ES3032134T3 - Stable pseudotyped lentiviral particles and uses thereof - Google Patents

Stable pseudotyped lentiviral particles and uses thereof

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ES3032134T3
ES3032134T3 ES17720405T ES17720405T ES3032134T3 ES 3032134 T3 ES3032134 T3 ES 3032134T3 ES 17720405 T ES17720405 T ES 17720405T ES 17720405 T ES17720405 T ES 17720405T ES 3032134 T3 ES3032134 T3 ES 3032134T3
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Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
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Universite D'Evry Val D'Essonne
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Abstract

La presente invención se refiere a un método para obtener partículas lentivirales pseudotipadas estables que incluyen un gen heterólogo de interés. Este método comprende los siguientes pasos: a) transfectar al menos un plásmido en líneas celulares apropiadas, donde dicho plásmido comprende el gen de interés, los genes rev, gag y pol, y una secuencia que codifica una sincitina de ERV, donde los genes rev, gag y pol son genes retrovirales; b) incubar las células transfectadas obtenidas en a), para que produzcan las partículas lentivirales pseudotipadas estables en el sobrenadante; y c) recolectar y concentrar las partículas lentivirales estables obtenidas en b). La presente invención también se refiere a un método para transducir células inmunitarias utilizando vectores lentivirales pseudotipados con una glicoproteína sincitina de ERV. El método puede realizarse en células sanguíneas no estimuladas o en células estimuladas brevemente con IL-7, y las células pueden expandirse. Las partículas lentivirales pseudotipadas estables obtenidas son particularmente útiles en terapia génica. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Partículas lentivíricas seudotipificadas estables y usos de las mismas
Sector de la técnica
La presente invención se refiere al usoin vitrode partículas lentivíricas seudotipificadas estables para la transducción de células inmunitarias, como se define en las reivindicaciones. También se describen los usos terapéuticos y de diagnóstico de las células inmunitarias infectadas con dichas partículas. La invención también se refiere a un métodoin vitropara transducir células B indiferenciadas y células monocíticas de sangre periférica humana, preferentemente con una preactivación mínima o nula, usando dichas partículas lentivíricas seudotipificadas estables, en presencia de vectofusina.
Antecedentes de la invención
Los enfoques de genoterapia suelen verse obstaculizados por la baja eficacia de transducción de las células diana a través de vectores víricos recombinantes. Los vectores retrovíricos, y en particular, los vectores lentivíricos (VL) basados en el virus de la inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1), son vehículos prometedores en la genoterapia. Estos vectores se utilizan actualmente en aplicaciones clínicas para tratar diversas enfermedades tales como inmunodeficiencias, enfermedades neurodegenerativas o neurológicas, anemias o infección por VIH.
Algunas de las aplicaciones de los vectores retrovíricos se basan en la transducción de células diana específicasex vivo,tales como linfocitos o células madre/progenitoras hematopoyéticas que expresan el marcador CD34. Los VL se utilizan para transducir linfocitos T con el fin de generar linfocitos T-CAR (linfocitos T con receptor quimérico para el antígeno) duraderos para el tratamiento de cánceres como la leucemia linfocítica crónica (LLC) recidivante (Porteret al,Science Transl. Med. 7: 303ra1392015). Los VL se utilizan para transducir células CD34+ en genoterapia autóloga de una variedad de trastornos inmunitarios, sanguíneos, metabólicos o neurodegenerativos de origen genético (Wagemaker G. Hum Gene Ther. Octubre de 2014;25(10):862-5. doi: 10.1089/hum.2014). Los vectores lentivíricos son herramientas versátiles que pueden seudotipificarse con diversas glucoproteínas de la envoltura vírica, confiriendo de este modo características específicas de tropismo celular a las partículas (Buchholzet al.Trends Biotechnol. Diciembre de 2015;33(12):777-90. doi: 10.1016/j.tibtech.2015.09.008.).
Un factor limitante respecto al uso de partículas lentivíricas recombinantes es la capacidad de obtener títulos altamente infecciosos durante la producción de partículas lentivíricas recombinantes. Una forma de sortear esta limitación es concentrar el sobrenadante vírico durante las etapas de purificación. Sin embargo, los protocolos de purificación son difíciles de establecer para algunos VL, en función de las glucoproteínas de la envoltura utilizadas para seudotipificar las partículas víricas. Por lo tanto, muchas preparaciones de vectores lentivíricos tienen títulos bajos y la eficacia de la transducción es limitada.
Otro factor limitante es que resulta difícil transducir células primarias, por lo que a menudo deben activarse para transducirse, perdiendo de este modo su estado indiferenciado.
Finalmente, otro factor limitante es la capacidad del propio vector lentivírico para infectar células diana. Diversas glucoproteínas de la envoltura, tales como VSV-G (glucoproteína G del virus de la estomatitis vesicular) o RD114TR, pueden utilizarse para seudotipificar vectores lentivíricos y tienen infectividad variable en células diana tales como células CD34+ y glóbulos sanguíneos primarios.
Las sincitinas son glucoproteínas de la envoltura de retrovirus endógenos (sincitinas de ERV(endogenous retroviral virus)que tienen propiedades fusogénicas (Dupressoiret al.,2005; Lavialleet al.,2013).
Las propiedades fusogénicas de la glucoproteína de la envoltura de retrovirus endógenos humanos, codificada por el gen ERVW-1 (ENSG00000242950; también conocido como sincitina 1 o HERV-W), se han descrito en la solicitud de patente EP2385058. Dicha solicitud describe su uso en el tratamiento del cáncer, mediante la formación de sinticios (o sincicios).
Algunos estudios han demostrado la posibilidad de seudotipificar viriones del VIH-1, pero no partículas del VLM, con la envoltura de HERV-W (siglas del inglésHuman Endogenous Retrovirus-W, retrovirus endógenos humanos W)para obtener un virus infeccioso capaz de transducir células 293T. Sin embargo, dichas partículas de HERV-W no eran estables ya que la concentración, la congelación y la descongelación redujeron considerablemente los títulos (Anet al.,Journal of Virology, abril de 2001, págs. 3488-3489). Se utilizó una deleción de la región intracitoplasmática R para aumentar la fusión y el título del seudotipado de los vectores de transferencia genética derivados del VIH-1 (Lavilletteet al2002). La glucoproteína codificada por el gen ERVFRD-1 (ENSG00000244476; también conocido como sincitina 2 o HERV-FRD), se utilizó para seudotipificar vectores del VIS (virus de la inmunodeficiencia en simios) y al parecer funciona como seudotipado del VIH (virus de la inmunodeficiencia humana) o del VLM (virus de la leucemia murina), pero a títulos muy bajos, lo que impide realizar estudios funcionales, y se dispone de poca información sobre el seudotipado de HERV-<f>R<d>del VIH (Blaiseet al,Journal of Virology, enero de 2004, págs. 1050-1054).
Así pues, se necesitan medios para mejorar la eficacia de transducción de un virus o vector vírico, en particular un virus o vector vírico estable, por ejemplo, para mejorar el suministro de un gen en células diana específicas. De manera específica, se necesita un virus o un vector vírico, que sea estable y, por tanto, que pueda obtenerse a escala industrial. También se necesita un vector estable que pueda usarsein vitro,oin vivo,como una herramienta que presente nuevas propiedades biológicas.
También se necesita un procedimiento para transducir selectivamente células con un virus o vector vírico, de manera que se dirijain vitrooin vivo,únicamente a células específicas. Dicho virus o vector vírico tendría que inducir totalmente tolerancia, específica a células diana, y tendría que ser adecuado para múltiples administraciones.
Sorprendentemente, los inventores han elaborado un procedimiento para obtener partículas lentivíricas seudotipificadas con una glucoproteína de la envoltura específica, que son estables y que pueden congelarse. Dichas partículas lentivíricas seudotipificadas también mejoran la transducción de células diana seleccionadas, en particular células inmunitarias; esto amplía el ámbito terapéutico de dichas partículas. Dichas partículas lentivíricas seudotipificadas son de hecho eficaces para transducir células inmunitarias, y en particular células B, células T y células dendríticas y permiten la corrección funcional de la deficiencia celular. Asimismo, estos vectores lentivíricos seudotipificados pueden administrarsein vivodonde conducen a una transferencia genética detectable, estable y bien tolerada en el bazo y la médula ósea con evidencia de transducción de células B CD19+ del bazo.
Por tanto, el usoin vitrode dichas partículas lentivíricas seudotipificadas para transducir células inmunitarias es una estrategia prometedora para pacientes que padecen cánceres, enfermedades infecciosas, inmunodeficiencia, autoinmunidad o en genoterapia o como vacunas o como herramienta biogenotecnológica.
Explicación de la invención
La invención, como se expone en el juego de reivindicaciones adjunto, se refiere al usoin vitrode un preparado de partículas para la transducción de células inmunitarias, en donde el preparado comprende partículas lentivíricas concentradas seudotipificadas estables con una sincitina de retrovirus endógeno (sincitina de ERV) y el empaquetamiento de un gen heterólogo de interés, que comprende un título de partículas físicas superior a 1 x 105 ng de p24/ml (antígeno p24 en nanogramos por mililitro) y/o de partículas infecciosas superior a 2 x 104 UT/ml (unidades de transducción por ml).
De acuerdo con la invención, la sincitina de ERV puede seleccionarse del grupo que consiste en HERV-W(Human Endogenous Retrovirus type W,retrovirus endógeno humano que se une al triptófano (W)), HERV-FRD (dihidrofolato reductasa (FRD) del retrovirus endógeno humano), sincitina A murina, sincitina B murina, sincitina Ory1, sincitina Car1 (del grupo 1 de carnívoros) y sincitina Rum1 (del grupo de rumiantes 1), preferentemente, la sincitina de ERV se selecciona del grupo que consiste en HERV-W, HERV-FRD y sincitina A murina.
El preparado de partículas lentivíricas seudotipificadas estables con una sincitina de ERV que incluye un gen heterólogo de interés de acuerdo con la divulgación, es útil para la transducciónin vitrode células inmunitarias, preferentemente células B o células CD11c+ tales como células mieloides (p. ej.: granulocitos, monocitos y sus células progenitoras). La transducción de las células inmunitarias, preferentemente de células B, pueden encontrar aplicaciones en biogenotecnología, por ejemplo en la producción de inmunoglobulinas, o en células inmunitarias, preferentemente genomodificación de células B.
La presente invención también se refiere a un procedimientoex vivopara obtener células inmunitarias modificadas para expresar un gen heterólogo de interés, que comprende una etapa de infectar células inmunitarias con el preparado de partículas lentivíricas seudotipificadas estables con una sincitina de ERV que incluye un gen heterólogo de interés de acuerdo con la presente divulgación, preferentemente en presencia de un péptido LAH4 o de un derivado funcional del mismo.
Descripción detallada de la invención
La invención es como se define en las reivindicaciones.
Las sincitinas de EVR que tienen altas propiedades fusogénicas, tales como la sincitina 1 humana (HERV-W), la sincitina 2 humana (HERV-FRD) y la sincitina A murina, puede usarse para obtener seudotipados de lentivirus recombinantes derivados del VIH-1. Como se demuestra claramente en los Ejemplos, los resultados muestran que es posible producir partículas lentivíricas estables e infecciosas que comprendan un gen de interés, y que tengan tropismo selectivo sobre líneas celulares. Sorprendentemente, las partículas lentivíricas seudotipificadas con sincitina pueden transducir eficazmente linfocitos B primarios humanos y células mieloides Cd11c+ y/o dendríticas, especialmente en presencia de Vectofusina 1, un aditivo catiónico de transducción.
Por tanto, los inventores han obtenido partículas lentivíricas seudotipificadas con una sincitina de ERV, que son estables, infecciosas y que pueden congelarse. Las partículas lentivíricas seudotipificadas mejoran la transducción de células diana seleccionadas, en particular, de células inmunitarias, y particularmente, de células B, células T y células dendríticas.
Las sincitinas de ERV de acuerdo con la invención, se refieren a glucoproteínas de la envoltura altamente fusogénicas de mamíferos euterios, que pertenecen a la familia de Retrovirus Endógenos (ERV,Endogenous Retroviruses).
Estas proteínas están codificadas por genes, que muestran una expresión preferente en la placenta e inducen la formación de sincitios (o sincicios) cuando se introducen en células cultivadas (Lavialleet al.,2013).
Las sincitinas de los ERV de acuerdo con la invención pueden seleccionarse de sincitinas humanas (p. ej.: HERV-W y HERV-FRD), sincitinas murinas (p. ej.: sincitina A y sincitina B), sincitina Ory1, sincitina Car1, sincitina Rum1 o de sus ortólogos funcionales (Dupressoiret al.,2005; Lavialleet al.,2013).
Por ortólogos funcionales se entiende proteínas ortólogas codificadas por genes ortólogos y que presentan propiedades fusogénicas. Las propiedades fusogénicas pueden evaluarse en ensayos de fusión como los descritos en Dupressoiret al.(PNAS 2005). Resumiendo, las células se transfectan, por ejemplo, utilizando Lipofectamine (Invitrogen) y aproximadamente 1-2 pg de ADN por 5 * 105 células o precipitación con fosfato cálcico (Invitrogen, 5 20 pg de ADN por 5 * 105 células). Por lo general, las placas se inspeccionan para comprobar la fusión celular 24-48 h después de la transfección. Los sinticios pueden visualizarse utilizando tinción de May-Grünwald y Giemsa (Sigma) y el índice de fusión se calcula como [(N - S)/T] * 100, donde N es el número de núcleos en el sinticio, S es el número de sinticios y T es el número total de núcleos contados.
Las sincitinas humanas engloban HERV-W y HERV-FRD. En los homínidos (familiaHominidae)se pueden encontrar ortólogos funcionales de estas proteínas. HERV-W se refiere a una glucoproteína de membrana altamente fusogénica perteneciente a la familia de los retrovirus endógenos humanos (HERV,Human Endogenous Retroviruses).HERV-W es una glucoproteína de la envoltura; también se denomina Sincitina 1. Tiene la secuencia indicada en la base de datos Ensembl, correspondiente a la transcripción ERVW-1-001, ENST00000493463. El ADNc (ADN complementario) correspondiente tiene la secuencia indicada en la SEQ ID NO:1. HERV-FRD también se refiere a una glucoproteína de membrana altamente fusogénica perteneciente a la familia de los retrovirus endógenos humanos (HERV). HERV-FRD es una glucoproteína de la envoltura, también denominada Sincitina 2. Tiene la secuencia indicada en la base de datos Ensembl, correspondiente a la transcripción ERVFRD-1, ENSG00000244476. El ADNc correspondiente tiene la secuencia indicada en la SEQ ID NO:2.
Las sincitinas murinas engloban la sincitina A murina (es decir: sincitina A, sinA deMus musculus)y la sincitina B murina (es decir: sincitina B, sinB deMus musculus).En los muridos (familiaMuridae)se pueden encontrar ortólogos funcionales de estas proteínas. El gensincitina Acodifica la sincitina A murina. Lasincitina Atiene la secuencia indicada en la base de datos de Ensembl Sina ENSMUSG00000085957. El ADNc correspondiente tiene la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 40. El gensincitina Bcodifica la sincitina B murina. Lasincitina Btiene la secuencia indicada en la base de datos Ensembl Sinb ENSMUSG00000047977. El ADNc correspondiente tiene la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 41.
El gensincitina Ory1codifica la sincitina Ory1. En los lepóridos (familiaLeporidae,normalmente conejo y liebre), se pueden encontrar ortólogos funcionales de la sincitina Ory1.
El gensincitina Car1codifica la sincitina Car1. En mamíferos carnívoros laurasiaterios (superordenLaurasiatheria)se pueden encontrar ortólogos funcionales de la sincitina Car1 (Corneliset al.,2012; Lavialleet al.,2013).
El gensincitina Rum1codifica la sincitina Rum1. En mamíferos rumiantes se pueden encontrar ortólogos funcionales de la sincitina Rum1.
En las diversas realizaciones de la presente invención, la sincitina de ERV de acuerdo con la invención puede seleccionarse normalmente del grupo que consiste en HERV-W, HERV-FRD, sincitina A, sincitina B, sincitina Ory1, sincitina Car1 y sincitina Rum1 y sus ortólogos funcionales; preferentemente, la sincitina de ERV se selecciona del grupo que consiste en HERV-W, HERV-FRD, sincitina A murina y sus ortólogos funcionales, más preferentemente, la sincitina de ERV se selecciona del grupo que consiste en HERV-W, HERV-FRD y sincitina A murina y aún más preferentemente la sincitina de ERV es He RV-W o HERV-FRD.
El preparado de partículas que se usa para la transducción de células inmunitarias de acuerdo con la invención puede obtenerse mediante un método para obtener partículas lentivíricas seudotipificadas estables que incluyen un gen heterólogo de interés, que comprende las siguientes etapas:
a) transfectar al menos un plásmido en estirpes celulares apropiadas, en donde dicho al menos un plásmido comprende el gen heterólogo de interés, los genes retrovíricosrev, gagypol,y un ácido nucleico que codifica una sincitina de ERV;
b) incubar las células transfectadas obtenidas en la etapa a), para que produzcan las partículas lentivíricas seudotipificadas con una sincitina de ERV, respectivamente, y empaquetar el gen heterólogo de interés; y c) recoger y concentrar las partículas lentivíricas estables obtenidas en la etapa b).
La etapa c) del método puede comprender recoger, concentrar y/o purificar las partículas lentivíricas estables producidas en la etapa b), del sobrenadante. En particular, la concentración de la etapa c) comprende la centrifugación y/o purificación de las partículas lentivíricas estables recogidas obtenidas en la etapa b). Dicha recogida puede realizarse de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. En particular, los vectores lentivíricos se recogen antes de la fusión de las células transfectadas, por ejemplo, entre 20 y 72 horas después de la transfección, en particular después de 24 horas. Por ejemplo, la etapa de recogida consiste en una única recogida de lentivirus, en particular, implementada entre 20 y 72 horas después de la transfección, tal como entre 20 y 30 horas después de la transfección, particularmente después de 24 horas.
El método de la divulgación permite obtener títulos físicos elevados, así como títulos infecciosos elevados, de partículas lentivíricas estables seudotipificadas que incluyen un gen heterólogo de interés. De hecho, las partículas lentivíricas seudotipificadas estables que incluyen un gen heterólogo de interés se obtienen a un título físico elevado gracias al método de la divulgación, y son infecciosas, por tanto, eficientes, en particular para transducir células B o células mieloides.
Por "título físico", se entiende que se refiere a la cantidad de partículas lentivíricas que se produce. El título físico puede medirse de acuerdo con métodos clásicos conocidos en la técnica, y que se utilizan habitualmente para cuantificar las partículas lentivíricas, por ejemplo, mediante ELISA p24(enzyme-linkedimmunosorbent assay,ensayo de inmunoadsorción enzimática, para detectar el antígeno p24), que se ilustra en los ejemplos, mediante recuento directo de partículas con un contador automatizado, tal como el instrumento Nanosight NS300 de Malvern, siguiendo las instrucciones del fabricante, mediante ELISA con RT (retrotranscriptasa) (como se describe en Ciréet al,Plosone, julio de 2014, vol. 9, publicación 7, Immunization of mice with lentiviral vectors targeted to MHC class II+ cells is due to preferential transduction of dendritic cellsin vivo)or by viral RNA RT-qPCR.
Por "título físico elevado", se entiende que se refiere a un título de partículas producido al final de la etapa b) superior a 200 ng de p24/ml, preferentemente superior a 210 ng de p24/ml, aún más preferentemente superior a 300 ng de p24/ml. Más preferentemente, el título físico de partículas seudotipificadas con una sincitina de ERV, tal como HERV-W, producido al final de la etapa b) es superior a 300 ng de p24/ml, preferentemente superior a 400 ng de p24/ml. Más preferentemente, el título físico de partículas seudotipificadas con una sincitina de ERV, tal como HERV-FRD, producido al final de la etapa b) es superior a 210 ng de p24/ml, preferentemente superior a 300 ng de p24/ml.
Por "título físico elevado", también se entiende que se refiere a un título de partículas producido al final de la etapa c) (es decir, concentrado) superior a 1 x 105 ng de p24/ml, preferentemente superior a 1,1 x 105 ng de p24/ml, más preferentemente superior a 1,5 x 105 ng de p24/ml. Más preferentemente, el título físico de las partículas seudotipificadas con una sincitina de ERV, tal como HERV-W, producidas al final de la etapa c) es superior a 2,2 x 105 ng de p24/ml, preferentemente superior a 3,0 x 105 ng de p24/ml, incluso preferentemente superior a 4,0 x 105 ng de p24/ml. Más preferentemente, el título físico de partículas seudotipificadas con una sincitina de ERV, tal como HERV-FRD, producidas al final de la etapa c) es superior a 1,1 x 105 ng de p24/ml, preferentemente superior a 1,5 x 105 ng de p24/ml.
Según Farsonet al.,(Hum. Gene Ther. 2001) se puede suponer que 1 femtogramo (fg) de p24 corresponde a 12 partículas físicas (pf) de lentivirus. Sin desear quedar ligado a teoría alguna, los inventores creen que este número de partículas físicas calculadas, obtenido basándose en p24, está ligeramente sobreestimado en comparación con un valor obtenido por recuento directo de partículas con un contador automatizado (tal como el instrumento Nanosight NS300), porque también se tiene en cuenta solo el p24. En general, se puede estimar que, en promedio, hay alrededor de 4 veces más partículas calculadas con ELISA p24 que partículas medidas con el contador automatizado (véase la Tabla suplementaria S6 en el Ejemplo 3 más adelante). Por tanto, un título físico superior a 1 x 105 ng de p24/ml corresponde a un título físico superior a 1,2 x 1012 partículas físicas (pf) calculadas/ml o superior a aproximadamente 3 x 1011 pf/ml, según las mediciones del recuento Nanosight.
Por "título infeccioso", se entiende que se refiere a la cantidad de partículas lentivíricas funcionales. El título infeccioso puede medirse de acuerdo con métodos clásicos conocidos en la técnica, por ejemplo, por citometría de flujo, para calcular un título de unidades de transducción (UT/ml) o por qPCR(quantitative polymerase chain reaction,reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa) para medir los genomas infecciosos (gi/ml), que se ilustran en los ejemplos. Una publicación que describe dicho método es la de Kutner RH, Zhang XY, Reiser J (2009). Production, concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors. Nature protocols 4: 495-505. El título infeccioso de las partículas lentivíricas de la divulgación se mide tras la infección de una estirpe celular permisiva, preferentemente células 293T, u otra célula permisiva tal como células A20, más preferentemente utilizando el método de titulación (o valoración) descrito en el presente documento en la sección de ejemplos experimentales de la solicitud.
Por "título infeccioso elevado", se entiende que se refiere a un título de partículas infecciosas producido al final de la etapa c), superior a 2 E+04 UT/ml, preferentemente superior a 1 E+05 UT/ml, más preferentemente superior a 1 E+06 UT/ml, aún más preferentemente superior a 2 E+06 UT/ml. Más preferentemente, el título infeccioso de partículas seudotipificadas con HERV-W producido al final de la etapa c), es superior a 1,2 E+05 UT/ml, preferentemente superior a 2 E+05 UT/ml, más preferentemente superior a 1 E+06 UT/ml, aún más preferentemente superior a 1,5 E+06 UT/ml. Más preferentemente, el título infeccioso de partículas seudotipificadas con HERV-FRD producido al final de la etapa c), es superior a 2 E+04 UT/ml, preferentemente superior a 2 E+05 UT/ml, más preferentemente superior a 1 E+06 UT/ml, aún más preferentemente superior a 2,5 E+06 UT/ml. Preferentemente, dichos títulos infecciosos elevados se miden utilizando infección de células 293T y el método de titulación descrito en el ejemplo del presente documento.
Por "estable", se entiende que se refiere a que el título infeccioso de las partículas lentivíricas estables seudotipificadas con una sincitina de ERV, tal como una sincitina de ERV, como se ha definido anteriormente, y más preferentemente seudotipificada con HERV-W, HERV-FRD o la sincitina A murina y empaquetada en un gen heterólogo de interés, y que tiene células 293T infectadas u otra estirpe celular permisiva infectada, por ejemplo, células A20, se ha dividido como máximo por 10 entre dos puntos temporales consecutivos. Los dos puntos temporales consecutivos pueden representar una duración de algunas semanas, tal como de 1 a 3 semanas. Los dos puntos temporales consecutivos también pueden representar una duración de algunos meses, tal como 1, 2 o 3 meses, o 6, 9, 10 meses o incluso 12 o 18 meses. Las partículas lentivíricas seudotipificadas obtenidas por el método de la divulgación pueden congelarse, conservando así sus propiedades de estabilidad. En efecto, son resistentes a tratamientos a muy baja temperatura, tal como la congelación o la crioconservación. También pueden ser resistentes a tratamientos a temperatura media.
Dichas partículas lentivíricas seudotipificadas pueden por tanto centrifugarse y/o congelarse, conservando al mismo tiempo sus propiedades fusogénicas e infecciosas, así como su capacidad para suministrar el gen de interés a las células diana, en particularin vivo.De nuevo, las partículas lentivíricas seudotipificadas estables empaquetadas en un gen heterólogo de interés obtenido por el método de la presente divulgación, presentan un título físico elevado, así como un título infeccioso elevado.
Por gen "heterólogo", se entiende que se refiere a un gen, que proviene de un organismo diferente al de los genesrev, gagypolretrovíricos.
Por "gen de interés", se entiende que se refiere a una versión funcional de un gen. La versión funcional significa la versión de tipo silvestre (natural o no mutada) de dicho gen, un gen variante perteneciente a la misma familia, o una versión truncada, que preserva la funcionalidad de la proteína codificada.
El gen de interés puede proceder de un gen, que es deficiente o no funcional en un paciente, o de un gen que codifica una proteína inmunogénica (tal como una proteína vírica, una proteína bacteriana o un antígeno tumoral). El gen heterólogo de interés también puede ser un gen indicador (útil para fines de diagnóstico y para identificar ligandos de una proteína diana), un gen suicida, o un gen que codifique un ARN terapéutico (es decir, que codifique un ARN antisentido complementario a una secuencia diana de ADN o ARN, o un ARNg (guía), una iARN (interferencia por ARN) tal como ARNhc (de horquilla corto)). El gen de interés puede producir la proteína, el péptido o el ARN codificado.
Por "seudotipo", se entiende que se refiere a una partícula lentivírica que comprende:
- una glucoproteína de la envoltura procedente de un virus, siendo dicho virus diferente de aquel del que procede dicha partícula lentivírica;
- una glucoproteína de la envoltura modificada. En tal caso, la glucoproteína nativa de la envoltura vírica puede modificarse por mutación o por cualquier otra modificación de aminoácidos; o
- una glucoproteína quimérica. Dicha glucoproteína es una proteína de fusión entre al menos una parte de la glucoproteína vírica y otra secuencia.
En la etapa a), las estirpes celulares apropiadas se transfectan con al menos un plásmido. En particular, la transfección es una transfección transitoria.
En particular, las estirpes celulares apropiadas se transfectan con al menos uno, dos, tres o cuatro plásmidos. Estos tipos celulares incluyen cualquier célula eucariota que soporte el ciclo de vida del lentivirus.
En particular, las estirpes celulares apropiadas son estirpes celulares estables o estirpes celulares resistentes a las consecuencias catastróficas de los efectos fusogénicos de las sincitinas, para seguir creciendo mientras se producen las partículas. Dichas estirpes celulares apropiadas son estirpes celulares de mamífero, en particular estirpes celulares de seres humanos. Como ejemplos representativos de dichas células se incluyen células 293 de riñón embrionario humano (HEK,Human Embryonic Kidney)y derivadas de las mismas, células T HEK293, así como subconjuntos de células seleccionadas por su capacidad para crecer como células adherentes, o adaptadas para crecer en suspensión en condiciones aséricas. Dichas células son altamente transfectables.
Por ejemplo, las estirpes celulares apropiadas ya expresan al menos una, y como máximo cuatro de las cinco secuencias que constituyen el gen heterólogo de interés, los genesrev, gagypolretrovíricos y el ácido nucleico que codifica una sincitina de ERV, tal como HERV-W, HERV-FRD o sincitina A murina, en particular, en forma inducible. En tal caso, la etapa a) comprende transfectar dicha estirpe celular con al menos un plásmido que comprende al menos una secuencia que ya no está expresada en dicha estirpe celular. La mezcla de plásmidos, o el plásmido único (si sólo se usa un plásmido) se elige de tal manera que, cuando se transfectan en dichas estirpes celulares en la etapa a), dichas estirpes celulares expresan las cinco secuencias anteriores.
Por ejemplo, si la estirpe celular adecuada expresa los genesrev, gagypolretrovíricos, entonces el plásmido o la mezcla de plásmidos a transfectar comprende las secuencias restantes a expresar, es decir, el gen heterólogo de interés y el ácido nucleico que codifica una sincitina de ERV, tal como HERV-W, HERV-FRD o sincitina A murina.
Cuando se usa un solo plásmido, éste comprende las 5 secuencias de interés, es decir:
- el gen heterólogo de interés,
- los genesrev, gagypolgenes, y
- un ácido nucleico que codifica una sincitina de ERV como se ha descrito anteriormente y, que codifica en particular, HERV-W, HERV-FRD o la sincitina A murina.
Cuando se utilizan dos o tres plásmidos (mezcla de plásmidos), cada uno de ellos comprende algunas de las secuencias de interés indicadas en el párrafo anterior, de modo que la mezcla de plásmidos comprenda todas las secuencias de interés citadas anteriormente.
En particular se usan cuatro plásmidos, y la cuadritransfección comprende lo siguiente:
- el primer plásmido comprende el gen de interés,
- el segundo plásmido comprende el genrev,
- el tercer plásmido comprende los genesgagypol,y
- el cuarto plásmido comprende un ácido nucleico que codifica una sincitina de ERV como se ha descrito anteriormente y, que codifica en particular, HERV-W, HERV-FRD o la sincitina A murina.
Dicha cuadritransfección se realiza en particular con relaciones específicas entre los cuatro plásmidos. La relación molar entre los distintos plásmidos puede adaptarse para optimizar el aumento a escala de la producción. El experto en la materia podrá adaptar este parámetro a los plásmidos específicos que utilice para producir el lentivirus de interés. En particular, las proporciones en peso del primer, segundo, tercer, y cuarto plásmidos son (0,8-1,2): (0,1-0,4); (0,5 0,8): (0,8-1,2), en particular en torno a 1: 0,25; 0,65: 1.
Los genesrev, gagypolson retrovíricos, en particular lentivíricos. Estos pueden ser genes del VIH, en particular genes del VIH-1, pero también pueden ser genes del VAIE (Virus de la Anemia Infecciosa Equina), del VIS (Virus de la Inmunodeficiencia en Simios), de espumavirus o del virus VLM (Virus de la Leucemia Murina).
El ácido nucleico que codifica la sincitina de ERV, tal como una sincitina de ERV como se ha definido anteriormente y en particular que codifica HERV-W, HERV-FRD o la sincitina A murina, es una secuencia de ADN o de ADNc. En particular, corresponde a la secuencia de ADNc que se indica en la SEQ ID NO: 1, 2 o 40 respectivamente o a una secuencia que presenta al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 99 % de identidad con dicha SEQ ID NO: 1,2 o 40 respectivamente. En particular, la etapa a) comprende la transfección de al menos el plásmido que comprende, en particular, que consiste en, la secuencia de ADNc indicada en la SEQ ID NO:3 o 4.
El término "identidad" se refiere a la similitud de secuencia entre dos moléculas de polipéptido o entre dos moléculas de ácido nucleico. Cuando una posición en ambas secuencias comparadas está ocupada por la misma base o el mismo resto de aminoácido, entonces las moléculas respectivas son idénticas en dicha posición. El porcentaje de identidad entre dos secuencias corresponde al número de posiciones coincidentes compartidas por ambas secuencias, dividido por el número de posiciones comparadas y multiplicado por 100. Generalmente, se realiza una comparación cuando dos secuencias se alinean para obtener la máxima identidad. La identidad se puede calcular mediante alineación usando, por ejemplo, el programa de compilación GCG (Manual del Programa Genetics Computer Group, para el paquete de GCG, Versión 7, Madison, Wisconsin) o cualquiera de los algoritmos de comparación de secuencias, tales como BLAST, FASTA o CLUSTALW.
Los expertos en la materia saben cuáles son los plásmidos que codifican las glucoproteínas de la envoltura y que pueden utilizarse, tal como el pCDNA3, disponible en el comercio, una estructura o cualquier otro casete plasmídico que utilice un sistema de expresión similar, por ejemplo que utilice el promotor de CMV tal como el plásmido pKG descrito en Mertenet al.(Hum Gene Ther., 2011).
Con respecto a la etapa a), para introducir moléculas de ácido nucleico en las células pueden emplearse diversas técnicas conocidas en la materia. Dichas técnicas incluyen la transfección facilitada químicamente utilizando compuestos tales como el fosfato cálcico, lípidos catiónicos, polímeros catiónicos, transfección mediada por liposomas, tales como liposomas catiónicos de tipo Lipofectamine (Lipofectamine 2000 o 3000), polietilenimina (PEI), métodos no químicos tales como la electroporación, bombardeo de partículas o microinyección.
En particular, la transfección de la etapa a) se lleva a cabo utilizando fosfato cálcico.
Normalmente, la etapa a) puede realizarse mediante transfección transitoria de células 293T con 4 plásmidos (cuadritransfección), en presencia de fosfato cálcico. Los 4 plásmidos son, en particular: un plásmido pKL que expresa los genesgagypoldel VIH-1, un plásmido pK que expresa el genrevdel v IH-1 , un plásmido pCCL que expresa el gen heterólogo de interés bajo el control de un promotor celular tal como el promotor de la fosfoglicerato cinasa humana (PGK) y un plásmido pCDNA3 que expresa una sincitina de ERV, tal como una sincitina de ERV como se ha definido anteriormente y que expresa más preferentemente HERV-W (Sincitina 1), HERV-FRD (Sincitina 2) o las glucoproteínas de la sincitina A murina a partir de un promotor de CMV.
A continuación, después de la etapa (a), el método de la divulgación comprende una etapa b) de incubación de las células transfectadas obtenidas en la etapa a), para que se produzcan, en particular, en el sobrenadante, las partículas lentivíricas seudotipificadas con una sincitina de ERV, tal como una sincitina de ERV como se ha definido anteriormente y en particular seudotipificada con HERV-W, HERV-FRD o la sincitina A murina que incluye el gen heterólogo de interés. De hecho, una vez realizada la etapa a), se realiza la incubación de las células obtenidas. Esto conduce a la producción de las partículas lentivíricas estables en el sobrenadante, que están seudotipificadas con una sincitina de ERV, tal como una sincitina de ERV como se ha definido anteriormente y en particular seudotipificadas con HERV-W, HERV-FRD o la sincitina A murina y que incluye el gen heterólogo de interés.
Después de la transfección, las células transfectadas se dejan crecer durante un tiempo que puede estar comprendido entre 20 y 72 horas después de la transfección, en particular después de 24 horas.
El medio utilizado para el cultivo de las células es un medio clásico, tal como DMEM, que comprende un azúcar, tal como glucosa. En particular, el medio es un medio asérico. El cultivo puede llevarse a cabo en diversos dispositivos de cultivo tales como sistemas multiestrato o biorreactores adaptados al cultivo de células en suspensión. El biorreactor puede ser de un solo uso (desechable) o reutilizable. El biorreactor puede seleccionarse, por ejemplo, de entre recipientes o bolsas de cultivo y reactores de tanque. Como biorreactores representativos no limitativos se incluyen un biorreactor de vidrio (p. ej., B-DCU® de 2 l- 10 l, Sartorius), un biorreactor de un solo uso que utilice agitación por movimiento de balanceo, tal como un biorreactor de ondas (p. ej., Cultibag RM® de 10 l-25 l, Sartorius), un biorreactor de tanque agitador de un solo uso (Cultibag STR® de 50 l, Sartorius) o un biorreactor de tanque de acero inoxidable.
Después de la incubación, las partículas lentivíricas estables obtenidas se recogen y concentran; esta es la etapa c). En particular, las partículas lentivíricas estables obtenidas en la etapa b) se recogen antes de la fusión de las células transfectadas, por ejemplo, 24 h después de la transfección. En particular, las partículas lentivíricas estables presentes en el sobrenadante obtenido en la etapa b) se centrifugan y/o purifican. Dicha etapa de concentración c) puede realizarse mediante cualquier método conocido en la técnica, tal como por centrifugación, ultrafiltración/diafiltración y/o cromatografía.
Por ejemplo, el sobrenadante se centrifuga a una velocidad comprendida entre 40000 y 60000 g, durante 1 a 3 horas, a una temperatura comprendida preferentemente entre 1 °C y 5 °C, para obtener un centrifugado de partículas víricas seudotipificadas estables.
En particular, la centrifugación se realiza a una velocidad entre 45000 y 55000 g durante una 1 hora y media a 2 horas y media, a una temperatura entre 2 °C y 5 °C, en particular a una temperatura de aproximadamente 4 °C. Al final de esta etapa, las partículas se concentran en forma de centrifugado, que puede usarse.
Como alternativa, la etapa c) es una cromatografía, tal como una cromatografía de intercambio aniónico o una cromatografía de afinidad. La cromatografía de intercambio aniónico puede ir precedida o seguida de una etapa de ultrafiltración, en particular una ultrafiltración/diafiltración, incluida la filtración de flujo tangencial. La cromatografía de intercambio aniónico es, por ejemplo, una cromatografía de intercambio aniónico débil (incluye DEAE (D) -dietilaminoetil, PI - polietilenimina).
El método de la divulgación permite obtener partículas lentivíricas seudotipificadas con una sincitina de ERV, tal como una sincitina de ERV como se ha definido anteriormente y en particular seudotipificada con HERV-W, HERV-FRD o la sincitina A murina. Dichas partículas son estables, porque, gracias al método anterior, pueden concentrarse sin degradarse, como se muestra en los ejemplos. Asimismo, dichas partículas comprenden el gen heterólogo de interés.
Los resultados proporcionados en la presente solicitud demuestran claramente que las células inmunitarias, en particular, las células B transducidas con un vector lentivírico seudotipificado con sincitina de la divulgación, pueden usarse en inmunoterapia en seres humanos y pueden corregir funcionalmente las células B en una enfermedad humana.
Las células inmunitarias, preferentemente células B transducidas con el preparado de partículas lentivíricas estables seudotipificadas con una sincitina de ERV, tal como una sincitina de ERV, como se ha definido anteriormente, y más preferentemente seudotipificada con HERV-W, HERV-FRD o la sincitina A murina empaquetada en un gen heterólogo de interés, pueden usarse en genoterapia o inmunoterapia o como vacuna o en inmunoprofilaxis.
La genoterapia puede realizarse mediante transferencia génica, edición génica, omisión (o saltos) de exones, interferencia de ARN, corte y empalme en trans o cualquier otra modificación genética de cualquier secuencia codificante o reguladora en la célula, incluyendo las que se encuentre en el núcleo, en las mitocondrias o como ADN comensal (secuencias víricas contenidas en las células).
Los dos tipos principales de genoterapia son los siguientes:
- una terapia cuyo objetivo es la sustitución de un gen deficiente/anómalo: lo que se denomina genoterapia sustitutiva;
- una terapia dirigida a la reescritura genómica: en tal caso, el propósito es proporcionar a una célula las herramientas necesarias para que se exprese el gen de interés: lo que se denomina terapia de reescritura genómica.
En la genoterapia sustitutiva, el gen de interés puede ser una versión correcta de un gen deficiente o que ha mutado en un paciente, como es el caso, por ejemplo, de una enfermedad genética. En tal caso, el gen de interés restaurará la expresión del gen deficiente o mutado. De particular interés son los genes deficientes o mutados en pacientes que presentan una enfermedad que, una vez corregida en las células inmunitarias, preferentemente en células B, células T, monocitos o células dendríticas, más preferentemente en células B, mejoran la enfermedad o los síntomas del paciente. Son ejemplos de genes mutados en células B genéticamente defectuosas los siguientes:
- el gen que codifica la cadena gamma en la enfermedad de inmunodeficiencia combinada grave ligada al cromosoma X (SCID-X1) (los pacientes tienen un fenotipo T-NK-B+), o para pacientes con SCID-X1 ya tratados mediante genoterapia pero en los que no se indujo la corrección de las células B;
- el gen TNFRSF13B que codifica el TACI (activador transmembrana y modulador de calcio e interaccionador de ligando de ciclofilina) que está mutado en la inmunodeficiencia común variable (IDCV);
- el gen CD19 o BAFFR que puede estar mutado en la inmunodeficiencia común variable (IDCV);
- cualquiera de los genes responsables de la hiperinmunoglobulina M, causada principalmente por mutaciones en el gen que codifica el CD40;
- el gen IM4S que está mutado en el síndrome de Wiskott-Aldrich, incluidos los pacientes con WAS ya tratados con genoterapia basada en células madre y en los que la corrección de las células B es incompleta;
- los genes Fanc, que mutan en cualquiera de los subtipos de anemia de Fanconi, por ejemplo FancA o FancC; - cualquiera de los genes responsables de la hiperinmunoglobulina E.
Por tanto, estos genes podrían usarse como genes de interés.
Son ejemplos de genes mutados en enfermedades genéticas de la función fagocítica, en particular, los que conducen a la producción de monocitos o células dendríticas no funcionales o anómalos y que podrían tratarse expresando o corrigiendo el gen causal en dichos monocitos o células dendríticas, los siguientes: Síndrome de Wiskott Aldrich (gen WAS), enfermedad granulomatosa crónica (CGD, genes CYBB o p47), deficiencia de adhesión leucocitaria (DAL), deficiencia de IL-12/23 (cadenas de IL12 p40, p70, IL23), síndrome del linfocito desnudo debido a la ausencia de moléculas HLA, trastornos autoinflamatorios tales como la poliserositis familiar recurrente (gen de la pirina) o las enfermedades relacionadas con la criopirina (mutaciones de NALP3).
La genoterapia sustitutiva también puede usarse para tratar el cáncer. Genes de interés en el cáncer podrían regular el ciclo celular o el metabolismo y la migración de las células tumorales, o inducir la muerte de las células tumorales. Por ejemplo, la caspasa 9 inducible podría expresarse en leucemias de células B o linfomas de células B para desencadenar la muerte celular, preferentemente en combiterapia para suscitar respuestas inmunitarias antitumorales duraderas.
En genoterapia, podría ser posible usar las partículas lentivíricas seudotipificadas estables de la divulgación para transducir células inmunitarias en la genomodificación de células inmunitarias, preferentemente genomodificación de células B. Podría ser posible generar células B reguladoras expresando proteínas inmunosupresoras en las células B, por ejemplo IL-10, o para inducir la producción de proteínas inmunorreguladoras tales como anticuerpos o proteínas de fusión.
También podría ser posible insertar secuencias que favorezcan el corte y empalme, la expresión o la regulación de genes así como la reescritura genómica. Para este fin pueden utilizarse herramientas tales como CRISPR/Cas9. Esto podría usarse para modificar la expresión génica en células B, en el caso de autoinmunidad o cáncer, o para alterar el ciclo de virus en dichas células. En dichos casos, preferentemente, el gen heterólogo de interés se elige entre ARNg, nucleasas, moldes de ADN y componentes de iARN, tal como ARNhc.
Un ejemplo concreto de reescritura genómica sería el tratamiento de la macroglobulinemia de Waldenstrom: en dicha enfermedad, se ha observado una mutación puntual (L265P) de (MYD88) en las células B del 80-88 % de los pacientes y contribuye a la supervivencia y persistencia de estas células tumorales. Por tanto, reescribiendo genéticamente una versión correcta de este gen en los pacientes afectados, esto puede contribuir a terapias eficaces contra esta enfermedad.
Las partículas lentivíricas seudotipificadas estables de la divulgación podrían utilizarse juntas o secuencialmente para dirigirse a las mismas células a través de diferentes receptores. Esto podría ser una ventaja en estrategias tales como la reescritura genómica, en la que es necesario añadir a las células múltiples componentes de la plataforma de reescritura genómica.
En la terapia de reescritura genómica, también podría ser posible transducir células inmunitarias, preferentemente células B, con las partículas lentivíricas seudotipificadas estables de la divulgación. Entonces, preferentemente, si el gen heterólogo de interés codifica una inmunoglobulina, entonces las células B transducidas pueden producir las inmunoglobulinas correspondientes. Un ejemplo sería genomodificar una secuencia conocida de regiones variables de inmunoglobulina que confiera un reconocimiento específico de patógenos tales como virus (de la rabia, VIH, Ébola, Gripe, CMV, Zika) o parásitos(T. cruzi, P. falciparum)que podrían usarse para profilaxis, terapia o diagnóstico.
Cuando las células inmunitarias transducidas son macrófagos, entonces la terapia puede ser una terapia antiinflamatoria, inducción de la tolerancia o una vacunación.
Cuando las células inmunitarias transducidas son células B, entonces la terapia puede ser para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria.
Cuando las células inmunitarias transducidas son células dendríticas, entonces la terapia puede ser una vacuna. Por ejemplo, las células dendríticas inmaduras del receptor transducidas con antígenos de histocompatibilidad mayor o menor específicos de un donante de órganos alogénicos pueden utilizarse para inducir tolerancia al trasplante de órganos alogénicos en el receptor.
De nuevo, pueden encontrarse aplicaciones inmunoterapéuticas mediante genomodificación de células presentadoras de antígeno, tales como células B humanas, células dendríticas mieloides o monocitos humanos, introduciendo en estas células un casete de expresión génica recombinante que contenga una secuencia antigénica asociada o no a secuencias inmunomoduladoras, para la presentación antigénica con fines de vacunación para proteger contra las enfermedades infecciosas; para el tratamiento del cáncer; o con el fin de inducir la tolerancia inmunitaria específica de células o antígenos, para tratar enfermedades con componentes inmunitarios inflamatorios, como la diabetes o la enfermedad de Alzheimer, o para facilitar el trasplante de órganos o médula ósea.
Como se utiliza en el presente documento, el término "paciente" indica un mamífero. Preferentemente, un paciente de acuerdo con la invención es un ser humano.
Una célula inmunitaria es una célula implicada en el sistema inmunitario. Comprende sobre todo células B, células T, células NK, macrófagos y células dendríticas.
Una célula B (o linfocito B) es una célula inmunitaria responsable de la producción de anticuerpos e implicada en la respuesta inmunitaria humoral.
Una célula dendrítica es una célula inmunitaria, que es accesoria: es una célula presentadora de antígenos. Su función principal es procesar el material antigénico y presentarlo en su superficie celular a las células T. Una célula T (o linfocito T) es una célula inmunitaria implicada en la respuesta inmunitaria mediada por células. Puede elegirse entre linfocitos T citotóxicos, células T auxiliares y células T gamma delta.
Las células inmunitarias infectadas con el preparado de partículas lentivíricas seudotipificadas estables de la divulgación pueden usarse en inmunoterapia o como vacuna o en inmunoprofilaxis. En tal caso, el gen heterólogo de interés puede codificar una proteína inmunogénica, tal como una proteína vírica, una proteína bacteriana o un antígeno tumoral. En tal caso, la expresión del gen estimulará las respuestas inmunitarias, permitiendo la inmunización. Esto corresponde a una vacuna. En inmunoprofilaxis, el gen heterólogo de interés puede codificar una proteína que impide la infección vírica de las células B, tal como la infección por VEB, que puede causar una transformación neoplásica maligna en pacientes inmunodeficientes.
En algunas realizaciones de la invención, el preparado de partículas lentivíricas seudotipificadas estables con una sincitina de ERV, tal como una sincitina de ERV, como se ha definido anteriormente, y más preferentemente seudotipificada con HERV-W, HERV-FRD o la sincitina A murina que empaqueta un gen heterólogo de interés, se utiliza en biogenotecnología. Particularmente, puede usarse para generar estirpes celulares, preferentemente estirpes de células B, para fabricar un producto específico, tal como inmunoglobulinas.
En algunas realizaciones particulares de la invención, el preparado de partículas lentivíricas seudotipificadas estables con una sincitina de ERV, tal como una sincitina de ERV, como se ha definido anteriormente, y más preferentemente seudotipificada con HERV-W, HERV-FRD o la sincitina A murina que empaqueta un gen heterólogo de interés, se utiliza en biogenotecnología en células B humanas. Por ejemplo, se puede citar la producción de anticuerpos vectorizados en células B, que consiste en expresar por transferencia génica en células B humanas anticuerpos recombinantes dirigidos contra toxinas, patógenos (tal como el VIH-1) o parásitos (tal comoPlasmodium)para facilitar el rápido reconocimiento y neutralización de estos patógenos. Ejemplos de anticuerpos recombinantes que se vectorizan en ratones en un sistema diferente se describen en "Balazs A<b>,et al.Nat Med. Marzo de 2014;20(3):296-300. doi: 10.1038/nm" o "Deal Cet al.Proc Natl Acad Sci U S A. 26 de agosto de 2014;111(34):12528-32. doi: 10.1073/pnas.1407362111".
La biogenotecnología en células B humanas también podría consistir en utilizar la transferencia génica para inmortalizar a las células B humanas que responden a los antígenos (por ejemplo, las células B del centro germinal CD27+) con genes tales como genes antiapoptóticos u oncogenes de células B (tales como Bcl6 o BclX), con el fin de cultivar dichas células que responden a patógeno y seleccionar sus secuencias de anticuerpos, como se describe en "Kwakkenbos MJet al.Nat Med. enero de 2010; 16(1): 123-8. doi: 10.1038/nm.2071. Generation of stable monoclonal antibody-producing B cell receptor-positive human memory B cells by genetic programming".
Dichas partículas lentivíricas seudotipificadas con una sincitina de ERV, tal como una sincitina de ERV, como se ha definido anteriormente, y más preferentemente seudotipificada con HERV-W, HERV-FRD o la sincitina A murina, que empaquetan un gen heterólogo de interés, se utilizan para la transducción de células inmunitarias de pacientesin vitro.Por ejemplo, previamente se toma de un paciente una muestra de células inmunitarias, preferentemente células B, o de sus precursores, a continuación, dichas partículas lentivíricas de la muestra se inyectan en las células inmunitarias o en sus precursores (es decir, por tantoin vitro),y la muestra tratada se vuelve a administrar finalmente al paciente. La muestra de células inmunitarias o de sus precursores infectados con dichas partículas lentivíricas, y que comprende por tanto el gen heterólogo de interés, es el medicamento. Por tanto, la invención también tiene por objeto el uso en terapia de una muestra de células inmunitarias o de sus precursores infectados con dichas partículas lentivíricas, o con fines de diagnóstico (en el caso de que el gen heterólogo de interés sea un gen indicador).
Por "inmunodeficiencias", se entiende que se refiere una afección que conduce a un aumento del número o de la gravedad de infecciones microbianas (bacterianas, víricas, parasitarias) o que reduce la vigilancia antitumoral y conduce a una mayor frecuencia de cánceres.
Para ello, el gen heterólogo de interés puede ser un gen suicida, un gen "dominante-negativo", un gen que codifica un anticuerpo que bloquearía la activación de la célula diana, un gen que codifique una proteína que corrija la expresión de un oncogén, o un gen que codifique una proteína que reduzca o altere el ciclo vírico de un virus transformante de células B (tal como el VEB (virus de Epstein-Barr) en el caso del síndrome de Burkitt).
Por "autoinmunidades", se entiende que se refiere a enfermedades autoinmunitarias. Corresponden a afecciones que implican una respuesta inmunitaria anómala del organismo contra las células sanas de dicho organismo. Las autoinmunidades pueden limitarse a un órgano o a un tejido. Las enfermedades autoinmunitarias, en particular enfermedades autoinmunitarias susceptibles de tratarse mediante estrategias citorreductoras de células B (es decir, rituximab) y que podrían tratarse expresando un gen en las células B patológicas con la intención de destruirlas (tal como caspasa 9 o caspasa 9 inducible, timidina cinasa o cualquier otro "gen suicida"), o con la intención de inmunomodular su función mediante la expresión de genes inmunorreguladores tales como IL-10, son, por ejemplo: artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, púrpura trombocitopénica idiopática, vasculitis asociada a anticuerpos contra el citoplasma de los neutrófilos (vasculitis asociadas a ANCA,anti-neutrophil cytoplasmic antibody),enfermedad de Grave, esclerosis sistémica, anemia hemolítica autoinmunitaria, pénfigo vulgar, enfermedad por crioaglutininas, síndrome de Sjogren, púrpura trombocitopénica trombótica, crioglobulinemia, neuropatía mediada por IgM, esclerosis múltiple, neuromielitis óptica, nefropatía membranosa idiopática, dermatomiositis, trastornos neurológicos autoinmunitarios, hemofilia A, o complicaciones por trasplante de órganos (riñón) por rechazo de órganos o complicaciones por trasplante de médula ósea causadas por la enfermedad injerto contra huésped.
Por "enfermedades infecciosas", se entiende que se refiere a enfermedades causadas por microorganismos patógenos, tales como bacterias, virus, parásitos u hongos; las enfermedades pueden propagarse, directa o indirectamente, de una persona a otra. Las infecciones bacterianas pueden deberse aStreptococcus, StaphylococcusyE. coli.Las infecciones víricas pueden deberse a virus de las familiasPapillomaviridae, Polyomaviridae(virus BK, virus JC),Herpesviridae(Herpes simple tipo 1 o 2, virus de la varicela-zóster, virus de Epstein-Barr, citomegalovirus),Poxviridae(viruela),Hepadnaviridae(hepatitis B),Parvoviridae(parvovirus B19),Caliciviridae(virus Norwalk),Picornaviridae(coxsakievirus, virus de la hepatitis A, poliovirus, rinovirus),Coronoviridae(virus del síndrome respiratorio agudo grave,Flaviviridae(virus de la hepatitis C, virus de la fiebre amarilla, virus del dengue, virus del Nilo Occidental, virus de ETG (encefalitis transmitida por garrapatas), virus de Zika),Retroviridae(VIH),Filoviridae(virus del Ébola, virus de Marburgo),Orthomyxoviridae(virus de la gripe),Paramyxoviridae(virus del sarampión, virus de las paperas, virus respiratorio sincitial (o sincicial) yRhabdoviridae(virus de la rabia). Las infecciones parasitarias pueden deberse a organismos protozoarios (tales comoPlasmodiumspp), organismos helmintos o ectoparásitos. Las infecciones por hongos pueden deberse aTinea versicolor,dermatofitos(Microsporum, Trichophyton, Epidermophyton) oCandida albicans.
Como se utiliza en el presente documento, el término "cáncer relacionado con las células B" se refiere a la afección patológica en mamíferos que se caracteriza normalmente por el crecimiento celular no regulado de las células B. Las neoplasias malignas de células B pueden ser leucemia linfoide aguda, leucemia linfocítica crónica, mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom o cualquier tipo de linfoma de células B, incluido el mioclono opsoclono y cualquiertipo de patología de células B inducida por virus, tales como las causadas por el virus de Epstein-Barr, en el que podría obtenerse un efecto terapéutico mediante la transferencia génica de un modulador del ciclo celular o de una secuencia génica antioncogénica (tal como p53, secuencia antisentido contra un oncogén, ARNhc contra un oncogén) o un gen suicida (tal como icasp9, timidina cinasa) o secuencias antivíricas, o cualquier secuencia genética susceptible de detener el crecimiento, la propagación o la producción de moléculas patológicas por las células tumorales, incluyendo secuencias se reescritura gnómica cuando existen mutaciones genéticas específicas, tales como mutaciones en MyD88 en el caso de la hiperglobulinemia de Waldenstrom, o secuencias para reescribir genes críticos del ciclo de vida del virus, o secuencias que activarán una respuesta inmunitaria antitumoral o cualquier combinación de estos enfoques.
En el contexto de la invención, el término "tratar" o "tratamiento", como se utiliza en el presente documento, significa invertir, aliviar o inhibir el avance del trastorno o afección al que se aplica dicho término, o invertir, aliviar o inhibir el avance de uno o más síntomas del trastorno o afección al que se aplica dicho término.
Finalmente, la presente invención se refiere a un procedimiento ex vivo para obtener células inmunitarias modificadas para expresar un gen heterólogo de interés, que comprende una etapa de infección de células inmunitarias con partículas lentivíricas seudotipificadas estables con una sincitina de ERV como se describe anteriormente y, en particular, seudotipificadas con HERV-W, HERV-FRD o la sincitina A murina que empaqueta un gen de interés, en presencia de un péptido LAH4 o de un derivado funcional del mismo, preferentemente vectofusina 1.
Preferentemente, las células inmunitarias se eligen entre células B, células T, células dendríticas y macrófagos.
Preferentemente, las células inmunitarias están indiferenciadas. De acuerdo con las realizaciones preferidas, las células inmunitarias indiferenciadas no se han estimulado anteriormente.
De acuerdo con otra realización, cuando se usa la estimulación, la etapa de estimulación es mínima y se realiza incubando células inmunitarias indiferenciadas en un medio que comprende IL-7 para preservar la supervivencia de las células B indiferenciadas.
Por tanto, preferentemente, el procedimiento ex vivo para obtener células inmunitarias modificadas para expresar un gen heterólogo de interés de acuerdo con la invención, comprende una etapa de infección directa de células inmunitarias indiferenciadas, especialmente células B indiferenciadas, con partículas lentivíricas seudotipificadas estables con una sincitina de e Rv como se describe anteriormente y, en particular, seudotipificadas con HERV-W, HERV-FRD o la sincitina A murina que empaqueta un gen heterólogo de interés, en presencia de un péptido LAH4 o de un derivado funcional del mismo. Dichas células inmunitarias indiferenciadas no se han estimulado anteriormente.
De acuerdo con otra realización, el procedimiento ex vivo para obtener células inmunitarias modificadas para expresar un gen heterólogo de interés de acuerdo con la invención, puede comprender también las siguientes etapas:
- opcionalmente, estimular las células inmunitarias indiferenciadas incubándolas en un medio que comprenda IL-7, y a continuación
- infectar las células inmunitarias indiferenciadas, estimuladas o no, con partículas lentivíricas seudotipificadas con una sincitina de ERV, como se describió anteriormente y, en particular, seudotipificadas con HERV-W, HERV-FRD o la sincitina A murina que incluye un gen de interés, en presencia de un péptido LAH4 o de un derivado funcional del mismo.
Preferentemente, el péptido LAH4 o derivado funcional del mismo, preferentemente vectofusina 1, está presente en concreto a una concentración de 7 a 20 pg/ml, más preferentemente de 10 a 15 pg/ml.
En el contexto de la presente invención, la expresión "péptido LAH4" se refiere al péptido con la secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO: 5. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "derivado funcional de LAH4" se refiere a cualquier péptido cuya secuencia se haya diseñado basándose en la estructura primaria del péptido LAH4 y que tenga la capacidad de mejorar la eficacia de transducción de un virus o vector vírico. En una realización particular, un derivado funcional de LAH4 es un péptido que tiene la capacidad de mejorar la eficacia de transducción de un virus encapsulado con una sincitina de ERV como se describe anteriormente y, en particular, encapsulado con HERV-W, HERV-FRD o la envoltura de la sincitina A murina en células eucariotas, en particular, células humanas, de ratón, rata, mono, perro o hámster, en particular una célula CD34+ humana.
El péptido LAH4 o un derivado funcional del mismo puede seleccionarse de entre las secuencias representadas en las SEQ ID NO: 5 a 31:
LAH4: KKALLALALHHLAHLALHLALALKKA (SEQ ID NO: 5)
LAH4-L1: KKALLAHALHLLALLALHLAHALKKA (SEQ ID NO:6)
LAH4-Ll-dKC: KKALLAHALHLLALLALHLAHALA (SEQ ID NO:7)
LAH4-L1-R: RRALLAHALHLLALLALHLAHALRRA (SEQ ID NO:8)
LAH4-L0: KKALLAHALAHLALLALHLALHLKKA (SEQ ID NO:9)
LAH4-L2: KKALLALALHHLALLALHLAHALKKA (SEQ ID NO: 10)
LAH4-L3: KKALLALALHHLALLAHHLALALKKA (SEQ ID NO:11)
LAH4-L4iso: KKALLHLALLHAALLAHHLALALKKA (SEQ ID NO: 12)
LAH4-L5: KKALLHLALLHAALLAHLAALHLKKA (SEQ ID NO:13)
LAH4-L6iso: KKALLHLALLLAALHAHLAALHLKKA (SEQ ID NO: 14)
LAH4-A1: KKALLAHALHLLAALALHLAHLLKKA (SEQ ID NO: 15)
LAH4-A2: KKALLLAALHHLAALALHLAHLLKKA (SEQ ID NO: 16)
LAH4-A3: KKALLLAALHHLLALAHHLAALLKKA (SEQ ID NO: 17)
LAH4-A4 (denominada también vectofusina 1): KKALLHAALAHLLALAHHLLALLKKA (SEQ ID NO: 18) LAH4-A5: KKALLHALLAHLAALLHALLAHLKKA (SEQ ID NO: 19)
LAH4-A6iso: KKALLHALLAALLAHLHALLAHLKKA (SEQ ID NO: 20)
LAH4-A4-K1N: KALLHAALAHLLALAHHLLALLKKA (SEQ ID NO: 21)
LAH4-A4-K3N: KKKLLHAALAHLLALAHHLLALLKKA (SEQ ID NO: 22)
LAH4-A4-dKC: KKALLHAALAHLLALAHHLLALLA (SEQ ID NO: 23)
LAH4-A4-dlaa: KKALLHAALAHLLALAHHLLALLK (SEQ ID NO:24)
LAH4-A4-d2aa: KKLLHAALAHLLALAHHLLALLK (SEQ ID NO:25)
LAH4-A4-d2Caa: KKALLHAALAHLLALAHHLLALK (SEQ ID NO:26)
LAH4-A4-d3aa: KKLHAALAHLLALAHHLLALLK (SEQ ID NO:27)
LAH4-A4-d5aa: KKLHAALAH LLALAH HLLAK (SEQ ID NO:28)
LAH2-A6: KKALLHAALAHLLALAAALLALLKKA (SEQ ID NO:29)
K2-L10A12-K2: KKALLAAALAALLALAAALLALLKKA (SEQ ID NO:30)
LAH4-A4-Leu: KKLLLHALLAHLLALLHHLLALLKKL (SEQ ID NO:31).
Preferentemente, se usa un derivado funcional del péptido LAH4. Preferentemente, dicho derivado funcional es LAH4-A4, que también se denomina vectofusina 1 y que tiene la SEQ ID NO: 18.
La invención se ilustrará ahora con los siguientes ejemplos, que no son limitativos.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: Transducción de células BeWO con vectores seudotipificados con sincitina en presencia de diversos aditivos de transducción
Células BeWO se infectaron con vectores que codifican la GFP(green fluorescent protein,proteína verde fluorescente), bien con LV-VSVg (108 UT/ml) o con LV-Sin2 (105 UT/ml) en ausencia o en presencia de aditivos, sulfato de protamina (PS,protamine sulfate),polibreno (PB) o Vectofusina 1 (VF1) y la expresión del transgén se midió mediante FACS al cabo de 3 días. Se muestran los porcentajes de células vivas GFP+ (marcadas con GFP) en la selección. Resultados de un experimento.
Figura 2: Transducción de células 293T con vectores seudotipificados con sincitina y Vectofusina 1 (VF-1) A. B.Un experimento representativo de 3 que muestra los efectos dependientes de la dosis de vectores seudotipificados con sincitina en presencia de VF1. Se cultivaron células T 293 con LV-Sin1(A)o LV-Sin2(B)que codifica la GFP utilizando concentraciones del vector que variaban de 104 a 105 UT/ml y en ausencia o en presencia de VF1. La expresión de GFP se midió mediante<f>A<c>S al cabo de 3 días.C.El efecto potenciador de VF1 es estadísticamente significativo, tal como se muestra en 5-6 experimentos utilizando una prueba de Mann-Whitney.
D.La correlación entre la expresión de GFP medida por FACS (clasificación de células activadas por fluorescencia) y el número de copias del vector (NCV,vector copy number)por célula mediante qPCR, se obtuvo a partir de 3 experimentos distintos en los que se probaron diferentes concentraciones de vector.
Figura 3: Transducción de subconjuntos de glóbulos sanguíneos primarios con vectores seudotipificados con sincitinaCélulas mononucleares de sangre periférica (CMSP) humana (de 4 a 9 donantes de sangre distintos) se infectaron con vectores de LV-Sin1 o LV-Sin2 que codifican la GFP (105 UT/ml) en ausencia o en presencia de VF1 e inmediatamente después del aislamiento de las células (sin activación) o tras un cultivo de una noche de las células con IL-7 (10 ng/ml). Después de 3 días, la GFP se midió por FACS en diferentes subconjuntos de células vivas (células T CD3+ CD19- CD11c-; células B CD3-CD19+ CD11c-; células mieloides CD3- CD19- CD11c+), subconjuntos de células B indiferenciadas (CD27-) o de memoria (CD27+).
Figura 4: Efectos dependientes de la dosis de los vectores seudotipificados con sincitina sobre los subconjuntos de células sanguíneasResultados representativos de 3 donantes de CMSP incubadas con IL-7 durante la noche, que después se transducen con LV-Sin1 y LV-Syn2 que codifican ANGFR a concentraciones de 105 y 106 UT/ml en presencia de VF1. La expresión transgénica se midió por FACS al cabo de 3 días.
Figura 5: Transducción de glóbulos sanguíneos CD11c+ con vectores seudotipificados con sincitinaSe transdujeron CMSP enteras (de 2 donantes analizados en 2 experimentos distintos) o CMSP adherentes al plástico (de 1 donante analizado en otro experimento distinto), con el vector LV-Sin1 o LV-Sin2 que codifica la GFP (2x105 UT/ml) o con el vector LV-VSVg (108 UT/ml) en ausencia o en presencia de VF1 (12 pg/ml). Las células se lavaron y se siguieron cultivando en medio XVivo20 FCS al 10 %+GM-CSF IL-4 durante 3 a 7 días.A.Estrategia de selección con respecto al análisis de células mieloides CD11c+ HLD-DR+.B.Experimento representativo de 3 que muestra la transducción de células CD11c+ HLD-DR+ obtenidas después de 3 días en diferentes condiciones.
Figura 6: Expresión de los receptores de ASCT2 y MFSD2a en glóbulos sanguíneos
A.Análisis de FACS multicolor de la expresión de ASCT2 y MFSD2a en células B CD19+, células T CD3+ y células dendríticas mieloides CD11c+ en un experimento representativo de 3 (1 donante de sangre cada uno).B.Promedio y desviación estándar del porcentaje de células que expresan los receptores indicados en 5 experimentos, después de restar el fondo obtenido con el control de inmunoglobulina de conejo. C. Análisis mediante RT-PCR de ARNm de MFSD2a y ASCT2 en subconjuntos de células CMSP promediando 2 experimentos.
Figura 7: Fenotipo de células mononucleares sanguíneas de un paciente con SCIDX1 tratado con genoterapia.Se realizó un análisis de citometría de flujo: (A) con CMSP de un donante sano y en comparación (B) después de descongelar las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) del paciente y en comparación.
Figuras 8-9: Transducción de esplenocitos (células del bazo) murinos (Fig.8) y de células de la médula ósea (Fig.9) con vectores LV-Sin A.El vector LV-SinA, que codificaba la dNGFR, se añadió a esplenocitos con empobrecimiento eritrocitario obtenidos de ratones C57Bl/6. Después de 3 días, utilizando citometría de flujo, se midió el fenotipo de las células y la expresión transgénica.
Figura 10: Suministroin vivodel transgén LucII con LV-SinA.Una única embolada de LV-Sin A que codificaba el transgén LucII (C, n = 7, flujo: 1,8.108 fotones/seg) se inyectó por vía intravenosa a ratones C57Bl/6 albinos (5x 105 UT/ratón n=3). Como control se utilizó un LV-VSVg que codificaba el mismo transgén (B, n = 4, flujo: 7.108 fotones/seg), así como PBS (A, n = 7, flujo: 1,5.104 fotones/seg). La detección por bioluminiscencia de la expresión transgénica se realizó 16 días después de la inyección i.v. de los LV. Uno de los ratones anestesiados se abrió para confirmar la bioluminiscencia del bazo (D).
Figura Suplementaria S1
A. Optimización de la proporción de plásmidos para la producción de LV mediante transfección transitoria en células HEK293T.Producción del vector LV-Sin2 que codifica la GFP (proteína verde fluorescente) utilizando diversas cantidades de plásmido pcDNA3Sin2 en cada matraz T de 175 cm2 como se indica en el eje X. El medio se recogió 24 h después de la transfección y al antígeno p24 mediante un ELISA. Resultados del promedio ± DE de 4 mediciones.
B. Aumento de la transducción dependiente de la dosis y estabilidad de la transducción a lo largo del tiempo.Se transdujeron células HEK293T con concentraciones en aumento de LV-Sin1 que codificada la GFP. Las células se cultivaron durante los tiempos indicados (d=días) en los que se midió la expresión de la proteína verde fluorescente, GFP, mediante FACS. Los resultados se expresan como porcentaje de células GFP+ en el cultivo. Resultados de 1 experimento representativo de 4.
C. Transducción comparativa de diferentes estirpes celulares con LV seudotipificado con sincitina.Células HEK293T, células BeWO o células HCT116, se transdujeron con los vectores LV-Sin1 (105 UT/ml), LV-Sin2 (105 UT/ml) o LV-VSVg (106 UT/ml) que codificaban la Gf P. La expresión de la GFP se midió por FAc S después de 3 días. Los resultados se obtuvieron con LV-Sin1 y LV-Sin1 respectivamente en 5 y 6 experimentos distintos en células 293T; en 1 y 3 experimentos en células BeWO y en 2 y 4 experimentos en células HCT116.
Figura Suplementaria S2
A.Esquema de tratamiento de CMSP con vectores
B.Estrategia de selección mediante FACS para analizar la transducción de diversas subpoblaciones de células B
Figura Suplementaria S3
A.Estrategia de selección mediante FACS para analizar la transducción de células dendríticas que son CD3-CD19-, HLA-DR+, CD1a+ y que expresan o no la GFP y CD86 o CD80. Transducción de CMSP con LV-Sin1, LV-Sin2 o LV-VSVG en las mismas condiciones que en la Figura 5 y expresión de CD80 y CD86 (porcentajes indicados en los cuadrantes) en el subconjunto de células CD3-CD19-CD14-CDla+GFP+ después de 7 días.
B.Igual que A y expresión de GFP (porcentajes indicados en el histograma) en el subconjunto de células CD3-CD19-CD14+h La -DR+ después de 7 días.
Figura Suplementaria S4: Inmunotinción para detectar ASCT2 y MFSD2a en células HEK293T y HCT116
Los histogramas representan la intensidad media de fluorescencia (IMF) de células de control negativo no teñidas (293T: 5 %; HCT116: 3 %), de células teñidas con IgG irrelevante y con el anticuerpo secundario conjugado con Alexa 647 (293T: y HCT116: 1 %), de células teñidas con el anticuerpo anti-ASCT2 y el anticuerpo secundario (293T: 12 %, HCT116: 4 %) y de células teñidas con el anticuerpo anti-MFSD2a y el anticuerpo secundario (293T: 99 %, HCT116: 65 %).
Figura Suplementaria S5: Transducción de células Raji y Jurkat con los vectores LV-Sin1 y LV-Sin2 que codifican la GFP utilizando 106 UT/ml de vector
Las células se analizaron mediante FACS 8 días después de la infección.
Figura Suplementaria S6: Transducción in vivo con el vector LV-Sin1
En el seno retroorbitario de ratones NSG (Nod/Scid/gc-/-) hembra de 7 semanas de vida adquiridos en Charles River, se inyectaron 107 CMSP en un volumen de 100 pl. Después de 24 horas, los ratones recibieron una inyección intravenosa en la vena de la cola de 150 pl del vector LV-Sin1 sin diluir. Después de 7 días, los ratones se sacrificaron y se extirparon sus bazos, se sometieron a lisis con tampón de lisis ACK y la fracción con empobrecimiento eritrocitario se analizó mediante FACS para medir la GFP en la fracción de células CD45+ humanas. Los resultados muestran las representaciones gráficas FACS de 2 ratones en los que se encontraron células GFP+ (marcadas con proteína verde fluorescente) humanas.
Figura Suplementaria S7: Transducción ex vivo de células murinas con los vectores LV-Sin1 o LV-Sin2
Se obtuvieron esplenocitos de ratones C57Bl/6 hembra de 6 semanas de vida tras la lisis de eritrocitos con ACK. Las células se cultivaron en RPMI suplementado con FCS al 10 % y p-mercaptoetanol a la concentración de 106 células/ml en 100 pl en presencia de LV-Sin1 o LV-Sin2 que codifican la ANGFR a 1 o 5 x 105 UT/ml y VF1 (12 pg/ml). Después de 3 días, la expresión de ANGFR se midió mediante FACS en células vivas.
Figura Suplementaria S8: Titulación infecciosa de LV-SinA en la estirpe celular A20 de linfoma murino de células B
Células A20 se transdujeron con diferentes cantidades de vector LV-SinA (0, 0,2, 0,6, 1,8, 3,2, 5,4 y 16,2 pl) con VF1 (en rojo) y sin VF1) a 12 pg/ml. Las células se cultivaron durante 7 días en medio completo. Evaluación del número de copias de sincitina A mediante qPCR.
EJEMPLO 1: Las glucoproteínas de envoltura retrovírica endógena humana sincitina-1 y sincitina-2, permiten realizar una transducción lentivírica eficaz de células B primarias y células dendríticas humanas
Materiales y métodos
Estirpes celulares
Células de riñón embrionario humano 293T y células de carcinoma colorrectal humano HCT116 (CCL-247; ATCC, Manassas, VA) se cultivaron a 37 °C, con CO<2>al 5 % en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM glutamax) (Life Technologies, St-Aubin, Francia) suplementado con 10 % de suero bovino fetal (FCS,fetal calf serum)termoinactivado (Life Technologies). Células BeWO de coriocarcinoma humano (CCL-98; ATCC) se cultivaron en medio F12K de Ham (Life technologies) suplementado con 10 % de FCS. Células Raji y Jurkat se infectaron en medio XVivo 20.
Clonación de plásmidos que expresan sincitina y producción de vectores
Los plásmidos pCDNA3-sincitina 1 y pCDNA3-sincitina 2, que codifican la sincitina 1 humana (ERVW-1-001) o la sincitina 2 humana (ERVFRD-1), se construyeron clonando las respectivas secuencias de ADN sintetizadas (Gencust, Dudelange, Luxemburgo) correspondientes a las secuencias de transcripción ENST00000493463 y ENSG00000244476 del navegador del genoma Ensembl, en un plásmido pCDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, California) utilizando las enzimas de restricción NHel y Xhol. Las secuencias plasmídicas se verificaron mediante secuenciación bicatenaria. La funcionalidad del plásmido de sincitina 2 se verificó mediante inmunotransferencia de extractos de proteína después de la transfección de células 293T utilizando el anticuerpo anti-HERV-FRD (LS-BIO, Nanterre, Francia) que detecta una proteína de 65-70 Kd que se espera que sea la sincitina 2. Los plásmidos se produjeron sin endotoxinas utilizando el kit de purificación Nucleobond de ADN y ARN (Macherey-Nagel, Duren, Alemania). Se produjeron partículas lentivíricas seudotipificadas con sincitina 1 o sincitina 2 mediante transfección transitoria de células 293T con 4 plásmidos, usando fosfato cálcico. Cada matraz T de 175 cm2 se transfectó con 14,6 pg de pKLgagpol que expresaba los genesgalypoldel VIH-1, con 5,6 pg de pKRev que expresaba secuencias rev del VIH-1, con 22,5 pg del casete de transferencia génica (pCCL PGK GFP que expresaba la proteína verde fluorescente (GFP) potenciada bajo el control del promotor de la fosfoglicerato cinasa (PGK) humana (Charrieret al,2011) o pCCL PGK delta-NGFR que expresaba una forma truncada del receptor del factor de crecimiento nervioso (NGFR) bajo el control del promotor de la PGK humana) y con 22 pg del plásmido pCDNA3-sincitina 1 o pCDNA3-sincitina 2. El medio se cambió al día siguiente y se sustituyó por DMEm 4,5 g/l de glucosa suplementado con penicilina y estreptomicina y FCS al 10 %. Después de 24 horas, se recogió el medio que contenía las partículas víricas, se centrifugó a baja velocidad, se filtró de manera estéril (0,22 pm) y se concentró por ultracentrifugación a 50000 g (19500 RPM utilizando una ultracentrífuga Beckman con rotor SW28) durante 2 h a 4 °C. El sedimento se resuspendió en PBS, se dividió en alícuotas y se conservó a -80 °C. Las partículas seudotipificadas con VSVg se produjeron también mediante transfección transitoria, como se ha descrito (Mertenet al,2011).
Aditivos de transducción
Los péptidos de vectofusina 1 (VF1) se sintetizaron mediante síntesis estándar de péptidos en fase sólida con cloruro de fluorenil-metiloxi-carbonilo, seguido de purificación por HPLC y espectrometría de masas (Gencust). Los péptidos se solubilizaron en H<2>O, se dividieron en alícuotas y se conservaron a -80 °C hasta su uso. Cuando se necesitó para realizar los experimentos de transducción, la VF1 se descongeló, se resuspendió en el medio y se añadió al vector y a las células a una concentración final de 12 pg/ml. El sulfato de protamina (PS,Protamine Sulfate)(Sigma-Aldrich, Louis, MO) y el polibreno (PB) (Sigma-Aldrich), también se diluyeron en el momento de su uso con el vector y las células y se usaron a concentraciones finales de 8 pg/ml y 6 pg/ml respectivamente en el cultivo de transducción.
Titulación de vectores
El vector concentrado y crioconservado se tituló antes de su uso. El título físico de las partículas se determinó mediante ELISA de p24 (kit Elisa para el VIH-1 de Alliance©, Perkin Elmer, Villebon/Yvette, Francia) como se ha indicado anteriormente (Charrieret al,2011). El título infeccioso se determinó añadiendo diluciones en serie del vector a células HEK293T en presencia de 12 pg/ml de VF1 y después de 3 días, las células 293T se analizaron por citometría de flujo para calcular un título de unidades de transducción (UT/ml) o por qPCR para medir los genomas infecciosos (gi/ml) utilizando cálculos estándar (Kutneret al,2009).
Cultivo y transducción de células mononucleares de sangre periférica
La sangre periférica recogida con EDTA se adquirió en elEtablissement Frangais du Sang(Instituto Francés de Sangre) (Evry, Francia). Células mononucleares de sangre periférica (CMSP) purificadas por centrifugación en gradiente con Ficoll (Eurobio, les Ulis, Francia), se suspendieron en medio asérico X-VIVO 20 (Lonza, Levallois-Perret, Francia) para la transducción. En algunos experimentos, se añadieron citocinas IL-7 (10 ng/pl) (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Alemania) al medio durante la noche anterior a la transducción. Para la transducción, se añadieron los vectores LV-Sin1 o LV-Sin2 (1.105 UT/ml) o LV-VSVg (1.108 UT/ml) a las células en presencia de VF1 (12 pg/ml). Después de 6 horas, el medio se cambió a medio XVivo20 suplementado con FCS al 10 % e IL-7 (10 ng/ml) y las células se cultivaron durante un máximo de 7 días. Para expandir las células B transducidas, se añadió al medio CD40L (2 pg/ml) e IL-4 (20 ng/ml) y las células se cultivaron en estas condiciones durante un máximo de 2 semanas. Para expandir las células dendríticas mieloides, se añadió al medio hGM-CSF (50 ng/ml) e IL-4 (20 ng/ml).
Inmortalización del VEB
Se cultivaron CMSP durante la noche con IL-7, y después se infectaron con vectores. Después de 6 horas, las células se lavaron y se cultivaron en presencia de sobrenadante de células de tití B95.8 con ciclosporina utilizando procedimientos estándar de inmortalización del VEB. El medio se cambió dos veces por semana.
Transducción de células de pacientes con SCID-X1
CMSP de pacientes con SCID-X1 tratados con genoterapia, se descongelaron rápidamente a 37 °C y a continuación se lavaron dos veces con PBS. Después de un recuento con azul de tripano, las células se marcaron con CFSE(carboxyfluorescein succinimidyl ester,éster de succinimidil-carboxifluoresceína) 2 pM (Molecular Probes, Cambridge, RU), se transdujeron con el vector Lv-Sin1 IL2rg y se cultivaron (3.105/200 pl) en placas de 96 pocillos con fondo redondo, en ausencia o en presencia del ligando CD40L [2 pg/ml] (Miltenyi Biotec) e IL-21 [50 ng/ml] (Miltenyi Biotec). Después de 3, 6 y 7 días de cultivo, la transducción de células B (es decir, la expresión de<n>G<f>R o IL2Rg), la proliferación de células B (es decir, la dilución de CFSE) y la frecuencia de células CD19+ CD27+, se determinaron mediante citometría de flujo. La secreción de IgG humana en el medio se determinó mediante ELISA (Sigma-Aldrich, St Louis, MO).
Activación de células B in vitro
Las CMSP se marcaron con CFSE 2 pM (Molecular Probes, Cambridge, RU) y se cultivaron (3.105/200 pl) en placas de 96 pocillos de fondo redondo en ausencia o en presencia del ligando CD40L [2 pg/ml] (Miltenyi Biotec) e IL-21 [50 ng/ml] (Miltenyi Biotec). Después de 3, 6 y 7 días de cultivo, la transducción de células B (es decir, la expresión de NGFR o IL2Rg), la proliferación de células B (es decir, la dilución de CFSE) y la frecuencia de plasmoblastos CD19+ CD27++, se determinaron mediante citometría de flujo. La secreción de IgG humana se determinó mediante ELISA (Sigma-Aldrich, St Louis, MO).
Citometría de flujo
Los anticuerpos utilizados para la citometría de flujo se adquirieron en BD-Biosciences (Le Pont de Claix, Francia) e incluían los anticuerpos anti-CD3 y anti-CD1a conjugados con PE, anti-CD19 conjugado con Alexa-Fluor 700, antiCD45 y anti-IgD conjugados con APC-H7, anti-IgM conjugado con CF594, anti-CD27 y anti-HLA-DR conjugados con PeCy7, anti-CD14 conjugado con APC, anti-CD11c conjugado con V450. Antes de añadir los anticuerpos a las células, los receptores de Fc se bloquearon incubando las células con gammaglobulina (1 mg/ml) (Sigma Aldrich) durante 15 minutos, a 4 °C. A continuación se añadieron cantidades saturantes de anticuerpos durante 30 minutos a 4 °C en PBS con seroalbúmina bovina (BSA) al 0,1 % (Sigma Aldrich) y las células se lavaron dos veces. Al final del procedimiento, se añadió 7-amino-actinomicina D (0,3 mg/ml) (Sigma-Aldrich) para descartar células muertas. Para los estudios con receptores, se utilizaron anticuerpos anti-SLC1A5 (ASCT2) policlonales de conejo (Abcam, París, Francia), anti-MFSD2a (Origene, Rockville, MD) o controles de inmunoglobulina de conejo (Origene) y se revelaron con anticuerpos de cabra anti-conejo conjugados con Alexa 647 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MD). Las adquisiciones se realizaron en un citométro de flujo LSRII utilizando el programa informático Diva (BD-Biosciences) y los análisis se llevaron a cabo utilizando en programa informático Kaluza (Beckman-Coulter, Villepinte, Francia).
La detección del IL2Rg humano se realizó utilizando anticuerpo anti CD132 humano conjugado con PE (BD bioscience).
Medición de la expresión de ASCT2 y MFSD2A mediante RT-qPCR
Se extrajo ARN total de células purificadas utilizando aislamiento de ARN total SV (Promega, Charbonniére les bains, Francia). El ADN residual se eliminó de las muestras utilizando el kit ADN libre (Ambion, Courtaboeuf, Francia). El ADNc se sintetizó a partir de 1 pg de ARN utilizando hexámeros aleatorios de acuerdo con el protocolo del sistema de sintesis de la primera cadena Superscript II para la PCR con retrotranscripción (Invitrogen). La PCR en tiempo real se realizó con el sistema LightCycler 480 (Roche, Bále, Suiza) con 0,1 pM de cada cebador de acuerdo con el protocolo Sybr Green PCR Master Mix (Applied Biosystem, Foster City, CA, EE. UU.). Los pares de cebadores utilizados para amplificar ASCT2 o MFSD2A se describieron anteriormente (Corneliset al,PNAS, 2008 y Toufaillyet al,placenta, 2013). Las secuencias de los cebadores de ASCT2 son (en sentido, 5'-GGCTTGG<t>A<g>TGT<t>T<g>CC<a>T- 3'; en antisentido, 5'-GGCAAAGAGTAAACCCACA- 3') y los cebadores de MFSD2A son (en sentido, 5' -CTCCTGGCCATCATGCTCTC- 3'; en antisentido, 5' - GGCCACCAAGATGAGAAA- 3'). También se utilizaron cebadores TFIID (Transcripción Final II D) como normalización. Las secuencias de los cebadores TFIID son (en sentido, 5'-ACGGACAACTGCGTTGATTTT-3'; en antisentido, 5' -ACTTAGCTGGGAAGCCCAAC-3'). Los resultados se expresan como factor de cambio utilizando la fórmula: abundancia relativa = 2A_ññCt siendo ACt= Ct ASCT2 o MFSD2A - Ct TFIID y AACt= ACtsmuestra - ACtcalibrador.
Transducción in vivo con el vector LV-Sin1
En el seno retroorbitario de ratones NSG (Nod/Scid/gc-/-) hembra de 7 semanas de vida adquiridos en Charles River, se inyectaron 107 CMSP en un volumen de 100 pl. Después de 24 horas, los ratones recibieron una inyección intravenosa en la vena de la cola de 150 pl del vector LV-Sin1 sin diluir. Después de 7 días, los ratones se sacrificaron y se extirparon sus bazos, se sometieron a lisis con tampón de lisis ACK y la fracción con empobrecimiento eritrocitario se analizó mediante FACS
Transducción ex vivo de células murinas con los vectores LV-Sin1 o LV-Sin2
Se obtuvieron esplenocitos de ratones C57Bl/6 hembra de 6 semanas de vida tras la lisis de eritrocitos con ACK. Las células se cultivaron en RPMI suplementado con FCS al 10 % y p-mercaptoetanol a la concentración de 106 células/ml en 100 pl en presencia de LV-Sin1 o LV-Sin2 que codifican la ANGFR a 1 o 5 x 105 UT/ml y VF1 (12 pg/ml). Después de 3 días, la expresión de ANGFR se midió mediante FACS en células vivas.
Análisis estadístico
La significación estadística se evaluó mediante un análisis ANOVA unidireccional, la prueba de Mann-Whitney o la de la t de Student, como se ha especificado, utilizando el programa informático GraphPad Prism (GraphPad Inc, La Jolla, CA).
RESULTADOS
Los LV seudotipificados con Sincitina-1 y Sincitina-2 pueden producirse como partículas estables e infecciosas
Dos glucoproteínas de la envoltura de retrovirus endógenos humanos, la sincitina 1 y la sincitina 2, se exploraron como posibles nuevos seudotipos de LV derivados del VIH-1 recombinante. Los ADNc de longitud completa de estas glucoproteínas se expresaron en un sistema de producción transitoria de LV en células 293T. Una optimización de la cantidad de plásmidos con sincitina 1 y sincitina 2 para la etapa de transfección aumentó la producción de partículas de LV en función de los niveles de p24 en el medio (Figura Suplementaria S1A). En las condiciones definidas (véase Materiales y métodos), fue posible producir partículas estables e infecciosas seudotipificadas con cualquiera de estas envolturas. Usando diferentes transgenes (GFP y dNGFR), las reservas en bruto recogidas de LV-Sin-1 tenían un título promedio de 705 ng de p24/ml (n=7 producciones) y las de LV-Sin-2 tenían un título promedio de 496 ng de p24/ml (n=4 producciones) (Tabla 1). Las partículas lentivíricas seudotipificadas con cualquiera de estas envolturas pudieron concentrarse satisfactoriamente por ultracentrifugación utilizando las mismas condiciones que las empleadas para las partículas seudotipificadas con VSVg (Charrieret al,2011). Las reservas concentradas se crioconservaron a -80 °C y fueron estables durante varios meses. T ras la descongelación de las reservas de LV, se obtuvieron títulos de 4,1 ± 1,7 E+05 ng de p24/ml para LV-Sin1 (n=6 producciones) y de 1,7 ± 0,6 E+05 ng de p24/ml para LV-Sin2 (n=6 producciones) y pudieron producirse vectores para codificar diferentes transgenes (GFP o ANGFR) (Tabla 1).
Tabla 1: Títulos de los LV seudoti ificados con sincitina 1 2
Leyenda:Se produjeron distintos lotes de LV con la envoltura y el transgén indicados (n= número de lotes probados) mediante transfección transitoria, se clarificaron, se filtraron de manera estéril, se concentraron o no, se crioconservaron, se descongelaron y se titularon. La concentración se realizó por ultracentrifugación (19500 rpm (50 000 g) durante 2 horas). Los títulos físicos en los niveles de p24 se midieron mediante ELISA y los títulos infecciosos se midieron como unidades de transducción (UT) de células 293T en presencia de Vectofusina 1 mediante citometría de flujo.
Para determinar las propiedades infecciosas de estas partículas, los inventores infectaron primero la línea celular de coriocarcinoma humano BeWo que se sabe que expresa tanto el receptor de ASCT2 de la sincitina 1 como el receptor de MFSD2a más restringido de la sincitina-2 (Esnaultet al,2008). Las células BeWo no se transdujeron eficazmente con LV-Sin1 ni con LV-Sin2, mientras que se transdujeron bien con LV seudotipificado con VSVg. Sin embargo, la adición de agentes catiónicos, tales como sulfato de protamina (PS), polibreno (PB) o Vectofusina 1 (VF1), mejoró la transducción de las células BeWo, como se muestra, con LV-Sin2 (Figura 1). De estos agentes, el mayor nivel de mejora de la transducción se obtuvo con VF1. La vectofusina 1 es un péptido anfipático corto rico en histidina que mejora la infectividad de los vectores lentivíricos y Y-retrovíricos seudotipificados con diversas glucoproteínas de la envoltura, incluida la RD114-TR (Fenardet al,2015 y Majdoulet al,2015). Los efectos de la Vectofusina 1 no se habían probado antes con sincitinas, y este péptido corto revela la posibilidad de transferir genes de partículas de LV seudotipificadas con sincitina.
En presencia de VF1, fue posible transducir células T 293 con cualquiera de los vectores seudotipificados con sincitinas de una manera dependiente de la dosis y alcanzando niveles comparables a los obtenidos en células BeWo (Figura 2 A,B). En cambio, sólo alrededor del 1 al 2 % de las células 293T fueron transducidas sin este aditivo. Los efectos potenciadores de VF1 fueron estadísticamente significativos en experimentos repetidos en células 293T utilizando LV-Sin1 o LV-Sin2 (Figura 2C). La transducción de células 293T con vectores seudotipificados con sincitina condujo a una integración genómica estable del transgén a lo largo del tiempo, como se examinó en cultivos continuos de 2 semanas de duración (Figura Suplementaria S1B). El nivel de expresión génica fue coherente con el número de copias por célula, sin mostrar pruebas de silenciamiento transgénico a lo largo del tiempo (Figura 2D).
El descubrimiento de los efectos potenciadores del péptido VF1 sobre la infectividad de LV-Sin1 y LV-Sin2, permitió desarrollar un sólido ensayo de titulación infecciosa utilizando células 293T. La elección de la estirpe celular 293T se debió a la imposibilidad de transducir células de carcinoma de colon HCT116, que se utilizan habitualmente para titular VL seudoptificados con VSVg en el laboratorio.
HCT116 no pudo transducirse con LV-Sin1 ni con LV-Sin2 a ninguna de las concentraciones probadas e incluso en presencia de Vectofusina 1 (Figura Suplementaria S1C). Además, se prefirieron las células 293 T a las células BeWo para este ensayo de título infeccioso debido a patrones de crecimiento más consistentes y a una tendencia a niveles de transducción más altos en experimentos repetidos (Figura Suplementaria S1C). En las condiciones definidas en el ensayo (véase Materiales y métodos), el título infeccioso de los lotes concentrados y crioconservados de LV-Sin1 y LV-Sin2 que codifican la GFP fue respectivamente de 2,8 ±6 x E+06 UT/ml (n=6 lotes) y de 2,7±6 xE+06 UT/ml (n=6 lotes) para el transgén GFP y 6,3 ±7,5 x E+06 UT/ml (n=3 lotes) y de 4,4±1,5 xE+06 UT/ml (n=2 lotes) para el transgén dNGFR (Tabla 1). Por tanto, las glucoproteínas sincitina 1 y sincitina 2 pueden seudotipificar vectores del VIHr para obtener partículas estables que sean infecciosas y útiles para transferir genes de forma estable. Su infectividad requiere cofactores y es selectiva a nivel celular.
Los vectores LV-Sin1 y LV-Sin2 transducen eficazmente glóbulos sanguíneos indiferenciados
Las sincitinas son proteínas celulares, que pueden ser útiles para obtener vectores tolerados inmunológicamente para aplicacionesin vivo. Por tanto, para evaluar si los vectores seudotipificados con sincitina interaccionaban con los glóbulos sanguíneos, los inventores añadieron los vectores a células mononucleares de sangre periférica (CMSP)in vitro.Las CMSP se infectaron inmediatamente después de su aislamientoin vitro,o tras un cultivo de una noche enpresencia de IL-7 con el objetivo de mantener la viabilidad de los linfocitos indiferenciados (Figura Suplementaria S2A). Después de la etapa de infección, las células se cultivaron en presencia de IL-7 para sustentar la viabilidad celular durante al menos 3 días. A nivel mundial, la expresión transgénica era baja en la población total de células nucleadas que expresaban CD45 (Tabla Suplementaria S1). Sin embargo, se transdujeron cantidades significativamente mayores de células en presencia de VF1 en comparación con los controles simulados sin vector (Tabla Suplementaria S1). Los efectos de LV-Sin1 fueron comparables a los de VSVg. Las células que se habían preactivado con IL-7 transducían mejor que las células infectadas inmediatamente después del aislamiento.
Tabla Suplementaria S1: Transducción de CMSP enteras con LV-Sin1 y LV-Sin2 en presencia de Vectofusina 1
Leyenda:Porcentaje promedio±DE del total de células nucleadas (CD45+) que expresan GFP, 3 días después de la infección de CMSP. Las células se preactivaron con IL-7 o no, como se indica, y se transdujeron con el LV indicado en presencia o en ausencia del aditivo Vectofusina 1 (VF1). Las CMSP se obtuvieron de diferentes donantes y se indica el número de donantes (n) analizados. (&) p<0,05 en comparación con "sin vector" en una prueba de la t de Student de datos independientes
Las CMSP contienen múltiples subconjuntos de células en distinta proporción. Como se muestra en la Figura 3 y en la Tabla 2, se encontró expresión transgénica en una gran proporción de linfocitos B CD19+ y en células mieloides CD11c+/dendríticas (que son una minoría en las CMSP) mientras que sólo se marcó una fracción de células T CD3+ (que son más abundantes en las CMSP) de acuerdo con los bajos resultados globales de transducción obtenidos en células CD45+. Un promedio del 59 % de cada una de las células CD19+ o de las células CD11c+ se transdujo con LV-Sin1 tras una preactivación con IL-7 (Tabla 2). Como se observó con las células 293T y BeWo, la adición de VF1 fue necesaria para lograr la transducción de CMSP, ya que se transducían pocas células en ausencia de este aditivo. El péptido VF1 también potenció la transducción de CMSp con LV-VSVg.
Tabla 2: Transducción de subconjuntos de células de sangre periférica humana con el LV seudotipificado con sincitina
sin activación células B CD19+ células T CD3+ células mieloides CD11c+ PBS 0,0 ± 0 0,1 ± 0,1 0,2 ± 0,3
LV-Sin1 2,3 ± 4,3 1,3 ± 2,6 5,5 ± 6,3
LV-Sin2 0,6 ± 0,4 0,4 ± 1,0 0,2 ± 8,2
LV-VSVg 3,6 ± 5,0 2,8 ± 2,9 11,5+3,5
VF1 3,3 ± 4,0 0,24 ± 0,2 7,8 ± 8,4
LV-Sin1 VF1 35,7 ± 24 3,61 ± 3,6 57,7 ± 11
LV-Sin2 VF1 22,2 ± 26 1,49 ± 1,9 35,5 ± 34
LV-VSVg VF1 27,6 ± 17 0,97 ± 0,6 45,2 ± 16
IL-7 células B CD19+ células T CD3+ células mieloides CD11c± activación
PBS 0,3 ± 0,4 0,5 ± 0,4 0,8 ± 0,6
LV-Sin1 2,1 ± 2,6 0,8 ± 0,3 4,1 ± 6,0
LV-Sin21,8 ± 1,5 1,5 ± 1,0 2,2 ± 2,2
LV-VSVg2,6 ± 1,6 1,3 ± 0,6 2,4 ± 0,8
VF1 0,8 ± 0,5 0,18 ± 0,2 0,25 ± 0,5
LV-Sin1 VF1 59,3 ± 23 11,2 ± 19 59,2 ± 18
LV-Sin2 VF1 44,0 ± 24 6,1 ± 10 40,1 ± 15
LV-VSVg VF1 32,1 ± 18 3,5 ± 1,4 35,1 ± 10
Leyenda:se transdujeron CMSP humanas con los vectores indicados, con o sin Vectofusina 1 (VF1) en condiciones estables (sin activación) o después de una breve preactivación nocturna con IL-7, y posteriormente se cultivaron con IL-7 durante 3 días. Los resultados de la transducción se expresan como el porcentaje promedio±DE de células positivas a GFP en CD3+ (células T), de células CD19+ (células B) o CD11c+ (células dendríticas mieloides) en cultivo, 3 días después de la infección. Los datos representan 3 experimentos distintos sin VF1 y de 8 a 9 experimentos distintos en presencia de VF1.
Cabe destacar que, fue posible transducir células CD19+ no activadas, lo que sugiere que las sincitinas pueden dirigirse a células verdaderamente indiferenciadas. Se han caracterizado varios subconjuntos de células B CD19+ (Kaminskiet al,2012), incluidas células CD19+ CD27- IgD+ indiferenciadas (50-70 % de la población); células CD19+ CD27+ IgD+ de memoria no cambiadas (15-20 % de la población); células CD19+ CD27+ IgD- IgM- de memoria cambiadas (2-5 % de la población); células CD19+ CD27+ IgD-IgM+ de memoria cambiada IgM solamente (2-5 % de la población) y plasmoblastos CD19+ CD27hi (1-2 % de la población). En la Figura Suplementaria S2B se muestran las estrategias de selección FACS después de la infección de CMSP. En general, los subconjuntos tanto de células B indiferenciadas como las de memoria, fueron transducidos eficazmente con los vectores seudotipificados con sincitina independientemente de la activación previa (Figura 3). Con mayor detalle, se observó que todos los subconjuntos de células B de memoria se transducían en ausencia de activación previa (Tabla 3). En estas condiciones de no activación, los vectores seudotipificados con sincitinas transducen las células B con mayor eficacia que los LV-VSVg, lo que sugiere un tropismo específico de las sincitinas por estas células. Los efectos de las transducciones de células B de LV-Sin1 y LV-Sin2 resultaron ser dependientes de la concentración del vector (Figura 4) e independientes del transgén. Casi todas las células CD19+ de sangre periférica pueden transducirse utilizando 106 UT/ml de vectores LV-Sin1 o LV-Sin2 que codifican GFP o ANGFR, proporcionando de este modo un sistema muy eficaz para expresar varios tipos de proteínas heterólogas en estas células.
Tabla 3: Porcentaje de transducción de subconjuntos de células B
moria sólo Memoria
Indiferenciadas Memoria no Me
cambiada cambiada Plasmoblastos PBS0,2 ± 0,3 0,0 ± 0 0,3 ± 0,5 0,5 ± 1 0,3 ± 0,6
VF1 0,6 ± 0,5 1 ± 0,1 0 ± 0 0,3 ± 0,5 0,3 ± 0,6
LV-Sin10,4 ± 1,1 1 ± 0,9 0,2 ± 0,3 0 ± 0 0,3 ± 0,6
LV-Sin1+VF1 62 ± 26 23 ± 3,3 16 ± 13 41 ± 11 32 ± 13
LV-Sin21 ± 0,1 4 ± 5,2 5 ± 6 4 ± 5,3 1,00 ± 1,4
LV-Sin2+VF1 52 ± 29 29 ± 15 27 ± 34 26 ± 30 29 ± 8,5
LV-VSVg0,1 ± 0,1 9 ± 8,4 4 ± 4 10 ± 16 2 ± 1,1
LV-VSVg+VF1 14 ± 14 18 ± 16 12 ± 11 20 ± 11 nd
Leyenda:Se transdujeron CMSP humanas en condiciones estables con LV-Sin1 o LV-Sin2 (1E105 UT/ml) o LV-VSVg (1E107 UT/ml). Los resultados son el porcentaje promedio±DE de células positivas a GFP en las poblaciones indicadas definidas como células B indiferenciadas (células CD3-, CD19+, CD27-, IgM+, IgD+); células B de memoria no cambiadas (células CD3-, CD19+, CD27+, IgM+, IgD+); células B de memoria sólo IgM (células CD3-, CD19+, CD27+, IgM+, IgD-); células B de memoria cambiadas (CD3-, CD19+, CD27+, IgM-, IgD-) y plasmoblastos (CD3-, CD19+, expresión elevada de CD27), 3 días después de la infección. Los datos representan de 2 a 3 experimentos distintos con de 1 a 2 donantes diferentes por experimento. nd=no determinado porque había muy pocas células para analizar en la ventana de selección.
Las células B funcionales se transducen de forma estable con vectores seudotipificados con sincitina
Para descartar que los efectos observados fueran inespecíficos, causados por seudotransducción o por autofluorescencia artefactual de Vectofusina 1 que puede producirse en la agregación (Fenardet al2013) el inventor verificó la integración provírica en células tratadas con el vector y cultivadas a lo largo del tiempo. Tras la adición delvector a las células, los inventores añadieron CD40L e IL-4 para activar y expandir el cultivo durante 8-14 días. En dichos cultivos, los inventores detectaron copias de vectores específicamente cuando los vectores se añadieron junto con Vectofusina 1 (Tabla 4) aunque las condiciones no eran óptimas para garantizar la supervivencia de todas las células. Además, utilizando señales de activación de células B, tales como el ligando CD40 (CD40L) y la IL-21 que, según se había informado anteriormente, son esenciales para el desarrollo de células B de memoria (Recheret al2011), los inventores confirmaron que las células B transducidas podían activarse de manera eficaz (Tabla 5). Utilizando marcaje con CFSE y citometría de flujo para detectar la división de células B y la expresión de transgenes, los inventores confirmaron el marcaje de células capaces de responder a CD40L e IL-21 y con fenotipo de célula B activada, incluyendo plasmoblastos (Tabla 5). Para confirmar adicionalmente la transducción de células B funcionales, los inventores utilizaron el VEB para transformar CMSP inmediatamente después de que se hubieran infectado con el vector LV-Sin1 y obtuvieron células linfoblásticas que contenían secuencias del vector integradas de forma estable (Tabla 4). Estos resultados confirman que los vectores de sincitina pueden transducir de forma estable células B primarias que conservan la capacidad funcional de proliferar y expandirse.
Tabla 4: Las células B funcionales se transducen de forma estable con LV seudoti ificados con sincitina
Leyenda:Las CMSP se activaron con IL-7 y se transdujeron en las condiciones indicadas, después se cultivaron durante 6-13 días en presencia de CD40L e IL4 (tabla superior) o se incubaron con el VEB y ciclosporina A para su inmortalización utilizando procedimientos estándar y se cultivaron durante 2 semanas (tabla inferior). En los momentos indicados, se extrajo ADN genómico del cultivo y se midió el número promedio de copias del vector (NCP) integrado por célula mediante qPCR. En el experimento 2 de transformación del VEB, se muestran los resultados con 3 donantes de sangre diferentes.
T l . A iv i n in vi r l l B D1 rim ri r n i
Leyenda.Las CMSP se marcaron con CFSE 2 pM,setransdujeron con Lv-Sin1-2 NGFR, y se cultivaron en ausencia o en presencia de ligando CD40L [2 pg/ml] e IL-21 [50 ng/ml]. Después de 3 y 6 días de cultivo, la transducción de células B (es decir, la expresión de NGFR), la proliferación de células B (es decir, la dilución de CFSE) y la frecuencia de plasmoblastos CD19+ CD27++, se determinaron mediante citometría de flujo.
Transducción de células B primarias murinas
Durante 3 días, se cultivaron esplenocitos aislados recientes con los vectores LV-Sin1 o LV-Sin2 que codificaban ANGFR. Como se muestra en la Figura Suplementaria S7, esto dio lugar a una transducción muy eficaz de células B CD19+. En estos cultivos, en proporción, se transducían muchas menos células CD19-, confirmando así el tropismo particular de los vectores seudotipificados con sincitina para las células B en ratones, al igual que en seres humanos. Los datos también muestran que las glucoproteínas sincitina 1 y sincitina 2 reconocen a sus homólogos murinos, y estos hallazgos facilitarán futuros estudios preclínicos con estos vectores.
Transducción de células CD11c+
Como se observa en la Figura 3, una gran proposición de células CD19- CD3- CD11c+ fue transducida con LV-Sin1 y LV-Sin2 desde CMSP sin activación previa y en presencia de Vectofusina 1. Otros fenotipos mostraron que estas células CD11c también expresaban altos niveles de HLA-DR y se transducían eficazmente con los vectores seudotipificados con sincitina (Figura 5). Las células se cultivaron en GM-CSF IL-4, y expresaron CD1a, CD80, CD86 pero no CD14, lo que sugiere que eran células dendríticas inmaduras (Figura Suplementaria S3A). Además, también se transdujeron células CD14+ HLA-DR+ que tenían el fenotipo de células monocíticas (Figura Suplementaria S3B). Por tanto, tanto LV-Sin1 como LV-Sin2 pueden utilizarse eficazmente para expresar un transgén en células presentadoras de antígenos.
Los vectores LV-Sin1 y LV-Sin2 no transducen eficazmente células T humanas primarias
Las células T de sangre periférica no se transdujeron eficazmente con el LV seudotipificado con sincitina, aunque algunas células podrían transducirse después de su activación. Tras una activación previa con IL-7, una pequeña proporción de células T de sangre periférica se transdujo con los vectores LV-Sin1 o LV-Sin2, pero estos efectos no fueron congruentes en todos los experimentos (Figura 3 y Tabla 2). Sin activación previa, los niveles de transducción eran siempre bajos.
Por tanto, se observa una transducción diferencial de los subconjuntos de glóbulos sanguíneos con los vectores seudotipificados con sincitina.
Expresión de los receptores de ASCT2 y MFSD2a en subconjuntos de glóbulos sanguíneos y estirpes celulares
ASCT2 y MFSD2a, que son respectivamente los receptores de entrada de la sincitina-1 y la sincitina-2, se detectaron en la superficie celular de subconjuntos de glóbulos sanguíneos mediante detección por inmunofluorescencia indirecta (Figura 6A). El mayor porcentaje de células que expresaban estos marcadores eran células CD19+ y CD11c+, mientras que las células T expresaban niveles más bajos de estos receptores (Figura 6B). Estos resultados se confirmaron mediante qRT-PCR, que muestran por primera vez que las células B humanas expresan MFSD2a y ASCT2 (Figura 6-C). También se encontró expresión de ASCT2 y MFSD2a en las células 293T, mientras que en las células HCT116, no transducidas con los vectores, el nivel de expresión fue mucho más bajo (Figura Suplementaria S4). En las células analizadas, la expresión de los receptores se correlacionó bien con los niveles de transducción que se alcanzaron.
Las estirpes de células B y T humanas se transducen con vectores seudotipificados con sincitina
Para ampliar los resultados obtenidos en células primarias y seguir evaluando la especificidad celular de los vectores seudotipificados con sincitina, los inventores intentaron transducir un panel de estirpes celulares humanas. Se analizaron células B Raji de linfoma de Burkitt y células T Jurkat. Las células B Raji pudieron transducirse con los vectores seudotipificados con Sincitina (Figura Suplementaria S5). Los niveles más altos obtenidos en células Raji utilizando 2 x 106 UT/ml del vector LV-Sin2, alcanzaron el 16 % (frente al >90 % alcanzado con 106 UT/ml en células B primarias, como se aprecia en la Figura 4). Los inventores verificaron que las células Raji eran permisivas para la transducción con LV porque el 88 % de las células Raji se transducían con 108 UT/ml de LV-VSVg (control de la Figura Suplementaria S5, no mostrada). En un experimento, las células Raji transducidas se clasificaron mediante citometría de flujo y se cultivaron durante 49 días, demostrando la integración estable del transgén durante periodos de tiempo prolongados (Tabla Suplementaria S2). Las células T Jurkat se transdujeron parcialmente con vectores seudotipificados con sincitina (Figura Suplementaria S5). Por tanto, los LV seudotipificados con sincitina pueden usarse como herramientas de transferencia de genes en algunas estirpes celulares. En las células B, la transducción parece ser más eficaz en células primarias que con estirpes de células B establecidas.
Tabla Suplementaria S2: Transducción estable de células Raji con vectores seudotipificados con Sincitina
Leyenda:Se utilizaron tres vectores diferentes que codificaban la GFP a una concentración de 1,2 105 UT/ml para infectar células Raji en presencia de Vectofusina 1 (12 pg/ml). Después de 2 semanas, la expresión de la GFP fue del 2,5%con el vector LV-Sin1, del 5%con LV-Sin2 y del 100%con LV-VSVg. Después de 30 días, las células que expresaban la GFP (GFP+) o no (GFP-) se seleccionaron por citometría de flujo y se cultivaron hasta el día 49 para medir la expresión de la GFP por FACS y el número promedio de copias del vector (NCV) por célula mediante qPCR.
Corrección funcional en un déficit inmunitario primario
La inmunodeficiencia combinada grave de tipo 1 (SCIDX1) es una inmunodeficiencia primaria ligada al cromosoma X que está causada por mutaciones en el gen de la cadena gamma del receptor de interleucina 2 (IL2Rg). El trasplante alogénico de médula ósea puede curar la enfermedad, pero algunos pacientes permanecen con una corrección incompleta, presentado solo un quimerismo parcial en las células B (Recheret al2011). Los pacientes con un quimerismo inferior al 5 % de células B no pueden madurar ni producir inmunoglobulinas. Sus células B no pueden convertirse en células B de memoria maduras secretoras de IgG. De hecho, recientemente se ha descubierto que IL2Rg es también el receptor de IL-21 que proporciona señales esenciales para la maduración de las células B (Recheret al2011). Se han realizado diversos ensayos de genoterapia para tratar esta enfermedad utilizando la transferencia del gen IL2Rg en células madre y progenitoras hematopoyéticas. Sin embargo, sin la preparación del paciente, las células corregidas genéticamente solo producen células T corregidas y las células B permanecen sin corregir, como se muestra en el ensayo de genoterapia más reciente (Hacein-Bey-Abinaet al2014). Como resultado, las células B de dichos pacientes no son funcionales y los pacientes siguen dependiendo de infusiones de inmunoglobulina para prevenir infecciones. Esto llevó a los inventores a preguntarse si los vectores seudotipificados con sincitina podrían utilizarse para transferir IL2Rg a las células B periféricas en pacientes que no se han corregido completamente mediante genoterapia. Se obtuvieron células de un paciente. Se observó que las células mononucleares de la sangre del paciente contenían células T CD3+ IL2Rg+, pero al contrario de lo que ocurría en individuos sanos, las células B CD19+ de la sangre del paciente no expresaban el marcador de maduración CD27, no expresaban IL2Rg (Figura 7 A y B) y no producían IgG (Tabla 6). Después de la transferencia génica con vectores LV-sincitina1 que codifican el IL2Rg, las células de los pacientes pudieron responder a CD40L+IL-21 produciendo IgG en el medio, aunque no se detectaron marcadores de activación en las células, probablemente debido al alto nivel de mortalidad de estas frágiles células en cultivo. Estos resultados demuestran que las células B de sangre periférica pueden dirigirse por transferencia génica para proporcionar alguna corrección funcional en SCIDX1 y que los LV seudotipificados con sincitina son herramientas útiles en esta aplicación.
Experimentos in vivo
La transducción eficaz de células B humanas primarias mediante LV-Sin1 llevó a probar si este vector funcionabain vivo.Ratones NSG inmunodeficientes se injertaron primero con 107 CMSP por ratón y al día siguiente recibieron una única embolada de LV-Sin1 por vía intravenosa. Después de 7 días, los ratones se sacrificaron y se examinaron diferentes tejidos. En 2 ratones de 3, los inventores descubrieron la presencia de células B humanas CD45+ CD19+ en el bazo en las que una pequeña proporción (3-15 %) expresaba GFP, lo que sugería que se habían transducidoin vivo(Figura Suplementaria S6). Estos resultados preliminares sugieren la posibilidad de usar vectores seudotipificados con sincitina para dirigirse a células B humanasin vivo.
EJEMPLO 2: Sincitina A murina y suministro génico in vivo con LV-SinA en ratones. Producción de partículas de LV-SinA estables e infecciosas
Materiales y métodos (véanse también los materiales y métodos del ejemplo 1)
Clonación de Sincitina A y producción de LV-Sin A.
a. Generación de un plásmido que expresa la Sincitina A murina.
La clonación del ADNc de la sincitina A murina en los sitios HindIII y XbaI del plásmido de expresión eucariota pcDNA3.1, se realizó insertando un fragmento amplificado por PCR del plásmido pUC-SinA generado por Genecust (Ellange, Luxemburgo) y que contenía el ADNc de longitud completa del gen de la Sin A murina (referencia Ensembl ENSMUSG00000085957) utilizando los siguientes cebadores, directo 5' AGCAAGCTTATGGTTCGTCCTTGG 3' (SEQ ID NO:32) (Tf = 69,8 °C; % de GC = 50 %; Sigma, Saint-Louis, EE.UU.) e inverso 5' AGCTCTAGACTAGACGGCATCCTC 3' (SEQ ID NO:33) (Tf = 65 °C; % de GC = 54 %; Sigma) y ligando dicho fragmento. El plásmido se verificó mediante secuenciación (Beckman Coulter Genomics, Takeley, RU).
b. Producción de vectores lentivíricos seudotipificados con Sin A.
Células HEK293T sembradas en matraces T de 175 cm2 en DMEM suero bovino fetal (FCS) al 10 % se cotransfectaron con los 4 plásmidos siguientes (cantidades por matraz): pKLgagpol (14,6 |jg), pKRev (5,6 |jg), pcDNA3.1-SinA (20 jg), y plásmido de transferencia PRRL-SFFV LuclI o pRRL-SFFV-LucII-2A-ANGFR-WPRE (22,5 jg). Después de 24 horas, las células se lavan y se añade medio reciente. Al día siguiente, el medio se recoge, se clarifica por centrifugación a 1500 rpm durante 5 min y se pasa por un filtro de 0,45 jm , después se concentró por ultracentrifugación a 50000 g durante 2 h a 12 °C y se conservó a -80 °C hasta su uso.
c. Titulación de LV seudotipificado con sincitina A.
El título físico se determinó mediante ELISA de p24 al igual que para otros tipos de LV. El título infeccioso se determinó como título de genoma infeccioso (GI/ml) utilizando la estirpe celular A20 de linfoma murino. Durante 6 horas, se añaden diluciones en serie del vector a células A20 en presencia de Vectofusina 1® (12 jg / jl) . Se renueva el medio y se incuban las células durante 7 días y se obtiene a Dn genómico para medir el número de copias del vector por células mediante qPCR dúplex en el analizador iCycler 7900HT (Applied Biosystems) con los cebadores: PSI directo 5'CAGGACTCGGCTTGCTGAAG3' (SEQ ID NO:34), PSI inverso 5'TCCCCCGCTTAATACTGACG3' (SEQ ID NO:35), y una sonda PSI marcada con FAM (6-carboxifluoresceína) 5'CGCACGGCAAGAGGCGAGG3' (SEQ ID NO:36), Titina directo 5'-AAAACGAGCAGTGACGTGAGC3' (SEQ ID NO:37), Titina inverso 5'TTCAGTCATGCTGCTAGCGC3' (SEQ ID NO:38) y una sonda de Titina marcada con VIC 5'TGCACGGAAGCGTCTCGTCTCAGTC3' (SEQ ID NO:39).
Transferencia génica bioluminiscente in vivo en ratones.
Se produjo un vector LV-SinA que codifica LucII y se inyectaron 5x 105 UT del vector por vía intravenosa en ratones albinos C57Bl/6. Los controles incluían LV-VSVg que codifica LucII y PBS. Para la detección de bioluminiscencia, los ratones se anestesiaron con ketamina (100 mg/kg)/xilasina (10 mg/kg) y se administraron 100 j l de D-luciferina 150 jg/m l por vía intraperitoneal y 10 minutos después, se obtuvieron imágenes con una cámara CCD ISO14N4191 (IVIS Lumina, Xenogen, MA, EE. UU.). Se obtuvo una imagen bioluminiscente a los 3 min utilizando un campo de visión de 15 cm, un binning (resolución) de factor 4, una apertura del diafragma de 1/f y con filtro abierto. Las regiones de interés (RDI) se definieron manualmente (utilizando un área estándar en cada caso), las intensidades de las señales se calcularon con el programa informático Living Image 3.0 (Xenogen) y se expresaron en fotonespor segundo.El flujo de fotones de fondo se definió a partir de una RDI dibujada sobre los ratones de control o el músculo de control donde no se había administrado ningún vector.
RESULTADOS
Se exploraron las sincitinas murinas para aplicacionesin vivo.La sincitina A es un homólogo murino no ortólogo pero funcionalmente similar a las sincitinas 1 y 2 humanas (Dupressoiret al2005). La SinA murina se clonó en un plásmido de expresión y se utilizó para producir partículas de vectores lentivíricos. Se descubrió que la Sincitina A podía seudotipificar satisfactoriamente vectores lentivíricos (LV) procedentes del VIHr. Se utilizaron las mismas condiciones ya definidas para la producción de LV seudotipificado con sincitina humana (22 Ug de ADN por placa, una sola recogida) para generar LV-SinA estables. Los LV-Sin A fueron muy eficaces en la transducción de la estirpe celular A20 de linfoma B murino en presencia de VF1 (Figura S8) (Tabla suplementaria S4). Se descubrió que la SinA era tan eficaz como sus homólogos humanos para transducir células B murinas primarias no activadasin vitro.Como se observa en las Figuras 8 y 9, los LV-SinA pudieron transducir sin tratamiento previo de células B murinas procedentes del bazo (Figura 8) y de la médula ósea (Figura 9). Estos experimentos demuestran también que es posible transducir células T murinas. La transducción de células B220 de expresión baja sugiere que las células B inmaduras se transdujeron y que podían ser objeto para aplicaciones biológicas.
Curiosamente, fue posible transducir células B CD19+ humanas con LV seudotipificado con la sincitina A murina (tabla suplementaria S5)
LV-Sin A demostró ser eficaz en ratones para el suministro de genesin vivo.La Figura 10 muestra la detección bioluminiscente del transgén 16 días después de la inyección de un vector LV-SinA que codifica LucII. El vector se inyectó a través de la vena de la cola de los ratones y los inventores no utilizaron vectofusina para ello. La presencia del vector en los esplenocitos CD45+ CD19+ se confirmó purificando los esplenocitos mediante clasificación celular por citometría de flujo y midiendo los niveles de transducción mediante q-PCR (tabla suplementaria S3). Por tanto, las sincitinas son herramientas únicas para actuar como mediadoras en la entrada en células B humanas y murinasin vitroein vivo.
Tabla suplementaria S3: Suministro in vivo del transgén LucII con LV-SinA.
Leyenda: la tabla muestra el número de copias del vector obtenido en las subpoblaciones celulares obtenidas mediante clasificación celular por citometría de flujo de esplenocitos utilizando anticuerpos CD45 y CD19. Las células CD45- representan células estromales de origen no hematopoyético. Las células CD45+ CD19+ son células B.
Tabla suplementaria S4: Titulación infecciosa de Lv-SinA en la estirpe celular A20 de linfoma B murino.
Leyenda: diferentes producciones y títulos de LV-SinA y LV-VSVg obtenidos en partículas físicas (ng de p24/ml) y partículas infecciosas (UT/ml y GI/ml). UT: unidad de transducción, GI: genoma infeccioso.
Tabla suplementaria S5:Transducción de células B CD19+ humanas con LV seudotipificado con sincitina A.
Leyenda:Se obtuvieron células B CD19+ de sangre periférica humana de 3 donantes de sangre distintos, y se prepararon mediante separación con Ficoll de las células mononucleares seguida de selección positiva de células B CD19+ utilizando perlas magnéticas y el sistema AutoMacs de Miltenyi. Las células CD19+ se incubaron en las condiciones indicadas, utilizando diversas preparaciones de LV seudotipificados con sincitina A, o sincitina 1 y que expresaban diferentes transgenes. Se utilizaron 2 pl de vector concentrado en las células en presencia de Vectofusina 1 (12 pg/ml). Las células se lavaron después de 6 horas y se cultivaron durante 4 días antes de medir el número de copias del vector integrado por célula utilizando una qPCR dúplex como se describe en (Mertenet al.2011).
EJEMPLO 3: Determinación física de los títulos: correspondencia entre el título físico obtenido por ELISA con RT de p24 y por recuento directo de partículas con un contador automatizado.
Los títulos físicos se determinaron mediante 2 métodos diferentes para vectores lentivíricos (LV) derivados del VIH-1 seudotipificados con sincitina 1 (S1), sincitina 2 (S2), sincitina A (SA) o con VSVg, y que codifican la forma truncada del receptor del factor de crecimiento nervioso (ANGFR) o la proteína verde fluorescente (GFP). Los LV se produjeron por transfección transitoria, se concentraron por ultracentrifugación y se criopreservaron a -80 °C antes de la titulación.
Los métodos consistían en (a) un ELISA que medía la concentración de p24 en la muestra seguido de un cálculo del título como partículas físicas (pf) suponiendo que 1 fg de p24 corresponde a 12 pf de LV (Farsonet al,2001) o (b) el uso del contador de partículas NS300 Nanosight de Malvern Instruments (RU) que mide directamente la concentración de partículas en la muestra mediante microscopía automatizada.
Tabla su lementaria S6:
En promedio, un factor de conversión entre el título en pf/ml (ELISA P24) y el título en pf/ml (Nanosight) obtenido como [(título medio con ELISA P24) / (título medio con Nanosight)] es de aproximadamente 3,7, es decir, de aproximadamente 4.
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Claims (10)

REIVINDICACIONES
1.Uso in vitrode un preparado de partículas para la transducción de células inmunitarias, en donde el preparado comprende partículas lentivíricas concentradas seudotipificadas estables con una sincitina de retrovirus endógeno (sincitina de ERV) y el empaquetamiento de un gen heterólogo de interés, que comprende un título de partículas físicas superior a 1 x 105 ng de p24/ml y/o de partículas infecciosas superior a 2 x 104 UT/ml.
2. El usoin vitrode acuerdo con la reivindicación 1, en donde la sincitina de ERV se selecciona del grupo que consiste en HERV-W, HERV-FRD, sincitina A murina, sincitina B murina, sinticina Ory1, sincitina Car1 y sincitina Rum1.
3. El usoin vitrode acuerdo con la reivindicación 2, en donde la sincitina de ERV se selecciona del grupo que consiste en HERV-W, HERV-FRD y sincitina A murina.
4. El usoin vitrode acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el título de partículas infecciosas es superior a 1 x 105 UT/ml, 1 x 106 UT/ml o 2 x 106 UT/ml, y/o en donde el título de partículas físicas es superior a, 1,1 x 105 ng de p24/ml o 1,5 x 105 ng de p24/ml.
5. El usoin vitrode acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde las células inmunitarias se seleccionan del grupo que consiste en células B, células T, células NK, macrófagos y células dendríticas.
6. El usoin vitrode acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para biogenotecnología o genomodificación de células B.
7. El usoin vitrode acuerdo con la reivindicación 6, para la producción de inmunoglobulinas.
8. Un procedimientoex vivopara obtener células inmunitarias modificadas para expresar un gen heterólogo de interés, que comprende una etapa de infectar células inmunitarias con el preparado de partículas como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
9. El procedimientoex vivode la reivindicación 8, en donde éste se realiza en presencia de un péptido LAH4 o un derivado funcional del mismo, y/o en donde las células inmunitarias se eligen entre células B, células T, células dendríticas, monocitos y macrófagos.
10. El procedimientoex vivode una cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9, en donde éste comprende las siguientes etapas:
- opcionalmente, estimular las células inmunitarias indiferenciadas incubándolas en un medio que comprenda IL-7, e
- infectar las células inmunitarias indiferenciadas, estimuladas o no, con dicho preparado de partículas como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en presencia de un péptido LAH4 o de un derivado funcional del mismo.
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