ES3030960T3 - Use of monensin to regulate glycosylation of recombinant proteins - Google Patents

Abstract

Se proporcionan métodos para modular el alto contenido de glicoforma de manosa de una proteína en un cultivo celular poniendo en contacto las células que expresan la proteína de interés con monensina. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Uso de monensina para regular la glucosilación de proteínas recombinantes

Campo de la invención

La presente invención se refiere generalmente a compuestos y a procesos para modular una o más propiedades de una proteína recombinante producida por cultivo celular, incluyendo cultivos de células de mamífero, tales como cultivos de células CHO.

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de EE. UU. n.° 61/898.310 presentada el 31 de octubre de 2013.

Antecedentes de la invención

La glucosilación es una modificación postraduccional ubicua en células de mamífero; tanto las inmunoglobulinas humanas normales como los anticuerpos monoclonales terapéuticos (mAb) producidos en células de ovario de hámster chino (CHO) son glucoproteínas. Aunque las glucoformas de una proteína expresada por células hospedadoras CHO se determinan en gran parte durante la generación de la línea celular y la selección del clon, la presencia y/o grado del alto contenido de glucoformas de manosa también pueden verse afectados por las condiciones del cultivo celular (Pacis et al., (2011) Biotechnol Bioeng 108, 2348-2358).

Tanto las propiedades farmacocinéticas como las funciones efectoras de los mAb terapéuticos se pueden ver afectadas por glucosilación de la región constante. Los azúcares terminales, tales como la fucosa y la galactosa, pueden afectar la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC; Wright, A. y S.L. Morrison, Trends Biotechnol (1997) 15:26-32). Los glucanos de alta manosa pueden aumentar la depuración del suero de ciertos mAb, afectando así posiblemente la eficacia (Goetze, et al., (2011) Glycobiology 21:949-59). Alternativamente, las glucoformas de alta manosa pueden aumentar la afinidad de los anticuerpos por el receptor Fc gamma III, aumentando así la actividad de ADCC de ciertos anticuerpos (Yu, et al. (2012) MAbs 4:475-87). Así, para cada mAb recombinante, necesita mantenerse un cierto perfil de glucosilación que soporta mejor el potencial terapéutico del mAb.

Los métodos de manipulación del contenido de glucoformas de alta manosa de una proteína en el cultivo celular incluyen cambios en las composiciones de medios, osmolalidad, pH, temperatura, etc. (Yu, et al., arriba, Pacis et al., arriba, Chee Furng Wong et al. (2005) Biotechnol Bioeng 89:164-177; Ahn, et al. (2008) Biotechnol Bioeng 101:1234-44). La efectividad de estos métodos es específica para las líneas celulares, tipos de molécula y ambiente de los medios y se obtiene normalmente por prueba y error. Además, estos métodos tienden también a alterar la productividad del anticuerpo, el comportamiento del cultivo celular y otros atributos de la calidad del anticuerpo. La monensina es un ionóforo de sodio-hidrógeno capaz de integrarse en las membranas biológicas y de esta manera perturbar los gradientes de sodio-hidrógeno a través de aquellas membranas. Se usa ampliamente como un antibiótico en la industria del ganado y las aves de corral y como una herramienta para estudiar el tráfico vesicular intracelular en células eucariotas cultivadas. Se ha informado que la adición de monensina inhibe la secreción de muchas proteínas diferentes de varios tipos celulares (Fukao, H., et al. (1989) 14:673-84; Kuhn, L.J., et al (1986). J Biol Chem 261:3816-25). La monensina también inhibe el procesamiento de glucanos al neutralizar el pH del Golgi, afectando así la función de varias enzimas de glucosilación (Kubo, R.T. y M.L. Pigeon, (1983) Mol Immunol 20:345-8). Se ha observado que la adición de monensina lleva a un aumento en las glucoformas de alta manosa en una variedad de diferentes proteínas expresadas en varios sistemas celulares (Machamer, C.E. y P. Cresswell (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81:1287-91; Kousoulas, K.G., et al. (1983) Intervirology 20:56-60; Chatterjee, S., et al., (1982) J Virol 44:1003-12). Marcella Yu et al., ("Production, characterization and pharmacokinetic properties of N-Linked Mannose-5 glycans", MAbs, vol. 4, n.° 4, julio/agosto de 2012, páginas 475-487) se refiere a la producción y caracterización de las propiedades farmacocinéticas de anticuerpos con glucanos Man5 unidos a N mediante la regulación del contenido de glucoformas de alta manosa con kifunesina. El efecto fue que se produjeron principalmente anticuerpos con glucanos manosa 8 y manosa 9. Los glucanos de manosa 5 se produjeron mediante una etapa adicional de una reacción de recortein vitrocon a-1,2-manosidasa. P.W. Ledger et al. ("Abnormal Glycosylation of Human Fibronectin Secreted in the Presence of Monensin", The Journal of Biological Chemistry, vol.

258, n.° 1, 10 de enero de 1983, páginas 547-554) descubrieron que la monensina lleva a una glucosilación anómala de la fibronectina y sugirieron que la monensina no altera la glucosilación inicial de la fibronectina, ya que los oligosacáridos de alta manosa están presentes tanto en la fibronectina intracelular de control como en la tratada con fibronectina. Pacis E. et al., "Effects of cell culture conditions on antibody N-linked glycosylation-what affects high mannose 5 glycoform", Biotechnology and Bioengineering, vol. 108, n.° 10, páginas 2348-2358) investigaron el papel de las glucosiltransferasas en el nivel de Man5, midiendo los niveles de ARNm de la N-acetilglucosaminiltransferasa I GnT-I en diferentes condiciones de osmolalidad.

Sin embargo, en la mayoría de los informes publicados se usa la aplicación a corto plazo de monensina para estudiar sus efectos en el procesamiento de glucanos; la administración prolongada de monensina en concentraciones micromolares es tóxica para las células. Por lo tanto, ningún estudio ha evaluado la utilidad de monensina para modular el perfil de alto manosa de los anticuerpos terapéuticos producidos por las líneas celulares de producción de CHO.

Todavía existe una necesidad de identificar un mecanismo universal que pueda aumentar las glucoformas de alta manosa (particularmente manosa 5) en los mAb sin comprometer el comportamiento del cultivo de producción de CHO y el rendimiento de anticuerpos. Dicho método debería beneficiar el desarrollo del proceso de proteínas terapéuticas. La invención proporciona un método que regula la glucoforma de alta manosa al poner en contacto células que expresan una proteína terapéutica con monensina.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona las siguientes realizaciones definidas en los puntos 1-17, a continuación:

1. Un método de regulación por incremento del contenido de glucoformas de alta manosa de una proteína recombinante que comprende una región Fc de inmunoglobulina durante un proceso de cultivo de células de mamífero, que comprende:

establecer un cultivo de células de mamífero que expresa la proteína recombinante en un medio de cultivo sin suero en un biorreactor,

mantener las células de mamífero durante una fase de producción, y

poner en contacto el cultivo celular con monensina.

2. El método según el punto 1, en donde la monensina está presente en el cultivo celular durante un periodo de tiempo seleccionado del grupo que consiste en: un día; dos días; tres días; cuatro días; cinco días; seis días; siete días; ocho días; nueve días; y 10 días o más.

3. El método según el punto 1, en donde la monensina está presente en el cultivo celular durante la duración del cultivo celular.

4. El método según el punto 1, 2 o 3, en donde la monensina está presente en el cultivo celular a una concentración fija y seleccionada, seleccionada preferentemente del grupo que consiste en una concentración:

entre 10 nM y 800 nM;

entre 25 nM - 750 nM; y

entre 50 nM y 500 nM.

5. El método según el punto 4, en donde la concentración de monensina se selecciona del grupo que consiste en 50 nM, 100 nM, 250 nM; 500 nM; y 750 nM.

6. El método según el punto 1, 2 o 3, en donde la monensina está presente en el cultivo celular a una primera concentración seleccionada de entre 25 nM y 100 nM, luego se aumenta a una segunda concentración más alta entre 100 nM y 500 nM.

7. El método según el punto 6, en donde la monensina se mantiene a la primera concentración durante un periodo de tres a cinco días, luego se mantiene a la segunda concentración durante un periodo de un día a durante toda la duración del cultivo.

8. El método según el punto 6 o 7, en donde la segunda concentración más alta de monensina se estrecha posteriormente a entre 25 nM y 100 nM durante un periodo de tiempo de un día a durante toda la duración del cultivo.

9. El método del punto 1 o 2, en donde la monensina se añade al cultivo celular entre tres y 15 días después de establecerse el cultivo.

10. El método del punto 9, en donde la monensina se añade al cultivo celular en el día 3, en el día 4, en el día 5; en el día 6; en el día 7; en el día 8; en el día 9; en el día 10; en el día 11; o en el día 12 después de establecerse el cultivo.

11. El método de uno cualquiera de los puntos 1 - 10, en donde cultivo celular se mantiene por perfusión, preferentemente

en donde la perfusión comienza en o aproximadamente el día 1 a en o aproximadamente el día 9 del cultivo celular;

en donde la perfusión comienza en o aproximadamente el día 3 a en o aproximadamente el día 7 del cultivo celular; o

en donde la perfusión comienza cuando células han alcanzado una fase de producción.

12. El método del punto 11, en donde la perfusión se lleva a cabo mediante flujo tangencial alterno.

13. El método del punto 12, en donde la perfusión se lleva a cabo mediante flujo tangencial alterno usando un ultrafiltro o un microfiltro.

14. El método de una cualquiera de los puntos 1 - 10, en donde el cultivo celular se mantiene por lote alimentado, preferentemente en donde el cultivo se alimenta tres o cuatro veces durante la producción; más preferentemente, en donde el cultivo se alimenta en un día entre el día dos y cuatro, en un día entre el día 5 y 7, y en un día entre el día 8 y 10, o en donde el cultivo se alimenta en un día entre el día dos y cuatro, en un día entre el día 5 y 6, en un día entre el día 7 y 8, y en un día entre el día 8 y 10 o después.

15. El método de uno cualquiera de los puntos 1 a 14, en donde el método comprende además una etapa de recogida.

16. El método de uno cualquiera de los puntos 1 a 15, en donde el contenido de glucoformas de alta manosa está regulado por incremento, y en donde la especie de alta manosa que está regulada por incremento se selecciona al menos del grupo que consiste en Man5, Man6, Man7, Man8a, Man8b y Man9.

17. El método de la reivindicación 16, en donde la especie de alta manosa que está regulada por incremento es Man5.

En el presente documento se divulga un método de regulación de la glucoforma de alta manosa de una proteína recombinante durante un proceso de cultivo de células de mamífero que comprende estabilizar un cultivo de células de mamífero en un biorreactor, y poner en contacto el cultivo celular con monensina. Opcionalmente, la invención comprende además una etapa de recoger la proteína recombinante producida por el cultivo celular. En una realización adicional, la proteína recombinante producida por el cultivo celular se purifica y formula en una formulación farmacéuticamente aceptable.

En una realización adicional, aumenta la glucoforma de alta manosa de una proteína recombinante en comparación con la producida por un cultivo donde las células no se ponen en contacto con monensina. En una realización, la especie de glucano de alta manosa es Manosa 5 (Man5). En otra realización, la especie de glucano de alta manosa es manosa 6 (Man6), Manosa 7 (Man7), Manosa 8 (incluyendo manosa 8a y 8b; Man8a y 8b, o manosa 9 (Man9). En una realización adicional, la especie de glucano de alta manosa comprende una mezcla de Man5, Man6, Man7, Man8a, Man8b y/o Man9.

La divulgación proporciona una realización adicional en la cual la glucoforma de alta manosa de una proteína recombinante es menos de 10 %. En otra realización, la glucoforma de alta manosa de una proteína recombinante es mayor que o igual a 10 %. En una realización adicional, la glucoforma de alta manosa de una proteína recombinante producida por un cultivo celular que está en contacto con monensina es mayor que la producida por un cultivo celular que no está en contacto con monensina en un punto porcentual, dos puntos porcentuales, tres puntos porcentuales, cuatro puntos porcentuales o 5 puntos porcentuales. Aún en otra realización, la glucoforma de alta manosa de una proteína recombinante producida por un cultivo celular que está en contacto con monensina es mayor que la producida por un cultivo celular que no está en contacto con monensina en 6, 7, 8, 9 o 10 puntos porcentuales. En realizaciones adicionales, la glucoforma de alta manosa de una proteína recombinante producida por un cultivo celular que está en contacto con monensina es mayor que la producida por un cultivo celular que no está en contacto con monensina en 12, 15, 17, 20, 22, 25, 27, 30, 32, 35, 37 o 40 puntos porcentuales. Aún en otra realización, la glucoforma de alta manosa de una proteína recombinante producida por un cultivo celular que está en contacto con monensina es mayor que la producida por un cultivo celular que no está en contacto con monensina en 50 puntos porcentuales o más (es decir, 60, 70, 80, 90 o 100 puntos porcentuales).

En una realización, se añade monensina al cultivo celular en una única dosis en bolo en embolada para lograr una concentración final. En una realización, la concentración final de monensina en el medio es 0,1 nM - 1000 nM; en otra realización, la concentración es 10 nM - 800 nM; en otra, la concentración final es 25 nM - 750 nM; aún en otra realización, la concentración final es 50 nM - 500 nM. Aspectos adicionales incluyen un método de regulación del contenido de glucoformas de alta manosa de una proteína recombinante durante un proceso de cultivo de células de mamífero al incluir monensina en el medio de cultivo celular a una concentración final de 50 nM, 100 nM, 250 nM; 500 nM; o de 750 nM.

Una realización de la divulgación proporciona un método de regulación del contenido de glucoformas de alta mañosa de una proteína recombinante durante un proceso de cultivo de células de mamífero al alimentar las células con un medio que contiene monensina, o al cual se añada monensina, continuamente durante entre uno y tres días. En una realización, la monensina está presente en el cultivo celular (debido a que se añade al medio o se añade al cultivo junto con el medio) durante aproximadamente un día (20 - 28 horas); durante aproximadamente dos días (40 - 56 horas) o aproximadamente tres días (60 - 84 horas). En una realización adicional, la monensina está presente en el cultivo celular (debido a que se añade al medio o se añade al cultivo junto con el medio) durante cuatro días, cinco días, seis días, siete días, ocho días, nueve días, 10 días o más. Para realizaciones adicionales, la monensina está presente en el cultivo celular para la duración completa del proceso de cultivo. En esta realización, la monensina puede estar presente en un conjunto, concentración seleccionada, o puede estar presente en concentración aumentada, o en una concentración inicial que se aumenta a una concentración superior antes de disminuirse de nuevo a la concentración original, u otra concentración inferior, como se describe en el presente documento.

Una realización adicional proporciona un método de regulación del contenido de glucoformas de alta manosa de una proteína recombinante durante un proceso de cultivo de células de mamífero al poner en contacto las células con un medio que contiene monensina, y simultáneamente o secuencialmente añadir monensina de manera separada al cultivo. Las realizaciones adicionales incluyen el uso de monensina en un cultivo por lote alimentado y el uso de monensina en un cultivo por perfusión. En una realización, el cultivo se perfunde usando flujo tangencial alterno (ATF). En una realización, la monensina está presente en el cultivo celular debido a que se añade al cultivo en el medio a una concentración seleccionada durante un periodo de tiempo seleccionado, como se describe en el presente documento, y la concentración de monensina se aumenta, en un momento de tiempo seleccionado y durante un periodo de tiempo seleccionado, por la adición de monensina al cultivo de manera separada de, pero opcionalmente junto con, el medio de alimentación o el medio de perfusión.

La divulgación proporciona además para la adición de monensina al cultivo celular entre tres y 15 días después de que el cultivo se establezca. En una realización, la monensina se añade al cultivo celular en el día 3, en el día 4, en el día 5; en el día 6; en el día 7; en el día 8; en el día 9; en el día 10; en el día 11; o en el día 12 después de que el cultivo se establezca. La monensina se mantiene a una concentración como se describe previamente (en una realización, a una concentración final de 25 nM, 50 nM, 100 nM, 250 nM, de 500 nM o de 750 nM) durante un periodo de tiempo entre uno y siete días, y se puede añadir por cualquiera de los métodos mencionados en el presente documento (es decir, inclusión en el medio de alimentación, adición de manera separada del medio de alimentación, etc.).

Una realización adicional de la invención proporciona la adición de monensina al cultivo celular entre uno y 15 días antes de que se recoja el cultivo celular. Aún en otra realización, la monensina está presente para la duración completa del cultivo celular, desde el día 0 hasta la recogida. En una realización, se añade monensina al cultivo celular un día antes de la recogida; dos días, tres días; cuatro días; cinco días; seis días; siete días; ocho días; nueve días; o diez días antes de la recogida. La monensina se mantiene a una concentración como se describe previamente (en una realización, a una concentración final de 25 nM, 50 nM, 100 nM, 250 nM, de 500 nM o de 750 nM; en otra realización, en uno de los intervalos mencionados anteriormente) durante un periodo de tiempo entre uno y tres días. En una realización adicional, la cantidad de monensina se aumenta con el paso del tiempo, hasta un estado estacionario o hasta una concentración de la cual luego disminuye, como se describe en el presente documento.

Aún en otro aspecto de la invención, la adición de monensina al cultivo celular comienza entre uno y 15 días después de que el cultivo se establezca, o entre tres y 15 días después de que el cultivo se establezca, y opcionalmente continua hasta que el cultivo celular se recoge. En una realización, se añade monensina al cultivo celular un día después de que el cultivo se establezca; dos días, tres días; cuatro días; cinco días; seis días; siete días; ocho días; nueve días; o diez días después de que el cultivo se establezca. En una realización adicional, se añade monensina al cultivo celular 11 días, 12 días; 13 días; 14 días; 15 días; 16 días; 17 días; 18 días; 19 días; 20 días; 21 días o 22 días después del establecimiento del cultivo. Como se describe previamente, en una realización, la monensina está presente para la duración completa del cultivo celular, desde el día 0 hasta la recogida. En otra realización, la monensina se mantiene a una concentración como se describe arriba (en una realización, a una concentración final de 25 nM, 50 nM, 100 nM, 250 nM, de 500 nM o de 750 nM; en otra realización, en uno de los intervalos mencionados anteriormente) durante un periodo de tiempo entre uno y tres días. En una realización adicional, la cantidad de monensina se aumenta con el paso del tiempo, hasta un estado estacionario o hasta una concentración de la cual luego disminuye, como se describe en el presente documento.

En una realización, se añade monensina al cultivo celular para lograr una concentración constante; en otra realización, la concentración de monensina es variada. Para una realización, la concentración de monensina en el cultivo celular puede mantenerse a 25 nM durante tres a cinco días, luego aumentarse (o escalonarse) hasta 50 nM durante desde un día hasta la duración del cultivo. En otra realización, la concentración de monensina en el cultivo celular puede mantenerse a 25 nM durante tres a cinco días, luego aumentarse hasta 50 nM durante tres a cinco días, luego estrecharse de nuevo hasta 25 nM para la duración del cultivo. Las realizaciones adicionales comprenden periodos de tiempo más cortos o más largos durante los cuales los niveles de monensina aumentan, se mantienen estacionarios, y opcionalmente disminuyen, por ejemplo, aumentan durante un periodo de uno a dos días, se mantienen estacionarios durante un periodo de uno a dos días, y opcionalmente disminuyen durante un periodo de uno a dos días.

La divulgación incluye además variar la concentración de monensina desde entre 25 nM y 100 nM hasta entre 100 nM y 500 nM, y mantener la segunda concentración más alta de monensina durante un periodo desde un día hasta la duración del cultivo. En otra realización, el método comprende opcionalmente una etapa de estrechamiento que reduce la concentración de monensina hasta entre 25 nM y 100 nM (durante un periodo desde un día hasta la duración del cultivo). La duración de cada etapa puede variarse, como se describe, manteniendo la monensina a un nivel seleccionado durante desde tres hasta cinco días en cada etapa. También pueden emplearse periodos de tiempo más largos, así como otras variaciones tales como aumentar gradualmente la cantidad de monensina durante un periodo de tiempo y mantener la concentración de monensina, o disminuirla gradualmente.

En una realización, la monensina se incluye en el medio, el cual puede ser un medio de alimentación o un medio de perfusión, a una concentración final seleccionada (es decir, 25 nM, 50 nM, 100 nM, 250 nM, de 500 nM o de 750 nM); en otra realización, la monensina se añade al cultivo celular junto con el medio, aún en otra realización la monensina se añade de manera separada del medio. La monensina se añade al cultivo a una tasa suficiente para lograr y/o mantener una concentración final deseada en el cultivo. En una realización, la monensina se añade a una tasa de 1/40 - 1/60 de la tasa a la cual el medio se añade al cultivo, por ejemplo, por perfusión; en otra realización, la monensina se añade a una tasa de 1/50 de la tasa. En realizaciones adicionales, la tasa se varía para lograr una concentración deseada usando cálculos que se conocen en la técnica. La monensina se puede añadir a una tasa que es desde 1/10 de la del medio de cultivo hasta 1/100 de la del medio de cultivo.

En combinación con cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, también puede añadirse antiespumante en el recipiente de cultivo en caso de necesidad. Alternativamente o además, se usa carbonato sódico 1 M u otra base adecuada para mantener el pH en el valor de consigna deseado.

Como se describe en el presente documento, el cultivo celular puede mantenerse por perfusión. En una realización, la perfusión comienza en o aproximadamente el día 1 hasta en o aproximadamente el día 9 del cultivo celular. En una realización relacionada, la perfusión comienza en o aproximadamente el día 3 hasta en o aproximadamente el día 7 del cultivo celular. En una realización, la perfusión comienza cuando las células han alcanzado una fase de producción. En realizaciones adicionales, la perfusión se lleva a cabo mediante flujo tangencial alterno. En una realización relacionada, la perfusión se lleva a cabo mediante flujo tangencial alterno usando un ultrafiltro o un microfiltro.

Una realización adicional de la divulgación proporciona perfusión continua; aún en una realización adicional la tasa de la perfusión es constante. Una realización de la divulgación proporciona la perfusión realizada a una tasa de menor que o igual a 1,0 volumen de trabajo por día. En una realización relacionada, la perfusión se realiza a una tasa que aumenta durante la fase de producción desde 0,25 volúmenes de trabajo por día hasta 1,0 volumen de trabajo por día durante el cultivo celular. En otra realización relacionada, la perfusión se realiza a una tasa que alcanza 1,0 volumen de trabajo por día en el día 9 hasta el día 11 del cultivo celular. En otra realización relacionada, la perfusión se realiza a una tasa que alcanza 1,0 volumen de trabajo por día en el día 10 del cultivo celular.

En una realización, el cultivo celular recibe alimentaciones de los medios de cultivo celular en embolada antes de los días 3 - 7 del cultivo.

Aún en otro aspecto, el cultivo celular se mantiene mediante alimentación por lotes. En una realización de un cultivo por lote alimentado, el cultivo se alimenta tres veces durante la producción. En una realización adicional, el cultivo se alimenta en un día entre el día dos y cuatro, en un día entre el día 5 y 7, y en un día entre el día 8 y 10. Otra realización proporciona un método de lotes alimentados en el cual el cultivo se alimenta cuatro veces durante la producción. Todavía en una realización adicional, el cultivo se alimenta en un día entre el día dos y cuatro, en un día entre el día 5 y 6, en un día entre el día 7 y 8, y en un día entre el día 8 y 10 o después.

En una realización, se añade monensina a un cultivo por lote alimentado junto con el medio de alimentación. Así, la monensina puede añadirse tres o cuatro veces durante el proceso de producción, en los tiempos establecidos previamente. La monensina se puede añadir al medio (es decir, el medio de producción) a una concentración diseñada para lograr una concentración particular en el cultivo, o la monensina se puede añadir al cultivo de manera separada de, pero junto con, el medio de alimentación. En otra realización, la monensina se añade directamente al cultivo en un día o días durante los cuales el cultivo no se está alimentando (es decir, no se añade medio de alimentación adicional). La concentración de la monensina y la cantidad de tiempo que está presente en el cultivo se selecciona según los parámetros mencionados anteriormente.

Según una realización, el cultivo de células de mamífero se establece al inocular el biorreactor con al menos 0,5 x 106 a 3,0 x 106 células/ml en un medio de cultivo sin suero. En una realización alterna o adicional, el cultivo de células de mamífero se estable al inocular el biorreactor con al menos 0,5 x 106 a 1,5 x 106 células/ml en un medio de cultivo sin suero.

La divulgación puede comprender además un cambio de temperatura durante el cultivo. En una realización, el cambio de temperatura es desde 36 °C hasta 31 °C. En una realización, la divulgación comprende además un cambio de temperatura desde 36 °C hasta 33 °C. En una realización relacionada, el cambio de temperatura ocurre en la transición entre la fase de crecimiento y la fase de producción. En una realización relacionada, el cambio de temperatura ocurre durante la fase de producción.

En otra realización, la divulgación comprende además inducir la detención del crecimiento celular por inanición de L-asparagina seguido de perfusión con un medio de perfusión sin suero que tiene una concentración de L-asparagina de 5 mM o menos. En otra realización, la divulgación comprende además inducir la detención del crecimiento celular por perfusión con un medio de perfusión sin suero que tiene una concentración de L-asparagina de 5 mM o menos. En una realización relacionada, la concentración de L-asparagina en el medio de perfusión sin suero es menor que o igual a 5 mM. En una realización relacionada, la concentración de L-asparagina en el medio de perfusión sin suero es menor que o igual a 4,0 mM. En una realización relacionada, la concentración de L-asparagina en el medio de perfusión sin suero es menor que o igual a 3,0 mM. En una realización relacionada, la concentración de L-asparagina en el medio de perfusión sin suero es menor que o igual a 2,0 mM. En una realización relacionada, la concentración de L-asparagina en el medio de perfusión sin suero es menor que o igual a 1,0 mM. En una realización relacionada, la concentración de L-asparagina en el medio de perfusión sin suero es 0 mM. En una realización relacionada, la concentración de L-asparagina del medio de cultivo celular se monitoriza antes y durante la inanición de L-asparagina.

Aún en otra realización la divulgación comprende que el hematocrito durante una fase de producción es menor que o igual al 35 %. En una realización relacionada, el hematocrito es menor que o igual al 35 %. En una realización relacionada, el hematocrito es menor que o igual al 30 %.

En una realización relacionada, la densidad de células viables del cultivo de células de mamífero en un hematocrito menor que o igual al 35 % es 10 x 106 células viables/ml a 80 x 106 células viables/ml. En otra realización, la densidad de células viables del cultivo de células de mamífero es 20 x 106 células viables/ml a 30 x 106 células viables/ml.

Aún en otra realización, el biorreactor tiene una capacidad de al menos 500 l. Aún en otra realización, el biorreactor tiene una capacidad de al menos 500 l hasta 2000 l. Aún en otra realización, el biorreactor tiene una capacidad de al menos 1000 l hasta 2000 l.

Aún en otra realización, las células de mamífero son células de ovario de hámster chino (CHO). Aún en otra realización, la proteína recombinante se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, una proteína de fusión recombinante, o una citocina.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1 a 4 presentan los resultados obtenidos cuando se evalúa el efecto de la monensina sobre el rendimiento del cultivo celular en biorreactores usando flujo tangencial alterno (ATF). La concentración de monensina en reactores ATF Ra (triángulo gris) y Rb (círculos grises) se mantuvo a 500 nM durante el curso de ~22 horas empezando en el día 8 y terminando en el día 9. Las células en el reactor de control (círculos negros) se hicieron crecer en ausencia de monensina. La densidad de células viables se ilustra en la Figura 1. La Figura 2 presenta los resultados de los análisis de viabilidad. En la Figura 3, se muestra el hematocrito de la monensina y los tanques de control, monitorizados diariamente durante el transcurso del experimento. Las muestras del medio consumido diario también se sometieron a análisis de valoración. Los valores de valoración y de hematocrito se usaron para calcular los valores ajustados al hematocrito, que se muestran en la Figura 4.

Las Figuras 5 - 8 representan los perfiles de alta manosa del MAb E producido en ATF en presencia de monensina. Como se describe para las Figuras 1-4, la concentración de monensina en reactores de ATF Ra y Rb se mantuvo a 500 nM durante el curso de ~22 horas iniciando en el día 8 y terminando en el día 9. Las muestras de medio consumido diario se sometieron a análisis de glucanos de alta manosa totales. El análisis de glucanos totales para las muestras de medio consumido se muestra en la Figura 5 (Ra - triángulos grises, Rb - círculos grises, control (sin monensina) - círculos negros). Además de la alta manosa total, se analizaron las especies de manosa de orden superior individuales; los resultados se muestran en la Figura 6 para el control del reactor ATF (sin monensina) (alta manosa total, círculos negros; Man5 (rombos negros), Man6 (triángulos negros), Man7 (asterisco negro), Man8 (cuadrado negro), Man9 (línea negra). La Figura 7 representa el mismo análisis para el reactor Ra, y la Figura 8 para el reactor Rb.

Las Figuras 9 - 12 representan los altos niveles de manosa medidos y predichos y la tasa de disminución de alta manosa para MAb E producido en los reactores ATF con monensina. La concentración de monensina en los reactores ATF Ra y Rb se mantuvo a 500 nM durante el transcurso de ~22 horas empezando en el día 8 y terminando en el día 9. Para los puntos de tiempo cuando se mide la alta manosa (barras negras), se continuó para aumentar (días 9-11), se calcularon los valores de alta manosa predichos (barras blancas) para los reactores Ra (Figura 9) y Rb (Figura 10) basándose en la suposición de que todos de los anticuerpos MAb E producidos contienen glucanos de alta manosa. Para los días 13 y cuando los altos niveles de manosa en MAb E comienzan a disminuir, se calcularon los valores de alta mañosa predichos suponiendo que ninguno de los anticuerpos MAb E nuevamente producidos contenía ninguno de los glucanos de alta manosa (Figuras 9 y 10). También se calcularon las veces de aumento del valor (barras negras) y las veces de disminución de alta manosa (barras blancas) durante este periodo de tiempo para Ra (Figura 11) y Rb (Figura 12).

Las Figuras 13 y 14 ilustran la concentración de monensina calculada en los reactores ATF Ra (Figura 13) y Rb (Figura 14). La monensina se inyectó en embolada a 500 nM en los reactores en el día 8 y se mantuvo a esa concentración durante un periodo de ~22 horas. La concentración de monensina en tanques después de la finalización de la administración de monensina se calculó basándose en las tasas de perfusión del medio en los reactores (círculos grises). El porcentaje medido total de alta manosa se muestra en los círculos negros.

Descripción detallada de la invención

Aunque la terminología usada en la presente solicitud es habitual dentro de la técnica, las definiciones de ciertos términos se proporcionan en el presente documento para asegurar la claridad y definición en el significado de las reivindicaciones. Las unidades, prefijos y símbolos pueden indicarse en su forma aceptada por el SI (Sistema Internacional de Unidades). Los intervalos numéricos citados en el presente documento incluyen los números que definen el intervalo e incluyen y son de apoyo de cada número entero dentro del intervalo definido. Los métodos y técnicas descritos en el presente documento se realizan generalmente según métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en varias referencias generales y más específicas que se citan y tratan a lo largo de la presente memoria descriptiva, a menos que se indique lo contrario. Véanse, por ejemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3.a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001) y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), y Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990).

Los métodos divulgados son aplicables a cultivos adherentes o cultivos en suspensión crecidos en reactores de tanque con agitación (incluyendo cultivos celulares discontinuos y por lote alimentado tradicionales, que pueden pero no necesariamente comprenden un filtro giratorio), sistemas de perfusión (incluyendo cultivos de flujo tangencial alterno ("ATF"), sistemas de perfusión acústicos, sistemas de perfusión en filtro profundo y otros sistemas), biorreactores de fibra hueca (HFB, que en algunos casos pueden emplearse en los procesos de perfusión), así como varios otros métodos de cultivo celular (véanse, por ejemplo, Tao et al., (2003) Biotechnol. Bioeng. 82:751-65; Kuystermans & Al-Rubeai, (2011) "Biorreactor Systems for Producing Antibody from Mammalian Cells" en Antibody Expression and Production, Cell Engineering 7:25-52, Al- Rubeai (ed) Springer; Catapano et al., (2009) "Biorreactor Design and Scale-Up" en Cell and Tissue Reaction Engineering: Principies and Practice, Eibl et al. (eds) Springer-Verlag).

Lo que se describe en una realización de la invención puede combinarse con otras realizaciones de la invención.

Definiciones

Como se usa en el presente documento, los términos "un" y "una" significan uno o más, a menos que se indique específicamente lo contrario. Además, a menos que el contexto requiera lo contrario, los términos en singular deberán incluir pluralidades y los términos en plural deberán incluir el singular. Generalmente, las nomenclaturas usadas junto con, y técnicas de, cultivo celular y tisular, biología molecular, inmunología, microbiología, genética y química e hibridación de proteínas y ácidos nucleicos descritas en el presente documento son aquellas bien conocidas y comúnmente usadas en la técnica.

La presente divulgación proporciona métodos de modulación de las propiedades de los cultivos celulares expresando una "proteína de interés;" una "proteína de interés" incluye proteínas naturales, proteínas recombinantes y proteínas manipuladas (por ejemplo, proteínas que no ocurren en la naturaleza y que se han diseñado y/o creado por humanos). Una proteína de interés puede, pero no necesita ser, una proteína que se conozca o se sospeche que sea terapéuticamente relevante. Los ejemplos particulares de una proteína de interés incluyen proteínas de unión al antígeno (como se describe y define en el presente documento), pepticuerpos (es decir, una molécula que comprende péptido(s) fusionado(s) ya sea directa o indirectamente a otras moléculas tales como un dominio Fc de un anticuerpo, donde el resto de péptido se une específicamente a una diana deseada; el (los) péptido(s) se puede(n) fusionar a ya sea una región Fc o insertarse en un bucle Fc, o una molécula Fc modificada, por ejemplo como se describe en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° US2006/0140934, proteínas de fusión (por ejemplo, proteínas de fusión Fc, en donde un fragmento Fc se fusiona a una proteína o péptido), citocinas, factores de crecimiento, hormonas y otras proteínas secretadas naturales, así como formas mutantes de proteínas naturales.

El término "proteína de unión al antígeno" se usa en su sentido más amplio y significa una proteína que comprende una porción que se une a un antígeno o diana y, opcionalmente, un armazón o porción de región estructural que permite a la porción de unión al antígeno adoptar una conformación que promueve el enlace de la proteína de unión al antígeno al antígeno. Los ejemplos de proteínas de unión al antígeno incluyen un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado; un anticuerpo quimérico; un anticuerpo recombinante; un anticuerpo de cadena sencilla; un diacuerpo; un triacuerpo; un tetracuerpo; un fragmento Fab; un fragmento F(ab')<2>; un anticuerpo IgD; un anticuerpo IgE; un anticuerpo IgM; un anticuerpo IgG1; un anticuerpo IgG2; un anticuerpo IgG3; o un anticuerpo IgG4, y fragmentos de los mismos. La proteína de unión al antígeno puede comprender, por ejemplo, armazón de proteína alterna o armazón artificial con derivados de CDR injertadas o derivados de CDR. Dichos armazones incluyen, pero no se limitan a, armazones derivados de anticuerpo que comprenden mutaciones introducidas para, por ejemplo, estabilizar la estructura tridimensional de la proteína de unión al antígeno, así como armazones completamente sintéticos que comprenden, por ejemplo, un polímero biocompatible. Véase, por ejemplo, Korndorfer et al., 2003, Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics 53(1 ):121-129 (2003); Roque et al., Biotechnol. Prog. 20:639-654 (2004). Además, pueden usarse miméticos de péptido-anticuerpo ("PAM"), así como armazones basados en los miméticos de anticuerpo que utilizan componentes de fibronectina como un armazón.

Una proteína de unión al antígeno puede tener, por ejemplo, la estructura de una inmunoglobulina natural. Una "inmunoglobulina" es una molécula tetramérica. En una inmunoglobulina natural, cada tetrámero está compuesto de dos pares idénticos de cadenas de polipéptido, teniendo cada par una cadena "ligera" (aproximadamente de 25 kDa) y una "pesada" (aproximadamente de 50-70 kDa). La porción aminoterminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos responsable principalmente del reconocimiento del antígeno. La porción carboxiterminal de cada cadena define una región constante responsable principalmente de la función efectora. Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras kappa y lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como mu, delta, gamma, alfa o épsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente.

Las cadenas de la inmunoglobulina natural presentan la misma estructura general de las regiones estructurales relativamente conservadas (FR) unidas por tres regiones hipervariables, también denominadas regiones determinantes de la complementariedad o CDR. De extremo N a extremo C, ambas cadenas ligeras y pesadas comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de los aminoácidos a cada dominio puede hacerse según las definiciones de Kabat et al. en Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a Ed., Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE. UU., PHS, NIH, Publicación NIH n.° 91- 3242, (1991). Según se desee, las CDR también pueden volverse definir según un esquema de nomenclatura alternativa, tal como el de Chothia (véase Chothia & Lesk, (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., (1989) Nature 342:878-883 o Honegger & Pluckthun, (2001) J. Mol. Biol. 309:657-670).

En el contexto de la presente divulgación, se dice que una proteína de unión al antígeno "se une específicamente" o "se une selectivamente" a su antígeno diana cuando la constante de disociación (K<d>) es <10-8 M. El anticuerpo se une específicamente al antígeno con "alta afinidad" cuando K<d>es <5 x 10-9 M, y con "afinidad muy alta" cuando K<d>es < 5 x 10-10 M.

El término "anticuerpo" incluye referencia a tanto inmunoglobulinas glucosiladas como no glucosiladas de cualquier isotipo o subclase o a una región de unión al antígeno del mismo que compite con el anticuerpo intacto para enlace específico, a menos que se especifique lo contrario. Además, el término "anticuerpo" se refiere a una inmunoglobulina intacta o a una porción de unión al antígeno del mismo que compite con el anticuerpo intacto para enlace específico, a menos que se especifique lo contrario. Las porciones de unión al antígeno pueden producirse por técnicas de ADN recombinantes o por escisión química o enzimática de anticuerpos intactos y pueden formar un elemento de una proteína de interés. Las porciones de unión al antígeno incluyen, entre otras, Fab, Fab', F(ab')<2>, Fv, anticuerpos de dominio (dAb), fragmentos que incluyen regiones determinantes de la complementariedad (CDR), anticuerpos de cadena sencilla (scFv), anticuerpos quiméricos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, y polipéptidos que contienen al menos una porción de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir el enlace del antígeno especifico al polipéptido.

Un fragmento Fab es un fragmento monovalente que tiene los dominios V<l>, V<h>, C<l>y C<h>1 ; un fragmento F(ab')<2>es un fragmento bivalente que tiene dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; un fragmento Fd tiene los dominios V<h>y C<h>1 ; un fragmento Fv tiene los dominios V<l>y V<h>de un brazo sencillo de un anticuerpo; y un fragmento dAb tiene un dominio V<h>, un dominio V<l>, o un fragmento de unión al antígeno de un dominio V<h>o V<l>(patentes de EE. UU. n.° 6.846.634, 6.696.245, publicaciones de solicitud de EE. UU. n.° 05/0202512, 04/0202995, 04/0038291,04/0009507, 03/0039958, Ward et al., (1989)Nature341:544-546).

Un anticuerpo de cadena sencilla (scFv) es un anticuerpo en el que una región V<l>y una V<h>se unen por medio de un conector (por ejemplo, una secuencia sintética de residuos de aminoácidos) para formar una cadena de proteína continua en donde el conector es suficientemente largo para permitir que la cadena de proteína se pliegue de nuevo en sí misma y formar un sitio de unión al antígeno monovalente (véase, por ejemplo, Bird et al., Science 242:423-26 (1988) y Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83). Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes que comprenden dos cadenas de polipéptido, en donde cada cadena de polipéptido comprende dominios V<h>y V<l>unidos por un conector que es demasiado corto para permitir que se empareje entre dos dominios en la misma cadena, permitiendo así que cada dominio se empareje con un dominio complementario en otra cadena de polipéptido (véase, por ejemplo, Holliger et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48; y Poljak et al., (1994) Structure 2:1121-23). Si las dos cadenas polipeptídicas de un diacuerpo son idénticas, entonces un diacuerpo resultante de su emparejamiento tendrá dos sitios de unión al antígeno idénticos. Se pueden usar cadenas polipeptídicas que tienen diferentes secuencias para producir un diacuerpo con dos sitios de unión a antígeno diferentes. De forma similar, los tricuerpos y tetracuerpos son anticuerpos que comprenden tres y cuatro cadenas polipeptídicas, respectivamente, y que forman tres y cuatro sitios de unión a antígeno, respectivamente, que pueden ser iguales o diferentes.

Una o más CDR pueden incorporarse en una molécula ya sea covalentemente o no covalentemente para convertirla en una proteína de unión al antígeno. Una proteína de unión al antígeno puede incorporar la(s) CDR como parte de una cadena de polipéptido más grande, puede unir covalentemente la(s) CDR a otra cadena de polipéptido, o puede incorporar la(s) CDR no covalentemente. La(s) CDR permiten que la proteína de unión al antígeno se una específicamente a un antígeno particular de interés.

Una proteína de unión al antígeno puede tener uno o más sitios de unión. Si existe más de un sitio de unión, los sitios de unión pueden ser idénticos uno con el otro o pueden ser diferentes. Por ejemplo, una inmunoglobulina humana natural tiene normalmente dos sitios de unión idénticos, mientras que un anticuerpo "biespecífico" o "bifuncional" tiene dos sitios de unión diferentes.

A efectos de mayor claridad, y como se describe en el presente documento, se señala que una proteína de unión al antígeno puede, pero no necesita, ser de origen humano (por ejemplo, un anticuerpo humano), y en algunos casos comprenderá una proteína no humana, por ejemplo una proteína de rata o murina, y en otros casos una proteína de unión al antígeno puede comprender un híbrido de proteínas humanas y no humanas (por ejemplo, un anticuerpo humanizado).

Una proteína de interés puede comprender un anticuerpo humano. El término "anticuerpo humano" incluye todos los anticuerpos que tienen una o más regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina humana. En una realización, todos de los dominios variables y constantes derivan de las secuencias de inmunoglobulina humanas (un anticuerpo completamente humano). Dichos anticuerpos pueden prepararse en una variedad de formas, incluyendo a través de la inmunización con un antígeno de interés de un ratón que se modifica genéticamente para expresar anticuerpos derivados de genes que codifican la cadena ligera y/o pesada humana, tales como un ratón derivado de un sistema Xenomouse®, UltiMab™, o Velocimmune®. También pueden emplearse enfoques basados en fago.

Alternativamente, una proteína de interés puede comprender un anticuerpo humanizado. Un "anticuerpo humanizado" tiene una secuencia que difiere de la secuencia de un anticuerpo derivado de una especie no humana por una o más sustituciones, deleciones y/o adiciones de aminoácidos, de manera que es menos probable que el anticuerpo humanizado es induzca una respuesta inmunitaria, y/o induzca una respuesta inmunitaria menos grave, en comparación con el anticuerpo de especie no humana, cuando se administra a un sujeto humano. En una realización, ciertos aminoácidos en la región estructural y los dominios constantes de las cadenas ligeras y/o pesadas del anticuerpo de especie no humana se mutan para producir el anticuerpo humanizado. En otra realización, el (los) dominio(s) constante(s) de un anticuerpo humano se fusionan al (a los) dominio(s) variable(s) de una especie no humana. Los ejemplos de cómo preparar anticuerpos humanizados se pueden encontrar en las patentes de EE. UU. n.26.054.297, 5.886.152 y 5.877.293.

Una región "Fc", como el término se usa en el presente documento, comprende dos fragmentos de cadena pesada que comprenden los dominios C<h>2 y C<h>3 de un anticuerpo. Los dos fragmentos de cadena pesada se mantienen juntos por dos o más enlaces disulfuro y por interacciones hidrofóbicas de los dominios C<h>3. Las proteínas de interés que comprenden una región Fc, incluyendo proteínas de unión al antígeno y proteínas de fusión de Fc, forman otro aspecto de la presente divulgación.

Un "hemicuerpo" es una construcción de inmunoglobulina inmunológicamente funcional que comprende una cadena pesada completa, una cadena ligera completa y una segunda región Fc de cadena pesada emparejada con la región Fc de la cadena pesada completa. Un conector puede, pero no necesita, emplearse para unir la región Fc de cadena pesada y la segunda región Fc de cadena pesada. En realizaciones particulares, un hemicuerpo es una forma monovalente de una proteína de unión al antígeno divulgada en el presente documento. En otras realizaciones, los pares de residuos cargados pueden emplearse para asociar una región Fc con la segunda región Fc. Un hemicuerpo puede ser una proteína de interés en el contexto de la presente divulgación.

El término "célula hospedadora" significa una célula que se ha transformado, o es capaz de transformarse, con una secuencia de ácido nucleico y por ello expresa un gen de interés. El término incluye la descendencia de la célula parental, tanto si la descendencia es idéntica como si no en morfología o en constitución genética a la célula parental original, en tanto que el gen de interés esté presente. Un cultivo celular puede comprender una o más células hospedadoras.

El término "hibridoma" significa una célula o descendencia de una célula que resulta de la fusión de una célula inmortalizada y una célula productora de anticuerpo. El hibridoma resultante es una célula inmortalizada que produce anticuerpos. Las células individuales usadas para crear el hibridoma pueden ser de cualquier fuente de mamífero, que incluyen, pero no limitan a, hámster, rata, cerdo, conejo, oveja, cabra y humano. El término también engloba líneas células de trioma, que resultan cuando la descendencia de las fusiones de mieloma heterohíbrido, que son el producto de una fusión entre células humanas y una línea celular de mieloma murino, se fusionan posteriormente con una célula plasmática. El término pretende incluir cualquier línea celular híbrida Inmortalizada que produce anticuerpos tales como, por ejemplo, cuadromas (véase, por ejemplo, Milstein et al., (1983) Nature, 537:3053).

Los términos "cultivo" y "cultivo celular" se usan indistintamente y se refieren a una población de células que se mantiene en un medio en condiciones adecuadas para la supervivencia y/o el crecimiento de la población celular. Como será evidente para los expertos en la técnica, estos términos también se refieren a la combinación que comprende la población de células y el medio en el que se suspende la población.

Los términos "polipéptido" y "proteína" (por ejemplo, como se usa en el contexto de una proteína de interés o un polipéptido de interés) se usan indistintamente en el presente documento para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos también aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos es un análogo o mimético de un aminoácido natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos naturales. Los términos también pueden englobar polímeros de aminoácidos que se han modificado, por ejemplo, por la adición de residuos de hidratos de carbono para formar glucoproteínas, o fosforilado. Los polipéptidos y proteínas se pueden producir por una célula natural y no recombinante, o los polipéptidos y proteínas se pueden producir por una célula manipulada genéticamente o recombinante. Los polipéptidos y proteínas pueden comprender moléculas que tienen la secuencia de aminoácidos de una proteína nativa, o moléculas que tienen deleciones de, adiciones a y/o sustituciones de uno o más aminoácidos de la secuencia nativa.

Los términos "polipéptido" y "proteína" engloban moléculas que comprenden únicamente aminoácidos naturales, así como moléculas que comprenden aminoácidos no naturales. Los ejemplos de aminoácidos naturales (que pueden sustituirse por cualquier aminoácido natural encontrado en cualquier secuencia divulgada en el presente documento, según se desee) incluyen: 4-hidroxiprolina, Y-carboxiglutamato, £-N,N,N-trimetil-lisina, e-N-acetil-lisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, o-N-metilarginina, y otros aminoácidos similares e iminoácidos (por ejemplo, 4-hidroxiprolina). En la notación de polipéptidos usada en el presente documento, la dirección izquierda es la dirección de extremo amino y la dirección derecha es la dirección de extremo carboxilo, según los usos y convencionales habituales.

Una lista no limitante de ejemplos de aminoácidos no naturales que se pueden insertar en una secuencia de proteína o polipeptídica o sustituirse con un residuo natural en una secuencia polipeptídica incluyen aminoácidos p, homoaminoácidos, aminoácidos cíclicos y aminoácidos con cadenas laterales derivadas. Los ejemplos incluyen (en la forma L o forma D; abreviado como está entre paréntesis): citrulina (Cit), homocitrulina (hCit), Na-metilcitrulina (NMeCit), Na-metilhomocitrulina (Na-MeHoCit), ornitina (Orn), Na-metilornitina (Na-MeOrn o NMeOrn), sarcosina (Sar), homolisina (hLys o hK), homoarginina (hArg o hR), homoglutamina (hQ), Na-metilarginina (NMeR), Nametilleucina (Na-MeL o NMeL), N-metilhomolisina (NMeHoK), Na-metilglutamina (NMeQ), norleucina (Nle), norvalina (Nva), 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina (Tic), ácido octahidroindol-2-carboxílico (Oic), 3-(1-naftil)alanina (1 -Nal), 3-(2-naftil)alanina (2-Nal), 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina (Tic), 2-indanilglicina (Igl), para-yodofenilalanina (pl-Phe), paraaminofenilalanina (4AmP o 4-Amino-Phe), 4-guanidino fenilalanina (Guf), glicillisina (abreviada "K(N£-glicil)" o "K(glicil)" o "K(gly)"), nitrofenilalanina (nitrophe), aminofenilalanina (aminophe o Amino-Phe), bencilfenilalanina (benzylphe), ácido Y-carboxiglutámico (Y-carboxyglu), hidroxiprolina (hydroxypro), p-carboxil-fenilalanina (Cpa), ácido a-aminoadípico (Aad), Na-metil valina (NMeVal), N-a-metil Ieucina (NMeLeu), Na-metilnorleucina (NMeNIe), ciclopentilglicina (Cpg), ciclohexilglicina (Chg), acetilarginina (acetilarg), ácido a,p-diaminopropionoico (Dpr), ácido a,Y-diaminobutírico (Dab), ácido diaminopropiónico (Dap), ciclohexilalanina (Cha), 4-metil-fenilalanina (MePhe), p,pdifenil-alanina (BiPhA), ácido aminobutírico (Abu), 4-fenil-fenilalanina (o bifenilalanina; 4Bip), ácido a-aminoisobutírico (Aib), beta-alanina, ácido beta-aminopropiónico, ácido piperidínico, ácido aminocaproico, ácido aminoheptanoico, ácido aminopimélico, desmosina, ácido diaminopimélico, N-etilglicina, N-etilaspargina, hidroxilisina, alo-hidroxilisina, isodesmosina, alo-isoleucina, N-metilglicina, N-metilisoleucina, N-metilvalina, 4-hidroxiprolina (Hyp), Y-carboxiglutamato, £-N,N,N-trimetil-lisina, e-N-acetil-lisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, w-metilarginina, ácido 4-amino-O-ftálico (4APA) y otros aminoácidos similares y formas derivadas de cualquiera de esos enumerados específicamente.

Por "cultivo celular" o "cultivo" se entiende el crecimiento y la propagación de células fuera de un organismo multicelular o tejido. En la técnica se conocen condiciones de cultivo adecuadas para las células de mamífero. Véase, por ejemplo, Animal cell culture: A Practical Approach, D. Rickwood, ed., Oxford University Press, Nueva York (1992). Las células de mamífero pueden cultivarse en suspensión o mientras se unen a un sustrato sólido. Pueden usarse biorreactores de lecho fluidizado, biorreactores de fibra hueca, botellas giratorias, matraces de agitación, o biorreactores de tanque con agitación, con o sin microportadores. En una realización, se usan biorreactores de 500 l a 2000 l. En una realización, se usan biorreactores de 1000 l a 2000 l.

El término "medio de cultivo celular" (también denominado "medio de cultivo," "medio de cultivo celular," "medio de cultivo tisular") se refiere a cualquier disolución nutritiva usada para el crecimiento de células, por ejemplo, células animales o de mamífero, y que generalmente proporciona al menos uno o más componentes de lo siguiente: una fuente de energía (normalmente en la forma de un hidrato de carbono, tal como glucosa); uno o más de todos los aminoácidos esenciales, y generalmente los veinte aminoácidos básicos, más cisteína; vitaminas y/u otros compuestos orgánicos normalmente requeridos a bajas concentraciones; lípidos o ácidos grasos libres; y oligoelementos, por ejemplo, compuestos inorgánicos o elementos naturales que se requieren normalmente en concentraciones muy bajas, normalmente en el intervalo micromolar.

La disolución nutritiva puede complementarse opcionalmente con componentes opcionales adicionales para optimizar el crecimiento de células, tales como hormonas y otros factores de crecimiento, por ejemplo, insulina, transferina, factor del crecimiento epidérmico, suero y similares; sales, por ejemplo, calcio, magnesio y fosfato, y tampones, por ejemplo, HEPES; nucleósidos y bases, por ejemplo, adenosina, timidina, hipoxantina; e hidrolizados de proteína y tejido, por ejemplo, proteína animal o vegetal hidrolizada (peptona o mezclas de peptona, que se pueden obtener de subproductos animales, gelatina purificada o material material); antibióticos, por ejemplo, gentamicina; protectores celulares o tensioactivos, tales como Pluronic®F68 (también referido como Lutrol® F68 y Kolliphor® P188; copolímeros de tribloque no iónicos compuestos de una cadena hidrófoba central de polioxipropileno (poli(óxido de propileno)) flanqueados por dos cadenas hidrófobas de polioxietileno (poli(óxido de etileno)); poliaminas, por ejemplo, putrescina, espermidina y espermina (véase, por ejemplo, la publicación WIPO n.° WO 2008/154014) y piruvato (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 8053238) dependiendo de los requerimientos de las células a cultivarse y/o los parámetros de cultivo celular deseados.

Los medios de cultivo celular incluyen los que se emplean normalmente en y/o se conocen para uso con cualquier proceso de cultivo celular, tales como, pero no se limitan a, cultivo discontinuo, por lote extendido, por lote alimentado y/o de perfusión o continuo de células.

Un medio de cultivo celular "base" (o lote) se refiere a un medio de cultivo celular que se usa normalmente para iniciar un cultivo celular y es suficientemente completo para soportar el cultivo celular.

Un medio de cultivo celular de "crecimiento" se refiere a un medio de cultivo celular que se usa normalmente en cultivos celulares durante un periodo de crecimiento exponencial, una "fase de crecimiento", y es suficientemente completo para soportar el cultivo celular durante esta fase. Un medio de cultivo celular de crecimiento también puede contener agentes de selección que confieren resistencia o supervivencia a marcadores de selección incorporados en la línea celular hospedadora. Dichos agentes de selección incluyen, pero no se limitan a, geneticina (G4118), neomicina, higromicina B, puromicina, zeocina, metionina sulfoximina, metotrexato, medio de cultivo celular sin glutamina, medio de cultivo celular que carece de glicina, hipoxantina y timidina, o timidina solo.

Un medio de cultivo celular de "producción" se refiere a un medio de cultivo celular que se usa normalmente en cultivos celulares durante la transición cuando el crecimiento exponencial se termina y la producción de proteína se hace cargo, fases de "transición" y/o "producto", y es suficientemente completo para mantener una densidad celular deseada, viabilidad y/o valoración del producto durante esta fase.

Un medio de cultivo celular de "perfusión" se refiere a un medio de cultivo celular que se usa normalmente en cultivos celulares que se mantienen por métodos de cultivo por perfusión o continuo y es suficientemente completo para soportar el cultivo celular durante este proceso. Las formulaciones del medio de cultivo celular de perfusión pueden ser más ricas o más concentradas que las formulaciones del medio de cultivo celular base para acomodar el método usado para retirar el medio consumido. El medio de cultivo celular de perfusión se puede usar durante tanto el crecimiento como las fases de producción.

El medio de cultivo celular concentrado puede contener algunos o todos de los nutrientes necesarios para mantener el cultivo celular; en particular, el medio concentrado puede contener nutrientes identificados como consumidos o que se sabe que se consumen durante el transcurso de la fase de producción del cultivo celular. El medio concentrado se puede basar en prácticamente cualquier formulación del medio de cultivo celular. Dicho medio de alimentación concentrado puede contener algunos o todos de los componentes del medio de cultivo celular en, por ejemplo, aproximadamente de 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 12X, 14X, 16X, 20X, 30X, 50X, 100X, 200X, 400X, 600X, 800X, o aún aproximadamente de 1000X de su cantidad normal.

Los componentes usados para preparar el medio de cultivo celular pueden molerse completamente en una formulación de medio en polvo; molerse parcialmente con complementos líquidos añadidos al medio de cultivo celular según sea necesario; o añadirse en una forma completamente líquida al cultivo celular.

Los cultivos celulares también pueden complementarse con alimentaciones concentradas independientes de nutrientes particulares que pueden ser difíciles de formular o se eliminan rápidamente en cultivos celulares. Dichos nutrientes pueden ser aminoácidos tales como tirosina, cisteína y/o cistina (véase, por ejemplo, la publicación WIPO n.° 2012/145682). En una realización, una disolución concentrada de tirosina se alimenta independientemente a un crecimiento de cultivo celular en un medio de cultivo celular que contiene tirosina, de manera que la concentración de tirosina en el cultivo celular no supere 8 mM. En otra realización, una disolución concentrada de tirosina y cistina se alimenta independientemente al cultivo celular que está creciendo en un medio de cultivo celular que carece de tirosina, cistina o cisteína. Las alimentaciones independientes pueden comenzar antes de o al inicio de la fase de producción. Las alimentaciones independientes se pueden realizar por lote alimentado al medio de cultivo celular en los mismos días o días diferentes que el medio de alimentación concentrado. Las alimentaciones independientes también se pueden perfundir en los mismos días o días diferentes como el medio perfundido.

"Sin suero" aplica a un medio de cultivo celular que no contiene suero animal, tal como suero bovino fetal. Varios medios de cultivo de tejido, incluyendo medio de cultivo definido, están comercialmente disponibles, por ejemplo, puede usarse uno cualquiera o una combinación de los siguientes medios de cultivo celular: medio RPMI-1640, medio RPMI-1641, medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), medio esencial mínimo Eagle, medio F-12K, medio F12 de Ham, medio Dulbecco modificado por Iscove, medio 5A de McCoy, medio L-15 de Leibovitz y medio sin suero, tal como EX-CELL™ 300 Series (JRH Biosciences, Lenexa, Kansas), entre otros. Las versiones sin suero de dichos medios de cultivo también están disponibles. Los medios de cultivo celular pueden complementarse con concentraciones adicionales o aumentadas de componentes, tales como aminoácidos, sales, azúcares, vitaminas, hormonas, factores de crecimiento, tampones, antibióticos, lípidos, oligoelementos y similares, dependiendo de los requisitos de las células a cultivar y/o los parámetros de cultivo celular deseados. El término "biorreactor" significa cualquier recipiente útil para el crecimiento de un cultivo celular. Los cultivos celulares de la presente divulgación pueden hacerse crecer en un biorreactor, que puede seleccionarse basándose en la aplicación de una proteína de interés que se produce por células que crecen en el biorreactor. Un biorreactor puede ser de cualquier tamaño, siempre que sea útil para el cultivo de células; normalmente, un biorreactor tiene el tamaño apropiado para el volumen de cultivo celular que está creciendo dentro de este. Normalmente, un biorreactor será al menos 1 litro y puede ser 2, 5, 10, 50, 100, 200, 250, 500, 1.000, 1500, 2000, 2.500, 5.000, 8.000, 10.000, 12.000 litros o más, o cualquier volumen intermedio. Las condiciones internas del biorreactor que incluyen, pero no se limitan a, pH y temperatura, pueden controlarse durante el periodo de cultivo. Los expertos en la técnica serán conscientes de, y serán capaces de seleccionar, biorreactores adecuados para su uso en la práctica de la presente invención basándose en las consideraciones relevantes.

"Densidad celular" se refiere al número de células en un volumen dado del medio de cultivo. "Densidad de células viables" se refiere al número de células vivas en un volumen dado del medio de cultivo, como se determina por ensayos de viabilidad habituales (tales como método de exclusión con colorante azul de tripano).

El término "viabilidad celular" significa la capacidad de las células en el cultivo para sobrevivir bajo un conjunto dado de condiciones de cultivo o variaciones experimentales. El término también se refiere a esa porción de células que están vivas en un momento particular en relación al número total de células, vivas y muertas, en el cultivo en ese tiempo.

"Hematocrito" (HCT), también denominado "porcentaje de hematocrito" (% de HTC), es la relación entre el volumen ocupado por las células y el volumen total de cultivo celular, expresado como un porcentaje (véase Stettler, et al., (2006) Biotechnol Bioeng. Dec 20:95(6):1228-33). El hematocrito es una función de la densidad celular y el diámetro celular; los aumentos en el hematocrito podrían surgir de aumentos en ya sea la densidad celular o el diámetro celular, o ambos. El hematocrito es una medida del contenido de sólidos en el cultivo celular. Los sólidos se eliminan durante la recogida y purificación aguas abajo. Más sólidos significa más esfuerzo para separar el material sólido del producto deseado durante la recogida y etapas de purificación aguas abajo. Por lo tanto, el producto deseado puede quedar atrapado en los sólidos y perderse durante el proceso de recogida, lo que da lugar a un rendimiento de producto disminuido. Como las células hospedadoras varían en tamaño y los cultivos celulares también contienen células muertas y moribundas y otros desechos celulares, el hematocrito es una forma más exacta para describir el contenido de sólidos dentro de un cultivo celular que la densidad celular o la densidad de células viables. Por ejemplo, un cultivo de 2000 l que tiene una densidad celular de 50 x 106 células/ml tendría hematocritos enormemente diferentes dependiendo del tamaño de las células. Además, algunas células, cuando están en un estado detenido para crecimiento, aumentarán de tamaño, así el hematocrito previo a la detención del crecimiento y posterior a la detención del crecimiento probablemente será diferente, debido al aumento en biomasa como resultado del aumento del tamaño celular.

"Detención del crecimiento", que también puede denominarse "detención del crecimiento celular", es el punto donde las células detienen el aumento en número o cuando el ciclo celular ya no progresa. La detención del crecimiento puede monitorizarse determinando la densidad de células viables de un cultivo celular. Algunas células en un estado de detención del crecimiento pueden aumentar en tamaño, pero no en número, así el hematocrito de un cultivo de detención del crecimiento puede aumentar. La detención del crecimiento puede invertirse en cierta medida, si las células no están en salud decreciente, al añadir la inversión de las condiciones que llevan a la detención del crecimiento.

El término "título" significa la cantidad total de un polipéptido o proteína de interés (que puede ser una proteína natural o recombinante de interés) producida por un cultivo celular en una cantidad dada del volumen de medio. El título se puede expresar en unidades de miligramos o microgramos de polipéptido o proteína por mililitro (u otra medida de volumen) del medio. "Título acumulado" es el título producido por las células durante el transcurso del cultivo, y se puede determinar, por ejemplo, midiendo diariamente los títulos y usando aquellos valores para calcular el título acumulado.

El término "cultivo por lote alimentado" se refiere a una forma de cultivo en suspensión y significa un método de cultivo de células en el que los componentes adicionales se proporcionan al cultivo en un tiempo o tiempos posteriores al inicio del proceso de cultivo. Los componentes proporcionados comprenden normalmente complementos nutricionales para las células que se han eliminado durante el proceso de cultivo. Adicionalmente o alternativamente, los componentes adicionales pueden incluir componentes complementarios (por ejemplo, un compuesto inhibidor del ciclo celular). Un cultivo por lote alimentado se detiene normalmente en algún punto y las células y/o componentes en el medio se recogen y opcionalmente purifican.

Los términos "densidad de células viables integrada" o "IVCD" se usan indistintamente y significan la densidad promedio de las células viables durante el transcurso del cultivo multiplicada por la cantidad de tiempo que el cultivo se ha ejecutado.

La "densidad de células viables acumulada" (CVCD) se calcula multiplicando una densidad de células viables (VCD) promedio entre dos puntos de tiempo con la duración de tiempo entre aquellos dos puntos de tiempo. La CVCD es el área bajo la curva formada al representar la VCD frente al tiempo.

Descripción del proceso de cultivo celular

Durante la producción de proteína recombinante es deseable tener un sistema controlado donde las células se hacen crecer a una densidad deseada y luego el estado fisiológico de las células se intercambia a una detención del crecimiento, estado de productividad alto donde las células usan energía y sustratos para producir la proteína recombinante de interés en lugar de producir más células. Existen varios métodos para alcanzar este objetivo, e incluyen cambios de temperatura e inanición de los aminoácidos, así como el uso de un inhibidor del ciclo celular u otra molécula que pueda detener el crecimiento celular sin provocar la muerte celular.

La producción de una proteína recombinante comienza con el establecimiento de un cultivo de producción de células de mamífero de células que expresan la proteína, en una placa de cultivo, matraz, tubo, biorreactor u otro recipiente adecuado. Normalmente se usan biorreactores de producción más pequeños, en una realización, los biorreactores son de 500 l a 2000 l. En otra realización, se usan biorreactores de 1000 l - 2000 l. La densidad de células semilla usada para inocular el biorreactor puede tener un impacto positivo en el nivel de la proteína recombinante producida. En una realización, el biorreactor se inocula con al menos 0,5 x 106 hasta y más allá de 3,0 x 106 células viables/ml en un medio de cultivo sin suero. En otra realización, la inoculación es 1,0 x 106 células viables/ml.

Las células de mamífero experimentan a continuación una fase de crecimiento exponencial. El cultivo celular puede mantenerse sin alimentación complementaria hasta que se logra una densidad celular deseada. En una realización, el cultivo celular se mantiene durante hasta tres días con o sin alimentación complementaria. En otra realización, el cultivo puede inocularse a una densidad celular deseada para comenzar la fase de producción sin una fase de crecimiento breve. En cualquiera de las realizaciones en el presente documento, el intercambio de la fase de crecimiento a la fase de producción también puede iniciarse por cualquiera de los métodos mencionados antes.

En la transición entre la fase de crecimiento y la fase de producción, y durante la fase de producción, el porcentaje del hematocrito (% de HCT) es igual a o menor que 35 %. El hematocrito deseado mantenido durante la fase de producción es igual a o menor que 35 %. En una realización, el hematocrito es igual a o menor que 30 %. En otra realización, el hematocrito es igual a o menor que 20 %. Aún en otra realización, el hematocrito es igual a o menor que 15 %. En una realización adicional, el hematocrito es igual a o menor que 10 %.

La densidad de células viables deseada en la transición entre las fases de crecimiento y producción y mantenida durante la fase de producción pueden ser variada dependiendo de los proyectos. Puede decidirse basándose en el hematocrito equivalente de los datos históricos. En una realización, la densidad de células viables es al menos aproximadamente 10 x 106 células viables/ml a 80 x 106 células viables/ml. En una realización la densidad de células viables es al menos aproximadamente 10 x 106 células viables/ml a 70 x 106 células viables/ml. En una realización la densidad de células viables es al menos aproximadamente 10 x 106 células viables/ml a 60 x 106 células viables/ml. En una realización la densidad de células viables es al menos aproximadamente 10 x 106 células viables/ml a 50 x 106 células viables/ml. En una realización la densidad de células viables es al menos aproximadamente 10 x 106 células viables/ml a 40 x 106 células viables/ml. En otra realización la densidad de células viables es al menos aproximadamente 10 x 106 células viables/ml a 30 x 106 células viables/ml. En otra realización la densidad de células viables es al menos aproximadamente 10 x 106 células viables/ml a 20 x 106 células viables/ml. En otra realización, la densidad de células viables es al menos aproximadamente 20 x 106 células viables/ml a 30 x 106 células viables/ml. En otra realización la densidad de células viables es al menos aproximadamente 20 x 106 células viables/ml a al menos aproximadamente 25 x 106 células viables/ml, o al menos aproximadamente 20 x 106 células viables/ml.

Un hematocrito más bajo durante la fase de producción ayuda a mitigar los problemas de burbujeo de oxígeno disueltos que pueden impedir los cultivos de perfusión de densidad celular más alta. Un hematocrito más bajo también se permite un volumen de medio más pequeño que permite el uso de recipientes de almacenamiento de medio más pequeños y puede combinarse con tasas de flujo más lentas. Un hematocrito más bajo también tiene menos impacto en la recogida y el procesamiento aguas abajo, en comparación con cultivos de biomasa celular superiores. Todos de los cuales reducen los costes asociados a la fabricación de terapéuticos de proteína recombinante.

Se usan normalmente tres métodos en procesos comerciales para la producción de proteínas recombinantes por cultivo de células de mamífero: cultivo discontinuo, cultivo por lote alimentado y cultivo por perfusión. El cultivo discontinuo es un método discontinuo donde las células se hacen crecer en un volumen fijo de medio de cultivo durante un periodo de tiempo corto seguido de una recogida completa. Los cultivos se hacen crecer usando el método discontinuo que experimenta un aumento en la densidad celular hasta que se logra una densidad celular máxima, seguido por una disminución en la densidad de células viables ya que los componentes del medio se consumen y los niveles de los subproductos metabólicos (tales como lactato y amoniaco) se acumulan. La recogida normalmente ocurre en el punto cuando se logra la densidad celular máxima (normalmente 5-10 x 106 células/ml, dependiendo de la formulación del medio, línea celular, etc.). El proceso discontinuo es el método de cultivo más sencillo; sin embargo, la densidad de células viables se limita por la disponibilidad del nutriente y una vez las células están en densidad máxima, el cultivo baja y la producción disminuye. No existe capacidad para extender una fase de producción debido a que la acumulación de los productos de desecho y la eliminación del nutriente lleva rápidamente a la disminución del cultivo (normalmente aproximadamente de 3 a 7 días).

El cultivo por lote alimentado mejora sobre el proceso discontinuo al proporcionar alimentaciones del medio en embolada o continuas para reponer aquellos componentes de los medios que se han consumido. Ya que los cultivos por lote alimentado reciben nutrientes adicionales a lo largo de la ejecución, tienen el potencial de lograr densidades celulares más altas (>10 a 30 x 106 células/ml, dependiendo de la formulación del medio, la línea celular, etc.)) y títulos del producto elevados, cuando se comparan con el método discontinuo. A diferencia del proceso discontinuo, puede crearse un cultivo bifásico y sostenerse al manipular las estrategias de alimentación y formulaciones de los medios para distinguir el periodo de proliferación celular para lograr una densidad celular deseada (la fase de crecimiento) desde el periodo de crecimiento celular suspendido o lento (la fase de producción). Como tal, los cultivos por lote alimentado tienen el potencial de lograr títulos de producto más altos en comparación con los cultivos discontinuos. Normalmente, se usa un método discontinuo durante la fase de crecimiento y un método de lote alimentado usado durante la fase de producción, pero se puede usar una estrategia de alimentación de lote alimentado a lo largo del proceso completo. Sin embargo, a diferencia del proceso discontinuo, el volumen del biorreactor es un factor limitante que limita la cantidad de alimento. Por lo tanto, como con el método discontinuo, la acumulación del subproducto metabólico llevará a la disminución del cultivo, que limita la duración de la fase de producción, aproximadamente de 1,5 a 3 semanas. Los cultivos por lote alimentado son discontinuos y la recogida normalmente ocurre cuando los niveles del subproducto metabólico o la viabilidad del cultivo alcanzan niveles predeterminados. Cuando se comparan con un cultivo discontinuo, en el cual no ocurre la alimentación, un cultivo por lote alimentado puede producir cantidades mayores de proteína recombinante. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 5.672.502.

Los métodos de perfusión ofrecen mejoras potenciales sobre los métodos discontinuos y por lote alimentado al añadir medios frescos y retirar simultáneamente los medios consumidos. Las estrategias del cultivo celular comercial a gran escala típicas se esfuerzan por alcanzar densidades celulares altas, 60 - 90(+) x 106 células/ml, donde casi un tercio a más de la mitad del volumen del reactor es biomasa. Con el cultivo por perfusión, se han alcanzado densidades celulares extremas de >1 x 108 células/ml y aún se predicen densidades incluso más altas. Los cultivos de perfusión típicos comienzan con un arranque de cultivo discontinuo que dura durante un día o dos seguido de adición continua, en etapas y/o intermitente de medio de alimentación recién preparado al cultivo y retirada simultánea del medio consumido con la retención de células y compuestos de alto peso molecular adicionales, tales como proteínas (basándose en el corte de peso molecular del filtro) a lo largo de las fases de crecimiento y producción del cultivo. Se pueden usar varios métodos, tales como sedimentación, centrifugación o filtración, para retirar el medio consumido, mientras se mantiene la densidad celular. Se ha informado de tasas de flujo de perfusión de una fracción de un volumen de trabajo por día hasta muchos volúmenes de trabajo múltiples por día.

Una ventaja del proceso de perfusión es que el cultivo de producción puede mantenerse durante periodos más largos que los métodos de cultivo discontinuo o por lote alimentado. Sin embargo, el aumento de preparación de medios, el uso, el almacenamiento y la disposición son necesarios para soportar un cultivo por perfusión de larga duración, particularmente aquellos con densidades celulares altas, que también aún necesitan más nutrientes, y todo esto conduce a costes de producción aún más altos, en comparación con los métodos discontinuos y de lote alimentado. Además, densidades celulares más altas pueden provocar problemas durante la producción, tales como mantener los niveles de oxígeno disueltos y problemas con la elevada liberación de gas, incluyendo suministrar más oxígeno y retirar más dióxido de carbono, que daría como resultado más formación de espuma y la necesidad para alteraciones a las estrategias antiespumantes; así como durante la recogida y el procesamiento aguas abajo donde los esfuerzos requeridos para retirar el material celular excesivo puede dar lugar a una pérdida de producto, negando el beneficio del elevado título debido al aumento de la masa celular.

También se proporciona una estrategia de cultivo celular a gran escala que combina la alimentación por lote alimentado durante la fase de crecimiento seguido de perfusión continua durante la fase de producción. El método se dirige a una fase de producción donde el cultivo celular se mantiene en un hematocrito de menor que o igual al 35 %.

En una realización, se usa un cultivo por lote alimentado con alimentaciones en embolada para mantener un cultivo celular durante la fase de crecimiento. Entonces se puede usar alimentación por perfusión durante una fase de producción. En una realización, la perfusión comienza cuando las células han alcanzado una fase de producción. En otra realización, la perfusión comienza en o aproximadamente el día 3 a en o aproximadamente el día 9 del cultivo celular. En otra realización, la perfusión comienza en o aproximadamente el día 5 a en o aproximadamente el día 7 del cultivo celular.

El uso de alimentación en embolada durante la fase de crecimiento permite a las células pasar a la fase de producción, dando como resultado menos dependencia de un cambio de temperatura como medio para iniciar y controlar la fase de producción; sin embargo, un cambio de temperatura de 36 °C a 31 °C puede tener lugar entre la fase de crecimiento y la fase de producción. En una realización, el cambio es de 36 °C a 33 °C. En otra realización, el inicio de la detención del crecimiento celular en el cultivo por lote alimentado se puede iniciar exponiendo el cultivo por lote alimentado a un inhibidor del ciclo celular. En otra realización, el inicio de la detención del crecimiento celular en el cultivo por lote alimentado se puede lograr por perfusión con un medio de perfusión sin suero que comprende un inhibidor del ciclo celular.

Como se describe en el presente documento, el biorreactor se puede inocular con al menos 0,5 x 106 hasta y más allá de 3,0 x 106 células viables/ml en un medio de cultivo sin suero, por ejemplo 1,0 x 106 células viables/ml.

El cultivo por perfusión es uno en el que el cultivo celular recibe medio de alimentación de perfusión recién preparado, mientras se retira simultáneamente el medio consumido. La perfusión puede ser continua, en etapas, intermitente, o una combinación de cualquiera o todos de cualquiera de estos. Las tasas de perfusión pueden ser inferiores a un volumen de trabajo para muchos volúmenes de trabajo por día. Las células son retenidas en el cultivo y el medio consumido que se retira está sustancialmente libre de células o tiene significativamente menos células que el cultivo. Las proteínas recombinantes expresadas por el cultivo celular también pueden ser retenidas en el cultivo. La perfusión se puede llevar a cabo por varios medios que incluyen centrifugación, sedimentación o filtración. Véanse, por ejemplo, Voisard et al., (2003), Biotechnology and Bioengineering 82:751-65. Un ejemplo de un método de filtración es filtración de flujo tangencial alterno. El flujo tangencial alterno se mantiene bombeando medio a través de módulos de filtración de fibra hueca. Véanse, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 6.544.424; Furey (2002) Gen. Eng. News. 22 (7), 62-63.

"Caudal de perfusión " es la cantidad de medio que se pasa a través de (se añade y retira) de un biorreactor, normalmente expresado como cierta porción o múltiplo del volumen de trabajo, en un tiempo dado. El "volumen de trabajo" se refiere a la cantidad de volumen de biorreactor usado para el cultivo celular. En una realización, el caudal de perfusión es un volumen de trabajo o menos por día. El medio de alimentación de perfusión se puede formular para maximizar la concentración del nutriente de perfusión para minimizar la tasa de perfusión.

Los cultivos celulares se pueden complementar con medio de alimentación concentrado que contiene componentes, tales como nutrientes y aminoácidos, que se consumen durante el transcurso de la fase de producción del cultivo celular. El medio de alimentación concentrado se puede basar en prácticamente cualquier formulación del medio de cultivo celular. Dicho medio de alimentación concentrado puede contener la mayoría de los componentes del medio de cultivo celular a, por ejemplo, aproximadamente 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 12x , 14X, 16X, 20x , 30X, 50X, 100x, 200X, 400X, 600X, 800X, o incluso aproximadamente 1000X de su cantidad normal. Los medios de alimentación concentrados se usan frecuentemente en procesos de cultivo de lote alimentado.

El método según la presente divulgación se puede usar para mejorar la producción de proteínas recombinantes en procesos de cultivo de múltiples fases. En un proceso de múltiples etapas, las células se cultivan en dos o más fases distintas. Por ejemplo, las células se pueden cultivar en primer lugar en una o más fases de crecimiento, en condiciones medioambientales que maximizan la proliferación y viabilidad celulares, luego se transfieren a una fase de producción, en condiciones que maximizan la producción de proteínas. En un proceso comercial para la producción de una proteína por células de mamífero, existen comúnmente múltiples fases de crecimiento, por ejemplo, al menos aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, que ocurren en diferentes recipientes de cultivo que precedente a un cultivo de producción final.

Las fases de crecimiento y producción pueden ir precedidas de, o separadas por, una o más fases de transición. En procesos de múltiples fases, el método según la presente invención se puede emplear al menos durante la fase de crecimiento y producción de la fase de producción final de un cultivo celular comercial, aunque también se puede emplear en una fase de crecimiento precedente. Una fase de producción se puede realizar a gran escala. Un proceso a gran escala se puede realizar en un volumen de al menos aproximadamente 100, 500, 1000, 2000, 3000, 5000, 7000, 8000, 10.000, 15.000, 20.000 litros. En una realización, la producción se realiza en biorreactores 500 l, 1000 l y/o 2000 l.

Una fase de crecimiento puede ocurrir a una temperatura más alta que una fase de producción. Por ejemplo, una fase de crecimiento puede ocurrir a una primera temperatura desde aproximadamente 35 °C hasta aproximadamente 38 °C, y una fase de producción puede ocurrir a una segunda temperatura desde aproximadamente 29 °C hasta aproximadamente 37 °C, opcionalmente desde aproximadamente 30 °C hasta aproximadamente 36 °C o desde aproximadamente 30 °C hasta aproximadamente 34 °C. Además, se pueden añadir inductores químicos de producción de proteínas, tales como, por ejemplo, cafeína, butirato y hexametilenbisacetamida (HMBA), al mismo tiempo, antes y/o después de un cambio de temperatura. Si se añaden inductores después de un cambio de temperatura, se pueden añadir de una hora a cinco días después del cambio de temperatura, opcionalmente de uno a dos días después del cambio de temperatura. Los cultivos celulares se pueden mantener durante días o incluso semanas mientras que las células producen la(s) proteína(s) deseada(s).

Se pueden monitorizar y evaluar muestras del cultivo celular usando cualquiera de las técnicas analíticas conocidas en la técnica. Se puede monitorizar una variedad de parámetros que incluyen proteína recombinante y calidad y características del medio durante la duración del cultivo. Se pueden tomar muestras y monitorizar intermitentemente a una frecuencia deseable, que incluye monitorización continua, en tiempo real o casi en tiempo real.

Normalmente, los cultivos celulares que preceden al cultivo de producción final (N-x a N-1) se usan para generar las células semilla que se usarán para inocular el biorreactor de producción, el cultivo N-1. La densidad de células semilla puede tener un impacto positivo sobre el nivel de proteína recombinante producido. Los niveles de producto tienden a aumentar al aumentar la densidad de semilla. La mejora en el título no solo está relacionada con una mayor densidad de semilla, sino que es probable que se influya por el estado del ciclo metabólico y celular de las células que se colocan en producción.

Se pueden producir células semilla por cualquier método de cultivo. Dicho método es un cultivo por perfusión usando filtración de flujo tangencial alterno. Un biorreactor N-1 puede ponerse en funcionamiento usando filtración de flujo tangencial alterno para proporcionar células a alta densidad para inocular un biorreactor de producción. La etapa N-1 se puede usar para hacer crecer las células hasta densidades de >90 x 106 células/ml. El biorreactor N-1 se puede usar para generar cultivos de semillas en embolada o se puede usar como cultivo de reserva de semillas rodante que se podría mantener para sembrar múltiples biorreactores de producción a alta densidad de células semilla. La duración de la etapa de crecimiento de la producción puede variar de 7 a 14 días y se puede diseñar para mantener células en crecimiento exponencial antes de la inoculación del biorreactor de producción. Las tasas de perfusión, el medio formulación y los tiempos se optimizan para hacer crecer las células y suministrara al biorreactor de producción en un estado que es el más propicio para optimizar su producción. Las densidades de células semilla de >15 x 106 células/ml se pueden lograr para la siembra de biorreactores de producción. Densidad de células semilla más altas en la inoculación pueden disminuir o incluso eliminar el tiempo necesario para alcanzar una densidad de producción deseada.

La invención encuentra utilidad particular en la regulación de la presencia y/o cantidad de glucosilación de una proteína recombinante. Las líneas celulares (también denominadas "células hospedadoras") usadas en la invención se manipulan genéticamente para expresar un polipéptido de interés comercial o científico. Las líneas celulares derivan normalmente de un linaje que surge de un cultivo primario que se puede mantener en cultivo durante un tiempo ilimitado. La manipulación genética de la línea celular implica transfectar, transformar o transducir las células con una molécula de polinucleótido recombinante, y/u alterar de otro modo (por ejemplo, por recombinación homóloga y activación génica o fusión de una célula recombinante con una célula no recombinante) de manera que provoque que la célula hospedadora exprese un polipéptido recombinante deseado. Los métodos y vectores para manipular genéticamente las células y/o líneas celulares para expresar un polipéptido de interés se conocen bien por los expertos en la técnica; por ejemplo, diversas técnicas se ilustran en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. (Wiley & Sons, Nueva York, 1988, y actualizaciones trimestrales); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Laboratory Press, 1989); Kaufman, R.J., Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990, pp. 15-69.

Las líneas celulares animales derivan de células cuyos progenitores derivaron de un animal multicelular. Un tipo de línea de célula de animal es una línea celular de mamífero. Están disponibles una amplia variedad de líneas celulares de mamífero adecuadas para el crecimiento en cultivo de la Colección Americana de Cultivos Tipo (Manassas, Va.) y vendedores comerciales. Los ejemplos de líneas celulares usadas comúnmente en la industria incluyen VERO, BHK, HeLa, CV1 (incluyendo Cos), MDCK, 293, 3T3, líneas celulares de mieloma (por ejemplo, NSO, NS1), PC12, células WI38 y células de ovario de hámster chino (CHO). Las células CHO se usan ampliamente para la producción de proteínas recombinantes complejas, por ejemplo citocinas, factores de coagulación y anticuerpos (Brasel et al. (1996), Blood 88:2004-2012; Kaufman et al. (1988), J. Biol Chem. 263:6352-6362; McKinnon et al. (1991), J Mol Endocrinol. 6:231-239; Wood et al. (1990), J. Immunol. 145:3011-3016). Las líneas celulares mutantes deficientes en dihidrofolato reductasa (DHFR) (Urlaub et al. (1980), Proc Natl Acad Sci USA 77: 4216-4220), DXB11 y DG-44, son líneas de células hospedadoras CHO deseables debido a que el sistema de expresión génica de selección y amplificable DHFR eficiente permite la expresión de proteínas recombinante de alto nivel en estas células (Kaufman R.J. (1990), Meth Enzymol 185:537-566). Además, estas células son fáciles de manipular como cultivos adherentes o en suspensión y presentan estabilidad genética relativamente buena. Las células CHO y proteínas expresadas recombinantemente en ellas se han caracterizado ampliamente y han sido autorizadas para su uso en la fabricación comercial clínica por organismos públicos.

Proteínas de interés

Los métodos de la invención se pueden usar para cultivar células que expresan proteínas recombinantes de interés. Las proteínas recombinantes expresadas se pueden secretar en el medio de cultivo del que se pueden recuperar y/o recoger. Además, las proteínas se pueden purificar, o purificar parcialmente, de dicho cultivo o componente (por ejemplo, de medio de cultivo) usando procesos conocidos y productos disponibles de vendedores comerciales. Las proteínas purificadas se pueden entonces "formular", que significar intercambiar el tampón, esterilizar, envasar a granel y/o envasar para un usuario final. Formulaciones adecuadas para las composiciones farmacéuticas incluyen las descritas en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.a ed. 1995, Mack Publishing Company, Easton, PA.

Los ejemplos de polipéptidos que se pueden producir con los métodos de la invención incluyen proteínas que comprenden secuencias de aminoácidos idénticas o sustancialmente similares a todas o parte de una de las siguientes proteínas: factor de necrosis tumoral (TNF), ligando flt3 (documento de patente WO 94/28391), eritropoyetina, trombopoyetina, calcitonina, IL-2, angiopoyetina-2 (Maisonpierre et al. (1997), Science 277(5322): 55 60), ligando para el activador del receptor de NF-kappa B (RANKL, documento de patente WO 01/36637), ligando inductor de la apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral (TNF) (TRAIL, documento de patente WO 97/01633), linfopoyetina derivada del estroma tímico, factor estimulante de colonias de granulocitos, factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF, patente australiana n.° 588819), factor del crecimiento de mastocitos, factor de crecimiento de células madre (patente de EE. UU. n.° 6.204.363), factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento de queratinocitos, factor de crecimiento y desarrollo megacariocitos, RANTES, proteína 2 similar al fibrinógeno humano (FGL2; n.° de acceso de NCBI Nm_00682; Rüegg y Pytela (1995), Gene 160:257-62), hormona de crecimiento, insulina, insulinotropina, factores de crecimiento similares a la insulina, hormona paratiroidea, interferones que incluyen a-interferones, Y-interferón e interferones consenso (las patentes de EE. UU. n.° 4.695.623 y 4.897.471), factor de crecimiento nervioso, factor neurotrófico derivado del cerebro, proteínas de tipo sinaptotagmina (SLP 1-5), neurotrofina-3, glucagón, interleucinas, factores estimulantes de colonias, linfotoxina-p, factor inhibidor de la leucemia y oncostatina-M. Las descripciones de proteínas que se pueden producir según los métodos inventivos se pueden encontrar en, por ejemplo, Human Cytokines: Handbook for Basic and Clinical Research, todos los volúmenes (Aggarwal y Gutterman, eds. Blackwell Sciences, Cambridge, MA, 1998); Growth Factors: A Practical Approach (McKay and Leigh, eds., Oxford University Press Inc., New York, 1993); y The Cytokine Handbook, Vols. 1 y 2 (Thompson and Lotze eds., Academic Press, San Diego, CA, 2003)

Además, los métodos de la invención serían útiles para producir proteínas que comprendieran toda o parte de la secuencia de aminoácidos de un receptor para cualquiera de las proteínas mencionadas anteriormente, un antagonista para dicho receptor o cualquiera de las proteínas mencionadas anteriormente, y/o proteínas sustancialmente similares a dichos receptores o antagonistas. Estos receptores y antagonistas incluyen: ambas formas del receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR, denominado p55 y p75, patente de EE. UU. n.° 5.395.760 y patente de EE. UU. n.° 5.610.279), receptores de interleucina-1 (IL-1) (tipos I y II; patente EP n.° 0460846, patente de EE. UU. n.° 4.968.607 y patente de EE. UU. n.° 5.767.064), antagonistas del receptor de IL-1 (patente de E<e>. UU. n.° 6.337.072), antagonistas o inhibidores de IL-1 (patentes de EE. UU. n.° 5.981.713, 6.096.728 y 5.075.222), receptores de IL-2, receptores de IL-4 (patente EP n.° 0367566 y patente de EE. UU. n.° 5.856.296), receptores de IL-15, receptores de IL-17, receptores de IL-18, receptores de Fc, receptor del factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos, receptor del factor estimulante de colonias de granulocitos, receptores para oncostatina-M y el factor inhibidor de leucemia, activador del receptor de NF-kappa B (RANK, documento de patente WO 01/36637 y patente de EE. UU. n.° 6.271.349), osteoprotegerina (patente de EE. UU. n.° 6.015.938), receptores para TRAIL (incluyendo los receptor de TRAIL 1, 2, 3 y 4), y receptores que comprenden dominios de muerte, tales como Fas o receptor inductor de la apoptosis (AIR).

Otras proteínas que se pueden producir usando la invención incluyen proteínas que comprenden toda o parte de las secuencias de aminoácidos de antígenos de diferenciación (denominados proteínas CD) o sus ligandos o proteínas sustancialmente similares a cualquier de estos. Dichos antígenos se divulgan en Leukocyte Typing VI (Proceedings of the VIth International Workshop and Conference, Kishimoto, Kikutani et al., eds., Kobe, Japón, 1996). En seminarios posteriores se divulgan proteínas CD similares. Los ejemplos de dichos antígenos incluyen CD22, CD27, CD30, CD39, CD40 y ligandos de los mismos (ligando CD27, ligando CD30, etc.). Varios de los antígenos CD son miembros de la familia de receptores de TNF, que también incluyen 41BB y OX40. Los ligandos son frecuentemente miembros de la familia TNF, ya que son el ligando 41 BB y el ligando OX40.

Las proteínas enzimáticamente activas o sus ligandos también se pueden producir usando la invención. Los ejemplos incluyen proteínas que comprenden la totalidad o parte de una de las siguientes proteínas o sus ligandos o una proteína sustancialmente similar a una de las mismas: una desintegrina y miembras de la familia del dominio de metaloproteinasa, incluyendo la enzima convertidora de TNF-alfa, diversas cinasas, glucocerebrosidasa, superóxido dismutasa, activador del plasminógeno tisular, factor VIII, factor IX, apolipoproteína E, apolipoproteína A-I, globinas, antagonista de IL-2, antitripsina alfa-1, ligandos para cualquiera de las enzimas mencionadas anteriormente y otras numerosas enzimas y sus ligandos.

Ejemplos de anticuerpos que se pueden producir incluyen, pero no se limitan a, los que reconocen una cualquiera o una combinación de proteínas que incluyen, pero no se limitan a, las proteínas mencionadas anteriormente y/o los siguientes antígenos: CD2, CD3, CD4, CD8, CD11a, CD14, CD18, CD20, CD22, CD23, CD25, CD33, CD40, CD44, CD52, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD147, IL-1 a, IL-1 p, IL-2, IL-3, IL-7, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, receptor de IL-1, receptor de IL-2, receptor de IL-4, receptor de IL-6, receptor de IL-13, subunidades del receptor de IL-18, FGL2, PDGF-p y sus análogos (véanse las patentes de EE. UU. n.° 5.272.064 y 5.149.792), VEGF, t Gf , TGF-p2, TGF-p1, receptor de EGF (véase la patente de EE. UU. n.° 6.235.883), receptor de VEGF, factor de crecimiento de hepatocitos, ligando de osteoprotegerina, interferón gamma, estimulador de linfocitos B (BlyS, también conocido como BAFF, THANK, TALL-1 y zTNF4; véase Do y Chen-Kiang (2002), Cytokine Growth Factor Rev. 13(1): 19-25), complemento C5, IgE, antígeno de tumor CA125, antígeno de tumor MUC1, antígeno PEM, LCG (que es un producto génico que se expresa en asociación con cáncer de pulmón), HER-2, HER-3, una glucoproteína asociada a tumor TAG-72, el antígeno SK-1, epítopos asociados a tumor que están presentes en niveles elevados en los sueros de pacientes con cáncer de colon y/o pancreático, epítopos o proteínas asociados al cáncer expresados en células de cáncer de mama, colon, de células escamosas, próstata, pancreático, de pulmón y/o riñón y/o en células de melanoma, glioma o neuroblastoma, el núcleo necrótico de un tumor, integrina alfa 4 beta 7, la integrina VLA-4, integrinas (incluyendo integrinas que comprenden alfa4beta7), receptores de TRAIL 1, 2, 3 y 4, RANK, ligando de RANK, TNF-a, la molécula de adhesión VAP-1, molécula de adhesión a células epiteliales (EpCAM), molécula de adhesión intercelular-3 (ICAM-3), leucointegrina adhesina, la glucoproteína plaquetaria gp IIb/IIIa, cadena pesada de miosina cardíaca, hormona paratiroidea, rNAPc2 (que es un inhibidor del factor VIIa-factor tisular), MHC I, antígeno carcinoembrionario (CEA), alfa-fetoproteína (AFP), factor de necrosis tumoral (TNF), CTLA-4 (que es un antígeno asociado a linfocitos T citotóxicos), receptor de F<c>-<y>-1, HLA-DR 10 beta, antígeno HLA-DR, esclerostina, L-selectina, virus respiratorio sincitial, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la hepatitis B (VHB),Streptococcus mutansyStaphylococcus aureus.

Ejemplos específicos de anticuerpos conocidos que se pueden producir usando los métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a, adalimumab, bevacizumab, infliximab, abciximab, alemtuzumab, bapineuzumab, basiliximab, belimumab, briakinumab, brodalumab, canakinumab, certolizumab pegol, cetuximab, conatumumab, denosumab, eculizumab, gemtuzumab ozogamicin, golimumab, ibritumomab tiuxetán, labetuzumab, mapatumumab, matuzumab, mepolizumab, motavizumab, muromonab-CD3, natalizumab, nimotuzumab, ofatumumab, omalizumab, oregovomab, palivizumab, panitumumab, pemtumomab, pertuzumab, ranibizumab, rituximab, rovelizumab, tocilizumab, tositumomab, trastuzumab, ustekinumab, vedolizomab, zalutumumab y zanolimumab.

La invención también se puede usar para producir proteínas de fusión recombinantes que comprenden, por ejemplo, cualquiera de las proteínas mencionadas anteriormente. Por ejemplo, las proteínas de fusión recombinantes que comprenden una de las proteínas mencionadas anteriormente más un dominio de multimerización, tal como una cremallera de leucina, una superhélice, una porción Fc de una inmunoglobulina, o una proteína sustancialmente similar, se pueden producir usando los métodos de la invención. Véanse, por ejemplo, el documento de patente WO94/10308; Lovejoy et al. (1993), Science 259:1288-1293; Harbury et al. (1993), Science 262:1401-05; Harbury et al. (1994), Nature 371:80-83; Hákansson et al. (1999), Structure 7:255-64. Específicamente incluidas entre dichas proteínas de fusión recombinantes están las proteínas en las que una porción de un receptor se fusiona con una porción Fc de un anticuerpo, tal como etanercept (un p75 TNFR:Fc), abatacept y belatacept (CTLA4:Fc).

Ejemplos

Ejemplo 1

El efecto de la monensina sobre los glucanos de alta manosa en una línea celular CHO recombinante que produce un anticuerpo (MAb A) que presenta niveles muy bajos de glucanos de alta manosa se evaluó en un ensayo discontinuo de seis días. Las células se centrifugaron a 1500 rpm durante cinco minutos y se sembraron a 2 x 106 células por ml en medio de producción discontinuo en una placa profunda de 24 pocillos a un volumen final de 3 ml. Las disoluciones madre de monensina (1000X; eBiosciences Inc., San Diego, Ca) se prepararon en metanol y se añadieron a los cultivos a diferentes concentraciones y en diferentes momentos de tiempo durante el ensayo (0,1 nM a 50 nM en el día 1 y 100-500 nM en el día 3); se añadió metanol como control de vehículo.

Se analizaron los parámetros del cultivo celular en el día 6 y se evaluaron los sobrenadantes del medio consumido correspondientes para el título de anticuerpos y el análisis de glucanos para evaluar el efecto de la monensina sobre el crecimiento celular, la viabilidad, el título y el perfil de glucanos del anticuerpo recombinante. Se midieron la densidad celular y la viabilidad por el citómetro de flujo Guava easyCyte (Milipore, Billerica, MA) con la aplicación ViaCount. Los cultivos se centrifugaron, los sobrenadantes se filtraron sobre filtros de 0,4 micrómetros, y se analizaron para el título y distribución de glucanos.

Se midieron los títulos de anticuerpos cargando los sobrenadantes de cultivo celular filtrados sobre una columna POROS A/20 proteína A (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) equilibrada con Tris 20 mM, NaCl 150 nM, tampón pH 7,0. La elución del anticuerpo se realizó con ácido acético 220 mM, NaCl 150 nM, tampón de pH 2,6 a un caudal de fase móvil de 4,0 ml/min. El anticuerpo eluido se detectó a una longitud de onda de 280 nm. La concentración de anticuerpo se determinó basándose en una curva patrón con un patrón de anticuerpo de referencia. Para la medición de alto peso molecular, los anticuerpos se purificaron de los sobrenadantes de medio consumido en columnas ATOLL (ATOLL-Bio Inc USA, Lawrance, Kansas) y a continuación se analizaron usando cromatografía de exclusión por tamaño.

Para el análisis de glucanos, los glucanos asociados en N liberados por la péptido -N-glucosidasa F (PNGAsa F) a partir de anticuerpos purificados por proteína A se marcaron con ácido 2-aminobenzoico (2-AA) y se separaron por HILIC (cromatografía de líquidos de interacción hidrófila) en línea con un detector de fluorescencia. La separación se realizó usando un Waters Acquity UPLC (Waters, Milford, MA). La espectrometría de masas (EM) en línea, usando un espectrómetro de masas de trampa iónica (LTQ; Thermo Scientific, Waltham, MA) en modo positivo, se incorporó para acomodar la determinación de masa de las especies. Los glucanos se inyectaron y se unieron a la columna en condiciones orgánicas elevadas y a continuación se eluyeron con un gradiente creciente de un tampón acuoso de formiato de amonio. Los tiempos de separación se lograron usando un formato de columna de partículas pequeñas de 1,7 microM (columna de glucanos Acquity UPLC BEH, 2,1 x 100 mm; Waters, Milford, MA).

La monensina causó un aumento dependiente de la dosis en los glucanos de alta manosa en el anticuerpo recombinante como se muestra en la Tabla 1. Man5 fue la principal especie de alta manosa regulada por incremento tras el tratamiento con monensina, aunque también hubo un ligero aumento en las estructuras de manosa de orden superior. A concentraciones de monensina entre 0,1 a 10 nM, no hubo impactos en la alta manosa o los parámetros del cultivo celular. A altas concentraciones (50 nM incubadas durante seis días y 500 nM incubadas durante tres días), la monensina causó un gran aumento en alta manosa a costa del crecimiento celular, la viabilidad y el título. Sin embargo, cuando se administran como una embolada a 25 nM en el día 0 o en embolada ya sea a 200 nM o 100 nM en el día 3, la monensina aumentó los glucanos de alta manosa totales en el anticuerpo recombinante desde 6 hasta 30 veces sin impacto negativo sobre los parámetros del cultivo celular. El metanol, que se usó como un control de vehículo, no aumentó los glucanos de alta manosa.

Tabla 1: Niveles de diversos glucanos

Se evaluó el rendimiento del cultivo celular mediante mediciones de la densidad de células viables (VCD), la viabilidad y el título mediciones de muestras recogidas. Cada barra representa un resultado promedio para muestras de cultivo celular duplicadas. Cada valor es un promedio de duplicados.

Tabla 2: Parámetros del cultivo celular

Tomados conjuntamente estos resultados indicaron que la monensina tiene un potencial que se va a usar para aumentar los glucanos de alta manosa en anticuerpos terapéuticos recombinantes sin impactos negativos sobre el rendimiento de producto.

Ejemplo 2

Se evaluó el efecto de monensina en diversas líneas celulares de producción de anticuerpos en un entorno de perfusión simulada. El ensayo de perfusión simulada es un ensayo a pequeña escala basado en placa que se diseñó para imitar las condiciones de perfusión en biorreactores mediante intercambios de medio diarios. Para un ensayo de perfusión simulado de 10 días, cultivos de pases de diversas líneas celulares de producción se diluyeron 1:5 en medio de perfusión de base químicamente definido en una placa profunda de 24 pocillos a un volumen final de 3 ml por pocillo. La perfusión simulada se inició en el día 3 cuando las células se centrifugaron a 1000 rpm durante 5 minutos y se intercambió 25 % de cada medio de cultivo consumido con el volumen equivalente de medio de perfusión recién preparado. Los porcentajes de intercambio de medio posterior fueron del 40 % en los días 4-8 y del 50 % en el día 9. Los sobrenadantes intercambiados se almacenaron a 4 °C antes del análisis.

También se inició el análisis de parámetros del cultivo celular en el día 3; se analizaron la densidad de células viables y la viabilidad usando el ensayo ViaCount Guava como se describe previamente. Se midió diariamente la glucosa empezando en el día 3 y se mantuvo a 12 g/l. Los sobrenadantes almacenados se analizaron para el título de anticuerpos como se describe previamente. Las muestras de líquido del sobrenadante de los días 6, 8 y 10 también se analizaron para la presencia y tipo de glucanos por análisis HILIC.

Las líneas celulares usadas incluyeron tres líneas celulares de producción que se conocen por generar mAb con pocos glucanos de alta manosa (MAb A, MAb B y MAb C) y una línea celular de producción que produce continuamente producto con altos niveles de glucanos de alta manosa (MAb D). Se añadió monensina a una concentración final de 25 nM en el día 3 y a partir de entonces un conjunto de muestras duplicadas se sometió diariamente a intercambios parciales de medio con medio de perfusión que contenía monensina 25 nM (denominada "Monensina constante" en la Tabla 3 a continuación; columnas 3 y 4 de la placa de 24 pocillos). Otro conjunto de muestras duplicadas recibió medio de perfusión con dosis crecientes de monensina (denominada "Monensina creciente" en la Tabla 3 a continuación; columnas 5 y 6 de la placa de 24 pocillos). Se añadieron volúmenes equivalentes de metanol diariamente para controlar los cultivos (columnas 1 y 2 de la placa de 24 pocillos). Este esquema se representa a continuación:

En el día 10, se lavaron los sedimentos de células una vez con PBS frío y se fijaron en 4 % de paraformaldehído durante 10 minutos sobre hielo. A continuación, las células se lavaron una vez en otra vez PBS frío y se almacenaron a 4 °C hasta que se tiñeron por inmunofluorescencia como se describe a continuación Similar a los resultados obtenidos con el ensayo discontinuo de seis días, la monensina aumentó los glucanos de alta manosa en los cuatro productos de anticuerpo probados en un modo dependiente de la dosis, aunque la magnitud de regulación por incremento era dependiente de la línea celular, como se muestra en la Tabla 3.

Tabla 3: Niveles de diversos glucanos

Cuando se comparó con las muestras de control, los niveles de alta manosa en anticuerpos recogidos en el día 10 del ensayo de producción presentaron aumentos de 1,5 a 15 veces dependiendo de la dosis de monensina. Los niveles de glucanos de alta manosa disminuyeron con el tiempo en cultivos que se sometieron a intercambio de medio diario parcial, empezando en el día 3, con medio de perfusión que contenía monensina 25 nM, pero fueron superiores a los cultivos de control en todos los puntos de tiempo (Tabla 3, valores mostrados en las filas designadas "Monensina constante"). Esto es probablemente debido a aumentos en la cifra de células con el tiempo, reduciéndose así la dosis de monensina por célula en momentos de tiempo posteriores.

Para una de las líneas celulares, la dosis de monensina en el medio de perfusión se incrementó hasta 50 nM durante el transcurso de la serie del ensayo de producción; para las líneas celulares restantes, la dosis de monensina en el medio de perfusión se incrementó (aumentó) hasta 100 nM. Como resultado de la concentración creciente de monensina, los niveles de alta manosa en los anticuerpos producidos por estas líneas celulares se mantuvieron estacionarios desde los primeros momentos de tiempo hasta los últimos (Tabla 3, valores mostrados en filas designados "Monensina creciente"). Para la línea celular que expresa MAb A (evaluada en el Ejemplo 1), la concentración de monensina en el medio de perfusión no aumentó más allá de 50 nM debido a los efectos perjudiciales previamente observados en los parámetros del cultivo celular. Por lo tanto, y similarmente a lo que se observó con la condición de adición 25 nM, los niveles de alta manosa en anticuerpos producidos por esa línea celular disminuyeron con el tiempo.

Los valores de alta manosa total (columna de HM total) y las distribuciones correspondientes en la especie de alta manosa de Man5 a Man9 se determinaron para las muestras de anticuerpo purificado recogidas en el día 10. Cada valor mostrado en la Tabla 4 representa un promedio de duplicados.

Tabla 4: Niveles de diversos glucanos

En la mayoría de los casos la monensina elevó el nivel de especies de alta manosa sin cambiar su distribución relativa (es decir, si Man5 era la forma de alta manosa principal antes de la adición de monensina, normalmente siguió siendo la forma predominante después de la administración de monensina).

La única excepción a este efecto se observó en una línea celular, que produjo MAb D. La dosis creciente de monensina reguló principalmente por incremento los glucanos de alta manosa Man7 y Man8(b) en los mAb producidos por esta línea celular. Esta línea celular ha producido coherentemente (en estos experimentos y en los últimos) mAb con altos niveles de glucanos de alta manosa incluso en condiciones de cultivo de control. La diferencia en la regulación por incremento de especies de alta manosa en presencia de monensina en esta línea celular cuando se comparó con las otras líneas celulares probadas podría reflejar una diferencia fundamental en la maquinaria de procesamiento de alta manosa en estas células.

Ejemplo 3

Se sabe que la monensina provoca cambios macroscópicos en la arquitectura de Golgi caracterizada por cisternas hinchadas y fragmentadas. La estructura del Golgi de las líneas celulares de producción CHO después del tratamiento con monensina se analizó usando un panel de cinco anticuerpos disponibles comercialmente diferentes contra diversas proteínas de Golgi con un cultivo de células recombinantes de pases que producen MAb A usando microscopía de inmunofluorescencia. Solo el anticuerpo contra GM130, una proteína de la matriz de Golgi, mostró un patrón de tinción específico de Golgi.

A continuación, los cultivos de control y de perfusión simulada tratados con monensina de día 10 de células productoras de MAb A y células productoras de MAb C se sometieron a microscopía de inmunofluorescencia usando el anticuerpo GM130. Los sedimentos celulares fijados con paraformaldehído se permeabilizaron con 0,1 % de TritonX-100 preparado en PBS. Los sedimentos se lavaron con PBSA (0,5 % de BSA en PBS) y se incubaron con anticuerpo contra GM130 (BD Biosciences, San Jose, CA) diluido 1:50 en PBSA. Las células se lavaron tres veces con PBSA y se incubaron con anticuerpo secundario de ratón conjugado con Alexa 488 (Invitrogen, Grand Island, NY) diluido 1: 1000 en PBSA. Se visualizó el ADN nuclear con DRAQ5 (Invitrogen, Grand Island, NY). Las imágenes se capturaron usando el microscopio Zeiss 510 (Carl Zeiss, Inc., Jena, Alemania) con lente de inmersión de agua 63X y se analizó usando el software navegador de imágenes LSM.

No se observó diferencia morfológica entre las células productoras de MAb A tratadas con control y monensina. Sin embargo, las células productoras de MAb C tratadas con medio de perfusión que contenía cantidades continuamente crecientes de monensina, culminando en una concentración final de monensina 100 nM en el medio de perfusión de los días 7-10, mostró una distribución punteada de la proteína GM130, quizás indicativa del estrés del Golgi. Este tipo de cambio en el patrón de tinción de GM130 se ha asociado previamente al estrés celular inducido por arsenito o por choque térmico en células HeLa (Kolobova, E., et al., Exp Cell Res, 2009; 315(3) 542-55).

También se evaluaron los efectos de tanto los niveles constantes de monensina como los niveles crecientes de monensina en diversos parámetros del cultivo celular. Se midieron diariamente la densidad de células viables (VCD) y la viabilidad a partir del día 3. Se recogieron muestras de medio consumido en los días 3-10 y se sometieron a análisis del título. Las densidades de células viables se usaron para calcular densidades de células viables acumuladas, que se usaron junto con los valores de títulos acumulados para calcular las productividades específicas (qP). Cada valor mostrado es un promedio de duplicados. No hubo disminución en el título ni ningún otro impacto negativo del cultivo celular en estas células, a pesar de la aparente pérdida de morfología de Golgi, como se muestra en la Tabla 5.

Tabla 5: Parámetros del cultivo celular

El efecto de la monensina sobre los parámetros del cultivo celular en condiciones de perfusión simulada fue específico de la línea celular, presentando las células MAb A una disminución en la acumulación de masa celular total seguido de un impacto negativo del crecimiento similar, aunque no tan pronunciado, sobre las células MAb D. La monensina no tuvo efecto sobre el crecimiento o la viabilidad de las células MAb B y aumentó ligeramente la densidad de células viables acumulada y mejoró la viabilidad de células de MAb C.

La monensina tiene un efecto diferente sobre el crecimiento y la viabilidad celulares dependiendo de la línea celular de producción en cuestión. Se ha informado que la monensina provoca el bloqueo del ciclo celular de G1/S o G2/M e induce la apoptosis en ciertas líneas de linfoma y cáncer de células renales. Se mostró que reducía el nivel de varias proteínas relacionadas con el ciclo celular como CDK2, CD6, ciclina A y ciclina B1 y aumentaba los niveles de inhibidores del ciclo celular p21 y p27 (Park, W.H., et al., Int J Oncol. 2003, 22(4): 855-60; Park, W.H., et al., Int J Oncol. 2003, 23(1): 197-204; Park, W.H., et al., Br J Haematol. 2002, 119(2): p. 400-7). El efecto de la monensina en estas proteínas del ciclo celular podría explicar el efecto negativo de la monensina sobre el crecimiento y la viabilidad celulares de MAb A y MAb D.

Por otra parte, se ha informado que bajas dosis de monensina mejoran los parámetros del cultivo celular aumentando los iones Na+ intracelulares que podrían explicar la mejora del rendimiento del cultivo celular de células MAb C en presencia de monensina (Tenaglia, A.N., C.G. Fry, y G. Van Zant, Exp Hematol. 1985. 13(6): 512-519). No se sabe por qué líneas celulares de producción diferentes responden de manera diferente a la monensina y se podría explicar en parte por la heterogeneidad de las células de las que derivaron estas líneas celulares clónicas.

El efecto de la monensina sobre el título y la productividad específica también fue específico de la línea celular (Figura 3). Las células MAb A mostraron una disminución del título, pero aumentaron la productividad específica, mientras que las células MAb C mostraron un aumento del título, pero productividad específica ligeramente más baja en presencia de monensina. La monensina no tuvo impacto ni sobre el título ni la productividad específica de las células MAb B y disminuyó ligeramente el título de células de MAb D, pero no tuvo efecto sobre la productividad específica. Este efecto sobre el título y la productividad específica refleja probablemente el efecto que la monensina tiene sobre el crecimiento y la viabilidad celulares. En general, sin embargo, el uso de monensina facilitará grandes aumentos en los glucanos de alta manosa sin efectos significativos sobre el título o la productividad específica, y prácticamente sin cambios en los perfiles de alto peso molecular de los anticuerpos producidos.

Ejemplo 4

La aplicabilidad del uso de la monensina para modular los niveles de alta manosa en un ámbito de producción controlada a gran escala se evaluó usando una línea celular recombinante que produce MAb E en biorreactores de flujo tangencial alterno (ATF). Las células de MAb E cultivadas en medio de crecimiento para el tren de semillas se usaron para inocular el biorreactor N-1 a 6 x 105 células/ml en medio de crecimiento. Las células del biorreactor N-1 se usaron entonces para inocular tres biorreactores de producción de 2 l (N) a 7,5 x 105 células/ml en medio de perfusión base (denominados biorreactores de control, Ra y Rb).

Los biorreactores de producción se cultivaron durante 20 días a pH 7,00, 36 °C, 30 % de DO y 400 rpm de agitación. Estos tanques de producción se hicieron funcionar con el sistema ATF empezando en el día 3 con 0,5 vol/día de tasa de perfusión, que aumentó hasta 0,6 vol/día, 0,8352 vol/día y 1 vol/día en el día 6, 7 y 8, respectivamente. Los niveles de glucosa se mantuvieron por separado a 5 g/l puesto que el medio de perfusión se preparó sin glucosa.

La monensina (disolución madre 25 microM) se añadió como una dosis en bolo única para lograr una concentración final de 500 nM en dos tanques (Ra y Rb) en el día 8; el tercer tanque sirvió de tanque de control. A partir de aquí, la monensina se alimentó continuamente durante aproximadamente 22 horas a una tasa de 1/50 de la tasa del medio de perfusión para mantener la concentración de 500 nM en los tanques. También se añadió antiespumante en el tanque según se necesitara, mientras que se usó carbonato sódico 1 M para mantener el pH al punto de consigna deseado. Se recogieron diariamente muestras del tanque para la medición de diversos parámetros del cultivo celular, así como para los análisis del título y de alta manosa.

Se digirieron sesenta microgramos de muestras de MAb E diarias recogidas de biorreactores ATF en Fc/2 y Fab'2 con 60 unidades de la enzima IdeS (fabRICATOR, Genovis, Lund, Suecia) en fosfato de sodio 50 mM, NaCl 150 mM, pH 6,6 con incubación en un baño de agua a 37 °C durante 30 minutos. Las muestras digeridas se redujeron entonces en clorhidrato de guanidina 4 M, Tris 50 mM, pH 8,3 con DTT 50 mM seguido de incubación en un bloque térmico a 55 °C durante 10 minutos dando como resultado la reducción a Fc/2, LC y Fd.

Tras la digestión y reducción, las muestras se analizaron inmediatamente por RP-HPLC/EM. El análisis se realizó usando el sistema de cromatografía de líquidos Waters Acquity Ultra-Performance (UPLC) (Waters, Milford, MA) acoplado a un espectrómetro de masas de tiempo de Flight (TOF) Agilent MST (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Las muestras digeridas y reducidas se separaron en una columna de fase inversa Water BEH Phenyl (tamaño de partículas de 1,7 micrómetros, 2,1 x 150 mm; Waters, Milford, MA) mantenida a 80 °C. Las fases móviles empleadas para la separación fueron 0,1 % de TFA (tampón A) y acetonitrilo, 0,1 % de TFA (tampón B).

Se inyectaron cinco microgramos de cada muestra y se eluyeron a un caudal de 0,5 ml/min con el siguiente gradiente: se mantuvo 30 % de B durante 2,5 minutos seguido de un gradiente del 30 % al 45 % de B durante una duración de 5 minutos, seguido de un gradiente del 45 % al 100 % de B durante 0,5 minutos; B se mantuvo al 100 % durante 4 minutos, seguido de un gradiente del 100 % al 30 % de B durante 0,1 minutos, y luego se mantuvo al 30 % de B durante los 2,9 minutos restantes. También se monitorizó la elución por UV a una longitud de onda de 220 nm. Los datos de masa se extrajeron de TIC del pico FC/2, seguido de deconvolución de los espectros extraídos usando el software de deconvolución Agilent MassHunter. Las intensidades iónicas de los picos deconvolucionados se usaron para la cuantificación de las especies de glucano.

Como se muestra en las Figuras 1 - 4 y la Figura 7, la adición de monensina tuvo un ligero impacto negativo sobre el crecimiento y la viabilidad celulares, pero estos efectos no fueron suficientemente significativos para provocar un impacto negativo sobre la productividad de los cultivos. En realidad, los tanques tratados con monensina mostraron títulos marginalmente mejorados en comparación con el tanque de control. Y, lo que es más importante, la adición de monensina condujo a un aumento de 9-10 veces en los niveles de glucanos de alta manosa en los anticuerpos recombinantes (Figuras 5 - 9). Los aumentos primarios se observaron en las especies Man5, aunque en momentos de tiempo previos (días 9 y 10) también se regularon por incremento otras especies de manosa de orden superior. Desde el día 11 en adelante, la Man5 fue casi la especie exclusiva de alta manosa presente en los tanques con cantidades despreciables de otras especies de alta manosa detectadas.

Las comparaciones de niveles de alta manosa predichos y medidos muestran que la expresión de anticuerpos que contienen alta manosa alcanzaron un pico en el día 10 donde el 89 % de los anticuerpos producidos contuvieron glucanos de alta manosa (Figura 9). Una vez las cantidades de monensina llegaron a ser despreciables en los tanques (basándose en los cálculos de caudal del medio de perfusión, días 11 y siguientes), la tasa de disminución en el porcentaje de anticuerpos con glucanos de alta manosa fue proporcional a la tasa a la que el título fue creciendo (Figura 10). En otras palabras, altos niveles de anticuerpos de alta manosa se diluyeron con los anticuerpos recién producidos que contenían bajo nivel de alta manosa.

En general, el aumento en los niveles de alta manosa se correlacionó bien con las concentraciones de monensina calculadas basándose en el caudal en los tanques, con aumentos máximos observados en los días 9 y 10 cuando las concentraciones de monensina estaban en su punto más alto y empezaban a disminuir desde el día 11 en adelante (Figuras 9-12). Después del lavado completo de la monensina de los tanques mediante el proceso de perfusión de medio continuo, los niveles de alta manosa disminuyeron desde un pico inicial del 35-50 % hasta el 15 17 % en el día de la recogida (Figuras 13 y 14).

Claims (17)

REIVINDICACIONES

1. Un método de regulación por incremento del contenido de glucoformas de alta mañosa de una proteína recombinante que comprende una región Fc de inmunoglobulina durante un proceso de cultivo de células de mamífero, que comprende:

establecer un cultivo de células de mamífero que expresa la proteína recombinante en un medio de cultivo sin suero en un biorreactor,

mantener las células de mamífero durante una fase de producción, y

poner en contacto el cultivo celular con monensina.

2. El método según la reivindicación 1, en donde la monensina está presente en el cultivo celular durante un periodo de tiempo seleccionado del grupo que consiste en: un día; dos días; tres días; cuatro días; cinco días; seis días; siete días; ocho días; nueve días; y 10 días o más.

3. El método según la reivindicación 1, en donde la monensina está presente en el cultivo celular durante la duración del cultivo celular.

4. El método según la reivindicación 1, 2 o 3, en donde la monensina está presente en el cultivo celular a una concentración fija y seleccionada, seleccionada preferentemente del grupo que consiste en una concentración: entre 10 nM y 800 nM;

entre 25 nM - 750 nM; y

entre 50 nM y 500 nM.

5. El método según la reivindicación 4, en donde la concentración de monensina se selecciona del grupo que consiste en 50 nM, 100 nM, 250 nM; 500 nM; y 750 nM.

6. El método según la reivindicación 1, 2 o 3, en donde la monensina está presente en el cultivo celular a una primera concentración seleccionada de entre 25 nM y 100 nM, luego se aumenta a una segunda concentración más alta entre 100 nM y 500 nM.

7. El método según la reivindicación 6, en donde la monensina se mantiene a la primera concentración durante un periodo de tres a cinco días, luego se mantiene a la segunda concentración durante un periodo de un día a durante toda la duración del cultivo.

8. El método según la reivindicación 6 o 7, en donde la segunda concentración más alta de monensina se estrecha posteriormente a entre 25 nM y 100 nM durante un periodo de tiempo de un día a durante toda la duración del cultivo.

9. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde la monensina se añade al cultivo celular entre tres y 15 días después de establecerse el cultivo.

10. El método de la reivindicación 9, en donde la monensina se añade al cultivo celular en el día 3, en el día 4, en el día 5; en el día 6; en el día 7; en el día 8; en el día 9; en el día 10; en el día 11; o en el día 12 después de establecerse el cultivo.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 10, en donde el cultivo celular se mantiene por perfusión, preferentemente

en donde la perfusión comienza en o aproximadamente el día 1 a en o aproximadamente el día 9 del cultivo celular;

en donde la perfusión comienza en o aproximadamente el día 3 a en o aproximadamente el día 7 del cultivo celular; o

en donde la perfusión comienza cuando células han alcanzado una fase de producción.

12. El método de la reivindicación 11, en donde la perfusión se lleva a cabo mediante flujo tangencial alterno.

13. El método de la reivindicación 12, en donde la perfusión se lleva a cabo mediante flujo tangencial alterno usando un ultrafiltro o un microfiltro.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 10, en donde el cultivo celular se mantiene por lote alimentado, preferentemente en donde el cultivo se alimenta tres o cuatro veces durante la producción; más preferentemente en donde el cultivo se alimenta en un día entre el día dos y cuatro, en un día entre el día 5 y 7, y en día entre el día 8 y 10, o en donde el cultivo se alimenta en un día entre el día dos y cuatro, en un día entre el día 5 y 6, en un día entre el día 7 y 8, y en un día entre el día 8 y 10 o después.

15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde el método comprende además una etapa de recogida.

16. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en donde el contenido de glucoformas de alta manosa está regulado por incremento, y en donde la especie de alta manosa que está regulada por incremento se selecciona al menos del grupo que consiste en Man5, Man6, Man7, Man8a, Man8b y Man9.

17. El método de la reivindicación 16, en donde la especie de alta manosa que está regulada por incremento es Man5.