuerpo y una molécula pequeña.
Los datos de los cuadros que figuran en este documento
Las Tablas 1, 2 y 8 muestran marcadores específicos que pueden usarse para detectar el estado de respuesta. Su presencia o ausencia puede utilizarse en dicha detección (es decir, son marcadores "diseminadores"). Las tablas 1 y 8 muestran marcadores que detectan la respuesta a la inmunoterapia, y la tabla muestra cuáles están vinculados a la respuesta y cuáles están vinculados a la falta de respuesta. En la Tabla 2 se muestran los marcadores que detectan a los hiperprogresores, y las tablas muestran cuáles están relacionados con ser un hiperprogresor y cuáles están relacionados con una enfermedad estable.
Los marcadores se definen utilizando secuencias de sonda (que detectan un producto ligado como se define en el presente documento). Los dos primeros conjuntos de posiciones de inicio y fin muestran las posiciones de la sonda, y los dos segundos conjuntos de posiciones de inicio y fin muestran la región de 4 kb relevante.
La siguiente información se proporciona en la tabla de datos de la sonda:
RP - Suma las estadísticas del producto de rango evaluadas por cada interacción cromosómica.
FC - Frecuencia de interacción (positiva o negativa).
Pfp - porcentaje estimado de predicciones falsas positivas (pfp), considerando ambas interacciones cromosómicas positivas y negativas.
Pval - valores p estimados para cada CCS, siendo positivos y negativos.
Valor p ajustado (FDR) - valor p ajustado de la tasa de descubrimientos falsos.
Tipo - en qué estado se encuentra el bucle.
La estimación basada en permutación simple se utiliza para determinar la probabilidad de que se observe un valor RP dado o mejor en un experimento aleatorio. Esto tiene las siguientes etapas:
1. Generar p permutaciones de k listas de rangos de longitud n.
2. Calcular los productos de rango de los n CCS en las p permutaciones.
3. Contar (c) cuántas veces los productos de rango del CCS en las permutaciones son menores o iguales al producto de rango observado. Establecer c en este valor.
4. Calcular el valor esperado promedio para el producto de rango mediante: Erp(g)=c/p.
5. Calcular el porcentaje de falsos positivos como: pfp (g)=Erp(g)/rank (g) donde rank(g) es el rango de CCS g en una lista de todos los n CCS ordenados por RP creciente.
La estadística de producto de rango clasifica las interacciones cromosómicas según las intensidades dentro de cada microarray y calcula el producto de estos rangos a través de múltiples micromatrices. Esta técnica puede identificar interacciones cromosómicas que se detectan consistentemente entre las interacciones cromosómicas más diferenciales en una serie de microarreglos replicados. Cuando el valor p es 0, esto indica que hay muy poca variación en el producto de rango del CCS entre las muestras; este es un buen ejemplo de la relación señal-ruido y el tamaño del efecto del CCS. Donde el valor p es 0 y pfp es 0, esto significa que el producto de rango permutado no difiere del producto de rango observado real. Estos métodos se describen Breitling R y Herzyk P (2005) Métodos basados en rango como una alternativa no paramétrica de la prueba t para el análisis de datos de microarrays biológicos. J Bioinf Comp Biol 3, 1171-1189.
La FC indica la prevalencia del marcador en cada comparación, 2 significa el doble del promedio de la prueba, 1,5 significa 1,5 sobre el promedio de la prueba, etc., y por lo tanto la FC indica el peso de un marcador para el fenotipo/grupo. El valor FC se puede utilizar para dar una indicación de cuántos marcadores se necesitan para una prueba altamente efectiva.
Las sondas están diseñadas para estar a 30 pb del sitio Taq1. En el caso de la PCR, los cebadores de la PCR suelen estar diseñados para detectar el producto ligado, pero su ubicación con respecto al sitio Taq1 varía. Ubicaciones de las sondas:
Inicio 1 - 30 bases aguas arriba del sitio Taql en el fragmento 1
Extremo 1 - Sitio de restricción Taql en el fragmento 1
Inicio 2 - Sitio de restricción Taql en el fragmento 2
Extremo 2 - 30 bases aguas abajo del sitio Taql en el fragmento 2
Ubicación de la secuencia de 4kb:
Inicio 1 - 4000 bases aguas arriba del sitio Taql en el fragmento 1
Extremo 1 - Sitio de restricción Taql en el fragmento 1
Inicio 2 - Sitio de restricción Taql en el fragmento 2
Extremo 2 - 4000 bases aguas abajo del sitio Taql en el fragmento 2
Tipos de detección
Cuando la detección se realiza utilizando una sonda, normalmente se puede detectar la secuencia de ambas regiones de la sonda (es decir, de ambos sitios de la interacción cromosómica). En aspectos preferidos se utilizan en el proceso sondas que comprenden o consisten en la misma secuencia o una secuencia complementaria a una sonda que se muestra en cualquier tabla. En algunos aspectos se utilizan sondas que comprenden una secuencia que es homóloga a cualquiera de las secuencias de sonda que se muestran en las tablas.
El enfoque adoptado para identificar marcadores y paneles de marcadores
La invención descrita en el presente documento se relaciona con el perfil de conformación cromosómica y la arquitectura 3D como una modalidad reguladora por derecho propio, estrechamente vinculada al fenotipo. El descubrimiento de biomarcadores se basó en anotaciones mediante reconocimiento de patrones y cribado en cohortes representativas de muestras clínicas que representan las diferencias en los fenotipos. Anotamos y examinamos partes significativas del genoma, en partes codificantes y no codificantes y en grandes extensiones de 5' y 3' no codificantes de genes conocidos, para identificar conformaciones cromosómicas condicionales consistentes y estadísticamente diseminadas, que por ejemplo se anclan en sitios no codificantes dentro (intrónicos) o fuera de marcos de lectura abiertos.
En la selección de los mejores marcadores nos guiamos por datos estadísticos y valores p para los marcadores principales. Las conformaciones cromosómicas seleccionadas y validadas dentro de la firma son entidades estratificadoras diseminadoras por derecho propio, independientemente de los perfiles de expresión de los genes utilizados en la referencia.
Se puede realizar más trabajo sobre las modalidades reguladoras relevantes, como los SNP en los sitios de anclaje, los cambios en los perfiles de transcripción genética y los cambios a nivel de H3K27ac.
Estamos abordando la cuestión de las diferencias en los fenotipos clínicos y su estratificación desde la base de la biología fundamental y los controles epigenéticos sobre el fenotipo, incluido, por ejemplo, el marco de la red de regulación. Como tal, para ayudar a la estratificación, se pueden capturar cambios en la red y esto se hace preferiblemente a través de firmas de varios biomarcadores, por ejemplo, siguiendo un algoritmo de aprendizaje automático para la reducción de marcadores que incluye la evaluación de la cantidad óptima de marcadores para estratificar la cohorte de prueba con un ruido mínimo. Esto puede terminar con 3-20 marcadores.
La selección de marcadores para los paneles puede realizarse mediante el rendimiento estadístico de validación cruzada (y no, por ejemplo, mediante la relevancia funcional de los genes vecinos, utilizados para el nombre de referencia).
Un panel de marcadores (con nombres de genes adyacentes) es un producto de la selección agrupada a partir de la evaluación en partes significativas del genoma, analizando de manera no sesgada los poderes de difusión estadística en 14.000-60.000 sitios EpiSwitch anotados en partes significativas del genoma. No debe percibirse como una captura personalizada de una conformación cromosómica en un gen de valor funcional conocido para la cuestión de la estratificación. El número total de sitios de interacción cromosómica es 1,2 millones, por lo que el número potencial de combinaciones es 1,2 millones elevado a 1,2 millones. Sin embargo, el enfoque que hemos seguido permite identificar las interacciones cromosómicas relevantes.
Los marcadores específicos que proporciona esta aplicación han pasado la selección, estando asociados estadísticamente (significativamente) con la condición o subgrupo. Esto es lo que demuestran los datos de la tabla correspondiente. Cada marcador puede verse como la representación de un evento de epigenética biológica como parte de la desregulación de la red que se manifiesta en la condición relevante. En términos prácticos, significa que estos marcadores prevalecen en todos los grupos de pacientes en comparación con los controles. En promedio, a modo de ejemplo, un marcador individual puede estar presente típicamente en el 80 % del grupo de respondedores relevante y en el 10 % de los controles y, por lo tanto, los resultados de la prueba mediante el método de la invención son fáciles de interpretar y esencialmente equivalen a una "lectura binaria".
La simple adición de todos los marcadores no representaría directamente las interrelaciones de la red entre algunas de las desregulaciones. en el presente documento es donde puede utilizarse el análisis de biomarcadores multivariados estándar GLMNET (paquete R). El paquete GLMNET ayuda a identificar la interdependencia entre algunos de los marcadores, que reflejan su papel conjunto en el logro de desregulaciones que conducen al fenotipo de la enfermedad. El modelado y posterior prueba de los marcadores con las puntuaciones GLMNET más altas no solo permite identificar el número mínimo de marcadores que identifica con precisión la cohorte de pacientes, sino también el número mínimo que ofrece la menor cantidad de resultados falsos positivos en el grupo de control de pacientes, debido al ruido estadístico de fondo de baja prevalencia en el grupo de control. Normalmente, un grupo (combinación) de marcadores seleccionados (por ejemplo, de 3 a 11) ofrece el mejor equilibrio entre la sensibilidad y la especificidad de la detección, lo que surge en el contexto del análisis multivariado a partir de las propiedades individuales de todos los marcadores estadísticamente significativos seleccionados para la afección.
Las tablas que se incluyen en el presente documento muestran los nombres de referencia de las sondas de matriz (60-mer) para el análisis de matriz que se superpone a la unión entre los sitios de interacción de largo alcance, el número de cromosomas y el inicio y el final de dos fragmentos cromosómicos que entran en yuxtaposición. En un aspecto preferido, los 11 marcadores de la Tabla 1 están tipificados. En otro aspecto preferido, los 11 marcadores de la Tabla 2 están tipificados. En otro aspecto preferido, los 8 marcadores de la Tabla 8 están tipificados.
Muestras y tratamiento de muestras
El proceso de la invención se llevará a cabo normalmente sobre una muestra. La muestra puede obtenerse en un punto de tiempo definido, por ejemplo en cualquier punto de tiempo definido en el presente documento. La muestra contendrá normalmente ADN del individuo. Normalmente contendrá células. En un aspecto, la muestra se obtiene por medios mínimamente invasivos y puede ser, por ejemplo, una muestra de sangre. El ADN puede extraerse y cortarse con una enzima de restricción estándar. Esto puede predeterminar qué conformaciones cromosómicas se conservan y se detectarán con las plataformas EpiSwitch™ . Debido a la sincronización de las interacciones cromosómicas entre los tejidos y la sangre, incluida la transferencia horizontal, se puede usar una muestra de sangre para detectar las interacciones cromosómicas en los tejidos, como los tejidos relevantes para la enfermedad.
Aspectos preferidos para la preparación de muestras y la detección de interacciones cromosómicas
Se describen en este documento métodos para preparar muestras y detectar conformaciones cromosómicas. Pueden utilizarse versiones optimizadas (no convencionales) de estos procesos, por ejemplo, como se describe en esta sección.
Normalmente, la muestra contendrá al menos 2 *105 células. La muestra puede contener hasta 5 * 105 células. En un aspecto, la muestra contendrá de 2 * 105 a 5,5 * 105 células.
Se describe en este documento la reticulación de interacciones cromosómicas epigenéticas presentes en el locus cromosómico. Esto puede realizarse antes de que se produzca la lisis celular. La lisis celular puede realizarse durante 3 a 7 minutos, como, por ejemplo, de 4 a 6 o aproximadamente 5 minutos. En algunos aspectos, la lisis celular se realiza durante al menos 5 minutos y durante menos de 10 minutos.
En este documento se describe la digestión de ADN con una enzima de restricción. Normalmente, la restricción de ADN se realiza a una temperatura de aproximadamente 55 °C a aproximadamente 70 °C, como, por ejemplo, aproximadamente 65 °C, durante un período de aproximadamente 10 a 30 minutos, como aproximadamente 20 minutos.
Preferiblemente se utiliza una enzima de restricción de corte frecuente que da lugar a fragmentos de ADN ligado con un tamaño medio de fragmento de hasta 4000 pares de bases. Opcionalmente, la enzima de restricción da como resultado fragmentos de ADN ligado que tienen un tamaño de fragmento promedio de aproximadamente 200 a 300 pares de bases, como aproximadamente 256 pares de bases. En un aspecto, el tamaño típico del fragmento es de 200 pares de bases a 4.000 pares de bases, como de 400 a 2.000 o de 500 a 1.000 pares de bases. En un aspecto del proceso EpiSwitch no se realiza un paso de precipitación del ADN entre el paso de digestión de restricción del ADN y el paso de ligación del ADN.
Se describe en este documento la ligadura de ADN. normalmente, la ligadura del ADN se realiza durante 5 a 30 minutos, tal como aproximadamente 10 minutos.
La proteína de la muestra puede digerirse enzimáticamente, por ejemplo utilizando una proteinasa, opcionalmente Proteinasa K. La proteína puede digerirse enzimáticamente durante un periodo de entre 30 minutos y 1 hora, por ejemplo durante unos 45 minutos. En un aspecto, después de la digestión de la proteína, por ejemplo la digestión con Proteinasa K, no hay reversión de enlaces cruzados ni paso de extracción de ADN con fenol.
En un aspecto, la detección por PCR es capaz de detectar una sola copia del ácido nucleico ligado, preferiblemente con una lectura binaria de presencia/ausencia del ácido nucleico ligado.
La Figura 1 muestra un proceso preferido para detectar interacciones cromosómicas.
Procesos y usos de la invención
El proceso de la invención puede describirse de diferentes maneras. Puede describirse como un proceso para producir uno o más ácidos nucleicos ligados que comprende (i) reticularin vitrode regiones cromosómicas que se han unido en una interacción cromosómica; (ii) someter dicho ADN reticulado a corte o escisión por digestión de restricción; y (iii) ligar dichos extremos de ADN reticulado escindido para formar uno o más ácidos nucleicos ligados, en donde opcionalmente la detección del ácido nucleico ligado puede usarse para determinar el estado cromosómico en un locus, y en donde preferiblemente las interacciones cromosómicas pueden ser 1, 3, 5, 8 o todas las interacciones cromosómicas de la Tabla 1 o 2. En este proceso, las interacciones cromosómicas pueden ser 1, 3, 5 u 8 de las interacciones cromosómicas de la Tabla 8.
Homólogos
En el presente documento se hace referencia a homólogos de secuencias de polinucleótidos / ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN). Dichos homólogos tienen normalmente al menos un 70 % de homología, preferiblemente al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de homología, por ejemplo, en una región de al menos 10, 15, 20, 30, 100 o más nucleótidos contiguos, o a través de la porción del ácido nucleico que es de la región del cromosoma implicada en la interacción cromosómica. La homología se puede calcular sobre la base de la identidad de los nucleótidos (a veces denominada "homología dura").
Por lo tanto, en un aspecto particular, los homólogos de secuencias de polinucleótidos / ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN) se mencionan en el presente documento por referencia al porcentaje de identidad de secuencia. Dichos homólogos tienen normalmente al menos un 70 % de identidad de secuencias, preferiblemente al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencias, por ejemplo, en una región de al menos 10, 15, 20, 30, 100 o más nucleótidos contiguos, o a través de la porción del ácido nucleico que es de la región del cromosoma implicada en la interacción cromosómica. Los homólogos pueden tener al menos un 70 % de identidad de secuencia, preferiblemente al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia en toda la sonda, el cebador o el par de cebadores.
Por ejemplo, el paquete UWGCG proporciona el programa BESTFIT, que puede utilizarse para calcular la homología y/o el % de identidad de secuencia (por ejemplo, si se utiliza con la configuración predeterminada) (Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395). Los algoritmos PILEUP y BLAST pueden utilizarse para calcular la homología y/o el % de identidad de secuencias y/o alinear secuencias (como la identificación de secuencias equivalentes o correspondientes (normalmente en su configuración por defecto)), por ejemplo como se describe en Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-300; Altschul, S, F et al (1990) J Mol Biol 215:403-10.
El software para la realización del análisis con BLAST se encuentra disponible públicamente a través del Centro Nacional para la Información Biotecnológica. Este algoritmo implica identificar primero los pares de secuencias con puntuación alta (HSP, por sus siglas en inglés) mediante la identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia problema que corresponde o satisface alguna puntuación umbral T valorada de forma positiva cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. La T hace referencia a la puntuación umbral de la palabra más próxima (Altschulet al,supra). Estos resultados iniciales de la palabra más próxima actúan como punto de partida para iniciar las búsquedas para encontrar HSP más largos que las contengan. Los resultados de la palabra se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta el grado en que pueda incrementarse la puntuación de alineamiento acumulativa. La extensión de los resultados de la palabra en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de alineamiento acumulativa desciende por la cantidad X del valor máximo logrado; la puntuación acumulativa disminuye a cero o menos, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de residuos de puntuación negativa; o se alcanza el final de alguna secuencia. Los parámetros W5 T y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y la velocidad del alineamiento. El programa BLAST utiliza por defecto una longitud de palabra (W) de 11, la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff, (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89: 10915-10919) alineaciones (B) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5, N = 4 y una comparación de ambas hebras.
El algoritmo BLAST realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias; véase, por ejemplo, Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787. Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la menor probabilidad de suma (P(N)), la que es una indicación de la probabilidad de que una coincidencia entre dos secuencias de polinucleótidos ocurra por casualidad. Por ejemplo, se considera que una secuencia es similar a otra secuencia si la menor probabilidad de suma al comparar la primera secuencia a la segunda secuencia es menor que aproximadamente 1; preferiblemente menor que aproximadamente 0,1; más preferiblemente menor que aproximadamente 0,01; y lo más preferiblemente menor que aproximadamente 0,001.
La secuencia homóloga difiere típicamente en 1, 2, 3, 4 o más bases, como por ejemplo menos de 10, 15 o 20 bases (que pueden ser sustituciones, deleciones o inserciones de nucleótidos). Estos cambios pueden medirse en cualquiera de las regiones mencionadas anteriormente en relación con el cálculo de la homología y/o el porcentaje de identidad de secuencia.
La homología de un "par de cebadores" se puede calcular, por ejemplo, considerando las dos secuencias como una sola secuencia (como si las dos secuencias estuvieran unidas) con el propósito de luego compararlas con el otro par de cebadores que nuevamente se considera como una sola secuencia.
El umbral de detección
Se ha descubierto que los marcadores que se divulgan en el presente documento son "marcadores de difusión" capaces de determinar el estado de respuesta y las tablas 1 y 2 muestran en qué grupo de respuesta está presente cada marcador (respondedor/no respondedor a la inmunoterapia o hiperprogresor/enfermedad estable).
En términos prácticos, significa que estos marcadores prevalecen en todo el grupo de respondedores relevante en comparación con los controles (como lo muestra el valor FC, por ejemplo). En promedio, a modo de ejemplo, un marcador individual puede estar presente típicamente en el 80 % del grupo de respondedores relevantes y en el 10 % de los controles. Al evaluar a un individuo, el resultado será una combinación de interacciones cromosómicas "presentes" y "ausentes" para cada uno de los marcadores mostrados en las Tablas 1 o 2, lo que permite determinar el grupo de respuesta del individuo. Normalmente, la presencia/ausencia de al menos 8 de 11 marcadores, en comparación con el resultado "ideal" mostrado en la tabla, permite asignar al individuo a un grupo de respuesta.Agentes terapéuticos y tratamientos
Esta sección es relevante tanto para las inmunoterapias que definen el grupo de respuesta del individuo como también para la terapia que se puede administrar a los individuos en función de los resultados del método de prueba de la invención.
Divulgamos agentes terapéuticos para su uso en la prevención o tratamiento de cualquier condición mencionada en el presente documento. Esto puede incluir administrar a un individuo que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz del agente. Divulgamos el uso del agente en la fabricación de un medicamento para prevenir o tratar la afección, por ejemplo, en individuos evaluados mediante el método de la invención.
La formulación del agente dependerá de la naturaleza del agente. El agente se proporcionará en forma de una composición farmacéutica que contiene el agente y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Los portadores y diluyentes adecuados incluyen soluciones salinas isotónicas, por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato. Las composiciones de dosificación oral típicas incluyen comprimidos, cápsulas, soluciones líquidas y suspensiones líquidas. El agente puede formularse para administración parenteral, intravenosa, intramuscular, subcutánea, transdérmica u oral.
La dosis de un agente puede determinarse de acuerdo a diversos parámetros, especialmente de acuerdo a la sustancia utilizada; la edad, el peso y la condición del individuo a tratar; la vía de administración; y el régimen requerido. Un médico podrá determinar la vía de administración y la dosis requeridas para cualquier agente en particular. Una dosis adecuada puede ser, sin embargo, de 0,1 a 100 mg/kg de peso corporal, tal como por ejemplo de 1 a 40 mg/kg de peso corporal, que se tomará de 1 a 3 veces al día.
Divulgamos un agente inmunoterapéutico, preferiblemente seleccionado de cualquiera de las tablas 4 a 6, para su uso en un método de tratamiento de un individuo identificado como sensible a la inmunoterapia, comprendiendo opcionalmente dicho método:
- identificar si un individuo responde a la inmunoterapia mediante el método de la invención, y
- administrar a cualquier individuo identificado como sensible a la inmunoterapia dicho agente.
Divulgamos (i) una inmunoterapia combinada o (ii) un agente terapéutico que no es una inmunoterapia para su uso en un método de tratamiento de un individuo identificado como no respondedor a la inmunoterapia, comprendiendo opcionalmente dicho método:
- identificar si un individuo responde a la inmunoterapia mediante el método de la invención, y
- administrar a cualquier individuo identificado como no respondedor (i) y/o (ii), en donde opcionalmente la terapia de combinación de (i) es cualquier terapia de combinación que se muestra en la tabla 4 o que comprende al menos un agente elegido de las tablas 4 y 5.
Detección de agentes terapéuticos
Divulgamos un método de detección para identificar agentes terapéuticos para el cáncer que comprende determinar si un agente candidato es capaz de provocar un cambio en todas las interacciones cromosómicas que se muestran en la Tabla 1 y/o la Tabla 2. Este método de detección puede comprender determinar si un agente candidato es capaz de provocar un cambio en todas las interacciones cromosómicas que se muestran en la Tabla 8.
Ácidos nucleicos
Divulgamos ciertos ácidos nucleicos, incluidas sondas y cebadores. Preferiblemente los ácidos nucleicos son ADN. Se entiende que cuando se proporciona una secuencia específica, la invención puede utilizar la secuencia complementaria según se requiera en el aspecto particular.
Los cebadores o sondas que se muestran en la Tabla 1 o 2 pueden usarse en la invención. En un aspecto, se utilizan sondas o cebadores que comprenden cualquiera de: las secuencias mostradas en la Tabla 1 o 2; o fragmentos y/o homólogos de cualquier secuencia mostrada en la Tabla 1 o 2. Los cebadores o sondas que se muestran en la Tabla 8 se pueden utilizar en la invención. En un aspecto, se utilizan sondas o cebadores que comprenden cualquiera de: las secuencias que se muestran en la Tabla 8; o fragmentos y/o homólogos de cualquier secuencia que se muestra en la Tabla 8.
Ácidos nucleicos etiquetados y patrón de hibridación
Los ácidos nucleicos mencionados en este documento pueden etiquetarse, preferiblemente usando una etiqueta independiente tal como un fluoróforo (molécula fluorescente) o una etiqueta radiactiva que ayuda a la detección de una hibridación exitosa. Algunas etiquetas pueden detectarse bajo la luz ultravioleta.
Formas de la sustancia mencionada en este documento
Cualquiera de las sustancias, como los ácidos nucleicos o los agentes terapéuticos, aquí mencionadas puede estar en forma purificada o aislada. Pueden tener una forma distinta a la que se encuentran en la naturaleza, por ejemplo, pueden estar presentes en combinación con otra sustancia con la que no se dan en la naturaleza. Los ácidos nucleicos (incluidas porciones de secuencias definidas en este documento) pueden tener secuencias diferentes a las que se encuentran en la naturaleza, por ejemplo, tener al menos 1, 2, 3, 4 o más cambios de nucleótidos en la secuencia como se describe en la sección sobre homología. Los ácidos nucleicos pueden tener secuencia heteróloga en el extremo 5' o 3'. Los ácidos nucleicos pueden ser químicamente diferentes de los que se encuentran en la naturaleza, por ejemplo, pueden estar modificados de alguna manera, pero preferiblemente aún son capaces de realizar apareamientos de bases Watson-Crick. Cuando sea apropiado, los ácidos nucleicos se proporcionarán en forma bicatenaria o monocatenaria. La invención proporciona todas las secuencias específicas de ácido nucleico mencionadas en el presente documento en forma de cadena simple o doble, y por lo tanto incluye la cadena complementaria a cualquier secuencia que se divulgue.
Se divulga un kit para llevar a cabo cualquier procedimiento de la invención, incluyendo la detección de una interacción cromosómica relacionada con el pronóstico. Un kit de este tipo puede incluir un agente de unión específico capaz de detectar la interacción cromosómica relevante, tal como agentes capaces de detectar un ácido nucleico ligado generado mediante procesos de la invención. Los agentes preferidos presentes en el kit incluyen sondas capaces de hibridar con el ácido nucleico ligado o pares de cebadores, por ejemplo como se describe en el presente documento, capaces de amplificar el ácido nucleico ligado en una reacción de PCR. Los agentes preferidos incluyen cualquiera de los cebadores y sondas específicos descritos en el presente documento y/o homólogos de dichos cebadores y sondas.
Revelamos un dispositivo que es capaz de detectar las interacciones cromosómicas relevantes. El dispositivo comprende preferiblemente cualquier agente de unión específico, sonda o par de cebadores capaces de detectar la interacción cromosómica, tal como cualquier agente, sonda o par de cebadores descritos en el presente documento.
Proceso de detección
En un aspecto, la detección cuantitativa de la secuencia ligada que es relevante para una interacción cromosómica se lleva a cabo utilizando una sonda que es detectable tras la activación durante una reacción de PCR, en donde dicha secuencia ligada comprende secuencias de dos regiones cromosómicas que se unen en una interacción cromosómica epigenética, en donde dicho proceso comprende poner en contacto la secuencia ligada con la sonda durante una reacción de PCR y detectar el grado de activación de la sonda, y en donde dicha sonda se une al sitio de ligadura. El proceso normalmente permite detectar interacciones particulares de manera compatible con MIQE utilizando una sonda de hidrólisis fluorescente de doble marcado.
La sonda generalmente está marcada con una etiqueta detectable que tiene un estado inactivo y activo, de modo que solo se detecta cuando se activa. El grado de activación estará relacionado con la cantidad de plantilla (producto de ligadura) presente en la reacción de PCR. La detección puede llevarse a cabo durante toda o parte de la PCR, por ejemplo durante al menos el 50 % o el 80 % de los ciclos de la PCR.
La sonda puede comprender un fluoróforo unido covalentemente a un extremo del oligonucleótido, y un extintor unido al otro extremo del nucleótido, de modo que la fluorescencia del fluoróforo es extinguida por el extintor. En un aspecto, el fluoróforo está unido al extremo 5' del oligonucleótido y el extintor está unido covalentemente al extremo 3' del oligonucleótido. Los fluoróforos que se pueden utilizar en el proceso de la invención incluyen FAM, TET, JOE, Yakima Yellow, HEX, Cyanine3, ATTO 550, TAMRA, ROX, Texas Red, Cyanine 3.5, LC610, LC 640, ATTO 647N, Cyanine 5, Cyanine 5.5 y ATTO 680. Los extintores que se pueden utilizar con el fluoróforo apropiado incluyen TAM, BHQ1, DAB, Eclip, BHQ2 y BBQ650, donde opcionalmente dicho fluoróforo se selecciona entre HEX, Texas Red y FAM. Las combinaciones preferidas de fluoróforo y extintor incluyen FAM con BHQ1 y Texas Red con BHQ2.
Uso de la sonda en un ensayo qPCR
Las sondas de hidrólisis de la invención normalmente están optimizadas por gradiente de temperatura con controles negativos adaptados a la concentración. Preferiblemente se optimizan las reacciones de PCR de una sola etapa. Más preferiblemente es calcular una curva estándar. Una ventaja de utilizar una sonda específica que se une a través de la unión de la secuencia ligada es que se puede lograr la especificidad de la secuencia ligada sin utilizar un enfoque de PCR anidada. Los procesos descritos en el presente documento permiten una cuantificación precisa y exacta de dianas con un número de copias bajo. La secuencia ligada objetivo se puede purificar, por ejemplo, en gel, antes de la optimización del gradiente de temperatura. La secuencia ligada diana se puede secuenciar. Preferiblemente, las reacciones de PCR se realizan utilizando aproximadamente 10 ng, o 5 a 15 ng, o 10 a 20 ng, o 10 a 50 ng, o 10 a 200 ng de ADN plantilla. Los cebadores directos e inversos están diseñados de modo que un cebador se une a la secuencia de una de las regiones cromosómicas representadas en la secuencia de a Dn ligada, y el otro cebador se une a otra región cromosómica representada en la secuencia de ADN ligada, por ejemplo, siendo complementario a la secuencia.
Elección de la diana de ADN ligado
La invención incluye seleccionar cebadores y una sonda para usar en un proceso de PCR como se define en el presente documento que comprende seleccionar cebadores en función de su capacidad para unirse y amplificar la secuencia ligada y seleccionar la secuencia de sonda en función de las propiedades de la secuencia diana a la que se unirá, en particular la curvatura de la secuencia diana.
Las sondas generalmente se diseñan/seleccionan para unirse a secuencias ligadas que son fragmentos de restricción yuxtapuestos que abarcan el sitio de restricción. En un aspecto de la invención, se calcula la curvatura prevista de posibles secuencias ligadas relevantes para una interacción cromosómica particular, por ejemplo utilizando un algoritmo específico al que se hace referencia en el presente documento. La curvatura se puede expresar en grados por vuelta helicoidal, por ejemplo 10,5° por vuelta helicoidal. Las secuencias ligadas se seleccionan para la orientación donde la secuencia ligada tiene un pico de propensión a la curvatura de al menos 5° por vuelta helicoidal, típicamente al menos 10°, 15° o 20° por vuelta helicoidal, por ejemplo 5° a 20° por vuelta helicoidal. Preferiblemente, la puntuación de propensión a la curvatura por vuelta helicoidal se calcula para al menos 20, 50, 100, 200 o 400 bases, tal como por ejemplo para 20 a 400 bases aguas arriba y/o aguas abajo del sitio de ligadura. Así, en un aspecto, la secuencia diana en el producto ligado tiene cualquiera de estos niveles de curvatura. Las secuencias diana también se pueden elegir en función de la energía libre de estructura termodinámica más baja.
Aspectos particulares
En aspectos particulares, ciertas interacciones cromosómicas no están tipificadas, por ejemplo, cualquier interacción específica mencionada no mencionada en el presente documento. En algunos aspectos solo se escriben los marcadores de la Tabla 1 o la Tabla 2 y no se escribe ningún otro marcador. En algunos aspectos, sólo se escriben los marcadores de la Tabla 2 o la Tabla 8 y no se escriben otros marcadores. En algunos aspectos, sólo se escriben los marcadores de la Tabla 1 y la Tabla 2 y no se escriben otros marcadores. En algunos aspectos, sólo se escriben los marcadores de la Tabla 2 y la Tabla 8 y no se escriben otros marcadores.
Técnicas utilizadas para identificar las interacciones cromosómicas relevantes específicas
La tecnología de la plataforma EpiSwitch™ detecta firmas reguladoras epigenéticas de cambios regulatorios entre condiciones normales y anormales en los loci. La plataforma EpiSwitch™ identifica y monitorea el nivel epigenético fundamental de la regulación genética asociada con las estructuras reguladoras de alto orden de los cromosomas humanos, también conocidas como firmas de conformación cromosómica. Las firmas cromosómicas son una etapa primaria distintiva en una cascada de desregulación genética. Son biomarcadores de alto orden con un conjunto único de ventajas frente a las plataformas de biomarcadores que utilizan biomarcadores epigenéticos y de expresión genética tardíos, como la metilación del ADN y el perfil de ARN.
Ensayo de matriz EpiSwitch™
Las plataformas EpiSwitch™ de cribado de arrays personalizados vienen en 4 densidades de, 15K, 45K, 100K y 250K conformaciones cromosómicas únicas, cada fragmento quimérico se repite en los arrays 4 veces, lo que hace que las densidades efectivas sean 60K, 180K, 400K y 1 millón respectivamente.
Matrices EpiSwitch™ diseñadas a medida
La matrix 15K EpiSwitch™ puede analizar todo el genoma, incluidos unos 300 loci interrogados con Tecnología de descubrimiento de biomarcadores EpiSwitch ™. La matriz EpiSwitch™ está construida sobre la plataforma de micromatrices CGH personalizadas Agilent SurePrint G3; esta tecnología ofrece 4 densidades, 60K, 180K, 400K y 1 millón de sondas. La densidad por matriz se reduce a 15K, 45K, 100K y 250K ya que cada sonda EpiSwitch™ se presenta como cuadruplicado, lo que permite la evaluación estadística de la reproducibilidad. El número promedio de marcadores EpiSwitch™ potenciales explorados por loci genético es 50, por lo tanto, los números de loci que se pueden investigar son 300, 900, 2000 y 5000.
Canalización de matriz personalizada EpiSwitch™
La matriz EpiSwitch™ es un sistema de color dual con un conjunto de muestras, después de la generación de la biblioteca EpiSwitch™ , etiquetadas en Cy5 y el otro conjunto de muestras (controles) etiquetadas para comparar/analizar en Cy3. Las matrices se escanean usando el escáner Agilent SureScan y los rasgos resultantes se extraen usando el software Agilent Feature Extraction. Luego, los datos se procesan usando los scripts de procesamiento de matrices EpiSwitch™ en R. Las matrices se procesan usando paquetes de color dual estándar en Bioconductor en R: Limma*. La normalización de las matrices se hace mediante la función normalizada dentro de matrices en Limma* y esto se aplica a los controles positivos Agilent en chip y a los controles positivos EpiSwitch™. Los datos se filtran en función de las llamadas de Agilent Flag, se eliminan las sondas de control de Agilent y se promedian las sondas técnicas replicadas para poder analizarlas mediante Limma*. Las sondas se modelan en función de su diferencia entre los dos escenarios que se comparan y luego se corrigen usando la tasa de descubrimiento falso. Las sondas con coeficiente de variación (CV) <=30 % que son <=-1,1 o =>1,1 y pasan el valor p de FDR p <= 0,1 se usan para una evaluación adicional. Para reducir aún más el conjunto de sondas, se realiza un análisis factorial múltiple usando el paquete FactorMineR en R.
* Nota: LIMMA son modelos lineales y procesos bayesianos empíricos para evaluar la expresión diferencial en experimentos de micromatrices. Limma es un paquete R para el análisis de datos de expresión genética que surgen de microarrays o RNA-Seq.
El grupo de sondas se selecciona inicialmente en función de los parámetros de valor p ajustado, FC y CV <30 % (punto de corte arbitrario) para la selección final. Los análisis posteriores y la lista final se elaboran basándose únicamente en los dos primeros parámetros (valor p ajustado; FC).
Canalización estadística
Las matrices de detección de EpiSwitch™ se procesan usando el paquete analítico EpiSwitch™ en R para seleccionar marcadores EpiSwitch™ de alto valor para su traducción a la plataforma PCR EpiSwitch™ .
Etapa 1
Las sondas se seleccionan en función de su valor p corregido (tasa de falsos descubrimientos, FDR, por sus siglas en inglés), que es el producto de un modelo de regresión lineal modificado. Se seleccionan las sondas con un valor p inferior a <= 0,1 y luego se reducen aún más por su índice epigenético (ER), las sondas ER deben ser <= -1,1 o => 1,1 para poder seleccionarse para un análisis posterior. El último filtro es un coeficiente de variación (CV), las sondas deben estar por debajo de <= 0,3.
Etapa 2
Los 40 marcadores principales de las listas estadísticas se seleccionan en función de su ER para su selección como marcadores para la traducción de PCR. Los 20 marcadores principales con la mayor carga de ER negativa y los 20 marcadores principales con la mayor carga de ER positiva forman la lista.
Etapa 3
Los marcadores resultantes de la etapa 1, las sondas estadísticamente significativas, forman las bases del análisis de enriquecimiento usando enriquecimiento hipergeométrico (HE). Este análisis permite la reducción de marcadores de la lista de sondas significativas y, junto con los marcadores de la etapa 2, forma la lista de sondas traducidas a la plataforma PCR EpiSwitch™ .
Las sondas estadísticas son procesadas por HE para determinar qué ubicaciones genéticas tienen un enriquecimiento de sondas estadísticamente significativas, lo que indica qué ubicaciones genéticas son centros de diferencia epigenética.
Los loci enriquecidos más significativos basados en un valor p corregido se seleccionan para la generación de la lista de sondas. Se seleccionan las ubicaciones genéticas con un valor p inferior a 0,3 o 0,2. Las sondas estadísticas que asignan a estas ubicaciones genéticas, con los marcadores de la etapa 2, forman los marcadores de alto valor para la traducción por PCR de EpiSwitch™.
Diseño y procesamiento de matrices
Diseño de matriz
Los loci genéticos se procesan utilizando el software SII (actualmente v3.2) para:
- Extraer la secuencia del genoma en estos loci genéticos específicos (secuencia genética con 50 kb aguas arriba y 20 kb aguas abajo)
- Definir la probabilidad de que una secuencia dentro de esta región esté involucrada en CC
- Cortar la secuencia usando un RE específico
- Determinar qué fragmentos de restricción es probable que interactúen en una determinada orientación - Clasificar la probabilidad de que diferentes CC interactúen entre sí.
- Determinar el tamaño de la matriz y, por lo tanto, el número de posiciones de sonda disponibles (x) - Extraer las interacciones x/4.
- Para cada interacción, definir una secuencia de 30 pb hasta el sitio de restricción de la parte 1 y de 30 pb hasta el sitio de restricción de la parte 2. Verificar que esas regiones no sean repeticiones, si es así, exclúyalas y tome la siguiente interacción en la lista. Unión de ambos 30 pb para definir la sonda
- Crear una lista de x/4 sondas más las sondas de control definidas y replique 4 veces para crear una lista que se creará en la matriz
- Cargar la lista de sondas en el sitio web de diseño Sure de Agilent para la matriz CGH personalizada. - Usar el grupo de sondas para diseñar la matriz CGH personalizada de Agilent,
Procesamiento de matrices
-Procesar muestras usando el Procedimiento operativo estándar (SOP) EpiSwitch™ para la producción de plantillas.
- Limpiar con precipitación de etanol mediante procesamiento de matriz de laboratorio.
- Procesar muestras según el kit completo de etiquetado de ADN Agilent SureTag: CGH basado en matriz de oligonucleótidos de Agilent para análisis de ADN genómico Etiquetado enzimático para sangre, células o tejidos - Escanear utilizando el escáner Agilent C mediante el software de extracción de características de Agilent.Las firmas de biomarcadores EpiSwitch™demuestran alta robustez, sensibilidad y especificidad en la estratificación de fenotipos de enfermedades complejas. Esta tecnología aprovecha los últimos avances en la ciencia de la epigenética, el monitoreo y la evaluación de las firmas de conformación cromosómica como una clase altamente informativa de biomarcadores epigenéticos. Los métodos de investigación actuales implementados en el entorno académico requieren de 3 a 7 días para el procesamiento bioquímico del material celular con el fin de detectar CCS. Estos procedimientos tienen una sensibilidad y reproducibilidad limitadas y, además, no cuentan con el beneficio de la información específica que proporciona el paquete analíticoEpiSwitch™enla etapa de diseño.Identificación de marcadores in silico de matriz EpiSwitch™
Los sitios CCS en todo el genoma se evalúan directamente mediante la matrizEpiSwiteh™en muestras clínicas de cohortes de prueba para la identificación de todos los biomarcadores principales de estratificación relevantes. La plataforma de matriz EpiSwitch™ se utiliza para la identificación de marcadores debido a su capacidad de alto rendimiento y su capacidad para examinar grandes cantidades de loci rápidamente. La matriz utilizado fue el array Agilent custom-CGH, que permite interrogar marcadores identificados a través del softwarein silico.
PCR EpiSwitch™
Los marcadores potenciales identificados por la matrizEpiSwitch™se validan luego mediante PCR EpiSwitch™ o secuenciadores de ADN (es decir, Roche 454, Nanopore MiniON, etc.). Los principales marcadores de PCR estadísticamente significativos y con la mejor reproducibilidad se seleccionan para su posterior reducción al conjunto de firmasEpiSwitch™final y se validan en una cohorte independiente de muestras. La PCREpiSwitch™puede ser realizada por un técnico capacitado siguiendo un protocolo de procedimiento operativo estandarizado. Todos los protocolos y fabricación de reactivos se realizan bajo acreditación ISO 13485 y 9001 para garantizar la calidad del trabajo y la capacidad de transferencia de los protocolos.Las plataformas de biomarcadores de PCR EpiSwitch™y matricesEpiSwitch™son compatibles con el análisis tanto de sangre completa como de líneas celulares. Las pruebas son lo suficientemente sensibles para detectar anomalías en números muy bajos de copias utilizando pequeños volúmenes de sangre.
Uso de un clasificador
El método de la invención puede incluir el análisis de las interacciones cromosómicas identificadas en el individuo, por ejemplo utilizando un clasificador, lo que puede aumentar el rendimiento, tal como la sensibilidad o la especificidad. El clasificador normalmente es uno que ha sido "entrenado" con muestras de la población y dicho entrenamiento puede ayudar al clasificador a detectar cualquier grupo de respondedores mencionado en el presente documento.
Esta invención se ilustra mediante los siguientes:
Ejemplos
Ejemplo 1. Desarrollo de un conjunto de marcadores universales y un conjunto de marcadores para detectar hiperprogresores
Al trabajar con poblaciones de pacientes sometidos a inmunoterapia para el cáncer, se desarrollaron dos conjuntos de marcadores distintos: uno es un conjunto de marcadores universal que permite detectar la respuesta a la terapia en una variedad de cánceres y terapias específicas, y el segundo es un conjunto de marcadores que detecta hiperprogresores que nunca deberían ser tratados con tipos particulares de inmunoterapia.
Ahora hemos definido un panel especializado, distinto y optimizado de 11 biomarcadores (el conjunto universal), a partir de unos pocos cientos identificados en una matriz de detección original y probados posteriormente en cohortes específicas de pacientes. La característica única de cada uno de estos 11 marcadores es que cada uno de ellos es estadísticamente significativo (como parte del núcleo descubierto) en todos los casos de PD-1/PD-L1 en todas las indicaciones oncológicas evaluadas, lo que define un núcleo universal de respuesta/no respuesta al tratamiento por PD-1/PD-L1. Un clasificador que utiliza estos 11 marcadores funciona de manera muy sólida como una entidad de desempeño diferenciada en todas las cohortes de pacientes evaluadas.
Como antecedente del presente trabajo, la Figura 1 muestra el desempeño de la predicción basal de la respuesta/no respuesta para avelumab (PD-L1) en NSCLC en base a un amplio conjunto de marcadores evaluados.
Por el contrario, para el conjunto de 11 marcadores universales, la lista de todos los tratamientos por varios activos terapéuticos PD-1/PD-L1 y varias indicaciones oncológicas con las que hemos trabajado se muestra en la Lista A a continuación: - Activos PD-1 y PD-L1, como pembrolizumab, durvalumab, avelumab, atezolizumab, en melanoma, NSCLC, pulmón, CHC, vejiga, próstata, NPC, glándula parótida, sarcoma de partes blandas alveolares. El clasificador universal de 11 marcadores funciona bien en todas esas cohortes e identifica un perfil universal que proporciona una clasificación de referencia sólida para la respuesta/no respuesta, independientemente de qué tratamiento PD-1 o PD-L1 se haya utilizado exactamente y qué tipo de cáncer se haya probado exactamente. Capturamos con 11 marcadores una configuración de red sistémica epigenética propicia/no propicia muy específica de características que definen los resultados en terapias de puntos de control inmunitario.
Pasando al segundo conjunto de marcadores, un problema muy grave en la inmunoterapia contra el cáncer es la presencia constante de un subgrupo de pacientes que nunca deberían ser tratados con terapias PD-1/PD-L1. Se les llama hiperprogresores (o superprogresores), donde progresor significa progresión hacia la enfermedad. Estos pacientes reaccionan de manera muy diferente al tratamiento: la tasa de crecimiento del tumor se dispara y mueren muy rápidamente, esencialmente en cuestión de semanas.
Los hiperprogresores pueden definirse como pacientes que responden adversamente al tratamiento inmunooncológico de punto de control inmunológico al demostrar una reducción significativa ya sea en la supervivencia libre de progresión (como una medida de supervivencia en respuesta al tratamiento farmacológico) (SSP < 60 días) o en la supervivencia general (SG < 150 días).
Los ensayos promedio demuestran que entre 8-15 % de sus pacientes presentan un perfil de superprogresor. Actualmente, no existen medios para identificar y excluir a estos pacientes para prevenir efectos adversos graves de la inmunoterapia. En la mayoría de los estudios, los hiperprogresores se clasifican dentro del grupo más grande de no respondedores, también denominados progresores/enfermedad progresiva (EP). La mayoría de los que no responden son pacientes que no se benefician de la inmunoterapia. Hoy en día, el uso de inhibidores de puntos de control está justificado por los beneficios generales entre el porcentaje de pacientes que responden a la inmunoterapia (10-70 %).
Aquí utilizamos pacientes de cohortes de inmunoterapia, centrándonos en aquellos con una SSP/SG dentro del rango de hiperprogresores y aquellos más allá de esos límites de tiempo de supervivencia (marcados con S como "Estándar" en las diapositivas y tablas). Los marcadores de hiperprogresor identifican el perfil del paciente que se prevé que muestre una SSP/SG corta tras el tratamiento. En un grupo de 32 pacientes (brazos iguales de H y S) evaluados antes del tratamiento, cuando se comparó con la SSP y la SG después del tratamiento, 11 marcadores superprogresores predijeron correctamente 15 de 17 H (sensibilidad 0,88), 14/15 (especificidad 0,93), 15/16 (VPP 0,94), 14/16 (0,875).
Estos marcadores se seleccionan específicamente para identificar y excluir a los pacientes antes del tratamiento sobre la base de una reducción grave prevista en su supervivencia como consecuencia de la inmunoterapia. Esto podría verse como un subgrupo de una cohorte más grande de pacientes que no responden y que podrían identificarse y predecirse mediante el conjunto universal de 11 marcadores.
Si bien el presente trabajo se ha llevado a cabo en pacientes con melanoma, cáncer de pulmón, carcinoma hepatocelular (cáncer de hígado), vejiga, próstata, cáncer nasal, glándula parótida (cáncer de glándulas salivales), sarcoma de partes blandas alveolares (cáncer de tejidos blandos), también se aplica a otros cánceres en los que se utilizan inhibidores de puntos de control inmunitario PD-1/PD-L1 para terapia, como cáncer de mama, cáncer de cuello uterino, cáncer de colon, cáncer de cabeza y cuello, linfoma de Hodgkin, cáncer de riñón, cáncer de estómago, cáncer rectal y cualquier tumor sólido.
Mecanismo de detección
Los conjuntos de marcadores que se han identificado capturan una red de desregulaciones a nivel de la genómica celular 3d , que refleja una red de tipos de células desreguladas que actúan en conjunto para sostener y avanzar el fenotipo patológico o fisiológico del cáncer. Hasta ahora, al observar conformaciones cromosómicas estadísticamente significativas como evidencia de desregulación junto con los loci CD de subtipificación celular, podemos afirmar que las firmas universales observadas contienen y representan desregulaciones en células T, células NK (asesinas naturales), macrófagos, células B y células dendríticas (DC). Esto pone de relieve el papel que desempeña la configuración específica a nivel celular del sistema inmunológico adaptativo e innato en pacientes individuales como parte de la interacción cáncer-huésped, que define la progresión de la enfermedad (hiperprogresores) y la capacidad de respuesta a los inhibidores del punto de control inmunológico PD-1/PD-L1.
Procedimientos
Los estudios iniciales de interacciones cromosómicas se llevaron a cabo en las siguientes poblaciones (trabajo descrito en la Figura 1):
Lista A - Trabajo inicial
- Cohorte de melanoma de 16 anti-PD-1 (Pembrolizumab)
- Cohorte de 16 pacientes con NSCLC anti-PD-L1
- Cohorte de 99 pacientes con NSCLC anti-PD-L1
- Cohorte de 49 pacientes con NSCLC anti-PD-1
- Cohorte de 50 NSCLC con anti-PD-1 y terapia combinada
- Cohorte de melanoma de 48 anti-PD-1 (pembrolizumab), incluidos hiperprogresores
- Cáncer uretral de 550 con anti-PD-LI
Observacional Longitudinal:
- anti-PD-L1 (Durvalumab, Atezolizumab) y anti-PD1 (Pembrolizumab)
- Pulmón, carcinoma hepatocelular, vejiga, próstata, NPC, glándula parótida, sarcoma de partes blandas alveolares.
Los conjuntos de marcadores se desarrollaron utilizando los siguientes pacientes:
Capacitación de 80 pacientes, todos con NSCLC
Mezcla de 1L, 2L de Avelumab (54) y 2L de Pembrolizumab (36)
Prueba: 38 pacientes, todos con NSCLC
Mezcla de 1L, 2L de Avelumab (27) y 2L de Pembrolizumab (11)
Prueba: Mezcla de 20 muestras
Pacientes de mezcla 2L con diferentes inhibidores de puntos de control y diferentes tumores sólidos Atezolizumab (7), Durvalumab (3) y Pembrolizumab (10)
Pulmón (13), NPC (2), CHC (2), vejiga (1), sarcoma alveolar (1) y glándula parótida (1)
Total 138 muestras.
Para probar los marcadores universales se recopiló una cohorte ciega para probar la característica de No Respuesta. Esta cohorte se recolectó en Malasia y estuvo compuesta por 21 pacientes que proporcionaron muestras de sangre al inicio del estudio antes de la inmunoterapia. Todos los pacientes tenían líneas de terapia previas. Se utilizaron 3 puntos de control: Atezolizumab (anti-PD-L1), Durvalumab (anti-PD-L1) y Pembrolizumab (anti-PD-1). Hubo 7 indicaciones de enfermedad: pulmón, carcinoma hepatocelular, vejiga, próstata, NPC, glándula parótida y sarcoma de partes blandas alveolares. 11 de los pacientes tenían colecciones múltiples: 2-4. 3 pacientes tenían hasta 4 colecciones. La etnia de los pacientes era china Han o indonesia.
La figura 4 muestra la alta concordancia entre las llamadas basales de EpiSwitch, la expresión de PD-L1 y la respuesta clínica observada.
La figura 5 muestra datos de un conjunto de entrenamiento para un modelo de 11 marcadores basado en 80 pacientes con NSCLC que son una mezcla de 1L, 2L de avelumab (54) y 2L de pembrolizumab (36).
La figura 6 muestra datos para un conjunto de prueba del modelo de 11 marcadores basado en 38 pacientes con NSCLC que son una mezcla de 1L, 2L de avelumab (27) y 2L de pembrolizumab (11).
Las figuras 7 y 8 muestran datos de un segundo conjunto de pruebas para el Estudio observacional de Malasia que analiza una combinación de IPC y tumores.
La Figura 9 muestra las llamadas de los pacientes que tuvieron múltiples colecciones. Las llamadas a lo largo de los puntos de tiempo son en gran medida consistentes y concordantes:El paciente 12 en Durvalumab muestra el perfil de Respondedor en 4 recolecciones, y una puntuación en la segunda recoleccion entrando en la zona gris R/NR. El perfil general de probabilidades en realidad se vuelve más fuerte con el tiempo para el Respondedor. El paciente 1 con Atezolizumab muestra una interesante falta de respuesta inicial, pero se convierte en un respondedor tardío.
El paciente 17 con Pembrolizumab es un paciente con NPC y muestra un perfil de respuesta en ambos muestreos. Esto resalta la capacidad de los marcadores EpiSwitch™ para encontrar pacientes que responden y que no responden para capturar características comunes del perfil de respuesta del huésped para inhibidores de múltiples puntos de control bajo diversas condiciones oncológicas.
La Figura 10 muestra las llamadas de EpiSwitch para pacientes muestreados en múltiples puntos de tiempo, donde OBD.261.263 y OBD.301.303 representan marcadores de respuesta universales y OBD.029.031, OBD.045.047, OBD.645.647, OBD.753.755 y OBD.8.69.871 representan marcadores de no respuesta universales.
Para el trabajo relacionado con hiperprogresores, la Figura 11 muestra la selección de muestra con hiperprogresores seleccionados en función de tener una SSP <= 60 días (2 meses) y una SG <= 150 días (4,5 meses), el grupo de supervivencia (S) se seleccionó ya que en su mayoría todos tenían más de 1 año de SSP La Figura 13 muestra 11 CCS de EpiSwitch seleccionados de un total de 60, marcadores seleccionados en función de la diferencia binaria y el análisis del registro de rango de SO y PFS. También se muestran las ubicaciones genéticas asociadas. Las figuras 10 y 11 muestran un análisis de la vía de las ubicaciones genéticas.
La Figura 16 muestra datos para un conjunto de entrenamiento para hiperprogresores: un modelo de marcador XGBoost 11. La figura 17 muestra datos para una prueba para hiperprogresores con 6 muestras excluidas de la selección de marcadores. La figura 18 muestra un análisis de componentes principales logísticos (PCA) de un conjunto de entrenamiento. La figura 19 muestra un PCA logístico del conjunto de entrenamiento con muestras de prueba previstas. Este es un segundo enfoque de clasificación y está en concordancia con XGBoost. La figura 20 muestra el PCA logístico del conjunto de entrenamiento con PFS como etiqueta. La figura 21 muestra el PCA logístico del conjunto de entrenamiento con OS como etiqueta.
Enfoque para el análisis de los pacientes
Se adoptó un enfoque específico para la forma en que se analizó la población de pacientes. Las cohortes de pacientes pertinentes habían recibido una terapia previa (una ronda de quimioterapia basada en cisplatino) o habían sido tratadas únicamente con inhibidores de puntos de control. También analizamos únicamente a pacientes con una respuesta definida, es decir, respuesta completa, respuesta parcial o ninguna respuesta. Eliminamos del análisis a los pacientes que experimentaron una enfermedad estable.
La salida de datos de la plataforma PCR anidada EpiSwitch™ se analizó con múltiples técnicas estadísticas, que incluyen, pero no se limitan a, procedimientos univariados establecidos (prueba exacta de Fisher) y multivariantes (GLMNET permutado, Random Forest con valores de explicación aditivos de SHapley (SHAP)).
Para el desarrollo de los clasificadores de diagnóstico y pronóstico EpiSwitch™, se utilizó el siguiente análisis estadístico: (i) XGBoost: Un algoritmo de árbol de decisión potenciado por gradiente. Se genera un conjunto de modelos de árboles de decisión débiles y se combinan para producir un modelo de clasificación fuerte (crecimiento del árbol por niveles); (ii) Análisis de componentes principales logísticos (PCA): análisis de componentes principales optimizado para usar datos binarios; y (iii) GLMNET: modelo lineal generalizado ajustado a través de la técnica de máxima verosimilitud penalizada (iv) LightGBM: marco de refuerzo de gradiente que utiliza algoritmos de aprendizaje basados en árboles (crecimiento del árbol de hojas verticales).
A continuación se muestra un análisis SHAP para un conjunto de marcadores universales.
Marcadores clasificados por sus puntuaciones SHAP, siendo el mejor marcador OBD117_029_0.31. El valor SHAP (SHapley Additive exPlanations) es un enfoque unificado para explicar el resultado de cualquier modelo de aprendizaje automático. Hay tres beneficios importantes:
La primera es la interpretabilidad global - los valores SHAP colectivos pueden mostrar cuánto contribuye cada predictor, ya sea positiva o negativamente, a la variable diana. Esto es como el gráfico de importancia variable pero puede mostrar la relación positiva o negativa de cada variable con la diana.
El segundo beneficio es la interpretabilidad local - cada observación obtiene su propio conjunto de valores SHAP. Esto aumenta enormemente su transparencia. Podemos explicar por qué un caso recibe su predicción y las contribuciones de los predictores. Los algoritmos tradicionales de importancia variable sólo muestran los resultados de toda la población, pero no de cada caso individual. La interpretabilidad local nos permite identificar y contrastar los impactos de los factores.
En tercer lugar, los valores SHAP se pueden calcular para cualquier modelo basado en árbol (nuestro modelo es un modelo basado en árbol potenciado, XGboost), mientras que otros métodos utilizan modelos de regresión lineal o regresión logística como modelos sustitutos.
Esto representa la tubería analítica para la selección de marcadores. El alto rendimiento de los dos conjuntos de marcadores se muestra en las figuras y tablas. En particular, para el conjunto de marcadores universales, los 7 tipos de cáncer que se muestran en la Figura 3 estuvieron representados en 21 pacientes observados longitudinalmente, donde el rendimiento fue del 100 % en especificidad y valor predictivo positivo en toda la cohorte.
Ejemplo 2. Trabajo adicional que conduce al desarrollo del conjunto de marcadores que se muestra en la Tabla 8
Los inhibidores de puntos de control inmunitario son una clase de medicamentos que se dirigen a un conjunto estrecho de proteínas en una red reguladora específica presente en las células inmunitarias, como las células T y algunas células cancerosas de los pacientes. Las dianas de las proteínas de control y la red que controlan ayudan a evitar que las respuestas inmunes sean demasiado fuertes y brindan protección adicional contra las enfermedades autoinmunes, pero en el caso del cáncer pueden impedir que las células T maten a las células cancerosas. El uso de inhibidores de puntos de control inmunitario ayuda a reactivar la respuesta inmunitaria en pacientes con cáncer, con resultados eficaces y una mejor supervivencia de los pacientes.
Los inhibidores de puntos de control inmunitario actúan restableciendo y activando la respuesta inmunitaria dirigiéndose a: 1) PD-1 (Nivolumab, Pembrolizumab, Cemiplimab, Camrelizumab, Tislelizumab, Sasanlimab); o 2) el ligando PD-1, llamado PD-L1 (Avelumab, Atezolizumab y Durvalumab).
El presente trabajo ha planteado varias preguntas, incluyendo si, teniendo en cuenta el papel desempeñado por el sistema inmunológico del paciente en la respuesta exitosa a los inhibidores del punto de control inmunológico y el número limitado de objetivos para la terapia, particularmente el receptor PD-1 y su ligando PD-L1, uno puede descubrir y validar biomarcadores EpiSwitch en un formato de detección qPCR para pacientes de referencia que predecirían universalmente la respuesta/no respuesta al tratamiento por adelantado, independientemente del tipo de inhibidor del punto de control utilizado y en todo el espectro de condiciones oncológicas.
El formato qPCR compatible con MIQE es el estándar para pruebas clínicas basadas en PCR. Este formato es muy diferente del formato PCR anidado o del formato de matriz, debido a sus limitaciones en los diseños de secuencias de cebadores y sondas y el rango continuo de detección, tradicionalmente medido a través de números de ciclos de Cq.
Las siguientes etapas se llevaron a cabo como parte del descubrimiento y validación de estos biomarcadores (la tabla 9 muestra los datos de los pacientes):Etapa 1. A partir de los marcadores anteriores identificados por matrices, se identificaron los 24 marcadores principales que satisfacían las restricciones teóricas iniciales y los requisitos para los diseños de secuencias en cebadores y sondas de qPCR, es decir, secuencias únicas para la detección, temperatura de recocido correcta para cebadores y sondas, unión 3C superpuesta, para la detección de las conformaciones cromosómicas. En la etapa experimental, los diseños de 20 marcadores pasaron el control de calidad y la optimización satisfactoria en gradiente de temperatura.
Etapa 2. Se utilizaron marcadores con formato qPCR para identificar si hay un número mínimo de biomarcadores que, como firma, tendrán un fuerte poder de estratificación para predecir la respuesta y la falta de respuesta en una amplia cohorte de pacientes tratados con inhibidores de puntos de control inmunitarios: pembrolizumab, avelumab, atezolizumab, durvalumab contra cada uno de los tres objetivos (PD-1, PD-L1) de una amplia selección de afecciones oncológicas: melanoma, cáncer de pulmón de células no pequeñas, uretral, carcinoma hepatocelular, vejiga, próstata, carcinoma de células no pequeñas, glándula parótida, sarcoma de partes blandas alveolares, carcinoma nasofaríngeo, carcinoma vulvar, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de hueso, cáncer de cerebro, carcinoma del seno sagital, linfoma, cáncer de laringe, cáncer de cuello uterino, carcinoma de cavidad oral.
Etapa 3: En la pantalla 1, se evaluaron primero los 20 marcadores en plantillas de ADN agrupadas de 3 categorías de resultados clínicos de pacientes: respondedores, no respondedores y enfermedades estables. Las cohortes de muestra representaron pacientes con diversos tipos de cáncer (ver anotaciones adjuntas) que recibieron varios inhibidores de puntos de control inmunológico como monoterapias: Avelumab, Pembrolizumab, Atezolizumab y Durvalumab.
Etapa 4: En la pantalla 2, los 13 marcadores principales, preseleccionados de la pantalla 1, se evaluaron en muestras individuales de los mismos pacientes utilizados en la pantalla 1: 24 pacientes/muestras en total (ver la Tabla 9, pacientes mostrados con un asterisco).
La selección de los mejores marcadores en la etapa 2 y 3 se realizó utilizando un modelo lineal. El modelo lineal se ajusta a los valores de Cq para cada marcador, comparando PR v PD, PR v SD y PD v SD. Los coeficientes de los modelos ajustados describen las diferencias entre los CCS en cada una de las comparaciones. Los modelos lineales se utilizan luego para calcular las probabilidades logarítmicas de las estadísticas t moderadas de los CCS diferenciales mediante la moderación bayesiana empírica de los errores estándar hacia un valor global (0 logaritmo o 1 lineal). Luego, los marcadores se clasifican según el valor p ajustado y la diferencia de abundancia de CCS entre los grupos. A los marcadores entre PR v PD se les da más peso.
Etapa 5: En la pantalla 3 los 8 marcadores principales (preseleccionados de la pantalla 2) se validaron en muestras de IO que consistían en pacientes con los siguientes resultados clínicos: 55% NR (no respondedores), 24% SD (enfermedad estable, de acuerdo con la norma regulatoria y la práctica clínica, SD debe estar sujeta a terapia IO al igual que el grupo de posibles respondedores), 20% R (respondedores, también denominados PR para respondedores parciales) y 1% CR (respondedores completos). La eficacia de la estratificación del modelo basado en 8 marcadores se muestra en las figuras 22 a 24. Valor predictivo (VPP) = 100xVP/(VP+FP). Valor predictivo negativo (VPN) = 100xTN/(FN+TN).
El clasificador de puntos de control de inmunoterapia se construye utilizando CatBoost. Catboost es un miembro de las técnicas de conjunto de aprendizaje automático de árboles de decisión potenciados por gradiente (GBDT) (véase Hancock y Khoshgoftaar; J. Big Data (2020) 7:94).
Tipos de formato para la prueba
Tanto los formatos anidados como los de qPCR imponen limitaciones estrictas sobre cuáles de los marcadores basados en matrices podrían traducirse con éxito a uno u otro formato. Esto es particularmente cierto en el caso del formato qPCR, donde tenemos que determinar si podemos usar dos cebadores y una sonda fluorescente sobre la unión 3C (esta es similar a la sonda de matriz), que 1) tienen una secuencia única en todo el genoma para una detección específica, 2) tienen temperaturas de hibridación muy similares, 3) muestran cómo la eficacia en la amplificación en un único procedimiento de PCR, y no en dos reacciones secuenciales como lo requiere la PCR anidada (primero con un par de cebadores, segundo con otro par de cebadores). Los requisitos para la qPCR son mucho más estrictos y selectivos.
Conclusiones
Con base en la evaluación mediante qPCR de 8 conformaciones de cromatina condicionales como biomarcadores reguladores basados en la sangre, se podría evaluar a los individuos para determinar la probabilidad de respuesta a monoterapias con inhibidores del punto de control inmunitario (ICI). En la interacción entre el microambiente tumoral del paciente y el sistema inmunológico del paciente, la vía PD-1, que comprende el receptor de muerte programada 1 (Pd-1) y su ligando PD-L1, media la inmunosupresión local en el microambiente tumoral. El presente trabajo se relaciona directamente con los ICI que eran antagonistas dirigidos a PD-1 (Pembrolizumab) o su ligando, PD-L1 (Atezolizumab, Avelumab y Durvalumab). La estratificación basada en un clasificador de 8 marcadores coloca a los pacientes en grupos de probables respondedores o no respondedores a la monoterapia con ICI, antes de la aplicación de la terapia. La clasificación se aplica a todas las monoterapias ICI contra PD-L1 y su ligando PD-L1, en el contexto de todas las indicaciones oncológicas utilizadas en tratamientos de monoterapia ICI.
Las figuras 25 a 27 describen las características de los marcadores de interacciones cromosómicas identificados. La figura 25 muestra la importancia de los marcadores en términos de su poder en el modelo. La figura 26 muestra las ubicaciones genéticas. La figura 27 muestra las vías con las que están asociados los genes. Éstas son vías implicadas en la respuesta del punto de control. Esto indica que el modelo es predictivo y cabe destacar que los marcadores dentro del modelo tienen relevancia biológica. De hecho, uno de los marcadores se encuentra entre PD-L1 y PD-L2 (q057_q059).
Tabla 1.a1
Tabla 1.a2
Tabla 1.a3
Tabla 1.a4
Tabla 1.a5
Tabla 1.a6
Tabla 1.a7
Tabla 2.a1
Tabla 2.a2
Tabla 2.a3
Tabla 2.a4
Tabla 2.a5
Tabla 2.a7
Tabla 3
Tabla 4. Combinaciones en inmunoterapia contra el cáncer (biológicos, inmunocitocinas (L19-IL2 y L19-TNF), citotóxicos (Paxlitaxel)
Tabla 5. Otras moléculas individuales, inmunocitocinas y productos biológicos para la terapia del cáncer
Tabla 6
Tabla 7a
Tabla 7b
Tabla 7c
Tabla 7d
Tabla 7e
Tabla 7f
Tabla 7g
Tabla 7h
Tabla 7i
Tabla 7k
Tabla 8a
Tabla 8b
Tabla 9.1
Tabla 9.2
Tabla 9.3
Tabla 9.4
Tabla 9.5
Claims (15)
1. Un método para determinar cómo responde un individuo a la inmunoterapia para el cáncer que comprende detectar la presencia o ausencia en el individuo de:
- todas las interacciones cromosómicas representadas por las secuencias de sonda que se muestran en la Tabla 8c para determinar así si el individuo responderá a la inmunoterapia; y/o
- todas las interacciones cromosómicas representadas por las secuencias de sonda que se muestran en la Tabla 2. a3 para determinar así si el individuo es un hiperprogresor en quien la inmunoterapia acelerará la enfermedad.
2. Un método según la reivindicación 1, que comprende además detectar la presencia o ausencia en el individuo de todas las interacciones cromosómicas representadas por las secuencias de sonda mostradas en la Tabla 1.a3 para determinar así si el individuo responderá a la inmunoterapia.
3. Un método según la reivindicación 1 o 2, en donde se determina la presencia o ausencia de las interacciones cromosómicas:
- en una muestra del individuo, y/o
- en el ADN del individuo, y/o
- detectando la presencia o ausencia de un bucle de ADN en el sitio de las interacciones cromosómicas, y/o - detectar la presencia o ausencia de regiones distales de un cromosoma que se unen en una conformación cromosómica, y/o
- detectando la presencia de un ácido nucleico ligado que se genera durante dicha tipificación y cuya secuencia comprende dos regiones cada una de las cuales corresponde a las regiones del cromosoma que se unen en la interacción cromosómica, y/o
- mediante un proceso que detecta la proximidad de las regiones cromosómicas que se han unido en la interacción cromosómica.
4. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha detección de la presencia o ausencia de interacciones cromosómicas se realiza mediante un proceso que comprende:
(i) reticular in vitro las interacciones cromosómicas epigenéticas que están presentes;
(ii) aislar opcionalmente el ADN reticulado;
(iii) someter dicho ADN reticulado a escisión;
(iv) ligar dichos extremos de ADN escindidos reticulados para formar ADN ligado; y
(v) identificar la presencia o ausencia en dicho ADN ligado de una secuencia de ADN que corresponda a cada interacción cromosómica;
para así determinar la presencia o ausencia de cada interacción cromosómica.
5. Un método según la reivindicación 3 o 4, en donde dicho ADN ligado se detecta mediante PCR o mediante el uso de una sonda.
6. Un método según la reivindicación 5, en donde:
(i) la detección se realiza mediante el uso de una sonda, en donde dicha sonda preferiblemente tiene al menos un 70 % de identidad con cualquiera de las sondas que se muestran en la Tabla 1.a3, 2.a3 o 8c; o
(ii) la detección se realiza mediante el uso de PCR, en donde la PCR utiliza preferiblemente un par de cebadores que tiene al menos un 70 % de identidad con cualquiera de los pares de cebadores que se muestran en:
- Tabla 1a6 y 1a7,
- Tabla 2.a6, o
- Tabla 8b y 8c.
7. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde:
(i) el método se lleva a cabo antes de que el individuo reciba inmunoterapia y/o se lleva a cabo para seleccionar qué terapia debe recibir el individuo para el cáncer, y/o
(ii) el método se lleva a cabo en un individuo que tiene cáncer o se sospecha que tiene cáncer, y/o
(iii) el método se lleva a cabo en un individuo que ha sido preseleccionado en función de una característica física, un factor de riesgo o la presencia de un síntoma de cáncer.
8. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el individuo:
- se encuentra en una etapa temprana del cáncer; y/o
- está recibiendo o está a punto de recibir una terapia contra el cáncer, por ejemplo inmunoterapia contra el cáncer.
9. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el cáncer es:
(i) uno en el que se utilizan inhibidores de puntos de control inmunitario PD-1/PD-L1 para la terapia; y/o (ii) melanoma, cáncer de pulmón, carcinoma hepatocelular (cáncer de hígado), cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer nasal, cáncer de glándula parótida (cáncer de glándula salival), sarcoma alveolar de partes blandas (cáncer de tejidos blandos); y/o
(iii) cáncer de mama, cáncer de cuello uterino, cáncer de colon, cáncer de cabeza y cuello, linfoma de Hodgkin, cáncer de riñón, cáncer de estómago, cáncer rectal o un tumor sólido.
10. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la inmunoterapia:
(i) comprende un anticuerpo o una célula inmunitaria, preferiblemente una célula T o una célula dendrítica; y/o (ii) comprende una vacuna, preferiblemente contra el cáncer; y/o
(iii) modula, bloquea o estimula un punto de control inmunitario, y preferiblemente se dirige o modula PD-L1, PD-L2 o CTLA4 o cualquier otra molécula de punto de control inmunitario descrita en la Tabla 3; y/o
(iv) comprende una terapia mostrada en cualquiera de las tablas 4 a 6; y/o
(v) aumenta la eliminación de células cancerosas por parte del sistema inmunológico, preferiblemente en donde dicha eliminación se realiza por una célula T
11. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la inmunoterapia es:
(i) un inhibidor de PD-1 o un inhibidor de PD-L1, y es preferiblemente un anticuerpo específico para PD-1 o PD-L1; y/o
(ii) un inhibidor de PD-2 o un inhibidor de PD-L2, y es preferiblemente un anticuerpo específico para PD-2 o PD-L2.
12. Un método según la reivindicación 4, en donde la detección de la presencia o ausencia de interacciones cromosómicas comprende la detección específica del ADN ligado mediante PCR cuantitativa (qPCR), que utiliza cebadores capaces de amplificar el ADN ligado y una sonda que se une al sitio de ligación durante la reacción de PCR, donde dicha sonda comprende una secuencia complementaria a la secuencia de cada una de las regiones cromosómicas que se han unido en la interacción cromosómica
13. Un método según la reivindicación 13, en donde la sonda comprende:
- un fluoróforo unido covalentemente al extremo 5' de la sonda, y/o
- un extintor unido covalentemente al extremo 3' de la sonda
14. Un método según la reivindicación 13, en donde:
- dicho fluoróforo se selecciona entre HEX, Texas Red y FAM; y/o
- dicha sonda comprende una secuencia de ácido nucleico de una longitud de 10 a 40 bases nucleotídicas, preferiblemente una longitud de 20 a 30 bases nucleotídicas.
15. Una inmunoterapia para el cáncer que es un anticuerpo específico para PD-1 o PD-L1 para su uso en un método de tratamiento de un cáncer en un individuo, en donde dicho método de tratamiento comprende:
- identificar si el individuo responde al anticuerpo específico para PD-1 o PD-L1 mediante el método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, y
- administrar a un individuo que ha sido identificado como sensible a un anticuerpo específico para PD-1 o PD-L1 dicho anticuerpo específico para PD-1 o PD-L1.
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