ES3035307A1 - Procedimiento para el aumento de sensibilidad en masa de microcanales suspendidos y medida de la compresibilidad utilizando presion hidrostatica - Google Patents

Abstract

Procedimiento para el alimento de sensibilidad en masa de microcanales suspendidos y medida de la compresibilidad utilizando presión hidrostática. La invención provee un procedimiento para la espectrometría de partículas en tiempo real que mejora la sensibilidad en masa mediante el uso de presiones hidrostáticas. De acuerdo con el procedimiento de la invención, se mide la frecuencia de resonancia del microcanal suspendido, utilizándola para determinar información sobre la masa del analito. La compresibilidad de las partículas se mide aplicando una presión hidrostática por las bombas en el microcanal, que se consigue aplicando una presión no nula en todas las entradas y salidas del microcanal.

Description

DESCRIPCIÓN

PROCEDIMIENTO PARA EL AUMENTO DE SENSIBILIDAD EN MASA DE

MICROCANALES SUSPENDIDOS Y MEDIDA DE LA COMPRESIBILIDAD

UTILIZANDO PRESIÓN HIDROSTÁTICA

OBJETO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a métodos de análisis de analitos utilizando microdispositivos, como un dispositivo resonador que se basa en un micro canal suspendido que mide las propiedades mecánicas de analitos.

El método de la invención se usa en la espectrometría de analitos en tiempo real y mejora la sensibilidad en masa de esta técnica mediante el uso de presiones hidrostáticas. La invención permite medir la compresibilidad de los analitos y ofrece utilizar la información de la compresibilidad y otros parámetros para realizar técnicas de análisis y diagnóstico de alta precisión.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El estudio de las propiedades físicas de partículas, particularmente entidades biológicas en medio líquido, es de vital importancia para numerosas aplicaciones, tanto en el campo de la salud como en medio ambiente o seguridad. La medición y monitorización de magnitudes como la rigidez celular, la morfología y la masa o el índice de refracción han aportado conocimientos, que de otro modo serían inaccesibles, sobre la fisiología celular, así como métodos innovadores para la clasificación celular de alto rendimiento sin necesidad del uso de marcadores. Además, la mecánica celular demuestra un alto potencial para comprender y estudiar procesos relevantes de la biología celular, donde la masa celular y la compresibilidad son parámetros biofísicos particularmente relevantes a estudiar.

Hoy en día existen diferentes métodos para detectar las bioparticulas. Además de métodos basados en el filtrado y posterior análisis, algunos de estos métodos se basan en el uso de resonadores mecánicos, que pueden utilizar elementos en voladizo cuya frecuencia de resonancia se puede utilizar para la realización de medidas de distintas propiedades físicas. El método de medida se basa en el cambio de frecuencia de resonancia del resonador debido al cambio de alguna de sus propiedades mecánicas, por ejemplo, el cambio de masa experimentado cuando se añaden partículas en su superficie. Estos métodos permiten una resolución adecuada para este tipo de aplicaciones. Siendo usados habitualmente como sensores de masa en el laboratorio, se ha llegado incluso a alcanzar una resolución suficiente para realizar medidas de unidades de masa atómica en ambientes controlados.

Entre los resonadores mecánicos, los resonadores de microcanal suspendido (SMR, por sus siglas en inglés:suspended microchanel resonator)combinan un resonador nanomecánico con un microcanal interno, permitiendo combinar la medida en tiempo real de propiedades mecánicas de partículas inmersas en medios líquidos con el uso de fuerzas hidrodinámicas e hidrostáticas.

Los resonadores de microcanal suspendido se utilizan habitualmente para medir la masa boyante de las partículas que pasan a través de ellos mediante la medida del cambio en la frecuencia de resonancia mecánica del microcanal suspendido. La masa boyante es la diferencia entre la masa de la partícula y la masa del líquido que ésta desplaza cuando se introduce en el microcanal, y se calcula como el producto del volumen de la partícula por la diferencia entre la densidad de masa de ésta y la densidad del líquido en el que se encuentra inmersa. Esta combinación de parámetros produce que, en algunos casos, partículas de distintos materiales y tamaños presenten la misma masa boyante, como, por ejemplo, una partícula pequeña muy densa y una partícula grande con una densidad próxima a la del líquido. Esta circunstancia se produce de manera frecuente en el caso de la medida de distintas líneas celulares ya que, aunque los valores de volumen y densidad son distintos para cada línea celular, la proximidad entre dichos valores hace que estos tipos de células presenten la misma o muy similar masa boyante, dificultando o imposibilitando así una distinción inequívoca entre esas partículas.

Por lo tanto, en la técnica actual todavía es necesario un método de alta eficiencia usando un dispositivo resonador que se base en un microcanal suspendido para analizar diferentes tipos de células en suspensión usando diferentes parámetros mecánicos, que complementen la medida de la masa boyante.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención provee un procedimiento para la espectrometría de partículas en tiempo real que mejora la sensibilidad en masa mediante el uso de presiones hidrostáticas. El procedimiento de la invención permite medir la compresibilidad de las partículas, particularmente bioparticulas, siendo especialmente útil para técnicas de diagnóstico, por ejemplo, para identificar estados sanos y enfermos de biopartículas derivadas de células o tejidos vivos.

El procedimiento de la invención utiliza un dispositivo resonador que se basa en un microcanal suspendido. El dispositivo que se usa para la invención puede ser un dispositivo de tipo resonador mecánico con microcanales integrados a cuyas entradas y salidas se conectan sendas bombas. Por ejemplo, el resonador que se utiliza para el método de la invención comprende, una estructura alargada hueca, de tipo tubo capilar, que tiene al menos dos extremos, por los que se puede introducir y evacuar el fluido con unos analitos de interés en suspensión y al menos un anclaje que determina la zona en la que el microcanal queda suspendido. Además, se conecta una bomba a cada entrada y salida del dispositivo para aplicar presión al líquido en el microcanal y se usan medios para detectar diferencias o fluctuaciones la frecuencia de resonancia de la parte en la que el microcanal se encuentra suspendido mediante lo cual se puede obtener información sobre las partículas y transformarlas en datos de salida.

Según la invención, a través del resonador fluye un líquido que contiene los analitos de interés, como diferentes tipos de células en suspensión. Se mide la frecuencia de resonancia del microcanal suspendido, en función del tiempo, midiendo los cambios en frecuencia que produce una partícula cuando atraviesa la zona suspendida del dispositivo, es decir la zona en la que se produce la vibración mecánica. A partir del análisis de esta señal, se pueden obtener diferentes parámetros e información simultánea acerca de los analitos que atraviesan el resonador.

La presente invención tiene como objetivo obtener parámetros mecánicos, como la masa boyante y la compresibilidad de los analitos, al analizar las vibraciones del tubo capilar que sirven para distinguir entre células sanas y enfermas. Estos parámetros se complementan con otros parámetros que se pueden medir usando el resonador, como la velocidad de los analitos y el tamaño de los analitos, ofreciendo así un método de caracterización multiparamétrica de alta eficiencia.

El procedimiento de la invención usa la medida del cambio en frecuencia (medida de la frecuencia de resonancia en función del tiempo), particularmente usa el máximo cambio en frecuencia de resonancia producido al paso de una partícula obteniendo así el valor de su masa boyante. La inclusión de bombas en cada entrada y salida del dispositivo permite variar la masa boyante de las partículas de manera controlada a través del valor de la presión hidrostática aplicada. De esta manera, en el caso de tener partículas de distintos materiales y tamaños que presentan la misma masa boyante a presión atmosférica, se conseguirá que presenten masas boyantes diferentes cuando se aplica la presión hidrostática, permitiendo distinguirlas. Como la masa boyante es proporcional al volumen de la partícula, al aplicar una compresión hidrostática a la partícula, varía el volumen de dicha partícula y, en consecuencia, su masa boyante. La respuesta de la masa boyante a la presión hidrostática es proporcional al módulo de compresibilidad de la partícula. El módulo de compresibilidad de una sustancia es una medida de la resistencia de dicha sustancia a la compresión volumétrica. De esta manera, la presente invención proporciona un sistema que permite realizar estas compresiones hidrostáticas usando las bombas y medir el módulo de compresibilidad de las partículas.

De acuerdo con el procedimiento de la invención, la compresibilidad de las partículas se mide aplicando una presión hidrostática por las bombas en el tubo capilar, que se consigue ajustando la presión en todas las entradas y salidas del dispositivo. Dada la configuración de las bombas, se puede aplicar, de manera simultánea a la presión hidrostática, una diferencia de presión entre los extremos del tubo, con lo que se conseguirá un flujo neto dentro del tubo produciendo que los analitos se desplacen. Al aumentar la presión hidrostática, los analitos se comprimen, lo que altera su volumen y, por ende, su masa boyante, modificando así el máximo cambio en frecuencia de resonancia que producen al atravesar el microcanal suspendido.

Según la presente invención, cada una de las entradas y salidas del dispositivo de tipo resonador de microcanal suspendido están conectadas a una respectiva bomba. Esta configuración permite controlar el caudal, controlando la diferencia de presión entre cada bomba y presurizar el microcanal. Si se aplica la misma presión en todas las entradas y salidas, el caudal será nulo, pero habrá una diferencia de presión entre el interior del microcanal y el exterior del dispositivo (habitualmente a presión atmosférica), lo que permite modificar las propiedades mecánicas del dispositivo y de las partículas a analizar. Dicha configuración de las bombas también permite trabajar en una combinación de los dos casos: control del caudal y control de la presurización del dispositivo. En esta ocasión, se aplica una presión no nula en todas las bombas, siendo la presión de, al menos una de las bombas, inferior a la de las demás. La diferencia de presión entre las entradas y salidas del microcanal es lo que determina el caudal mientras que la diferencia entre la presión base, es decir la presión aplicada de menor magnitud, y la presión atmosférica, determina el cambio en las propiedades mecánicas.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Para complementar la descripción que se está realizando y con objeto de ayudar a una mejor comprensión de las características de la invención, de acuerdo con un ejemplo preferente de realización práctica de la misma, se acompaña como parte integrante de dicha descripción, un juego de dibujos en donde con carácter ilustrativo y no limitativo, se ha representado lo siguiente:

Figura 1 - Muestra una gráfica que representa la función de densidad de probabilidad (PDF, por sus siglas en inglés:probability density function)en función de la masa boyante (mb) para dos poblaciones de partículas diferentes bajo diferentes valores de presión. Las poblaciones de partículas representadas se corresponden con las líneas celulares epiteliales de tejido mamario humano MCF-10A (sana, representada en línea negra), y MCF-7 (adenoicarcinoma, representada en línea gris).

Figura 2 - Muestra una gráfica que representa la función de la sensibilidad (S) y la especificidad (E) obtenidas al realizar una distinción entre las líneas celulares MCF-10A y MCF-7 a través de su masa boyante en función de la presión hidrostática (P).

REALIZACIÓN PREFERENTE DE LA INVENCIÓN

Una realización de la invención divulga un procedimiento de espectrometría de analitos que usa un dispositivo de tipo resonador mecánico, conectado a sendas bombas en cada extremo del dispositivo, que comprende un microcanal con al menos una entrada y una salida, una zona en la que el microcanal forma una estructura de tipo voladizo, es decir microcanal suspendido, un módulo para la medida de la vibración de dicho microcanal suspendido.

El procedimiento comprende las etapas de aplicar una presión hidrostática en el microcanal ajustando una presión diferente de cada bomba y obtener una medida de la frecuencia de resonancia mecánica del tubo capilar en función del tiempo, que contiene la información de la masa de los analitos.

Los analitos pueden ser tanto entidades biológicas, como células o bacterias, o partículas inorgánicas de interés.

La presente invención utiliza una configuración de bombas, estando cada una acoplada a una entrada o salida del microcanal. El microcanal se presuriza mediante la aplicación de una presión no nula en todas las bombas de manera simultánea, lo que permite establecer una diferencia de presión hidrostática entre el interior del microcanal y el exterior (habitualmente a presión atmosférica). Esta configuración permite controlar el caudal dentro del tubo capilar, ajustando la diferencia de presión entre las diferentes bombas. Dichas bombas se utilizan no sólo para generar una diferencia de presión entre las entradas y salidas del microcanal consiguiendo así un flujo, sino también para controlar la presión hidrostática en el interior del microcanal aplicando una presión mínima (no nula) de manera simultánea en todas las entradas y salidas del microcanal.

Se pueden usar bombas de presión de gas introduciendo un gas, como, por ejemplo, nitrógeno, en un reservorio presurizado con una presión controlada. La presión del gas se transmite al líquido a analizar contenido en el reservorio, el cual se conecta con el resonador. Se pueden usar otros tipos de bombas, como bombas de jeringa, peristálticas, etc.

Por ejemplo, utilizando dos bombas de presión de gas conectadas a la entrada y salida de uno de estos dispositivos se puede generar una diferencia de presión de 250 mbar, aplicando (a) 500 mbar en la entrada y 250 mbar en la salida, o (b) aplicando 750 mbar en la entrada y 500 mbar en la salida, o (c) aplicando 1000 mbar en la entrada y 750 mbar en la salida. En estos ejemplos se puede obtener la misma diferencia de presión entre la entrada y la salida (250 mbar) y, por tanto, el mismo flujo y una presión hidrostática dentro del microcanal de 250 mbar, 500 mbar y 750 mbar respectivamente. Esta presión en el interior del dispositivo causa un compresión volumétrica de las partículas de diferente magnitud para cada situación (a, b, c).

En la figura 1 se muestra una gráfica que representa el cambio en las masas boyantes de dos poblaciones de partículas diferentes, una línea celular sana y una línea celular tumoral bajo diferentes valores de presión hidrostática. Según los cálculos y simulaciones con dos líneas celulares de tejido mamario (MCF-10A sano y MCF-7 tumoral) partiendo de valores de tamaño, densidad y módulos de Young y Poisson ya publicados y conocidos, se puede ver que la diferencia en compresibilidad hace que, el solapamiento entre ambas funciones de distribución de probabilidad se reduzca de manera progresiva con la presión hidrostática en el interior del tubo. La reducción de este solapamiento controlada mediante la aplicación de presión consigue en última instancia una mayor precisión al distinguir dichas líneas celulares mediante la medida de su masa boyante. Los resultados se muestran en la gráfica de la figura 1.

En la figura 2 se muestra una gráfica que representa cómo la sensibilidad (S) aumenta con la presión hidrostática (P) para la distinción de las líneas celulares a través de la medida de su masa boyante. Línea discontinua representa la especificidad (E) y línea continua representa la sensibilidad (S). Para cada valor de la presión en esta gráfica, se ha calculado las funciones de distribución de probabilidad de las líneas celulares MCF-7 y MCF-10A correspondiente a dicho valor de la presión hidrostática. Con cada par de funciones de distribución de probabilidad se realiza un análisis de la curva característica operativa del receptor (ROC, por sus siglas en ingés:Receiver Operating Characteristic)obteniendo así los valores óptimos de sensibilidad y especificidad para cada valor de la presión.

La realización del procedimiento de la invención comprende adicionalmente una etapa final de

cálculo de la masa boyante de los analitos y el cálculo de la compresibilidad de los analitos.

La compresibilidad se define como la inversa del módulo de compresibilidad:

donde es la compresibilidad,V0es el volumen inicial de los analitos, K es el módulo de

compresibilidad, p es la presión hidrostática y es la derivada del volumen con respecto

a la presión hidrostática.

En la presente invención se mide experimentalmente la masa boyante, que se define como la diferencia entre la masa de un analito en un líquido y la masa del líquido que desplaza:

dondem bes la masa boyante,ppartes la densidad en masa del analito,puqUides la densidad en masa del líquido que se encuentra inmersa.

Al comprimir las partículas, su volumen cambia y, por tanto, su masa boyante. Despejando en la definición de compresibilidad, se puede llegar a que la masa boyante en función de la presión se muestra según una expresión:

Otro parámetro que se mide experimentalmente por el procedimiento de la invención es el máximo cambio de frecuencia de resonancia del tubo(d f)que se produce debido a la masa boyante del analito que está atravesándolo. Este cambio en frecuencia se muestra según la expresión:

donde / 0 es la frecuencia inicial del microcanal suspendido sin ninguna partícula en su interior, ^ es el valor de la forma del modo de vibración en su punto de máxima amplitud ym 0es la masa microcanal suspendido.

A fes la diferencia entre el máximo cambio en frecuencia que produce una partícula comprimida a una cierta presión cuando atraviesa el resonador y el máximo cambio en frecuencia producido por la misma partícula cuando no está sometida a presión. Despejando el valor de la masa boyante en función de la presión se obtiene una expresión:

Despejando la compresibilidad se obtiene una expresión que se utiliza en una etapa de cálculo de la compresibilidad de los analitos según el procedimiento de la invención:

Los parámetros obtenidos mediante el procedimiento de la presente invención se utilizan para la caracterización de entidades biológicas tales como células. Gracias al procedimiento de la presente invención se pueden medir parámetros de forma simultánea como la masa de la partícula, el tamaño de la partícula, etc. y así se puede ofrecer una técnica con reproducibilidad y eficiencia en los estudios donde mide la compresibilidad celular.

Claims (3)

1. REIVINDICACIONES 1. Procedimiento de espectrometría de analitos que usa un dispositivo de tipo resonador mecánico, conectado a sendas bombas en cada extremo del dispositivo, que comprende un microcanal con al menos una entrada y una salida, una zona en la que el microcanal forma una estructura de microcanal suspendido, un módulo para la medida de la vibración de dicho microcanal suspendido, en el que el procedimiento comprende las etapas de: - aplicar una presión hidrostática en el microcanal ajustando una presión no nula en cada bomba, y - obtener una medida de la frecuencia de resonancia mecánica del tubo capilar en función del tiempo, que contiene la información de la masa de los analitos.
2. 2. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente una etapa de cálculo de la masa boyante de los analitos mediante la medida del cambio en la frecuencia de resonancia según una expresión:

   Donded fes el máximo cambio en frecuencia producido al paso del analito por el microcanal suspendido,mbes la masa boyante de dicho analito, dondef 0es la frecuencia inicial del tubo capilar sin ningún analito en su interior, ^ es el valor de la forma del modo de vibración en su punto de máxima amplitud ym0es la masa del microcanal suspendido.
3. 3. El procedimiento de las reivindicaciones 1 o 2, que comprende adicionalmente una etapa de cálculo de la compresibilidad de los analitos según la expresión:

   donde es la compresibilidad,m 0es la masa del microcanal suspendido, ^ es el valor de la forma del modo de vibración en su punto de máxima amplitud,V0es el volumen inicial de los analitos, p es la presión que se aplica al liquido del tubo capilar por las bombas y es la derivada del máximo cambio en frecuencia producido por una partícula al atravesar el microcanal suspendido en función de la presión hidrostática.