ES3033945T3

ES3033945T3 - Anti-tm4sf4 antibody and use thereof

Info

Publication number: ES3033945T3
Application number: ES20897028T
Authority: ES
Inventors: In Gyu Kim; Rae Kwon Kim; Jai Ha Lee; Chang Kyu Heo; Yeon Jee Kahm; Byung Chul Shin; Eun Wie Cho; Chun Jeih Ryu; Min Kyu Kim; Mun Ju Choi
Original assignee: Korea Atomic Energy Research Institute KAERI
Current assignee: Korea Atomic Energy Research Institute KAERI
Priority date: 2019-12-06
Filing date: 2020-12-04
Publication date: 2025-08-11
Anticipated expiration: 2040-12-04
Also published as: EP4071171A1; KR20210071856A; WO2021112640A1; JP2022521663A; CN113227149A; JP7250938B2; CN113227149B; US20230002485A1; EP4071171C0; PL4071171T3; KR102575994B1; EP4071171B1; EP4071171A4; US12421309B2

Abstract

La presente invención se refiere a nuevos anticuerpos que se unen específicamente al miembro 4 de la superfamilia transmembrana 4 (TM4SF4), o a sus fragmentos de unión al antígeno. Estos anticuerpos o sus fragmentos de unión al antígeno pueden prevenir o tratar eficazmente el cáncer al inhibir la proliferación de células cancerosas y reducir la capacidad de autorrenovación de las células madre cancerosas. Por lo tanto, también pueden ser útiles en el tratamiento del cáncer con pronóstico desfavorable debido a los tratamientos antineoplásicos existentes. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpo anti-TM4SF4 y uso del mismo

[Campo técnico]

La presente invención se refiere a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente al Miembro 4 de la Superfamilia TransMembrana 4 (TM4SF4,TransMembrane 4 Superfamily Member4), y a una composición para prevenir o tratar el cáncer que comprende el mismo.

[Antecedentes de la técnica]

Se ha informado de que el Miembro 4 de la Superfamilia TransMembrana 4 (TM4SF4) es un tipo de proteína tetraspanina, y que otras proteínas de esta clase, TM4SF1 y TM4SF5, tienen una expresión regulada al alza en muchos tumores y están implicados en la metástasis epitelio-mesenquimática y en la migración celular, y se han realizado numerosos estudios asociados a células cancerosas. Se ha informado de que la proteína TM4SF4 interviene en la apoptosis y en la diferenciación y capacidad de invasión de las células cancerosas. Sin embargo, no se conoce nada acerca de las características de las células madre cancerosas, y no se han realizado estudios de las mismas. Recientemente, los investigadores de la presente invención han informado de que la proteína TM4SF4 promueve el crecimiento de células madre cancerosas, la capacidad de autorrenovación y la metástasis/invasión en células de cáncer de pulmón humano. Además, los investigadores han sugerido que la proteína TM4SF4 promueve la activación de IGF1Rp/AKT/NFKB o JAK2(o FAR) /STAT3 como un importante sistema de señalización en la aparición de cáncer, y potencia las características de las células madre cancerosas mediante la secreción de citocinas que se promueven de este modo para hacer que los tumores sean más malignos (Choi SIet al.,Oncotarget. 2014; 5 (20): 9823-9837, Choi SIet al.,Oncotarget. 2017; 8 (60):101284-101297).

Los anticuerpos se han utilizado como agentes terapéuticos debido a su alta especificidad de unión a antígenos diana y a su estabilidad en el cuerpo humano. En particular, se han mejorado y utilizado anticuerpos con funciones anticancerosas para convertirse en anticuerpos humanizados, anticuerpos monocatenarios, anticuerpos dobles y anticuerpos de fusión con fármacos, basándose en el desarrollo de la tecnología de genomodificación de anticuerpos con el fin de mejorar considerablemente la eficacia del tratamiento contra el cáncer. Sin embargo, debido a la diversidad de las características del cáncer y a la inducción de resistencia al tratamiento por la expresión de nuevos antígenos, se están señalando limitaciones en los tipos de antígenos que se utilizan para dirigirse a las células cancerosas en la técnica relacionada, y se sigue investigando para buscar nuevos antígenos específicos del cáncer y obtener anticuerpos contra dichos antígenos.

En particular, en el caso de un cáncer que muestre resistencia a fármacos diana o a la radioterapia que se han utilizado en los tratamientos existentes contra el cáncer y reaparezca, se ha informado de que las características de las células madre cancerosas se aplican de manera importante, y como resultado, el descubrimiento de antígenos y la obtención de anticuerpos específicos que puedan utilizarse para dirigirse a las células madre cancerosas están cobrando cada vez más importancia.

El uso de anticuerpos anti-TM4SF4 en el contexto del cáncer se ha sugerido en la patente de EE.UU. n.°: US9075064B2.

En este contexto técnico, los presentes inventores han realizado muchos intentos para desarrollar nuevos anticuerpos dirigidos contra las células madre cancerosas, y como resultado, desarrollaron nuevos anticuerpos anti-TM4SF4 que se unen a TM4SF4 con alta afinidad, y descubrieron que los nuevos anticuerpos no sólo inhibían significativamente la proliferación de células tumorales, incluidas las células madre cancerosas, sino que también tenían excelentes efectos anticancerosos, y después llevaron a cabo la presente invención.

[Divulgación]

[Problema técnico]

Por consiguiente, un objeto de la presente invención es proporcionar un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se una específicamente al Miembro 4 de la Superfamilia TransMembrana 4 (TM4SF4).

Otro objeto de la presente invención es proporcionar una molécula de ácido nucleico que codifique el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico, una célula hospedadora que comprenda el vector de expresión y un método para producir un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprenda el cultivo de la célula hospedadora.

Otro objeto más de la presente invención es proporcionar una composición para detectar TM4SF4 que comprenda el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, un kit de detección que comprenda el mismo, y un método para detectar un antígeno TM4SF4 usando el mismo.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición farmacéutica para prevenir o tratar el cáncer que comprenda el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo; una composición para inhibir el crecimiento de células madre cancerosas; y una composición para quimiorradioterapia adyuvante.

[Solución técnica]

Para lograr los objetos anteriores, un aspecto de la presente invención proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente al Miembro 4 de la Superfamilia Transmembrana 4 (TM4SF4). Otro aspecto de la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo.

Otro aspecto más de la presente invención proporciona un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico.

Otro aspecto más de la presente invención proporciona una célula hospedadora que comprende el vector de expresión. Otro aspecto más de la presente invención proporciona un método para producir un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende cultivar la célula hospedadora.

Otro aspecto más de la presente invención proporciona una composición y un kit para detectar TM4SF4 que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo.

Otro aspecto más de la presente invención proporciona un método para detectar un antígeno TM4SF4 que comprende poner en contacto el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo con una muestra a detectar que se espera que incluya el antígeno TM4SF4.

Otro aspecto más de la presente invención proporciona una composición farmacéutica para prevenir o tratar el cáncer que comprende (a) una dosis terapéuticamente eficaz del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo; y (ii) un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Otro aspecto más de la presente invención proporciona una composición para inhibir el crecimiento de células madre cancerosas.

Incluso otro aspecto más de la presente invención proporciona una composición para quimiorradioterapia adyuvante que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo.

[Efectos ventajosos]

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a TM4SF4 de la presente invención tiene una nueva secuencia y presenta excelente actividad inhibidora de la proliferación de células cancerosas, previniendo o tratando de este modo eficazmente enfermedades tales como el cáncer.

Además, el crecimiento de células madre cancerosas puede inhibirse reduciendo la capacidad de autorrenovación, la capacidad de invasión y migración de las células madre cancerosas, tratando de este modo eficazmente el cáncer resistente a los métodos de tratamiento existentes contra el cáncer.

Además, los agentes anticancerosos o la radioterapia existentes se tratan conjuntamente para aumentar aún más la actividad anticancerosa, el uso de agentes anticancerosos puede reducirse drásticamente para reducir los efectos secundarios causados por el uso de agentes anticancerosos, y como una tecnología capaz de mejorar notablemente el efecto de la quimiorradioterapia para un sujeto que no es fácil de tratar debido a la resistencia a la radioterapia convencional, es útil para el tratamiento del cáncer con mal pronóstico de los tratamientos convencionales contra el cáncer.

Por lo tanto, los nuevos anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno del mismo de la presente invención pueden usarse provechosamente en el desarrollo de nuevos fármacos anticuerpo dirigidos contra TM4SF4.

[Descripción de los dibujos]

La FIG. 1 ilustra una región epitópica en una proteína TM4SF4 (SEQ ID NO: 32) a la que se une específicamente un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención: La región epitópica representa un péptido de 15meros (unidades oligoméricas) en las posiciones 126 a 140 de una región expuesta en el exterior de una membrana celular de la proteína TM4SF4; G representa un sitio de glucosilación; y C representa la cisteína que forma un enlace disulfuro.

La FIG. 2 ilustra un resultado de la confirmación de la pureza mediante la purificación de cinco nuevos anticuerpos ECL-2B7, ECL-4C1, ECL-8E2, ECL-8E5 y ECL-12A8 de una solución de cultivo de células de hibridoma. A partir del hecho de que en las posiciones de 55 kDa y 26 kDa se identifica una cadena pesada(heavy chain,HC) de IgG (IgG-HC) y una cadena ligera(light chain)de IgG (IgG-LC) de cada anticuerpo, respectivamente, se puede confirmar que los nuevos anticuerpos son anticuerpos de tipo IgG y que la IgG no reducida se identifica como una banda de IgG situada por encima de 170 kDa, y que la seroalbúmina bovina (BSA,bovine serum albumin)es un control para comparar las cantidades de proteínas.

La FIG. 3 ilustra la capacidad de respuesta antigénica de los nuevos anticuerpos de la presente invención realizando un ensayo ELISA contra un antígeno TM4SF4(126- 140)-BSA. El antígeno se recubrió a un nivel de 500 a 4 ng/pocillo, y el anticuerpo se trató en un intervalo (de 200 a 0,8 ng/pocillo) indicado en un eje X. Los cinco anticuerpos mostraron una alta capacidad de respuesta a un antígeno peptídico (A a E). En particular, al comparar los resultados por ELISA utilizando 100 ng/pocillo de un antígeno recubierto con péptido, se observa que los anticuerpos 2B7, 4C1 y 12A8 muestran una gran afinidad por el antígeno (F).

La FIG. 4 ilustra un resultado que confirma la capacidad de respuesta al antígeno de los nuevos anticuerpos de la presente invención, mostrando si el anticuerpo preparado se une específicamente a una proteína TM4SF4 utilizando un análisis de interacción intermolecular (Biocore). Se utilizaron los anticuerpos ECL-2B7, ECL-4C1 y ECL-12A8, y se observó que los valores de unión específica cambiaron de manera significativa con cada concentración y se confirmó que los valores de unión medidos eran altos. Se puede observar que el periodo de unión, en el cual el gráfico muestra un aumento, se incrementa con el tiempo, y cuando la unión se inhibe a los 480 segundos, la capacidad de unión disminuye, y esta es una forma típica de un anticuerpo con alta capacidad de unión que se muestra en el análisis de interacción intermolecular.

La FIG. 5 ilustra los resultados de la confirmación de la capacidad de respuesta antigénica de los nuevos anticuerpos de la presente invención, mediante el análisis de inmunoprecipitados para determinar si el anticuerpo preparado se une específicamente a la proteína TM4SF4. La FIG. 5A ilustra un resultado de la inmunoprecipitación de lisados celulares (Muestras 1 y 2) obtenidos mediante la expresión de Flag o de un vector de expresión Flag-TM4SF4 en células HEK293T utilizando un nuevo anticuerpo o un anticuerpo anti-GAPDH de ratón como anticuerpo de control y detectando el inmunoprecipitado con un anticuerpo anti-Flag mediante inmunoelectrotransferencia Western. La FIG.

5B ilustra el resultado de la verificación de una dosis de anticuerpo con anticuerpo anti-ratón marcado con HRP(Horseradish Peroxidase,peroxidasa de rábano picante) para el inmunoprecipitado, con el fin de verificar si se ha añadido la misma cantidad de anticuerpo al experimento de inmunoprecipitación.

La FIG. 6 ilustra los resultados de realizar un análisis de inmunofluorescencia para verificar si los nuevos anticuerpos de la presente invención se unen específicamente a un antígeno diana. La FIG. 6A ilustra un resultado de la verificación de que el nuevo anticuerpo se une a la proteína TM4SF4-EGFP expresada en la superficie de células HEK293T, y la FIG. 6B ilustra un resultado de la verificación de que el nuevo anticuerpo se une específicamente a TM4SF4 existente en la superficie de células A549. En particular, cuando el ARNpi (ARN pequeño de interferencia) inhibe la expresión de un antígeno TM4SF4, se confirmó que la respuesta del anticuerpo desaparecía, y se verificó de nuevo que el nuevo anticuerpo se une específicamente al antígeno TM4SF4.

La FIG. 7 ilustra la confirmación del efecto inhibidor de la capacidad de autorrenovación de las células madre cancerosas con los nuevos anticuerpos de la presente invención. Se usaron ECL-2B7 y ECL-4C1 como nuevos anticuerpos, y un anticuerpo anti-TM4SF4 de Sigma como control (con). A la izquierda se observa la capacidad de formación de esferas de las células madre cancerosas con un microscopio óptico, y a la derecha se muestra un gráfico con la longitud del diámetro de las esferas formadas.

La FIG. 8 ilustra la confirmación del efecto inhibidor de la capacidad de migración e invasión de las células cancerosas con los nuevos anticuerpos de la presente invención. Se usaron ECL-2B7 y ECL-4C1 como nuevos anticuerpos, y un anticuerpo anti-TM4SF4 de Sigma como control (con). A la izquierda se observa la migración y la invasión de las células mediante tinción, y a la derecha se muestra un gráfico que refleja la capacidad relativa de migración e invasión con respecto al control. En un experimento de migración, se realizaron tres experimentos repetidos hasta un total de 4 veces, y en un experimento de invasión, se realizaron tres experimentos repetidos 3 veces.

La FIG. 9 ilustra la confirmación del efecto de mejora de la sensibilidad a la radiación de las células cancerosas mediante los nuevos anticuerpos de la presente invención. Células A549 (A) y Huh7 (B) se trataron con los anticuerpos ECL-2B7, ECL-4C1 y ECL-12A8 y después se irradiaron con 6 Gy de radiación para confirmar que se reducía la formación de colonias de las células.

La FIG. 10 ilustra los mecanismos de confirmación de los nuevos anticuerpos mediante inmunoelectrotransferencia Western. ECL-2B7, ECL-4C1, ECL-8E2 y ECL-12A8 se utilizaron como anticuerpos, y células A549 como células cancerosas. Cuando se trató cada anticuerpo, se observó que ALDH1A1, ALDH1A3 y CD44, proteínas marcadas de las células madre cancerosas, disminuyeron, y que la p-catenina y el Oct4(Octamer-binding transcription factor 4,factor de transcripción de unión al octámero 4, implicados en la autorrenovación de las células madre cancerosas, también disminuyeron. Además, se confirmó que las vías de señalización de IGF1p y PI3K-AKT, conocidas como vías de señalización implicadas en los marcadores y reguladores de la capacidad de autorrenovación, se redujeron cuando se trató cada anticuerpo, de modo que los nuevos anticuerpos de la presente invención inhibieron las vías de señalización de IFG1Rp y PI3K- AKT para regular las células madre cancerosas.

La FIG. 11 ilustra los resultados de la realización de un ensayo con animales de xenotransplante de cáncer de pulmón para verificar el efecto anticanceroso de los nuevos anticuerpos de la presente invención. Cuando el tamaño del tejido canceroso era de 30 mm o mayor (A, B) o de 200 mm o mayor (C, D), los anticuerpos se inyectaban directamente en el tejido canceroso. En los dos experimentos, los anticuerpos se inyectaron a un nivel de a 13 pg por sujeto a la vez de la misma manera durante un total de 6 veces (fechas de flechas en B y D), y se midieron los tamaños de los tejidos cancerosos a intervalos de 2 a 3 días.

La FIG. 12 ilustra los resultados de la realización de RT-PCR y clonación para la secuenciación de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR,complementarity determining regions)de los nuevos anticuerpos de la presente invención: Un gen de cadena pesada de subtipo IgG1 y un gen de cadena ligera kappa (A) de un anticuerpo ECL-2B7, y un gen de cadena pesada de subtipo IgG2a y un gen de cadena ligera kappa (B) de un anticuerpo ECL-4C1 se amplificaron mediante RT-PCR utilizando cebadores que contenían secuencias de enzimas de restricción y se clonaron en un vector. Las secuencias clonadas en el vector se confirmaron de nuevo mediante la escisión de las enzimas de restricción, y a continuación se realizó la secuenciación de nucleótidos en el sitio del gen del anticuerpo. El gen de la cadena pesada (HC) de cada anticuerpo se escindió con EcoRI y Sal I, y el gen de la cadena ligera (LC) se escindió con HindIII y SalI para la identificación en un gel de agarosa. Flecha negra: Vector (V) después de la escisión, Flecha: Genes de inserción escindidos (C, D).

La FIG. 13a ilustra los resultados del análisis de una secuencia de nucleótidos y de una secuencia de proteínas de una región variable de cadena pesada de un nuevo anticuerpo ECL-2B7. Las regiones determinantes del reconocimiento de antígenos de acuerdo con la estructura del anticuerpo, se ordenaron utilizando la numeración de Kabat y se indicaron en la secuencia como las CDR 1, 2 y 3.

La FIG. 13b ilustra los resultados del análisis de una secuencia de nucleótidos y de una secuencia de proteínas de una región variable de cadena ligera del nuevo anticuerpo ECL-2B7. Las regiones determinantes del reconocimiento de antígenos de acuerdo con la estructura del anticuerpo, se ordenaron utilizando la numeración de Kabat y se indicaron en la secuencia como las CDR 1, 2 y 3.

La FIG. 14a ilustra los resultados del análisis de una secuencia de nucleótidos y de una secuencia de proteínas de una región variable de cadena pesada de un nuevo anticuerpo ECL-4C1. Las regiones determinantes del reconocimiento de antígenos de acuerdo con la estructura del anticuerpo, se ordenaron utilizando la numeración de Kabat y se indicaron en la secuencia como las CDR 1, 2 y 3.

La FIG. 14b ilustra los resultados del análisis de una secuencia de nucleótidos y de una secuencia de proteínas de una región variable de cadena ligera del nuevo anticuerpo ECL-4C1. Las regiones determinantes del reconocimiento de antígenos de acuerdo con la estructura del anticuerpo, se ordenaron utilizando la numeración de Kabat y se indicaron en la secuencia como las CDR 1, 2 y 3.

La FIG. 15 ilustra los resultados de la observación del efecto de destrucción de células cancerosas por los nuevos anticuerpos de la presente invención a través de la capacidad de formación de colonias. Se utilizaron una estirpe celular de cáncer de pulmón (H1299), una estirpe celular de cáncer de hígado (Huh7), una estirpe celular de cáncer de mama (MCF7 y MDA-MB 231) y una estirpe celular de cáncer de páncreas (MIA Paca- 2), y un anticuerpo ECL-2B7 anti-TM4SF4 (grupo experimental) e IgG de ratón (control) se trataron en cada célula con 5 pg, respectivamente, y a continuación se confirmó la capacidad de formación de colonias de las células. Puede observarse que el grado de formación de colonias disminuye en todas las estirpes celulares utilizadas, lo que demuestra que los anticuerpos de la presente invención pueden aplicarse no solo a las células de cáncer de pulmón, sino también a las células de cáncer de hígado, a las células de cáncer de mama y a las células de páncreas.

[Mejor forma de realización]

En lo sucesivo en el presente documento, se describirá con detalle la presente invención.

En un aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente al Miembro 4 de la Superfamilia Transmembrana 4 (TM4SF4).

En la presente invención, el término "anticuerpo" se refiere a una molécula de proteína que sirve como receptor para reconocer específicamente un antígeno, incluyendo moléculas de inmunoglobulina que tienen una capacidad de respuesta inmunológica a un antígeno específico, y por ejemplo, puede incluir todos los anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos de longitud completa y fragmentos de anticuerpos. Además, el término "anticuerpo" puede incluir una molécula bivalente o biespecífica (p. ej., un anticuerpo biespecífico), un diacuerpo, un triacuerpo o un tetracuerpo.

En la presente invención, la expresión "anticuerpo monoclonal" se refiere a una molécula de anticuerpo de una composición molecular única obtenida desde sustancialmente el mismo grupo de anticuerpos, y dicho anticuerpo monoclonal presenta especificidad de unión y afinidad únicas contra un epítopo específico. En la presente invención, la expresión "anticuerpo de longitud completa" se refiere a una estructura que tiene dos cadenas ligeras de longitud completa y dos cadenas pesadas de longitud completa, y cada cadena ligera está unida a la cadena pesada mediante un enlace disulfuro. Una región constante de cadena pesada tiene los tipos gamma (<y>), mu (p), alfa (a), delta (8) y épsilon (£), y las subclases gammal (<y>1), gamma2 (<y>2), gamma 3 (<y>3), gamma 4 (<y>4), alfa 1 (a1) y alfa2 (a2). Una región variable de cadena ligera tiene tipos kappa (K) y lambda (A). IgG es un subtipo, e incluye IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4.

En la presente invención, el término "fragmento", y las expresiones "fragmento de anticuerpo" y "fragmento de unión a antígeno" se utilizan indistintamente para referirse a cualquier fragmento del anticuerpo de la presente invención que conserve una función de unión a antígeno del anticuerpo. Como fragmentos de unión a antígeno ilustrativos se incluyen Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dAb, Fd, un fragmento de la región determinante de la complementariedad (CDR), un anticuerpo monocatenario (scFv), un anticuerpo monocatenario bivalente, un anticuerpo monocatenario de fago, un diacuerpo, un triacuerpo, un tetracuerpo, un polipéptido que contiene uno o más fragmentos de inmunoglobulina suficientes para unirse a un antígeno específico del polipéptido, y similares, pero sin limitarse a estos.

El Fab tiene una estructura que tiene regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas, una región constante de la cadena ligera y una primera región constante de la cadena pesada (CH1) y tiene un sitio de unión a antígeno. El fragmento de unión a antígeno o fragmento de anticuerpo de la molécula de anticuerpo, se refiere a un fragmento que tiene una función de unión a antígeno, y el Fab' tiene una región bisagra que incluye uno o más restos de cisteína en un extremo carboxílico del dominio CH1 de la cadena pesada, que es diferente al del Fab. El anticuerpo F(ab')2 se produce cuando los restos de cisteína de la región bisagra del Fab' forman un enlace disulfuro. El Fv se refiere al fragmento de anticuerpo más pequeño que tiene únicamente una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera. El Fv de doble cadena (Fv bicatenario) tiene una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera unidas por un enlace no covalente, el Fv monocatenario puede formar generalmente una estructura similar a un dímero, tal como la del Fv de doble cadena, porque la región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena única están unidas de manera covalente por un enlazador peptídico o están directamente unidas en el extremo carboxílico. Aunque sin limitarse a lo anterior, estos fragmentos de anticuerpos pueden obtenerse utilizando enzimas proteolíticas [por ejemplo, el anticuerpo completo se escinde por restricción con papaína para obtener Fab, y se escinde con pepsina para obtener un fragmento F(ab')2], o puede producirse mediante tecnología de recombinación genética.

En la presente invención, el término "epítopo" se refiere a un sitio específico en un antígeno al que la inmunoglobulina y un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se unen y que reconocen específicamente. El epítopo puede formarse a partir de aminoácidos continuos o de aminoácidos discontinuos paralelos por plegamiento terciario de la proteína.

En una realización de la presente invención, la presente invención proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a una proteína TM4SF4 en la región epitópica en la que una proteína de membrana, TM4SF4 existe en una región expuesta fuera de las células.

La región epitópica puede ser, por ejemplo, GGCARCLGGTLIPLAFFGFLANILLFFPGG (SEQ ID NO: 23) en las posiciones 4 a 33, LGSGVLMIFPALVFL (SEQ ID NO: 24) en las posiciones 53 a 67, NNDCCGCCGN (SEQ ID NO: 25) en las posiciones 71 a 80, STIFAWGFLGAGYSFIISAI (SEQ ID NO: 26) en las posiciones 92 a 112, KGPKCLM (SEQ ID NO: 27) en las posiciones 116 a 122, WGYPFHD (SEQ ID NO: 28) en las posiciones 127 a 133, y CREPLNWPWNLTLFSILLWGGIQ MVLCAIQVVNGLLGTLCGDCQCCGGG (SEQ ID NO: 29) en las posiciones 146 a 198 desde un extremo amínico en un antígeno TM4SF4 de referencia (SEQ ID NO: 1). Más específicamente, la región epitópica puede ser TWGYPFHDGDYLNDE (SEQ ID NO: 2) en las posiciones 126 a 140 desde el extremo amínico en el antígeno TM4SF4 de referencia (SEQ iD NO: 1).

Además, incluso si la región epitópica descrita en la SEQ ID NO: 2 incluye algunas mutaciones (sustitución, adición o deleción) en una secuencia antigénica de TM4SF4 a la que se une el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención, o el sitio o secuencia de unión es ligeramente diferente ya que el antígeno de unión está presente en forma de fragmento, de un precursor o de un subtipo de TM4SF4, los expertos en la materia pueden especificar claramente una posición y una secuencia a la que se une el antígeno o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención, basándose en la información de la secuencia epitópica del antígeno TM4SF4 de referencia.

En una realización específica de la presente invención, en una estructura antigénica de TM4SF4, una proteína de membrana que consistía en 202 aminoácidos, se seleccionó como región epitópica para la producción del anticuerpo un sitio expuesto al exterior de la célula, que se espera que tenga una alta capacidad de inducción de anticuerpos y que no presente glucosilación ni enlaces disulfuro (FIG. 1).

Como otra realización de la presente invención, el anticuerpo puede ser (a) un anticuerpo que incluye una región variable de cadena pesada que tiene una CDR-H1 que incluye una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, una CDR-H2 que incluye una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y una CDR-H3 que incluye una secuencia de aminoácidos de<s>E<q>ID NO: 5; y una región variable de cadena ligera que tiene una CDR-L1 que incluye una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, una CDR-L2 que incluye una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y una CDR-L3 que incluye una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; o (b) un anticuerpo que incluye una región variable de cadena pesada que tiene una CDR-H1 que incluye una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, una CDR-H2 que incluye una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 y una CDR-H3 que incluye una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; y una región variable de cadena ligera que tiene una CDR-L1 que incluye una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, una CDR-L2 que incluye una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 y una CDR-L3 que incluye una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.

En la presente invención, la expresión "cadena pesada" puede incluir tanto una cadena pesada de longitud completa como un fragmento de la misma que incluye un dominio de región variable VH que incluye una secuencia de aminoácidos que tiene una secuencia de región variable suficiente para conferir especificidad al antígeno y tres dominios de región constante CH1, CH2 y CH3. Además, en la presente invención, la expresión "cadena ligera" incluye tanto una cadena ligera de longitud completa como un fragmento de la misma que incluye un dominio de región variable VL que incluye una secuencia de aminoácidos que tiene una secuencia de región variable suficiente para conferir especificidad al antígeno y un dominio de región constante CL.

En la presente invención, el anticuerpo puede incluir todos los anticuerpos de ratón producidos a partir de un ratón y las variantes obtenidas por sustitución, adición y/o deleción de una parte de una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo progenitor con el fin de mejorar la afinidad y la inmunidad del anticuerpo a partir del mismo. Las variantes no se limitan a esto, pero como ejemplos de las mismas pueden incluirse anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos optimizados por afinidad, y similares. La variante se refiere genéricamente a un anticuerpo en el que se incluye la misma CDR que la del anticuerpo progenitor o se muta (sustituye, añade o deleciona) una parte de la secuencia de aminoácidos de la CDR del anticuerpo progenitor, con la condición de que se dirija al mismo epítopo. Los expertos en la materia pueden ajustar dichas variantes adecuadamente con el fin de mejorar la afinidad y la inmunidad del anticuerpo dentro de un intervalo en el que se conserve la capacidad de unión al mismo epítopo.

Es decir, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención puede incluir no sólo una secuencia del anticuerpo anti-TM4SF4 descrito actualmente descrito, sino también equivalentes biológicos de la misma dentro de un intervalo que puede reconocer específicamente TM4SF4. Por ejemplo, para mejorar aún más la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo, pueden introducirse cambios adicionales en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, la deleción, la inserción y/o la sustitución de restos de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo. Estas variantes de aminoácidos se crean en función de la similitud relativa de los sustituyentes de las cadenas laterales de los aminoácidos, tales como de la hidrofobia, hidrofilia, cargas, tamaños y similares. Mediante análisis del tamaño, forma y tipo del sustituyente de la cadena lateral del aminoácido, puede observarse que la arginina, la lisina y la histidina son restos con carga positiva; la alanina, la glicina y la serina tienen tamaños similares; y la fenilalanina, el triptófano y la tirosina tienen formas similares. Por consiguiente, basándose en estas consideraciones, la arginina, lisina e histidina; la alanina, glicina y serina; y la fenilalanina, triptófano y tirosina, pueden ser equivalentes biológicamente funcionales.

En la presente invención, la expresión "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo obtenido por recombinación de una región variable de un anticuerpo de ratón y una región constante de un anticuerpo humano, y a un anticuerpo con una respuesta inmunitaria muy mejorada en comparación con la del anticuerpo de ratón.

En la presente invención, la expresión "anticuerpo humanizado" se refiere a un anticuerpo en el que la secuencia de proteínas de un anticuerpo derivado de una especie no humana se modifica para que sea similar a la de una variante de anticuerpo producida de manera natural en el ser humano. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado puede prepararse recombinando una CDR derivada de ratón con una FR derivada de anticuerpo humano para producir una región variable humanizada, y a continuación recombinar la región variable humanizada producida con una región constante de un anticuerpo humano preferido. Sin embargo, si sólo se realiza el injerto de la CDR, se reduce la afinidad del anticuerpo humanizado. Por lo tanto, varios restos importantes de aminoácidos de la FR que se considera que influyen en una estructura tridimensional de la CDR se han emparejado con los del anticuerpo de ratón para que su afinidad aumente al mismo nivel que la afinidad original del anticuerpo de ratón.

En la presente invención, la expresión "anticuerpo con afinidad optimizada" se refiere a una variante en la que una parte de la secuencia de la CDR de un anticuerpo específico, se sustituye, se añade o se deleciona, y se refiere a anticuerpos con afinidad de unión mejorada contra el antígeno al tiempo que se unen al mismo epítopo antigénico que el del anticuerpo específico. Específicamente, el anticuerpo con afinidad optimizada de la presente invención se refiere a un anticuerpo variante que se une al mismo epítopo que (a) un anticuerpo que incluye una región variable de cadena pesada que tiene una CDR-H1 que incluye una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3, una CDR-H2 que incluye una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y una CDR-H3 que incluye una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; y una región variable de cadena ligera que tiene una CDR-L1 que incluye una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, una CDR-L2 que incluye una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y una CDR-L3 que incluye una secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO: 8; o (b) un anticuerpo que incluye una región variable de cadena pesada que tiene una CDR-H1 que incluye una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, una CDR-H2 que incluye una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 y una CDR-H3 que incluye una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; y una región variable de cadena ligera que tiene una CDR-L1 que incluye una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, CDR-L2 que incluye una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, y CDR-L3 incluye una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 de la presente invención. Los expertos en la materia pueden preparar el anticuerpo con afinidad optimizada utilizando técnicas conocidas basadas en secuencias de la CDR de cadena ligera y pesada especificadas.

En otra realización de la presente invención, el anticuerpo puede ser un anticuerpo que tiene una región variable de cadena pesada que incluye una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; y una región variable de cadena ligera que incluye una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16. En un ejemplo, el anticuerpo puede ser un anticuerpo que tiene una región variable de cadena pesada codificada por una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 17; y una región variable de cadena ligera codificada por una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 18, pero sin limitarse a esto.

Además, el anticuerpo puede ser un anticuerpo que tenga una región variable de cadena pesada que incluya una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; y una región variable de cadena ligera que incluye una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20. En un ejemplo, el anticuerpo puede ser un anticuerpo que tenga una región variable de cadena pesada codificada por una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 21; y una región variable de cadena ligera codificada por una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 22, pero sin limitarse a esto.

En una realización específica de la presente invención, se obtuvo un grupo de células de hibridoma de un ratón utilizando una proteína TM4SF4 humana como antígeno, y a partir de éste, el cribado se realizó mediante un ensayo ELISA utilizando la proteína TM4SF4 como antígeno para seleccionar anticuerpos anti-TM4SF4 que se unen específicamente a TM4SF4.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico, una célula hospedadora en la que se introduce el vector de expresión, y un método para producir un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo usando la célula hospedadora.

En la presente memoria descriptiva, la expresión "molécula de ácido nucleico" tiene un significado de incluir íntegramente las moléculas de<a>D<n>y ARN, y los nucleótidos, que son unidades estructurales básicas de la molécula de ácido nucleico, no son únicamente nucleótidos naturales, sino también análogos con fracciones modificadas de azúcar o de base. La secuencia de la molécula de ácido nucleico que codifica las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera de la presente invención, puede modificarse, y la modificación incluye además, la deleción o la sustitución no conservadora o conservadora de los nucleótidos.

Se interpreta que la molécula de ácido nucleico de la presente invención incluye una secuencia de nucleótidos que presenta una identidad sustancial con la secuencia de nucleótidos. En la presente invención, por identidad sustancial se entiende que es una secuencia de nucleótidos que presenta una homología de al menos un 80 %, específicamente una homología de al menos un 90 %, y más específicamente una homología de al menos un 95 %, cuando se alinea la secuencia de nucleótidos de la presente invención para que se corresponda con cualquier otra secuencia en la medida de lo posible, y se analiza la secuencia alineada utilizando un algoritmo de uso común en la técnica.

En esta memoria descriptiva, el término "vector" como medio para expresar un gen diana en una célula hospedadora incluye un vector de plásmido; un vector de cósmido; y un vector de virus, tal como un vector de bacteriófago, un vector de adenovirus, un vector de retrovirus y un vector de dependoparvovirus, y similares, y específicamente, puede ser un vector de plásmido, pero sin limitarse a esto.

En el vector de la presente invención, la molécula de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena pesada y la molécula de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena ligera, pueden estar unidas operativamente con un promotor.

En la presente invención, la expresión "unido(a) operativamente" se refiere a una unión funcional entre una secuencia reguladora de la expresión de ácido nucleico (p. ej., una matriz de un promotor, una secuencia señal, o un sitio de unión de un factor regulador transcripcional) y otra secuencia de ácido nucleico, y como resultado, la secuencia reguladora regula la transcripción y/o traducción de la otra secuencia de ácido nucleico.

El sistema de vector recombinante de la presente invención puede construirse mediante diversos métodos conocidos en la técnica.

El vector de la presente invención puede construirse normalmente como vector de clonación o como vector de expresión. Además, el vector de la presente invención puede construirse utilizando células procariotas o eucariotas como hospedador.

Por ejemplo, cuando el vector de la presente invención es un vector de expresión y se usa una célula procariota como hospedador, el vector incluye generalmente un promotor fuerte (p. ej., el promotor tac, el promotor lac, el promotor lacUV5, el promotor lpp, el promotor pLA, el promotor pRA, el promotor rac5, el promotor amp, el promotor recA, el promotor SP6, el promotor trp y el promotor T7, etc.) capaz de promover la transcripción, un sitio de unión al ribosoma para el inicio de la traducción y una secuencia de terminación de la transcripción/traducción. Cuando se utilizaE. coli(p. ej., HB101, BL21, DH5a, etc.) como célula hospedadora, pueden utilizarse sitios promotores y operadores de una vía biosintética de triptófano deE coli(Yanofsky, C, J Bacteriol, (1984) 158:1018-1024), y un promotor orientado a la izquierda del fago A (promotor pLA, Herskowitz, I y Hagen, D, Ann Rev Genet, (1980) 14:399-445) como sitio regulador. Cuando se utilizan bacterias del géneroBacilluscomo célula hospedadora, también puede utilizarse promotor de un gen de proteína de toxina deBacillus thuringensis(Appl Environ Microbiol (1998) 64:3932-3938; Mol Gen Genet (1996) 250:734-741) o cualquier promotor que pueda expresarse en bacterias del géneroBacilluscomo sitio regulador.

Por otro lado, el vector recombinante de la presente invención puede prepararse manipulando plásmidos (p. ej., pCL, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, serie pGEX, serie pET, y pUC19, etc.), fagos (es decir, Agt4^AB, A-Charon, AAz1 y M13, etc.), o virus (p. ej. SV40, etc.), que a menudo se han utilizado en la técnica.

Por otro lado, cuando el vector de la presente invención es un vector de expresión y se usa una célula eucariota como hospedador, el vector puede usar promotores (p. ej., el promotor de la metalotionina, el promotor de la p-actina, el promotor de la hemoglobina humana y el promotor de la creatina muscular humana) derivados del genoma de células de mamíferos o promotores (p. ej., el promotor tardío de adenovirus, el promotor 75K del virus variolovacunal, el promotor de SV40, el promotor de citomegalovirus (CMV), el promotor de tk del VHS, el promotor del virus de tumor mamario de ratón (VTM<r>), el promotor de la LTR (región larga terminal) del VIH, el promotor del virus de Epstein-Barr (VEB) del virus de Moloney, y el promotor del virus del sarcoma de Rous (VSR)) derivados de virus de mamíferos, y generalmente tiene una secuencia de poliadenilación como secuencia de terminación de la transcripción. Específicamente, el vector recombinante de la presente invención incluye un promotor de CMV.

El vector recombinante de la presente invención puede fusionarse con otras secuencias para facilitar la purificación de los anticuerpos expresados a partir de los mismos. Las secuencias que van a fusionarse incluyen, por ejemplo, glutatión S-transferasa (Pharmacia, EE.UU.), proteína de unión a maltosa (NEB, EE.UU.), FLAG (IBI, EE.UU.), 6x His (hexahistidina; Quiagen, EE.UU.), y similares. Además, dado que la proteína expresada por el vector de la presente invención es un anticuerpo, el anticuerpo expresado puede purificarse fácilmente mediante una columna de proteína A o similares sin una secuencia adicional para la purificación.

Por otro lado, el vector recombinante de la presente invención incluye un gen de resistencia a antibióticos comúnmente utilizado en la técnica como marcador de selección, y puede incluir genes de resistencia a, por ejemplo, ampicilina, gentamicina, carbenicilina, cloranfenicol, estreptomicina, kanamicina, geneticina, neomicina y tetraciclina.

El vector que expresa el anticuerpo de la presente invención puede ser un sistema vectorial en el que las cadenas ligeras y pesadas se expresan simultáneamente en un vector, o un sistema en el que las cadenas ligeras y pesadas se expresan en vectores distintos, respectivamente. En el último caso, los dos vectores pueden introducirse en una célula hospedadora, por ejemplo, mediante cotransformación o transformación dirigida. La cotransformación es un método que consiste en introducir simultáneamente cada ADN vectorial que codifica una cadena ligera y una cadena pesada en una célula hospedadora, y a continuación seleccionar células que expresen tanto la cadena ligera como la cadena pesada. La transformación dirigida es un método de selección de células transformadas con un vector que contiene una cadena ligera (o una cadena pesada) y de transformación de las células seleccionadas con un vector que contiene una cadena pesada (o una cadena ligera) de nuevo para seleccionar finalmente células que expresen tanto la cadena ligera como la cadena pesada.

Cualquier célula hospedadora conocida en la técnica, que pueda de clonar y expresar de forma estable y continua el vector de la presente invención, puede usarse como célula hospedadora. Por ejemplo, la célula hospedadora puede incluir cepas deBacillustales comoEscherichia coli, Bacillus subtilisyBacillus thuringiensis,y células hospedadoras procariotas tales comoStreptomyces, Pseudomonas(p. ej.,Pseudomonas putida), Proteus mirabilisoStaphylococcus(p. ej.,Staphylococcus carnosus),pero sin limitarse a esto.

Las células hospedadoras eucariotas adecuadas del vector pueden usar hongos tales como de especies deAspergillus,levaduras tales comoPichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, SchizosaccharomycesyNeurospora crassa,otras células eucariotas inferiores, células eucariotas superiores, tales como células derivadas de insectos y células derivadas de plantas o mamíferos.

Específicamente, las células hospedadoras pueden ser células COS7 (células de riñón de mono), células NSO, SP2/0, células de ovario de hámster chino (CHO,Chinese Hamster Ovary),W138, células de riñón de cría de hámster (BHK,Baby Hamster Kidney),MDCK, una estirpe celular de mieloma, células HuT 78 o células 293, pero sin limitarse a estas.

En la presente invención, "transformación" y/o "transfección" en una célula hospedadora incluye cualquier método de introducción de un ácido nucleico en un organismo, una célula, un tejido o un órgano, y puede realizarse seleccionando una técnica estándar adecuada de acuerdo con una célula hospedadora, como se sabe en la técnica. Dicho método incluye electroporación, fusión del protoplasma, precipitación con fosfato cálcico (CaPO4), precipitación con cloruro cálcico (CaCh), agitación utilizando fibras de carburo de silicio, transformación mediada por agrobacterias, PEG, sulfato de dextrano, lipofectamina y métodos de transformación mediados por secado/inhibición, y similares, pero sin limitarse a estos.

En la presente invención, el método de producción del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, usando la célula hospedadora, puede incluir las siguientes etapas: (a) cultivar la célula hospedadora transformada con el vector recombinante de la presente invención; y (b) expresar un anticuerpo anti-TM4SF4 o un fragmento de unión a antígeno del mismo en la célula hospedadora.

En la producción de anticuerpos, la célula hospedadora transformada puede cultivarse de acuerdo con un medio apropiado y unas condiciones de cultivo conocidas en la técnica. El proceso de cultivo puede ajustarse fácilmente y los expertos en la materia pueden utilizarlo de acuerdo con una cepa seleccionada. El cultivo celular se divide en cultivo en suspensión y cultivo de adhesión, de acuerdo con el método de crecimiento celular, y en métodos de cultivo por lotes, semicontinuo y continuo de acuerdo con un método de cultivo. El medio utilizado para el cultivo debe cumplir adecuadamente los requisitos de la cepa específica.

En el cultivo de células animales, el medio contiene diversos componentes de fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno y oligoelementos. Como ejemplos de fuentes de carbono que pueden utilizarse se incluyen hidratos de carbono tales como glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, almidón y celulosa, grasas tales como aceite de soja, aceite de girasol, aceite de ricino y aceite de coco, ácidos grasos, tales como ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico, alcoholes tales como glicerol y etanol, y ácidos orgánicos tales como ácido acético, y estas fuentes de carbono pueden usarse solas o combinadas.

Como ejemplos de fuentes de nitrógeno que pueden utilizarse en la presente invención pueden incluirse fuentes de nitrógeno orgánico, tales como peptona, extracto de levadura, salsa, extracto de malta, licor macerado de maíz (CSL) y harina de soja; y fuentes de nitrógeno inorgánico tales como urea, sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio, y estas fuentes de nitrógeno pueden usarse solas o combinadas. En el medio, como fuente de fosfato puede incluirse dihidrogenofosfato de potasio, hidrogenofosfato dipotásico y sales correspondientes que contienen sodio. Además, puede incluirse una sal metálica tal como sulfato de magnesio o sulfato de hierro. Además, pueden incluirse aminoácidos, vitaminas, precursores adecuados y similares.

Durante el cultivo, se añade un compuesto, tal como hidróxido de amonio, hidróxido de potasio, amoniaco, ácido fosfórico y ácido sulfúrico, a la solución de cultivo mediante un método adecuado, para ajustar el pH del medio de cultivo. Además, durante el cultivo, la producción de burbujas puede inhibirse usando un agente antiespumante tal como éster policíclico de ácido graso. Además, para mantener un estado aeróbico de la solución de cultivo, se inyecta oxígeno o un gas que contenga oxígeno (p. ej., aire) en la solución de cultivo. La temperatura de la solución de cultivo suele oscilar entre 20 °C y 45 °C, preferentemente entre 25 °C y 40 °C.

El método de producción puede incluir además (c) recuperar el anticuerpo anti-TM4SF4 o el fragmento de unión a antígeno del mismo expresado en la célula hospedadora. El anticuerpo obtenido cultivando la célula hospedadora transformada puede usarse en estado no purificado, o puede purificarse además y usarse con gran pureza usando diversos métodos generales, tales como diálisis, precipitación salina y cromatografía. Entre los métodos, el método que utiliza cromatografía es el más utilizado, y el tipo y orden de una columna puede seleccionarse de cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de afinidad en función de las características del anticuerpo, del método de cultivo, y similares.

En otro aspecto más, la presente invención proporciona una composición para detectar TM4SF4, que incluye el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, un kit de detección que incluye el mismo, y un método para detectar un antígeno TM4SF4 usando el mismo.

La composición para la detección de TM4SF4 y el kit que incluye la misma, pueden detectar TM4SF4 de forma eficaz poniendo en contacto el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a TM4SF4, con una muestra que se va a detectar, para formar un complejo antígeno-anticuerpo.

La expresión "complejo antígeno-anticuerpo", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un conjugado de TM4SF4 y a un anticuerpo que reconoce el TM4SF4, para confirmar las células tumorales o cancerosas que expresan TM4SF4 en la muestra.

Un método para cuantificar el antígeno TM4SF4 utilizando la composición para detectar TM4SF4 y el kit que incluye la misma puede realizarse confirmando la formación del complejo antígeno-anticuerpo. La formación del complejo antígeno-anticuerpo puede confirmarse mediante ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA), inmunoelectrotransferencia Western, inmunofluorescencia, tinción inmunohistoquímica, citometría de flujo, inmunocitoquímica, radioinmunoensayo (RIA), ensayo de inmunoprecipitación, ensayo de inmunodifusión, ensayo de fijación del complemento, microplaca de proteínas, o similares, pero sin limitarse a estos. El ensayo ELISA incluye varios métodos ELISA, tales como ELISA directo utilizando un anticuerpo marcado que reconoce un antígeno unido a un soporte sólido, ELISA indirecto que utiliza un anticuerpo secundario marcado que reconoce un anticuerpo de captura en un complejo de un anticuerpo que reconoce un antígeno unido a un soporte sólido, ELISA directo tipo sándwich que utiliza otro anticuerpo marcado que reconoce un antígeno en un complejo de un anticuerpo y un antígeno unido a un soporte sólido, ELISA indirecto tipo sándwich que utiliza un anticuerpo secundario marcado que reconoce un anticuerpo después de reaccionar con otro anticuerpo que reconoce el antígeno en un complejo del anticuerpo y el antígeno unido a un soporte sólido, y similares.

Como etiquetas que permiten medir cualitativa o cuantitativamente la formación del complejo antígeno-anticuerpo se incluyen enzimas, sustancias fluorescentes, ligandos, sustancias luminiscentes, micropartículas, moléculas redox y radioisótopos, pero sin limitarse a estas.

La enzima incluye p-glucuronidasa, p-D-glucosidasa, p-D- galactosidasa, ureasa, peroxidasa, fosfatasa alcalina, acetilcolinesterasa, glucosa oxidasa, hexocinasa y GDPasa, RNasa, glucosa oxidasa y luciferasa, fosfofructocinasa, fosfoenolpiruvato carboxilasa, aspartato aminotransferasa, fosfoenolpiruvato descarboxilasa, p-latamasa, y similares, pero sin limitarse a estas.

En otro aspecto más, la presente invención proporciona una composición para prevenir o tratar el cáncer que incluye el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo.

El anticuerpo y el fragmento de unión a antígeno del mismo son como se ha descrito anteriormente.

Dado que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención se une a TM4SF4 con alta afinidad para inhibir el crecimiento de células cancerosas, el anticuerpo puede usarse para tratar, prevenir y diagnosticar enfermedades hiperproliferativas tales como el cáncer, solo o junto con un vehículo convencional farmacéuticamente aceptable.

El cáncer que es una enfermedad aplicada a la composición de la presente invención, puede ser específicamente cáncer de pulmón, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer rectal, triple cáncer de mama, glioblastoma, cáncer de páncreas, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de endometrio, cáncer de glándula salival o cáncer de tiroides, y más específicamente, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de hígado, cáncer de riñón, cáncer gástrico, cáncer de páncreas y cáncer cerebral, pero sin limitarse a esto. En la presente invención, el cáncer puede ser particularmente cáncer causado por sobreexpresión, amplificación, mutación o activación de TM4SF4, pero sin limitarse a esto. Es decir, dado que la composición que incluye el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención, tiene un efecto inhibidor de la proliferación en todos los carcinomas independientemente de la expresión anómala o mutación de TM4SF4, un uso farmacéutico de la presente invención no está limitado en función del aspecto de expresión o mutación de TM4SF4.

La composición puede estar en forma de una composición farmacéutica, una composición parafarmacéutica o una composición alimenticia saludable.

La composición para prevenir o tratar el cáncer de la presente invención puede incluir además un vehículo farmacéuticamente aceptable. Por 'farmacéuticamente aceptable' se entiende que la diana que se va a aplicar (prescribir) no tiene toxicidad más que adaptable sin inhibir la actividad de un principio activo, y el 'vehículo' se define como un compuesto que facilita la adición de un compuesto en las células o en los tejidos.

La composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse sola o junto con cualquier vehículo conveniente y similar, y dichas formas farmacéuticas pueden ser formas farmacéuticas de dosis única o repetida. La composición farmacéutica puede ser una formulación sólida o líquida. La formulación sólida incluye polvos, granulados, comprimidos, cápsulas, supositorios, y similares, pero sin limitarse a esto. La formulación sólida puede incluir un vehículo, un agente aromatizante, un aglutinante, un conservante, un disgregante, un lubricante, una carga, etc., pero sin limitarse a estos. La formulación líquida incluye soluciones tales como agua y una solución de propilenglicol, suspensiones, emulsiones y similares, pero sin limitarse a esto y puede prepararse añadiendo agentes colorantes, agentes aromatizantes, estabilizantes, agentes viscosos, etc, adecuados. Por ejemplo, los polvos pueden prepararse simplemente mezclando un derivado trihidroxi de ácido graso poliinsaturado, que es un principio activo de la presente invención, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como lactosa, almidón y celulosa microcristalina. Los granulados pueden prepararse mezclando el derivado trihidroxi del ácido graso poliinsaturado de la presente invención, un vehículo adecuado, farmacéuticamente aceptable y un aglutinante adecuado, farmacéuticamente aceptable, tal como polivinilpirrolidona e hidroxipropilcelulosa, y después, utilizando un método de granulación en húmedo utilizando un disolvente tal como agua, etanol e isopropanol o un método de granulación en seco utilizando una fuerza de compresión. Además, los comprimidos pueden prepararse mezclando los granulados con un lubricante adecuado, farmacéuticamente aceptable, tal como estearato de magnesio, y después, comprimiendo la mezcla con una compresora.

La composición farmacéutica puede administrarse con un agente oral, una inyección (p. ej., inyección intramuscular, inyección intraperitoneal, inyección intravenosa, infusión, inyección subcutánea, implante), un inhalante, una inyección nasal, un agente vaginal, un agente rectal, un agente sublingual, un agente transdérmico, un agente tópico, o similares, en función de la enfermedad a tratar y del estado del sujeto, pero sin limitarse a esto. Dependiendo de la vía de administración, la composición farmacéutica puede formularse en una forma farmacéutica unitaria adecuada que incluya un portador, un aditivo y un vehículo, farmacéuticamente aceptable, de uso común y no tóxicos.

La composición farmacéutica puede administrarse a una dosis diaria de aproximadamente 0,0001 mg/kg a aproximadamente 10g/kg, y de aproximadamente 0,001 mg/kg a aproximadamente 1 g/kg. Sin embargo, la dosificación puede variar dependiendo del grado de purificación de la mezcla, del estado del paciente (edad, sexo, peso, etc.), de la gravedad de la afección a tratar, y similares. Si fuese necesario, por comodidad de uso, la dosis diaria total puede dividirse y administrarse varias veces al día.

Además, la presente invención proporciona una composición para inhibir el crecimiento de células madre cancerosas, que incluye el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo.

En la presente invención, la 'célula madre cancerosa (CMC)' se refiere a una célula indiferenciada que tiene la capacidad de diferenciarse en varias células cancerosas. Las células madre cancerosas están presentes en aproximadamente el 1-2 % de los tejidos tumorales malignos, y tienen capacidad de autorreplicación y pluripotencia, que son las características de las células madre normales, pero tienen una anomalía en la función de autorregulación para aumentar el número de células debido a la activación de la división celular y se autodiferencian en células tumorales malignas. Debido a las características de las células madre cancerosas, se sabe que, en general, las células cancerosas se eliminan mediante un tratamiento contra el cáncer, pero que las células madre cancerosas sobreviven, y la recidiva y metástasis del cáncer están causadas por algunas de las células madre cancerosas supervivientes.

Específicamente, las células madre cancerosas de la presente invención pueden ser células cancerosas en las que una proteína aldehído deshidrogenasa 1 (ALDH1), que es uno de los marcadores de las células madre cancerosas, está sobreexpresada o la actividad de la proteína es positiva.

En la presente invención, se confirmó que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, inhibía selectivamente las células madre cancerosas y, en particular, destruía a un grupo de células cancerosas que contenía células madre cancerosas que tenían una alta resistencia al tratamiento contra el cáncer, obteniendo de este modo excelentes efectos anticancerosos. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención, puede inhibir el crecimiento de células madre cancerosas reduciendo la capacidad de autorrenovación, la capacidad de invasión y la capacidad de migración de las células madre cancerosas. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo no está limitado al mismo, pero puede usarse para prevenir o tratar el cáncer que tiene características de células madre cancerosas.

Dado que el cáncer con las características de las células madre cancerosas muestra resistencia a los tratamientos anticancerosos existentes y tiene un mal pronóstico, el cáncer requiere tratamientos diferentes a los tratamientos anticancerosos existentes. Por ejemplo, incluso en pacientes con el mismo carcinoma, si el carcinoma corresponde a un caso en el que la proporción de células madre cancerosas es elevada, los pacientes no podrán obtener efectos terapéuticos contra el cáncer con los tratamientos anticancerosos conocidos existentes, tales como la administración de agentes anticancerosos o la radioterapia. Por lo tanto, incluso con el mismo tipo de cáncer, es muy importante aplicar nuevos tratamientos diferentes de los tratamientos anticancerosos existentes cuando la proporción de células madre cancerosas es elevada en las células del lugar de una lesión cancerosa.

En la presente invención, el 'cáncer con las características de las células madre cancerosas' se refiere al cáncer que tiene una elevada proporción de células madre cancerosas en un grupo celular constitutivo del cáncer. Considerando que la proporción de células madre cancerosas entre las células cancerosas generales es de aproximadamente un 1 % o mayor e inferior a un 5 %, por ejemplo, un caso en el que la proporción de células madre cancerosas en un grupo celular constitutivo de cáncer sea del 5 % o mayor, del 10 % o mayor, del 30 % o mayor, del 50 % o mayor y del 70 % o mayor, puede definirse como "el cáncer con las características de las células madre cancerosas", y como se ha descrito anteriormente, puede caracterizarse por que el cáncer tiene un mal pronóstico de tratamiento contra el cáncer debido a la resistencia a los tratamientos existentes contra el cáncer.

Específicamente, en la presente invención, el 'cáncer con las características de las células madre cancerosas' puede ser un cáncer que sobreexpresa ALDH1. El cáncer que sobreexpresa ALDH1 puede ser un cáncer que expresa ALDH1 o que tiene una proporción relativamente mayor de células madre cancerosas con la actividad positiva que el cáncer general.

Específicamente, el 'cáncer que sobreexpresa ALDH1' puede ser al menos uno seleccionado del grupo que consiste en cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de hígado, cáncer de riñón, cáncer gástrico, cáncer de páncreas y cáncer cerebral, pero sin limitarse a esto.

La prevención o el tratamiento del cáncer pueden consistir en prevenir o tratar la resistencia química del cáncer, recidiva del cáncer, o metástasis del cáncer durante o después del tratamiento del cáncer reduciendo la capacidad de renovación, la capacidad de crecimiento, la capacidad de invasión y la capacidad de migración de las células madre cancerosas.

En otro aspecto adicional más, la presente invención proporciona una composición para quimiorradioterapia adyuvante que incluye el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como principio activo.

La composición de la presente invención incluye el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como principio activo para mejorar la sensibilidad a la radiación de las células relacionadas con el cáncer. Los detalles del anticuerpo y del fragmento de unión a antígeno del mismo son como se ha descrito anteriormente.

Las células relacionadas con el cáncer de la presente invención son células constitutivas de cáncer, y pueden tener características tales como que las células no tienen una forma uniforme en comparación con las células normales, proliferan indefinidamente y tienen una fuerza de unión débil con las células circundantes. Específicamente, las células relacionadas con el cáncer pueden ser células cancerosas o células madre cancerosas, y específicamente, células madre cancerosas.

Las células madre cancerosas pueden ser células indiferenciadas que tengan la capacidad de diferenciarse en varias células cancerosas, y específicamente, pueden ser células cancerosas que expresen ALDH1 o que tengan una actividad positiva. En la presente invención, las células madre cancerosas pueden tener características tales que la proliferación celular no se inhiba ni siquiera con la irradiación de radiación, no se reduzca la capacidad de autorrenovación ni se inhiban las capacidades de migración e invasión.

Además, las células relacionadas con el cáncer pueden tener una baja sensibilidad a la radiación, es decir, pueden tener una alta resistencia a la radioterapia, y sustancialmente no tener sensibilidad a la radiación, por lo que el tratamiento contra el cáncer mediante irradiación podría no ser posible.

El tratamiento contra el cáncer puede inhibir la proliferación de células relacionadas con el cáncer, inhibir la metástasis y la invasión, e inducir la muerte celular mediante irradiación, cirugía quirúrgica y quimioterapia. En la presente invención, el tratamiento contra el cáncer puede administrarse con el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo junto con irradiación. Como tal, cuando el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se administra junto con irradiación, la sensibilidad a la radiación de las células relacionadas con el cáncer se mejora gracias al anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, maximizando de este modo el efecto del tratamiento contra el cáncer mediante irradiación e impidiendo además la recidiva y metástasis del cáncer.

En lo sucesivo en el presente documento, la presente invención se describirá detalladamente mediante Ejemplos y Ejemplos experimentales.

Sin embargo, los siguientes Ejemplos y Ejemplos experimentales son únicamente ilustrativos de la presente invención, y el contenido de la presente invención no se limita a los siguientes Ejemplos y Ejemplos experimentales.

[Ejemplo 1]

Producción de anticuerpos monoclonales humanos contra el antígeno TM4SF4

<1-1> Selección o secuencia epitópica para la producción del anticuerpo específico de antígeno de la proteína de membrana TM4SF4 humana

Para producir un anticuerpo específico de respuesta TM4SF4 capaz de inhibir un sistema de señalización relacionado con las características de las células madre cancerosas mediado por un antígeno TM4SF4, en una estructura de un antígeno TM4SF4, que era una proteína de membrana que consistía en 202 aminoácidos, se debía seleccionar un sitio que quedara expuesto en el exterior de las células y que se esperaba que tuviera una elevada capacidad de inducción de anticuerpos.

En primer lugar, se confirmó, mediante secuenciación de proteínas, que la proteína de membrana, TM4SF4, incluía dos estructuras de bucle (secuencias de aminoácidos 31 a 45 y 115 a 158) expuestas en el exterior de las células. Entre ellas, se confirmó que las asparaginas, que eran aminoácidos en las posiciones 124 y 156, eran un sitio de glucosilación, y se formó un enlace disulfuro entre las cisteínas, que eran aminoácidos en las posiciones 120 y 146 (FIG. 1). A continuación, la secuencia de la proteína TM4SF4 se analizó utilizando un programa de predicción de antigenicidad. Como resultado del análisis de la antigenicidad utilizando los métodos de Kolaskar y Tongaonkar para toda la secuencia, las secuencias en las posiciones 4 a 33, 53 a 67, 71 a 80, 92 a 112, 127 a 133 y 146 a 198, se predijeron como sitios con alta antigenicidad (Tabla 1).

[T l 11

continuación

Resumiendo estos resultados, en la presente invención, como epítopo antigénico para producir un anticuerpo (FIG.

1A), como sitio expuesto extracelular, se seleccionó un sitio (es decir, SEQ ID NO 2: TWGYPFHDGDYLNDE, que consistía en secuencias de aminoácidos en las posiciones 126 a 140) con alta antigenicidad y sin glucosilación ni enlaces disulfuro.

<1-2> Selección de clones de hibridoma de linfocitos B productores de anticuerpos anti-TM4SF4

Se sintetizó un péptido 'CTWGYPFHDGDYLNDE' (SEQ ID NO: 39) de una secuencia en la que se añadió cisteína a un extremo amínico de la secuencia antigénica seleccionada y se conjugó con seroalbúmina bovina (BSA) utilizando Sulfo-SMCC. El antígeno preparado se inyectó tres veces en 4 ratones de acuerdo con un proceso de inmunización general, y se confirmó mediante ELISA si, debido a un efecto de inmunización, había aumentado en la sangre un anticuerpo de respuesta específica al antígeno. Después de la inmunización final, se recogieron esplenocitos de ratones en los que se confirmó la producción de anticuerpos y se fusionaron con células de mieloma de ratón para obtener células de hibridoma de linfocitos B productores de anticuerpos. Se obtuvo una pluralidad de hibridomas de linfocitos B fusionados satisfactoriamente utilizando un medio de selección HAT (hipoxantina - aminopterina -timidina) para cultivar una estirpe celular de fusión, y se probaron anticuerpos específicos de antígeno en una solución de cultivo celular mediante ELISA mientras se cultivaban las células de acuerdo con un protocolo general de selección de células de hibridomas. En el ELISA, como antígeno de recubrimiento (100 ng/pocillo) se utilizó un péptido antigénico conjugado con BSA que se había utilizado para la inmunización y como control se utilizó BSA.

Como resultado, se seleccionaron cinco clones de hibridoma de linfocitos B productores de anticuerpos anti-TM4SF4, ECL-2B7, ECL-4C1, ECL-8E2, ECL-8E5 y ECL-12A8, con una respuesta significativamente más alta contra el péptido TM4SF4 conjugado con BSA que la respuesta contra la BSA (Tabla 2).

[Tabla 2]

Las células productoras de anticuerpos se identificaron realizando selección de clones celulares por dilución limitante tres veces, y con un kit de isotipado se verificó que los subtipos de globulina de los anticuerpos generados por las células eran IgG1, IgG2a, IgG2b, etc., y que consistían en una cadena ligera de tipo kappa (Tabla 3).

[Tabla 3

<1-3> Purificación de los nuevos anticuerpos

Para verificar la eficaciain vitro e in vivode los nuevos anticuerpos, se cultivaron clones de hibridoma de linfocitos B tales como ECL-2B7 en grandes cantidades, y los anticuerpos se purificaron a partir de una solución de cultivo.

Específicamente, para purificar los nuevos anticuerpos, cada hibridoma de linfocitos B se cultivó durante 3 a 4 días en un medio DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Médium,medio Eagle modificado de Dulbecco) que contenía suero bovino al 10 % y se preparó para producir y secretar anticuerpos en cantidad suficiente, y la solución del cultivo celular se recogió y se utilizó para la purificación de anticuerpos. La solución de cultivo celular recogida se trató con sulfito de amonio a una concentración del 50 %, se centrifugó a 10.000xg durante 30 minutos para precipitar los anticuerpos, y después se disolvió en solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4). Puesto que se confirmó que los isotipos de los anticuerpos eran IgG1, IgG2a y IgG2b, respectivamente, los anticuerpos se purificaron de acuerdo con un protocolo para usar un producto utilizando proteína G-agarosa que tiene alta afinidad contra los anticuerpos. Los anticuerpos purificados se cuantificaron mediante un método de Bradford y un método ELISA, y la pureza se confirmó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE).

Como resultado, los anticuerpos se purificaron con una alta pureza de aproximadamente el 99 % mediante cromatografía de afinidad, y se obtuvo aproximadamente 1 mg por cada anticuerpo en 200 ml de la solución de cultivo celular. En las posiciones de 55 kDa y 26 kDa se identificó una cadena pesada (IgG-HC) y una cadena ligera (IgG-LC) de cada anticuerpo que identificaba un anticuerpo de tipo IgG, y la IgG no reducida se identificó mediante una banda (IgG) situada por encima de 170 kDa.

[Ejemplo 2]

Confirmación de la capacidad de respuesta específica de antígeno del nuevo anticuerpo anti-TM4SF4

<2-1> Verificación de la respuesta específica de antígeno de los nuevos anticuerpos mediante ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA)

Para confirmar la capacidad de respuesta específica de antígeno de los nuevos anticuerpos, se utilizó un antígeno de seroalbúmina bovina (péptido TM4SF4-BSA) unido con aminoácidos en las posiciones 126 a 140 que eran algunas secuencias peptídicas en un dominio de bucle grande (ECL,large loop domain)extracelular de una proteína TM4SF4. También se midió la afinidad antigénica de los nuevos anticuerpos mediante ELISA utilizando un inmunógeno, y se seleccionaron los anticuerpos con una excelente capacidad de unión al antígeno.

Específicamente, para confirmar la capacidad de respuesta del anticuerpo contra el antígeno peptídico TM4SF4-BSA, el antígeno se diluyó en PBS, se dispensó en una placa ELISA Maxisorp (Nunc) de 96 pocillos y se indujo la adhesión para preparar una placa recubierta con el antígeno. El antígeno se diluyó secuencialmente en 1/5 partiendo de una concentración de 500 ng/pocillo, y se añadieron 100 pl del antígeno diluido a pocillos individuales de la placa, y se indujo el recubrimiento del antígeno en la superficie de los pocillos de la placa durante 16 horas o más a 4 °C. Después del recubrimiento del antígeno, la placa se lavó dos veces con 300 pl de una solución de lavado TBST (TBS que contiene Tween-20 al 0,1 % (v/v)) por pocillo para eliminar los antígenos residuales no recubiertos, y como solución de bloqueo se añadió una solución de leche desnatada (5 % (p/v) de leche desnatada/TBST) en 300 pl y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 2 horas para bloquear la parte restante después del recubrimiento del antígeno. El nuevo anticuerpo anti-TM4SF4 se preparó diluyendo secuencialmente en 1/3 desde una concentración inicial de 200 ng/pocillo en la solución de bloqueo, y se añadieron 100 pl/pocillo del anticuerpo diluido a la placa bloqueada, agitándose a continuación a 37 °C a una velocidad de 50 rpm durante 2 horas para inducir la unión antígeno/anticuerpo. Después de la reacción, la solución se eliminó y la placa se lavó 5 veces con 300 pl/pocillo de una solución de lavado para eliminar los anticuerpos que no se unieron a los antígenos, y los anticuerpos unidos a los antígenos se detectaron tratando con el anticuerpo secundario anti-IgG-HRP de ratón (Cell signaling technology Co., Ltd.) diluido en una proporción de 1:2500 en un tampón de bloqueo. El anticuerpo secundario también se agitó durante 90 minutos a 37 °C a una velocidad de 50 rpm, y después se lavó 6 veces con una solución de lavado para eliminar el anticuerpo secundario que no estaba unido al anticuerpo anti-TM4SF4, y a continuación se realizó una reacción de revelado de color utilizando una solución de TMB (tetrametilbencidina) como sustrato para la HRP (Thermo Scientific Co., Ltd.), y la respuesta del anticuerpo contra el antígeno se cuantificó midiendo la absorbancia a 450 nm.

Como resultado, se confirmó que los cinco anticuerpos anti-TM4SF4, ECL-2B7, ECL-4C1, ECL-8E2, ECL-8E5 y ECL-12A8 de la presente invención, preparados en el Ejemplo 1, tenían una excelente capacidad de unión antigénica frente al antígeno peptídico. Se confirmó que entre ellos, los anticuerpos ECL-2B7, ECL-4C1 y ECL-12A8, presentaban una afinidad antigénica particularmente más alta (FIG. 3).

<2-2> Verificación de las interacciones intermoleculares de los nuevos anticuerpos mediante resonancia de plasmón superficial (SPR)

Para confirmar la capacidad de respuesta específica de antígeno de los nuevos anticuerpos, el péptido TM4SF4-BSA (Biotina-GSAGGSTWGYPFHDGDYLNDE) (Se Q ID NO: 33) utilizado en el Ejemplo 2-1, se utilizó como antígeno, y los anticuerpos ECL-2B7, ECL-4C1 y ECL-12A8 se trataron para medir la respuesta específica de antígeno.

Específicamente, para confirmar la capacidad de respuesta del anticuerpo contra el antígeno peptídico TM4SF4-BSA de cada anticuerpo, se eliminó una proteína de la superficie presente en una microplaca detectara utilizando los reactivos NaCl 1 M y NaOH 50 mM. Para encontrar una condición óptima de inmovilización de un péptido-biotina (ligando), se intentó inmovilizar la concentración del ligando entre 10 pM y 100 nM. Después de la inmovilización, los anticuerpos ECL-2B7, ECL-4C1 y ECL-12A8, fluyeron a una concentración de 32 nM para confirmar la unión al antígeno, y se repitió la regeneración para intentar estabilizar un punto de partida. Después de una hora o más, los analitos ECL-2B7, ECL-4C1 y ECL-12A8, se analizaron basándose en el punto de partida estabilizado.

Como resultado, se observó que un periodo de unión durante el cual el gráfico aumentaba se incrementaba con el tiempo, y se confirmó que cuando la unión se inhibía a los 480 segundos, la capacidad de unión disminuía.

A través de esto, puede observarse que los anticuerpos ECL-2B7, ECL-4C1 y ECL-12A8, son anticuerpos con alta capacidad de unión a antígenos peptídicos.

<2-3> Verificación de la respuesta específica de antígeno de los nuevos anticuerpos mediante inmunoelectrotransferencia Western después de inmunoprecipitación

Para que los nuevos anticuerpos que muestran una alta capacidad de respuesta al antígeno peptídico TM4SF4 puedan utilizarse en el direccionamiento celular, la capacidad de respuesta a la estructura terciaria del antígeno TM4SF4 expresado en las células debe ser elevada. Para comprobarlo, se verificó la respuesta específica de los nuevos anticuerpos contra el antígeno de la proteína TM4SF4 expresado en las células. Se preparó un vector de expresión de la proteína TM4SF4 marcado con el epítopo flag (pFLAG-TM4SF4) y se expresó en células HEK293T. Se realizó la inmunoprecipitación de estos lisados celulares con los nuevos anticuerpos anti-TM4SF4, y después de la inmunoelectrotransferencia Western, se detectó la etiqueta FLAG para confirmar que el antígeno inmunoprecipitado con los nuevos anticuerpos era TM4SF4.

Específicamente, la secuencia génica completa de la proteína TM4SF4 se preparó mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando ADNc de células A549, células de cáncer de pulmón humano, como ADN molde y se clonó en un vector p3xFLAG-CMV™-7.1 (Sigma-Aldrich) utilizando una secuencia de enzimas de restricción EcoRI/BamHI para construir un vector (vector 3xFLAG-TM4SF4: pFLAG-TM4SF4) en el que la proteína TM4SF4 se expresaba con tres etiquetas FLAG en un extremo amínico en las células. La expresión intracelular de pFLAG-TM4SF4 se indujo en células de riñón embrionario humano(Human Embryonic Kidney293T, HEK293T) mediante transfección génica. En primer lugar, durante 16 horas, se cultivaron células HEK293T a 6x105/pocillo en un medio DMEM que contenía suero bovino fetal (FBS) al 5 % en una placa de cultivo celular de 100 mm para preparar células que expresasen una proteína 3xFLAG-TM4SF4. La solución de cultivo de las células preparadas se eliminó y 36 |jg del vector 3xFLAG-TM4SF4 pFLAG-TM4SF4 y la misma cantidad de polietileneimina (PEI, Polysciences Co., Ltd.) se mezclaron en 1 ml de una solución de cultivo DMEM (FBS al 5% ) y se hizo reaccionar durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después, la mezcla se trató en células que contenían 9 ml de la solución de cultivo que se iba a someter a transfección génica. Después de 15 horas, se eliminó la solución de cultivo celular y para inducir la expresión de la proteína 3xFLAG-TM4SF4, las células se cultivaron de nuevo durante 48 horas en la solución de cultivo DMEM que contenía FBS al 10 %, y se verificó la capacidad de respuesta específica a los nuevos anticuerpos mediante inmunoprecipitación e inmunoelectrotransferencia Western. Las células transfectadas con genes se disolvieron en un tampón RIPA (de radioinmunoprecipitación) (NP40 al 1 %, desoxicolato sódico al 0,5 %, SDS al 0,1 %, inhibidores de fosfatasa, inhibidores de proteasa/PBS), se sometió a ultrasonidos a 21 amplitudes durante 5 segundos y, a continuación, se centrifugó a 13.000 rpm a 4 °C para obtener una solución de proteínas celulares. La cuantificación de las proteínas se realizó mediante el método de Bradford, se mezclaron 500 jg de una proteína con 5 jg de anticuerpos nuevos o de un anticuerpo de control, anticuerpo anti-GAPDH de ratón, a 4 °C durante 16 horas para inducir la unión antígeno/anticuerpo del anticuerpo y la proteína, y se añadieron 30 j l de perlas de proteína G y se hizo reaccionar de nuevo durante 4 horas para unir los anticuerpos a las perlas. Para eliminar una proteína inespecífica, las perlas se lavaron 6 veces con el tampón RIPA y después se añadió un tampón de muestra de SDS que contenía un agente reductor y se hirvió a 95 °C, y la proteína se reveló en un gel de SDS-PAGE al 12 %. La proteína revelada se transfirió a una membrana de PVDF, la membrana en la que se realizó la transferencia de proteínas se bloqueó durante 1 hora a temperatura ambiente con una solución de bloqueo TBST (solución salina tamponada con Tris, Tween 20 al 0,1 %) que contenía leche desnatada al 5 % (p/v), y el anticuerpo anti-FLAG (Cell signaling technology) diluido en la solución de bloqueo se trató a temperatura ambiente durante 2 horas y a continuación se agitó y se lavó 8 veces con TBST durante 5 minutos para eliminar los anticuerpos inespecíficos. El anticuerpo anti-FLAG unido a la proteína 3xFLAG-TM4SF4 se trató con un anticuerpo secundario (anti-IgG-HRP de conejo) y a continuación se detectó mediante un método de quimioluminiscencia intensificada (ECL,enhanced chemiluminescence).

Como resultado, el peso molecular previsto de la proteína 3xFLAG-TM4SF4 era de 24,8 kDa, y se confirmó la respuesta del anticuerpo anti-FLAG al lisado celular que expresaba la proteína 3xFLAG o 3xFLAG-TM4SF4 (muestras de entrada de las líneas 1 y 2 de la FIG. 5A). Como resultado, la respuesta específica se confirmó en una posición de 26 a 30 kDa, y la respuesta específica se confirmó también incluso en posiciones de peso molecular de 34 kDa y 95 kDa o superiores. Ya se ha confirmado que la proteína TM4SF4 tiene propiedades de tetraspanina que forma enlaces covalentes con las proteínas circundantes utilizando restos de cisteína. Se determinó que la razón por la que la etiqueta Flag en la proteína de alto peso molecular era diferente a la del control era que la proteína TM4SF4 formaba un conjugado mediante restos de cisteína. Se confirmó que los nuevos anticuerpos utilizados para la inmunoprecipitación no inmunoprecipitaban la proteína marcada con FLAG en un lisado celular (Muestra 1) transfectado con genes con un vector de control p3xFLAG-CMV™-7.1 (pFLAG), mientras que en un lisado celular (Muestra 2) transfectado con genes con un vector 3xFLAG-TM4SF4 (pFLAG-TM4SF4), 3xFLAG-TM4SF4 se detectó específicamente por inmunoprecipitación en una posición de 26 kDa o superior. Como resultado, se verificó la respuesta específica de los nuevos anticuerpos contra la proteína TM4SF4 expresada en las células (FIG. 5A). Además, en las muestras con 3xFLAG-TM4SF4 confirmado en 26 kDa, se confirmó que también se detectaron por inmunoprecipitación proteínas con un peso molecular de 95 kDa o superior, y se demostró que estas muestras eran conjugados múltiples de la proteína TM4SF4. En el caso de una banda de proteína de FLAG-TM4SF4 identificada por debajo de 26 kDa, las proteínas también se detectaron incluso en una muestra tratada con un anticuerpo anti-GAPDH de ratón (IgG de ratón) utilizado como anticuerpo de inmunoprecipitación de control negativo durante la inmunoprecipitación, y por tanto, se determinó como la unión inespecífica del anticuerpo anti-FLAG (FIG. 5A, Antígeno anti-FLAG). Todos los anticuerpos utilizados durante la inmunoprecipitación eran anticuerpos derivados de ratón, y se detectaron tratando anti-IgG de ratón-HRP en una membrana de PVDF, y como resultado, se confirmó que, durante la inmunoprecipitación, se utilizaba la misma cantidad de anticuerpos (FIG. 5B).

<2-4> Verificación de la respuesta específica de antígeno en la superficie celular de los nuevos anticuerpos mediante inmunofluorescencia

Para confirmar si los nuevos anticuerpos podían reconocer específicamente la proteína TM4SF4 expresada en la superficie celular, la capacidad de unión a la TM4SF4 expresada en la superficie celular se verificó mediante análisis de inmunofluorescencia.

Específicamente, para confirmar una posición de expresión intracelular de TM4SF4, un extremo amínico de TM4SF4 se marcó con una proteína verde fluorescente, EGFP (proteína verde fluorescente intensificada), de modo que la TM4SF4 presenta fluorescencia verde cuando se expresa en células para preparar un vector transgénico. La secuencia génica completa de la proteína TM4SF4 se preparó mediante PCR utilizando ADNc de células A549, células de cáncer de pulmón humano, como ADN molde y se clonó en un vector pEGFP-C2 (Clonetech Co., Ltd.) utilizando una secuencia de enzimas de restricción EcoRI/BamHI para construir un vector (vector EGFP-TM4SF4) en el que la proteína TM4SF4 se expresaba con una etiqueta de EGFP en el extremo amínico en las células. La expresión intracelular de la proteína TM4SF4 marcada con EGFP se indujo en células de riñón embrionario humano(Human Embryonic Kidney293T, HEK293T) mediante transfección génica. En primer lugar, durante 16 horas, se cultivaron células HEK293T a 1x105/pocillo en un medio DMEM que contenía suero bovino fetal (FBS) al 5 % en una placa de cultivo celular de 6 pocillos cubierta con un cubreobjetos para preparar células que expresasen una proteína TM4SF4 marcada con EGFP. Se retiró la solución de cultivo de las células preparadas y 6 |jg del vector EGFP-TM4SF4 y la misma cantidad de polietileneimina (PEI, Polysciences Co., Ltd.) se mezclaron en 400 j l de una solución de cultivo DMEM (FBS al 5 %) y se hizo reaccionar durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después, la mezcla se trató en células que contenían 1,6 ml de la solución de cultivo que se iba a someter a transfección génica. Después de 15 horas, se eliminó la solución de cultivo celular, y las células se cultivaron de nuevo en la solución de cultivo DMEM que contenía un 10 % de FBS durante 48 horas para inducir la expresión de la proteína TM4SF4-EGFP, y la respuesta entre los nuevos anticuerpos y la TM4SF4 que expresaba la célula se confirmó mediante análisis de inmunofluorescencia. El proceso de análisis de inmunofluorescencia fue el siguiente. Tras la inducción de la expresión de la proteína TM4SF4 marcada con EGFP, la solución de cultivo se eliminó por completo de la placa, y se pretrató a temperatura ambiente durante 2 minutos una solución de cultivo que contenía paraformaldehído al 2 %, y después, se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos una solución fijadora de paraformaldehído al 2 % mezclada en PBS para fijar las células (fijación). Después del proceso de fijación celular, las células se lavaron tres veces durante 5 minutos con una solución de lavado de PBS que contenía seroalbúmina bovina (BSA) al 0,1 % para eliminar la solución fijadora restante, y con el fin de impedir la unión inespecífica de los anticuerpos, las células se bloquearon durante 30 minutos con una solución de bloqueo (BSA/PBS al 1 %). Los nuevos anticuerpos se diluyeron en la solución de bloqueo a una concentración de 50 jg/ml y se trataron a temperatura ambiente durante 1 hora para inducir la unión del anticuerpo con el antígeno, y a continuación se lavaron tres veces durante 5 minutos con una solución de lavado para eliminar los anticuerpos residuales que no se habían unido al antígeno. Los anticuerpos que se unieron al antígeno se trataron con un anticuerpo secundario anti-IgG de ratón marcado con Rodamina (RDM) diluido en una proporción de 1:1000 en una solución de bloqueo durante 1 hora, y la solución de lavado se trató tres veces durante 5 minutos, y después los núcleos celulares se tiñeron con una solución de DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) durante 5 minutos y se confirmó con un microscopio confocal de barrido láser. La fluorescencia verde de la EGFP se midió para confirmar la expresión de la proteína TM4SF4-EGFP, y la fluorescencia roja de la Rodamina se midió para confirmar los sitios de respuesta de los anticuerpos.

Además, cuando se inhibió la expresión de TM4SF4 mediante el tratamiento con ARNpi (ARN pequeño de interferencia) en células de cáncer de pulmón, A549, que sobreexpresan TM4SF4, se confirmó que la respuesta de los nuevos anticuerpos se reducía. El ARNpi específico de TM4SF4 [de sentido, 5'-gcc ucu caa ugu ggu ucc cug gaa u- 3' (SEQ ID NO: 30); de antisentido, 5'-auu cca ggg aac cac auu gag agg c-3' (SEQ ID NO: 31)] o un control negativo de Stealth RNAiTM de contenido medio de GC (Invitrogen) se transfirió a células A549 utilizando el reactivo RNAiMAX de Lipofectamine® (Invitrogen) y se recogió durante 48 horas, y después, en una placa preparada con un cubreobjetos, se cultivaron 1x105 células durante 24 horas. Después de eliminar la solución de cultivo de las células cultivadas, las células se fijaron con una solución de paraformaldehído, como se ha descrito anteriormente, y se hizo reaccionar a los nuevos anticuerpos. Los anticuerpos que se unieron al antígeno se trataron con un anticuerpo secundario anti-IgG de ratón marcado con FITC (isotiocianato de fluoresceína) diluido en una proporción de 1:1000 en una solución de bloqueo durante 1 hora, y la solución de lavado se trató tres veces durante 5 minutos, y después los núcleos celulares se tiñeron con una solución de DAPI durante 5 minutos y se confirmó con un microscopio de fluorescencia.

Como resultado, como se ilustra en la FIG. 6A, se confirmó que la proteína TM4SF4-EGFP se situaba en la superficie celular cuando se expresaba en células HEK293 a través de la señal verde de la EGFP expresada, y la respuesta al antígeno de los nuevos anticuerpos, detectada por una señal de fluorescencia roja de Rodamina, se confirmó en el interior de las células, incluida la superficie celular. Además, cuando las dos señales de color rojo y verde se fusionaron, se confirmó que las dos señales existían en la misma posición, y se localizó un sitio amarillento en la membrana celular.

A partir de esto, se verificó que los cinco nuevos anticuerpos se unían a la proteína TM4SF4 situada en la superficie celular, y se confirmó que la capacidad de respuesta de ECL-2B7, ECL-4C1 y ECL-12A8 entre ellos fue mayor. Las células A549 eran células con alta expresión de TM4SF4, y se confirmó que la respuesta en la superficie celular de los nuevos anticuerpos ECL-2B7, ECL-4C1 y ECL-12A8 fue alta (FIG. 6B). Sin embargo, cuando se inhibió la expresión de TM4SF4 mediante tratamiento con si-TM4SF4, no se pudo confirmar la respuesta de los anticuerpos, confirmando de este modo una vez más la respuesta específica de antígeno de los nuevos anticuerpos.

[Ejemplo 3]

Confirmación del efecto inhibidor del crecimiento de células madre cancerosas mediante el anticuerpo anti-TM4SF4

Se realizaron ensayos de formación de esferas y ensayos de invasión y migración para confirmar el efecto inhibidor de las características de las células madre cancerosas de los nuevos anticuerpos con especificidad de respuesta al antígeno TM4SF4 confirmada.

<3-1> Aislamiento y cultivo de células madre cancerosas

Específicamente, células A549 de la estirpe celular de cáncer de pulmón humano, se cultivaron en condiciones de humedad con CO2 al 5 % a 37 °C. Las células se cultivaron en RPMI suplementado con suero bovino fetal al 10 % y estreptomicina (100g/ml). Entre las células, se aislaron células madre cancerosas A549-ALDH1 y se usaron en experimentos posteriores.

<3-2> Confirmación del efecto inhibidor de la capacidad de autorrenovación de las células madre cancerosas con los nuevos anticuerpos

Células madre cancerosas A549-ALDH1 se cultivaron en un medio aceptable para células madre cancerosas que contenía DMEM-F12 (Invitrogen), un factor de crecimiento epidérmico (EGF,epidermal growth factor.20 ng/ml), unfactor de crecimiento de fibroblastos básico (20 ng/ml) y un suplemento sin suero de B27 al 2 % (1:50). Como incubadora de células, se utilizó una placa de 96 pocillos con adhesión ultrabaja (Corning Co., Ltd.). Después se añadieron de 1 a 2 células por pocillo de la incubadora y se estabilizaron durante 24 horas, los nuevos anticuerpos o anticuerpos anti-TM4SF4 de Sigma Co, Ltd. se trataron en la solución de cultivo celular a una concentración de 3 pg/ml, respectivamente. Después del tratamiento, las células se cultivaron en una incubadora celular humidificada con CO2 al 5 % a 37 °C, y al cabo de 10 días, con un microscopio se confirmó el número y el tamaño de las esferas formadas para las células madre cancerosas.

Como resultado, como se ilustra en la FIG. 7, se confirmó que cuando se trataron los nuevos anticuerpos de la presente invención, el número y el tamaño de las esferas formadas se redujeron significativamente en comparación con el caso del tratamiento con anticuerpos conocidos.

A partir de los resultados anteriores, puede observarse que la capacidad de formar esferas de las células madre cancerosas puede inhibirse eficazmente a través de la inhibición de la proteína TM4SF4 presente en la membrana celular de las células madre cancerosas, y como resultado, puede observarse que se inhibe la capacidad de autorrenovación de las células madre cancerosas.

<3-3> Confirmación del efecto inhibidor de la capacidad de invasión y migración de las células cancerosas con los nuevos anticuerpos

Células A549 (5x104 células/pocillo) se suspendieron en 0,2 ml de un medio RPMI sin suero. Para el análisis de la invasión, las células se dispensaron en un pocillo superior de una cámara Transwell con un tamaño de poro de 8 pm previamente cubierta con 10 mg/ml de Matrigel. El pocillo superior preparado se colocó en una cámara de pocillos inferior cargada con 0,8 ml de un medio RPMI 'que no contenía suero y se cultivó a 37 °C durante 48 horas; a continuación, las células invasivas que se habían desplazado al exterior del filtro superior, se tiñeron y analizaron. En el análisis del movimiento, se utilizó una cámara en la que el Matrigel no estaba recubierto en un inserto utilizado en el experimento de invasión. Los anticuerpos se añadieron en el pocillo superior mientras se dispensaban las células a una concentración de 3 pg/ml.

Como resultado, como se ilustra en la FIG. 8, se confirmó que cuando se trataron los nuevos anticuerpos de la presente invención, el número de células madre cancerosas en las que se produjo migración e invasión se redujo significativamente en comparación con el caso del tratamiento con anticuerpos conocidos.

A partir de esto, puede observarse que los nuevos anticuerpos de la presente invención pueden inhibir eficazmente las capacidades de invasión y migración de las células cancerosas.

[Ejemplo 4]

Confirmación del efecto inhibidor de la resistencia a la radiación de las células cancerosas con el anticuerpo anti-TM4SF4

Células A549 y Huh7 se recubrieron a 1x103 células/placa en una placa de 35 mm, respectivamente. Después de 24 horas, la solución de cultivo celular se trató con los nuevos anticuerpos ECL-2B7, ECL-4C1 y ECL-12A8 o con el anticuerpo anti-TM4SF4 de Sigma Co, Ltd. a una concentración de 3 pg/ml, respectivamente. Después del tratamiento, las células se cultivaron en una incubadora celular humidificada con CO2 al 5 % a 37 °C durante 7 días. La placa de la que se eliminó la solución de cultivo se tiñó con un reactivo de violeta cristal al 0,5 % durante 10 minutos, se lavó varias veces con PBS y se confirmó al microscopio. Para confirmar la sensibilidad a la irradiación, las células A549 se irradiaron con una dosis total de radiación de 6 Gy (gray) (tasa de dosis: x/hora) utilizando una fuente de rayos<y>de Cobalto 60 y se recubrieron sobre una placa, y después se trataron con anticuerpos al cabo de 24 horas.

Como resultado, como se ilustra en la FIG. 9, se confirmó que las colonias de células que sobrevivieron al tratamiento con los nuevos anticuerpos de la presente invención eran significativamente más pequeñas que las colonias de células que sobrevivieron al tratamiento con anticuerpos conocidos. Además, se confirmó que se producían efectos similares no solo en las células de cáncer de pulmón, sino también en las de cáncer de hígado.

A partir de esto, puede observarse que los nuevos anticuerpos de la presente invención pueden utilizarse como método para aumentar el efecto del tratamiento con radiación, y pueden utilizarse como método para aumentar el efecto del tratamiento con radiación no solo en células de cáncer de pulmón, sino también en células de cáncer de hígado.

[Ejemplo 5]

Confirmación del proceso de señalización intracelular asociado a la inducción de la muerte de células cancerosas con el anticuerpo anti-TM4SF4

Para verificar el proceso de señalización intracelular implicado en la inducción de la muerte de células cancerosas de los nuevos anticuerpos de la presente invención, se confirmó el proceso de señalización relacionado con TM4SF4 y se examinó si dicho proceso se veía afectado por los anticuerpos.

Específicamente, tal y como se confirmó en los resultados del estudio anterior, la expresión de las proteínas se confirmó mediante inmunoelectrotransferencia Western con respecto a si la expresión de IGF1, ILIbeta y Osteopontina, que eran productos del proceso de señalización incrementado por la expresión de TM4SF4, se inhibía mediante el tratamiento con los nuevos anticuerpos. Para el experimento de inmunoelectrotransferencia Western, cada célula se recogió, se añadieron 50 pl de una solución de lisis de proteínas cada vez, reaccionaron a 4 °C durante 30 minutos, y a continuación, con una centrífuga a 4 °C y 13.000 RpM, se separaron un sedimento y un sobrenadante. El sobrenadante se cargó en un gel de SDS-PAGE con 40 pg de cada proteína utilizando un kit de ensayo de proteínas (Sigma). Posteriormente, la proteína cargada en el gel de SDS-PAGE se transfirió a una membrana de nitrocelulosa y se hizo reaccionar con un tampón de BSA a temperatura ambiente durante 30 minutos para impedir que se unieran otros anticuerpos, reaccionaron durante 4 horas en un tampón de PBS en el que los anticuerpos primarios TM4SF4, ALDH1A1, ALDH1A3(Abcam), p-catenina, CD133, Oct4 (millipore) y CD44 y p-actina (cell signaling) se diluyeron a 1:1000, y a continuación se volvió a hacer reaccionar durante 1 hora en un tampón de PBS en el que se diluyó a 1:10000 un anticuerpo secundario anti-Igs de conejo o anti-Igs de ratón-HRP (cell signaling). Posteriormente, la membrana de nitrocelulosa se lavó 5 veces con PBS y, a continuación, se hizo reaccionar con una solución de detección ECL y se expuso a una película.

Como resultado, como se ilustra en la FIG. 10, se observó que después del tratamiento con los anticuerpos, las proteínas marcadas ALDH1A1, ALDH1A3 y CD44 de las células madre cancerosas, se redujeron cuando se trataron con un anticuerpo anti-TM4SF4, y que también disminuyó la expresión de la p-catenina y Oct4 implicados en la autorrenovación de las células madre cancerosas. Además, se observó que entre los mecanismos de señalización implicados en la malignización del cáncer, estaba implicado un mecanismo de señalización de IGF1Rp. Se descubrió que la malignización de las células madre cancerosas se regulaba a través de la señal de IGFIRp. A partir de esto, puede observarse que el efecto inhibidor de tumores y el efecto de mejora de la sensibilidad a la radiación de los nuevos anticuerpos de la presente invención se deben a la destrucción de las células madre cancerosas, a la inhibición de la capacidad de autorrenovación y a la inhibición de las capacidades de invasión y migración.

[Ejemplo 6]

Ensayo de xenoinjerto en ratón para confirmar el efecto destructor de células cancerosas de los nuevos anticuerpos

Para confirmar la eficacia de los nuevos anticuerpos para destruir células cancerosas en condicionesin vivo,se formó un xenoinjerto de células de cáncer de pulmón en un ratón y se inyectaron los nuevos anticuerpos para verificar la inhibición del crecimiento y/o la muerte de las células cancerosas.

Específicamente, el ratón que se utilizó para formar el xenoinjerto de cáncer de pulmón era un ratón Balb/c lampiño y a las 6 semanas de vida se inyectaron por vía subcutánea 1x106 células/ratón de células A549 en la extremidad derecha posterior. Después de la inyección, cuando el tamaño del tejido canceroso creció hasta un tamaño de 100 mm3, el anticuerpo TM4SF4 se inyectó directamente en el tejido canceroso, y el tamaño de dicho tejido se midió a intervalos de 2 a 3 días. El anticuerpo inyectado se administró a una dosis total de 80 |jg por ratón, dividida en 6 dosis de 13,333 jg/ratón por inyección a intervalos de 2 a 3 días. El experimento completo se llevó a cabo hasta el día 49 después de la inyección de las células cancerosas. El tamaño del tejido canceroso se calculó mediante el cálculo del eje corto2 x (eje largo/2) utilizando un diámetro del tejido canceroso.

Se realizaron dos experimentos variando el momento de la administración del anticuerpo en función del tamaño del tejido canceroso. En un primer experimento, después de 4 semanas de la inyección de las células cancerosas, los anticuerpos comenzaron a administrarse cuando el tamaño del tejido canceroso era de 30 mm3 o mayor.

Como resultado, el crecimiento del tejido canceroso en un grupo al que se le administró el anticuerpo se inhibió y el tamaño del tejido canceroso dejó de aumentar (FIGS. 11A y 11B). En un segundo experimento, después de 5 semanas de la inyección de las células cancerosas, los anticuerpos comenzaron a administrarse cuando el tamaño del tejido canceroso era de 200 mm3 o mayor. En este momento, también se observó que el crecimiento de las células cancerosas se inhibió en el grupo al que se le inyectó el anticuerpo. Sin embargo, se confirmó que el tamaño de las células cancerosas se mantenía y el tamaño del cáncer aumentó ligeramente después de suspender la inyección de anticuerpos y, como resultado, se determinó que existía una correlación entre el tamaño del tumor y la cantidad de anticuerpo capaz de maximizar el efecto cuando el anticuerpo se utilizaba como agente anticanceroso (FIGS. 11C y 11D). En un tercer experimento, se inyectó un anticuerpo anti-TM4SF4 en los vasos sanguíneos en lugar de inyectarlo directamente en un cáncer para observar un cambio en el tamaño del tejido canceroso. Como resultado, podrían obtenerse resultados similares a los de los experimentos descritos anteriormente (FIGS. 11E y 11F).

[Ejemplo 7]

Clonación y secuenciación de nucleótidos de los genes de anticuerpos de los nuevos anticuerpos monoclonales ECL-2B7 y ECL-4C1

La especificidad del anticuerpo se determinó mediante la identificación de una región de unión complementaria (CDR) al antígeno del nuevo anticuerpo. Para determinar una secuencia de proteínas correspondiente a la región CDR del nuevo anticuerpo, se clonó el gen del anticuerpo y se determinó la secuencia de nucleótidos de la región CDR.

Específicamente, se recogieron por centrifugación 5 x 106 clones celulares de hibridomas vigorosos ECL-2B7 o ECL-4C1, y se extrajo el ARN total con un reactivo RNAiso plus (TaKaRa, Otsu, Japón) de acuerdo con el protocolo de un proveedor. El ARN total obtenido se cuantificó midiendo un valor de DO260 (Densidad Óptica a 260 nm). El ARN total se añadió a una mezcla maestra PrimeScript RT (TaKaRa) para preparar una mezcla de reacción en cadena con retrotranscriptasa y sintetizar el ADNc.

Para clonar el gen del anticuerpo, se modificaron y utilizaron cebadores conocidos de la PCR (Wang, et al 2000, J. Immunol. Methods 233:167). Para la clonación de cadenas pesadas con ADNc sintetizado, se preparó una mezcla de PCR añadiendo 10 pmol de un oligonucleótido que era una secuencia de nucleótidos de 5'-GGA GTC GAC ATA GAC AGA TGG GGG TGT CGT TTT GGC-3' (SEQ ID NO: 34) (región constante del subtipo IgG1) o 5'-GGA GTC GAC CTT GAC CAG GCA TCC TAG AGT CA-3' (SEQ ID NO: 35) (región constante del subtipo IgG2a) como cebador de PCR correspondiente a una región constante de cada uno de un anticuerpo del subtipo IgG1, ECL-2B7, y un anticuerpo del subtipo IgG2a, ECL-4C1 y de un oligonucleótido que era una secuencia de nucleótidos de 5'MH1 5'-ctt ccg gaa ttc SAR GTN MAG CTG SAG SAG TC- 3'(SEQ ID NO: 36) y 5'MH2- 5'-ctt ccg gaa ttc SAR GTN MAG CTG SAG SAG TCW GG-3' (SEQ ID NO: 40) como cebador correspondiente a un extremo amínico de una región variable de cadena pesada del anticuerpo. Para la clonación de cadenas ligeras, se utilizó un oligonucleótido de 5'- ggt gtc gac GGA TAC AGT TGG TGC AGC ATC-3' (SEQ ID NO: 37) como cebador correspondiente a una región constante de la cadena kappa y 5'MK 5'-cgg aag ctt GAY ATT GTG MTS ACM CAR WCT MCA-3' (SEQ ID NO: 38) como cebador correspondiente a un extremo amínico de una región variable de cadena kappa, respectivamente. Para una clonación eficaz de los productos de la PCR, se proporcionó un sitio de enzima de restricción SalI al extremo del cebador en 3' en el caso de una cadena ligera, y un sitio de enzima de restricción HindIII en el caso de un cebador en 5'. En el caso de una cadena pesada, se proporcionó la enzima de restricción EcoRI al cebador en 5' y la SalI al cebador en 3'. Después de mezclar las soluciones de reacción de cadena pesada y de cadena ligera, respectivamente, la reacción se realizó 30 veces a 95 °C durante 1 minuto, a 40 °C durante 1 minuto y a 72 ° durante 1 minuto. Para clonar los genes ECL-2B7 y ECL-4C1 amplificados, el producto de la PCR se trató primero con EcoRI y SalI para la cadena pesada, y con HindIII y SalI para la cadena ligera, y después de reveló en un gel de agarosa al 1,0 % (p/v). Después, el ADN correspondiente a aproximadamente 400 pb y 390 pb se aisló con un kit de purificación de PCR FavorPrep GEL™ (Favorgen Co., Ltd., Taiwán). El pBluescript KS+ a utilizar como vector para clonar un gen de cadena pesada se trató con EcoRI y SalI, y el pBluescript KS+ se trató con HindIII y SalI como vector de clonación de un gen de cadena ligera, y después se aisló con un kit de purificación de PCR FavorPrep GEL™ (FIGS. 12C y 12D). Estos dos ADN se ligaron con ADN ligasa de T4 (New England Biolab, EE.UU.) y se transformaron enE. coliDH5a mediante el método de CaCh. Se seleccionaron clones que tenían un inserto de ADN de un tamaño de aproximadamente 400 pb en el caso de la cadena pesada, y clones deE. colique tenían un tamaño de aproximadamente 390 pb en el caso de la cadena ligera.

Para el análisis de secuenciación de ADN de genes de anticuerpos, los diversos clones se cultivaron durante la noche en 3 ml de un medio LB que contenía 100 pg/ml de ampicilina, y a continuación se aisló el ADN plasmídico utilizando un kit DNA-Spin plasmid mini prep (Intron, Corea), y la secuencia de nucleótidos de cada inserto de ADN se confirmó mediante secuenciación de nucleótidos (Bionics, Corea).

Como resultado de la amplificación génica de los anticuerpos monoclonales ECL-2B7 y ECL-4C1, los ADN amplificados pueden obtenerse en una posición correspondiente a aproximadamente 400 pb, que era una longitud que debía estimarse como fragmento de ADN correspondiente a la región constante de la cadena pesada, y en una posición correspondiente a aproximadamente 390 pb, que era una longitud que debía estimarse como fragmento de ADN correspondiente a la región constante de la cadena ligera (FIGS. 12A y 12B). Después de clonar los ADN, se obtuvieron los resultados del análisis de las secuencias de nucleótidos de los insertos de ADN (FIGS. 12C y 12D), las secuencias de nucleótidos de los ADN de cadena pesada y de cadena ligera se tradujeron a aminoácidos, y a continuación se indicaron las CDR 1, 2 y 3 en la secuencia disponiendo un sitio determinante del reconocimiento de antígenos de acuerdo con una estructura de anticuerpo mediante la numeración de Kabat. Como resultado del análisis de comparación de secuencias de los anticuerpos, las cadenas pesadas de los anticuerpos ECL-2B7 y ECL-4C1 pertenecían a un subgrupo IIIC, y las cadenas ligeras de los mismos pertenecían a un subgrupo V (FIGS. 13 y 14).

[Ejemplo 8]

Verificación de la extensibilidad a otros carcinomas a través de la comparación de la capacidad de formación de colonias

Para confirmar el grado de inhibición de la malignización de diversas células cancerosas con los nuevos anticuerpos, se realizó un experimento de comparación de la capacidad de las células para formar colonias.

Específicamente, para un ensayo de formación de colonias, células H1299 de cáncer de pulmón, células Huh7 de cáncer de hígado, células MCF7 y MDA-MB 231 de cáncer de mama y células MIA-Paca-2 de cáncer de páncreas, se recubrieron a 1x103 células/placa en una placa de 35 mm. Después de 24 horas, se trató un nuevo anticuerpo ECL-2B7 en una solución de cultivo celular a una concentración de 5 pg/ml, respectivamente. Después del tratamiento, las células se cultivaron en una incubadora celular humidificada con CO2 al 5 % a 37 °C durante 7 días. La placa de la que se eliminó la solución de cultivo se tiñó con un reactivo de violeta cristal al 0,5 % durante 10 minutos, se lavó varias veces con PBS y se confirmó al microscopio.

Como resultado, se confirmó que no sólo en las células de cáncer de pulmón, sino también en las células de cáncer de hígado y de mama, el grado de formación de colonias disminuyó cuando se trataron con los nuevos anticuerpos de la presente invención (FIG. 15).

A través de esto, puede observarse que, utilizando la unión específica del antígeno TM4SF4 de los nuevos anticuerpos, puede proponerse una tecnología de tratamiento contra el cáncer para diversos tipos de cáncer.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente al Miembro 4 de la Superfamilia Transmembrana 4 (TM4SF4), en donde

el anticuerpo se une a una región epitópica que incluye una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y en donde el anticuerpo es

(a) un anticuerpo que incluye una región variable de cadena pesada que tiene una CDR-H1 que incluye una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, una CDR-H2 que incluye una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y una CDR-H3 que incluye una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; y una región variable de cadena ligera que tiene una CDR-L1 que incluye una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, una CDR-L2 que incluye una secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO: 7 y una CDR-L3 que incluye una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; o

(b) un anticuerpo que incluye una región variable de cadena pesada que tiene una CDR-H1 que incluye una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, una CDR-H2 que incluye una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 y una CDR-H3 que incluye una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; y una región variable de cadena ligera que tiene una CDR-L1 que incluye una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, una CDR-L2 que incluye una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 y una CDR-L3 que incluye una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.

2. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo incluye una región variable de cadena pesada que incluye una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; y una región variable de cadena ligera que incluye una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.

3. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo incluye una región variable de cadena pesada que incluye una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; y una región variable de cadena ligera que incluye una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.

4. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el fragmento de unión a antígeno es Fab, F(ab'), F(ab')2 o Fv.

5. Una molécula de ácido nucleico que codifica el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

6. Un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 5.

7. Una célula hospedadora que comprende el vector de expresión de la reivindicación 6.

8. Un método para producir un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende el cultivo de la célula hospedadora de la reivindicación 7.

9. Un kit para detectar TM4SF4 en una muestra, que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

10. Una composición farmacéutica que comprende una dosis terapéuticamente eficaz del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

11. Una composición para su uso en un método de prevención o tratamiento del cáncer, que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

12. La composición para el uso de la reivindicación 11, en donde la prevención o el tratamiento del cáncer consiste en prevenir o tratar la resistencia química al cáncer, la recidiva del cáncer o metástasis del cáncer, durante o después del tratamiento del cáncer.

13. La composición para el uso de la reivindicación 11, en donde el cáncer es al menos uno seleccionado del grupo que consiste cáncer de pulmón, cáncer gástrico, cáncer de ovario, cáncer cervicouterino, cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer de esófago, cáncer de piel, cáncer de tiroides, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, neoplasia hemática, mieloma múltiple, leucemia mielógena aguda, linfoma maligno, cáncer de timo, osteosarcoma, tumor fibrótico y cáncer cerebral.

14. La composición para el uso de la reivindicación 11, en donde el cáncer es cáncer que comprende células madre cancerosas.