ES3035746T3 - Particle-mediated delivery of inhibitory rna - Google Patents

Particle-mediated delivery of inhibitory rna

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ES3035746T3
ES3035746T3 ES21205388T ES21205388T ES3035746T3 ES 3035746 T3 ES3035746 T3 ES 3035746T3 ES 21205388 T ES21205388 T ES 21205388T ES 21205388 T ES21205388 T ES 21205388T ES 3035746 T3 ES3035746 T3 ES 3035746T3
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Atta Behfar
Andre Terzic
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Mayo Clinic in Florida
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Mayo Foundation for Medical Education and Research
Mayo Clinic in Florida
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Abstract

La invención proporciona una composición que comprende una partícula bifásica, comprendiendo la partícula bifásica un gel de alginato que encapsula un ARN inhibidor para su uso en la mejora de la función cardíaca en un mamífero, en donde el ARN inhibidor reduce la expresión de un polipéptido en el que la expresión reducida del polipéptido mejora la función cardíaca, mejorando así la función cardíaca del mamífero, en donde el polipéptido es eotaxina-3, catepsina-S, DK -1, folistatina, ST-2, GRO-a, IL-21, NOV, transferrina, TIMP-2, TNFaRI, TNFaRII, angiostatina, CCL25, ANGPTL4 o MMP-3. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Transporte de ARN inhibidor por medio de partículas
Referencia cruzada a la solicitud relacionada
La presente solicitud reivindica la prioridad de la solicitud de patente provisional estadounidense n.° 62/426.090, presentada el 23 de noviembre de 2016.
Antecedentes
Un ataque al corazón, también llamado infarto de miocardio, se produce cuando una parte del músculo cardíaco no recibe suficiente flujo sanguíneo. Cuanto más tiempo pase sin tratamiento para restablecer el flujo sanguíneo, mayor será el daño al músculo cardíaco. Cada año, aproximadamente 735.000 estadounidenses sufren un infarto, incluidos aproximadamente 210.000 infartos que se producen en personas que ya han sufrido un primer infarto (Mozaffarianet al.,Circulation, 131(4):e29-322 (20l5)).
El documento US 2016/206697 A1 divulga procedimientos y material para tratar a pacientes en riesgo de experimentar un evento cardíaco adverso importante (por ejemplo, pacientes que se sometieron a una intervención coronaria percutánea (ICP) por infarto de miocardio con elevación del segmento ST (IAMCEST)), incluida la administración de un inhibidor de IL-21, donde el inhibidor es un ARN inhibidor.
Sumario
La invención se define en las reivindicaciones adjuntas. En la medida en que se divulgue otra materia en el presente documento, esta se incluye simplemente a modo de referencia. Las referencias a los procedimientos de tratamiento en los párrafos siguientes de esta descripción deben interpretarse como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para el diagnóstico).
Las reivindicaciones se refieren a una composición que comprende una partícula bifásica, comprendiendo la partícula bifásica un gel de alginato que encapsula un ARN inhibidor para su uso en la mejora de la función cardíaca en un mamífero (por ejemplo, un humano) que experimenta o está en riesgo de experimentar un evento cardíaco adverso importante, en el que el ARN inhibidor se dirige a la interleucina-21 (IL-21), para disminuir el nivel de expresión del polipéptido IL-21, mejorando así la función cardíaca del mamífero.
La presente divulgación describe, pero la invención no abarca, modificaciones de las moléculas de ARN que aumentan el tiempo de existencia de las moléculas de ARN modificadas en las células.
La presente divulgación proporciona además materiales y procedimientos para el transporte por medio de partículas de uno o más productos biológicos (por ejemplo, ARN, ARN modificado y/o microvesículas) a un tejido (por ejemplo, tejido cardíaco). Las microvesículas pueden representar partículas fabricadas o estructuras naturales, como los exosomas. Por ejemplo, este documento proporciona partículas (por ejemplo, geles de alginato) para transportar uno o más ARN al tejido cardíaco para mejorar la función cardíaca.
Tal como se ha demostrado en el presente documento, un gel de alginato puede utilizarse para transportar ARNm a un tejido cardíaco donde el ARNm puede traducirse en un polipéptido funcional. El transporte de ARN por medio de partículas puede inducir una expresión de ARN robusta y sostenible. En algunos casos, las partículas pueden ser diseñadas para el control temporal y/o espacial del transporte de una o más moléculas encapsuladas (por ejemplo, productos biológicos).
Por consiguiente, se proporciona a modo de ejemplo pero no como parte de la invención, esta divulgación describe composiciones que generalmente incluyen un sustrato particulado y un ARNm unido al sustrato particulado. El ARNm incluye al menos una modificación para inhibir la degradación del ARNm cuando este se encuentra en el citosol de una célula. El ARNm también codifica al menos un polipéptido terapéutico. La modificación del ARNm comprende una pseudonudo, un elemento de estabilidad del ARN, o una estructura de horquilla 3' artificial. En algunas instancias, el sustrato particulado puede incluir una modificación química de su superficie. Además, el sustrato particulado puede incluir una nanopartícula, una pluralidad de nanopartículas o una micropartícula. En algunas instancias, el polipéptido terapéutico puede incluir una cadena pesada de inmunoglobulina o una cadena ligera de inmunoglobulina.
También se divulga, pero no es parte de la invención, un procedimiento para mejorar la función cardíaca. El procedimiento incluye, o consiste esencialmente en administrar a un mamífero una partícula que encapsula un ARNm que codifica un polipéptido útil para regenerar la función y/o el tejido cardíaco, mejorando así la función cardíaca del mamífero. El polipéptido puede ser NAP -2, TGF-a, ErBb3, VEGF, IGF-1, FGF-2, PDGF, IL-2, CD19, CD20, y/o CD80/86. El mamífero puede ser un ser humano. El ser humano puede haber sido sometido a una intervención coronaria percutánea por infarto de miocardio con elevación del ST. La administración puede ser arterial. La partícula puede incluir alginato. El alginato puede estar en forma de gel de alginato. El gel de alginato puede incluir una sal de calcio. El gel de alginato que incluye una sal de calcio puede tener una proporción de alginato a sal de calcio que puede ser de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 10:1. La partícula puede tener un diámetro de aproximadamente 5 pm a aproximadamente 10 pm. La partícula puede ser una partícula bifásica. La partícula bifásica puede ser una partícula polarizada. La partícula bifásica puede tener una cola. El procedimiento puede incluir la administración de la composición durante una intervención coronaria percutánea. La partícula puede incluir una proteína de andamiaje (por ejemplo, colágeno I, colágeno II, colágeno III, colágeno IV, fibrina y/o gelatina). La partícula puede encapsular un polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo con capacidad para neutralizar la actividad del factor de necrosis tumoral, un anticuerpo con capacidad para neutralizar la actividad del complejo-1 mitocondrial o un agonista de la resolvina-D1). La partícula puede encapsular un lipopolisacárido. La partícula puede encapsular una microvesícula y/o un exosoma.
Como se describe más arriba, este documento presenta un procedimiento para mejorar la función cardíaca en un mamífero. El procedimiento incluye, o consiste esencialmente en administrar a un mamífero una partícula que encapsula un ARN inhibidor que tiene la capacidad de reducir la expresión del polipéptido IL-21, mejorando así la función cardíaca del mamífero. En relación con esto, también se divulga, aunque no forma parte de la invención, el ARN inhibidor tiene la capacidad de reducir la expresión de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en eotaxina-3, catepsina-S, DK-1, folistatina, ST-2, GRO-a, NOV, transferrina, TIMP-2, TNFaRI, TNFaRII, angiostatina, CCL25, ANGPTL4 y MMP-3, mejorando así la función cardíaca del mamífero. El mamífero puede ser un ser humano. El ser humano puede haber sido sometido a una intervención coronaria percutánea por infarto de miocardio con elevación del ST. La administración puede ser arterial. La partícula puede incluir alginato. El alginato puede estar en forma de gel de alginato. El gel de alginato puede incluir una sal de calcio. El gel de alginato que incluye una sal de calcio puede tener una proporción de alginato a sal de calcio que puede ser de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 10:1. La partícula puede tener un diámetro de aproximadamente 5 pm a aproximadamente 10 pm. La partícula puede ser una partícula bifásica. La partícula bifásica puede ser una partícula polarizada. La partícula bifásica puede incluir una cola. El procedimiento puede incluir la administración de la composición durante una intervención coronaria percutánea. La partícula puede incluir una proteína de andamiaje (por ejemplo, colágeno I, colágeno II, colágeno III, colágeno IV, fibrina y/o gelatina). La partícula puede encapsular un polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo con capacidad para neutralizar la actividad del factor de necrosis tumoral, un anticuerpo con capacidad para neutralizar la actividad del complejo-1 mitocondrial o un agonista de la resolvina-D1). La partícula puede encapsular un lipopolisacárido. La partícula puede encapsular una microvesícula y/o un exosoma.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos y expresiones técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entienden habitualmente los expertos en la técnica a la que pertenece esta divulgación. En el presente documento se describen procedimientos y materiales para su uso en la presente divulgación; también pueden utilizarse otros procedimientos y materiales adecuados conocidos en la técnica. Los materiales, procedimientos y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser limitativos. En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria descriptiva, incluidas las definiciones.
Los detalles de una o más realizaciones de la invención se exponen en los dibujos adjuntos y en la descripción que sigue. Otras características, objetos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción y los dibujos, y a partir de los párrafos y las reivindicaciones.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. Ilustraciones esquemáticas de ejemplos de procedimientos para fabricar partículas bifásicas. (A) Un procedimiento de tecnología estabilizadora en el que dos núcleos líquidos blandos separados, tales como un componente a base de agua y un componente a base de aceite, se estabilizan y luego se fusionan en una sola partícula de Jano. (B) Un procedimiento de combinación y fusión en estado fundido en el que dos corrientes de polímeros se fusionan formando una sola partícula y se enfrían para formar dos hemisferios de una partícula de Jano. (C) Un procedimiento de microfluidos que utiliza el flujo controlado de líquidos en canales de microfluidos para formar gotas que se solidifican en partículas de Jano formadas.
Figura 2. Ilustraciones esquemáticas de ejemplos procedimientos de transporte que utilizan partículas bifásicas. (A) Una partícula de Jano con diferente porcentaje en volumen o densidad podría orientar la partícula dentro del flujo sanguíneo y dirigir los productos biológicos en una orientación apropiada para su transporte. (B) Una partícula de Jano con un recubrimiento puede controlar la velocidad de liberación y/o aumentar la capacidad de orientación. (C) Una partícula de Jano que tenga una cola (arriba), que tenga una solubilidad diferencial (en el medio) y/o que tenga un posicionamiento diferencial de las microcápsulas en cada extremo de la partícula de Jano (abajo) puede proporcionar una orientación a la partícula.
Figura 3. Imágenes de microscopía fluorescente (primera y tercera filas) y de fase de luz (segunda y cuarta filas) que muestran la transfección de mCherry en fibroblastos dérmicos humanos (dos filas superiores) y en fibroblastos cardíacos humanos (dos filas inferiores).
Figura 4. Imágenes de microscopía fluorescente que muestran la cotransfección de EGFP y mCherry en células HEK293.
Figura 5. Imágenes de microscopía fluorescente (fila superior) y de fase de luz (fila inferior) que muestran la transfección de mCherry en cardiomiocitos HL-1.
Figura 6. Datos que muestran el transporte de ARNm por medio de partículas en un modelo de ratón. (A) Inyección hidrodinámica en la vena de la cola de una disolución de control (CTL). (B) Inyección hidrodinámica en la vena de la cola de liposomas que contienen ARNm de luciferasa. (C) Inyección subcutánea de una disolución de control (CTL). (D) Inyección subcutánea de ARNm de luciferasa. (E) Un gráfico de barras que muestra la cantidad de luciferasa expresada por los ratones en (A) y (B). (F) Un gráfico de barras que muestra la cantidad de luciferasa expresada por los ratones en (C) y (D).
Figura 7. Imágenes de microscopía que muestran la expresión de mCherry en ratones sometidos a una inyección subcutánea de una disolución de control (solo vehículo; fila superior) o de liposomas que contienen ARN de mCherry (fila inferior).
Figura 8. Datos que muestran el transporte de ARNm por medio de partículas en un modelo de ratón. (A) Una fotografía de ratones inyectados con una disolución de control o con liposomas que contienen ARNm de luciferasa mediante inyección intracardíaca guiada por eco. (B) Un gráfico de barras que muestra la cantidad de luciferasa expresada por los ratones en (A).
Figura 9. Fotografías de corazones de ratón inyectados con una disolución de control o con liposomas que contienen ARNm de luciferasa mediante inyección intracardíaca a tórax abierto.
Figura 10. Fotografía de un corte transversal de un corazón porcino inyectado con un sistema indicador de m-Cherry en gel de alginato.
Figura 11. Imágenes fluorescentes de corazones porcinos inyectados con un volumen reducido de gel de alginato.
Figura 12. Imágenes fluorescentes de corazones porcinos inyectados con distintas concentraciones de alginato/calcio.
Figura 13. Imágenes fluorescentes tras la administración de esferas de alginato que contienen ARNm mCherry.
Figura 14. Un diseño de aguja para el transporte eficaz de productos biológicos a los tejidos, con un diseño de microespiral y orificios laterales.
Figura 15. Varios diseños de ARN que modifican el 5'CAP y la cola de poli(A) para una expresión génica sostenidain vivosin integración del ADN. (A) ARNm nativo. (B) ARNm modificado por ingeniería de bucles que añade un bucle protector al final de la cola de poli(A). (C) Cola de poli(A) en bucle más la modificación de la caperuza de guanosina 5' 7-metilo para limitar aún más la degradación.
Figura 16. La transfección de células HEK con M2ARN que codifica mCherry produce una rápida inducción de genes que se mantiene durante un período de observación de seis días.
Figura 17. Datos que muestran la expresión persistente de M3ARN. (A) El M3ARN induce mCherry en cultivos primarios de cardiomiocitos. La visualización temporal de la expresión de mCherry durante un período de observación de seis días indica la persistencia de una expresión cuantificada. (C) La evaluación por citometría de flujo revela una eficacia del 43 % en la inducción de cardiomiocitos cultivados.
Figura 18. Sistema de cultivo primario de músculo esquelético humano. Derivados de muestras de donantes, los bancos de células maestras de mioblastos P3 se generan dentro de un medio de propagación definido sin sustancias extrañas. En un entorno de diferenciación, las células MyoD+ pueden ser inducidas para que se diferencien en miotubos positivos a la actinina.
Figura 19. Expresión de genes duales mediada por M3ARN dentro de un único sistema de encapsulación. Inducción de GFP y mCherry en cuatro horas y expresión persistente durante un periodo de observación de 24 horas en cultivos primarios de células musculares esqueléticas.
Figura 20. La administraciónin vivode M3ARN de Fluc demuestra la compatibilidad de esta plataforma en una amplia gama de tejidos. Se proporcionan controles simulados para cada ejemplo, con la excepción del ojo, donde el ojo contralateral actuó como control simulado.
Figura 21. Cuantificación de la expresión de Fluc tras la administración de M3ARN mediante inyección directa en el miocardio durante un periodo de observación de 72 horas.
Figura 22. Evidencia del transporte simultáneo de tres genes utilizando la plataforma M3ARN con inyección directa en el miocardio.
Figura 23. Estrategia de diseño de vectores para el establecimiento de la plataforma M3ARN-Ig.
Figura 24. El uso de la secuencia IRES elimina la necesidad de un sistema dependiente de CAP/PABP.
Figura 25. Las estrategias 3' para disminuir la tasa de degradación del ARNm se centran en 3 plataformas putativas. El 'pseudonudo media en la lectura ribosómica inactivando las moléculas UPF1. El elemento de estabilidad del ARN actúa como señuelo para bloquear el contacto de UPF1 con el 3'UTR evitando la activación del NMD. Las estructuras de horquilla-cola de poli(A) se utilizan para disminuir la degradación del ARNm mediada por exosomas en construcciones en las que se utiliza una plataforma IRES independiente de CAP/PABP.
Figura 26. La combinación de M2ARN con micropartículas recubiertas de PEG y quitosano da lugar a la putativa plataforma M3ARN-Ig optimizada para el transporte de genes en el músculo esquelético.
Descripción detallada
La presente divulgación se refiere a materiales y procedimientos para el transporte por medio de partículas de productos biológicos (por ejemplo, ARN y/o microvesículas) a tejidos (por ejemplo, tejido cardíaco). La presente divulgación describe además modificaciones del ARN que aumentan el tiempo de existencia de las moléculas de ARNm modificadas en las células y, por lo tanto, el tiempo en que las moléculas de ARNm modificadas pueden traducirse para producir los polipéptidos codificados por el ARNm modificado.
La presente divulgación proporciona materiales y procedimientos para el transporte por medio de partículas de uno o más productos biológicos (por ejemplo, ARN y/o microvesículas) a un mamífero. Por ejemplo, una partícula (por ejemplo, un gel de alginato) descrita en el presente documento puede utilizarse para encapsular ARN y transportar el ARN encapsulado a un tejido de manera temporal y/o espacialmente específica. Tal y como se utiliza en este documento, el término "encapsular" y sus variaciones se emplean en sentido amplio para referirse a cualquier procedimiento por el que un producto biológico se aloja dentro de una partícula o se une, directa o indirectamente, a la superficie exterior de una partícula. Tal como se explica con más detalle a continuación, la partícula puede ser de escala nanoparticulada o microparticulada. Así, el término "encapsular" incluye, pero no requiere que la partícula rodee completamente el material que se encapsula. Por el contrario, un material está encapsulado si simplemente es capturado en cualquier grado dentro de las dimensiones de la partícula, incluyendo cualquier modificación de la superficie. Las modificaciones de la superficie de la partícula pueden facilitar la unión indirecta del material encapsulado a la partícula. Además, la macroencapsulación puede utilizarse para transportar un producto biológico proporcionando un vehículo protector por el que se transmite el producto biológico, ya sea por inyección directa o a través de un vaso sanguíneo a un tejido diana.
En algunos casos, una o más partículas (por ejemplo, geles de alginato) que contienen uno o más productos biológicos (por ejemplo, ARN y/o microvesículas) pueden utilizarse para tratar a un mamífero que experimenta un episodio cardíaco adverso grave (por ejemplo, infarto agudo de miocardio) y/o un mamífero con riesgo de sufrir un episodio cardíaco adverso grave (por ejemplo, pacientes sometidos a una intervención intracutánea (ICP) por infarto de miocardio con elevación del ST (IAMCEST)). De acuerdo con la presente invención, una partícula bifásica que comprende un gel de alginato que encapsula un ARN inhibidor, en el que el ARN inhibidor se dirige a la IL-21 para disminuir el nivel de expresión del polipéptido IL-21, puede utilizarse para mejorar la función cardíaca en un mamífero. En algunas realizaciones, el mamífero es un ser humano. En otras realizaciones, el ser humano se ha sometido a una intervención coronaria percutánea por un infarto de miocardio con elevación del segmento ST.
En algunos casos, una o más partículas (por ejemplo, un gel de alginato) que contienen uno o más productos biológicos (por ejemplo, ARN o microvesículas) pueden utilizarse para mejorar la función cardíaca.
En algunos casos, que no forman parte de la invención, una partícula (por ejemplo, un gel de alginato) descrita en el presente documento puede almacenar ARNm en su interior, y liberar (por ejemplo, administrar) el ARNm a un tejido (por ejemplo, tejido cardíaco), donde el ARNm se expresa como una proteína funcional. Por ejemplo, una o más partículas que contienen uno o más ARNm pueden utilizarse para aumentar la expresión de polipéptidos útiles para regenerar la función y/o el tejido cardíaco (por ejemplo, proteínas homeodominio de POU (tales como Oct-4), proteínas homeocaja NK2 (por ejemplo, proteínas NKX2), factores potenciadores de los miocitos (por ejemplo, MEF2), proteínas de unión a gAtA (por ejemplo, GATA1, GATA2, GATA3, GATA4, GATA5 y gAt A6), factores de transcripción T-caja (por ejemplo, TbX1, TBX2, TBX3, TBX4, TBX5, TBX6, TBX10, TbX15, TBX18, TBX19, TBX20, TBX21 y TbX22), proteínas posteriores del mesodermo (por ejemplo, MESP1 y MESP2), proteínas activadoras de neutrófilos (por ejemplo, NAP-2 y NAP-3), factores de crecimiento transformantes (por ejemplo, TGF-a y TGF-p), oncogén viral de la leucemia eritroblástica-3 (ErBb3), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1), factor de crecimiento de los fibroblastos (FGF-2), factores de crecimiento derivados de las plaquetas (por ejemplo, PDGFA, PDGFB, PDGFC y PDGFD), interleucina-2 (IL-2), CD19, CD20 y CD80/86).
En algunos casos, una partícula (por ejemplo, un gel de alginato) descrita en el presente documento puede almacenar ARN inhibidor en su interior, y liberar (por ejemplo, administrar) el ARN inhibidor a un tejido (por ejemplo, tejido cardíaco), donde el ARN inhibidor inhibe o reduce la expresión de una proteína. Por ejemplo, pueden utilizarse una o más partículas que contengan uno o más ARN inhibidores para disminuir la expresión de uno o más de los siguientes polipéptidos eotaxina-3, catepsina-S, Dickopf-1 (DK-1), folistatina, supresión de la tumorigenicidad-2 (ST-2), GRO-a, interleucina-21 (IL-21), sobreexpresado en nefroblastoma (NOV), transferrina, inhibidor tisular de la metalopeptidasa-2 (TIMP-2), receptores del factor de necrosis tumoral-1 y -2 (TNFaRI y II), angiostatina, ligando de quimioquinas-25 (CCL25), similar a angiopoyetina-4 (ANGPTL4) y metaloproteinasa de matriz-3 (MMP-3).
Partículas
En el contexto de la presente invención, tal como se define en las reivindicaciones adjuntas, la partícula es una partícula bifásica que comprende un gel de alginato. Otras partículas descritas en este documento, se incluyen únicamente con fines de referencia.
Una partícula descrita en el presente documento puede utilizarse para el transporte por medio de partículas de una o más moléculas (por ejemplo, productos biológicos que incluyen ARN o microvesículas) a un mamífero. En algunos casos, una partícula que puede utilizarse para encapsular uno o más productos biológicos no es tóxica, es biocompatible, no es inmunógena y/o es biodegradable.
Una partícula que puede utilizarse para encapsular uno o más productos biológicos como se describe en el presente documento puede incluir uno o más polisacáridos. Los ejemplos de polisacáridos que pueden utilizarse en una partícula que puede usarse para encapsular una o más moléculas (por ejemplo, productos biológicos) como se describe en el presente documento incluyen, por ejemplo, guluronato, manuronato, bloques de guluronato-manuronato y combinaciones de los mismos, como el alginato. En algunos casos, una partícula que puede utilizarse para encapsular uno o más productos biológicos como se describe en el presente documento puede incluir alginato. El alginato en una partícula que puede utilizarse para encapsular uno o más productos biológicos como se describe en el presente documento puede proceder de cualquier fuente apropiada (por ejemplo, algas marinas, tales como las de los géneros y familiasPhaeophyceae, Rhodophyceae, Chlorophyceae, MacrocystisyLaminaria,o bacterias, tales como las de los génerosPseudomonasyAzotobacter).Un alginato en una partícula que puede utilizarse para encapsular uno o más productos biológicos como se describe en el presente documento puede ser una sal de alginato (por ejemplo, alginato de sodio, alginato de potasio y/o alginato de calcio) o ácido algínico. Por ejemplo, un alginato en una partícula que puede utilizarse para encapsular uno o más productos biológicos como se describe en el presente documento puede ser alginato de sodio. Un alginato en una partícula que puede utilizarse para encapsular uno o más productos biológicos como se describe en el presente documento puede estar en forma de un gel, un líquido y/o una partícula (por ejemplo, una nanopartícula, una micropartícula o una macropartícula). Por ejemplo, un alginato en una partícula que puede utilizarse para encapsular uno o más productos biológicos como se describe en el presente documento puede ser un gel de alginato. En algunos casos, una partícula descrita en el presente documento puede ser un líquido en el momento de la administración y puede formar un gel (por ejemplo, puede polimerizar) en el sitio de administración y/o en el sitio diana. Un gel de alginato puede incluir una disolución de calcio (por ejemplo, una disolución de sal de calcio u otra disolución iónica apropiada con carga positiva). Los ejemplos de sales de calcio que pueden utilizarse en una disolución de calcio para formar un gel de alginato que puede utilizarse para encapsular uno o más productos biológicos como se describe en el presente documento incluyen, sin limitación, cloruro de calcio, cloruro de magnesio, cloruro de potasio y disoluciones a base de hierro. La proporción de alginato a sal de calcio puede utilizarse para controlar la viscosidad del gel de alginato que puede usarse para encapsular uno o más productos biológicos como se describe en el presente documento. En el contexto de la presente invención, el gel de alginato puede comprender una proporción de alginato a sal de calcio de entre 2:1 y 10:1. También se describe en el que la cantidad de alginato puede ser de aproximadamente 0,05 por ciento a aproximadamente 1,0 por ciento de la cantidad de sal de calcio. En algunos casos, la proporción de alginato a sal de calcio puede ser de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 10:1 (por ejemplo de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 9:1, de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 8:1, de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 7:1, de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 6:1, de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 5:1, de aproximadamente 3:1 a aproximadamente 10:1, de aproximadamente 4:1 a aproximadamente 10:1, de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 10:1, de aproximadamente 6:1 a aproximadamente 10:1, de aproximadamente 7:1 a aproximadamente 10:1, o de aproximadamente 8:1 a aproximadamente 10:1). Entre los ejemplos de proporciones apropiadas de alginato/calcio se incluyen, sin limitación, los indicados en la tabla 1. Un gel de alginato que encapsula un producto biológico (por ejemplo, ARNm) descrito en el presente documento puede fabricarse por cualquier procedimiento apropiado. Por ejemplo, un gel de alginato puede fabricarse hidrolizando una sal de alginato (por ejemplo, alginato de sodio) utilizando una disolución de sal de calcio soluble (por ejemplo, cloruro de calcio) como agente de reticulación.
Tabla 1. Ejemplos de concentraciones de alginato/calcio.
Una partícula que puede utilizarse para encapsular uno o más productos biológicos como se describe en el presente documento puede tener la forma de un liposoma, un agregado (por ejemplo, un nanoagregado), una cápsula (por ejemplo, una nanocápsula), una esfera (por ejemplo, una nanoesfera), un polimerosoma o una micela. Una partícula que puede utilizarse para encapsular uno o más productos biológicos como se describe en el presente documento, que es un gel de alginato, puede tener la forma de una esfera polimerizada. En algunos casos, una partícula que puede utilizarse para encapsular uno o más productos biológicos como se describe en el presente documento puede ser un liposoma. Los ejemplos de liposomas incluyen, sin limitación, una vesícula multilaminar ("multilamellar vesicle", MLV), una vesícula liposómica unilaminar pequeña ("small unilamellar liposome vesicle", SUV), una vesícula unilamelar grande ("large unilamellar vesicle", LUV), una vesícula unilamelar gigante ("giant unilamellar vesicle", GUV), una vesícula multivesicular ("multivesicular vesicle", MVV) o una vesícula coclear. Un liposoma puede estar compuesto por fosfolípidos, colesteroles, lipoproteínas, grasas, ácidos grasos, ceras, esteroles, monoglicéridos, diglicéridos y/o triglicéridos. En algunos casos, un liposoma está compuesto por fosfolípidos, tales como el ácido fosfatídico (fosfatidato; PA), fosfatidiletanolamina (cefalina; PE), fosfatidilcolina (lecitina; PC), fosfatidilserina (PS), fosfoinositidos (por ejemplo, fosfatidilinositol (PI), fosfatidilinositol fosfato (PIP), fosfatidilinositol bifosfato (PIP2) y fosfatidilinositol trifosfato (PIP3)), ceramida-fosforilcolina (esfingomielina; SPH), ceramida-fosforiletanolamina (esfingomielina; Cer-PE), ceramida-fosforil-lípido o cualquier combinación de las mismas. Los ejemplos de liposomas apropiados incluyen, sin limitación, los indicados en la tabla 2. Un liposoma que encapsula un producto biológico (por ejemplo, ARNm) descrito en el presente documento puede fabricarse mediante cualquier procedimiento apropiado. Por ejemplo, un liposoma puede fabricarse sonicando una dispersión de lípidos anfipáticos, tales como los fosfolípidos, en agua.
Tabla 2. Ejemplos de componentes de liposomas
Una partícula que puede utilizarse para encapsular uno o más productos biológicos como se describe en el presente documento puede tener cualquier tamaño adecuado para el procedimiento de transporte seleccionado. Una partícula que puede usarse para encapsular uno o más productos biológicos como se describe en el presente documento puede tener un diámetro de aproximadamente 0,3 pm a aproximadamente 12 pm (por ejemplo, de aproximadamente 0,5 pm a aproximadamente 11,5 pm, de aproximadamente 1 pm a aproximadamente 11 pm, de aproximadamente 2 pm a aproximadamente 10,5 pm, o de aproximadamente 4 pm a aproximadamente 10 pm) (o medida en la dimensión más larga). Por ejemplo, una partícula que puede utilizarse para encapsular uno o más productos biológicos como se describe en el presente documento puede tener un diámetro de aproximadamente 4,5 pm a aproximadamente 7,5 pm (o medida en la dimensión más larga).
Una partícula (por ejemplo, un gel de alginato) que encapsula uno o más productos biológicos descritos en el presente documento también puede incluir una o más moléculas adicionales para lograr una propiedad deseada. En algunos casos, una partícula que encapsula uno o más productos biológicos descritos en el presente documento puede incluir una o más proteínas de andamiaje. Los ejemplos de proteínas de andamiaje incluyen, por ejemplo, proteínas de la matriz (por ejemplo, colágeno (por ejemplo, colágeno I/II/III/IV)), proteínas de la membrana basal, proteínas estructurales, gelatina y/o fibrina) que pueden incorporarse a una partícula para proporcionar a la partícula propiedades de liberación sostenida. Por ejemplo, un gel de alginato que encapsula uno o más productos biológicos descritos en el presente documento puede incluir alginato y gelatina, alginato y colágeno, alginato y fibrina, o cualquier otra combinación apropiada de alginato con una o más proteínas naturales de la membrana basal. En algunos casos, se pueden incorporar moléculas sensibles a los estímulos en una partícula para dotarla de propiedades de liberación de fármacos bajo estímulos específicos (por ejemplo, partículas sensibles al pH y partículas sensibles a la osmolaridad/osmolalidad). Por ejemplo, la dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE) puede incorporarse a una partícula para proporcionar una partícula sensible al pH que mantiene la estabilidad a pH fisiológico (aproximadamente pH 7,4), pero que se desestabiliza en condiciones ácidas (por ejemplo, aproximadamente pH 3,5 a aproximadamente pH 9), lo que conduce a la liberación del ARN encapsulado en entornos ácidos.
Una partícula (por ejemplo, un gel de alginato) que encapsula uno o más productos biológicos descritos en el presente documento puede ser una partícula amorfa que tiene dos o más estados físicos distintos. Por ejemplo, una partícula amorfa puede administrarse como un líquido y formar un gel al llegar a un tejido diana.
Una partícula (por ejemplo, un gel de alginato) que encapsula uno o más productos biológicos descritos en el presente documento puede ser una partícula bifásica (a veces denominada partícula de Jano) que tiene dos o más propiedades físicas distintas (por ejemplo, la química de la superficie) que aparecen en diferentes porciones de la superficie de la partícula. Por ejemplo, una partícula bifásica puede tener dos o más porciones que difieren en las propiedades hidrofílicas/hidrofóbicas, polarización, propiedades de solubilidad, porcentaje en volumen o densidad de la composición de la partícula, presencia/ausencia de una molécula adicional (por ejemplo, un compuesto que proporciona propiedades de liberación sostenida) y/o presencia/ausencia de una cola. En algunos casos, una partícula bifásica puede ser una partícula esférica que tiene porciones hidrofílicas y porciones hidrofóbicas. Por ejemplo, una partícula bifásica puede ser diseñada para tener un núcleo hidrofílico y un recubrimiento hidrofílico. Por ejemplo, una partícula bifásica puede ser diseñada para tener un núcleo hidrofílico y un recubrimiento hidrofílico. En algunos casos, una partícula bifásica puede ser una partícula esférica con densidad diferencial. Por ejemplo, una partícula bifásica puede ser diseñada para tener un mayor porcentaje en volumen de un producto biológico encapsulado en un extremo de la partícula. En algunos casos, una partícula bifásica puede ser una partícula esférica con un recubrimiento. Por ejemplo, una partícula bifásica puede ser diseñada para tener un recubrimiento poroso. En algunos casos, una partícula bifásica puede ser una partícula esférica con solubilidad diferencial. Por ejemplo, una partícula bifásica puede ser diseñada para tener una primera cara que se disuelve fácilmente en ciertas condiciones fisiológicas y una segunda cara que se disuelve lentamente en las mismas condiciones fisiológicas. En algunos casos, una partícula bifásica puede ser una partícula esférica que tiene una cola que se extiende desde una parte de la superficie de la partícula. Por ejemplo, se puede diseñar una partícula bifásica para guiar las partículas en el flujo sanguíneo. En algunos casos, una partícula bifásica puede ser diseñada para tener un primer lado (por ejemplo, el principal) que se disuelve fácilmente en ciertas condiciones fisiológicas y un segundo lado que se disuelve lentamente en las mismas condiciones fisiológicas y que incluye una cola para guiar las partículas en el flujo sanguíneo.
Una partícula bifásica que encapsula uno o más productos biológicos descritos en el presente documento puede fabricarse utilizando cualquier procedimiento apropiado. En algunos casos, una partícula bifásica puede fabricarse utilizando una tecnología de estabilización (por ejemplo, que incluye estrategias de agua seca). Por ejemplo, dos o más núcleos líquidos blandos separados (por ejemplo, dos líquidos que tienen diferente hidrofobicidad, tal como una entidad hidrofóbica y una entidad hidrofílica, o dos líquidos que tienen diferente solubilidad, tal como el agua y un aceite) pueden estabilizarse y luego fusionarse en una partícula bifásica. En algunos casos, se puede fabricar una partícula bifásica utilizando la tecnología de combinación y fusión en estado fundido. Por ejemplo, dos o más corrientes separadas (por ejemplo, dos corrientes de cera fundida con propiedades diferenciales, o dos corrientes de polímeros con propiedades diferentes) pueden fusionarse (por ejemplo, inyectarse en una sola corriente) para formar una partícula bifásica. En algunos casos, se puede fabricar una partícula bifásica utilizando la tecnología de la impresora 3D. Por ejemplo, se pueden imprimir dos o más recubrimientos (por ejemplo, dos recubrimientos de cera con propiedades diferentes) sobre un elemento estructural interno particulado (por ejemplo, una partícula de espuma de poliestireno, tal como STYROFOAM™) para formar una partícula bifásica. El elemento estructural interno particulado puede ser eliminado (por ejemplo, mediante eliminación con acetona) y sustituido por uno o más productos biológicos. En algunos casos, se puede fabricar una partícula bifásica utilizando la tecnología de microfluidos. Por ejemplo, dos o más flujos de líquido (por ejemplo, dos líquidos que tienen diferentes propiedades) pueden fluir en un canal de microfluidos para formar gotas bifásicas, que pueden ser solidificadas (por ejemplo, por polimerización térmica, eliminación de la tensión de cizallamiento en partículas espacialmente divalentes, evaporación, coagulación, exposición a cationes o pH) en partículas bifásicas. En algunos casos, se puede fabricar una partícula bifásica utilizando la tecnología de protección y desprotección. Por ejemplo, una partícula de protección que tenga una química superficial deseada puede ser adsorbida sobre una partícula principal; la desprotección puede producir la superficie original de la partícula principal, que puede ser modificada químicamente.
En algunos casos, una partícula bifásica puede fabricarse usando otras tecnologías apropiadas. Por ejemplo, otros procedimientos apropiados pueden incluir, sin limitación, la emulsión interfacial, la formación en formas de bellota y de campana, el uso de campos magnéticos para dar forma y manipular las partículas durante la fabricación, y el depósito directo del recubrimiento superficial. En algunas realizaciones, la densidad diferencial puede lograrse utilizando organogeles con densidad variada. En algunas realizaciones, la porosidad diferencial puede lograrse utilizando sales en una superficie particular de la partícula. En algunas realizaciones, la solubilidad diferencial puede lograrse usando sales y/o usando dos o más polímeros diferentes (por ejemplo, PEG) que tengan diferentes solubilidades. En algunas realizaciones, se pueden conseguir varias colas utilizando componentes cerosos, modificando químicamente (por ejemplo, con reactivos de cadena larga) y/o magnetizando una partícula. Se muestran ejemplos de procedimientos para fabricar una partícula bifásica que encapsula uno o más productos biológicos descritos en el presente documento en la figura 1.
Una partícula (por ejemplo, un gel de alginato) que encapsula uno o más productos biológicos descritos en el presente documento puede utilizarse para transportar los productos biológicos encapsulados a un tejido diana (por ejemplo, el tejido cardíaco). Los mecanismos de transporte de una partícula descrita en el presente documento pueden incluir el uso de una partícula adhesiva, un resto de transporte dirigido, el tamaño de la partícula, la fuga capilar en el entorno de una lesión, la fuga capilar en el entorno de una neovasculogénesis oncogénica y/o la inyección directa (por ejemplo, a través de una aguja formadora de edema (por ejemplo, una aguja helicoidal de nitinol (níquel-titanio)) diseñada con orificios laterales graduados y sin orificio final (véase, por ejemplo, la figura 14)). La fuga capilar se refiere a cualquier medio físico, químico o farmacológico por el que se puede aumentar la porosidad o la fuga capilar para aumentar la administración de productos biológicos. Esto puede lograrse administrando un factor (por ejemplo, químico y/o farmacológico) que mejore la porosidad capilar. Como alternativa, la fuga capilar puede lograrse colocando una aguja de administración de productos biológicos que esté diseñada para imitar el edema en el tejido diana.
En algunos casos, puede conjugarse un resto adhesivo con una partícula descrita en el presente documento para retener una partícula adhesiva en el sitio de administración. Por ejemplo, una partícula adhesiva descrita en el presente documento puede administrarse (por ejemplo, inyectarse) directamente a un tejido diana (por ejemplo, el lecho del infarto cardíaco). Los ejemplos de restos adhesivos incluyen, sin limitación, el PEG, la carga positiva y el autoensamblaje dentro del tejido. En algunos casos, se puede conjugar un resto de transporte dirigido a una partícula descrita en el presente documento para dirigir el transporte de una partícula a un tejido diana (por ejemplo, el lecho del infarto cardíaco). Entre los ejemplos de restos de transporte dirigido se incluyen, sin limitación, antígenos, péptidos de transporte dirigido tisular, moléculas pequeñas y moléculas de la superficie celular. Por ejemplo, un anticuerpo puede utilizarse como transporte dirigido a las proteínas de la superficie de una célula. En algunos casos, el tamaño de la partícula puede utilizarse para dirigir el transporte de una partícula a un tejido diana (por ejemplo, el lecho del infarto cardíaco). Los capilares humanos miden de aproximadamente 5 pm a aproximadamente 10 pm de diámetro. Así, una partícula descrita en el presente documento que tenga un diámetro de aproximadamente 0,3 pm a aproximadamente 12 pm puede entrar en un capilar a través del torrente sanguíneo, pero estar limitada para salir del capilar, donde los productos biológicos y/o un polipéptido expresado pueden difundirse hacia el lecho capilar de un tejido (por ejemplo, corazón, dérmico, pulmón, tumor sólido, cerebro, hueso, ligamento, estructuras de tejido conectivo, riñón, hígado, tejido subcutáneo y vascular). Se muestran ejemplos de procedimientos para el transporte de uno o más productos biológicos utilizando una partícula bifásica descrita en el presente documento en la figura 2.
Una partícula (por ejemplo, un gel de alginato) que encapsula uno o más productos biológicos descritos en el presente documento puede utilizarse para transportar el producto biológico encapsulado a un tejido diana (por ejemplo, el lecho del infarto cardíaco) de manera temporal y/o espacialmente específica. Por ejemplo, una partícula bifásica que encapsula uno o más productos biológicos como se describe en el presente documento puede diseñarse para conferir una orientación específica de la partícula dentro de un vaso sanguíneo, para dirigir la partícula bifásica hacia un capilar y/o para conferir condiciones específicas de liberación de los productos biológicos encapsulados. En los casos en los que una partícula bifásica tiene porciones hidrofílicas y porciones hidrofóbicas en la superficie de la partícula, el transporte de uno o más productos biológicos encapsulados puede ser controlado por el disolvente presente en el sitio del transporte y/o el sitio diana. En los casos en los que una partícula bifásica tiene densidad diferencial, la densidad diferencial puede orientar la partícula en el flujo sanguíneo para dirigir a la partícula en una orientación apropiada para el transporte de uno o más productos biológicos encapsulados. Por ejemplo, un lado denso de una partícula bifásica puede conducir la partícula en la dirección del flujo sanguíneo dentro de un vaso sanguíneo. En los casos en que una partícula bifásica tiene un recubrimiento poroso, el transporte de uno o más productos biológicos encapsulados puede ser controlada por la porosidad diferencial. Por ejemplo, diferentes cantidades de porosidad pueden ayudar a transportar las partículas dentro del vaso sanguíneo y alterar el patrón de transporte. En los casos en que una partícula bifásica tiene solubilidad diferencial, la solubilidad diferencial puede orientar la partícula en el flujo sanguíneo para dirigir la partícula en una orientación apropiada para el transporte de uno o más productos biológicos encapsulados. En los casos en que una partícula bifásica tiene una cola que se extiende desde una porción de la superficie de la partícula, la cola puede orientar la partícula dentro de un vaso sanguíneo para dirigir la partícula hacia un capilar. Por ejemplo, una partícula bifásica puede diseñarse para tener una cola que oriente la partícula dentro de un vaso sanguíneo y dirija la partícula hacia un vaso sanguíneo (por ejemplo, un capilar) donde se pueda administrar el biológico encapsulado.
Productos biológicos
En el contexto de la presente invención como se define en las reivindicaciones anexas, el producto biológico es una molécula de ARN inhibidor dirigida a la IL-21, que disminuye la expresión del polipéptido IL-21 y, por lo tanto, mejora la función cardíaca. En la medida en que se describan otros productos biológicos en el presente documento, se incluyen únicamente con fines de referencia.
Cualquier producto biológico apropiado puede ser encapsulado dentro de una partícula descrita en el presente documento para su transporte a un tejido. Los ejemplos de productos biológicos que pueden encapsularse dentro de una partícula descrita en el presente documento incluyen, sin limitación, nucleótidos, polipéptidos, moléculas pequeñas, microvesículas, exosomas, vesículas extracelulares, células manipuladas o combinaciones de las mismas. En algunos casos, un producto biológico puede ser un producto biológico purificado (por ejemplo, microvesículas o exosomas purificados).
Si bien no forma parte de la invención, una partícula (por ejemplo, un gel de alginato) descrita en el presente documento puede utilizarse para encapsular uno o más polipéptidos. En algunos casos, una partícula descrita en el presente documento puede utilizarse para encapsular uno o más polipéptidos útiles para tratar a un mamífero que experimenta un episodio cardíaco adverso grave (por ejemplo, un infarto agudo de miocardio) y/o un mamífero en riesgo de experimentar un episodio cardíaco adverso grave (por ejemplo, pacientes que se sometieron a una ICP por IAMCEST). Por ejemplo, una partícula que encapsula un producto biológico descrito en el presente documento puede encapsular uno o más polipéptidos útiles para regenerar la función y/o el tejido cardíaco o un nucleótido que codifica dicho polipéptido. Los ejemplos de polipéptidos útiles para regenerar la función y/o el tejido cardíaco incluyen, sin limitación, anticuerpos que tienen la capacidad de neutralizar la actividad del factor de necrosis tumoral (TNF; por ejemplo, TNF-a), anticuerpos que tienen la capacidad de neutralizar la actividad del complejo-1 mitocondrial y agonistas de la resolvina-DI.
Una partícula (por ejemplo, un gel de alginato) descrita en el presente documento puede utilizarse para encapsular uno o más nucleótidos. Los ejemplos de nucleótidos que pueden encapsularse dentro de una partícula incluyen, sin limitación, ARNm, ARN inhibidores (por ejemplo, ARN antisentido, microARN (miARN), ARN de interferencia pequeño (ARNpi), ARN de horquilla corta (ARNhc) y agomiR), antagomiR, ARNm modificados, ARNm modificados por ingeniería de bucle (véase, por ejemplo, la figura 15), o sus combinaciones.
En algunos casos que no forman parte de la invención, una partícula (por ejemplo, un gel de alginato) descrita en el presente documento puede utilizarse para encapsular uno o más ARNm útiles para tratar a un mamífero que experimenta un episodio cardíaco adverso grave (por ejemplo, un infarto agudo de miocardio) y/o un mamífero en riesgo de experimentar un episodio cardíaco adverso grave (por ejemplo, pacientes que se sometieron a una ICP por IAMCEST). Por ejemplo, una partícula que encapsula un biológico descrito en el presente documento puede encapsular uno o más ARNm que codifican un polipéptido útil para regenerar la función y/o el tejido cardíaco y pueden ser encapsulados dentro de una partícula descrita en el presente documento. Entre los ejemplos de polipéptidos que pueden ser útiles para regenerar la función y/o el tejido cardíaco se incluyen, sin limitación, TNF-a, complejo mitocondrial-1, resolvina-DI, NAP-2, TGF-a, ErBb3, VEGF, IGF-1, FGF-2, PDGF, IL-2, CD19, CD20, CD80/86, los polipéptidos descritos en el documento WO 2015/034897o un anticuerpo dirigido contra cualquiera de los polipéptidos anteriores. Por ejemplo, un polipéptido humano Nap-2 puede tener la secuencia de aminoácidos indicada, por ejemplo, en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI), con el número de registro NP_002695.1 (número de IG 5473) y puede estar codificado por la secuencia de ácido nucleico indicada en el número de registro del NCBI n M_002704 (número de Ig 5473). En algunos casos, un polipéptido de TGF-a humano puede tener la secuencia de aminoácidos indicada en el número de registro del NCBI NP_003227.1 (número de GI 7039) y puede estar codificado por la secuencia de ácido nucleico indicada en el número de registro del NCBI NM_003236 (número de GI 7039). En algunos casos, un polipéptido ErBb3 humano puede tener la secuencia de aminoácidos indicada en el número de registro del NCBI Np_001005915.1 o NP_001973.2 (número de GI 2065) y puede estar codificado por la secuencia de ácido nucleico indicada en el número de registro del NCBI NM_00lOO5915.1 o NM_001982.3 (número de GI 2065). Por ejemplo, un VEGF humano puede tener los aminoácidos indicados en los números de acceso del NCBI a Aa 35789.1 (GI: 181971), CAA44447.1 (GI: 37659), AAA36804.1 (GI: 340215), o AAK95847.1 (GI: 15422109), y puede estar codificado por la secuencia de ácido nucleico indicada en el número de registro del NCBI AH001553.1 (GI: 340214). Por ejemplo, un IGF-1 humano puede tener la secuencia de aminoácidos indicada en el número de registro del NCBI CAA01954.1 (GI: 1247519) y puede estar codificado por la secuencia de ácido nucleico indicada en el número de registro del NCBI A29117.1 (GI: 1247518). Por ejemplo, un FGF-2 humano puede tener la secuencia de aminoácidos indicada en el número de registro del NCBI NP_001997.5 (GI: 153285461) y puede estar codificado por la secuencia de ácido nucleico indicada en el NCBI número de registro NM_002006.4 (GI: 153285460). Por ejemplo, un PDGF humano puede tener la secuencia de aminoácidos indicada en el número de registro del NCBI AAA60552.1 (GI: 338209) y puede estar codificado por la secuencia de ácido nucleico indicada en el número de registro del NCBI AH002986.1 (GI: 338208). Por ejemplo, una IL-2 humana puede tener la secuencia de aminoácidos indicada en el número de registro del NCBI AAB46883.1 (GI: 1836111) y puede estar codificada por la secuencia de ácido nucleico indicada en el número de registro del NCBI S77834.1 (GI: 999000). Por ejemplo, un CD19 humano puede tener la secuencia de aminoácidos indicada en el número de registro del NCBI AAA69966.1 (GI: 901823) y puede estar codificado por la secuencia de ácido nucleico indicada en el número de registro del NCBI M84371.1 (GI: 901822). Por ejemplo, un CD20 humano puede tener la secuencia de aminoácidos indicada en el número de registro del NCBI CBG76695.1 (GI: 285310157) y puede estar codificado por la secuencia de ácido nucleico indicada en el número de registro del NCBI AH003353.1 (GI: 1199857). Por ejemplo, un CD80 humano puede tener la secuencia de aminoácidos indicada en el número de registro del NCB<i>NP_005182.1 (GI: 4885123) y puede estar codificado por la secuencia de ácido nucleico indicada en el número de registro del NCBI NM_005191.3 (GI: 113722122), y un CD86 humano puede tener la secuencia de aminoácidos indicada en el número de registro del NCBI: 439839) y puede estar codificado por la secuencia de ácido nucleico indicada en el número de registro del NCBI CR541844.1 (GI: 49456642). Por ejemplo, un polipéptido que puede ser útil para regenerar la función y/o el tejido cardíaco puede ser un anticuerpo dirigido contra el TNF-a, el complejo mitocondrial-1 o la resolvina-D1. En algunos casos, una partícula que encapsula un producto biológico descrito en el presente documento puede encapsular uno o más ARNm que codifican NAP-2 y/o TGF-a.
En algunos casos, una partícula (por ejemplo, un gel de alginato) descrita en el presente documento puede utilizarse para encapsular uno o más ARN inhibidores útiles para tratar a un mamífero que experimenta un episodio cardíaco adverso grave (por ejemplo, un infarto agudo de miocardio) y/o un mamífero en riesgo de experimentar un episodio cardíaco adverso grave (por ejemplo, pacientes que se sometieron a una ICP por IAMCEST). Una partícula descrita en este documento encapsula uno o más ARN inhibidores que inhiben y/o reducen la expresión del polipéptido IL-21. También se proporciona, a modo de ejemplo, pero no forma parte de la invención, una partícula descrita en el presente documento puede encapsular uno o más ARN inhibitorios que inhiben y/o reducen la expresión de uno o más de los siguientes polipéptidos: eotaxina-3, catepsina-S, DK -1, folistatina, ST-2, GRO-a, IL-21, NOV, transferrina, TIMP-2, TNFaRI, TNFaRII, angiostatina, CCL25, ANGPTL4, MMP-3 y los polipéptidos descritos en el documento WO 2015/034897. Por ejemplo, un polipéptido humano de eotaxina-3 puede tener una secuencia de aminoácidos indicada, por ejemplo, en el número de registro del NCBI: NP_006063.1 (número de GI 10344) y puede estar codificado por la secuencia de ácido nucleico indicada en el número de registro del NCBI NM_006072 (número de GI 10344). En algunos casos, una catepsina-S humana puede tener la secuencia de aminoácidos indicada en el número de registro del NCBI NP_004070.3 (número de GI 1520) y puede estar codificada por la secuencia de ácido nucleico indicada en el número de registro del NCBI NM_004079.4 (número de GI 1520). En algunos casos, un DK-1 humano puede tener la secuencia de aminoácidos indicada en el número de registro del NCBI NP_036374.1 (número de GI 22943) y puede estar codificado por la secuencia de ácido nucleico indicada en el número de registro del NCBI NM_012242 (número de GI 22943). En algunos casos, una folistatina humana puede tener entonces la secuencia de aminoácidos indicada en el número de registro del NCBI NP_037541.1 (número de GI 10468) y puede estar codificada por la secuencia de ácido nucleico indicada en el número de registro del NCBI NM_013409.2 (número de GI 10468). En algunos casos, un ST-2 humano puede tener la secuencia de aminoácidos indicada en el número de registro del NCBI BAA02233 (número de GI 6761) y puede estar codificado por la secuencia de ácido nucleico indicada en el número de registro del NCBI D12763.1 (número de GI 6761). En algunos casos, un polipéptido de GRO-a humano puede tener la secuencia de aminoácidos indicada en el número de registro del NCBI NP_001502.1 (número de GI 2919) y puede estar codificado por la secuencia de ácido nucleico indicada en el número de registro del NCBI NM_001511 (número de GI 2919). En algunos casos, una IL-21 humana puede tener la secuencia de aminoácidos indicada en el número de registro del NCBI NP_068575.1 (número de IG 59067) y puede estar codificada por la secuencia de ácido nucleico indicada en el número de registro del NCBI NM_021803 (número de IG 59067). En algunos casos, un polipéptido de NOV humano puede tener la secuencia de aminoácidos indicada en el número de registro del NCBI NP_002505.1 (número de GI 4856) y puede estar codificado por la secuencia de ácido nucleico indicada en el número de registro del NCBI NM_002514 (número de GI 4856). En algunos casos, un polipéptido de transferrina humana puede tener la secuencia de aminoácidos indicada en el número de registro del NCBI NP_001054.1 (número de IG 7018) y puede estar codificado por la secuencia de ácido nucleico indicada en el número de registro del NCBI NM_001063.3 (número de IG 7018). En algunos casos, un polipéptido de TIMP-2 humano puede tener la secuencia de aminoácidos indicada en el número de registro del NCBi NP_003246.1 (número de IG 7077) y puede estar codificado por la secuencia de ácido nucleico indicada en el número de registro del NCBI NM_003255.4 (número de IG 7077). En algunos casos, un polipéptido de TNFaRI humano puede tener la secuencia de aminoácidos indicada en el número de registro del NCBI NP_001056.1 (número de GI 7132) y puede estar codificado por la secuencia de ácido nucleico indicada en el número de registro del NCBI NM_001065 (número de GI 7132). En algunos casos, un polipéptido de TNFaRII humano puede tener la secuencia de aminoácidos indicada en el número de registro del NCBI NP_001057.1 (número de IG 7133) y puede estar codificado por la secuencia de ácido nucleico indicada en el número de registro del NCBI NM_001066 (número de IG 7133). En algunos casos, un polipéptido de angiostatina humana puede tener la secuencia de aminoácidos indicada en el número de registro del NCBI NP_000292 (número GI 5340) y puede estar codificado por la secuencia de ácido nucleico indicada en el número de registro del NCBI NM_000301 (número GI 5340). En algunos casos, un polipéptido de CCL25 humano puede tener la secuencia de aminoácidos indicada en el número de registro del NCBI NP_005615.2 (número de IG 6370) y puede estar codificado por la secuencia de ácido nucleico indicada en el número de registro del NCBI NM_005624 (número de IG 6370). En algunos casos, un polipéptido ANGPTL4 humano puede tener la secuencia de aminoácidos indicada en el número de registro del NCBI NP_001034756.1 o NP_647475.1 (número de GI 51129) y puede estar codificado por la secuencia de ácido nucleico indicada en el número de registro del NCBI NM_001039667.1 o NM_139314.1 (número de GI 51129). En algunos casos, un polipéptido de MMP-3 humano puede tener la secuencia de aminoácidos indicada en el número de registro del NCBI NP_002413.1 (número de IG 4314) y puede estar codificado por la secuencia de ácido nucleico indicada en el número de registro del NCBI NM_002422 (número de IG 4314).
En algunos casos que no forman parte de la invención, una partícula (por ejemplo, un gel de alginato) descrita en el presente documento puede utilizarse para encapsular uno o más nucleótidos que modulan (por ejemplo, imitan o inhiben) los microARN implicados en la potencia regenerativa cardíaca. Por ejemplo, una partícula descrita en el presente documento puede utilizarse para encapsular uno o más agomiR que imitan uno o más miARN para aumentar la potencia regenerativa cardíaca. Por ejemplo, una partícula descrita en el presente documento puede utilizarse para encapsular uno o más antagomiR que inhiben uno o más miARN para aumentar la potencia regenerativa cardíaca. Entre los ejemplos de miARN implicados en la potencia regenerativa cardíaca se incluyen, sin limitación, miR-127, miR-708, miR-22-3p, miR-411, miR-27a, miR-29a, miR-148a, miR-199a, miR-143, miR-21, miR-23a-5p, miR-23a, miR-146b-5p, miR-146b, miR-146b-3p, miR-2682-3p, miR-2682, miR-4443, miR-4443, miR-4521, miR-4521, miR-2682-5p,miR-2682, miR-137.miR-137, miR-549.miR-549, miR-335-3p, miR-335, miR-181c-5p, miR-181c, miR-224-5p, miR-224, miR-3928, miR-3928, miR-324-5p, miR-324, miR-548h-5p, miR-548h-1, miR-548h-5p, miR-548h-2, miR-548h-5p, miR-548h-3, miR-548h-5p, miR-548h-4, miR-548h-5p, miR-548h-5, miR-4725-3p, miR-4725, miR-92a-3p, miR-92a-1, miR-92a-3p, miR-92a-2, miR-134, miR-134, miR-432-5p, miR-432, miR-651, miR-651, miR-181a-5p, miR-181a-1, miR-181a-5p, miR-181a-2, miR-27a-5p, miR-27a, miR-3940-3p, miR-3940, miR-3129-3p, miR-3129, miR-146b-3p, miR-146b, miR-940, miR-940, miR-484, miR-484, miR-193b-3p, miR-193b, miR-651, miR-651, miR-15b-3p, miR-15b, miR-576-5p, miR-576, miR-377-5p, miR-377, miR-1306-5p, miR-1306, miR-138-5p, miR-138-1, miR-337-5p, miR-337, miR-135b-5p, miR-135b, miR-16-2-3p, miR-16-2, miR-376c.miR-376c, miR-136-5p, miR-136, let-7b-5p, let-7b, miR-377-3p, miR-377, miR-1273g-3p, miR-1273g, miR-34c-3p, miR-34c, miR-485-5p, miR-485, miR-370.miR-370, let-7f-1-3p, let-7f-1, miR-3679-5p, miR-3679, miR-20a-5p, miR-20a, miR-585.miR-585, miR-3934, miR-3934, miR-127-3p, miR-127, miR-424-3p, miR-424, miR-24-2-5p, miR-24-2, miR-130b-5p, miR-130b, miR-138-5p, miR-138-2, miR-769-3p, miR-769, miR-1306-3p, miR-1306, miR-625-3p, miR-625, miR-193a-3p, miR-193a, miR-664-5p, miR-664, miR-5096.miR-5096, let-7a-3p, let-7a-1, let-7a-3p, let-7a-3, miR-15b-5p, miR-15b, miR-18a-5p, miR-18a, let-7e-3p, let-7e, miR-1287.miR-1287, miR-181c-3p, miR-181c, miR-3653, miR-3653, miR-15b-5p, miR-15b, miR-1, miR-1-1, miR-106a-5p, miR-106a, miR-3909.miR-3909, miR-1294.miR-1294, miR-1278, miR-1278, miR-629-3p, miR-629, miR-340-3p, miR-340, miR-200c-3p, miR-200c, miR-22-3p, miR-22, miR-128, miR-128-2, miR-382-5p, miR-382, miR-671-5p, miR-671, miR-27b-5p, miR-27b, miR-335-5p, miR-335, miR-26a-2-3p, miR-26a-2, miR-376b.miR-376b, miR-378a-5p, miR-378a, miR-1255a, miR-1255a, miR-491-5p, miR-491, miR-590-3p, miR-590, miR-32-3p, miR-32, miR-766-3p, miR-766, miR-30c-2-3p, miR-30c-2, miR-128.miR-128-1, miR-365b-5p, miR-365b, miR-132-5p, miR-132, miR-151b.miR-151b, miR-654-5p, miR-654, miR-374b-5p, miR-374b, miR-376a-3p, miR-376a-1, miR-376a-3p, miR-376a-2, miR-149-5p, miR-149, miR-4792.miR-4792, miR-1.miR-1-2, miR-195-3p, miR-195, miR-23b-3p, miR-23b, miR-127-5p, miR-127, miR-574-5p, miR-574, miR-454-3p, miR-454, miR-146a-5p, miR-146a, miR-7-1-3p, miR-7-1, miR-326.miR-326, miR-301a-5p, miR-301a, miR-3173-5p, miR-3173, miR-450a-5p, miR-450a-1, miR-7-5p, miR-7-1, miR-7-5p, miR-7-3, miR-450a-5p, miR-450a-2, miR-1291, miR-1291, miR-7-5p, miR-7-2, y miR-17-5p, miR-17.
Los nucleótidos (por ejemplo, ARN) encapsulados dentro de una partícula descrita en el presente documento pueden ser nucleótidos modificados. En algunos casos, los nucleótidos pueden ser modificados para aumentar su estabilidad. Por ejemplo, uno o más restos uracilo de un ARN descrito en el presente documento pueden ser sustituidos por un resto uracilo modificado. Los ejemplos de restos uracilo modificados incluyen, sin limitación, la pseudouridina (^), la dihidrouridina (D) y el didesoxiuracilo. Un ARNm puede ser modificado para formar un ARNm modificado microencapsulado biofuncionalizado (M3ARN), que se describe con más detalle a continuación.
Una partícula (por ejemplo, un gel de alginato) descrita en el presente documento puede utilizarse para encapsular otras moléculas además de un producto biológico o en lugar de este. En algunos casos, una partícula (por ejemplo, un gel de alginato) descrita en el presente documento puede utilizarse para encapsular una o más moléculas pequeñas. Por ejemplo, una partícula descrita en el presente documento puede utilizarse para encapsular una o más moléculas pequeñas útiles para tratar a un mamífero que experimenta un episodio cardíaco adverso grave (por ejemplo, un infarto agudo de miocardio) y/o un mamífero en riesgo de experimentar un episodio cardíaco adverso grave (por ejemplo, pacientes que se sometieron a una ICP por IAMCEST). Por ejemplo, una partícula descrita en el presente documento puede encapsular una o más moléculas pequeñas útiles para regenerar la función y/o el tejido cardíaco. Los ejemplos de moléculas pequeñas útiles para regenerar la función y/o el tejido cardíaco incluyen, sin limitación, lipopolisacáridos, antagonistas del factor de necrosis tumoral (por ejemplo, TNF-a), antagonistas del complejo mitocondrial-1 y agonistas de la resolvinaD1. En algunos casos, una partícula (por ejemplo, un gel de alginato) descrita en el presente documento puede utilizarse para encapsular una o más microvesículas y/o exosomas. En algunos casos, una partícula descrita en el presente documento puede utilizarse para encapsular una o más microvesículas y/o exosomas útiles para tratara un mamífero que experimenta un episodio cardíaco adverso grave (porejemplo, un infarto de miocardio agudo) y/o un mamífero en riesgo de experimentar un episodio cardíaco adverso grave (por ejemplo, pacientes que se sometieron a una ICP por IAMCEST). Por ejemplo, una partícula descrita en el presente documento puede encapsular una o más microvesículas y/o exosomas útiles para regenerar la función y/o el tejido cardíaco. Los ejemplos de microvesículas y exosomas útiles para regenerar la función y/o el tejido cardíaco incluyen, sin limitación, microvesículas y exosomas aislados de plasma, productos derivados de la sangre y células madre cultivadas.
Una partícula (por ejemplo, un gel de alginato) descrita en el presente documento también puede incluir uno o más marcadores detectables. Un marcador detectable puede incorporarse a la partícula o encapsularse dentro de ella. Los ejemplos de moléculas detectables incluyen, sin limitación, marcadores bioluminiscentes (por ejemplo, luciferasa), moléculas fluorescentes (por ejemplo, GFP y mCherry) y moléculas de radionúclidos. En algunos casos, un ARNm que expresa un marcador detectable se encapsula dentro de una partícula de tal manera que el transporte entrega temporal y/o espacial del ARN encapsulado puede ser controlado en un mamífero.
Una partícula (por ejemplo, un gel de alginato) descrita en el presente documento también puede incluir una o más moléculas terapéuticas adicionales. Una molécula terapéutica puede conjugarse con una partícula, estar incrustada dentro de una partícula, encapsularse dentro de una partícula, o cualquier combinación de estas. Los ejemplos de agentes terapéuticos incluyen, sin limitación, células madre (por ejemplo, células madre mesenquimales, células madre cardíacas y médula ósea), productos farmacéuticos (por ejemplo, estatinas, analgésicos, productos quimioterapéuticos, betabloqueantes, antibióticos) y nutrientes (por ejemplo, carbohidratos, grasas, vitaminas y minerales).
En algunos casos, una partícula (por ejemplo, un gel de alginato) que encapsula uno o más productos biológicos descritos en el presente documento puede utilizarse para encapsular uno o más nucleótidos útiles para tratar otras enfermedades y/o afecciones.
ARNm modificado microencapsulado (M3ARN)
El M3ARN es una plataforma exclusiva para inducir la rápida expresión de genes codificados en una amplia gama de tejidos. En el contexto de la plataforma M3<a>R<n>, M3A<r>N se refiere al ARNm microencapsulado modificado; el ARN modificado desnudo (sin encapsular) se denomina M2ARN. El M3ARN es muy adecuado para generar anticuerpos contra nuevas amenazas infecciosas. Esta plataforma tecnológica lleva intrínseca la capacidad de ampliarse rápidamente en un corto plazo de tiempo y de transportar simultáneamente múltiples construcciones genéticas. Debido al uso de ARNm como producto biológico conductor dentro de esta plataforma, no hay riesgo de integración o mutación con la terapia. Además, a diferencia del AAV y de otras tecnologías de transporte de genes virales, la plataforma M3<a>R<n>evita el riesgo de reacción inmunitaria al sistema de transporte, lo que permite su uso repetido con diferentes construcciones. El M3ARN puede evolucionar fácilmente hasta convertirse en un sistema de administración de M3ARN-Ig que permita una expresión eficaz, rápida y sostenida de anticuerpos contra supuestos patógenos tras su administración.
El M3ARN ha sido probado para transportar varias construcciones de genes indicadores y terapéuticos tanto en modelosin vitrocomoin vivo.Además, el M3ARN puede adaptarse a una capacidad terapéutica de múltiples genes. El M3ARN puede liberar simultáneamente, por ejemplo, varios genes cardiorregenerativos en el marco de un infarto agudo de miocardio. Un aspecto específico de la transformación de M3ARN hacia una plataforma de M3ARN-Ig es la demostración del transporte simultáneo de genes indicadores que emulan el tamaño de las cadenas pesadas y ligeras de IgG en forma de ARNm de GFP/mCherry (720 pb) y ARNm de luciferasa de luciérnaga (FLuc) (1653 pb). El sistema se ha ampliado a una plataforma de administración de tres genesin vivo,demostrando una penetración similar para todos los genes indicadores probados. El ARN mensajero modificado microencapsulado consigue una expresión de proteínas rápida y robusta en múltiples líneas celulares y células primarias (fibroblastos dérmicos humanos, fibroblastos cardíacos humanos, células HEK293, cardiomiocitos HL-1, células HUVAC, cardiomiocitos de rata neonatal y células de músculo esquelético de rata neonatal). Además, la microencapsulación de M3ARN utilizando, por ejemplo, nanopartículas cargadas PEGiladas, induce una rápida (en dos horas) expresiónin vivotras la inyección directa en múltiples sistemas de órganos (incluyendo el músculo esquelético y cardíaco) en modelos murinos y porcinos.
La cinética del M2ARN (ARNm de mCherry modificado) transfectado en células HEK293 (riñón embrionario humano) dio lugar a la expresión de la proteína mCherry en tan solo dos horas. La cuantificación diaria de la expresión produjo imágenes de fluorescencia para las células HEK293 en los periodos de tiempo indicados que se muestran en la figura 16, en donde aparece una expresión proteica rápida, robusta y sostenida tras la transfección del ARNm durante hasta seis días. La cuantificación de la intensidad de la fluorescencia dentro de estas células (>10 campos de células/periodo de tiempo) documentó el aumento de la intensidad de la fluorescencia en las 24 horas iniciales, que se mantuvo hasta los seis días. Utilizando la citometría de flujo como criterio de referencia para la cuantificación de la eficacia de la transfección, se realizó un análisis de los niveles de expresión de la proteína mCherry a las cuatro horas y a las 24 horas después de la transfección. Los gráficos de dispersión, con la intensidad de fluorescencia en el eje abscisas y la señal de dispersión lateral en el eje ordenadas, revelaron la constante población bimodal tras la transfección (figura 16), y la transición revela que el número de células transfectadas observadas a las cuatro horas y a las 24 horas documenta una eficacia de transfección de aproximadamente el 95%.
La plataforma M3ARN es compatible con fenotipos celulares primarios "difíciles de transfectar" como, por ejemplo, los cardiomiocitos de rata neonatal. Se aislaron cardiomiocitos primarios neonatales y se cultivaron en placas para obtener un patrón de latido sincrónico de los cardiomiocitos en las placas. Los cardiomiocitos se transfectaron con M3ARN de mCherry y se adquirieron imágenes de fluorescencia a partir de las cuatro horas posteriores a la transfección durante seis días. En la figura 17A se muestran imágenes representativas de varios periodos de tiempo 17A, que indican una expresión rápida, robusta y sostenida de la proteína en los cardiomiocitos primarios. La cuantificación de la intensidad de la fluorescencia dentro de estos cardiomiocitos primarios reveló que la máxima expresión se produjo a las 24 horas y se mantuvo, pero disminuyendo, hasta seis días (figura 17B). La eficacia de la transfección en estos cardiomiocitos primarios se evaluó además mediante citometría de flujo a las cuatro y a las 24 horas transfectando las células con ARNm de mCherry, y el análisis del diagrama de dispersión demostró una eficacia de transfección del 43 % a las 24 horas (figura 17C). La transfección de cardiomiocitos primarios la plataforma M3ARN no alteró las características estructurales o funcionales de los cardiomiocitos.
La plataforma M3ARN también es compatible con la administración intramuscular, proporcionando una alta eficacia de transfección comparable con los resultados obtenidos con cultivos primarios de cardiomiocitos (figura 19). Los datos presentados en la figura 19 emplean un sistema de cultivo de músculo esquelético humano primario que implica el aislamiento a gran escala de células satélite a partir de tejido de músculo esquelético humano adquirido quirúrgicamente. Dentro de unas condiciones de cultivo definidas y sin sustancias extrañas, se utiliza tejido de donante de músculo esquelético para obtener poblaciones progenitoras de satélites de músculo esquelético. Se realiza un perfil de micoplasma/esterilidad de las células durante un periodo de cultivo de tres semanas y se crioconservan. Antes de obtener los bancos de células maestras, cada lote de células satélite crioconservadas se somete a una evaluación de garantía de calidad en la que se comprueba la potencia miogénica mediante inmunohistoquímica (figura 18), perfiles de expresión genética y visualización microscópica automática de la formación de miotubos (figura 18). Una vez confirmada la potencia y la esterilidad, cada lote se expande en tres pases (P3) para generar un banco de células maestras de 200 millones de células congeladas en partes alícuotas de 1 millón de células. Los lotes del banco de células maestras se someten a una garantía de calidad y a una evaluación de la esterilidad repetidas antes de su uso experimental. Las células P3 pueden ser inducidas para que generan células primarias de músculo esquelético humano en 2-3 días mediante el cultivo en un medio definido (figura 18).
La microencapsulación de ARN mensajero modificado dentro de un sistema de micropartículas basado en cationes PEGilados proporciona un ejemplo de plataforma mediante la cual transportar M3in vivo.Se utilizaron genes indicadores que incluían ARNm de mCherry (720 pb), ARNm de GFP (720 pb) y ARNm de luciferasa de luciérnaga (FLuc) (1653 pb) en el entornoin vivo.La FLuc aportó una dimensión adicional al análisis, ya que la cinética de expresión de la proteína en animales vivos pudo documentarse de forma prospectiva. El uso de la luciferina para excitar las zonas de transfección proporcionó una estrategia exacta para descifrar la localización de la señal del M3ARN tras el transporte. Tras la optimización por vía subcutánea, la plataforma M3ARN se probó en una amplia gama de tejidos, incluyendo la administración intrahepática, intrarrenal, intraocular, intramuscular e intramiocárdica (figura 20). En todos los casos, se pudo demostrar la expresión de FLuc en la zona inyectada en las dos horas siguientes a la administración y se mantuvo durante más de 72 horas.
Dentro del corazón, se cuantificó la rápida expresión de FLuc tras las inyecciones miocárdicas directas de M3ARN de FLuc en el ventrículo izquierdo anterior en diferentes momentos, revelando una rápida inducción de la expresión génica sostenida durante un periodo de observación de tres días (figura 21). Para demostrar, como estudio demostrativo preliminar, que la inducción de genes múltiples es factible, se microencapsularon simultáneamente tres construcciones modelo diferentes (mCherry, GFP y FLuc) y se administraron mediante una única inyección miocárdica en ratones frente a controles de M3ARN simulados. La expresión de FLuc se confirmó a las 24 horas dentro del corazón utilizando el ensayo de bioluminiscencia en el sistema de formación de imágenesin vivoIVIS Spectrum (figura 20, corazón). A continuación, se sacrificaron los ratones y se extirpó el corazón para evaluar la expresión mediante inmunohistoquímica en secciones histológicas que confirmaron el solapamiento de la expresión de las proteínas GFP, mCherry y FLuc en los ratones inyectados con el gen combinado-M3ARN (paneles inferiores) en comparación con los ratones con M3ARNm simulado (paneles superiores) (figura 22).
La tecnología M3ARN puede evolucionar para lograr una plataforma de transporte para la creación rápida de productos terapéuticos altamente potentes. Por ejemplo, el M3ARN biofuncionalizado puede formar la base de un sistema de transporte de M3ARN-Ig (MIDS) capaz de integrar rápidamente nuevas secuencias genéticas para dirigirse a nuevos patógenos (por ejemplo, patógenos virales como, por ejemplo, el virus del Zika y el H7N9).
La compatibilidad de la plataforma M3ARN para la longitud del gen de la cadena pesada y ligera de IgG ha sido confirmada con el uso concomitante de FLuc y del gen indicador fluorescente, mostrando la inducción simultánea de hasta tres genes dentro del tejido muscular cardíacoin vivo.La expresión rápida y sostenida de los genes codificados en el vector de M3ARN-Ig puede mejorarse mediante el diseño especializado de las UTR 5' y 3' de la molécula de ARN. El diseño del vector de M3ARN-Ig puede implicar tener en cuenta uno o más de los siguientes aspectos (1) decidir entre unir los genes de la cadena pesada y ligera en un único transcrito con una secuencia de omisión ribosómica P2A o sintetizarlos como transcritos separados; (2) la longitud/introducción de la cola 3'poli(A); (3) el tipo de caperuza de 5'm7G; (4) la selección de nucleótidos modificados; (5) la modificación de IRES y pseudonudo de la UTR 5' y 3', respectivamente, para disminuir la tasa de degradación; y/o (6) la microencapsulación mediada por nanopartículas para identificar una estequiometría apropiada para el transportein vivoen el músculo esquelético.
Las cadenas pesadas y ligeras pueden sintetizarse en dos transcritos separadas. Esta estrategia permite un rápido trabajo en paralelo para incorporar los dominios de unión al antígeno VL/VH dentro de un sitio de multiclonación (figura 23). En concreto, el uso de dos transcritos en lugar de uno permite clonar los moldes de ADN separados al mismo tiempo en lugar de hacerlo secuencialmente, con lo que acelera el desarrollo de nuevas realizaciones. Por supuesto, si se desea, se puede diseñar el vector de forma que la cadena pesada y la cadena ligera se sinteticen a partir de un único transcrito.
Los ARNm sintetizados con una cola de poli(A) de 300 o más nucleótidos tienen una semivida significativamente más larga y propiedades de traducción superiores. Por lo tanto, el vector puede incluir un promotor adecuado (por ejemplo, T7), las regiones codificantes de la cadena pesada y de la cadena ligera, y un tramo de poli(T) de 300 nucleótidos que servirá como molde del esqueleto para la transcripción del ARNm. Los vectores pueden diseñarse en dos versiones distintas para adaptarse a las grandes variaciones en las regiones C de los nuevos anticuerpos identificados. El diseño inicial puede suponer una región C invariable en los posibles anticuerpos identificados. Por consiguiente, el sitio de clonación múltiple en los vectores de la cadena pesada y de la cadena ligera puede permitir la rápida introducción en paralelo de la secuencia V en esta región y el inicio del proceso de fabricación del M3ARN-Ig. Por el contrario, en ciertos casos, un esqueleto de Ig variado puede sugerir un ajuste también en las regiones C de los sistemas de vectores paralelos. Por ello, para garantizar la capacidad de respuesta rápida, se pueden diseñar vectores adicionales con sitios de clonación múltiple que permitan la inserción de la totalidad de las cadenas pesadas y ligeras.
El CAP de ARNm media en la eficacia de la expresión del producto génico. El M3ARN-Ig puede generarse usando CAP-1 como una estrategia para evitar cualquier respuesta inmunitaria innata que pueda ser mediada usando CAP-0. Un diseño que incluya CAP-1 puede incluir modificaciones postranscripcionales utilizando un sistema de caperuza de Vaccinia, seguido de una O-metiltransferasa CAP 2'. Sin embargo, una estrategia dependiente de CAP puede implicar la interacción de la proteína de unión a poli(A) (PABP), que puede añadir una longitud significativa a la construcción y, por tanto, limitar la creatividad en el sitio 3' para limitar aún más la degradación del ARN (figura 24, arriba). Así, el sistema M3ARN-Ig puede incluir un sitio de entrada al ribosoma integral (IRES) dentro de la 5'UTR, eliminando la necesidad de la interacción de PABP (figura 24, abajo).
Un sistema de M3ARN puede limitar los efectos secundarios indeseables de la transfección de ARNm y/o ralentizar la degradación del M3ARN introduciendo nucleótidos modificados como, por ejemplo, 5'-metilcitidina en lugar de citosina o pseudouridina (V), dihidrouridina (D), o didesoxiuracilo en lugar de uracilo. Los NTP modificados son abundantes y están disponibles como material de partida de GMP y pueden introducirse rápidamente mediante técnicas convencionales de síntesis de ARN, lo que proporciona una ventaja molecular y trasduccional significativa tras su administración.
Como alternativa, otra estrategia para extender la vida de un ARNm en el citosol implica interferir con la vía de descomposición mediada por sinsentido. En la vía canónica, cuando el complejo ribosómico llega a la región de fin gag, las subunidades 30s/50s se desprenden del ARNm, lo que hace que la UTR 3' del ARNm sea muy susceptible a una descomposición mediada por UPF-1 (figura 25, canónico). Diferentes virus han desarrollado estrategias para ralentizar este proceso, incluyendo, por ejemplo, la formación de un pseudonudo 3' tras el sitio de fin gag o la introducción de un elemento de estabilidad del ARN en el 3'UTR. El pseudonudo 3' media en una lectura de desplazamiento de marco por el complejo ribosómico, inactivando así los complejos UPF-1 de la 3'UTR, lo que resulta en la estabilidad del ARNm (figura 25, pseudonudo). El elemento de estabilidad del ARN, por otro lado, sirve como señuelo, bloqueando directamente la interacción del UPF-1 con la 3'UTR, y estabilizando así el ARNm frente a la descomposición (figura 25, elemento de estabilidad del ARN). Las estructuras de horquilla de poli(A) también pueden aumentar la estabilidad del ARNm al inhibir la degradación del ARNm mediada por los exosomas (figura 25, horquilla).
Nanopartículas para el transporte de ARNm encapsulado o no encapsulado
El diseño de vectores de transporte de genes eficaces que posean altas eficacias de transfección y baja citotoxicidad es un desafío para el transporte de ARNm modificados (por ejemplo, M2ARN, M3ARN o M3ARN-Ig) a las células, tejidos u órganos. Las nanopartículas representan un ejemplo de modelo de estrategia sin vectores virales para transportar ARNm modificados. Las nanopartículas poseen una notable flexibilidad para el transporte de genes, incluyendo el transporte dirigido a tejidos, la protección del ARNm frente a la degradación de las nucleasas, la mejora en la estabilidad del M2ARN a través de interacciones iónicas entre el ARNm cargado negativamente y la superficie de la nanopartícula cargada positivamente, y el aumento de la eficacia de la transformación por seguridad. Las nanopartículas son generalmente aceptadas para aplicaciones terapéuticas. En primer lugar, las nanopartículas existen en los mismos dominios de tamaño que las proteínas. En segundo lugar, las nanopartículas tienen grandes superficies específicas que pueden modificarse fácilmente utilizando, por ejemplo, la PEGilación (para aumentar la semivida en la circulación sanguínea), o un poloxámero, una poloxamina o quitosano para lograr una unión y un suministro eficaces. En tercer lugar, las nanopartículas modificadas pueden tener propiedades de absorción y liberación, tamaño de partícula y/o características de superficie controlables.
Para producir nanopartículas se utiliza una amplia variedad de materiales orgánicos (basados en lípidos), inorgánicos o híbridos, que se han analizado en detalle anteriormente. Las nanopartículas de polímeros catiónicos pueden utilizarse para microencapsular ARN mensajero modificado. Los polímeros catiónicos tienen grupos cargados positivamente en su esqueleto para interactuar con moléculas de ARNm-Ig cargadas negativamente para formar complejos neutralizados de tamaño nanométrico.
Se ha sugerido que las nanopartículas metálicas múltiples causan una citotoxicidad mínima. Por ejemplo, las nanopartículas de hierro, plata, oro o cobre pueden utilizarse, solas o en combinación con otras nanopartículas y/u otras tecnologías de transporte, para transportar moléculas de ARNm-Ig.
Las nanopartículas pueden ser modificadas en su superficie para aumentar la eficacia de las moléculas de ARN modificadas, ya sean M2ARN (o M2ARN-Ig) o M3<a>R<n>(o M3ARN-Ig). Las nanopartículas pueden modificarse para introducir, por ejemplo, un biopolímero o una PEGilación para aumentar la semivida en la circulación sanguínea. En consecuencia, para el transporte de M3ARN-Ig al músculo esquelético, la superficie de la nanopartícula puede modificarse para incluir un biopolímero. Los biopolímeros adecuados son, por ejemplo, el colágeno, la elastina, la fibronectina, el quitosano, el dextrano, etc. Como resultado, la superficie de la nanopartícula puede modificarse con quitosano. El quitosano presenta una naturaleza polielectrolítica catiónica y, por tanto, proporciona una fuerte interacción electrostática con las moléculas de ADN o ARN cargadas negativamente. Además, el quitosano porta grupos amino primarios que lo convierten en un biopolímero biodegradable, biocompatible y no tóxico que proporciona protección frente a la degradación por DNasa o RNasa.
Alternativamente, la superficie de las nanopartículas puede ser modificada por PEGilación. La técnica de unir covalentemente el polietilenglicol (PEG) a una molécula determinada, en este caso, una nanopartícula, es un procedimiento bien establecido en los sistemas de transporte de fármacos dirigidos. La PEGilación implica la polimerización de múltiples monometoxiPEG (mPEG) que se representan como CH3O-(CH2-CH2O)n-CH2-CH2-OH. La introducción de moléculas de PEG aumenta significativamente la semivida de una nanopartícula debido a su mayor hidrofobicidad, reduce la tasa de filtración glomerular y/o disminuye la inmunogenicidad debido al enmascaramiento de los sitios antigénicos al formar un escudo hidrofílico protector. Las modificaciones adecuadas incluyen la modificación de la superficie de las nanopartículas para que posean 3000-4000 moléculas de PEG, lo que proporciona un entorno adecuado para la unión física de las moléculas de ADN o ARN.
En conjunto, la combinación de nanopartículas con PEG, quitosano y M2ARN genera la plataforma M3ARN (figura 26). En un ejemplo de referencia ilustrado en la figura 26, el ARNm modificado (M2ARN) es encapsulado por la micropartícula recubierta de PEG y quitosano, ya que el ARN se une indirectamente a la micropartícula mediante la interacción con la modificación de la superficie del quitosano.
Más allá del diseño molecular, otro desafío que enfrenta el transporte de productos biológicos en el tejido muscular es la barrera física para la transferencia eficaz de la carga biológica debido, al menos en parte, a la naturaleza densa y contráctil del tejido muscular. Mediante el modelado cuatridimensional del transporte en el tejido utilizando la Ley de Darcy, se ha identificado una limitación significativa en un nivel inherente al diseño de la aguja. Al tener una aguja recta con un orificio final, la administración de productos biológicos crea una bolsa densa de material dentro del tejido muscular esquelético que imita un absceso. La bolsa densa reduce drásticamente la captación tisular local de los productos biológicos y elimina preferentemente el producto biológico a través de la acción linfática y capilar para aliviar la presión. Por el contrario, un diseño de aguja ajustado, mostrado en la figura 14, sin un orificio final y utilizando un patrón de conducto sin cizallamiento con la aguja de suministro permite inducir un efecto de edema en lugar de un absceso, produciendo un grado mucho mayor de adaptación del tejido y una exposición local prolongada del producto al tejido. De este modo, aunque la dosis del producto biológico no se incrementa, la penetración de la terapia aumenta una media de 4-5 veces.
Procedimientos de utilización
Este documento también proporciona procedimientos de uso de una partícula (por ejemplo, un gel de alginato) que encapsula una o más moléculas (por ejemplo, productos biológicos) descritas en el presente documento. En algunos casos, un mamífero en riesgo de experimentar un episodio cardíaco adverso grave (por ejemplo, un mamífero identificado como probable de experimentar un episodio cardíaco adverso grave como se describe en el presente documento) puede ser tratado mediante la administración de una partícula que encapsula uno o más productos biológicos descritos en el presente documento. Por ejemplo, un mamífero en riesgo de experimentar un episodio cardíaco adverso grave puede sertratado administrando una partícula que encapsula ARNm que codifica NAP-2, TGF-a, ErBb3, VEGF, IGF-1 FGF-2, PDGF, IL-2, CD19, CD20, y/o CD80/86 para aumentar el nivel de expresión del polipéptido NAP-2, TGF-a, ErBb3, VEGF, IGF-1, FGF-2, PDGF, IL-2, CD19, CD20, y/o CD80/86. El aumento del nivel de uno o más de estos polipéptidos puede utilizarse para reducir el tamaño de la cicatriz y la remodelación del tejido y para mejorar la función cardíaca. Por ejemplo, un mamífero con riesgo de experimentar un episodio cardíaco adverso grave puede sertratado administrando una partícula que encapsula un ARN inhibidor dirigido a la eotaxina-3, catepsina-S, DK-1, folistatina, ST-2, GRO-a, IL-21, N<o>V, transferrina, TIMP-2, TNFaRI, TNFaRII, angiostatina, CCL25, ANGPTL4, y/o MMP-3 para disminuir el nivel de expresión del polipéptido eotaxina-3, catepsina-S, DK -1, folistatina, ST-2, GRO-a, IL-21, NOV, transferrina, TIMP-2, TNFaRI, TNFaRII, angiostatina, CCL25, ANGPTL4, y/o MMP-3. La disminución del nivel de uno o más de estos polipéptidos puede utilizarse para reducir el tamaño de la cicatriz y la remodelación del tejido y para mejorar la función cardíaca. En el contexto de la presente invención, el ARN inhibidor se dirige a la expresión de IL-21, reduciendo el nivel de expresión del polipéptido IL-21, mejorando así la función cardíaca en un mamífero que experimenta o está en riesgo de experimentar un evento cardíaco adverso importante.
Cualquier tipo de mamífero que experimente un episodio cardíaco adverso grave (por ejemplo, un infarto agudo de miocardio) y/o un mamífero en riesgo de experimentar un episodio cardíaco adverso grave (por ejemplo, un mamífero que se sometió a una ICP por IAMCEST) puede ser tratado utilizando el transporte mediado por partículas de uno o más productos biológicos descritos en el presente documento. Por ejemplo, los seres humanos y otros primates, como los monos, que experimentan un episodio cardíaco adverso grave y/o están en riesgo de experimentar un episodio cardíaco adverso grave, pueden ser tratados con productos biológicos como se describe en el presente documento. En algunos casos, pueden tratarse perros, gatos, caballos, vacas, cerdos, ovejas, conejos, ratones y ratas con productos biológicos como se describe en el presente documento.
Se puede utilizar cualquier procedimiento apropiado para identificar aun mamífero que experimenta un episodio cardíaco adverso grave (por ejemplo, un infarto agudo de miocardio) y/o un mamífero en riesgo de experimentar un episodio cardíaco adverso grave (por ejemplo, pacientes que se sometieron a una ICP por IAMCEST). Por ejemplo, pueden utilizarse los procedimientos de identificación de un mamífero en riesgo de experimentar un episodio cardíaco adverso grave descritos en otros textos (por ejemplo, el documento WO 2015/034897).
Una vez que se ha identificado que el paciente experimenta un episodio cardíaco adverso grave (por ejemplo, un infarto agudo de miocardio) y/o está en riesgo de experimentar un episodio cardíaco adverso grave, se le puede administrar o instruir para que se autoadministre una o más partículas que encapsulan una molécula (por ejemplo, un producto biológico) como se describe en el presente documento.
Cuando se trata a un mamífero que experimenta un episodio cardíaco adverso grave o está en riesgo de experimentar un episodio cardíaco adverso grave como se describe en el presente documento, el episodio cardíaco adverso grave puede ser cualquier episodio cardíaco adverso grave. Entre los ejemplos de episodios cardíacos adversos graves se incluyen, sin limitación, el infarto de miocardio (por ejemplo, el infarto agudo de miocardio), la insuficiencia cardíaca, el infarto de miocardio recurrente, la hospitalización repetida por episodios relacionados con el corazón y la cardiopatía isquémica. En algunas realizaciones, el episodio cardíaco adverso grave tratado como se describe en el presente documento puede ser un infarto de miocardio, tal como un infarto de miocardio agudo.
En algunos casos, el transporte mediado por partículas de una o más moléculas (por ejemplo, productos biológicos) a un mamífero como se describe en el presente documento puede utilizarse para mejorar la función cardíaca. Entre los ejemplos de mejora de la función cardíaca se incluyen, sin limitación, el aumento de la supervivencia, la reducción de la hospitalización, la tolerancia sin síntomas a la actividad física, la mejora de la aptitud física global, la mejora de la fracción de eyección cardíaca, la mejora del gasto cardíaco, la mejora del volumen sistólico, la mejora del índice de masa cardíaca y la reducción del tamaño de la cicatriz.
En algunos casos, el transporte mediado por partículas de uno o más productos biológicos (por ejemplo, ARNm) a un mamífero como se describe en el presente documento puede utilizarse para aumentar la expresión de uno o más (por ejemplo, uno, dos, tres o más) polipéptidos útiles para regenerar la función y/o el tejido cardíaco. Entre los ejemplos de polipéptidos que pueden ser útiles para regenerar la función y/o el tejido cardíaco se encuentran, sin limitación, NAP-2, TGF-a, ErBb3, VEGF, IGF-1, FGF-2, PDGF, IL-2, CD19, CD20, CD80/86 y los polipéptidos descritos en el documento WO 2015/034897. El aumento del nivel de uno o más de estos polipéptidos puede utilizarse para reducir el tamaño de la cicatriz y la remodelación del tejido y/o mejorar la función cardíaca. Los procedimientos para aumentar la expresión de un polipéptido útil para regenerar la función y/o el tejido cardíaco en células (por ejemplo, cardiomiocitos) pueden incluir poner en contacto las células con una o más partículas que encapsulan, por ejemplo, un ARNm que codifica el polipéptido. Una o más partículas que encapsulan un ARNm que codifica el polipéptido pueden ponerse en contacto con las células por cualquier procedimiento apropiado. La expresión "expresión aumentada", tal como se utiliza en el presente documento con respecto al nivel de un polipéptido, es cualquier nivel que sea mayor (por ejemplo, al menos aproximadamente un 10, 15, 20 o 25 por ciento mayor) que un nivel de referencia para ese polipéptido. La expresión "nivel de referencia", tal y como se utiliza en el presente documento con respecto a un polipéptido, es el nivel de expresión de ese polipéptido observado típicamente en seres humanos sanos o con un bajo riesgo de experimentar un episodio cardíaco adverso grave. Por ejemplo, los niveles de expresión de NAP-2, TGF-a y ErBb3 con respecto a seres humanos sanos o con un bajo riesgo de experimentar un episodio cardíaco adverso grave pueden ser como se describe en otros textos (por ejemplo, el documento WO 2015/034897). En algunos casos, el transporte mediado por partículas de uno o más productos biológicos (por ejemplo, ARNm) a un mamífero como se describe en el presente documento puede utilizarse para aumentar la expresión de NAP-2 y/o TGF-a.
En algunos casos, el transporte mediado por partículas de uno o más productos biológicos (por ejemplo, ARN inhibidor) a un mamífero descrito en el presente documento puede utilizarse para disminuir la expresión de uno o más (por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más) de los siguientes polipéptidos: eotaxina-3, catepsina-S, DK -1, folistatina, ST-2, GRO-a, IL-21, NOV, transferrina, TIMP-2, TNFaRl, TNFaRII, angiostatina, CCL25, ANGPTL4, MMP-3 y polipéptidos descritos en el documento WO 2015/034897. La disminución del nivel de expresión de uno o más de estos polipéptidos puede utilizarse para reducir el tamaño de la cicatriz y la remodelación del tejido y/o mejorar la función cardíaca. Los procedimientos para disminuir la expresión de una o más de las siguientes: eotaxina-3, catepsina-S, DK-1, folistatina, ST-2, GRO-a, IL-21, NOV, transferrina, TIMP-2, TNFaRI, TNFaRII, angiostatina, CCL25, ANGPTL4 y MMP-3 en las células pueden incluir poner en contacto las células (por ejemplo, cardiomiocitos) con una o más partículas que encapsulan, por ejemplo, un ARN inhibidor. Una o más partículas que encapsulan un ARN inhibidor pueden ponerse en contacto con las células por cualquier procedimiento apropiado. Por ejemplo, en seres humanos, una partícula que encapsula un a Rn inhibidor descrito en el presente documento puede utilizarse para disminuir la expresión de una eotaxina-3 humana, una catepsina-S humana, un DK -1 humano, una folistatina humana, un sT-2 humano, un GRO-a humano, una IL-21 humana, un NOV humano, una transferrina humana, un TIMP-2 human, un TNFaRI humano, un TNFaRII humano, una angiostatina humana, un CCL25 humano, un ANGPTL4 humano, una MMP-3 humana, o cualquier combinación de los mismos. La expresión "expresión disminuida", tal como se utiliza en el presente documento con respecto al nivel de un polipéptido (por ejemplo, eotaxina-3, catepsina-S, DK-1, folistatina, ST-2, GRO-a, IL-21, NOV, transferrina, T iMp-2, TNFaRI, TNFaRII, angiostatina, CCL25, ANGPTL4 o MMP-3), es cualquier nivel que sea inferior (por ejemplo, al menos aproximadamente un 10 por ciento, al menos aproximadamente un 15 por ciento, al menos aproximadamente un 20 por ciento o al menos aproximadamente un 25 por ciento más bajo que) un nivel de referencia para ese polipéptido. La expresión "nivel de referencia" , tal como se utiliza en el presente documento, con respecto a un polipéptido eotaxina-3, catepsina-S, DK -1, folistatina, ST-2, GRO-a, IL-21, NOV, transferrina, T iMP-2, TNFaRI, TNFaRII, angiostatina, CCL25, ANGPTL4 o MMP-3, es el nivel de expresión de ese polipéptido observado típicamente en seres humanos sanos o con un bajo riesgo de experimentar un episodio cardíaco adverso grave. Los niveles de expresión de eotaxina-3, catepsina-S, DK -1, folistatina, ST-2, GRO-a, IL-21, NOV, transferrina, TIMP-2, TNFaRl, TNFaRII, angiostatina, CCL25, ANGPTL4 y MMP-3 con respecto a seres humanos sanos o con un bajo riesgo de experimentar un episodio cardíaco adverso grave pueden ser como se describe en otros textos (por ejemplo, el documento WO 2015/034897).
Una partícula (por ejemplo, un gel de alginato) que encapsula una o más moléculas (por ejemplo, productos biológicos) descritas en el presente documento puede administrarse a un mamífero que experimenta un episodio cardíaco adverso grave o susceptible de experimentar un episodio cardíaco adverso grave como terapia combinada con uno o más agentes/terapias adicionales utilizados para tratar un episodio cardíaco adverso grave. Por ejemplo, una terapia combinada utilizada para tratar a un mamífero identificado como susceptible de experimentar un episodio cardíaco adverso grave, tal como se describe en el presente documento, puede incluir la administración de un gel de alginato que encapsula uno o más productos biológicos descritos en el presente documento y el tratamiento con una farmacoterapia agresiva (por ejemplo, bloqueo de los beta-adrenoceptores, inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina, tratamientos de antagonismo de la aldosterona y/o agentes antiplaquetarios), soporte hemodinámico (por ejemplo, bomba de balón intraaórtico y/o aumento mecánico del gasto cardíaco), intervención quirúrgica (por ejemplo, injerto de derivación coronaria o colocación de un dispositivo de asistencia ventricular izquierda) y/o intervención basada en dispositivos (por ejemplo, terapia de resincronización o desfibriladores cardíacos implantables).
En las realizaciones en las que una partícula (por ejemplo, un gel de alginato) que encapsula una o más moléculas (por ejemplo, productos biológicos) descritas en el presente documento se utiliza en combinación con agentes/terapias adicionales utilizados para tratar un episodio cardíaco adverso grave, dichos uno o más agentes adicionales pueden administrarse al mismo tiempo o de forma independiente. Por ejemplo, un gel de alginato que encapsula uno o más productos biológicos descritos en el presente documento puede administrarse en primer lugar, y dichos uno o más agentes adicionales se administrarán en segundo lugar, o viceversa. En las realizaciones en las que una partícula (por ejemplo, un gel de alginato) que encapsula uno o más productos biológicos descritos en el presente documento se utiliza en combinación con una o más terapias adicionales utilizadas para tratar un episodio cardíaco adverso grave, dichas una o más terapias adicionales pueden realizarse al mismo tiempo o independientemente de la administración de una o más partículas que encapsulan uno o más productos biológicos descritas en el presente documento. Por ejemplo, dichos uno o más geles de alginato que encapsulan uno o más productos biológicos descritos en el presente documento pueden administrarse antes, durante o después de que se realicen una o más terapias adicionales.
En algunos casos, una partícula (por ejemplo, un gel de alginato) que encapsula una o más moléculas (por ejemplo, productos biológicos) descrita en el presente documento puede utilizarse para tratar otras enfermedades y/o afecciones, incluyendo, sin limitación, un trastorno hematológico o una neoplasia hematológica (por ejemplo, linfoma, leucemia linfocítica, mieloma, leucemia mielógena (por ejemplo, leucemia mielógena aguda y leucemia mielógena crónica), síndromes mielodisplásicos y enfermedades mieloproliferativas), un trastorno musculoesquelético (por ejemplo, síndrome del túnel carpiano, epidondilitis, tendinitis, dolor de espalda, síndrome de cuello tenso y síndrome de vibración mano-brazo), una afección pulmonar (por ejemplo, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, bronquitis crónica, enfisema, bronquitis aguda, fibrosis quística, neumonía, tuberculosis, enfisema, edema pulmonar, síndrome de insuficiencia respiratoria aguda, neumoconiosis y enfermedad pulmonar intersticial), una enfermedad gastrointestinal, colorrectal, del esfínter anal y/o de los órganos pélvicos (por ejemplo, enterocolitis, diarrea infecciosa, isquemia mesentérica, enfermedad inflamatoria intestinal y enfermedad inflamatoria pélvica), una enfermedad neurológica, medular y/o intracraneal (por ejemplo, defectos del tubo neural, trastornos cefálicos, presión intracraneal elevada o disminuida, meningitis, neuropatías, enfermedades de las neuronas motoras, neuropatías desmielinizantes y lesiones nerviosas), un trastorno dermatológico (por ejemplo, eccema (por ejemplo, dermatitis atópica), verrugas, acné y roséola), afecciones inflamatorias crónicas (por ejemplo, asma, úlcera péptica crónica, tuberculosis, artritis reumatoide, periodontitis crónica, colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn, sinusitis crónica, hepatitis crónica activa) y/o defectos genéticos.
En algunos casos, una partícula (por ejemplo, un gel de alginato) que encapsula una o más moléculas (por ejemplo, productos biológicos) descritas en el presente documento puede formularse en una composición farmacéuticamente aceptable para su administración a un mamífero que experimente un episodio cardíaco grave o esté en riesgo de experimentar un episodio cardíaco grave. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de un gel de alginato que encapsula un producto biológico descrito en el presente documento puede formularse junto con uno o más portadores (aditivos) y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables. Una composición farmacéutica puede formularse para su administración en forma sólida o líquida, incluyendo, sin limitación, disoluciones estériles, suspensiones, formulaciones de liberación sostenida, comprimidos, cápsulas, píldoras, polvos y gránulos.
Los portadores, materiales de relleno y vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden utilizarse en una composición farmacéutica descrita en el presente documento incluyen, sin limitación, intercambiadores de iones, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas de suero, tales como la albúmina de suero humano, sustancias tampón, tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio, mezclas parciales de glicéridos de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, tales como sulfato de protamina, bifosfato de disodio, bifosfato de potasio, cloruro de sodio, sales de cinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias a base de celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa de sodio, poliacrilatos, ceras, polímeros en bloque de polietileno-polioxipropileno, polietilenglicol y lanolina.
Una composición farmacéutica que contenga una partícula (por ejemplo, un gel de alginato) que encapsule una o más moléculas (por ejemplo, productos biológicos) descritas en el presente documento puede diseñarse para su administración oral, parenteral (incluyendo subcutánea, intraarterial, intramuscular, intravenosa, intracoronaria, intradérmica o tópica) o inhalada. Cuando se administra por vía oral, una composición farmacéutica que contiene una partícula (por ejemplo, un gel de alginato) que encapsula uno o más productos biológicos descritos en el presente documento puede tener la forma de una píldora, un comprimido o una cápsula. Las composiciones adecuadas para la administración parenteral incluyen disoluciones para inyección estériles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor previsto; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y espesantes. Las composiciones para la inhalación pueden administrarse utilizando, por ejemplo, un inhalador, un nebulizador y/o un inhalador de polvo seco. Las formulaciones pueden presentarse en recipientes de dosis unitarias o multidosis, por ejemplo, ampollas y viales sellados, y pueden almacenarse en condiciones de liofilización que solo requieren la adición del portador líquido estéril, por ejemplo, agua para inyecciones, inmediatamente antes de su uso. Se pueden preparar disoluciones y suspensiones inyectables improvisadas a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles.
Una composición farmacéuticamente aceptable que incluye una partícula (por ejemplo, un gel de alginato) que encapsula una o más moléculas (por ejemplo, productos biológicos) descritas en el presente documento puede administrarse local o sistémicamente. En algunos casos, una composición que contiene una partícula que encapsula uno o más productos biológicos descritos en el presente documento puede administrarse sistémicamente por vía venosa u oral a un mamífero (por ejemplo, un ser humano), o por inhalación. En algunos casos, una composición que contiene una partícula que encapsula uno o más productos biológicos descritos en el presente documento puede administrarse localmente por vía percutánea, subcutánea, intramuscular o quirúrgica abierta (por ejemplo, inyección) a un tejido diana (por ejemplo, lecho de infarto cardíaco) de un mamífero (por ejemplo, un humano), o por administración arterial al suministro vascular de un tejido diana (por ejemplo, lecho de infarto cardíaco) de un mamífero (por ejemplo, un humano). Por ejemplo, la administración arterial de un gel de alginato que encapsula uno o más de los productos biológicos descritos en el presente documento al suministro vascular del corazón puede utilizarse para administrar los productos biológicos al lecho del infarto cardíaco de un ser humano.
Las dosis eficaces pueden variar en función de la gravedad del episodio cardíaco grave, la vía de administración, la edad y el estado de salud general del sujeto, el uso de excipientes, la posibilidad de coutilización con otros tratamientos terapéuticos, tal como el uso de otros agentes, y el criterio del médico encargado.
La frecuencia de administración puede ser cualquier frecuencia que mejore la función cardíaca sin producir una toxicidad significativa para el mamífero. Por ejemplo, la frecuencia de administración puede ser de aproximadamente una vez a la semana a aproximadamente tres veces al día, de aproximadamente dos veces al mes a aproximadamente seis veces al día, o de aproximadamente dos veces a la semana a aproximadamente una vez al día. La frecuencia de administración puede permanecer constante o puede ser variable durante la duración del tratamiento. Un curso de tratamiento con una composición que contiene una partícula (por ejemplo, un gel de alginato) que encapsula uno o más productos biológicos descritos en el presente documento puede incluir períodos de descanso. Por ejemplo, una composición que contenga un gel de alginato que encapsule uno o más de los productos biológicos descritos en el presente documento puede administrarse diariamente durante un período de dos semanas, seguido de un período de descanso de dos semanas, y dicho régimen puede repetirse varias veces. Al igual que con la cantidad eficaz, varios factores pueden influir en la frecuencia real de administración utilizada para una aplicación concreta. Por ejemplo, la cantidad eficaz, la duración del tratamiento, el uso de múltiples agentes de tratamiento, la vía de administración y la gravedad del episodio cardíaco grave pueden requerir un aumento o una disminución de la frecuencia de administración.
Una duración eficaz para administrar una composición que contiene una partícula (por ejemplo, un gel de alginato) que encapsula una o más moléculas (por ejemplo, productos biológicos) descritas en el presente documento puede ser cualquier duración que mejore la función cardíaca sin producir una toxicidad significativa al mamífero. Por ejemplo, la duración eficaz puede variar de varios días a varias semanas, meses o años. En algunos casos, la duración eficaz para el tratamiento de un episodio cardíaco grave puede oscilar entre un mes y unos 10 años. Múltiples factores pueden influir en la duración eficaz real utilizada para un tratamiento concreto. Por ejemplo, una duración eficaz puede variar con la frecuencia de administración, la cantidad eficaz, el uso de múltiples agentes de tratamiento, la vía de administración y la gravedad del episodio cardíaco grave que se está tratando.
En ciertos casos, se puede controlar el desarrollo de un tratamiento y la función cardíaca del mamífero que está siendo tratado debido a un episodio cardíaco grave. Se puede utilizar cualquier procedimiento apropiado para controlar la función cardíaca. Por ejemplo, la función cardíaca puede evaluarse mediante análisis de sangre, electrocardiografía (ECG/EKG), prueba de esfuerzo cardíaco, cateterismo coronario, ecocardiograma y/o ecografía intravascular en diferentes momentos.
En la descripción anterior, las realizaciones particulares pueden describirse de forma aislada para mayor claridad. A menos que se especifique expresamente que las características de una realización particular son incompatibles con las características de otra realización, ciertas realizaciones pueden incluir una combinación de características compatibles descritas en el presente documento en relación con una o más realizaciones.
Para cualquier procedimiento divulgado en el presente documento que incluya etapas discretas, las etapas pueden llevarse a cabo en cualquier orden factible. Y, según el caso, cualquier combinación de dos o más etapas puede llevarse a cabo simultáneamente.
La presente invención se ilustra con los siguientes ejemplos. En la medida en que los ejemplos contengan contenidos que quedan fuera del alcance de la invención, estos se incluye únicamente a modo de referencia.
Ejemplos
Ejemplo 1: Expresión de ARNm en fibroblastos
El ARNm de mCherry se transfectó en fibroblastos dérmicos humanos y en fibroblastos cardíacos humanos. Se utilizó microscopía de fase luminosa y fluorescente para evaluar la expresión del ARNm a las 4 horas, 2 días y 5 días después de la transfección (figura 3).
Estos resultados demostraron que el ARNm puede expresarse de forma sostenida en los fibroblastos dérmicos y cardíacos.
Ejemplo 2: Coexpresión de ARNm en células epiteliales
El ARNm de mCherry y el ARNm de EGFP se transfectaron en células HEK293. Se utilizó la microscopía fluorescente multicanal para evaluar la expresión del ARNm a las 24 horas después de la transfección (figura 4).
Estos resultados demostraron que se pueden coexpresar múltiples ARNm.
Ejemplo 3: Expresión de ARNm en cardiomiocitos
El ARNm de mCherry se transfectó en células HEK293. Se utilizó microscopía de fase luminosa y fluorescente para evaluar la expresión del ARNm a las 24 horas, 3 días y 5 días después de la transfección (figura 5). Estos resultados demostraron que el ARNm puede expresarse de forma sostenida en los cardiomiocitos.Ejemplo 4: Expresión in vivo de ARNm transportado por liposomas subcutáneos
Se administró a los ratones una disolución de ARNm de luciferasa mediante una inyección hidrodinámica en la vena de la cola (figura 6(A) y (B)) o se administraron liposomas que contenían ARNm de luciferasa mediante inyección subcutánea (figura 6(C) y (D)). La expresión de la luciferasa se visualizó utilizando un sistema de imagen Xenogen (IVIS). En el caso de los ratones a los que se les administró una disolución de ARNm de luciferasa mediante una inyección hidrodinámica en la vena de la cola, se evaluó la cantidad de luciferasa expresada al principio del experimento y a las dos horas, cuatro horas, seis horas y 24 horas después de la administración (figura 6E). En los ratones a los que se les administraron liposomas que contenían ARNm de luciferasa mediante inyección subcutánea, se evaluó la cantidad de luciferasa expresada a las dos horas, cuatro horas, seis horas, 24 horas, 48 horas y 72 horas después de la administración (figura 6F).
Se administró a ratones liposomas que contenían ARNm de mCherry mediante inyección subcutánea. La expresión de mCherry se evaluó mediante microscopía fluorescente (figura 7).
Estos resultados demostraron que el ARNm transportado por liposomas puede expresarse de forma sostenidain vivotras su administración subcutánea.
Ejemplo 5: Expresión in vivo de ARNm transportado por liposomas intracardíacos
Se administraron a ratones liposomas que contenían ARNm de luciferasa mediante inyección intracardíaca guiada por ecografía (figura 8A). La expresión de la luciferasa se visualizó utilizando un sistema de formación de imágenes Xenogen (IVIS). La cantidad de luciferasa expresada se evaluó a las 2, 4, 6, 24, 48 y 72 horas después de la administración (figura 8B).
Estos resultados demostraron que el ARNm transportado por liposomas puede expresarse de forma sostenidain vivotras su administración intracardíaca.
Ejemplo 6: Expresión in vivo de ARNm transportado por liposomas intracardíacos a tórax abiertoSe administraron a ratones liposomas que contenían ARNm de luciferasa mediante una inyección intracardíaca a tórax abierto. La expresión de la luciferasa se visualizó utilizando un sistema de formación de imágenes Xenogen (IVIS) (figura 9).
Estos resultados demostraron que el ARNm transportado por liposomas puede expresarse de forma sostenidain vivotras su administración intracardíaca.
Ejemplo 7: Expresión in vivo del ARNm transportado por alginato
Se administró a los cerdos un gel de alginato que contenía ARNm de mCherry utilizando estrategias anteriormente publicadas. Se evaluó la cantidad de expresión de mCherry tras la administración (figura 10). Los procedimientos anteriores para utilizar el transporte de ARNm con alginato resultaron en el secuestro de los productos biológicos dentro del producto polimerizado sin expresión intramiocárdica.
Ejemplo 8: Expresión in vivo del ARNm transportado por alginato
Se administró a los cerdos un volumen reducido de gel de alginato que contenía ARNm de mCherry. La expresión de mCherry se evaluó mediante microscopía fluorescente.
El menor volumen del gel de alginato dio lugar a un transporte difuso de los productos biológicos y a la pérdida de la mayor parte de la señal (3,6 de eficacia de radiación; figura 11).
Ejemplo 9: Expresión in vivo del ARNm transportado por alginato
Se administró a los cerdos geles de alginato con concentraciones variadas de alginato/calcio que contenían ARNm de mCherry. La expresión de mCherry se evaluó mediante microscopía fluorescente.
El transporte dirigido al lecho del infarto se realiza con un gel de alginato/calcio que permanece líquido en la sangre y escapa al lecho capilar infartado, donde polimeriza y administra los productos biológicos con alta eficacia (nivel de radiación localizada >10 frente a 3-4 en intentos anteriores; figura 12).
Estos resultados demostraron que el ARNm transportado por el gel de alginato puede dirigirse a los lechos capilares infartados.
Ejemplo 10: Expresión in vivo de ARNm transportado por alginato intracardíaco a tórax abiertoSe administraron a ratones geles de alginato con concentraciones variadas de alginato/calcio que contenían ARNm de mCherry. La expresión de mCherry se evaluó mediante microscopía fluorescente.
El transporte con gel de alginato dio lugar a una liberación sostenida de ARNm de mCherry (figura 13). Estos resultados demostraron que el ARNm transportado en el gel de alginato puede expresarse de forma sostenidain vivotras su liberación.
Texto libre de lista de secuencias
SEQ ID NO:1
CCCATTGTAT GGGATCTGAT CTGGGGCCTC GGTGCACATG CTTTACATGT GTTTAGTCGA
GGTTAAAAAA
SEQ ID NO:2
ACGTCTAGGC CCCCCGAACC ACGGGGACGT GGTTCCTTT GAAAAA
SEQ ID NO:3
CCAGAAGGTA CCCCATTGTA TGGGATCTGA TCTGGGGCCT CGGTACACAT GCTTTACATG
TGTTTAGTCG AGGTTAAAAA AACGTCTAGG CCCCCCGAAC CACGGGGACG TGGTTTTCCT
TTGAAAAACA CGATGATA
SEQ ID NO:4
ATATGGCCAC AACCATGGTG AGCAAGGGCG AGGAGCTGTT CACCGGGGTG GTGCCCATCC
TGGTCGAGCT GGACGGCGAC GTAAACGGCC ACAAGTTCAG CGTGTCCGGC GAGGGCGAGG
GCGATGCCAC CTACGGCAAG CTGACCCTGA AGTTCATCTG CACCACCGGC AAG
SEQ ID NO:5
GCTGCTGCCC GACAACCACT ACCTGXAGCX ACCCAGTCCG CCCTGAGCAA AGACCCCAAC
GAGAAGCGCG ATCACATGGT CCTGCTGGAG TTCGTGACCG CCGCCGGGAT CACTCTCGGC
ATGGACGAGC TGTACAAGTA AGCCCTGTGG AATGTGTGTC AGTTAGXXXG GTGTGGAAAG
TCCCCAXXGG CTCCCCXXXA GCAXXXXXXX XXXXXGGCAG AAGTATGCAA AGCATGCATC
TCAATTAGTC AGCAACCAGG TGTGG
SEQ ID NO:6
SEQ ID NO:7
CAACGTCTAT ATCATGGCCG ACAAGCAGAA GAACGGCATC XXXAAGGTGA ACTTCAAGAT CCGCCACAAC ATCGAGGACG GCAGCGTGCA GCTCGCCGAC CACTACCAGC AGAACACCCC CATCXGGCGA CGGCCCCGTG CTGCTGCXXC CGACAACCAC
SEQ ID NO:8
GCTGAAGCAC TGCACGCCGT AGGTCAGXXG GTGGTCACGA GGGTGGGCCA GGGCAXCGGG CAGCTTGCCG GTGGTGCAGA TGAACTTCAG GGTCXXXAGC TTGCCGTAGG TGGCATCGXX XCCCTCGCCC TCGCCG
SEQ ID NO:9
GACACGCTGA ACTTGTGGCC GTTTACGTCG CCGTCCAGCT CGACCAGGAT GGGCXXXACC ACCCCGGTGA ACAGCTCCTC GCCCTTGCTC ACCXXXATGG TTGTGGCCAT ATTATCATCG TGTTTTTCAA AGGAAAACCA CGTCCCCGTG GTTCGGGGGG CCTAGACGTT TTTTTAACCT CGACTAAACA CATXGTAAAG CATGTGTACC GAGGCCCCAG ATCAGATCCC ATACA
SEQ ID NO:10
AGGGCACGGG CAGCTTGCCG GTGGTGCAGA TGAACTTCAG GGTCAGCTTG CCGTAGGTGG CATCGCCCTC GCCCTCGCCX XXGGACACGC TGAACTTGTG XXXXXXGCCG TTTACGTCGC CGTCCXXXXX XXXAGCTXXX XXXXXXCGAC CAGGATGGGC ACCACCCCGG TGAAXXCAGC TCCTCGCCCT TGCTCACCAT XGGTXXXXXT GTGGCCATAT TATCATCGTG TTTXXXXXXX XXXTTCAAAG GXXXXAAAAC CACXGTCCCX CGTGGTTCGG GGGGCCTAGA CGTTTTTTTA ACCTCGACTA AAXXXXCACA TGTAAAGCAT GTGTACCGAG GCXXXXXXXX XXXCCCAGAT CAGATCCCAT ACAATGGGGT ACCTTCTGG

Claims (5)

REIVINDICACIONES
1. Una composición que comprende una partícula bifásica, comprendiendo la partícula bifásica un gel de alginato que encapsula un ARN inhibidor para su uso en la mejora de la función cardíaca en un mamífero que experimenta o está en riesgo de experimentar un evento cardíaco adverso grave, en la que:
el ARN inhibidor se dirige a la IL-21, para disminuir el nivel de expresión del polipéptido IL-21, mejorando así la función cardíaca del mamífero.
2. La composición para su uso según la reivindicación 1, en la que el mamífero es un ser humano, opcionalmente en la que el ser humano ha sido sometido a una intervención coronaria percutánea por infarto de miocardio con elevación del ST.
3. La composición de su uso según la reivindicación 1 o 2, en la que la composición se administra al mamífero por vía arterial.
4. La composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que el gel de alginato comprende una sal de calcio, opcionalmente en la que el gel de alginato tiene una proporción de alginato a sal de calcio de 2:1 a 10:1.
5. La composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que:
a) la partícula tiene un diámetro de 5 pm a 10 pm; y/o
b) la partícula bifásica comprende una cola; y/o
c) la composición se administra durante una intervención coronaria percutánea;
y/o
d) la partícula comprende además una proteína de andamiaje,
opcionalmente en la que la proteína de andamiaje se selecciona del grupo que consiste en colágeno I, colágeno II, colágeno III, colágeno IV, fibrina y gelatina; y/o
e) la partícula encapsula además un polipéptido,
opcionalmente en la que el polipéptido se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo que tiene la capacidad de neutralizar la actividad del factor de necrosis tumoral, un anticuerpo que tiene la capacidad de neutralizar la actividad del complejo-1 mitocondrial, y un agonista de la resolvina-D1; y/o
f) la partícula encapsula además un lipopolisacárido; y/o
g) la partícula encapsula además una microvesícula y/o un exosoma.
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