ES3034186T3

ES3034186T3 - Chimeric papillomavirus l1 protein

Info

Publication number: ES3034186T3
Application number: ES20843433T
Authority: ES
Inventors: Liangzhi Xie; Chunxia Luo; Wei Zhang; Xiaoyan Suo; Lin Pang; Ping Hu
Original assignee: Sinocelltech Ltd
Current assignee: Sinocelltech Ltd
Priority date: 2019-07-19
Filing date: 2020-07-17
Publication date: 2025-08-13
Anticipated expiration: 2040-07-17
Also published as: ZA202201570B; EP4001297A1; US20250109174A1; US12139514B2; EP4001297B1; CN114364692A; JP7805920B2; US20250101068A1; US20250136644A1; US20250122245A1; US20220281925A1; JP2022540951A; BR112022001075A2; EP4001297C0; HUE073111T2; AU2020318114A1; CA3147850A1; MY197457A; HRP20250701T1; US20250136646A1

Abstract

La presente invención se refiere a una proteína L1 quimérica del virus del papiloma humano y a un polinucleótido que la codifica, así como a partículas similares al virus del VPH y a su método de preparación. La proteína L1 quimérica del virus del papiloma humano comprende un fragmento N-terminal derivado de la proteína L1 del primer tipo, que conserva la inmunogenicidad de la proteína L1 correspondiente a los tipos de VPH; y un fragmento C-terminal derivado de la proteína L1 del segundo tipo, que presenta mejores características de expresión y solubilidad que otros tipos de proteína L1. La proteína L1 quimérica del virus del papiloma humano posee la inmunogenicidad de la proteína L1 correspondiente a los tipos de VPH. La proteína L quimérica del virus del papiloma humano presenta una mayor expresión y una mejor solubilidad, y puede utilizarse para la producción a gran escala de vacunas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Proteína quimérica 11 del papilomavirus

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la proteína L1 del virus del papiloma (VPH) y al polinucleótido que la codifica, y también a partículas similares al virus VPH y a sus métodos de preparación.

Antecedentes de la invención

El virus del papiloma (PV) pertenece a la familiaPapillomaviridaey causa papilomas en humanos, ganado, perros y conejos. Uno de sus miembros, el virus del papiloma humano (VPH), es un virus de ADN sin envoltura. El genoma de este virus es un ADN circular cerrado de doble cadena, de unos 7,2-8kb de tamaño, con 8 marcos de lectura abiertos, que pueden dividirse en tres regiones según sus funciones: (1) región temprana (E), de unos 4,5kb, que codifica E1, E2, E4-E7, un total de 6 proteínas no estructurales relacionadas con la replicación, la transcripción y la transformación virales; (2) región tardía (L), de unos 2,5 kb, que codifica la proteína mayor de la cápside L1 y la proteína menor de la cápside L2; (3) región reguladora larga (LCR), que se sitúa entre el final de la región L y el principio de la región E, tiene una longitud de unos 800-900 pb y no codifica ninguna proteína, sirviendo como elementos reguladores de la replicación y la expresión del ADN.

Las proteínas L1 y L2 se sintetizan tarde en el ciclo de infección del VPH. La proteína L1 es la principal proteína de la cápside y tiene un peso molecular de 55-60 kDa. La proteína L2 es la proteína menor de la cápside. 72 Los pentámeros de la proteína L1 forman la cubierta exterior de la partícula icosaédrica del VPH (45-55 nm de diámetro), que encierra ADN circular cerrado de doble cadena. La proteína L2 se encuentra en el lado interno de la proteína L1 (Structure of Small Virus-like Particles Assembled from the L1 Protein of Human Papillomavirus 16 Chen, XS, RL Garcea, Mol.Cell.5(3):557-567, 2000).

El ORF de la proteína L1, el gen más conservado del genoma de la PV, puede utilizarse para identificar nuevos tipos de PV. Se identifica un nuevo tipo de PV si se clona su genoma completo y su secuencia de ADN ORF L1 difiere del tipo de PV conocido más cercano en más del 10%. Las homologías con diferencias entre el 2% y el 10% se definen como subtipos diferentes, y las diferencias inferiores al 2% se definen como variantes diferentes del mismo subtipo (E.-M. de Villiers et al. / Virology 324 (2004) 17-27).

En las últimas fases de la infección por VPH, las proteínas L1 recién sintetizadas en el citoplasma son transportadas al núcleo de la queratina diferenciada terminalmente donde, junto con las proteínas L2, empaquetan el ADN genómico replicado del VPH para formar virus infecciosos (Nelson, LM, et al. 2002. Nuclear import strategies of high risk VPH16 L1 major capsid protein. J. Biol. Chem. 277: 23958-23964). Esto sugiere que la importación nuclear de la proteína L1 desempeña un papel muy importante en la infección y producción del VPH. La capacidad del virus para entrar en el núcleo viene determinada por la señal de localización nuclear (NLS) en el C-terminal-terminal de la proteína L1 del VPH, la NLS se caracteriza por la abundancia de aminoácidos básicos (Garcia-Bustos, J., et al. 1991. Nuclear protein localization. Biochimica et Biophysica Acta 1071: 83-101).

15 tipos de VPH de alto riesgo (AR) pueden provocar cánceres de cuello uterino, ano, pene, vagina, vulva y orofaringe, entre los cuales el VPH-16 y el v PH-18 son, con diferencia, las causas más comunes de cáncer, representando aproximadamente el 70% de los cánceres de cuello uterino, y los otros tipos de VPH-AR (tipos 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 y 82) causan el resto. El VPH-16 es responsable de aproximadamente el 95% de los cánceres orofaríngeos (CPO) positivos para el VPH. Los genotipos persistentes de bajo riesgo VPH-6 y VPH-11 causan la mayoría de las verrugas anogenitales y los papilomas respiratorios, pero rara vez se asocian a cánceres (Human Papillomavirus in Cervical Cancer and Oropharyngeal Cancer: One Cause, Two Diseases Tara A. Bermanand John T Schiller, PhD2 Cancer 2017;123:2219-29).

La proteína L1 puede expresarse de forma recombinante mediante poxvirus, baculovirus o sistemas de levadura y, a continuación, se autoensambla para formar partículas similares a virus (VLP) que contienen aproximadamente 72 proteínas L1, similares a la cápside del virus. VLP no tiene indicación. La VLP induce anticuerpos neutralizantes en los animales inoculados y protege a los animales experimentales de ataques posteriores por virus infecciosos. Así pues, las VLP parecen ser un excelente candidato para las vacunas contra el virus del papiloma (Estructura de pequeñas partículas similares a virus ensambladas a partir de la proteína L1 del virus del papiloma humano 16 Chen, XS, RL Garcea, Mol. Cell. 5(3):557-567, 2000).

CERVARIX® de Glaxo, una vacuna recombinante bivalente contra el VPH, contiene la proteína L1 recombinante del VPH de tipo 16 y la proteína L1 recombinante del VPH de tipo 18. La proteína L1 se obtiene por expresión de un sistema de vector de expresión de baculovirus recombinante en células de insecto de la polilla nocturna(Trichoplusia ni).La proteína L1 se autoensambla en partículas similares al virus para la prevención del cáncer de cuello de útero, la neoplasia intraepitelial cervical de grado 2 o 3 y el adenocarcinoma in situ causados por los tipos 16 y 18 del VPH, y la neoplasia intraepitelial cervical de grado 1 (oncogénica) en mujeres de 9 a 25 años (https://www.fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/Vaccines/ApprovedProducts/UCM186981.pdf). GARDASIL®es una vacuna recombinante tetravalente contra el virus del papiloma humano (tipos 6, 11, 16 y 18) de Merck para la prevención del cáncer de cuello de útero, las verrugas genitales (condilomas acuminados) y las lesiones anormales precancerosas o proliferativas causadas por los tipos 6, 11, 16 y 18 del VPH en niñas y mujeres de 9 a 26 años; y para la prevención del cáncer anal, las verrugas genitales (condilomas acuminados) y las lesiones precancerosas o proliferativas anormales causadas por los tipos 6, 11, 16 y 18 del VPH en niños y hombres de 9 a 26 años de edad (https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/vaccines/gardasil).

GARDASIL®9 es una vacuna contra el virus del papiloma humano recombinante de nueve valencias de Merck que contiene partículas similares a virus de las proteínas L1 de los tipos de VPH 6, 11, 16, 18, 31, 33, 45, 52 y 58, la proteína L1 se produce por fermentación deSaccharomyces cerevisiaey se autoensambla en VLP. Se utiliza en niñas y mujeres de 9 a 45 años de edad para la prevención del cáncer de cuello uterino, cáncer de vulva, cáncer de vagina y cáncer de ano causados por los tipos de VPH 16, 18, 31, 33, 45, 52 y 58, verrugas genitales (condilomas acuminados) causadas por los tipos de VPH 6 y 11, y anomalías precancerosas o proliferativas causadas por los tipos de VPH 6, 11, 16, 18, 31, 33, 45, 52 y 58; y en niños y hombres de 9 a 45 años de edad para la prevención del cáncer anal causado por los tipos 16, 18, 31, 33, 45, 52 y 58 del VPH, verrugas genitales (condiloma acuminado) causadas por los tipos 6 y 11 del VPH y lesiones precancerosas o anormales del desarrollo causadas por los tipos 6, 11, 16, 18, 31, 33, 45, 52 y 58 del VPH (https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/vaccines/gardasil-9).

Las instrucciones para GARDASIL®9 anunciaron que los tipos 16 y 18 de VPH son la causa de aproximadamente el 70% de los cánceres de cuello uterino, y el 20% restante de los casos se atribuyen a los tipos 31, 33, 45, 52 y 58, por lo que GARDASIL®9 previene el 90% de los cánceres de cuello uterino (https://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/Vaccines/ApprovedProducts/ucm426445.htm).

La producción industrial de partículas similares al virus es fundamental para el desarrollo de la vacuna contra el VPH. Los sistemas comunes para producir partículas similares a virus se clasifican principalmente en el sistema de expresión eucariota y el sistema de expresión procariota.

Los sistemas de expresión eucariotas comúnmente utilizados incluyen sistemas de expresión de poxvirus, sistemas de expresión de baculovirus de insectos y sistemas de expresión de levadura. La proteína L1 del VPH expresada en sistemas de expresión eucarióticos puede ensamblarse espontáneamente en partículas similares a virus, ya que su conformación natural está menos alterada, pero su rendimiento es bajo. La proteína L1 del VPH expresada en sistemas de expresión procariotas, principalmente sistemas de expresión deE. coli,es de alto rendimiento pero principalmente en forma de cuerpos de inclusión, esta forma de proteína no se puede purificar fácilmente, lo que hace que el proceso de producción sea complicado.

Por lo tanto, todavía existe la necesidad de obtener altos rendimientos de partículas similares al virus VPH. El documento US60663254 divulga proteínas L1 modificadas.

Compuesto de la invención

La invención se refiere a aspectos revelados en las reivindicaciones adjuntas.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1A: Expresión de la proteína L1 del VPH 6 L1:33C. M: Marcador; L: lisado celular; ES: sobrenadante recogido después de la centrifugación del lisado.

Figura 1B: Expresión de la proteína L1 del VPH 11 L1:33C. M: Marcador; L: lisado celular; ES: sobrenadante recogido después de la centrifugación del lisado.

Figura 1C: Expresión de la proteína L1 del VPH 16 L1:33C. M: Marcador; L: lisado celular; ES: sobrenadante recogido después de la centrifugación del lisado.

Figura 1D: Expresión de la proteína L1 del VPH 18 L1:33C. M: Marcador; L: lisado celular; ES: sobrenadante recogido después de la centrifugación del lisado.

Figura 1E: Expresión de la proteína L1 del VPH 31 L1:33C. M: Marcador; L: lisado celular; ES: sobrenadante recogido después de la centrifugación del lisado.

Figura 1F: Expresión de la proteína L1 del VPH 35 L1:33C. M: Marcador; L: lisado celular; ES: sobrenadante recogido después de la centrifugación del lisado.

Figura 1G: Expresión de la proteína L1 del VPH 39 L1:59C. M: Marcador; L: lisado celular; ES: sobrenadante recogido después de la centrifugación del lisado.

Figura 1H: Expresión de la proteína L1 del VPH 45 L1:33C. M: Marcador; L: lisado celular; ES: sobrenadante recogido después de la centrifugación del lisado.

Figura 1I: Expresión de la proteína L1 del VPH 51 L1:33C. M: Marcador; L: lisado celular; ES: sobrenadante recogido después de la centrifugación del lisado.

Figura 1J: Expresión de la proteína L1 del VPH 52 L1:33C. M: Marcador; L: lisado celular; ES: sobrenadante recogido después de la centrifugación del lisado.

Figura 1K: Expresión de la proteína L1 del VPH 56 L1:33C. M: Marcador; L: lisado celular; ES: sobrenadante recogido después de la centrifugación del lisado.

Figura 1L: Expresión de la proteína L1 del VPH 58 L1:33C. M: Marcador; L: lisado celular; ES: sobrenadante recogido después de la centrifugación del lisado.

Figura 2A: Microscopía electrónica de transmisión de partículas similares al virus VPH 6 L1: 33C.

Figura 2B: Microscopía electrónica de transmisión de partículas similares al virus VPH 11 L1: 33C.

Figura 2C: Microscopía electrónica de transmisión de partículas similares al virus VPH 16 L1: 33C.

Figura 2D: Microscopía electrónica de transmisión de partículas similares al virus VPH 18 L1: 33C.

Figura 2E: Microscopía electrónica de transmisión de partículas similares al virus VPH 31 L1: 33C.

Figura 2F: Microscopía electrónica de transmisión de partículas similares al virus VPH 35 L1: 33C.

Figura 2G: Microscopía electrónica de transmisión de partículas similares al virus VPH 39 L1: 59C.

Figura 2H: Microscopía electrónica de transmisión de partículas similares al virus VPH 45 L1: 33C.

Figura 2I: Microscopía electrónica de transmisión de partículas similares al virus VPH 51 L1: 33C.

Figura 2J: Microscopía electrónica de transmisión de partículas similares al virus VPH 52 L1: 33C.

Figura 2K: Microscopía electrónica de transmisión de partículas similares al virus VPH 56 L1: 33C.

Figura 2L: Microscopía electrónica de transmisión de partículas similares al virus VPH 58 L1: 33C.

Figura 3: Expresión de VPH 16L1 truncado C-terminal (1-474). M: marcador; L: lisados celulares; E-S: sobrenadante recogido tras la centrifugación de los lisados.

Modalidades específicas

En un aspecto, la presente invención proporciona una proteína quimérica L1 del virus del papiloma humano (VPH) que comprende, desde su orientación N-terminal hasta la C-terminal,

a. un fragmento N-terminal de una proteína L1 de un primer tipo de virus del papiloma humano, donde dicho fragmento N-terminal es un fragmento obtenido truncando el C-terminal-terminal de la secuencia natural de dicha proteína L1 del primer tipo de virus del papiloma humano, y dicho fragmento N-terminal mantiene la inmunogenicidad de la proteína L1 del primer tipo de virus del papiloma humano, y donde dicho primer tipo de virus del papiloma humano se selecciona de los tipos de VPH 6, 11, 16, 18, 31, 35, 39, 45, 51, 52, 56 y 58, y dicho fragmento N-terminal derivado de dicha proteína L1 del primer tipo de virus del papiloma humano se selecciona de la secuencia de SEQ ID No: 1,<s>E<q>ID No: 14,<s>E<q>ID No: 27, SEQ ID No: 4o, SEQ ID No: 53, SEQ ID No: 66, SEQ ID No: 79, SEQ ID No: 92, SEQ ID No: 105, SEQ ID No: 118, SEQ ID No: 131 y SEQ ID No: 144; y

b. un fragmento C-terminal de una proteína L1 de un segundo tipo de virus del papiloma humano, en donde dicho fragmento C-terminal es un fragmento obtenido truncando el N-terminal-terminal de la secuencia natural de dicha proteína L1 del segundo tipo de virus del papiloma humano, dicha proteína L1 del segundo tipo de virus del papiloma humano tiene un mejor nivel de expresión y solubilidad en comparación con las proteínas L1 de otros tipos, y dicho segundo tipo de virus del papiloma humano se selecciona de los tipos de VPH 33 y 59, y dicho fragmento C-terminal derivado de la proteína L1 del segundo tipo de virus del papiloma humano se selecciona de la secuencia de SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 132 y SEQ ID No: 13;

en donde la proteína L1 del virus del papiloma humano quimérico tiene la inmunogenicidad de la proteína L1 del primer tipo de virus del papiloma humano.

En una realización, el C-terminal de dicho fragmento N-terminal está conectado al N-terminal de dicho fragmento C-terminal directamente o mediante un enlazador.

El enlazador no afecta la inmunogenicidad de dicho fragmento N-terminal y no afecta el nivel de expresión o solubilidad de la proteína. En una realización, dicho fragmento N-terminal y dicho fragmento C-terminal están conectados a través de un enlazador que comprende 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos. En una realización, el enlazador es una secuencia artificial. En otra realización, el enlazador es una secuencia que ocurre de forma natural en la proteína L1 del VPH. En otra realización, el enlazador puede ser una secuencia parcial de la proteína L1 del VPH tipo 33. En otra realización, el enlazador puede ser una secuencia parcial de la proteína L1 del VPH tipo 59.

En una realización, dentro del rango de más o menos 4 posiciones de aminoácidos del punto de conexión cuando el C-terminal de dicho fragmento N-terminal está conectado al N-terminal de dicho fragmento C-terminal, se presenta la siguiente secuencia continua de aminoácidos: RKFL; preferiblemente, dentro del rango de más o menos 6 posiciones de aminoácidos del punto de conexión, se presenta la siguiente secuencia continua de aminoácidos: LGRKFL.

En un aspecto, la presente invención proporciona una partícula similar al virus del papiloma, que comprende una proteína L1 del virus del papiloma quimérico como se describió anteriormente. En una realización, la partícula similar al virus del papiloma es la partícula similar al virus VPH, y en una realización, la partícula similar al virus VPH es el icosaedro que comprende 72 pentámeros de dicha proteína L1 de VPH quimérica. En una realización, la partícula similar al virus VPH ha formado correctamente enlaces disulfuro y, por lo tanto, tiene una buena conformación natural. En una realización, las partículas similares al virus VPH se autoensamblan en un sistema de expresiónin vivo.

En un aspecto, la presente invención proporciona una composición inmunogénica para la prevención de enfermedades o infecciones relacionadas con el virus del papiloma, que comprende partículas similares al virus del papiloma y adyuvantes como se describió anteriormente. Dicha prevención puede considerarse como un tratamiento y pueden utilizarse indistintamente.

En un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica una proteína L1 del virus del papiloma quimérico como se ha descrito previamente. En una realización, el polinucleótido es un polinucleótido optimizado en codones para variedades de sistemas de expresión. En una realización, el polinucleótido es un polinucleótido optimizado en codones para un sistema de expresión de baculovirus de insectos.

En un aspecto, la presente invención proporciona un vector, que comprende un polinucleótido como se describió previamente. En una realización, el vector es un vector de baculovirus. En una realización, el vector puede ser un vector de transferencia para un sistema de expresión de baculovirus. En otra realización, el vector puede ser un vector de expresión para un sistema de expresión de baculovirus. En otra realización, el vector puede ser un vector recombinante para el sistema de expresión de baculovirus.

En un aspecto, la presente invención proporciona un vector, que comprende un polinucleótido como se describió previamente.

En un aspecto, la presente invención proporciona una célula huésped, que comprende el polinucleótido, el vector o el baculovirus como se ha descrito anteriormente. En una realización, la célula huésped es una célula de insecto, preferiblemente, dicha célula de insecto se selecciona entre células Sf9, células Sf21, células Hi5 y células S2.

En un aspecto, la presente invención proporciona un método para preparar partículas similares al virus del papiloma como se describió previamente, que comprende: cultivar las células huésped como se describió previamente para expresar dichas proteínas L1 del virus del papiloma quimérico que se ensamblan en partículas similares al virus; y purificar dichas partículas similares al virus del papiloma.

En una realización, las células huésped son células de insecto. En una realización, las células huésped son células Hi5. En una realización, las proteínas L1 de papiloma quimérico son proteínas L1 de VPH quiméricas que se autoensamblan en partículas similares al virus VPH en las células huésped. En una realización, las proteínas quiméricas VPH L1 se autoensamblan en partículas similares al virus VPH en células huésped que tienen un icosaedro que comprende 72 pentámeros de dichas proteínas quiméricas VPH L1. En una realización, las partículas similares al virus VPH tienen enlaces disulfuro correctamente formados y, por lo tanto, tienen una buena conformación natural.

En una realización, la purificación se lleva a cabo utilizando cromatografía de intercambio catiónico. En una realización, la purificación se lleva a cabo mediante cromatografía de intercambio catiónico fuerte. En otra realización, la purificación se lleva a cabo mediante cromatografía de intercambio catiónico débil. En una realización, la purificación se lleva a cabo utilizando una combinación de cromatografía de intercambio catiónico múltiple. En una realización, la purificación se lleva a cabo mediante cromatografía de intercambio catiónico fuerte HS. En otra realización, la purificación se lleva a cabo mediante cromatografía de intercambio iónico MMA. En otra realización, la purificación se realiza utilizando cromatografía de dos pasos HS-MMA.

Las proteínas L1 del papilomavirus expresadas mediante sistemas de expresión eucarióticos pueden ensamblarse espontáneamente en partículas similares a virus, pero su bajo nivel de expresión hace que no sean adecuadas para la producción masiva.

Las secuencias de las proteínas L1 de cada tipo de VPH pueden obtenerse fácilmente de https://www.uniprot.org.Para un tipo de VPH dado, la proteína L1 puede derivar de diferentes cepas, por lo que la secuencia de aminoácidos de la misma puede tener múltiples versiones, cualquier versión de la secuencia natural puede utilizarse en la presente invención. Es posible que la secuencia de la proteína L1 de VPH de un tipo determinado utilizada durante la concepción y diseño de la presente invención pueda diferir de la secuencia utilizada en los siguientes ejemplos, pero dichas diferencias no afectan las decisiones y conclusiones de los inventores.

Los expertos en la materia aceptan generalmente que el C-terminal de la proteína L1 no contiene un epítopo antigénico neutralizante principal y, por lo tanto, se han realizado intentos para aumentar la expresión truncando el C-terminal de la proteína L1 de VPH, por ejemplo, la patente de EE. UU de Glaxo US6361778B1, en la que el C-terminal de la proteína L1 de VPH16 está truncado por 1-34 aminoácidos, preferiblemente 26 aminoácidos, establece que el rendimiento de VLP aumenta muchas veces, preferiblemente al menos 10 veces, y en particular aproximadamente entre 10 y 100 veces. Inspirados por esto, los inventores intentaron truncar el C-terminal de la proteína VPH 16 L1 en 31 aminoácidos y denominaron a la proteína truncada VPH 16 L1 (1-474). La proteína tiene un alto nivel de expresión pero poca solubilidad y es difícil de extraer y purificar (ver ejemplo comparativo).

La poca solubilidad de la proteína debido a este truncamiento puede deberse a la eliminación de la secuencia de localización nuclear ubicada en el C-terminal, pero la presente invención no es vinculante a esta especulación. Durante la investigación y la producción, el inventor descubrió que la proteína L1 de VPH tipo 16, la proteína L1 de VPH tipo 28, la proteína L1 de VPH tipo 33, la proteína L1 de VPH tipo 59 y la proteína L1 de VPH tipo 68 tienen mejores niveles de expresión y solubilidad que otras proteínas L1 de v Ph . Inspirados por el descubrimiento, los inventores reemplazaron el C-terminal de las proteínas L1 de tipos específicos de VPH que son menos extraíbles o menos solubles por el C-terminal de la proteína L1 de tipos específicos de VPH que tiene mejores niveles de expresión y solubilidad. Es decir, los inventores han construido una proteína quimérica: que comprende, en la orientación N-terminal a C-terminal, un fragmento N-terminal derivado de la proteína L1 del primer tipo de virus del papiloma (por ejemplo, la proteína L1 del VPH), que proporciona la inmunogenicidad del primer tipo de virus del papiloma (por ejemplo, el VPH), y un fragmento C-terminal derivado de la proteína L1 del segundo tipo de virus del papiloma (por ejemplo, la proteína L1 del VPH), que proporciona las características de mejores niveles de expresión y solubilidad. Estos dos fragmentos se pueden conectar directamente o mediante un enlazador.

Se determina la longitud del fragmento N-terminal de la proteína L1 del VPH apropiado para mantener la inmunogenicidad de la proteína L1 del primer tipo de VPH y asegurar la formación de VLP Los siguientes informes se relacionan con estudios de epítopos de tipos comunes de VPH.

Sunanda Baidya y otros. informaron que los epítopos de la proteína L1 48EEYDLQFIFQLCKITLTA65, 45RHGEEYDLQFIFQLCKITLTA65, 63LPDPNKF69, 79PETQRLVWAC88, 36PVPGQYDA43, 77YNPETQRLVWAC88, 188DTGYGAMD195, 36PVPGQYDATK45, 45KQDIPKVSAYQYRVFRV61, 130RDNVSVDYKQTQLCI144 y 49YSRHVEEYDLQFIF62 se pueden utilizar como herramientas para diseñar vacunas contra el VPH 16 y 18 (véase Diseño de epítopos de la proteína L1 para la producción de vacunas contra el virus del papiloma humano tipos 16 y 18,Bioinformation 13(3): 86-93 marzo de 2017).

Katharina Slupetzky et al. informaron que las regiones cerca de los aa 282-286 y 351-355 de VPH-16 contribuyen a los epítopos de neutralización y que este último es el sitio inmunodominante (ver Partículas similares al virus del papiloma quimérico que expresan un epítope extraño en los bucles de la superficie de la cápside,Journal of General Virology (2001), 82, 2799-2804).

Brooke Bishop et al. prepararon las siguientes tres variantes de las proteínas L1 de VPH 11, 16, 18 y 35: eliminación de 9 aminoácidos en su N-terminal, eliminación de a4 (que corresponde a los residuos de aminoácidos 404-436 de VPH 16) y eliminación de 31 aminoácidos en su C-terminal respectivamente, e informaron que las dos primeras no se pudieron ensamblar en VLP, pero este fenómeno no se ha informado en la última (Crystal Structures of Four Types of Human Papillomavirus L1 Capsid ProteinsUNDERSTANDING THE SPECIFICITY OF NEUTRALIZING MONOCLONAL ANTIBODIES, The Journal of Biological Chemistry, 282, 31803-31811). Cada una de las hélices a, las láminas de pliegues p y la región de bucle de cada tipo de proteína L1 de VPH se pueden determinar convenientemente mediante un software de análisis de secuencias comúnmente utilizado en el campo. En donde las regiones de hélice a contienen la Región a1, la Región a2, la Región a3, la Región a4 y la Región a5.

Los inventores realizaron alineaciones de secuencias de proteínas L1 de 14 tipos de VPH (tipos 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58 y 59) y luego realizaron una predicción de estructura secundaria de acuerdo con la bibliografía citada anteriormente (Crystal Structures of Four Types of Human Papillomavirus L1 Capsid Proteins UNDERSTANDING THE SPECIFICITY OF NEUTRALIZING MONOCLONAL ANTIBODIES, The Journal of Biological Chemistry, 282,31803-31811), cuyos resultados se muestran a continuación, donde la parte entre las flechas que apuntan hacia abajo corresponde a las regiones que se habían eliminado para preparar las variantes en esa bibliografía.

H H H H H M H H M H H H H H

H H H H H M H H H I H H H H

H H H H H H H I H H H H H

H

Además de los métodos utilizados por los inventores para alineaciones de secuencias, el software de predicción de estructura secundaria de proteínas que se puede utilizar para la predicción incluye, pero no se limita a: 1. JPred: http://www.compbio.dundee.ac.uk/jpred/index.html

2. ProtPredicct: http://predictprotein.org

3. PsiPred: http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred

4. SCRATCH-1D: http://download.igb.uci.edu

5. Nnpredict: http://www.cmpharm.ucsf.edu/~nomi/nnpredict

6. Predictprotein: http://www.embl-heidelberg.de/predictprotein/SOPMA http://www.ibcp.fr/predict.html 7. SSPRED: http://www.embl-heidelberg.de/sspred/ssprd_info.html.

En un aspecto de la divulgación, los inventores determinan la longitud del fragmento N-terminal de la proteína L1 de VPH derivada del primer tipo de la siguiente manera: la secuencia natural de la proteína L1 se trunca dentro de su región a5 y regiones cercanas a la misma, y se conserva la secuencia desde su N-terminal hasta el C-terminal recién generado dentro de la región a5. Una secuencia truncada de este tipo garantiza que tenga la inmunogenicidad del primer tipo y sea capaz de formar VLP.

El fragmento N-terminal de la proteína L1 de VPH derivado del primer tipo puede modificarse aún más siempre que conserve la inmunogenicidad del primer tipo y sea capaz de formar v Lp.

La longitud del fragmento C-terminal de la proteína L1 del VPH derivada del segundo tipo se determina de la siguiente manera: La secuencia natural de la proteína L1 se trunca dentro de su región a5 y regiones cercanas de la misma, luego se conserva la secuencia desde el N-terminal recién generado dentro de su región a5 hasta el C-terminal. Esta secuencia truncada no tiene el principal epítopo antigénico neutralizante, por lo que no interfiere con la inmunogenicidad de la proteína quimérica resultante.

El fragmento C-terminal de la proteína VPH L1 derivada del segundo tipo puede mutarse, suprimirse y/o añadirse adicionalmente, conservando preferiblementeal menos una de sus secuencias de localización nuclear. Yang et al. predijeron las secuencias de localización nuclear de 107 subtipos de VPH (Yang et al. Predicción de las señales de localización nuclear de 107 tipos de proteínas L1 de VPH mediante análisis bioinformático. Geno. Prot. Bioinfo. Vol. 4 No. 12006). Las secuencias de localización nuclear de cada tipo de proteína L1 del VPH pueden determinarse convenientemente mediante programas informáticos de análisis de secuencias utilizados habitualmente en este campo.

La conexión descrita anteriormente del fragmento N-terminal con el fragmento C-terminal ocurre en el C-terminal recién generado del primero y en el N-terminal recién generado del último. Esta puede ser una conexión directa o una conexión a través de un enlazador. El lugar donde se produce la conexión se define como la coordenada de origen, el lado N-terminal del origen se considera menos mientras que el lado C-terminal se considera más.

A continuación se muestra la secuencia de los aminoácidos 453-469 de la proteína L1 de VPH6 y las secuencias correspondientes de las proteínas L1 de otros tipos de VPH. Estas secuencias se superponen con su región a5 respectivamente. Se puede ver que estas secuencias son muy similares. Los números entre paréntesis indican las posiciones del último residuo de aminoácido de las secuencias enumeradas, donde para el VPH Tipo 45, hay 26 aminoácidos adicionales presentes en el N-terminal de la proteína L1 de algunas cepas del v Ph Tipo 45, mientras que en el N-terminal de la proteína L1 de otras cepas del VPH Tipo 45, dichos 26 aminoácidos adicionales no están presentes, por lo tanto, el número se indica como (478)+26.

VPH6 ELDQYPLGRKFLLQSGY(469)

VPH11 ELDQFPLGRKFLLQSGY(470)

VPH16 DLDQFPLGRKFLLQAGL(474)

VPH18 DLDQYPLGRKFLVQAGL(475)

VPH31 DLDQFPLGRKFLLQAGY(475)

VPH35 DLDQFPLGRKFLLQAGL(472)

VPH39 ELDQFPLGRKFLLQARV (474)

VPH45 DLDQYPLGRKFLVQAGL(478)+26

VPH51 DLDQFALGRKFLLQVGV(474)

VPH52 DLDQFPLGRKFLLQAGL(478)

VPH56 DLDQFPLGRKFLMQLGTRS(474)

VPH58 DLDQFPLGRKFLLQSGL(473)

VPH33 DLDQFPLGRKFLLQAGL(473) KAKPKLKRAAPTSTRTSSAKRKKVKK en donde KR en las posiciones 480-481 y KRKK en las posiciones 493-496 son secuencias de localización nuclear.

VPH59 DLDQFPLGRKFLLQLGA(475) RPKPTIGPRKRAAPAPTSTPSPKRVKRRKSSRK en donde RKR en las posiciones 484-486 y KRVKRRK en las posiciones 498-504 son secuencias de localización nuclear.

En un aspecto divulgado en este documento, los inventores han completado sustituciones del C-terminal de las proteínas L1 entre diferentes tipos de VPH aprovechando la similitud de secuencia de la región a5 y las regiones cercanas entre los tipos de VPH.

En un aspecto preferido, los inventores han observado que la proteína L1 de cada tipo de VPH tiene un tetrapéptido RKFl o, más ventajosamente, un hexapéptido LGRKFL, en una posición similar. Los inventores han explotado hábilmente esta secuencia altamente conservada para localizar el punto de conexión de la proteína quimérica en cualquier posición de aminoácido dentro de este oligopéptido. Por un lado, la secuencia que parte del N-terminal de la proteína quimérica hasta RKFL o LGRKFL es idéntica a la secuencia del fragmento N-terminal derivado de la proteína L1 del primer tipo de VPH, mientras que, por otro lado, la secuencia que parte de RKFL o LGRKFL hasta el C-terminal de la proteína quimérica es idéntica a la secuencia del fragmento C-terminal derivado de la proteína L1 del segundo tipo.

La proteína quimérica así producida mantiene un alto grado de similitud con la proteína L1 de VPH natural, y se puede esperar que tenga un buen desempeño en la producción e incluso en procedimientos médicos o profilácticos posteriores.

Será comprensible para los expertos en la materia que existen diferentes cepas con diferentes secuencias naturales de un tipo de VPH dado, las proteínas quiméricas construidas utilizando diferentes cepas también entran dentro del alcance de la presente invención.

Será comprensible para los expertos en la materia que debido al alto grado de similitud entre la proteína L1 de diferentes tipos de VPH, si, durante la construcción de las proteínas quiméricas, el fragmento N-terminal derivado de la proteína L1 del primer tipo de VPH se extiende por más residuos de aminoácidos hacia el C-terminal, o el fragmento C-terminal derivado de la proteína L1 del segundo tipo de VPH se extiende por más residuos de aminoácidos hacia el N-terminal, también es posible formar proteínas quiméricas que sean estructuralmente idénticas a la presente invención debido a aminoácidos idénticos o similares en los sitios correspondientes. Las proteínas quiméricas así formadas también quedan dentro del ámbito de la presente invención.

Será comprensible para aquellos expertos en la materia que sobre la base de las proteínas quiméricas de las realizaciones descritas anteriormente, se pueden formar variantes de las proteínas quiméricas mediante mutaciones, deleciones y/o adiciones de residuos de aminoácidos. Es probable que estas variantes tengan la inmunogenicidad de la proteína L1 del primer tipo de VPH, puedan formar VLP y tengan un buen rendimiento y solubilidad. Las proteínas quiméricas así formadas también entran dentro del ámbito de la presente invención.

Los efectos beneficiosos de la invención

Los sistemas de expresión utilizados habitualmente para producir partículas similares a virus se clasifican en sistemas de expresión eucariótica y sistemas de expresión procariótica. Las proteínas L del virus del papiloma expresadas por los sistemas de expresión eucariótica pueden ensamblarse espontáneamente en partículas similares a las virales, pero tienen la desventaja de su bajo nivel de expresión, por lo que no son adecuadas para la producción en masa. La proteína L del virus del papiloma expresada por el sistema de expresión procariota requiere procesamientoin vitropara obtener partículas similares al virus debido a que a menudo se destruye su conformación natural y tiene un bajo rendimiento, lo que dificulta su uso en la industrialización.

La presente invención modifica el C-terminal de la proteína L del virus del papiloma (por ejemplo, virus del papiloma humano), por ejemplo sustituyéndolo por el fragmento C-terminal de la proteína L1 del VPH tipo 16, la proteína L1 del<v>P<h>tipo 28, la proteína L1 del VPH tipo 33, la proteína L1 del VPH tipo 59 o la proteína L1 del VPH tipo 68, por lo que puede utilizarse en sistemas de expresión (por ejemplo, células huésped, por ejemplo células de insecto) para mejorar el nivel de expresión y la solubilidad de la proteína L del virus del papiloma en sistemas de expresión (por ejemplo, células huésped, por ejemplo células de insecto). Esto se puede utilizar para la producción en masa de vacunas, como la vacuna contra el VPH.

Los inventores encontraron que la proteína L1 del VPH tipo 16, la proteína L1 del VPH tipo 28, la proteína L1 del VPH tipo 33, la proteína L1 del VPH tipo 59 y la proteína L1 del VPH tipo 68 tienen un mayor nivel de expresión y una mayor solubilidad en comparación con las proteínas L1 de otros tipos de VPH, y se encontró que dicho mayor nivel de expresión de la proteína y mayor solubilidad dependen de la secuencia C-terminal de dicha proteína L1 del VPH. Entre las 107 proteínas VPH tipo L1, la mayoría de ellas tienen secuencias de localización nuclear en los extremos C, y las secuencias C-terminales tienen algunas similitudes.

Para las proteínas L del virus del papiloma que actualmente son inexpresables, de muy bajo nivel de expresión o insolubles tras la expresión, la sustitución de sus fragmentos C-terminales por fragmentos C-terminales de la proteína L1 del VPH tipo 16, de la proteína L1 del VPH tipo 28, de la proteína L1 del VPH tipo 33, de la proteína L1 del VPH tipo 59 o de la proteína L1 del VPH tipo 68 hace posible su expresión soluble y posterior purificación. Esta estrategia se puede utilizar para la producción masiva de vacunas polivalentes (por ejemplo, vacunas contra el VPH), lo que permite proporcionar una protección más completa contra una amplia gama de infecciones por el virus del papiloma, especialmente el VPH.

Es necesario aumentar el nivel de expresión y la solubilidad de la proteína L1 de VPH en células de insectos con fines de producción en masa. Además, las partículas similares a virus ensambladas por la proteína L del VPH carecen de una buena conformación en las células de levadura debido a la imposibilidad de formar enlaces disulfuro correctos.

En el caso de las proteínas L1 del VPH que se expresan mal y son insolubles en células de insecto, se puede conseguir un aumento significativo del nivel de expresión y de la solubilidad tras la modificación de su fragmento C-terminal en el fragmento C-terminal de la proteína L1 del VPH tipo 33 o 59, por lo que se podrían utilizar para la producción masiva de vacunas contra el VPH.

En el caso de las proteínas L1 del VPH que se expresan mejor y son más solubles en células de insecto en comparación con las proteínas L1 de otros tipos de VPH, como la proteína del VPH tipo 16, la proteína L1 del VPH tipo 28, la proteína L1 del VPH tipo 68, etc., es necesario seguir mejorando el nivel de expresión y la solubilidad para lograr la producción masiva de vacunas. En la presente invención, por ejemplo, después de modificar el fragmento C-terminal de la proteína L1 del VPH tipo 16 al fragmento C-terminal de la proteína L1 del VPH tipo 33, se mejoran el nivel de expresión y la solubilidad de la proteína quimérica modificada del VPH tipo 16, lo que favorece la producción en masa de vacunas contra el v Ph .

En resumen, las proteínas VPH L1 quiméricas mostraron un nivel de expresión y solubilidad mucho mayor en células de insectos en comparación con la proteína VPH L1 no modificada. Puede utilizarse para la producción masiva de vacunas contra el VPH. Además, las proteínas quiméricas VPH L1 pueden formar correctamente enlaces disulfuro y así ensamblarse en partículas similares al virus VPH con buenas conformaciones en células de insectos. Esto puede mejorar la inmunogenicidad de las partículas similares al virus del VPH y desencadenar mejores respuestas inmunes.

Definición

A menos que se indique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el significado normalmente entendido por una persona con conocimientos ordinarios en la materia a la que pertenece la invención. Para facilitar la comprensión de la presente invención, se citan a continuación los siguientes términos por su significado ordinario.

Cuando se utilizan en este documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un/un", "otro" y "dijo/el" incluyen las designaciones plurales de los objetos a menos que el contexto indique claramente lo contrario. A menos que se indique expresamente lo contrario, los términos "incluir/comprender/tener", "por ejemplo", etc. tienen como objetivo transmitir inclusión en lugar de limitación.

El término "inmunogenicidad" se refiere a la capacidad de una sustancia, por ejemplo una proteína o un péptido, de desencadenar una respuesta inmune, es decir, la capacidad de desencadenar la producción de anticuerpos, en particular la capacidad de desencadenar una respuesta humoral o mediada por células.

El término "anticuerpo" se refiere a una molécula de inmunoglobulina que se une a un antígeno. Los anticuerpos pueden ser mezclas policlonales o monoclonales. Pueden ser inmunoglobulinas intactas de origen natural o recombinante, o porciones inmunorreactivas de inmunoglobulinas intactas. Los anticuerpos pueden estar presentes en una variedad de formas, incluyendo, por ejemplo, Fv, Fab', F(ab')2 y como cadenas simples.

El término "antigenicidad" se refiere a la capacidad de una sustancia, por ejemplo una proteína o un péptido, de desencadenar la producción de anticuerpos que se unen específicamente a ella.

El término "epítopo" incluye cualquier grupo determinante de proteína que se une específicamente a un anticuerpo o receptor de células T Los determinantes epitópicos suelen consistir en grupos superficiales químicamente activos (por ejemplo, aminoácidos o cadenas laterales de azúcar, o combinaciones de los mismos) de la molécula y suelen tener características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas.

Los términos "subtipo" o "tipo" se utilizan indistintamente en este documento para referirse a la variante genética del virus que permite que el sistema inmunológico lo reconozca como un antígeno distinto de un tipo a otro. Por ejemplo, el VPH 16 es inmunológicamente diferenciable del VPH 33.

El término "proteína L1 del VPH", tal como se utiliza en el presente documento, el término "VPH" y "virus del papiloma humano" se refieren a virus de ADN bicatenario sin envoltura de la familia del virus del papiloma. Sus genomas son circulares y de tamaño aproximado de 8 kilopares de bases. La mayoría de los VPH codifican ocho proteínas principales, seis en la región "temprana" (E1-E2) y dos en la región "tardía" (L1 (proteína de la cápside principal) y L2 (proteína de la cápside menor)). Se han identificado más de 120 tipos de VPH y están etiquetados con números (por ejemplo, VPH-16, VPH-18, etc.).

El término "VPH" o "virus VPH" se refiere a los virus del papiloma de la familiaPapillomaviridae,que son virus de ADN sin envoltura con un genoma de ADN circular cerrado bicatenario de aproximadamente 8 kb de tamaño que generalmente se clasifica en tres regiones: (i) la región temprana (E), que contiene seis marcos de lectura abiertos E1, E2, E4-E7, que codifican proteínas no estructurales relacionadas con la replicación, transcripción y transformación viral, así como marcos de lectura abiertos E3 y E8; (ii) la región tardía (L), que contiene marcos de lectura que codifican la proteína de la cápside principal L1 y la proteína de la cápside menor L2; y (iii) la región reguladora larga (LCR), que no codifica ninguna proteína pero tiene el origen de replicación y múltiples sitios de unión de factores de transcripción.

Los términos "proteína L1 del VPH" y "proteína L2 del VPH" se refieren a proteínas codificadas por la región tardía (L) del gen del VPH y sintetizadas tarde en el ciclo de infección del VPH. La proteína L2 es la proteína menor de la cápside. Los pentámeros L1 72 forman la cubierta exterior de las partículas icosaédricas del VPH, que encierra el microcromosoma circular cerrado de ADN de doble cadena.

El término "partícula similar a un virus" se refiere a una partícula hueca que contiene una o pluralidad de proteínas estructurales de un virus, sin ácidos nucleicos virales.

El "pseudovirus del VPH" es un modelo ideal para la neutralizaciónin vitrodel VPH, aprovechando la propiedad de encapsulación inespecífica del ácido nucleico de la VLP del VPH, se forma el pseudoviru del VPH envolviendo ADN libre o introduciendo un plásmido exógeno en una VLP compuesta por VPH L1 y L2 expresados intracelularmente.

El "ensayo de neutralización de pseudovirus" es un método para evaluar la actividad neutralizante de los anticuerpos. Tras la incubación de suero animal inmunizado con una determinada cantidad de pseudovirus y la posterior infección de las células, la cantidad de éstas disminuye cuando aumentan los anticuerpos neutralizantes del suero, mostrando una correlación lineal negativa en un determinado intervalo. Por lo tanto, la actividad neutralizante de los anticuerpos en el suero se puede evaluar midiendo los cambios en las cantidades de células.

El término "fragmento del mismo" o "variante del mismo" se refiere a una deleción, inserción y/o sustitución de una secuencia de nucleótidos o aminoácidos de la presente invención. Preferiblemente, el fragmento o variante del polipéptido proporcionado por la presente invención es capaz de desencadenar la respuesta inmune humoral y/o celular en animales o humanos.

El término "quimérico" significa que las secuencias de polipéptidos o nucleótidos derivados de diferentes moléculas parentales están conectadas entre sí por enlaces -CO-NH- o 3', 5'-fosfodiéster, respectivamente. Preferiblemente, no están espaciados por secuencias de enlace adicionales, sino que están directamente adyacentes entre sí.

El término "truncamiento" se refiere a la eliminación de uno o varios aminoácidos del N-terminal y/o C de un polipéptido o la eliminación de uno o varios aminoácidos del interior de un polipéptido.

El término "secuencia de localización nuclear" se refiere a una secuencia de aminoácidos que dirige la proteína al núcleo. En algunas proteínas L1 de VPH, dos grupos apretados de residuos básicos (es decir, secuencias de localización nuclear) (por ejemplo, uno es KRKR, Kr KK, KRKRK, KRKKRK, KRVKRr K, etc. y el otro es KR, RKR, KRK, etc.) tienen una región espaciadora de 10-14 aminoácidos entre ellos. Los grupos de residuos básicos anteriores pertenecen a secuencias de localización nuclear. En algunas otras proteínas L1 del VPH, la secuencia de localización nuclear es un grupo compacto de residuos básicos formados por argininas y/o lisinas. Las secuencias de localización nuclear incluyen, entre otros, ejemplos de grupos de residuos básicos como los descritos anteriormente. Véase Jun Yang et al, Predicting the Nuclear Localization Signals of 107 Types of VPH L1 Proteins by Bioinformatic Analysis, Genomics, Proteomics & Bioinformatics, volumen 4, número 1, 2006, páginas 34-41.

El término "variante funcional" se refiere a una versión de un polipéptido o una proteína que conserva las actividades o características deseadas después del truncamiento, mutación, eliminación y/o adición.

La "identidad de secuencia" entre dos secuencias de polipéptidos o ácidos nucleicos indica el número de residuos idénticos entre dichas secuencias como porcentaje del número total de residuos, y se calcula en función del tamaño de la menor de las moléculas comparadas. Al calcular el porcentaje de identidad, las secuencias que se comparan se emparejan de forma que se produzca la máxima coincidencia entre las secuencias, y las posiciones vacantes (si las hay) en la coincidencia se resuelven mediante un algoritmo específico. Los métodos de programas informáticos preferidos para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, entre otros, paquetes de programas GCG que incluyen GAP, BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410). Los programas mencionados anteriormente están disponibles públicamente en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) y otras fuentes. También se puede utilizar el conocido algoritmo de Smith Waterman para determinar la identidad.

Los aminoácidos no críticos pueden sustituirse de forma conservadora sin afectar la función normal de la proteína. La sustitución conservadora significa reemplazar aminoácidos con aminoácidos química o funcionalmente similares. Las tablas de sustituciones conservadoras que proporcionan aminoácidos similares son bien conocidas en la técnica. A modo de ejemplo, en algunas realizaciones, los grupos de aminoácidos proporcionados en las Tablas 1-3 se consideran sustituciones conservativas entre sí.

Tabla 1 En algunas realizaciones, los grupos seleccionados de aminoácidos que se consideran sustituciones conservadoras entre sí

Tabla 2 En algunas realizaciones, los grupos seleccionados de aminoácidos que se consideran sustituciones conservadoras entre sí

Tabla 3 En algunas realizaciones, los grupos seleccionados de aminoácidos que se consideransustituciones conservadoras entre sí

El término "aminoácidos" se refiere a los veinte aminoácidos comunes que se encuentran en la naturaleza. Los aminoácidos naturales incluyen alanina (Ala; A), arginina (Arg; R), asparagina (Asn; N), ácido aspártico (Asp; D), cisteína (Cys; C), ácido glutámico (Glu; E), glutamina (Gln; Q), glicina (Gly; G), histidina (His; H), isoleucina (Ile; I), leucina (Leu; L), lisina (Lys; K), metionina (Met; M), fenilalanina (Phe; F), prolina (Pro; P), serina (Ser; S), treonina (Thr; T), triptófano (Trp; W), tirosina (Tyr; Y) y valina (Val; V).

El término "adyuvante" se refiere a un compuesto o mezcla que mejora las respuestas inmunes. En particular, una vacuna puede comprender un adyuvante. Los adyuvantes para su uso en la presente invención pueden incluir, entre otros, uno o varios de los siguientes: composiciones adyuvantes que contienen minerales, adyuvantes de emulsión oleosa, formulaciones adyuvantes de saponina, derivados de bacterias o microbios. El término “vector” se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de proliferar otro ácido nucleico conectado a ella. El término incluye vectores como estructuras de ácido nucleico autorreplicantes y como vectores integrados en el genoma de células huésped en las que se ha introducido el vector. Ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de ácidos nucleicos a los que dichos vectores están operativamente conectados. El término "célula huésped" se refiere a una célula en la que se ha introducido un ácido nucleico exógeno, así como a la progenie de dicha célula. Las células hospedadoras incluyen "transformantes" (o "células transformadas"), "transfectantes" (o "células transfectadas") o "infectantes" (o "células infectadas"), cada uno de los cuales incluye células primarias transformadas, transfectadas o infectadas y la progenie derivada de ellas. Dicha progenie puede no ser idéntica a las células parentales en términos de contenido de ácido nucleico y puede contener mutaciones.

La cantidad de administración es preferiblemente una "cantidad profilácticamente efectiva" (en este contexto, la profilaxis puede considerarse como tratamiento y los dos pueden usarse indistintamente), que es suficiente para mostrar beneficios para el individuo.

Ejemplos

Ejemplo 1 Construcción de genes quiméricos

Ejemplo 1.1: Construcción de un gen quimérico con el C-terminal de VPH6 L1 sustituido por el C-terminal de VPH33 L1

1.1.1 Construcción de pFB-VPH6 L1 como plantilla

El gen VPH6 L1 con los sitios de corte KpnI y XbaI en ambos extremos de las secuencias sintetizadas fue sintetizado por Thermo Fisher [anteriormente Invitrogen (Shanghai) Trading Co.], su secuencia se muestra en SEQ ID NO: 5. El plásmido pcDNA3-VPH6-L1 que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el aminoácido 1-500 de VPH6 L1 se obtuvo ligando el fragmento de gen sintetizado con el vector pcDNA3 (distribuidor: Thermo Fisher) en los sitios de corte KpnI y XbaI.

El plásmido pcDNA3-VPH6-L1 obtenido se sometió a una doble digestión enzimática con KpnI y XbaI para obtener un fragmento de gen de VPH6 L1 (1-500). A continuación, el fragmento se ligó con el vector pFastBac™1 de doble digestión KpnI / XbaI (distribuidor: Thermo Fisher) para obtener un vector varilla que contiene el fragmento del gen VPH6 L1 (1-500), denominado pFB-VPH6 L1.

1.1.2 Construcción de pFB-VPH33 L1 como plantilla

El gen VPH33 L1 con los sitios de corte Kpn I y XbaI en ambos extremos de las secuencias sintetizadas fue sintetizado por Thermo Fisher [anteriormente Invitrogen (Shanghai) Trading Co.), su secuencia se muestra como SEQ ID NO: 6. El plásmido pcDNA3-VPH33-L1 que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 1-499 de VPH33 L1 se obtuvo ligando el fragmento de gen sintetizado con el vector pcDNA3 (distribuidor: Thermo Fisher) en los sitios de escisión Kpn I y XbaI.

El plásmido pcDNA3-VPH33-L1 se sometió a una doble digestión enzimática con Kpnl y Xbal para obtener un fragmento del gen VPH33 L1 (1-499). A continuación, el fragmento se ligó al vector pFastBac™1 con doble digestión KpnI y XbaI (distribuidor: Thermo Fisher) para obtener un vector varilla que contiene el fragmento del gen VPH33 L1 (1-499), denominado pFB-VPH33 L1.

1.1.3 Construcción de pFB-VPH6 L1: 33C

Gen quimérico con el C-terminal de VPH6 L1 sustituido por el C-terminal de VPH33 L1: el plásmido recombinante construido pFB-VPH6 L1 se utilizó como molde del gen para amplificar un fragmento del gen de 1426 pb utilizando los cebadores F1 y R1, la secuencia del cebador F1 se muestra en SEQ ID No: 7 y R1 se muestra en SEQ ID No: 8.

Este fragmento de gen contiene un fragmento que codifica los aminoácidos 1-469 de VPH6 L1, 10 bases que se solapan con el fragmento de gen que codifica los aminoácidos 474-499 de VPH33 L1, y un fragmento del sitio de digestión KpnI (GGTACAC), la secuencia amplificada se muestra en SEQ ID No: 9.

Parámetros de amplificación PCR: pre-desnaturalización a 94°C durante 5min; desnaturalización a 98°C durante 10 s, recocido a 69°C durante 15 s, 1 kb/1 min a 72°C, durante 30 ciclos; extensión a 72°C durante 5 min; final a 16°C.

El plásmido recombinante pFB-VPH33 L1 se utilizó como molde del gen para amplificar un fragmento del gen de 101 pb de longitud utilizando los cebadores F2 y R2, la secuencia del cebador F2 se muestra en la SEQ ID No: 10 y la secuencia del cebador R2 se muestra en la SEQ ID No: 11.

Este fragmento de gen contiene un fragmento de gen que codifica 26 aminoácidos C-terminales (474-499) de VPH33 L1, una base de 10 pb solapada con el fragmento de gen que codifica el C-terminal de los aminoácidos 1-469 de VPH6 L1 y el sitio de digestión XbaI (TACTAGA), la secuencia amplificada se muestra en SEQ ID No: 12.

Secuencias de ligadura de PCR:

Los cebadores de ligadura fueron F1 y R2, y los fragmentos amplificados utilizando los cebadores anteriores (fragmentos amplificados de F1 y R1, fragmentos amplificados de F2 y R2) se utilizaron como plantillas.

Parámetros de ligadura PCR: pre-desnaturalización a 94°C durante 5 min; desnaturalización a 98°C durante 10 s, recocido a 52°C durante 15 s, 72°C para 1 kb/1 min, durante 5 ciclos; desnaturalización a 98°C durante 10 s, recocido a 68°C durante 15 s, 72°C para 1 kb/1 min, durante 25 ciclos; extensión a 72°C durante 5 min; final a 16°C.

El resultado final fue SEQ ID NO: 4, una secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 1-469 de VPH6 L1 y 26 aminoácidos C-terminales de VPH33 L1 (aa 474-499), con sitios de escisión KpnI y XbaI en ambos extremos (en adelante denominada secuencia de ligadura).

El plásmido recombinante pFB-VPH6 L1: 33C se obtuvo mediante la doble digestión del vector pFastBac™1 y del fragmento de secuencia de ligación con las enzimas KpnI+XbaI y la clonación de la secuencia de ligación en el vector pFastBac™1 para obtener pFB-VPH6 L1: 33C, que es un gen quimérico con el C-terminal de VPH6 L1 sustituido por el C-terminal de VPH33 L1.

Ejemplo 1.2 Construcción de un gen quimérico con el C-terminal de VPH11 L1 sustituido por el C-terminal de VPH33 L1

Los métodos y procedimientos experimentales fueron los mismos que en el Ejemplo 1.1, consulte el Apéndice 2 para las secuencias relevantes.

Ejemplo 1.3 Construcción de un gen quimérico con el C-terminal de VPH16 L1 sustituido por el C-terminal de VPH33 L1

El método y el procedimiento experimentales fueron los mismos que en el Ejemplo 1.1; véanse las secuencias pertinentes en el Apéndice 3.

Ejemplo 1.4 Construcción de un gen quimérico con el C-terminal de VPH18 L1 sustituido por el C-terminal de VPH33 L1

El método y el procedimiento experimentales fueron los mismos que en el Ejemplo 1.1; véanse las secuencias pertinentes en el Apéndice 4.

Ejemplo 1.5 Construcción de un gen quimérico con el C-terminal de VPH31 L1 sustituido por el C-terminal de VPH33 L1

El método y el procedimiento experimentales fueron los mismos que en el Ejemplo 1.1; véanse las secuencias pertinentes en el Apéndice 5.

Ejemplo 1.6 Construcción de un gen quimérico con el C-terminal de VPH35 L1 sustituido por el C-terminal de VPH33 L1

Los métodos y procedimientos experimentales fueron los mismos que en el Ejemplo 1.1, consulte el Apéndice 6 para las secuencias relevantes.

Ejemplo 1.7 Construcción de un gen quimérico con el C-terminal de VPH39 L1 sustituido por el C-terminal de VPH59 L1

1.7.1 Construcción de pFB-VPH39 L1 como plantilla

El gen VPH39 L1 con los sitios de escisión KpnI y XbaI en ambos extremos de las secuencias sintetizadas fue sintetizado por Thermo Fisher [anteriormente Invitrogen (Shanghai) Trading C o.), su secuencia se muestra como SEQ ID NO: 83. El plásmido pcDNA3-VPH39-L1 que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 1-505 de VPH39 L1 se obtuvo ligando el fragmento del gen sintetizado con el vector pcDNA3 (distribuidor: Thermo Fisher) en los sitios de escisión Kpn I y XbaI.

El plásmido pcDNA3-VPH39-L1 se sometió a una doble digestión con KpnI y XbaI para obtener un fragmento del gen VPH39 L1 (1-505). A continuación, el fragmento se ligó al vector pFastBac™1 con doble digestión KpnI y XbaI (distribuidor: Thermo Fisher) para obtener un vector varilla que contiene el fragmento del gen VPH39 L1 (1-505), denominado pFB-VPH39 L1.

1.7.2 Construcción de pFB-VPH59 L1 como plantilla

El gen VPH59L1 fue sintetizado por Thermo Fisher [anteriormente Invitrogen (Shanghai) Trading Co.) para obtener el plásmido pcDNA3-VPH59-L1 que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 1-508 de VPH59L1.

El plásmido pcDNA3-VPH59-L1 se digirió dos veces con KpnI y XbaI para obtener un fragmento del gen VPH59L1 (1-508). A continuación, el fragmento se ligó al vector pFastBac™1 con doble digestión KpnI/XbaI (distribuidor: Thermo Fisher) para obtener un vector varilla que contiene el fragmento del gen VPH59 L1 (1 508), denominado pFB-VPH59 L1.

1.7.3 Construcción de pFB-VPH39 L1: 59C

Gen quimérico con el C-terminal de VPH39 L1 sustituido por el C-terminal de VPH59L1: El plásmido recombinante construido pFB-VPH39 L1 se utilizó como molde del gen para amplificar un fragmento del gen de 1428 pb utilizando los cebadores F1 y R1, la secuencia del cebador F1 se muestra en SEQ ID No: 85 y la secuencia del cebador R1 se muestra en SEQ ID No: 86.

Este fragmento contiene un fragmento que codifica los aminoácidos 1-469 de VPH39 L1, una superposición de 12 bases con un fragmento que codifica los aminoácidos 471-508 de VPH59L1 y un segmento del sitio de digestión KpnI (GGTACAC), la secuencia amplificada se muestra en SEQ ID No: 87.

Parámetros de amplificación PCR: pre-desnaturalización a 94°C durante 5min; desnaturalización a 98°C durante 10 s, recocido a 69°C durante 15 s, 1 kb/1 min a 72°C, durante 30 ciclos; extensión a 72°C durante 5min; final a 16°C.

El plásmido recombinante pFB-VPH59L1 se utilizó como plantilla genética para amplificar un fragmento genético de 139 pb de longitud utilizando los cebadores F2 y R2. La secuencia del cebador F2 se muestra en SEQ ID No: 88 y R2 se muestra en SEQ ID No: 89.

Este fragmento de gen contiene un fragmento de gen que codifica 38 aminoácidos C-terminales (471-508) del VPH59L1, una base de 12 pb solapada con el fragmento de gen que codifica los aminoácidos 1-469 del VPH39 L1 y el sitio de digestión XbaI (T<a>C<t>AGA), y la secuencia amplificada se muestra en SEQ ID No: 90.

Parámetros de amplificación PCR: pre-desnaturalización a 94°C durante 5min; desnaturalización a 98°C durante 10 s, recocido a 69°C durante 15 s, 1 kb/1 min a 72°C durante 30 ciclos; extensión a 72°C durante 5min; final a 16°C.

Secuencia de ligadura de PCR

Los cebadores de ligación fueron F1 y R2, y los fragmentos amplificados utilizando los cebadores anteriores (fragmentos amplificados F1 y R1, fragmentos amplificados F2 y R2) se utilizaron como plantillas.

El resultado final fue SEQ ID NO: 82, una secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 1-469 de VPH39 L1 y 38 aminoácidos C-terminales de VPH59 L1 (471-508), con sitios de escisión de las encimas KpnI y XbaI en ambos extremos (en adelante denominada secuencia de ligadura).

El plásmido recombinante pFB-VPH39 L1: 59C se obtuvo por doble digestión del vector pFastBac™1 y el fragmento de secuencia de ligación con las enzimas KpnI+XbaI y la secuencia de ligación se clonó en el vector pFastBac™1 para obtener pFB-VPH39 L1: 59C, que es un gen quimérico con el C-terminal de VPH39 L1 sustituido por el C-terminal de VPH59L1.

Ejemplo 1.8 Construcción de un gen quimérico con el C-terminal de VPH45 L1 sustituido por el C-terminal de VPH33 L1

Los métodos y procedimientos experimentales fueron los mismos que en el Ejemplo 1.1, consulte el Apéndice 8 para las secuencias relevantes.

Ejemplo 1.9 Construcción de un gen quimérico con el C-terminal de VPH51 L1 sustituido por el C-terminal de VPH33 L1

Los métodos y procedimientos experimentales fueron los mismos que en el Ejemplo 1.1, consulte el Apéndice 9 para las secuencias relevantes.

Ejemplo 1.10 Construcción de un gen quimérico con el C-terminal de VPH52 L1 sustituido por el C-terminal de VPH33 L1

Los métodos y procedimientos experimentales fueron los mismos que en el Ejemplo 1.1, consulte el Apéndice 10 para las secuencias relevantes.

Ejemplo 1.11 Construcción de un gen quimérico con el C-terminal de VPH56 L1 sustituido por el C-terminal de VPH33 L1

Los métodos y procedimientos experimentales fueron los mismos que en el Ejemplo 1.1, consulte el Apéndice 11 para las secuencias relevantes.

Ejemplo 1.12 Construcción de un gen quimérico con el C-terminal de VPH58 L1 sustituido por el C-terminal de VPH33 L1

Los métodos y procedimientos experimentales fueron los mismos que en el Ejemplo 1.1, consulte el Apéndice 12 para las secuencias relevantes.

Ejemplo 2 Empaquetamiento del baculovirus recombinante

Ejemplo 2.1: Envasado de baculovirus recombinante VPH6 L1: 33C de

El plásmido recombinante de pFB-VPH6 L1: 33C construido en el Ejemplo 1 se identificó y secuenció como correcto, y se transformó en células competentes de bacterias DH10Bac (kit Bac-to-Bac®, adquirido de Thermo Fisher), se incubó a 37 °C para proliferación y se incubó en una placa plana para cultivo en estrías. Se seleccionaron colonias blancas y se incubaron durante la noche. Se recogió el cultivo bacteriano y se extrajo el ADN del baculovirus recombinante utilizando el método de lisis alcalina.

El ADN del baculovirus recombinante se transfectó en células de insecto SF9 utilizando un reactivo de transfección catiónico (comprado a Sino Biological) para empaquetar las cepas virulentas del baculovirus recombinante. El procedimiento fue el siguiente:

a. Las células SF9 en fase logarítmica se inocularon en placas a una densidad de 0,6 * 106 células/placa. La placa inoculada con células SF9 se dejó a temperatura ambiente durante 2 horas para que las células se adhirieran a la pared de la placa. ;b. Se agregaron 20 pL de ADN plasmídico extraído de Bacmid a 200 pL de medio Grace (sin suero, sin aditivos, comprado a Gibico) y se mezcló e invirtió 5 veces. ;c. Se agregaron gota a gota 25 pL de 0,2x TF1 (reactivo de transfección, adquirido en Sino Biological) a 200 pL de Grace's Meduim y se mezcló suavemente. ;d. Mezcla de b y c. Incubado a temperatura ambiente durante 15-45 min. ;e. Durante la incubación del ADN con cellfectin (comprado a Sino Biological), se descartó el sobrenadante celular y se agregaron 0,8 mL de medio Grace (sin aditivo de suero) a la placa. ;f. La mezcla incubada de ADN y reactivo de transfección de d se añadió gota a gota a la placa. ;g. Incubado a 27°C durante 2 horas. ;h. Se desechó el medio de cultivo celular y se añadieron 2,5 mL de medio de crecimiento completo por plato (SCD6 SF 10% FBS) (SCD6 SF se adquirió a Sino Biological, FBS se adquirió a Gibico)a. ;i. Se realizó el cultivo a 27°C durante 7 días y se observó si se produjo infección viral. ;El sobrenadante del virus se recogió una vez que se observaron lesiones visibles en las células transfectadas, normalmente tras 7-11 días de cultivo. El sobrenadante viral, es decir, la cepa del virus de la generación P1 de VPH6 L1:33C, se recoge asépticamente con una pipeta. Las células SF9, a una densidad de 2 * 106 células/mL, se infectaron utilizando la cepa del virus de la generación P1 de VPH6 L1: 33C en una proporción de 1: 50 (V/V), se cultivaron a 27 °C durante 3 días y se centrifugaron a 1000 g ± 200 g durante 10 min a temperatura ambiente. El sobrenadante del virus recolectado fue el virus de la generación P2 y podría usarse para infectar las células huésped y la producción.

Ejemplo 2.2: Envasado del baculovirus recombinante VPH11 L1: 33C

Los métodos y procedimientos experimentales fueron los mismos que en el Ejemplo 2.1.

Ejemplo 2.3: Envasado del baculovirus recombinante VPH 16L1: 33C

Los métodos y procedimientos experimentales fueron los mismos que los del Ejemplo 2.1.

Ejemplo 2.4: Envasado del baculovirus recombinante VPH18 L1: 33C

Ejemplo 2.5: Envasado del baculovirus recombinante VPH31 L1: 33C

Ejemplo 2.6: Envasado del baculovirus recombinante VPH35 L1: 33C

Ejemplo 2.7: Envasado del baculovirus recombinante VPH39 L1: 59C

Ejemplo 2.8: Envasado del baculovirus recombinante VPH45 L1: 33C

Ejemplo 2.9: Envasado del baculovirus recombinante VPH51 L1: 33C

Ejemplo 2.10: Envasado del baculovirus recombinante VPH52 L1: 33C

Ejemplo 2.11: Envasado del baculovirus recombinante VPH56 L1: 33C

Ejemplo 2.12: Envasado del baculovirus recombinante VPH58 L1: 33C

Ejemplo 3 Expresión de proteínas quiméricas

Ejemplo 3.1: Expresión de VPH6 L1: 33C

Se infectaron células High Five con baculovirus que contenían el gen recombinante VPH6 L1: 33C obtenido en el Ejemplo 2 en una proporción de 1: 200 (V/V), y el precipitado celular se recogió por centrifugación a 1000g ± 100 g a temperatura ambiente. Las células se rompieron mediante sonicación a baja temperatura durante 3 minutos, se centrifugaron a >10.000 g durante 10 minutos y se recogió el sobrenadante para SDS-PAGE. Carril 1: Marcador (el marcador es una mezcla de 7 proteínas purificadas con pesos moleculares que van desde 14,4 kDa a 116 kDa, producida por Thermo Scientific); Carril 2: lisado celular; Carril 3: sobrenadante del lisado recolectado por centrifugación.

El resultado se muestra en la Figura 1A. La proteína VPH6 L1: 33C L1 preparada por este método tiene un rendimiento de >100 mg/L y un tamaño de proteína de aproximadamente 56 KD, que puede utilizarse para la producción en masa.

Ejemplo 3.2: Expresión y producción de VPH11 L1: 33C

Los métodos y procedimientos experimentales fueron los mismos que en el Ejemplo 3.1.

El resultado se muestra en la Figura 1B. La proteína VPH11 L1: 33C L1 preparada por este método tiene un rendimiento de >100 mg/L y un tamaño de proteína de aproximadamente 56 KD, que puede utilizarse para la producción en masa.

Ejemplo 3.3: Expresión y producción de VPH 16L1: 33C

El resultado se muestra en la Figura 1C. La proteína VPH 16L1: 33C L1 preparada por este método tiene un rendimiento de >100 mg/L y un tamaño de proteína de aproximadamente 56 KD, que puede utilizarse para la producción en masa.

Ejemplo 3.4: Expresión y producción de VPH18 L1: 33C

El resultado se muestra en la Figura 1D. La proteína VPH18 L1: 33C L1 preparada por el método tiene un rendimiento de > 100 mg/L y un tamaño de proteína de aproximadamente 56 KD, que puede utilizarse para la producción en masa.

Ejemplo 3.5: Expresión y producción de VPH31 L1: 33C

El resultado se muestra en la Figura 1E. La proteína VPH31 L1: 33C L1 preparada por este método tiene un rendimiento de >100 mg/L y un tamaño de proteína de aproximadamente 56 KD, que puede utilizarse para la producción en masa.

Ejemplo 3.6: Expresión y producción de VPH35 L1: 33C

El resultado se muestra en la Figura 1F. La proteína VPH35 L1: 33C L1 preparada por este método tiene un rendimiento de >100 mg/L y un tamaño de proteína de aproximadamente 56 KD, que puede utilizarse para la producción en masa.

Ejemplo 3.7: Expresión y producción de VPH39 L1: 59C

El resultado se muestra en la Figura 1G. La proteína VPH39 L1: 59C L1 preparada por este método tiene un rendimiento de >100 mg/L y un tamaño de proteína de aproximadamente 56 KD, que puede utilizarse para la producción en masa.

Ejemplo 3.8: Expresión y producción de VPH45 L1: 33C

El resultado se muestra en la Figura 1H. La proteína VPH45 L1: 33C L1 preparada por este método tiene un rendimiento de >100 mg/L y un tamaño de proteína de aproximadamente 56 KD, que puede utilizarse para la producción en masa.

Ejemplo 3.9: Expresión y producción de VPH51 L1: 33C

El resultado se muestra en la Figura 1I. La proteína VPH51 L1: 33C L1 preparada por este método tiene un rendimiento de >100 mg/L y un tamaño de proteína de aproximadamente 56 KD, que puede utilizarse para la producción en masa.

Ejemplo 3.10: Expresión y producción de VPH52 L1: 33C

El resultado se muestra en la Figura 1J. La proteína VPH52 L1: 33C L1 preparada por este método tiene un rendimiento de >100 mg/L y un tamaño de proteína de aproximadamente 56 KD, que puede utilizarse para la producción en masa.

Ejemplo 3.11: Expresión y producción de VPH56 L1: 33C

El resultado se muestra en la Figura 1K. La proteína VPH56 L1: 33C L1 preparada por este método tiene un rendimiento de >100 mg/L y un tamaño de proteína de aproximadamente 56 KD, que puede utilizarse para la producción en masa.

Ejemplo 3.12: Expresión y producción de VPH58 L1: 33C

El resultado se muestra en la Figura 1L. La proteína VPH58 L1: 33C L1 preparada por este método tiene un rendimiento de >100 mg/L y un tamaño de proteína de aproximadamente 56 KD, que puede utilizarse para la producción en masa.

Ejemplo 4 Preparación de partículas purificadas similares a virus

Ejemplo 4.1: Preparación de partículas virales VPH6 L1: 33C purificadas

Las partículas similares al virus VPH6 L1: 33C se purificaron mediante un método cromatográfico de dos pasos, es decir, el método HS-MMA, se purificó el sobrenadante recogido en el Ejemplo 3 y, finalmente, se obtuvieron partículas similares al virus de alta pureza.

Cromatografía de primer paso:

Medio: Se utilizó el medio de intercambio catiónico fuerte POROS® 50 HS producido por Thermo Fisher. Volumen medio: 150 mL de volumen de medio, 30 mL/min de caudal lineal.

Condiciones cromatográficas: tampón de equilibrio (pH 6,2, la concentración de sal es de 50 mM de fosfato, 0,5 M de NaCl); tampón de lavado (la concentración de sal es de 50 mM de fosfato, 0,75 M de NaCl, pH 6,2).

Primero se equilibró la columna cromatografía con 5 CV de tampón de equilibrio y después se cargó la muestra. Después de la carga, la columna se eluyó con 5 CV de tampón de equilibrio y tampón de lavado, respectivamente, para eliminar las impurezas de la proteína.

Condiciones de elución: se utilizó un tampón fosfato 50 mM que contenía clorhidrato de arginina 50 mM, pH 6,2, con una concentración de sal de elución de 1,25 M NaCl.

Cromatografía de segundo paso.

Medio: Se utilizó medio de intercambio iónico MMA producido por Bestchrom (Shanghai) Biosciences Co., Ltd. Volumen del medio: el volumen del medio es de 150 mL, mientras que el caudal lineal es de 30 mL/min. Condiciones de cromatografía: tampón de equilibrio: 50 mM PB, 1,25 M NaCl, pH 6,2. Primero se equilibró la columna cromatográfica con 4 CV de tampón de equilibrio y después se cargó la muestra. Después de la carga, las impurezas de la proteína se enjuagaron con un tampón de equilibrio de 5 CV y luego la proteína objetivo se eluyó con tampón de elución y se recogió.

Condiciones de elución: 100 mM NaAC, 150 mM NaCl, 0,01 % Tween 80, pH 4,5.

Ejemplo 4.2: Preparación de partículas virales VPH11 L1: 33C purificadas

Los métodos y procedimientos experimentales fueron los mismos que en el Ejemplo 4.1.

Ejemplo 4.3: Preparación de partículas virales VPH 16L1: 33C purificadas

Ejemplo 4.4: Preparación de partículas virales VPH18 L1: 33C purificadas

Ejemplo 4.5: Preparación de partículas virales VPH31 L1: 33C purificadas

Ejemplo 4.6: Preparación de partículas virales VPH35 L1: 33C purificadas

Ejemplo 4.7: Preparación de partículas virales VPH39 L1: 59C purificadas

Ejemplo 4.8: Preparación de partículas virales VPH45 L1: 33C purificadas

Ejemplo 4.9: Preparación de partículas virales VPH51 L1: 33C purificadas

Ejemplo 4.10: Preparación de partículas virales VPH52 L1: 33C purificadas

Ejemplo 4.11: Preparación de partículas virales VPH56 L1: 33C purificadas

Ejemplo 4.12: Preparación de partículas virales VPH58 L1: 33C purificadas

Ejemplo 5 Observación morfológica de partículas similares a virus

Ejemplo 5.1: Observación morfológica de partículas similares al virus VPH6 L1: 33C

Se tomó una muestra de 10 pL para microscopía electrónica de transmisión. La muestra se fijó en una rejilla de cobre recubierta de carbono durante 2 minutos, el resto del líquido se absorbió con papel de filtro y, a continuación, se tiñó dos veces con ácido fosfotúngstico (Beijing Electron Microscopy China Technology Co., Ltd., concentración 2%, pH 6,5) durante 30 segundos cada vez, el resto de la solución de tinción se absorbió con papel de filtro, se dejó secar la muestra y, a continuación, se realizó la observación por microscopía electrónica de transmisión. El microscopio electrónico de transmisión (marca: Hitachi, modelo n.°: H-7650) era de 80 KV con un aumento de 80.000x.

La observación mediante microscopía electrónica se muestra en la Figura 2A. Como puede verse en la Figura 2A, el VPH6 L1: 33C modificado en su C-terminal-terminal puede formar partículas similares a virus de tamaño uniforme con un diámetro medio aproximado de 60 nm.

Ejemplo 5.2: Observación morfológica de partículas similares al virus VPH11 L1: 33C

Los métodos y procedimientos experimentales fueron los mismos que en el Ejemplo 5.1.

La observación mediante microscopía electrónica se muestra en la Figura 2B. Como puede verse en la Figura 2B, el VPH11 L1: 33C modificado en su C-terminal-terminal puede formar partículas similares a virus de tamaño uniforme con un diámetro medio aproximado de 60 nm.

Ejemplo 5.3: Observación morfológica de partículas similares al virus VPH16 L1: 33C

La observación mediante microscopía electrónica se muestra en la Figura 2C. Como puede verse en la Figura 2C, el VPH16 L1: 33C modificado en su C-terminal-terminal puede formar partículas similares a virus de tamaño uniforme con un diámetro medio aproximado de 60 nm.

Ejemplo 5.4: Observación morfológica de partículas similares al virus VPH18 L1: 33C

La observación mediante microscopía electrónica se muestra en la Figura 2D. Como puede observarse en la Figura 2D, el VPH18 L1: 33C modificado en su C-terminal-terminal puede formar partículas similares a virus de tamaño uniforme con un diámetro medio aproximado de 60 nm.

Ejemplo 5.5: Observación morfológica de partículas similares al virus VPH31 L1: 33C

La observación mediante microscopía electrónica se muestra en la Figura 2E. Como puede observarse en la Figura 2E, el VPH31 L1: 33C modificado en su C-terminal-terminal puede formar partículas similares a virus de tamaño uniforme con un diámetro medio aproximado de 60 nm.

Ejemplo 5.6: Observación morfológica de partículas similares al virus VPH35 L1: 33C

La observación mediante microscopía electrónica se muestra en la Figura 2F. Como puede observarse en la Figura 2F, el VPH35 L1: 33C modificado en su C-terminal-terminal puede formar partículas similares a virus de tamaño uniforme con un diámetro medio aproximado de 60 nm.

Ejemplo 5.7: Observación morfológica de partículas similares al virus VPH39 L1: 59C

La observación mediante microscopía electrónica se muestra en la Figura 2G. Como puede observarse en la Figura 2G, el VPH39 L1: 59C modificado en su C-terminal-terminal puede formar partículas similares a virus de tamaño uniforme con un diámetro medio aproximado de 60 nm.

Ejemplo 5.8: Observación morfológica de partículas similares al virus VPH45 L1: 33C

La observación por microscopía electrónica se muestra en la Figura 2H. Como puede verse en la Figura 2H, el VPH45 L1: 33C modificado en su C-terminal-terminal puede formar partículas similares a virus de tamaño uniforme con un diámetro medio de aproximadamente 60 nm.

Ejemplo 5.9: Observación morfológica de partículas similares al virus VPH51 L1: 33C

La observación mediante microscopía electrónica se muestra en la Figura 2I. Como puede observarse en la Figura 2I, el VPH51 L1: 33C modificado en su C-terminal-terminal puede formar partículas similares a virus de tamaño uniforme con un diámetro medio aproximado de 60 nm.

Ejemplo 5.10: Observación morfológica de partículas similares al virus VPH52 L1: 33C

La observación por microscopía electrónica se muestra en la Figura 2J. Como puede verse en la Figura 2J, el VPH52 L1: 33C modificado en su C-terminal-terminal puede formar partículas similares a virus de tamaño uniforme con un diámetro medio de aproximadamente 60 nm.

Ejemplo 5.11: Observación morfológica de partículas similares al virus VPH56 L1: 33C

La observación mediante microscopía electrónica se muestra en la Figura 2K. Como puede observarse en la Figura 2K, el VPH56 L1: 33C modificado en su C-terminal-terminal puede formar partículas similares a virus de tamaño uniforme con un diámetro medio aproximado de 60 nm.

Ejemplo 5.12: Observación morfológica de partículas similares al virus VPH58 L1: 33C

La observación mediante microscopía electrónica se muestra en la Figura 2L. Como puede observarse en la Figura 2L, el VPH58 L1: 33C modificado en su C-terminal-terminal puede formar partículas similares a virus de tamaño uniforme con un diámetro medio aproximado de 60 nm.

Ejemplo 6 Evaluación de la inmunogenicidad de partículas similares al virus en animales

Ejemplo 6.1: Evaluación de la inmunogenicidad de partículas similares al virus VPH6 L1: 33C en animales 6.1.1 Modelado de células neutralizantes de pseudovirus

Como el VPH es difícil de cultivarin vitroy tiene una fuerte especificidad de huésped, es difícil reproducirlo en organismos distintos de los humanos, por lo que hay una falta de modelos animales adecuados. Por lo tanto, existe la necesidad de establecer modelos experimentales de neutralizaciónin vitroadecuados y efectivos para la evaluación de la inmunoprotección de las vacunas.

El pseudovirus del VPH es un modelo ideal para la neutralizaciónin vitrodel VPH: gracias a la característica de las VLP del VPH de encapsular de forma no específica los ácidos nucleicos, el pseudovirus del VPH se puede formar a partir de las VLP, compuestas de L1 y L2 del VPH expresadas en las células, encapsulando ADN libre o introduciendo plásmidos exógenos.

La inmunogenicidad de muestras de suero de animales inmunizados se analizó mediante ensayo de neutralización de pseudovirus. El animal inmunizado con partículas similares al virus VPH6 puede producir anticuerpos neutralizantes contra el VPH6 que pueden neutralizar el pseudovirus VPH6. Cuando el suero animal inmunizado se incuba con una cierta cantidad de pseudovirus y luego infecta células, el número de células capaces de expresar fluorescencia GFP disminuye cuando aumentan los anticuerpos neutralizantes en el suero, mostrando una correlación lineal negativa en un cierto rango, por lo que la actividad neutralizante de los anticuerpos en el suero puede evaluarse detectando el cambio en el número de células que expresan GFP Método de construcción del pseudovirus: El plásmido VPH6 pCMV3-3-VPH6 L1+L2 (la secuencia L1 era de Uniprot P69898, la secuencia L2 era de Uniprot Q84297) (comprado a Sino Biological) y el plásmido fluorescente (PSEU-GFP Spark, comprado a Sino Biological) se co-transfectaron en células adherentes 293FT (compradas a Thermo Fisher). Los métodos específicos se refieren a la literatura publicada (Pastrana DV, Buck CB, Pang YS, Thompson CD, Castle PE, FitzGerald PC, Kjaer SK, Lowy DR, Schiller J T Reactividad de sueros humanos en un ensayo de neutralización del virus del papiloma basado en pseudovirus sensible y de alto rendimiento para VPH16 y VPH18. [J] Virología 2004,321:205-216.). Se recogió el sobrenadante del pseudovirus, se dividió en alícuotas y se almacenó en un refrigerador a -80 °C para su almacenamiento. 6.1.2 Evaluación inmunoprotectora de las partículas similares al virus VPH6 L1: 33C en animales Procedimientos de inmunización en ratones:

Las partículas similares al virus VPH6 L1: 33C se adsorbieron en adyuvante de fosfato de aluminio, se mezclaron y se utilizaron para inmunizar ratones a una dosis de 0,15 pg/200 pL por ratón, 10 ratones en total. Los ratones fueron inmunizados con las muestras diluidas en los días 0, 7 y 21, con ratones de control inmunizados con suero blanco. Se extrajo sangre de los ojos de los ratones el día 28 y se aislaron los sueros para el ensayo de títulos de neutralización del pseudovirus.

Ensayo EC50 de ratones:

El suero murino se inactivó a 56 °C durante 30 minutos, se centrifugó a 6.

000 g, 5 minutos, y se recogió el sobrenadante para el ensayo. 4-8 horas antes del ensayo, se inocularon células 293FT a una densidad de 15.000 células/pocillo en placas de 96 pocillos y se incubaron a 37 °C en una incubadora de CO2 con 5 % de CO2. El suero murino posinmune y el suero de control en blanco se diluyeron en serie con medios neutralizantes, respectivamente, y luego se mezclaron con el pseudovirus VPH6 preparado en 6,1 en una relación de volumen de 1:1, se incubaron a 2-8°C durante 1 h. A continuación, se añadieron 100 pL/pocillo de la mezcla a las células 293FT, que habían sido inoculadas con 4-8 horas de antelación. Cada muestra se replicó y se utilizó un grupo de control de suero blanco, un grupo de control positivo de pseudovirus y un grupo de control negativo de pseudovirus. Las células infectadas por pseudovirus se incubaron a 37 °C en una incubadora de CO2 con 5 % de CO2 durante 62-96 horas, se fotografiaron mediante escaneo de fluorescencia y se contaron en un analizador ELISPOT (modelo n.°: S6 Universal-V Analyzer, fabricante: CTL). Sobre la base de la inhibición de neutralización de cada muestra de suero murino, se calculó la dilución máxima del suero con una inhibición de neutralización del 50 % para cada muestra de suero murino según el método de Reed-Muench, es decir, la dilución de eficacia media EC50.

Los resultados del ensayo de título de neutralización del pseudovirus sérico VPH6 se detallan en la Tabla 4.

Tabla 4 EC50 del ensayo de titulación de neutralización sérica en ratones (GMT ± SEM)

Notas:

1. número de animales, N = 10.

2. GMT (Título medio geométrico): título medio geométrico.

3. SEM (Error estándar de la media): error estándar.

Los resultados de la evaluación anterior muestran que las partículas similares al virus VPH6 L1:33C preparadas por la presente invención tienen buena inmunogenicidad y pueden producir anticuerpos neutralizantes con títulos altos en animales, que pueden usarse para preparar una vacuna para prevenir infecciones por VPH. Ejemplo 6.2: Evaluación de la inmunogenicidad de las partículas similares al virus VPH11 L1: 33C en animales Los métodos y procedimientos experimentales fueron los mismos que en el Ejemplo 6.1. La secuencia L1 fue de Uniprot P04012 y la secuencia L2 fue de Uniprot P04013.

Los resultados del ensayo de neutralización del pseudovirus VPH11 en suero se detallan en la Tabla 5.

Tabla 5 EC50 del ensayo de título de neutralización sérica en ratones (GMT±SEM)

Los resultados de la evaluación anterior muestran que las partículas similares al virus VPH11 L1:33C preparadas por la presente invención tienen buena inmunogenicidad, pueden producir títulos elevados de anticuerpos neutralizantes en animales y pueden utilizarse para preparar una vacuna para la prevención de la infección por VPH.

Ejemplo 6.3: Evaluación de la inmunogenicidad de las partículas similares al virus VPH 16L1: 33C en animales Los métodos y procedimientos experimentales fueron los mismos que en el Ejemplo 6.1. La secuencia L1 fue de Uniprot P03101 y la secuencia L2 fue de Uniprot P03107.

Los resultados del ensayo de título de neutralización del pseudovirus sérico VPH16 se detallan en la Tabla 6.

Tabla 6 EC50 del ensayo de título de neutralización sérica en ratones (GMT±SEM)

Los resultados de la evaluación anterior muestran que las partículas similares al virus VPH 16L1:33C preparadas por la presente invención tienen buena inmunogenicidad y pueden producir títulos elevados de anticuerpos neutralizantes en animales, que pueden utilizarse para preparar una vacuna para la prevención de la infección por VPH.

Ejemplo 6.4: Evaluación de la inmunogenicidad de las partículas similares al virus VPH18 L1: 33C en animales Los métodos y procedimientos experimentales fueron los mismos que en el Ejemplo 6.1. La secuencia L1 fue de Uniprot Q80B70 y la secuencia L2 fue de Uniprot P06793.

Los resultados del ensayo de título de neutralización del pseudovirus sérico VPH18 se detallan en la Tabla 7.

Tabla 7 EC50 del ensayo de título de neutralización sérica en ratones (GMT±SEM)

Los resultados de la evaluación anterior muestran que las partículas similares al virus VPH18 L1:33C preparadas por la presente invención tienen buena inmunogenicidad, pueden producir títulos elevados de anticuerpos neutralizantes en animales y pueden utilizarse para preparar una vacuna para prevenir la infección por VPH.

Ejemplo 6.5: Evaluación de la inmunogenicidad de las partículas similares al virus VPH31 L1: 33C en animales Los métodos y procedimientos experimentales fueron los mismos que en el Ejemplo 6.1. La secuencia L1 fue de Uniprot P17388 y la secuencia L2 fue de Uniprot P17389.

Los resultados del ensayo de título de neutralización del pseudovirus sérico VPH31 se detallan en la Tabla 8.

Tabla 8 EC50 del ensayo de título de neutralización sérica en ratones (GMT±SEM)

Los resultados de la evaluación anterior muestran que las partículas similares al virus VPH31 L1:33C preparadas por la presente invención tienen buena inmunogenicidad, pueden producir títulos elevados de anticuerpos neutralizantes en animales y pueden utilizarse para preparar una vacuna para prevenir la infección por VPH.

Ejemplo 6.6: Evaluación de la inmunogenicidad de las partículas similares al virus VPH35 L1: 33C en animales Los métodos y procedimientos experimentales fueron los mismos que en el Ejemplo 6.1. La secuencia L1 fue de Uniprot P27232 y la secuencia L2 fue de Uniprot P27234.

Los resultados del ensayo de título de neutralización del pseudovirus sérico VPH35 se detallan en la Tabla 9.

Tabla 9 EC50 del ensayo de título de neutralización sérica en ratones (GMT±SEM)

Los resultados de la evaluación anterior muestran que las partículas similares al virus VPH35 L1:33C preparadas por la presente invención tienen buena inmunogenicidad, pueden producir títulos elevados de anticuerpos neutralizantes en animales y pueden utilizarse para preparar una vacuna para prevenir la infección por VPH.

Ejemplo 6.7: Evaluación de la inmunogenicidad de las partículas similares al virus VPH39 L1: 59C en animales

Los métodos y procedimientos experimentales fueron los mismos que en el Ejemplo 6.1. La secuencia L1 fue de Uniprot P24838 y la secuencia L2 fue de Uniprot P24839.

Los resultados del ensayo de título de neutralización del pseudovirus sérico VPH39 se detallan en la Tabla 10.

Tabla 10 EC50 del ensayo de título de neutralización sérica en ratones (GMT±SEM)

Los resultados de la evaluación anterior muestran que las partículas similares al virus VPH39 L1:59C preparadas por la presente invención tienen buena inmunogenicidad, pueden producir títulos elevados de anticuerpos neutralizantes en animales y pueden utilizarse para preparar una vacuna para prevenir la infección por VPH.

Ejemplo 6.8: Evaluación de la inmunogenicidad de partículas similares al virus VPH45 L1: 33C en animales

Los métodos y procedimientos experimentales fueron los mismos que en el Ejemplo 6.1. La secuencia L1 fue de Uniprot P36741 y la secuencia L2 fue de Uniprot P36761.

Los resultados del ensayo de título de neutralización del pseudovirus sérico VPH45 se detallan en la Tabla 11.

Tabla 11 EC50 del ensayo de título de neutralización sérica en ratones (GMT±SEM)

Los resultados de la evaluación anterior muestran que las partículas similares al virus VPH45 L1:33C preparadas por la presente invención tienen buena inmunogenicidad, pueden producir títulos elevados de anticuerpos neutralizantes en animales y pueden utilizarse para preparar una vacuna para prevenir la infección por VPH.

Ejemplo 6.9: Evaluación de la inmunogenicidad de las partículas similares al virus VPH51 L1: 33C en animales

Los métodos y procedimientos experimentales fueron los mismos que en el Ejemplo 6.1. La secuencia L1 fue de Uniprot P26536 y la secuencia L2 fue de Uniprot P26539.

Los resultados del ensayo de título de neutralización del pseudovirus sérico VPH51 se detallan en la Tabla 12.

Tabla 12 EC50 del ensayo de título de neutralización sérica en ratones (GMT±SEM)

Los resultados de la evaluación anterior muestran que las partículas similares al virus VPH51 preparadas por la presente invención tienen buena inmunogenicidad, pueden producir títulos elevados de anticuerpos neutralizantes en animales y pueden utilizarse para preparar una vacuna para prevenir la infección por VPH.

Ejemplo 6.10: Evaluación de la inmunogenicidad de las partículas similares al virus VPH52 L1: 33C en animales

Los métodos y procedimientos experimentales fueron los mismos que en el Ejemplo 6.1. La secuencia L1 fue de Uniprot Q05138 y la secuencia L2 fue de Uniprot F8S4U2.

Los resultados del ensayo de título de neutralización del pseudovirus sérico VPH52 se detallan en la Tabla 13.

Tabla 13 EC50 del ensayo de título de neutralización sérica en ratones (GMT±SEM)

Los resultados de la evaluación anterior muestran que las partículas similares al virus VPH52 L1:33C preparadas por la presente invención tienen buena inmunogenicidad, pueden producir títulos elevados de anticuerpos neutralizantes en animales y pueden utilizarse para preparar una vacuna para prevenir la infección por VPH.

Ejemplo 6.11: Evaluación de la inmunogenicidad de las partículas similares al virus VPH56 L1: 33C en animales Los métodos y procedimientos experimentales fueron los mismos que en el Ejemplo 6.1. La secuencia L1 fue de Uniprot P36743 y la secuencia L2 fue de Uniprot P36765.

Los resultados del ensayo de título de neutralización del pseudovirus sérico VPH56 se detallan en la Tabla 14.

Tabla 14 EC50 del ensayo de título de neutralización sérica en ratones (GMT±SEM)

Los resultados de la evaluación anterior muestran que las partículas similares al virus VPH56 L1:33C preparadas por la presente invención tienen buena inmunogenicidad, pueden producir títulos elevados de anticuerpos neutralizantes en animales y pueden utilizarse para preparar una vacuna para prevenir la infección por VPH.

Ejemplo 6.12: Evaluación de la inmunogenicidad de las partículas similares al virus VPH58 L1: 33C en animales Los métodos y procedimientos experimentales fueron los mismos que en el Ejemplo 6.1. La secuencia L1 fue de Uniprot P26535 y la secuencia L2 fue de Uniprot B6ZB12.

Los resultados del ensayo de título de neutralización del pseudovirus sérico VPH58 se detallan en la Tabla 15. Tabla 15 EC50 del ensayo de título de neutralización sérica en ratones (GMT±SEM)

Los resultados de la evaluación anterior muestran que las partículas similares al virus VPH58 L1:33C preparadas por la presente invención tienen buena inmunogenicidad, pueden producir títulos elevados de anticuerpos neutralizantes en animales y pueden utilizarse para preparar una vacuna para la prevención de la infección por VPH.

Ejemplo comparativo 1: Expresión de VPH16L1 truncado C-terminal (aa 1-474)

Los inventores intentaron truncar el C-terminal del VPH16L1 en 31 aminoácidos y lo denominaron VPH16L1 (1-474) (SEQ ID NO: 27). Sin embargo, en el estudio se encontró que la proteína VPH16L1 (1-474) truncada estaba altamente expresada pero tiene muy poca solubilidad y es difícil de extraer y purificar; los resultados detallados de la expresión y extracción se muestran en la Figura 3.

Apéndice 1: LISTADO DE SECUENCIAS - PROTEÍNA L1 DEL VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO QUIMÉRICO TIPO 6

-499.

6 L1

Apéndice 2: LISTADO DE SECUENCIAS - PROTEINA L1 DEL PAPILLOMAVIRUS HUMANO CIMERICO TIPO 11

-499.

1 L1

Apéndice 3: LISTADO DE SECUENCIAS - PROTEINA L1 DEL VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO QUIMERICO TIPO 16

H16

Apéndice 4: LISTADO DE SECUENCIAS - PROTEINA L1 DEL VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO QUIMERICO TIPO 18

H18

Apéndice 5: LISTADO DE SECUENCIAS - PROTEINA L1 DEL PAPILLOMAVIRUS HUMANO CIMERICO TIPO 31

1 L1

Apéndice 6: LISTADO DE SECUENCIAS - PROTEINA L1 DEL VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO QUIMERICO TIPO 35

H35

Apéndice 7: LISTADO DE SECUENCIAS - PROTEINA L1 DEL VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO QUIMERICO TIPO 39

9 L1

Apéndice 8: LISTADO DE SECUENCIAS - PROTEINA L1 DEL VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO QUIMERICO TIPO 45

-499.

H45

Apéndice 9: LISTADO DE SECUENCIAS - PROTEINA L1 DEL PAPILLOMAVIRUS HUMANO CIMERICO TIPO 51

-499.

H51

Apéndice 10: LISTADO DE SECUENCIAS - PROTEINA L1 DEL PAPILLOMAVIRUS HUMANO CIMERICO TIPO 52

-499.

H52

Apéndice 11: LISTADO DE SECUENCIAS - PROTEINA L1 DEL VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO QUIMÉRICO TIPO 56

H56

Apéndice 12: LISTADO DE SECUENCIAS - PROTEINA L1 DEL VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO QUIMÉRICO TIPO 58

-499.

H58

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una proteína quimérica L1 del virus del papiloma humano (VPH) que comprende, desde su orientación N-terminal hasta la C-terminal,

2. La proteína L1 de VPH quimérica según la reivindicación 1, en donde dicha proteína L1 del primer tipo de VPH se selecciona entre proteínas L1 de los tipos de VPH 6, 11, 16, 18, 31, 35, 39, 45, 51, 52, 56 o 58; preferiblemente, seleccionada entre

Proteína L1 del VPH tipo 6 codificada por el gen que se muestra en SEQ ID No: 5,

Proteína L1 del VPH tipo 11 codificada por el gen que se muestra en SEQ ID No: 18,

Proteína L1 del VPH tipo 16 codificada por el gen que se muestra en SEQ ID No: 31,

Proteína L1 del VPH tipo 18 codificada por el gen que se muestra en SEQ ID No: 44,

Proteína L1 del VPH tipo 31 codificada por el gen que se muestra en SEQ ID No: 57,

Proteína L1 del VPH tipo 35 codificada por el gen que se muestra en SEQ ID No: 70,

Proteína L1 del VPH tipo 39 codificada por el gen que se muestra en SEQ ID No: 83,

Proteína L1 del VPH tipo 45 codificada por el gen que se muestra en SEQ ID No: 96,

Proteína L1 del VPH tipo 51 codificada por el gen que se muestra en SEQ ID No: 109,

Proteína L1 del VPH tipo 52 codificada por el gen que se muestra en SEQ ID No: 122,

Proteína L1 del VPH tipo 56 codificada por el gen que se muestra en SEQ ID No: 135, o

Proteína L1 del VPH tipo 58 codificada por el gen que se muestra en SEQ ID No: 148.

3. La proteína quimérica VPH L1 según la reivindicación 1 o 2, opcionalmente seleccionada de la proteína quimérica VPH L1 de los tipos VPH 6, 11, 16, 18, 31, 35, 39, 45, 51, 52, 56, y 58 tiene 98%, 98,5%, 99%, 99, 5% o 100% de identidad con SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 16, SEQ ID No: 29, SEQ ID No: 42, SEQ ID No: 55, SEQ ID No: 68, SEQ ID No: 81, SEQ ID No: 94, SEQ ID No: 107, SEQ ID No: 120, SEQ ID No: 133 y SEQ ID No: 146, respectivamente.

4. Una partícula similar al VPH, que comprende la proteína L1 del VPH quimérica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Una composición inmunogénica para la prevención de enfermedades o infecciones asociadas al VPH, que comprende las partículas similares al VPH según la reivindicación 4 y adyuvantes.

6. Un polinucleótido aislado que codifica la proteína L1 del VPH quimérica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que opcionalmente el polipéptido se selecciona de

la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína quimérica L1 del VPH tipo 6 que se muestra en SEQ ID No: 4,

la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína quimérica L1 del VPH tipo 11 que se muestra en SEQ ID No: 17,

la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína quimérica L1 del VPH tipo 16 que se muestra en SEQ ID No: 30,

la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína quimérica L1 del VPH tipo 18 que se muestra en SEQ ID No: 43,

la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína quimérica L1 del VPH tipo 31 que se muestra en SEQ ID No: 56,

la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína quimérica L1 del VPH tipo 35 que se muestra en SEQ ID No: 69,

la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína quimérica L1 del VPH tipo 39 que se muestra en SEQ ID No: 82,

la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína quimérica L1 del VPH tipo 45 que se muestra en SEQ ID No: 95,

la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína quimérica L1 del VPH tipo 51 que se muestra en SEQ ID No: 108,

la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína quimérica L1 del VPH tipo 52 que se muestra en SEQ ID No: 121,

la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína quimérica L1 del VPH tipo 56 que se muestra en SEQ ID No: 134, o

la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína quimérica L1 del VPH tipo 58 que se muestra en SEQ ID No: 147.

7. Un vector que comprende el polinucleótido según la reivindicación 6, opcionalmente en donde dicho vector es un vector de baculovirus.

8. Un baculovirus que comprende el polinucleótido según la reivindicación 6.

9. Una célula huésped que comprende un polinucleótido según la reivindicación 6, un vector según la reivindicación 7, o un baculovirus según la reivindicación 8, opcionalmente en donde la célula huésped es una célula de insecto, preferiblementedicha célula de insecto se selecciona entre células Sf9, células Sf21, células Hi5 y células S2.

10. Un método para preparar una partícula similar al VPH según la reivindicación 4 que comprende, cultivar células huésped de la reivindicación 9 para expresar dicha proteína L1 de VPH quimérica y ensamblarlas en partículas similares a virus; y

purificar dichas partículas similares al VPH, opcionalmente en donde dicha purificación se lleva a cabo utilizando cromatografía de intercambio catiónico, preferiblemente, dicha cromatografía de intercambio catiónico es cromatografía HS-MMA de dos pasos.