ES3030696T3

ES3030696T3 - Use of radiolabeled nanobody in prognosis and diagnosis of cancer

Info

Publication number: ES3030696T3
Application number: ES18855865T
Authority: ES
Inventors: Hong Hoi Ting; Chung Lim Wong
Original assignee: Nanomab Technology Ltd
Current assignee: Nanomab Technology Ltd
Priority date: 2017-09-13
Filing date: 2018-09-13
Publication date: 2025-07-01
Anticipated expiration: 2038-09-13
Also published as: EP3682907B1; DK3682907T3; EP3682907A4; JP2020533370A; US20200276330A1; CN109485726A; US11642418B2; PT3682907T; WO2019052508A1; EP3682907A1; JP7007758B2; FI3682907T3; CN109485726B

Abstract

Se describe el uso de un antinanocuerpo radiomarcado para el pronóstico y diagnóstico de cánceres. En particular, se describe un inmunoconjugado para detectar una molécula de PD-L1. El inmunoconjugado comprende la cadena VHH de un nanocuerpo anti-PD-L1 específico y un radionúclido, y puede utilizarse para la detección no invasiva de la expresión de la PD-L1 objetivo. El inmunoconjugado de la invención presenta un tamaño pequeño y una alta especificidad, y es adecuado para la detección sistémica que actúa simultáneamente sobre tumores primarios y metastásicos, con alta precisión y baja dosis de radiación. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Uso de nanocuerpos radiomarcados en el pronóstico y diagnóstico del cáncer

Campo técnico

La invención se refiere al campo de la ciencia biomédica o la bioimagen y, más particularmente, a la aplicación de nanocuerpos radiomarcados para su uso en el pronóstico y el diagnóstico del cáncer.

Antecedentes de la invención

La PD-1 y su ligando PD-L1 son dianas importantes para la inmunidad tumoral. El bloqueo de las rutas de PD-1/PD-L1 por anticuerpos monoclonales ha recibido una amplia atención en los últimos años. PD-1 y PD-L1 son moléculas inmunosupresoras y son componentes importantes del sistema inmunitario para prevenir enfermedades autoinmunitarias. La activación de la ruta inhibe la respuesta inmune tumoral e induce apoptosis de células T específicas de tumor que están estrechamente relacionadas con el desarrollo tumoral. PD-1 (CD279) es una proteína transmembrana de tipo I que pertenece a la superfamilia de inmunoglobulinas. Se expresa principalmente en linfocitos T CD4+ activados, linfocitos T CD8+ y linfocitos B. El ligando PD-L1 (también llamado B7-H1, CD274) es un miembro de la familia B7. PD-L1 se expresa altamente en células tumorales infiltrantes de tumores (TIC) y diversas células tumorales malignas tales como células en melanoma maligno, cáncer de pulmón de células no pequeñas y carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello. Los anticuerpos monoclonales PD-1 y PD-L1 mostraron una excelente eficacia y seguridad en ensayos clínicos. La FDA de Estados Unidos ya ha aprobado varios anticuerpos monoclonales anti-PD-1, PD-L1 para el tratamiento de diferentes cánceres, incluyendo melanoma, cáncer de pulmón de células no pequeñas y carcinoma de células renales avanzado. También hay múltiples ensayos clínicos de anticuerpos monoclonales PD-1 y PD-L1 en curso.

La expresión de PD-L1 regulada positivamente en células tumorales previene el reconocimiento y eliminación de células tumorales del sistema inmunitario. Los especímenes clínicos demuestran que la alta expresión de PD-L1 en diversos tejidos tumorales malignos y TIC muestra correlación con mal pronóstico en pacientes con cáncer. Los anticuerpos monoclonales PD-1 y PD-L1 han mostrado buen efecto terapéutico en diversos ensayos clínicos de tumores malignos. Sin embargo, la tasa de respuesta global es solo de aproximadamente el 20% donde la mayoría de los pacientes con tumor con reacción clínica eran pacientes con alta expresión de PD-L1 en TIC o células tumorales. Para cribar los pacientes y mejorar el beneficio clínico del tratamiento, el nivel de expresión de PD-L1 en el paciente debe medirse mediante biopsia antes del tratamiento. El método de detección actual de la expresión de PD-L1 en tejidos de pacientes aún depende de la IHC de punción tisular. Sin embargo, debido a que PD-L1 es un biomarcador dinámico y el nivel de expresión cambia con el tiempo durante el transcurso del tratamiento, el método de examen de punción tisular convencional tiene muchas limitaciones en la práctica. Por lo tanto, es importante desarrollar métodos de diagnóstico más eficaces para detectar tumores primarios y metastásicos, usando detección en tiempo real y no invasiva y PD-L1 cuantitativa como biomarcador dinámico, para seleccionar pacientes adecuados para tratamiento, para monitorizar el efecto terapéutico y optimizar el plan de tratamiento.

El nanocuerpo es actualmente la molécula de anticuerpo más pequeña, cuyo dominio de unión tiene un peso molecular de aproximadamente 1/10 del de un anticuerpo monoclonal convencional. Fue descubierto en primer lugar por el científico belga Hamers, R en sangre de camello. Es un tipo muy interesante en productos de anticuerpos manipulados. Además de la reactividad antigénica, el nanocuerpo también tiene algunas propiedades funcionales únicas. El nanocuerpo tiene un peso molecular pequeño, una estabilidad fuerte, una buena solubilidad, una alta expresión, una inmunogenicidad débil (con más del 70% de similitud con la secuencia de proteína humana), una penetración fuerte, una orientación fuerte, una humanización fácil, un bajo coste de preparación, etc. El tamaño pequeño hace que el nanocuerpo sea un portador óptimo de orientación a radioisótopos. El nanocuerpo penetra rápidamente en el tejido tumoral y se une específicamente a la diana. El nanocuerpo no unido se retira rápidamente de la sangre, reduciendo la dosis de radiación del cuerpo. En comparación con el anticuerpo convencional, el nanocuerpo tiene más ventajas como trazador tumoral.

Actualmente, se han informado muchos nanocuerpos que se dirigen a PD-L1, tales como los nanocuerpos descritos en los documentos WO2017/157334A1, WO2008/071447A2, WO2009/030285A1, WO2017/020802A1, FEI ZHANG et al (2017) y KATRIJN BROOS et al (2017). Sin embargo, actualmente no está disponible ningún nanocuerpo satisfactorio para la detección de la expresión de PD-L1 en entornos clínicos. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar nanocuerpos específicos novedosos que sean eficaces contra PD-L1.

Compendio de la invención

La presente invención es para proporcionar un nanocuerpo específico que se dirige eficazmente a PD-L1.

En particular, la presente invención es para proporcionar un uso de nanocuerpos radiomarcados dirigidos eficazmente a PD-L1 para la detección no invasiva de la expresión de PD-L1 en seres humanos.

En un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un inmunoconjugado, en donde el inmunoconjugado comprende:

(a) una cadena VHH de un nanocuerpo anti-PD-L1 o un nanocuerpo anti-PD-L1 con la cadena VHH, en donde la secuencia de aminoácidos de la cadena VHH se muestra como SEQ ID NO: 2; y

(b) un resto de conjugación que es un radionúclido.

En otra realización preferida, la unión del nanocuerpo anti-PD-L1 a PD-L1 no interfiere con la unión de PD-1 a PD-L1.

En otra realización preferida, la región de unión de PD-L1 al anti-PD-L1 está fuera de la región de unión de PD-L1 a PD-L1.

El radionúclido comprende:

(i) un radioisótopo de diagnóstico, que se selecciona de un grupo que consiste en: Tc-99m, Ga-68, F-18, I-123, I-125, In-111, Ga-67, Cu-64, Zr-89, C-11, y una combinación de los mismos; y/o

(ii) un radioisótopo terapéutico, que se selecciona de un grupo que consiste en: Lu-177, Y-90, Ac-225, As-211, Bi-212, Bi-213, Cs-137, Cr-51, Co-60, Dy-165, Er-169, Fm-255, Au-198, Ho-166, 1-125, I-131, Ir-192, Fe-59, Pb-212, Mo-99, Pd-103, P-32, K-42, Re-186, Re-188, Sm-153, Ra223, Ru-106, Na24, Sr89, Tb-149, Th-227, Xe-133, Yb-169, Yb-177, y una combinación de los mismos.

En otra realización preferida, el inmunoconjugado comprende:

una cadena VHH multivalente (tal como bivalente) o un nanocuerpo anti-PD-L1 con la cadena VHH.

El término multivalente significa que la secuencia de aminoácidos del inmunoconjugado contiene múltiples repeticiones de la secuencia de aminoácidos del nanocuerpo de VHH o anti-PD-L1.

En otra realización preferida, el inmunoconjugado se utiliza para la detección de la expresión de PD-L1 en el pronóstico y diagnóstico del cáncer.

En otra realización preferida, la detección es detecciónin vivo.

En otra realización preferida, el inmunoconjugado se utiliza para tratar o prevenir tumores con expresión de PD-L1 (PD-L1 positivo).

En un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona un reactivo de detección de PD-L1, que comprende el inmunoconjugado del primer aspecto de la invención y un portador de detección aceptable. En otra realización preferida, el resto de conjugación del inmunoconjugado es un radioisótopo de diagnóstico. En otra realización preferida, el portador de detección aceptable es un portador basado en agua inerte, no tóxico. En otra realización preferida, el reactivo de detección se selecciona de un grupo que consiste en: trazadores de isótopos, agentes de contraste, reactivos de detección FACS, reactivos de detección de inmunofluorescencia, nanopartículas magnéticas y agentes de formación de imágenes.

En otra realización preferida, el reactivo de detección es un agente de contraste, y el agente de contraste también comprende otras preparaciones para radiografía.

En otra realización preferida, el agente de contraste es un agente de contraste para MRI (formación de imágenes por resonancia magnética) o CT (tomografía computarizada).

En otra realización preferida, el agente de formación de imágenes comprende dos o más señales, tales como Ga-68 y Gd, para PET/CT y MRI; o Tc-99m y agentes fluorescentes, para SPECT/CT y detección de fluorescencia.

En otra realización preferida, el reactivo de detección es para detecciónin vivo.

En otra realización preferida, el reactivo de detección está en forma de líquido o polvo (tal como un agente acuoso, una inyección, polvo liofilizado, un comprimido, un agente sublingual o un aerosol).

En un tercer aspecto de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica, que comprende el inmunoconjugado en el primer aspecto de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable.

En otra realización preferida, el resto conjugado del inmunoconjugado es un radioisótopo terapéutico.

En otra realización preferida, la composición farmacéutica comprende además otros fármacos para el tratamiento de tumores, tales como fármacos citotóxicos.

En otra realización preferida, la composición farmacéutica se usa para tratar o prevenir tumores con expresión de PD-L1 (positivo para PD-L1)

En otra realización preferida, los tumores comprenden cáncer gástrico, linfoma, cáncer de hígado, leucemia, tumor de riñón, cáncer de pulmón, cáncer de intestino delgado, cáncer de hueso, cáncer de próstata, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de intestino grueso, cáncer de próstata o tumor adrenal.

En otra realización preferida, la composición farmacéutica está en forma de inyección.

En un cuarto aspecto de la presente invención, se proporciona un kit de detección para la expresión de PD-L1, que comprende el inmunoconjugado en el primer aspecto de la invención y un manual de instrucciones. En otra realización preferida, según el manual de instrucciones, el kit es para la detección no invasiva de la expresión de PD-L1 en un sujeto.

En otra realización preferida, el kit se usa para la detección de tumores con expresión de PD-L1 (positivo para PD-L1).

En un quinto aspecto de la presente invención, el uso del inmunoconjugado en el primer aspecto de la invención se proporciona para la preparación de (a) un reactivo de detección, un kit de detección o una placa de detección para detectar PD-L1in vivo; (b) una composición farmacéutica para tratar o prevenir tumores con expresión de PD-L1 (positivo para PD-L1).

En otro aspecto de la presente invención, el uso del inmunoconjugado en el primer aspecto de la invención se proporciona para la preparación de un agente de formación de imágenes para detectar la expresión de PD-L1in vivo.

En un sexto aspecto de la presente invención, se proporciona un método para tratar enfermedades, que comprende administrar el nanocuerpo y el inmunoconjugado de la presente invención a un sujeto que lo necesita. En otra realización preferida, el sujeto es un mamífero, tal como un ser humano.

Dentro del alcance de la presente invención, las características técnicas descritas anteriormente y las características técnicas descritas a continuación (tales como ejemplos) pueden combinarse entre sí para formar una solución técnica nueva o alternativa. Debido a limitaciones de espacio, no se repiten aquí una a una.Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra el resultado de la purificación de nanocuerpos anti-PD-L1. M es el marcador de peso molecular de proteína, y el carril 1-2 corresponde a los nanocuerpos con secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 1-2, respectivamente.

La Figura 2 muestra los resultados de ELISA de nanocuerpos anti-PD-L1 contra diferentes antígenos. La barra 1-2 corresponde a los nanocuerpos con secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 1-2, respectivamente. La Figura 3 muestra el resultado de la obtención de imágenes por SPECT-CT de nanocuerpos anti-PD-L1 marcados con I-125 en ratones portadores de tumores con alta expresión de PD-L1. Los nanocuerpos con secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 1-2 pueden acumularse eficazmente en tumores con alta expresión de PD-L1, y los anticuerpos no de unión pueden eliminarse rápidamente de la sangre a través del riñón y la vejiga.

La Figura 4 muestra el espectro de HPLC del nanocuerpo anti-PD-L1. Se examinó la estabilidad de los contenidos y las composiciones en diferentes puntos de tiempo después de la incubación de nanocuerpos anti-PD-L1 con sueros de ratón y humano, respectivamente.

La Figura 5 muestra el resultado de la obtención de imágenes por SPECT-CT del nanocuerpo de PD-L1 marcado con 99mTc en ratones portadores de tumores con alta expresión de PD-L1. Los nanocuerpos pueden acumularse eficazmente en tumores con alta expresión de PD-L1, y los anticuerpos no de unión pueden eliminarse rápidamente de la sangre a través del riñón y la vejiga.

La Figura 6 muestra una comparación de las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID NO: 1 a 3, en donde las regiones CDR están marcadas en rojo.

Nota: SEQ NO. en el dibujo tiene el mismo significado que SEQ ID NO., indicando los números de secuencia en el listado de secuencias.

Descripción detallada de la invención

Los presentes inventores han realizado estudios exhaustivos e intensivos, e inesperadamente han descubierto un inmunoconjugado para la detección de PD-L1 por primera vez. El inmunoconjugado comprende una cadena VHH de un nanocuerpo anti-PD-L1 específico y radionúclidos. La unión del nanocuerpo anti-PD-L1 a PD-L1 no interfiere con la unión de PD-1 a PD-L1 y el nanocuerpo anti-PD-L1 puede usarse para la detección no invasiva de la expresión de PD-L1 en un sujeto. El inmunoconjugado de la invención tiene un tamaño pequeño y una especificidad elevada, y es adecuado para la detección corporal sistémica de tumores primarios y metastásicos con elevada exactitud y baja dosis de radiación, con elevada exactitud y baja dosis de radiación. Sobre esta base, se ha completado la presente invención.

Términos

Como se usa en la presente memoria, las expresiones "nanocuerpo de la presente invención", "nanocuerpo anti-PD-L1 de la presente invención" y "nanocuerpo PD-L1 de la presente invención" son intercambiables y todos se refieren a los nanocuerpos que reconocen y se unen específicamente a PD-L1 (incluyendo PD-L1 humano). La unión del nanocuerpo anti-PD-L1 de la presente invención a PD-L1 no interfiere con la unión de PD-1 a PD-L1. Las secuencias de aminoácidos preferidas de la cadena VHH de los nanocuerpos específicos se muestran en las SEQ ID NO: 1-3.

Las secuencias de aminoácidos de las cadenas VHH de la presente invención se muestran a continuación, en las que las regiones CDR se indican mediante subrayado

SEQ ID NO.1:

OVOLOESGGGSVOTGGSLRLSCAASTSIYSNNYMAWFSOAPGKGREGVAAV

YIDDGRPYYADSVKGRFTISLDSAKNTVYLOMNRLKPEDTAMYYCAAAPGPLSHN

YWYTSANYDYWGOGTOVTVSS

SEQ ID NO.2:

OVOLOESGGGSVOAGGSLRLSCAASGYTYSSDGMGWFROTPGKEREGVAAIS

PTGRRTE Y AD S VKGRFTISRDNNKNMLSLOMN SLKPEDTGM Y Y CAREGSWSF SL A

NSAVRSWGOGTOVTVSS

SEQ ID NO.3:

OVOLOESGGGSVOTGGSLRLSCTASTSIYSNNYMAWFSOSPGKGREGVAAVY

MDDGRPYYADSVKGRFTISLDSAKNTMYLQMNSLKPEDTAMYYCAAAPGPLSRN

YWYTSANYDYWGOGTOVTVSS

La alineación de secuencias de las secuencias de aminoácidos de los nanocuerpos de la presente invención se muestra en la FIG. 6. La varianza de los nanocuerpos en la presente invención está principalmente en la región CDR. El nanocuerpo de la SEQ ID NO: 1 tiene una identidad de secuencia de >95% en comparación con el nanocuerpo de la SEQ ID NO: 3.

Como se usa en la presente memoria, el término "anticuerpo" o "inmunoglobulina" es una proteína de glucosaminoglicano heterotetramérica de aproximadamente 150.000 Dalton con las mismas características estructurales, que consiste en dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera está unida a la cadena pesada a través de un enlace disulfuro covalente, y el número de enlaces disulfuro entre las cadenas pesadas de diferentes isoformas de inmunoglobulina es diferente. Cada cadena pesada y ligera también tiene enlaces disulfuro intracatenarios que están separados regularmente. Cada cadena pesada tiene una región variable (VH) en un extremo seguida por una pluralidad de regiones constantes. Cada cadena ligera tiene una región variable (VL) en un extremo y una región constante en el otro extremo. La región constante de la cadena ligera corresponde a la primera región constante de la cadena pesada, y la región variable de la cadena ligera corresponde a la región variable de la cadena pesada. Los residuos de aminoácidos especiales forman una interfaz entre las regiones variables de las cadenas ligera y pesada.

Como se usa en la presente memoria, las expresiones "anticuerpo de dominio único (VHH)" y "nanocuerpo" tienen el mismo significado que se refiere a una región variable de una cadena pesada de un anticuerpo clonado, y construir un anticuerpo de dominio único (VHH) que consiste en solo una región variable de cadena pesada. Es el fragmento de unión a antígeno más pequeño con función completa. Generalmente, se obtienen en primer lugar los anticuerpos con una deficiencia natural de la cadena ligera y la región constante de cadena pesada 1 (CH1), las regiones variables de la cadena pesada del anticuerpo se clonan por lo tanto para construir un anticuerpo de dominio único (VHH) que consiste en solo una región variable de cadena pesada.

Como se usa en la presente memoria, el término "variable" se refiere a que ciertas porciones de la región variable en los nanocuerpos varían en secuencias, lo que forma la unión y especificidad de diversos anticuerpos específicos a su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente por toda la región variable del nanocuerpo. Se concentra en tres segmentos denominados regiones determinantes de complementariedad (CDR) o regiones hipervariables en las regiones variables de la cadena ligera y pesada. La parte más conservada de la región variable se denomina región marco (FR). Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera naturales contienen cada una cuatro regiones FR, que están sustancialmente en una configuración de p-veces, unidas por tres CDR que forman un bucle de unión, y en algunos casos pueden formar una estructura de p-veces parcialmente. Las CDR en cada cadena son estrechamente adyacentes a las otras por las regiones FR y forman un sitio de unión a antígeno del anticuerpo con las CDR de la otra cadena (véase Kabat et al., NIH Publ. No. 91-3242, Volumen I, páginas 647-669. (1991)). Las regiones constantes no están directamente implicadas en la unión del anticuerpo al antígeno, pero muestran diferentes funciones efectoras, por ejemplo, implican citotoxicidad dependiente de anticuerpos de los anticuerpos.

Como saben los expertos en la técnica, los inmunoconjugados y productos de expresión de fusión incluyen: conjugados formados por la unión de fármacos, toxinas, citocinas, radionúclidos, enzimas y otras moléculas de diagnóstico o terapéuticas a los nanocuerpos o fragmentos de los mismos de la presente invención. La invención también incluye un marcador de superficie celular o un antígeno que se une a dicho nanocuerpo de proteína anti-PD-1 o el fragmento del mismo.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "región variable de cadena pesada" y "V<h>" pueden usarse indistintamente.

Como se usa en la presente memoria, los términos "región variable" y "región determinante complementaria (CDR)" pueden usarse indistintamente.

En otra realización preferida, la región variable de cadena pesada de dicho nanocuerpo comprende 3 regiones determinantes complementarias: CDR1, CDR2 y CDR3.

En otra realización preferida, la cadena pesada de dicho nanocuerpo comprende la región variable de cadena pesada anterior y una región constante de cadena pesada.

Según la presente invención, las expresiones "nanocuerpo de la invención", "proteína de la invención" y "polipéptido de la invención" se usan indistintamente y todos se refieren a un polipéptido, tal como una proteína o polipéptido que tiene una región variable de cadena pesada, que se une específicamente a la proteína PD-1. Pueden contener o no una metionina de partida.

La invención también proporciona otras proteínas o productos de expresión de fusión que tienen los nanocuerpos de la invención. Específicamente, la presente invención incluye cualquier proteína o conjugado de proteína y producto de expresión de fusión (es decir, inmunoconjugado y producto de expresión de fusión) que tiene una cadena pesada que contiene una región variable, siempre que la región variable sea idéntica o al menos 90% idéntica, preferiblemente al menos 95% idéntica a la cadena pesada del nanocuerpo de la presente invención.

En general, las propiedades de unión a antígeno de un nanocuerpo pueden describirse mediante tres regiones específicas ubicadas en la región variable de la cadena pesada, denominadas regiones variables (CDR), y el segmento se divide en cuatro regiones marco (FR). Las secuencias de aminoácidos de cuatro FR son relativamente conservadoras y no participan directamente en las reacciones de unión. Estas CDR forman una estructura de bucle que están espacialmente próximas entre sí a través del pliegue p formado por las FR entre las mismas. Las CDR en la cadena pesada y las CDR en la cadena ligera correspondiente constituyen el sitio de unión a antígeno del anticuerpo. Las secuencias de aminoácidos del mismo tipo de anticuerpos pueden compararse para determinar qué aminoácidos constituyen las regiones FR o CDR.

Las regiones variables de las cadenas pesadas de los anticuerpos de la invención se vuelven de particular interés porque al menos una parte de ellas está implicada en la unión de antígenos. Por tanto, la presente invención incluye aquellas moléculas que tienen una región variable de cadena pesada de anticuerpo con CDR, siempre que sus CDR sean idénticas en un 90% o más (preferiblemente en un 95% o más, lo más preferiblemente en un 98% o más) a las CDR identificadas en la presente memoria.

La presente invención incluye no sólo anticuerpos intactos sino también fragmentos de anticuerpo o proteínas de fusión formados por los anticuerpos con otras secuencias, que son inmunológicamente activas. Por lo tanto, la presente invención también incluye fragmentos, derivados y análogos del anticuerpo.

Como se usa en la presente memoria, los términos "fragmento", "derivado" y "análogo" se refieren a un polipéptido que conserva sustancialmente la misma función o actividad biológica de un anticuerpo de la invención. Los fragmentos polipeptídicos, derivados o análogos de la invención pueden ser (i) polipéptidos que tienen uno o más residuos de aminoácidos conservativos o no conservativos (preferiblemente residuos de aminoácidos no conservativos) sustituidos. Tales residuos de aminoácidos sustituidos pueden o no estar codificados por el código genético; o (ii) un polipéptido que tiene un grupo sustituyente en uno o más residuos de aminoácidos; o (iii) un polipéptido formado por fusión de un polipéptido maduro y otro compuesto (tal como un compuesto que aumenta la semivida del polipéptido, por ejemplo, polietilenglicol); o (iv) un polipéptido formado por fusión de una secuencia de aminoácidos adicional a la secuencia del polipéptido (por ejemplo, una secuencia líder o secretora o una secuencia usada para purificar este polipéptido o una secuencia de proproteína, o una proteína de fusión formada con una etiqueta 6His). Según las enseñanzas de la presente memoria, estos fragmentos, derivados y análogos están dentro del alcance de un experto en la técnica.

El anticuerpo de la presente invención se refiere a un polipéptido que incluye las regiones CDR anteriores que tienen actividad de unión a la proteína PD-1. El término también abarca formas variantes de polipéptidos que comprenden las regiones CDR anteriores que tienen la misma función que los anticuerpos de la invención. Estas variaciones incluyen, pero sin que ello pretenda ser limitante, deleción, inserción y/o sustitución de uno o varios (normalmente 1-50, preferiblemente 1-30, más preferiblemente 1-20, óptimamente 1-10) aminoácidos, y adición de uno o varios (generalmente menos de 20, preferiblemente menos de 10, y más preferiblemente menos de 5) aminoácidos en el extremo C y/o el extremo N. Por ejemplo, en la técnica, la sustitución de aminoácidos con propiedades análogas o similares normalmente no altera la función de la proteína. Para otro ejemplo, la adición de uno o varios aminoácidos en el extremo C y/o el extremo N habitualmente no cambia la función de la proteína. El término también incluye fragmentos activos y derivados activos de los anticuerpos de la invención.

Las formas variantes del polipéptido incluyen: secuencias homólogas, variantes conservadoras, variantes alélicas, mutantes naturales, mutantes inducidos, proteínas codificadas por ADN capaces de hibridarse con ADN que codifica el anticuerpo de la presente invención bajo condiciones rigurosas altas o bajas, y polipéptidos o proteínas obtenidos usando antisuero contra los anticuerpos de la invención.

La invención también proporciona otros polipéptidos, tales como una proteína de fusión que comprende anticuerpos o fragmentos de los mismos. Además de polipéptidos casi de longitud completa, la presente invención también incluye fragmentos de los anticuerpos de la invención. Normalmente, el fragmento tiene al menos aproximadamente 50 aminoácidos contiguos del anticuerpo de la invención, preferiblemente al menos aproximadamente 50 aminoácidos contiguos, más preferiblemente al menos aproximadamente 80 aminoácidos contiguos, y lo más preferiblemente al menos aproximadamente 100 aminoácidos contiguos.

En la presente invención, "una variante conservativa de un anticuerpo de la presente invención" se refiere a los polipéptidos en los que hay hasta 10, preferiblemente hasta 8, más preferiblemente hasta 5, y lo más preferiblemente hasta 3 aminoácidos sustituidos por aminoácidos que tienen propiedades análogas o similares, en comparación con la secuencia de aminoácidos del anticuerpo de la presente invención. Estos polipéptidos variantes conservativos se producen preferiblemente según las sustituciones de aminoácidos en la Tabla A.

Tabla A

La presente invención también proporciona una molécula de polinucleótido que codifica el anticuerpo anterior o fragmento o proteína de fusión del mismo. Los polinucleótidos de la invención pueden estar en forma de ADN o ARN. Las formas de ADN incluyen ADNc, ADN genómico o ADN sintético. El ADN puede ser monocatenario o bicatenario. El ADN puede ser una cadena codificante o una cadena no codificante.

Los polinucleótidos que codifican los polipéptidos maduros de la invención incluyen: secuencias codificantes que codifican solo el polipéptido maduro; secuencias codificantes para el polipéptido maduro y diversas secuencias codificantes adicionales; secuencias codificantes (y secuencias codificantes adicionales opcionales) y secuencias no codificantes para el polipéptido maduro.

La expresión "polinucleótido que codifica un polipéptido" puede incluir un polinucleótido que codifica el polipéptido, y también puede incluir un polinucleótido que incluye secuencias codificantes y/o no codificantes adicionales.

La invención también se refiere a polinucleótidos que se hibridan con las secuencias descritas anteriormente y que tienen al menos el 50%, preferiblemente al menos el 70% y más preferiblemente al menos el 80% de identidad entre las dos secuencias. La presente invención se refiere específicamente a polinucleótidos que pueden hibridarse con los polinucleótidos de la presente invención en condiciones rigurosas. En la presente invención, "condiciones rigurosas" se refiere a: (1) hibridación y elución a fuerza iónica más baja y temperatura más alta, tal como 0,2 x SSC, SDS al 0,1%, 60°C; o (2) desnaturalizantes adicionales durante la hibridación, tales como formamida al 50% (v/v), suero bovino fetal al 0,1%/Ficoll al 0,1%, 42°C, etc.; o (3) la hibridación se produce sólo cuando la identidad entre las dos secuencias es al menos superior al 90%, preferiblemente superior al 95%. Además, los polipéptidos codificados por polinucleótidos hibridables tienen las mismas funciones y actividades biológicas que los polipéptidos maduros.

La secuencia de nucleótidos de longitud completa del anticuerpo de la presente invención o un fragmento de la misma puede obtenerse generalmente mediante un método de amplificación por PCR, un método de recombinación o un método de síntesis artificial. Un posible método es sintetizar secuencias relacionadas usando métodos sintéticos, especialmente cuando la longitud del fragmento es corta. En general, puede obtenerse una secuencia larga de fragmentos sintetizando primero una pluralidad de fragmentos pequeños y a continuación ligándolos. Además, la secuencia codificante de la cadena pesada y la etiqueta de expresión (por ejemplo, 6His) pueden fusionarse entre sí para formar una proteína de fusión.

Una vez obtenidas las secuencias implicadas, las secuencias de interés pueden obtenerse a gran escala usando métodos recombinantes. Normalmente, las secuencias pueden obtenerse clonándolas en un vector, transfiriéndolas a las células, y después aislando las secuencias de las células hospedadoras proliferadas mediante métodos convencionales. Las biomoléculas (ácidos nucleicos, proteínas, etc.) a las que se refiere la presente invención incluyen biomoléculas que existen en forma aislada.

En la actualidad, las secuencias de ADN que codifican la proteína de la presente invención (o un fragmento de la misma, o un derivado de la misma) se pueden obtener completamente mediante síntesis química. La secuencia de ADN puede introducirse entonces en diversas moléculas de ADN existentes (por ejemplo, vectores) y células conocidas en la técnica. Además, también pueden introducirse mutaciones en las secuencias de proteínas de la invención mediante síntesis química.

La invención también se refiere a vectores que comprenden las secuencias de ADN adecuadas mencionadas anteriormente y promotores o secuencias de control adecuadas. Estos vectores pueden usarse para transformar una célula hospedadora apropiada de modo que pueda expresar la proteína.

La célula hospedadora puede ser una célula procariota, tal como una célula bacteriana; o una célula eucariota inferior, tal como una célula de levadura; o una célula eucariota superior, tal como una célula de mamífero. Son ejemplos representativos:Escherichia coli, Streptomyces,células bacterianas tales como células bacterianasSalmonella typhimurium,células fúngicas tales como levadura, células de insecto deDrosophilaS2 o Sf9, células animales de CHO, COS7, 293 células, y similares.

La transformación de la célula hospedadora con el ADN recombinante puede realizarse usando técnicas convencionales bien conocidas por los expertos en la técnica. Cuando el hospedador es un organismo procariota tal comoE. coli,las células competentes capaces de absorber ADN pueden recogerse después de la fase de crecimiento exponencial y tratarse con método de CaCl<2>. Los procedimientos usados son bien conocidos en la técnica. Otro método es usar MgCl<2>. Si es necesario, la conversión también se puede realizar por electroporación. Cuando el hospedador es eucariota, pueden usarse los siguientes procedimientos de transfección de ADN: coprecipitación con fosfato de calcio, procedimientos mecánicos convencionales tales como microinyección, electroporación, empaquetamiento de liposomas y similares.

Los transformantes obtenidos pueden cultivarse de manera convencional para expresar el polipéptido codificado por el gen de la presente invención. Dependiendo de las células hospedadoras utilizadas, el medio utilizado en el cultivo puede seleccionarse de entre varios medios convencionales. El cultivo se realiza en condiciones adecuadas para el crecimiento de las células hospedadoras. Después de que las células hospedadoras se cultivan hasta una densidad celular apropiada, el promotor seleccionado se induce mediante un método adecuado (tal como desplazamiento de temperatura o inducción química) y las células se incuban durante un periodo de tiempo adicional.

El polipéptido recombinante en el método anterior puede expresarse intracelularmente, o en la membrana celular, o secretarse extracelularmente. Si es necesario, la proteína recombinante puede aislarse y purificarse mediante diversos métodos de separación utilizando sus características físicas, químicas y otras. Estos métodos son bien conocidos por los expertos en la técnica. Los ejemplos de estos métodos incluyen, pero sin que ello pretenda ser limitante: tratamiento de renaturalización convencional, tratamiento con un agente de precipitación de proteínas (método de precipitación salina), centrifugación, alteración osmótica, supertratamiento, ultracentrifugación, cromatografía de tamiz molecular (filtración en gel), análisis de capa de adsorción, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) y diversas otras técnicas de cromatografía líquida y las combinaciones de las mismas.

Los anticuerpos de la invención pueden usarse solos o en combinación o conjugados con un marcador detectable (para fines de diagnóstico), un agente terapéutico, un resto de modificación de PK (proteína quinasa) o cualquier combinación de los mismos.

Los marcadores detectables con fines de diagnóstico incluyen, pero sin que ello pretenda ser limitante: marcadores fluorescentes o luminiscentes, marcadores radiactivos, agentes de contraste de MRI (formación de imágenes por resonancia magnética) o CT (tomografía computarizada), o enzimas capaces de producir productos detectables.

Los agentes terapéuticos que pueden unirse o conjugarse con los anticuerpos de la presente invención incluyen, pero sin que ello pretenda ser limitante: 1. radionúclidos; 2. venenos biológicos; 3. citocinas tales como IL-2, etc.; 4. nanopartículas/nanovarillas de oro; 5. partículas de virus; 6. liposoma; 7. nanopartículas magnéticas; 8. enzimas activadoras de profármacos (por ejemplo, DT-diaforasa (DTD) o proteína similar a bifenil hidrolasa (BPHL)); 10. agentes quimioterapéuticos (por ejemplo, cisplatino) o cualquier forma de nanopartículas, etc.

Inmunoconjugado

La presente invención también proporciona un inmunoconjugado, que comprende:

(a) una cadena VHH de un nanocuerpo anti-PD-L1 o un nanocuerpo anti-PD-L1 con la cadena VHH, en donde la secuencia de aminoácidos de la cadena VHH se muestra como una cualquiera de las SEQ ID NO: 1-3; y

(b) un resto de conjugación seleccionado de un grupo que consiste en: radionúclidos, anticuerpos enzimáticos, células y combinaciones de los mismos.

En otra realización preferida, el resto de conjugación es un radionúclido.

En otra realización preferida, el resto de conjugación es un fármaco o toxina.

En otra realización preferida, el resto de conjugación es un marcador detectable.

En otra realización preferida, el resto de conjugación se selecciona de un grupo que consiste en: marcadores fluorescentes o luminosos, marcadores radiactivos, agentes de contraste de MRI (formación de imágenes por resonancia magnética) o CT (tomografía computarizada), o enzimas capaces de producir productos detectables, radionúclidos, biotoxinas, citocinas (tales como IL-2, etc.), anticuerpos, fragmentos Fc de anticuerpo, fragmentos scFv de anticuerpo, nanopartículas/nanovarillas de oro, partículas víricas, liposomas, nanopartículas, enzimas activadoras de profármacos (por ejemplo, DT-xantasa de miocardio (DTD) o proteína similar a bifenil hidrolasa (BPHL), agentes quimioterapéuticos (tales como cisplatino) y cualquier forma de nanopartículas.

El inmunoconjugado de la presente invención puede utilizarse para la detección no invasiva de la expresión de PD-L1 en un sujeto. El inmunoconjugado tiene un tamaño pequeño y una especificidad elevada, y es adecuado para la detección corporal sistémica de tumores primarios y metastásicos con elevada exactitud y baja dosis de radiación

Kit

La presente invención también proporciona un kit que comprende el inmunoconjugado de la presente invención. En una realización preferida en la presente invención, el kit comprende además un recipiente, un manual de instrucciones, un indicador de isótopos y uno o más reactivos seleccionados del grupo que consiste en: agentes de contraste, reactivos de detección FACS, reactivos de detección de inmunofluorescencia celular, partículas magnéticas nanométricas y agentes de formación de imágenes.

Preferiblemente, el kit de la presente invención es un kit de diagnósticoin vivopara la detección no invasiva de la expresión de PD-L1 en un sujeto.

Agente citotóxico

El resto de conjugación del inmunoconjugado de la presente invención comprende: toxinas, tales como toxinas moleculares pequeñas o toxinas activas enzimáticas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo los fragmentos y/o variantes de las mismas. Los ejemplos de agentes citotóxicos incluyen, pero sin que ello pretenda ser limitante: auristatinas (tales como auristatina E, auristatina F, MMAE y MMAF), clortetraciclina, metanosol, ricina, cadena A de ricina, cobustatina, dokamicina, dorastatina, adriamicina, daunorubicina, paclitaxel, cisplatino, cc1065, bromuro de etidio, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, dihidroxiantrax dicetona, actinomicina, toxina diftérica, exotoxina de Pseudomonas(PE) A, PE40, toxina de la judía de acacia, cadena A de la toxina de la judía de acacia, cadena A de la toxina de la raíz de la cápsula, a-sarcisus, gelonina, mitogelina, retstreptocina, fenomicina, enomicina, curicina, toxina crotón, caliqueamicina, inhibidores deSaponaria officinalis,así como glucocorticoides y otros agentes quimioterapéuticos, y radioisótopos tales como At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212 o 213, P32 y Lu, incluyendo Lu177. Los anticuerpos también pueden conjugarse con enzimas activadoras de profármacos anticancerosos que pueden convertir profármacos en las formas activas.

El fármaco de peso molecular pequeño preferido con alta citotoxicidad se selecciona del grupo que consiste en monometilauristatina, galactomicina, medenina y una combinación de las mismas; más preferiblemente se selecciona del grupo que consiste en monometilolastatina-E (MMAE), monometilolastatina-D (MMAD), monometilolastatina-F (MMAF) y una combinación de las mismas.

Composición farmacéutica

La invención también proporciona una composición. Preferiblemente, dicha composición es una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anterior o fragmento activo o proteína de fusión del mismo, y un portador farmacéuticamente aceptable. En general, estos materiales pueden formularse en medios portadores acuosos no tóxicos, inertes y farmacéuticamente aceptables en los que el pH es generalmente de aproximadamente 5-8, preferiblemente de aproximadamente 6-8, aunque el pH puede variarse con la naturaleza del material de formulación y la afección que va a tratarse. Las composiciones farmacéuticas formuladas pueden administrarse por vías convencionales que incluyen, pero sin que ello pretenda ser limitante, administración intratumoral, intraperitoneal, intravenosa o tópica.

La composición farmacéutica de la presente invención puede usarse directamente para unirse a la molécula de proteína PD-1 y, por tanto, puede usarse para tratar tumores. Además, también se pueden usar otros agentes terapéuticos al mismo tiempo.

La composición farmacéutica de la presente invención contiene una cantidad segura y eficaz (por ejemplo, 0,001-99% en peso, preferiblemente 0,01-90% en peso, y más preferiblemente 0,1-80% en peso) de los anticuerpos de la presente invención anteriormente mencionados (o sus conjugados) y portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables. Tales portadores incluyen, pero sin que ello pretenda ser limitante: solución salina, tampón, dextrosa, agua, glicerol, etanol y las combinaciones de los mismos. La formulación de fármaco debería ser adecuada para el modo de administración. La composición farmacéutica de la presente invención puede prepararse en forma de una inyección, por ejemplo, mediante un método convencional que usa solución salina fisiológica o una solución acuosa que contiene glucosa y otro adyuvante. Las composiciones farmacéuticas tales como inyecciones y soluciones se preparan preferiblemente en condiciones asépticas. La cantidad de ingrediente activo administrada es una cantidad terapéuticamente eficaz, por ejemplo, de aproximadamente 10 microgramos/kilogramo de peso corporal a aproximadamente 50 miligramos/kilogramo de peso corporal al día. Además, los polipéptidos de la invención también pueden usarse con otros agentes terapéuticos.

Cuando se usa una composición farmacéutica, se administra una cantidad segura y eficaz del inmunoconjugado al mamífero, en el que la cantidad segura y eficaz es habitualmente de al menos aproximadamente 10 microgramos/kilogramo de peso corporal, y en la mayoría de los casos, no mayor de aproximadamente 50 mg/kilogramo de peso corporal, preferentemente la dosis es de aproximadamente 10 microgramos/kilogramo de peso corporal a aproximadamente 10 miligramos/kilogramo de peso corporal. Por supuesto, debe considerarse que factores tales como la vía de administración y el estado de salud del paciente definen las dosis específicas, todas las cuales están dentro de las habilidades de los médicos expertos. Las principales ventajas de la invención incluyen:

(a) El inmunoconjugado de la presente invención se dirige a tumores tanto primarios como metastásicos simultáneamente con la obtención de imágenes de cuerpo completo para la localización, medición cualitativa y cuantitativa así como la estadificación del cáncer.

(b) El inmunoconjugado de la presente invención tiene un tamaño pequeño y una especificidad elevada, y puede penetrar en el tejido tumoral de manera más eficaz y se excreta más fácilmente por el cuerpo, reduciendo de este modo la dosis de radiación a los tejidos no diana.

(c) El inmunoconjugado de la presente invención tiene una semivida corta y un tiempo de diagnóstico más corto. Y los resultados pueden obtenerse rápidamente.

(d) El inmunoconjugado de la presente invención tiene alta especificidad, detección precisa y puede evitar falsos negativos locales.

(e) La unión del nanocuerpo anti-PD-L1 de la presente invención a PD-L1 no interfiere con la unión del PD-1 al PD-L1.

La presente invención se ilustra adicionalmente a continuación junto con ejemplos específicos. Debe entenderse que estos ejemplos no pretenden limitar el alcance de la invención. Los métodos experimentales en los siguientes ejemplos que no especifican las condiciones específicas habitualmente están de acuerdo con las condiciones convencionales o condiciones recomendadas por el fabricante. A menos que se indique lo contrario, los porcentajes y copias se calculan en peso.

Ejemplo 1. Expresión y purificación del nanocuerpo enEscherichia coli

(1) Los plásmidos correspondientes de nanocuerpos (secuencias de SEQ ID NO: 1 -3 como se muestra en la Fig. 6) se electrotransformaron en WK6 deE. coliy se revistieron en una placa de cultivo de glucosa LA+ que contenía ampicilina y glucosa, y se incubaron durante la noche a 37°C.

(2) Se seleccionaron colonias individuales y se inocularon en 5 ml de medio LB que contenía ampicilina y se incubaron durante la noche en un agitador incubador a 37°C.

(3) Se inoculó 1 ml del cultivo inoculado durante la noche en 330 ml de medio de cultivo TB y se incubó durante la noche a 37°C. Se añadió IPTG cuando el valor de DO alcanzó 0,6-1 y el cultivo se incubó durante la noche en un agitador incubador a 28°C.

(4) Las bacterias se recogieron por centrifugación, y el extracto bruto de anticuerpo se obtuvo por el método de ósmosis.

(5) El extracto bruto de anticuerpo se obtuvo por el método de ósmosis.

(6) Los nanocuerpos con pureza >90% se prepararon mediante cromatografía de afinidad iónica en columna de níquel.

Los nanocuerpos con las secuencias de SEQ ID No.: 1-3 se designaron como Nanocuerpo n.°1, Nanocuerpo n.° 2 y Nanocuerpo n.°3, respectivamente.

Los resultados de la purificación se muestran en la figura 1. La pureza del nanocuerpo n.° 1 y el nanocuerpo n.° 2 alcanzó en ambos más del 95%.

Ejemplo 2. Identificación de la afinidad de nanocuerpos mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)

(1) El PD-L1 se revistió sobre la placa, y se usaron IgG y NaHCO3 (100 mM, pH 8,2) como controles en blanco. Todos se incubaron durante la noche a 4°C.2

(2) Al día siguiente, las muestras se lavaron tres veces con PBST. Se añadió BSA al 1% y las placas se sellaron a temperatura ambiente durante 2 horas.

(3) Los nanocuerpos purificados se diluyeron y se hicieron reaccionar con PD-L1, IgG y NaHCO3 revestidos a temperatura ambiente durante 1 hora.

(4) Los anticuerpos no unidos se lavaron con PBST. Se añadieron anticuerpos anti-HA de ratón y las placas se pusieron a temperatura ambiente durante 1 hora

(5) Los anticuerpos no unidos se lavaron con PBST. Después se añadieron anticuerpos marcados con fosfatasa alcalina anti-ratón de cabra. Las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. (6) Los anticuerpos no unidos se lavaron con PBST y se añadió solución cromogénica de fosfatasa alcalina. El valor de absorción se leyó a 405 nm mediante un instrumento ELISA, y la especificidad del nanocuerpo se valoró según el valor de absorción.

Como se muestra en la figura 2, el nanocuerpo n.°1 y el nanocuerpo n.°2 solo se unieron a PD-L1. El resultado de la detección del nanocuerpo n.°3, que no se mostró específicamente en la figura, fue similar al del nanocuerpo n.°1

La afinidad de los nanocuerpos se determinó adicionalmente mediante dilución en gradiente.

Los resultados se muestran en la Tabla 1. Los resultados mostraron que la afinidad de los nanocuerpos en la presente invención alcanzó 1 x 10-9 o más.

Tabla 1. Afinidad y especificidad de los Nanocuerpos anti-PD-L1

Ejemplo 3. Detección del efecto inhibidor del nanocuerpo en la interacción PD-1/PD-L1 mediante citometría de flujo (FAC)

(1) Se recogieron 1x106 células HEK293F transfectadas transitoriamente para expresar la proteína de longitud completa de PD-L1 humana y se resuspendieron en tampón BSA-PBS al 0,5%. Y se añadieron 10 pg de nanocuerpos anti-PD-L1, y se prepararon un control positivo, un control negativo y un grupo en blanco (PBS). Todas las muestras se incubaron con 5 pg de hPD-1 -Fc-biotina durante 20 minutos a 4°C. (2) Las células se lavaron dos veces con PBS y se incubaron con SA-PE de eBioscience durante 20 minutos a 4°C. Las células se lavaron de nuevo con PBS dos veces y se detectaron por citometría de flujo. Los resultados se muestran en la Tabla 1. Los resultados mostraron que los nanocuerpos de la presente invención no interferían en la unión de PD-1 a PD-L1.

Ejemplo 4. Detección de la especificidad del nanocuerpo por citometría de flujo

(1) Tipos de células: HCC827 y A549. Las células se lavaron dos veces con PBS.

(2) La solución de nanocuerpos se diluyó con PBS. Se prepararon al mismo tiempo el grupo de control positivo, control negativo y blanco (PBS).

(3) Las células se dividieron en placas de 96 pocillos, en las que el número de células por muestra fue de 3x1045. Los nanocuerpos diluidos se añadieron a continuación a cada pocillo, se mezclaron y se colocaron a 4°C durante 20 minutos.

(4) Las células se lavaron dos veces con PBS y se incubaron con anti-HA Alexa Fluor 488 durante 20 minutos a 4°C

(5) Las células se lavaron de nuevo dos veces y se detectaron mediante BD FACS Calibur.

Los resultados se muestran en la Tabla 1. La tasa positiva de los nanocuerpos fue del 67-93% en líneas celulares con alta expresión de PD-L1 (HCC827) y fue del 12-33% en líneas celulares con baja expresión de PD-L1 (A549). La diferencia entre las dos líneas celulares fue de más de 2 veces, lo que sugirió además que los nanocuerpos de la presente invención eran altamente específicos para PD-L1.

Ejemplo 5. Marcaje con I-125, purificación y exploración SPECT del nanocuerpo

(1) Se añadieron 150 j l de la solución de nanocuerpo con 100 j l de solución 0,02 mol/l de tampón fosfato a pH 7,4 y 50 j l de solución de Na125I, y se añadieron 20 j l de solución de 5 mg/ml de cloramina T a la mezcladora, y se hicieron reaccionar en la mezcladora durante 70 s a temperatura ambiente. Después se añadieron 200 j l de solución de sulfito sódico (5 mg/ml) y se incubaron durante 5 minutos.

(2) Los nanocuerpos se separaron mediante columna PD10 y se eluyeron usando solución tampón 0,02 mol/l de fosfato a pH 7,4. Se recogieron 10 gotas por tubo. La radiopureza de los nanocuerpos marcados con I-125 se identificó mediante cromatografía en papel.

(3) Se inocularon 5x105 células HCC827 con alta expresión de PD-L1 en la axila derecha de ratones lampiños y el tumor se cultivó hasta el tamaño de 150-200 mm3 para el estudio.

(4) Los ratones portadores de tumor se anestesiaron con isoflurano y, a través de la vena de la cola, se les inyectaron nanocuerpos marcados con I-125 (~50 ug, 5 MBq).

(5) Se realizó el barrido 0,5 h después de la administración, y los datos se recogieron con SPECT estática de 15 min y CT de cuerpo completo de resolución media.

La Figura 3 y la Tabla 2 muestran las imágenes de exploración SPECT de 30 minutos y los datos de biodistribución de ratones portadores de tumores. Los resultados mostraron que el nanocuerpo n.°1 y el nanocuerpo n.°2 pueden acumularse eficazmente en el tumor con alta expresión de PD-L1 para la detección no invasiva de la expresión de PD-L1, por lo que pueden usarse para el pronóstico y diagnóstico de cáncer. Mientras tanto, los anticuerpos que no se unen se eliminaron rápidamente del torrente sanguíneo a través de los riñones y las vejigas, reduciendo la dosis de radiación del cuerpo y acortando el tiempo de espera para la obtención de imágenes. El resultado de la formación de imágenes del nanocuerpo n.°3, que no se mostró específicamente en la figura, fue similar al del nanocuerpo n.°1

Tabla 2. Biodistribución de nanocuerpo anti-PD-L1 marcado con I-125 en ratones portadores de tumores con alta expresión de PD-L1

Ejemplo 5. Marcaje con 99mTc, separación y purificación de nanocuerpos, ensayo de estabilidad en suero y exploración por formación de imágenes SPECT

(1) Se añadieron 5,5 mg de Na2CÜ3, 15, 2 mg de tartrato sódico potásico y 20,5 mg de NaBH4 a una botella estéril de 10 ml. Se hizo pasar CO durante 20 minutos. Y se añadió 1 ml de Na [99 mTcÜ4] (35 mCi). La botella se selló y se dejó reaccionar durante 30 min a 80°C.

(2) Se añadieron 50 j l de la solución de anticuerpo a 500 j l de la solución de reacción de 99mTc (CO)3(H2O)3 (6,56 mCi), para que reaccionaran durante 90 min a 45-50°C.

(3) Los nanocuerpos marcados con 99mTc se separaron mediante columna PD10 y se eluyeron con 0,02 mol/l de solución tampón fosfato pH 7,4. La pureza radioquímica se identificó mediante cromatografía en capa fina (TLC).

(4) Se añadieron 100 ql de los nanocuerpos marcados con 99mTc a 500 ql de suero de ratón o humano y se incubaron durante 30, 90 y 180 min a 37°C.

(5) La solución de nanocuerpo marcado con 99mTc se analizó por HPLC SEC.

(6) Se inocularon 5x105 de células HCC827 con alta expresión de PD-L1 o 5x105 de células A549 con baja expresión de PD-L1 en la axila derecha de ratones lampiños y el tumor se cultivó hasta el tamaño de 150-200 mm3 para el estudio.

(7) Los ratones portadores de tumor se anestesiaron con isoflurano y, a través de la vena de la cola, se les inyectaron nanocuerpos marcados con Tc-99m (~ 10 ug, 5 MBq) o nanocuerpos marcados mezclados con nanocuerpos no marcados 20x o, a través de la vena de la cola, se les inyectó Atezolizumab hace 72 horas previamente. Se realizó un barrido 0,5 h después de la administración, y los datos se recogieron con SPECT estática de 15 min y CT de cuerpo completo de resolución media

Los resultados se muestran en la figura 4. El espectro de HPLC mostró que el nanocuerpo n.° 2 se incubóin vitrohasta 180 minutos sin ninguna degradación y fue muy estable. Los resultados de HPLC del nanocuerpo n.° 1 y el nanocuerpo n.° 3, que no se muestran específicamente en la figura, fueron similares a los del nanocuerpo n.° 2

Las Figuras 5 y la Tabla 3 muestran las imágenes de exploración SPECT de 30 minutos y los datos de biodistribución de ratones portadores de tumores. Los resultados mostraron que el nanocuerpo n.° 2 puede acumularse eficazmente en el tumor con alta expresión de PD-L1 para la detección no invasiva de la expresión de PD-L1 y puede usarse para el pronóstico y diagnóstico de cáncer. Los resultados de la imagen del nanocuerpo n.° 1 y el nanocuerpo n.° 3, que no se muestran específicamente en la figura, fueron similares a los del nanocuerpo n.° 2.

Tabla 3. Distribuciónin vivode nanocuerpos anti-PD-L1 marcados con 99m-Tc en ratones portadores de tumores

Todas las referencias bibliográficas mencionadas en la presente invención se citan como referencia en esta solicitud, al igual que cada referencia bibliográfica se cita por separado como referencia.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un inmunoconjugado, que comprende:

(a) una cadena VHH de un nanocuerpo anti-PD-L1 o un nanocuerpo anti-PD-L1 con la cadena VHH, en donde la secuencia de aminoácidos de la cadena VHH es como se define en la SEQ ID NO: 2; y

(b) un resto de conjugación que es un radionúclido que comprende:

(i) un radioisótopo de diagnóstico seleccionado de un grupo que consiste en: Tc-99m, Ga-68, F-18, I-123, I-125, In-111, Ga-67, Cu-64, Zr-89, C-11, y una combinación de los mismos; y/o

(ii) un radioisótopo terapéutico seleccionado de un grupo que consiste en: Lu-177, Y-90, Ac-225, As-211, Bi-212, Bi-213, Cs-137, Cr-51, Co-60, Dy-165, Er-169, Fm-255, Au-198, Ho-166, I-125, I-131, Ir-192, Fe-59, Pb-212, Mo-99, Pd-103, P-32, K-42, Re-186, Re-188, Sm-153, Ra-223, Ru-106, Na-24, Sr-89, Tb-149, Th-227, Xe-133, Yb-169, Yb-177, y una combinación de los mismos.

2. El inmunoconjugado de la reivindicación 1, en el que el radionucleido es Tc-99m o I-125.

3. Un reactivo de detección de PD-L1, que comprende el inmunoconjugado de la reivindicación 1 y un portador de detección aceptable.

4. El reactivo de detección de la reivindicación 3, que se selecciona de un grupo que consiste en: nanopartículas magnéticas.

5. Una composición farmacéutica, que comprende el inmunoconjugado de la reivindicación 1 y un portador farmacéuticamente aceptable.

6. Un kit de detección para la expresión de PD-L1, que comprende el inmunoconjugado de la reivindicación 1 y un manual de instrucciones.

7. Un inmunoconjugado de la reivindicación 1 para su uso en la detección de PD-L1in vivoo en el tratamiento o prevención de tumores con expresión de PD-L1.