ES3032084T3 - A method for detecting an analyte - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona un método para detectar un analito en una muestra, comprendiendo el método los pasos de: (i) proporcionar una mezcla que comprende una muestra y un reactivo reportero a un dispositivo, comprendiendo el dispositivo un sustrato que tiene un componente óptico y un componente de unión unido a una superficie del sustrato; (ii) permitir que una proporción del reactivo reportero se una a la superficie del sustrato en proporción a la concentración del analito, por medio del componente de unión; (iii) irradiar el dispositivo con radiación electromagnética para su absorción por un fotosensibilizador del reactivo reportero, de modo que el fotosensibilizador de la porción de reactivo reportero unida interactúe con el componente óptico para hacer que el componente óptico cambie de un primer estado óptico a un segundo estado óptico, formando así un conjunto de regiones locales del componente óptico que tienen el segundo estado óptico en el sustrato; y (iv) detectar el conjunto de regiones locales que tienen el segundo estado óptico en el sustrato. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Un método para detectar un analito

La presente invención se refiere a un método para detectar un analito, y particularmente a un método para detectar eventos de unión individuales debido a la presencia de un analito en una muestra.

Hay muchas técnicas disponibles para la medición de parámetros biológicamente relevantes en muestras humanas, como sangre, plasma, suero, tejido, etc. Un método común es utilizar un reactivo de captura que se une al objetivo de interés y un reactivo indicador que tiene una etiqueta de algún tipo. El reactivo de captura puede estar unido a una fase sólida, como una placa de microtitulación, una perla o una membrana. Cuando la muestra se incuba con el reactivo de captura, el analito se une al reactivo de captura. El reactivo indicador también se une al analito. Luego se puede eliminar el exceso de indicador (mediante lavado) y se puede medir la cantidad de reactivo indicador, obteniendo así una medida de la cantidad de analito presente en la muestra. Existen muchas variaciones diferentes sobre cómo se pueden llevar a cabo este tipo de ensayos de unión. Por ejemplo, el analito puede unirse primero al reactivo de captura y luego se puede agregar el indicador en una etapa separada, o el analito puede unirse primero al indicador y luego unirse al agente de captura.

Existe una amplia gama de reactivos que pueden utilizarse como captura e indicador en ensayos de unión de este tipo, incluidos ácidos nucleicos, carbohidratos, antígenos, péptidos, proteínas y anticuerpos. También hay una amplia gama de analitos objetivo, incluidos péptidos, proteínas, anticuerpos, ácidos nucleicos, células, carbohidratos, moléculas pequeñas, medicamentos terapéuticos, drogas de abuso, esteroides, hormonas, lípidos, etc.

Los ensayos que utilizan anticuerpos se denominan comúnmente inmunoensayos. Los inmunoensayos pueden adoptar varios formatos. Por ejemplo, cuando se utiliza un anticuerpo de captura para capturar el analito y se utiliza un anticuerpo indicador para generar una señal medible, esto se denomina comúnmente inmunoensayo tipo sándwich. Se conocen formatos alternativos en los que el agente aglutinante se une a una fase sólida y el analito objetivo compite en solución con un reactivo marcado que también se une al agente aglutinante. En ausencia de analito, se obtiene una señal alta, ya que se unen altos niveles del reactivo marcado. En presencia de analito, una fracción de los sitios de unión se bloquean, por lo que se une menos reactivo marcado y se reduce la señal. Estos ensayos se conocen comúnmente como ensayos de inhibición o de competencia. Se conocen varios tipos de ensayos de competencia. Por ejemplo, un anticuerpo podría estar unido a la fase sólida y el analito marcado (o análogo del analito) puede competir por los sitios de unión en el anticuerpo. Alternativamente, se podría inmovilizar un análogo del analito y un anticuerpo marcado podría unirse a esta superficie. En presencia de analito en la muestra, este se unirá al anticuerpo en solución, evitando la unión a la superficie y la señal disminuirá.

Hay muchos formatos de ensayos y muchos tipos diferentes de etiquetas que se pueden emplear. Por ejemplo, los ensayos pueden ser heterogéneos, en el sentido de que el exceso de etiqueta se elimina antes de que se realice la medición, por ejemplo, mediante el uso de etapas de lavado. La eliminación del exceso de etiqueta también se puede lograr haciendo fluir la muestra y el indicador más allá de un área de captura. Este enfoque se utiliza en tiras inmunocromatográficas o de flujo lateral, que se emplean en pruebas rápidas para enfermedades infecciosas y pruebas de embarazo, por ejemplo. Alternativamente, se conocen ensayos homogéneos, donde no se elimina el exceso de indicador. Los ensayos homogéneos tienden a depender de la proximidad de la captura y del indicador que crea algún tipo de señal. Un ejemplo de un ensayo homogéneo es un ensayo de aglutinación, donde las partículas se unen en solución. Las partículas aglutinadas provocan la dispersión de la luz, que puede medirse mediante turbidimetría o nefelometría. Otro ejemplo de un ensayo homogéneo que utiliza partículas es el inmunoensayo de canalización de oxígeno luminiscente (LOCI), descrito con más detalle a continuación.

Otro ejemplo de un ensayo homogéneo es la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET), donde los reactivos de captura e indicador son fluoróforos donador y aceptor respectivamente, y la excitación del donante conduce a la transferencia de energía al aceptor, seguida de emisión de luz.

Un formato de ensayo homogéneo que funciona en sangre completa, sin eliminación de material celular, es el inmunoensayo piroóptico. El anticuerpo de captura se recubre sobre un sensor de polivinilideno PVDF piroeléctrico y se utilizan partículas de carbono como indicador. La señal se genera iluminando la muestra con luz, lo que provoca un calentamiento localizado de las partículas. Los que están unidos al sensor transfieren energía al sensor piroeléctrico, provocando un estrés térmico que se detecta como una señal eléctrica. Cuanto más carbono esté unido, mayor será la señal.

La etiqueta que se adhiere al agente de unión del indicador puede ser un agente que absorbe la luz, como un colorante, una partícula de oro o una microesfera de látex teñida. Las partículas más grandes pueden, en principio, absorber más luz y generar más señal. Sin embargo, existe un límite de tamaño en el cual las etiquetas de partículas se vuelven poco prácticas para usar en ensayos, como se describe con más detalle a continuación. También se conocen marcas luminiscentes como fluorescentes, quimioluminiscentes, bioluminiscentes y electroquimioluminiscentes. También se han encapsulado etiquetas luminiscentes en partículas para ciertos tipos de ensayos. La amplificación de la señal también puede realizarse mediante reacciones enzimáticas o catalíticas. Las enzimas se pueden utilizar para convertir un sustrato de un colorante leuco a una forma coloreada, o a una forma fluorescente o luminiscente. Es común eliminar el exceso de enzima mediante etapas de lavado antes de agregar el sustrato, de modo que la señal es generada solo por la enzima que está unida específicamente al analito.

También se conocen inmunoensayos que no utilizan marcadores, como los ensayos que utilizan la resonancia plasmónica de superficie como método de transducción de señales. Sin embargo, los ensayos sin etiquetas tienden a carecer de la sensibilidad de los ensayos que utilizan etiquetas para mejorar la señal.

Puede encontrar más información sobre el campo de los inmunoensayos en “The Immunoassay Handbook: 4th Edition: Theory and Applications of Ligand Binding, ELISA and Related Techniques”, Ed. D. Wild, Elsevier Science, 2013.

Todos los ensayos de unión, incluidos los inmunoensayos, tienen limitaciones en términos de las concentraciones mínimas y máximas de analito que se pueden medir de manera confiable.

La señal máxima generalmente está limitada por factores como la cantidad total de anticuerpo de captura disponible para unirse al analito y la cantidad total de anticuerpo indicador para generar la señal. Si el anticuerpo de captura está inmovilizado en una fase sólida, entonces el área de superficie de la fase sólida puede limitar el límite superior de detección. Además, algunas técnicas de transducción de señales pueden ser propensas a la saturación, como los métodos colorimétricos, dependiendo del recorrido que la luz necesita recorrer a través de la muestra. Los métodos luminiscentes son menos propensos a la saturación, ya que la ganancia del detector se puede atenuar para lidiar con niveles más altos de emisión de luz. Cuando todos los sitios de unión de anticuerpos en un ensayo heterogéneo están llenos de analito, se alcanza la señal máxima y el sistema se ha saturado. El exceso de analito normalmente se eliminará en una etapa de lavado antes de agregar el indicador. Los ensayos homogéneos también pueden sufrir un efecto conocido como efecto gancho de dosis alta, donde la concentración de analito es mayor que la concentración efectiva del anticuerpo de captura y/o indicador. En este caso, en concentraciones muy altas, todos los sitios de unión de la captura y del indicador pueden bloquearse y la señal del ensayo puede disminuir, dando lugar a resultados erróneos.

El nivel inferior de detección está determinado por una serie de factores diferentes. En general, todos los ensayos se verán afectados por atributos como la calidad de los anticuerpos utilizados (afinidad y especificidad) y la reactividad cruzada de los anticuerpos con analitos relacionados. El límite inferior de detección también depende de la configuración del ensayo y de factores que afectan la relación señal-ruido del diseño del sistema. Por ejemplo, en un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) estándar, el anticuerpo de captura se recubre sobre la superficie de una placa de microtitulación de 96 pocillos y luego la muestra se incuba en los pocillos, lo que permite capturar el analito. Se lavan los pocillos y luego se agrega el indicador en exceso, uniéndose al analito capturado. Luego se elimina el exceso de indicador y se agrega un sustrato que puede reaccionar con la enzima y convertirse en una forma activa. Por ejemplo, un colorante leuco no coloreado, como el ácido 2,2'-azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) (ABTS), puede ser convertido por la peroxidasa de rábano picante en una forma verde oxidada en presencia de peróxido de hidrógeno. Cuando el analito está presente en cantidades muy bajas (por ejemplo, menos de 1 picomolar), solo habrá cantidades muy pequeñas de enzima unida a la superficie del pocillo. El ABTS reacciona con la enzima para generar la forma verde, luego se difunde en la mayor parte del fluido, generando una solución tan diluida que no se puede distinguir de la señal de fondo. La autoconversión del sustrato también puede generar color que interfiera con la medición.

De manera similar, otros métodos de detección, como la fluorescencia, pueden verse afectados por factores de interferencia y autofluorescencia de los componentes en la muestra o en los pocillos de reacción.

Otro factor de confusión en los inmunoensayos puede ser la unión no específica de los reactivos indicadores a la superficie de captura. Por ejemplo, en el ensayo ELISA descrito anteriormente, el pocillo de microtitulación está recubierto con una capa de proteína, parte de la cual puede desnaturalizarse durante el proceso de recubrimiento. No es raro que el indicador se una a áreas de la superficie de captura durante el ensayo. Si este indicador revierte el sustrato para contribuir a la señal general, no es posible distinguir la señal debida al indicador unido específicamente de aquella que está unida de manera no específica. La unión no específica también puede ser promovida por muchos de los componentes presentes en la muestra original, que pueden unirse a la superficie de captura durante la incubación inicial, modificando las propiedades de la superficie de la capa de captura y creando una superficie que puede unirse al indicador. Para minimizar la unión no específica del indicador es necesario optimizar cuidadosamente todos los reactivos y las condiciones de reacción utilizados durante el ensayo, incluidos los anticuerpos, los detergentes, la temperatura y la fuerza iónica.

Generalmente, el límite de detección de los inmunoensayos tradicionales es de alrededor de 0.1 picomolar a 1 nanomolar, dependiendo de la metodología del ensayo. El desarrollo de ensayos con límites de detección muy bajos utilizando enfoques tradicionales a menudo requiere un alto grado de optimización, con estrictos etapas de lavado para reducir la unión no específica y maximizar la relación señal-ruido. Además, la superficie de captura suele ser pequeña en relación con el volumen de la muestra para garantizar que la señal sea lo suficientemente alta en relación con el fondo.

Un enfoque que se ha utilizado para sortear problemas relacionados con la relación señal-ruido y mejorar los límites de detección es medir eventos de unión individuales y contabilizar estos eventos como eventos “activados” o “desactivados”, si la medición está por encima de un umbral localizado. De esta manera se puede eliminar gran parte del ruido de fondo. Se pueden establecer analogías con la digitalización de señales de audio o de comunicación. Se ha demostrado que estos ensayos digitales alcanzan límites de detección que antes eran inalcanzables utilizando los métodos analógicos tradicionales. Por ejemplo, se han reportado límites de detección en el rango femtomolar bajo (10-15 mol/l) e incluso attomolar (10-18 mol/l). Véase por ejemplo “Evaluation of highly sensitive immunoassay technologies for quantitative measurements of sub-pg/mL levels of cytokines in human serum", Yeung et al, Journal of Immunological Methods, 2016, 437, 53 y "Digital Detection of Biomarkers Assisted by Nanoparticles: Application to Diagnostics", Cretich et al, Trends in Biotechnology, 2015, 33, 343.

La mayoría de las etiquetas/indicadores utilizados en ensayos (como fluoróforos, colorantes, etc.) no son visibles individualmente con un microscopio de campo amplio, incluso con gran aumento, ya que su tamaño está por debajo del límite de difracción de la luz visible. Por lo tanto, la presencia de estas etiquetas solo puede medirse como un fenómeno en conjunto, no contando cada etiqueta. Por el contrario, las etiquetas de partículas, como las de látex, pueden visualizarse en teoría mediante microscopía óptica de campo amplio si superan un tamaño determinado. Dependiendo de la configuración óptica, es posible comenzar a visualizar partículas cuando tienen un diámetro de varios cientos de micrones o más, dependiendo de la apertura numérica y el tipo de microscopio.

Sin embargo, el uso de partículas de este tamaño como etiquetas para monitorizar eventos de unión individuales en una superficie de captura (como una interacción anticuerpo-antígeno) se vuelve poco práctico por varias razones. Por ejemplo, las partículas de este tamaño se difunden muy lentamente en comparación con otros tipos de etiquetas, lo que perjudica la velocidad de la reacción en una superficie plana. También comienzan a exhibir efectos de flotabilidad macroscópica y sedimentarán o flotarán si la densidad de la partícula es significativamente diferente al medio en el que están contenidas, lo que también puede causar problemas con el formato del ensayo. Las partículas de este tamaño son particularmente propensas a unirse de manera no específica a las superficies, lo que genera un fondo alto, que es difícil de eliminar. Por último, se deben eliminar las partículas sobrantes, lo que requiere etapas de lavado. Sin embargo, las partículas grandes comienzan a sufrir efectos de cizallamiento en presencia de flujo de fluido, donde la fuerza de cizallamiento sobre la partícula se vuelve mayor que la resistencia a la ruptura de la interacción anticuerpo-antígeno (aproximadamente 60-250 pN), lo que lleva a que las partículas sean arrastradas (ver “Rapid Femtomolar Bioassays in Complex Matrices Combining Microfluidics and Magnetoelectronics", Mulvaney et al, Biosensors and Bioelectronics, 2007, 23, 191).

Los ejemplos de ensayos digitales incluyen el sistema Quanterix Single Molecule Array (SIMOA) y el sistema Singulex Single Molecule Counting (SMC).

El sistema Quanterix SIMOA utiliza perlas paramagnéticas recubiertas de anticuerpos para capturar el analito de la solución. Luego se lavan las perlas magnéticas y se agrega el anticuerpo indicador marcado con enzima. La cantidad de perlas es suficiente para minimizar la probabilidad de tener más de un analito e indicador por perla. Las perlas se lavan nuevamente y luego se cargan en un conjunto de micropocillos que solo pueden contener una perla por pocillo. El volumen de los micropocillos está en la escala de femtolitros. Si la perla tiene enzima adherida, entonces el sustrato fluorogénico en el pocillo se voltea. Las pequeñas dimensiones del pocillo evitan que el producto fluorescente se difunda demasiado. Luego, cada pocillo se cuenta como un evento “encendido” o “apagado” si la fluorescencia está por encima de un valor umbral.

El sistema SMC se utiliza en el instrumento Singulex Clarity y también en los sistemas Erenna y SMCxPRO de Merck Millipore. La técnica de medición fundamental en los tres sistemas es la misma. Se utilizan perlas magnéticas, recubiertas con anticuerpos de captura, para capturar el analito objetivo en un ensayo tipo sándwich. El anticuerpo indicador marcado con fluorescencia también se une a la perla, en presencia del analito. Las perlas se bajan con un imán y se elimina el exceso de indicador marcado con fluorescencia. Luego se agrega un tampón de elución que provoca la disociación del complejo sándwich, que luego se transfiere a un recipiente de medición.

Luego se mide la presencia de la etiqueta fluorescente utilizando un microscopio fluorescente confocal que examina secuencialmente pequeños volúmenes de la muestra para determinar si la etiqueta fluorescente está presente o no. Si la señal de cada medición individual está por encima de un valor umbral, esto cuenta como un evento “activado” para esa medición.

Varias revisiones académicas independientes de inmunoensayos de alta sensibilidad han destacado que el enfoque digital de los inmunoensayos permite mejoras sin precedentes en los límites de detección (véanse las referencias Yeung y Cretich más arriba).

El límite de detección de los sistemas Quanterix y Singulex depende del volumen de muestra que se utiliza en el ensayo. Para una muestra de suero o plasma de 10 microlitros, el límite teórico sería la detección de un único evento de unión, correspondiente a 1 molécula. Sin embargo, en términos de molaridad, esto correspondería a 100.000 moléculas por litro de muestra, o 0.16 x 10-18 moles por litro (0.16 attomolar).

Sin embargo, los sistemas Quanterix y Singulex descritos anteriormente son complejos y engorrosos, y cada uno de ellos requiere una serie de etapas de lavado y transferencia. Además, los ensayos sólo pueden realizarse para muestras que no contienen material celular y los sistemas requieren instrumentación costosa para lograr el rendimiento que ofrecen. Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de sistemas de alta sensibilidad más simples y rentables.

El documento US 2006/281104 se refiere a métodos y composiciones para detectar la presencia o medir cantidades de objetivos moleculares, particularmente complejos moleculares que comprenden dos o más proteínas, tales como complejos receptores de membranas de superficie celular.

El documento WO 2011/143606 Se refiere a métodos para determinar un analito en un medio sospechoso de contener el analito.

El documento US 2007/264664 Se refiere a métodos de ensayo que implican reacciones de unión específicas que son simplificadas en comparación con los métodos conocidos.

El documento US 4654300 se refiere a un método y composiciones para realizar inmunoensayos que tienen partículas fluorescentes conjugadas y catalizador conjugado donde las partículas y los catalizadores están conjugados a miembros de un par de unión específico.

De acuerdo con, la presente invención proporciona un método para detectar un analito en una muestra, el método comprende las etapas de:

(i) proporcionar una mezcla que comprende una muestra de fluido y un reactivo indicador a un dispositivo, el dispositivo comprende un sustrato que tiene un componente óptico y un componente de unión unido a una superficie del sustrato,

en el que el sustrato está ubicado en una cámara que tiene una o más paredes laterales, una superficie superior y una superficie inferior,

en la que la cámara contiene la muestra, y la muestra que contiene el analito está en contacto con el sustrato, y

en el que el sustrato se coloca encima de la solución a granel en la superficie superior de la cámara, con los componentes ópticos y de unión en la superficie interior de la cámara en contacto con la muestra;

(ii) permitir que una proporción del reactivo indicador se una a la superficie del sustrato en proporción a la concentración del analito, por medio del componente de unión;

(iii) irradiar el dispositivo con radiación electromagnética para su absorción por un fotosensibilizador del reactivo indicador, de modo que el fotosensibilizador de la porción de reactivo indicador unida interactúe con el componente óptico para hacer que el componente óptico cambie de un primer estado óptico a un segundo estado óptico, formando así un conjunto de regiones locales del componente óptico que tienen el segundo estado óptico sobre el sustrato, en el que el componente óptico cuando está en el primer estado óptico es fluorescente y el componente óptico cuando está en el segundo estado óptico es no fluorescente, y en el que el cambio del primer estado óptico al segundo estado óptico es irreversible; y

(iv) detectar el conjunto de regiones locales que tienen el segundo estado óptico en el sustrato, en la que las regiones locales que tienen el segundo estado óptico se cuentan como eventos de unión individuales.

De este modo, la presente invención proporciona un método para detectar un analito en una muestra de fluido en el que sólo el reactivo indicador que está en la proximidad de la superficie del sustrato da como resultado una señal (región local del componente óptico en el segundo estado óptico) y se detectan las señales (conjunto de regiones locales del componente óptico en el segundo estado óptico). Por lo tanto, el método de la presente invención simplifica la detección digital del analito. El método de la presente invención facilita ensayos homogéneos en una variedad de muestras, incluidas aquellas que contienen materiales celulares.

La presente invención se describirá ahora con referencia a los dibujos, en los que:

La Fig. 1 muestra varios componentes que pueden utilizarse en el método de la presente invención;

La Fig. 2 muestra un dispositivo en el que un reactivo indicador está unido a la superficie del sustrato antes de la irradiación;

La Fig. 3 muestra el dispositivo de la figura 2 siendo irradiado;

La Fig. 4 muestra el dispositivo de la figura 3 después de la irradiación;

La Fig. 5 muestra un dispositivo en el que están presentes una muestra de sangre completa y un reactivo indicador antes de la irradiación;

La Fig. 6 muestra el dispositivo de la figura 5 después de la irradiación;

La Fig. 7 muestra un dispositivo utilizado en un método de referencia en el que un reactivo indicador se une a la superficie del sustrato en proporción a la concentración del analito, por medio del componente de unión, antes de la irradiación;

La Fig. 8 muestra el dispositivo de la figura 7 después de la irradiación;

La Fig. 9 muestra una configuración óptica para la detección;

La Fig. 10 muestra un sustrato y un pocillo creados para el método de la presente invención;

La Fig. 11 muestra una cámara de muestra creada utilizando el sustrato y el pocillo de la figura 10;

La Fig. 12 muestra los resultados de detección del Ejemplo 5;

La Fig. 13 muestra los resultados de detección del Ejemplo 6; y

La Fig. 14 muestra los resultados de detección del Ejemplo 7.

El método de la presente invención se utiliza para detectar un analito en una muestra de fluido (lo que puede ser mediante la detección de un complejo o derivado del analito).

Los componentes de la Fig. 1 son: analito 1; fotosensibilizador 2; partícula de látex recubierta de estreptavidina infundida con fotosensibilizador 3; partícula de látex recubierta de anticuerpo infundida con fotosensibilizador 4; anticuerpo 5; anticuerpo marcado con fotosensibilizador 6; colorante en estado fluorescente 7; colorante en estado no fluorescente 8; estreptavidina polimerizada 9; conjugado de colorante de poliestreptavidina en estado fluorescente 10; conjugado de colorante de poliestreptavidina en estado no fluorescente 11; conjugado de biotina-BSA 12; glóbulo rojo 13; conjugado de aminodextrano-biotina-colorante en estado fluorescente 14; y conjugado de aminodextrano-biotina-colorante en estado no fluorescente 15.

La etapa (i) del método de la presente invención implica proporcionar una mezcla que comprende un líquido muestra y un reactivo indicador a un dispositivo, el dispositivo comprende un sustrato 17 que tiene un componente óptico y un componente de unión unidos a una superficie del sustrato 17, en el que el sustrato 17 está ubicado en una cámara 16 que tiene una o más paredes laterales, una superficie superior y una superficie inferior, en la que la cámara 16 contiene la muestra, y la muestra que contiene el analito está en contacto con el sustrato 17, y en el que el sustrato 17 está posicionado encima de la solución a granel en la superficie superior de la cámara 16, los componentes ópticos y de unión están en la superficie interior de la cámara 16 en contacto con la muestra. La muestra y el reactivo indicador pueden mezclarse previamente antes de agregar la mezcla al dispositivo o la muestra y el reactivo indicador pueden agregarse secuencialmente al dispositivo para formar la mezcla. La mezcla también puede contener reactivos adicionales, pero preferiblemente la mezcla consta de la muestra y el reactivo indicador.

A modo de explicación del principio subyacente a la presente invención, la figura 2 muestra un dispositivo en el que un reactivo indicador se une a la superficie del sustrato antes de la irradiación. El dispositivo incluye un sustrato 17 y una cámara de muestra 16 para contener una muestra que contiene un analito disuelto o suspendido en ella. El sustrato puede ser cualquier sustrato que permita la detección del conjunto de regiones locales que tienen el segundo estado óptico en el sustrato. Preferiblemente, el sustrato es un sustrato transparente y, más preferiblemente, el sustrato es vidrio.

El sustrato 17 tiene un conjugado de aminodextrano-biotina-colorante 14 unido a una superficie del sustrato 17 a través del conjugado de biotina-BSA 12 y estreptavidina polimerizada 9. El colorante actúa como componente óptico y la biotina actúa como componente de unión. El conjugado biotina-BSA 12 y la estreptavidina polimerizada 9 son macromoléculas inertes que facilitan la unión de los componentes ópticos y de unión a la superficie del sustrato 17. Este enfoque se utiliza cuando el componente óptico es soluble en agua, ya que el componente óptico debe estar unido a la superficie del sustrato 17 para que quede inmovilizado.

Aunque los componentes ópticos y de unión se muestran de esta manera, es aplicable cualquier técnica para sujetar los componentes ópticos y de unión proximales a la superficie del sustrato 17. Por ejemplo, los componentes ópticos y de unión pueden ser reactivos separados y el componente de unión puede estar unido al componente óptico.

El componente óptico también puede estar encapsulado dentro de una capa de polímero que recubre la superficie del sustrato 17 y el componente de unión está unido a la capa de polímero. El polímero puede ser silicona, poliestireno o poliisobutileno, o cualquier otro plástico polimérico adecuado que pueda utilizarse para encapsular el componente óptico. Este enfoque se puede utilizar cuando el componente óptico es insoluble en agua.

Como alternativa, se puede impregnar una capa de gel/hidrogel con el componente óptico y aplicar la capa de gel/hidrogel sobre la superficie del sustrato 17 y el componente de unión adherido a la capa de gel/hidrogel.

La etapa (ii) del método de la presente invención implica permitir que una proporción del reactivo indicador se una a la superficie del sustrato en proporción a la concentración del analito, por medio del componente de unión. Esto se puede lograr dejando reposar el dispositivo durante un período de tiempo, por ejemplo 10 minutos.

En la Fig. 2, la partícula de látex recubierta de estreptavidina infundida con fotosensibilizador 3 está unida a la superficie del sustrato 17 por medio de biotina en el conjugado aminodextrano-biotina-colorante 14. La partícula de látex recubierta de estreptavidina infundida con el fotosensibilizador 3 actúa como reactivo informador.

Aunque el reactivo indicador se muestra unido a la superficie del sustrato 17 de esta manera, cuando el analito está presente, el reactivo indicador se une a la superficie del sustrato en proporción a la concentración del analito. Por ejemplo, si el componente de unión y el reactivo indicador son anticuerpos, y el analito es un antígeno, el reactivo indicador se une al componente de unión a través del analito para formar un complejo denominado “sándwich”, como se analiza a continuación con referencia a las Figs. 7 y 8.

Todas las etapas hasta este punto se han realizado en ausencia de luz. La etapa (iii) del método de la presente invención implica irradiar el dispositivo con radiación electromagnética para su absorción por un fotosensibilizador del reactivo indicador, de tal manera que el fotosensibilizador de la porción de reactivo indicador unida interactúa con el componente óptico para hacer que el componente óptico cambie de un primer estado óptico a un segundo estado óptico, formando así un conjunto de regiones locales del componente óptico que tiene el segundo estado óptico sobre el sustrato 17, en donde el componente óptico cuando está en el primer estado óptico es fluorescente y el componente óptico cuando está en el segundo estado óptico es no fluorescente, y en donde el cambio del primer estado óptico al segundo estado óptico es irreversible.

La Fig. 3 muestra el dispositivo de la figura 2 siendo irradiado con radiación electromagnética (normalmente denominada “ luz”), preferiblemente luz visible. La fuente de luz puede ser, por ejemplo, LED 18. La fuente de luz ilumina la cámara de muestra 16 con luz de la longitud de onda apropiada para excitar el fotosensibilizador 2. La longitud de onda depende del fotosensibilizador, pero la longitud de onda preferida es 680 nm. El dispositivo normalmente se irradia durante al menos 30 segundos. Preferiblemente, el dispositivo se expone a la fuente de radiación electromagnética durante más de 1 segundo, más preferiblemente al menos 2 segundos, más preferiblemente al menos 5 segundos, más preferiblemente al menos 20 segundos y más preferiblemente al menos 30 segundos. Esto garantiza que haya un cambio óptico irreversible en la superficie del sustrato, permitiendo así distinguir entre eventos de unión transitorios y de larga duración.

La Fig. 4 muestra el dispositivo de la figura 3 después de la irradiación. El fotosensibilizador 2 interactúa con el componente óptico del colorante del conjugado aminodextrano-biotina-colorante 14 para hacer que el colorante cambie de un estado fluorescente a un estado no fluorescente. El conjugado de aminodextrano-biotinacolorante en estado fluorescente 14 se convierte en conjugado de aminodextrano-biotina-colorante en estado no fluorescente 15. Sólo el colorante que está cerca del fotosensibilizador 2 cambia del primer estado óptico al segundo estado óptico.

La Fig. 5 muestra un dispositivo en el que están presentes una muestra de sangre completa y un reactivo indicador antes de la irradiación. La muestra de sangre completa también contiene componentes adicionales como glóbulos rojos 13. El sustrato 17 forma la parte superior de la cámara de muestra 16, lo que permite que los glóbulos rojos 13 se sedimenten lejos del sustrato 17.

Una proporción del reactivo indicador se une a la superficie del sustrato 17 por medio del componente de unión. Por lo tanto, la muestra contiene reactivo indicador unido y reactivo indicador no unido libre en solución. La profundidad de la cámara de muestra 16 está diseñada para minimizar la longitud del recorrido de difusión del reactivo indicador y permitir que se alcance el equilibrio rápidamente. Normalmente, la profundidad de la cámara de muestra es de 50 a 200 pm.

A continuación, el dispositivo se irradia como se describe anteriormente y la figura 6 muestra el dispositivo de la figura 5 después de la irradiación. Cualquier fotosensibilizador en la proximidad del componente óptico interactúa para provocar que el componente óptico cambie del primer estado óptico al segundo estado óptico. De esta manera, el fotosensibilizador de la porción de reactivo indicador ligada interactúa con el componente óptico para hacer que el componente óptico cambie del primer estado óptico al segundo estado óptico, formando así un conjunto de regiones locales del componente óptico que tienen el segundo estado óptico en el sustrato 17.

La Fig. 7 muestra un dispositivo utilizado en un método de referencia en el que un reactivo indicador se une a la superficie del sustrato en proporción a la concentración del analito, por medio del componente de unión, antes de la irradiación.

En un inmunoensayo sándwich típico que utiliza el método de referencia, el sustrato 17 tiene un conjugado de poliestreptavidina-colorante 11 unido a una superficie del sustrato 17 a través del conjugado de biotina-BSA 12, y el anticuerpo 5 unido al conjugado de poliestreptavidina-colorante 11. El colorante actúa como componente óptico y el anticuerpo actúa como componente de unión. Aunque los componentes ópticos y de unión se muestran de esta manera, es aplicable cualquier técnica para sujetar los componentes ópticos y de unión proximales a la superficie del sustrato 17, tales como las descritas anteriormente.

En el método de referencia, la cámara de muestra 16 se llena con una muestra que contiene un analito 1. También se añade a la cámara de muestra 16 un reactivo indicador, tal como el anticuerpo 6 marcado con fotosensibilizador. Si se utiliza una muestra de sangre completa, la muestra también puede contener componentes adicionales como glóbulos rojos 13.

Se alcanza entonces un equilibrio. El anticuerpo 6 marcado con fotosensibilizador se une a la superficie del sustrato 17 en proporción a la concentración de analito 1 por medio del anticuerpo 5. El anticuerpo 6 marcado con fotosensibilizador actúa como reactivo indicador. Se incluye un exceso de anticuerpo 6 marcado con fotosensibilizador de modo que todo el analito 1 forme un complejo tipo sándwich. De este modo, una proporción del reactivo indicador se une a la superficie del sustrato 17 en proporción a la concentración del analito 1, por medio del componente de unión. Por lo tanto, la muestra contiene reactivo indicador unido y reactivo indicador no unido libre en solución.

La Fig. 8 muestra el dispositivo de la figura 7 después de la irradiación. El fotosensibilizador 2 interactúa con el componente óptico del colorante del conjugado de poliestreptavidina-colorante 11 para hacer que el colorante cambie de un estado no fluorescente a un estado fluorescente. El conjugado de poliestreptavidina-colorante en estado no fluorescente 11 se convierte en conjugado de poliestreptavidina-colorante en estado fluorescente 10. Sólo el colorante que está cerca del fotosensibilizador 2 cambia del primer estado óptico al segundo estado óptico.

El reactivo indicador debe estar unido permanentemente a la superficie del sustrato 17 durante todo el período de irradiación para lograr la conversión completa del primer estado óptico al segundo estado óptico. Cualquier reactivo indicador no unido en solución no hace que el componente óptico cambie del primer estado óptico al segundo estado óptico.

Esto proporciona una ventaja significativa sobre otros métodos de análisis digitales, ya que elimina la necesidad de etapas de lavado. De esta manera, el método de la presente invención es un ensayo homogéneo. En un ensayo convencional, el reactivo indicador no unido debe separarse del reactivo indicador unido antes de tomar cualquier medición, ya que el reactivo indicador no unido interfiere con la señal generada por el reactivo indicador unido. Sin embargo, debido a los cambios superficiales localizados proporcionados por la presente invención, se puede distinguir el reactivo indicador unido y no unido. De hecho, la capacidad de distinguir entre reactivos indicadores proximales a la superficie del sustrato 17 (es decir, unidos) y reactivos indicadores en la solución a granel (es decir, no unidos) es una ventaja particular de la presente invención. Preferiblemente, las etapas (i) a (iii) tienen lugar en ausencia de etapas de lavado, es decir, el método se lleva a cabo sin retirar la muestra del sustrato en las etapas (i), (ii) y (iii).

El fotosensibilizador de la porción de reactivo indicador ligada puede interactuar directamente con el componente óptico para provocar el cambio (por ejemplo, el fotosensibilizador se excita y transfiere esta energía directamente al componente óptico) o indirectamente con el componente óptico para provocar el cambio a través de un reactivo adicional (por ejemplo, el fotosensibilizador se excita y transfiere esta energía a un componente adicional, que luego transfiere esta energía al componente óptico).

En una realización preferida, la absorción por el fotosensibilizador es para interactuar con un reactivo preactivador presente en la mezcla para generar así un reactivo activador, y el reactivo activador es para interactuar con el componente óptico para cambiar del primer estado óptico al segundo estado óptico.

El reactivo preactivador puede estar presente en la muestra o puede agregarse a la mezcla de la muestra y el reactivo indicador como un reactivo adicional. En una realización preferida, el reactivo preactivador es oxígeno triplete. En otra realización preferida, el reactivo activador es una especie reactiva de oxígeno (ROS). Preferiblemente, el ROS se selecciona entre un radical hidroxilo, superóxido, peróxido, peróxidos orgánicos, peroxinitrito, oxígeno singlete y mezclas de los mismos. Más preferiblemente, el reactivo activador es oxígeno singlete. El oxígeno singlete es el reactivo activador preferido porque tiene una vida media corta y una longitud de trayectoria de difusión finita (hasta 200 nm en condiciones acuosas).

Aunque no se pretende limitarlo a la teoría, se considera que el fotosensibilizador absorbe la luz para generar un estado excitado que puede sufrir un cruce entre sistemas (ISC) con el oxígeno presente en la muestra y proximal al reactivo indicador para generar oxígeno singlete. Luego, el oxígeno singlete pasa a interactuar con el componente óptico como se analiza a continuación. En una realización particularmente preferida, el reactivo preactivador es oxígeno triplete y el reactivo activador es oxígeno singlete.

El oxígeno singlete se ha utilizado anteriormente en inmunoensayos en el inmunoensayo de canalización de oxígeno luminiscente (LOCI). El inmunoensayo LOCI es un ensayo homogéneo no digital que utiliza perlas donantes y aceptoras. Las perlas donantes generan oxígeno singlete al iluminarse a 680 nm, y las perlas aceptoras generan una señal quimioluminiscente cuando se activan con oxígeno singlete. La unión del donante a las perlas aceptoras se promueve mediante la unión del anticuerpo al antígeno. La mezcla de reacción normalmente se ilumina durante 0.5 a 1.0 segundos y luego se mide la señal de luminiscencia durante 0.5 a 1.0 segundos. Es fundamental que la medición se realice en presencia de todas las perlas donantes y aceptoras no unidas. La separación espacial de las perlas minimiza la señal de fondo; sin embargo, el ensayo LOCI no puede distinguir entre eventos de unión transitorios y de larga duración, debido al corto tiempo de medición. El ensayo puede alcanzar un límite de detección de alrededor de 1-5 pg/ml para sus ensayos más sensibles, por ejemplo, la interleucina 6 (IL-6) o la hormona estimulante de la tiroides (TSH). El método de la presente invención minimiza aún más la señal de fondo porque las partículas “donantes”, el reactivo indicador, deben estar cerca de la superficie del sustrato 17, en lugar de partículas en solución, para que se detecte una señal, y también deben estar allí durante todo el período de iluminación. Por lo tanto, el método de la presente invención es más sensible y puede detectar un analito en concentraciones más bajas que el ensayo LOCI.

En una realización preferida, el componente óptico es un colorante. Algunos ejemplos de colorantes incluyen:

Los colorantes (1)-(5) son conocidos y se utilizan como sondas celulares para monitorizar la formación de ROS en células bajo estrés oxidativo. Sin embargo, no se sabe si estos colorantes se utilizarán en un inmunoensayo estándar o digital. El colorante (6) es un colorante fluorescente común. Existe una amplia gama de otros colorantes fluorescentes disponibles comercialmente, incluidos los colorantes Alexafluor, los colorantes BODIPY, los colorantes rodamina, el rojo Texas, el verde Oregón, el amarillo Cascade, el azul Pacífico, etc. Para obtener más ejemplos, consulte The Molecular Probes Handbook, Thermo Fisher Scientific.

El sensor de oxígeno singlete colorante verde (SOSG) (1) reacciona con el oxígeno singlete para convertirlo de una forma débilmente fluorescente a una forma altamente fluorescente. El oxígeno singlete reacciona con el grupo antracenilo para formar un endoperóxido.

El colorante boro-dipirrometeno581/591 (BODIPY581/591) (2) reacciona con especies reactivas de oxígeno, como el oxígeno singlete y el radical hidroxilo, lo que genera un cambio hipsocrómico en los máximos de excitación/emisión de fluorescencia.

Los colorantes (3)-(5) comparten la misma estructura central y reaccionan con agentes oxidantes generales, incluido el oxígeno singlete, para convertirlos en una forma fluorescente. Por tanto, estos colorantes pueden convertirse de un estado leuco a un estado fluorescente.

Se ha descubierto que el colorante (6) reacciona con el oxígeno singlete para convertirlo de una forma fluorescente a una forma no fluorescente. Utilizando fluoresceína, se ha descubierto sorprendentemente que es posible eliminar completamente la fluorescencia en la proximidad del fotosensibilizador para crear un área oscura no fluorescente en el sustrato fluorescente. Por lo tanto, en una realización preferida, el componente óptico es fluoresceína. Más preferiblemente, el componente óptico es fluoresceína, el primer estado óptico es fluorescente y el segundo estado óptico es no fluorescente. Lo más preferible es que el componente óptico sea fluoresceína, el primer estado óptico sea fluorescente, el segundo estado óptico sea no fluorescente y el conjunto de regiones locales sean áreas oscuras no fluorescentes en el sustrato.

El componente óptico cuando está en el primer estado óptico es fluorescente y el componente óptico cuando está en el segundo estado óptico es no fluorescente.

El cambio del primer estado óptico al segundo estado óptico es irreversible. Esto permite el escaneo posterior del sustrato para identificar áreas en las que se ha producido el cambio en el estado óptico.

La etapa (iv) del método de la presente invención implica detectar el conjunto de regiones locales que tienen el segundo estado óptico en el sustrato, en donde las regiones locales que tienen el segundo estado óptico se cuentan como eventos de unión individuales.

El componente óptico que tiene el segundo estado óptico forma un conjunto de regiones locales en el sustrato. Ventajosamente, las regiones locales que tienen el segundo estado óptico se cuentan como eventos de enlace individuales. El método de la presente invención es por tanto adecuado para realizar un ensayo digital.

El conjunto de regiones locales que tienen el segundo estado óptico en el sustrato se detecta contando las regiones locales en el conjunto de regiones locales que tienen el segundo estado óptico en el sustrato.

Es posible que las regiones locales que tengan el segundo estado óptico deban estar por encima de un valor umbral correspondiente a una señal de fondo, dependiendo del primer y segundo estado óptico. Por ejemplo, la muestra puede tener cierta autofluorescencia de fondo, pero si ésta no supera el valor umbral, no debería afectar la señal debido a la naturaleza digital del ensayo.

Además, la superficie del sustrato se puede escanear para obtener una imagen 2D de la superficie antes de la irradiación del fotosensibilizador y luego escanearla después de la irradiación; de la imagen previa a la iluminación se puede restar el fondo de la imagen posterior a la iluminación para reducir la interferencia de artefactos, contaminantes y cualquier autofluorescencia en la superficie o en la muestra misma. Por lo tanto, en una realización preferida, el método de la presente invención comprende además restar cualquier componente que tenga el segundo estado óptico en el sustrato detectado antes de irradiar el dispositivo con radiación electromagnética del conjunto de regiones locales que tienen el segundo estado óptico en el sustrato detectado en la etapa (iv). De esta manera, la imagen sin fondo solo mostrará cambios en las propiedades ópticas del sustrato (por ejemplo, cambios en la intensidad de fluorescencia).

El conjunto de regiones locales que tienen el segundo estado óptico en el sustrato son típicamente áreas discretas en el sustrato. Sin embargo, algunas regiones locales pueden quedar excluidas de la detección debido a su morfología. Las regiones locales correspondientes a un evento de enlace individual tienden a ser uniformes y circulares, pero algunas regiones locales pueden tener una forma irregular, lo que corresponde a artefactos. Además, algunas regiones locales pueden ser más grandes que otras donde las partículas se han agrupado. Por lo tanto, en una realización preferida, sólo se detectan regiones locales circulares uniformes que tienen el segundo estado óptico en el sustrato.

El conjunto de regiones locales del sustrato se puede detectar utilizando medios ópticos simples. En una realización preferida, el conjunto de regiones locales que tienen el segundo estado óptico en el sustrato se detecta utilizando microscopía óptica. En la figura 9 se muestra una configuración óptica adecuada para la detección. Más preferiblemente, el conjunto de regiones locales que tienen el segundo estado óptico en el sustrato se detecta utilizando microscopía de campo amplio. La microscopía de campo amplio es la forma más simple de microscopía, en la que se ilumina y se captura la imagen de toda la muestra al mismo tiempo, en comparación con técnicas más complejas como la microscopía confocal, en la que solo se ilumina y registra un único punto focal a la vez. Los beneficios de la microscopía confocal son el aumento del contraste mediante la eliminación de la neblina fuera de foco y la capacidad de tomar una pila de imágenes a través de la profundidad de la muestra. También se conocen técnicas de microscopía de superresolución, como la microscopía de localización fotoactivada (PALM o FPALM) y la microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM). Estos métodos tienen mayor complejidad y coste que los métodos simples de campo amplio.

Si se utiliza el colorante (6), se pueden observar manchas oscuras (o, si hay una gran cantidad de eventos de enlace, una imagen oscura) en la superficie del sustrato donde el componente óptico se ha convertido al segundo estado óptico. Para detectar estas manchas oscuras o imagen, se puede utilizar un microscopio fluorescente de campo amplio con una fuente de luz (por ejemplo, un LED) y un fotodetector (por ejemplo un tubo fotomultiplicador o una cámara, como una CCD), utilizando filtros de excitación y emisión adecuados para la detección de fluoresceína (por ejemplo excitación a 490 nm y emisión a 520 nm).

El fotosensibilizador está próximo al sustrato cuando se produce el evento de unión. Es decir, el fotosensibilizador está lo suficientemente cerca de la superficie del sustrato para interactuar con el componente óptico y convertirlo del primer estado óptico al segundo estado óptico al irradiar el dispositivo. Sin embargo, la distancia real entre el fotosensibilizador y la superficie del sustrato dependerá de una serie de variables, como el tamaño y la naturaleza del fotosensibilizador, el tamaño y la naturaleza del componente de unión, el reactivo indicador y el analito, y la naturaleza del medio de muestra.

El componente de unión tiene un sitio de unión que es capaz de unirse a un reactivo indicador proporcionalmente a la concentración del analito en la muestra. La proporcionalidad es importante para el funcionamiento del ensayo ya que la unión debe depender de la concentración del analito para que se pueda determinar cualquier medida significativa de la concentración del analito. La unión puede ser directamente proporcional o indirectamente proporcional a la concentración del analito dependiendo del tipo de ensayo que se esté realizando. En el caso de un ensayo no competitivo, por ejemplo un ensayo inmunométrico, la unión es directamente proporcional a la concentración del analito, pero en un ensayo competitivo, la unión es indirectamente proporcional a la concentración del analito.

Se presenta un tipo particular de ensayo competitivo en el que un anticuerpo contra el analito se inmoviliza en el sustrato y se introduce un análogo marcado del analito en la muestra. Luego, el analito y el análogo marcado del analito “compiten” por el anticuerpo en la superficie. En ausencia de analito, el análogo marcado se unirá a la velocidad máxima posible. Sin embargo, en presencia de analito, el anticuerpo en el sustrato se puebla con analito y la tasa de unión del análogo disminuye.

El componente de unión puede estar adaptado para unirse al analito, o a un complejo o derivado del analito, en cuyo caso el reactivo informador se unirá al componente de unión en presencia del analito, o del complejo o derivado del analito. En este caso, el componente de unión tiene un sitio de unión que es capaz de unirse al reactivo indicador en presencia del analito o del complejo o derivado del analito. Sin embargo, la unión sigue siendo proporcional a la concentración del analito.

Como alternativa, el componente de unión puede ser en sí mismo un análogo del analito y el reactivo indicador se une directamente al componente de unión (es un análogo porque está unido a la superficie del sustrato ya sea a través de enlaces covalentes o interacciones no covalentes). En este caso, el componente de unión competirá con el analito no unido, o con un complejo o derivado no unido del analito, por la unión del reactivo indicador. De acuerdo con lo anterior, el componente de unión simplemente será capaz de unirse al reactivo indicador.

La determinación del grado de unión del reactivo indicador al componente de unión (ya sea directamente o mediada por el analito/complejo o derivado del analito) proporciona una medición de la concentración del analito en la muestra.

El ensayo también requiere la presencia de un reactivo indicador. El reactivo indicador comprende un fotosensibilizador. El fotosensibilizador es capaz de absorber la radiación electromagnética para interactuar con el componente óptico. Es esta interacción la que hace que el componente óptico cambie del primer estado óptico al segundo estado óptico.

Por tanto, el fotosensibilizador puede estar compuesto de cualquier material que sea capaz de interactuar con la radiación electromagnética de esta manera. Los fotosensibilizadores adecuados se conocen para la terapia fotodinámica (PDT) como reactivos PDT. Los reactivos PDT se utilizan en la terapia del cáncer y en la dermatología para destruir las células mediante la iluminación (Shafirstein et al, Cancers, 2017, 9, 12; Wan and Lin, Clinical, Cosmetic and Investigational Dermatology, 2014, 7, 145).

Tras la irradiación con radiación electromagnética, los reactivos PDT pasan a un estado triplete excitado. Este estado triplete excitado puede interactuar directamente con los componentes celulares, en lo que se denomina un proceso Tipo I, o puede interactuar con el oxígeno en lo que se denomina un proceso Tipo II. Tanto los procesos de tipo I como los de tipo II pueden conducir a la formación de ROS. En el proceso Tipo II, el producto predominante es el oxígeno singlete, a través de un mecanismo de cruce intersistema.

El oxígeno singlete es un estado excitado del oxígeno que es altamente reactivo. Puede sufrir una serie de reacciones antes de desintegrarse, incluidas reacciones de tipo Diels-Alder y reacciones eno. También sufre reacciones de oxidación general con compuestos que contienen azufre y nitrógeno. La reactividad indiscriminada del oxígeno singlete es una de las razones por las que se utiliza en la terapia fotodinámica.

Se conoce una amplia gama de compuestos fotosensibilizadores, incluidas porfirinas, clorinas (por ejemplo, pirofeoforbida-a), ftalocianinas y otras especies poliaromáticas (ver, por ejemplo, Antibody-Directed Phototherapy, Pye et al, Antibodies, 2013, 2, 270).

En una realización, el fotosensibilizador se selecciona entre porfirinas, clorinas, ftalocianinas y otras especies poliaromáticas. En una realización preferida, el fotosensibilizador es pirofeoforbida-a (PPa). PPa tiene la siguiente estructura:

Pirofeofórbido-a (PPa)

Se pueden utilizar otros fotosensibilizadores que catalicen reacciones sin generar ROS. Estos incluyen Ru(II)-tris dicloruro de (2,2'-bipiridilos), que cataliza la reducción de diclorodifeniltricloroetano en presencia de un agente reductor; benzofenona/eosina, que cataliza la cis-trans isomerización de estilbeno y clorofila, que cataliza la reacción del dióxido de carbono con agua para generar carbohidratos. También se conocen fotosensibilizadores que pueden catalizar reacciones de polimerización, lo que también podría provocar cambios en las propiedades ópticas del sustrato. Véase, por ejemplo, Dyes as Photoinitiators or Photosensitisers of Polymerisation Reactions, Fouassier et al, Materials, 2010, 3, 5130.

La naturaleza del componente de unión y del reactivo indicador dependerán de la naturaleza del analito, pero preferiblemente son anticuerpos. El método de la presente invención tiene aplicabilidad particular en inmunoensayos. En una realización particularmente preferida, el componente de unión es un anticuerpo generado contra el analito o el complejo o derivado del analito, y el reactivo indicador comprende un anticuerpo generado contra el analito o el complejo o derivado del analito. En principio, se podría utilizar una única molécula para cada reactivo, pero en la práctica, el componente de unión y el reactivo indicador son una población de moléculas. El término “anticuerpo” incluye preferiblemente dentro de su alcance un fragmento Fab, un fragmento variable de cadena única (scFv) y un fragmento de unión recombinante.

Como alternativas a las reacciones anticuerpo-antígeno, el componente de unión, el reactivo indicador y el analito pueden ser un primer y un segundo ácido nucleico donde los primeros y segundos ácidos nucleicos son complementarios, o un reactivo que contiene avidina o derivados de la misma y un analito que contiene biotina o derivados de la misma, o viceversa. El componente de unión y el reactivo indicador también pueden ser aptámeros. El sistema tampoco se limita a los ensayos biológicos y puede aplicarse, por ejemplo, a la detección de metales pesados en agua. El sistema tampoco necesita limitarse a líquidos y se puede utilizar cualquier sistema de fluidos, por ejemplo, la detección de enzimas, células y virus, etc. en el aire.

La señal máxima observable es la señal máxima que se puede lograr al monitorizar la unión del fotosensibilizador a una superficie. La unión de las partículas al sustrato está determinada por la velocidad de difusión del analito y del reactivo indicador, que, a su vez, está determinada en gran medida por el radio hidrodinámico de estos componentes y la viscosidad/temperatura de la muestra.

El dispositivo utilizado en el método de la presente invención puede comprender además controles que compensen la variabilidad natural en los componentes del sistema de medición, la variabilidad en las muestras que se miden y la variabilidad en las condiciones ambientales durante la medición. Esto se puede lograr exponiendo la muestra a reactivos en la superficie del sustrato. Los diferentes reactivos normalmente se ubican en diferentes áreas de la superficie del sustrato, y estas áreas están recubiertas con diferentes reactivos. Estos controles se definen como controles “negativos” y “positivos”, en el sentido de que el control negativo debe aproximarse a la señal esperada en ausencia de analito, y el control positivo debe aproximarse a la señal esperada cuando el analito ha saturado el sistema.

Para lograr la detección con estos controles, el dispositivo de la presente invención comprende preferiblemente un componente de unión, un reactivo de control negativo y un reactivo de control positivo, cada uno de los cuales está unido a la superficie del sustrato como se describió anteriormente.

El componente de enlace es como se describe arriba.

El reactivo de control negativo tiene una menor afinidad por el reactivo indicador en las condiciones del ensayo que el componente de unión. De acuerdo con lo anterior, el reactivo de control negativo proporciona el control negativo. Es importante que se considere la afinidad en las condiciones del ensayo. La razón es que en el caso de un ensayo no competitivo, la afinidad del componente de unión por el reactivo indicador está mediada por la presencia del analito, o del complejo o derivado del analito. Por lo tanto, en ausencia del analito, o del complejo o derivado del analito, ni el componente de unión ni el reactivo de control negativo tienen afinidad por el reactivo indicador. Sin embargo, en presencia del analito, o del complejo o derivado del analito, el reactivo de control negativo tiene una menor afinidad por el reactivo indicador que el componente de unión.

Además, en las realizaciones en las que el componente de unión se une al analito, o al complejo o derivado del analito, el reactivo de control negativo preferiblemente tiene una afinidad menor por el analito o, si se utiliza, el complejo o derivado del analito que el componente de unión. El reactivo de control negativo es preferiblemente una proteína y más preferiblemente un anticuerpo. El reactivo de control negativo generalmente tiene propiedades químicas y físicas similares al componente de unión, pero proporciona poca o ninguna afinidad por el reactivo indicador en las condiciones del ensayo. En una realización particularmente preferida, el reactivo de control negativo esencialmente no tiene afinidad por el reactivo indicador en las condiciones del ensayo. Preferiblemente, el reactivo de control negativo esencialmente no proporciona afinidad por el analito o el complejo o derivado del analito. Es decir, la unión del reactivo indicador, o, cuando corresponda, del analito o del complejo o derivado del analito, al reactivo de control negativo no es específica. De esta manera, el reactivo de control negativo puede compensar la unión no específica del reactivo indicador al componente de unión.

El reactivo de control positivo se une al reactivo indicador y tiene una afinidad por el reactivo indicador que está menos influenciada por la concentración en la muestra del analito o, si se utiliza, el complejo o derivado del analito que el componente de unión y, por lo tanto, proporciona el control positivo. Preferiblemente, el reactivo de control positivo tiene una afinidad por el reactivo indicador que es esencialmente independiente de la concentración del analito o del complejo o derivado del analito. Más preferiblemente, el reactivo de control positivo tiene una mayor afinidad por el reactivo indicador en las condiciones del ensayo que el componente de unión. De esta manera, el reactivo de control positivo mide la señal máxima esperada en el sistema.

Para aumentar el rango dinámico de un ensayo realizado de acuerdo con la presente invención, mejorando al mismo tiempo la precisión, se prefiere tener el componente de unión en una pluralidad de ubicaciones en el sustrato. Estas ubicaciones se pueden ajustar a diferentes sensibilidades, variando la concentración del componente de unión en cada ubicación. Cada ubicación también puede tener sus propios reactivos de control negativo y control positivo para actuar como controles para los diferentes rangos dinámicos. Esto es particularmente aplicable a los ensayos competitivos que son particularmente sensibles a la concentración de cada uno de los componentes individuales que forman el sistema.

Aunque la descripción anterior permite que el ensayo alcance un equilibrio antes de activar el fotosensibilizador, también es posible que la cinética de los eventos de unión se pueda monitorizar iluminando el fotosensibilizador durante períodos de tiempo discretos a lo largo de un período de tiempo y monitorizando los eventos de unión a medida que ocurren en el curso de la reacción, antes de que se alcance el equilibrio.

El analito puede ser una macromolécula o una molécula pequeña. La macromolécula suele ser una proteína, como una hormona proteica, y también puede formar parte de una partícula más grande, como un virus, una bacteria, una célula (por ejemplo, un glóbulo rojo) o un prión. La pequeña molécula podría ser un fármaco.

El término “molécula pequeña” utilizado en este documento es un término de la técnica y se utiliza para distinguir la molécula de macromoléculas como proteínas y ácidos nucleicos. En el campo de los inmunoensayos, a menudo se hace referencia a una molécula pequeña como “hapteno”, que es una molécula pequeña que, cuando se une a una molécula transportadora grande como una proteína, puede provocar una respuesta inmunitaria e incluye moléculas como hormonas y fármacos sintéticos. Una molécula pequeña de este tipo normalmente tendrá un peso molecular de 2.000 o menos, a menudo 1.000 o menos e incluso 500 o menos. El componente de unión puede adaptarse para unirse al propio analito, aunque el analito puede sufrir una reacción química o un evento de formación de complejos inicial antes de unirse al componente de unión. Por ejemplo, el analito podría estar protonado/desprotonado en el pH de las condiciones del ensayo. De este modo, el analito que está unido al componente de unión puede ser el propio analito o un derivado del analito; ambos están incluidos dentro del alcance de la presente invención.

En una realización preferida, la presente invención puede utilizarse para detectar la presencia de múltiples analitos en la misma muestra al mismo tiempo. Se podrían utilizar diferentes componentes de unión en diferentes ubicaciones del sustrato para la medición de cada analito. Los ensayos sándwich y competitivos se pueden ejecutar en paralelo y los ensayos pueden utilizar los mismos controles negativos y positivos que se describieron anteriormente, o puede haber controles separados para cada analito que se mide.

La muestra que se sospecha que contiene el analito de interés generalmente será una muestra de fluido, por ejemplo una muestra líquida, y normalmente una muestra biológica, como un fluido corporal, por ejemplo sangre, plasma, saliva, suero, líquido intraocular, líquido cefalorraquídeo u orina. La muestra puede contener partículas suspendidas e incluso ser sangre completa. En una realización preferida, la muestra no está procesada y, más preferiblemente, es un fluido sin procesar. Por no procesado se entiende que la muestra/fluido no ha sido tratado previamente mediante filtración, dilución o cualquier otra etapa de preprocesamiento antes de ser mezclado con el reactivo indicador y otros componentes del ensayo. Una ventaja del método de la presente invención es que el ensayo puede realizarse en una muestra que contiene partículas suspendidas sin influir indebidamente en los resultados del ensayo.

En una realización preferida, la muestra es sangre completa. Es sorprendente que los componentes de la sangre entera no interfieran con el método de detección de la presente invención. Es habitual extraer los glóbulos rojos de la sangre para medir la fluorescencia en el componente plasmático o sérico de la sangre debido a la dispersión impredecible de la luz por parte de los componentes celulares, que varía de una muestra a otra. Sin embargo, en el método de la presente invención, debido a que la fluorescencia se mediría en el sustrato y debido a que se pueden medir eventos de unión individuales, la medición puede tener lugar en sangre completa.

La muestra normalmente será del orden de microlitros (por ejemplo, 1-100 jl, preferiblemente 1-10 jl). Para contener una muestra de fluido, el sustrato se ubica en una cámara que tiene una o más paredes laterales, una superficie superior y una superficie inferior. Por consiguiente, el dispositivo utilizado en el método de la presente invención comprende además una cámara para mantener la muestra que contiene el analito en contacto con el sustrato.

Una posible fuente adicional de interferencia de fondo es la sedimentación de partículas suspendidas en la superficie del sustrato, incluido el reactivo indicador y los componentes celulares de la muestra. Esta fuente de interferencia se reduce colocando el sustrato encima de la solución a granel en la superficie superior de la cámara. De esta forma, si se produjera algún asentamiento, éste no interferiría con el sustrato. El sustrato forma la superficie superior como se muestra en las figuras. Claramente, los componentes ópticos y de unión estarán en las superficies interiores de la cámara para permitir el contacto con la muestra.

La muestra puede simplemente quedar retenida por fuerzas de tensión superficial, por ejemplo, dentro de un canal capilar.

El reactivo indicador y opcionalmente uno o más reactivos adicionales se almacenan preferiblemente en una cámara incorporada al dispositivo utilizado en el método de la presente invención.

El método de la presente invención es especialmente útil en pruebas en el punto de atención (POC). Las pruebas POC se definen como pruebas de diagnóstico en el punto de atención o cerca del mismo, es decir, pruebas junto a la cama del paciente. Las pruebas POC permiten realizar pruebas rápidas y convenientes, lo que permite una mejor toma de decisiones y clasificación, al tiempo que asigna mejor los recursos hospitalarios, como atención de accidentes y emergencias y camas de hospital. Esto contrasta con las pruebas tradicionales en las que se tomaban muestras en el punto de atención y luego se enviaban al laboratorio para su análisis. Con este tipo de pruebas, a menudo se necesitan horas o días para obtener los resultados, tiempo durante el cual la atención debe continuar sin la información deseada. Las pruebas POC a menudo utilizan kits de prueba en combinación con instrumentos portátiles.

El método de la presente invención es especialmente útil para monitorizar la concentración o presencia/ausencia de analitos que normalmente se encuentran en abundancia muy baja. Las posibles aplicaciones incluyen la medición de biomarcadores en enfermedades cardíacas (por ejemplo, troponina de alta sensibilidad), enfermedades infecciosas (por ejemplo, antígeno central del virus de la hepatitis C), envejecimiento/demencia (por ejemplo, marcadores de la enfermedad de Alzheimer, beta amiloide y tau), citocinas y oncología (por ejemplo, marcadores tumorales circulantes).

Se puede proporcionar un dispositivo, que no está abarcado por el texto de las reivindicaciones pero que se considera útil para comprender la invención, para detectar un analito en una muestra, el dispositivo comprende: un sustrato que tiene un componente óptico y un componente de unión unido a una superficie del sustrato, siendo capaz el componente óptico de cambiar de un primer estado óptico a un segundo estado óptico, en respuesta a la interacción con fotosensibilizadores irradiados de reactivos indicadores unidos a la superficie del sustrato en proporción a la concentración de analito en la muestra, para formar de este modo un conjunto de regiones locales del componente óptico que tiene el segundo estado óptico sobre el sustrato.

Las características del dispositivo son las descritas anteriormente para el dispositivo utilizado en el método de la presente invención.

El dispositivo puede comprender además una cámara para contener una mezcla de la muestra y el reactivo indicador.

El dispositivo puede incluir una fuente de radiación que está adaptada para generar radiación electromagnética y un detector que está adaptado para detectar el componente óptico en el segundo estado óptico, permitiendo así una determinación precisa de la posición del fotosensibilizador con respecto al sustrato.

El dispositivo puede adoptar la forma de un cartucho para ser utilizado con un lector separado. El lector puede incorporar la fuente de radiación y el detector. El lector puede ser un lector portátil. El dispositivo puede comprender un cartucho, en el que el sustrato está dentro del cartucho, y en el que el dispositivo comprende además un detector para detectar el conjunto de regiones locales que tienen el segundo estado óptico en el sustrato. El cartucho también puede proporcionarse con el sustrato y los componentes ópticos y de unión tal como se define en este documento. El cartucho puede ser un cartucho desechable.

Se puede proporcionar un sistema, que no está abarcado por el texto de las reivindicaciones pero que se considera útil para comprender la invención, para detectar un analito en una muestra, que comprende: el dispositivo; y el reactivo informador para formar una mezcla que comprende la muestra, el reactivo informador comprende el fotosensibilizador, en el que el fotosensibilizador es capaz de absorber radiación electromagnética para interactuar con el componente óptico para cambiar el componente óptico del primer estado óptico al segundo estado óptico.

El fotosensibilizador puede ser capaz de absorber radiación electromagnética para interactuar con un reactivo preactivador presente en la mezcla para generar un reactivo activador, y el reactivo activador es capaz de interactuar con el componente óptico para cambiar el componente óptico del primer estado óptico al segundo estado óptico.

El sistema puede constar esencialmente de las características descritas anteriormente. Por “esencialmente” se entiende que no se requieren otras características para realizar el ensayo.

La presente invención se describirá ahora con referencia a los siguientes ejemplos que no pretenden ser limitativos.

Ejemplos

La BSA biotinilada se preparó de acuerdo con técnicas conocidas en la materia. Las perlas donantes Alphascreen con fotosensibilizador de oxígeno singlete encapsulado se obtuvieron de Perkin Elmer.

Ejemplo 1

Conjugado de aminodextrano-biotina-fluoresceína de 70 kD

Se pesaron 10 mg de aminodextrano (70 kD) en un vial de vidrio y se completó hasta 2 mg/ml en tampón de fosfato de potasio 100 mM. Se dispensaron 250 pl de esta solución en un criotubo de 2 ml. Se preparó una solución de éster de biotina-N-hidroxi succinimida (NHS) de 4 mg/ml en DMSO y se agregaron 16.2 pl de ésta al criotubo. La muestra se mezcló en un rodillo a 20 °C durante 30 minutos, mientras tanto se preparó una solución de éster de fluoresceína-NHS de 20 mg/ml en DMSO.

Tras la reacción de 30 minutos con el éster de biotina-NHS, se añadieron 8.5 pl de la solución de éster de fluoresceína-NHS de 20 mg/ml y se agitó en un rodillo durante 60 minutos más a 20 °C. La reacción se extinguió añadiendo 11.3 pl de una solución de glicina de 10 mg/ml y se agitó en un rodillo durante 20 minutos a 20 °C. La muestra se desalinizó en tampón de fosfato 50 mM utilizando una columna Sephadex G-25 PD10. La absorbancia se midió a 280 nm y 495 nm utilizando un espectrofotómetro Nanodrop2000 para determinar la concentración y la incorporación de fluoresceína. Luego, la muestra se filtró a 0.2 pm utilizando un filtro Minisart (Sartorius). Las incorporaciones calculadas de biotina y fluoresceína fueron 1.2 y 4.3 respectivamente.

Ejemplo 2

Estreptavidina polimerizada (poliestreptavidina)

La estreptavidina polimerizada se preparó de acuerdo con técnicas conocidas en la técnica. En resumen, una alícuota de estreptavidina (1 mg/ml) se activó con 9.7 equivalentes molares de SMCC (4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato de N-succinimidilo) durante una hora, luego la reacción se extinguió con glicina y el producto se desalinizó en una columna de exclusión por tamaño PD10. Paralelamente, se hizo reaccionar una alícuota separada de estreptavidina con 9.7 equivalentes molares de SATA (N-succinimidil-s-acetil-tioacetato) durante una hora, luego se desalinizó con hidroxilamina y se purificó en una columna de exclusión por tamaño PD10.

La SATA-estreptavidina y la SMCC-estreptavidina se combinaron en una proporción molar de 3:2 durante 30 minutos, luego se agregó NEM (N-etil maleimida) para detener la reacción. Luego, el producto se purificó en una columna Sephadex G25 para obtener estreptavidina polimerizada. La concentración del producto se midió mediante espectroscopia UV-vis y se ajustó a 1.0 mg/ml. No se realizó ninguna caracterización adicional.

Ejemplo 3

Preparación de la superficie del sustrato 1

Un trozo cuadrado de adhesivo sensible a la presión 19 de 1 cm por 1 cm y 200 pm de espesor con un orificio de 6 mm de diámetro fue fijado a un cubreobjetos de vidrio 20 de 22 mm por 22 mm (Brand, número de catálogo 4700 55), para crear un pocillo poco profundo 21.

Luego se colocaron 30 |jl de BSA biotinilada (10 |jg/ml en tampón de fosfato 40 mM) en este pocilio y se incubó durante dos horas, antes de lavarlo con tampón de lavado (fosfato 40 mM, sacarosa 2 %, NaCl 0.9 %, BSA 0.03 %). Luego se agregaron 30 j l de poliestreptavidina (10 jg/m l en tampón de fosfato 40 mM) al pocillo y se incubó durante 60 minutos, antes de lavarlo tres veces con tampón de lavado. Luego se incubaron 30 j l de conjugado de aminodextrano-biotina-fluoresceína de 70 kD (10 jg/m l en tampón fosfato 40 mM) durante 30 minutos, luego se lavaron tres veces con tampón de lavado y se secaron al aire a temperatura ambiente.

Ejemplo 4

Unión de perlas de estreptavidina a la superficie

Las perlas donantes Alphascreen revestidas con estreptavidina (número de catálogo de Perkin Elmer 6760002S, 5 mg/ml) se diluyeron 1/1000 en un tampón de fosfato de 40 mM, luego se agregaron 20 j l de esta solución al sustrato del Ejemplo 3 y se incubaron durante dos horas, antes de lavarlas tres veces con tampón de lavado y secarlas. Esto se llevó a cabo en condiciones de poca iluminación con filtros verdes sobre las luminarias. Las perlas recubiertas de estreptavidina se unen a los grupos de biotina libres en el conjugado aminodextrano-biotina-fluoresceína, como se muestra en la Figura 2.

Ejemplo 5

Generación de puntos no fluorescentes en la capa fluorescente

20 j l de H2 se añadió O al sustrato y se iluminó la superficie total a 680 nm utilizando un LED rojo que proporcionó una salida de luz total de 15 mW, correspondiente a aproximadamente 0.5 mW/mm2 del flujo de luz en la superficie, como se muestra en la Figura 3. Después de cinco minutos de iluminación, se retiró el líquido y se secó la superficie. Luego, el sustrato se invirtió y se fijó a la parte superior de un portaobjetos de vidrio como el que se muestra en la Fig. 11, y luego se fotografió en un microscopio fluorescente de campo amplio Leica<d>M<r>con una fuente de iluminación CoolLED pE-300 y una cámara digital Leica DFC9000GT (2048 x 2048 píxeles), utilizando una lente de inmersión en aceite de 100x y un equipo de fluoresceína. La Fig. 9 ilustra la configuración óptica.

La Fig. 4 ilustra cómo las moléculas de colorante en el aminodextrano que están en estrecha proximidad a la perla unida se han convertido de su forma fluorescente 14 a su forma no fluorescente 15 debido al flujo de oxígeno singlete generado por la perla 3 tras la iluminación a 680 nm, como se describió anteriormente.

La Fig. 12 es una imagen de parte de la superficie del sustrato tomada por la cámara del microscopio. Se pueden observar áreas con manchas oscuras discretas en el lugar donde se han unido las cuentas. Hay algunos puntos más grandes donde las cuentas se han agrupado. Sin embargo, los puntos más pequeños y uniformes se pueden distinguir claramente como eventos de unión individuales debido a que las perlas se mantienen cerca de la superficie durante el período de iluminación de cinco minutos.

Ejemplo 6

Se preparó la superficie del sustrato y se unieron las perlas a la superficie como se describe en los Ejemplos 3 y 4 anteriores. Luego se agregaron 20 j l de plasma humano a la superficie y la excitación y la obtención de imágenes de las perlas se llevaron a cabo como se describe en el Ejemplo 5 anterior. En la Figura 13 se muestra una imagen de una parte de la superficie del sustrato tomada con una cámara de microscopio. Se observan áreas oscuras discretas en la superficie del sustrato, correspondientes a perlas unidas individualmente, lo que demuestra que los componentes del plasma humano no impiden ni extinguen la reacción del oxígeno singlete con el colorante activo durante la etapa de iluminación.

Ejemplo 7

Se preparó la superficie del sustrato y se unieron las perlas a la superficie como se describe en los Ejemplos 3 y 4 anteriores. Luego se agregaron 20 j l de sangre humana fresca a la superficie y se llevó a cabo la excitación y la obtención de imágenes de las perlas como se describe en el Ejemplo 5 anterior. En la Figura 14 se muestra una imagen de una parte de la superficie del sustrato tomada con una cámara de microscopio. Se observan áreas oscuras discretas en la superficie del sustrato, correspondientes a perlas unidas individualmente, lo que demuestra que los componentes celulares de la sangre humana no impiden ni extinguen la reacción del oxígeno singlete con el colorante activo durante la etapa de iluminación.

Ejemplo 8

Conjugado de poliestreptavidina con sensor de oxígeno singlete verde (SOSG)

Se sacan del congelador seis viales de sensor de oxígeno singlete verde (Thermo Fisher, número de catálogo S36002, 100 jg por vial) y se descongelan a temperatura ambiente durante 30 minutos. Luego se reconstituyen en metanol y se agrupan para obtener un volumen total de 200 jl. El SOSG se activa añadiendo 19.1 j l de N-hidroxisuccinimida (6 mg/ml en tampón MES 25 mM), luego 31.9 j l de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (6 mg/ml en tampón MES 25 mM) y mezclando la solución en un rodillo a 20 °C durante 15 minutos. Se dispensa 1 ml de una solución de poliestreptavidina de 1 mg/ml (en tampón fosfato 100 mM) en un criotubo.

Después de 15 minutos de incubación, se añaden 90.7 j l de SOSG activado y la muestra se mezcla en un rodillo a 20 °C durante aproximadamente 65 horas. Luego, la muestra se desaliniza en un tampón de fosfato de 50 mM utilizando una columna Sephadex G-25 PD10. La absorbancia se mide a 280 nm y 520 nm utilizando un espectrofotómetro Nanodrop2000 para determinar la concentración y la incorporación de SOSG. Se añaden 25 j l de Proclin 950 a la muestra y luego se filtra a 0.2 jm utilizando un filtro Minisart. Se calcula que la incorporación de SOSG es de 1.8 moles por mol de monómero de estreptavidina.

Ejemplo 11

Preparación de la superficie del sustrato 2

Un trozo cuadrado de adhesivo sensible a la presión 19 de 1 cm por 1 cm y 200 jm de espesor con un orificio de 6 mm de diámetro se fija a un cubreobjetos de vidrio 20 de 22 mm por 22 mm (Brand GMBH, número de catálogo 470055), para crear un pocillo poco profundo 21 como se muestra en la Fig. 10.

Luego se colocan 30 j l de BSA biotinilada (10 jg/m l en tampón de fosfato 40 mM) en este pocillo y se incuba durante dos horas, antes de lavarlo con tampón de lavado (fosfato 40 mM, sacarosa 2 %, NaCl 0.9 %, BSA 0.03 %). Luego se agregan 30 j l de conjugado de poliestreptavidina-SOSG (10 jg/m l en tampón de fosfato 40 mM) al pocillo y se incuba durante 60 minutos, antes de lavarlo tres veces con tampón de lavado. A continuación, se incuban 30 j l del anticuerpo anti-TSH biotinilado 5409 (que reconoce la unión entre las subunidades alfa y beta de la TSH, con una constante de disociación de 50 pM) (2 jg/m l en tampón fosfato 40 mM), durante 30 minutos, después se lava tres veces con tampón de lavado y se seca al aire a temperatura ambiente.

Ejemplo 12

Preparación de pirofeoforbida, un conjugado del anticuerpo anti-TSH 5407

El anticuerpo 5407 (que reconoce la subunidad beta de TSH, con una constante de disociación de 180 pM) proviene de Medix Biochemica y la pirofeoforbida-a (PPa) proviene de Frontier Scientific (Logan, Utah). El PPa se convierte en el éster succinimidílico y se acopla al anticuerpo utilizando técnicas descritas en “Targeted photodynamic therapy with multiply-loaded recombinant antibody fragments, Bhatti et al, Int. J. Cancer, 2008, 122, 1155.” La incorporación molar de PPa se calcula como 3.5 por mol de anticuerpo.

Ejemplo de referencia 13

Generación de puntos fluorescentes discretos

Se invierte la superficie del sustrato 17 y se retira el revestimiento de liberación adhesiva, luego el sustrato se adhiere a una lámina de acrílico 22 con dos pequeños orificios 23 a cada lado del pocillo del sustrato, como se muestra en el perfil en la Fig. 11.

Se preparan mezclas de reacción que contienen sangre completa libre de TSH adicionada con el conjugado de anticuerpo 5407-PPa (10 ng/ml) y TSH en un rango de concentraciones mediante dilución en serie (1 nm, 100 pM, 10 pM, 1 pM, 100 fM, 10 fM). Las mezclas (aproximadamente 6 j l ) se transfieren al sustrato mediante una pipeta a través de uno de los orificios 23, luego los orificios 23 se sellan con grasa.

La cámara se incuba en la oscuridad durante 10 minutos y luego se ilumina a 680 nm utilizando un LED rojo con una salida de luz total de 15 mW Después de dos minutos de iluminación, se toma una imagen de la superficie del sustrato utilizando la configuración óptica que se muestra en la Fig. 9 y se describió anteriormente. Se pueden observar áreas discretas de fluorescencia donde el PPa ha estado unido a la superficie del sustrato durante los dos minutos completos. La TSH se puede cuantificar como la señal de fondo anterior a una concentración estimada de 50 femtomolar (tres veces la desviación estándar de los recuentos puntuales en muestras de analito cero).

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Un método para detectar un analito en una muestra, el método comprende las etapas de:

(i) proporcionar una mezcla que comprende una muestra de fluido y un reactivo indicador a un dispositivo, el dispositivo comprende un sustrato que tiene un componente óptico y un componente de unión unido a una superficie del sustrato,

en el que el sustrato está ubicado en una cámara que tiene una o más paredes laterales, una superficie superior y una superficie inferior,

en el que la cámara contiene la muestra, y la muestra que contiene el analito está en contacto con el sustrato, y

en el que el sustrato se coloca encima de la solución a granel en la superficie superior de la cámara, con los componentes ópticos y de unión en la superficie interior de la cámara en contacto con la muestra;

(ii) permitir que una proporción del reactivo indicador se una a la superficie del sustrato en proporción a la concentración del analito, por medio del componente de unión;

(iii) irradiar el dispositivo con radiación electromagnética para su absorción por un fotosensibilizador del reactivo indicador, de modo que el fotosensibilizador de la porción de reactivo indicador unida interactúe con el componente óptico para hacer que el componente óptico cambie de un primer estado óptico a un segundo estado óptico, formando así un conjunto de regiones locales del componente óptico que tienen el segundo estado óptico sobre el sustrato,

en el que el componente óptico cuando está en el primer estado óptico es fluorescente y el componente óptico cuando está en el segundo estado óptico es no fluorescente, y

en el que el cambio del primer estado óptico al segundo estado óptico es irreversible; y

(iv) detectar el conjunto de regiones locales que tienen el segundo estado óptico en el sustrato, en el que las regiones locales que tienen el segundo estado óptico se cuentan como eventos de unión individuales.

2. Un método como se reivindica en la reivindicación 1, en el que la absorción por el fotosensibilizador es para la interacción con un reactivo preactivador presente en la mezcla para generar de este modo un reactivo activador, y el reactivo activador es para la interacción con el componente óptico para cambiar del primer estado óptico al segundo estado óptico.

3. Un método como se reivindica en la reivindicación 2, en el que el reactivo activador es una especie reactiva de oxígeno.

4. Un método como se reivindica en la reivindicación 3, en el que la especie reactiva de oxígeno es oxígeno singlete.

5. Un método como se reivindica en cualquier reivindicación anterior, en el que el conjunto de regiones locales que tienen el segundo estado óptico en el sustrato se detecta utilizando microscopía óptica.

6. Un método como se reivindica en cualquier reivindicación anterior, en el que las etapas (i) a (iii) tienen lugar en ausencia de etapas de lavado.

7. Un método como se reivindica en cualquier reivindicación anterior, en el que la muestra no está procesada.

8. Un método como se reivindica en cualquier reivindicación anterior, en el que el dispositivo se irradia con radiación electromagnética durante más de 1 segundo.