ES3034683T3 - Multispecific antigen-binding molecule with improved internalization characteristics - Google Patents

Multispecific antigen-binding molecule with improved internalization characteristics

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ES3034683T3
ES3034683T3 ES17704190T ES17704190T ES3034683T3 ES 3034683 T3 ES3034683 T3 ES 3034683T3 ES 17704190 T ES17704190 T ES 17704190T ES 17704190 T ES17704190 T ES 17704190T ES 3034683 T3 ES3034683 T3 ES 3034683T3
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Napel Hendrik Ten
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Abstract

La presente invención se refiere a una molécula multiespecífica de unión a antígeno que comprende un primer dominio de unión a antígeno y un segundo dominio de unión a antígeno. El primer dominio se une específicamente a una molécula diana (T) y el segundo dominio se une específicamente a una proteína efectora internalizante (E). El segundo dominio de unión a antígeno tiene una constante de disociación (KD) con una E de entre 10-4 y 10-4 M. Esta molécula multiespecífica de unión a antígeno es útil en un método para el tratamiento y/o la prevención del cáncer. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Molécula de unión a antígeno multiespecífica con características de intemalización mejoradas
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un anticuerpo multiespecífico, a composiciones que comprenden dicho anticuerpo multiespecífico y al uso de dicho anticuerpo multiespecífico en el tratamiento de una enfermedad.
Antecedentes de la invención
Desde el desarrollo de los primeros anticuerpos monoclonales, la investigación se ha dirigido a seguir optimizando los anticuerpos para la terapia humana. Los primeros anticuerpos monoclonales procedían de ratones y ratas. Los avances en la tecnología de anticuerpos han conducido a la disponibilidad de anticuerpos humanizados y humanos con perfiles de riesgo de inmunogenicidad reducidos. La ingeniería genética y química está conduciendo al desarrollo de anticuerpos más potentes con un mayor potencial terapéutico. Esto incluye anticuerpos con funciones efectoras optimizadas mediadas por Fc, características de unión optimizadas o actividad antitumoral optimizada a través de la conjugación con moléculas tóxicas (conjugados anticuerpo-fármaco).
Los conjugados anticuerpo-fármaco (ADC, por sus siglas en inglés) se perfilan como agentes terapéuticos potentes para el tratamiento del cáncer, ya que combinan el direccionamiento a tumores mediado por anticuerpos con la actividad citotóxica de las toxinas. Los ADC comprenden un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, un fragmento variable monocatenario [scFv] o un anticuerpo biespecífico) unido a una carga útil citotóxica o a un fármaco. La ventaja de dirigir los fármacos citotóxicos a los tumores con un anticuerpo contra un antígeno asociado a tumor es que se puede mejorar la ventana terapéutica con respecto al fármaco citotóxico no conjugado. Esto permite la aplicación de cargas útiles citotóxicas de mayor potencia.
En la actualidad, ya se han aprobado dos ADC para su uso terapéutico: brentuximab vedotina (Adcetris) para el tratamiento del linfoma de Hodgkin recidivante y el LACGs recidivante, y trastuzumab emtansina (Kadcyla), para el tratamiento de pacientes con cáncer de mama metastásico, HER2-positivo, que previamente recibieron trastuzumab y un taxano, por separado o en combinación. Además, actualmente se están evaluando clínicamente más de 50 ADC diferentes. En muchos casos, los ADC dependen de la internalización de las moléculas de anticuerpo conjugado con toxina en las células diana para liberar su carga útil e inducir la citotoxicidad posterior. La mayoría de los ADC en desarrollo clínico se diseñan para ser estables en circulación y liberar su carga útil citotóxica después de la internalización y el procesamiento lisosómico del complejo antígeno/ADC.
Sin embargo, el requisito de internalización mediada por antígenos y anticuerpos limita el número de dianas ADC adecuadas. Muchos antígenos asociados a tumores no se internalizan bien o no se encaminan bien a los lisosomas y, por lo tanto, representan dianas candidatas menos prometedoras para los agentes terapéuticos a base de ADC. Además, en muchos casos, el procesamiento intracelular de los ADC es ineficiente. Después de la interiorización, receptores tales como transferrina, HER2, molécula de adhesión celular L1 e integrinas, se reciclan continuamente desde el compartimento endosómico a la membrana plasmática. Por lo tanto, se requiere una alta rotación de antígenos, una translocación eficiente a los lisosomas y cargas útiles altamente tóxicas para conseguir la máxima actividad de eliminación de los ADC.
Pueden usarse métodos para potenciar la internalización, el direccionamiento lisosómico, el procesamiento intratumoral e intracelular de los ADC, para potenciar la actividad de eliminación de células tumorales de los ADC. Un enfoque para optimizar la actividad de los ADC consiste en seleccionar un epítopo específico en la diana asociada a tumor, ya que el epítopo específico reconocido puede influir en la internalización y el encaminamiento lisosómico. Por ejemplo, se ha demostrado previamente que la eficacia de los HER2-ADC puede mejorarse seleccionando HER2-ADC que permitan una internalización potenciada por transporte acoplado(piggybacking)de HER2 sobre otras moléculas ErbB a través de la formación de heterodímeros. Esto proporciona una estrategia atractiva para aumentar el suministro de ADC y la capacidad de eliminación de células tumorales en células tumorales tanto con alta como con baja expresión de HER2.
Generalmente, se prefiere la internalización eficiente del ADC, seguida de su encaminamiento a los lisosomas, donde puede tener lugar la proteólisis. Para muchas proteínas de la superficie celular y estructuras de hidratos de carbono en células tumorales, sin embargo, la magnitud de estos procesos es insuficiente para permitir una eliminación celular suficientemente potente por el ADC.
La solicitud de patente internacional WO2013/138400 describe anticuerpos multiespecíficos que tienen un primer dominio que se une específicamente a un antígeno diana tal como IL-4R o SOST, y un segundo dominio que se une específicamente a una proteína efectora internalizante. Si el antígeno diana es un antígeno asociado a tumor, la unión del antígeno asociado a tumor y la proteína efectora internalizante por el anticuerpo multiespecífico facilita la eliminación selectiva de las células tumorales. El documento WO2013/138400 enseña además la producción de anticuerpos biespecíficos que comprenden un primer dominio de unión a antígeno y un segundo dominio de unión a antígeno, en donde el primer dominio de unión a antígeno se une a una molécula diana (T) y en donde el segundo dominio de unión a antígeno se une a una proteína efectora internalizante (E) para aumentar la internalización. Los ejemplos muestran la reducción del receptor de IL-4 usando un anticuerpo biespecífico anti-IL-4R/anti-CD63 debido al aumento de la internalización del receptor. Los anticuerpos biespecíficos anti-SOST/anti-CD63 o anti-LPS/anti-CD63 aumentan la internalización de SOST y LPS, respectivamente. Se sugiere usar las construcciones biespecíficas para aumentar la internalización de ADC.
La solicitud de patente internacional WO2015/157592 produce ADC anti-HER2 biespecíficos, en donde ambos dominios de unión se unen a HER2, pero en regiones diferentes. El ADC biespecífico muestra una internalización mejorada en comparación con el ADC monoespecífico y un efecto antitumoralin vitroein vivomejorado.
El documento EP2808035 divulga el uso de anticuerpos biespecíficos para inducir el agotamiento de proteínas de membrana. En los ejemplos se muestra la producción del anticuerpo biespecífico anti-Met/anti-HER2 y del anticuerpo anti-Met/anti-EGFR.
La solicitud de patente internacional WO2017/007796 divulga un anticuerpo biespecífico anti-LPS/CD63 o anti-IL-4R/CD63 o anti-SOST/CD63, pero no divulga el intervalo de KD reivindicado limitado ni un efecto vinculado al intervalo reivindicado.
Un objetivo de la presente invención consiste en proporcionar anticuerpos biespecíficos o multiespecíficos cuya capacidad de internalización aumente con respecto a los anticuerpos monoespecíficos contra una diana asociada a tumor.
Otro objeto de la presente invención consiste en proporcionar moléculas de conjugado anticuerpo-fármaco biespecífico o multiespecífico cuya capacidad de internalización aumente con respecto a la molécula de conjugado anticuerpofármaco monoespecífico dirigida contra una diana asociada a tumor.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar ADC con internalización, direccionamiento lisosómico y/o procesamiento intracelular aumentados en células tumorales.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar ADC con citotoxicidad aumentada para las células tumorales y/o menos efectos secundarios.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar ADC con una ventana terapéutica aumentada.
Otro objeto de la presente invención es permitir la generación de ADC eficaces contra antígenos asociados a tumores que se internalizan mal o que se encaminan mal a los lisosomas.
Sumario de la invención
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un anticuerpo multiespecífico, que comprende un primer dominio de unión a antígeno y un segundo dominio de unión a antígeno, en donde el primer dominio se une específicamente a una molécula diana (T), que es una molécula diana expresada en la superficie celular y en donde el segundo dominio se une específicamente a una proteína efectora internalizante (E), en donde E es CD63, y en donde el segundo dominio de unión a antígeno tiene una constante de disociación K<d>con E de entre 2,0*10-9y 7,3*10' 9 M, determinándose la K<d>mediante interferometría de biocapas.
Los presentes inventores han descubierto que el intervalo de afinidad específico del segundo dominio de unión a antígeno confiere propiedades sorprendentemente ventajosas al anticuerpo multiespecífico de la presente invención. El segundo dominio de unión a antígeno se encuentra dentro de un intervalo específico de afinidades de unión para inducir fácilmente la internalización del anticuerpo multiespecífico, así como para inducir la citotoxicidad del anticuerpo conjugado con fármaco. Esto se aplica en particular cuando el primer dominio se une específicamente a un antígeno asociado a tumor tal como, por ejemplo, h ER2. Al mismo tiempo, el segundo dominio de unión a antígeno ejerce sólo una internalización y una citotoxicidad limitadas (cuando se emplea en el contexto de un ADC) dentro del intervalo específico de afinidades de unión, sin unión del primer dominio de unión, es decir, demostrando una citotoxicidad sorprendentemente baja en células que expresan la proteína efectora internalizante (E) en ausencia de la diana asociada a tumor (T). Por lo tanto, el anticuerpo multiespecífico de la presente invención demuestra unión, internalización, encaminamiento lisosómico y liberación de toxinas en células tumorales, acompañados de internalización, encaminamiento lisosómico y liberación mínimos de toxinas en células no tumorales.
También se ha descubierto por los presentes inventores que el anticuerpo multiespecífico de la presente invención permite la utilización de antígenos tumorales que por lo general no se internalizan o se internalizan mal, potenciando de este modo considerablemente el conjunto de posibles dianas de los ADC.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a la molécula de unión a antígeno multiespecífica, en donde la molécula se conjuga con un resto citotóxico, un radioisótopo o un fármaco. En otros aspectos, la presente invención se refiere al uso del anticuerpo multiespecífico en un método para tratar y/o prevenir un cáncer, y al uso del anticuerpo multiespecífico en un método de direccionamiento a un tumor en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto el anticuerpo multiespecífico o ADC.
En otros aspectos, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo multiespecífico como principio activo, a uno o más ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo multiespecífico, a un vector de expresión que contiene dicho uno o más ácidos nucleicos y que es capaz de expresar dicho uno o más ácidos nucleicos en una única o múltiples estirpes celulares hospedadoras procariotas o eucariotas, según proceda, y a estirpes celulares hospedadoras procariotas o eucariotas que comprenden dicho uno o más vectores.
Definiciones
Unión, afinidad y K<d>
El término "unión", como se usa en el presente documento, se refiere a la unión de un anticuerpo a un antígeno o diana predeterminados, por ejemplo, con una afinidad de unión correspondiente a un valor de K<d>de aproximadamente 10<-8>M o menos.
El lector experto estará familiarizado con el concepto de afinidad y la constante de disociación de equilibrio K<d>. La constante de disociación K<d>puede medirse mediante interferometría de biocapas.
Los valores de K<d>pueden determinarse mediante interferometría de biocapas (BLI, por sus siglas en inglés) en un instrumento Octet HTX usando el anticuerpo, como ligando inmovilizado y el antígeno como analito.
K<d>(M) se refiere a la constante de equilibrio de disociación de una interacción particular entre un anticuerpo multiespecífico y un antígeno, preferentemente la interacción entre un único brazo de unión de una molécula de anticuerpo y un antígeno, y puede obtenerse dividiendo k<d>por k<a>. La expresión "k<d>" (s<-1>), como se usa en el presente documento, se refiere a la constante de velocidad de disociación de una interacción particular entre un anticuerpo y un antígeno. Dicho valor también se denomina la k<dis>, el valor de k<disociación>o la velocidad de desactivación. La expresión "k<a>" (M<-1>x s<-1>), como se usa en el presente documento, se refiere a la constante de velocidad de asociación de una interacción particular entre un anticuerpo multiespecífico y un antígeno. Dicho valor también se denomina el valor de k<asociación>o velocidad de asociación.
Anticuerpo
Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" (Ab, por sus siglas en inglés) en el contexto de la presente invención se refiere a una molécula de inmunoglobulina, a un fragmento de una molécula de inmunoglobulina o a un derivado de cualquiera de los mismos, que tiene la capacidad de unirse específicamente a un antígeno, preferentemente de unión doble a dos antígenos diferentes, tal como para anticuerpos biespecíficos, en condiciones fisiológicas normales durante un periodo definido funcionalmente relevante para inducir, promover, potenciar y/o modular una respuesta fisiológica asociada a la unión del anticuerpo al antígeno.
Las regiones variables de la molécula de inmunoglobulina (ya sea de las cadenas pesadas y/o ligeras o sólo de las cadenas pesadas) contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos (Ab) pueden mediar en la unión de la inmunoglobulina a FcRn. Un anticuerpo también puede ser un anticuerpo biespecífico o multiespecífico, tal como, pero sin limitación: moléculas de DuoCuerpo, scFv en tándem, scFv-Fc en tándem, IgG de botón en ojal, scFv-Fc de botón en ojal, scFv-Fc-scFv, F(ab')2, Fab-scFv, (Fab'scFv)2, Diacuerpo, scDiacuerpo, scDiacuerpo-Fc o scDiacuerpo-CH3, Triomab, LC común de IgG kih, CrossMab, DVD-Ig, IgG 2 en 1, IgG-scFv, bi-Nanocuerpo, BiTE, TandAb, DART, DART-Fc, scFv-HSA-scFv, ortoFab-IgG, Tv-IgG tetravalentes, formatos de acoplamiento y cerradura (DNL, por sus siglas en inglés) tales como DNL-Fab3 y armazón Azymetric, o molécula similar.
Como se ha indicado anteriormente, el término anticuerpo, en el presente documento, a menos que se especifique lo contrario o que el contexto lo contradiga claramente, incluye fragmentos de un anticuerpo que son fragmentos de unión a antígeno, es decir, conservan la capacidad de unirse específicamente al antígeno. Se ha demostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo puede realizarse mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de unión a antígeno incluidos en el término "anticuerpo" incluyen (i) un fragmento Fab' o Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1, o un anticuerpo monovalente como se describe en el documento WO2007059782 (Genmab); (ii) fragmentos F(ab')2, fragmentos bivalentes que comprenden dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región de bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste esencialmente en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste esencialmente en los dominios VL y VH de un único dominio de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb, que consiste esencialmente en un dominio VH y también se denomina anticuerpos de dominio; (vi) de camélido o nanocuerpos y (vii) una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, estén codificados por genes separados, estos pueden unirse, usando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que les permite formarse como una única cadena de proteína en la que las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como anticuerpos monocatenarios o Fv monocatenarios (scFv)). Dichos anticuerpos monocatenarios se incluyen en el término anticuerpo a menos que se indique otra cosa o lo indique claramente el contexto. Estos y otros fragmentos de anticuerpos útiles en el contexto de la presente invención, así como formatos biespecíficos de dichos fragmentos, se analizan adicionalmente en el presente documento. También debe entenderse que el término anticuerpo, a menos que se indique otra cosa, también incluye anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales (mAb), polipéptidos similares a anticuerpos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y totalmente humanos, y fragmentos de anticuerpos que conservan la capacidad de unirse específicamente al antígeno (fragmentos de unión a antígeno) proporcionados mediante cualquier técnica conocida, tal como escisión enzimática, síntesis peptídica y técnicas de expresión recombinante. Un anticuerpo generado de este modo puede poseer cualquier isotipo.
Como se usa en el presente documento, "isotipo" se refiere a la (sub)clase de inmunoglobulina (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE o IgM) que está codificada por los genes de la región constante de cadena pesada.
La expresión "anticuerpo monovalente" significa, en el contexto de la presente invención, que una molécula de anticuerpo es capaz de unirse a no más de una sola molécula del antígeno.
La expresión "anticuerpo bivalente" significa, en el contexto de la presente invención, que la molécula de anticuerpo contiene dos dominios de unión para un antígeno específico y, por lo tanto, es capaz de unir una o dos moléculas de ese antígeno
Generación de anticuerpos multiespecíficos
Los anticuerpos multiespecíficos, en particular los anticuerpos biespecíficos, de la presente invención pueden generarse a través del intercambio controlado Fab-brazo (FAE) como se describe enLabrijn et al., Efficient generation of stable bispecific IgG1 by controlled Fab-arm exchange, PNAS, vol. 110, N ° 13, págs. 5145-5150, marzo de 2013,en el documento WO 2011/131746 A2 o enLabrijn et al. Controlled Fab-arm exchange for the generation of stable bispecific IgG1, Nat Protoc, octubre de 2014; 9(10):2450-63,también conocido como tecnología DuoBody®. Resumiendo, en este métodoin vitro,se proporcionan dos anticuerpos diferentes, ambos comprenden una región Fc de una inmunoglobulina con una región CH3, en donde las secuencias de las respectivas regiones CH3 son diferentes y contienen una mutación coincidente. Como resultado, la interacción heterodimérica entre las regiones CH3 primera y segunda es más fuerte que cada una de las interacciones homodiméricas de dichas regiones CH3 primera y segunda. Los anticuerpos se incuban en condiciones reductoras para permitir que las cisteínas de la región bisagra experimenten la isomerización de los enlaces disulfuro y para obtener el anticuerpo biespecífico mediante el intercambio controlado de brazos Fab. A continuación, el agente reductor se retira de las mezclas (que ahora contienen anticuerpos biespecíficos) para permitir la oxidación de los enlaces disulfuro. Las secuencias de dichas regiones CH3 contienen mutaciones coincidentes, es decir, mutaciones en diferentes posiciones en las dos regiones CH3, preferentemente una mutación en la posición 405 en una de las regiones CH3 de una molécula de IgG1 y una mutación en la posición 409 en la región CH3 de otra molécula de IgG1. Los anticuerpos multiespecíficos también pueden generarse usando otras tecnologías y formatos, tales como, pero sin limitación: scFv en tándem, scFv-Fc en tándem, IgG de botón en ojal, scFv-Fc de botón en ojal, scFv-Fc-scFv, F(ab')2, Fab-scFv, (Fab'scFv)2, Diacuerpo, scDiacuerpo, scDiacuerpo-Fc o scDiacuerpo-CH3, Triomab, LC común de IgG kih, CrossMab, DVD-Ig, IgG 2 en 1, IgG-scFv, bi-Nanocuerpo, BiTE, TandAb, DART, DART-Fc, scFv-HSA-scFv, ortoFab-IgG, Tv-IgG tetravalentes, formatos de acoplamiento y cerradura (DNL, por sus siglas en inglés) tales como DNL-Fab3 y armazón Azymetric, o molécula similar.
Inducción de la internalización de un anticuerpo multiespecífico
La unión de T y E por el anticuerpo multiespecífico induce preferentemente la internalización del anticuerpo multiespecífico de la presente invención, así como la citotoxicidad de un anticuerpo multiespecífico conjugado con fármaco de la presente invención, en mayor medida que la unión a la diana T sola. Por ejemplo, la internalización inducida por la unión, preferentemente la unión simultánea, de T y E por el anticuerpo multiespecífico puede ser más del 10 %, tal como más del 20 %, más del 30 %, más del 40 %, más del 50 %, más del 60 %, más del 70 %, más del 80 %, más del 90 %, más del 100 %, más del 110 %, más del 150 %, más del 200 %, más del 300 %, más del 400 %, más del 500 %, más del 750 %, más del 1000 %, más del 2000 % o más del 5000 % superior al nivel de internalización medido en presencia de una construcción de control que contenga solamente unión a T y no a E.
Un ejemplo no limitante para determinar si el anticuerpo multiespecífico de la presente invención potencia la internalización del anticuerpo multiespecífico en mayor medida que la unión de la molécula diana (T) por el primer dominio solo se muestra en los ensayos de colocalización de los Ejemplos 5 y 8, o en el ensayo de modulación negativa de HER2 del Ejemplo 9, como se analiza a continuación. En esos ejemplos, T es HER2 y E es CD63. En cuanto al concepto de internalización potenciada, en el Ejemplo 13 y 14, la internalización potenciada de anticuerpos multiespecíficos se demuestra usando Integrina beta-1 (CD29) como diana (T) y CD63 como proteína efectora internalizante (E) que está induciendo la internalización potenciada.
Los presentes inventores han descubierto que, en particular cuando E es CD63, el intervalo de afinidad específico del segundo dominio de unión a antígeno confiere propiedades sorprendentemente ventajosas al anticuerpo biespecífico de la presente invención. La unión monovalente del dominio de unión a antígeno a E dentro del intervalo de afinidad específico de una constante de disociación Kd 2,0*10-9y 7,3*10-9 M induce fácilmente la internalización de anticuerpos biespecíficos y la citotoxicidad de anticuerpos conjugados con fármaco biespecíficos, cuando el primer dominio se une específicamente a un antígeno asociado a tumor expresado en la superficie celular, tal como, por ejemplo, HER2. Por otra parte, cuando sólo hay presente E y no el antígeno diana asociado a tumor (T), el segundo dominio de unión a antígeno ejerce sólo una contribución limitada a la internalización del anticuerpo multiespecífico y la citotoxicidad de los anticuerpos conjugados con fármaco multiespecíficos dentro de este intervalo de afinidad específico, es decir, demostrando una citotoxicidad sorprendentemente baja o ausente en células que expresan la proteína efectora internalizante (E) en ausencia de la diana tumoral (T). Por lo tanto, el anticuerpo multiespecífico de la presente invención demuestra unión, internalización, acumulación lisosómica en células tumorales, acompañadas de una internalización mínima en células no tumorales.
CD63
La molécula de Grupo de Diferenciación 63 (CD63, ID de Uniprot P08962) también es conocida como glicoproteína 3 de membrana asociada al lisosoma (LAMP-3). CD63 también se conoce como: glicoproteína plaquetaria 40 (Pltgp40), antígeno de melanoma ME491 o MLA1, antígeno asociado al melanoma ocular (OMA81H), tetraspanina-30 (TSPAN30), granulofisina o proteína 1 de membrana integral lisosómica (LIMP-1). CD63 es un miembro de la superfamilia de las tetraspaninas y se expresa ubicuamente. El gen de CD63 se ubica en el cromosoma humano 12q13 y fue la primera tetraspanina caracterizada. Originariamente, CD63 se descubrió como una proteína presente en la superficie celular de las plaquetas sanguíneas activadas, conocida como Pltgp40 y en células de melanoma humano en estadio inicial, donde se conocía como ME491.
CD63 se expresa en muchos tipos celulares. Entre otros, CD63 se expresa intracelularmente en lisosomas, endosomas, gránulos de plaquetas y basófilos en reposo. La expresión en la superficie celular de CD63 puede detectarse en basófilos y plaquetas, monocitos, macrófagos y granulocitos activados. CD63 también se expresa en las células endoteliales, fibroblastos, osteoblastos, tejido neural, células de melanoma, células musculares lisas y mastocitos. Se ha descrito que CD63 se desplaza entre la membrana plasmática y los compartimentos intracelulares.
La mayor parte de CD63 reside en compartimentos intracelulares tales como endosomas y lisosomas, pero puede encontrarse cierta expresión en la superficie celular. Se ha descrito que CD63 regula el transporte de otras proteínas normalmente a través de endocitosis. Además, se ha descrito que CD63 regula la expresión superficial de la metaloproteinasa de matriz de tipo 1 de la membrana dirigiendo la enzima para la degradación lisosómica, y el silenciamiento de CD63 en células endoteliales impide la internalización del receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR2) en respuesta a su ligando VEGF. También entre tipos tumorales diferentes, se ha demostrado que CD63 se desplaza continuamente entre la membrana plasmática y los lisosomas, lo que dependía de la presencia de AP2 y clatrina. Por lo tanto, CD63 parece un antígeno atractivo para facilitar la internalización y la liberación lisosómica, una característica adecuada para potenciar la eficacia de determinados conjugados anticuerpofármaco (ADC) dirigidos a antígenos tumorales que por sí mismos no se internalizan y/o se transportan a los lisosomas suficientemente.
La expresión de CD63 no muestra una expresión específica de tumor, aunque CD63 se descubrió por primera vez como un antígeno de superficie expresado abundantemente en células de melanoma en estadio inicial. La expresión de CD63 en la superficie celular se reduce durante la progresión del melanoma maligno, lo que indica una correlación negativa entre la expresión de CD63 en la superficie celular y la invasividad tumoral.
Antígenos asociados a tumores
Los antígenos asociados a tumores son antígenos que se expresan en la superficie de (determinadas) células tumorales y cuya expresión superficial se encuentra en menor medida en las células normales. Como se usa en el presente documento, la expresión "antígeno asociado a tumor" se refiere a proteínas o polipéptidos, pero también a hidratos de carbono, glicoproteínas, lípidos, lipoproteínas, lipopolisacáridos u otros polímeros no proteicos que se expresan preferentemente en la superficie (externa) de una célula tumoral. La expresión "expresado preferentemente", como se usa en este contexto, significa que el antígeno se expresa en una célula tumoral a un nivel que es al menos el 10 %, tal como al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 100 %, al menos el 110 %, al menos el 150 %, al menos el 200 %, al menos el 300 %, al menos el 400 %, al menos el 500 %, al menos el 750 %, al menos el 1000 %, al menos el 2000 % o al menos el 5000 % superior al nivel de expresión del antígeno en células no tumorales. Los antígenos asociados a tumores pueden derivar de cualquier proteína, glicoproteína u otras macromoléculas sintetizadas por la célula tumoral.
Los antígenos asociados a tumores pueden agruparse en diferentes clases de antígenos: 1) Antígenos testiculares de cáncer restringidos por HLA de clase l que se expresan normalmente en los testículos o en algunos tumores, pero no en los tejidos normales, incluyendo antígenos de las familias MAGE, BAGE, GAGE, NY-ESO y BORIS; 2) Antígenos de diferenciación restringidos por HLA de clase I, incluyendo antígenos de diferenciación de melanocitos tales como MART-1, gp100, PSA, Tirosinasa, TRP-1 y TRP-2; 3) Antígenos expresados ampliamente, que son antígenos que se expresan tanto en el tejido normal como en el tumoral, aunque a niveles diferentes o con productos de traducción alterados, incluyendo CEA, HER2/neu, hTERT, MUC1, MUC2 y WT1; 4) Antígenos tumorales específicos que son antígenos únicos que surgen de mutaciones de genes normales, incluyendo p-catenina, a-fetoproteína, MUM, RAGE, SART, etc.; 5) Antígenos víricos tales como VPH, VEB; y 6) Proteínas de fusión, que son proteínas creadas mediante reordenamientos cromosómicos tales como supresiones, translocaciones, inversiones o duplicaciones que dan como resultado una nueva proteína expresada exclusivamente por las células tumorales, tales como Bcr-Abl.
Los ejemplos preferidos de antígenos asociados a tumores incluyen 5T4, A33, receptor de activina, receptores de adrenomedulina, AFP, AGS-5, ALK, anexina, AXL, B7-H3, B7-H4, proteínas BAGE, BCMA, Bombesina, antígeno de C33, C4.4a, (receptor) similar a la lectina de tipo C, CA19.9, CA-125, CADM1, CAIX, CanAg, CAR, anhidrasa carbónica, Caveolina-1, CCK2R, CD4, CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD27, CD30, CD33, CD37, CD38, CD44, CD51, CD57, CD70, CD73, CD74, CD79a, CD79b, CD80, CEA, CEACAM, c-kit, claudina, receptores de quimiocinas (es decir, CXCR4, CXCR5), c-Met, Cripto-1, DEC-205, Derlina-1, Desmogleína-3, DIk-1, DLL3, DS6, E-cadherina, E-Selectina, EAG-1, ED-B, EpCAM, e Gf R, EGFRvlII, emmprina, receptor de endotelina, ErbB2/Her2, ErbB3, ErbB4, ETV6-AML, Receptor de efrina de tipo A, Epirregulina, ETA, FAP-alfa, FcyR's, FGFR, FOLR1, Frizzled, Fyn3, Galectina, Gangliósidos, GCC, GD2, GD3, GloboH, lipicano-3, GLUT3, GP<n>M<b>, Receptores acoplados a proteína G (es decir, GPR49), gp100, Hsp, HLA/B-raf, HLA-DR, HLA/k-ras, HLA MAG E-A3, HMW-MAA, hTERT, ICAM-3, IGF-R, IL-13-R, L1CAM, receptor de laminina, LIV1, LMP2, LRP5, LRP6, proteínas MAGE, MART-1, melanotransferrina, mesotelina, metaloproteinasa, ML-IAP, Mucinas, Mud, Mud 6 (CA-125), MU M1, N-cadherina, NA17, NCAM-1, Nectin4, Notch, NP-55, NRP1, NY-BR1, NY-BR62, NY-BR85, NY-ES01, PLAC1, PRLR, PRAME, prominina-1, PSMA (FOLH 1), RON, SLC44A4, SLITRK6, Steap-1, Steap-2, survivina, sindecano, TAG-72, TF, TGF-p, TMPRSS2, TMEFF2, TNFR, Tn, TROP2, TRP-1, TRP-2, TWEAKR, tirosinasa, uroplacina-3 y VEGFR.
Los ejemplos preferidos de antígenos asociados a tumores incluyen antígenos asociados a tumores que están altamente sobreexpresados, pero carecen de suficiente transporte lisosómico, tales como proteínas ancladas a glucosilfosfatidilinositol (GPI) (es decir, familia de glipicano, uPAR, receptores de unión a folato, prostasina, FcgRlllb [CD16b], fosfatasa alcalina, acetilcolinesterasa, 5' nucleotidasa [p36], Cripto, LFA-3 [CD58], DAF [CD55], Thy-1 [CD90], Qa-2, Ly-6A y MIRL [CD59]), moléculas de adhesión (es decir, selectinas, L1CAM, N-CAM, LRP1, T<a>G1, cadherinas), que con frecuencia se reciclan de nuevo a la membrana plasmática después de la endocitosis, y sólo una fracción minoritaria se destina a la degradación lisosómica.
Los ejemplos preferidos de antígenos asociados a tumores incluyen antígenos específicos de tumores que se sabe que interactúan con CD63, lo que puede mejorar la unión bivalente de bsADC en números de copias bajos. Por ejemplo, se ha descrito que CD63 interactúa con otras tetraspaninas (es decir, CD81, CD82, CD9 y CD151), integrinas, MHCII, CXCR4, TM4SF5, sintenina-1, TIMP-1, H, K-ATPasa, L6-antígeno y MT1-MMP.
Los ejemplos de antígenos asociados a tumores incluyen la selección de glicodianas tales como, Lewis-Y (CD174), Lewis-X (CD15), SLe<X>, SLe<A>, sTn, fucosil-GM1, Globo H, SSEA-3, GM2, GD2, GD3, Ácidos polisiálicos o glicoproteínas (es decir, mucinas).
Descripción de las figuras
La Figura 1 muestra una curva dosis-respuesta de la unión de anticuerpos anti-CD63 a CD63 humano recombinante medida mediante ELISA.
La Figura 2 muestra mediciones de afinidad de variantes de afinidad de anticuerpos anti-CD63 medidas con interferometría de Bio-Capas sin marcador.
La Figura 3 muestra los resultados de un ensayo de viabilidad para someter a ensayo la citotoxicidad de los ADC monovalentes bsCD63<N74H>xb12-Duo3 y bsHER2xCD63<N74H>-Duo3 en células Colo205.
La Figura 4 muestra los resultados de un ensayo de viabilidad para someter a ensayo la citotoxicidad de los ADC monovalentes bsCD63<n74H>xb12-Duo3 y bsHER2xCD63<N74H>-Duo3 en células SK-OV-3.
La Figura 5 muestra los resultados de un ensayo de viabilidad para someter a ensayo la citotoxicidad de los ADC monovalentes bsCD63<n74H>xb12-Duo3 y bsHER2xCD63<N74H>-Duo3 en células HCC1954.
La Figura 6 muestra la colocalización lisosómica de moléculas biespecíficas monovalentes bsCD63<N74H>xb12 medida en células SK-OV-3 con microscopía confocal.
La Figura 7 muestra la unión de bsHER2xCD63<N74H>a células SK-OV-3 determinada mediante citometría de flujo.
La Figura 8 muestra la acumulación intracelular del anticuerpo contra CD63 conjugado con FITC y de los anticuerpos variantes de afinidad contra CD63 en granulocitos y trombocitos.
La Figura 9 muestra la colocalización lisosómica de bsHER2xCD63<N74H>en células SK-OV-3 seguida a lo largo del tiempo.
La Figura 10 muestra la cantidad total de proteína HER2 en estirpes celulares tumorales con diferentes niveles de expresión de HER2, cuantificada mediante ELISA después de tres días de incubación con bsHER2xCD63<N74H>, en comparación con células sin tratar.
La Figura 11 muestra los resultados de un ensayo de viabilidad para someter a ensayo la citotoxicidad de los ADC biespecíficos conjugados con Duostatina-3in vitro.
La Figura 12 muestra el tamaño tumoral medio y el porcentaje de supervivencia sin tumor en ratones a los que se habían inoculado xenoinjertos tumorales de SK-OV-3 por vía subcutánea, seguido de tratamiento con ADC multiespecíficos conjugados con Duostatina-3.
La Figura 13 muestra la unión de bsBeta1xCD63<N74H>a células SK-OV-3 evaluada mediante citometría de flujo. La Figura 14 muestra la colocalización lisosómica de bsBeta1xCD63<N74H>en células SK-OV-3.
La Figura 15 muestra la colocalización lisosómica de bsBeta1xCD63<N74H>en células SK-OV-3 seguida a lo largo del tiempo.
Descripción detallada de la invención
En un aspecto, la presente invención se refiere a un anticuerpo multiespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno y un segundo dominio de unión a antígeno, en donde el primer dominio se une específicamente a una molécula diana (T), que es un antígeno asociado a tumor expresado en la superficie celular, y en donde el segundo dominio se une específicamente a una proteína efectora internalizante (E), en donde E es CD63, y en donde el segundo dominio de unión a antígeno tiene un valor de constante de disociación K<d>con E de entre 2,0*10<-9>y 7,3*10<' 9>M, determinándose la Kd mediante interferometría de biocapas.
Para proporcionar especificidad tumoral al anticuerpo multiespecífico de la presente invención, en ausencia del primer dominio de unión a antígeno, el segundo dominio que se une específicamente a la proteína efectora internalizante (E), puede ventajosamente no unirse o sólo unirse con baja afinidad y posteriormente no internalizarse o al menos internalizarse en un grado significativamente menor. Los presentes inventores han descubierto que un anticuerpo multiespecífico en donde el segundo dominio de unión a antígeno tiene un valor de constante de disociación Kd con E de entre 2,0*10<-9>y 7,3*10<-9>M cumple estos criterios.
La molécula diana (T), preferentemente una molécula diana asociada a tumor, puede ser una proteína, polipéptido, lípido u otra macromolécula. En una realización preferida, la molécula diana es una proteína. En otra realización, la molécula diana, preferentemente una molécula diana asociada a tumor es un polipéptido. En algunas realizaciones, T es una proteína diana o polipéptido diana expresado en la superficie celular. En otras realizaciones, T es una proteína diana o polipéptido diana soluble, preferentemente uno que interactúa con un receptor de la superficie celular. La unión a la diana por el anticuerpo multiespecífico puede tener lugar extracelularmente o en la superficie celular.
En una realización, la molécula diana es un receptor expresado en la superficie celular. En una realización preferida, la molécula diana es una tirosina cinasa receptora, preferentemente una tirosina cinasa receptora transmembrana. En otra realización, la molécula diana es un ligando unido a membrana.
El anticuerpo multiespecífico, preferentemente anticuerpo biespecífico, puede unirse a E en la superficie celular o en el interior de la célula.
Se prefiere particularmente que la molécula diana sea una proteína o polipéptido asociado a tumor. Ventajosamente, el antígeno asociado a tumor es un antígeno que no se internaliza habitualmente o que se internaliza mal. Preferentemente, el antígeno asociado a tumor es un antígeno que muestra un encaminamiento ineficiente hacia el compartimento lisosómico.
En una realización preferida, el anticuerpo multiespecífico comprende i) un primer brazo de unión que comprende el primer dominio de unión a antígeno y ii) un segundo brazo de unión que comprende el segundo dominio de unión a antígeno.
Se prefiere particularmente que el anticuerpo multiespecífico sea un anticuerpo biespecífico.
Preferentemente, el anticuerpo multiespecífico se internaliza en la célula por medio de la unión a E solamente en presencia de la molécula diana (T). También se prefiere que el anticuerpo multiespecífico se internalice en la célula mediante la unión a E sólo cuando el primer dominio está específicamente unido a la molécula diana (T).
El anticuerpo multiespecífico puede, tras unirse a E, internalizarse más eficientemente en las células que expresan T en comparación con las células que no expresan T.
El anticuerpo multiespecífico puede, tras unirse a T, internalizarse más eficientemente en las células que expresan E en comparación con las células que no expresan E.
El anticuerpo multiespecífico puede, tras unirse a E, transportarse al compartimento lisosómico en células que expresan T.
El anticuerpo multiespecífico puede, tras unirse a E, transportarse más eficientemente al compartimento lisosómico en las células que expresan T en comparación con las células que no expresan T.
El anticuerpo multiespecífico puede, tras unirse a T, transportarse más eficientemente al compartimento lisosómico en las células que expresan E en comparación con las células que no expresan E.
La estrategia de potenciación de la internalización de la presente invención implica combinar un antígeno diana asociado a tumor con las capacidades de internalización de CD63. En particular, los anticuerpos biespecíficos que se unen tanto a CD63 como a una diana asociada a tumor pueden ser útiles en contextos terapéuticos en los que se desea un direccionamiento específico y una internalización potenciada de un conjugado anticuerpo-fármaco. De acuerdo con una realización, T es HER2.
De acuerdo con otra realización, el primer y/o el segundo dominio de unión a antígeno comprende al menos una región variable de anticuerpo, preferentemente al menos dos regiones variables de anticuerpos.
De acuerdo con algunas realizaciones, el anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo biespecífico, o un fragmento de anticuerpo multiespecífico, preferentemente biespecífico. También se ha divulgado una parte del mismo obtenida por ingeniería recombinante. Se prefiere particularmente un anticuerpo biespecífico. Un anticuerpo biespecífico puede emplearse para usar las propiedades potenciadoras de la internalización de un antígeno uniéndose al mismo con un brazo, y unirse a una molécula diana, tal como una molécula diana asociada a tumor, con el otro brazo del anticuerpo biespecífico. Después, un anticuerpo biespecífico de este tipo puede cargarse con un conjugado citotóxico para inducir la muerte celular tras la internalización del ADC.
El anticuerpo puede ser un anticuerpo biespecífico, que comprende (i) un primer anticuerpo que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a una molécula diana (T) como se define en el presente documento, y (ii) un segundo anticuerpo que comprende un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a una proteína efectora internalizante (E) como se define en el presente documento.
En una realización preferida, el anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo biespecífico que comprende un primer brazo de unión que comprende el primer dominio de unión a antígeno y un segundo brazo de unión que comprende dicho segundo dominio de unión a antígeno. Ventajosamente, dicho primer dominio de unión a antígeno comprende una primera secuencia variable de cadena pesada (VH) y una primera secuencia variable de cadena ligera (VL), y dicho segundo dominio de unión a antígeno comprende una segunda secuencia variable de cadena pesada (VH) y una segunda secuencia variable de cadena ligera (VL) y en donde dichas secuencias variables comprenden cada una tres secuencias de CDR, CDR1, CDR2 y CDR3.
En una realización preferida, (i) dicho primer brazo de unión comprende una primera cadena pesada que comprende una primera secuencia variable de cadena pesada (VH) y una primera secuencia constante de cadena pesada (CH), y una primera cadena ligera que comprende una primera secuencia variable de cadena ligera (VL) y una primera secuencia constante de cadena ligera (CL), y (ii) dicho segundo brazo de unión comprende una segunda cadena pesada que comprende una segunda secuencia variable de cadena pesada (VH) y una segunda secuencia constante de cadena pesada (CH), y una segunda cadena ligera que comprende una segunda secuencia variable de cadena ligera (VL) y una segunda secuencia constante de cadena ligera (CL).
De acuerdo con otra realización, el primer brazo de unión deriva de un anticuerpo quimérico o de un anticuerpo humanizado o de un anticuerpo humano. También se han divulgado anticuerpos en donde, el segundo brazo de unión deriva de un anticuerpo quimérico o de un anticuerpo humanizado o de un anticuerpo humano. En consecuencia, el primer brazo de unión puede derivar de un anticuerpo humano y el segundo brazo de unión deriva de un anticuerpo humanizado o de un anticuerpo quimérico.
Se prefiere que el anticuerpo multiespecífico de la presente invención sea un anticuerpo biespecífico, en donde el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo de longitud completa, preferentemente un anticuerpo IgG1.
El anticuerpo multiespecífico de la invención puede aislarse. Un "anticuerpo multiespecífico aislado", como se usa en el presente documento, tiene por objeto referirse a un anticuerpo multiespecífico, tal como un anticuerpo biespecífico, que está sustancialmente exento de otras moléculas de unión a antígeno o anticuerpos que tengan especificidades antigénicas diferentes. Por otra parte, un anticuerpo multiespecífico aislado puede estar sustancialmente exento de otro material celular y/o productos químicos.
Dicho segundo dominio de unión a antígeno puede tener una o más mutaciones que modulen la afinidad del segundo dominio de unión a antígeno con CD63. Dicho segundo dominio de unión a antígeno puede derivar de un anticuerpo que tenga una o más mutaciones en la VH y/o VL que module la afinidad del segundo dominio de unión a antígeno con E.
Dicho anticuerpo puede tener una o más mutaciones en la región Fab anti-CD63 que module la afinidad del segundo dominio de unión a antígeno con CD63. La mutación puede ser una única sustitución de aminoácido, preferentemente una única sustitución de aminoácido histidina.
Dicha una o más mutaciones en la VH y/o VL puede ser una sustitución de aminoácidos, preferentemente una sustitución de histidina, en la posición 54 de la VL de acuerdo con la SEQ ID NO: 5 de la Tabla 1 a continuación, o en las posiciones 71, 72 y/o 74 de la VH de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 de la Tabla 1 a continuación. Por ejemplo, anti-CD63-N74H tiene una mutación de asparagina a histidina en la posición 74 de la cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID NO: 1, anti-CD63-LN54H tiene una mutación de asparagina a histidina en la posición 54 de la cadena ligera de acuerdo con la SEQ ID NO: 5. El segundo dominio de unión a antígeno puede seleccionarse de manera que se una a la diana E con una K<d>dentro del intervalo de afinidad preferido.
Dicha sustitución de aminoácido, preferentemente una sustitución de histidina preferentemente en la posición 74 de la VH de acuerdo con la SEQ ID NO: 1. Preferentemente, la mutación es N74H de la VH de acuerdo con la SEQ ID NO: 1.
En una realización preferida, dicho segundo dominio, preferentemente como parte de dicho segundo brazo de unión, comprende:
a) CDR de VH 1, 2, y 3 como se proporcionan en las SEQ ID NO: 2, 3 y 4, respectivamente, y CDR de VL 1, 2, y 3 como se proporcionan en las<s>E<q>ID NO: 9, 7 y 8, respectivamente, o
b) CDR de<v>H 1, 2, y 3 como se proporcionan en las SEQ ID NO: 2, 10 y 4, respectivamente, y CDR de VL 1, 2, y 3 como se proporcionan en las SEQ ID NO: 6, 7 y 8, respectivamente, o
c) CDR de VH 1, 2, y 3 como se proporcionan en las SEQ<i>D NO: 2, 11 y 4, respectivamente, y CDR de VL 1, 2, y 3 como se proporcionan en las SEQ ID NO: 6, 7 y 8, respectivamente, o
d) CDR de VH 1, 2, y 3 como se proporcionan en las SEQ iD NO: 2, 12 y 4, respectivamente, y CDR de VL 1, 2, y 3 como se proporcionan en las SEQ ID NO: 6, 7 y 8, respectivamente.
En una realización particularmente preferida, dicho segundo dominio, preferentemente como parte de dicho segundo dominio de unión, comprende las CDR de VH 1, 2 y 3 como se proporcionan en las SEQ ID NO: 2, 12 y 4, respectivamente, y CDR de VL 1,2, y 3 como se proporcionan en las S<e>Q ID NO: 6, 7 y 8, respectivamente.
Dicho anticuerpo multiespecífico puede comprender una región Fab mutada de un anticuerpo monoclonal específico de CD63. Dicho anticuerpo multiespecífico puede comprender una región Fab mutada de un Ab monoclonal específico de CD63 2192. Dicho anticuerpo multiespecífico puede comprender una región de unión a antígeno específica para CD63 seleccionada de una biblioteca de hibridomas o de presentación en fagos.
De acuerdo con otra realización, dichos dominios de unión a antígeno primero y segundo son cada uno un par de un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo y un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo.
El anticuerpo biespecífico puede comprender además preferentemente regiones constantes de anticuerpo.
El anticuerpo multiespecífico puede ser un anticuerpo biespecífico de diana (T)xCD63 asociada a tumor. El anticuerpo biespecífico (T)xCD63 puede conjugarse con un fármaco citotóxico. El anticuerpo biespecífico (T)xCD63 puede conjugarse con duostatina-3. El anticuerpo biespecífico (T)xCD63 puede conjugarse con duostatina-3 y el dominio de unión anti-CD63, que es el segundo dominio de unión, puede comprender las CDR de VH 1, 2, y 3 como se proporcionan en las SEQ ID NO: 2, 12 y 4, respectivamente, y CDR de VL 1,2, y 3 como se proporcionan en las SEQ ID NO: 6, 7 y 8, respectivamente. En particular, los conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) biespecíficos de diana asociada a tumor (T)xCD63 son útiles en entornos terapéuticos en los que se desea un direccionamiento específico y una internalización potenciada del conjugado anticuerpo-fármaco. Los inventores han descubierto que los ADC biespecíficos (T)xCD63 de la presente invención son más eficaces para eliminar células que expresan T diana que los ADC monoespecíficos que se dirigen solamente al antígeno asociado a tumor. Dichos ADC son más potentes en la erradicación de células tumoralesin vitroy en modelos animales que los ADC biespecíficos de la técnica anterior.
Los ADC biespecíficos (T)xCD63 de la presente invención resultan ventajosos al potenciar la internalización del ADC al poder unirse tanto a la diana asociada a tumor como a las características de internalización potentes del antígeno<c>D63, induciendo de este modo una mayor eliminación de células mediante un suministro más eficaz de la carga útil en el interior de las células diana. Para adaptarse a la necesidad de aumentar la eficacia de los anticuerpos dirigidos contra diversos antígenos tumorales, se encontró un estrecho intervalo de variantes de afinidad de CD63 sorprendentemente eficientes (que abarcan un intervalo de afinidades CD63) para potenciar la eficacia de los ADC biespecíficos.
De acuerdo con otra realización, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico HER2xCD63.
El anticuerpo puede tener un valor de CE50 para la unión a células que expresan diana asociada a tumor (T), tales como células que expresan HER2, inferior a 5,0 pg/ml, tal como inferior a 4,0 pg/ml, tal como inferior a 3,0 pg/m como inferior a 2,0 pg/ml, tal como inferior a 1,0 pg/ml, tal como inferior a 0,9 pg/ml, tal como inferior a 0,8 pg/m como inferior a 0,7 pg/ml, tal como inferior a 0,6 pg/ml, tal como inferior a 0,5 pg/ml, tal como inferior a 0,4 pg/m como inferior a 0,3 pg/ml, tal como inferior a 0,2 pg/ml, tal como inferior a 0,1 pg/ml, tal como inferior a 0,05 pg/ml, tal como inferior a 0,01 pg/ml, como se determina mediante citometría de flujo.
La unión de T y E por el anticuerpo multiespecífico puede inducir la internalización del anticuerpo multiespecífico en mayor medida que la unión de T por el primer dominio solo. De manera similar, la unión de T y E por los anticuerpos multiespecíficos de la presente invención induce preferentemente citotoxicidad en mayor medida que la unión de T por el primer dominio solo.
La unión de T y E por el anticuerpo multiespecífico, preferentemente biespecífico, puede inducir la internalización del anticuerpo multiespecífico en mayor medida que el correspondiente anticuerpo monoespecífico bivalente que se une a T. De manera similar, la unión de T y E por los anticuerpos multiespecíficos, preferentemente biespecíficos, conjugados con fármacos de la presente invención induce preferentemente citotoxicidad en mayor medida que los correspondientes ADC monoespecíficos bivalentes de unión a T.
El valor de Kd puede determinarse mediante interferometría de biocapas a 30 °C. El valor de Kd puede determinarse mediante interferometría de biocapas a 30 °C y un pH de entre 7,2 y 7,5, tal como entre 7,3 y 7,4, tal como pH 7,4. Kd puede determinarse mediante interferometría de biocapas a 30 °C a una velocidad de agitación de 1000 RPM. Kd puede determinarse mediante interferometría de biocapas usando un sistema Octet, tal como Octet HTX (ForteBio).
En una realización preferida, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico que comprende:
i) un primer brazo de unión que comprende una primera cadena pesada que comprende una primera secuencia constante de cadena pesada (CH), comprendiendo dicha primera CH una primera región CH3, y
ii) un segundo brazo de unión que comprende una segunda cadena pesada que comprende una segunda secuencia constante de cadena pesada (CH), comprendiendo dicha segunda CH una segunda región CH3,
en donde las secuencias de dichas regiones CH3 primera y segunda son diferentes y son de manera que una interacción heterodimérica entre dicho brazo de unión primer y segundo es más fuerte que una interacción homodimérica de cada uno de dichos brazos de unión primer y segundo.
Preferentemente, en dicha primera región CH3 de cadena pesada al menos uno de los aminoácidos en una posición correspondiente a las posiciones T366, L368, K370, D399, F405, Y407 o K409 de la cadena pesada de IgG1 humana se ha sustituido, y en dicha segunda región CH3 de cadena pesada al menos uno de los aminoácidos en una posición correspondiente a las posiciones T366, L368, K370, D399, F405, Y407 o K409 de la cadena pesada de IgG1 humana se ha sustituido, en donde dichas cadenas pesadas primera y segunda no están sustituidas en las mismas posiciones, y en donde las posiciones de aminoácidos se numeran de acuerdo con el índice EU.
En otra realización, (i) la primera región CH3 tiene una sustitución F405L y la segunda región CH3 tiene una sustitución K409R, o (ii) la primera región CH3 tiene una sustitución K409R y la segunda región CH3 tiene una sustitución F405L.
La molécula de anticuerpo multiespecífico se conjuga con un resto citotóxico, un radioisótopo, un fármaco, una citocina o un vehículo silenciador de ARN. Preferentemente, el anticuerpo multiespecífico se conjuga con un resto citotóxico, un radioisótopo o un fármaco. Preferentemente, el anticuerpo multiespecífico se conjuga con un resto citotóxico.
El resto citotóxico puede seleccionarse del grupo que consiste en duostatina-3, duostatina-5, pirrolobenzodiazepina o un análogo o derivado de las mismas, toxinas basadas en IGN o un análogo o derivado de las mismas, alfa-amanitina o un análogo o derivado de la misma, dolastatina o un análogo o derivado de la misma, taxol; citocalasina B; gramicidina D; bromuro de etidio; emetina; mitomicina; etopósido; tenopósido; vincristina; vinblastina; colchicina; doxorrubicina; daunorrubicina; dihidroxiantracindiona; un inhibidor de tubulina tal como maitansina o un análogo o derivado de la misma; mitoxantrona; mitramicina; actinomicina D; 1-deshidrotestosterona; un glucocorticoide; procaína; tetracaína; lidocaína; propranolol; puromicina; caliqueamicina o un análogo o derivado de la misma, un antimetabolito tal como metotrexato, 6 mercaptopurina, 6 tioguanina, citarabina, fludarabina, 5 fluorouracilo, decarbazina, hidroxiurea, asparaginasa, gemcitabina o cladribina; un agente alquilante tal como mecloretamina, tiotepa, clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU), lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, dacarbacina (DTIC), procarbazina, mitomicina C, cisplatino, carboplatino, duocarmicina A, duocarmicina SA, raquelmicina (CC-1065) o un análogo o derivado de la misma; un antibiótico tal como dactinomicina, bleomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, idarrubicina, mitramicina, mitomicina, mitoxantrona, plicamicina, antramicina (AMC)); un agente antimitótico tal como una auristatina o un análogo o derivado de las misma, monometil auristatina E o F o un análogo o derivado de las mismas; toxina diftérica y moléculas relacionadas tales como la
cadena A diftérica y fragmentos activos de la misma y moléculas híbridas, toxina de ricina tal como ricina A o una toxina de cadena de ricina A desglicosilada, toxina colérica, una toxina de tipo Shiga tal como SLT I, SLT II, SLT IIV, toxina LT, toxina C3, toxina Shiga, toxina pertúsica, toxina tetánica, inhibidor de la proteasa Bowman-Birk de la soja, exotoxina dePseudomonas,alorina, saporina, modeccina, gelanina, cadena de abrina A, cadena de modecina A, alfasarcina, proteínas deAleurites fordii,proteínas de diantina, proteínas dePhytolacca americanatales como PAPI, PAPII y PAP S, inhibidor deMomordica charantia,curcina, crotina, inhibidor deSaponaria officinalis,gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina y toxinas de enomicina; ribonucleasa (RNasa); DNasa I, enterotoxina A estafilocócica; proteína antivírica de fitolaca americana; toxina diftérica, endotoxina dePseudomonasy ARNi (es decir, ARNip, ARNhp conjugado con un anticuerpo o suministrado en una nanopartícula).
De acuerdo con otra realización, el resto citotóxico se selecciona del grupo que consiste en maitansina, caliqueamicina, duocarmicina, duostatina, duostatina-3, duostatina-5, raquelmicina (CC-1065), auristatina, monometil auristatina E, monometil auristatina F, doxorrubicina, dolastatina, pirrolobenzodiazepina, toxinas basadas en IGN, alfa-amanitina.
El resto citotóxico, fármaco o radioisótopo puede estar unido a dicho anticuerpo, o fragmento del mismo, con un enlazador escindible, tal como 4-(2-piridilditio)-pentanoato de W-succinimidilo (SSP), maleimidocaproil-valina-citrulinap-aminobenciloxicarbonilo (mc-vc-PAB) o AV-1 K-lock valina-citrulina.
La expresión "enlazador escindible", como se usa en el presente documento, se refiere a un subconjunto de enlazadores que son catalizados por proteasas específicas en la célula diana o en el microambiente tumoral, dando como resultado la liberación del agente citotóxico. Los ejemplos de enlazadores escindibles son enlazadores basados en motivos químicos que incluyen disulfuros, hidrazonas o péptidos. Otro subconjunto de enlazadores escindibles, añade un motivo enlazador adicional entre el agente citotóxico y el enlazador primario, es decir, el sitio que une la combinación enlazador-fármaco al anticuerpo. En algunas realizaciones, el motivo enlazador adicional es escindible por un agente escindible que está presente en el entorno intracelular (por ejemplo, dentro de un lisosoma o endosoma o caveola). El enlazador puede ser, por ejemplo, un enlazador de peptidilo que es escindible con una enzima peptidasa o proteasa intracelular, incluyendo, pero sin limitación, una proteasa lisosómica o endosómica. En algunas realizaciones, el enlazador peptídico tiene una longitud de al menos dos aminoácidos o de al menos tres aminoácidos. Los agentes de escisión pueden incluir catepsinas B y D y plasmina, todas ellas conocidas por hidrolizar derivados de fármacos de tipo dipéptido dando como resultado la liberación del fármaco activo dentro de las células diana (véase, por ejemplo, Dubowchik y Walker, 1999,Pharm. Therapeutics83:67-123). En una realización específica, el enlazador de peptidilo escindible por una proteasa intracelular es un enlazador Val-Cit (valina-citrulina) o un enlazador Phe-Lys (fenilalanina-lisina) (véase, por ejemplo, el documento US6214345, que describe la síntesis de doxorrubicina con el enlazador Val-Cit). Una ventaja de usar la liberación proteolítica intracelular del agente terapéutico es que el agente se atenúa normalmente cuando se conjuga y que las estabilidades de los conjugados en suero son normalmente altas.
el agente citotóxico, fármaco o radioisótopo puede estar unido a dicho anticuerpo, o fragmento del mismo, con un enlazador no escindible, tal como succinimidil-4(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (MCC) o maleimidocaproilo (MC).
La expresión "enlazador no escindible", como se usa en el presente documento, se refiere a un subconjunto de enlazadores que, a diferencia de los enlazadores escindibles, no comprenden motivos que sean reconocidos específica y predeciblemente por proteasas intracelulares o extracelulares. Por lo tanto, los ADC basados en enlazadores no escindibles no se liberan ni se escinden del anticuerpo hasta que el complejo anticuerpo-enlazadorfármaco completo se degrada en el compartimento lisosómico. Los tioéteres son un ejemplo de un enlazador no escindible. En otra realización más, la unidad enlazadora no puede escindirse y el fármaco se libera mediante degradación de anticuerpos.
La unión de T y E por el anticuerpo multiespecífico puede inducir la internalización del anticuerpo multiespecífico en mayor medida que la unión a la diana T sola.
Los anticuerpos multiespecíficos divulgados en el presente documento pueden generarse usando tecnologías o formatos tales como, pero sin limitación: DuoCuerpo, CrossMab, Triomab, LC común de IgG kih, DVD-Ig, IgG 2 en 1, IgG-scFv, bi-Nanocuerpo, BiTE, TandAb, DART, DART-Fc, scFv-HSA-scFv, ortoFab-IgG, Tv-IgG tetravalentes, formatos de acoplamiento y cerradura (DNL) tales como DNL-Fab3, o fragmentos tales como scFv en tándem, scFv-Fc en tándem, IgG de botón en ojal, scFv-Fc de botón en ojal, scFv-Fc-scFv, F(ab')2, Fab-scFv, (Fab'scFv)2, Diacuerpo, scDiacuerpo, scDiacuerpo-Fc, scDiacuerpo-CH3 o armazón Azymetric.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un fragmento de anticuerpo biespecífico del anticuerpo multiespecífico, en donde el fragmento de anticuerpo es un scFv en tándem, scFv-Fc en tándem, scFv-Fc de botón en ojal, scFv-Fc-scFv, F(ab')<2>, Fab-scFv, (Fab'scFv)<2>, Diacuerpo, scDiacuerpo, scDiacuerpo-Fc, scDiacuerpo-C<H>3.
En otro aspecto, la presente invención se refiere al anticuerpo multiespecífico o al fragmento de anticuerpo biespecífico para su uso en un método para tratar y/o prevenir un cáncer. El sujeto tratado en dicho método es preferentemente un individuo humano que necesita dicho tratamiento, tal como un paciente de cáncer. El cáncer puede ser cáncer de mama, incluyendo cáncer de mama primario, metastásico y refractario.
En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de endometrio/de cuello del útero, cáncer de pulmón, melanoma maligno, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer de testículos, un tumor de tejidos blandos tal como sarcoma sinovial, cáncer de mama, tumor cerebral, leucemia, linfoma, mastocitoma, cáncer renal, cáncer de cuello del útero, cáncer de vejiga, cáncer de esófago, cáncer gástrico o cáncer colorrectal.
Las dosis eficaces y las pautas posológicas para el anticuerpo multiespecífico dependen del cáncer que ha de tratarse. Un intervalo de ejemplo, no limitante, para una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo biespecífico de la presente invención es de aproximadamente 0,1-100 mg/kg, tal como aproximadamente 0,1-50 mg/kg, por ejemplo, aproximadamente 0,1-20 mg/kg, tal como aproximadamente 0,1-10 mg/kg, por ejemplo, aproximadamente 0,5, aproximadamente tal como 0,3, aproximadamente 1, aproximadamente 3, aproximadamente 5 o aproximadamente 8 mg/kg.
El anticuerpo multiespecífico puede administrarse profilácticamente con el fin de reducir el riesgo de desarrollar cáncer, retrasar el inicio de la aparición de un evento en la progresión del cáncer, o en un entorno adyuvante, y/o reducir el riesgo de reaparición cuando un cáncer está en remisión.
El método para tratar o prevenir un cáncer puede comprender la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de la molécula de anticuerpo multiespecífico de la presente invención y al menos un agente terapéutico adicional a un sujeto que lo necesite. Un agente terapéutico adicional de este tipo puede seleccionarse de un antimetabolito, tal como metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, fludarabina, 5-fluorouracilo, decarbazina, hidroxiurea, asparaginasa, gemcitabina o cladribina. Como alternativa, un agente terapéutico adicional de este tipo puede seleccionarse de un agente alquilante, tal como mecloretamina, tiotepa, clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU), lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, dacarbacina (DTIC), procarbazina, mitomicina C, cisplatino y otros derivados de platino, tales como carboplatino. Como alternativa, un agente terapéutico adicional de este tipo puede seleccionarse de un agente antimitótico, tal como taxanos, por ejemplo, docetaxel, paclitaxel y alcaloides de la vinca, por ejemplo, vindesina, vincristina, vinblastina y vinorelbina. Como alternativa, un agente terapéutico adicional de este tipo puede seleccionarse de un inhibidor de topoisomerasa, tal como topotecán o irinotecán, o un fármaco citostático, tal como etopósido y tenipósido. Como alternativa, un agente terapéutico adicional de este tipo puede seleccionarse de un inhibidor del factor de crecimiento, tal como un inhibidor de ErbB1 (EGFR) (tal como un anticuerpo contra EGFR, por ejemplo, zalutumumab, cetuximab, panitumumab o nimotuzumab u otros inhibidores del EGFR, tales como gefitinib o erlotinib), otro inhibidor de ErbB2 (HER2/neu) (tal como un anticuerpo contra HER2, por ejemplo, trastuzumab, trastuzumab-DMI o pertuzumab) o un inhibidor tanto de EGFR como de HER2, tal como lapatinib). Como alternativa, un agente terapéutico adicional de este tipo puede seleccionarse de un inhibidor de tirosina cinasa, tal como imatinib o lapatinib.
El anticuerpo multiespecífico puede ser para su uso en un método de direccionamiento a un tumor en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto el anticuerpo multiespecífico. Los tumores a los que puede dirigirse de acuerdo con la presente invención incluyen tumores malignos y no malignos. Los tumores malignos (incluyendo los primarios y metastásicos) que pueden tratarse incluyen, pero sin limitación, los que se producen en las glándulas suprarrenales; vejiga; huesos; mama; cuello del útero; glándulas endocrinas (incluyendo las glándulas tiroides, la hipófisis y el páncreas); colon; recto; corazón; tejido hematopoyético; riñón; hígado; pulmón; músculo; sistema nervioso; cerebro; ojo; cavidad oral; faringe; laringe; ovarios; pene; próstata; piel (incluyendo melanoma); testículos; timo; y útero. Los ejemplos de dichos tumores incluyen apudoma, coristoma, branquioma, síndrome carcinoide maligno, cardiopatía carcinoide, carcinoma (por ejemplo, Walker, basocelular, basoescamoso, Brown-Pearce, ductal, tumor de Ehrlich,in situ,Krebs 2, de célula de Merkel, mucinoso, de pulmón no microcítico, de célula de avena, papilar, escirrosa, bronquiolar, broncogénico, de células escamosas y de células de transición), plasmocitoma, melanoma, condroblastoma, condroma, condrosarcoma, fibroma, fibrosarcoma, tumores de células gigantes, histiocitoma, lipoma, liposarcoma, mesotelioma, mixoma, mixosarcoma, osteoma, osteosarcoma, sarcoma de Ewing, sinovioma, adenofibroma, adenolinfoma, carcinosarcoma, cordoma, mesenquimoma, mesonefroma, miosarcoma, ameloblastoma, cementoma, odontoma, teratoma, timoma, tumor trofoblástico, adenocarcinoma, adenoma, colangioma, colesteatoma, cilindroma, cistadenocarcinoma, cistadenoma, tumor de células de la granulosa, ginandroblastoma, hepatoma, hidradenoma, tumor de células de islote, tumor de células de Leydig, papiloma, tumor de células de Sertoli, tumor de células de teca, leiomioma, leiomiosarcoma, mioblastoma, mioma, miosarcoma, rabdomioma, rabdomiosarcoma, ependimoma, gangliocuroma, glioma, meduloblastoma, meningioma, neurilemoma, neuroblastoma, neuroepitelioma, neurofibroma, neuroma, paraganglioma, paraganglioma no cromafín, angioqueratoma, hiperplasia angiolinfática con eosinofilia, angioma esclerosante, angiomatosis, glomangioma, hemangioendotelioma, hemangioma, hemangiopericitoma, hemangiosarcoma, linfangioma, linfangiomiorna, linfangiosarcoma, pinealoma, carcinosarcoma, condrosarcoma, cistosarcoma filodes, fibrosarcoma, hemangiosarcoma, leiomiosarcoma, leucosarcoma, liposarcoma, linfangiosarcoma, miosarcoma, mixosarcoma, carcinoma de ovario, rabdomiosarcoma, sarcoma (por ejemplo, experimental de Ewing, de Kaposi y mastocitario), neoplasias y para otras células de este tipo. La administración puede incluir las vías intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral.
En otro aspecto más, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo multiespecífico como principio activo. Ventajosamente, dicha composición farmacéutica se formula con excipientes adecuados, tales como antioxidantes, agentes antibacterianos, agentes quelantes, agentes tamponantes, agentes colorantes, agentes aromatizantes, agentes diluyentes, agentes emulsionantes y/o agentes de suspensión. La composición farmacéutica puede administrarse mediante infusión, mediante inyección en embolada, mediante absorción a través de los revestimientos epiteliales o mucocutáneos. La composición farmacéutica de la presente invención puede comprender uno o más principios activos farmacéuticos adicionales, tales como sustancias citotóxicas o fármacos antineoplásicos.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a ácidos nucleicos, tales como moléculas de ADN, que codifican un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la presente invención. El ácido nucleico puede codificar las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos biespecíficos de la presente invención.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un vector de expresión que contiene dicho ácido nucleico y es capaz de expresar dicho ácido nucleico en estirpes celulares hospedadoras procariotas o eucariotas. También se proporciona o un conjunto de vectores de expresión que contienen dicho ácido nucleico y son capaces de expresar dicho ácido nucleico en estirpes celulares hospedadoras procariotas o eucariotas. Las cadenas pesada y ligera del anticuerpo pueden estar codificadas por el mismo vector o por vectores diferentes, dependiendo de la tecnología de anticuerpos biespecíficos utilizada. Dichos vectores de expresión pueden usarse para la producción recombinante de anticuerpos de la invención.
Un vector de expresión en el contexto de la presente invención puede ser cualquier vector adecuado, incluyendo vectores cromosómicos, no cromosómicos y de ácido nucleico sintético (una secuencia de ácido nucleico que comprende un conjunto adecuado de elementos de control de la expresión). Los ejemplos de dichos vectores incluyen derivados de SV40, plásmidos bacterianos, ADN de fago, baculovirus, plásmidos de levadura, vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fagos, y vectores de ácido nucleico (ARN o ADN) vírico. En una realización, los ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo están comprendidos en un vector de ADN o ARN desnudo, incluyendo, por ejemplo, un elemento de expresión lineal, un vector de ácido nucleico compactado, un vector plasmídico tal como pBR322, pUC 19/18 o pUC 118/119, un vector de ácido nucleico de tamaño mínimo "enano", o como una construcción de vector de ácido nucleico precipitado, tal como una construcción precipitada con CaP04.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a estirpes celulares hospedadoras procariotas o eucariotas que comprenden dichos vectores. Una célula hospedadora es una célula en la que se ha introducido el vector de expresión, es decir, el vector de expresión que codifica moléculas precursoras monoespecíficas homodiméricas cuando se usa la tecnología Duocuerpo para generar el anticuerpo biespecífico de la presente invención, o las células hospedadoras individuales que comprenden ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos biespecíficos de la invención. Las células hospedadoras recombinantes incluyen, por ejemplo, transfectomas, tales como células CHO, células HEK293, células NS/0 y células linfocíticas.
Ejemplos
Ejemplo 1: Generación de anticuerpos, mutagénesis dirigida al sitio y conjugación con Duostatina-3
La clonación y producción del anticuerpo contra HER2 humano IgG1-153 se ha descrito en otro sitio; de Goeij B.E.C.G.MAb,2014. 6(2): págs. 392-402. Las regiones de cadena pesada y ligera de dominio variable del anticuerpo contra CD63 monoclonal de ratón 2192 (véase la Tabla 1 a continuación, SEQ ID NO: 1 y 5) se obtuvieron del hibridoma 2.19 (Metzelaar M.J.).Virchows Arch B Cell Pathol Incl Mol Pathol,1991. 61(4): págs. 269-77), mediante 5'-RACE de las regiones variables a partir de ARN derivado de hibridoma y secuenciación. Las regiones variables se clonaron en el vector de expresión de mamíferos pcDNA3.3 (Invitrogen) que contiene los dominios constantes de cadena ligera humana relevantes (codón optimizado, Invitrogen) con las mutaciones de dominio constante de cadena pesada humana relevantes (K409R o F405L). El anticuerpo contra CD63 quimérico humano-ratón se denominó IgG1-CD63 de tipo silvestre. Las mutaciones del anticuerpo IgG1-CD63 se introdujeron en los dominios variables mediante mutagénesis dirigida al sitio o síntesis génica directa, con el objetivo de generar un panel de variantes de afinidad de IgG1-CD63. Las mutaciones de aminoácidos se indicaron en los nombres de los anticuerpos (es decir, anti-CD63-N74H tiene una mutación de asparagina a histidina en la posición de aminoácido 74 de la cadena pesada (SEQ ID NO: 1, Tabla 1), anti-CD63-LN54H tiene una mutación de asparagina a histidina en la posición 54 de la cadena ligera, como se numera en la SEQ ID NO: 5, Tabla 1. Se produjeron anticuerpos mediante cotransfección de vectores de cadena pesada y cadena ligera y expresión transitoria en células HEK-293 de estilo libre (Invitrogen) como se describe en Vink T.Methods,2014. 65(1): págs. 5-10. Se fabricaron anticuerpos biespecíficos (Duocuerpo) mediante intercambio controlado de brazos Fab como se describe en Labrijn A.F.Nat Protoc,2014. 9(10): págs. 2450-63. Se incluyó como control de isotipo el anticuerpo humano IgG1-b12 específico de gp120 del VIH, véase; Parren P.W.H.I.AIDS,1995. 9(6): págs. F1-6.
Se generaron anticuerpos conjugados con duostatina-3 mediante conjugación covalente de valina-citrulina-duostatina-3 (Duo3) en grupos de lisina de anticuerpos IgG1-HER2-F405L e IgG1-b12-F405L como se describe en de Goeij B.E.C.G.Mol Cáncer Ther.2015. 14(5):1130-40. Los ADC biespecíficos bsHER2xCD63-Duo3 y bsHER2xb12-Duo3 se generaron por intercambio de brazos Fab del anticuerpo conjugado con Duo3 IgG1-HER2-F405L-Duo3 con IgG1-CD63-K409R o IgG1-b12-K409R no conjugados. El a Dc biespecífico bsCD63xb12-Duo3 se generó mediante el intercambio de brazos Fab de IgG1-b12-F405L-Duo3 con IgG1-CD63-K409R. Todos los ADC biespecíficos tenían un DAR de 1. Para generar ADC de control con un DAR de 1, se intercambiaron brazos Fab de IgG1-HER2-F405L-Duo3 e IgG1-b12-F405L-Duo3 con IgG1-HER2-K409R e IgG1-b12-K409R, para generar IgG1-HER2-Duo3 e IgG1 b12-Duo3, respectivamente. El DAR de los ADC se determinó mediante cromatografía de interacción hidrófoba (HIC).
Tabla 1- Región variable de cadena pesada (VH), región variable de cadena ligera (VL) y secuencias CDR del anticuer o anti-CD632192
Ejemplo 2: ELISA de unión a CD63
Para mejorar la eficacia de los ADC, se generó un ADC biespecífico que se une específicamente a una proteína diana (T) con un brazo Fab, mientras que su segundo brazo Fab se une a una proteína efectora (E), que facilita la internalización y el suministro lisosómico de la carga útil citotóxica. El bsADC resultante debería inducir citotoxicidad en las células que expresan tanto T como E. También puede inducirse cierta citotoxicidad en las células que expresan T pero no E, mientras que el bsADC no debe inducir citotoxicidad en células que expresan E pero no T, se usa CD63 como proteína efectora (E). Para garantizar la especificidad tumoral del bsAb, es preferible que el brazo anti-CD63 (E) del bsAb no se una ni internalice en ausencia del brazo específico del tumor (T) o que sólo lo haga en un grado muy limitado. Se generó un panel de variantes de IgG1-CD63 con mutaciones en la región variable como se ha descrito anteriormente. Las variantes del anticuerpo IgG1-CD63 se cribaron mediante ELISA para determinar su unión a CD63 soluble. En pocas palabras, se recubrieron placas de ELISA (Greiner) durante la noche a 4 °C con 0,8 |jg/ml de IgG antihumana de cabra (Jackson). Las placas se bloquearon con suero de pollo al 2 % y se incubaron con 1 jg/m l de variantes mutadas con histidina del mAb 2192 anti-CD63. Se añadió CD63 humano recombinante diluido en serie (1 0,0005 jg/m l) (Creative Biomart) seguido de anti-poli-histidina-biotina de ratón 1 jg/m l (R&D). La reacción se visualizó usando ABTS y se detuvo con ácido oxálico. Se midió la fluorescencia a 405 nm y se representó usando el software GraphPad Prism 6.
Como se observa en la Figura 1, se encontró una gran variedad en las curvas de unión a CD63 para los diferentes anticuerpos anti-CD63 mutados con histidina. Para algunas de las variantes de afinidad, la unión a CD63 fue comparable a la de la IgG1-CD63 de tipo silvestre (wt, por sus siglas en inglés) (se denominan IgG1-CD63 wt), mientras que otras mostraron una pérdida parcial o completa de la unión.
Ejemplo 3: Mediciones de la afinidad de CD63
Se evaluó la cinética de unión de los anticuerpos anti-CD63 al segundo dominio extracelular recombinante humano de CD63 (Ala 103-Val 203) fusionado con un marcador de polihistidina en el extremo C y un péptido señal en el extremo N (Creative BioMart) mediante interferometría de biocapas sin marcador en un Octet HTX (ForteBio). Se inmovilizó IgG1-CD63 Wt o variantes de afinidad de la misma durante 1000 s en biosensores de captura de Fc de IgG antihumana (ForteBio) a 1 jg/ml. Se determinó la cinética de asociación y disociación de CD63 humano marcado con His (100 nM, 50 nM, 25 nM y 12,5 nM), las concentraciones se calcularon usando el peso molecular previsto de 13 kDa) en diluyente de muestras (ForteBio), usando un tiempo de asociación de 1000 s, un tiempo de disociación de 2000 s y una velocidad de agitación de 1000 rpm a 30 °C. Los trazos de datos se corrigieron usando un sensor de referencia expuesto al diluyente de la muestra sólo durante las etapas de asociación y disociación, el eje Y se alineó con el valor basal y se aplicaron la corrección entre etapas y el filtrado de Savitzky-Golay. La constante de velocidad de asociación Kasociación (1/Ms), la constante de velocidad de disociación Kdis (1/s) y la constante de disociación de equilibrio K<d>(M) se determinaron con el software de análisis de datos ForteBio v8.1, usando el modelo 1:1 y un ajuste global completo. Se usó un tiempo de disociación de 1000 s para el cálculo de la K<d>, excepto para las variantes de afinidad T71, P72, N74, Y121, lV49 y LY51 para las que se usó un tiempo de disociación de 200 s.
Se midió una amplia gama de afinidades de Ab que en el intervalo de 3,6 x 10'10 - 2,7 x 10'8 M para las diferentes variantes de anticuerpos anti-CD63 (véanse la Figura 2 y la Tabla 2). Por lo tanto, introduciendo sustituciones de un solo aminoácido histidina fue posible reducir la afinidad de IgG1-CD63 wt.
Tabla 2
Ejemplo 4: Citotoxicidad de variantes de afinidad de ADC bsCD63xHER2-Duo3 y variantes de afinidad de ADC monovalentes bsCD63xb12-Duo3 usando células HCC1954, SK-OV-3 y Colo205
La unión del bsADC a células tumorales que expresan tanto la proteína diana (T) como la proteína efectora (E), debería dar como resultado preferentemente a citotoxicidad. Sin embargo, en ausencia de la proteína diana asociada a tumor (T), preferentemente, los bsADC no deben inducir citotoxicidad. Se generaron varios bsADC dirigidos contra CD63 (E) y h ER2 (T), usando las diferentes variantes de afinidad anti-CD63. Las mismas variantes de afinidad anti-CD63 se usaron también para generar bsADC dirigidos a CD63 y a gp120 del VIH. gp120 de VIH es una proteína vírica que no se expresa en las células tumorales sometidas a ensayo. Por lo tanto, los bsADC dirigidos a CD63 y gp120 (es decir, los bsADC que contienen dominios de unión derivados de un anticuerpo contra CD63 y del anticuerpo IgG1-b12 específico de gp120), sólo pueden unirse a CD63, lo que refleja la actividad del ADC en tejido normal que carece de expresión de T.
La citotoxicidad de los bsADC se sometió a ensayo usando células HCC1954, SK-OV-3 y Colo205. Se sembraron células en placas de cultivo tisular de 96 pocillos (5.000 células/pocillo) y se incubaron durante 6 horas a 37 °C. Se añadieron ADC diluidos en serie (10-0,0005 pg/ml) y las células se incubaron durante 4 días a 37 °C. La viabilidad celular se evaluó mediante CellTiter-GLO (Promega), de acuerdo con las especificaciones del fabricante. El porcentaje de células viables se representó como un porcentaje con respecto a las células sin tratar (0 % de muerte celular) y a las células tratadas con estaurosporina (100 % de muerte celular).
Porcentaje de células viables = (UFR células tratadas con ADC - UFR células tratadas con estaurosporina) * 100 / (UFR células sin tratar - UFR células tratadas con estaurosporina)
UFR = unidades de fluorescencia relativas
Las Figuras 3-5 muestran la viabilidad celular después de 4 días de tratamiento con ADC diluidos en serie como porcentaje comparado con células sin tratar. Los datos mostrados son la media ± desviación estándar de al menos dos experimentos diferentes. Los valores de CI<50>de citotoxicidad se determinaron usando el software GraphPad Prism 6 y se representan en la Tabla 3.
Tabla 3- Valores de CI50
Los BsADC en las Figuras 3A, 4A y 5A tenían las afinidades más altas por CD63 (en el intervalo de 3,6 x 10<' 1°>- 7,8 x 10<' 1°>M; Tabla 2), indujeron citotoxicidad con valor de CI<50>bajo cuando se sometieron a ensayo como bsCD63xHER2-ADC, pero también mostraron cierta citotoxicidad cuando se sometieron a ensayo como bsCD63xb12-ADC. Los BsADC en las Figuras 3B, 4B y 5B tenían afinidades moderadas (en el intervalo de 2,0 x 10<' 9>- 7,3 x 10<' 9>M), indujeron citotoxicidad con un valor de CI<50>bajo cuando se sometieron a ensayo como bsCD63xHER2-ADC, y mostraron una citotoxicidad limitada cuando se sometieron a ensayo como bsCD63xb12-ADC. Los anticuerpos en las Figuras 3C, 4C y 5C tenían afinidades bajas (en el intervalo de 1,7 x 10<-8>- 2,7 x 10<-8>M), indujeron citotoxicidad con un valor de CI<50>escaso cuando se sometieron a ensayo como bsCD63xHER2-ADC, y mostraron casi ninguna citotoxicidad cuando se combinaron y se sometieron a ensayo como bsCD63xb12-ADC.
En conclusión, los anticuerpos contra CD63 representados en las Figuras 3B, 4B y 5B, con afinidades en el intervalo de 2,0 x 10<-9>- 7,3 x 10<-9>M, mostraron las características más favorables para el suministro potenciado de ADC.
Estos anticuerpos fueron capaces de inducir citotoxicidad con un valor de CI50 bajo como bsCD63xHER2-ADC, mientras que indujeron una citotoxicidad limitada como bsCD63xb12-ADC.
Ejemplo 5: Colocalización lisosómica de variantes de afinidad de ADC monovalentes bsCD63xb12
Se realizó un experimento de microscopía confocal para confirmar que los anticuerpos biespecíficos CD63xb12 con afinidad reducida por CD63 muestran menor internalización y transporte lisosómico. Se cultivaron células SK-OV-3 en cubreobjetos de vidrio (Thermo Fisher Scientific) a 37 °C durante 16 horas. Se añadió anticuerpo (2 y 10 |jg/ml) y las células se incubaron durante 16 horas a 37 °C. Las células se fijaron, se permeabilizaron y se incubaron 45 min con anti-IgG1 humana de cabra-FITC (Jackson) para teñir la IgG humana y anti-CD107a-APC humana de ratón (BD) para teñir los lisosomas. Los cubreobjetos se montaron (Calbiochem) en portaobjetos de microscopio y se tomaron imágenes con un microscopio confocal Leica SPE-II (Leica Microsystems) equipado con el software LAS-AF. Las imágenes de TIFF en escala de grises de 12 bits se analizaron para la colocalización usando el software MetaMorph<®>(Molecular Devices). La colocalización se representó como unidades arbitrarias [UA] que representan la intensidad total de píxeles de la superposición del anticuerpo con el marcador lisosómico LAMP1. Este valor se dividió por la intensidad total de píxeles de LAMP1, para corregir las diferencias de densidad celular entre distintas imágenes.
Como se observa en la Figura 6, IgG1-CD63 de tipo silvestre mostró los valores más altos de colocalización, seguido de su homólogo monovalente (bsCD63<w r>xb12) y bsCD63-Y79Hxb12. Los valores de colocalización lisosómica para bsP72Hxb12, bsY121Hxb12, bsLN54Hxb12 y bsN74Hxb12 fueron ~10 veces inferiores en comparación con bsY79Hxb12 y bsCD63xb12 de tipo silvestre. Los valores para bsV52Hxb12, bsG76Hxb12, bsLv49Hxb12 y bsLY51Hxb12 fueron incluso inferiores, lo que indica que apenas hubo transporte lisosómico de los anticuerpos contra CD63 monovalentes. Las muestras marcadas con un asterisco (*) no se han analizado. Los datos mostrados son la media ± desviación estándar de 3 imágenes.
Ejemplo 6: Unión de bsHER2xCD63N74H a células SK-OV-3 determinada mediante citometría de flujo
Basándose en su capacidad para inducir citotoxicidad con un valor de CI50 bajo como bsCD63xHER2-ADC, mientras que induce una citotoxicidad limitada como bsCD63xb12-ADC, se seleccionó el clon anti-CD63-N74H para su análisis adicional. La unión de bsHER2xCD63<N74H>a células SK-OV-3 positivas para HER2 se comprobó mediante citometría de flujo (FACS Canto II, BD Biosciences). Se incubaron anticuerpos diluidos en serie 30 minutos a 4 °C con células SK-OV-3. La unión del anticuerpo se detectó usando un anticuerpo IgG antihumano de cabra conjugado con ficoeritrina (Jackson) y las muestras se analizaron en un citómetro de flujo. Se usó IgG1-b12 como anticuerpo de control de isotipo. Los datos resultantes que se muestran en la Figura 7 son la media de dos experimentos.
Como se observa en la Figura 7, las curvas de unión de bsHER2xCD63<N74H>y el anticuerpo contra HER2 monovalente bsHER2xb12, eran idénticas. Esto indica que la unión a células tumorales de bsHER2xCD63<N74H>se produce a través de la unión monovalente a HER2. IgG1-CD63<N74H>y bsCD63<N74H>xb12 no mostraron unión a las células SK-OV-3, lo que concuerda con la expresión baja de CD63 en la membrana plasmática.
Ejemplo 7: Ensayo de acumulación de mAb-FITC con bsHER2xCD63N74H y bsCD63N74Hxb12 en células sanguíneas enteras
Para demostrar que bsHER2xCD63<N74H>no se une a, ni se acumula en, tejidos sanos que no expresan el antígeno tumoral modelo HER2, bsHER2xCD63<N74H>y los anticuerpos de control monovalentes y bivalentes se conjugaron con FITC. Se investigó su acumulación en granulocitos y trombocitos de donantes sanos que no expresan HER2. Se recogieron muestras de sangre entera de donantes sanos en tubos de heparina. La sangre entera se diluyó 1:2 en RPMI-1640 suplementado con suero cósmico de ternera inactivado por calor al 10 %. Se conjugaron anticuerpos anti-CD63 con FITC (Thermo Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se añadieron a células de sangre entera a una concentración final de 10 g/ml.
Después de 1 hora de incubación a 4 °C o 3 y 16 horas de incubación a 37 °C, los eritrocitos se lisaron incubándolos 15 minutos a 4°C con tampón de lisis de eritrocitos (NH<4>Cl 155 mM, KHCO<3>10 mM y EDTA 0,1 mM a pH 7,4). Las intensidades de fluorescencia de FITC se midieron en un citómetro de flujo (BD). Los granulocitos se marcaron con CD66b-PerCP-Cy5.5 anti-humano de ratón (BD) y los trombocitos se marcaron con CD62-APC anti-humano de ratón (BD).
La Figura 8 muestra niveles casi nulos, o muy bajos de, unión de anticuerpos contra CD63 a granulocitos o trombocitos después de 1 hora. Sin embargo, la fluorescencia FITC de IgG1-CD63 en los granulocitos aumentó claramente después de 16 horas de incubación, lo que indica la acumulación de IgG1-CD63 en los granulocitos. Por el contrario, la fluorescencia FITC de bsCD63<N74H>xb12 y bsHER2xCD63<N74H>apenas aumentó después de 16 horas (véase la Figura 8). Asimismo, IgG1-HER2 y bsHER2xb12 no mostraron ninguna unión ni acumulación intracelular en granulocitos o trombocitos, lo que concordaba con la falta de expresión de HER2 en estos tipos celulares. Por lo tanto, mediante el uso de un brazo Fab específico de CD63 de baja afinidad, fue posible minimizar la unión y la acumulación intracelular de un Ab contra CD63 monovalente en células sanas.
Ejemplo 8: Microscopía confocal, colocalización lisosómica de bsHER2xCD63N74H seguida a lo largo del tiempo
La internalización y la colocalización lisosómica de bsHER2xCD63<N74H>se siguieron a lo largo del tiempo. Se cultivaron células SK-OV-3 (20.000) en cubreobjetos de vidrio (Thermo Fisher Scientific) a 37 °C durante 16 horas. Una hora antes del tratamiento con anticuerpos, las células se preincubaron con leupeptina 50 pg/ml (Sigma) para bloquear la actividad lisosómica. Se añadió anticuerpo (5 o 1 pg/ml) y las células se incubaron durante 1, 3 o l6 horas a 37 °C. Las células se fijaron, se permeabilizaron, y se incubaron 45 min con anti-IgG1 humana de cabra-FITC (Jackson) para teñir la IgG humana y anti-CD107a-APC humana de ratón (BD) para teñir los lisosomas. Se añadió Hoechst (Molecular Probes, 1:10.000) para teñir el núcleo (5 minutos a TA). Los cubreobjetos se montaron (Calbiochem) en portaobjetos de microscopio y se tomaron imágenes con un microscopio confocal Leica SPE-II (Leica Microsystems) equipado con el software LAS-AF. Las imágenes de TIFF en escala de grises de 12 bits se analizaron para la colocalización usando el software MetaMorph<®>(Molecular Devices). La colocalización se representó como unidades arbitrarias [UA] que representan la intensidad total de píxeles de la superposición del anticuerpo con el marcador lisosómico LAMP1. Este valor se dividió por la intensidad total de píxeles de LAMP1, para corregir las diferencias de densidad celular entre distintas imágenes. La tinción total de IgG se representó como la intensidad total de píxeles de FITC, dividido por la intensidad total de píxeles de LAMP1.
Las barras de color gris de la Figura 9 representan la tinción total de IgG (representada como unidades arbitrarias). Las barras de color negro de la Figura 9 representan la colocalización lisosómica (representada como unidades arbitrarias). Tanto IgG1-HER2 como bsHER2xb12 mostraron una tinción similar de las células SK-OV-3 después de 1, 3 y 16 horas (barras de color gris). Una pequeña porción de IgG1-HER2 y bsHER2xb12 mostró colocalización lisosómica tras 16 horas de exposición al anticuerpo (barras de color negro). El anticuerpo dirigido a CD63, IgG1-CD63<N74H>, no mostraron tinción (barras de color gris) ni colocalización lisosómica (barras de color negro) después de 1 y 3 horas, Sin embargo, la exposición al anticuerpo durante 16 horas dio lugar a una tinción de Ab de las células que se colocalizaron con el marcador lisosómico LAMP1. El anticuerpo contra CD63 monovalente, bsCD63<N74H>xb12, no mostró tinción de mAb o colocalización lisosómica en cualquiera de los puntos temporales medidos. Por otro lado, la colocalización lisosómica de bsHER2xCD63<N74H>aumentó gradualmente a lo largo del tiempo (barras de color negro). Los datos mostrados son la media ± desviación estándar de 3 imágenes.
Ejemplo 9: BsHER2xCD63n 74h induce la modulación negativa de HER2
Uusando un ELISA de modulación negativa de HER2 se investigó si la fuerte orientación lisosómica observada con bsHER2xCD63<N74H>, también dio como resultado una mayor modulación negativa del antígeno diana. Se sembraron células AU565, SK-OV-3 y Colo 205 (1 millón de células/matriz) en matraces T25 (Greiner) y se incubaron durante la noche a 37 °C para obtener una monocapa confluente. Se añadieron anticuerpos (10 pg/ml) y las células se cultivaron durante otros 3 días a 37 °C, se lavaron y se lisaron. Los niveles de proteínas totales se cuantificaron usando el reactivo de ensayo de proteínas con ácido bicinconínico (BCA) (Pierce), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación, las placas de ELISA (Greiner) se recubrieron con anticuerpo de conejo anti-HER2 humano 1 pg/ml (Cell Signalling Technology), se bloquearon con suero de pollo al 2 % (Hyclone) y se incubaron con 50 pl de lisado celular. Se añadió anti HER2 humano-biotina de cabra (R&D, 50 ng/ml) para detectar HER2, seguido de estreptavidina-poli-HRP (Sanquin, 100 ng/ml). La reacción se visualizó usando ABTs y se detuvo con ácido oxálico. Se midió la fluorescencia a 405 nm y la cantidad de HER2 se expresó como porcentaje con respecto a las células sin tratar.
La cantidad total de proteína HER2 en estirpes celulares tumorales con diferentes niveles de expresión de HER2; AU565 (500.000 HER2/célula, Figura 10A), SK-OV-3 (200.000 HER2/célula, Figura 10B) y Colo205 (50.000 HER2/célula, Figura 10C) se cuantificó después de tres días de incubación con el anticuerpo contra HER2 y se comparó con las células sin tratar (véase la Figura 10). IgG1-HER2 indujo una reducción del ~40 % de HER2 total en células AU565 que expresan altos niveles de HER2. A pesar de que el anticuerpo monovalente bsHER2xb12 mostró una unión dependiente de la dosis a las células SK-OV-3 HER2-positivas (ejemplo de unión FACS), con bsHER2xb12 no se observó una modulación negativa de HER2. Esto pone de manifiesto que la unión de anticuerpos bivalentes era importante para aumentar la degradación de HER2. El bsHER2xCD63<N74H>fue capaz de restablecer la modulación negativa de HER2 en las células AU565. Por otra parte, en estirpes celulares con menor expresión de HER2, tales como SK-OV-3 y Colo205, bsHER2xCD63<N74H>también indujo una modulación negativa de HER2, mientras que IgG1-HER2 no afectó a los niveles de proteína HER2.
Ejemplo 10: Citotoxicidad inducida por ADC conjugados con Duostatina-3
Se sembraron células en placas de cultivo tisular de 96 pocillos (5.000 células/pocillo) y se dejarona adherir durante 6 horas a 37 °C. Se añadieron ADC diluidos en serie (10-0,0005 |jg/ml) y las células se incubaron durante otros 3 días a 37 °C. La viabilidad celular se evaluó mediante CellTiter-GLO (Promega), de acuerdo con las especificaciones del fabricante. El porcentaje de células viables se representó como un porcentaje con respecto a las células sin tratar.
Como se observa en la Figura 11, IgG1-HER2-Duo3 fue capaz de eliminar el ~80 % de HCC1954 que mostraban una alta expresión de HER2 (500.000 HER2/célula). En células SK-OV-3, que expresaban 200.000 HER2/célula, IgG1-HER2-Duo3 eliminó sólo el ~30 % de las células, mientras que la viabilidad de las células Colo205 con baja expresión de HER2 (50.000 HER2/célula) no se vio afectada.
El bsHER2xb12 monovalente eliminó un porcentaje similar de células en comparación con IgG1-HER2-Duo3, pero con un valor de CI<50>~10 veces menor. La citotoxicidad inducida por bsHER2xCD63<N74H>-Duo3 () en células HCC1954 fue igual a la de IgG1-HER2-Duo3. Sin embargo, en células con menor número de copias de HER2 (SK-OV-3 y, en menor medida, Colo205), bsHER2xCD63<N74H>-Duo3 indujo mucha más citotoxicidad que los ADC dirigidos únicamente a HER2 (véase la Figura 11). Los datos mostrados son la media ± desviación estándar de al menos dos experimentos distintos.
Ejemplo 11: Efecto antitumoral de bsHER2xCD63N74H-ADC en xenoinjertos tumorales de SK-OV-3
Se investigó el efecto antitumoral de bsHER2xCD63<N74H>-ADC en xenoinjertos tumorales de SK-OV-3. Se adquirieron ratones SCID hembra de 6-11 semanas de edad (C.B-17/lcrPrkdc-scid/CRL) en Charles River. Se indujeron tumores subcutáneos mediante la inoculación de 5 x 10<6>células SK-OV-3 en el flanco derecho de los ratones. Los volúmenes tumorales se calcularon a partir de mediciones con calibre digital como 0,52 * longitud * anchura<2>(mm<3>). Cuando los tumores alcanzaron 200 - 400 mm<3>, los ratones se agruparon en grupos de 7 ratones con igual distribución de tamaño tumoral y se les inyectaron mAb por vía intraperitoneal (8 mg/kg). Durante el estudio, se recogieron muestras de sangre en tubos que contenían heparina para confirmar la presencia de IgG humana en el plasma. Los niveles de IgG se cuantificaron usando un nefelómetro (Siemens Healthcare). Los ratones que no mostraron IgG humana en plasma se excluyeron del análisis.
Como se muestra en la Figura 12, bsHER2xCD63<N74H>-ADC indujo una inhibición significativa del crecimiento tumoral, mientras que los bsHER2xb12-ADC o bsCD63<N74H>xb12-duo3 monovalentes, no tuvieron ningún efecto sobre el crecimiento tumoral. Esto demuestra que puede usarse un brazo Fab de baja afinidad específico de CD63 para inducir la liberación lisosómica y de toxinas de un ADC de internalización escasa en tumoresin vivo.El análisis de Mantel-Cox del gráfico de Kalan Meyer indicó una inhibición significativa del crecimiento tumoral por bsHER2xCD63<N74H>-ADC, valor de P < 0,0001.
Ejemplo 12: Unión de bsBeta1xCD63N74H a células SK-OV-3 detectada mediante citometría de flujo
Se investigó si un dominio de unión de baja afinidad dirigido contra E puede usarse también para potenciar la internalización y el direccionamiento lisosómico de otros antígenos tumorales. Se ha descrito que las integrinas dependen de la agrupación para su internalización. Por lo tanto, se espera que un anticuerpo de integrina monovalente muestre una internalización y un direccionamiento lisosómico mínimos y, por lo tanto, puede representar un sistema modelo adecuado para someter a ensayo si se puede potenciar la internalización en un formato biespecífico dirigido a T y E. Con este fin, se seleccionó el anticuerpo huK20, dirigido contra la integrina Beta-1. La secuencia del anticuerpo huK20 se obtuvo del documento WO1996/008564 y se clonó y produjo como se describe en el Ejemplo 1 del mismo.
La unión del anticuerpo IgG1-Beta1, un bsBeta1xb12 de control monovalente y el anticuerpo biespecífico bsBeta1xCD63<N74H>frente a SK-OV-3 se investigó mediante citometría de flujo (FACS Canto II, BD Biosciences). Se incubaron anticuerpos diluidos en serie 30 minutos a 4 °C con células SK-OV-3. Después, la unión del anticuerpo se detectó usando un anticuerpo IgG antihumano de cabra conjugado con ficoeritrina (Jackson) y las muestras se analizaron en un citómetro de flujo. Se usó IgG1-b12 como anticuerpo de control de isotipo.
Como se observa en la Figura 13, las curvas de unión de bsBeta1xCD63<N74H>y el anticuerpo contra integrina-Beta-1 monovalente bsBeta1xb12, eran muy parecidas. Esto indica que la unión a células tumorales de bsBeta1xCD63<N74H>se produce a través de la unión monovalente a la integrina Beta-1. IgG1-CD63<N74H>y bsCD63<N74H>xb12 no mostraron unión a las células SK-OV-3, lo que concuerda con la expresión baja de CD63 en la membrana plasmática.
Ejemplo 13: Colocalización lisosómica de bsBeta1xCD63N74H medida con microscopía confocal
Para investigar si el direccionamiento doble de la integrina Beta-1 y CD63 da como resultado un aumento de la colocalización lisosómica de bsBeta1xCD63<N74H>, se realizó un experimento de microscopía confocal con estirpes celulares tumorales que tenían diferentes números de copias de la integrina Beta-1 en la membrana plasmática. Se cultivaron 20.000 células SK-OV-3, NCI-H1975 y MDA-<m>B-468 en cubreobjetos de vidrio (Thermo Fisher Scientific) a 37 °C durante 4 horas. Una hora antes del tratamiento con anticuerpos, las células se preincubaron con leupeptina 50 jg/m l (Sigma) para bloquear la actividad lisosómica. Se añadió anticuerpo (2, 0,4 y 0,08 jg/m l) y las células se incubaron durante 16 horas a 37 °C. Las células se fijaron, se permeabilizaron, y se incubaron 45 min con anti-IgG1 humana de cabra-FITC (Jackson) para teñir la IgG humana y anti-CD107a-APC humana de ratón (BD) para teñir los lisosomas. Se añadió Hoechst (Molecular Probes, 1:10.000) para teñir el núcleo (5 minutos a TA). Los cubreobjetos se montaron (Calbiochem) en portaobjetos de microscopio y se tomaron imágenes con un microscopio confocal Leica SPE-II (Leica Microsystems) equipado con el software LAS-AF. Las imágenes de TIFF en escala de grises de 12 bits se analizaron para la colocalización usando el software MetaMorph<®>(Molecular Devices). La colocalización se representó como unidades arbitrarias [UA] que representan la intensidad total de píxeles de la superposición del anticuerpo con el marcador lisosómico LAMP1. Este valor se dividió por la intensidad total de píxeles de LAMP1, para corregir las diferencias de densidad celular entre distintas imágenes.
Como se observa en la Figura 14, bsBeta1xCD63<N74H>demostró la mayor cantidad de colocalización lisosómica en todas las estirpes celulares y concentraciones de mAb sometidas a ensayo (sólo se muestra para SK-OV-3). IgG1-Beta1 y bsAb-Beta1xb12 mostraron una colocalización lisosómica modesta que no se vio afectada por la concentración de mAb. IgG1-CD63<N74H>sólo mostró una colocalización lisosómica sustancial a 2 pg/ml y a 0,4 pg/ml en células NCI-H1975. Aunque el control monovalente bsCD63<N74H>xb12 sólo mostró colocalización lisosómica a 2 pg/ml en células NCI-H1975, lo que se correlacionó con la afinidad reducida de CD63n74h. El aumento de la colocalización lisosómica de bsBeta1xCD63<N74H>fue más claro en las células que expresaban un elevado número de copias de integrina Beta-1 (SK-OV-3 > NCI-H1975 > MDA-MB-468). Para algunos clones no se representó ninguna UA porque no se midió la colocalización lisosómica. Los datos mostrados son la media ± desviación estándar de 3 imágenes.
Ejemplo 14: Microscopía confocal, intemalización y colocalización lisosómica de bsBeta1xCD63N74H seguidas a lo largo del tiempo
Para comprender mejor la cinética de internalización y colocalización lisosómica de bsBeta1xCD63<N74H>, se siguieron la internalización y la colocalización lisosómica de bsBeta1xCD63<N74H>a lo largo del tiempo. Se cultivaron células SK-OV-3 (20.000) en cubreobjetos de vidrio (Thermo Fisher Scientific) a 37 °C durante 16 horas. Una hora antes del tratamiento con anticuerpos, las células se preincubaron con leupeptina 50 pg/ml (Sigma) para bloquear la actividad lisosómica. Se añadió anticuerpo (2 pg/ml) y las células se incubaron durante 1, 3 o 16 horas a 37 °C. Las células se fijaron, se permeabilizaron, y se incubaron 45 min con anti-IgG1 humana de cabra-FITC (Jackson) para teñir la IgG humana y anti-CD107a-APC humana de ratón (BD) para teñir los lisosomas. Se añadió Hoechst (Molecular Probes, 1:10.000) para teñir el núcleo (5 minutos a TA). Los cubreobjetos se montaron (Calbiochem) en portaobjetos de microscopio y se tomaron imágenes con un microscopio confocal Leica SPE-II (Leica Microsystems) equipado con el software LAS-AF. Las imágenes de TIFF en escala de grises de 12 bits se analizaron para la colocalización usando el software MetaMorph<®>(Molecular Devices). La colocalización se representó como unidades arbitrarias [UA] que representan la intensidad total de píxeles de la superposición del anticuerpo con el marcador lisosómico LAMP1, dividido por la intensidad total de píxeles de LAMP1. La tinción total de IgG se representó como la intensidad total de píxeles de FITC, dividido por la intensidad total de píxeles de LAMP1.
Las barras de color gris de la Figura 15 representan la tinción total de IgG (representada como unidades arbitrarias). Las barras de color negro de la Figura 15 representan la colocalización lisosómica (representada como unidades arbitrarias). Tanto IgG1-Beta1 como bsBeta1xb12 mostraron una tinción similar de las células SK-OV-3 después de 1, 3 y 16 horas (barras de color gris), sin embargo, apenas se midió ninguna colocalización lisosómica (barras de color negro). Por lo tanto, aunque IgG1-Beta1 y bsBeta1xb12 fueron capaces de unirse a las células SK-OV-3, no se transportaron a los lisosomas. Los anticuerpos dirigidos contra CD63, IgG1-CD63<N74H>and bsCD63<N74H>xb12, no mostraron tinción (barras de color gris) ni colocalización lisosómica (barras de color negro) después de 1 hora. Sin embargo, la incubación prolongada dio como resultado la tinción de Ab de las células, que se colocalizaron con el marcador lisosómico LAMP1, lo que indica que ambos anticuerpos fueron transportados inmediatamente a los lisosomas. Este efecto fue más pronunciado para IgG1-CD63<N74H>y menos pronunciado para bsCD63<N74H>xb12. Por último, Beta1xCD63<N74H>demostró una tinción igual de las células SK-OV-3 después de 1, 3 y 16 horas (barras de color gris). Mientras que la colocalización lisosómica aumentó gradualmente a lo largo del tiempo (barras de color negro), lo que indica que Beta1xCD63<N74H>se une primero a las células tumorales, a través de la integrina Beta-1, y se transporta posteriormente a los lisosomas. Los datos mostrados son la media ± desviación estándar de al menos 3 imágenes.

Claims (33)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo multiespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno y un segundo dominio de unión a antígeno, en donde el primer dominio de unión a antígeno se une específicamente a una molécula diana (T), que es un antígeno asociado a tumor expresado en la superficie celular, y en donde el segundo dominio de unión a antígeno se une específicamente a una proteína efectora internalizante (E), en donde E es CD63, y en donde el segundo dominio de unión a antígeno tiene un valor de constante de disociación K<d>con E de entre 2,0*10'9 y 7,3*10' 9 M, determinándose la K<d>mediante interferometría de biocapas.
2. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende i) un primer brazo de unión que comprende el primer dominio de unión a antígeno y ii) un segundo brazo de unión que comprende el segundo dominio de unión a antígeno.
3. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo biespecífico.
4. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde T es un receptor expresado en la superficie celular.
5. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde T es una tirosina cinasa receptora.
6. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde T se selecciona del grupo que consiste en CD81, CD82, CD9 y CD151, una integrina, MHCII, CXCR4, TM4SF5, sintenina-1, TIMP-1, H, K-ATPasa, L6-antígeno y MT1-MMP.
7. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde T es HER2.
8. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y 6, en donde T es una integrina.
9. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es un anticuerpo biespecífico o un fragmento de anticuerpo biespecífico.
10. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo biespecífico que comprende un primer brazo de unión que comprende el primer dominio de unión a antígeno y un segundo brazo de unión que comprende dicho segundo dominio de unión a antígeno.
11. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la reivindicación 10, en donde dicho primer dominio de unión a antígeno comprende una primera secuencia variable de cadena pesada (VH) y una primera secuencia variable de cadena ligera (VL), y dicho segundo dominio de unión a antígeno comprende una segunda secuencia variable de cadena pesada (VH) y una segunda secuencia variable de cadena ligera (VL), y en donde dichas secuencias variables comprenden cada una tres secuencias de CDR, CDR1, CDR2 y CDR3.
12. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, en donde (i) dicho primer brazo de unión comprende una primera cadena pesada que comprende una primera secuencia variable de cadena pesada (VH) y una primera secuencia constante de cadena pesada (CH), y una primera cadena ligera que comprende una primera secuencia variable de cadena ligera (VL) y una primera secuencia constante de cadena ligera (CL), y (ii) dicho segundo brazo de unión comprende una segunda cadena pesada que comprende una segunda secuencia variable de cadena pesada (VH) y una segunda secuencia constante de cadena pesada (CH), y una segunda cadena ligera que comprende una segunda secuencia variable de cadena ligera (VL) y una segunda secuencia constante de cadena ligera (CL).
13. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10-12, en donde el primer brazo de unión deriva de un anticuerpo quimérico o de un anticuerpo humanizado o de un anticuerpo humano.
14. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es un anticuerpo biespecífico, en donde el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo de longitud completa, preferentemente un anticuerpo IgG1.
15. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho segundo dominio comprende:
a. CDR de VH 1, 2, y 3 como se proporcionan en las SEQ ID NO: 2, 3 y 4, respectivamente, y CDR de VL 1, 2, y 3 como se proporcionan en las SEQ ID NO: 9, 7 y 8, respectivamente, o
b. CDR de VH 1,2, y 3 como se proporcionan en las S<e>Q ID NO: 2, 10 y 4, respectivamente, y CDR de VL 1,2, y 3 como se proporcionan en las SEQ iD NO: 6, 7 y 8, respectivamente, o
c. CDR de VH 1, 2, y 3 como se proporcionan en las Se Q ID NO: 2, 11 y 4, respectivamente, y CDR de VL 1,2, y 3 como se proporcionan en las SEQ ID NO: 6, 7 y 8, respectivamente, o
d. CDR de VH 1,2, y 3 como se proporcionan en las Se Q ID NO: 2, 12 y 4, respectivamente, y CDR de VL 1,2, y 3 como se proporcionan en las SEQ iD NO: 6, 7 y 8, respectivamente.
16. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la reivindicación 15, en donde dicho segundo dominio de unión comprende las CDR de VH 1, 2 y 3 como se proporcionan en las SEQ ID NO: 2, 12 y 4, respectivamente, y CDR de VL 1, 2, y 3 como se proporcionan en las SEQ ID NO: 6, 7 y 8, respectivamente.
17. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dichos dominios de unión a antígeno primero y segundo son cada uno un par de un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo y un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo.
18. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico de diana asociada a tumor (T)xCD63.
19. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, 7 y 9-18, en donde el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico HER2xCD63.
20. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el anticuerpo tiene un valor de CE<50>para la unión a células que expresan diana asociada a tumor (T), tales como células que expresan HER2, inferior a 5,0 pg/ml, tal como inferior a 0,5 pg/ml, como se determina mediante citometría de flujo.
21. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde Kd se determina mediante interferometría de biocapas a 30 °C.
22. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico que comprende:
i) un primer brazo de unión que comprende una primera cadena pesada que comprende una primera secuencia constante de cadena pesada (CH), comprendiendo dicha primera CH una primera región CH3, y
ii) un segundo brazo de unión que comprende una segunda cadena pesada que comprende una segunda secuencia constante de cadena pesada (CH), comprendiendo dicha segunda CH una segunda región CH3,
en donde las secuencias de dichas regiones CH3 primera y segunda son diferentes y son de manera que una interacción heterodimérica entre dicho brazo de unión primer y segundo es más fuerte que una interacción homodimérica de cada uno de dichos brazos de unión primer y segundo.
23. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la reivindicación 22, en donde en dicha primera región CH3 de cadena pesada al menos uno de los aminoácidos en una posición correspondiente a las posiciones T366, L368, K370, D399, F405, Y407 o K409 de la cadena pesada de IgG1 humana se ha sustituido, y en dicha segunda región CH3 de cadena pesada al menos uno de los aminoácidos en una posición correspondiente a las posiciones T366, L368, K370, D399, F405, Y407 o K409 de la cadena pesada de IgG1 humana se ha sustituido, y en donde dichas cadenas pesadas primera y segunda no están sustituidas en las mismas posiciones, y en donde las posiciones de aminoácidos se numeran de acuerdo con el índice EU.
24. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la reivindicación 23, en donde (i) la primera región CH3 tiene una sustitución F405L y la segunda región CH3 tiene una sustitución K409R, o (ii) la primera región CH3 tiene una sustitución K409R y la segunda región CH3 tiene una sustitución F405L.
25. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el anticuerpo multiespecífico se conjuga con un resto citotóxico, un radioisótopo o un fármaco.
26. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la reivindicación 25, en donde el resto citotóxico se selecciona del grupo que consiste en maytansina, caliqueamicina, duocarmicina, duostatina, duostatina-3, duostatina-5, raquelmicina (CC-1065), auristatina, monometil auristatina E, monometil auristatina F, doxorrubicina, dolastatina, pirrolobenzodiazepina, toxinas basadas en IGN y alfa-amanitina.
27. Un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo biespecífico seleccionado de un scFv en tándem, scFv-Fc en tándem, scFv-Fc de botón en ojal, scFv-Fc-scFv, F(ab')<2>, Fab-scFv, (Fab'scFv)<2>, Diacuerpo, scDiacuerpo, scDiacuerpo-Fc y scDiacuerpo-C<H>3.
28. Un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-26 o un fragmento de anticuerpo biespecífico de acuerdo con la reivindicación 27 para su uso en un método para tratar y/o prevenir un cáncer.
29. El anticuerpo multiespecífico para su uso de acuerdo con la reivindicación 28, en donde el cáncer es cáncer de endometrio/de cuello del útero, cáncer de pulmón, melanoma maligno, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer de testículos, un tumor de tejidos blandos tal como sarcoma sinovial, cáncer de mama, tumor cerebral, leucemia, linfoma, mastocitoma, cáncer renal, cáncer de cuello del útero, cáncer de vejiga, cáncer de esófago, cáncer gástrico o cáncer colorrectal.
30. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-26 como principio activo.
31. Un ácido nucleico que codifica un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 26.
32. Un vector de expresión que contiene el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 31 capaz de expresar dicho ácido nucleico en estirpes celulares hospedadoras procariotas o eucariotas.
33. Una estirpe celular hospedadora procariota o eucariota que comprende un vector de acuerdo con la reivindicación 32.
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