ES3034017T3 - Use of umbilical cord blood derived exosomes for tissue repair - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona un método para promover la cicatrización de heridas en un paciente que lo necesite, que comprende poner en contacto una herida del paciente con exosomas secretados por células mononucleares de sangre de cordón umbilical (UCBMNC) para promover así la cicatrización. La presente solicitud también proporciona un método para promover la cicatrización de heridas en un paciente que lo necesite, que comprende poner en contacto una herida del paciente con una composición que contiene uno o más miARN y un vehículo farmacéuticamente aceptable para promover así la cicatrización. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Uso de exosomas derivados de la sangre del cordón umbilical para la reparación de tejidos

Campo técnico

La presente solicitud de patente se refiere a un proceso para preparar una composición que comprende exosomas secretados por la UCBMNC, a composiciones preparadas por este proceso y al uso de dichas composiciones en el área médica con fines terapéuticos, concretamente, para tratar afecciones de la piel.

Antecedentes de la invención

Las heridas crónicas se definen como heridas que no cicatrizan en 3 meses (Nunan et al., 2014). Una herida es una alteración de la estructura y función normales de la piel. A diferencia de las heridas agudas, las heridas crónicas no siguen un proceso reparador ordenado y temporalmente oportuno que dé lugar a una restauración sostenida de la piel.

En los países desarrollados, se calcula que entre el 1 y el 2 % de la población sufrirá una herida crónica a lo largo de su vida (Gottrup, 2004). Además, hay aproximadamente 150 millones de pacientes diabéticos en todo el mundo, de los cuales alrededor del 15 % sufren ulceraciones en los pies que pueden evolucionar a heridas crónicas que no cicatrizan (Boulton et al., 2005).

Las heridas crónicas y que no cicatrizan son especialmente costosas debido a la necesidad de varios tratamientos en comparación con los tratamientos de heridas agudas. La carga que suponen las heridas crónicas es cada vez mayor debido al aumento de los costes sanitarios, el envejecimiento de la población y el fuerte incremento de la diabetes y la obesidad en todo el mundo (Sen, 2009).

Los tipos más comunes de heridas crónicas son: (i) úlceras arteriales, (ii) úlceras venosas, (iii) úlceras diabéticas y (iv) úlceras por presión.

Las úlceras arteriales se forman en pacientes con hipertensión, aterosclerosis y trombosis, en los que la reducción del riego sanguíneo conduce a un estado isquémico.

Las úlceras venosas representan más de la mitad de los casos de úlceras, se producen sobre todo en las extremidades inferiores (principalmente las piernas) y están asociadas a trombosis venosas profundas, varices e hipertensión venosa (Eberhardt & Raffetto, 2005). Se calcula que en Estados Unidos hay aproximadamente 0,5 millones de pacientes con úlceras venosas (Abbade & Lastoria, 2005).

Las úlceras diabéticas se producen en individuos con diabetes mellitus, que tienen una función inmunitaria deteriorada, isquemia (debida a una mala circulación sanguínea) y neuropatía (daño nervioso). La neuropatía diabética aumenta las probabilidades de amputación de las extremidades inferiores si no se trata. En 2004, se realizaron unas 71 000 amputaciones no traumáticas de miembros inferiores en personas con diabetes (Sen, 2009) y las tasas de amputaciones aumentan con la edad.

Las úlceras por presión se producen debido a la presión y fricción constantes del peso corporal sobre una zona localizada, lo que puede provocar la rotura de la piel y la ulceración. Entre los pacientes vulnerables se encuentran ancianos, víctimas de derrames cerebrales, pacientes con diabetes o demencia, pacientes con lesión medular, pacientes en silla de ruedas o que sufren problemas de movilidad o sensibilidad. Cada año se tratan en Estados Unidos 2,5 millones de úlceras por presión solo en centros de cuidados intensivos (Reddy et al., 2006).

El proceso de cicatrización de heridas

La cicatrización de heridas es un proceso dinámico que consta de cuatro fases continuas y superpuestas: hemostasia, inflamación, proliferación y remodelación tisular. (Guo et al., 2010). Para que la cicatrización de la herida sea óptima, los acontecimientos de cada fase deben producirse de forma precisa y regulada. Las interrupciones, aberraciones o prolongaciones del proceso pueden provocar un retraso en la cicatrización de las heridas o heridas crónicas que no cicatrizan. (Guo et al., 2010).

La fase de hemostasia de la cicatrización de heridas comienza inmediatamente después de la lesión y se caracteriza por la constricción vascular, la agregación plaquetaria, la degranulación y la formación de coágulos de fibrina. (Guo et al, 2010). Concretamente, el contacto con la matriz extracelular expuesta en el lugar de la lesión hace que las plaquetas liberen factores de coagulación, lo que conduce a la formación de un coágulo sanguíneo. Además, el contacto también hará que las plaquetas liberen citocinas proinflamatorias y factores de crecimiento como el factor de crecimiento transformante (TGF)-p, el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), el factor de crecimiento epidérmico (EGF) y el factor de crecimiento similar a la insulina (IGF). Estas moléculas activan y atraen a neutrófilos y macrófagos, iniciando así la fase inflamatoria de la cicatrización de heridas. Estas moléculas también atraen a las células endoteliales y a los fibroblastos, lo que afectará a las fases posteriores de proliferación y remodelación del tejido. (Guo et al., 2010; Velnaret al., 2009).

La fase inflamatoria de la cicatrización de heridas se caracteriza por la infiltración de neutrófilos, la infiltración de monocitos y su diferenciación en macrófagos, y la infiltración de linfocitos. La función principal de los neutrófilos es eliminar, mediante la fagocitosis, los microbios invasores y los restos celulares en la zona de la herida, produciendo sustancias como proteasas y especies reactivas del oxígeno (ROS). Los macrófagos desempeñan varias funciones en el proceso de cicatrización de heridas, como la liberación de citocinas para reclutar y activar leucocitos, y la eliminación de células apoptóticas (incluidos los neutrófilos). Los macrófagos también liberan factores de crecimiento como el TGF-p y el FGF, que activan los queratinocitos, los fibroblastos y las células endoteliales, iniciando así la fase proliferativa de la cicatrización de heridas. Los linfocitos también migran a las heridas durante la fase inflamatoria tardía. Sin embargo, su papel en la cicatrización de heridas no se conoce por completo. (Guo et al., 2010; Velnar et al., 2009).

La fase proliferativa se caracteriza por la repitelización, la angiogénesis, la síntesis de colágeno y la formación de matriz extracelular. En la dermis reparadora, los fibroblastos y las células endoteliales son los tipos celulares presentes más prominentes y su función es favorecer el crecimiento capilar, la formación de colágeno y la formación de tejido de granulación en el lugar de la lesión. (Guo et al, 2010; Velnar et al., 2009).

La fase de remodelación es la fase final de la cicatrización de la herida, y puede durar hasta uno o dos años, a veces incluso durante un periodo de tiempo más prolongado. La fase de remodelación es un delicado equilibrio entre degradación y síntesis, y se caracteriza por la remodelación del colágeno y la maduración y regresión vasculares. En concreto, la matriz extracelular se remodela en una arquitectura que se aproxima a la del tejido normal, y la herida experimenta una contracción mediada por miofibroblastos. (Guo et al., 2010; Velnar et al., 2009).

Diabetes Mellitus

La diabetes mellitus representa un espectro de trastornos metabólicos caracterizados por una hiperglucemia crónica. La diabetes mellitus tipo I, también conocida como diabetes juvenil, es el resultado de la destrucción autoinmune de las células p pancreáticas secretoras de insulina. La diabetes mellitus tipo II, también conocida como diabetes del adulto, se caracteriza por una secreción excesiva de insulina, resistencia tisular a la insulina y la consiguiente disfunción de las células p. (Goutos et al., 2015).

Efecto de la diabetes mellitus en el proceso de cicatrización de heridas

Las personas diabéticas presentan alteraciones en la cicatrización de las heridas agudas y son propensas a desarrollar heridas crónicas, como las úlceras del pie diabético. (Guo et al., 2010).

La diabetes mellitus ejerce un efecto perjudicial sobre varios aspectos del proceso de cicatrización de heridas. Por ejemplo, la diabetes altera el equilibrio entre los distintos fenotipos de macrófagos, lo que provoca un aumento del número de células inflamatorias y dificulta la transición a la fase proliferativa. La diabetes también se asocia con niveles reducidos de factores de crecimiento en el lugar de la herida, deposición anormal de matriz extracelular e inhibición de la vascularización. (Goutos et al., 2015; Guo et al., 2010).

Exosomas

Los exosomas son vesículas similares a liposomas (30-200 nm) secretadas por la mayoría de los tipos de células, que se forman en el interior de la célula secretora en compartimentos denominados cuerpos multivesiculares (MVB) y posteriormente se liberan por fusión del compartimento endosomal con la membrana plasmática, lo que da lugar a la liberación del contenido al medio extracelular (Raposo y Stoorvogel, 2013). Contienen conjuntos específicos de proteínas, lípidos y RNA, dependiendo del tipo de célula secretora y de los estímulos, y no una muestra aleatoria del contenido citoplasmático (Raposo y Stoorvogel, 2013; Mathivanan S. y Simpson R.J., 2009). Transportan material genético, en forma de RNAm y microRNA, una característica que los convirtió en prometedores sistemas de administración de genes de origen biológico (O'Loughlin et al., 2012).

Los tipos celulares empleados en la regeneración experimental de tejidos lesionados, como las células madre mesenquimales (MSC) o las células madre hematopoyéticas (HSC), son fuentes ricas de exosomas, que se han propuesto para sustituir con éxito a las terapias basadas en células en diferentes modelos de lesión (Bian et al., 2014; Shabbir et al., 2015; Zhang B. et al., 2015; Zhang J. etal.; Lai RC, 2010; Zhou Y, 2013; Sahoo S, 2011).

Las MSC son células madre adultas multipotentes, no hematopoyéticas, que pueden aislarse del tejido del cordón umbilical (Erices et al., 2000; Gang et al., 2004), del tejido placentario o adiposo y de la médula ósea. Estas células pueden diferenciarse en varios tipos celulares, como osteoblastos, condrocitos, adipocitos y células endoteliales (Pittenger et al., 1999; Crapnell et al., 2013).

Recientemente se ha demostrado que, además de su potencial regenerativo directo a través de la diferenciación, estas células pueden inducir la reparación mediante estimulación paracrina, como la secreción de exosomas (Lai et al., 2011; Lai et al., 2010). Se ha demostrado que los exosomas secretados por las CMM inducen la reparación en diferentes modelos de enfermedad en ratones, como el infarto de miocardio (Lai et al., 2010) y también la cicatrización de heridas (Zhang et al., Stem Cells 2014; Shabir et al., Stem Cells Dev 2015; Zhang et al. J Transí Med 2015).

A pesar de los numerosos trabajos que demuestran que los exosomas derivados de (MSC) pueden inducir la regeneración de tejidos, como la cicatrización de heridas, no ocurre lo mismo con los exosomas derivados de células mononucleares de la sangre de cordón umbilical (UCBMNC). Además, no se ha evaluado la bioactividad de los exosomas secretados por células mononucleares humanas de la sangre de cordón umbilical, ni tampoco su potencial terapéutico para el tratamiento de heridas crónicas.

El documento US2012093885A1 describe composiciones que comprenden UCBMNC y exosomas secretados por UCBMNC y un proceso para preparar dichas composiciones. Estas composiciones son aplicables en la reparación de tejidos en el ámbito de las terapias regenerativas, en particular en la terapia angiogénica asociada a las enfermedades cardiovasculares. Este documento divulga además que las células recogidas de UBMNC y los exosomas respectivos, se cultivan en un medio de cultivo de acondicionamiento adecuado que comprende a saber 0,25 % de albúmina de suero humano y factor de crecimiento endotelial. Está generalmente aceptado que las características y la funcionalidad de los exosomas se ven muy afectadas por el tipo de células que los secretan, pero también por las condiciones de procesamiento de dichas células. En este sentido, es importante señalar que el proceso aquí descrito utiliza (0,1 a 5 %) de albúmina de suero humano en el medio de cultivo en condiciones convencionales de O2 y CO2.

Además, los exosomas del documento US2012093885A1 generalmente presentan al menos dos moléculas purificadas seleccionadas del grupo que consiste en miRNA 130a, miRNA 125b, miRNA 92a, miRNA 126, haptoglobina y hemopexina, forma de copa con 30-100 nm de diámetro y densidad de 1,1-1,2 g/cm3 en contraste con las características de los exosomas de la invención. Además, dichos exosomas son secretados por células UBMNC CD34+ y son utilizados en terapia angiogénica asociada a enfermedad cardiovascular como reemplazo de células CD34+.

Además, los exosomas descritos en el documento US2012093885A1 no son adecuados para ser utilizados en terapias de regeneración cutánea con el objetivo de aumentar la tasa de supervivencia de las células endoteliales y los queratinocitos, aumentar la proliferación de las células endoteliales, los fibroblastos y los queratinocitos, y estimular la cicatrización de las heridas cutáneas.

Por lo tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar una composición farmacéutica que se pueda utilizar en terapias de regeneración de la piel, que sea fácil de obtener, no costosa, que utilice preferiblemente productos seguros y no humanos y derivados de animales, que confiera un mayor grado de eficacia en los procesos de cicatrización y reparación de heridas, incluso en el caso de tipos específicos y difíciles de heridas como las heridas crónicas y las que no cicatrizan.

El proceso y las composiciones de exosomas de la presente invención resuelven los problemas de la técnica anterior proporcionando composición de exosomas que comprende exosomas secretados por UCBMNC, acondicionando dichas UCBMNC mediante exposición a condiciones hipóxicas de 0,5 % O2, 5 % CO2, en un medio de cultivo desprovisto de suero bovino fetal (0 % FBS).

Resumen de la invención

La presente invención proporciona un proceso de fabricación de una composición de exosomas con exosomas secretados por células mononucleares de la sangre de cordón umbilical (UCBMNC) que comprende las siguientes fases:

a) Proporcionar células mononucleares aisladas de sangre de cordón umbilical (UCBMNC),

b) Acondicionamiento de las UCBMNC de la fase a) mediante exposición a condiciones hipóxicas de 0,5 % O2, 5 % CO2, durante 18h, en un medio de cultivo desprovisto de suero bovino fetal (0 % FBS),

c) separar y aislar los exosomas secretados por las UCBMNC de la fase b) anterior, y

d) suspender los exosomas aislados de la fase c) en un portador adecuado, según la reivindicación 1.

El exosoma preparado por el proceso descrito anteriormente, comprende que al menos uno de los exosomas contiene uno o más miRNA seleccionados de un grupo que consiste en:

- hsa-miR-150-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-let-7g-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-let-7f-5p, hsa-miR-19b-3p, hsa-let-7a-5p, hsa-miR-26a-1-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-451a, hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-342-3p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-15a-5p, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-30d-5p, hsa-miR-146b-5p, hsa-miR-106b-5p, hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-29b-3p, and hsa-miR-101-3p, y

- los exosomas presentan una morfología esférica,

- los exosomas tienen un tamaño medio de partícula de 100 nm a 200 nm,

- los exosomas tienen un potencial zeta negativo de -10 mV a -50 mV,

- al menos uno de los exosomas expresa los marcadores CD9, CD34, CD81 y/o Hsc70, y

- los exosomas aumentan la tasa de supervivencia de las células endoteliales y los queratinocitos y estimulan la cicatrización de heridas, según la reivindicación 2.

Se divulga, pero no forma parte de la invención, un procedimiento para fabricar una composición que comprende miRNA hsa-miR-150-5p y un portador farmacéuticamente aceptable que comprende la fase a) mezclar el miRNA hsa-miR-150-5p con un agente de transfección, y b) suspender la mezcla en un portador farmacéuticamente aceptable.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden las composiciones de exosomas según la presente invención se utilizan ventajosamente en aplicaciones médicas cutáneas tales como en terapias de heridas cutáneas, concretamente en terapia de heridas abiertas cutáneas tales como una incisión, una laceración, un desgarro, una abrasión, una avulsión o una herida quirúrgica, en terapia de heridas por quemadura, tales como una quemadura térmica, una quemadura química o una quemadura por radiación.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Caracterización de las células mononucleares de sangre de cordón umbilical y el impacto de la crioconservación, analizados en el analizador hematológico.

(A) Composición detallada de las diferentes subpoblaciones de glóbulos blancos presentes en la sangre del cordón umbilical (linfocitos, monocitos, neutrófilos, eosinófilos y basófilos).

(B) Impacto del procesamiento en la composición de las células mononucleares de la sangre de cordón umbilical (linfocitos y monocitos totales) en relación con los glóbulos blancos totales.

Figura 2. Caracterización de exosomas secretados por células mononucleares de la sangre de cordón umbilical. (A) Distribución del tamaño de los exosomas mediante DLS.

(B) Potencial zeta de los exosomas evaluado mediante DLS.

(C.1) Tamaño y morfología de los exosomas secretados por UCBMNC evaluados mediante TEM. (C.2) Tamaño y morfología de los exosomas secretados por UCBMNC evaluados mediante TEM.

(D) Expresión de marcadores de superficie en exosomas secretados por UCBMNC preacondicionadas en hipoxia y en condiciones control (normoxia) analizadas por citometría de flujo. Los resultados son la media /-SEM, n=3.

(E) Contenido total de proteínas, cuantificado con el ensayo de proteínas DC de Biorad, de exosomas secretados por UCBMNC preacondicionadas en hipoxia (Exo-Hyp) y normoxia (Exo_Nor). Los resultados son la media /- SEM, n=3. Los análisis estadísticos se realizaron mediante una prueba t. *p<0,05.

Figura 3. Citotoxicidad y captación de exosomas en células endoteliales, fibroblastos y queratinocitos.

(A) Citotoxicidad de los exosomas (de 3 donantes diferentes) en HUVEC evaluada mediante tinción con yoduro de propidio/Hoechst. Las células fueron expuestas a los exosomas durante 24 horas y se evaluó su viabilidad a las 72 horas. Los resultados son la media /- SEM, n=3 por donante. En cada imagen se cuantificaron aproximadamente 2000 células.

(B) Captación de exosomas por células endoteliales, fibroblastos y queratinocitos, evaluada mediante citometría de flujo. Los resultados son la media /- SEM, n=4-6.

(C) Microscopía confocal de células cutáneas expuestas a exosomas marcados con Syto® RNASelect™ (1-20 |jg/ml) en medio empobrecido en exosomas e incubados durante 16 h.

(D) Cuantificación de exosomas marcados con Syto® RNASelect™ en HUVEC, células HaCaT y fibroblastos. Los resultados son la media /- SEM, n=4.

Figura 4. Bioactividad UCBMNC-Exo en células cutáneas.

(A) Los exosomas secretados por células UCBMNC empobrecidas en células CD34 y sometidas a preacondicionamiento isquémico (Exo_Hyp) aumentan la supervivencia de células endoteliales y queratinocitos pero no de fibroblastos. Los resultados se obtuvieron para exosomas recogidos de 3 donantes diferentes. Los resultados son la media /- SEM, n=3 por donante. Se utilizaron como controles el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, 50 ng/mL) o el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF-BB, 50 ng/mL).

(B) Proliferación de células endoteliales, fibroblastos y queratinocitos tras el tratamiento con Exo_Hyp o Exo_Nor. Los resultados se obtuvieron para exosomas recogidos de 3 donantes diferentes. Los resultados son la media /- SEM, n=3 por donante.

*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001.

Figura 5. Bioactividad UCBMNC-Exo en células cutáneas.

(A) Ensayo de rascado en queratinocitos y fibroblastos tras el tratamiento con Exo_Hyp o Exo_Nor.

(B) Ensayo de formación de tubos endoteliales en Matrigel. Las HUVEC se trataron con Exo_Hyp o Exo_Nor.

En (A) y (B), los resultados se obtuvieron para exosomas recogidos de 3 donantes diferentes. Los resultados son la media /- SEM, n=3 por donante.

*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001.

Figura 6. Caracterización del perfil de miRNA de UCBMNC-Exo.

(A) miRNA identificados en Exo_Hyp y Exo_Nor en dos donantes diferentes. (A) Se identificaron 69 miRNA diferentes en exosomas secretados por hUCBMNC empobrecidas en células CD34 de dos donantes diferentes (A y B) sometidas a hipoxia (HYP) y condiciones control (NOR) mediante RNASeq, contando más de 20 lecturas en todos los exosomas analizados.

(A2) Representación arborescente de 44 miRs con más de 50 lecturas para exosomas obtenidos tras acondicionar hUCBMNC de ambos donantes en hipoxia (HYP) y normoxia (NOR).

(B) Expresión media de miRNA en 10 donantes. (B1) Expresión relativa de los 15 miRNA más expresados, detectados por RNASeq, de exosomas de hUCBMNC condicionadas por hipoxia. RNU6 se utilizó como control. Los resultados se obtuvieron para exosomas recogidos de 10 donantes diferentes. Los resultados son la media /- SEM, n=3-4 por donante.

(B2) Expresión relativa de los 12 miRNA más expresados en exosomas de hUCBMNC condicionadas por hipoxia (HYP) frente a normoxia (NOR). RNU6 se utilizó como control. Los resultados se obtuvieron para exosomas recogidos de 10 donantes diferentes. Los resultados son la media /- SEM, n=3-4 por donante. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Newman-Keuls, *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001.

Figura 7. UCBMNC-Exo estimulan la cicatrización de heridas en modelos de ratón normales y diabéticos de tipo I y II.

(A1) UCBMNC-Exo del donante 1; (A2) UCBMNC-Exo del donante 2; (A3) UCBMNC-Exo del donante 1 administrado a animales no diabéticos; (A4) UCBMNC-Exo del donante 1 administrado a animales diabéticos genéticos (db/db);

(B) Tinción de H&E de las heridas de control y tratadas (diabetes de tipo 1) en el día 10;

(C) Comparación de las tasas de cierre de heridas entre heridas tratadas con solución salina de control (herida control), cuando se aplican UCBMNC-Exo en una herida distante una sola vez el día 1 (CT Exo Ap única), o dos veces al día (CT Exo 1 Ap bidiaria y CT Exo 2 Ap bidiaria). UCBMNC-Exo aplicado dos veces al día en heridas por escisión distantes estimula la cicatrización en la herida control.

Figura 8. MiR-150-5p mejora la supervivencia de los fibroblastos a la isquemia y la migración de queratinocitosin vitro,así como la cicatrización de heridasin vivo.

(A) Efectoin vitrode miR-150-5p en (A1) Supervivencia en condiciones isquémicas y (A2) Proliferación de células endoteliales, fibroblastos y queratinocitos, (A3) Ensayo de rascado de fibroblastos y queratinocitos y (A4) Formación de tubos de células endoteliales en Matrigel. El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, 50 ng/mL) y el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF-BB, 50 ng/mL) se utilizaron como controles para todos los ensayos. Los resultados son la media /- SEM, n=3-6. Los análisis estadísticos se realizaron mediante la prueba de Mann-Whitney, *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001.

(B1) Efectoin vivode miR-150 en la cicatrización de heridas por escisión infligidas en C57Bl/6. Los resultados son la media /- SEM, n=5-6. Los análisis estadísticos se realizaron mediante la prueba t, p<0,05 para el tratamiento Aleatorio (*); para «Sin tratamiento» = PBS (#). (B2) Imágenes representativas en los días 0; 7 y 10 de las heridas tratadas con miR-150-5p, Aleatorio y PBS (Sin tratamiento).

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a un proceso para preparar una composición que comprende exosomas secretados por UCBMNC, a composiciones preparadas por este proceso y al uso de dichas composiciones en el área médica con fines terapéuticos, concretamente, para tratar afecciones de la piel.

El proceso para preparar una composición de exosomas que comprende exosomas secretados por UCBMNC, según la presente invención, comprende una fase en donde dichas UCBMNC se tratan en condiciones específicas de hipoxia de 0,5 % O2, 5 % CO2, durante 18 h en un medio de cultivo desprovisto de suero bovino fetal (0 % FBS), y siendo los exosomas secretados separados de las UCBMNC y suspendidos en un portador adecuado.

Las UCBMNC comprenden linfocitos, monocitos, neutrófilos, eosinófilos y/o basófilos.

En una realización, la exposición a condiciones isquémicas y/o hipóxicas estimula el aumento de la secreción de exosomas de UCBMNC.

En otra realización, la exposición a condiciones isquémicas y/o hipóxicas aumentó la bioactividad de los exosomas secretados.

En una realización, la bioactividad es bioactividad pro-supervivencia.

En otra realización, la bioactividad es bioactividad pro-proliferación. En otra realización, la bioactividad es bioactividad pro-migración.

En una realización, al menos uno de los exosomas presenta una morfología esférica.

En una realización, los exosomas tienen un tamaño medio de partícula de 100 nm a 200 nm. En una realización, los exosomas tienen un tamaño medio de partícula de 120 nm a 170 nm. En una realización, los exosomas tienen un tamaño medio de partícula de 130 nm a 150 nm. En una realización, los exosomas tienen un tamaño medio de partícula de 140 nm.

En una realización, los exosomas tienen un potencial zeta negativo de -10 mV a -50 mV. En una realización, los exosomas tienen un potencial zeta negativo de -20 mV a -40 mV. En una realización, los exosomas tienen un potencial zeta negativo de -30 mV.

En una realización, al menos uno de los exosomas expresa los marcadores CD9, CD34, CD81 y/o Hsc70.

En una realización, al menos uno de los exosomas contiene uno o más miRNA seleccionados del grupo que consiste en: hsa-miR-150-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-let-7g-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-let-7f-5p, hsa-miR-19b-3p, hsa-let-7a-5p, hsa-miR-26a-1-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-451a, hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-342-3p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-15a-5p, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-30d-5p, hsa-miR-146b-5p, hsa-miR-106b-5p, hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-29b-3p, y hsa-miR-101-3p.

En una realización, al menos uno de los exosomas contiene uno o más miRNA seleccionados de un grupo que consiste en: hsa-miR-150-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-let-7g-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-let-7f-5p, hsa-miR-19b-3p, hsa-let-7a-5p, hsa-miR-26a-1-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-451a, hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-342-3p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-15a-5p, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-30d-5p, y hsa-miR-146b-5p.

En una realización, al menos uno de los exosomas contiene uno o más miRNA seleccionados de un grupo que consiste en: hsa-miR-150-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-let-7g-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-let-7f-5p, hsa-miR-19b-3p, hsa-let-7a-5p, hsa-miR-26a-1-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-451a, hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-342-3p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-15a-5p, hsa-miR-142-5p, y hsa-miR-146a-5p.

En una realización, al menos uno de los exosomas contiene uno o más miRNA seleccionados de un grupo que consiste en: hsa-miR-150-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-let-7g-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-let-7f-5p, hsa-miR-19b-3p, hsa-let-7a-5p, hsa-miR-26a-1-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-451a, hsa-miR-23a-3p, y hsa-miR-342-3p.

En una realización, al menos uno de los exosomas contiene uno o más miRNA seleccionados de un grupo que consiste en: hsa-miR-150-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-let-7g-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-let-7f-5p, hsa-miR-19b-3p, hsa-let-7a-5p, y hsa-miR-26a-1-5p.

En una realización, al menos uno de los exosomas contiene uno o más miRNA seleccionados de un grupo que consiste en: hsa-miR-150-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-let-7g-5p, y hsa-miR-21-5p.

En una realización, al menos uno de los exosomas contiene uno o más miRNA seleccionados de un grupo que consiste en: hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-451a, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-15a-5p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-30d-5p, hsa-miR-146b-5p, hsa-miR-106b-5p, hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-29b-3p, y hsa-miR-101-3p.

En una realización, al menos uno de los exosomas contiene el miRNA hsa-miR-150-5p. En una realización, al menos el 10 % de los exosomas contienen el miRNA hsa-miR-150-5p. En una realización, al menos el 25 % de los exosomas contienen el miRNA hsa-miR-150-5p. En una realización, al menos el 50 % de los exosomas contienen el miRNA hsa-miR-150-5p. En una realización, al menos el 75 % de los exosomas contienen el miRNA hsa-miR-150-5p. En una realización, al menos el 90 % de los exosomas contienen el miRNA hsa-miR-150-5p.

En una realización, el miRNA hsa-miR-150-5p tiene una concentración mayor en los exosomas que la concentración de cualquier otro miRNA en los exosomas.

En una realización, los exosomas están enriquecidos con uno o más miRNA seleccionados de un grupo que consiste en: hsa-miR-150-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-let-7g-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-let-7f-5p, hsa-miR-19b-3p, hsa-let-7a-5p, hsa-miR-26a-1-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-451a, hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-342-3p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-15a-5p, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-30d-5p, hsa-miR-146b-5p, hsa-miR-106b-5p, hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-29b-3p, y hsa-miR-101-3p, aumentando así la concentración del miRNA en los exosomas.

En una realización, los exosomas están enriquecidos con uno o más miRNA seleccionados de un grupo que consiste en: hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-451a, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-15a-5p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-30d-5p, hsa-miR-146b-5p, hsa-miR-106b-5p, hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-29b-3p, y hsa-miR-101-3p, aumentando así la concentración del miRNA en los exosomas.

En una realización, los exosomas están enriquecidos con miRNA hsa-miR-150-5p, aumentando así la concentración del miRNA en los exosomas.

Los exosomas pueden enriquecerse en miRNA utilizando métodos convencionales conocidos en la técnica que incluyen, entre otros, la centrifugación diferencial, la centrifugación en gradiente de densidad/sobre cólchon , la cromatografía de exclusión por tamaño, la precipitación, la captura por inmunoafinidad en perlas y técnicas de carga de RNA como las técnicas basadas en la electroporación, la infección vírica de las células secretoras y la incorporación dirigida de secuencias específicas de RNA mediante dominios de reconocimiento de secuencias fusionados a proteínas vesiculares.

En una realización, la composición es un líquido. En una realización, la composición es una crema. En una realización, la composición es un gel.

En una realización, la composición se administra en una sola aplicación. En otra realización, la composición se administra periódicamente. En otra realización, la composición se administra con menos frecuencia que una vez al día. En otra realización, la composición se administra una vez al día. En otra realización, la composición se administra con más frecuencia que una vez al día. En otra realización, la composición se administra dos veces al día. En otra realización, la composición se administra tres veces al día.

En una realización, la composición se aplica tópicamente. En una realización, la composición se aplica mediante inyección subcutánea. En una realización, la composición se aplica mediante inyección dérmica. En una realización, la composición se aplica mediante inyección intraperitoneal. En una realización, la composición se aplica mediante inyección intravenosa.

En una realización, la concentración de exosomas en la composición es 0,01 pg/mL-10 pg/mL. En una realización, la concentración de exosomas es 1 pg/mL-3 pg/mL. En una realización, la concentración de exosomas es 0,5 pg/mL-1.5 pg/mL. En una realización, la concentración de exosomas es de aproximadamente 1 pg/mL. En una realización, la concentración de exosomas es 0,01 pg/mL. En una realización, la concentración de exosomas es 0,25 pg/mL. En una realización, la concentración de exosomas es 0,5 pg/mL. En una realización, la concentración de exosomas es 0,75 pg/mL. En una realización, la concentración de exosomas es 1,0 pg/mL. En una realización, la concentración de exosomas es 1,25 pg/mL. En una realización, la concentración de exosomas es 1,5 pg/mL. En una realización, la concentración de exosomas es 1,75 pg/mL. En una realización, la concentración de exosomas es 2,0 pg/mL. En una realización, la concentración de exosomas es 2,25 pg/mL. En una realización, la concentración de exosomas es 2,5 pg/mL. En una realización, la concentración de exosomas es 2,75 pg/mL. En una realización, la concentración de exosomas es 3,0 pg/mL. En una realización, la concentración de exosomas es 5,0 pg/mL. En una realización, la concentración de exosomas es 10 pg/mL.

En una realización, la composición comprende además uno o más miRNA seleccionados de un grupo que consiste en: hsa-miR-150-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-let-7g-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-let-7f-5p, hsa-miR-19b-3p, hsa-let-7a-5p, hsa-miR-26a-1-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-451a, hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-342-3p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-15a-5p, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-30d-5p, hsa-miR-146b-5p, hsa-miR-106b-5p, hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-29b-3p, y hsa-miR-101-3p, en donde el miRNA no está contenido en los exosomas.

En una realización, la composición comprende además uno o más miRNA seleccionados de un grupo que consiste en: hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-451a, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-15a-5p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-30d-5p, hsa-miR-146b-5p, hsa-miR-106b-5p, hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-29b-3p, y hsa-miR-101-3p, en donde el miRNA no está contenido en los exosomas.

En una realización, la composición comprende además miRNA hsa-miR-150-5p en donde el miRNA hsa-miR-150-5p no está contenido en los exosomas.

En una realización, la cicatrización de heridas se promueve acelerando el ritmo de cicatrización de la herida. En una realización, la cicatrización de heridas se promueve induciendo la vascularización.

En una realización, la cicatrización de heridas se promueve aumentando la supervivencia de las células. En una realización, la cicatrización de heridas se promueve aumentando la supervivencia de los queratinocitos. En otra realización, la cicatrización de heridas se promueve estimulando la supervivencia de las células endoteliales.

En una realización, la cicatrización de heridas se promueve aumentando la proliferación de células. En una realización, la cicatrización de heridas se promueve aumentando la proliferación de fibroblastos.

En una realización, la cicatrización de heridas se promueve aumentando la migración de células hacia la herida. En una realización, la cicatrización de heridas se promueve aumentando la migración de fibroblastos hacia la herida. En otra realización, la cicatrización de heridas se promueve aumentando la migración de queratinocitos hacia la herida.

En una realización, la cicatrización de heridas se promueve aumentando la formación de tubos en y/o cerca del lugar de la herida. En una realización, la cicatrización de heridas se promueve induciendo la formación de tubos mediante células endoteliales.

En una realización, los exosomas son eficaces para aumentar el número total de tubos vasculares formados. En otra realización, los exosomas son eficaces para incrementar la complejidad de la red vascular formada. En una realización, la complejidad de la red vascular formada se evalúa por el número aumentado de puntos de ramificación.

En una realización, los queratinocitos han sido expuestos a condiciones isquémicas. En una realización, los queratinocitos han sido expuestos a condiciones hipóxicas. En una realización, los fibroblastos han sido expuestos a condiciones isquémicas. En una realización, los fibroblastos han sido expuestos a condiciones hipóxicas. En una realización, las células endoteliales han sido expuestas a condiciones isquémicas. En una realización, las células endoteliales han sido expuestas a condiciones hipóxicas.

En una realización, los exosomas expuestos a condiciones isquémicas son más eficaces para inducir la proliferación de fibroblastos que los exosomas no expuestos a condiciones isquémicas.

En una realización, los exosomas expuestos a condiciones isquémicas son más eficaces para inducir la proliferación de fibroblastos a una concentración de 1 pg/mL que los exosomas no expuestos a condiciones isquémicas a una concentración de 1 pg/mL. En una realización, los exosomas expuestos a condiciones isquémicas son más eficaces para inducir la proliferación de fibroblastos a una concentración de 2 pg/mL que los exosomas no expuestos a condiciones isquémicas a una concentración de 2 pg/mL.

En otra realización, los exosomas expuestos a condiciones hipóxicas son más eficaces para inducir la proliferación de fibroblastos. En una realización, los exosomas expuestos a condiciones hipóxicas son más eficaces para inducir la proliferación de fibroblastos a una concentración de 1 pg/mL. En una realización, los exosomas expuestos a condiciones hipóxicas son más eficaces para inducir la proliferación de fibroblastos a una concentración de 2 pg/mL.

En una realización, la cicatrización de heridas es promovida por el miRNA hsa-miR-150-5p.

En otra realización, el miRNA hsa-miR-150-5p aumenta la migración de los queratinocitos hacia la herida, promoviendo así la cicatrización de la misma.

En otra realización, el miRNA hsa-miR-150-5p aumenta la supervivencia de los fibroblastos, promoviendo así la cicatrización de heridas.

En una realización, la cicatrización de la herida se promueve en un sitio local al sitio de contacto de los exosomas. En otra realización, se promueve la cicatrización de la herida en un lugar distante del lugar de contacto de los exosomas.

En otra realización, la herida es una herida crónica.

En una realización, la herida es una úlcera por presión. En otra realización, la herida es una úlcera venosa. En otra realización, la herida es una úlcera posquirúrgica. En otra realización, la herida es una úlcera traumática. En otra realización, la herida es una herida en una extremidad inferior. En otra realización, la herida es una úlcera arterial.

En una realización, la herida es una úlcera bucal.

En una realización, la herida es una herida ocular o una úlcera corneal.

En una realización, el paciente padece diabetes. En una realización, el paciente no padece diabetes.

En otra realización, el paciente padece diabetes tipo I. En otra realización, el paciente padece diabetes tipo II.

En una realización, la herida es una úlcera diabética. En una realización, la úlcera diabética es una úlcera de pie diabético.

En una realización, la herida es una herida abierta. En una realización, la herida abierta es una incisión. En una realización, la herida abierta es una laceración. En una realización, la herida abierta es un desgarro. En una realización, la herida abierta es una abrasión. En una realización, la herida abierta es una avulsión. En una realización, la herida abierta es una punción.

En una realización, la herida es una herida por escisión. En otra realización, la herida es una herida infecciosa. En otra realización, la herida es una herida isquémica. En otra realización, la herida es una herida por envenenamiento por radiación. En otra realización, la herida es una herida quirúrgica.

En una realización, la herida es una quemadura. En una realización, la quemadura es una quemadura térmica. En una realización, la quemadura es una quemadura química. En una realización, la quemadura es una quemadura por radiación.

En una realización, la herida se refiere a una afección o enfermedad de la piel que comprende una herida, como acné, psoriasis, rosácea, dermatitis, eczema, impétigo, intertrigo o foliculitis.

En una realización, la tasa acelerada de cicatrización de la herida es significativa en el día 2. En otra realización, la aceleración de la cicatrización de la herida es significativa al tercer día. En otra realización, la aceleración de la cicatrización de la herida es significativa al décimo día.

En una realización, la cicatrización de la herida se evalúa mediante el cierre de la herida. En una realización, el cierre de la herida mejora al menos un 10 %. En otra realización, el cierre de la herida mejora al menos un 20 %. En otra realización, el cierre de la herida mejora al menos un 30 %. En otra realización, el cierre de la herida mejora al menos un 50 %. En otra realización, el cierre de la herida mejora al menos un 80 %. En otra realización, el cierre de la herida mejora en más del 100 %.

En una realización, el tiempo necesario para el cierre completo de la herida se reduce al menos en un 10 %. En otra realización, el tiempo necesario para el cierre completo de la herida se reduce al menos en un 20 %. En otra realización, el tiempo necesario para el cierre completo de la herida se reduce al menos en un 30 %. En otra realización, el tiempo necesario para el cierre completo de la herida se reduce al menos en un 50 %. En otra realización, el tiempo necesario para el cierre completo de la herida se reduce al menos en un 80 %. En otra realización, el tiempo necesario para el cierre completo de la herida se reduce en más del 100 %.

La invención en cuestión proporciona un proceso de elaboración de una composición que comprende exosomas secretados por células mononucleares de la sangre de cordón umbilical (UCBMNC) como se reivindica en la reivindicación 1 que comprende la fase a) separar los exosomas de las UCBMNC y b) suspender los exosomas en un portador farmacéuticamente aceptable.

En una realización, el portador farmacéuticamente aceptable es una solución salina tamponada con fosfato (PBS). En una realización, el portador farmacéuticamente aceptable es una suspensión líquida. En una realización, el portador farmacéuticamente aceptable es un polímero. En una realización, el portador farmacéuticamente aceptable es un hidrogel. En una realización, el portador farmacéuticamente aceptable es una matriz proteica. En una realización, el portador farmacéuticamente aceptable es una suspensión liposomal. En una realización, el portador farmacéuticamente aceptable es una espuma.

En una realización, los exosomas se separan de la UCBMNC por centrifugación. En una realización, los exosomas se separan de la UCBMNC por centrifugación diferencial.

La técnica más utilizada para purificar los exosomas es la ultracentrifugación diferencial, pero también pueden utilizarse otras técnicas para la invención objeto de estudio, incluidas, entre otras, la ultracentrifugación en un gradiente de densidad, la cromatografía líquida de alta presión-cromatografía de exclusión en gel (HPLC-GEC, por sus siglas en inglés), la precipitación con disolventes, la ultrafiltración, la captura por inmunoafinidad (IAC, por sus siglas en inglés) y el fraccionamiento por flujo de campo (FFF, por sus siglas en inglés).

La precipitación con disolventes es una técnica que separa con éxito los exosomas a velocidades de centrifugado relativamente lentas sin necesidad de una ultracentrifugadora. Tres ejemplos de kits comerciales que utilizan la precipitación con disolventes son Exosome Isolation kit (Life Technologies), ExoQuick (System Bioscience) y Exo-spin™ (Cell Guidance System).

La IAC se basa en la unión de un anticuerpo a su antígeno específico. A medida que aumenta el conocimiento de los subcomponentes de los exosomas, se identifican más dianas antigénicas individuales (normalmente proteínas) que pueden utilizarse para identificar específicamente los exosomas.

FFF es una técnica en la que las partículas se separan por su posición en un gradiente de velocidad laminar. En el fraccionamiento por campo de flujo asimétrico, un flujo transversal perpendicular al flujo descendente del canal impulsa las partículas hacia la membrana que limita el canal. La difusión hace que las partículas se alejen de la membrana, oponiéndose al flujo cruzado.

En una realización, el proceso comprende además una fase de enriquecimiento de los exosomas en uno o más miRNA antes de la fase b), en donde el miRNA se selecciona de un grupo que consiste en: hsa-miR-150-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-let-7g-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-let-7f-5p, hsa-miR-19b-3p, hsa-let-7a-5p, hsa-miR-26a-1-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-451a, hsa-miR-23a-3p, hsamiR-342-3p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-15a-5p, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-146a-5p, hsamiR-19a-3p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-30d-5p, hsa-miR-146b-5p, hsa-miR-106b-5p, hsamiR-29a-3p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-29b-3p, y hsa-miR-101-3p.

En una realización, el proceso comprende además una fase de enriquecimiento de los exosomas en uno o más miRNA antes de la fase b), en donde el miRNA se selecciona de un grupo que consiste en: hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-451a, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-15a-5p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-26b-5p, hsamiR-30d-5p, hsa-miR-146b-5p, hsa-miR-106b-5p, hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-29b-3p, y hsamiR-101-3p.

En una realización, el proceso comprende además una fase de enriquecimiento de los exosomas en miRNA hsa-miR-150-5p antes de la fase b).

En una realización, la composición comprende además uno o más miRNA no contenidos en los exosomas y el proceso comprende además las fases de mezclar el miRNA con un agente de transfección y suspender la mezcla en el portador farmacéuticamente aceptable, en donde el miRNA se selecciona de un grupo que consiste en hsa-miR-150-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-let-7g-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-let-7f-5p, hsa-miR-19b-3p, hsa-let-7a-5p, hsa-miR-26a-1-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-451a, hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-342-3p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-15a-5p, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-30d-5p, hsa-miR-146b-5p, hsa-miR-106b-5p, hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-29b-3p, y hsa-miR-101-3p.

En una realización, el miRNA se selecciona de un grupo que consiste en hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-451a, hsamiR-103a-3p, hsa-miR-15a-5p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-30d-5p, hsa-miR-146b-5p, hsa-miR-106b-5p, hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-29b-3p, y hsa-miR-101-3p.

En una realización, el miRNA es hsa-miR-150-5p.

La invención también proporciona una composición que comprende exosomas secretados por células mononucleares de la sangre de cordón umbilical (UCBMNC) preparadas mediante los procedimientos de la invención.

La invención también proporciona un producto para el cuidado de heridas que comprende la composición exosomal de la invención.

En una realización, la cantidad de miRNA hsa-miR-150-5p aplicada está comprendida entre 100 pmol y 1 nmol. En una realización, la cantidad de miRNA hsa-miR-150-5p aplicada está comprendida entre 100 pmol y 800 pmol. En una realización, la cantidad de miRNA hsa-miR-150-5p aplicada está comprendida entre 300 pmol y 500 pmol. En una realización, la cantidad de miRNA hsa-miR-150-5p aplicada es de 400 pmol.

Se divulga en el presente documento, pero no forma parte de la invención, una composición que comprende miRNA seleccionado de un grupo que consiste en: hsa-miR-150-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-451a, hsamiR-103a-3p, hsa-miR-15a-5p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-30d-5p, hsa-miR-146b-5p, hsa-miR-106b-5p, hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-29b-3p, y hsa-miR-101-3p para promover la cicatrización de heridas en un paciente que lo necesite. En un aspecto, uno de los miRNA es hsamiR-150-5p.

En un aspecto, la composición comprende además un portador farmacéuticamente aceptable.

Se divulga en el presente documento, pero no forma parte de la invención, un procedimiento para fabricar una composición que comprende uno o más miRNA y un portador farmacéuticamente aceptable que comprende la fase a) mezclar el miRNA con un agente de transfección, y b) suspender la mezcla en un portador farmacéuticamente aceptable, en donde el miRNA se selecciona del grupo que consiste en: hsa-miR-150-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-451a, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-15a-5p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-15b-5p, hsamiR-26b-5p, hsa-miR-30d-5p, hsa-miR-146b-5p, hsa-miR-106b-5p, hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-29b-3p, y hsa-miR-101-3p. En un aspecto, uno de los miRNA es hsa-miR-150-5p.

Se divulga en el presente documento, pero no forma parte de la invención, una composición que comprende miRNA y un portador farmacéuticamente aceptable preparado mediante los procedimientos descritos en el presente documento.

Las composiciones de la invención pueden utilizarse para proporcionar un producto para el cuidado de heridas como, por ejemplo, un apósito o un preparado farmacéutico.

Dicho apósito o preparado farmacéutico puede ser un material de injerto, parche, almohadilla, esparadrapo, película, esparadrapo, adhesivo, gel, espuma, crema, ungüento, bálsamo, embrocación, pomada, cataplasma, unción, emoliente, linimento, poción, ungüento, loción, aerosol, suspensión, polvo, jeringa, nebulizador o envase de aerosol.

El producto para el cuidado de heridas es preferiblemente:

a) un material de injerto que comprende al menos una capa de fibroblastos,

b) un gel o material de injerto compuesto por una matriz de fibrina y fibroblastos,

c) un material de injerto que comprende una matriz de al menos una proteína estructural,

d) un material de injerto que comprende una matriz de colágeno reticulado y glicosaminoglicano, e) un gel, parche, almohadilla, esparadrapo, película o adhesivo que comprende una matriz de polímeros hidrófilos dispersos en agua,

f) una película de poliuretano y/o una espuma,

g) un preparado farmacéutico que comprende proteína de matriz extracelular, alginato y agua, o h) un recipiente de aerosol que contiene un aerosol con dichos exosomas.

Preferiblemente, el producto para el cuidado de heridas comprende además un agente antiséptico o antibacteriano.

La composición de la invención se utiliza en la fabricación de un medicamento para promover la cicatrización de heridas en un paciente que lo necesite.

Términos

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende una persona con conocimientos ordinarios en la materia a la que pertenece esta invención.

Tal y como se utilizan en el presente documento, y a menos que se indique lo contrario o que el contexto exija otra cosa, cada uno de los siguientes términos tendrá la definición que se establece a continuación.

El término «herida», tal como se utiliza aquí, se refiere a una lesión en cualquier tejido vivo. Una herida puede estar causada por un acto, por una enfermedad infecciosa o por una afección subyacente. Una herida puede ser crónica o aguda. Algunos ejemplos de heridas son, entre otros, cortes, úlceras, úlceras diabéticas, daños isquémicos en los tejidos, daños isquémicos en el corazón, etc.

Esta invención se entenderá mejor haciendo referencia a los Detalles Experimentales que siguen, pero los expertos en la materia apreciarán fácilmente que los experimentos específicos detallados son únicamente ilustrativos de la invención tal como se define en las reivindicaciones que siguen a continuación.

Detalles experimentales

Ejemplo 1. El preacondicionamiento isquémico estimula a las células mononucleares de la sangre de cordón umbilical (UCBMNC) a secretar exosomas y aumenta su bioactividad hacia las células de la piel

La fracción total de UCBMNC se aisló utilizando Lymphoprep™ y las células se caracterizaron mediante un analizador hematológico. Tras la crioconservación, la población se enriquece en linfocitos y monocitos (MNC), mientras que se pierde una fracción significativa de neutrófilos (Figura 1A y 1B). La reserva utilizada para la secreción de exosomas se compone principalmente de linfocitos y monocitos.

Los experimentos demostraron que el preacondicionamiento isquémico (0,5 % O2, 5 % CO2, 0 % FBS, 18h) estimula a las UCBMNC a secretar exosomas bioactivos que son internalizados con cinética específica por diferentes tipos de células cutáneas (fibroblastos, queratinocitos y células endoteliales). Los experimentos también demostraron que estos exosomas (UCBMNC-Exo) ejercen un potente efecto pro-regenerativo in vitro, que consiste en aumentar la supervivencia y proliferación de las células de la piel (fibroblastos, queratinocitos y células endoteliales), así como estimular la migración de fibroblastos y queratinocitos y la formación de tubos por parte de las células endoteliales. Además, los experimentos demostraron que la administración tópica de UCBMNC-Exo dos veces al día acelera significativamente la cicatrización de las heridas por escisión en modelos animales normales y diabéticos de tipo 1 y 2.

Ejemplo 1.1: Caracterización de los exosomas

Procedimiento experimental:

Los exosomas se purificaron por centrifugación diferencial como se describe en Thery C. et al. (2006), cuyo contenido se incorpora íntegramente al presente documento.

Brevemente, el sobrenadante se sometió a fases secuenciales de centrifugación de 300 g (10 minutos), 2000 g (20 minutos) y dos veces a 10 000 g (30 minutos), para la eliminación de células, restos celulares y microvesículas, respectivamente. Tras 2 horas de centrifugación a 100000 g en un rotor de cubeta oscilante SW41Ti o SW32Ti (Beckman), el sedimento se lavó con 7 mL de PBS y se centrifugó a 100000 g durante otras 2 horas. El sedimento que contenía los exosomas se resuspendió en 250 uL de PBS. Los exosomas se cuantificaron en función de su contenido en proteínas utilizando un kit de ensayo de proteínas DC de BioRad™.

Los exosomas secretados por UCBMNC se caracterizaron inicialmente mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) y dispersión dinámica de luz (DLS). Los análisis DLS se llevaron a cabo en un Zeta PALS Zeta Potential Analyzer, que contenía un ZetaPlus Particle Sizing Software, v. 2.27 (Brookhaven Instruments Corporation). Para el tamaño de partícula, los exosomas (50<j>L) se diluyeron en PBS (200<j>L) y se adquirieron cinco mediciones por muestra a 25 °C para n=17. Para el potencial zeta, los exosomas (50<j>L) se diluyeron 25 veces con agua de grado molecular biológico filtrada a través de un poro de 0,2 jm (concentración final de PBS de 5 mM). Cada muestra se midió 5 veces y los resultados presentados son las medias aritméticas de n=4. Los análisis TEM se realizaron en un microscopio electrónico de transmisión Jeol JEM 1400 (Tokio). Las muestras se montaron en rejillas de cobre formar de malla 300, se tiñeron con acetato de uranilo al 1 %. Las imágenes se grabaron digitalmente utilizando una cámara CCD Gatan SC 1000 ORIUS (Warrendale, PA, EE. UU.), y los fotomontajes se realizaron utilizando el software Adobe Photoshop CS (Adobe Systems, San Jose, CA), en el HEMS / IBMC - Instituto de Biología Molecular y Celular (IBMC) de la Universidad de Oporto, Portugal.

Resultados:

Nuestros resultados indicaron que los exosomas tenían un tamaño medio de 140 nm (Figura 2A), un potencial zeta negativo (-30 mV) (Figura 2B) y una morfología esférica (Figura 2C.1 y 2C.2). Además, estos exosomas expresaban los marcadores CD9, c D81 y HSC70, según se analizó mediante FACS (Figura 2D).

No hubo diferencias significativas entre las características biofísicas de los exosomas secretados en hipoxia y las de los secretados en normoxia (condiciones control). Sin embargo, los datos sugerían que la hipoxia estimulaba una mayor secreción de exosomas por parte de las UCBMNC, como se observaba a partir del aumento del contenido proteico (Figura 2E), que se normalizan con el mismo número de células secretoras y se resuspendierón en volúmenes finales equivalentes.

Ejemplo 1.2: Cinética de captación de exosomas por células cutáneas

1.2.1 Porcentaje de células cutáneas

Procedimiento experimental:

Las células de la piel captan exosomas derivados de UCBMNC, aunque la cinética y la magnitud de la captación dependen del tipo de célula. Para demostrar las diferencias en la cinética de captación de exosomas por las células de la piel, los exosomas se marcaron inicialmente con un colorante fluorescente (NBD-DPPE y verde Syto). En resumen, se añadieron los colorantes NBD-DPPE (16 j M en etanol) o Syto Verde (10 j M en DMSO) a una suspensión de exosomas (100<j>L; concentración de proteínas entre 60 y 70 jg/mL) (DMSO y EtOH <1 %) y se incubaron a 37 °C durante 30 min. Tras bloquear la reacción con albúmina de suero bovino (BSA, 1 %, p/v), los exosomas se lavaron con PBS (6 mL) y el colorante libre se eliminó por ultracentrifugación a 100000 g durante 1 h. A continuación, los exosomas se resuspenderierón en PBS (100 |jL). Este procedimiento se realizó siempre con exosomas nuevos. Los exosomas marcados se utilizaron inmediatamente en los experimentos de internalización.

Evaluamos el porcentaje de células cutáneas capaces de captar exosomas derivados de UCBMNC tras 4 h de incubación, mediante citometría de flujo. Se sembraron HUVEC (80 000 células/pocillo), células HaCaT (160 000 células/pocillo) y fibroblastos (50 000 células/pocillo) en una placa de 24 pocillos y se dejaron crecer durante 18-24 h. Las células confluentes se incubaron con exosomas marcados con NBD-DPPE durante 4 h en medio de cultivo celular sin suero bovino fetal (FBS), a concentraciones finales de 1,2 y 3 jg/mL. Después, las células se lavaron una vez con PBS, se desprendieron con tripsina (HUVEC y NDHF) o tripLE™ Express (HaCaT), se lavaron dos veces en PBS y se analizaron por citometría de flujo en un instrumento FACS-Calibur integrado con el software Cell-Quest (BD Biosciences).

Resultados:

Los exosomas no son citotóxicos para las células endoteliales, para concentraciones de hsata 10 jg/m L (Figura 3A).

Nuestros resultados también mostraron que para concentraciones de exosomas entre 1 y 3 jg/mL, se observaron mayores niveles de internalización para concentraciones más altas de exosomas (Figura 3B). Además, tanto los queratinocitos como los fibroblastos fueron más permisivos a la internalización de exosomas que las células endoteliales.

1.2.2: Efecto del tiempo de incubación

Procedimiento experimental:

A continuación, evaluamos la influencia del tiempo de incubación y la concentración de exosomas en la cinética de captación de exosomas por las células cutáneas mediante microscopía confocal (Figura 3C). Las instantáneas (Figura 3C) se adquirieron con un equipo de escaneo confocal Zeiss LSM 710, utilizando las longitudes de onda de excitación de, 405 y 488 y un objetivo de inmersión en aceite Plan-Apochromat 40*/1,4. También se obtuvo el perfil cinético analizando la intensidad del citoplasma en diferentes puntos temporales durante 24h, utilizando microscopía de alto contenido (In Cell Analyser, GE Healthcare). El microscopio está equipado con una incubadora de calor que se ajustó a 37 °C y un suministro de CO2 ajustado al 5 %. Para los experimentos de microscopía de células vivas, se cultivaron células HUVEC durante 24 h en unaplaca de angiogénesis IBIDI™p-Slide. Exosomas marcados con Syto® RNASelect™(1-20jg/m l) se añadieron a células confluentes en un medio empobrecido en exo y se incubaron durante diferentes periodos de tiempo. Las células se lavaron dos veces con PBS y se mantuvieron en un medio que contenía FBS durante el transcurso de los experimentos.

Resultados:

Nuestros resultados mostraron que en los tres tipos de células analizadas, los exosomas se localizaban en el citoplasma general. La acumulación de exosomas en el citoplasma celular alcanzó su punto máximo aproximadamente 16 h después del contacto (Figura 3D).

1.2.3: Efectos funcionales de los exosomas

Procedimiento experimental:

Para determinar los efectos funcionales de los exosomas en las células cutáneas, evaluamos si la internalización de los exosomas podía inducir (i) la supervivencia celular en condiciones isquémicas, (ii) la proliferación celular, (iii) la migración celular y (iv) la formación de tubos endoteliales (Figuras 4 y 5).

Para los experimentos de supervivencia celular, las HUVEC (1'104) se cultivaron en EGM-2 (Lonza), con un 2 % de FBS, las NDHF (5'103) y las HaCaT (2'104) se cultivaron en DMEM (Invitrogen), con un 0,5 % de Penstrep y un 10 % de FBS, en placas de 96. Tras 20 h, las células se lavaron con PBS y se incubaron con medio empobrecido en exosomas solamente (100 pL) o con exosomas (100 pL, que contenían 1 pg/mL, 2 pg/mL, 3 pg/mL o 5 pg/mL) durante 48 h. A continuación, las células se incubaron en condiciones de isquemia durante 48 h (HUVEC en EGM-2 sin VEGF y FBS; y HaCaT en DMEM sin FBS a 37 °C, 5 % CO2, 0,1 % O2) o 72 h (fibroblastos en DMEM sin FBS a 37 °C, 5 % CO2, 0,1 % O2). Al final, las células se controlaron mediante microscopía de alto contenido y la viabilidad celular se cuantificó mediante tinción de Hoescht/yoduro de propidio (PI). La supervivencia celular se calculó según la siguiente ecuación: (Supervivencia celulargrupotratamiento - Supervivencia c e lu la d o control) / Supervivencia c e lu la d o control.

Se adoptó el siguiente procedimiento para demostrar las propiedades inductoras de proliferación de los exosomas. Las HUVEC (2,5'103) se cultivaron en EGM-2 (Lonza), con un 2 % de FBS, los fibroblastos (5'103) y las HaCaT (2,5'103) se cultivaron en DMEM (Invitrogen), con un 0,5 % de Penstrep y un 10 % de FBS, en placas de 96. Tras 20 h, las células se tiñeron con Hoechst (33342, Life Technologies) durante 15 min, se lavaron con PBS y se incubaron en medio empobrecido de exosomas solo (100<j>L) o con exosomas (1 pg/mL, 2 pg/mL o 3 |jg/mL) durante 24 h. A continuación, se cambió el medio y las células se incubaron (37 °C, 5 % CO2, 0,1 % O2) en un medio empobrecido de exosomas (200<j>L) durante 72 h. Las células se tiñeron con Hoechst y se fotografiaron (IN Cell, GE Healthcare) cada 24 h y el número de células se calculó contando los núcleos celulares. La ratio de proliferación se obtuvo dividiendo el número de células a las 72 h después del tratamiento por el número de células en el momento de la incubación con exosomas (Tiempo cero - T0).

Los fibroblastos (1x104) y las células HaCaT (2x104) se cultivaron en DMEM (Invitrogen), con 0,5 % de Pen Strep y 10 % de FBS, en placas de 96. Después de 20 h, se hizo un rasguño vertical con una punta de pipeta de 200 j L en el centro del pocillo y se lavaron las células con PBS. A continuación, se añadió a las células medio empobrecido en exosomas solo (100 jL ) o suplementado con exosomas (1 pg/mL, 2 pg/mL o 3 pg/mL) y se tomaron imágenes de los pocillos (tiempo cero<t>0) en In Cell Analyzer (GE Healthcare). Tras 4 h, se añadió más medio empobrecido de exosomas (100 pL) y las células se incubaron durante 18 h. A continuación, se cambió el medio celular a DMEM empobrecido de exosomas con 0,5 % de FBS y se incubaron las células a 37 °C, 5 % de CO2 y 20 % de O2 durante 48 h. Se tomaron fotografías 48 h después del arañazo y se midió el área de la herida con el software AxioVision 4.6.3 (Carl Zeiss Imaging Solutions GmbH).

Para determinar el efecto de los exosomas en la formación de tubos en células endoteliales, se cultivaron HUVEC (5x104/pocillo, pasaje 3 - 5) en EGM-2 (Lonza) en una placa de 24 pocillos durante toda la noche. Tras 20 h, las células se incubaron en 200 pL de medio empobrecido de exosomas solo y con exosomas (1 pg/mL, 2 pg/mL, 3 pg/mL y 5 pg/mL). Tras 48 h, se tripsinizaron las células y se sembraron en EBM-2 sobre el Matrigel polimerizado (BD Biosciences, 10 pL por pocillo, 30 minutos a 37 °C) en una placa ibidi de 15 pocillos. Doce horas después de la siembra celular, se fotografiaron las células mediante microscopía de contraste de fases y se evaluó y cuantificó la formación de tubos utilizando el software WimTube (Wimasis).

Resultados:

Nuestros resultados mostraron que los exosomas aislados de UCBMNC cultivados en condiciones de hipoxia (Exo_Hyp), pero no en condiciones de normoxia (Exo_Nor), fueron muy eficientes para inducir la supervivencia de las células endoteliales cultivadas en condiciones de isquemia durante 48 h (Figura 4A.1-4).

Según nuestros resultados, la supervivencia alcanzó su máximo para concentraciones de exosomas de 2 pg/mL. Curiosamente, aunque tanto Exo_Hyp como Exo_Nor inducen la supervivencia de los queratinocitos cultivados en condiciones isquémicas in vitro, no tuvieron ningún efecto en la supervivencia de los fibroblastos. Por lo tanto, nuestros resultados indican que la pro-supervivencia de los exosomas depende de la célula y de la concentración.

Nuestros resultados mostraron que los exosomas inducían la proliferación de fibroblastos a concentraciones de 1 y 2 jg/m L para Exo_Hyp y de 2 y 3 jg/m L para Exo_Nor (Figura 4B.1-4). Curiosamente, los exosomas no tuvieron un efecto significativo en la proliferación de células endoteliales y queratinocitos en condiciones in vitro, lo que demuestra una vez más que las propiedades inducidas por los exosomas dependen de la célula y de la concentración.

Nuestros resultados mostraron que los exosomas, en particular Exo_Hyp, aumentaron significativamente la movilidad de las células de fibroblastos y queratinocitos, lo que indica que estos exosomas también presentan una bioactividad pro-migratoria (Figura 5A1-3).

Nuestros resultados mostraron que los UCBMNC-Exo aumentaban significativamente el número total de tubos vasculares y la complejidad de la red vascular formada, como se observaba por el aumento del número de puntos de ramificación (Figura 5B).

Estos resultados demostraron el efecto de los UCBMNC-Exo sobre los queratinocitos, las células endoteliales y los fibroblastos individualmente y en condiciones in vitro. Los queratinocitos, las células endoteliales y los fibroblastos son los principales tipos celulares implicados en la cicatrización de heridas, lo que indica el papel de los UCBMNC-Exo en la cicatrización de heridas. Dado que los estudios in vitro no pueden recapitular las condiciones in vivo, se realizaron estudios in vivo del efecto de los UCBMNC-Exo en la cicatrización de heridas (explicado en el Ejemplo 3). En el Ejemplo 3, demostramos el efecto de los UCBMNC-Exo en la cicatrización de heridas.

Ejemplo 2. Caracterización del contenido de RNA de UCBMNC-Exo

Procedimiento experimental:

El contenido de RNA de UCBMNC-Exo se caracterizó mediante secuenciación profunda de RNA. Se utilizaron UCBMNC-Exo secretados en hipoxia y normoxia de dos donantes diferentes. Se utilizó la siguiente metodología.

El RNA total se extrajo del sedimento de exosomas con el miRCURY RNARNA Isolation Kit - Cell & Plant (EXIQON) utilizando el protocolo Lysate Preparation from Cultured Animal Cells (preparación de lisado a partir de células animales cultivadas). La cantidad y la calidad del RNA total y del RNA pequeño se evaluaron utilizando el kit RNARNA 6000 Pico y el kit Small RNARNA en el Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies), respectivamente. Las muestras se sometieron a la preparación de bibliotecas de ADNc utilizando los protocolos de bibliotecas de transcriptoma completo (WT) y de pequeñas bibliotecas de RNA descritos en la Guía del usuario del Ion Total RNARNA-Seq Kit v2 (Life Technologies).

Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante, excepto la fase de fragmentación del RNA, que se omitió en la preparación de las bibliotecas del transcriptoma completo puesto que el material de partida ya tenía la longitud requerida.

Brevemente, se utilizaron 2,1-4,5 ng de RNA pequeño y 20 ng de RNA total para construir las bibliotecas pequeña y WT, respectivamente. Los adaptadores de r Na se ligaron a 16 °C durante 16 h a las bibliotecas pequeñas y a 30 °C durante 1 h a las bibliotecas WT. Se sintetizaron la primera y la segunda cadena de ADNc, y el ADNc purificado se amplificó con cebadores específicos con código de barras mediante PCR y los fragmentos resultantes se seleccionaron para el tamaño correcto con perlas magnéticas. Las bibliotecas de ADNc se cuantificaron y su calidad se evaluó con el kit de ADN de alta sensibilidad Agilent para bibliotecas de RNA WT y el kit Agilent DNA 1000 para bibliotecas pequeñas en el bioanalizador 2100 (Agilent Technologies). Se prepararon dos reservas de bibliotecas con código de barras (WT y RNA pequeño) y se amplificaron clonalmente mediante PCR en emulsión utilizando el kit Ion PI Template 0 T2200 v2 y el sistema Ion OneTouch 2 (Life Technologies), y las partículas Ion Sphere positivas se enriquecieron en la máquina Ion OneTouch ES (Life Technologies). Por último, las esferas positivas se cargaron en un único chip Ion Pi v2 y se secuenciaron en el sistema Ion Proton (Life Technologies) en Genoinseq (Cantanhede, Portugal). Todos los procedimientos se llevaron a cabo siguiendo las instrucciones del fabricante. Las secuencias adaptadoras de Ion Proton y las bases de baja calidad se recortaron utilizando el software Torrent Suite (Life Technologies).

A continuación, las lecturas de secuencias se filtraron por longitud, eliminando las lecturas de menos de 15 pb de la biblioteca pequeña y las de 18 pb de la biblioteca grande. A continuación, se identificaron rRNA, tRNA, miRNA, mRNA y ncRNA alineando las lecturas de cada muestra con sus bibliotecas específicas (rRNA: 5S -NR_023379.1, 5.8S - NR_003285.2, 18S - NR_003286.2, 28S - NR_003287.2; tRNA: biblioteca de tRNA extraída de UCSC; mir: mirbase; RNAm: Biblioteca CDS de Ensembl; biblioteca ncRNA de Ensembl y ENCODE) utilizando TMAP versión 4.1.

A continuación, verificamos la expresión de los 15 miRNA mediante qRT-PCR en exosomas recogidos de 10 sujetos (Figura. 6B1). Tras aislar el RNA total de los exosomas secretados en hipoxia y normoxia por células mononucleares de 10 donantes diferentes, se poliadenilaron todos los miRNA de la muestra y se construyó una biblioteca de ADNc utilizando el kit de síntesis de ADNc de primera cadena de miRNA y qRT-PCR NCode™ (Invitrogen™, Life Technologies, Carlsbad, California, EE.UU.) y la expresión de los 15 microRNA más expresados, determinada por los datos de RNASeq, se confirmó mediante qRT-PCR utilizando la matriz dinámica de Fluidigm en el sistema BioMark™ (Fluidigm corporation, South San Francisco, CA, EE. UU.), siguiendo las instrucciones del fabricante. Se diseñaron cebadores específicos para cada microRNA de acuerdo con las instrucciones del kit NCode y se utilizó el snRNA U6 como control endógeno (Wang Y, et al, 2015).

Resultados:

Nuestros resultados mostraron que tanto Exo-Hyp como Exo_Nor tienen una gran reserva de miRNA (Figura 6A). En términos de lecturas totales, los 30 miRNA más representativos para ambos exosomas fueron: hsamiR-150-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-let-7g-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-let-7f-5p, hsa-miR-19b-3p, hsa-let-7a-5p, hsa-miR-26a-1-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-451a, hsamiR-23a-3p, hsa-miR-342-3p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-15a-5p, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-30d-5p, hsa-miR-146b-5p, hsa-miR-106b-5p, hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-29b-3p, y hsa-miR-101-3p.

El número de acceso y las secuencias maduras de los 30 miRNA más representativos se resumen a continuación en la Tabla I.

Tabla I - MicroRNA maduros en exosomas de UCBMNC, número de acceso y secuencia de miRBASE

Las secuencias de los cebadores directos utilizados en la qRT-PCR para el miRNA maduro y el RNU6 se resumen en la Tabla II.

Tabla II - Números de acceso de microRNA maduros y RNU6 (miRBase y GenBank) y secuencias de los cebadores directos utilizados para la qRT-PCR

Nuestro análisis también confirmó que el hsa-miR-150-5p era el más expresado con, aproximadamente, más de 4 veces la expresión del siguiente microRNA más expresado, el hsa-miR-342a-3p (Figura 6B).

Un informe anterior (Gray et al., 2015) ha identificado 7 miRNA que se expresaron diferencialmente en exosomas recogidos de células progenitoras cardíacas cultivadas en normoxia e hipoxia: miR-292, miR-210, miR-103, miR-17, miR-199a, miR-20a y miR-15b. Es importante señalar que la mayoría de los miRNA identificados en esta patente (con la excepción de miR-20a y miR-15b) son nuevos y no se habían divulgado anteriormente.

Ejemplo 3. UCBMNC-Exo acelera la cicatrización de heridasin vivo

Procedimiento experimental:

En el modelo de tipo 1, se indujo diabetes mellitus mediante inyección intraperitoneal de estreptozotocina (Sigma-Aldrich) en ratones machos C57BL/6 (10-12 semanas de edad), adquiridos de Charles River (Wilmington, MA, EE. UU.).

Para el modelo de diabetes de tipo 2, se adquirieron ratones modificados genéticamente db/db de Charles River (Wilmington, MA, EE. UU.).

Tras confirmar que los niveles de glucosa eran superiores a 300 mg/dL (de seis a ocho semanas después de la inducción de la diabetes en el modelo de tipo 1), se anestesió a los animales, se afeitó y desinfectó la piel dorsolumbary se crearon dos heridas de escisión dorsal de espesor total de 6 mm de diámetro con un punzón de biopsia estéril en cada animal.

A continuación, las heridas se cubrieron con PBS (10 pL; dos veces al día), Exo_Hyp (10 pL de una suspensión de exosomas a 2 pg/mL; dos veces al día; por tanto, 0,4 pg por herida durante el tratamiento global de 10 días) o PDGF-BB (100 pg/mL, Peprotech; 4 pg/cm2; una vez al día).

Tras la cirugía, los animales se mantuvieron en jaulas individuales con comida y agua ad libitum y en un entorno de temperatura y humedad controladas. Las heridas se midieron todos los días durante 10-15 días. Al final del estudio, los animales fueron sacrificados por dislocación cervical y se recogieron biopsias de piel de 10 mm de diámetro para su posterior análisis.

Resultados:

Nuestros resultados mostraron que el tratamiento con exosomas aceleraba significativamente la velocidad de cicatrización de las heridas por escisión de los diabéticos de tipo 1 (Figura 7A1 y A2). Se observó una aceleración de la cicatrización de la herida (menor tamaño de la herida) desde el segundo día, que fue estadísticamente significativa en el Donante 2. Al cabo de 10 días, se observó una mejora constante del 55 % del cierre de la herida tras la aplicación de UCBMNC-Exo (el tamaño de la herida tratada es la mitad del tamaño del control), independientemente del donante. Se aplicó la misma pauta de tratamiento a ratones normales, y se observó una aceleración del cierre de la herida, significativa a partir del día 3, que condujo a una mejora general del 39 % en el día 10 (Figura 7A3).

En el modelo de ratón con diabetes de tipo 2 (modelo genético db/db), los resultados muestran que UCBMNC-Exo también aceleró la cicatrización de heridas, mostrando un efecto significativo en el día 2, una mejora del 20 % en el día 10 y un tiempo total de cicatrización de 17 días, es decir, 4 días antes que el tratamiento de control (Figura 7A4).

Estos animales también fueron tratados con el agente activo de un producto conocido comercializado para el tratamiento de las úlceras diabéticas humanas (PDGF-BB), con la pauta recomendada (una vez al día, concentración máxima recomendada). Sorprendentemente, los UCBMNC-Exo fueron significativamente más eficaces, ya que empezaron a acelerar el cierre de las heridas antes (día 2, en comparación con el día 5), mostraron una mayor mejoría en el día 10 (20 %, en comparación con el 10 % con PDGF-BB) y cerraron totalmente las heridas antes (día 17, en comparación con el día 18 con PDGF-BB) (Figura 7A4). Curiosamente, cuando se aplican UCBMNC-Exo dos veces al día en una herida de ratones diabéticos, la cicatrización de la herida se acelera en la herida distante de control durante los primeros días, lo que sugiere que también estimulan la cicatrización en lugares distantes (Figura 7C).

El análisis histológico de las heridas indica que el tratamiento con UCBMNC-Exo aumentó la repitelización , estimuló la formación de tejido fibrótico y se asoció a un aumento de las infiltraciones celulares, lo que puede ser indicativo de un aumento de la infiltración de macrófagos, esenciales para la cicatrización de las heridas (Figura 7B).

Ejemplo 4. MiR-150-5p mejora la supervivencia de los fibroblastos a la isquemia y la migración de queratinocitos in vitro.

Procedimiento experimental:

Para los ensayos in vitro, se transfectaron células endoteliales, fibroblastos y queratinocitos con miR-150-5p (5 nM, miRIDIAN microRNA Human hsa-miR-150-5p mimic MIMAT0000082, Dharmacon, Lafayette, Colorado, EuA) y el reactivo de transfección Lipofectamine® RNAiMAX (Invitrogen™) en 100 pL de medio completo durante 48 h (ensayo de supervivencia celular y formación de tubos) o 24 h (ensayo de proliferación celular y scratch). La transfección solo con Lipofectamine se utilizó como control negativo.

Se utilizaron como controles positivos el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, 50 ng/mL) y el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF-BB, 50 ng/mL).

Todos los ensayos in vitro se llevaron a cabo según lo descrito para la evaluación de la bioactividad de los exosomas.

Resultados:

Nuestros resultados muestran que los fibroblastos transfectados con miR-150-5p presentan una mayor supervivencia tras 72 h de isquemia que las células no transfectadas (Figura 8A). No ocurrió lo mismo con las células endoteliales y los queratinocitos. Ampliamos nuestros análisis a ensayos de migración, proliferación y angiogénesis. Los queratinocitos transfectados con miR-150-5p, pero no los fibroblastos, presentaron mejores propiedades de migración, evaluadas mediante un ensayo de raspado. No se observaron diferencias estadísticas en las células con respecto a la proliferación y la angiogénesis.

Ejemplo 5. MiR-150-5p mejora la cicatrización de heridasin vitro,

Se evaluó el efectoin vivode hsa-miR-150-5p en un modelo de cicatrización de heridas sin enfermedad.

Procedimiento experimental:

Seis ratones machos C57BL/6 de tipo salvaje (de 8 semanas de edad), adquiridos en Charles River (Francia) y con un peso de entre 20 y 30 g, fueron anestesiados y se realizaron dos escisiones de espesor completo de 6 mm de diámetro cada una y separadas 5 cm con un punzón de biopsia estéril en el dorso de cada animal. Una dosis única de miR-150-5p (5 pM), en complejo con el reactivo de transfección de RNAsi DharmaFECT 1 (120 pL) (Dharmacon, Lafayette, Colorado, EUA), se inyectó por vía subcutánea en el borde de la herida ( 2 ' 40 pL) inmediatamente después de la creación de la herida.

Como controles negativos se utilizaron un miR aleatorio (microRNA Mimic Negative Control, Dharmacon, Lafayette, Colorado, EUA) y PBS.

Los animales se mantuvieron en jaulas individuales con comida y agua ad libitum, y la zona de la herida se observó diariamente durante el periodo total del experimento. La zona de la herida se trazó cada día en papel de acetato para hacer un seguimiento de la tasa de cierre de la herida hsata 10 días después de la herida. El tamaño de la herida se determinó con el software ImageJ (NIH). Los datos se presentaron como porcentaje de la herida original (día 0). Los animales fueron sacrificados 10 días después de la herida.

Resultados:

Nuestros resultados mostraron que las heridas tratadas con hsa-miR-150-5p cicatrizaban más rápidamente que las heridas tratadas con miR negativo de control (aleatorio) y las no tratadas (PBS) (Figura 8B).

Es interesante señalar que hsa-miR-150-5p es un miR mononuclear específico (Li, et al, 2013; Allantaz, et al, 2012; Zhang, et al, 2010). Estudios anteriores han demostrado que hsa-miR-150-5p se dirige a VEGF y tiene actividades tanto antiangiogénicas como proangiogénicas (He, et al, 2016; Yang, et al, 2015; Li, et al, 2013). Además, también se ha descrito que hsa-miR-150-5p está relacionada con la migración de células endoteliales (Yang, et al, 2015; Zhang, et al, 2010) y la proliferación y apoptosis celular (Gu, et al, 2014; Shi, et al, 2007).

Nuestros resultados muestran por primera vez la implicación de hsa-miR-150-5p como miRNA inductor de la cicatrización de heridas.

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Un proceso para preparar una composición de exosomas que comprende exosomas secretados por UCBMNC, que comprende las siguientes fases:

a) Proporcionar células mononucleares aisladas de la sangre de cordón umbilical (UCBMNC), b) Acondicionamiento de las UCBMNC de la fase a) mediante exposición a condiciones hipóxicas de 0,5 % 0 2, 5 % CO2, durante 18h, en un medio de cultivo desprovisto de suero bovino fetal (0 % FBS),

c) separar y aislar los exosomas secretados por las UCBMNC de la fase b) anterior, y

d) suspender los exosomas aislados de la fase c) en un portador adecuado.

2. Una composición de exosomas que comprende exosomas secretados por células mononucleares de la sangre de cordón umbilical (UCBMNC) preparadas según el procedimiento de la reivindicación 1, en donde al menos uno de los exosomas contiene uno o más miRNA seleccionados del grupo que consiste en:

hsa-miR-150-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-let-7g-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-let-7f-5p, hsa-miR-19b-3p, hsa-let-7a-5p, hsa-miR-26a-1-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-451a, hsamiR-23a-3p, hsa-miR-342-3p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-15a-5p, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-30d-5p, hsa-miR-146b-5p, hsa-miR-106b-5p, hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-29b-3p, y hsa-miR-101-3p, y

- los exosomas presentan una morfología esférica,

- los exosomas tienen un tamaño medio de partícula de 100 nm a 200 nm,

- los exosomas tienen un potencial zeta negativo de -10 mV a -50 mV,

- al menos uno de los exosomas expresa los marcadores CD9, CD34, CD81 y/o Hsc70, y

- los exosomas aumentan la tasa de supervivencia de las células endoteliales y los queratinocitos y estimulan la cicatrización de heridas.

3. Una composición de exosomas, según la reivindicación 2, en donde al menos uno de los exosomas contiene uno o más miRNA seleccionados de un grupo que consiste en:

hsa-miR-150-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-let-7g-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-let-7f-5p, hsa-miR-19b-3p, hsa-let-7a-5p, hsa-miR-26a-1-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-451a, hsamiR-23a-3p, hsa-miR-342-3p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-15a-5p, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-30d-5p, y hsa-miR-146b-5p, preferiblemente, los exosomas contienen uno o más miRNA seleccionados de un grupo que consiste en: hsa-miR-150-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-let-7g-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-let-7f-5p, hsa-miR-19b-3p, hsa-let-7a-5p, hsa-miR-26a-1-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-451a, hsamiR-23a-3p, hsa-miR-342-3p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-15a-5p, hsa-miR-142-5p, y hsamiR-146a-5p,

preferiblemente, los exosomas contienen uno o más miRNA seleccionados de un grupo que consiste en: hsa-miR-150-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-let-7g-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-let-7f-5p, hsa-miR-19b-3p, hsa-let-7a-5p, hsa-miR-26a-1-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-451a, hsamiR-23a-3p, y hsa-miR-342-3p,

preferiblemente, los exosomas contienen uno o más miRNA seleccionados de un grupo que consiste en: hsa-miR-150-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-let-7g-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-let-7f-5p, hsa-miR-19b-3p, hsa-let-7a-5p, y hsa-miR-26a-1-5p,

preferiblemente, los exosomas contienen uno o más miRNA seleccionados de un grupo que consiste en: hsa-miR-150-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-let-7g-5p, y hsa-miR-21-5p, preferiblemente, los exosomas contienen el miRNA hsa-miR-150-5p.

4. Una composición según la reivindicación 2 o 3 en donde la concentración de los exosomas en la composición es de 0,01 pg/mL a 10 pg/mL,

preferiblemente, la concentración de los exosomas en la composición es de 1 pg/mL a 3 pg/mL, preferiblemente, la concentración de los exosomas en la composición es de 0,5 pg/mL-1,5 pg/mL,

aún más preferiblemente, la concentración de los exosomas en la composición es de aproximadamente 1 |jg/mL, 0,01 |jg/mL, 0,25 pg/mL, 0,5 pg/mL, 0,75 pg/mL, 1,0 pg/mL, 1,25 pg/mL, 1,5 pg/mL, 1,75 pg/mL, 2,0 pg/mL, 2,25 pg/mL, 2,5 pg/mL, 2,75 pg/mL, 3,0 pg/mL, 5,0 pg/mL, o 10 pg/mL.

5. Una composición que comprende exosomas secretados por células mononucleares de la sangre de cordón umbilical (UCBMNC), según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 para su uso como medicamento.

6. Una composición que comprende exosomas secretados por células mononucleares de la sangre de cordón umbilical (UCBMNC), según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 para su uso como medicamento en la reparación de tejidos.

7. Una composición que comprende exosomas secretados por células mononucleares de la sangre de cordón umbilical (UCBMNC), según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 para su uso en la terapia de heridas abiertas en la piel, tales como una incisión, una laceración, un desgarro, una abrasión, una avulsión o una herida quirúrgica.

8. Una composición que comprende exosomas secretados por células mononucleares de la sangre de cordón umbilical (UCBMNC), según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 para su uso en la terapia de heridas por quemaduras, tales como una quemadura térmica, una quemadura química o una quemadura por radiación.

9. Una composición que comprende exosomas secretados por células mononucleares de la sangre de cordón umbilical (UCBMNC), según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 para su uso en terapia de heridas relacionada con una afección cutánea o enfermedad cutánea que comprenda una herida, como acné, psoriasis, rosácea, dermatitis, eczema, impétigo, intertrigo o foliculitis.

10. Una composición que comprende exosomas secretados por células mononucleares de la sangre de cordón umbilical (UCBMNC), según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 para su uso como medicamento en la terapia de heridas tales como úlceras arteriales, úlceras venosas, úlceras diabéticas y úlceras por presión, úlcera posquirúrgica, úlcera traumática, úlcera bucal, úlcera de pie diabético o úlcera corneal.

11. Un producto para el cuidado de heridas que comprende una composición de exosomas según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en donde dicha composición está en forma líquida, en forma de polvo o en forma de aerosol, en forma de crema, en forma de hidrogel o en forma de gel.