ES3035736T3 - Antagonists of the complement system for use in methods of treating paraproteinemic neuropathies - Google Patents

Antagonists of the complement system for use in methods of treating paraproteinemic neuropathies

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ES3035736T3
ES3035736T3 ES20729653T ES20729653T ES3035736T3 ES 3035736 T3 ES3035736 T3 ES 3035736T3 ES 20729653 T ES20729653 T ES 20729653T ES 20729653 T ES20729653 T ES 20729653T ES 3035736 T3 ES3035736 T3 ES 3035736T3
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Abstract

La presente invención se refiere a un método para tratar una neuropatía paraproteinémica en un sujeto mediante la administración de un antagonista del sistema del complemento. El antagonista inhibe el sistema del complemento aguas arriba del factor C5. Más específicamente, el antagonista puede ser un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que bloquea o inhibe el sistema del complemento mediante la inhibición del dominio C2b del factor C2. Las neuropatías paraproteinémicas que pueden tratarse incluyen, en particular, la neuropatía motora multifocal (NMM), la polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (PDIC) y el síndrome de Guillain-Barré (SGB). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Antagonistas del sistema del complemento para su uso en métodos de tratamiento de neuropatías paraproteinémicas
Campo de la invención
La presente invención se refiere a anticuerpos anti-C2 o fragmentos de unión al antígeno para su uso en métodos de tratamiento de neuropatías paraproteinémicas. Los anticuerpos anti-C2 o fragmentos de unión al antígeno bloquean o inhiben el sistema del complemento aguas arriba del factor del complemento C5. Las neuropatías paraproteinémicas que pueden tratarse incluyen, en particular, neuropatía motora multifocal (MMN), polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP) y síndrome de Guillain-Barré (GBS).
Antecedentes de la invención
El sistema del complemento es una faceta importante del sistema inmunitario innato que potencia (complementa) la capacidad de los anticuerpos y las células fagocíticas para eliminar los intrusos microbianos y las células dañadas de un organismo. Por lo tanto, el complemento forma una línea de defensa esencial contra la infección.
La respuesta a la infección tiene que ser rápida y lo suficientemente integral para evitar el riesgo para el huésped, pero lo suficientemente selectiva para evitar daños a las células sanas. El complemento logra típicamente este delicado equilibrio mediante el empleo de un sistema en cascada escalonado y estrechamente regulado de más de 30 proteínas solubles y expresadas en la superficie. Los factores del complemento circulan en la sangre como proteínas precursoras inactivas. La activación del sistema conduce a una cascada de activación donde un factor activa el subsecuente mediante proteólisis específica de una proteína del complemento aguas abajo en la cascada. Esta cascada puede dar como resultado en última instancia: la producción de anafilatoxinas que atraen y activan macrófagos y leucocitos; formación del complejo de ataque a la membrana lítico (MAC); y opsonización de objetivos para la fagocitosis y destrucción.
La activación del sistema del complemento puede producirse a través de tres vías: la vía clásica; la vía de la lectina; y la vía alternativa (ver Figura 1). Cada vía activa un componente central, C3, lo que da como resultado la activación de una vía de terminación común que conduce a la formación de MAC (Muller-Eberhrd, Annu Rev Biochem 1988, 57:321). La vía clásica a menudo se denomina dependiente de anticuerpos, porque se inicia fuertemente por conglomerados de IgM o IgG. Esta vía se activa habitualmente cuando el C1q hexamérico se une a las regiones Fc de las moléculas de IgG o IgM que están presentes en un complejo anticuerpo/antígeno. Tras la unión, C1s escinde C4 para producir C4a y C4b. A continuación, C2 se une a C4b unido a la superficie (en presencia de Mg2+) para formar un complejo C4bC2, que después se escinde por C1s activado en dos fragmentos: un fragmento C2b más pequeño de 30 kDa, y un fragmento C2a más grande de 70 kDa, que permanece unido a C4b para formar la C3 convertasa de la vía clásica C4bC2a. La C3 convertasa es capaz de escindir C3 en C3a (una anafilatoxina; potencia la inflamación) y C3b, lo que inicia de esta manera la amplificación y las funciones efectoras aguas abajo.
La activación de la vía de la lectina es mediada por la unión de lectinas de unión a manosa (MBL), o ficolinas, a motivos de carbohidratos bacterianos expresados en la superficie de patógenos o microbios. La unión de MBL estimula subsecuentemente la activación de la serina proteinasa-1 (MASP-1) y MASP-2 asociadas a MBL, lo que conduce a la escisión de C4 y C2, lo que conduce a la generación de la C3 convertasa de la vía de la lectina de C4bC2a.
La vía alternativa puede considerarse un lazo de amplificación que se activa independientemente del desencadenante inicial. C3b se une directamente a los objetivos en las superficies celulares de microbios, material extraño o tejido dañado. El C3b unido a la superficie puede unirse después al factor B para formar C3bB. Este complejo en presencia del factor D se escinde en Ba y Bb. Bb permanece asociado con C3b para formar C3bBb, que es la C3 convertasa de la vía alternativa.
Por lo tanto, las tres vías convergen en las C3 convertasas centrales. Las C3 convertasas, C4bC2a o C3bBb, forman complejos multiméricos con moléculas de C3b adicionales, lo que produce las C5 convertasas, C4bC2aC3b y C3bBbC3b, respectivamente. Estas enzimas escinden preferentemente el factor del complemento C5, liberando C5a (una anafilatoxina; potencia la inflamación) y el fragmento C5b. C5b recluta y se asocia con C6 y C7; el complejo se inserta en las membranas celulares e interactúa con C8; lo que induce la unión de múltiples unidades de moléculas C9 para formar el complejo de ataque a la membrana (MAC) C5b-9 o el complejo de complemento terminal soluble (TCC). El MAC forma un poro al insertarse en las membranas celulares, lo que da como resultado principalmente la lisis celular de células no nucleadas (por ejemplo, eritrocitos envejecidos y ciertas bacterias Gram negativas). Sin embargo, en las células nucleadas, la formación del MAC se regula estrictamente, y su efecto lítico puede contrarrestarse mediante las bombas iónicas. Además, los niveles sublíticos de MAC pueden inducir daño o activación de células huésped y actuar como un mediador proinflamatorio. Además de los efectos mediados por MAC de la cascada, las anafilatoxinas, C3a y C5a, actúan como moduladores inmunitarios potentes, que reclutan células inmunitarias al sitio de activación. Las opsoninas, C3b y C4b, pueden unirse además a diversos receptores del complemento y mediar en la eliminación de complejos inmunitarios, la fagocitosis o la estimulación de respuestas de células B.
El sistema del complemento se controla además mediante una serie de proteínas reguladoras del complemento. Estas incluyen el inhibidor de C1, que inhibe las etapas de iniciación de las vías clásica y de la lectina; el factor H que disocia la C3 convertasa; el factor I que degrada C4b y C3b; y las proteínas plasmáticas vitronectina y clusterina y la proteína de membrana CD59 que inhiben la formación del MAC (Sahu y otros, Immunol Res 1998, 17:109; Campbell y otros, Annu Rev Immunol 1988, 6:161).
Si bien el complemento forma una línea de defensa esencial contra organismos patógenos, si no se controla adecuadamente, estas funciones defensivas pueden volverse en contra de las células huésped e inducir o exacerbar afecciones inmunitarias, inflamatorias y degenerativas. Cuando el complemento se hiperactiva, como se produce en enfermedades autoinmunitarias o en sujetos con proteínas reguladoras disfuncionales, provoca una respuesta inflamatoria grave en numerosos órganos (Noris y Remuzzi, Semin Nephrol 2013, 33(6): 479-492). Dada la expresión ubicua de las proteínas del complemento en todo el cuerpo, se cree que el sistema del complemento puede desempeñar un papel en muchas enfermedades con un componente inmunitario, tales como enfermedades inflamatorias, enfermedades degenerativas, cáncer y rechazo de trasplantes. El sistema del complemento también se ve cada vez más implicado en enfermedades del sistema nervioso central, tales como la enfermedad de Alzheimer (Carpanini y otros, Front Immunol 2019, 10:362).
La posición única del complemento tanto como detector inicial de material extraño o dañado y como un organizador de respuestas inmunitarias aguas abajo hace que el complemento sea un objetivo terapéutico atractivo. De hecho, actualmente se informan programas de desarrollo clínico para inhibidores contra más de una docena de objetivos del complemento distintos.
Se han producido varios inhibidores del complemento solubles. El C1-INH (diversos fabricantes) está aprobado actualmente para el tratamiento del angioedema hereditario, y se está evaluando en otros trastornos tales como la sepsis y la lesión por isquemia-reperfusión. Sin embargo, el C1-INH es un inhibidor de serina proteasa amplio que bloquea las proteasas iniciadoras de las vías clásica y de la lectina, así como también las proteasas que no son del complemento de los sistemas de coagulación y contacto. Por el contrario, el sutimlimab (también conocido como BIVV009, anteriormente TNT009) es un anticuerpo monoclonal humanizado que se diseña para inhibir selectivamente la vía clásica del complemento al dirigirse a C1s, y se ha mostrado promisorio en el tratamiento de la anemia hemolítica y la enfermedad por aglutinina fría. También se han desarrollado otros anticuerpos que inhiben proteínas clave en la cascada. Annexon ha desarrollado un anticuerpo monoclonal (ANX005) que actúa a nivel de C1q para trastornos neurodegenerativos y autoinmunitarios, mientras que Omeros ha desarrollado un anticuerpo monoclonal contra MASP-2 (OMS721) como candidato clínico para el tratamiento del síndrome hemolítico urémico atípico (aHUS).
Actuando en el extremo opuesto de la cascada del complemento está el eculizumab (Soliris®), un anticuerpo anti-C5 que actualmente está aprobado para su uso en el tratamiento de la hemoglobinuria paroxística nocturna (PNH) y el aHUS. Este anticuerpo se une a un sitio en C5 que evita su activación por las C5 convertasas, lo que impide de esta manera la liberación de C5a y la formación del MAC. También se ha evaluado un anticuerpo anti-C5a (IFX-1), así como también una serie de antagonistas de C5aR1 de moléculas pequeñas (PMX53; PMX205; CCX186) que se han mostrado promisorios como tratamientos potenciales para diversos trastornos.
También se han desarrollado anticuerpos para dirigirse a la proteína C2 de la cascada del complemento. La solicitud de patente internacional núm. WO2014/189378 describe moléculas de unión, por ejemplo anticuerpos, con propiedades inhibitorias de la actividad de C2 específicas. Tales moléculas de unión se describen como útiles en el tratamiento de síntomas de diversas enfermedades humanas, tales como enfermedad inflamatoria, o lesión por isquemia-reperfusión.
A pesar de esfuerzos significativos para desarrollar agentes terapéuticos que se dirigen a la cascada del complemento, el éxito clínico de los inhibidores del complemento ha permanecido limitado. Esto se debe probablemente a la naturaleza compleja de la cascada del complemento. Sigue existiendo la necesidad de comprender mejor el papel de la actividad del complemento hiperactivo en diversos trastornos para desarrollar terapias efectivas basadas en la inhibición del complemento.
Resumen de la invención
Los presentes inventores han descubierto que dirigirse a la cascada del complemento aguas arriba del factor del complemento C5 es probable que sea una estrategia efectiva en el tratamiento de las neuropatías paraproteinémicas, particularmente las neuropatías tales como la neuropatía motora multifocal (MMN), la polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP) y el síndrome de Guillain-Barré (GBS). Las neuropatías paraproteinémicas son neuropatías periféricas caracterizadas por la presencia de "paraproteínas" en el suero. Las paraproteínas son anticuerpos monoclonales o inmunoglobulinas de un tipo específico que se producen en exceso relativo por una proliferación clonal anómala de linfocitos B o células plasmáticas. A diferencia de los anticuerpos de inmunoglobulina normales, las paraproteínas típicamente no pueden combatir la infección.
Como se informa y ejemplifica en la presente descripción, el sistema del complemento desempeña un papel importante en la patología de las neuropatías paraproteinémicas. En particular, se encontró que los sueros de pacientes con MMN, CIDP y GBS activan el complemento a través de la opsonización tanto de las células de Schwann como de las neuronas motorasin vitro.Es importante señalar que los resultados presentados en la presente descripción demuestran además que las células de Schwann y las neuronas motoras expresan niveles elevados de la proteína reguladora del complemento CD59, un factor que evita la polimerización terminal del complejo de ataque a la membrana (MAC). Los resultados también muestran que las células de Schwann son resistentes a la lisis mediada por el complemento. En conjunto, esto indica que en las neuropatías paraproteinémicas, existe protección contra la lisis mediada por el complemento, y que la patología observada probablemente sea independiente del MAC, es decir, provocada por proteínas del complemento aguas arriba del MAC. En consecuencia, la presente invención se dirige al tratamiento de las neuropatías paraproteinémicas al dirigirse al sistema del complemento aguas arriba del factor del complemento C5.
De acuerdo con las reivindicaciones, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-C2 o fragmento de unión al antígeno que comprende un dominio variable de la cadena pesada (VH) y un dominio variable de la cadena ligera (VL) en donde el dominio VH comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 y el dominio VL comprende las secuencias de CDR:
- LCDR3 que comprende o que consiste de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5;
- LCDR2 que comprende o que consiste de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; y
- LCDR1 que comprende o que consiste de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, para su uso en un método de tratamiento de una neuropatía paraproteinémica en un sujeto, en donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno se une al dominio C2b de C2.
En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-C2 o fragmento de unión al antígeno inhibe la vía clásica del complemento y/o la vía del complemento de la lectina.
En ciertas modalidades, la neuropatía paraproteinémica es una neuropatía desmielinizante.
En ciertas modalidades, la neuropatía paraproteinémica se caracteriza por la presencia de inmunoglobulinas IgM, IgA o IgG.
En ciertas modalidades, la neuropatía paraproteinémica se caracteriza por la presencia de autoanticuerpos. Los autoanticuerpos pueden ser inmunoglobulinas de la clase IgM, IgA o IgG.
En ciertas modalidades, la neuropatía paraproteinémica se caracteriza por la presencia de autoanticuerpos contra un antígeno neural. El antígeno neural puede ser un gangliósido o el antígeno neural puede ser una glucoproteína asociada a mielina (MAG). Para modalidades en donde el antígeno neural es un gangliósido, el gangliósido puede seleccionarse de GM1, GM1b, GM2, GM3, GD1a, GD1b, GD2, GD3, GT1a, GT1b, GT3 y GQ1b. En ciertas modalidades preferidas, el gangliósido es GM1.
En ciertas modalidades, la neuropatía paraproteinémica se selecciona de: neuropatía motora multifocal (MMN), polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP), síndrome de Guillain-Barré (GBS), síndrome de Miller Fisher, neuropatía axonal motora aguda (AMAN), neuropatía axonal motora y sensitiva aguda (AMSAN), síndrome de neuropatía atáxica crónica-oftalmoplejía-paraproteína de IgM-aglutininas frías-anticuerpos disialosil (CANOMAD), neuropatía simétrica desmielinizante adquirida distal (DADS), neuropatía periférica asociada a gammopatía monoclonal, neuropatía periférica anti-MAG y síndrome de POEMS. En ciertas modalidades preferidas, la neuropatía paraproteinémica es neuropatía motora multifocal (MMN), polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP) o síndrome de Guillain-Barré (GBS). La neuropatía paraproteinémica es preferentemente neuropatía motora multifocal (MMN).
En modalidades preferidas, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este es un anticuerpo IgG o fragmento de unión al antígeno de este.
En ciertas modalidades, el fragmento de unión al antígeno se selecciona de: un dominio variable de la cadena ligera de anticuerpo (VL), un dominio variable de la cadena pesada de anticuerpo (VH), un anticuerpo de cadena sencilla (scFv), un fragmento F(ab')2, un fragmento Fab, un fragmento Fd, un fragmento Fv, un anticuerpo de un solo brazo (monovalente), diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, unicuerpos, anticuerpos de dominio y nanocuerpos.
En ciertas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno comprende un dominio VH que comprende o que consiste de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 y un dominio VL que comprende o que consiste de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70 % de identidad con la misma. En ciertas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno comprende un dominio VH que comprende o que consiste de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 y un dominio VL que comprende o que consiste de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.
En ciertas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este comprende un dominio constante de la cadena pesada de IgG humana.
En ciertas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.
En ciertas modalidades, el método comprende además administrar IVIg al sujeto.
En ciertas modalidades, el método comprende además administrar rituximab al sujeto.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 es un diagrama esquemático que muestra la cascada de señalización celular involucrada en las vías clásica, de la lectina y alternativa del sistema del complemento.
La Figura 2 muestra el perfil de expresión de diversas proteínas de membrana en células de Schwann vivas (sNF02.2). Las células de Schwann se tiñeron para determinar diferentes proteínas de membrana, particularmente proteínas asociadas con la cascada del complemento, mediante el uso de análisis de citometría de flujo. Los siete gráficos muestran lo siguiente: (A) CD46, (B) CD55, (C) CD59, (D) CD64, (E) CD88, (F) GM1 y (G) MAG.
La Figura 3 muestra el perfil de expresión de CRP en células de Schwann sNF02.2 con o sin tratamiento con fosfolipasa-C (PL-C). Las células de Schwann sNF02.2 se trataron con diferentes concentraciones de PL-C (1 - 0,5 - 0,25 U/ml) y se incubaron durante 1 h a 37 °C antes de teñirlas con anticuerpos que detectan CD46 (A), CD55 (B) y CD59 (C), respectivamente.
La Figura 4 muestra la resistencia de las células de Schwann (sNF96.2) a la lisis mediada por el complemento. Cada uno de los gráficos de la Figura 4 muestra 'sin tratamiento con PL-C' en la mitad izquierda del gráfico y 'tratamiento con PL-C' en la mitad derecha del gráfico.
(A) El tratamiento con PL-C redujo la expresión tanto de CD59 como de CD55 mediante la escisión del ancla de GPI. La expresión de CD46, que es una proteína transmembrana, no se vio afectada (eje y derecho). PL-C tampoco tuvo efecto sobre la expresión de GM1 (eje y izquierdo, panel A).
(B) Las células están intrínsecamente protegidas contra la fijación de C3. Se observó fijación de C3 en ausencia de opsonización con suero de pacientes con MMN, y la fijación de C3 aumentó ligeramente tras la opsonización con suero de pacientes con MMN. Las células tratadas con PL-C fueron más susceptibles a la fijación de C3, especialmente después de la opsonización. ARGX-117 inhibió la fijación de C3, aunque solo se observó una inhibición parcial después de la opsonización y el tratamiento con PL-C. Esto se debe presumiblemente a la densidad de opsonización combinada de anticuerpos anti-GM1 y anticuerpos séricos dirigidos a otros epítopos.
(C) Se observaron resultados similares a los observados en el panel B cuando se cuantificó la fijación de MAC.
(D) Las células de Schwann se protegieron contra la lisis celular mediada por el complemento, atribuible a la alta expresión de CD59. Las células no tratadas con PL-C siguieron siendo viables después de la opsonización y la incubación con suero con actividad del complemento. Después del tratamiento con PL-C, se observó lisis celular cuando las células de Schwann se opsonizaron con anticuerpos anti-GM1 derivados de pacientes. Esto se inhibió hasta la línea de base mediante ARGX-117.
La Figura 5 muestra la fijación del complemento C3 en células de Schwann sNF02.2 mediante AcM anti-HLA. Las células se opsonizaron con concentraciones crecientes de W6/32 (anticuerpo anti-HLA) antes de la adición de HPS (suero humano agrupado) para activar la vía del complemento. Se añadieron tanto EDTA como TNT009 (480 |jg/ml) para evaluar la especificidad del complemento.
La Figura 6 muestra la expresión de GM1 y la unión de IgM en células de Schwann. (A) Las células de Schwann sNF02.2 se tiñeron con CTb para detectar la expresión de GM1 mediante el uso de citometría de flujo. (B) Detección por citometría de flujo de la unión de IgM a células de Schwann sNF02.2 cultivadas después de la opsonización con suero de pacientes con MMN (barras sombreadas) o sin activación del complemento (barras blancas).
La Figura 7 muestra la unión de IgM en suero de pacientes con MMN a células de Schwann sNF02.2. Las células de Schwann se opsonizaron con diferentes muestras de pacientes, que contenían diversos títulos de GM1 y todas mostraron unión a IgM tras la incubación con células sNF02.2. (A) MFI de tinción de IgM (B) Porcentaje de células de Schwann positivas para IgM.
La Figura 8 muestra la optimización de la fijación de C3 en células de Schwann sNF02.2 después de la opsonización con suero de pacientes con MMN. Se sembraron 50 000 células de Schwann en placas de 96 pocillos y se opsonizaron con suero de pacientes con MMN (1 h, TA). Cada uno de los gráficos de la Figura 8 muestra 'sin opsonización' en la mitad izquierda del gráfico y 'opsonización' en la mitad derecha del gráfico. (A) El complemento se activó mediante el uso de diferentes porcentajes de suero con actividad del complemento: 10 % (gráfico izquierdo), 5 % (gráfico del medio) o 2,5 % (gráfico derecho). Se investigó el suero con actividad del complemento (barras negras) frente al suero aclarado (= suero con actividad del complemento incubado previamente con células de Schwann) (barras grises). (B) Resumen de resultados representados en (A) que compara suero (barras negras) frente a suero aclarado (barras gris claro). (C) Fijación de C3 en células de Schwann mediante el uso de diferentes anticuerpos de detección de C3: FITC c 3 (LSBio, clon 6C9) (gráfico de la izquierda), C3-BIO (LSBio, clon 6C9) APC estreptavidina (gráfico del medio) o C3-BIO (anti-C3 humano policlonal de oveja) APC estreptavidina (gráfico de la derecha). Las células se activaron con suero al 10 % (barras negras) o al 5 % (barras grises). Las barras blancas representan los controles de EDTA y todos fueron como se esperaba.
La Figura 9 muestra la dependencia de C2 de la activación del complemento en células de Schwann. Las células de Schwann se sembraron en placas de 96 pocillos y se opsonizaron con suero de pacientes con MMN (MMN-005) (1 h, TA) seguido de incubación con suero con agotamiento de C2 complementado con concentraciones crecientes de rhC2, que comienzan en 1,11 pg/ml hasta 30 pg/ml (concentración fisiológica). Después de 1 h (37 °C), se midió la fijación de C3 mediante el uso de citometría de flujo, después de teñir con C3-BIO (LSBio, clon 6C9).
La Figura 10 muestra la inhibición dependiente de la dosis de la fijación de C3 en células de Schwann sNF02.2 opsonizadas con suero de pacientes con MMN por ARGX-117. Las células de Schwann se transfirieron a una placa de 96 pocillos (50 000 células/pocillo), se opsonizaron con suero de pacientes con MMN (1 h, TA) y subsecuentemente se incubaron con suero con actividad del complemento al 5 % que se preincubó con anticuerpos bloqueadores del complemento o EDTA (20 min, TA). La detección de la fijación de C3 se realizó mediante la tinción de las células de Schwann con C3-BIO (LSBio, clon 6C9) y estreptavidina-APC. (A) Fijación de C3 en células de Schwann por los valores de MFI de APC. (B) Porcentaje de inhibición de la fijación de C3 en células de Schwann calculado con suero al 5 % fijado en cero % de inhibición y EDTA 10 mM fijado como 100 % de inhibición.
La Figura 11 muestra la secreción de citocinas por las células de Schwann sNF02.2 después de la activación del complemento inducida por sueros con MMN. Las células de Schwann se sembraron en placas de 24 pocillos, se opsonizaron con suero de pacientes con MMN (1 h, TA) y se añadió suero con actividad del complemento en presencia o ausencia de anticuerpos bloqueadores del complemento. Después de 48 h, se recogió el sobrenadante y se midió la secreción de citocinas mediante el uso de la plataforma Luminex. Los tres gráficos muestran lo siguiente: (A) IL-6, (B) IL-8 y (C) MCP-1. Cada uno de los gráficos de la Figura 11 muestra las barras en el siguiente orden (de izquierda a derecha): sin estimulación, IL-1b 10 ng/ml, IL-1b 5 ng/ml, IL-1b 2,5 ng/ml, TNF-a 50 ng/ml, TNF-a 25 ng/ml, TNF-a 12,5 ng/ml, solo suero, solo MMN-05, MMN-05 suero, MMN-05 suero MgEGTA, MMN-05 suero ARGX-117, MMN-05 suero TNT009, MMN-05 suero eculizumab, MMN-05 suero HI, solo MMN-73, MMN-73 suero, MMN-73 suero MgEGTA, MMN-73 suero ARGX-117, MMN-73 suero TNT009, MMN-73 suero eculizumab, MMN-73 suero HI.
La Figura 12 muestra un mecanismo propuesto de eventos del complemento desencadenados por autoanticuerpos contra GM1 presentes en pacientes con MMN.
La Figura 13 muestra la expresión de proteínas del complemento de membrana que incluyen proteínas reguladoras del complemento (CRP) en iPSC-MN fijadas. Las neuronas motores derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPSC-MN) se cultivaron y fijaron mediante el uso de PFA al 4 % en cubreobjetos antes de teñir para detectar marcadores de expresión. m Gv = valor gris medio.
La Figura 14 muestra la dependencia de C2 de la fijación de C3. Las neuronas motoras derivadas de iPSC se opsonizaron con suero con deficiencia de C2 y se reconstituyeron con concentraciones crecientes de C2 humano (hC2) purificado para evaluar la activación del complemento mediante la medición de la fijación de C3. Las iPSC-MN se cultivaron durante 3 días antes de la fijación y se tiñeron subsecuentemente para detectar la expresión de GM1 y el depósito de C3. Las imágenes se analizaron a un aumento de 40x y se calculó el valor gris medio (MGV) para g M1 solo, C3 solo o la relación entre los dos.
La Figura 15 muestra que ARGX-117 bloqueó el complemento en otras neuropatías mediadas por el sistema inmunitario. Se usaron sueros de pacientes con GBS o CIPD para opsonizar las neuronas motoras en presencia o ausencia de ARGX-117 (200 pg/ml). Las neuronas motoras derivadas de iPSC se cultivaron durante 12-14 días antes de la fijación y se tiñeron para detectar la expresión de GM1 y el depósito de C3. Las imágenes se analizaron a un aumento de 40x y se calculó el valor gris medio (MGV) para GM1 solo, C3 solo o la relación entre los dos (C3/GM1). Cada uno de los gráficos de la Figura 15 compara 'suero solo' (barra izquierda), 'suero EDTA' (barra del medio) y 'ARGX-117200 pg/ml' (barra derecha).
La Figura 16 muestra los efectos de IVIg sobre la fijación de C3 mediante el uso de iPSC-MN opsonizadas con muestra de pacientes con MMN. Las neuronas motoras derivadas de iPSC se cultivaron durante 12-14 días antes de la fijación y se tiñeron subsecuentemente para detectar la expresión de GM-1 y el depósito de C3. Se probaron dos lotes de IVIg diferentes: GammaQuin y Nanogam, ambas usados a 50 mg/ml. Las imágenes se analizaron a un aumento de 40x y se calculó el valor gris medio (MGV) para GM1 solo, C3 solo o la relación entre los dos (C3/GM1). Cada uno de los gráficos de la Figura 16 muestra las barras en el siguiente orden (de izquierda a derecha): suero solo, suero EDTA, GammaQuin ops, GammaQuin ops comp, GammaQuin comp, Nanogram ops, Nanogram ops comp, Nanogram comp.
La Figura 17 muestra el efecto antiidiotípico de IVIg sobre la unión a GM1 por sueros de pacientes con MMN. El ELISA se realizó con sueros de pacientes con MMN, MMN005 y MMN073. GM1 se recubrió en una placa de 96 pocillos, se incubó con sueros de pacientes con MMN con o sin la adición de IVIg 50 pg/ml (2 lotes: GammaQuin y Nanogam) antes de la detección de IgM mediante el uso de un anticuerpo anti-IgM humana.
Descripción detallada
A. Definiciones
A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente el experto en la técnica a la que se refiere la invención. Sin limitar ningún término, más abajo se proporcionan más aclaraciones de algunos de los términos usados en la presente descripción.
"Neuropatía paraproteinémica" - como se usa en la presente, el término "neuropatía paraproteinémica" o "PPN" describe un conjunto de neuropatías periféricas caracterizadas por la presencia de inmunoglobulina homogénea en el suero. La inmunoglobulina homogénea se conoce como "paraproteína". Una proliferación clonal anómala de linfocitos B o células plasmáticas, que puede producirse o no en el contexto de una neoplasia hematológica, produce un exceso de inmunoglobulinas. Varios trastornos del sistema nervioso periférico están estrechamente asociados con la presencia de cantidades excesivas de inmunoglobulinas anómalas en la sangre. La PPN puede ser provocada por la interacción de anticuerpos con objetivos antigénicos específicos en los nervios periféricos o por el depósito de las inmunoglobulinas. Las neuropatías paraproteinémicas ilustrativas que pueden tratarse de acuerdo con la invención incluyen MMN, CIDP y GBS.
"Neuropatía motora multifocal" - La neuropatía motora multifocal o MMN es un trastorno raro con una prevalencia de alrededor de 0,6 por cada 100000 individuos, con los hombres afectados con mayor frecuencia que las mujeres (relación de 2,7:1) (Harschnitz y otros, J Clin Immunol 2014, 34:112-119). La MMN es una neuropatía crónica mediada por el sistema inmunitario, caracterizada por una debilidad asimétrica predominantemente distal de las extremidades. El rasgo distintivo de la enfermedad es la presencia de bloqueos de la conducción motora multifocales, y los pacientes a menudo muestran altos niveles séricos de anticuerpos IgM contra el glicoesfingolípido GM1, que se expresa abundantemente en regiones perinodales de los nervios periféricos. Estos anticuerpos IgM auto-GM1 tienen propiedades de activación del complemento y son determinantes de la gravedad de la enfermedad (Vlam y otros, Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm 2015, 25;2(4)). GM1 se expresa abundantemente en los nervios motores periféricos y se localiza tanto en el axolema como en la mielina de los nervios periféricos. GM1 tiene varias funciones importantes necesarias para la propagación del potencial de acción y el mantenimiento de la velocidad de conducción. La mayor expresión de GM1 se encuentra en el nodo de Ranvier y en los paranodos adyacentes, donde ancla los canales de potasio y agrupa los canales de sodio para mantener las uniones estrechas a través de la estabilización paranodal. Además, GM1 funciona tanto como un modulador del receptor de factores neurotróficos que controlan la neuritogénesis y la apoptosis, como parte de ensambles multimoleculares en balsas lipídicas en la señalización y el tráfico de membrana. La interrupción de estas funciones da como resultado una falla en la conducción a través de áreas paranodales. Los anticuerpos IgM anti-GM1 presentes en pacientes con MMN son producidos por células B activadas (células plasmáticas); sin embargo, el mecanismo de esta activación de la células B aún no está establecido.
"Síndrome de Guillain-Barré" - El síndrome de Guillain-Barré o GBS tiene una incidencia de 0,81-1,89 casos por 100 000 individuos, con los hombres afectados con mayor frecuencia que las mujeres (relación de 3:2) (Kieseier y otros, Nature Reviews, 2018, 4:31). En el 60-70 % de los casos, los primeros síntomas de GBS se manifiestan entre 1 y 3 semanas después de una infección aguda, habitualmente una infección de las vías respiratorias superiores o una infección gastrointestinal. Los síntomas iniciales del GBS son típicamente cambios en sensación o dolor, junto con debilidad muscular, que comienzan en los pies y las manos. Esto a menudo se extiende a los brazos y a la parte superior del cuerpo. Los autoanticuerpos contra diversos gangliósidos encontrados en los axones se usan para ayudar al diagnóstico de ciertos subtipos de GBS. Por ejemplo, los anticuerpos IgG anti-GM1 y anti-GD1a se encuentran en el suero de pacientes que padecen neuropatía axonal motora aguda (AMAN) y neuropatía axonal motora y sensitiva aguda (AMSAN). Estos anticuerpos se unen a los nodos de Ranvier, donde interrumpen las disposiciones estructurales finas responsables del agrupamiento de canales de sodio, lo que conduce a una conducción axonal ralentizada y a la pérdida de función. Alternativamente, los anticuerpos se unen a las terminales nerviosas motoras lo que provoca la degeneración de la terminal nerviosa presináptica.
"Polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica" - La polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica o CIDP es la neuropatía más común mediada por el sistema inmunitario, con una prevalencia informada que varía de 0,8-8,9 casos por 100000 individuos (Kieseier y otros, Nature Reviews, 2018, 4:31). Los hombres se ven afectados con más frecuencia que las mujeres (relación de 2:1). La CIDP está estrechamente relacionada con el GBS y se considera la contraparte crónica de la enfermedad aguda. Los síntomas más comunes de CIDP son debilidad, entumecimiento y hormigueo en las piernas, brazos, dedos y manos. Otros síntomas incluyen fatiga, dolor, problemas de equilibrio y deterioro de la capacidad de caminar. Algunas variantes de CIDP presentan autoinmunidad contra proteínas en el nodo de Ranvier. Estas variantes comprenden un subgrupo de neuropatías inflamatorias con autoanticuerpos IgG4 contra las proteínas paranodales neurofascina-186, neurofascina-155, contactina-1 y caspr-1 (Querol y otros, Nat Rev Neurol. 2017, 13(9):533-547). Estas proteínas desempeñan un papel fundamental en la compartimentalización del axón mielinizado en el nodo, el paranodo y el internodo.
La compartimentalización es necesaria para la conducción saltatoria, ya que mantiene la segregación de los canales de sodio y potasio regulados por voltaje involucrados en la transmisión de los potenciales de acción. La interrupción de estas regiones puede dar como resultado una conducción nerviosa ralentizada o bloqueada.
"Antagonista del sistema del complemento" - como se usa en la presente, la frase "antagonista del sistema del complemento" o "antagonista del complemento" se refiere a cualquier agente capaz de bloquear o inhibir la función de un factor o componente del complemento de la cascada del complemento, lo que inhibe o reduce de esta manera la actividad del complemento. El antagonista del sistema del complemento puede bloquear o inhibir la vía clásica del complemento, la vía del complemento de la lectina, la vía alternativa del complemento o cualquiera de sus combinaciones. Preferentemente, el antagonista del sistema del complemento inhibe la vía clásica del complemento y la vía del complemento de la lectina al dirigirse a un factor del complemento que es común a ambas vías. El antagonista del complemento para su uso de acuerdo con los métodos descritos en la presente descripción inhibe el sistema del complemento aguas arriba del factor del complemento C5. Esto significa que el antagonista inhibe o reduce la actividad del complemento al inhibir cualquier componente o factor de la vía del complemento que precede a C5 en la cascada del complemento, es decir, el antagonista no inhibe directamente a C5 ni a ningún factor del complemento aguas abajo de C5. Por ejemplo, el antagonista puede inhibir la función del factor del complemento C1, C2, C3 o C4, o cualquier de sus combinaciones. La inhibición de la función de un factor del complemento significa que se evita que el factor del complemento realice su función en la cascada general de la activación del complemento incluso cuando está en presencia de su señal de activación aguas arriba.
Los antagonistas descritos en la presente descripción pueden tomar la forma de cualquier agente adecuado y pueden bloquear o inhibir la función de un factor del complemento o componente directa o indirectamente. El antagonista puede inhibir la función de su objetivo mediante la regulación negativa de la expresión del objetivo, tal como mediante la tecnología de ARNip. Con respecto a esto, los antagonistas adecuados incluyen especies de ARN inhibitorias, por ejemplo, ARNip o ARNhc. El antagonista puede inhibir la función de su objetivo al unirse directamente al objetivo; por ejemplo, el antagonista puede unirse directamente a su objetivo y evitar que active el siguiente factor del complemento en la cascada. En modalidades preferidas, el antagonista es específico para su objetivo. Por ejemplo, un antagonista de C2 inhibirá preferentemente la función de C2 en comparación con otros objetivos moleculares. Los antagonistas lograrán típicamente el nivel requerido de especificidad al interactuar directamente con su objetivo, por ejemplo, al unirse selectivamente a una proteína del complemento. Los agentes adecuados que pueden servir como antagonistas para su uso en los métodos descritos en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a: inhibidores de moléculas pequeñas; y antagonistas biológicos que incluyen péptidos inhibitorios, miméticos de anticuerpos tales como aficuerpos, afilinas, afitinas, adnectinas, atrímeros, evasinas, DARPins, anticalinas, avímeros, fínómeros, versacuerpos y duocalinas. De acuerdo con las reivindicaciones, los antagonistas para su uso en la presente invención son anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de estos.
"Anticuerpo" o "inmunoglobulina"- Como se usa en la presente, el término "inmunoglobulina" incluye un polipéptido que tiene una combinación de dos cadenas pesadas y dos ligeras, ya sea que posea o no alguna inmunorreactividad específica relevante. Los "anticuerpos" se refieren a los ensambles que tienen una actividad inmunorreactiva específica conocida significativa hacia un antígeno de interés. Los anticuerpos y las inmunoglobulinas comprenden cadenas ligeras y pesadas, con o sin un enlace covalente entre ellas. Las estructuras de inmunoglobulinas básicas en sistemas de vertebrados se comprenden relativamente bien.
El término genérico "inmunoglobuNna" comprende cinco clases distintas de anticuerpos que pueden distinguirse bioquímicamente. Con respecto a la IgG, las inmunoglobulinas comprenden dos cadenas polipeptídicas ligeras idénticas de peso molecular aproximadamente 23 000 Daltons, y dos cadenas pesadas idénticas de peso molecular 53000-70000. Las cuatro cadenas se unen mediante enlaces disulfuro en una configuración en "Y" en donde las cadenas ligeras se enmarcan en las cadenas pesadas que comienzan en la boca de la "Y" y continúan a través de la región variable. Las cadenas ligeras de un anticuerpo se clasifican como kappa o lambda (k,A). Cada clase de cadena pesada puede unirse con una cadena ligera kappa o lambda. En general, las cadenas ligeras y pesadas se unen covalentemente entre sí, y las porciones de "cola" de las dos cadenas pesadas se unen entre sí mediante enlaces disulfuro covalentes o enlaces no covalentes cuando las inmunoglobulinas se generan ya sea por hibridomas, células B o células huésped modificadas genéticamente. En la cadena pesada, las secuencias de aminoácidos van desde un extremo N-terminal en los extremos ramificados de la configuración Y hasta el extremo C-terminal en la parte inferior de cada cadena. Los expertos en la técnica apreciarán que las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, (y, |j, a, 8, £) con algunas subclases entre ellas (por ejemplo, Y1-Y4). Es la naturaleza de esta cadena la que determina la “clase” del anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgD o IgE, respectivamente. Las subclases de inmunoglobulinas (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, etc. están bien caracterizadas y se conoce que confieren especialización funcional. Las versiones modificadas de cada una de estas clases e isotipos son fácilmente discernibles para el experto en la técnica en vista de la presente descripción y, en consecuencia, están dentro del alcance de la presente invención.
Como se indicó anteriormente, la región variable de un anticuerpo permite que el anticuerpo reconozca selectivamente y se una específicamente a epítopos en antígenos. Es decir, el dominio VL y el dominio VH de un anticuerpo se combinan para formar la región variable que define un sitio de unión al antígeno tridimensional. Esta estructura de anticuerpo cuaternaria forma el sitio de unión al antígeno presente al final de cada brazo de la Y. Más específicamente, el sitio de unión al antígeno se define por tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) en cada una de las cadenas VH y VL.
El término "anticuerpo" como se usa en la presente descripción también pretende abarcar "anticuerpos VHH" o "anticuerpos solo de cadena pesada".
"Anticuerpos VHH" - Como se usa en la presente descripción, el término "anticuerpo VHH" o "anticuerpo solo de cadena pesada" se refiere a un tipo de anticuerpo producido solo por especies de la familiaCamelidae,que incluye camellos, llamas y alpacas. Los anticuerpos solo de cadena pesada o anticuerpos VHH están compuestos por dos cadenas pesadas y carecen de cadenas ligeras. Cada cadena pesada tiene un dominio variable en el extremo N-terminal, y estos dominios variables se denominan dominios "VHH" para distinguirlos de los dominios variables de las cadenas pesadas de los anticuerpos heterotetraméricos convencionales, es decir, los dominios VH, descritos anteriormente.
"Región variable" o "dominio variable" - los términos "región variable" y "dominio variable" se usan indistintamente en la presente descripción y pretenden tener un significado equivalente. El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables VH y VL difieren ampliamente en secuencia entre anticuerpos y se usan en la unión y especificidad de cada anticuerpo en particular por su antígeno objetivo. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente a lo largo de los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos denominados "lazos hipervariables" en cada uno del dominio VL y el dominio VH que forman parte del sitio de unión al antígeno. El primer, segundo y tercer lazos hipervariables del dominio de cadena ligera VLambda se denominan en la presente descripción L1(A), L2(A) y L3(A) y pueden definirse como que comprenden los residuos 24-33 (L1(A), que consiste de 9, 10 u 11 residuos de aminoácidos), 49-53 (L2(A), que consiste de 3 residuos) y 90-96 (L3(A), que consiste de 5 residuos) en el dominio VL (Morea y otros, Methods 20:267-279 (2000)). El primer, segundo y tercer lazos hipervariables del dominio de cadena ligera VKappa se denominan en la presente descripción l 1(k), L2(k) y L3(k) y pueden definirse como que comprenden los residuos 25-33 (L1(k), que consiste de 6, 7, 8, 11, 12 o 13 residuos), 49 53 (L2(<k>), que consiste de 3 residuos) y 90-97 (L3(<k>), que consiste de 6 residuos) en el dominio VL (Morea y otros, Methods 20:267-279 (2000)). El primer, segundo y tercer lazos hipervariables del dominio VH se denominan en la presente descripción H1, H2 y H3 y pueden definirse como que comprenden los residuos 25 33 (H1, que consiste de 7, 8 o 9 residuos), 52-56 (H2, que consiste de 3 o 4 residuos) y 91-105 (H3, muy variable en longitud) en el dominio VH (Morea y otros, Methods 20:267-279 (2000)).
A menos que se indique de otra forma, los términos L1, L2 y L3 se refieren respectivamente al primer, segundo y tercer lazos hipervariables de un dominio VL, y abarcan lazos hipervariables obtenidos de los isotipos Vkappa y Vlambda. Los términos H1, H2 y H3 se refieren respectivamente al primer, segundo y tercer lazos hipervariables del dominio VH, y abarcan lazos hipervariables obtenidos de cualquiera de los isotipos de cadena pesada conocidos, que incluyen<y>, £, 8, a o j .
Los lazos hipervariables L1, L2, L3, H1, H2 y H3 pueden comprender cada uno parte de una "región determinante de la complementariedad" o "CDR", como se define más abajo. Los términos "lazo hipervariable" y "región determinante de la complementariedad" no son estrictamente sinónimos, ya que los lazos hipervariables (HV) se definen sobre la base de la estructura, mientras que las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) se definen sobre la base de la variabilidad de la secuencia (Kabat y otros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ta Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD., 1983) y los límites de las HV y las CDR pueden ser diferentes en algunos dominios VH y VL.
Las CDR de los dominios VL y VH pueden definirse típicamente como que comprenden los siguientes aminoácidos: residuos 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2) y 89-97 (LCDR3) en el dominio variable de la cadena ligera, y residuos 31-35 o 31-35b (HCDR1), 50-65 (h Cd R2) y 95-102 (HCDR3) en el dominio variable de la cadena pesada; (Kabat y otros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ta Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Por lo tanto, las HV pueden comprenderse dentro de las CDR correspondientes y las referencias en la presente descripción a los "lazos hipervariables" de los dominios VH y VL deben interpretarse como que también abarcan las CDR correspondientes, y viceversa, a menos que se indique de otra forma.
Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se denominan región marco (FR), como se define más abajo. Los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras nativas comprenden cada uno cuatro FR (FR1,<f>R2, FR3 y FR4, respectivamente), que adoptan en gran medida una configuración de lámina p, conectada por los tres lazos hipervariables. Los lazos hipervariables en cada cadena se mantienen unidos en estrecha proximidad por las f R y, con los lazos hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno de los anticuerpos. El análisis estructural de anticuerpos reveló la relación entre la secuencia y la forma del sitio de unión formado por las regiones determinantes de la complementariedad (Chothia y otros, J. Mol. Biol. 227: 799-817 (1992)); Tramontano y otros, J. Mol. Biol, 215:175-182 (1990)). A pesar de su alta variabilidad de secuencia, cinco de los seis lazos adoptan solo un pequeño repertorio de conformaciones de cadena principal, denominadas "estructuras canónicas". Estas conformaciones se determinan en primer lugar por la longitud de los lazos y en segundo lugar por la presencia de residuos clave en ciertas posiciones en los lazos y en las regiones marco que determinan la conformación a través de su empaquetamiento, formación de enlaces de hidrógeno o la capacidad de asumir conformaciones inusuales de la cadena principal.
"CDR" - como se usa en la presente, el término "CDR" o "región determinante de la complementariedad" significa los sitios de unión al antígeno no contiguos que se encuentran dentro de la región variable de polipéptidos de cadena pesada y ligera. Estas regiones particulares se han descrito por Kabat y otros, J. Biol. Chem. 252, 6609-6616 (1977) y Kabat y otros, Sequences of protein of immunological interest. (1991), y por Chothia y otros, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) y por MacCallum y otros, J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996) donde las definiciones incluyen solapamientos o subconjuntos de residuos de aminoácidos cuando se comparan entre sí. Los residuos de aminoácidos que abarcan las CDR como se define por cada una de las referencias citadas anteriormente se exponen para su comparación. Preferentemente, el término "CDR" es una CDR como se define por Kabat en base a comparaciones de secuencias.
Tabla 1: Definiciones de CDR
1La numeración de residuos sigue la nomenclatura de Kabat y otros, supra
2La numeración de residuos sigue la nomenclatura de Chothia y otros, supra
3La numeración de residuos sigue la nomenclatura de MacCallum y otros, supra
"Región marco" - El término "región marco" o "región FR" como se usa en la presente descripción, incluye los residuos de aminoácidos que son parte de la región variable, pero no son parte de las c Dr (por ejemplo, mediante el uso de la definición de Kabat de las CDR). Por lo tanto, un marco de región variable tiene entre aproximadamente 100-120 aminoácidos de longitud pero solo incluye aquellos aminoácidos fuera de las CDR. Para el ejemplo específico de un dominio variable de la cadena pesada y para las CDR como se define por Kabat y otros, la región marco 1 corresponde al dominio de la región variable que abarca los aminoácidos 1 30; la región marco 2 corresponde al dominio de la región variable que abarca los aminoácidos 36-49; la región marco 3 corresponde al dominio de la región variable que abarca los aminoácidos 66-94, y la región marco 4 corresponde al dominio de la región variable de los aminoácidos 103 al final de la región variable. Las regiones marco para la cadena ligera se separan de manera similar por cada una de las CDR de la región variable de la cadena ligera. De manera similar, mediante el uso de la definición de CDR por Chothia y otros o McCallum y otros, los límites de la región marco se separan por los respectivos extremos de CDR como se describió anteriormente. En modalidades preferidas, las CDR son como se definen por Kabat.
En los anticuerpos de origen natural, las seis CDR presentes en cada anticuerpo monomérico son secuencias cortas y no contiguas de aminoácidos que se posicionan específicamente para formar el sitio de unión al antígeno a medida que el anticuerpo asume su configuración tridimensional en un entorno acuoso. El resto de los dominios variables pesados y ligeros muestran menos variabilidad intermolecular en la secuencia de aminoácidos y se denominan las regiones marco. Las regiones marco adoptan en gran medida una conformación de lámina p y las CDR forman lazos que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de lámina p. Por lo tanto, estas regiones marco actúan para formar un andamiaje que proporciona el posicionamiento de las seis CDR en la orientación correcta mediante interacciones no covalentes entre cadenas. El sitio de unión al antígeno formado por las CDR posicionadas define una superficie complementaria al epítopo en el antígeno inmunorreactivo. Esta superficie complementaria promueve la unión no covalente del anticuerpo al epítopo antigénico inmunorreactivo. La posición de las CDR puede identificarse fácilmente por un experto en la técnica.
"Región constante" - Como se usa en la presente, el término "región constante" se refiere a la porción del anticuerpo fuera de los dominios variables o regiones variables. Las cadenas ligeras de inmunoglobulina tienen un único dominio de "región constante", denominado típicamente "dominio CL o CL1". Este dominio se encuentra C terminal al dominio VL. Las cadenas pesadas de inmunoglobulina difieren en su región constante en dependencia de la clase de inmunoglobulina (<y>,<m>, a, 8, £). Las cadenas pesadas<y>, a y 8 tienen una región constante que consiste de tres dominios de inmunoglobulina (denominados CH1, CH2 y CH3) con una región bisagra flexible que separa los dominios CH1 y CH2. Las cadenas pesadas<m>y £ tienen una región constante que consiste de cuatro dominios (CH1-CH4). Los dominios constantes de la cadena pesada se colocan C terminal al dominio VH.
La numeración de los aminoácidos en las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulinas va desde el extremo N-terminal en los extremos ramificados de la configuración Y hasta el extremo C-terminal en la parte inferior de cada cadena. Se usan diferentes esquemas de numeración para definir los dominios constantes de las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulinas. De acuerdo con el esquema de numeración EU, los dominios constantes de la cadena pesada de una molécula de IgG se identifican de la siguiente manera: CH1 - residuos de aminoácidos 118-215; CH2 - residuos de aminoácidos 231-340; CH3 - residuos de aminoácidos 341-446. De acuerdo con el esquema de numeración de Kabat, los dominios constantes de la cadena pesada de una molécula de IgG se identifican de la siguiente manera: CH1 - residuos de aminoácidos 114-223; CH2 - residuos de aminoácidos 244-360; CH3 - residuos de aminoácidos 361-477. El “dominio Fc” o “región Fc” define típicamente la porción de la región constante de una cadena pesada que incluye los dominios CH2 y CH3. La región Fc puede incluir además algunos residuos de la región bisagra. La "región bisagra" incluye la porción de una molécula de cadena pesada que une el dominio CH1 al dominio CH2. Esta región bisagra comprende aproximadamente 25 residuos y es flexible, lo que permite que las dos regiones de unión al antígeno N-terminal se muevan independientemente. Las regiones bisagra pueden subdividirse en tres dominios distintos: dominios bisagra superior, medio e inferior (Roux K.H. y otros J. Immunol. 161:4083-90 1998). Los anticuerpos de la invención que comprenden una región bisagra "totalmente humana" pueden contener una de las secuencias de la región bisagra mostradas en la Tabla 2 más abajo.
Tabla 2: Secuencias bisa ra humana
"Fragmento" - el término "fragmento" o "fragmento de unión al antígeno" se refiere a una parte o porción de un anticuerpo o cadena de anticuerpo que comprende menos residuos de aminoácidos que un anticuerpo o cadena de anticuerpo intacto o completo. El término "fragmento de unión al antígeno" se refiere a un fragmento polipeptídico de una inmunoglobulina o anticuerpo que se une al antígeno o compite con el anticuerpo intacto (es decir, con el anticuerpo intacto del que se derivaron) por la unión al antígeno. Como se usa en la presente, el término "fragmento" de una molécula de anticuerpo incluye fragmentos de unión al antígeno de anticuerpos, por ejemplo, un dominio variable de la cadena ligera de anticuerpo (VL), un dominio variable de la cadena pesada de anticuerpo (VH), un anticuerpo de cadena sencilla (scFv), un fragmento F(ab')2, un fragmento Fab, un fragmento Fd, un fragmento Fv, un anticuerpo de un solo brazo (monovalente), diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos o cualquier molécula de unión al antígeno formada por la combinación, ensamble o conjugación de tales fragmentos de unión al antígeno. El término "fragmento de unión al antígeno" como se usa en la presente descripción pretende abarcar además fragmentos de anticuerpos seleccionados del grupo que consiste en unicuerpos, anticuerpos de dominio y nanocuerpos. Los fragmentos pueden obtenerse, por ejemplo, mediante tratamiento químico o enzimático de un anticuerpo intacto o completo o cadena de anticuerpo o mediante medios recombinantes.
"Especificidad" y "anticuerpos multiespecíficos"- Los anticuerpos para su uso en los métodos descritos en la presente descripción se unen a antígenos objetivo dentro del sistema del complemento. Se prefiere que los anticuerpos “se unan específicamente” a su antígeno objetivo, en donde el término “se unan específicamente” se refiere a la capacidad de cualquier anticuerpo para inmunoreaccionar preferentemente con un objetivo dado, por ejemplo, C1, C2, C3 o C4. Los anticuerpos pueden ser monoespecíficos y contener uno o más sitios de unión que se unen específicamente a un objetivo en particular. Los anticuerpos pueden incorporarse en formatos de "anticuerpo multiespecífico", por ejemplo, anticuerpos biespecíficos, en donde el anticuerpo multiespecífico se une a dos o más antígenos objetivo. Para lograr especificidades múltiples, los "anticuerpos multiespecíficos" típicamente se manipulan genéticamente para incluir diferentes combinaciones o emparejamientos de polipéptidos de cadena pesada y ligera con diferentes pares VH-VL. Los anticuerpos multiespecíficos, notablemente los biespecíficos, pueden manipularse genéticamente para adoptar la conformación general de un anticuerpo nativo, por ejemplo, un anticuerpo en forma de Y que tiene brazos Fab de diferentes especificidades conjugados a una región Fc. Alternativamente, los anticuerpos multiespecíficos, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos, pueden manipularse genéticamente para adoptar una conformación no nativa, por ejemplo, en donde los dominios variables o pares de dominios variables que tienen diferentes especificidades se colocan en extremos opuestos de la región Fc.
"Anticuerpo modificado" - Como se usa en la presente descripción, el término "anticuerpo modificado" incluye formas sintéticas de anticuerpos que se alteran de manera que no son de origen natural, por ejemplo, anticuerpos que comprenden al menos dos porciones de cadena pesada pero no dos cadenas pesadas completas (tales como, anticuerpos con dominio eliminado o minicuerpos); formas multiespecíficas de anticuerpos (por ejemplo, biespecíficos, triespecíficos, etc.) alteradas para unirse a dos o más antígenos diferentes o a epítopos diferentes en un solo antígeno); moléculas de cadena pesada unidas a moléculas scFv y similares. Las moléculas scFv se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos 5,892,019. Además, el término "anticuerpo modificado" incluye formas multivalentes de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos trivalentes, tetravalentes, etc., que se unen a tres o más copias del mismo antígeno). En otra modalidad, un anticuerpo modificado de la invención es una proteína de fusión que comprende al menos una porción de la cadena pesada que carece de un dominio CH2 y que comprende un dominio de unión de un polipéptido que comprende la porción de unión de un miembro de un par ligando y receptor.
"Sustituciones humanizadoras" - Como se usa en la presente, el término "sustituciones humanizadoras" se refiere a sustituciones de aminoácidos en las que el residuo de aminoácido presente en una posición particular en el dominio VH o VL de un anticuerpo se reemplaza con un residuo de aminoácido que se presenta en una posición equivalente en un dominio VH o VL humano de referencia. El dominio VH o VL humano de referencia puede ser un dominio VH o VL codificado por la línea germinal humana. Las sustituciones humanizadoras pueden realizarse en las regiones marco y/o las CDR de los anticuerpos, definidas en la presente descripción.
"Variantes humanizadas" - Como se usa en la presente descripción, el término "variante humanizada" o "anticuerpo humanizado" se refiere a una variante de anticuerpo que contiene una o más "sustituciones humanizadoras" en comparación con un anticuerpo de referencia, en donde una porción del anticuerpo de referencia (por ejemplo, el dominio VH y/o el dominio VL o partes de estos que contienen al menos una CDR) tiene un aminoácido derivado de una especie no humana, y las "sustituciones humanizadoras" se presentan dentro de la secuencia de aminoácidos derivada de una especie no humana.
"Variantes de la línea germinal" - El término "variante de la línea germinal" o "anticuerpo de la línea germinal" se usa en la presente descripción para referirse específicamente a "variantes humanizadas" en las que las "sustituciones humanizadoras" dan como resultado el reemplazo de uno o más residuos de aminoácidos presentes en (una) posición(ones) particular(es) en el dominio VH o VL de un anticuerpo con un residuo de aminoácido que se presenta en una posición equivalente en un dominio VH o VL humano de referencia codificado por la línea germinal humana. Es típico que para cualquier "variante de la línea germinal" dada, los residuos de aminoácidos de reemplazo sustituidosenla variante de la línea germinal se toman exclusivamente, o predominantemente, de un solo dominio VH o VL codificado por la línea germinal humana. Los términos "variante humanizada" y "variante de la línea germinal" se usan a menudo indistintamente. La introducción de una o más "sustituciones humanizadoras" en un dominio VH o VL derivado de camélidos (por ejemplo, derivado de llama) da como resultado la producción de una "variante humanizada" del dominio VH o VL derivado de camélidos (llama). Si los residuos de aminoácidos sustituidos se derivan predominantemente o exclusivamente de una única secuencia de dominio VH o VL codificada por la línea germinal humana, entonces el resultado puede ser una "variante de la línea germinal humana" del dominio VH o VL derivado de camélidos (llama).
"Variantes de afinidad" - Como se usa en la presente, el término "variante de afinidad" se refiere a una variante de anticuerpo que presenta uno o más cambios en la secuencia de aminoácidos en comparación con un anticuerpo de referencia, en donde la variante de afinidad presenta una afinidad alterada por el antígeno objetivo en comparación con el anticuerpo de referencia. Por ejemplo, las variantes de afinidad exhibirán una afinidad cambiada por un objetivo en comparación con un anticuerpo de referencia. Preferentemente, la variante de afinidad mostrará una afinidad mejorada por el antígeno objetivo, en comparación con el anticuerpo de referencia. Las variantes de afinidad presentan típicamente uno o más cambios en la secuencia de aminoácidos en las CDR, en comparación con el anticuerpo de referencia. Tales sustituciones pueden dar como resultado el reemplazo del aminoácido original presente en una posición dada en las CDR con un residuo de aminoácido diferente, que puede ser un residuo de aminoácido de origen natural o un residuo de aminoácido que no es de origen natural. Las sustituciones de aminoácidos pueden ser conservadoras o no conservadoras.
"Sujeto" - como se usa en la presente descripción, el término "sujeto" se refiere a un mamífero, preferentemente un ser humano. El sujeto puede ser un hombre o una mujer. El sujeto puede presentar uno o más síntomas consistentes con una neuropatía paraproteinémica. En ciertas modalidades, el sujeto puede ser un paciente, donde un paciente es un individuo que está bajo atención médica y/o busca activamente atención médica para el tratamiento de una neuropatía paraproteinémica.
B. Anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno para su uso en métodos de tratamiento
La presente invención proporciona anticuerpos anti-C2 y fragmentos de unión al antígeno para su uso en métodos de tratamiento de neuropatías paraproteinémicas. Los métodos implican la administración a un sujeto de un antagonista del sistema del complemento como se reivindicó, en donde el antagonista inhibe el sistema del complemento aguas arriba del factor del complemento C5.
Las neuropatías paraproteinémicas se definen en otra parte en la presente descripción y comprenden una clase de neuropatías periféricas caracterizadas por la presencia de una inmunoglobulina homogénea o "paraproteína" en el suero. Las neuropatías periféricas son enfermedades o estados degenerativos de los nervios periféricos en los que se ven afectadas las fibras nerviosas motoras, sensitivas o vasomotoras. De particular interés son las neuropatías mediadas por el sistema inmunitario, que representan una clase de trastornos de los nervios periféricos provocados por el daño mediado por el sistema inmunitario a los nervios periféricos. En general, las neuropatías periféricas mediadas por el sistema inmunitario se caracterizan por debilidad muscular progresiva y a menudo van acompañadas de déficits sensoriales tales como dolor y entumecimiento. Se especula que estos trastornos son provocados por anticuerpos autorreactivos en el suero que se unen a componentes de mielina o a proteínas ubicadas en los nodos de Ranvier. Una característica común de estos trastornos es que se ve comprometida la barrera hemato-nerviosa (BNB), lo que permite que los autoanticuerpos, los componentes del complemento y las células inflamatorias accedan al endoneuro del nervio. Se cree que esta ruptura de la BNB es desencadenada por citocinas circulantes, tales como VEGF, TNFa e IL1-p y metaloproteasas secretadas por células T. Tras la entrada al nervio, los autoanticuerpos pueden unirse a antígenos neuronales tales como glicoproteína asociada a mielina (MAG) o gangliósidos que están presentes en la mielina, o en la unión entre axones, respectivamente. Como se explica en otra parte en la presente descripción, la formación de complejos inmunitarios anticuerpo/antígeno puede iniciar la vía clásica del sistema del complemento mediante el reclutamiento de C1q.
Las neuropatías paraproteinémicas son un grupo de neuropatías mediadas por el sistema inmunitario caracterizadas por exceso de inmunoglobulinas en el suero. Las PPN se asocian frecuentemente con la presencia de autoanticuerpos. Las estrategias de tratamiento existentes para esta clase de neuropatías incluyen actualmente inmunoglobulina intravenosa (IVIg), plasmaféresis (intercambio de plasma), corticosteroides, azatioprina, rituximab, clorambucilo, fludarabina, melfalán y otros (ver Rison y Beydoun. BMC Neurology. (2016) 16:13).
Como se informa en la presente descripción, las inmunoglobulinas presentes en el suero de pacientes con diferentes neuropatías paraproteinémicas pueden activar el complemento y esto respalda un papel en el daño tisular mediado por el complemento en la patología observada en pacientes con PPN. Sin embargo, un estudio clínico previo que probó eculizumab (Soliris™- un anticuerpo anti-C5) en el tratamiento de la neuropatía motora multifocal (MMN) no demostró eficacia (Fitzpatrick y otros, J Peripher Nerv Syst, 2011, 16(2):84-91).
Es importante destacar que los presentes inventores han demostrado que tanto las células de Schwann como las neuronas motoras regulan positivamente la proteína reguladora del complemento CD59, una proteína que protege a las células contra la lisis mediada por MAC. Esta observación indica que los elementos de la cascada del complemento aguas arriba de C5 desempeñan un papel más importante en la patología de la PPN. Esto puede explicar bien la falta de eficacia observada anteriormente con el eculizumab. Sin desear limitarse por la teoría, se cree que la activación del complemento en las neuropatías paraproteinémicas induce la liberación de citocinas y/o quimiocinas a través de la activación de C3aR, que se encontró que se expresa en las células de Schwann y las neuronas motoras. Las quimiocinas, tales como MCP-1, pueden desempeñar un papel en la atracción de células inflamatorias, lo que promueve de esta manera el daño neurológico.
La presente invención busca mejorar el tratamiento de la PPN al dirigirse a la actividad del complemento aguas arriba del factor del complemento C5.
Las neuropatías a tratar de acuerdo con los métodos descritos en la presente descripción incluyen todas las neuropatías periféricas categorizadas como "neuropatías paraproteinémicas". Esto incluye tanto trastornos agudos como crónicos. Las neuropatías paraproteinémicas pueden clasificarse como desmielinizantes o axonales, o una de sus combinaciones, en dependencia de si se dañan la mielina y/o el axón. En ciertas modalidades, la neuropatía a tratar es una neuropatía axonal. En ciertas modalidades, la neuropatía a tratar es una neuropatía desmielinizante, por ejemplo, una neuropatía desmielinizante crónica.
Las neuropatías paraproteinémicas se caracterizan frecuentemente por la presencia de autoanticuerpos. Por lo tanto, en ciertas modalidades, las neuropatías a tratar de acuerdo con los métodos descritos en la presente descripción se caracterizan por la presencia de autoanticuerpos. Los altos títulos de autoanticuerpos séricos que reconocen antígenos neurales se producen en varias formas de neuropatías sensoriales, motoras y sensoriomotoras periféricas. Los anticuerpos reaccionan frecuentemente con moléculas de la superficie celular glicosiladas, que incluyen glicolípidos, glicoproteínas y glicosaminoglucanos, pero también se han descrito anticuerpos contra proteínas intracelulares. Existen varias correlaciones entre la especificidad de los anticuerpos y los síntomas clínicos, lo que sugiere que las neuropatías pueden ser provocadas por los anticuerpos. Los autoanticuerpos, típicamente del isotipo IgM o IgG, son capaces de activar la vía clásica del sistema del complemento en los nervios periféricos, como se describe en otra parte en la presente descripción. El acceso a los nervios periféricos por autoanticuerpos y el complemento es posible después de la ruptura de la barrera hemato-nerviosa (BNB). En ciertas modalidades, la neuropatía paraproteinémica se caracteriza por un título alto de autoanticuerpos. En ciertas modalidades, la neuropatía paraproteinémica se caracteriza por la presencia de autoanticuerpos IgG, IgM o IgA.
En ciertas modalidades, la neuropatía paraproteinémica se caracteriza por la presencia de autoanticuerpos contra un antígeno neural. En ciertas modalidades, el antígeno neural es una proteína ubicada en los nodos de Ranvier. En otras modalidades, el antígeno neural es una proteína ubicada en la envoltura de mielina. La glicoproteína asociada a mielina (MAG) es un constituyente de la mielina del sistema nervioso periférico y central. Los altos títulos de anticuerpos IgM contra MAG se asocian con la neuropatía periférica desmielinizante sensoriomotora. Los anticuerpos anti-MAG se asocian habitualmente con la presencia de una proteína monoclonal IgM. En ciertas modalidades, el antígeno neural es la glicoproteína asociada a mielina (MAG).
Los gangliósidos son un grupo de glicoesfingolípidos ampliamente distribuidos en los componentes de membrana del sistema nervioso. En ciertas modalidades, el antígeno neural es un gangliósido. Los gangliósidos más comúnmente reconocidos por los autoanticuerpos asociados a neuropatías son GM1, GD1a, GD1b y GQ1b. En ciertas modalidades, el gangliósido se selecciona de GM1, GM1b, GM2, GM3, GD1a, GD1b, GD2, GD3, GT1a, GT1b, GT3 y GQ1b. En una modalidad preferida, el gangliósido es GM1. Los pacientes individuales pueden tener anticuerpos contra un solo gangliósido o contra múltiples gangliósidos. En consecuencia, en ciertas modalidades, la neuropatía paraproteinémica se caracteriza por la presencia de autoanticuerpos contra uno o más antígenos neurales. En ciertas modalidades, la neuropatía periférica se caracteriza por la presencia de autoanticuerpos contra uno o más gangliósidos. En ciertas modalidades, el antígeno neural es una proteína paranodal. En ciertas modalidades, el antígeno neural puede ser una proteína paranodal seleccionada de contactina 1, NF155, NF186 y NF140. Los autoanticuerpos conocidos por estar asociados con diversas neuropatías periféricas se describen en la Tabla 3 más abajo. Por ejemplo, se han identificado en pacientes con CIDP autoanticuerpos IgG4 dirigidos contra proteínas paranodales. La detección de anticuerpos GM1, habitualmente del isotipo IgM, se asocia con la neuropatía motora multifocal y la neuropatía motora inferior, caracterizada por debilidad muscular y atrofia. La IgM anti-GM1 puede estar presente como una paraproteína IgM monoclonal o como IgM policlonal.
POEMS desconocido
Las neuropatías paraproteinémicas particulares a tratar de acuerdo con los métodos descritos en la presente descripción pueden seleccionarse de neuropatía motora multifocal (MMN), polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP), síndrome de Guillain-Barré (GBS), síndrome de Miller Fisher, neuropatía axonal motora aguda (AMAN), neuropatía axonal motora y sensitiva aguda (AMSAN), síndrome de neuropatía atáxica crónica-oftalmoplejía-paraproteína de IgM-aglutininas frías-anticuerpos disialosil (CANOMAD), neuropatía simétrica desmielinizante adquirida distal (DADS), neuropatía periférica asociada a gammopatía monoclonal, neuropatía periférica anti-MAG y síndrome de POEMS. En ciertas modalidades preferidas, la neuropatía paraproteinémica se selecciona de neuropatía motora multifocal (MMN), polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP), síndrome de Guillain-Barré (GBS). Los métodos descritos en la presente descripción se prefieren particularmente para el tratamiento de la neuropatía motora multifocal (MMN).
Los métodos descritos en la presente descripción son para tratar una neuropatía paraproteinémica en un sujeto que lo necesita. El sujeto es preferentemente un sujeto humano. El sujeto puede ser un paciente, donde un paciente es una persona que está bajo atención médica y/o busca activamente atención médica para el tratamiento de una neuropatía paraproteinémica. El sujeto a tratar presentará típicamente uno o más síntomas consistentes con una neuropatía paraproteinémica que incluyen, pero no se limitan a, el inicio gradual de entumecimiento; picazón u hormigueo en los pies o las manos, que puede extenderse hacia arriba en las piernas y los brazos; dolor agudo, punzante, palpitante, helado o ardiente; sensibilidad extrema al tacto; falta de coordinación y caídas; espasmos y calambres musculares; adelgazamiento (desnutrición) de los músculos; debilidad muscular o parálisis. El sujeto a tratar se puede haber diagnosticado previamente como que tiene una neuropatía paraproteinémica mediante cualquier criterio de evaluación estándar. El sujeto puede identificarse o se ha diagnosticado previamente sobre la base de un exceso de inmunoglobulinas en el suero. Alternativamente o además, el sujeto puede poseer autoanticuerpos contra uno o más antígenos neurales
El sujeto a tratar puede estar ya recibiendo tratamiento para una neuropatía paraproteinémica o puede que ha recibido previamente tratamiento para una neuropatía paraproteinémica. En algunas modalidades, el sujeto ha recibido previamente o está recibiendo IVIg. En otras modalidades, el sujeto ha recibido previamente o está recibiendo rituximab. En algunas modalidades, el sujeto ha recibido o está recibiendo un intercambio de plasma. El sujeto puede no haber respondido al tratamiento anterior o puede haber desarrollado resistencia al tratamiento anterior de manera que sus síntomas han empeorado.
Los métodos de tratamiento descritos en la presente descripción pueden conducir a una reversión completa o parcial de uno o más síntomas asociados con la PPN. Las mejoras en el rendimiento pueden medirse mediante el uso de cualquier criterio de evaluación estándar adecuado para evaluar el tratamiento de la PPN.
Los anticuerpos anti-C2 o fragmentos de unión al antígeno para su uso de acuerdo con la presente invención pueden administrarse con uno o más agentes terapéuticos adicionales para el tratamiento de la neuropatía paraproteinémica. Los uno o más agentes terapéuticos adicionales pueden administrarse simultáneamente con el antagonista del complemento como una terapia combinada. Alternativamente, los uno o más agentes adicionales pueden administrarse antes o después de la administración del antagonista del complemento, es decir, los agentes se administran secuencialmente. Los agentes terapéuticos adicionales que pueden administrarse de acuerdo con los métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a, IVIg, rituximab, corticosteroides, azatioprina, clorambucilo, fludarabina, melfalán, ciclofosfamida/prednisona, melfalán, gabapentina, pregabalina, valproato, dextrometorfano, tramadol, duloxetina, amitriptilina y venlafaxina.
C. Antagonistas del complemento
Los resultados presentados en la presente descripción indican que las etapas terminales de la cascada del complemento, particularmente la lisis mediada por MAC, pueden no desempeñar un papel significativo en la patología de la PPN. Esto se debe a que las células de Schwann y las neuronas motoras expresan altos niveles de la proteína reguladora del complemento CD59, que protege contra la lisis mediada por MAC. Por lo tanto, se deduce que la patología relacionada con el complemento asociada con las neuropatías paraproteinémicas descritas en la presente descripción puede estar mediada por factores aguas arriba de C5, por ejemplo, a través del C3aR. Por lo tanto, la presente invención proporciona anticuerpos anti-C2 o fragmentos de unión al antígeno para su uso en un método de tratamiento de neuropatías paraproteinémicas al inhibir la vía del complemento aguas arriba de C5.
Los métodos comprenden administrar a un sujeto un antagonista del sistema del complemento como se define en las reivindicaciones, en donde el antagonista inhibe el sistema del complemento aguas arriba del factor del complemento C5. Un antagonista que inhibe el sistema del complemento aguas arriba del factor del complemento C5 no inhibe directamente al propio factor del complemento C5 ni a ninguno de los factores aguas abajo (C6, C7, C8, C9) que se combinan para formar el complejo de ataque a la membrana. En cambio, un antagonista que inhibe el sistema del complemento aguas arriba del factor del complemento C5 se dirige a un factor o componente de la cascada del complemento que precede al factor del complemento C5. Los factores del complemento aguas arriba de C5 incluyen C1, C2, C4 y C3. El factor iniciador de la vía clásica del complemento es el factor del complemento C1. Aunque no forman parte de la presente invención, en la presente descripción se describen además antagonistas que inhiben el factor del complemento C1. Estos antagonistas pueden inhibir el factor del complemento C1q C1r o C1s. Al inhibir la cascada del complemento en el factor del complemento C1, es posible prevenir o reducir la escisión de los objetivos específicos de C1, C4 y C2, e inhibir específicamente la activación del complemento a través de la vía clásica del sistema del complemento. La inhibición de C1 puede reducir el depósito de la opsonina C4b, lo que reduce de esta manera el direccionamiento de células para la fagocitosis y destrucción. Además, la inhibición de C1 puede prevenir o reducir la formación de la C3 convertasa, C4bC2a. C4 y C2 también pueden escindirse por enzimas MASP a través de la vía de la lectina; sin embargo, los niveles totales de C3 convertasa aún pueden inhibirse significativamente al dirigirse al factor del complemento C1.
Aunque no forman parte de la presente invención, en la presente descripción se describen además antagonistas que inhiben el factor del complemento C4. Estos antagonistas pueden inhibir el factor del complemento C4a o C4b. Al dirigirse al factor del complemento C4, es posible prevenir la formación de la C3 convertasa, C4bC2a, e inhibir la activación del complemento a través de las vías clásica y de la lectina del sistema del complemento.
De acuerdo con la invención, el antagonista inhibe el factor del complemento C2. La inhibición de C2 también evitará o reducirá la formación de la C3 convertasa, por lo tanto, se reduce el depósito de la anafilatoxina C3a y la opsonina C3b, y otros productos de la activación del complemento aguas abajo de C2. Los antagonistas de C2 pueden inhibir directamente a C2a, lo que evita la formación de la C3 convertasa. Alternativamente, y de acuerdo con la invención, el antagonista inhibe C2b lo que evita la unión inicial de C2 a C4b unido a la superficie. Un antagonista de C2b puede dejar intacta la unión de C2a a C4b. Sin embargo, la actividad de C2 puede inhibirse significativamente mediante un antagonista de C2b.
Aunque no forman parte de la presente invención, en la presente descripción se describen además antagonistas que inhiben el factor del complemento C3. Estos antagonistas pueden inhibir el factor del complemento C3a o C3b. La inhibición de C3 puede prevenir o reducir la formación de la C5 convertasa, C3bBbC3b, lo que reduce así el depósito de la anafilatoxina C5a y el generador de MAC, C5b.
En dependencia del punto en la cascada del complemento en el que el antagonista inhibe el sistema del complemento, el antagonista puede inhibir la vía clásica del complemento, la vía del complemento de la lectina, la vía alternativa del complemento o una combinación de estas vías. En ciertas modalidades, el antagonista inhibe la vía clásica del complemento y la vía del complemento de la lectina, pero no afecta la vía alternativa del complemento. Los antagonistas dirigidos a C2 y C4 son capaces de inhibir las vías del complemento clásicas y de la lectina al tiempo que dejan intacta la vía alternativa. En algunos casos, puede ser beneficioso dejar intacta una de las vías del complemento de manera que este importante brazo del sistema inmunitario innato no se inhabilite por completo. Alternativamente o además, el antagonista puede necesitar solo provocar una inhibición parcial de la actividad del complemento para lograr un efecto terapéutico.
Los antagonistas para su uso en los métodos terapéuticos descritos en la presente descripción inhiben los factores o componentes del sistema del complemento aguas arriba del factor del complemento C5 para inhibir o reducir la actividad del complemento. Como se informa en la presente descripción, es beneficioso dirigirse a la cascada del complemento aguas arriba de C5 para inhibir la actividad de los factores del complemento que preceden a la formación del complejo MAC. Los antagonistas para su uso de acuerdo con los métodos descritos en la presente descripción pueden reducir o inhibir la actividad del complemento mediante la inhibición de la generación de los péptidos derivados del complemento biológicamente activos tales como C4a, C4b, C3a, C3b y C5a. El antagonista puede prevenir, al menos en parte, los efectos dañinos de los péptidos derivados del complemento en células y tejidos. El antagonista del sistema del complemento puede inhibir o reducir la actividad del complemento mediante la reducción del depósito de anafilatoxinas, mediante la reducción del depósito de opsoninas, mediante la reducción de la producción o secreción de citocinas y/o quimiocinas, mediante la reducción de la fagocitosis, mediante la reducción del reclutamiento de células inmunitarias, y cualquiera de sus combinaciones. En ciertas modalidades, el antagonista del sistema del complemento inhibe el depósito de anafilatoxinas. En ciertas modalidades, el antagonista inhibe el depósito de C3a o C5a. En ciertas modalidades, el antagonista inhibe el depósito de opsoninas. En ciertas modalidades, el antagonista inhibe el depósito de C3b o C4b. En ciertas modalidades, el antagonista inhibe la producción y/o secreción de citocinas y/o quimiocinas inflamatorias. En algunas modalidades, el antagonista inhibe la producción y/o secreción de MCP-1.
El antagonista para su uso en la presente invención puede ser cualquier agente capaz de inhibir la función de un factor del complemento, lo que inhibe o reduce de esta manera la actividad del complemento. Como se señala en otra parte en la presente descripción, se prefiere que los antagonistas para su uso en los métodos exhiban especificidad por su objetivo. Esta especificidad se logra típicamente mediante la unión del antagonista directamente a su objetivo e inhibiendo la función del objetivo.
De acuerdo con las reivindicaciones, el antagonista es un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este.
De acuerdo con las reivindicaciones, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno se une a C2, específicamente a C2b.
Los anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno para su uso en los métodos descritos en la presente descripción están destinados para su uso terapéutico en seres humanos y, por lo tanto, serán típicamente de tipo IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, a menudo de tipo IgG, en cuyo caso pueden pertenecer a cualquiera de las cuatro subclases IgG1, IgG2a y b, IgG3 o IgG4. En modalidades preferidas, los anticuerpos son anticuerpos IgG, opcionalmente anticuerpos IgG1. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales, policlonales, multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), siempre que presenten la especificidad inmunológica apropiada por su objetivo. Se prefieren los anticuerpos monoclonales ya que son altamente específicos, al dirigirse contra un solo sitio antigénico.
Los fragmentos de unión al antígeno descritos en la presente descripción comprenderán típicamente una porción de un anticuerpo de longitud completa, generalmente el dominio de unión al antígeno o variable de este. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen Fab, Fab', F(ab')2, Fab biespecíficos y fragmentos Fv, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpos de cadena sencilla, un fragmento variable de cadena sencilla (scFv) y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos (ver Holliger y Hudson (2005) Nature Biotechnol. 23:1126-36).
Los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno para su uso de acuerdo con los métodos descritos en la presente descripción pueden presentar una alta homología con los humanos. Tales moléculas de anticuerpos que tienen alta homología con los humanos pueden incluir anticuerpos que comprenden dominios VH y VL de anticuerpos no humanos nativos que presentan un % de identidad de secuencia suficientemente alto con secuencias de la línea germinal humana. En ciertas modalidades, las moléculas de anticuerpos son variantes humanizadas o de la línea germinal de anticuerpos no humanos.
En modalidades no limitantes, los anticuerpos pueden comprender dominios CH1 y/o dominios CL (de la cadena pesada y la cadena ligera, respectivamente), cuya secuencia de aminoácidos es completamente o sustancialmente humana. Para las moléculas de anticuerpos destinadas al uso terapéutico en seres humanos, es típico que toda la región constante del anticuerpo, o al menos una parte de esta, tenga una secuencia de aminoácidos completamente o sustancialmente humana. Por lo tanto, una o más o cualquier combinación del dominio CH1, región bisagra, dominio CH2, dominio CH3 y dominio CL (y dominio CH4 si está presente) puede ser completamente o sustancialmente humana con respecto a su secuencia de aminoácidos. El dominio CH1, la región bisagra, el dominio CH2, el dominio CH3 y/o el dominio CL (y/o el dominio CH4 si está presente) pueden derivarse de un anticuerpo humano, preferentemente un anticuerpo IgG humano, con mayor preferencia un anticuerpo IgG1 humano de subtipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.
Ventajosamente, el dominio CH1, la región bisagra, el dominio CH2, el dominio CH3 y el dominio CL (y el dominio CH4 si está presente) pueden tener todos secuencias de aminoácidos completamente o sustancialmente humanas. En el contexto de la región constante de un anticuerpo humanizado o quimérico, o un fragmento de anticuerpo, el término "sustancialmente humana" se refiere a una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos 90 %, o al menos 92 %, o al menos 95 %, o al menos 97 %, o al menos 99 % con una región constante humana. El término "secuencia de aminoácidos humana" en este contexto se refiere a una secuencia de aminoácidos que es codificada por un gen de inmunoglobulina humana, que incluye genes de la línea germinal, reorganizados y mutados somáticamente.
En una modalidad, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende un dominio Fc humano, que comprende una o más mutaciones diseñadas para aumentar la semivida sérica del anticuerpo o molécula de anticuerpo. Tales esfuerzos de optimización tienen como objetivo mejorar la circulación del anticuerpoin vivo.Los ejemplos de mutaciones que afectan la semivida en el dominio Fc de IgG humana incluyen His433Lys Asn434Phe (NHance); Arg435His; Asn434Ala; Met252Tyr Ser254Thr Thr256Glu (YTE); Met428Leu Asn434Ser (LS); Thr252Leu Thr253Ser Thr254Phe (LSF); Glu294delta Thr307Pro Asn434Tyr (C6A-66); Thr256Asn Ala378Val Ser383Asn Asn434Tyr (C6A-78); y Glu294delta (del). En dependencia de la semivida sérica del inhibidor del complemento, puede administrarse como una dosis única, o puede administrarse como dosis múltiples con un intervalo de 1 día a 1 mes entre dosis subsecuentes.
En otra modalidad, el dominio Fc puede comprender una o más mutaciones diseñadas para afectar la función efectora del dominio Fc. Tales mutaciones se conocen bien por los expertos en la técnica. En el caso de IgG1 humana, el anticuerpo puede comprender un dominio Fc humano que se ha modificado para anular o afectar su función efectora. Tales mutaciones en el dominio Fc comprenden generalmente el cambio de al menos 1 aminoácido de la región constante de la cadena pesada en la posición 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 o 322, lo que provoca de esta manera una alteración en la función efectora mientras se retiene la unión al antígeno. Los ejemplos de mutaciones que afectan a los efectores en el dominio Fc de IgG humana incluyen Leu234Ala + Leu235Ala (denominada LALA); Leu234Ala Leu235Ala Pro329Gly (denominada LALA-PG); Ser228Pro Leu235Glu en IgG4; Pro331Ser Leu234Glu Leu235Phe; y Pro331Ser Leu234Ala Leu235Ala.
Los ejemplos de antagonistas que inhiben el factor del complemento C1 incluyen Cinryze (Shire), sutimlimab -también conocido como TNT009 y BIV009 (Bioverativ), TNT003 (True North), ANX005 (Annexon) y nafamostat (Torii Pharmaceutical).
Los ejemplos de antagonistas que inhiben el factor del complemento C3 incluyen compstatina Cp40 (Amyndas), PEG-Cp40 (Amyndas), AMY-101 (Amyndas), AMY-201 (Amyndas), APL-1 y APL-2 (Apellis), CDX-1135 (Celldex),<a>P<t>070 Mirococept (M<r>C), HC3-1496 (InCode), anticuerpo monoclonal humanizado H17 (Elusys Therapeutics) o proteína de control del complemento del virus de la vaccinia (VCP).
D. Anticuerpos anti-C2 y fragmentos de unión al antígeno
Los antagonistas del complemento para su uso en los métodos terapéuticos descritos en la presente descripción son aquellos que inhiben el factor del complemento C2. De acuerdo con las reivindicaciones, el antagonista del complemento para su uso en el tratamiento es un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este que se une a C2. Los ejemplos de anticuerpos anti-C2 y fragmentos de unión al antígeno incluyen los anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno identificados en la solicitud de patente internacional núm. WO2014/189378.
C2 es una glicoproteína de 90-100 kDa que participa en las vías clásicas y de la lectina de la activación del complemento. Como se describió anteriormente, C2 puede activarse por C1s de la vía clásica o por MASP2 activada de la vía de la lectina. C2 se une a C4b unido a la superficie (en presencia de Mg2+) para formar un complejo C4bC2, que después se escinde por C1s o MASP2 activados en dos fragmentos: un fragmento C2a de 70 kDa más grande, que permanece unido a C4b para formar una C3 convertasa C4bC2a, y un fragmento C2b N-terminal de 30 kDa más pequeño, que se libera en la fase fluida. Una vez activado y unido a C4b, C2a constituye la subunidad catalítica de las C3 y C5 convertasas que son capaces de escindir C3 y C5, respectivamente.
Se conoce la secuencia de aminoácidos de C2 humano (núm. de acceso de GenBank NM_000063) y se muestra como SEQ ID NO: 1 más abajo.
Secuencia de aminoácidos de C2 humana (SEQ ID NO: 1):
MGPLMVLFCLLFLYPGLADSAPSCPQNVNISGGTFTLSHGWAPGSLLTYSCPQGLYPSPASRLC
KSSGGWGTPGATRSLSKAVCKPVRCPAPVSFENGIYTPRLGSYPVGGNVSFECEDGFILRGSP
VRQCRPNGMWDGETAVCDNGAGHCPNPGISLGAVRTGFRFGHGDKVRYRCSSNLVLTGSSE
RECQGNGVWSGTEPICRQPYSYDFPEDVAPALGTSFSHMLGATNPTQKTKESLGRKIQIQRSG
HLNLYLLLDCSQSVSENDFLIFKESASLMVDRIFSFEINVSVAIITFASEPKVLMSVLNDNSRDMTE
VISSLENANYKDFIENGTGTNTYAALNSVYLMMNNQMRLLGMETMAWQEIRHAIILLTDGKSNMG
GSPKTAVDHIREILNINQKRNDYLDIYAIGVGKLDVDWRELNELGSKKDGERHAFILQDTKALHGV
FEHMLDVSKLTDTICGVGNMSANASDQERTPWHVTIKPKSGETCRGALISDGWVLTAAHCFRD
GNDHSLWRVNVGDPKSQWGKEFLIEKAVISPGFDVFAKKNQGILEFYGDDIALLKLAQKVKMST
HARPICLPCTMEAN LALRRPQGSTCRDHENELLNKQSVPAHFVALNGSKLNINLKMGVEWTSCA
EVVSGEKTMFPNLTDVREVVTDQFLCSGTQEDESPCKGESGGAVFLERRFRFFQVGLVSWGL
YMPCLGSADKNSRKRAPRSKVPPPRDFHINLFRMQPWLRGHLGDVLNFLPL
El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno para su uso de acuerdo con la invención se une a C2b y comprende las siguientes secuencias de CDR:
- H<c>DR3 que comprende o que consiste de la SEQ ID NO: 2 [EDDHDAFAY];
- HCDR2 que comprende o que consiste de la SEQ ID NO: 3 [DINPNYESTGYNQKFKG];
- HCDR1 que comprende o que consiste de la SEQ ID NO: 4 [DYNMD];
- LCDR3 que comprende o que consiste de la SEQ ID NO: 5 [QHSR<e>L<p>YT];
- LCDR2 que comprende o que consiste de la SEQ ID NO: 6 [LASNLKS]; y
- LCDR1 que comprende o que consiste de la SEQ ID NO: 7 [RASKSVRTSGYNYMH].
En ciertas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno se une a C2b y comprende un dominio variable de la cadena pesada (VH) que comprende o que consiste de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 y un dominio variable de la cadena ligera (VL) que comprende o que consiste de una secuencia al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90%o al menos 95%idéntica a la SEQ ID NO: 9. En ciertas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno que se une a C2b comprende un dominio variable de la cadena pesada (dominio VH) que comprende o que consiste de la SEQ ID NO: 8 y un dominio variable de la cadena ligera (dominio VL) que comprende o que consiste de la SEQ ID NO: 9.
De acuerdo con las reivindicaciones, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno se une a C2b y comprende un dominio variable de la cadena pesada (VH) y un dominio variable de la cadena ligera (VL), en donde el dominio VH comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 y el dominio VL comprende las secuencias de CDR:
LCDR3 que comprende o que consiste de la SEQ ID NO: 5 [QHSRELPYT];
LCDR2 que comprende o que consiste de la SEQ ID NO: 6 [LASNLKS]; y LCDR1 que comprende o que consiste [RASKSVRTSGYNYMH].
Para modalidades en donde los dominios de los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno se definen por un porcentaje particular de identidad de secuencia con una secuencia de referencia, los dominios VH y/o VL pueden retener secuencias de CDR idénticas a las presentes en la secuencia de referencia de manera que la variación está presente solo dentro de las regiones marco.
Tabla 4 Secuencias de dominios VH VL
En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-C2b incluyen el dominio CH1, dominio bisagra, dominio CH2 y/o dominio CH3 de un anticuerpo humano, en particular IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana. En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-C2b incluye el dominio CH1, dominio bisagra, dominio CH2 y dominio CH3 de una IgG1 humana e incluye las sustituciones L234A y L235A en el dominio CH2, en donde las posiciones se definen de acuerdo con la numeración EU. Alternativamente o además, el anticuerpo anti-C2b incluye el dominio CH1, dominio bisagra, dominio CH2 y dominio CH3 de una IgG1 humana e incluye las sustituciones H433K y N434F en el dominio CH3, en donde las posiciones se definen de acuerdo con la numeración EU. La numeración EU se refiere a la convención para la región Fc descrita en Edelman, G.M. y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 63: 78-85 (1969); y Kabat y otros, en "Sequences of Proteins of Immunological Interest", U.S. Dept. Health and Human Services, 5ta edición, 1991.
En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-C2b incluye el dominio CH1, dominio bisagra, dominio CH2 y dominio CH3 de una IgG4 humana. En ciertas modalidades, el anticuerpo incluye el dominio CH1, dominio bisagra, dominio CH2 y dominio CH3 de una IgG4 humana e incluye la sustitución S228P en el dominio bisagra.
En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-C2b incluye el dominio CH1, el dominio bisagra, el dominio CH2 y el dominio CH3 de una IgG4 humana e incluye la sustitución L445P en el dominio CH3.
En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-C2b incluye el dominio CH1, dominio bisagra, dominio CH2 y dominio CH3 de una IgG4 humana e incluye tanto la sustitución S228P en el dominio bisagra como la sustitución L445P en el dominio CH3.
En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-C2b incluye el dominio CH1, dominio bisagra, dominio CH2 y dominio CH3 de una IgG4 humana e incluye las sustituciones H433K y N434F en el dominio CH3.
En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-C2b incluye el dominio CH1, dominio bisagra, dominio CH2 y dominio CH3 de una IgG4 humana e incluye la sustitución S228P en el dominio bisagra, y las sustituciones H433K y N434F en el dominio CH3.
En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-C2b comprende un dominio constante de la cadena pesada de IgG humana. En ciertas modalidades, el dominio constante de la cadena pesada comprende un dominio constante de la cadena pesada de IgG1 humana. En ciertas modalidades, el dominio constante de la cadena pesada consiste en un dominio constante de la cadena pesada de IgG1 humana. En ciertas modalidades, el dominio constante de la cadena pesada comprende un dominio constante de la cadena pesada de IgG1 humana que comprende o que consiste de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 10 u 11.
En ciertas modalidades, el dominio constante de la cadena pesada comprende un dominio constante de la cadena pesada de IgG4 humana. En ciertas modalidades, el dominio constante de la cadena pesada consiste en un dominio constante de la cadena pesada de IgG4 humana. En ciertas modalidades, el dominio constante de la cadena pesada comprende un dominio constante de la cadena pesada de IgG4 humana que comprende o que consiste de la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 12, 13 o 14.
Los dominios constantes de la cadena pesada se muestran en la Tabla 5 más abajo.
En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-C2b comprende o consiste en una cadena ligera con al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 20, y una cadena pesada seleccionada de las siguientes: (i) una cadena pesada con al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 15;
(ii) una cadena pesada con al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 97 %, al menos 98%o al menos 99%de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 16;
(iii) una cadena pesada con al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 17;
(iv) una cadena pesada con al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 18; y
(v) una cadena pesada con al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 19.
En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-C2b comprende una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 y una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 15-19.
En una modalidad preferida, el anticuerpo anti-C2b comprende una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 y una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.
Las secuencias de cadenas pesadas y ligeras se muestran en la Tabla 6 más abajo.
T l n n li r
En una modalidad preferida, el anticuerpo anti-C2b es un anticuerpo IgG monoclonal.
Para modalidades en donde las cadenas pesadas y/o ligeras de los anticuerpos se definen por un porcentaje particular de identidad de secuencia con una secuencia de referencia, la cadena pesada y/o cadena ligera pueden retener secuencias de CDR idénticas a las presentes en la secuencia de referencia, de manera que la variación esté presente solo fuera de las regiones CDR.
A menos que se indique de cualquier otra manera en la presente solicitud, el % de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse mediante la comparación de estas dos secuencias alineadas de manera óptima y en la que la secuencia de aminoácidos a comparar puede comprender adiciones o deleciones con respecto a la secuencia de referencia para un alineamiento óptimo entre estas dos secuencias. El porcentaje de identidad se calcula al determinar el número de posiciones idénticas para las que el residuo de aminoácido es idéntico entre las dos secuencias, al dividir este número de posiciones idénticas por el número total de posiciones en la ventana de comparación, y al multiplicar el resultado obtenido por 100 para obtener el porcentaje de identidad entre estas dos secuencias. Por ejemplo, es posible usar el programa BLAST, "secuencias BLAST 2" (Tatusova y otros, "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250), los parámetros usados son aquellos dados por defecto (en particular para los parámetros "penalización de espacio abierto": 5, y "penalización de extensión de espacio": 2; la matriz elegida es, por ejemplo, la matriz "BLOSUM 62" propuesta por el programa), el porcentaje de identidad entre las dos secuencias a comparar se calcula directamente por el programa.
Los anticuerpos anti-C2 pueden modificarse dentro de la región Fc para aumentar la afinidad de unión por el receptor neonatal FcRn, preferentemente FcRn humano. La afinidad de unión aumentada puede ser medible a pH ácido (por ejemplo, de aproximadamente pH 5,5 a aproximadamente pH 6,0). La afinidad de unión aumentada también puede ser medible a pH neutro (por ejemplo, de aproximadamente pH 6,9 a aproximadamente pH 7,4). Por "afinidad de unión aumentada" se entiende la afinidad de unión aumentada a FcRn con relación a la afinidad de unión de la región Fc no modificada. Típicamente, la región Fc no modificada poseerá la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana. En tales modalidades, la afinidad de unión aumentada a FcRn de la molécula de anticuerpo que tiene la región Fc modificada se medirá con relación a la afinidad de unión de la IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 de tipo silvestre por FcRn, preferentemente FcRn humano.
E. Composiciones farmacéuticas
Los antagonistas, particularmente los anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno, para su uso en los métodos terapéuticos descritos en la presente descripción, pueden formularse como composiciones farmacéuticas para su administración al sujeto.
Las composiciones farmacéuticas pueden formularse con portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables, así como también cualquier otro adyuvante y excipiente conocido de acuerdo con técnicas convencionales tales como las descritas en (Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a edición, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1995). El término "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a portadores o excipientes que son inherentemente no tóxicos. Los ejemplos de tales excipientes son, pero no se limitan a, solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa y solución de Hanks. También pueden usarse excipientes no acuosos tales como aceites no volátiles y oleato de etilo.
Típicamente, las composiciones farmacéuticas deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede formularse como una solución, microemulsión, liposoma, u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentración del fármaco. Los ejemplos de portadores acuosos y no acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, y similares), y mezclas adecuadas de estos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, por el uso de materiales de recubrimiento, tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones, y por el uso de surfactantes.
Las composiciones farmacéuticas pueden contener además adyuvantes tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la presencia de microorganismos puede garantizarse tanto mediante procedimientos de esterilización como mediante la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. También puede ser conveniente incluir en las composiciones agentes de isotonicidad, tales como azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, glicerol o cloruro de sodio. También pueden incluirse antioxidantes farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, (1) antioxidantes solubles en agua, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares; (2) antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol y similares; y (3) agentes quelantes de metales, tales como ácido cítrico, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, y similares.
Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse a través de cualquier modo de administración adecuado. Por ejemplo, la administración puede ser parenteral, preferentemente por inyección o infusión intravenosa (i.v.) o subcutánea (s.c.). Las frases "administración parenteral" y "administrado por vía parenteral" como se usan en la presente descripción, significan modos de administración distintos de la administración enteral y tópica, habitualmente por inyección, e incluyen, sin limitación, inyección e infusión intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradérmica, transtraqueal, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal.
EJEMPLOS
La invención se entenderá adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplo 1 Inhibición del complemento en un modeloin vitrode neuropatía motora multifocal (MMN) mediante el uso de células de Schwann vivas
Las células de Schwann son células gliales que secretan mielina que envuelven en espiral un axón del sistema nervioso periférico para formar la envoltura de mielina. Estas células se unen a los axones mediante la proteína GM1. Su función más importante es la mielinización de los axones para aumentar la conducción saltatoria de las neuronas, pero también ayudan en la supervivencia y la señalización neuronal. La disfunción de estas células provoca desmielinización, lo que conduce a una disminución de la transducción de señales. Como tal, las células de Schwann se asocian con varios trastornos desmielinizantes como la MMN. Existe una línea celular de Schwann humana - sNF02.2 - y se derivó de una metástasis pulmonar, diagnosticada como tumor maligno de la envoltura nerviosa periférica, en un paciente. Las células se establecieron a partir de numerosos pases de material tumoral primario en cultivo hasta que formaron una población homogénea similar a células de Schwann, que muestra una morfología clonal positiva para los marcadores de células de Schwann S100 y p75. Esta línea celular adquirida de ATCC® se usó en los experimentos descritos en la presente descripción.
A. Métodos
1.1 Protocolo para cultivar células de Schwann
Las células de Schwann sNF02.2 (ATCC® CRL-2885™) o sNF96.2 (ATCC© CRL-2884) se cultivaron en medio DMEM completado con 100 U/ml de penicilina, 100 |jg/ml de estreptomicina y suplementado con FCS al 10 % a 37 °C a 5 % de CO2. Dos veces a la semana, cuando la confluencia alcanzó >80 %, las células se pasaron o se usaron en experimentos. Se desechó el medio y las células se lavaron con 10 ml de PBS. Para disociar las células, se añadieron 3 ml (T75) o 5 ml (T175) de solución de desprendimiento celular Accutase (eBioscience™, Thermo Fischer Scientific; Cat. Núm. 00-455-56), y las células se incubaron a 37 °C durante 5 min, o hasta que las células se desprendieron completamente. Después, se añadió medio de cultivo (7 ml a T75 y 10 ml a T175) y las células se transfirieron a tubos de 15 ml antes de la centrifugación (125 xg,10 min). Los gránulos se resuspendieron en 5 ml de medio de cultivo y se contaron mediante el uso de azul de tripán para discriminar las células viables de las células muertas. A continuación, las células se ajustaron a la concentración deseada y se sembraron en matraces de cultivo (10 ml en T75, 20 ml en T175) o se usaron en experimentos de FACS.
1.2 Protocolo para teñir células de Schwann
Las células se cultivaron como se describió anteriormente y después de contarlas, se transfirieron 50 000 células a una placa de fondo en V. Las células se lavaron una vez en tampón FACS (PBS al 1 % BSA al 0,01 % azida de sodio) y se tiñeron con anticuerpos respectivos diluidos en tampón FACS durante 45 min en hielo en la oscuridad (ver Tabla 7 para anticuerpos para tinción FACs). Si fue necesario, las células se lavaron una vez mediante la adición de 100 j l de tampón FACS seguido de centrifugación de 5 min a 125 x g. A continuación, las células se incubaron con un anticuerpo secundario durante 45 min en hielo en la oscuridad. Después de la incubación, se añadieron 100 j l de tampón FACS y las células se centrifugaron (5 min a 125 x g). Finalmente, el gránulo celular se resuspendió en 100 j l de tampón FACS y se analizó mediante el uso de un FACS Canto II y el software acompañante.
T l 7 An i r r in i n FA
1.3 Ensayo de activación del complemento en células de Schwann vivas
Cuando se evaluó la activación del complemento, se transfirieron 50000 células a placas de fondo en V de 96 pocillos antes de la opsonización con 20 j l del agente opsonizante respectivo diluido en VB++ (1 h, TA). A continuación, se añadieron 100 j l de VB++ y las muestras se centrifugaron (5 min a 125 x g). A continuación, se desechó el sobrenadante y las células se incubaron durante 1 h, 37 °C con 100 pl de suero con actividad del complemento (preincubado con EDTA, MgEDTA o AcM, 15 min, TA). A continuación, las células se centrifugaron durante 5 min a 125 xgy se desechó el sobrenadante. Subsecuentemente, se realizó la tinción para la activación del complemento de acuerdo con el protocolo de tinción descrito anteriormente.
1.4 Ensayo de secreción de citocinas
Las células sNF02.2 se cultivaron como se describió anteriormente. Después del tratamiento con Accutase y el recuento, las células se transfirieron a una placa de 24 pocillos a una densidad de 10000 células/pocillo en 1 ml de medio de cultivo de sNF02.2. Después de 2 días, se desechó el medio de cultivo y las células se opsonizaron con 100 pl de suero de pacientes con MMN inactivado por calor a una dilución de 1:50 en VB++ durante 1 h a TA. A continuación, se añadieron 100 pl de suero con actividad del complemento al 15 % (preincubado con MgEGTA o anticuerpos durante 15 min a TA) a las células opsonizadas, seguido de una incubación de 1 h a 37 °C. Subsecuentemente, se añadieron 300 pl de medio de cultivo a las células lo que dio como resultado un volumen final de 500 pl/pocillo. Después de 24 h y 48 h, se recogieron 200 pl de sobrenadante para el análisis interno por la Multiplex Core Facility del University Medical Centre en Utrecht (MC Utrecht).
B. Resultados
1.5 Expresión de receptores del complemento por células de Schwann vivas
Para investigar la biología de la MMN mediante el uso de células de Schwann, se evaluó la expresión de reguladores del complemento. Por lo tanto, se cultivaron células de Schwann sNF02.2 y se realizó tinción FACS para detectar marcadores de expresión. Los resultados se muestran en la Figura 2 y se resumen en la Tabla 8 más abajo.
Tabla 8: Expresión de r ín r l r l^ m l m n n l l s de Schwann sNF02.2
Estos resultados revelan que las proteínas reguladoras del complemento (CD46, CD55 y CD59) se expresan en células de Schwann, con una alta expresión del regulador clave de la vía terminal CD59. La alta expresión de CD59 en células de Schwann sugiere que la lisis mediada por complemento está limitada en estas células debido a que se inhibe la formación del m Ac . En cambio, se induce inflamación en el compartimiento nervioso a través de la señalización celular. Además, las células de Schwann mostraron expresión del receptor 1 de F<cy>(CD64) responsable del aclaramiento fagocítico. No se observó detección de CR1 (CD35) ya que la expresión de CR1 en las células de Schwann se produce con el inicio de la mielinización, y estas células de Schwann sNF02.2 cultivadas carecen de mielina (Terenghi F y otros, Neurology, 2004, 62: 666-668). C3aR mostró solo una expresión baja y C5aR estaba ausente. Para concluir, las células de Schwann expresan altamente CD59, lo que sugiere la formación sublítica del MAC que desencadena la inflamación dentro del compartimiento nervioso.
Para investigar la sensibilidad de las proteínas reguladoras del complemento (CRP) en células de Schwann a la lisis mediada por el complemento, las células sNF02.2 se trataron con diferentes concentraciones de fosfolipasa-C (PL-C), que escinde proteínas ancladas a glicosilfosfatidilinositol, que incluyen CD59 (Fitzpatrick A, Mann C y otros, J Peripher Nerv Syst, 2011, 16(2): 84-91). Los resultados se muestran en la Figura 3 y demuestran que tanto CD55 como CD59 son sensibles a la lisis mediada por el complemento, ya que los niveles de expresión de ambas CRP se disminuyeron tras el tratamiento con PL-C.
1.6 Resistencia de las células de Schwann a la lisis celular mediada por el complemento
Experimentos anteriores han demostrado una alta expresión de CD59 y CD55 en células de Schwann (sNF92.2 y sNF02.2). Para investigar las implicaciones funcionales de esta expresión, se evaluó la fijación de C3 y MAC mediada por anti-GM1 en células de Schwann sNF96.2 con o sin CD59 y CD55. Además, se investigó el efecto de la activación del complemento sobre la viabilidad celular. Con este fin, se cultivaron células de Schwann y se transfirieron a una placa de fondo en V para un análisis experimental adicional. El tratamiento con fosfolipasa C (PL-C) se usa comúnmente para eliminar las proteínas unidas a GPI, tales como CD59 y CD55, de la superficie celular. De hecho, el tratamiento con PL-C dio como resultado la eliminación de CD59 y CD55 mientras que la expresión superficial de CD46 y GM1 permaneció sin afectación (Figura 4A). Para evaluar los efectos del tratamiento con PL-C sobre la sensibilidad a la fijación de C3 y MAC, las células de Schwann se opsonizaron con suero de pacientes con MMN (1 hora, TA) que contenía anticuerpos anti-GM1, o tampón veronal (VB) como control. A continuación, las células se incubaron con suero con actividad del complemento al 5 % o suero con actividad del complemento al 5 % preincubado con 480 pg/ml de ARGX-117 durante 1 hora a 37 °C. Finalmente, se detectaron la fijación de C3 y MAC mediante el uso de anticuerpos marcados con biotina contra C3 y MAC, respectivamente, y se tiñeron con estreptavidina conjugada con APC. Los resultados se representan en la Figura 4A y revelan que la fijación de C3 se aumentó ligeramente después de la opsonización con suero con MMN-05 en comparación con la opsonización con VB solo en células de Schwann no tratadas con PL-C. Sin embargo, ARGX-117 inhibió completamente la fijación de C3 en ambas condiciones. La activación del complemento mediada por la vía clásica en el control de VB se debe presumiblemente a los anticuerpos presentes en el suero con actividad del complemento (por ejemplo, anticuerpos anti-HLA). Tras el tratamiento con PL-C, se observó un aumento de la fijación de C3 y ARGX-117 inhibió la fijación de C3 inducida por suero con MMN-005 en células tratadas con PL-C, aunque no completamente (Figura 4B). En esta condición se espera una alta densidad de opsonización y se alcanza mediante anticuerpos IgM dirigidos contra GM1 y anticuerpos IgM/IgG contra objetivos que no son GM1 que regulan una fuerte activación del complemento debido a la falta de mCRP. Se encontraron observaciones similares para la fijación de MAC, donde las células no tratadas mostraron bajos niveles de fijación de MAC que también aumentaron ligeramente después de la opsonización con suero MMN-005. El tratamiento con PL-C condujo a un aumento de la fijación de MAC después de la opsonización con suero MMN-005, que se inhibió por ARGX-117 (Figura 4C). Finalmente, para evaluar la inducción de la citotoxicidad mediada por el complemento (CDC), la viabilidad se midió mediante tinción con 7AAD combinada con anexina-V, y las células doblemente positivas se consideraron apoptóticas tardías/muertas. No se detectó CDC mediante el uso de células que expresan niveles normales de proteínas reguladoras del complemento incluso después de la opsonización con suero con MMN-005. Sin embargo, el tratamiento con PL-C aumentó la apoptosis en células opsonizadas con MMN-05 y la adición de ARGX-117 dio como resultado una protección total contra la lisis celular mediada por el complemento (Figura 4D). Para concluir, las células de Schwann están intrínsecamente protegidas contra la lisis mediada por el complemento debido a los altos niveles de expresión de CD59 y CD55. En ausencia de las mCRP, se detectó CDC que pudo (parcialmente) prevenirse mediante ARGX-117.
1.7 Detección de la activación del complemento mediante el uso de células de Schwann
Para investigar la activación del complemento en células de Schwann vivas, las células se transfirieron a una placa de fondo en v de 96 pocillos (50000 células/pocillo) y se opsonizaron con un anticuerpo anti-HLA (W6/32 - BioLegend; Cat Núm. 311402) durante 30 min a TA. A continuación, se añadió suero con actividad del complemento (preincubado con EDTA, MgEGTA o TNT009, 15 min, TA) a las células a una concentración final de suero al 5 %. Después de 1 h de incubación (37 °C), las células se transfirieron a placas de fondo en V de 96 pocillos y se midió la fijación de C3 después de la tinción (45 min, hielo). Los resultados se muestran en la Figura 5.
Estos resultados demuestran la fijación de C3 después de la activación del complemento con HPS (suero humano agrupado) al 5 %. Además, la fijación de C3 fue específica para el complemento porque la fijación de C3 disminuyó a niveles basales tras la adición de EDTA (10 mM) o TNT009 (480 mg/ml). Además, también se bloqueó C3 en presencia de MgEDTA, lo que descarta que se produjera principalmente a través de la vía alternativa del complemento. Notablemente, la fijación de C3 fue independiente de la opsonización con W6/32.
1.8 Unión de autoanticuerpos derivados de pacientes con MMN a células de Schwann cultivadas
Antes de determinar la patogenia de los anticuerpos IgM anti-GM1, se investigó la unión de estos anticuerpos a las células de Schwann humanasin vitro.Con este fin, se cultivaron células de Schwann sNF02.2 y se transfirieron a placas de fondo redondo de 96 pocillos (50000 células/pocillo) en 50 pl de medio de cultivo de sNF02.2. A continuación, las células se tiñeron con toxina B del cólera - AF488 para detectar la expresión de GM1. Los resultados representados en la Figura 6A muestran que las células de Schwann sNF0.2.2 humanas cultivadasin vitroexpresan GM1. Además, la incubación con suero de pacientes con MMN (que contiene autoanticuerpos contra GM1) dio como resultado una mayor expresión de anti-GM1 y, más importante, se detectó la unión de IgM a células de Schwann después de la opsonización con suero de pacientes con MMN (Figura 6B). Se investigaron diferentes sueros de pacientes con MMN con un amplio intervalo de títulos de anticuerpos IgM anti-GM1 y todos demostraron la unión de IgM a las células de Schwann. Además, se detectó un efecto de titulación de la unión de IgM en células de Schwann para todos los sueros de pacientes investigados (Figura 7).
A continuación, se evaluó el potencial de activación del complemento de los anticuerpos IgM anti-GM1 del paciente en las células de Schwann. Con este fin, células de Schwann sNF02.2 humanas se transfirieron a una placa de fondo en v de 96 pocillos (50000 células/pocillo) y se opsonizaron con sueros de pacientes con MMN (1 h, TA). A continuación, se añadió suero con actividad del complemento (1 h, 37 °C) antes de la detección de C3 mediante el uso de un anticuerpo conjugado con FITC.
Al principio, solo se observó una fijación limitada de C3 debido a la detección inadecuada de C3 con el anticuerpo usado. Por lo tanto, se usaron diferentes enfoques para aumentar la detección de C3 y para disminuir la activación del complemento de fondo. Primero, se probaron diferentes porcentajes de sueros con actividad del complemento (10 %, 5 % y 2,5 %) y se preincubaron con 200 pg/ml de AcM anti-C5 (1 h, 37 °C) para evitar la activación de la vía terminal del complemento y, por lo tanto, para evitar la lisis de las células de Schwann sNF02.2. Para reducir el fondo del complemento, también se probó una condición con suero aclarado (= suero con actividad del complemento incubado en células de Schwann durante 4x 10 min a 4 °C para eliminar los anticuerpos dentro del suero).
Los resultados representados en las Figuras 8A y 8B no muestran diferencias entre el suero con actividad del complemento (barras traseras) frente al suero aclarado (barras grises), lo que sugiere que los anticuerpos aún presentes en el suero no contribuyeron a la activación del complemento y, por lo tanto, a la fijación de C3. Se usó EDTA (barras blancas) como control. Sin embargo, el uso de suero con actividad del complemento al 5 % pareció óptimo ya que la ventana entre la ausencia de opsonización y la opsonización fue mayor. En segundo lugar, se probaron diferentes anticuerpos anti-C3 para aumentar la ventana de detección. Los resultados se presentan en la Figura 8C y mostraron una mejora de una de ventana de 10 % a 25 % mediante el uso de un anti-C3 biotinilado (LSBio, clon 6C9) para detectar la fijación de C3 en células de Schwann.
Por lo tanto, se observó una detección óptima de la fijación de C3 en células de Schwann cuando se usó suero con actividad del complemento a una concentración final del 5 % y con un anticuerpo de detección anti-C3 biotinilado de LSBio (clon 6C9). Para concluir, se detecta la fijación de C3 en las células de Schwann después de la opsonización con suero de pacientes con MMN. Esto indicó que los anticuerpos IgM anti-GM1 presentes en el suero de pacientes con MMN pueden activar la vía clásica del complemento.
1.9 Dependencia de C2
Se evaluó la dependencia de C2 para verificar la importancia del factor del complemento C2 en la patogenia de la MMN. Las células de Schwann sNF02.2 se opsonizaron con suero de pacientes con MMN y se sometieron a suero con agotamiento de C2 (Complement Technology; Cat Núm. A312) reconstituido con concentraciones crecientes de C2 humano recombinante, rhC2, (U-protein express; Cat Núm.: C001, 1987) para evaluar la fijación de C3. Los resultados se muestran en la Figura 9 y revelaron que el suero con agotamiento de C2 solo dio como resultado valores de intensidad de fluorescencia media (MFI) relativamente altos: la señal de MFI fue mayor en comparación con el control de EDTA, lo que dio como resultado una ventana experimental pequeña. Independientemente de eso, el suero reconstituido con 30 pg/ml de rhC2 restauró la fijación de C3 en células de Schwann de nuevo a niveles normales. Además, la fijación de C3 se restauró alrededor de 5 -10 pg/ml de rhC2, lo que correspondió a 20 - 40 % de los niveles fisiológicos de C2. Estos resultados indican que los niveles bajos de C2 no conducen a la fijación de C3 o a la activación del complemento.
1.10 Eficacia de ARGX-117 en la inhibición de la fijación de C3 en células de Schwann sNF02.2
Se han generado diversos anticuerpos monoclonales inhibitorios contra factores del complemento y algunos de ellos están aprobados para aplicaciones clínicas. Por ejemplo, TNT009 (BIVV009) es un anticuerpo humanizado anti-C1s que bloquea específicamente la vía clásica del complemento (Jager U, D'Sa y otros, Blood, 2019, 133(9): 893-901), mientras que OMS646 se dirige a MASP-2, lo que bloquea de esta manera la vía de la lectina. El eculizumab inhibe C5 y, por lo tanto, bloquea el depósito de MAC inducido por las tres vías (Brodsky R, Young N y otros, Blood, 2018, 111: 1840-1847).
ARGX-117 es un anticuerpo monoclonal dirigido a C2 y es único porque inhibe la vía clásica y de la lectina al tiempo que deja intacta la vía alternativa. Los resultados anteriores demuestran que los autoanticuerpos IgM anti-GM1 en suero de pacientes con MMN pueden unirse específicamente a las células de Schwann sNF02.2. Además, los autoanticuerpos son capaces de activar la cascada del complemento, lo que da como resultado la fijación de C3 en células de Schwann. Se estudió el efecto de ARGX-117 sobre la fijación de C3 mediada por sueros con MMN para evaluar el potencial terapéutico de este anticuerpo. Con este fin, las células de Schwann se cultivaron y se transfirieron a una placa de fondo en V (50000 células/pocillo), se opsonizaron con suero de pacientes con MMN (1 h, TA) y subsecuentemente se incubaron con suero con actividad del complemento al 5 % que se preincubó con anticuerpos bloqueadores del complemento o EDTA (20 min, TA). La detección de la fijación de C3 se realizó mediante la tinción de las células de Schwann con C3-BIO (LSBio, clon 6C9) y estreptavidina-APC. Los resultados se muestran en la Figura 10.
Los resultados revelaron que la fijación de C3 se inhibió de una manera dependiente de la dosis tanto por ARGX-117 como por TNT009. Sin embargo, la inhibición de ambos anticuerpos no alcanzó el control de EDT<a>. TNT009 pudo bloquear la fijación de C3 hasta 53 pg/ml, mientras que se necesitaron concentraciones más altas de ARGX-117 para bloquear en la misma medida (160 pg/ml). Es importante señalar que no se añadió anti-C5 a las células, lo que anteriormente se hizo para bloquear la vía terminal del complemento para poder detectar la fijación de C3. Sorprendentemente, las células no se lisaron, lo que significa que están intrínsecamente protegidas contra la lisis mediada por el complemento, probablemente debido a la alta expresión de CD59 en las células de Schwann. Para concluir, ARGX-117 es capaz de bloquear la fijación de C3 en células de Schwann de una manera dependiente de la dosis y estas células están intrínsecamente protegidas contra la lisis mediada por el complemento.
1.11 Ensayo de secreción de citocinas
Para desentrañar la fisiopatología del origen del daño nervioso en pacientes con MMN, se midió la producción de citocinas mediada por el complemento. Las células de Schwann se sembraron en placas de 24 pocillos (10 000 células/pocillo), se opsonizaron con suero de pacientes con MMN (1 h, TA) y se añadió suero con actividad del complemento en presencia o ausencia de anticuerpos bloqueadores del complemento. Después de 48 h, se recogió el sobrenadante y se midió la secreción de citocinas mediante el uso de la plataforma Luminex. Los resultados se muestran en la Figura 11 y demuestran que la estimulación de las células de Schwann con IL1-p o TNF-a da como resultado un aumento de la secreción de IL-6, IL-8 y MCP-1. En los sueros de pacientes con MMN no se observó la elevación de IL-6 o IL-8. Sin embargo, los niveles de MCP-1 en células incubadas con sueros de pacientes con MMN aumentaron 2 veces con relación a los controles (Figura 11C). Este aumento pudo bloquearse tras la adición de ARGX-117 o TNT009, mientras que el eculizumab solo pudo bloquear parcialmente la secreción de MCP-1.
MCP-1 desempeña un papel en el reclutamiento de células inmunitarias inflamatorias, monocitos y macrófagos al sitio de infección y también está involucrado en la patogenia de varias enfermedades, que incluyen los procesos neuroinflamatorios que se caracterizan por degeneración neurológica. Por ejemplo, los niveles circulantes de MCP-1 se aumentan tras la progresión de GBS (Orlikowski y otros, J of neuroimmunol, 2003, 134 (118-27))). Para concluir, las células de Schwann sNF02.2 producen MCP-1 después de la opsonización con sueros de pacientes con MMN y la subsecuente activación del complemento. ARGX-117 fue capaz de bloquear la producción de MCP-1.
C. Conclusión
La regulación del sistema del complemento se evaluó mediante el uso de células de Schwann sNF02.2. Los datos demuestran que las células de Schwann expresan altos niveles de las proteínas reguladoras del complemento CD46, CD55 y CD59. Además, se demostró que los anticuerpos IgM anti-GM1 de pacientes con MMN activan la vía clásica del complemento y que la fijación de C3 era dependiente de la presencia de C2 en el sistema modelo de MMN estudiado. ARGX-117 bloqueó eficientemente la activación del complemento en células sNF02.2 sensibilizadas con anticuerpos anti-GM1.
Estos resultados sugieren un nuevo mecanismo mediante el cual los eventos del complemento desencadenados por autoanticuerpos anti-GM1 contribuyen a la patología en pacientes con MMN. Esto se representa esquemáticamente en la Figura 12. Los autoanticuerpos IgM anti-GM1 activan la vía clásica del complemento, pero debido a la alta expresión de CD59 en las células de Schwann, no se forma MAC lítico. Por lo tanto, la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) directa es un mecanismo que es poco probable que contribuya al daño neurológico en esta afección. Sin embargo, se ha descrito que la formación de complejos MAC sublíticos provoca la activación celular, lo que puede inducir a la producción y secreción de mediadores inflamatorios. En el presente estudio, se observó la producción dependiente del complemento de la quimiocina MCP-1 por las células sNF02.2. El eculizumab, anti-C5, no pudo inhibir la secreción de MCP-1 en uno de dos sueros con MMN probados, lo que sugiere que la secreción de MCP-1 por las células sNF02.2 se desencadena por mecanismos aguas arriba de la formación de MAC sublítico.
Es probable que la activación del complemento por anticuerpos anti-GM1 induce la liberación de citocinas y/o quimiocinas a través de C3aR, que se descubrió que se expresa en estas células. Estas quimiocinas, tales como MCP-1, pueden desempeñar un papel en la atracción de células inflamatorias que conduce a una posterior disfunción y daño neuronal. Aquí, la activación del complemento por anticuerpos anti-GM1 en células de Schwann condujo a la secreción de MCP-1 que fue inhibida por ARGX-117, lo que sugiere un posible mecanismo terapéutico de este anticuerpo. Para concluir, la fisiopatología de la destrucción del nervio y la desmielinización en pacientes con MMN parece tener lugar aguas arriba de la formación del MAC, lo que hace que los componentes de la cascada del complemento aguas arriba del MAC sean objetivos terapéuticos más interesantes para tratar esta enfermedad. ARGX-117 se dirige a la proteína del complemento C2 y por lo tanto es un ejemplo de una molécula adecuada para tratar esta indicación.
Ejemplo 2 Inhibición del complemento en un modeloin vitrode neuropatía motora multifocal (MMN) mediante el uso de células de Schwann fijadas
A. Métodos
2.1 Protocolo para cultivar y fijar células de Schwann en cubreobjetos
Las células de Schwann se cultivaron en medio DMEM completado con 100 U/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina y suplementado con FCS al 10 % a 37 °C a 5 % de CO2. Dos veces a la semana, cuando la confluencia alcanzó >80 %, las células se pasaron o se usaron en experimentos. Se desechó el medio y las células se lavaron con 10 ml de PBS. Para disociar las células, se añadieron 3 ml (T75) o 5 ml (T175) de solución de desprendimiento celular Accutase, y las células se incubaron a 37 °C durante 5 min, o hasta que las células se desprendieron completamente. Después, se añadió medio de cultivo (7 ml a T75 y 10 ml a T175) y las células se transfirieron a tubos de 15 ml antes de la centrifugación (125 x g, 10 min). Los gránulos se resuspendieron en 5 ml de medio de cultivo y se contaron mediante el uso de azul de tripán para discriminar las células viables de las células muertas. A continuación, las células se ajustaron a la concentración deseada y se sembraron en matraces de cultivo (10 ml en T75, 20 ml en T175) o se sembraron en cubreobjetos que se colocaron en placas de 24 pocillos.
2.2 Protocolo para la evaluaciónin vitrode ARGX-117
Las células de Schwann sNF02.2 se cultivaron durante 3 días en cubreobjetos a 37 °C, 5 % de CO2. Las células se fijaron mediante el uso de PFA al 4 % (10 min a 4 °C), se lavaron una vez con 500 pl de PBS y se retiraron los cubreobjetos de placas de 24 pocillos. Para minimizar la tinción no específica, las células se inactivaron mediante el uso de 100 pl de NH4Cl durante 5 min a TA, se lavaron una vez con 100 pl de PBS seguido de bloqueo con 100 pl de p Bs BSA al 2 % durante 2 h a TA. Después de lavar con 100 pl de PBS, las células se incubaron de arriba hacia abajo con sueros de pacientes con MMN inactivados por calor, diluidos 1:50 en PBS+BSA al 2 %, durante 60 min. A continuación, las células se lavaron una vez (500 pl de PBS+BSA al 2 %), se incubaron con suero con actividad del complemento al 15 % (-/+ preincubación con anticuerpos bloqueadores del complemento) durante 30 min a TA y se lavaron una vez (100 pl de PBS+BSA al 2 %). Subsecuentemente, las células se tiñeron con 100 pl de anticuerpos primarios (diluidos en PBS+BSA al 2 %) y se incubaron de arriba hacia abajo (1 h, TA, oscuridad) antes de lavar con 100 pl de PBS+BSA al 2 %. A continuación, las células se incubaron de arriba hacia abajo con 100 pl de estreptavidina-APC (1:100 diluido en PBS+BSA al 2 %) durante 1 h a TA en la oscuridad seguido de un lavado una vez con 100 pl de PBS y una vez con 100 pl de agua MilliQ. Después de secar los cubreobjetos en un papel tisú, se pipetearon 7 pl de montante antidecoloración ProLong™ Diamond con DAPI sobre los cubreobjetos, se secaron durante la noche a 4 °C, antes de fijar con esmalte de uñas. Las células se analizaron mediante el uso de un microscopio Zeiss Z1 con LEDs Colibri con las siguientes configuraciones: aumento 40x, 25 % de LED, 400 ms para canal Alexa Fluor™ 488, 100 ms para canal APC y 50 ms para canal DAPI. Los anticuerpos usados para la tinción se muestran en la Tabla 9 más abajo.
Tabla 9 Anticuer os ara la tinción
(1) Reacciona tanto con C3a como con C3b humano.
(2) El anti-C5b-9 clon aE11 se dirige contra un neoepítopo expuesto en C9 cuando se incorpora al TCC.
B. Resultados
Para los experimentos realizados mediante el uso de células de Schwann fijadas, se observaron resultados muy similares a los informados anteriormente en el Ejemplo 1 mediante el uso de células de Schwann vivas.
2.3 Expresión de receptores del complemento
Se cultivaron células de Schwann sNF02.2 y se fijaron en cubreobjetos antes de teñir para detectar marcadores de expresión. Los resultados se muestran en la Tabla 10 más abajo y revelan que todas las proteínas reguladoras del complemento se expresan en las células de Schwann. CD59 se expresa altamente, lo que sugiere que las neuronas motoras están protegidas contra la lisis mediada por MAC porque CD59 es el regulador clave de la vía terminal. CD46, CD55 y C3aR mostraron una expresión moderada en las células de Schwann, mientras que C5aR se expresó altamente en el cuerpo celular de las células de Schwann. CD35, CD11b y CD11c estaban todos ausentes en las células de Schwann.
Tabla 10 Expresió e Schwann fijadas
2.4 Unión de autoanticuerpos derivados de pacientes con MMN a células de Schwann fijadas
Se estudió la unión de autoanticuerpos derivados de pacientes con MMN a células de Schwann fijadas y se observaron resultados similares a los informados en el Ejemplo 1.8 anterior.
Se cultivaron células de Schwann sNF02.2 en cubreobjetos (50000 células/cubreobjetos) en 1 ml de medio de cultivo de sNF02.2 durante 3 días seguido de fijación con PFA al 4 %. A continuación, los cubreobjetos se lavaron en PBS y se inactivaron con NH4Cl4 (5 min, TA) antes de 2 horas de bloqueo con PBS-BSA al 2 %. Se realizó tinción con toxina B del cólera - Alexa488 para detectar la expresión de GM1. Los resultados mostraron que las células de Schwann humanas sNF0.2.2 cultivadasin vitroexpresan GM1 así como también células N2a de ratón derivadas de neuroblastoma.
La incubación con suero de pacientes con MMN dio como resultado una tinción anti-GM1 significativa colocalizada con tinción de IgM. Se investigaron diferentes sueros de pacientes con MMN con un amplio intervalo de títulos de anticuerpos IgM anti-GM1 y todos demostraron la unión de IgM a las células de Schwann. Además, la unión de anticuerpos IgM a las células de Schwann humanas fue específica para GM-1 porque la incubación con cantidades excesivas de toxina del cólera soluble no marcada interfirió con la unión de anticuerpos IgM de sueros con MMN. La preincubación con 100 pg/ml de toxina del cólera no marcada previno eficientemente la unión de anticuerpos anti-GM1 a las células de Schwann debido a la competencia de unión entre la toxina del cólera y los anticuerpos anti-GM1 a gangliósidos GM1.
Se evaluó el potencial de activación del complemento de los anticuerpos IgM anti-GM1 de pacientes en las células de Schwann. Con este fin, las células de Schwann humanas se incubaron con suero inactivado por calor de pacientes con MMN (que contenía anticuerpos IgM anti-GM1 autorreactivos) y HPS (suero humano agrupado) que funcionó como fuente del complemento externa. El depósito de factores de complemento, tales como la formación de C4 y C3 se determinó mediante el uso de anticuerpos específicos. Los resultados mostraron que pudo detectarse la fijación de C4 en células de Schwann, que se correlacionó con los títulos de anti-GM1. Sin embargo, un título alto de IgM anti-GM1 no siempre se asoció con un depósito alto de C4.
Se evaluó la detección de C3 y los cubreobjetos se tiñeron con diferentes anticuerpos anti-C3. Subsecuentemente, las células de Schwann opsonizadas con diferentes sueros de pacientes con MMN mostraron fijación de C3 en estas células. Sin embargo, los altos títulos de GM1 anti-IgM no siempre se correlacionaron con un elevado depósito de C3. Todos los controles de EDTA fueron negativos.
La Tabla 11 más abajo resume los diferentes niveles de expresión de factores del complemento de diferentes muestras de pacientes con MMN.
Ta ^ MN
*Determinado en base a ELISA de GM1.
Para concluir, se detectó fijación de C4 y C3 en células de Schwann fijadas después de la opsonización con suero de pacientes con m Mn . Esto indica que los anticuerpos IgM anti-GM1 de pacientes con MMN pueden activar la vía clásica del complemento.
2.5 Dependencia de C2
Se evaluó la dependencia de C2 para verificar la importancia del factor del complemento C2 en la patogenia de la MMN. Por lo tanto, las células de Schwann se opsonizaron con suero con agotamiento de C2 y se reconstituyeron con concentraciones crecientes de C2 humano (hC2) purificado para evaluar la formación de C3. Los resultados no revelaron fijación de C3 con suero con agotamiento de C2. Sin embargo, la adición de C2 restauró la fijación de C3 de una manera dependiente de la concentración. Curiosamente, no fue necesario un bloqueo completo de C2 para bloquear la fijación de C3; 4,58 pg/ml de hC2 (aproximadamente 20 % de los niveles fisiológicos) apenas mostraron formación de C3.
En resumen, la fijación de C3 fue dependiente de la presencia de C2. No fue necesaria la inhibición completa de C2 para bloquear la vía clásica del complemento y prevenir, de esta manera, la formación de C3 en las células de Schwann.
2.6 Eficacia de ARGX-117 en células de Schwann fijadas
Se cultivaron células de Schwann durante 3 días en cubreobjetos antes de la fijación. Subsecuentemente, las células se lavaron, se inactivaron y se bloquearon seguido de la opsonización con suero de pacientes. Después, las células se incubaron con suero con actividad del complemento en presencia o ausencia de diferentes anticuerpos bloqueadores del complemento o IVIg durante 20 minutos a TA. Finalmente, las células se tiñeron y se obtuvieron imágenes mediante el uso de un aumento de 40x.
La fijación de C4 en las células de Schwann se inhibió con TNT009 (200 pg/ml) así como también con tratamiento con IVIg 12,5 mg/ml.
Se observó la inhibición de C3 con ARGX-117 y TNT009, ambos usados a 200 pg/ml, mientras que no se observó ningún efecto con eculizumab u OMS646 como se anticipó. La IVIg a una concentración de 12,5 mg/ml solo mostró una inhibición parcial de la fijación de C3 en las células de Schwann. Por lo tanto, las altas concentraciones (200 pg/ml) de anticuerpos inhibitorios del complemento fueron capaces de bloquear la fijación de C4 y C3 en este sistema de modelo de enfermedadin vitropara la MMN.
Para determinar los efectos diferenciales de los anticuerpos contra el complemento, se realizó una titulación y se analizaron los eventos del complemento aguas abajo. Las células de Schwann fijadas se opsonizaron con suero de pacientes con MMN, el complemento se activó en presencia de concentraciones crecientes de anticuerpos bloqueadores del complemento (TNT009, eculizumab y ARGX-117) que comienzan en 15 pg/ml hasta 480 pg/ml. Los resultados no mostraron efecto inhibitorio sobre la fijación de C3 con eculizumab, ya que este inhibe aguas abajo de C3. ARGX-117 mostró una inhibición completa de la fijación de C3 hasta una concentración de aproximadamente 30 pg/ml.
C. Conclusión
El efecto de inhibición del complemento de ARGX-117, dirigido a C2b humano, se evaluó en un modeloin vitromediante el uso de células de Schwann fijadas, lo que imita de esta manera la fisiopatología de la MMN. Los datos demuestran que las células de Schwann expresaron altos niveles de las proteínas reguladoras del complemento CD46, CD55 y CD59. Además, se demostró que los anticuerpos IgM anti-GM1 de pacientes con MMN activan la vía clásica del complemento y que la fijación de C3 era dependiente de la presencia de C2 en el sistema modelo de MMN. ARGX-117 bloqueó eficientemente la activación del complemento y superó tanto a eculizumab como a TNT009.
Ejemplo 3 Inhibición del complemento en un modeloin vitrode neuropatía motora multifocal (MMN) mediante el uso de células madre pluripotentes inducidas (iPSC)
A. Métodos
3.1 Protocolo para la diferenciación de neuronas motoras espinales a partir de iPSC
Se prepararon células similares a neuronas motoras (MN) a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) como se describe en la literatura (Harschnitz O y otros. J Clin Immunol. 2014, Jul; 34 Suppl 1:S112-9) y en cooperación con el Dr. L van der Pol y compañeros de trabajo, el Departamento de Neurología, UMCU, Países Bajos. Brevemente, se obtuvieron fibroblastos humanos de biopsias de piel de individuos sanos bajo un protocolo aprobado por la junta de revisión institucional. Estas células se cultivaron a 37 °C con 5 % de CO2 en medio para fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) que contiene DMEM GlutaMAX suplementado con suero fetal bovino al 10%y penicilina/estreptomicina al 1 %. Las células se reprogramaron dentro de los primeros 5 pases de acuerdo con el siguiente protocolo. Los fibroblastos humanos se sembraron a una densidad de 10000 células por pocillo en un plato de 6 pocillos y se cultivaron durante 24 horas en medio MEF. Subsecuentemente, se realizó la transducción viral con una mezcla que contenía medio MEF, 4 mg/ml de bromuro de hexadimetrina y un vector lentiviral que expresa Oct4, Klf4, Sox2 y c-Myc. Después de una incubación de 24 horas, las células se lavaron 3x con PBS, pH 7,4, y se cultivaron durante 5 días adicionales en medio MEF. Después, las células se incubaron con tripsina-EDTA y se transfirieron a un plato de 10 cm, prerrecubierto con gelatina al 0,1 % y que contenía una capa confluente de MEF irradiados en medio MEF. El medio de cultivo se reemplazó por medio de células madre embrionarias humanas (huES) que contenía DMEM-F12, reemplazo de suero con inactivación, penicilina/estreptomicina al 1 %, L-glutamina, aminoácidos no esenciales, p-mercaptoetanol y 20 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos humanos recombinantesbásico. Las colonias de iPSC se recogieron manualmente después de 3 a 6 semanas para su expansión y caracterización adicional. Las iPSC se mantuvieron en medio huES, se crioconservaron después de 4 a 6 pases, y se almacenaron en nitrógeno líquido. Las iPSC se cultivaron en MEF irradiados en medio huES y se pasaron manualmente. El cultivo de iPSC sin alimentador se realizó en Geltrex y se mantuvo en medio mTeSR1. Las iPSC cultivadas sin alimentador se pasaron enzimáticamente mediante el uso de Accutase.
3.2 Protocolo para la evaluaciónin vitrode ARGX-117
Las iPSC se cultivaron durante 12-14 días en cubreobjetos a 37 °C, 5 % de CO2, hacia las MN. A continuación, las iPSC-MN se fijaron mediante el uso de PFA al 4 % (10 min a 4 °C), se lavaron 3 veces con 500 pl de PBS y se retiraron los cubreobjetos de placas de 24 pocillos. Para minimizar la tinción no específica y neutralizar el fijador, las células se inactivaron mediante el uso de 100 pl de NH4O 50 mM durante 5 min a Ta , se lavaron una vez en PBS (todas las etapas de lavado a través de la inmersión del cubreobjeto) seguido de bloqueo con 100 pl de PBS+BSA al 2 % durante 2 h a TA. Después de lavar con PBS, las células se incubaron de arriba hacia abajo con sueros de pacientes con MMN inactivados por calor, se diluyeron 1:50 en PBS+BSA al 2 %, durante 60 min. A continuación, las células se lavaron una vez en PBS, se incubaron de arriba hacia abajo con suero con actividad del complemento al 15 % (-/+ preincubación con anticuerpos bloqueadores del complemento) durante 30 min a TA y se lavaron una vez en PBS. Subsecuentemente, las células se tiñeron con 100 pl de anticuerpos primarios (diluidos en PBS+BSA al 2 %) y se incubaron de arriba hacia abajo (1 h, TA, oscuridad) antes de lavar en PBS. A continuación, las células se incubaron de arriba hacia abajo con 100 pl de estreptavidina-APC (1:100 diluido en PBS+BSA al 2 %) durante 1 h a TA en la oscuridad seguido de lavado una vez con PBS y una vez con agua MilliQ (también sumergiendo el cubreobjetos). Después de secar los cubreobjetos en un papel tisú, se pipetearon 7 pl de montante antidecoloración ProLong™ Diamond con DAPI sobre el vidrio de objeto y se colocaron cubreobjetos en la parte superior hacia abajo sobre la gota y se secaron durante la noche a TA, antes de fijar con esmalte de uñas. Las células se analizaron mediante el uso de un microscopio Zeiss Z1 con LED Colibri con las siguientes configuraciones: aumento 40x o 20x (en dependencia de los experimentos), 25 % de LED, 400 ms para el canal Alexa Fluor™ 488, 100 ms para el canal APC y 50 ms para el canal DAPI (a menos que se indique de otra forma). Se tomaron cuatro imágenes por condición en todo el cubreobjeto. Todas las imágenes se normalizaron en el control positivo y negativo y se exportaron en un único canal y en un canal combinado al formato TIFF de 8 bit no comprimido mediante el uso del software ZEN 2012. Se calculó el valor gris medio de cada canal único con ImageJ (Fiji). Las relaciones se calcularon en Microsoft Excel 2010 y se visualizaron mediante el uso de GraphPad Prism 7. Los anticuerpos usados para la tinción se muestran en la Tabla 12 más abajo.
Tabla 12 Anticuer os ara la tinción
(1) Reacciona tanto con C3a como con C3b humano.
(2) El anti-C5b-9 clon aE11 se dirige contra un neoepítopo expuesto en C9 cuando se incorpora al TCC.
3.3 Protocolo para determinar GM1 mediante el uso de ELISA
Placas NUNC maxisorp se recubrieron con GM1 (5 |jg/ml) en metanol. El metanol se evaporó durante /- 2,5 h en un gabinete de flujo laminar. Subsecuentemente, los pocillos se bloquearon con 200 j l de BSA-PBS al 1 % durante 2 h a TA. El suero de pacientes con MMN se diluyó en BSA al 1 %-PBS (o preincubado con IVIg) y se añadieron 100 j l a cada pocillo seguido de incubación O/N a 4 °C. A continuación, las placas se lavaron 6 veces con PBS seguido de incubación con el anticuerpo primario que detecta IgM humana en BSA al 1 %-PBS (1 h a TA). Después de seis etapas de lavado con P<b>S, los pocillos se incubaron con 100 j l de anticuerpo secundario conjugado con HRP durante 1 h a TA. Después de seis etapas de lavado con PBS, se añadió t Mb y la reacción se detuvo mediante el uso de ácido clorhídrico. Las placas se analizaron a 415 nm mediante el uso de un lector de ELISA BioRad.
B. Resultados
Para investigar la patogenia de los anticuerpos IgM anti-GM1 de pacientes con MMN, se desarrolló un modeloin vitropara la MMN, ya que actualmente no está disponible un modelo animal para la MMN. En resumen, se generaron células madre pluripotentes inducidas humanas a partir de fibroblastos y se diferenciaron en neuronas motoras como se describió anteriormente. A continuación, estas neuronas motoras se fijaron en cubreobjetos mediante el uso de paraformaldehído (PFA) y se inactivaron con NH4CL Subsecuentemente, las células se opsonizaron mediante el uso de suero de pacientes con MMN, que contiene autoanticuerpos IgM anti-GM1, durante 1 hora, lo que permite la unión de estos autoanticuerpos al GM1. Después del lavado, se activó el complemento mediante el uso de suero humano agrupado (HPS) en presencia o ausencia de anticuerpos bloqueadores del complemento durante 30 minutos. Finalmente, las células se tiñeron con anticuerpos contra factores del complemento para evaluar la actividad del complemento. Los resultados de estos estudios se describen más abajo.
3.4 Expresión de receptores del complemento en neuronas motoras derivadas de iPSC
Para comprender mejor el papel del complemento en la fisiopatología de la MMN, se evaluó la expresión de proteínas reguladoras del complemento y receptores del complemento en las iPSC-MN. Por lo tanto, las iPSC-MN se cultivaron y fijaron mediante el uso de PFA al 4 % en cubreobjetos antes de teñir para detectar marcadores de expresión. Los resultados se muestran en la Tabla 13 y la Figura 13.
Tabl 1 Ex r i n r ín r l r l m l m n n iP -MN
Estos resultados revelan que todas las proteínas reguladoras del complemento (CD46, CD55 y CD59) se expresan en las neuronas motoras fijadas. CD59 se expresa altamente, lo que sugiere que las neuronas motoras están protegidas contra la lisis mediada por MAC. CD46 y CD55 mostraron una expresión intermedia localizada en el cuerpo celular. Tanto C3R como C5R se expresan en las neuronas motoras, con C5aR solo expresado en el cuerpo celular, no en las neuritas. CD11b y CD11c estaban ausentes, mientras que la expresión de CD35 fue baja.
3.5 Unión de autoanticuerpos derivados de pacientes con MMN a las iPSC-MN
Se investigó la unión de anticuerpos IgM anti-GM1 a las iPSC-MNin vitro.Con este fin, las iPSC-MN se cultivaron en cubreobjetos (80000-150000 células/cubreobjetos de 13 mm) en 1200 j l de medio de cultivo de hMN durante 12-14 días seguido de fijación con PFA al 4 %. A continuación, los cubreobjetos se lavaron en PBS y se inactivaron con NH4Cl4 (5 min, TA) antes de 2 horas de bloqueo con PBS-BSA al 2 %. Se realizó tinción con toxina B del cólera-Alexa 488 para detectar la expresión de GM1. Los resultados mostraron que las neuronas motoras derivadas de iPSC expresan GM1 y la incubación con suero de pacientes con m Mn dio como resultado una tinción anti-GM1 significativa colocalizada con tinción de IgM.
También se evaluó el potencial de activación del complemento de los anticuerpos IgM anti-GM1 del paciente en neuronas motoras derivadas de iPSC. Con este fin, las neuronas motoras derivadas de iPSC humanas se incubaron con suero inactivado por calor de pacientes con MMN (que contenía anticuerpos IgM anti-GM1 autorreactivos) y HPS que funcionó como fuente del complemento externa. El depósito de factores del complemento, tales como C4 y C3, se determinó mediante el uso de anticuerpos específicos. Los resultados mostraron que se pudo detectar la fijación de C4 y C3 en las iPSC-MN. Sin embargo, los altos títulos de GM1 anti-IgM no siempre se correlacionaron con un elevado depósito de C3. Para concluir, se detectó fijación de C4 y C3 en iPSC-MN fijadas después de la opsonización con suero de pacientes con MMN. Esto indica que los anticuerpos IgM anti-GM1 de pacientes con MMN pueden activar la vía clásica del complemento.
3.6 Dependencia de C2
Se evaluó la dependencia de C2 para verificar la importancia del factor del complemento C2 en la patogenia de la MMN. Las neuronas motoras derivadas de iPSC se opsonizaron con suero con agotamiento de C2 y se reconstituyeron con concentraciones crecientes de C2 humano (hC2) purificado para evaluar la activación del complemento mediante la medición de la fijación de C3. Los resultados se muestran en la Figura 14 y no revelaron fijación de C3 con suero con agotamiento de C2. Sin embargo, la adición de C2 restauró la fijación de C3 de una manera dependiente de la concentración. Además, ARGX-117 inhibió completamente la fijación de C3 en suero con agotamiento de C2 reconstituido con cantidades fisiológicas de hC2.
Para resumir, la fijación de C3 depende de la presencia de C2. Esto se demuestra por la capacidad de ARGX-117 de inhibir la fijación de C3 en presencia de hC2. Parece que no es necesaria la inhibición completa de C2 para bloquear la vía clásica del complemento y prevenir la formación de C3.
3.7 Eficacia de ARGX-117 para prevenir la fijación del complemento en iPSC-MN fijadas
Como se describió en la sección 1.9 anterior, se han generado diversos anticuerpos monoclonales inhibitorios contra factores del complemento y algunos de ellos están aprobados para aplicaciones clínicas. El efecto de estos anticuerpos inhibitorios se estudió en iPSC-MN fijadas. Con este fin, las iPSC-MN se cultivaron durante 12-14 días en cubreobjetos antes de la fijación. Subsecuentemente, las células se lavaron, se inactivaron y se bloquearon seguido de la opsonización con suero de pacientes. Después, las células se incubaron con suero con actividad del complemento en presencia o ausencia de diferentes anticuerpos bloqueadores del complemento durante 20 minutos a TA. Finalmente, las células se tiñeron y se obtuvieron imágenes mediante el uso de un aumento 40x o 20x.
La fijación de C4 en las neuronas motoras se inhibió mediante TNT009 (200 pg/ml) y no con otros AcM como se esperaba.
Se observó inhibición de C3 con ARGX-117 y TNT009 usados ambos a 200 pg/ml, mientras que no se observó ningún efecto con eculizumab, OMS646 y rituximab usados a la misma concentración. Por lo tanto, las altas concentraciones (200 pg/ml) de ARGX-117, que bloquea C2, fueron capaces de bloquear la fijación de C3 aguas abajo en este sistema de modeloin vitrode enfermedad para la m Mn .
Para determinar los efectos diferenciales de los anticuerpos contra el complemento, se realizó una titulación y se analizaron los eventos del complemento aguas abajo. Las neuronas motoras derivadas de iPSC fijadas se opsonizaron con suero de pacientes con MMN. El suero complementario activo se preincubó con concentraciones crecientes de anticuerpos bloqueadores del complemento (TNT009, OMS646 y ARGX-117) que comienzan en 3 jg/m l hasta 200 jg/m l antes de añadirlo a las iPSC-MN. Los resultados mostraron que no hubo efecto inhibitorio sobre la fijación de C3 con OMS646, ya que inhibe la vía de la lectina. ARGX-117 mostró una inhibición completa de la fijación de C3 hasta una concentración de aproximadamente 12 pg/ml. Se obtuvieron los mismos resultados con TNT009, donde el depósito de C3 también se bloqueó hasta 12 pg/ml. Por lo tanto, ARGX-117 y TNT009 realizaron igualmente bien la inhibición de la fijación de C3 en neuronas motoras derivadas de iPSC opsonizadas con suero de pacientes con MMN.
3.8 Inhibición del complemento mediante ARGX-117 en otras neuropatías mediadas por el sistema inmunitario
Las neuropatías periféricas autoinmunitarias representan un grupo clínicamente heterogéneo de enfermedades raras y discapacitantes caracterizadas por síntomas motores y/o sensoriales de gravedad de la enfermedad. En la MMN, existe evidencia directa de reactividad autoinmunitaria, mediada por anticuerpos IgM específicos dirigidos a GM1. Se han identificado otras neuropatías mediadas por el sistema inmunitario, que incluyen la polirradiculoneuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP) como la más común y el síndrome de Guillain-Barré (GBS) como el trastorno más agudo. Para evaluar los efectos terapéuticos de ARGX-117 en otras neuropatías mediadas por el sistema inmunitario, se usó el modeloin vitrodescrito anteriormente. Sin embargo, en lugar de opsonizar neuronas motoras derivadas de iPSC con suero de pacientes con MMN, se usaron sueros de pacientes con GBS y CIDP, respectivamente. Los resultados se representan en la Figura 15 y revelaron que los autoanticuerpos presentes en ambos sueros de pacientes pudieron activar el complemento, medida como fijación de C3 en neuronas motoras, y esto se bloqueó mediante la adición de 200 pg/ml de ARGX-117. Por lo tanto, además de la MMN, ARGX-117 también bloqueó el complemento en un modelo de enfermedad para otras neuropatías mediadas por el sistema inmunitario.
3.9 Efecto de IVIg sobre la inhibición del complemento mediante el uso del ensayo de MMNin vitro
Las IVIg son agentes biológicos usados frecuentemente para el tratamiento de diversas enfermedades autoinmunitarias. En la MMN, la IVIg está aprobada por la FDA y es el tratamiento de primera línea. Varios mecanismos son responsables de la modulación inmunitaria con IVIg, que incluyen la neutralización directa de inmunoglobulinas patógenas, el bloqueo de FcR y la regulación de varias células inmunitarias. IVIg actúa además sobre la inhibición de la activación del complemento, ya que la IgG, presente en IVIg, puede unirse a C3, lo que agota de esta manera C3 del suero y evita la vía terminal del complemento (Terenghi F y otros, Neurology, 2004, 62: 666-668; Fitzpatrick A, Mann C y otros, J Peripher Nerv Syst, 2011, 16(2): 84-91). En la MMN se ha demostrado que la IVIg reduce el depósito patológico de complejos anti-GM1-GM1 (Bhatheja K, Field J. Int J Biochem Cell Biol. 2006; 38(12):1995). El tratamiento estándar para la MMN es la IVIg; sin embargo, este tratamiento no es efectivo cuando se administra durante un período prolongado. Por lo tanto, el efecto inhibitorio del complemento de IVIg se investigó mediante el uso del modelo de MMNin vitromediante el uso de neuronas motoras derivadas de iPSC. Con este fin, los neuronas motoras derivadas de iPSC se cultivaron en cubreobjetos, se fijaron y se opsonizaron con suero de pacientes con MMN antes de la adición de suero con actividades del complemento para activar la cascada del complemento. Se probaron dos marcas de IVIg (GammaQuin y Nanogam) y se evaluaron también diferentes enfoques para el tratamiento con IVIg. Primero, se añadió IVIg 50 mg/ml durante la etapa de opsonización, donde IVIg no fue capaz de bloquear la fijación de C3 en las neuronas motoras. En segundo lugar, se realizó la administración de IVIg durante la opsonización y la activación del complemento, o durante la activación del complemento solamente, respectivamente. Ambos dieron como resultado una disminución de la fijación de C3 y GammaQuin mostró el efecto más fuerte sobre la inhibición del complemento en comparación con Nanogam (ver Figura 16).
Para evaluar el efecto antiidiotípico de IVIg, se realizó un ELISA de competencia para GM1 mediante el uso de sueros de pacientes con MMN. Los resultados mostrados en la Figura 17 revelan que no hubo efecto de competencia de IVIg para la unión a GM1 en este ensayo. Para resumir, el tratamiento con IVIg bloqueó la fijación de C3 cuando se añadió durante la etapa de activación del complemento, lo que confirma que la IVIg agotó a C3 del suero. Sin embargo, la IVIg no tuvo efecto sobre los anticuerpos idiotípicos.
C. Conclusiones
El efecto de inhibición del complemento de ARGX-117, dirigido a C2b humano, se evaluó en un modeloin vitromediante el uso de neuronas motoras derivadas de iPSC, lo que imita de esta manera la posible fisiopatología de la MMN. Los datos demuestran que las neuronas motoras en este sistema expresaron proteínas reguladoras del complemento con la expresión más alta de CD59. Además, se demostró que los anticuerpos IgM anti-GM1 de pacientes con MMN activaron la vía clásica del complemento y que el depósito de C3 era dependiente de la presencia de C2. ARGX-117 bloqueó eficientemente la activación del complemento no solo en pacientes con MMN, sino que también bloqueó la activación del complemento en muestras de pacientes con CIDP y GBS. Además, la IVIg solo bloqueó el complemento durante la etapa de activación del complemento y no tuvo efecto sobre los anticuerpos antiidiotípicos.

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo anti-C2 o fragmento de unión al antígeno que comprende un dominio variable de la cadena pesada (VH) y un dominio variable de la cadena ligera (VL), en donde el dominio VH comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 y el dominio VL comprende las secuencias de CDR:
- LCDR3 que comprende o que consiste de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5;
- LCDR2 que comprende o que consiste de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; y - LCDR1 que comprende o que consiste de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, para su uso en un método de tratamiento de una neuropatía paraproteinémica en un sujeto, en donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno se une al dominio C2b de C2.
2. El anticuerpo anti-C2 o fragmento de unión al antígeno para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo anti-C2 o fragmento de unión al antígeno inhibe la vía clásica del complemento y/o la vía del complemento de la lectina.
3. El anticuerpo anti-C2 o fragmento de unión al antígeno para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la neuropatía paraproteinémica es una neuropatía desmielinizante.
4. El anticuerpo anti-C2 o fragmento de unión al antígeno para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la neuropatía paraproteinémica se caracteriza por la presencia de inmunoglobulinas IgM, IgA o IgG.
5. El anticuerpo anti-C2 o fragmento de unión al antígeno para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la neuropatía paraproteinémica se caracteriza por la presencia de autoanticuerpos.
6. El anticuerpo anti-C2 o fragmento de unión al antígeno para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la neuropatía paraproteinémica se caracteriza por la presencia de autoanticuerpos contra un antígeno neural.
7. El anticuerpo anti-C2 o fragmento de unión al antígeno para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el antígeno neural es un gangliósido o glicoproteína asociada a mielina (MAG).
8. El anticuerpo anti-C2 o fragmento de unión al antígeno para su uso de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el gangliósido se selecciona de GM1, GM1b, GM2, GM3, GD1a, GD1b, GD2, GD3, GT1a, GT1b, GT3 y GQ1b.
9. El anticuerpo anti-C2 o fragmento de unión al antígeno para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el gangliósido es GM1.
10. El anticuerpo anti-C2 o fragmento de unión al antígeno para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde la neuropatía paraproteinémica se selecciona de: neuropatía motora multifocal (MMN), polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP), síndrome de Guillain-Barré (GBS), síndrome de Miller Fisher, neuropatía axonal motora aguda (AMAN), neuropatía axonal motora y sensitiva aguda (AMSAN), síndrome de neuropatía atáxica crónica-oftalmoplejía-paraproteína de IgM-aglutininas frías-anticuerpos disialosil (CANOMAD), neuropatía simétrica desmielinizante adquirida distal (DADS), neuropatía periférica asociada a gammopatía monoclonal, neuropatía periférica anti-MAG y síndrome de POEMS.
11. El anticuerpo anti-C2 o fragmento de unión al antígeno para su uso de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la neuropatía paraproteinémica es MMN, CIDP o GBS.
12. El anticuerpo anti-C2 o fragmento de unión al antígeno para su uso de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la neuropatía paraproteinémica es MMN.
13. El anticuerpo anti-C2 o fragmento de unión al antígeno para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde el dominio VL comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos al menos 70 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.
14. El anticuerpo anti-C2 o fragmento de unión al antígeno para su uso de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el dominio VL comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.
15. El anticuerpo anti-C2 o fragmento de unión al antígeno para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno comprende un dominio constante de la cadena pesada de IgG humana.
16. El anticuerpo anti-C2 o fragmento de unión al antígeno para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, en donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.
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