ES3032258B2 - ARNs largos no codificantes mitocondriales como biomarcadores de cáncer colorrectal - Google Patents

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0003] ARNs largos no codificantes mitocondriales como biomarcadores de cáncer colorrectal

[0004] Campo técnico

[0006] La presente invención pertenece al campo técnico de la medicina, en particular pertenece al campo de la oncología y la neurología y, más particularmente, se refiere a ARNs largos no codificantes útiles como marcador para la detección y/o seguimiento de tumores y enfermedad de Alzheimer, y como diana terapéutica para dichas patologías.

[0008] Antecedentes de la invención

[0010] El cáncer es la principal causa de muerte en el mundo, siendo el cáncer colorrectal el tercero más común, con una incidencia anual mundial de 1,9 millones y una mortalidad estimada de 935.000 casos anuales. La mayoría de los cánceres colorrectales tienen su origen en mutaciones esporádicas, aunque hay un pequeño grupo que tiene su origen en mutaciones hereditarias. Otro grupo de enfermedades con gran impacto en nuestra sociedad son las enfermedades neurodegenerativas. Esto se debe a que el incremento en la esperanza de vida de las sociedades occidentales se traduce en un aumento significativo de estas enfermedades.

[0012] Un biomarcador es una molécula, organismo o secuencia de material genético, que puede utilizarse para medir la presencia o ausencia de una enfermedad, su progresión o su respuesta frente a un tratamiento. Para ser útil, un biomarcador debe ofrecer una alta sensibilidad, especificidad y seguridad (Zvirblyte y Mazutis (2022)Microfluidics for Cancer Biomarker Discovery, Research, and Clinical Application. Adv Exp Med Biol 1379:499-524). En el cáncer colorrectal, las alteraciones producidas por inestabilidad cromosómica (CIN), inestabilidad de microsatélites (MSI) o el fenotipo metilado de islas CpG (CIMP) producen cambios en el ADN, ARN, proteínas y/o metabolitos que pueden medirse tanto en el tumor, como en la sangre o en las heces y que se pueden usar como biomarcadores de diagnóstico o de progresión/pronóstico. Estos biomarcadores se pueden utilizar para predecir el resultado de una intervención quirúrgica o farmacológica o para tener información sobre la respuesta a un tratamiento.

[0014] A pesar de que los biomarcadores ayudan a tener mejores resultados gracias al uso de tratamientos personalizados, en el cáncer y las enfermedades neurodegenerativas los biomarcadores disponibles son muy escasos. Por ejemplo, en el cáncer colorrectal se ha demostrado que en pacientes con MSI elevado, el tratamiento con 5-fluorouracil no es eficaz, pero el oxaliplatino surge efecto en este tipo de cáncer (Fekete y Gyorffy (2023)New Transcriptomic Biomarkers of 5-Fluorouracil Resistance. Int J Mol Sci 24(2):1508. También se ha comprobado que las mutaciones en RAS, KRAS o BRAF actúan como biomarcadores de respuesta al tratamiento, ya que los tumores con mutaciones en estos genes producen resistencia al tratamiento anti- receptor del factor de crecimiento epidérmico (anti-EGFR) con cetuximab (Malki et al. (2020)Molecular Mechanisms of Colon Cancer Progression and Metastasis: Recent Insights and Advancements. Int J Mol Sci 22(1):130). En el caso de las enfermedades neurodegenerativas, se han descrito biomarcadores a partir del líquido cefalorraquídeo, obtenidos mediante neuroimagen funcional y algunos biomarcadores sanguíneos, pero la mayor parte de ellos tienen un alto coste, son muy invasivos o presentan una aplicación clínica limitada. Por todo ello, hay una gran necesidad de encontrar biomarcadores con alta sensibilidad y especificidad que sirvan para identificar a los pacientes en las primeras fases de su dolencia.

[0016] Los distintos tipos de ARN, y especialmente los no codificantes, han atraído recientemente la atención como posibles biomarcadores, dado su alto número y grado de especialización. Por ejemplo, el miR-31-3p se ha propuesto como un biomarcador en pacientes de cáncer colorrectal sin mutación de KRAS sometidos al tratamiento con anti-EGFR. En estos pacientes, una baja expresión de miR-31-3p se correlaciona con una mayor supervivencia (Boisteau et al. (2022)MiR-31-3p do not predict anti-EGFR efficacy in first-line therapy of RAS wild-type metastatic right-sided colon cancer. Clin Res Hepatol Gastroenterol 46:101888). Entre estos ARNs, los ARNs largos no codificantes (lncRNAs de aquí en adelante) merecen una mención especial ya que regulan diferentes funciones celulares como la proliferación, la migración, la angiogénesis, la muerte celular y la metástasis, además de ser buenos candidatos a biomarcadores. Algunos ejemplos incluyen los lncRNAs ZEB1-AS1, FAM83H-AS1, LINC01296 y LINC01234, que se correlacionan con parámetros clinicopatológicos y la supervivencia de los pacientes con cáncer colorrectal (Qu et al. (2023)Prognostic and predictive value of a lncRNA signature in patients with stage II colon cancer. Sci Rep 13:1350).

[0018] Los lncRNAs pueden ser producidos tanto en el núcleo celular como en las mitocondrias. Las mitocondrias son orgánulos críticos que intervienen en la proliferación tumoral, la supervivencia, la metástasis y la resistencia a fármacos. El genoma mitocondrial contiene cientos de ARNs no codificantes. Sin embargo, muy pocos son a los que se les ha encontrado una aplicación clínica eficaz.

[0020] Los autores de la presente invención han identificado el lncRNA MDL1AS como un excelente biomarcador de diagnóstico y pronóstico en pacientes de cáncer y de la enfermedad de Alzheimer, y como diana terapéutica. Además, han identificado el lncRNA MDL1 como biomarcador de pronóstico en pacientes de cáncer colorrectal.

[0022] Objeto de la invención

[0024] Con el fin de resolver los inconvenientes del estado de la técnica y, en concreto, la falta de biomarcadores fiables para determinar el diagnóstico y pronóstico de cáncer y de la enfermedad de Alzheimer (también referida como Alzheimer de aquí en adelante), se han caracterizado los lncRNAs mitocondriales MDL1AS y MDL1. Como se muestra en los Ejemplos, el nivel de expresión de MDL1AS correlaciona con la presencia/ausencia de cáncer o Alzheimer, y predice la supervivencia de los pacientes de cáncer colorrectal. Este poder predictivo de la supervivencia también lo tiene MDL1. Además, se han diseñado técnicas para cuantificar adecuadamente estos lncRNAs y para reducir significativamente su expresión en células. La reducción de la expresión de MDL1AS tiene utilidad terapéutica, ya que se ha demostrado que propicia una disminución en el metabolismo mitocondrial de las células tumorales y en la capacidad proliferativa de dichas células.

[0026] Teniendo en cuenta lo anterior, la presente invención se refiere en unprimer aspectoa un métodoin vitropara el diagnóstico de cáncer o de Alzheimer en un sujeto, que comprende las siguientes etapas:

[0027] a) determinar el nivel de expresión del ARN largo no codificante MDL1AS en una muestra tomada de dicho sujeto;

[0028] b) comparar el nivel de expresión determinado en la etapa a) con una referencia;

[0029] c) identificar al sujeto como que padece o es susceptible de padecer cáncer colorrectal, si el nivel de expresión de la muestra es inferior a la referencia, o

[0030] identificar al sujeto como que padece o es susceptible de padecer cáncer de laringe, cáncer de mama o Alzheimer si el nivel de expresión de la muestra es superior a la referencia.

[0032] Unsegundo aspectode la presente invención se refiere a un métodoin vitropara el pronóstico de la supervivencia de un sujeto que padece cáncer colorrectal que comprende las siguientes etapas:

[0033] a) determinar el nivel de expresión de lncRNA MDL1AS y/o lncRNA MDL1 en una muestra tomada de dicho sujeto;

[0034] b) comparar el nivel de expresión determinado en la etapa a) con una referencia; donde un nivel de expresión igual o superior a dicha referencia es indicativo de un pronóstico positivo y un nivel de expresión inferior a dicha referencia es indicativo de un pronóstico negativo.

[0036] Untercer aspectode la presente invención se refiere a un método para evaluar la respuesta a un tratamiento de un sujeto con cáncer colorrectal que comprende determinar la expresión de lncRNA MDL1AS y/o lncRNA MDL1 en una muestra tomada de dicho sujeto antes y después del tratamiento, donde un aumento en el nivel de expresión de lncRNA MDL1AS y/o de lncRNA MDL1 en la muestra obtenida después del tratamiento es indicativo de buena respuesta al tratamiento.

[0038] Uncuarto aspectode la presente invención se refiere a un kit para llevar a cabo el método según el primer aspecto de la invención, que comprende medios para determinar el nivel de expresión de lncRNA MDL1AS, y se refiere también a un kit para llevar a cabo el método según el segundo y tercer aspecto de la invención que comprende medios para determinar el nivel de expresión de lncRNA MDL1AS y/o lncRNA MDL1.

[0040] Unquinto aspectode la presente invención se refiere al uso de un kit según el cuarto aspecto de la invención para llevar a cabo el método de uno cualquiera de los aspectos primero, segundo o tercero de la invención, según corresponda.

[0042] Unsexto aspectode la presente invención se refiere al uso del nivel de expresión del lncRNA MDL1AS como marcador para el diagnósticoin vitrode cáncer colorrectal, cáncer de laringe, cáncer de mama o Alzheimer. Asimismo, el sexto aspecto de la invención se refiere al uso del nivel de expresión del lncRNA MDL1AS y/o del lncRNA MDL1 como marcador para el pronósticoin vitrode cáncer colorrectal.

[0044] Unséptimo aspectode la presente invención se refiere a un inhibidor de la expresión del lncRNA MDL1AS seleccionado del grupo formado por DsiRNA, shRNA, siRNA, miRNA, CRISPR, oligómero antisentido, oligonucleótido gápmero, TALEN, nucleasa con dedos de Zinc y combinaciones de los mismos.

[0046] Unoctavo aspectode la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un inhibidor según el séptimo aspecto de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

[0047] Unnoveno aspectode la presente invención se refiere a un inhibidor de la expresión del ARN largo no codificante MDL1AS para su uso como medicamento.

[0049] Undécimo aspectode la presente invención se refiere a un inhibidor de la expresión del ARN largo no codificante MDL1AS para su uso en el tratamiento de un cáncer o de la enfermedad de Alzheimer.

[0051] Otros objetos, características, ventajas y aspectos de la presente solicitud serán evidentes para el experto en la materia a partir de la descripción y las reivindicaciones adjuntas.

[0053] Breve descripción de las figuras

[0055] LaFigura 1muestra un esquema de la estructura del genoma mitocondrial tal como aparece en la base de datos del genoma humano actual, como un ADN lineal interrumpido en el codón de iniciación de la replicación (A). En (B) se muestra la nueva representación del genoma mitocondrial necesaria para cuantificar correctamente la expresión de MDL1 y MDL1AS. Los genes MDL1 y MDL1AS se representan con una flecha negra rodeada de una elipse.

[0057] LaFigura 2muestra la expresión de MDL1 y MDL1AS en distintos tumores (blanco) comparada con la de los tejidos sanos adyacentes (tejido normal, negro). Los distintos tumores son tumor de colon (A), de recto (B), de mama (C) y de laringe (D). En los tumores de colon y recto se observa una disminución de MDL1AS cuando se compara con el tejido normal, mientras que en los de mama y laringe se observa un aumento de MDL1AS. RPKM:Reads per kilobase per million mapped reads. Cada barra representa la media y la desviación estándar (sd). Las diferencias estadísticas se muestran con asteriscos. *: p<0,05; **: p<0,01; ****: p<0,0001.

[0059] LaFigura 3muestra la expresión de MDL1 y MDL1AS en donantes sanos (negro) y en pacientes con la enfermedad de Alzheimer (blanco) en RPKM. Cada barra representa la media ± sd. Las diferencias estadísticas se muestran con asteriscos. **: p<0,01

[0061] LaFigura 4muestra las curvas de supervivencia (A) y la curva Característica Operativa del Receptor (ROC, del inglésReceiver Operating Characteristic) (B) para los pacientes de adenocarcinoma de recto según la expresión del lncRNA MDL1AS. En (A), la alta expresión se denota con la línea negra marcada con “a” y la baja expresión se denota con la línea gris marcada con “b”. En (B)se presenta la curva ROC con un área bajo la curva (AUC, del inglésArea Under the Curve)de 0,930 (p<0,0001), con una sensibilidad del 92,6% y una especificidad del 100%.

[0063] LaFigura 5muestra las curvas de supervivencia (A) y la curva ROC (B) para los pacientes de adenocarcinoma de recto según la expresión del lncRNA MDL1. En (A), la alta expresión se denota con la línea negra marcada con “a” y la baja expresión se denota con la línea gris marcada con “b”. En (B)se presenta la curva ROC con un AUC de 0,820 (p<0,0001), con una sensibilidad del 79,17% y una especificidad del 100%.

[0065] LaFigura 6muestra los resultados del silenciamiento del gen MDL1AS en células de carcinoma colorrectal HCT-116 (A) y en células de carcinoma de mama triple negativo MDA-MB-231 (B), relativos al control sin tratar, mediante un ARN de interferencia de doble hebra (DsiRNA) específico. Cada barra representa la media ± sd. La expresión del lncRNA se ha comparado con un gen de referencia nuclear (GAPDH) y con uno mitocondrial (ND1), con resultados idénticos. Las columnas en negro representan el control no tratado y las columnas en blanco las muestras silenciadas con DsiRNA.

[0067] LaFigura 7muestra los resultados de un experimento de actividad mitocondrial en la línea celular MDA-MB-231 normal (control, negro y círculos) y silenciada (DsiRNA, gris y triángulos) realizado con el dispositivo “Seahorse”. Las gráficas obtenidas en el dispositivo a medida que se añaden distintos inhibidores (A) ya indican claras diferencias debidas al silenciamiento, que se pueden ver cuantificadas en los histogramas (B-D). Cada barra representa la media ± sd de 15 medidas independientes. Las diferencias estadísticas se muestran con asteriscos. ****: p<0,0001.

[0069] LaFigura 8muestra los resultados de un experimento de actividad mitocondrial en la línea celular HCT-116 normal (control, negro y círculos) y silenciada (DsiRNA, gris y cuadrados) realizado con el dispositivo “Seahorse”. Las gráficas obtenidas en el dispositivo a medida que se añaden distintos inhibidores (A) ya indican claras diferencias debidas al silenciamiento, que se pueden ver cuantificadas en los histogramas (B-D). Cada barra representa la media ± sd de 15 medidas independientes. Las diferencias estadísticas se muestran con asteriscos. ****: p<0,0001.

[0071] LaFigura 9muestra los resultados del silenciamiento del gen MDL1AS sobre la capacidad de proliferación de la línea celular HCT-116 normal, sin silenciar (control, negro y círculos) y silenciada (DsiRNA, gris y cuadrados). Las diferencias estadísticas se muestran con asteriscos. ****: p<0,0001.

[0072] Descripción de la invención

[0074] Como se usa en la presente solicitud, las formas en singular “un/uno”, “una” y “el/la" incluyen sus correspondientes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el significado que un experto en la técnica a la que esta invención pertenece entiende habitualmente.

[0076] Como se muestra en el Ejemplo 2, el nivel de expresión de MDL1AS correlaciona con la presencia/ausencia de ciertos cánceres y de la enfermedad de Alzheimer. Así, la presente invención se refiere en unprimer aspectoa un método para el diagnóstico, en particular un métodoin vitropara el diagnóstico (también referido método para el diagnósticoin vitro),de cáncer o de Alzheimer en un sujeto (referido de aquí en adelante como método de diagnóstico de la invención), que comprende las siguientes etapas:

[0077] a) determinar el nivel de expresión de MDL1AS en una muestra tomada de dicho sujeto; b) comparar el nivel de expresión determinado en la etapa a) con una referencia;

[0078] c) identificar al sujeto como que padece o es susceptible de padecer cáncer colorrectal, si el nivel de expresión de la muestra es inferior a la referencia, o

[0079] identificar al sujeto como que padece o es susceptible de padecer cáncer de laringe, cáncer de mama o Alzheimer si el nivel de expresión de la muestra es superior a la referencia.

[0081] Los términos "sujeto", "paciente", e "individuo" se pueden usar indistintamente y se refieren a un ser humano o un animal no humano. Estos términos incluyen mamíferos tales como seres humanos, primates, animales de ganado (por ejemplo, bovinos, cerdos), animales de compañía (por ejemplo, caninos, felinos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas).

[0083] En el contexto de la presente invención, el término "referencia" o "nivel de referencia" se refiere a un valor o nivel que se ha determinado midiendo el nivel de expresión del mismo gen que la muestra de ensayo en una muestra biológica tomada de un sujeto o una población de sujetos que no padecen cáncer o Alzheimer (también denominados sujetos sanos). La muestra tomada de un sujeto que no padece cáncer o Alzheimer también se denomina "muestra de control", por lo que la referencia también se refiere al nivel de expresión de una muestra control. Preferiblemente, la muestra control es una muestra de sujetos emparejados en edad e índice de masa corporal con el sujeto analizado, o el tejido sano que rodea a un tumor en muestras patológicas. Preferiblemente, la referencia es un valor de referencia, un valor de corte o un umbral.

[0084] En el contexto de la presente invención, el término “susceptible de padecer” se refiere a que el sujeto tiene un riesgo de padecer (o desarrollar) una enfermedad, siendo la enfermedad cáncer colorrectal, cáncer de laringe, cáncer de mama o enfermedad de Alzheimer. Un sujeto se considera que tiene un riesgo, en particular un riesgo elevado, de desarrollar una enfermedad cuando tiene una probabilidad de desarrollar esta enfermedad de al menos 50%, o al menos 60%, o al menos 70%, o al menos 80%, o al menos 90%, o al menos 95%, o al menos 97%, o al menos 98%, o al menos 99%, o al menos 100%.

[0086] Como entenderá un experto en la materia, la susceptibilidad (o riesgo), aunque preferida, no necesita ser correcta para el 100% de los sujetos que se van a evaluar, pero es preferible que lo sea. La susceptibilidad (o riesgo), sin embargo, requiere que una parte estadísticamente significativa de los sujetos se puede identificar con una probabilidad más alta de tener un resultado particular. El experto en la materia puede determinar sin dificultad si una parte es estadísticamente significativa usando diversas herramientas estadísticas para evaluación bien conocidas, por ejemplo, determinación de intervalos de confianza, determinación del valor p, índices de clasificación de validación cruzada, etc. Los intervalos de confianza preferidos son al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90% o al menos 95%. Los valores de p son preferiblemente 0,05, 0,02, 0,01 o menor.

[0088] Los “ARN largos no codificantes" (lncRNAs), según se utiliza en la presente invención, son transcripciones no codificantes de proteínas que tienen más de 200 nucleótidos, más particularmente de entre 200 nucleótidos hasta 100 kilobases.

[0090] Las secuencias de los lncRNAs MDL1 y MDL1AS se encuentran en la región denominada región bucle D, que contiene el origen de replicación del genoma mitocondrial. Como se muestra en los ejemplos, solo MDL1AS tiene utilidad como biomarcador para determinar el diagnóstico de cáncer y del Alzheimer.

[0092] MDL1AS o lncRNA MDL1AS se refiere a un gen que es un fragmento del ADN mitocondrial, así como al ARN que se transcribe a partir de dicho gen. Al tratarse de un gen no codificador de proteínas, no existe producto proteico. En la presente invención, MDL1AS incluye tanto el MDL1AS humano como los MDL1AS homólogos de otras especies animales. La secuencia completa del ADN mitocondrial humano aparece en NC_012920.1 (NCBI Reference Sequence).

[0093] La secuencia del gen MDL1AS humano se muestra en la secuencia SEC ID Nº: 1:

[0095]

[0096]

[0099] Así, cuando MDL1AS es el RNA transcrito a partir de la SEC ID Nº: 1, la secuencia de ARN es complementaria al ADN de la secuencia SEC ID Nº:1, tal y como se muestra en la secuencia SEC ID Nº: 21.

[0101] En una realización particular, el nivel de expresión de MDL1AS (también referido como el nivel de expresión del lncRNA MDL1AS) se mide a nivel de ARN.

[0103] La determinación del nivel de expresión de MDL1AS se puede llevar a cabo mediante cualquier método conocido por el experto en la materia. En una realización particular según una cualquiera de las realizaciones del método del primer aspecto de la invención, la determinación del nivel de expresión de MDL1AS se lleva a cabo mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa, preferentemente PCR cuantitativa a tiempo real (qRT-PCR),Northern blot, o secuenciación masiva. Preferentemente, la expresión se determina mediante qRT-PCR. En otra realización preferente según una cualquiera de las realizaciones anteriores, la expresión se determina usando al menos un cebador seleccionado de los cebadores de las secuencias SEQ ID Nº: 2-5 o combinaciones de los mismos. Más preferentemente se determina usando alguna de las parejas de cebadores indicadas en la Tabla 3, SEC ID Nº:2 y 3, o SEC ID Nº: 4 y 5.

[0104] La muestra en la que se analiza la expresión de MDL1AS puede ser cualquier muestra biológica que comprenda material mitocondrial. En una realización particular según una cualquiera de las realizaciones del método según el primer aspecto de la invención, la muestra es una biopsia sólida, una necropsia, una biopsia líquida, sangre, un derivado de la sangre (por ejemplo, células blancas de la sangre, plasma sanguíneo o suero sanguíneo) o líquido cefalorraquídeo. Preferentemente, la muestra es una biopsia sólida.

[0106] En una realización particular según una cualquiera de las realizaciones del método del primer aspecto de la invención, el cáncer colorrectal (también referido como carcinoma colorrectal) se selecciona de adenocarcinoma de recto, cáncer de colon o cáncer de recto, y/o el cáncer de mama es cáncer de mama triple negativo.

[0108] Las definiciones y realizaciones particulares y preferentes dadas para el primer aspecto de la invención son aplicables al resto de los aspectos de la presente invención.

[0110] Como se muestra en el Ejemplo 3, los niveles de expresión de MDL1AS y MDL1 son un predictor excelente para la prognosis del cáncer colorrectal. Así, unsegundo aspectode la presente invención se refiere a un método, en particular un métodoin vitro,para el pronóstico de supervivencia de un sujeto que padece cáncer colorrectal (de aquí en adelante referido como método de pronóstico de la presente invención) que comprende las siguientes etapas:

[0111] a) determinar el nivel de expresión de lncRNA MDL1AS y/o lncRNA MDL1 en una muestra tomada de dicho sujeto;

[0112] b) comparar el nivel de expresión determinado en la etapa a) con una referencia;

[0113] donde un nivel de expresión de lncRNA MDL1AS y/o lncRNA MDL1 igual o superior a dicha referencia es indicativo de un pronóstico positivo y un nivel de expresión inferior a dicha referencia es indicativo de un pronóstico negativo.

[0115] MDL1 o lncRNA MDL1 se refiere a un gen que es un fragmento del ADN mitocondrial, así como al ARN que se transcribe a partir de dicho gen. Al tratarse de un gen no codificador de proteínas, no existe producto proteico. En la presente invención, MDL1 incluye tanto el MDL1 humano como los MDL1 homólogos de otras especies animales.

[0117] La secuencia del gen MDL1 se muestra en la secuencia SEC ID Nº: 6:

[0119]

[0120]

[0123] Así, cuando MDL1 es el RNA transcrito a partir de la SEC ID Nº: 6, la secuencia de ARN es complementaria al ADN de la secuencia SEC ID Nº: 6, tal y como se muestra en la secuencia SEC ID Nº: 22.

[0125] En una realización particular del método de pronóstico de la presente invención, el pronóstico de supervivencia es pronóstico de la supervivencia a 5 años.5 años se considera la etapa crítica a partir de la cual, si el paciente sobrevive, se considera que el cáncer se ha curado.

[0127] En otra realización particular según una cualquiera de las realizaciones del método de pronóstico de la presente invención, el cáncer colorrectal es adenocarcinoma de recto.

[0129] En otra realización particular según una cualquiera de las realizaciones del método de pronóstico de la presente invención, el sujeto ha sido tratado con quimio-radioterapia neoadyuvante.

[0131] En otra realización particular según una cualquiera de las realizaciones del método de pronóstico de la presente invención, la referencia del método de pronóstico es el valor 1980 unidades para MDL1AS y/o 2382 para MDL1, tal y como se utiliza en el Ejemplo 3.

[0132] Como se ha indicado anteriormente, las realizaciones particulares dadas para el primer aspecto de la presente invención son aplicables al segundo aspecto de la invención (por ejemplo, determinación de la expresión, muestra, etc.).

[0134] El nivel de expresión de MDL1AS y/o MDL1, sirve como biomarcador de pronóstico, por lo que también encuentra utilidad para evaluar la respuesta a un tratamiento terapéutico. Así, untercer aspectode la presente invención se refiere a un método para evaluar la respuesta a un tratamiento de un sujeto con cáncer colorrectal que comprende determinar la expresión de lncRNA MDL1AS y/o lncRNA MDL1 en una muestra tomada de dicho sujeto antes y después del tratamiento, donde un aumento en el nivel de expresión de lncRNA MDL1AS y/o lncRNA MDL1 en la muestra obtenida después del tratamiento es indicativo de buena respuesta al tratamiento. En una realización particular, el método es un métodoin vitro.

[0136] En una realización particular, el aumento es un aumento estadísticamente significativo. El experto en la materia puede determinar sin dificultad si el aumento es estadísticamente significativo usando diversas herramientas estadísticas bien conocidas, por ejemplo, determinación de intervalos de confianza, determinación del valor p, índices de clasificación de validación cruzada, etc. Los intervalos de confianza preferidos son al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90% o al menos 95%. Los valores de p son preferiblemente 0,05, 0,02, 0,01 o menor.

[0138] Como se ha indicado anteriormente, las realizaciones particulares dadas para el primer aspecto de la presente invención son aplicables al tercer aspecto de la invención (por ejemplo, determinación de la expresión, muestra, etc.).

[0140] Los reactivos para llevar a cabo los métodos de la invención se pueden agrupar en un kit de partes. Así, uncuarto aspectode la presente invención se refiere a un kit para llevar a cabo el método del primer aspecto, que comprende o consiste en medios para determinar el nivel de expresión del lncRNA MDL1AS. Igualmente, el cuarto aspecto de la presente invención se refiere a un kit para llevar a cabo el método del segundo o tercer aspecto de la invención, que comprende o consiste en medios para determinar el nivel de expresión del lncRNA MDL1AS y/o lncRNA MDL1.

[0142] Optativamente, dichos kits adicionalmente comprenden o consisten en medios para determinar el nivel de expresión de los genes ND1 y/o GAPDH y/o instrucciones de uso del kit.

[0143] En una realización particular, los medios para determinar el nivel de expresión de MDL1AS comprende cebadores, más particularmente cebadores que comprenden o consisten en al menos una cualquiera de las secuencias SEC ID Nº: 2 a SEC ID Nº: 5, preferentemente la pareja de cebadores de secuencia SEC ID Nº: 2 y 3, o de secuencia SEC ID Nº: 4 y 5. En una realización particular, los medios para determinar el nivel de expresión de MDL1 comprende cebadores, más particularmente cebadores que comprenden o consisten en al menos una cualquiera de las secuencias SEC ID Nº: 7 a SEC ID Nº: 10, preferentemente la pareja de cebadores de secuencia SEC ID Nº: 7 y 8, o SEC ID Nº: 9 y 10. En otra realización particular, los medios para determinar el nivel de expresión de ND1 comprende cebadores que comprenden o consisten en una o dos de las secuencias SEC ID Nº: 11 y SEC ID Nº: 12, y para determinar el nivel de expresión de GAPDH comprende cebadores que comprenden o consisten en una o dos de las secuencias SEC ID Nº: 13 y SEC ID Nº: 14. Estos cebadores son los usados en los Ejemplos (ver Tabla 3).

[0145] El kit de la invención es útil para llevar a cabo los métodos de la invención. Así, unquinto aspectode la invención se refiere al uso del kit según una cualquiera de las realizaciones del cuarto aspecto de la invención para llevar a cabo el método según una cualquiera de las realizaciones del primer, segundo y tercer aspecto de la invención.

[0147] Como se ha mostrado en los Ejemplos 2 y 3, el nivel de expresión del lncRNA MDL1AS sirve de biomarcador para el diagnóstico y pronóstico de diversas enfermedades. Así, unsexto aspectode la presente invención se refiere al uso del lncRNA o del nivel de expresión del lncRNA MDL1AS como marcador para el diagnósticoin vitrode cáncer colorrectal, cáncer de laringe, cáncer de mama o Alzheimer. También se refiere al uso del lncRNA MDL1 o del nivel de expresión del lncRNA MDL1 como marcador para el pronósticoin vitrode cáncer colorrectal.

[0149] De manera interesante, estos marcadores son independientes de otros marcadores normalmente utilizados en el diagnóstico y/o pronóstico de cáncer (por ejemplo, cáncer colorrectal) como pueden ser el gen KRAS mutado o el ser fumador (ver Tabla 1, Ejemplo 3). Esto supone una gran ventaja al poder sumarse su capacidad predictiva a la de otros marcadores ya conocidos.

[0151] En una realización particular según una cualquiera de las realizaciones del sexto aspecto de la invención, el cáncer colorrectal se selecciona de adenocarcinoma de recto, cáncer de colon o cáncer de recto, y/o el cáncer de mama es cáncer de mama triple negativo.

[0152] Como se muestra en las Figuras 2 y 3, en los cánceres de laringe y mama, y en la enfermedad de Alzheimer, el nivel de expresión de MDL1AS es mayor que en el tejido normal circundante. Sin embargo, en las células tumorales de colon y recto en muestras clínicas expresan niveles de MDL1AS inferiores a los del tejido normal circundante. A pesar de esta diferencia en el patrón de expresión de MDL1AS, los inventores han visto que, sorprendentemente, la disminución de la expresión de MDL1AS tiene propiedades beneficiosas para el paciente incluso en los cánceres con niveles de expresión de MDL1AS inferiores a los del tejido normal circundante (Ejemplo 4). Sin querer ceñirnos a ninguna teoría en particular, debemos señalar que los ARNs no codificantes regulan la expresión de un alto número de genes celulares y por lo tanto tienen un impacto pleiotrópico en las actividades celulares. De esta manera, la reducción de MDL1AS podría tener un efecto protector debido a, por ejemplo, propiedades antiinflamatorias o a influir sobre el sistema inmunitario o sobre otras vías celulares o fisiológicas.

[0154] En consecuencia, unséptimo aspectode la presente invención se refiere a un inhibidor de la expresión del lncRNA MDL1AS, más particularmente dicho inhibidor se selecciona del grupo formado por ARN de interferencia de cadena doble (DsiRNA, dedouble strand interference RNA), ARN de horquilla corta (shRNA, desmall hairpin RNA), ARN pequeño de interferencia (siRNA, desmall intereference RNA), micro ARN (miRNA), repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y espaciadas regularmente (CRISPR), oligómero antisentido, oligonucleótido gápmero, nucleasa efectora de tipo activador de la transcripción (TALEN, deTranscription activator-like effector nuclease), nucleasa de dedos de Zinc y combinaciones de los mismos.

[0156] En la presente invención se entiende por “inhibidor de la expresión” a aquel compuesto o molécula que disminuye o inhibe total o parcialmente la expresión de MDL1AS con respecto a una referencia. La definición de referencia dada en el primer aspecto de la invención es aplicable al séptimo aspecto de la invención. En una realización particular, inhibe la expresión al menos un 40%, más particularmente al menos un 50% y preferentemente al menos un 60%.

[0158] Si se desea lograr la inhibición a nivel del ADN, esto puede hacerse mediante terapia génica para eliminar o interrumpir el gen objetivo. Según se utiliza aquí, un "knock-out" puede ser una reducción del gen o el gen puede ser eliminado mediante una mutación como una mutación puntual, una inserción, una eliminación, mediante técnicas conocidas en el arte, incluyendo, pero no limitadas a, la transferencia génica retroviral. Otra forma de realizarknock-outsde genes es mediante el uso de nucleasas de dedos de zinc. Las nucleasas de dedos de zinc (ZFNs) son enzimas de restricción artificiales generadas al fusionar un dominio de unión al ADN de dedo de zinc con un dominio de escisión del ADN. Los dominios de dedo de zinc pueden diseñarse para dirigirse a secuencias de ADN deseadas, lo que permite a las nucleasas de dedos de zinc dirigirse a secuencias únicas dentro de un genoma complejo. Aprovechando la maquinaria endógena de reparación del ADN, estos agentes pueden utilizarse para alterar con precisión los genomas de organismos superiores.

[0160] Otras tecnologías para la personalización del genoma que pueden usarse para eliminar genes son las meganucleasas y las TALENs. Una TALEN está compuesta por un dominio de unión al ADN de efectores TAL para el reconocimiento específico de secuencias fusionado al dominio catalítico de una endonucleasa que introduce roturas de doble cadena (DSB). El dominio de unión al ADN de un TALEN es capaz de dirigirse con alta precisión a un sitio de reconocimiento grande (por ejemplo, 17 pares de bases). Las meganucleasas son endonucleasas específicas de secuencia, que tienen sitios de reconocimiento largos de entre 12 y 30 pares de bases. El sitio de reconocimiento de las meganucleasas naturales puede modificarse para dirigirse a secuencias de ADN genómico nativo (como genes endógenos).

[0162] Otro método para la inhibición de la expresión génica se basa en el uso de oligómeros antisentido que consisten en ADN u otros tipos estructurales sintéticos como fosforotioatos, quimeras de ribonucleótidos de 2'-O-alquilo, ácido desoxirribonucleico bloqueado (LNA), ácido nucleico peptídico (PNA) o morfolinos. Un "oligómero antisentido" se refiere a una molécula antisentido que comprende un oligómero de al menos unos 10 nucleótidos de longitud. En ciertas realizaciones, un oligómero antisentido comprende al menos 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40 o 50 nucleótidos. Los enfoques antisentido implican el diseño de oligonucleótidos (ya sea de ADN o ARN, o derivados de estos) que son complementarios a un ARN codificado por secuencias polinucleotídicas de MDL1AS. El ARN antisentido puede introducirse en una célula para inhibir la traducción de un ARN mensajero complementario mediante el emparejamiento de bases y obstrucción física de la maquinaria de traducción. Este efecto es, por lo tanto, estequiométrico. Aunque se prefiere la complementariedad absoluta, no es necesario. Una secuencia "complementaria" a una porción de un ARN, según se menciona aquí, significa una secuencia que tiene suficiente complementariedad como para poder hibridarse con el ARN, formando un dúplex estable.

[0164] Los oligonucléotidos gápmeros son estructuras cortas de oligonucleótidos antisentido de ADN con segmentos similares al ARN en ambos lados de la secuencia. Estas estructuras genéticas están diseñadas para hibridarse con una región diana de ARN y silenciar el gen a través de la inducción de la escisión por la RNasa H.

[0166] El sistema CRISPR, también conocida como CRISPR/Cas o CRISPR/Cas9, es un sistema bien conocido por el experto en la materia, al igual que lo son dsiRNA, shRNA, siRNA y miRNA.

[0168] Generalmente, la longitud de los siRNA es de entre 20 y 25 nucleótidos. El siRNA típicamente consta de una cadena de ARN sentido y una cadena de ARN antisentido complementaria unidas mediante interacciones estándar de apareamiento de Watson-Crick (en adelante "apareadas"). La cadena sentido comprende una secuencia de ácidos nucleicos idéntica a una secuencia diana contenida en el ARN mensajero objetivo. Las siRNA de la presente invención pueden comprender ARN sintético, ARN recombinante o ARN producido químicamente, así como ARN alterado que difiere del ARN natural mediante la adición, eliminación, sustitución y/o alteración de uno o más nucleótidos. Dichas alteraciones pueden incluir la adición de material no nucleotídico, como en los extremos del siRNA o en uno o más nucleótidos internos del siRNA, incluyendo modificaciones que hagan que el siRNA sea resistente a la digestión por nucleasas.

[0170] Los inhibidores pueden estar formulados en una composición farmacéutica. Así, unoctavo aspectode la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un inhibidor según el séptimo aspecto de la invención y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

[0172] El término "vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera de los vehículos o excipientes farmacéuticos estándares. Los vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables para uso terapéutico son bien conocidos en la técnica farmacéutica. Por ejemplo, se puede usar solución salina estéril y solución salina tamponada con fosfato a pH ligeramente ácido o fisiológico. Los agentes de tamponamiento del pH adecuados pueden ser, por ejemplo, fosfato, citrato, acetato, lactato, maleato, tris/hidroximetil) aminometano (TRIS), ácido N-Tris (hidroximetil) metil-3-aminopropansulfónico (TAPS), bicarbonato de amonio, dietanolamina, histidina, que en ciertas realizaciones es un tampón preferido, arginina, lisina, o acetato o mezclas de los mismos. El término abarca además los agentes enumerados en la Farmacopea US para su uso en animales, que incluye los seres humanos.

[0174] La composición farmacéutica que comprende dichos vehículos o excipientes pueden formularse mediante métodos convencionales bien conocidos. La composición puede estar en forma sólida, líquida o gaseosa y puede estar, entre otras, en forma de polvo(s), comprimido(s), solución(es) o aerosol(es).

[0176] Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse al sujeto a una dosis adecuada. El régimen de dosificación será determinado por el médico tratante y los factores clínicos. Como es bien sabido, las dosis para cualquier paciente dependen de muchos factores, incluyendo el tamaño del paciente, el área de superficie corporal, la edad, el sexo, el tiempo y la vía de administración, la salud general y otros fármacos que se administran simultáneamente. La cantidad terapéuticamente eficaz para una situación dada se determinará fácilmente mediante la experimentación rutinaria y está dentro de las habilidades y el juicio del clínico o médico ordinario. Generalmente, el régimen como administración regular de la composición farmacéutica está en el rango de 1 µg a 5 g unidades por día. Sin embargo, una dosificación más preferida está en el intervalo de 0,01 mg a 100 mg, más preferiblemente de 0,01 mg a 50 mg y aún más preferiblemente de 0,01 mg a 10 mg al día.

[0178] Como se muestra en el Ejemplo 4, el silenciamiento de la expresión de MDL1AS resulta en una pérdida de potencia mitocondrial por parte del tumor lo que es positivo para los pacientes con cáncer, ya que se ha demostrado que la inhibición de la fosforilación oxidativa mitocondrial reduce significativamente la producción de metástasis (Davis et al. (2020)Transcriptional diversity and bioenergetic shift in human breast cancer metastasis revealed by single-cell RNA sequencing. Nat Cell Biol 22:310-320). Además, el silenciamiento también resulta en una disminución de la capacidad de proliferación de las células tumorales. En consecuencia, unnoveno aspectode la presente invención se refiere a un inhibidor de la expresión del lncRNA MDL1AS para su uso como medicamento.

[0180] El noveno aspecto de la invención se refiere también al uso de un inhibidor de la expresión del lncRNA MDL1AS para la preparación de un medicamento.

[0182] Más concretamente, undécimo aspectode la presente invención se refiere a un inhibidor de la expresión del lncRNA MDL1AS para su uso en el tratamiento de un cáncer o Alzheimer.

[0184] Asimismo, el décimo aspecto de la invención se refiere al uso de un inhibidor de la expresión del lncRNA MDL1AS para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer o Alzheimer.

[0185] Igualmente, el décimo aspecto de la invención se refiere a un método de tratamiento de un cáncer o de Alzheimer que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de la expresión de MDL1AS.

[0187] En una realización particular del décimo aspecto de la invención, el cáncer es cáncer colorrectal, cáncer de laringe o cáncer de mama. Más particularmente, el cáncer colorrectal es adenocarcinoma de recto, cáncer de colon o cáncer de recto, y/o el cáncer de mama es cáncer de mama triple negativo.

[0189] En otra realización particular del décimo aspecto de la invención, el cáncer es un cáncer en el que se sobreexpresa MDL1AS. En la presente invención, un cáncer en el que se sobreexpresa MDL1AS se refiere a un cáncer en el que la expresión de MDL1AS es mayor, preferentemente significativamente mayor, que la expresión de MDL1AS de una referencia. Más particularmente, se considera que es mayor cuando hay un aumento de la expresión de al menos el 30% o más, preferentemente al menos un 50% o más, con respecto a una referencia. La definición de referencia dada en el primer aspecto de la invención es aplicable a este aspecto.

[0191] En otra realización particular según una cualquiera de las realizaciones de los aspectos noveno y décimo de la invención, el inhibidor se selecciona del grupo formado por DsiRNA, shRNA, siRNA, miRNA, CRISPR, oligómero antisentido, oligonucleótido gápmero, TALEN, nucleasa con dedos de Zinc y combinaciones de los mismos. Preferentemente el inhibidor es un DsiRNA. Las definiciones dadas en el séptimo aspecto de la invención son aplicables a los aspectos noveno y décimo de la presente invención. Más preferentemente, el DsiRNA comprende o consiste al menos una secuencia seleccionada del grupo formado por las secuencias SEC ID Nº: 15 a SEC ID Nº: 20, que son los usados en los ejemplos y han demostrado un silenciamiento de aproximadamente el 70%. Más preferiblemente el DsiRNA comprende o consiste en SEC ID Nº: 15 y 16, o SEC ID Nº: 17 y 18, o SEC ID Nº: 19 y 20.

[0193] La cantidad terapéuticamente eficaz de inhibidor para la administración a un sujeto puede determinarse teniendo en cuenta factores como el tamaño y peso del sujeto, la extensión de la penetración de la enfermedad, la edad, la salud y el sexo del sujeto, la vía de administración y si la administración es regional o sistémica. Generalmente, una cantidad terapéuticamente eficaz comprende una concentración intracelular de aproximadamente 1 nanomolar (nM) a aproximadamente 100 nM, preferiblemente de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 50 nM.

[0194] En otra realización particular según una cualquiera de las realizaciones de los aspectos noveno y décimo de la invención el inhibidor está vehiculizado mediante liposomas, nanopartículas o nanocomplejos peptídicos. Ventajosamente, esto facilita la administración y asimilación del inhibidor.

[0196] Las definiciones dadas a lo largo de la presente memoria son aplicables a todos los aspectos de la presente invención.

[0198] EJEMPLOS

[0200] Los siguientes ejemplos tienen únicamente carácter ilustrativo de esta invención, y no deben ser interpretados en sentido limitativo de la misma.

[0202] Ejemplo 1. Puesta a punto del sistema bioinformático para analizar las muestras

[0204] Ya que la secuencia que codifica los lncRNAs MDL1 y MDL1AS está a caballo sobre el codón de iniciación de la replicación del DNA mitocondrial, no es posible utilizar el modelo estándar del genoma humano, que corta esta región en dos fragmentos (Fig.1A). Por ello, se utilizó el genoma mitocondrial modificado que describieron Gao y colaboradores (Gao et al. (2018)Two novel lncRNAs discovered in human mitochondrial DNA using PacBio fulllength transcriptome data. Mitochondrion 38:41-47) (Fig. 1B). A partir de esa secuencia modificada se usó la página MITOS2 webServer (http://mitos.bioinf.uni-leipzig.de/index.py) (Bernt et al. (2013)MITOS: improved de novo metazoan mitochondrial genome annotation. Mol Phylogenet Evol 69:313-319) para obtener la anotación del genoma mitocondrial. La expresión de los genes mitocondriales, incluidos los de los lncRNAs, se realizó siguiendo las técnicas indicadas por Dündar y colaboradores (Dündar et al. (2020)Introduction to differential gene expression analysis using RNA-seq. Zenodo 12:1-98). Las cuentas obtenidas para cada región se normalizaron mediante la técnica “Reads per kilobase per million mapped reads” (RPKM).

[0206] Ejemplo 2. Minería de datos

[0208] Las muestras de transcriptómica se obtuvieron a partir de la página delNational Center for Biotechnology Information(NCIB) buscando proyectos que tuvieran datos de transcriptómica comparando muestras tumorales o muestras de cerebros de pacientes Alzheimer frente a tejidos sanos. Una vez identificados los estudios relevantes, se descargaron los archivos fastq, que a continuación se alinearon con el genoma mitocondrial de referencia descrito más arriba.

[0210] Los resultados se muestran en la Fig.2. Con esta tecnología se identificaron ciertos tumores (colon (A), recto (B)) que presentan una menor expresión de MDL1AS que los tejidos sanos, mientras que en otros tumores (mama (C) y laringe (D)) se observó una mayor expresión de MDL1AS (Fig.2). En todos los casos, la expresión de MDL1AS fue mayor que la de MDL1. En el cáncer de colon y de recto la expresión de MDL1AS en el tumor es significativamente menor que en los tejidos sanos. En los tumores de mama y laringe la expresión de este gen es significativamente mayor que en los tejidos sanos.

[0212] En los pacientes de Alzheimer también se vio que los niveles de MDL1AS aumentan significativamente en comparación con las muestras de cerebros sanos de sujetos de la misma edad (Fig.3).

[0214] Ejemplo 3. Estudio de supervivencia en pacientes de adenocarcinoma de recto tratados con quimio-radioterapia coadyuvante.

[0216] Se revisaron todos los casos de adenocarcinoma de recto diagnosticados y tratados en el Hospital San Pedro de Logroño y en el Hospital de Calahorra (La Rioja, España) entre los años 1998 y 2017 de los que se conservaban bloques de parafina. La recogida del material se hizo de acuerdo con la legislación vigente (Ley 14/2007 de 3 de julio de Investigación Biomédica) y tras aprobación por el Comité Ético local (CEICLAR, código PI-129). Las características clínicas de los pacientes (n=69), divididos según su expresión (alta o baja calculada según el índice de Youden que resulta en un nivel de corte = 1980 unidades) del gen MDL1AS, aparecen en la Tabla 1. Sorprendentemente, sólo la expresión de los dos lncRNAs MDL1AS y MDL1 es significativamente diferente entre los grupos. Otros marcadores típicamente utilizados, como KRAS mutado, ser fumador, etc., no muestras diferencias significativas. Esto sugiere que estos lncRNAs son marcadores independientes de otros marcadores y se pueden usar en combinación con dichos otros marcadores consiguiéndose así una información más fiable.

[0218] Tabla 1. Características clínicas de los 69 pacientes estudiados, divididos entre los que tienen una alta o baja expresión del gen MDL1AS.

[0220]

[0221]

[0224] Se realizaron uno o dos cortes de 4 μm cada uno de los bloques de parafina en condiciones libres de RNAsas. A partir de este material se purificó el RNA utilizando el High Pure FFPET RNA Isolation Kit (Roche). La calidad del RNA se analizó con el sistema de electroforesis automático Experion (BioRad) y el RNA que pasó los controles de calidad fue sometido a transcripción inversa utilizando los kits específicos de la casa Illumina. Posteriormente, el cDNA obtenido fue sometido a NGS (Next Generation Sequencing) utilizando los protocolos de Illumina y la plataforma Genome Analyzer IIx (Illumina), siguiendo la metodología publicada por Larrayoz et al. 2014 (Larrayoz et al. (2014)Transcriptomic profiling explains racial disparities in pterygium patients treated with doxycycline. Invest Ophthalmol Vis Sci 55:7553-7561).

[0226] El análisis de los ficheros fastq y la alineación con el genoma mitocondrial de referencia fue idéntico al descrito en el ejemplo anterior. Las curvas de supervivencia se realizaron según el método de Kaplan-Meier y se analizaron con los tests log-rank y de Cox. Además, se construyeron curvas ROC para evaluar la capacidad discriminativa de este biomarcador. El análisis de los resultados indicó que la capacidad pronóstica de los niveles de expresión de MDL1AS mediante curvas de supervivencia para pacientes de adenocarcinoma de recto con niveles altos (>1980 unidades, línea negra “a”) y bajos (<1980 unidades, línea gris “b”) del lncRNA según el índice de Youden (A). Claramente, los pacientes con niveles altos tienen un pronóstico mucho mejor que los que mostraron niveles más bajos (p=0,007, test de Mantel-Cox) (Fig.4A).

[0228] Cuando se estableció un nivel de corte (1980 unidades) para la expresión de MDL1AS y se calculó el número de falsos positivos y falsos negativos (curva ROC), se obtuvo un valor de AUC = 0,930 (p<0,0001), con una especificidad de 100% y una sensibilidad de 92,6% (Fig. 4B).

[0229] Se realizó el mismo análisis para MDL1 y se obtuvo una capacidad predictiva algo inferior a la presentada por MDL1AS (punto de corte= 2382 unidades según índice de Youden, p=0,040 test de Mantel-Cox, AUC=0,820 (p<0,0001), especificidad de 100% y una sensibilidad de 79,17%) (Fig.5A y 5B).

[0231] Estos resultados establecen los niveles de MDL1AS y MDL1 como predictores excelentes para la prognosis del cáncer colorrectal, en particular del adenocarcinoma de recto tratado con quimio-radioterapia coadyuvante.

[0233] Ejemplo 4. Efectos del silenciamiento del lncRNA MDL1AS.

[0235] Para entender mejor las funciones del lncRNA en la célula y poner a punto una posible técnica de terapia basada en la regulación de este gen, se procedió a silenciar la expresión del gen MDL1AS con la tecnología de RNA de interferencia de doble hebra (DsiRNA) en líneas celulares de cáncer. Para ello se diseñaron los siguientes fragmentos de RNA de interferencia (Tabla 2):

[0237] Tabla 2. Secuencias empleadas para silenciar la expresión de MDL1AS (U se representa como T en el listado de secuencias, de acuerdo a la Norma ST.26).

[0239]

[0242] Como células de cáncer modelo, se emplearon líneas celulares humanas de carcinoma colorrectal (HCT-116) y de carcinoma de mama triple negativo (MDA-MB-231). Las células fueron cultivadas en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS). Estas células se sembraron en una placa de 6 pocillos con una densidad de 100.000-150.000 células/pocillo y se les añadió 200µl de la mezcla de medio sin suero con lipofectamina y DsiRNA (10 nM) a cada pocillo. A distintos tiempos (24, 48, 72 h) se extrajo el RNA total de las células disolviéndolas en 0,5 ml de Trizol y siguiendo las instrucciones del kit Micro de Quiagen. A partir del ARN obtenido, se sintetizó el cDNA con el kit SuperMix que contiene la transcriptasa inversa SuperScript™ III. Al final del proceso se añadió 1µl deRNase Ha cada muestra para liberar la hebra de cDNA.

[0244] El cDNA se cuantificó mediante la técnica de PCR cuantitativa a tiempo real (qRT-PCR) siguiendo protocolos ya publicados (Larrayoz et al. (2016)Cold Shock Proteins Are Expressed in the Retina Following Exposure to Low Temperatures. PLoS One 11:e0161458) en un instrumento QuantStudio 5 real-Time PCR (Applied Biosystems) con los cebadores indicados en la Tabla 3, siendo el "cebador directo" el cebador que se extiende en la PCR desde el codón de iniciación hacia el codón de detención del ADN molde; y el “cebador inverso" es el cebador que se extiende desde el codón de detención hacia el codón de iniciación del ADN molde.

[0246] Tabla 3. Cebadores utilizados para cuantificar los genes de interés mediante qRT-PCR.

[0248]

[0251] Todos los DsiRNAs ensayados redujeron la expresión de MDL1AS. El DsiRNA MDL1AS.3 (SEC ID Nº: 19 y 20) resultó ser el más eficaz a la hora de silenciar la expresión del gen MDL1AS, consiguiendo reducir esta expresión en aproximadamente un 70 % (Fig. 6). Además, MDL1 y otros genes mitocondriales no cambiaron su expresión, indicando que el silenciamiento fue muy específico (Fig.6 y datos no mostrados).

[0252] El lncRNA MDL1AS se encuentra en la mitocondria, por lo que se estudió el impacto de silenciar esta molécula sobre el metabolismo mitocondrial ya que se ha demostrado que la inhibición de la fosforilación oxidativa mitocondrial reduce significativamente la producción de metástasis (Davis et al. (2020)Transcriptional diversity and bioenergetic shift in human breast cancer metastasis revealed by single-cell RNA sequencing. Nat Cell Biol 22:310-320). Se analizó el impacto del silenciamiento en líneas celulares humanas de carcinoma de mama triple negativo (MDA-MB-231, Figura 7) y de carcinoma colorrectal (HCT-116, Figura 8).

[0254] Para ello, se utilizó el equipo SeahorseXF24 (Agilent) siguiendo protocolos publicados (Plitzko and Loesgen (2018)Measurement of Oxygen Consumption Rate (OCR) and Extracellular Acidification Rate (ECAR) in Culture Cells for Assessment of the Energy Metabolism. Bio Protoc 8:e2850). Las células se sembraron a una densidad de 30.000-40.000 células por pocillo. Una hora antes del análisis, las células se incubaron en una atmósfera sin CO<2>, se retiró el medio de cultivo que se cambió por medio de ensayo y las placas se introdujeron en el aparato, donde se iniciaron las lecturas (de consumo de oxígeno y de acidificación extracelular) y se añadieron los inhibidores que permiten caracterizar los distintos aspectos del metabolismo (1,5 µM oligomicina, 0,5 µM rotenona/antimicina A y 0,5 µM carbonilcianuro p-trifluorometoxifenilhidrazona (FCCP) (Fig. 7A y 8A). Como se puede ver en las Figuras 7 y 8, el silenciamiento del gen MDL1AS produjo una reducción muy significativa (p<0,0001) en distintos aspectos de la respiración mitocondrial, tales como la respiración basal (Fig. 7B y 8B), la respiración máxima (Fig. 7C y 8C) y la producción de ATP (Fig. 7D y 8D), mientras que no produjo cambios significativos en el oxígeno no consumido por la mitocondria, los protones fugados, la capacidad respiratoria de reserva, o la eficacia de acoplamiento (Fig. 7A y 8A). Todo ello indica una pérdida importante en la capacidad de respiración y de producción de ATP en las mitocondrias tumorales con niveles bajos de MDL1AS y, por lo tanto, una pérdida en la vitalidad de las células tumorales, soportando así el uso de la inhibición de la expresión de MDL1AS para el tratamiento de cáncer.

[0256] Por último, se comparó el crecimiento de las células HCT-116 silenciadas con el DsiRNA MDL1AS.3 (DsiRNA) con las mismas células sin silenciar (control) mediante la técnica de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT). Brevemente, las células se sembraron en placas de 96 pocillos con una densidad de 3.000 células por pocillo. Al cabo de 24, 48, 72 y 96 horas, se añadió 15 µl de CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega) por pocillo y, tras 4 horas de incubación, se leyó la absorbancia a 490 nm con un lector de placas (POLARstar Omega, BMG Labtech). Como se puede ver en la Figura 9, las células silenciadas de carcinoma colorrectal tienen muy reducidas sus capacidades de crecimiento (p<0,0001). Este resultado soporta adicionalmente el uso de la inhibición de la expresión de MDL1AS para el tratamiento de cáncer.

Claims (7)

1. REIVINDICACIONES

1. Método in vitro para el pronóstico de la supervivencia de un sujeto que padece cáncer colorrectal que comprende las siguientes etapas:

a) determinar el nivel de expresión de lncRNA MDL1AS y/o lncRNA MDL1 en una muestra tomada de dicho sujeto;

b) comparar el nivel de expresión determinado en la etapa a) con una referencia consistente en un valor de corte de 1980 unidades para MDL1AS y 2382 unidades para MDL1, calculado según el índice de Youden;

donde un nivel de expresión igual o superior a dicha referencia es indicativo de un pronóstico positivo y un nivel de expresión inferior a dicha referencia es indicativo de un pronóstico negativo.

2. Método según la reivindicación 1, donde el cáncer colorrectal es adenocarcinoma de recto.

3. Método según las reivindicaciones 1 o 2, donde el sujeto ha sido tratado con quimioradioterapia coadyuvante.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 3, donde la muestra es una biopsia sólida, una necropsia, una biopsia líquida, sangre, un derivado de la sangre, o líquido cefalorraquídeo.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 4, donde la determinación del nivel de expresión de lncRNA MDL1AS y/o lcnRNA MDL1 se lleva a cabo mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa, PCR cuantitativa a tiempo real (qRT-PCR),Northem Blot, o secuenciación masiva, preferiblemente mediante secuenciación masiva.

6. Uso del nivel de expresión de lncRNA MDL1AS y/o lncRNA MDL1 como marcador para el pronóstico in vitro del cáncer colorrectal, de manera independiente y complementaria con otros marcadores.

7. Uso según la reivindicación 6, donde el cáncer colorrectal se selecciona de adenocarcinoma de recto, cáncer de colon y cáncer de recto.