ES3030490T3 - Increased yield and amount of soluble sugars allocated to fruits in tomato plants - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a una planta de Solanum lycopersicum que comprende en su genoma, en el cromosoma 1, secuencias introgresadas de Solanum habrochaites, donde dichas secuencias introgresadas confieren a la planta un fenotipo mejorado que corresponde tanto a un mayor rendimiento como a una mayor cantidad de azúcares solubles asignados a los frutos (Brix*Rendimiento), con respecto a una planta correspondiente desprovista de dichas secuencias, y donde dichas secuencias introgresadas se seleccionan entre las presentes en el genoma de una planta de las semillas ToPATYIELD NCIMB número de acceso 42567. Las secuencias introgresadas se caracterizan preferiblemente por alelos definidos de diferentes SNP en el cromosoma 1, entre otros el alelo T de SNPIL2_3605 (SEQ ID No.9) y/o el alelo A de IL2_641 (SEQ ID No.12). La invención también se dirige a partes de estas plantas con fenotipo mejorado, así como a la progenie, al uso de estas plantas para la introgresión del fenotipo mejorado en otro fondo genético, así como a diferentes métodos para la obtención de plantas o semillas de tomate con rendimiento y rendimiento brix* aumentados. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Rendimiento y cantidad incrementados de azúcares solubles asignados a los frutos de plantas de jitomate

Sector de la técnica

La presente invención se refiere al incremento del rendimiento en plantas deSolanum lycopersicum,también conocido comoLycopersicum esculentum.De conformidad con la invención, el incremento del rendimiento es provisto por secuencias de ADN, introgresadas a partir de S.habrochaites,también conocido comoLycopersicon hirsutumen loci específicos correspondientes en el genoma de una planta de S.lycopersicum.Las secuencias introgresadas pueden estar presentes en forma homocigota o heterocigota en el genoma de la planta de S.lycopersicum,y éstas confieren rendimiento incrementado a dicha planta de S.lycopersicum.

Antecedentes de la invención

Todas las formas cultivadas y comerciales de jitomate pertenecen a una especie muy frecuentemente referida comoLycopersicon esculentum Miller. Lycopersicones un género relativamente pequeño dentro de la extremadamente grande y diversa familia Solanaceae la cual se considera que consiste de alrededor de 90 géneros, incluyendo chile, tabaco y berenjena. El géneroLycopersiconha sido dividido en dos subgéneros, el complejoesculentumel cual contiene aquellas especies que se pueden cruzar fácilmente con el jitomate comercial y el complejoperuvianumel cual contiene aquellas especies que se cruzan con dificultad considerable (Stevens, M., y Rick, C. M. 1986). Debido a su valor como cultivo,L. esculentum Millerse ha difundido ampliamente en todo el mundo. Incluso si el origen preciso del jitomate cultivado sigue siendo un poco claro, parece que éste proviene del continente americano, siendo nativo de Ecuador, Perú y las islas Galápagos e inicialmente cultivado por los aztecas e incas alrededor del año 700 d.C. Al parecer México ha sido el sitio de domesticación y la fuente de introducción más temprana.

Se supone que el jitomate “cherry”,L. esculentum var. cerasiforme,es el ancestro directo de las formas cultivadas modernas.

El jitomate se cultiva por su fruto, ampliamente utilizado como producto fresco de mercado o producto procesado. Como cultivo, el jitomate se cultiva comercialmente en cualquier lugar en que las condiciones ambientales permitan la producción de un rendimiento económicamente viable. La mayoría de los jitomates frescos de mercado se cosechan a mano en las etapas de madurez maduro y verde maduro en la planta. Los jitomates frescos de mercado están disponibles todo el año. El jitomate procesado se cosecha principalmente en forma mecánica y se utiliza en muchas formas, como jitomates enlatados, jugo de jitomate, salsa de jitomate, puré, pasta o incluso catsup.

El jitomate es una especie diploide normalmente simple con doce pares de cromosomas diferenciados. Sin embargo, el jitomate poliploide también es parte de la presente invención. El jitomate cultivado es auto-fecundo y casi exclusivamente auto-polinizante. Las flores de jitomate son hermafroditas. Los cultivares comerciales inicialmente fueron de polinización abierta. A medida que se ha identificado el vigor híbrido en los jitomates, los híbridos están reemplazando las variedades de polinización abierta ganando más y más popularidad entre los agricultores con mejor rendimiento y uniformidad de las características de la planta. Los híbridos comerciales F1 se pueden formar en un número de diferentes maneras, incluyendo cruzando directamente dos líneas parentales (híbridos de cruza sencilla), cruzando un híbrido de cruza sencilla con otra línea parental (híbridos de tres vías o de cruza triple), o cruzando dos híbridos diferentes (híbridos de cuatro vías o de cruza doble). La semilla de jitomate F1 comercial híbrida se produce mediante polinización a mano. Se recolecta el polen del progenitor masculino y se aplica manualmente a la superficie estigmática del endógamo femenino. Antes de, y después de la polinización manual, las flores se cubren para que los insectos no traigan polen extraño y creen una mezcla o impureza. Las flores se etiquetan para identificar el fruto polinizado a partir del cual se van a cosechar las semillas. Una vez que se han identificado los endógamos parentales que dan el mejor desempeño de híbrido, la semilla híbrida se puede reproducir indefinidamente en tanto que se mantenga la homogeneidad de los progenitores endógamos.

La producción de híbridos es una industria bien desarrollada, que implica la producción aislada tanto de las líneas parentales como de los híbridos que resultan del cruzamiento de dichas líneas.

Debido a su amplia diseminación y elevado valor, el jitomate ha sido sometido intensivamente a mejoramiento. Esto explica el por qué actualmente está disponible una amplia variedad de jitomates. La forma puede variar desde pequeña grande y existen los tipos cherry, ciruela, pera, en forma de bloque, redonda, y de filete. Los jitomates se pueden agrupar por la cantidad de tiempo que les toma a las plantas madurar los frutos para cosecha y, en general los cultivares son considerados como de maduración temprana, mitad de temporada o tardía. Los jitomates también se pueden agrupar por el hábito de crecimiento de la planta; determinado, semi-determinado o indeterminado. Las plantas determinadas tienden a crecer su follaje primero, después dan flores que maduran como fruto si la polinización es exitosa. Todos los frutos tienden a madurar en una planta aproximadamente al mismo tiempo. Los jitomates indeterminados comienzan haciendo crecer algo de follaje, después continúan produciendo follaje y flores a través de la temporada de cultivo. Estas plantas tenderán a tener frutos de jitomate en diferentes etapas de madurez en cualquier tiempo dado. Los jitomates semi-determinados tienen un fenotipo entre determinado e indeterminado, éstos son tipos determinados típicos excepto que crecen más grandes que las variedades determinadas. Los desarrollos más recientes en el fitomejoramiento del jitomate han llevado a una variedad más amplia de color del fruto. Además del color maduro rojo estándar, los jitomates pueden ser de color blanco cremoso, verde lima, rosa, amarillo, dorado, naranja o morado.

La semilla de jitomate comercial híbrida se puede producir mediante polinización manual. Se recolecta el polen del progenitor masculino y se aplica manualmente a la superficie estigmática del endógamo femenino. Antes de y después de la polinización manual, las flores se cubren para que los insectos no traigan polen extraño y creen una mezcla o impureza. Las flores se etiquetan para identificar el fruto polinizado a partir del cual se van a cosechar las semillas.

Incrementar el rendimiento de las plantas de jitomate es uno de los objetivos principales del fitomejoramiento del jitomate. Durante años, los obtentores de plantas de jitomate han utilizado especies silvestres como un reservorio para genes y otras secuencias genéticas para mejorar las plantas de jitomate cultivadas.

En 1998, Bernacchiet al.(Bernacchiet al,1998a) crearon Líneas Casi Isogénicas (Near Isogenic Lines) desarrolladas para 15 regiones genómicas provenientes del donador silvestreL. hirsutumLA1777, predijeron que contenían 25 factores de rasgos cuantitativos para la mejora de siete rasgos agronómicos tales como rendimiento, sólidos solubles, viscosidad, color del fruto y firmeza del fruto. Monforte & Tanksley (Monforte & Tanksley, 2000) divulgan plantas de jitomate determinadas, que comprenden un fragmento de introgresión proveniente de LA1777, que supuestamente imparte un rendimiento total incrementado.

En 1995, Eshed y Zamir crearon líneas de introgresión que se originan a partir de una cruza entre la especie de fruto verdeLycopersicum pennelliiLA716 y el jitomate cultivado M82. Cada una de las líneas creadas contiene un fragmento individual deLycopersicum pennelliiy juntas, las líneas proveen cobertura completa del genoma. Se identificaron loci de rasgo cuantitativo (QTL por sus siglas en inglés) para rendimiento en peso de planta y sólidos solubles. Entre éstos, se encontró un fragmento genético en el brazo inferior del cromosoma 1 delLycopersicum pennellii,del cual también se demostró que incrementa el rendimiento de jitomates para procesamiento determinados (Eshed y Zamir, 1995, 1996, Bernacchiet al1998b).

Por lo tanto, el uso de dicho fragmento genético deLycopersicum pennelliioL. hirsutumes considerado como una manera sencilla para incrementar el rendimiento de plantas de jitomate, ya sea que sean plantas de jitomate determinadas o indeterminadas, pero, cuando se introgresaron en un fondo genético de jitomate indeterminado, los inventores de la presente invención encontraron que la planta de jitomate que lleva estas secuencias introgresadas no muestra el incremento en rendimiento esperado (véase ejemplos 1 y 4 de la sección experimental).

Existe por lo tanto una necesidad importante en la técnica para identificar una fuente de incremento de rendimiento para plantas de jitomate indeterminadas, que pueda ser utilizado para obtener plantas de jitomate indeterminadas que muestren un incremento en el rendimiento, y una necesidad de plantas de S.lycopersicummejoradas que muestren dicho incremento en rendimiento.

La presente invención provee plantas de jitomate S.lycopersicumcomerciales que despliegan un rendimiento incrementado, así como métodos que identifican las plantas o poblaciones (germoplasma) de S.lycopersicumque despliegan dicho rendimiento incrementado. La presente invención también describe marcadores genéticos moleculares, especialmente polimorfismos de nucleótido individual (SNP por sus siglas en inglés), ligados a los loci de rendimiento incrementado.

De manera inesperada, las secuencias introgresadas en las plantas deS. lycopersicumde conformidad con la invención proveen un rendimiento incrementado a las plantas de jitomate indeterminadas, pero también a las plantas de jitomate determinadas.

Además, es sabido en términos generales y está bien reportado que en el jitomate, existe una correlación negativa entre el rendimiento, es decir el peso total de frutos por plantas, y el contenido de azúcar del fruto. El rendimiento total de una planta es afectado tanto por el número de frutos como por el tamaño o peso de cada fruto; estos rasgos con frecuencia son referidos como “componentes de rendimiento”.

La correlación negativa es sugerida en términos generales debido a que el incremento en el rendimiento está limitado por la cantidad de azúcares que la planta pueda asignar en el fruto. Esto ha llevado al uso del rasgo Brix*Rendimiento (o Brix x Rendimiento) (es decir, la multiplicación del peso total del fruto en la planta y el contenido de azúcar del fruto), en el cual este Brix*Rendimiento representa la cantidad de azúcar asignado al fruto por la planta (Eshed y Zamir, 1995).

Además de la correlación negativa entre rendimiento total y el contenido de sólidos solubles del fruto, se describe una correlación negativa similar entre el componente de rendimiento del tamaño o peso del fruto, y el contenido de sólidos solubles del fruto.

Contrario a esta enseñanza, las plantas de jitomate de la presente invención no muestran dicha correlación negativa.

En efecto, las plantas de la invención exhiben tanto un rendimiento incrementado acoplado a una cantidad incrementada de azúcares y sólidos solubles asignados a los frutos (Brix x Rendimiento y TSS x Rendimiento).

Explicación de la invención

Los presentes inventores han identificado una accesión de jitomate silvestre de S.habrochaites(también conocido comoL. hirsutum)HABR1, que exhibe un QTL (locus de rasgo cuantitativo) el cual, una vez introgresado en el fondo genético de S.lycopersicum,en el cromosoma 1, confiere un fenotipo mejorado, que acumula tanto un rendimiento incrementado como una cantidad incrementada de azúcares solubles asignados a los frutos (Brix*Rendimiento), con respecto a la planta antes de la introgresión de dicho QTL. Esta accesión silvestre es distinta de la accesión LA1777 a la que se hace referencia en Bernacchi et al, 1998a y 1998b y Monforte & Tanksley, 2000. Los incrementos en rendimiento y en Brix*Rendimiento (o Brix x Rendimiento) también son caracterizados por la ausencia de un decremento estadísticamente significativo en los Sólidos Solubles Totales. El fenotipo mejorado se observa en presencia de las secuencias introgresadas, una vez introgresadas en un fondo genético de S.lycopersicum.

La presencia en HABR1 de un QTL que tiene estas propiedades es altamente inesperada en la medida en que la accesión silvestre no tenga dicho fenotipo mejorado, es decir las secuencias o QTL de interés no confieran el fenotipo mejorado en un fondo genético que no es el fondo genético de S.lycopersicum.Por último, el incremento simultáneo de rendimiento y brix*rendimiento es inesperado, ya que no solo se consideraron el rendimiento y el brix*rendimiento como correlacionados negativamente, sino que los QTL ya conocidos que modifican estos factores siempre fueron completamente distintos. Estos también afectan de manera negativa los sólidos solubles totales de la planta, contrario a las secuencias de la invención.

Por último, el QTL identificado por los inventores tiene la propiedad conveniente de mejorar el rendimiento y brix*rendimiento de una planta de S.lycopersicum,una vez introgresado en su genoma, independientemente de si la planta es determinada o indeterminada.

Los presentes inventores han identificado por lo tanto una fuente genética que confiere un fenotipo mejorado como se definió anteriormente, cuya fuente jamás ha sido probada anteriormente en este respecto. Asimismo, éstos han sido capaces de introgresar las secuencias de S.habrochaitesresponsables de este fenotipo mejorado.

Con introgresión, se quiere decir la infiltración de los genes o de secuencias genómicas de una especie en el acervo genético de otra proveniente de un híbrido interespecífico inicial entre dichas especies.

Con respecto a las secuencias introgresadas provenientes de la accesión HABR1 de S.habrochaitesespecífica que confiere el fenotipo mejorado de interés, éstas se eligen a partir de aquellas presentes en el genoma de una planta de la semilla de jitomate ToPATYIELD. Una muestra de esta semilla de S.lycopersicumha sido depositada por Hazera Seeds Ltd, Berurim, M.P. Shikmim 79837, Israel, conforme a, y en cumplimiento de, los requerimientos del Tratado de Budapest en materia de Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Propósitos de Procedimiento de Patente (el “Tratado de Budapest”) en el Depósito Nacional de Bacterias Industriales, de Alimentos y Marinas (NCIMB), (NCiMb Ltd, Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen AB21 9YA, Reino Unido), el 4 de abril de 2016, bajo el número de accesión NCIMB 42567.

Un depósito de esta semilla de jitomate es mantenido por Hazera Seeds Ltd, Berurim, M.P. Shikmim 79837, Israel.

Las semillas depositadas, y las plantas de las mismas, han sido obtenidas a partir de una cruza interespecífica inicial entre una planta de S.habrochaites,es decir el compañero de introgresión HABR1 que despliega el QTL de interés, pero no el fenotipo de interés, y una planta de la línea S.lycopersicumMoneyberg, el progenitor recurrente, seguido por varias retrocruzas. Las semillas depositadas provienen de una línea, que comprende secuencias introgresadas provenientes de S.habrochaitessolamente en el cromosoma 1. Las semillas depositadas representan un reservorio de secuencias introgresadas de S.habrochaitesen el genoma de S.lycopersicum.Las secuencias introgresadas que confieren el fenotipo mejorado de conformidad con la invención, es decir un rendimiento incrementado y Brix x rendimiento incrementado combinados, se eligen a partir de este reservorio, especialmente en el cromosoma 1.

De conformidad con un primer aspecto, la presente invención por lo tanto está dirigida a una planta deSolanum lycopersicumque comprende en su genoma, secuencias introgresadas provenientes de S.habrochaites,las cuales confieren a la planta un fenotipo mejorado con respecto a una planta correspondiente de S.lycopersicumcarente de dichas secuencias. El fenotipo mejorado de conformidad con la presente invención corresponde a la combinación de un rendimiento incrementado y una cantidad incrementada de azúcares solubles asignados a los frutos (Brix*Rendimiento o Brix x Rendimiento), con respecto a una planta correspondiente deS. lycopersicumcarente de dichas secuencias introgresadas. Las secuencias introgresadas se eligen de aquellas presentes en el genoma de semillas de S.lycopersicumnúmero de acceso de ToPATYIELD NCIMB 42567 y van a encontrarse en el cromosoma 1, dentro de la región cromosómica delimitada por SNP SL10332_112 (SEQ ID NO 1) y SNP EE_2225 (SEQ ID NO 13) y se caracterizan por la presencia en el genoma de dicha planta de al menos 5 de los siguientes alelos: alelo T de SNP SL10332_112 (SEQ ID NO. 1.), alelo C de SNP EP_1592 (SEQ ID NO. 2), alelo C de SNP EP_1027 (SEQ ID NO. 3), alelo G de SNP EP_1150 (SEQ ID NO. 4), alelo G de SNP EP_1876 (SEQ ID NO.5), alelo A de SNP EE_4621 (SEQ ID NO. 6), alelo G de SNP SL10522_138 (SEQ ID NO. 7), alelo T de SNP EP_0051 (SEQ ID NO. 8), alelo T de SNP IL2_3605 (SEQ ID NO. 9), alelo G de SNP SL20213_779 (SEQ ID NO. 10), alelo C de SNP SL20071_190 (SEQ ID NO. 11), alelo A de SNP IL2_6411 (SEQ ID NO. 12) y alelo T de SNP EE_2225 (SEQ ID NO. 13). La invención también está dirigida a una célula de dicha planta y semilla, que comprende dichas secuencias introgresadas. Las secuencias introgresadas, o QTL, confieren el fenotipo independientemente del hábito de crecimiento de la planta de S.lycopersicum,es decir ya sea determinada, semi-determinada o indeterminada.

Con Rendimiento se debe entender el rendimiento de fruto total por planta, especialmente el rendimiento de fruto comercial total por planta, incluyendo el fruto rojo y verde. Este parámetro se mide a través de la vida completa de las plantas, independientemente de su hábito de crecimiento determinado o indeterminado.

Con Brix*Rendim¡ento (o Brix x rendimiento) se debe entender el peso de azúcares solubles producidos por planta, Brix se refiere a los azúcares solubles, y especialmente sacarosa en los frutos. Mientras más alto el brix (o grado brix), mayor será el contenido de azúcar. La medición del brix es importante para evaluar el sabor de los frutos debido a que los frutos con brix bajo y por lo tanto bajo contenido de azúcar no serán apreciados por los clientes. TSS (Sólidos Solubles Totales) se refiere a todos los azúcares así como a los ácidos orgánicos en los frutos.

El grado Brix y Sólidos Solubles Totales (TSS por sus siglas en inglés) son parámetros altamente correlacionados de modo tal que el incremento en Brix*Rendimiento y el incremento en TSS*Rendimiento son concomitantes; el incremento en uno u otro de estos parámetros se utiliza por lo tanto de manera intercambiable en lo que sigue. En la medida en que el término Brix*Rendimiento es ampliamente utilizado y comúnmente aceptado por los profesionales en el campo de la invención, este término, sin embargo, de preferencia se utiliza en la siguiente descripción. Sin embargo, se debe entender que las plantas, células y semillas de la invención se pueden caracterizar de igual manera mediante un Brix*Rendimiento (Brix x Rendimiento) incrementado o un TSS*Rendimiento (TSS x Rendimiento) incrementado.

Con un “rendimiento incrementado” o un “Brix*Rendimiento incrementado”, se debe entender un incremento que es estadísticamente significativo.

Mientras que el fenotipo mejorado está caracterizado por los incrementos simultáneos del rendimiento y Brix*Rendimiento, o Rendimiento y TSS*Rendimiento; para una planta de la invención que tiene las secuencias introgresadas, el incremento en rendimiento y el incremento en Brix*Rendimiento, y por lo tanto en TSS*Rendimiento, puede sin embargo ser distinto, de magnitud diferente.

El incremento de preferencia es un incremento de por lo menos 10% para ambos parámetros, y de preferencia por lo menos 15% para ambos parámetros, de manera incluso más preferida por lo menos 20% para ambos parámetros. El incremento también puede ser un incremento de por lo menos 20% para por lo menos uno de los parámetros, y de por lo menos 10% o por lo menos 15% para el otro. Como se detalló anteriormente, el incremento se evalúa con respecto a una planta correspondiente que es distinta de una planta de la invención solamente por la ausencia de las secuencias introgresadas provenientes de S.habrochaitesy la presencia de las secuencias correspondientes de S.lycopersicum.

El rendimiento incrementado y TSS*Rendimiento o Brix*Rendimiento incrementado se puede medir entre otras cosas en invernaderos, por ejemplo como se detalla en la sección de ejemplos. El incremento en estos parámetros se puede observar independientemente de la temporada de cultivo, cuando hay más de una temporada de cultivo por año como en Israel, e independientemente de la ubicación.

Las secuencias introgresadas de conformidad con la invención, que confieren el fenotipo mejorado como se describió anteriormente son secuencias introgresadas elegidas a partir de aquellas presentes en el genoma de semillas de ToPATYIELD correspondiente al número de accesión NCIMB 42567.

Aunque todas las semillas depositadas poseen un fragmento introgresado en el mismo locus en ambos homólogos del cromosoma 1, y que confiere el fenotipo de conformidad con la invención, este fragmento introgresado puede variar ligeramente en longitud entre las semillas.

Tal como se utiliza en la presente solicitud, cromosomas homólogos, u homólogos, se refiere a un conjunto de cromosomas, uno materno y uno paterno, que se aparean uno con el otro durante la meiosis. Estas copias tienen los mismos genes en los mismos loci y la misma ubicación de centrómero.

Las secuencias introgresadas se van a encontrar en el cromosoma 1 de una planta de S.lycopersicumde la invención.

Las secuencias introgresadas actúan como un alelo dominante individual de un gen responsable del fenotipo mejorado, es decir el rasgo es monogénico y dominante. Las plantas homocigotas y heterocigotas para las secuencias introgresadas exhiben ambas completamente el fenotipo mejorado como se definió anteriormente.

Las secuencias introgresadas de la invención, que confieren el fenotipo en el fondo genético de S.lycopersicum,constituyen por lo tanto los loci de rasgo cuantitativo (QTL) que subyacen al rasgo correspondiente al fenotipo mejorado, específicamente un QTL individual responsable tanto del rendimiento incrementado como del Brix*Rendimiento incrementado.

Las secuencias introgresadas que confieren el fenotipo mejorado de la invención están ubicadas dentro de un intervalo cromosómico del cromosoma 1 el cual comprende el SNP SL10332_112 (SEQ ID No.1) y el SNP EE_2225 (SEQ ID No.13), de manera más preferida dentro de la región cromosómica delimitada por, y que de preferencia comprende, SNP SL10332_112 y SNP EE_2225.

Los polimorfismos específicos correspondientes a los SNPs (polimorfismo de nucleótido individual) a los que se hace referencia en esta descripción, así como las secuencias de flanqueo de dichos SNPs en el genoma de S.lycopersicum,se dan en la sección experimental (véaseinter aliatabla 2) y listado de secuencia anexo. Su ubicación con respecto a la versión 2.5 del genoma de jitomate, en el cromosoma 1, se indica en la tabla 2, y sus secuencias de flanqueo también se ilustran en la tabla 2 y en el listado de secuencias.

A este respecto se debe indicar que, por definición, un SNP se refiere a un nucleótido individual en el genoma, el cual es variable dependiendo del alelo que esté presente, mientras que los nucleótidos de flanqueo son idénticos. Para facilidad de identificación clara de la posición de los diferentes SNPs, su posición se da en la tabla 2, mediante referencia a la secuencia del genoma de jitomate y mediante referencia a sus secuencias de flanqueo, identificadas mediante el número de identificación de secuencia (SEQ ID No.). En la secuencia asociada con un SNP específico en la presente solicitud, por ejemplo SEQ ID No:1 para el SNP SL10332_112, solamente un nucleótido dentro de la secuencia realmente corresponde al polimorfismo, específicamente el nucleótido 61 de SEQ ID No:1 corresponde a la posición polimórfica SNP SL10332_112, el cual puede ser C o T como se indica en las tablas 1 y 2. Las secuencias de flanqueo se dan para posicionar el SNP en el genoma pero no son parte del polimorfismo como tal.

Los presentes inventores han identificado que las secuencias introgresadas esenciales para el fenotipo de interés se van a encontrar en la región cromosómica mencionada anteriormente, identificando la presencia de secuencias introgresadas en diferentes loci a lo largo de dicha región, específicamente en 13 loci diferentes definidos por los siguientes 13 SNPs: SL10332_112, EP_1592, EP_1027, EP_1150, EP_1876, EE_4621, SL10522_138, EP_0051, IL2_3605, SL20213_779, SL20071_190, IL2_6411 y EE_2225. La presencia de las secuencias introgresadas provenientes de S.habrochaitesen estos loci es por lo tanto indicativa del fenotipo mejorado de la invención. Estos 13 SNPs son referidos en la presente solicitud como los 13 SNPs de la invención.

Por lo tanto, de conformidad con un aspecto no reivindicado de la descripción, las secuencias introgresadas presentes en el genoma de una planta, semilla o célula de preferencia se van a encontrar por lo menos en uno o más de los 13 loci que abarcan dichos 13 SNPs mencionados anteriormente, específicamente el locus que abarca SL10332_112 (SEQ ID No.1), el locus que abarca EP_1592 (SEQ ID No.2), el locus que abarca EP_1027 (SEQ ID No.3), el locus que abarca EP_1150 (SEQ ID No.4), el locus que abarca EP_1876 (SEQ ID No.5), el locus que abarca EE_4621 (SEQ ID No.6), el locus que abarca SL10522_138 (SEQ ID No.7), el locus que abarca Ep_0051 (SeQ ID No.8), el locus que abarca IL2_3605 (SeQ ID No.9), el locus que abarca SL20213_779 (SEQ ID No.10), el locus que abarca SL20071_190 (SEQ ID No.11), el locus que abarca IL2_6411 (SEQ ID No.12) y/o el locus que abarca EE_2225 (SEQ ID No.13), por ejemplo en 2, 3, 4, 8, 10 o 12 de estos 13 loci, o en todos ellos.

Se debe indicar que, cuando las secuencias introgresadas se van a encontrar en más de uno de los loci anteriores, éstas de preferencia se van a encontrar en el mismo homólogo del cromosoma 1, independientemente de la ploidía de la planta, semilla o célula.

Cuando las secuencias introgresadas provenientes deS. habrochaitesque confieren el fenotipo mejorado de la invención se encuentran en un locus que abarca un SNP dado, esto significa que el alelo de este SNP es el alelo encontrado en el compañero de introgresión HABR1 de S.habrochaitessilvestre y también en las semillas depositadas ToPATYIELD (NCIMB 42567). Esto también significa que la región de flanqueo 5' de dichos SNPs, o la región de flanqueo 3' de dicho SNP, o ambas regiones, también son idénticas a las secuencias de S.habrochaitesen esta región. Por lo tanto, este SNP dado puede formar parte del borde 3' o el borde 5' del intervalo introgresado, o puede estar dentro del intervalo introgresado que confiere el fenotipo deseado.

Los alelos de los 13 SNPs de la invención correspondientes a los alelos del compañero de S.habrochaitesque confieren el fenotipo mejorado, son: alelo T de SL10332_112, alelo C de EP_1592, alelo C de EP_1027, alelo G de EP_1150, alelo G de EP_1876, alelo A de EE_4621, alelo G de SL10522_138, alelo T de EP_0051, alelo T de IL2_3605, alelo G de SL20213_779, alelo C de SL20071_190, alelo A de IL2_6411 y alelo T de EE_2225. La presencia de las secuencias introgresadas de interés puede ser revelada por la presencia de al menos 5 de dichos alelos específicos, característicos o representativos del compañero de introgresión que confiere el fenotipo mejorado, y distintos del alelo del progenitor S.lycopersicumrecurrente para estos. Los alelos de estos SNPs pueden por lo tanto reflejar la presencia de las secuencias de introgresión de la invención.

La presencia de secuencias introgresadas en el genoma de una planta, semilla o célula de S.lycopersicumse puede demostrar por ejemplo mediante hibridación genética in situ (GISH por sus siglas en inglés). GISH es en efecto una técnica poderosa para detección de la introgresión de material de cromatina de una especie a otra especie. La ventaja de GISH es que el proceso de introgresión se visualiza por medio de “ imágenes del genoma introgresado”. Con esta técnica, también es posible establecer si una región particular del genoma es homocigota o heterocigota, gracias al uso de marcadores citogenéticos moleculares los cuales son co-dominantes. Mediante esta técnica, también es posible determinar en cuál cromosoma y homólogo de cromosoma está presente un gen introgresado de interés.

De preferencia, en el genoma de una planta de S.lycopersicumde la invención, exceptuando las secuencias introgresadas en el cromosoma 1, que confieren el fenotipo de interés y elegidas a partir de aquellas presentes en las semillas ToPATYIELD número de accesión NCIMB 42567, no hay otro intervalo introgresado de 5 kilobases o más de longitud, de S.habrochaites,de preferencia ningún otro intervalo de 1 kb o más de S.habrochaites.Sin embargo, no se excluye que otras secuencias introgresadas, provenientes de otras accesiones silvestres, se encuentren en el genoma de una planta de la invención.

Las secuencias introgresadas que confieren el fenotipo corresponden a un intervalo introgresado individual en el cromosoma 1. El intervalo cromosómico que confiere el fenotipo de interés, especialmente el intervalo o región delimitada en un lado por SL10332_112 y en el otro lado por EE_2225, comprende o corresponde exclusivamente a secuencias introgresadas provenientes deS. habrochaites. De conformidad con esta modalidad, en una planta, semilla o célula de la invención, el fragmento genómico correspondiente a dicho intervalo, es un fragmento de introgresión de S.habrochaitesy por lo tanto tiene la misma secuencia que el fragmento genómico delimitado por los mismos SNPs en las semillas depositadas ToPATYIELD NCIMB 42567.

Se indica en este sentido que las posiciones específicas en un cromosoma pueden en efecto ser definidas con respecto al polimorfismo de nucleótido individual, en la medida en que las secuencias de flanqueo de dichos SNPs estén definidas con el fin de posicionarlas inequívocamente en el genoma. Los presentes inventores han utilizado SNPs, identificados por sus secuencias de flanqueo, presentes en los genomas de S.habrochaitesy de S.lycopersicumcon diferentes alelos, para discriminar entre secuencias introgresadas y secuencias que residen de forma endógena y para rastrear las secuencias introgresadas provenientes de S.habrochaitesen el genoma de S.lycopersicum.

Una región cromosómica delimitada por dos SNPs X y Y se refiere a la sección del cromosoma que yace entre las posiciones de estos dos SNPs y que comprende dichos SNPs, por lo tanto la secuencia de nucleótido de esta región cromosómica comienza con el nucleótido correspondiente a SNP X y termina con el nucleótido correspondiente a SNP Y, es decir los SNPs están comprendidos dentro de la región que éstos delimitan, en el sentido de la invención.

De conformidad con una modalidad preferida, las secuencias introgresadas provenientes de S.habrochaitesen una planta, semilla o célula de la invención, especialmente un intervalo introgresado como se definió anteriormente, comprenden por lo menos 10 kilobases, de preferencia por lo menos 100 kilobases, por lo menos 1000 kilobases.

En una planta, semilla o célula de la invención, la presencia de las secuencias introgresadas que confieren el fenotipo de interés de preferencia está caracterizada por el alelo T de IL2_3605 y/o por el alelo A de IL2_6411, y de preferencia por la presencia de ambos alelos simultáneamente en un homólogo del cromosoma 1, o en ambos, de una planta, semilla o célula de la invención.

Las secuencias introgresadas provenientes de S.habrochaitesque confieren el fenotipo mejorado de la invención se van a encontrar de manera homocigota o heterocigota en una planta, semilla o célula de la invención.

De conformidad incluso con otra modalidad, una planta de la invención es una planta determinada, indeterminada o semi-indeterminada, o semilla o célula de la misma, es decir correspondiente al hábito de crecimiento determinado, indeterminado o semi-indeterminado.

Con determinado, se quiere decir plantas de jitomate que tienden a hacer crecer primero su follaje, después dan flores que maduran como frutos si la polinización es exitosa. Todos los frutos tienden a madurar en una planta aproximadamente al mismo tiempo. Los jitomates indeterminados comienzan haciendo crecer algo de follaje, después continúan produciendo follaje y flores a través de toda la temporada de cultivo. Estas plantas tenderán a tener fruto de jitomate en diferentes etapas de madurez en cualquier tiempo dado. Los jitomates semi-determinados tienen un fenotipo entre determinado e indeterminado, éstos son tipos determinados típicos excepto que crecen más grandes que las variedades determinadas.

La invención también está dirigida a plantas híbridas de S.lycopersicum,que se pueden obtener cruzando una planta que tiene el fenotipo mejorado y que lleva de manera homocigota las secuencias introgresadas de la invención, con otro S.lycopersicum,de preferencia con una planta carente de las secuencias de introgresión de S.habrochaites.

De preferencia, una planta de S.lycopersicumde conformidad con la invención es una planta o línea comercial. Dicha planta o línea comercial de preferencia también exhibe resistencia a ToMV (virus del mosaico del jitomate), por ejemplo debido a la presencia de un gen de resistenciaTm-2(aleloTm-2oTm-22(también conocido como Tm-2a)) o Tm-1, el cual también confiere resistencia a TMV (virus del mosaico del tabaco). Una planta de conformidad con este aspecto de la invención de preferencia también tiene las siguientes características adicionales: rasgo de resistencia a nemátodo (Mi-1 o Mi-j), así como resistencias a Fusarium y Verticillium.

Además, la planta comercial de la invención da origen a frutos en condiciones apropiadas, los cuales son por lo menos de 10 gramos en plena madurez, de preferencia por lo menos 25 g en plena madurez y o incluso de manera más preferida por lo menos 50 g en plena madurez.

Como se detalló anteriormente, la invención está dirigida a plantas de S.lycopersicum,que exhiben el fenotipo mejorado, así como a semillas que dan origen a dichas plantas.

Una planta o semilla de conformidad con la invención puede ser una progenie o descendencia de una planta cultivada a partir de las semillas depositadas ToPATYIELD, depositadas en el NCIMB bajo el número de accesión NCIMB 42567. Las plantas cultivadas a partir de las semillas depositadas son en efecto homocigotas para las secuencias introgresadas que confieren el fenotipo mejorado, por lo tanto éstas llevan en su genoma las secuencias introgresadas de interés en cada uno de los homólogos del cromosoma 1. Estas se pueden utilizar para transferir dichas secuencias a otro fondo genético mediante cruzamiento y auto-fecundación y/o retrocruzamiento.

La invención también está dirigida a las semillas depositadas de ToPATYIELD (NCIMB 42567) y a las plantas cultivadas a partir de una de estas semillas. Dichas semillas contienen de manera homocigota las secuencias introgresadas y confieren el fenotipo de interés; sin embargo éstas son distintas en algunos otros rasgos fenotípicos de modo tal que éstas no forman una variedad vegetal.

La invención también está dirigida a plantas o semillas como se definió anteriormente, es decir que contienen las secuencias introgresadas de interés en estado homocigoto o heterocigoto, dichas secuencias confieren el fenotipo mejorado, cuyas plantas o semillas se pueden obtener transfiriendo las secuencias introgresadas desde una planta de S.lycopersicum,las semillas representativas de la misma se depositaron bajo la accesión NCIMB-42567 de NCIMB, hacia otro fondo genético de S.lycopersicum,por ejemplo cruzando dicha planta con una segunda planta de jitomate progenitora y selección de la planta que lleva las secuencias introgresadas responsables del fenotipo de interés.

La invención en un segundo aspecto también se refiere a cualquier planta con probabilidad de ser obtenida a partir de la semilla o plantas de la invención como se describió anteriormente, y también partes vegetales de dicha planta, y de manera más preferida explante, retoño, corte, semilla, fruto, raíz, rizoma, polen, óvulo, embrión, protoplasto, hoja, antera, tallo, peciolo, y cualesquiera otras partes vegetales, en el cual dicha planta, explante, retoño, corte, semilla, fruto, raíz, rizoma, polen, óvulo, embrión, protoplasto, hoja, antera, tallo, peciolo, y/o parte vegetal se puede obtener a partir de una semilla o planta de conformidad con el primer aspecto de la invención, es decir que lleva las secuencias introgresadas de interés de manera homocigota o heterocigota en su genoma. Dichas partes vegetales,inter aliaexplante, retoño, corte, semilla, fruto, raíz, rizoma, polen, óvulo, embrión, protoplasto, hoja, antera, tallo o peciolo, comprenden en su genoma las secuencias introgresadas de S.habrochaitesque confieren el fenotipo de interés, es decir rendimiento incrementado y brix*rendimiento incrementado o rendimiento incrementado y TSS*rendimiento incrementado. Las secuencias introgresadas a las que se hace referencia en este aspecto de la invención son aquellas definidas anteriormente en el contexto de plantas de la invención. Las diferentes características de las secuencias introgresadas definidas con relación al primer aspecto de la invención se aplicanmutatis mutandisa este aspecto de la invención. Las secuencias introgresadas por lo tanto se eligen a partir de aquellas presentes en el genoma de una planta correspondiente al material depositado ToPATYIELD (número de accesión NCIMB 42567), van a encontrarse en el cromosoma 1, dentro de la región cromosómica delimitada por SNP SL10332_112 (SEQ ID NO 1) y SNP EE_2225 (SEQ ID NO 13) y se caracterizan por la presencia en el genoma de dicha planta de al menos 5 de los siguientes alelos: alelo T de SNP SL10332_112 (SEQ ID NO. 1.), alelo C de SNP EP_1592 (SEQ ID NO. 2), alelo C de SNP EP_1027 (SEQ ID NO. 3), alelo G de SNP EP_1150 (SEQ ID NO. 4), alelo G de SNP EP_1876 (SEQ ID NO.5), alelo A de SNP EE_4621 (SEQ ID NO. 6), alelo G de SNP SL10522_138 (SEQ ID NO. 7), alelo T de SNP EP_0051 (SEQ ID NO. 8), alelo T de SNP IL2_3605 (SEQ ID NO. 9), alelo G de SNP SL20213_779 (SEQ ID NO. 10), alelo C de SNP SL20071_190 (SEQ ID NO. 11), alelo A de SNP IL2_6411 (SEQ ID NO. 12) y alelo T de SNP EE_2225 (SEQ ID NO. 13). Estas se caracterizan de manera conveniente por la presencia del alelo T de IL2_3605 y/o alelo A de IL2_6411, y de preferencia por la presencia de ambos alelos simultáneamente en un cromosoma, específicamente en por lo menos un homólogo del cromosoma 1.

La invención también está dirigida a células de plantas de S.lycopersicum,de modo tal que estas células comprenden, en su genoma, secuencias introgresadas provenientes de S.habrochaitesque confieren el fenotipo de interés a una planta de S.lycopersicum.Las secuencias introgresadas son aquellas ya definidas en el marco de la presente invención, éstas están caracterizadas por las mismas características y modalidades preferidas ya descritas con respecto a las plantas y semillas de conformidad con los aspectos precedentes de la invención. La presencia de estas secuencias introgresadas puede ser revelada mediante las técnicas descritas anteriormente y bien conocidas para el lector calificado. Se puede determinarinter aliasi las secuencias introgresadas están presentes en forma homocigota o heterocigota en el genoma de dicha célula de la invención. Estas se caracterizan de manera conveniente mediante la presencia del alelo T de IL2_3605 y/o mediante el alelo A de IL2_6411, y de preferencia mediante la presencia de ambos alelos simultáneamente en el mismo cromosoma, específicamente en por lo menos un homólogo del cromosoma 1.

Las células de conformidad con la invención pueden ser cualquier tipo de células de S.lycopersicum, inter aliauna célula aislada y/o una célula capaz de regenerar una planta de S.lycopersicumcompleta, que lleva las secuencias introgresadas de S.habrochaitesligadas al fenotipo de interés.

La presente invención también está dirigida a un cultivo de tejidos de células regenerables de la planta como se definió anteriormente de conformidad con la presente invención; de preferencia, las células regenerables se obtienen a partir de embriones, protoplastos, células meristemáticas, callos, polen, hojas, anteras, tallos, peciolos, raíces, puntas de raíz, frutos, semillas, flores, cotiledones, y/o hipocotilos de la invención, y por lo tanto contienen en su genoma las secuencias introgresadas de S.habrochaitesen el cromosoma 1 que confieren el fenotipo mejorado, específicamente rendimiento incrementado y brix*rendimiento/TSS*Rendimiento incrementado con respecto a una planta carente de dichas secuencias introgresadas.

El cultivo de tejidos de preferencia será capaz de regenerar plantas que tienen las características fisiológicas y morfológicas de la planta de jitomate anterior, y de regenerar plantas que tienen sustancialmente el mismo genotipo que el de la planta de jitomate anterior. La presente invención también provee plantas de jitomate regeneradas a partir de los cultivos de tejido de la invención.

La invención también provee un protoplasto de la planta definida anteriormente, o del cultivo de tejido definido anteriormente, dicho protoplasto contiene las secuencias introgresadas de S.habrochaitesque confieren el fenotipo mejorado de la invención.

De conformidad con otro aspecto no reivindicado, la presente invención también está dirigida al uso de una planta de jitomate de la invención, que de preferencia comprende de manera homocigota las secuencias introgresadas, como un compañero de reproducción en un programa de mejoramiento para obtener plantas de S.lycopersicumque tienen el fenotipo mejorado de la invención. En efecto, dicho compañero de reproducción aloja de manera homocigota en su genoma las secuencias introgresadas de S.habrochaites,que confieren el fenotipo de interés. Mediante cruzamiento de esta planta con una planta de jitomate, especialmente una línea, es, por lo tanto, posible transferir estas secuencias, que confieren el fenotipo deseado, a la progenie debido a que el fenotipo es un rasgo monogénico. Por lo tanto, una planta de conformidad con la invención se puede utilizar como un compañero de reproducción para introgresar las secuencias que confieren el fenotipo deseado en una planta o germoplasma de S.lycopersicum, inter aliaen un programa de mejoramiento para incrementar simultáneamente el rendimiento y la cantidad de azúcares solubles asignados a los frutos (Brix*Rendimiento) de plantas de S.lycopersicum.Aunque una planta o semilla que lleva las secuencias introgresadas de interés en forma heterocigota, también puede ser utilizada como un compañero de reproducción como se detalló anteriormente, es probable que la segregación del fenotipo haga que el programa de mejoramiento sea más complejo.

Las secuencias introgresadas de S.habrochaitesserán introducidas de manera conveniente en variedades que contienen otros rasgos genéticos deseables tales como resistencia a la enfermedad, maduración temprana del fruto, tolerancia a la sequía, forma del fruto, y similares.

La descripción también está dirigida al mismo uso no reivindicado con plantas o semilla de ToPATYIELD, depositada en el NCIMB bajo el número de accesión NCIMB 42567. Dichas plantas también son apropiadas como compañeros de introgresión en un programa de mejoramiento dirigido a conferir el fenotipo deseado a una planta o germoplasma deS. lycopersicum.

En dicho programa de mejoramiento, la selección de la progenie que despliega el fenotipo deseado, o que lleva secuencias ligadas al fenotipo deseado, se puede efectuar de manera conveniente tomando como base los alelos de los marcadores de SNP, especialmente los marcadores de SNP de la invención. La progenie de preferencia se selecciona sobre la presencia del alelo T de IL2_3605 y/o alelo A de IL2_6411, y de preferencia mediante la presencia de ambos alelos simultáneamente en un homólogo del cromosoma 1.

La selección se hace sobre la presencia simultánea de por lo menos 5 de los siguientes alelos de SNP: alelo T de SNP SL10332_112 (SEQ ID No.1.), alelo C de SNP EP_1592 (SEQ ID No.2), alelo C de SNP EP_1027 (SEQ ID No.3), alelo G de SNP EP_1150 (SEQ ID No.4), alelo G de SNP EP_1876 (SEQ ID No.5), alelo A de SNP EE_4621 (SEQ ID No.6), alelo G de SNP SL10522_138 (SEQ ID No.7), alelo T de SNP EP_0051 (SEQ ID No.8), alelo T de SNP IL2_3605 (SEQ ID No.9), alelo G de SNP SL20213_779 (SEQ ID No.10), alelo C de SNP SL20071_190 (SEQ ID No.11), alelo A de SNP IL2_6411 (SEQ ID No.12) y alelo T de SNP EE_2225 (SEQ ID No.13), en una muestra de material genético de la planta que se va a seleccionar. La presencia de estos alelos confirma en efecto la presencia de secuencias introgresadas en los loci definidos por dichos SNPs. Asimismo, además de la mutación puntual o evento de recombinación, es concebible que se pierda por lo menos 1 o 2 de estos alelos, sin embargo el resto del fragmento de introgresión sigue confiriendo el fenotipo de interés.

Una planta de conformidad con la invención, o que se cultiva a partir de una semilla como la depositada bajo el número de accesión NCIMB 42567, es por lo tanto particularmente valiosa en una selección asistida por marcador para obtener líneas y variedades de jitomate comerciales, que tienen el fenotipo mejorado de la invención.

La invención también está dirigida al uso de dichas plantas en un programa dirigido a identificar, secuenciar y/o clonar los genes que confieren el fenotipo deseado.

Cualquier modalidad específica descrita para los aspectos previos de la invención también es aplicable a este aspecto de la invención, especialmente con respecto a las características de las secuencias introgresadas de S.habrochaitesque confieren el fenotipo de interés.

La invención también está dirigida a un método para detectar y/o seleccionar plantas de S.lycopersicumque tienen secuencias introgresadas provenientes de S.habrochaitescomo las encontradas en el genoma de las semillas de ToPATYIELD (número de accesión NCIMB 42567), dichas secuencias introgresadas confieren un fenotipo mejorado, correspondiente tanto a un rendimiento incrementado como a una cantidad incrementada de azúcares solubles asignados a los frutos (Brix*Rendimiento), con respecto a una planta correspondiente carente de dichas secuencias, independientemente del hábito de crecimiento de la planta, el método comprende la detección de por lo menos cinco de los siguientes marcadores: alelo T de SNP SL10332_112 (SEQ ID No.1.), alelo C de SNP EP_1592 (SEQ ID No.2), alelo C de SNP EP_1027 (SEQ ID No.3), alelo G de SNP EP_1150 (SEQ ID No.4), alelo G de SNP EP_1876 (SEQ ID No.5), alelo A de SNP EE_4621 (SEQ ID No.6), alelo G de SNP SL10522_138 (SEQ ID No.7), alelo T de SNP EP_0051 (SEQ ID No.8), alelo T de SNP IL2_3605 (SEQ ID No.9), alelo G de SNP SL20213_779 (SEQ ID No.10), alelo C de SNP SL20071_190 (SEQ ID No.11), alelo A de SNP IL2_6411 (SEQ ID No.12) y alelo T de SNP EE_2225 (SEQ ID No.13), en una muestra de material genético de la planta que se va a seleccionar.

De conformidad incluso con un aspecto no reivindicado, la descripción también se refiere a métodos o procesos para la producción de plantas de S.lycopersicumque tienen el fenotipo deseado, especialmente plantas comerciales y líneas parentales endógamas. La presente descripción también está dirigida en efecto a transferir las secuencias introgresadas que confieren el fenotipo mejorado como se definió, a otras variedades de jitomate, u otras especies o líneas parentales endógamas, y es útil para producir nuevos tipos y variedades de jitomates.

Un método o proceso para la producción de una planta que tiene estas características puede comprender los siguientes pasos:

a) Cruzar una planta cultivada a partir de una semilla depositada NCIMB 42567, o progenie de la misma, que lleva las secuencias que confieren tanto un rendimiento incrementado como una cantidad incrementada de azúcares solubles asignados a los frutos (Brix*Rendimiento) con respecto a una planta correspondiente carente de dichas secuencias, y una planta inicial de S.lycopersicum,de preferencia carente de dichas secuencias;

b) Seleccionar una planta en la progenie así obtenida, que tiene tanto un rendimiento incrementado como una cantidad incrementada de azúcares solubles asignados a los frutos (Brix*Rendimiento), con respecto a la planta inicial;

c) Opcionalmente auto-polinizar una o varias veces la planta obtenida en el paso b) y seleccionar en la progenie así obtenida una planta que tiene tanto un rendimiento incrementado como una cantidad incrementada de azúcares solubles asignados a los frutos (Brix*Rendimiento), con respecto a la planta inicial.

De manera alternativa, el método o proceso puede comprender en lugar del paso a) los siguientes pasos:

a1) Cruzar una planta correspondiente a las semillas depositadas (NCIMB 42567), o progenie de la misma que lleva las secuencias que confieren tanto un rendimiento incrementado como una cantidad incrementada de azúcares solubles asignados a los frutos (Brix*Rendimiento) con respecto a una planta correspondiente carente de dichas secuencias, y una planta inicial deS. lycopersicum, de preferencia carente de dichas secuencias, a2) Incrementar el híbrido F1 por medio de auto-fecundación para crear la población F2.

En los métodos o procesos no reivindicados anteriores, los marcadores de los SNPs de preferencia se utilizan en los pasos b) y/o c), para seleccionar plantas que llevan secuencias que confieren el fenotipo de interés, es decir brix*rendimiento incrementado y rendimiento incrementado.

Los marcadores de SNP de preferencia son uno o más de los 13 marcadores de SNP de la invención, y de preferencia uno o ambos de los 2 marcadores de SNP preferidos IL2_3605 e IL2_6411.

De conformidad con un aspecto no reivindicado preferido, la selección se hace por lo menos parcialmente con base al alelo de IL2_3605 y/o mediante el alelo de IL2_6411. De manera incluso más preferida la selección se efectúa detectando los alelos de estos 2 marcadores de SNP. De manera alternativa, la selección se puede hacer sobre la detección del alelo de por lo menos 2 SNPs elegidos de entre los 13 SNPs de la invención.

De preferencia, la selección se hace sobre por lo menos 3 SNPs, de preferencia por lo menos 4, 5 o 6, siendo por lo menos uno o dos de los mismos IL2_3605 y/o IL2_6411. La selección también se puede hacer sobre la detección de los alelos de todos estos SNPs.

De conformidad con un aspecto no reivindicado preferido, la selección se hace con base a los alelos de los 2 SNPs IL2 3605 e IL2 6411.

Con seleccionar una planta con base al alelo de uno o más SNPs, se debe entender que se selecciona la planta que tiene tanto un rendimiento incrementado como una cantidad incrementada de azúcares o sólidos solubles asignados a los frutos (Brix*Rendimiento o TSS*Rendimiento), con respecto a la planta inicial, cuando el alelo del o los SNP es (son) el o los alelos correspondientes al alelo del progenitor HABR1 para este SNP y no el alelo de la planta de S.lycopersicuminicial. Por ejemplo, se puede seleccionar una planta que tenga el fenotipo mejorado de la invención, cuando se detecta el alelo T de SNP IL2_3605 y/o el alelo A de SNP IL2_6411.

De preferencia, la planta de S.lycopersicumdel paso a) es una línea de élite, utilizada para obtener una planta con rasgos comercialmente deseados o rasgos hortícolas deseados.

Un método o proceso no reivindicado como se definió anteriormente puede comprender de manera conveniente pasos de retrocruzamiento, de preferencia después del paso c), con el fin de obtener plantas que tengan todos los elementos caracterizadores de las plantas de S.lycopersicum.Por consiguiente, un método o proceso para la producción de una planta que tiene estas características también puede comprender los siguientes pasos adicionales:

d) Someter a retrocruzamiento la planta seleccionada en el paso b) o c) con una planta de S.lycopersicum;e) Seleccionar una planta que tiene tanto un rendimiento incrementado como una cantidad incrementada de azúcares solubles asignados al fruto (Brix*Rendimiento), con respecto a la planta inicial.

La planta utilizada en el paso a), específicamente la planta correspondiente a las semillas depositadas puede ser una planta cultivada a partir de las semillas depositadas; de manera alternativa ésta puede ser cualquier planta de conformidad con el primer aspecto de la invención, que lleva las secuencias introgresadas que confieren el fenotipo, de preferencia que lleva estas secuencias en forma homocigota.

En el paso e), se pueden utilizar los marcadores de SNPs para seleccionar plantas que tienen tanto un rendimiento incrementado como una cantidad incrementada de sólidos y azúcares solubles asignados al fruto (TSS*Rendimiento y Brix*Rendimiento), con respecto a la planta inicial. Los marcadores de SNP son aquellos de la invención, como se describió en las secciones previas.

De conformidad con un aspecto no reivindicado preferido, el método o proceso de la invención se efectúa de modo tal que, para por lo menos cinco de los pasos de selección, específicamente b), c) y/o e), la selección se basa en la detección de por lo menos uno de los siguientes alelos: alelo T de SNP SL10332_112, alelo C de SNP EP_1592, alelo C de SNP EP_1027, alelo G de SNP EP_1150, alelo G de SNP EP_1876, alelo A de SNP EE_4621, alelo G de SNP SL10522_138, alelo T de SNP EP_0051, alelo T de SNP IL2_3605, alelo G de SNP SL20213_779, alelo C de SNP SL20071_190, alelo A de SNP IL2_6411 y alelo T de SNP EE_2225.

Cuando la selección se hace en base a más de un SNPs, se prefiere que la selección se base en la presencia, en el mismo homólogo del cromosoma 1, de los alelos representativos del progenitor HABR1.

De preferencia, la selección se basa en la presencia simultánea del alelo T de SNP IL2_3605 y del alelo A de SNP IL2_6411, especialmente la presencia simultánea de ambos alelos en el mismo homólogo del cromosoma 1.

Se debe indicar que, cuando las plantas que tienen el fenotipo mejorado, y que llevan de manera homocigota las secuencias introgresadas que confieren este fenotipo, se van a seleccionar, la selección se va hacer tomando como base uno o más de los SNPs de la invención, sobre la presencia de los alelos representativos de las secuencias introgresadas, específicamente los alelos del progenitor HABR1, acoplado a la ausencia de los alelos representativos del progenitorS. lycopersicumrecurrente.

De preferencia, cada paso de selección se efectúa mediante detección del alelo T de SNP IL2_3605 y del alelo A de SNP IL2_6411, en el mismo homólogo del cromosoma 1.

La planta seleccionada en el paso e) de preferencia es una planta comercial, especialmente una planta que tiene frutos cuyo peso es de por lo menos 25 g, o por lo menos 50 g en plena madurez en condiciones de cultivo normales.

De preferencia, los pasos d) y e) se repiten por lo menos dos veces y de preferencia tres veces, necesariamente con la misma planta de S.lycopersicum.Dicha planta de S.lycopersicumde preferencia es una línea de mejoramiento.

De manera adicional, se puede seleccionar el rasgo de resistencia a nemátodos o resistencia a ToMV, en cada paso de selección de los procesos descritos anteriormente.

Los pasos de auto-polinización y retrocruzamiento se pueden efectuar en cualquier orden y pueden estar intercalados, por ejemplo se puede efectuar una retrocruza antes y después de una o varias auto-polinizaciones, y las autopolinizaciones se pueden contemplar antes y después de una o varias retrocruzas.

La selección de la progenie que tiene el fenotipo mejorado deseado también se puede hacer tomando como base la comparación de Rendimiento y Brix*Rendimiento con Rendimiento y Brix*Rendimiento del progenitor S.lycopersicum,como se describeinter aliaen los ejemplos.

El método utilizado para detección de alelo puede estar basado en cualquier técnica que permita la distinción entre dos alelos diferentes de un SNP, en un cromosoma específico.

La planta seleccionada al final del proceso, en el paso c) o e) o después de cualesquiera pasos adicionales como se describió anteriormente, es de manera conveniente una línea de jitomate endógama parental la cual se puede utilizar para producción de semillas de jitomate F1 comerciales híbridas, cruzando dicha línea parental, homocigota para las secuencias introgresadas de la invención, con otra línea endógama, que de preferencia no lleve dichas secuencias. Las plantas cultivadas a partir de las semillas así obtenidas tienen el fenotipo mejorado de conformidad con la invención.

La descripción también está dirigida, en un aspecto no reivindicado, a un método o proceso para obtener plantas de S.lycopersicumque tienen el fenotipo mejorado deseado, en el cual dicho método comprende los pasos de:

a) Hacer una cruza interespecífica entre una planta de S.habrochaitesy una planta de S.lycopersicum,b) Seleccionar un híbrido en la progenie así obtenida que lleve las secuencias ligadas al fenotipo mejorado, c) auto-polinizar una o varias veces la planta obtenida en el paso b) y seleccionar un híbrido en la progenie así obtenida que lleve las secuencias ligadas al fenotipo mejorado;

d) someter a retrocruza el híbrido seleccionado en el paso b) o c) con una planta de S.lycopersicum;

e) seleccionar una planta que lleve la secuencia introgresada que confiere el fenotipo mejorado,

f) Opcionalmente auto-polinizar la planta obtenida en el paso e), y

g) Opcionalmente seleccionar una planta que lleve la secuencia introgresada que confiere el fenotipo mejorado,

en el cual se pueden repetir los pasos d) a g) y en el cual los marcadores de SNPs se utilizan en los pasos b), c), e) y/o g) para seleccionar plantas que tienen el fenotipo mejorado, correspondiente a rendimiento incrementado acoplado con Brix*Rendimiento incrementado, como se detalló para los métodos previos.

La planta seleccionada al final del método de preferencia es una planta comercial o una línea parental endógama de la misma, especialmente una planta que tiene frutos cuyo peso es de por lo menos 25 g, o por lo menos 50 g, en plena madurez en condiciones de cultivo normales.

La descripción también se refiere a un método no reivindicado en el cual no se llevan a cabo los pasos a) a c) y en el cual el paso d) se efectúa con una planta obtenida a partir de la semilla depositada (número de accesión NCIMB 42567) en lugar del híbrido mencionado anteriormente en el paso d).

Todas las modalidades preferidas recitadas anteriormente para el método previo se aplicanmutatis mutandisa este método alternativo. En especial, los pasos d) y e) se pueden repetir, éstos de preferencia se efectúan dos, o tres veces. Lo mismo aplica para los pasos f) y g) los cuales de preferencia se efectúan dos, tres veces o más. La planta así obtenida de preferencia es para uso como una línea endógama parental para la producción de semillas de jitomate F1 comerciales híbridas.

La presente invención también se refiere a una planta obtenida o que se puede obtener mediante dicho método. Dicha planta es en efecto una planta de S.lycopersicumque tiene el fenotipo mejorado de conformidad con el primer aspecto de la invención.

La descripción también está dirigida a un método no reivindicado para obtener plantas de jitomate comerciales o líneas parentales endógamas del mismo, que tienen el fenotipo mejorado deseado, correspondiente tanto a un rendimiento incrementado como a una cantidad incrementada de azúcares y sólidos solubles asignados al fruto (Brix*Rendimiento), con respecto a una planta de S.lycopersicumcomercial inicial, que comprende los pasos de:

a) Someter a retrocruzamiento una planta que se obtiene germinando una semilla depositada ToPATYIELD número de accesión NCIMB 42567, con una planta de S.lycopersicumcomercial,

b) Seleccionar una planta que tiene el fenotipo mejorado.

De preferencia, la selección se hace tomando como base uno o más de los 13 SNPs de la invención, como se detalló para los otros métodos de la invención.

De conformidad con una modalidad preferida, el paso b) es un paso para seleccionar una planta que lleva el alelo T de SNP IL2_3605 y el alelo A de SNP IL2_6411, de preferencia en el mismo homólogo del cromosoma 1.

En todos los métodos y procesos no reivindicados, la planta de S.lycopersicuminicial es determinada, indeterminada o semi-determinada. De conformidad con un aspecto, la planta de S.lycopersicumutilizada en los procesos es una planta que tiene un hábito de crecimiento indeterminado.

Como se describió anteriormente, las plantas de jitomate de conformidad con la invención de preferencia también son resistentes al virus del mosaico del jitomate, a nemátodos, y a Fusarium y Verticillium. Para obtener dichas plantas en los procesos y métodos, los progenitores de S.lycopersicumutilizados en los programas de mejoramiento no reivindicados de preferencia llevan secuencias que confieren resistencia al virus del mosaico del jitomate, a nemátodos, y a Fusarium y Verticillium; y los pasos de selección se efectúan para seleccionar plantas que tienen estas secuencias de resistencia, además de las secuencias introgresadas que confieren el fenotipo mejorado de la invención.

La presente invención también está dirigida a una planta de S.lycopersicumque se puede obtener mediante cualquiera de los métodos y procesos descritos anteriormente.

Además de la introgresión de las secuencias que confieren el fenotipo mejorado como se detalló en los métodos de la invención, dichas secuencias también se pueden introducir en el fondo genético de S.lycopersicummediante ingeniería genética con el fin de obtener una planta de S.lycopersicumcomercial que exhiba el fenotipo mejorado. La identificación y clonación de las secuencias introgresadas provenientes de S.habrochaitesque confieren el fenotipo deseado,inter aliaa partir del depósito, son rutina para el experto en la técnica.

La invención también está dirigida a un método para detectar y/o seleccionar plantas de S.lycopersicumque tienen secuencias introgresadas provenientes de S.habrochaitesque confieren el fenotipo mejorado, tomando como base la detección de alelo de por lo menos cinco SNP elegidos de entre los 13 SNPs de la invención en el cromosoma 1, de preferencia por lo menos SNP IL2_3605 e IL2_6411.

Las plantas que llevan las secuencias introgresadas se seleccionan si por lo menos 5 o todos, de alelo T de SNP SL10332_112, alelo C de SNP EP_1592, alelo C de SNP EP_1027, alelo G de SNP EP_1150, alelo G de SNP EP_1876, alelo A de SNP EE_4621, alelo G de SNP SL10522_138, alelo T de SNP EP_0051, alelo T de SNP IL2_3605, alelo G de SNP SL20213_779, alelo C de SNP SL20071_190, alelo A de SNP IL2_6411 y alelo T de SNP EE_2225, se detectan en una muestra de material genético de la planta que se va a seleccionar, de preferencia en el mismo homólogo del cromosoma 1. De manera más preferida, se selecciona una planta si por lo menos uno o ambos de los siguientes alelos es/son detectados: alelo T de SNP IL2_3605 y alelo A de SNP IL2_6411, de preferencia en el mismo homólogo del cromosoma 1.

La invención también está dirigida al uso de la información provista con la presente por los presentes inventores, específicamente la existencia de un QTL, presente en HABR1 y en las semillas depositadas, y que confiere el fenotipo mejorado a plantas deS. lycopersicum, y la descripción de marcadores moleculares asociados a este QTL. Este conocimiento se puede utilizarinter aliapara mapear en forma precisa el QTL, para definir su secuencia, para identificar plantas de jitomate que comprenden el QTL que confiere el fenotipo mejorado y para identificar marcadores adicionales o alternativos asociados con este QTL. Dichos marcadores adicionales se caracterizan por su ubicación, específicamente cercanos a los marcadores descritos en la presente invención, y por su asociación con el fenotipo de interés, revelada por la invención.

La invención también está dirigida al uso de por lo menos uno de los marcadores de SNP SL10332_112, EP_1592, EP_1027, EP_1150, EP_1876, EE_4621, SL10522_138, EP_0051, IL2_3605, SL20213_779, SL20071_190, IL2_6411 y EE_2225, asociados con las secuencias introgresadas o QTL en el cromosoma 1 que confieren el fenotipo mejorado de conformidad con la invención, para identificar marcadores moleculares alternativos asociados con dichas secuencias introgresadas, en el cual dichos marcadores moleculares alternativos están en la región cromosómica delimitada en el cromosoma 1 por SL10332_112 y EE_2225, o en menos de 1 megabase desde el locus de por lo menos uno de los marcadores de SNP SL10332_112, EP_1592, EP_1027, EP_1150, EP_1876, EE_4621, SL10522_138, EP_0051, IL2_3605, SL20213_779, SL20071_190, IL2_6411 y EE_2225. Los marcadores moleculares alternativos de preferencia están asociados con dichas secuencias introgresadas/QTL con un valor p de 0,05 o menor, de preferencia menor de 0,01. El QTL o las secuencias introgresadas se van a encontrar en las semillas depositadas NCIMB 42567.

La invención también está dirigida a un método para identificar un marcador molecular asociado con un QTL que confiere el fenotipo mejorado de la invención, que comprende:

identificar un marcador molecular en la región cromosómica delimitada en el cromosoma 1 por los marcadores de SNP SL10332_112 y EE_2225, o a menos de una unidad de 1 megabase desde el locus de por lo menos uno de los marcadores de SNP SL10332_112, EP_1592, EP_1027, EP_1150, EP_1876, EE_4621, SL10522_138, EP_0051, IL2_3605, SL20213_779, SL20071_190, IL2_6411 y EE_2225; y determinar si dicho marcador molecular está asociado con o ligado al fenotipo mejorado en una población segregadora emitida desde una planta que exhibe dicho fenotipo mejorado. La población de preferencia es emitida desde una planta cultivada a partir de las semillas depositadas NCIMB 42567 o desde una progenie de la misma, que exhibe el fenotipo mejorado de la invención.

El fenotipo mejorado es tanto un rendimiento incrementado como una cantidad incrementada de azúcares solubles asignados a los frutos (Brix*Rendimiento) con respecto a una planta carente de dicho QTL, independientemente del hábito de crecimiento de dicha planta.

El QTL en el cromosoma 1 mencionado anteriormente, que confiere el fenotipo mejorado de conformidad con la invención, es el QTL presente en HABR1 y en T<o>PATYIE<l>D (NCIMB 42567).

Los marcadores moleculares de conformidad con este aspecto de la invención de manera más preferida son marcadores de SNP.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: esta figura ilustra el rendimiento de varias líneas de introgresión provenientes de la población mencionada en el ejemplo 2. ToPATYIELD está entre las pocas plantas que tienen un brix*rendimiento incrementado en comparación con el progenitor recurrente Moneyberg. Las mediciones de Brix*rendimiento de plantas individuales se muestran mediante puntos de color gris. La media y el ANADEVA para cada línea de introgresión se indican en rectángulos. Todos los rectángulos por encima de la línea gris horizontal (que cruzan los ejes de las Y en ~24000) indican líneas con valores de brix*rendimiento significativamente más alto (p<0,05).

Figura 2: esta figura ilustra los valores de la media de Brix*Rendimiento para tres híbridos diferentes en comparación con un control correspondiente a una cruza entre HAZ3 (línea endógama patentada de S.lycopersicum)y Moneyberg sin ningún ADN de especie silvestre. El híbrido 3 se crea cruzando HAZ3 y el ToPATYIELD. Los híbridos 1 y 2 se crean cruzando HAZ3 y otras líneas de introgresión que portan un fragmento genómico proveniente de otras especies silvestres en el extremo inferior del cromosoma 1. Solamente el híbrido 3 tiene un brix*rendimiento que es significativamente más alto que el control (p<0,01).

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Introgresión de un fragmento genómico proveniente de Lycopersicum pennellii LA 716 dentro de un fondo genético de Lycopersicum esculentum indeterminado

En un primer paso, se crea una plantaLycopersicum esculentum (=S. lycopersicum)determinada de conformidad con el método descrito por Eshed y Zamir en 1995 con laLycopersicum esculentumM82 determinada como progenitor recurrente yLycopersicum pennelliiLA716 como donador de introgresión.

Como un resultado de dicho primer paso, la planta deLycopersicum esculentumM82 obtenida contiene el fragmento de introgresión de LA716 esperado en el brazo inferior del cromosoma 1 y muestra el incremento esperado en rendimiento tanto en combinación endogámica como híbrida.

Es bien sabido por el experto en la técnica que la cruza de una línea determinada endogámica con una línea indeterminada endogámica produce una planta híbrida indeterminada. Por lo tanto, en un segundo paso, la planta deL. esculentumM82 que contiene el fragmento de introgresión LA716 en el brazo inferior del cromosoma 1 se cruza con una línea de propietario indeterminada, para producir una planta híbrida indeterminada, cuyo rendimiento se mide en el transcurso de tres temporadas tanto en el Sur de Francia como en Israel. Como comprobación, se elabora un híbrido entre la primera línea endogámica M82 que no contiene el fragmento de introgresión de LA716 y la segunda línea endogámica de propietario.

No hay ninguna diferencia de rendimiento entre los dos híbridos, lo que demuestra que el fragmento de introgresión de LA716 no provee ningún incremento de rendimiento en una planta deLycopersocum esculentumindeterminada.

Ejemplo 2: Introgresión de un fragmento genómico proveniente de Lycopersicum habrochaites

Los presentes inventores crearon una población de línea de introgresión cruzando una especie silvestre de (HABR1) donadora y el progenitor recurrenteLycopersocum esculentumindeterminado Moneyberg.

Después de varias retrocruzas con el progenitor recurrente indeterminado Moneyberg, se obtiene una población elaborada de 62 líneas de introgresión (IL) que cubren el genoma de S.habrochaitesde HABR1.

Identificación del fragmento genómico de S.habrochaitesque afecta el rendimiento

Datos fenotípicos

La población de IL se tamiza respecto a rendimiento. Se miden diversos parámetros que afectan el rendimiento como el tiempo de floración, porcentaje de cuajado, tiempo para maduración, número de frutos por racimo y el número de racimos maduros en una temporada durante la temporada de cultivo, con el fin de identificar a qué elementos se podría deber un incremento en el rendimiento.

Se miden el peso de los frutos (es decir el peso sumado de todos los frutos cosechados) y el contenido de sólidos solubles totales (TSS) de los frutos inmediatamente después de la cosecha de los frutos. El rendimiento se mide a lo largo de la temporada de cultivo: las plantas se cultivan en invernaderos que son visitados varias veces por los inventores quienes cosechan los racimos de jitomate cuando el 50% de los frutos de un racimo de jitomate dado está maduro. Al final de la temporada de cultivo, se suma el peso de todos los frutos, para proveer el rendimiento de la planta. La temporada de cultivo varía de conformidad con las prácticas locales, por ejemplo en Israel, hay dos temporadas de cultivo, una desde agosto/septiembre hasta febrero/marzo y una segunda desde marzo hasta agosto. La planta de conformidad con la invención muestra un incremento del rendimiento durante la temporada contra plantas que no contienen el fragmento de introgresión, independientemente de la temporada o la ubicación.

Se evalúa el valor Brix*Rendim¡ento por planta multiplicando el peso total de los frutos cosechados por planta y los sólidos solubles totales (TSS) promedio de cinco frutos maduros por planta, medidos utilizando un refractómetro. Aunque el parámetro medido de esta manera es TSS*Rendimiento, éste se puede asimilar a Brix*Rendimiento, dada la correlación entre Brix y TSS, y debido a que los datos realmente informativos es el % de incremento de dicho TSS*Rendimiento o Brix*Rendimiento y no el nivel absoluto de TSS*Rendimiento o Brix*Rendimiento. El grado de % de incremento de TSS*Rendimiento y de Brix*Rendimiento se espera que sean muy similares.

Se identifica la línea denominada ToPATYIELD porque tiene un brix*rendimiento más alto en comparación con el progenitor recurrente (Moneyberg) y se selecciona para análisis adicional. En este punto, los inventores han demostrado que un fragmento genómico de S.habrochaitesproveniente de HABR1 (el progenitor silvestre) podría proveer un incremento del valor brix*rendimiento en jitomates indeterminados. Los siguientes pasos son para identificar el fragmento genómico responsable para dicho genotipo.

Identificación de marcador molecular

Se extrae ADN genómico a partir de hojas de jitomate utilizando el kit para extracción de ADN vegetal DNeasy de Qiagen.

Selección de conjunto de SNP

Con base a conjuntos de datos de SNP de dominio público tales como los que se pueden encontrar en EUSOL, en la red de genómica sol o en el grupo de Biología del Genoma y Sistemas Vegetales PGSB dedicados al jitomate, se efectúa una selección de SNP y se crea un primer conjunto de 384 SNP:

La selección de los SNPs se efectúa aplicando los siguientes pasos de filtro:

• Filtro 1: Puntuación de SNP y capacidad de diseño: Se selecciona un SNP por loci/contig, que tiene una puntuación Illumina de 0,7 o más alta (de conformidad con los estándares de Illumina).

• Filtro 2: Repetitividad: Las secuencias se someten al algoritmo BLAST contra bases de datos de secuencias repetitivas de plantas, y los SNPs con aciertos en estas regiones se deseleccionan.

• Filtro 3: Información genotípica: En casos en los que la información genotípica está disponible, a partir de recursos de dominio público, los SNPs que no muestran ninguna segregación a través de las muestras se deseleccionan.

• Filtro 4: Información de SNP Único: Deselección para los SNP/loci idénticos obtenidos a partir de diferentes conjuntos de datos. Las secuencias de SNP que tienen más de 90% de traslape BLAST se consideran como idénticas.

• Filtro 5: Cobertura y distribución del genoma: Los SNPs seleccionados se inspeccionan respecto a su cobertura y distribución de genoma. Esto se realiza colocando mediante BLAST las secuencias de SNP en la WGS (Secuenciación de Genoma Completo) y posteriormente identificando la ubicación de cromosoma y la posición de SNP.

Genotipificación de SNP

Se lleva a cabo genotipificación de SNP de alto rendimiento con las pruebas GoldenGate y el lector BeadXpress de Illumina. Se tamizan los genotipos de las ILs y las dos líneas parentales con los 384 marcadores en una placa individual. Los datos de genotipificación de SNP se califican utilizando el software para genotipificación GenomeStudio de Illumina con un umbral de no comparación de 0,25.

Detalles de la tecnología GoldenGate de Illumina

Se diseña un conjunto de SNP para la prueba GoldenGate de Illumina, el cual utiliza oligos específicos de locus y de alelo con marca de cy3/cy5 para detectar los alelos de SNP en cada locus. Estos conjuntos de Prueba de Combinado de Oligo (OPA por sus siglas en inglés) hecha a la medida después se corren en el lector BeadXpress de Illumina como pruebas VeraCode de 384-plex. Veracode utiliza microglóbulos cilíndricos con un código de barras interno para diferenciar los tipos de glóbulo que corresponden a diferentes loci de SNP (se utilizan 384 tipos de glóbulos para un conjunto de SNP de 384-plex), y cada microglóbulo se recubre con oligos que contienen una dirección única que se hibrida con los productos marcados. Durante el barrido en el lector BeadXpress, los glóbulos se alinean en una placa ranurada, y se miden el código de glóbulo y las intensidades de la señal de cy3/cy5 a través de conjuntos replicados de glóbulos para asignar los alelos de SNP. Este procedimiento permite una comparación de SNP de alta calidad, rápida de 96 muestras mediante 384 SNPs sin requerir arreglos fijos. Se utiliza el software GenomeStudio de Illumina para agrupar alelos tomando como base la relación de las intensidades de señal de cy3/cy5 para comparar las tres clases de genotipos. Esto se realiza primero con los 384 SNP identificados, pero con el fin de incrementar la precisión del análisis, se crea un conjunto adicional de otros 384 marcadores de SNP, de manera similar al procedimiento descrito para el primer conjunto, lo que lleva a conjunto de 768 marcadores de SNP todos juntos).

Selección de SNPs polimórficos

Los SNPs con una tasa de comparación por debajo de 70% o sin ningún polimorfismo entre donador y progenitores recurrentes se eliminan del análisis, lo que da como resultado 353 SNPs que se retienen como marcadores técnicamente válidos y polimórficos provenientes la primera placa y 307SNPs adicionales provenientes de la segunda placa. En total, se utilizan 660 SNPs para análisis adicional.

Resultados

El análisis de asociación de la planta ToPATYIELD identifica un conjunto de marcadores vinculados significativamente con el incremento del rendimiento. La lista de marcadores asociados y sus posiciones se resumen en la tabla 1. Las secuencias de dichos SNPs, incluyendo las secuencias de flanqueo se reportan en la tabla 2 y listado de secuencias acompañante, parte de la solicitud.

Los resultados muestran que el locus responsable para el incremento del rendimiento se ubica en el cromosoma 1, en un fragmento de introgresión de 6,271 Mpb, entre la posición 91 778 012 y la posición 98 049 922, dicha posición física en el genoma está basada en la versión 2.5 del genoma de jitomate (Bombarely 2011).

Tabla 1: List NP i i n l l l l r ni r ilv r l r ni or recurrente

Tabla 2: Secuencias de los SNPs

continuación

Comparación de las combinaciones de híbridos

El valor de Brix*rendimiento de tres híbridos elaborados cruzando líneas de introgresión con una línea endogámica de propietario indeterminada denominada HAZ3 se mide de manera similar a lo que se describió en la presente solicitud anteriormente.

El Híbrido 1 es resultado de la cruza de HAZ3 con una línea de introgresión que contiene un fragmento de introgresión genómico proveniente del brazo inferior del cromosoma 1 de S.chmielewskii,

El Híbrido 2 es resultado de la cruza de HAZ3 con una línea de introgresión que contiene el fragmento de introgresión genómico del cromosoma 1 proveniente de LA716 mientras que el Híbrido 3 es resultado de la cruza de HAZ3 con la línea de introgresión ToPATYIELD que contiene el fragmento de introgresión genómico de la presente invención. Los híbridos indeterminados resultantes se cultivan en tres ubicaciones (Hazav y Beit Hanan, Israel y St. Remy, Francia) durante tres temporadas. Como control los presentes inventores utilizaron una cruza entre HAZ3 y Moneyberg sin ningún ADN de especie silvestre (Control). Los valores de la media de Brix*Rendimiento para todos los híbridos se comparan con el control. Solamente el híbrido con el fragmento de S.habrochaites(Híbrido 3) tiene un valor de Brix*Rendimiento más alto (p<0,01) (véase figura 2).

De manera muy interesante, el fragmento genómico en dichas tres líneas de IL se ubica en la misma región del cromosoma 1, pero confiere diferentes fenotipos, dependiendo de las secuencias introgresadas y por lo tanto del donador de introgresión.

Comparación adicional de las combinaciones de híbridos

El efecto del fragmento de introgresión de S.habrochaitesse mide en el rendimiento, brix y brix*rendimiento comparando los híbridos elaborados cruzando una línea endogámica de propietario con ToPATYIELD (“ToPATYIELD híbrido”) o con el progenitor recurrente Moneyberg (“Moneyberg híbrido»). Los valores marcados con * son estadísticamente significativos (p<0,01). Se reportan los resultados combinados de la prueba efectuada en el transcurso de dos años en Hazav, Israel y un año en St. Remy, Francia, en la tabla 3.

T l

Ejemplo 3: Mejoramiento y desarrollo adicionales de plantas endogámicas e híbridas indeterminadasCreación de semillas BC2S2

La línea denominada ToPATYIELD se cruza con una línea de mejoramiento indeterminada de propietario para crear semillas BC2S2 como se describe más adelante: la línea ToPATYIELD se cruza una vez con la línea de mejoramiento indeterminada de propietario y la planta resultante se retrocruza dos veces con la línea de mejoramiento indeterminada de propietario. La planta de BC2 se auto-poliniza una vez para obtener una BC2S1 y cuya planta se auto-poliniza a sí misma para obtener las semillas BC2S2.

Se notará que la presencia del fragmento genómico de S.habrochaiteses seguida a través de los pasos de mejoramiento mediante el uso de los marcadores moleculares descritos en la presente solicitud anteriormente, especialmente IL2_6411 e IL2_3605.

Creación de dos líneas endogámicas indeterminadas nuevas

Las plantas BC2S2 que contienen el fragmento de introgresión proveniente de S.habrochaitesen el cromosoma 1 han sido utilizadas en cruzas con dos líneas de mejoramiento indeterminadas no relacionadas, independientes, la Línea HAZ 1 y la Línea HAZ 2, utilizadas en términos generales para producir plantas de jitomate híbridas indeterminadas con frutos redondos de aproximadamente 150-200 gramos.

En ambos casos, las plantas de BC2S2 se cruzan una vez con la línea HAZ 1 o con la línea HAZ 2, seguido por cuatro retrocruzas y una autofecundación, lo que lleva a dos plantas BC4S1 indeterminadas, HAZ-1-BC4S1-ToPATYIELD y HAZ-2-BC4S1-ToPATYIELD, que tienen el fondo genético de plantas indeterminadas HAZ-1 o HAZ-2 y el fragmento de introgresión proveniente deS. habrochaitesen el cromosoma 1.

De manera similar a la creación de las plantas BC2S2, el fragmento de introgresión proveniente de S.habrochaitesen el cromosoma 1 es seguido a través de los pasos de mejoramiento mediante el uso de los marcadores moleculares.

Creación de cuatro híbridos indeterminados

Las dos plantas BC4S1 indeterminadas, HAZ-1-BC4S1-ToPATYIELD y HAZ-2-BC4S1-ToPATYIELD, que tienen el fragmento de introgresión proveniente de S.habrochaitesen el cromosoma 1 se cruzan con las líneas endogámicas de propietario HAZ-A y HAZ-B para crear dos híbridos nuevos.

En paralelo, también se Cruzan las líneas HAZ-1 y HAZ-2 con HAZ-A y HAZ-B, de manera tal que los híbridos que son resultado de las diversas cruzas pudieran ser comparados.

La tabla 4 a continuación resume el nombre de los híbridos y de los progenitores y especifica los híbridos que tienen los fragmentos de introgresión.

Tabla 4:

Los cuatro híbridos se cultivan en Yad Natan, Israel, en un invernadero con sistema de riego por goteo bajo condiciones de cultivo de invierno estándar (desde septiembre con la siembra hasta febrero en la cosecha final. La duración del día es entre 10 y 12 horas de luz por día y la temperatura promedio en °C se basa en datos de los Servicios Meteorológicos Israelíes, véase la tabla 5). 0

Tabla 5:

Los racimos de jitomate se cosechan cuando 50% de los frutos de un racimo están maduros (completamente rojos). Se registran el número de frutos en cada una de las plantas y el peso de fruto individual en gramos para cada racimo. El rendimiento total se calcula como la suma de todos los frutos individuales. Se miden los sólidos solubles totales del fruto hasta para tres frutos rojos por racimo con un refractómetro digital. En vista de la similitud de dichos parámetros, Brix*Rendimiento (última columna) se asimila a Rendimiento x TSS.

Los resultados se proveen en la tabla 6 y 7, para dos años, (*) indica resultados estadísticamente significativos (n=15; P<0,05).

T l R l ni r l Añ 1

Estas tablas muestran claramente que todos los híbridos que tienen el fragmento de introgresión tienen un rendimiento incrementado y un Brix*Rendimiento incrementado, con respecto a los híbridos correspondientes que no tienen el fragmento de introgresión.

Además, se puede observar que el rendimiento incrementado y el Brix*Rendimiento incrementado no está acompañado por un decremento estadísticamente significativo del brix (TSS).

Ejemplo 4: Introgresión de un fragmento genómico proveniente de Lycopersicum hirsutum LA1777 dentro de un fondo genético de Lycopersicum esculentum indeterminado

La publicación de Monforte et al, 2000 describe plantas de jitomate, que comprenden un fragmento de introgresión proveniente de S.habrochaitesaccesión LA1777 en el cromosoma 1, que supuestamente imparte rendimiento y brix*rendimiento incrementados de las plantas, especialmente en la etapa heterocigota. Sin embargo, este documento solamente se refiere a y describe plantas de jitomate que tienen hábitos de cultivo determinados.

Con el fin de evaluar la posibilidad de utilizar la introgresión LA1777 en jitomates indeterminados, de manera que ésta también pueda conferir el mismo fenotipo de rendimiento y brix*rendimiento incrementados no solamente en jitomates determinados, sino también en los indeterminados, los presentes inventores evaluaron el incremento de brix*rendimiento en un cruza híbrida que lleva a una planta de jitomate con un hábito indeterminado cruzando una planta que porta la introgresión LA1777 (a saber la Línea Isogénica Cercana TA523 referida en Monforte et al) con una línea indeterminada (4131).

Como control, se elabora una cruza híbrida entre la misma planta que no porta la introgresión LA1777 (a saber proveniente de la línea E6203, ya que TA523 es una NIL que comprende una introgresión individual proveniente de LA1777) y la misma línea indeterminada (4131).

Todo el cultivo, cosecha y fenotipificación se realizan como se describió en el ejemplo 3. Los racimos de jitomate se cosechan cuando 50% de los frutos de un racimo están maduros (completamente rojos). Se registran el número de frutos en cada una de las plantas y el peso de fruto individual en gramos para cada racimo. El rendimiento total se calcula como la suma de todos los frutos individuales (gramos por planta). Se miden los sólidos solubles totales del fruto hasta para tres frutos rojos por racimo con un refractómetro digital. En vista de la similitud de dichos parámetros, Brix*Rendimiento (última columna) se asimila a Yield x TSS. La prueba incluye tres replicados de cinco plantas por genotipo (es decir un total de 15 plantas por genotipo), y siete racimos. Los resultados se presentan en la tabla 8.

Tabla 8: Resumen de Brix*Rendimiento (es decir peso total del fruto multiplicado por la cantidad total de contenido de azúcar de los carbohidratos asi nados al fruto

Los datos claramente demuestran que la introgresión LA1777 NO lleva a ningún incremento de brix*rendimiento estadísticamente significativo en jitomates que tienen un hábito de cultivo indeterminado.

Referencias

Bernacchi et al. 1998a. Advanced backcross QTL analysis in tomato. I. Identification of QTLs for traits of agronomic importance from Lycopersicum hirsutum. Theor. Appl. Genet. 97: 381-397

Bernacchi et al. 1998b Advanced backcross QTL analysis of tomato. II. Evaluation of near-isogenic lines carrying .single-donor introgressions for desirable wild QTL-allele derived from Lycopersicum hirsutem and L. pimpinellifolium. Theor. Appl. Genet. 97: 170-180

Eshed and Zamir 1995, An introgression line population ofLycopersicum pennelliiin the cultivated tomato enables the identification and fine mapping of yield-associated QTL. Genetics 141: 1147-1162

Eshed and Zamir. 1996. Less-than-additive epistatic interactions of quantitative trait loci in tomato. Genetics 143: 1807-1817.

Monforte A.J. & Tanksley S.D. 2000. Fine mapping of a quantitative trait locus (QTL) from Lycopersicon hirsutum chromosome 1 affecting fruit characteristics and agronomic traits: breaking linkage among QTLs affecting different traits and dissection of heterosis for yield. Theor Appl Genet 100:471-479.

Stevens, M., and Rick, C. M. 1986. Genetics and Breeding. In: The Tomato Crop. A scientific basis for improvement, pp. 35-109. Atherton, J., Rudich, G. (eds.). Chapman and Hall, New York.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una planta deSolanum lycopersicumque comprende en su genoma, en el cromosoma 1, secuencias introgresadas provenientes deSolanum habrochaites,

   caracterizada porque dichas secuencias introgresadas confieren a la planta un fenotipo mejorado correspondiente tanto a un rendimiento incrementado como a una cantidad incrementada de azúcares solubles asignados a los frutos (Brix*Rendimiento), con respecto a una planta correspondiente carente de dichas secuencias, independientemente del hábito de crecimiento de dicha planta,

   porque dichas secuencias introgresadas se eligen a partir de aquellas presentes en el genoma de semillas de S.lycopersicumToPATYIELD número de accesión NCIMB 42567 y

   caracterizada porque dichas secuencias introgresadas van a encontrarse en el cromosoma 1, dentro de la región cromosómica delimitada por SNP SL10332_112 (SEQ ID NO 1) y SNP EE_2225 (SEQ ID NO 13) y se caracterizan por la presencia en el genoma de dicha planta de al menos 5 de los siguientes alelos: alelo T de SNP SL10332_112 (SEQ ID NO. 1.), alelo C de SNP EP_1592 (SEQ ID NO. 2), alelo C de SNP EP_1027 (SEQ ID NO. 3), alelo G de SNP EP_1150 (SEQ ID NO. 4), alelo G de SNP EP_1876 (SEQ ID NO.5), alelo A de SNP EE_4621 (SEQ ID NO.

   6), alelo G de SNP SL10522_138 (SEQ ID NO. 7), alelo T de SNP EP_0051 (SEQ ID NO. 8), alelo T de SNP IL2_3605 (SEQ ID NO. 9), alelo G de SNP SL20213_779 (SEQ ID NO. 10), alelo C de SNP SL20071_190 (SEQ ID NO. 11), alelo A de SNP IL2_6411 (SEQ ID NO. 12) y alelo T de SNP EE_2225 (SEQ ID NO. 13).

   2. Una planta de S.lycopersicumde conformidad con la reivindicación 1, que tiene en el cromosoma 1 ninguna otra secuencia introgresada proveniente de S.habrochaitesexcepto aquellas presentes en las semillas de ToPATYIELD número de accesión NCIMB 42567.

   3. Una planta deS. lycopersicumde conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque no tiene decremento estadísticamente significativo en los sólidos solubles totales con respecto a una planta correspondiente carente de dichas secuencias introgresadas.

   4. Una planta de S.lycopersicumde conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque dicha planta es determinada, indeterminada o semi-determinada, de preferencia indeterminada.

   5. La planta de S.lycopersicumde conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada por la presencia en el genoma de dicha planta de S.lycopersicumde los siguientes alelos:

   • alelo T de SNP SL10332_112 (SEQ ID No.1.),

   • alelo C de SNP EP_1592 (SEQ ID No.2),

   • alelo C de SNP EP_1027 (SEQ ID No.3),

   • alelo G de SNP EP_1150 (SEQ ID No.4),

   • alelo G de SNP EP_1876 (SEQ ID No.5),

   • alelo A de SNP EE_4621 (SEQ ID No.6),

   • alelo G de SNP SL10522_138 (SEQ ID No.7),

   • alelo T de SNP EP_0051 (SEQ ID No.8),

   • alelo T de SNP IL2_3605 (SEQ ID No.9),

   • alelo G de SNP SL20213_779 (SEQ ID No.10),

   • alelo C de SNP SL20071_190 (SEQ ID No.11),

   • alelo A de SNP IL2_6411 (SEQ ID No.12) y

   •alelo T de SNP EE_2225 (SEQ ID No.13).

   6. Una planta híbrida deS. lycopersicum, que se puede obtener cruzando una planta que tiene el fenotipo mejorado de conformidad con la reivindicación 1 y que tiene las secuencias introgresadas provenientes de S.habrochaitespresentes de manera homocigota en su genoma, con otroS. lycopersicum, de preferencia con una planta carente de las secuencias de introgresión deS. habrochaites.

   7. Parte vegetal de una planta deS. lycopersicumde conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en particular semillas, explantes, material reproductivo, retoño, corte, semilla, fruto, raíz, rizoma, polen, óvulo, embrión, protoplasto, hoja, antera, tallo, pecíolo o flores, caracterizada porque dicha parte vegetal comprende células que comprenden en su genoma en el cromosoma 1 secuencias introgresadas provenientes deS. habrochaitesque confieren el fenotipo mejorado.

   8. Un cultivo de tejidos de células regenerables de la planta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque las células regenerables se obtienen a partir de embriones, protoplastos, células meristemáticas, callos, polen, hojas, anteras, tallos, peciolos, raíces, puntas de raíz, semillas, flores, cotiledones, y/o hipocotilos, y contienen en su genoma secuencias introgresadas provenientes de S.habrochaitesen el cromosoma 1 que confieren el fenotipo mejorado.

   9. Una semilla, planta o parte vegetal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque la presencia de dichas secuencias introgresadas en el cromosoma 1, de preferencia en el mismo homólogo del cromosoma 1, se define mediante

   - la presencia de alelo T de SNP IL2_3605 y/o

   - la presencia de alelo A de SNP IL2_6411.

   10. Un método para detectar y/o seleccionar plantas de S.lycopersicumque tienen secuencias introgresadas provenientes de S.habrochaitescomo las encontradas en el genoma de las semillas de ToPATYIELD (número de accesión NCIMB 42567), dichas secuencias introgresadas confieren un fenotipo mejorado, correspondiente tanto a un rendimiento incrementado como a una cantidad incrementada de azúcares solubles asignados a los frutos (Brix*Rendimiento), con respecto a una planta correspondiente carente de dichas secuencias independientemente del hábito de crecimiento de la planta,

   dicho método caracterizado porque comprende la detección de por lo menos cinco de los siguientes marcadores: alelo T de SNP SL10332_112 (SEQ ID No.1.), alelo C de SNP EP_1592 (SEQ ID No.2), alelo C de SNP EP_1027 (SEQ ID No.3), alelo G de SNP EP_1150 (SEQ ID No.4), alelo G de SNP EP_1876 (SEQ ID No.5), alelo A de SNP EE_4621 (SEQ ID No.6), alelo G de SNP SL10522_138 (SEQ ID No.7), alelo T de SNP EP_0051 (SEQ ID No.8), alelo T de SNP IL2_3605 (SEQ ID No.9), alelo G de SNP SL20213_779 (SEQ ID No.10), alelo C de SNP SL20071_190 (SEQ ID No.11), alelo A de SNP IL2_6411 (SEQ ID No.12) y alelo T de SNP EE_2225 (SEQ ID No.13), en una muestra de material genético de la planta que se va a seleccionar.

   11. El uso de por lo menos uno de los marcadores de SNP SL10332_112 (SEQ ID No.1), EP_1592 (SEQ ID No.2), EP_1027 (SEQ ID No.3), EP_1150 (SEQ ID No.4), EP_1876 (SEQ ID No.5), EE_4621 (SEQ ID No.6), SL10522_138 (SEQ ID No.7), EP_0051 (SEQ ID No.8), IL2_3605 (SEQ ID No.9), SL20213_779 (SEQ ID No.10), SL20071_190 (SEQ ID No.11), IL2_6411 (SEQ ID No.12) y EE_2225 (SEQ ID No.13), asociado con un QTL en el cromosoma 1 que confiere un fenotipo mejorado a las plantas de S.lycopersicum,para identificar marcadores moleculares alternativos asociados con dicho QTL, en donde dichos marcadores moleculares alternativos están en la región cromosómica delimitada en el cromosoma 1 por SL10332_112 y EE_2225, o a menos de una unidad de 1 megabase desde el locus de por lo menos uno de los marcadores de SNP SL10332_112 (SEQ ID No.1), EP_1592 (SEQ ID No.2), EP_1027 (SEQ ID No.3), EP_1150 (SEQ ID No.4), EP_1876 (SEQ ID No.5), EE_4621 (SEQ ID No.6), SL10522_138 (SEQ ID No.7), EP_0051 (SEQ ID No.8), IL2_3605 (SEQ ID No.9), SL20213_779 (SEQ ID No.10), SL20071_190 (SEQ ID No.11), IL2_6411 (SEQ ID No.12) y EE_2225 (SEQ ID No.13), y porque dicho fenotipo mejorado es tanto un rendimiento incrementado como una cantidad incrementada de azúcares solubles asignados a los frutos (Brix*Rendimiento) con respecto a una planta carente de dicho QTL, independientemente del hábito de crecimiento de la planta.

   12. Método para identificar un marcador molecular asociado con un QTL que confiere un fenotipo mejorado a las plantas deS. lycopersicumcaracterizado porque comprende:

   identificar un marcador molecular en la región cromosómica delimitada en el cromosoma 1 por los marcadores de SNP SL10332_112 y EE_2225, o a menos de una unidad de 1 megabase desde el locus de por lo menos uno de los marcadores de SNP SL10332_112, EP_1592, EP_1027, EP_1150, EP_1876, EE_4621, SL10522_138, EP_0051, IL2_3605, SL20213_779, SL20071_190, IL2_6411 y EE_2225; y

   determinar si dicho marcador molecular está asociado con el fenotipo mejorado en una población segregadora emitida desde una planta que exhibe dicho fenotipo mejorado, de preferencia una planta cultivada a partir de las semillas depositadas NCIMB 42567 o una progenie de la misma,

   en el cual dicho fenotipo mejorado es tanto un rendimiento incrementado como una cantidad incrementada de azúcares solubles asignados a los frutos (Brix*Rendimiento) con respecto a una planta carente de dicho QTL, independientemente del hábito de crecimiento de la planta.