ES3036749T3 - Modified alginates for anti-fibrotic materials and applications - Google Patents

Modified alginates for anti-fibrotic materials and applications

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ES3036749T3
ES3036749T3 ES15750880T ES15750880T ES3036749T3 ES 3036749 T3 ES3036749 T3 ES 3036749T3 ES 15750880 T ES15750880 T ES 15750880T ES 15750880 T ES15750880 T ES 15750880T ES 3036749 T3 ES3036749 T3 ES 3036749T3
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Joshua C Doloff
Omid Veiseh
Minglin Ma
Robert S Langer
Daniel G Anderson
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Massachusetts Institute of Technology
Original Assignee
Boston Childrens Hospital
Massachusetts Institute of Technology
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Abstract

Se describen aquí polímeros de alginato modificados covalentemente, con biocompatibilidad mejorada y propiedades fisicoquímicas adaptadas, así como sus métodos de fabricación y uso. Los alginatos modificados covalentemente son útiles como matriz para el recubrimiento de cualquier material que requiera una reducción de la fibrosis, como células encapsuladas para trasplantes y dispositivos médicos implantados o utilizados en el cuerpo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Alginatos modificados para materiales antifibróticos y aplicaciones
Declaración con respecto a la investigación patrocinada federalmente
Esta invención se realizó con apoyo gubernamental bajo las concesiones EB000244, EB000351, DE013023 y CA151884 otorgadas por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) y la concesión W81XWH-13-1-0215 otorgada por el Departamento de Defensa (DOD). El gobierno tiene ciertos derechos en la invención.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a productos médicos, en donde la totalidad o una porción del producto médico está recubierta con un alginato modificado que comprende uno o más monómeros modificados covalentemente para potenciar su biocompatibilidad y propiedades antifibróticas, y al producto médico anterior para su uso en el tratamiento de una enfermedad o un trastorno en un paciente humano o animal, en donde el producto médico se implanta en o se trasplanta al paciente.
Antecedentes de la invención
La respuesta a cuerpos extraños es una reacción inmunomediada que tiene un impacto sobre la fidelidad de los dispositivos biomédicos implantados (Andersonet al.,Semin. Immunol. 20:86-100 (2008); Langer, Adv. Mater.
21:3235-3236 (2009); Ward, J. Diabetes Sci. Technol. Online 2:768-777 (2008); Harding y Reynolds, Trends Biotechnol. 32:140-146 (2014)). El reconocimiento por parte de macrófagos de las superficies de biomateriales en estos dispositivos inicia una cascada de eventos inflamatorios que dan como resultado la encapsulación fibrosa y colagenosa de estos materiales extraños (Andersonet al.(2008); Ward (2008); Harding y Reynolds (2014); Grainger, Nat. Biotechnol. 31:507-509 (2013); Williams, Biomaterials 29:2941-2953 (2008)). Esta encapsulación, con el tiempo, a menudo conduce al fallo del dispositivo y puede dar como resultado incomodidad para el receptor (Andersonet al.(2008); Harding y Reynolds (2014); Williams (2008)). Estos desenlaces adversos enfatizan la necesidad crítica de biomateriales que no provoquen respuestas a cuerpos extraños para superar este desafío clave para la función a largo plazo de los dispositivos biomédicos.
La respuesta a cuerpos extraños con respecto a los biomateriales implantados es la culminación de eventos inflamatorios y procesos de cicatrización que dan como resultado la encapsulación del implante (Andersonet al.(2008)). El producto patológico final de esta respuesta es la fibrosis, que se caracteriza por la acumulación de matriz extracelular en exceso en sitios de inflamación y es un obstáculo clave para los dispositivos médicos implantables, ya que la deposición celular y colagenosa aísla el dispositivo del huésped (Andersonet al.(2008); Wicket al.,Annu. Rev. Immunol. 31:107-135 (2013); Wynn y Ramalingam, Nat. Med. 18:1028-1040 (2012)). Este aislamiento del dispositivo puede interferir con la detección del entorno del huésped, conducir a una distorsión tisular dolorosa, interrumpir la nutrición (para implantes que contienen componentes celulares vivos) y, en última instancia, conducir al fallo del dispositivo. Los materiales habitualmente usados para la fabricación de dispositivos médicos en la actualidad provocan una respuesta a cuerpos extraños que da como resultado la encapsulación fibrosa del material implantado (Langer (2009); Ward (2008); Harding y Reynolds (2014); Williams (2008); Zhanget al.,Nat. Biotechnol.
31:553-556 (2013)). Superar la respuesta a cuerpos extraños con respecto a los dispositivos implantados podría allanar el camino para implementar nuevos avances médicos, haciendo que el desarrollo de materiales con propiedades tanto antiinflamatorias como antifibróticas sea una necesidad médica crítica (Andersonet al. (2008); Langer (2009); Harding y Reynolds (2014)).
Los macrófagos son un componente clave del reconocimiento de materiales y se adhieren activamente a la superficie de objetos extraños (Andersonet al.(2008); Ward (2008); Grainger, Nat. Biotechnol. 31:507-509 (2013); Sussmanet al.,Ann. Biomed. Eng. 1-9 (2013) (doi:10.1007/s10439-013-0933-0)). Los objetos demasiado grandes para la fagocitosis por parte de macrófagos inician procesos que dan como resultado la fusión de los macrófagos en células gigantes de cuerpos extraños. Estos cuerpos multinucleados amplifican la respuesta inmunitaria mediante la secreción de citocinas y quimiocinas que dan como resultado el reclutamiento de fibroblastos que depositan activamente matriz para aislar el material extraño (Andersonet al.(2008); Ward (2008); Rodríguezet al.,J. Biomed. Mater. Res. A 89:152-159 (2009); Hetricket al.,Biomaterials 28:4571-4580 (2007)). Esta respuesta se ha descrito para materiales de orígenes tanto naturales como sintéticos que abarcan una amplia gama de propiedades fisicoquímicas, incluyendo alginato, quitosano, dextrano, colágeno, hialuronano, poli(etilenglicol) (PEG), poli(metacrilato de metilo) (PMMA), poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) (PHEMA), poliuretano, polietileno, caucho de silicona, Teflon, oro, titanio, sílice, y alúmina (Ward (2008); Ratner, J. Controlled Release 78:211-218 (2002)).
El trasplante de células secretoras de hormonas o proteínas a partir de miembros genéticamente no idénticos de la misma especie (es decir, alotrasplante) o de otra especie (es decir, xenotrasplante) es una estrategia prometedora para el tratamiento de muchas enfermedades y trastornos. Usando microcápsulas de alginato para proporcionar inmunoaislamiento, pueden trasplantarse células secretoras de hormonas o proteínas a un paciente sin la necesidad de un extenso tratamiento con fármacos inmunodepresores. Este principio se ha demostrado con éxito mediante el trasplante de células p pancreáticas encapsuladas en alginato en modelos de ratas diabéticas (Lim, F. y Sun, A. M. Science. 210, 908-910 (1980)). Los métodos de encapsulación de material biológico en geles de alginato se describen, por ejemplo, en la patente estadounidense n.° 4.352.883 concedida a Lim. En el procedimiento de Lim, una disolución acuosa que contiene los materiales biológicos que van a encapsularse se suspende en una disolución de un polímero soluble en agua. Con la suspensión se forman gotitas que están configuradas en microcápsulas discretas mediante el contacto con cationes multivalentes tales como Ca2+. La superficie de las microcápsulas se reticula posteriormente con poliaminoácidos, formando una membrana semipermeable alrededor de los materiales encapsulados.
El método de Lim emplea condiciones que son lo suficientemente suaves como para encapsular células sin afectar de manera adversa a su supervivencia y función posteriores. Las microcápsulas de alginato resultantes son semipermeables, presentando una porosidad suficiente como para permitir que los nutrientes, los residuos, y las hormonas y/o proteínas secretadas a partir de las células encapsuladas difundan libremente hacia el interior y el exterior de las microcápsulas, y, cuando se implantan en un huésped animal, las microcápsulas de alginato aíslan eficazmente las células encapsuladas a partir del sistema inmunitario del huésped. Véase también la patente estadounidense 7.807.150 concedida a Vacanti,et al.
Se han probado muchos otros materiales sintéticos, incluyendo copolímeros de bloque tales como polímeros de polietilenglicol-diacrilato, poliacrilatos, y polímeros termoplásticos, tal como se notifica por la patente estadounidense n.° 6.129.761 concedida a Hubbell y por Aebischer,et al,J Biomech Eng. Mayo de 1991, 113(2):178-83. Véase Lesney Modern Drug Discovery 4(3), 45-46, 49, 50 (2001) para una revisión de estos materiales.
Desde que Lim notificó por primera vez el trasplante de células encapsuladas, muchos otros han intentado crear “biorreactores” para células que pudieran mantener la viabilidad de las células en ausencia de vascularización, mediante la difusión de nutrientes, gases y residuos a través de los materiales de encapsulación, y aun así proteger a las células de las inmunodefensas del cuerpo contra células y materiales extraños. Desafortunadamente, los esfuerzos por trasladar estas terapias a sujetos humanos han resultado difíciles. Por ejemplo, las células de los islotes porcinas encapsuladas en alginato trasplantadas a un sujeto humano que padecía diabetes tipo 1 demostraron inicialmente una mejora significativa y requirieron una dosificación disminuida de insulina. Sin embargo, en la semana 49, la dosis de insulina del paciente volvió a los niveles previos al trasplante (Elliot, R. B.et al.Xenotransplantation. 2007; 14(2): 157-161).
En algunos casos, es deseable provocar fibrosis, por ejemplo, cuando las células se implantan como material de relleno, tal como se describe en la patente estadounidense n.° 6.060.053 y tal como se aprobó posteriormente por la Administración de Alimentos y Medicamentos para el tratamiento de reflujo vesicoureteral.
La eficacia disminuida de las células implantadas con el tiempo es el resultado del sobrecrecimiento fibroblástico excesivo de las cápsulas de alginato. La matriz de gel de alginato provoca una respuesta inflamatoria tras la implantación, dando como resultado la encapsulación de la matriz de alginato con el tejido fibroso. El tejido fibroso sobre la superficie de la cápsula de alginato reduce la difusión de nutrientes y oxígeno a las células encapsuladas, provocando su muerte. No se han obtenido mejores resultados con los demás materiales.
El documento WO 2012/167223 describe células encapsuladas en alginato, pero no un implante que contenga materiales tal como se describen en la presente invención, en donde la totalidad o una porción de dicha superficie esté recubierta.
Jin Hi Leeet al.“Development and characterization of an alginate-impregnated polyester vascular graft”, Journal of Biomedical Materials Research vol. 36, n.° 2 describe un injerto de poliéster de punto poroso, impregnado con un alginato de sodio no modificado.
El documento WO 2014/044697 describe un método para producir armazones de óxido de titanio recubiertos con alginatos no modificados covalentemente y permitir la vascularización de nuevos tejidos.
Por tanto, un objeto de la invención es proporcionar polímeros adecuados para recubrir productos, dispositivos, y superficies donde los polímeros tengan mayor biocompatibilidad a largo plazo tras la implantación de los productos, los dispositivos, y las superficies.
Un objeto de la invención también es proporcionar polímeros adecuados para recubrir productos, dispositivos, y superficies donde los polímeros tengan menos respuesta a cuerpos extraños tras la implantación de los productos, los dispositivos, y las superficies.
Un objeto de la invención también es proporcionar alginatos reticulables iónicamente y modificados químicamente con biocompatibilidad mejorada y propiedades fisicoquímicas adaptadas, incluyendo estabilidad de gel, tamaño de poro, e hidrofobia/hidrofilia.
Un objeto de la invención también es proporcionar alginatos reticulables iónicamente y modificados químicamente con menos respuesta a cuerpos extraños.
Un objeto de la invención también es proporcionar métodos para el recubrimiento de productos, dispositivos, y superficies usando polímeros de alginato modificados.
Un objeto de la invención también es proporcionar productos médicos, en donde la totalidad o una porción del producto médico está recubierta con un polímero de alginato modificado para su uso en el tratamiento de una enfermedad o un trastorno en un paciente humano o animal, en donde el producto médico se implanta en o se trasplanta a un paciente humano o animal.
Sumario de la invención
Se han desarrollado productos médicos, en donde la totalidad o una porción del producto médico está recubierta con un alginato modificado que comprende uno o más monómeros modificados covalentemente.
Se han desarrollado alginatos, modificados químicamente para adaptar su biocompatibilidad y sus propiedades físicas. Los alginatos modificados descritos en el presente documento proporcionan propiedades potenciadas con respecto a los alginatos no modificados. Además, basándose en el descubrimiento de que los materiales de partida, así como los materiales reaccionados y modificados químicamente, deben purificarse exhaustivamente para eliminar los contaminantes antes de la implantación para impedir la encapsulación, es menos probable que estos materiales provoquen la formación de cápsulas fibrosas tras la implantación.
[1] En una primera realización, la invención se refiere a un producto médico, en donde el producto médico es un dispositivo implantable, un marcapasos cardiaco, un catéter, un catéter de inyección con aguja, un filtro de coágulos sanguíneos, un globo, un trasplante de endoprótesis vascular, una endoprótesis vascular biliar, una endoprótesis vascular intestinal, una endoprótesis vascular bronquial, una endoprótesis vascular esofágica, una endoprótesis vascular ureteral, an dispositivo de espiral de inserción en aneurismas u otro dispositivo de espiral, una malla de reparación quirúrgica, un dispositivo de revascularización transmiocárdica, un dispositivo de revascularización miocárdica percutánea, una prótesis, una válvula cardiaca, un tubo, un implante, una fibra, una fibra hueca, una membrana, un material textil, un recipiente para sangre, una placa de titulación, un medio adsorbente, un dializador, una pieza de conexión, un sensor, una válvula, un endoscopio, un filtro, una cámara de bomba, u otro dispositivo médico destinado a tener propiedades hemocompatibles, y
en donde la totalidad o una porción del producto médico está recubierta con
un alginato modificado que comprende uno o más monómeros modificados covalentemente definidos por la fórmula I
Fórmula I
en donde,
X es oxígeno, azufre, o NR<4>;
R<1>es, independientemente en el uno o más monómeros modificados,
en donde a es un número entero desde 1 hasta 30, z es un número entero desde 0 hasta 5, n es un número entero desde 1 hasta 12, m es un número entero desde 3 hasta 16, Ra se selecciona independientemente de grupo alcoxilo, amino, alquilamino, dialquilamino, hidroxilo, alquenilo, alquinilo, alquilo sustituido, alquenilo sustituido, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, sulfonilo, sulfonilo sustituido, ácido sulfónico, fosforilo, fosforilo sustituido, fosfonilo, fosfonilo sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C<3>-C20, cíclico C<3>-C<20>sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido, y en donde Rb es
Fórmula XIII
en donde
Yi e Y<2>son independientemente hidrógeno o -PO(OR5)2; o
Y<2>está ausente, e Y<1>, junto con los dos átomos de oxígeno a los que Y<1>e Y<2>están unidos, forman una estructura cíclica tal como se muestra en la fórmula II
en donde; y
R<2>y R<3>son, independientemente, hidrógeno o una agrupación orgánica que contiene cualquier número de átomos de carbono, preferiblemente 1-30 átomos de carbono, más preferiblemente 1-20 átomos de carbono, más preferiblemente 1-14 átomos de carbono, y que opcionalmente incluye uno o más heteroátomos tales como agrupación de oxígeno, azufre, o nitrógeno en formatos estructurales lineales, ramificados, o cíclicos, siendo agrupaciones de R<2>y R<3>representativas grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C<3>-C20, cíclico C<3>-C<20>sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido; o
R2 y R3, junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un anillo carbocíclico o heterocíclico no sustituido o sustituido de 3 a 8 miembros; y
R4 y R5 son, independientemente, hidrógeno o una agrupación orgánica que contiene cualquier número de átomos de carbono, preferiblemente 1-30 átomos de carbono, más preferiblemente 1-20 átomos de carbono, más preferiblemente 1-14 átomos de carbono, y que opcionalmente incluye uno o más heteroátomos tales como agrupación de oxígeno, azufre, o nitrógeno en formatos estructurales lineales, ramificados, o cíclicos, siendo agrupaciones de R<4>y R<5>representativas grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C<3>-C<20>, cíclico C<3>-C<20>sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido,
en donde R6, R8, y R9 son, independientemente, hidrógeno o una agrupación orgánica que contiene cualquier número de átomos de carbono, 1-30 átomos de carbono, 1-20 átomos de carbono, o 1-14 átomos de carbono, y que opcionalmente incluye uno o más heteroátomos tales como agrupación de oxígeno, azufre, o nitrógeno en formatos estructurales lineales, ramificados, o cíclicos, siendo agrupaciones orgánicas representativas grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, sulfonilo, sulfonilo sustituido, ácido sulfónico, fosforilo, fosforilo sustituido, fosfonilo, fosfonilo sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C3-C20, cíclico C3-C20 sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido. Realizaciones adicionales según la invención son:
[2] El producto médico según el punto [1], en donde
R6 es -CH<2>-Ar- o -CH2-CH2-(O-CH2-CH2)3-;
R<4>es hidrógeno;
R8 es hidrógeno, metilo, o -CH<2>-OH; y
R<9>es metilo, -COCH<3>, -CH2-N(CH2-CH3)2,
[3] El producto médico según el punto [2], en donde
R8 es hidrógeno; y
[4] El producto médico según el punto [2], en donde
R8 es hidrógeno; y
/ = N
Rg es »nn/v
[5] El producto médico según el punto [2], en donde
R<9>es metilo, -COCH<3>, o -CH2-N(CH2-CH3)2.
[6] El producto médico según el punto [1], en donde
X es oxígeno o NR4, en donde R4 es hidrógeno, metilo, o -CH2-CH3; y
Ri es -CH2-CH2-CH2-CH2-OH, -CH2-CH2-(O-CH2-CH2)m-O-CH3, donde m es un número entero desde 3 hasta 16, -CH2-CH2-O-CH2-CH2-OH, -(CH2-CH2)3-NH-CH3,
[7] El producto médico según el punto [1], en donde el uno o más monómeros modificados son
[8] El producto médico según uno cualquiera de los puntos [1-7], en donde Y1 e Y2 son hidrógeno.
[9] Un producto médico según uno cualquiera de los puntos [1-8] para su uso en el tratamiento de una enfermedad o un trastorno en un paciente humano o animal, en donde el producto médico se implanta en o se trasplanta a un paciente humano o animal.
A continuación se describirá con más detalle ejemplos de alginatos modificados según la reivindicación 1. Los ejemplos de alginatos modificados son polímeros de alginato que contienen uno o más monómeros modificados covalentemente definidos por la fórmula I
Fórmula I
en donde,
X es oxígeno, azufre, o NR<4>;
R<1>es, independientemente en el uno o más monómeros modificados tal como se definió anteriormente, -R6-Rb, en donde
R6 es, independientemente en el uno o más monómeros modificados,
Fórmula XIV Fórmula XV
en donde k es un número entero desde 1 hasta 10; en donde z es un número entero desde 0 hasta 5; en donde w es un número entero desde 0 hasta 4; en donde Xd está ausente, es O o S;
en donde Río, Rn, Ri2, R<13>, Ri4, R<15>, Ri6, Ri 7, R39, R4o, y R4i son independientemente hidrógeno, grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, sulfonilo, sulfonilo sustituido, ácido sulfónico, fosforilo, fosforilo sustituido, fosfonilo, fosfonilo sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C3-C20, cíclico C3-C20 sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido;
en donde R<37>es C o Si;
en donde Xg y R<38>son independientemente grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquileno, alquileno sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, sulfonilo, sulfonilo sustituido, ácido sulfónico, fosforilo, fosforilo sustituido, fosfonilo, fosfonilo sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C3-C20, cíclico C3-C20 sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido; y
en donde Ra y Rc son independientemente grupo alcoxilo, amino, alquilamino, dialquilamino, hidroxilo, alquenilo, alquinilo, alquilo sustituido, alquenilo sustituido, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C3-C20, cíclico C3-C20 sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido; o junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un anillo carbocíclico o heterocíclico no sustituido o sustituido de 3 a 8 miembros, y en donde Rb es, independientemente en el uno o más monómeros modificados,
Fórmula XIII
en donde R8, R9, o ambos son, independientemente, hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, alcoxilo, amino, alquilamino, dialquilamino, hidroxilo, alquenilo, alquinilo, alquilo sustituido, alquenilo sustituido, alquinilo sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carbinol,
en donde R<31>, R32, R<33>, R34, R<35>, y R36 son, independientemente, hidrógeno, grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C3-C20, cíclico C3-C20 sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido;
en donde y es un número entero desde 0 hasta 11; en donde Rd y Re son cada uno independientemente grupo alcoxilo, amino, alquilamino, dialquilamino, hidroxilo, alquenilo, alquinilo, alquilo sustituido, alquenilo sustituido, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C3-C20, cíclico C3-C20 sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, y polipéptido; o junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un anillo carbocíclico o heterocíclico no sustituido o sustituido de 3 a 8 miembros;
en donde R<18>, R<19>, R<20>, R<21>, R<22>, y R<23>son independientemente C, O, N, o S, en donde los enlaces entre R<18>a R<23>adyacentes son dobles o sencillos según la valencia, y en donde R<18>a R<23>están unidos a ninguno, uno, o dos hidrógenos según la valencia; y
en donde R<24>es independientemente -(CR<25>R<25>V o -(CR<25>R<25>)p-Xb-(CR<25>R<25>)q-, en donde p y q son independientemente números enteros desde 0 hasta 5, en donde Xb está ausente, es -O-, -S-, -SO2-, o<n>R4, en donde cada R25 está independientemente ausente, es hidrógeno, =O, =S, -OH, -SH, -NR4, en donde R4 es grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C3-C20, cíclico C3-C20 sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido;
en donde R8, y R9 no son ninguno hidrógeno; en donde al menos un Rb o Rc se define mediante la fórmula XIII;
en donde
Y1 e Y2 son independientemente hidrógeno o -PO(OR5)2; o
Y<2>está ausente, e Y<1>, junto con los dos átomos de oxígeno a los que Y<1>e Y<2>están unidos, forman una estructura cíclica tal como se muestra en la fórmula II
en donde
R2 y R3 son, independientemente, hidrógeno o una agrupación orgánica que contiene cualquier número de átomos de carbono, 1-30 átomos de carbono, 1-20 átomos de carbono, o 1-14 átomos de carbono, y que opcionalmente incluye uno o más heteroátomos tales como agrupación de oxígeno, azufre, o nitrógeno en formatos estructurales lineales, ramificados, o cíclicos, siendo agrupaciones de R2 y R3 representativas grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C<3>-C<20>, cíclico C3-C20 sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido; o
R2 y R3, junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un anillo carbocíclico o heterocíclico no sustituido o sustituido de 3 a 8 miembros; y
R4 y R5 son, independientemente, hidrógeno o una agrupación orgánica que contiene cualquier número de átomos de carbono, 1-30 átomos de carbono, 1-20 átomos de carbono, o 1-14 átomos de carbono, y que opcionalmente incluye uno o más heteroátomos tales como agrupación de oxígeno, azufre, o nitrógeno en formatos estructurales lineales, ramificados, o cíclicos, siendo agrupaciones orgánicas representativas grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C3-C20, cíclico C3-C20 sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido.
En algunos ejemplos, y en la fórmula IX es un número entero desde 0 hasta 3; Re es independientemente amino, hidroxilo, tiol, oxo, o alquilo C<1>-C<6>, alcoxilo C<1>-C<6>, alquilamino C<1>-C<6>, o alquiltio C<1>-C<6>sustituido o no sustituido;
donde R<18>, R<19>, R<20>, R<21>, R<22>, y R<23>son independientemente C, O, N, o S, donde los enlaces entre R<18>a R<23>adyacentes son dobles o sencillos según la valencia, y donde R<18>a R<23>están unidos a ninguno, uno, o dos hidrógenos según la valencia; y
donde R24 es independientemente -(CR25R25)p- o -(CR25R25)p-Xb-(CR25R25)q-, donde p y q son independientemente números enteros desde 0 hasta 3, donde Xb está ausente, es -O-, -S-, -SO2-, o<n>R4, donde cada R25 está independientemente ausente, es hidrógeno, =O, =S, -OH, -SH, -NR4, donde R4 es alquilo C1-C6, alcoxilo C1-C6, alquilamino C1-C6, o alquiltio C1-C6 sustituido o no sustituido.
En algunos ejemplos, y en la fórmula IX es 2, R<18>es N, R<19>, R<20>, R<21>, R<22>, o R<2>3 es S, ambos Re son oxo y están unidos al S, y la totalidad de los enlaces entre R<18>a R<23>adyacentes son sencillos.
En algunos ejemplos, y en la fórmula IX es 2, ambos Re son oxo y están unidos a R21, R18 es N, R21 es S, y la totalidad de los enlaces entre R18 a R23 adyacentes son sencillos.
En algunos ejemplos, y en la fórmula IX es 2, ambos Re son oxo y están unidos a R21, R18 es N, R21 es S, y la totalidad de los enlaces entre R18 a R23 adyacentes son sencillos, Xb está ausente, q es 0, p es 1, y cada R25 es hidrógeno.
En algunos ejemplos, y en la fórmula IX es 1, Re es amino, y tres de los enlaces entre R<18>a R<23>adyacentes son dobles y tres de los enlaces entre R<18>a R<23>adyacentes son sencillos.
En algunos ejemplos, y en la fórmula IX es 1, Re es amino y está unido a R21, y tres de los enlaces entre R18 a R23 adyacentes son dobles y tres de los enlaces entre R18 a R23 adyacentes son sencillos.
En algunos ejemplos, y en la fórmula IX es 1, Re es amino y está unido a R2i , y tres de los enlaces entre Ri8 a R23 adyacentes son dobles y tres de los enlaces entre R<i>8 a R23 adyacentes son sencillos, Xb está ausente, p es 0 y q es 0.
En algunos ejemplos, y en la fórmula IX es 0, Ri9, R20, R2i , R22, o R23 es O, y la totalidad de los enlaces entre Ri8 a R23 adyacentes son sencillos.
En algunos ejemplos, y en la fórmula IX es 0, R<19>es O, y la totalidad de los enlaces entre R<18>a R<23>adyacentes son sencillos.
En algunos ejemplos, y en la fórmula IX es 0, R<19>es O, la totalidad de los enlaces entre R<18>a R<23>adyacentes son sencillos, Xb es oxígeno, p es 1, q es 0 y cada R<25>es hidrógeno.
En algunos ejemplos, R<19>y R<23>de la fórmula IX son O y la totalidad de los enlaces entre R<18>a R<23>adyacentes son sencillos.
En algunos ejemplos, R19 y R23 de la fórmula IX son O, los enlaces entre R18 y R19, y entre R21 y R22 son enlaces dobles, y el resto de los enlaces en el anillo son enlaces sencillos.
En algunos ejemplos, y en la fórmula IX es 1, Re es alcoxilo y está unido a R19, R20, R21, R21, R22, o enlaces entre R18 a R23 adyacentes son dobles y tres de los enlaces entre R18 a R23 adyacentes son sencillos.
En algunos ejemplos, y en la fórmula IX es 1, Re es alcoxilo y está unido a R19, tres de los enlaces entre R18 a R23 adyacentes son dobles y tres de los enlaces entre R18 a R23 adyacentes son sencillos.
En algunos ejemplos, y en la fórmula IX es 1, Re es metoxilo, y está unido a R19, R18 a R23 son átomos de carbono, tres de los enlaces entre R18 a R23 adyacentes son dobles y tres de los enlaces entre R18 a R23 adyacentes son sencillos, Xb está ausente, p es 0 y q es 0.
En algunos ejemplos, y en la fórmula IX es 1, Re es hidroxilo.
En algunos ejemplos, y en la fórmula IX es 1 y Re es hidroxilo unido en la posiciónparaal grupo metileno.
En algunos ejemplos, y en la fórmula IX es 1, Re es la fórmula XIII mostrada a continuación:
Fórmula XIII
en donde R8 es un alquilo sustituido y R<9>es un dialquilamino, o R8 es un dialquilamino y R<9>es un alquilo sustituido, en donde el alquilo sustituido es hidroximetilo y el dialquilamino es N,N-dietilamino.
En algunos ejemplos, y en la fórmula IX es 1, Re es la fórmula XIII, en donde R<8>es hidrógeno y R<9>es la fórmula IX mostrada a continuación:
o R8 es la fórmula IX y R<9>es hidrógeno. En algunos ejemplos, y en la fórmula IX es 0, R<19>, R<20>, R<21>, R<22>, o R<23>es O, y la totalidad de los enlaces entre R<18>a R<23>adyacentes son sencillos. En algunas realizaciones, y en la fórmula IX es 0, R<i 9>es O, y la totalidad de los enlaces entre R<i 8>a R<23>adyacentes son sencillos. En algunos ejemplos, y en la fórmula IX es 0, R<i 9>es O, la totalidad de los enlaces entre R<i8>a R<23>adyacentes son sencillos, Xb es oxígeno, p es 1, q es 0 y cada R<25>es hidrógeno.
En algunos ejemplos, y en la fórmula IX es 1, Re es la fórmula XIII, en donde R<8>es hidrógeno y R<9>es la fórmula VII o la fórmula VIII mostradas a continuación:
Fórmula VII Fórmula VIII
en donde R<31>, R<32>, R<33>, R<34>, R<35>, y R<36>son, independientemente, hidrógeno, grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C<3>-C<20>, cíclico C<3>-C<20>sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido. En algunos ejemplos, R31 de la fórmula VII es alquilo. En algunos ejemplos, R31 es metilo.
En algunos ejemplos, R31 de la fórmula VII es metilo, R32 y R33 son hidrógeno.
En algunos ejemplos, y en la fórmula IX es 1 y Re es hidroxilo unido en la posiciónparaal grupo metileno.
En algunos ejemplos de a fórmula XII, k es 1 y Rc es hidroxilo.
En algunos ejemplos de a fórmula XII, k es 1, Rc es hidroxilo, y Xd está ausente.
En algunos ejemplos de a fórmula XII, k es 1, Rc es hidroxilo, Xd está ausente, y R<10>-R<17>son hidrógeno.
En algunos ejemplos de a fórmula XII, Rc es alcoxilo.
En algunos ejemplos de a fórmula XII, Rc es metoxilo y Xd es O.
En algunos ejemplos de a fórmula XII, Rc es metoxilo, Xd es O, y R<10>-R<17>son hidrógeno.
En algunos ejemplos de a fórmula XII, k es 2 y Rc es alquilamino.
En algunos ejemplos de a fórmula XII, k es 2, Rc es metilamino, y Xd está ausente.
En algunos ejemplos de a fórmula XII, k es 2, Rc es metilamino, Xd está ausente, y R<10>-R<17>son hidrógeno.
En algunos ejemplos de a fórmula XII, k es 3, Xd es O y Rc es la fórmula XIII mostrada a continuación:
Fórmula XIII
en donde R8 y R<9>son alquilo.
En algunos ejemplos de la fórmula XII, k es 3, Xd es O, y Rc es la fórmula XIII, en donde R8 y R9 son metilo.
En algunos ejemplos de la fórmula XII, k es 3, Xd es O y Rc es la fórmula XIII, en donde R8 es hidrógeno, y R9 es carbonilo, o R8 es carbonilo, y R9 es hidrógeno.
En algunos ejemplos de la fórmula XII, k es 3, Xd es O y Rc es la fórmula XIII, en donde R8 es hidrógeno, y R9 es acetilo, o R8 es acetilo, y R9 es hidrógeno.
En algunos ejemplos de la fórmula XII, k es 3 y Rc es la fórmula XIII, R8 es hidrógeno, y R9 es la fórmula IX mostrada a continuación:
o R<8>es hidrógeno y R<9>es la fórmula IX.
En algunos ejemplos de la fórmula XII, k es 3 y Rc es la fórmula XIII, en donde R<8>es hidrógeno, y R<9>es la fórmula IX, o R<8>es hidrógeno y R<9>es la fórmula IX, en donde y en la fórmula IX es 2, Ri<8>es N, Ri 9, R20, R<2>i , R22, o R<23>es S, ambos Re son oxo y están unidos al S, y la totalidad de los enlaces entre R<i 8>a R<23>adyacentes son sencillos.
En algunos ejemplos de la fórmula XII, k es 3 y Rc es la fórmula XIII, en donde R<8>es hidrógeno, y R<9>es la fórmula IX, o R<8>es hidrógeno y R<9>es la fórmula IX, en donde y en la fórmula IX es 2, ambos Re son oxo y están unidos a R<2 i>, R<i 8>es N, R2<i>es S, y la totalidad de los enlaces entre R<i 8>a R<23>adyacentes son sencillos.
En algunos ejemplos de la fórmula XII, k es 3 y Rc es la fórmula XIII, en donde R<8>es hidrógeno, y R<9>es la fórmula IX, o R<8>es hidrógeno y R<9>es la fórmula IX, en donde y en la fórmula IX es 2, ambos Re son oxo y están unidos a R<2>i , Ri<8>es N, R2i es S, y la totalidad de los enlaces entre Ri<8>a R<23>adyacentes son sencillos, Xb está ausente, q es 0, p es 1, y cada R<25>es hidrógeno.
En algunos ejemplos de la fórmula XII, k es 3 y Rc es la fórmula XIII, en donde R<8>es hidrógeno, y R<9>es la fórmula IX, o R<8>es hidrógeno y R<9>es la fórmula IX, en donde y en la fórmula IX es 1, Re es amino, y tres de los enlaces entre R<18>a R<23>adyacentes son dobles y tres de los enlaces entre R<18>a R<23>adyacentes son sencillos.
En algunos ejemplos de la fórmula XII, k es 3 y Rc es la fórmula XIII, en donde R<8>es hidrógeno, y R<9>es la fórmula IX, o R<8>es hidrógeno y R<9>es la fórmula IX, en donde y en la fórmula IX es 1, Re es amino y está unido a R<21>, y tres de los enlaces entre R<18>a R<2>3 adyacentes son dobles y tres de los enlaces entre R<18>a R<2>3 adyacentes son sencillos. En algunos ejemplos de la fórmula XII, k es 3 y Rc es la fórmula XIII, en donde R8 es hidrógeno, y R9 es la fórmula IX, o R8 es hidrógeno y R9 es la fórmula IX, en donde y en la fórmula IX es 1, Re es amino y está unido a R21, y tres de los enlaces entre R18 a R23 adyacentes son dobles y tres de los enlaces entre R18 a R23 adyacentes son sencillos, Xb está ausente, p es 0 y q es 0.
En algunos ejemplos de la fórmula XII, k es 3 y Rc es la fórmula XIII, en donde R8 es hidrógeno, y R9 es la fórmula IX, o R8 es hidrógeno y R9 es la fórmula IX, en donde y en la fórmula IX es 0, R19, R20, R21, R22, o R23 es O, y la totalidad de los enlaces entre R18 a R23 adyacentes son sencillos.
En algunos ejemplos de la fórmula XII, k es 3 y Rc es la fórmula XIII, en donde R8 es hidrógeno, y R9 es la fórmula IX, o R8 es hidrógeno y R9 es la fórmula IX, en donde y en la fórmula IX es 0, R19 es O, y la totalidad de los enlaces entre R18 a R23 adyacentes son sencillos.
En algunos ejemplos de la fórmula XII, k es 3 y Rc es la fórmula XIII, en donde R<8>es hidrógeno, y R<9>es la fórmula IX, o R<8>es hidrógeno y R<9>es la fórmula IX, en donde y en la fórmula IX es 0, R<19>es O, la totalidad de los enlaces entre R<18>a R<2>3 adyacentes son sencillos, Xb es oxígeno, p es 1, q es 0 y cada R<25>es hidrógeno.
En algunos ejemplos de la fórmula XII, k es 3 y Rc es la fórmula XIII, en donde R<8>es hidrógeno, y R<9>es la fórmula IX, o R<8>es hidrógeno y R<9>es la fórmula IX, en donde y en la fórmula IX es 1, Re es alcoxilo y está unido a R<19>, R<20>, R<21>, R<21>, R<22>, o R<2>3, tres de los enlaces entre R<18>a R<2>3 adyacentes son dobles y tres de los enlaces entre R<18>a R<2>3 adyacentes son sencillos.
En algunos ejemplos de la fórmula XII, k es 3 y Rc es la fórmula XIII, en donde R8 es hidrógeno, y R9 es la fórmula IX, o R8 es hidrógeno y Rg es la fórmula IX, en donde y en la fórmula IX es 1, Re es alcoxilo y está unido a Rig, tres de los enlaces entre Ri8 a R<23>adyacentes son dobles y tres de los enlaces entre Ri8 a R<23>adyacentes son sencillos.
En algunos ejemplos de la fórmula XII, k es 3 y Rc es la fórmula XIII, en donde R8 es hidrógeno, y Rg es la fórmula
IX, o R8 es hidrógeno y Rg es la fórmula IX, en donde y en la fórmula IX es 1, Re es alcoxilo tal como metoxilo, y está unido a Rig, Ri8 a R<23>son átomos de carbono, tres de los enlaces entre Ri8 a R<23>adyacentes son dobles y tres de los enlaces entre Ri8 a R<23>adyacentes son sencillos, Xb está ausente, p es 0 y q es 0.
En algunos ejemplos, y en la fórmula XIV es 0, Rig, R<20>, R<2>i, R<2>i, o R<22>es O, y, según permita la valencia, dos de los enlaces entre Ri8 a R<22>adyacentes son enlaces dobles, y tres de los enlaces entre Ri8 a R<22>adyacentes son enlaces sencillos.
En algunos ejemplos, y en la fórmula XIV es 0, Rig es O, Ri8, R<20>, R<2>i y R<22>son C, los enlaces entre Ri8 y R<22>entre R<20>y R<2>i, son enlaces dobles, y el resto de los enlaces en el anillo son enlaces sencillos.
En algunos ejemplos, y en la fórmula XIV es 0, Rig es O, Ri8, R<20>, R<2>i y R<22>son C, los enlaces entre Ri8 y R<22>entre R<20>y R<2>i, son enlaces dobles, el resto de los enlaces en el anillo son enlaces sencillos, Xb está ausente, p es i, q es 0, y cada R<25>es hidrógeno.
En algunos ejemplos, y en la fórmula XIV es 0, Rig, R<20>, R<2>i, o R<22>es O, y, los enlaces entre Ri8 a R<22>adyacentes son enlaces sencillos.
En algunos ejemplos, y en la fórmula XIV es 0, Rig es O, Ri8, R<20>, R<2>i y R<22>son C, y los enlaces entre Ri8 a R<22>adyacentes son enlaces sencillos.
En algunos ejemplos, y en la fórmula XIV es 0, Rig es O, Ri8, R<20>, R<2>i y R<22>son C, los enlaces entre Ri8 a R<22>adyacentes son enlaces sencillos, Xb está ausente, p es i, q es 0, y cada R<25>es hidrógeno.
En algunos ejemplos, y en la fórmula XIV es 0, Rig y R<22>son O, y los enlaces entre Ri8 a R<22>adyacentes son enlaces sencillos.
En algunos ejemplos, y en la fórmula XIV es 0, Rig y R<22>son O, Ri8, R<2>i y R<22>son C, los enlaces entre Ri8 a R<22>adyacentes son enlaces sencillos.
En algunos ejemplos, y en la fórmula XIV es 0, Rig y R<22>son O, Ri8, R<2>i y R<22>son C, los enlaces entre Ri8 a R<22>adyacentes son enlaces sencillos, Xb está ausente, p es i, q es 0, y cada R<25>es hidrógeno.
En algunos ejemplos, R<37>de la fórmula XV es Si, y Xg es alquinilo.
En algunos ejemplos, R<37>de la fórmula XV es Si, Xg es etinilo, y R<38>es alquileno.
En algunos ejemplos, R<37>de la fórmula XV es Si, Xg es etinilo, R<38>es metileno, y R<3>g, R<40>, y R<4>i son alquilo.
En algunos ejemplos, R<37>de la fórmula XV es Si, Xg es etinilo, R<38>es metileno, y R<3>g, R<40>, y R<4>i son metilo.
Los alginatos modificados pueden ser o bien polímeros de alginato modificados de manera individual o bien polímeros de alginato modificados de manera múltiple. Los polímeros de alginato modificados de manera individual son polímeros de alginato que contienen uno o más monómeros modificados covalentemente, en donde sustancialmente la totalidad de los monómeros modificados covalentemente presentan la misma modificación covalente (es decir, el polímero contiene un “tipo” o una especie de monómero modificado covalentemente). Los polímeros de alginato modificados de manera múltiple son polímeros de alginato que contienen monómeros modificados covalentemente, en donde sustancialmente la totalidad de los monómeros modificados covalentemente no presentan la misma modificación covalente (es decir, el polímero contiene dos o más “tipos” o especies de monómeros modificados covalentemente).
En algunos ejemplos, el polímero de alginato modificado es un polímero de alginato modificado de manera individual. En algunas realizaciones, el polímero de alginato modificado es uno de los polímeros de alginato modificados de manera individual mostrados a continuación.
i4
En ejemplos preferidos, el polímero de alginato modificado es un polímero de alginato modificado de manera múltiple que presenta una estructura principal de polisacárido que contiene monómeros de manuronato, monómeros de guluronato, una primera especie o tipo de monómero modificado covalentemente definido por la fórmula I, y una segunda especie o tipo de monómero modificado covalentemente definido por la fórmula I. En algunos ejemplos, el polímero de alginato modificado es uno de los polímeros de alginato modificados de manera múltiple mostrados a continuación.
En algunos ejemplos, los alginatos modificados de manera múltiple son polímeros de alginato que contienen uno o más monómeros modificados covalentemente que tienen una estructura según la fórmula III
en donde
X es oxígeno, azufre, o NR<4>;
Ri es tal como se definió anteriormente,
R<6>, R<7>, R<8>, y R<9>son, independientemente, hidrógeno o una agrupación orgánica que contiene cualquier número de átomos de carbono, 1-30 átomos de carbono,<1 - 2 0>átomos de carbono, o 1-14 átomos de carbono, y que opcionalmente incluye uno o más heteroátomos tales como agrupación de oxígeno, azufre, o nitrógeno en formatos estructurales lineales, ramificados, o cíclicos, siendo agrupaciones orgánicas representativas grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, sulfonilo, sulfonilo sustituido, ácido sulfónico, fosforilo, fosforilo sustituido, fosfonilo, fosfonilo sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C<3>-C20, cíclico C<3>-C<20>sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido; en donde
Y<1>e Y<2>son independientemente hidrógeno o -PO(OR5)2; o
Y<2>está ausente, e Y1, junto con los dos átomos de oxígeno a los que Y<1>e Y<2>están unidos, forman una estructura cíclica tal como se muestra en la fórmula IV
en donde
R<2>y R<3>son, independientemente, hidrógeno o una agrupación orgánica que contiene cualquier número de átomos de carbono, 1-30 átomos de carbono, 1-20 átomos de carbono, o 1-14 átomos de carbono, y que opcionalmente incluye uno o más heteroátomos tales como agrupación de oxígeno, azufre, o nitrógeno en formatos estructurales lineales, ramificados, o cíclicos, siendo agrupaciones de R<2>y R<3>representativas grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C<3>-C20, cíclico C<3>-C<20>sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido; o R<2>y R<3>, junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un anillo carbocíclico o heterocíclico no sustituido o sustituido de 3 a<8>miembros; y
R<4>y R<5>son, independientemente, hidrógeno o una agrupación orgánica que contiene cualquier número de átomos de carbono, 1-30 átomos de carbono, 1-20 átomos de carbono, o 1-14 átomos de carbono, y que opcionalmente incluye uno o más heteroátomos tales como agrupación de oxígeno, azufre, o nitrógeno en formatos estructurales lineales, ramificados, o cíclicos, siendo agrupaciones de R<4>y R<5>representativas grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C<3>-C20, cíclico C<3>-C<20>sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido. En algunos ejemplos, R8, R9, o ambos son, independientemente, hidrógeno,
Fórmula VII Fórmula VIII
en donde R<3>i , R32, R33, R34, R35, y R36 son, independientemente, hidrógeno, grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C<3>-C<20>, cíclico C<3>-C<20>sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido. En algunos ejemplos, R<1>es
(A)
Fórmula X Fórmula XII
en donde k es independientemente un número entero desde 1 hasta 30; en donde z es un número entero desde 0 hasta 4; en donde Xd es O o S; en donde R<10>, R<11>, Ri2, Ri 3, Ri4, Ri5, Ri6, y Ri7 son independientemente hidrógeno, grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, sulfonilo, sulfonilo sustituido, ácido sulfónico, fosforilo, fosforilo sustituido, fosfonilo, fosfonilo sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C<3>-C<20>, cíclico C<3>-C<20>sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido; y en donde Ra y Rc son independientemente grupo alcoxilo, amino, alquilamino, dialquilamino, hidroxilo, alquenilo, alquinilo, alquilo sustituido, alquenilo sustituido, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C3-C20, cíclico C3-C20 sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido; o junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un anillo carbocíclico o heterocíclico no sustituido o sustituido de 3 a 8 miembros o
Fórmula XIII
en donde R8, R9, o ambos son, independientemente, hidrógeno,
en donde R<31>, R<32>, R<33>, R<34>, R<35>, y R<36>son, independientemente, hidrógeno, grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C<3>-C<20>, cíclico C<3>-C<20>sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido.
En algunos ejemplos, los alginatos modificados son polímeros de alginato que contienen una o más unidades de alginato modificado covalentemente descritas por la fórmula I, la fórmula II, la fórmula III, o la fórmula IV, en donde, para cada fórmula, R<2>, R<3>, R<4>, R<5>, R6, R<7>, R8, y R<9>son independientemente hidrógeno o una agrupación orgánica que contiene cualquier número de átomos de carbono, 1-30 átomos de carbono, 1-20 átomos de carbono, o 1-14 átomos de carbono, y que opcionalmente incluye uno o más heteroátomos tales como agrupación de oxígeno, azufre, o nitrógeno en formatos estructurales lineales, ramificados, o cíclicos, siendo agrupaciones orgánicas representativas grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C3-C20, cíclico C3-C20 sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido; o R2y R3, junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un anillo carbocíclico o heterocíclico no sustituido o sustituido de 3 a 8 miembros; y en donde R<1>no es hidrógeno o una agrupación orgánica que contiene cualquier número de átomos de carbono, 1-30 átomos de carbono, 1-20 átomos de carbono, o 1-14 átomos de carbono, y que opcionalmente incluye uno o más heteroátomos tales como agrupación de oxígeno, azufre, o nitrógeno en formatos estructurales lineales, ramificados, o cíclicos, siendo agrupaciones orgánicas representativas grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C3-C20, cíclico C3-C20 sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido.
En algunos ejemplos, los alginatos modificados son polímeros de alginato que contienen una o más unidades de alginato modificado covalentemente descritas por la fórmula I, la fórmula II, la fórmula III, o la fórmula IV, en donde, para cada fórmula, R<3>, R<4>, R<5>, R6, R<7>, R8, y R<9>son independientemente hidrógeno o una agrupación orgánica que contiene cualquier número de átomos de carbono, 1-30 átomos de carbono, 1-20 átomos de carbono, o 1-14 átomos de carbono, y que opcionalmente incluye uno o más heteroátomos tales como agrupación de oxígeno, azufre, o nitrógeno en formatos estructurales lineales, ramificados, o cíclicos, siendo agrupaciones orgánicas representativas grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C<3>-C<20>, cíclico C<3>-C<20>sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido; o R<2>y R<3>, junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un anillo carbocíclico o heterocíclico no sustituido o sustituido de 3 a 8 miembros; y en donde R<2>no es hidrógeno o una agrupación orgánica que contiene cualquier número de átomos de carbono, 1-30 átomos de carbono, 1-20 átomos de carbono, o 1-14 átomos de carbono, y que opcionalmente incluye uno o más heteroátomos tales como agrupación de oxígeno, azufre, o nitrógeno en formatos estructurales lineales, ramificados, o cíclicos, siendo agrupaciones orgánicas representativas grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C<3>-C<20>, cíclico C<3>-C<20>sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido.
En algunos ejemplos, los alginatos modificados son polímeros de alginato que contienen una o más unidades de alginato modificado covalentemente descritas por la fórmula I, la fórmula II, la fórmula III, o la fórmula IV, en donde, para cada fórmula, R<2>, R<4>, R<5>, R6, R<7>, Rs, y R<9>son independientemente hidrógeno o una agrupación orgánica que contiene cualquier número de átomos de carbono, 1-30 átomos de carbono, 1-20 átomos de carbono, o 1-14 átomos de carbono, y que opcionalmente incluye uno o más heteroátomos tales como agrupación de oxígeno, azufre, o nitrógeno en formatos estructurales lineales, ramificados, o cíclicos, siendo agrupaciones orgánicas representativas grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C<3>-C<20>, cíclico C<3>-C<20>sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido; o R<2>y R<3>, junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un anillo carbocíclico o heterocíclico no sustituido o sustituido de 3 a 8 miembros; y en donde R<3>no es hidrógeno o una agrupación orgánica que contiene cualquier número de átomos de carbono, 1-30 átomos de carbono, 1-20 átomos de carbono, o 1-14 átomos de carbono, y que opcionalmente incluye uno o más heteroátomos tales como agrupación de oxígeno, azufre, o nitrógeno en formatos estructurales lineales, ramificados, o cíclicos, siendo agrupaciones orgánicas representativas grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C<3>-C<20>, cíclico C<3>-C<20>sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido.
En algunos ejemplos, los alginatos modificados son polímeros de alginato que contienen una o más unidades de alginato modificado covalentemente descritas por la fórmula I, la fórmula II, la fórmula III, o la fórmula IV, en donde, para cada fórmula, R<2>, R<3>, R<5>, R6, R<7>, Rs, y R<9>son independientemente hidrógeno o una agrupación orgánica que contiene cualquier número de átomos de carbono, 1-30 átomos de carbono, 1-20 átomos de carbono, o 1-14 átomos de carbono, y que opcionalmente incluye uno o más heteroátomos tales como agrupación de oxígeno, azufre, o nitrógeno en formatos estructurales lineales, ramificados, o cíclicos, siendo agrupaciones orgánicas representativas grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C<3>-C<20>, cíclico C<3>-C<20>sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido; o R<2>y R<3>, junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un anillo carbocíclico o heterocíclico no sustituido o sustituido de 3 a 8 miembros; y en donde R<4>no es hidrógeno o una agrupación orgánica que contiene cualquier número de átomos de carbono, 1-30 átomos de carbono, 1-20 átomos de carbono, o 1-14 átomos de carbono, y que opcionalmente incluye uno o más heteroátomos tales como agrupación de oxígeno, azufre, o nitrógeno en formatos estructurales lineales, ramificados, o cíclicos, siendo agrupaciones orgánicas representativas grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C<3>-C<20>, cíclico C<3>-C<20>sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido.
En algunos ejemplos, los alginatos modificados son polímeros de alginato que contienen una o más unidades de alginato modificado covalentemente descritas por la fórmula I, la fórmula II, la fórmula III, o la fórmula IV, en donde, para cada fórmula, R<2>, R<3>, R<4>, R6, R<7>, Rs, y R<9>son independientemente hidrógeno o una agrupación orgánica que contiene cualquier número de átomos de carbono, 1-30 átomos de carbono, 1-20 átomos de carbono, o 1-14 átomos de carbono, y que opcionalmente incluye uno o más heteroátomos tales como agrupación de oxígeno, azufre, o nitrógeno en formatos estructurales lineales, ramificados, o cíclicos, siendo agrupaciones orgánicas representativas grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C<3>-C<20>, cíclico C<3>-C<20>sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido; o R<2>y R<3>, junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un anillo carbocíclico o heterocíclico no sustituido o sustituido de 3 a 8 miembros; y en donde R<5>no es hidrógeno o una agrupación orgánica que contiene cualquier número de átomos de carbono, 1-30 átomos de carbono, 1-20 átomos de carbono, o 1-14 átomos de carbono, y que opcionalmente incluye uno o más heteroátomos tales como agrupación de oxígeno, azufre, o nitrógeno en formatos estructurales lineales, ramificados, o cíclicos, siendo agrupaciones orgánicas representativas grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C<3>-C<20>, cíclico C<3>-C<20>sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido.
En algunos ejemplos, los alginatos modificados son polímeros de alginato que contienen una o más unidades de alginato modificado covalentemente descritas por la fórmula I, la fórmula II, la fórmula III, o la fórmula IV, en donde, para cada fórmula, R<2>, R<3>, R<4>, R<5>, R<7>, Rs, y R<9>son independientemente hidrógeno o una agrupación orgánica que contiene cualquier número de átomos de carbono, 1-30 átomos de carbono, 1-20 átomos de carbono, o 1-14 átomos de carbono, y que opcionalmente incluye uno o más heteroátomos tales como agrupación de oxígeno, azufre, o nitrógeno en formatos estructurales lineales, ramificados, o cíclicos, siendo agrupaciones orgánicas representativas grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C<3>-C<20>, cíclico C<3>-C<20>sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido; o R<2>y R<3>, junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un anillo carbocíclico o heterocíclico no sustituido o sustituido de 3 a 8 miembros; y en donde R6 no es hidrógeno o una agrupación orgánica que contiene cualquier número de átomos de carbono, 1-30 átomos de carbono, 1-20 átomos de carbono, o 1-14 átomos de carbono, y que opcionalmente incluye uno o más heteroátomos tales como agrupación de oxígeno, azufre, o nitrógeno en formatos estructurales lineales, ramificados, o cíclicos, siendo agrupaciones orgánicas representativas grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C<3>-C<20>, cíclico C<3>-C<20>sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido.
En algunos ejemplos, los alginatos modificados son polímeros de alginato que contienen una o más unidades de alginato modificado covalentemente descritas por la fórmula I, la fórmula II, la fórmula III, o la fórmula IV, en donde, para cada fórmula, R<2>, R<3>, R<4>, R<5>, R6, Rs, y R<9>son independientemente hidrógeno o una agrupación orgánica que contiene cualquier número de átomos de carbono, 1-30 átomos de carbono, 1-20 átomos de carbono, o 1-14 átomos de carbono, y que opcionalmente incluye uno o más heteroátomos tales como agrupación de oxígeno, azufre, o nitrógeno en formatos estructurales lineales, ramificados, o cíclicos, siendo agrupaciones orgánicas representativas grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C<3>-C<20>, cíclico C<3>-C<20>sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido; o R<2>y R<3>, junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un anillo carbocíclico o heterocíclico no sustituido o sustituido de 3 a 8 miembros; y en donde R<7>no es hidrógeno o una agrupación orgánica que contiene cualquier número de átomos de carbono, 1-30 átomos de carbono, 1-20 átomos de carbono, o 1-14 átomos de carbono, y que opcionalmente incluye uno o más heteroátomos tales como agrupación de oxígeno, azufre, o nitrógeno en formatos estructurales lineales, ramificados, o cíclicos, siendo agrupaciones orgánicas representativas grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C<3>-C<20>, cíclico C<3>-C<20>sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido.
En algunos ejemplos, los alginatos modificados son polímeros de alginato que contienen una o más unidades de alginato modificado covalentemente descritas por la fórmula I, la fórmula II, la fórmula III, o la fórmula IV, en donde, para cada fórmula, R<2>, R<3>, R<4>, R<5>, R6, R<7>, y R<9>son independientemente hidrógeno o una agrupación orgánica que contiene cualquier número de átomos de carbono, 1-30 átomos de carbono, 1-20 átomos de carbono, o 1-14 átomos de carbono, y que opcionalmente incluye uno o más heteroátomos tales como agrupación de oxígeno, azufre, o nitrógeno en formatos estructurales lineales, ramificados, o cíclicos, siendo agrupaciones orgánicas representativas grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C<3>-C<20>, cíclico C<3>-C<20>sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido; o R<2>y R<3>, junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un anillo carbocíclico o heterocíclico no sustituido o sustituido de 3 a 8 miembros; y en donde Re no es hidrógeno o una agrupación orgánica que contiene cualquier número de átomos de carbono, 1-30 átomos de carbono, 1-20 átomos de carbono, o 1-14 átomos de carbono, y que opcionalmente incluye uno o más heteroátomos tales como agrupación de oxígeno, azufre, o nitrógeno en formatos estructurales lineales, ramificados, o cíclicos, siendo agrupaciones orgánicas representativas grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C<3>-C<20>, cíclico C<3>-C<20>sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido.
En algunos ejemplos, los alginatos modificados son polímeros de alginato que contienen una o más unidades de alginato modificado covalentemente descritas por la fórmula I, la fórmula II, la fórmula III, o la fórmula IV, en donde, para cada fórmula, R<2>, R<3>, R<4>, R<5>, R6, R<7>, y Re son independientemente hidrógeno o una agrupación orgánica que contiene cualquier número de átomos de carbono, 1-30 átomos de carbono, 1-20 átomos de carbono, o 1-14 átomos de carbono, y que opcionalmente incluye uno o más heteroátomos tales como agrupación de oxígeno, azufre, o nitrógeno en formatos estructurales lineales, ramificados, o cíclicos, siendo agrupaciones orgánicas representativas grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C<3>-C<20>, cíclico C<3>-C<20>sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido; o R<2>y R<3>, junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un anillo carbocíclico o heterocíclico no sustituido o sustituido de 3 a 8 miembros; y en donde R<9>no es hidrógeno o una agrupación orgánica que contiene cualquier número de átomos de carbono, 1-30 átomos de carbono, 1-20 átomos de carbono, o 1-14 átomos de carbono, y que opcionalmente incluye uno o más heteroátomos tales como agrupación de oxígeno, azufre, o nitrógeno en formatos estructurales lineales, ramificados, o cíclicos, siendo agrupaciones orgánicas representativas grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C<3>-C<20>, cíclico C<3>-C<20>sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido.
Los polímeros de alginato modificados pueden contener cualquier razón de monómeros de manuronato, monómeros de guluronato, y monómeros modificados covalentemente. En realizaciones preferidas, más del 5 %, más del 10 %, más del 15 %, más del 20 %, más preferiblemente más del 25 %, y lo más preferiblemente más del 30 % de los monómeros en el polímero de alginato modificado son monómeros modificados covalentemente.
En ejemplos preferidos, el polímero de alginato modificado puede reticularse iónicamente para formar hidrogeles usando un ion polivalente, tal como Ca2+, Sr2+, o Ba2+. La capacidad de los alginatos modificados para formar hidrogeles estables en condiciones fisiológicas puede cuantificarse usando el ensayo de formación de hidrogel descrito en el presente documento. En ejemplos preferidos, el polímero de alginato modificado forma hidrogeles de manera que la intensidad de fluorescencia medida usando el ensayo de alto rendimiento descrito en el presente documento es de entre 15.000 y 55.000, preferiblemente de entre 20.000 y 55.000, más preferiblemente de entre 25.000 y 55.000.
En ejemplos preferidos, el alginato modificado es biocompatible, e induce una menor respuesta a cuerpos extraños que el alginato no modificado. La biocompatibilidad de los alginatos modificados puede determinarse cuantitativamente usando ensayosin vitroein vivoconocidos en el campo, incluyendo el ensayo de biocompatibilidadin vivodescrito en el presente documento. En ejemplos preferidos, el polímero de alginato modificado es biocompatible de manera que la respuesta de fluorescencia normalizada con respecto al alginato no modificado medida usando el ensayo de biocompatibilidadin vivodescrito en el presente documento es menor del 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, o 50%. También se describen ensayos para la caracterización de polímeros de alginato modificados.
También se describe un ensayo de alto rendimiento útil para caracterizar la capacidad de los polímeros de alginato modificados para formar hidrogeles. En algunos ejemplos, el ensayo de formación de hidrogel descrito en el presente documento se usa para cuantificar la estabilidad de hidrogeles formados a partir de alginatos o alginatos modificados. En ejemplos preferidos, el ensayo de formación de hidrogel descrito en el presente documento se usa como herramienta de cribado para identificar alginatos modificados capaces de formar hidrogeles estables. El ensayo de biocompatibilidadin vivode alto rendimiento descrito en el presente documento se usa para identificar alginatos modificados que inducen una menor respuesta a cuerpos extraños que el alginato no modificado. También se proporcionan ensayos para cuantificar la biocompatibilidad de alginatos modificados.
Además, en el presente documento se describen métodos de recubrimiento de productos médicos, dispositivos, y superficies usando polímeros de alginato modificados. En ejemplos particulares, los polímeros de alginato modificados descritos en el presente documento se usan para recubrir productos, dispositivos, y superficies para su uso en métodos de tratamiento de una enfermedad o un trastorno en un paciente humano o animal. En algunos ejemplos, una enfermedad o un trastorno en un paciente humano o animal se trata trasplantando o implantando productos, dispositivos, y superficies recubiertos con un polímero de alginato modificado. En ejemplos particulares, una enfermedad o un trastorno en un paciente humano o animal se trata trasplantando o implantando productos, dispositivos, y superficies recubiertos con un polímero de alginato modificado.
Además, en el presente documento se describen métodos de encapsulación de materiales biológicos usando polímeros de alginato modificados. En ejemplos particulares, los polímeros de alginato modificados descritos en el presente documento se usan para encapsular células para su uso en métodos de tratamiento de una enfermedad o un trastorno en un paciente humano o animal. En algunos ejemplos, una enfermedad o un trastorno en un paciente humano o animal se trata trasplantando material biológico exógeno encapsulado en un polímero de alginato modificado. En ejemplos particulares, una enfermedad o un trastorno en un paciente humano o animal se trata trasplantando células encapsuladas en un polímero de alginato modificado. En ejemplos más particulares, la diabetes se trata trasplantando células de los islotes pancreáticos encapsuladas en un polímero de alginato modificado.
Ejemplos de células adecuadas para la encapsulación y el trasplante son preferiblemente células secretoras o metabólicas (es decir, secretan un factor terapéutico o metabolizan toxinas, o ambos) o células estructurales (por ejemplo, piel, músculo, vaso sanguíneo), o células metabólicas (por ejemplo, metabolizan sustancias tóxicas). En algunos ejemplos, las células son secretoras de manera natural, tales como células de los islotes que secretan insulina de manera natural, o metabólicas de manera natural, tales como hepatocitos que detoxifican y secretan de manera natural. En algunos ejemplos, las células se modifican por bioingeniería para expresar una proteína recombinante, tal como una proteína secretada o enzima metabólica. Dependiendo del tipo de célula, las células pueden organizarse como células individuales, agregados de células, esferoides, o incluso tejido natural o modificado por bioingeniería.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra la estructura general de los alginatos modificados obtenidos usando el enfoque de síntesis combinatoria descrito en el ejemplo 1. El número de alginatos preparados con cada estructura general se indica debajo.
La figura 2 es una representación gráfica obtenida a partir del ensayo de formación de hidrogel descrito en el ejemplo 2. Se representan gráficamente los valores de intensidad de fluorescencia promedio medidos para los alginatos modificados. Los alginatos modificados que produjeron valores de fluorescencia por debajo de 15.000 se consideraron inutilizables para aplicaciones donde la formación de hidrogel es crítica (es decir, la encapsulación de células).
La figura 3 es una representación gráfica que muestra el efecto de alginatos modificados seleccionados sobre la viabilidad de la línea celular HeLa en comparación con el control positivo (sin alginato). El alginato (Alg) tiene una viabilidad del 53 %. Se muestran varios polímeros que son más citotóxicos que Alg; sin embargo, la mayor parte de la biblioteca funciona tan bien o mejor que Alg.
La figura 4 es una representación gráfica obtenida usando el métodoin vivodescrito en el ejemplo 5, que cuantifica la biocompatibilidad de alginatos modificados seleccionados. La respuesta de fluorescencia obtenida para los alginatos modificados usando el métodoin vivodescrito en el ejemplo 5 se normalizó con respecto a la respuesta de fluorescencia medida usando alginato no modificado con el fin de cuantificar la biocompatibilidad de los alginatos modificados en cuanto al % de respuesta de fluorescencia.
La figura 5 es una representación gráfica que detalla el nivel de glucemia de ratones a los que se trasplantaron islotes de rata encapsulados en alginatos modificados seleccionados, así como dos alginatos no modificados diferentes (CMIT y CJOS). La línea a trazos representa la normoglucemia en ratones. 5 días tras la implantación, 287_F4, CJOS, 287_B4, 263_C12, y CMIT están por encima de la línea a trazos, mientras que los demás están por debajo de la línea. 20 días tras la implantación, las líneas son, desde la parte superior hasta la parte inferior: CJOS, 287_G3, 287_F4, 287B_B4, CMIT, 287B_B8, 263_C12, 263_C6, 287_B3, 287_D3, y 263_A7.
La figura 6 es un gráfico de barras que muestra la respuesta inflamatoria (tal como se mide mediante la fluorescencia normalizada con respecto a VLVG) en función del alginato modificado (combinado con alginato no modificado).
La figura 7 es un diagrama de las estructuras de las aminas, los alcoholes, las azidas, y los alquinos usados para la modificación química del alginato. La designación “N” indica reactivos de amidación, las designaciones “O” indican reactivos de esterificación, y las designaciones “Y” indican reactivos de química clic.
La figura 8 es un gráfico del análisis por FACS de macrófagos (CD11b+, CD68+) y neutrófilos (CD11b+, Ly6g+) aislados de cápsulas Z2-Y12, Z1-Y15, Z1-Y19, SLG20, y V/S recuperadas después de 14 días en el espacio IP de ratones C57BL/6. *** = p < 0,0001, ns = no significativo.
La figura 9 es un diagrama del esquema para la síntesis de 774 análogos de alginato.
La figura 10 es un gráfico de la cuantificación por inmunotransferencia de tipo Western de la proteína a-SMA aislada de implantes recuperados a partir de STZ-C57BL/6J.
La figura 11 es un gráfico que muestran la evaluación secundaria de catepsina de los 70 alginatos modificados mejores del cribado inicial formulados como cápsulas de 300 |am. Datos normalizados con respecto a la fluorescencia de las cápsulas de VLVG. Las diez cápsulas de análogos de alginato con los niveles más bajos de catepsina están a la derecha con un sombrado más claro.
La figura 12 es un gráfico del análisis del panel de citocinas (Elispot) de la proteína extraída a partir de cápsulas de 300 |am de las diez cápsulas de análogos de alginato mejores y cápsulas de alginato de control (SLG20, V/S) recuperadas a partir del espacio IP de ratones C57BL/6 después de 14 días. Para cada cohorte n=5. # indica una diferencia de significación entre las medias con p<0,01.
La figura 13 es una estructura química de alginato de dióxido de triazol-tiomorfolina (TMTD).
La figura 14 son gráficos del análisis por FACS de implantes de células humanas encapsuladas recuperadas después de 14 días IP en C57BL/6 que muestran macrófagos y neutrófilos.
La figura 15 son gráficos del análisis por FACS de implantes de células humanas encapsuladas recuperadas después de 14 días IP en C57BL/6 que muestran células B y células T CD8.
La figura 16 es un mapa térmico de la cuantificación proteómica de proteínas detectadas en aislados de proteína de implantes recuperados a partir de STZ-C57BL/6J. Cada columna en el mapa térmico es un ratón STZ-C57BL/6 individual de la cohorte respectiva.
Descripción detallada de la invención
Los alginatos son una clase de copolímeros de polisacáridos lineales formados a partir de p-D-manuronato (M) unido por enlace 1-4-glucosídico y su epímero C-5 a-L-guluronato (G). Los alginatos son biopolímeros que se producen de manera natural producidos por una variedad de organismos, incluyendo algas pardas marinas y al menos dos géneros de bacterias(PseudomonasyAzotobacter).Normalmente, los alginatos comerciales se aíslan a partir de algas marinas, incluyendoMacrocystis pyrifera, Ascophyllum nodosum,y diversos tipos deLaminaria.
Tres tipos de estructura primaria definen la estructura principal de polisacárido de los alginatos: regiones homopoliméricas de monómeros de guluronato consecutivos (bloques G), regiones homopoliméricas de monómeros de manuronato consecutivos (bloques M), y regiones que contienen monómeros de manuronato y guluronato alternos (bloques MG). Los bloques de monómeros presentan diferentes conformaciones en disolución, que van desde una estructura extendida flexible (bloques M) hasta una estructura compacta rígida (bloques G). En el caso de los bloques G, la conformación compacta facilita la quelación de iones multivalentes, en particular los iones Ca2+, de manera que los bloques G en una cadena de alginato pueden reticularse iónicamente con los bloques G en otra cadena de alginato, formando geles estables. Como resultado, la proporción, la longitud, y la distribución de los bloques de monómeros influyen en las propiedades fisicoquímicas del polímero de alginato.
En el caso de alginatos producidos comercialmente obtenidos a partir de algas, el peso molecular, la estructura primaria, y la razón molar general de los monómeros de ácido urónico (razón de M/G) en el polímero de alginato dependen de varios factores, incluyendo la especie que produce el alginato, el momento del año en que se recoge la especie, y la ubicación y la edad del cuerpo de algas. Como resultado, están disponibles comercialmente alginatos que presentan una gama de propiedades fisicoquímicas, tales como peso molecular y viscosidad.
Los alginatos pueden reticularse iónicamente a temperatura ambiente y pH neutro para formar hidrogeles. La capacidad de los alginatos para formar geles estables en condiciones fisiológicamente compatibles hace que los geles de alginato sean útiles en varias aplicaciones biomédicas. Por ejemplo, los geles de alginato se han usado como matriz para la administración de fármacos para modular la farmacocinética de agentes terapéuticos, diagnósticos, y profilácticos.
I. Definiciones
“Alginato”, tal como se usa en el presente documento, es un término colectivo usado para referirse a polisacáridos lineales formados a partir de p-D-manuronato y a-L-guluronato en cualquier razón de M/G, así como a sales y derivados de los mismos. El término “alginato”, tal como se usa en el presente documento, abarca cualquier polímero que tenga la estructura mostrada a continuación, así como sales del mismo.
“Biocompatible”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un material que realiza su función deseada cuando se introduce en un organismo sin inducir una respuesta inflamatoria, inmunogenicidad, o citotoxicidad significativa a las células, los tejidos, u órganos nativos. La biocompatibilidad, tal como se usa en el presente documento, puede cuantificarse usando el ensayo de biocompatibilidadin vivodescrito en el presente documento en el ejemplo 5.
“Respuesta a cuerpos extraños”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la respuesta inmunológica del tejido biológico a la presencia de cualquier material extraño en el tejido que puede incluir adsorción de proteínas, macrófagos, células gigantes de cuerpos extraños multinucleadas, fibroblastos, y angiogénesis.
“Alginato modificado químicamente” o “alginato modificado” se usan indistintamente en el presente documento, y se refieren a polímeros de alginato que contienen uno o más monómeros modificados covalentemente.
“Monómero modificado covalentemente”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un monómero que es un análogo o derivado de un monómero de manuronato y/o guluronato obtenido a partir de un monómero de manuronato y/o guluronato a través de un procedimiento químico.
“Poner en contacto”, tal como se usa en el presente documento en el contexto de recubrir, se refiere a cualquier modo de recubrir un sustrato o una superficie con un polímero, tal como los polímeros de alginato modificados divulgados en el presente documento. Poner en contacto puede incluir, pero no se limita a, recubrir por inmersión de manera intraoperatoria, pulverizar, humectar, sumir, sumergir, pintar, unir o adherir, someter a derivatización de superficie por etapas, o dotar de otro modo a un sustrato o una superficie de un compuesto con el polímero policatiónico hidrófobo. El polímero puede unirse de manera covalente o no covalente al sustrato o la superficie. En algunas realizaciones, el polímero se asocia de manera no covalente con la superficie.
“Recubrimiento”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier capa, revestimiento o superficie temporal, semipermanente o permanente. Un recubrimiento puede aplicarse como gas, vapor, líquido, pasta, semisólido, o sólido. Además, un recubrimiento puede aplicarse como líquido y solidificarse para dar un recubrimiento duro. Los recubrimientos pueden diseñarse por ingeniería para tener elasticidad que admite la flexibilidad, por ejemplo, hinchamiento o contracción, del sustrato o la superficie que va a recubrirse. Los recubrimientos preferidos son los polímeros de alginato modificados divulgados en el presente documento.
“Independientemente”, tal como se usa en el presente documento en el contexto de las fórmulas químicas (y a menos que el contexto indique claramente lo contrario), significa que cada aparición del grupo al que se hace referencia se elige independientemente de las demás apariciones de ese grupo. Por ejemplo, cada aparición del grupo podría ser diferente de cada una de las demás apariciones, algunas de las demás apariciones, o ninguna otra aparición del grupo. Cuando se hace referencia a múltiples grupos, “independientemente” significa que cada aparición de cada grupo dado se elige independientemente de las demás apariciones del grupo respectivo y que cada uno de los grupos se elige independientemente de los demás grupos. Por ejemplo, cada aparición de un primer grupo podría ser diferente de cada una de las demás apariciones, algunas de las demás apariciones, o ninguna otra aparición de un segundo grupo (o tercer, o cuarto, etc., grupo).
“Componente”, tal como se usa en el presente documento en el contexto de productos médicos, tales como dispositivos médicos, es una parte de un producto que está estructuralmente integrada con ese producto. Un componente puede aplicarse a un sustrato o a la superficie de un producto, estar contenido dentro de la sustancia del producto, estar retenido en el interior del producto, o cualquier otra disposición mediante la cual esa parte sea un elemento integral de la estructura del producto. Como un ejemplo, el revestimiento de silicona que rodea la parte mecánica de un marcapasos es un componente del marcapasos. Un componente puede ser la luz de un producto, donde la luz realiza cierta función esencial para la función general del producto. La luz de un orificio de expansor tisular es un componente del expansor tisular. Un componente puede referirse a un depósito o a una zona discreta dentro del producto específicamente adaptado para la administración de un fluido a una superficie del producto. Un depósito dentro de un dispositivo de administración de fármacos implantable es un componente de ese dispositivo. La expresión “cantidad eficaz”, tal como se usa en el presente documento en el contexto de un recubrimiento, se refiere generalmente a la cantidad del recubrimiento aplicada al implante con el fin de proporcionar uno o más criterios de valoración clínicamente medibles, tales como una respuesta a cuerpos extraños reducida en comparación con un implante no recubierto, un implante recubierto con un recubrimiento no modificado, u otro control adecuado. La expresión “cantidad eficaz”, tal como se usa en el presente documento en el contexto de una célula, una cápsula, un dispositivo, una composición o un compuesto, se refiere a una cantidad no tóxica pero suficiente de la célula, la cápsula, el dispositivo, la composición o el compuesto para proporcionar el resultado deseado. La cantidad exacta requerida puede variar de sujeto a sujeto, dependiendo de la especie, la edad, y el estado general del sujeto; la gravedad de la enfermedad que está tratándose; la célula, la cápsula, el dispositivo, la composición o el compuesto particular usado; su modo de administración; y otras variables de rutina. Una cantidad eficaz apropiada puede determinarla un experto habitual en la técnica usando únicamente experimentación de rutina.
“Superficie” o “superficies”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier superficie de cualquier material sólido o semisólido, incluyendo vidrio, plásticos, metales, polímeros, y similares. Esto incluye superficies construidas con más de un material, incluyendo superficies recubiertas.
“Polímero de alginato modificado de manera individual”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a alginatos modificados que contienen uno o más monómeros modificados covalentemente, en donde sustancialmente la totalidad de los monómeros modificados covalentemente presentan la misma modificación covalente (es decir, el polímero contiene un “tipo” o una especie de monómero modificado covalentemente). Los polímeros de alginato modificados de manera individual incluyen, por ejemplo, polímeros de alginato modificados en donde sustancialmente la totalidad de los monómeros en el polímero de alginato modificado están representados por monómeros de manuronato, monómeros de guluronato, y un monómero modificado covalentemente definido por la fórmula I. No necesariamente todos los monómeros están modificados covalentemente.
“Cápsula”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una partícula que tiene un diámetro medio de aproximadamente 150 |im a aproximadamente 5 cm, formada de un hidrogel reticulado, que tiene un núcleo de hidrogel reticulado que está rodeado por una o más cubiertas poliméricas, que tiene una o más capas de hidrogel reticulado, que tiene un recubrimiento de hidrogel reticulado, o una combinación de los mismos. La cápsula puede tener cualquier forma adecuada para, por ejemplo, la encapsulación de células. La cápsula puede contener una o más células dispersas en el hidrogel reticulado, “encapsulando” de ese modo las células. En el presente documento, a menos que el contexto indique claramente lo contrario, la referencia a “cápsulas” se refiere a, e incluye, microcápsulas. Las cápsulas preferidas tienen un diámetro medio de aproximadamente 150 |im a aproximadamente 8 mm.
“Microcápsula” y “microgel”, tal como se usan en el presente documento, se usan indistintamente para referirse a una partícula o cápsula que tiene un diámetro medio de aproximadamente 150 |im a aproximadamente 1000 |im. “Material biológico”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier sustancia biológica, incluyendo, pero sin limitarse a, tejido, células, micromoléculas biológicas tales como nucleótidos, aminoácidos, cofactores y hormonas, macromoléculas biológicas tales como ácidos nucleicos, polipéptidos, proteínas (por ejemplo, enzimas, receptores, proteínas secretoras, proteínas estructurales y de señalización, hormonas, ligandos, etc.), polisacáridos, y/o cualquier combinación de los mismos.
“Célula”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a células individuales, líneas celulares, cultivos primarios, o cultivos derivados de tales células, a menos que se indique específicamente. “Cultivo”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una composición que incluye células aisladas del mismo tipo o de un tipo diferente. “Línea celular”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un cultivo celular establecido de manera permanente que proliferará indefinidamente si se le da espacio y medio nuevo apropiado, haciendo de ese modo que la línea celular sea “inmortal”. “Cepa celular”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un cultivo celular que tiene una pluralidad de células adaptadas al cultivo, pero con potencial de división finito. “Cultivo celular”, tal como se usa en el presente documento, es una población de células hechas crecer en un medio tal como agar.
Las células pueden ser, por ejemplo, xenogénicas, autólogas, o alogénicas. Las células también pueden ser células primarias. Las células también pueden ser células derivadas del cultivo y la expansión de una célula obtenida de un sujeto. Por ejemplo, las células también pueden ser células madre o derivarse de células madre. Las células también pueden ser células inmortalizadas. Las células también pueden estar genéticamente modificadas por ingeniería para expresar una proteína, un ácido nucleico, u otro producto.
“Célula de mamífero”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier célula derivada de un sujeto mamífero.
“Autólogo”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un material biológico trasplantado, tal como células, tomado del mismo individuo.
“Alogénico”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un material biológico trasplantado, tal como células, tomado de un individuo diferente de la misma especie.
“Xenogénico”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un material biológico trasplantado, tal como células, tomado de una especie diferente.
“Célula endocrina”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una célula del sistema endocrino. “Célula endocrina secretora”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una célula endocrina que secreta una o más hormonas.
“Célula de los islotes”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una célula endocrina derivada de un páncreas de mamífero. Las células de los islotes incluyen células alfa que secretan glucagón, células beta que secretan insulina y amilina, células delta que secretan somatostatina, células PP que secretan polipéptido pancreático, o células épsilon que secretan grelina. El término incluye poblaciones homogéneas y heterogéneas de estas células. En realizaciones preferidas, una población de células de los islotes contiene al menos células beta. “Célula productora de hormonas”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una célula que produce una o más hormonas. Las células productoras de hormonas preferidas producen hormona en respuesta a un estímulo fisiológico, tal como el estímulo fisiológico que provoca la secreción de la hormona a partir de una célula endocrina que secreta de manera natural la hormona. Las células endocrinas secretoras, las células productoras de hormonas derivadas de células madre, y las células genéticamente modificadas por ingeniería para producir hormonas son ejemplos de células productoras de hormonas.
“Célula productora de insulina”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una célula que produce insulina. Las células productoras de insulina preferidas producen insulina en respuesta a los niveles de glucosa. Las células beta de los islotes, las células productoras de insulina derivadas de células madre, y las células genéticamente modificadas por ingeniería para producir insulina son ejemplos de células productoras de insulina. “Trasplante”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la transferencia de una célula, un tejido, u órgano a un sujeto desde otra fuente. El término no se limita a un modo particular de transferencia. Las células encapsuladas pueden trasplantarse mediante cualquier método adecuado, tal como mediante inyección o implantación quirúrgica.
“Células primarias”, “líneas celulares primarias” y “cultivos primarios”, tal como se usan en el presente documento, se usan indistintamente para referirse a células y cultivos celulares que se han derivado de un sujeto y se ha permitido su crecimientoin vitrodurante un número limitado de pases, es decir, divisiones, del cultivo.
“Célula madre mesenquimatosa” o “MSC”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a células madre multipotentes presentes en o derivadas de tejido mesenquimatoso que pueden diferenciarse en una variedad de tipos de células, incluyendo: osteoblastos, condrocitos, y adipocitos.
“Derivadas de”, tal como se usa en el presente documento, con respecto a células, se refiere a células obtenidas a partir de tejido, líneas celulares, o células, que luego se cultivan, someten a pases, diferencian, inducen, etc., para producir las células derivadas. Por ejemplo, las células madre pluripotentes inducidas se derivan de células somáticas.
“Pluripotencia”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad de las células para diferenciarse en múltiples tipos de células en un organismo. Por “células madre pluripotentes” se entiende células que pueden autorrenovarse y diferenciarse para producir todos los tipos de células en un organismo. Por “multipotencia” se entiende la capacidad de las células para diferenciarse en algunos tipos de células en un organismo, pero no en todos, normalmente en células de un tejido o linaje celular particular.
“Células multipotentes” y “células madre adultas”, tal como se usan en el presente documento, se refieren a cualquier tipo de célula madre que no se deriva de un embrión o feto y generalmente tiene una capacidad limitada para generar nuevos tipos de células (denominada “multipotencia”) y que está comprometida a un linaje particular.
“Célula madre pluripotente inducida”, tal como se usa en el presente documento, abarca células madre pluripotentes que, al igual que las células madre embrionarias (ES), pueden cultivarse durante un largo periodo de tiempo mientras se mantiene la capacidad para diferenciarse en todos los tipos de células en un organismo, pero que, a diferencia de las células ES (que se derivan de la masa celular interna de los blastocistos), se derivan de células somáticas.
Para mayor claridad de la discusión en el presente documento, los alginatos modificados de manera individual se definen usando fórmulas que ilustran la estructura de los monómeros modificados covalentemente incorporados en la estructura principal y omitiendo los monómeros de manuronato y guluronato. Por ejemplo, un polímero de alginato modificado de manera individual compuesto por monómeros de manuronato, monómeros de guluronato, y un monómero modificado covalentemente definido por la fórmula I, en donde X es NR4, Ri es metilo, y R4, Yi, e Y2 son hidrógeno, se ilustra en el presente documento por la estructura a continuación.
“Polímero de alginato modificado de manera múltiple”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a alginatos modificados que contienen monómeros modificados covalentemente, en donde sustancialmente la totalidad de los monómeros modificados covalentemente no presentan la misma modificación covalente (es decir, el polímero contiene dos o más “tipos” o especies diferentes de monómeros modificados covalentemente). Los polímeros de alginato modificados de manera múltiple incluyen, por ejemplo, polímeros de alginato modificados en donde sustancialmente la totalidad de los monómeros en el polímero de alginato modificado están representados por monómeros de manuronato, monómeros de guluronato, y dos o más tipos diferentes de monómeros modificados covalentemente definidos por la fórmula I. Tal como se usa en este contexto, un “tipo” o una “especie” de monómero modificado covalentemente se refiere a un monómero covalente definido por la fórmula I, en donde todas las posiciones variables posibles están definidas químicamente. No todos los monómeros están modificados covalentemente.
Para mayor claridad de la discusión en el presente documento, los alginatos modificados se definen usando fórmulas que ilustran los monómeros modificados covalentemente incorporados en la estructura principal y omitiendo los monómeros de manuronato y guluronato. Por ejemplo, un polímero de alginato modificado de manera múltiple compuesto por monómeros de manuronato, monómeros de guluronato, y dos tipos diferentes de monómeros modificados covalentemente, en donde el primer tipo de monómero modificado covalentemente está definido por la fórmula I, en donde X es NR4, R1 es metilo, y R4, Y1, e Y2 son hidrógeno, y el segundo tipo de monómero modificado covalentemente está definido por la fórmula I, en donde X es oxígeno, Ri es etilo, e Yi e Y2 son hidrógeno, se ilustra por la estructura a continuación.
“Análogo” y “derivado”, en el contexto de compuestos químicos, se usan indistintamente en el presente documento, y se refieren a un compuesto que tiene una estructura similar a la de un compuesto original, pero que varía con respecto al compuesto original por una diferencia en uno o más componentes determinados. Los análogos o derivados difieren del compuesto original en uno o más átomos, grupos funcionales, o subestructuras, que se reemplazan por otros átomos, grupos, o subestructuras. Puede imaginarse que un análogo o derivado se forma, al menos teóricamente, a partir del compuesto original a través de algún procedimiento químico o físico. Los términos análogo y derivado abarcan compuestos que conservan la misma estructura básica de anillos que el compuesto original, pero presentan uno o más sustituyentes diferentes en el/los anillo(s). Por ejemplo, análogo o derivado de manuronato o guluronato se refiere a compuestos que conservan el núcleo del monómero, por ejemplo, el anillo de piranosa, pero difieren en uno o más sustituyentes en el anillo.
“Manuronato” y “monómero de manuronato”, tal como se usan en el presente documento, se refieren a monómeros de ácido manurónico, así como a sales de los mismos.
“Guluronato” y “monómero de guluronato”, tal como se usan en el presente documento, se refieren a monómeros de ácido gulurónico, así como a sales de los mismos.
“Sustancialmente”, tal como se usa en el presente documento, especifica una cantidad del 95 % o más, el 96 % o más, el 97 % o más, el 98 % o más, o el 99 % o más.
“Temperatura de transición vítrea” (Tg), tal como se usa en el presente documento, se refiere a la temperatura a la que se observa una transición reversible en materiales amorfos desde un estado duro y relativamente frágil hasta un estado fundido o similar a un caucho. Los valores de Tg para los polímeros de alginato pueden determinarse experimentalmente usando calorimetría diferencial de barrido (DSC, con calentamiento y enfriamiento a una velocidad de 10 K/min). En todos los casos en el presente documento, los valores de Tg se miden usando muestras de polímero en polvo.
“Química clic”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a reacciones químicas usadas para acoplar dos compuestos juntos que son de alto rendimiento, de amplio alcance, sólo crean subproductos que pueden retirarse sin cromatografía, son estereoespecíficas, sencillas de realizar, y pueden llevarse a cabo en disolventes fácilmente eliminables o benignos. Los ejemplos de reacciones que cumplen estos criterios incluyen la apertura nucleófila del anillo de epóxidos y aziridinas, reacciones carbonílicas de tipo no aldólicas, incluyendo la formación de hidrazonas y heterociclos, adiciones a múltiples enlaces carbono-carbono, incluyendo adiciones de Michael, y reacciones de cicloadición, tales como una reacción de cicloadición 1,3-dipolar (es decir, una reacción de cicloadición de Huisgen). Véanse, por ejemplo, Moses y Moorhouse, Chem Soc. Rev. 36:1249-1262 (2007); Kolb y Sharpless, Drug Discovery Today. 8(24): 1128-1137 (2003); y Kolbet al,Angew. Chem. Int. Ed. 40:2004-2021 (2001).
“Catión polivalente”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cationes que tienen una carga positiva mayor de 1. Los ejemplos incluyen Ca2+, Ba2+, y Sr2+.
“Sustituido”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a todos los sustituyentes permisibles de los compuestos o grupos funcionales descritos en el presente documento. En el sentido más amplio, los sustituyentes permisibles incluyen sustituyentes acíclicos y cíclicos, ramificados y no ramificados, carbocíclicos y heterocíclicos, aromáticos y no aromáticos de compuestos orgánicos. Los sustituyentes ilustrativos incluyen halógenos, grupos hidroxilo, o cualesquiera otras agrupaciones orgánicas que contienen cualquier número de átomos de carbono, preferiblemente 1-14 átomos de carbono, y opcionalmente incluyen uno o más heteroátomos tales como agrupación de oxígeno, azufre, o nitrógeno en formatos estructurales lineales, ramificados, o cíclicos. Los sustituyentes representativos incluyen grupos alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, halo, hidroxilo, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, ciano, isociano, isociano sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, sulfonilo, sulfonilo sustituido, ácido sulfónico, fosforilo, fosforilo sustituido, fosfonilo, fosfonilo sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C<3>-C<20>, cíclico C<3>-C<20>sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, péptido, y polipéptido.
Los heteroátomos tales como nitrógeno pueden tener sustituyentes de hidrógeno y/o cualquier sustituyente permisible de los compuestos orgánicos descritos en el presente documento que satisfagan las valencias de los heteroátomos. Se entiende que “sustitución” o “sustituido” incluye la condición implícita de que tal sustitución es según la valencia permitida del átomo sustituido y el sustituyente, y que la sustitución da como resultado un compuesto estable, es decir, un compuesto que no experimenta espontáneamente una transformación tal como mediante transposición, ciclización, eliminación, etc.
“Arilo”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a sistemas de anillos aromáticos, heterocíclicos, aromáticos condensados, heterocíclicos condensados, biaromáticos, o bihetereocíclicos C<5>-C<10>. Ampliamente definido, “arilo”, tal como se usa en el presente documento, incluye grupos aromáticos de un solo anillo de 5, 6, 7, 8, 9, y 10 miembros que pueden incluir desde cero hasta cuatro heteroátomos, por ejemplo, benceno, pirrol, furano, tiofeno, imidazol, oxazol, tiazol, triazol, pirazol, piridina, pirazina, piridazina y pirimidina. Esos grupos arilo que tienen heteroátomos en la estructura de anillo también pueden denominarse “heterociclos de arilo” o “compuestos heteroaromáticos”. El anillo aromático puede estar sustituido en una o más posiciones del anillo con uno o más sustituyentes incluyendo halógeno, azida, alquilo, aralquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, hidroxilo, alcoxilo, amino (o amino cuaternizado), nitro, sulfhidrilo, imino, amido, fosfonato, fosfinato, carbonilo, carboxilo, sililo, éter, alquiltio, sulfonilo, sulfonamido, cetona, aldehído, éster, heterociclilo, restos aromáticos o heteroaromáticos, -CF<3>, -CN; y combinaciones de los mismos.
“Arilo” abarca además sistemas de anillos policíclicos que tienen dos o más anillos cíclicos en los que dos o más carbonos son comunes a dos anillos adyacentes (es decir, “anillos condensados”) en donde al menos uno de los anillos es aromático, por ejemplo, el/los otro(s) anillo(s) cíclico(s) puede(n) ser cicloalquilos, cicloalquenilos, cicloalquinilos, arilos y/o heterociclos. Los ejemplos de anillos heterocíclicos incluyen bencimidazolilo, benzofuranilo, benzotiofuranilo, benzotiofenilo, benzoxazolilo, benzoxazolinilo, benzotiazolilo, benzotriazolilo, benzotetrazolilo, bencisoxazolilo, bencisotiazolilo, bencimidazolinilo, carbazolilo, 4aH-carbazolilo, carbolinilo, cromanilo, cromenilo, cinolinilo, decahidroquinolinilo, 2H,6H-1,5,2-ditiazinilo, dihidrofuro[2,3-b]tetrahidrofurano, furanilo, furazanilo, imidazolidinilo, imidazolinilo, imidazolilo, 1H-indazolilo, indolenilo, indolinilo, indolizinilo, indolilo, 3H-indolilo, isatinoilo, isobenzofuranilo, isocromanilo, isoindazolilo, isoindolinilo, isoindolilo, isoquinolinilo, isotiazolilo, isoxazolilo, metilenodioxifenilo, morfolinilo, naftiridinilo, octahidroisoquinolinilo, oxadiazolilo, 1,2,3-oxadiazolilo, 1,2,4-oxadiazolilo, 1,2,5-oxadiazolilo, 1,3,4-oxadiazolilo, oxazolidinilo, oxazolilo, oxindolilo, pirimidinilo, fenantridinilo, fenantrolinilo, fenazinilo, fenotiazinilo, fenoxatinilo, fenoxazinilo, ftalazinilo, piperazinilo, piperidinilo, piperidonilo, 4-piperidonilo, piperonilo, pteridinilo, purinilo, piranilo, pirazinilo, pirazolidinilo, pirazolinilo, pirazolilo, piridazinilo, piridooxazol, piridoimidazol, piridotiazol, piridinilo, piridilo, pirimidinilo, pirrolidinilo, pirrolinilo, 2H-pirrolilo, pirrolilo, quinazolinilo, quinolinilo, 4H-quinolizinilo, quinoxalinilo, quinuclidinilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidroisoquinolinilo, tetrahidroquinolinilo, tetrazolilo, 6H-1,2,5-tiadiazinilo, 1,2,3-tiadiazolilo, 1,2,4-tiadiazolilo, 1,2,5-tiadiazolilo, 1,3,4-tiadiazolilo, tiantrenilo, tiazolilo, tienilo, tienotiazolilo, tienooxazolilo, tienoimidazolilo, tiofenilo y xantenilo. Uno o más de los anillos pueden estar sustituidos tal como se definió anteriormente para “arilo”.
“Alquilo”, tal como se usa en el presente documento, se refiere al radical de grupos alifáticos saturados o insaturados, incluyendo grupos alquilo, alquenilo o alquinilo de cadena lineal, grupos alquilo, alquenilo o alquinilo de cadena ramificada, grupos cicloalquilo, cicloalquenilo o cicloalquinilo (alicíclicos), grupos cicloalquilo, cicloalquenilo o cicloalquinilo sustituidos con alquilo, y grupos alquilo, alquenilo o alquinilo sustituidos con cicloalquilo. A menos que se indique lo contrario, un alquilo de cadena lineal o de cadena ramificada tiene 30 o menos átomos de carbono en su estructura principal (por ejemplo, C<1>-C<30>para cadena lineal, C<3>-C<30>para cadena ramificada), preferiblemente 20 o menos, más preferiblemente 10 o menos, lo más preferiblemente 6 o menos. Si el alquilo es insaturado, la cadena de alquilo tiene generalmente desde 2 hasta 30 carbonos en la cadena, preferiblemente desde 2 hasta 20 carbonos en la cadena, más preferiblemente desde 2 hasta 10 carbonos en la cadena. Asimismo, los cicloalquilos preferidos tienen desde 3 hasta 20 átomos de carbono en su estructura de anillo, preferiblemente desde 3 hasta 10 carbonos átomos en su estructura de anillo, lo más preferiblemente 5, 6 ó 7 carbonos en la estructura de anillo.
Los términos “alquenilo” y “alquinilo” se refieren a grupos alifáticos insaturados análogos en cuanto a longitud y posible sustitución a los alquilos descritos anteriormente, pero que contienen al menos un enlace doble o triple, respectivamente.
“Alquilo” incluye una o más sustituciones en uno o más átomos de carbono del radical hidrocarbonado, así como heteroalquilos. Los sustituyentes adecuados incluyen halógenos, tales como flúor, cloro, bromo, o yodo; hidroxilo; -NRR', en donde R y R' son independientemente hidrógeno, alquilo, o arilo, y en donde el átomo de nitrógeno está opcionalmente cuaternizado; -SR, en donde R es hidrógeno, alquilo, o arilo; -CN; -NO<2>; -COOH; carboxilato; -COR, -COOR, o -CON(R)<2>, en donde R es hidrógeno, alquilo, o arilo; azida, aralquilo, alcoxilo, imino, fosfonato, fosfinato, sililo, éter, sulfonilo, sulfonamido, heterociclilo, restos aromáticos o heteroaromáticos, -CF<3>; -CN; - NCOCOCH<2>CH<2>; -NCOCOCHCH; -NCS; y combinaciones de los mismos.
“Amino” y “amina”, tal como se usan en el presente documento, se reconocen en la técnica y se refieren a aminas tanto sustituidas como no sustituidas, por ejemplo, un resto que puede estar representado por la fórmula general:
en donde, R, R', y R” representan cada uno independientemente un hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, alquenilo sustituido o no sustituido, alquinilo sustituido o no sustituido, carbonilo sustituido o no sustituido, -(CH<2>)m-R'", o R y R' tomados junto con el átomo de N al que están unidos completan un heterociclo que tiene desde 3 hasta 14 átomos en la estructura de anillo; Rm representa un grupo hidroxilo, un grupo carbonilo sustituido o no sustituido, un arilo, un anillo de cicloalquilo, un anillo de cicloalquenilo, un heterociclo, o un policiclo; y m es cero o un número entero que oscila desde 1 hasta 8. En realizaciones preferidas, sólo uno de R y R' puede ser un carbonilo, por ejemplo, R y R' junto con el nitrógeno no forman una imida. En realizaciones preferidas, R y R' (y opcionalmente R”) representan cada uno independientemente un átomo de hidrógeno, un alquilo sustituido o no sustituido, un alquenilo sustituido o no sustituido, o -(CH<2>)m-Rm Por tanto, el término “alquilamina”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo amina, tal como se definió anteriormente, que tiene un alquilo sustituido o no sustituido unido al mismo (es decir, al menos uno de R, R', o R” es un grupo alquilo).
“Carbonilo”, tal como se usa en el presente documento, se reconoce en la técnica e incluye tales restos que pueden estar representados por la fórmula general:
en donde X es un enlace, o representa un oxígeno o un azufre, y R representa un hidrógeno, un alquilo sustituido o no sustituido, un alquenilo sustituido o no sustituido, un alquinilo sustituido o no sustituido, -(CH<2>)m-R”, o una sal aceptable farmacéutica, R' representa un hidrógeno, un alquilo sustituido o no sustituido, un alquenilo sustituido o no sustituido, un alquinilo sustituido o no sustituido, o -(CH<2>)m-R”; R” representa un grupo hidroxilo, un grupo carbonilo sustituido o no sustituido, un arilo, un anillo de cicloalquilo, un anillo de cicloalquenilo, un heterociclo, o un policiclo; y m es cero o un número entero que oscila desde 1 hasta 8. Cuando X es oxígeno y R se define tal como antes, el resto también se denomina grupo carboxilo. Cuando X es oxígeno y R es hidrógeno, la fórmula representa un “ácido carboxílico”. Cuando X es oxígeno y R' es hidrógeno, la fórmula representa un “formiato”. En general, cuando el átomo de oxígeno de la fórmula anterior se reemplaza por un átomo de azufre, la fórmula representa un grupo “tiocarbonilo”. Cuando X es azufre y R o R' no es hidrógeno, la fórmula representa un “tioéster”. Cuando X es azufre y R es hidrógeno, la fórmula representa un “ácido tiocarboxílico”. Cuando X es azufre y R' es hidrógeno, la fórmula representa un “tioformiato”. Cuando X es un enlace y R no es hidrógeno, la fórmula anterior representa una “cetona”. Cuando X es un enlace y R es hidrógeno, la fórmula anterior representa un “aldehído”.
“Heteroalquilo”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a radicales que contienen carbono de cadena lineal o ramificada, o cíclicos, o combinaciones de los mismos, que contienen al menos un heteroátomo. Los heteroátomos adecuados incluyen O, N, Si, P y S, en donde los átomos de nitrógeno, fósforo y azufre están opcionalmente oxidados, y el heteroátomo de nitrógeno está opcionalmente cuaternizado.
Los ejemplos de radicales hidrocarbonados saturados incluyen metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, t-butilo, isobutilo, sec-butilo, ciclohexilo, (ciclohexil)metilo, ciclopropilmetilo, y homólogos e isómeros de, por ejemplo, npentilo, n-hexilo, n-heptilo, n-octilo. Los ejemplos de grupos alquilo insaturados incluyen, pero no se limitan a, vinilo, 2-propenilo, crotilo, 2-isopentenilo, 2-(butadienilo), 2,4-pentadienilo, 3-(1,4-pentadienilo), etinilo, 1 -propinilo y 3-propinilo, y 3-butinilo.
“Alcoxilo”, “alquilamino”, y “alquiltio” se usan en el presente documento en su sentido convencional, y se refieren a aquellos grupos alquilo unidos a la parte restante de la molécula a través de un átomo de oxígeno, un grupo amino, o un átomo de azufre, respectivamente.
“Alquilarilo”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo alquilo sustituido con un grupo arilo (por ejemplo, un grupo aromático o heteroaromático).
“Heterociclo” o “heterocíclico”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un radical cíclico unido a través de un carbono o nitrógeno de anillo de un anillo monocíclico o bicíclico que contiene 3-10 átomos de anillo, y preferiblemente 5-6 átomos de anillo, que consiste en carbono y de uno a cuatro heteroátomos seleccionados, cada uno, del grupo que consiste en oxígeno distinto de peróxido, azufre, y N(Y) en donde Y está ausente o es H, O, alquilo C<1>-C<10>, fenilo o bencilo, y que opcionalmente contiene 1-3 enlaces dobles y está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes. Los ejemplos de anillo heterocíclico incluyen bencimidazolilo, benzofuranilo, benzotiofuranilo, benzotiofenilo, benzoxazolilo, benzoxazolinilo, benzotiazolilo, benzotriazolilo, benzotetrazolilo, bencisoxazolilo, bencisotiazolilo, bencimidazolinilo, carbazolilo, 4aH-carbazolilo, carbolinilo, cromanilo, cromenilo, cinolinilo, decahidroquinolinilo, 2H,6H-1,5,2-ditiazinilo, dihidrofuro[2,3-b]tetrahidrofurano, furanilo, furazanilo, imidazolidinilo, imidazolinilo, imidazolilo, 1H-indazolilo, indolenilo, indolinilo, indolizinilo, indolilo, 3H-indolilo, isatinoilo, isobenzofuranilo, isocromanilo, isoindazolilo, isoindolinilo, isoindolilo, isoquinolinilo, isotiazolilo, isoxazolilo, metilenodioxifenilo, morfolinilo, naftiridinilo, octahidroisoquinolinilo, oxadiazolilo, 1,2,3-oxadiazolilo, 1,2,4-oxadiazolilo, I , 2,5-oxadiazolilo, 1,3,4-oxadiazolilo, oxazolidinilo, oxazolilo, oxindolilo, pirimidinilo, fenantridinilo, fenantrolinilo, fenazinilo, fenotiazinilo, fenoxatinilo, fenoxazinilo, ftalazinilo, piperazinilo, piperidinilo, piperidonilo, 4-piperidonilo, piperonilo, pteridinilo, purinilo, piranilo, pirazinilo, pirazolidinilo, pirazolinilo, pirazolilo, piridazinilo, piridooxazol, piridoimidazol, piridotiazol, piridinilo, piridilo, pirimidinilo, pirrolidinilo, pirrolinilo, 2H-pirrolilo, pirrolilo, quinazolinilo, quinolinilo, 4H-quinolizinilo, quinoxalinilo, quinuclidinilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidroisoquinolinilo, tetrahidroquinolinilo, tetrazolilo, 6H-1,2,5-tiadiazinilo, 1,2,3-tiadiazolilo, 1,2,4-tiadiazolilo, 1,2,5-tiadiazolilo, 1,3,4-tiadiazolilo, tiantrenilo, tiazolilo, tienilo, tienotiazolilo, tienooxazolilo, tienoimidazolilo, tiofenilo y xantenilo. Los grupos heterocíclicos pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes tal como se definió anteriormente para alquilo y arilo.
“Halógeno”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a flúor, cloro, bromo, o yodo.
II. Alginatos modificados
La presente invención se refiere a productos médicos, en donde la totalidad o una porción del producto médico está recubierta con un alginato modificado.
En el presente documento se describen polímeros de alginato que se han modificado químicamente para alterar su biocompatibilidad y propiedades físicas, así como métodos de preparación de los mismos.
A. Estructura de los polímeros de alginato modificados
Los alginatos modificados contienen uno o más monómeros modificados covalentemente definidos por la fórmula I
en donde,
X es oxígeno, azufre, o NR<4>;
R<1>es, independientemente en el uno o más monómeros modificados,
en donde a es un número entero desde 1 hasta 30, z es un número entero desde 0 hasta 5, n es un número entero desde 1 hasta 12, m es un número entero desde 3 hasta 16, Ra se selecciona independientemente de grupo alcoxilo, amino, alquilamino, dialquilamino, hidroxilo, alquenilo, alquinilo, alquilo sustituido, alquenilo sustituido, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, sulfonilo, sulfonilo sustituido, ácido sulfónico, fosforilo, fosforilo sustituido, fosfonilo, fosfonilo sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C<3>-C<20>, cíclico C<3>-C<20>sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido, y en donde Rb es
Fórmula XIII
en donde
Y<1>e Y2 son independientemente hidrógeno o -PO(OR5)2; o
Y2 está ausente, e Y2, junto con los dos átomos de oxígeno a los que Y<1>e Y2 están unidos, forman una estructura cíclica tal como se muestra en la fórmula II
en donde; y
R2 y R3 son, independientemente, hidrógeno o una agrupación orgánica que contiene cualquier número de átomos de carbono, preferiblemente 1-30 átomos de carbono, más preferiblemente 1-20 átomos de carbono, más preferiblemente 1-14 átomos de carbono, y que opcionalmente incluye uno o más heteroátomos tales como agrupación de oxígeno, azufre, o nitrógeno en formatos estructurales lineales, ramificados, o cíclicos, siendo agrupaciones de R2 y R3 representativas grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C3-C20, cíclico C3-C20 sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido; o
R2 y R3, junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un anillo carbocíclico o heterocíclico no sustituido o sustituido de 3 a 8 miembros; y
R4 y R5 son, independientemente, hidrógeno o una agrupación orgánica que contiene cualquier número de átomos de carbono, preferiblemente 1-30 átomos de carbono, más preferiblemente 1-20 átomos de carbono, más preferiblemente 1-14 átomos de carbono, y que opcionalmente incluye uno o más heteroátomos tales como agrupación de oxígeno, azufre, o nitrógeno en formatos estructurales lineales, ramificados, o cíclicos, siendo agrupaciones de R<4>y R<5>representativas grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C<3>-C<20>, cíclico G<3>-C<20>sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido.
En algunos ejemplos, el polímero de alginato modificado es un polímero de alginato modificado de manera individual. En ejemplos específicos, el polímero de alginato modificado de manera individual contiene uno o más monómeros modificados covalentemente definidos por la fórmula I, en donde R<1>incluye un grupo azida, un grupo alquino, o un anillo de 1,2,3-triazol. En determinados ejemplos, el polímero de alginato modificado de manera individual contiene uno o más monómeros modificados covalentemente definidos por la fórmula I, en donde X no es oxígeno y R<1>no es un grupo alquilo C<1>-C<18>no sustituido, una cadena de poli(etilenglicol), o un resto colesterilo. En determinados ejemplos adicionales, el polímero de alginato modificado de manera individual contiene uno o más monómeros modificados covalentemente definidos por la fórmula I, en donde X no es NR4 y R<1>no es un grupo alquilo Ci-C6 sustituido o no sustituido, o una cadena de poli(etilenglicol).
En ejemplos alternativos, el polímero de alginato modificado es un polímero de alginato modificado de manera múltiple. En ejemplos preferidos, el polímero de alginato modificado de manera múltiple presenta una estructura principal de polisacárido que contiene monómeros de manuronato, monómeros de guluronato, una primera especie o tipo de monómero modificado covalentemente definido por la fórmula I, y una segunda especie o tipo de monómero modificado covalentemente definido por la fórmula I. En otros ejemplos, el polímero de alginato modificado de manera múltiple presenta una estructura principal de polisacárido que contiene monómeros de manuronato, monómeros de guluronato, y tres o más tipos diferentes de monómeros modificados covalentemente definidos por la fórmula I.
En algunos ejemplos, el polímero de alginato modificado de manera múltiple contiene dos especies diferentes de monómeros modificados covalentemente definidos por la fórmula I, en donde, en ambas especies de monómero, X es NR4. En otros ejemplos, el polímero de alginato modificado de manera múltiple contiene dos especies diferentes de monómeros modificados covalentemente definidos por la fórmula I, en donde, en ambas especies de monómero, X es oxígeno. En ejemplos adicionales, el polímero de alginato modificado de manera múltiple contiene dos especies diferentes de monómeros modificados covalentemente definidos por la fórmula I, en donde, en una especie de monómero, X es oxígeno, y en la segunda especie de monómero, X es NR4.
En algunos ejemplos, el polímero de alginato modificado de manera múltiple contiene dos especies diferentes de monómeros modificados covalentemente definidos por la fórmula I, en donde, en al menos una especie de monómero, R1 incluye uno o más restos cíclicos. En ejemplos preferidos, el polímero de alginato modificado de manera múltiple contiene dos especies diferentes de monómeros modificados covalentemente definidos por la fórmula I, en donde, en al menos una especie de monómero, R1 incluye un anillo de fenilo, un anillo de furano, un anillo de oxolano, un anillo de dioxolano, o un anillo de 1,2,3-triazol.
En determinados ejemplos, el polímero de alginato modificado de manera múltiple contiene dos especies diferentes de monómeros modificados covalentemente definidos por la fórmula I, en donde, en al menos una especie de monómero, R<1>incluye uno o más restos halógeno, un grupo azida, o un alquino.
En ejemplos preferidos, el polímero de alginato modificado de manera múltiple es uno de los polímeros de alginato modificados de manera múltiple mostrados a continuación.
En algunos ejemplos, R<2>a R<17>, R<31>a R<36>, Ra, Rb, Rc, Rd, y Re son independientemente hidrógeno, amino, hidroxilo, tiol, oxo, o alquilo C<1>-C<10>, alcoxilo C<1>-C<10>, alquilamino C<1>-C<10>, alquiltio C<1>-C<10>, alquilo C<1>-C<9>, alcoxilo C<1>-C<9>, alquilamino C<1>-C<9>, alquiltio C<1>-C<9>, alquilo C<1>-C<8>, alcoxilo C<1>-C<8>, alquilamino C<1>-C<8>, alquiltio C<1>-C<8>, alquilo C<1>-C<7>, alcoxilo C<1>-C<7>, alquilamino C<1>-C<7>, alquiltio C<1>-C<7>, alquilo C<1>-C<6>, alcoxilo C<1>-C<6>, alquilamino C<1>-C<6>, alquiltio C<1>-C<6>, alquilo C<1>-C<5>, alcoxilo C<1>-C<5>, alquilamino C<1>-C<5>, alquiltio C<1>-C<5>, alquilo C<1>-C<4>, alcoxilo C<1>-C<4>, alquilamino C<1>-C<4>, alquiltio C<1>-C<4>, alquilo C<1>-C<3>, alcoxilo C<1>-C<3>, alquilamino C<1>-C<3>, alquiltio C<1>-C<3>, alquilo C<1>-C<2>, alcoxilo C<1>-C<2>, alquilamino C<1>-C<2>, alquiltio C<1>-C<2>, alquilo C<10>, alcoxilo C<10>, alquilamino C<10>, alquiltio C<10>, alquilo C<9>, alcoxilo C<9>, alquilamino C<9>, alquiltio C<9>, alquilo C8, alcoxilo C8, alquilamino C8, alquiltio C8, alquilo C<7>, alquiltio C<7>, alquilo C6, alcoxilo C6, alquilamino C6, alquiltio C6, alquilo C<5>, alcoxilo C<5>, alquilamino C<5>, alquiltio C<5>, alquilo C<4>, alcoxilo C<4>, alquilamino C<4>, alquiltio C<4>, alquilo C<3>, alcoxilo C<3>, alquilamino C<3>, alquiltio C<3>, alquilo C<2>, alcoxilo C<2>, alquilamino C<2>, alquiltio C<2>, alquilo C<1>, alcoxilo C<1>, alquilamino C<1>, o alquiltio C<1>sustituido o no sustituido.
En algunos ejemplos, R<2>a R<17>, R<31>a R<36>, Ra, Rb, Rc, Rd, y Re son independientemente hidrógeno, amino, hidroxilo, tiol, oxo, o alquilo C<1>-C<10>, alcoxilo C<1>-C<10>, alquilamino C<1>-C<10>, o alquiltio C<1>-C<10>sustituido o no sustituido.
En algunos ejemplos, Re son tiol, oxo, o alquilo C<1>-C<9>, alcoxilo C<1>-C<9>, alquilamino C<1>-C<9>, o alquiltio C<1>-C<9>sustituido o no sustituido.
En algunos ejemplos, Re son tiol, oxo, o alquilo C<1>-C<8>, alcoxilo C<1>-C<8>, alquilamino C<1>-C<8>, o alquiltio C<1>-C<8>sustituido o no sustituido.
En algunos ejemplos, Re son tiol, oxo, o alquilo C<1>-C<7>, alcoxilo C<1>-C<7>, alquilamino C<1>-C<7>, o alquiltio C<1>-C<7>sustituido o no sustituido.
En algunos ejemplos, Re son tiol, oxo, o alquilo C<1>-C<6>, alcoxilo C<1>-C<6>, alquilamino C<1>-C<6>, o alquiltio C<1>-C<6>sustituido o no sustituido.
En algunos ejemplos, R<2>a R<17>, R<31>a R<36>, Ra, Rb, Rc, y Rd son independientemente hidróg oxo, o alquilo C<1>-C<5>, alcoxilo C<1>-C<5>, alquilamino C<1>-C<5>, o alquiltio C<1>-C<5>sustituido o no sustituido.
En algunos ejemplos, Re son tiol, oxo, o alquilo C<1>-C<4>, alcoxilo C<1>-C<4>, alquilamino C<1>-C<4>, o alquiltio C<1>-C<4>sustituido o no sustituido.
En algunos ejemplos, Re son tiol, oxo, o alquilo C<1>-C<3>, alcoxilo C<1>-C<3>, alquilamino C<1>-C<3>, o alquiltio C<1>-C<3>sustituido o no sustituido.
En algunos ejemplos, Re son tiol, oxo, o alquilo C<1>-C<2>, alcoxilo C<1>-C<2>, alquilamino C<1>-C<2>, o alquiltio C<1>-C<2>sustituido o no sustituido.
En algunos ejemplos, Re son tiol, oxo, o alquilo C<10>, alcoxilo C<10>, alquilamino C<10>, o alquiltio C<10>sustituido o no sustituido.
En algunos ejemplos, Re son tiol, oxo, o alquilo C<9>, alcoxilo C<9>, alquilamino C<9>, o alquiltio C<9>sustituido o no sustituido.
En algunos ejemplos, Re son tiol, oxo, o alquilo C8, alcoxilo C8, alquilamino C8, o alquiltio C8 sustituido o no sustituido.
En algunos ejemplos, Re son tiol, oxo, o alquilo C<7>, alcoxilo C<7>, alquilamino C<7>, o alquiltio C<7>sustituido o no sustituido.
En algunos ejemplos, Re son tiol, oxo, o alquilo C6, alcoxilo C6, alquilamino C6, o alquiltio C6 sustituido o no sustituido.
En algunos ejemplos, Re son tiol, oxo, o alquilo C<5>, alcoxilo C<5>, alquilamino C<5>, o alquiltio C<5>sustituido o no sustituido.
En algunos ejemplos, Re son tiol, oxo, o alquilo C<4>, alcoxilo C<4>, alquilamino C<4>, o alquiltio C<4>sustituido o no sustituido.
En algunos ejemplos, Re son tiol, oxo, o alquilo C<3>, alcoxilo C<3>, alquilamino C<3>, o alquiltio C<3>sustituido o no sustituido.
En algunos ejemplos, R<2>a R<17>, R<31>a R<36>, Ra, Rb, Rc, Rd, y Re son tiol, oxo, o alquilo C<2>, alcoxilo C<2>, alquilamino C<2>, o alquiltio C<2>sustituido o no sustituido.
En algunos ejemplos, R<2>a R<17>, R<31> Re son independ tiol, oxo, o alquilo C<1>, alcoxilo C<1>, alquilamino C<1>, o alquiltio C<1>sustituido o no sustituido.
En algunos ejemplos, R<2>a R<17>, R<31>a R<36>, Ra, Rb, Rc, Rd, y Re son independ alquilo C<1>-C<10>, alcoxilo C<1>-C<10>, alquilamino C<1>-C<10>, alquiltio C<1>-C<10>, alquilo C<1>-C<9>, alcoxilo C<1>-C<9>, alquilamino C<1>-C<9>, alquiltio C<1>-C<9>, alquilo C<1>-C<8>, alcoxilo C<1>-C<8>, alquilamino C<1>-C<8>, alquiltio C<1>-C<8>, alquilo C<1>-C<7>, alcoxilo C<1>-C<7>, alquilamino C<1>-C<7>, alquiltio C<1>-C<7>, alquilo C<1>-C<6>, alcoxilo C<1>-C<6>, alquilamino C<1>-C<6>, alquiltio C<1>-C<6>, alquilo C<1>-C<5>, alcoxilo C<1>-C<5>, alquilamino C<1>-C<5>, alquiltio C<1>-C<5>, alquilo C<1>-C<4>, alcoxilo C<1>-C<4>, alquilamino C<1>-C<4>, alqui alquilo C<1>-C<3>, alcoxilo C<1>-C<3>, alquilamino C<1>-C<3>, alquiltio C<1>-C<3>, alquilo C<1>-C<2>, alcoxilo C<1>-C<2>, alquilamino C<1>-C<2>, alquiltio C<1>-C<2>, alquilo C<10>, alcoxilo C<10>, alquilamino C<10>, alquiltio C<10>, alquilo C<9>, alcoxilo C<9>, alquilamino C<9>, alquiltio
C<9>, alquilo C8, alcoxilo C8, alquilamino C8, alquiltio C8, alquilo C<7>, alcoxilo C<7>, alquilamino C<7>, alcoxilo Ca, alquilamino Ca, alquiltio Ca, alquilo C<5>, alcoxilo alquilamino C<5>, alquiltio C<5>, alqui alquilamino C<4>, alquiltio C<4>, alquilo C<3>, alcoxilo C<3>, alquilamino C<3>, alquiltio C<3>, alquilo C<2>, alquiltio C<2>, alquilo C<1>, alcoxilo C<1>, alquilamino C<1>, o alquiltio C<1>sustituido o no sustituido.
En algunos ejemplos, R<2>a R<17>, R<31>a R<3>a, Ra, Rb, Rc, Rd, Re son independ alquilo C<1>-C<10>, alcoxilo C<1>-C<10>, alquilamino C<1>-C<10>, o alquiltio C<1>-C<10>sustituido o no sustituido.
En algunos ejemplos, R<2>a R<17>, R<31>a R<3>a, Ra, Rb, Rc, Rd, Re son independ alquilo C<1>-C<9>, alcoxilo C<1>-C<9>, alquilamino C<1>-C<9>, o alquiltio C<1>-C<9>sustituido o no sustituido.
En algunos ejemplos, R<2>a R<17>, R<31>a R<3>a, Ra, Rb, Rc, Rd, Re son independ alquilo C<1>-C<8>, alcoxilo C<1>-C<8>, alquilamino C<1>-C<8>, o alquiltio C<1>-C<8>sustituido o no sustituido.
En algunos ejemplos, R<2>a R<17>, R<31>a R<3>a, Ra, Rb, Rc, Rd, Re son independ alquilo C<1>-C<7>, alcoxilo C<1>-C<7>, alquilamino C<1>-C<7>, o alquiltio C<1>-C<7>sustituido o no sustituido.
En algunos ejemplos, R<2>a R<17>, R<31>a R<3>a, Ra, Rb, Rc, Rd, Re son independ alquilo C<1>-Ca, alcoxilo CrCa, alquilamino C<1>-Ca, o alquiltio CrCa sustituido o no sustituido.
En algunos ejemplos, R<2>a R<17>, R<31>a R<3>a, Ra, Rb, Rc, Rd, Re son independ alquilo C<1>-C<5>, alcoxilo C<1>-C<5>, alquilamino C<1>-C<5>, o alquiltio C<1>-C<5>sustituido o no sustituido.
En algunos ejemplos, R<2>a R<17>, R<31>a R<3>a, Ra, Rb, Rc, Rd, Re son independ alquilo C<1>-C<4>, alcoxilo C<1>-C<4>, alquilamino C<1>-C<4>, o alquiltio C<1>-C<4>sustituido o no sustituido.
En algunos ejemplos, R<2>a R<17>, R<31>a R<3>a, Ra, Rb, Rc, Rd, Re son independ alquilo C<1>-C<3>, alcoxilo C<1>-C<3>, alquilamino C<1>-C<3>, o alquiltio C<1>-C<3>sustituido o no sustituido.
En algunos ejemplos, R<2>a R<17>, R<31>a R<3>a, Ra, Rb, Rc, Rd, Re son independ alquilo C<1>-C<2>, alcoxilo C<1>-C<2>, alquilamino C<1>-C<2>, o alquiltio C<1>-C<2>sustituido o no sustituido.
En algunos ejemplos, R<2>a R<17>, R<31> Re son independ alquilo C<10>, alcoxilo C<10>, alquilamino C<10>, o alquiltio C<10>sustituido o no sustituido.
En algunos ejemplos, R<2>a R<17>, R<31> Re son independ alquilo C<9>, alcoxilo C<9>, alquilamino C<9>, o alquiltio C<9>sustituido o no sustituido.
En algunos ejemplos, R<2>a R<17>, R<31> Re son independ alquilo C8, alcoxilo C8, alquilamino C8, o alquiltio C8 sustituido o no sustituido.
En algunos ejemplos, R<2>a R<17>, R<31> Re son independ alquilo C<7>, alcoxilo C<7>, alquilamino C<7>, o alquiltio C<7>sustituido o no sustituido.
En algunos ejemplos, R<2>a R<17>, R<31> Re son independ alquilo Ca, alcoxilo Ca, alquilamino Ca, o alquiltio Ca sustituido o no sustituido.
En algunos ejemplos, R<2>a R<17>, R<31> Re son independ alquilo C<5>, alcoxilo C<5>, alquilamino C<5>, o alquiltio C<5>sustituido o no sustituido.
En algunos ejemplos, R<2>a R<17>, R<31> Re son independ alquilo C<4>, alcoxilo C<4>, alquilamino C<4>, o alquiltio C<4>sustituido o no sustituido.
En algunos ejemplos, R<2>a R<17>, R<31>a R<3>a, Ra, Rb, Rc, Rd, y Re son independ alquilo C<3>, alcoxilo C<3>, alquilamino C<3>, o alquiltio C<3>sustituido o no sustituido.
En algunos ejemplos, R<2>a R<17>, R<31>a R<36>, Ra, Rb, Rc, Rd, y Re son independientemente amino, hidroxilo, tiol, oxo, o alquilo C<2>, alcoxilo C<2>, alquilamino C<2>, o alquiltio C<2>sustituido o no sustituido.
En algunos ejemplos, R<2>a R<17>, R<31>a R<36>, Ra, Rb, Rc, Rd, y Re son independientemente amino, hidroxilo, tiol, oxo, o alquilo C<1>, alcoxilo C<1>, alquilamino C<1>, o alquiltio C<1>sustituido o no sustituido.
Los polímeros de alginato modificados pueden tener cualquier peso molecular deseado. El peso molecular promedio en peso de los alginatos es preferiblemente de entre 1.000 y 1.000.000 Dalton, más preferiblemente de entre 10.000 y 500.000 Dalton, tal como se determina mediante cromatografía de permeación en gel.
Los polímeros de alginato modificados pueden contener cualquier razón de monómeros de manuronato, monómeros de guluronato, y monómeros modificados covalentemente. En algunas realizaciones, más del 2,5 %, 5 %, 7,5 %, 10%, 12%, 14%, 15%, 16%, 18%, 20%, 22%, 24%, 25%, 26%, 28%, 30%, 32,5%, 35%, 37,5%, 40%, 45 %, 50 %, 55 %, o 60 % de los monómeros en el polímero de alginato modificado son monómeros modificados covalentemente. Preferiblemente, más del 10 %, más preferiblemente más del 20 %, y lo más preferiblemente más del 30 % de los monómeros en el polímero de alginato modificado son monómeros modificados covalentemente. Los polímeros de alginato modificados pueden producirse incorporando monómeros modificados covalentemente que presentan una gama de diferentes potenciales de formación de enlace de hidrógeno, hidrofobias/hidrofilias, y estados de carga. La inclusión de monómeros modificados covalentemente en un polímero de alginato altera las propiedades fisicoquímicas del polímero de alginato. Por consiguiente, las propiedades fisicoquímicas de los alginatos pueden ajustarse para aplicaciones deseadas mediante la incorporación selectiva de monómeros modificados covalentemente.
Por ejemplo, la temperatura de transición vítrea (Tg) puede variarse mediante la incorporación de monómeros modificados covalentemente. En algunas realizaciones, el polvo de polímero de alginato modificado presenta una Tg, tal como se mide mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC), de más de 50 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C, 95 °C, 100 °C, 105 °C, 110 °C, 115 °C, 120 °C, 125 °C, 130 °C, 135 °C, 140 °C, 145 °C, 150 °C, 160 °C, 175 °C, 190 °C, o 200 °C.
La hidrofobia/hidrofilia de los alginatos puede variarse mediante la incorporación de monómeros modificados covalentemente hidrófobos y/o hidrófilos. En ejemplos preferidos, el polímero de alginato modificado contiene uno o más monómeros modificados covalentemente hidrófobos. La hidrofobia/hidrofilia relativa de los alginatos modificados puede evaluarse cuantitativamente midiendo el ángulo de contacto de una gotita de agua sobre una película del polímero de alginato modificado usando un goniómetro. En algunos ejemplos, el alginato modificado tiene un ángulo de contacto de menos de 90° (es decir, es hidrófilo). En ejemplos preferidos, el alginato modificado tiene un ángulo de contacto de más de 90° (es decir, es hidrófobo). En algunas realizaciones, el alginato modificado tiene un ángulo de contacto de más de 95°, 100°, 105°, 110°, 115°, o 120°.
En ejemplos usados para la encapsulación de células, el polímero de alginato modificado puede estar iónicamente reticulado mediante un catión polivalente tal como Ca2+, Sr2+ o Ba2+ para formar hidrogeles. La capacidad de los alginatos modificados para formar hidrogeles estables en condiciones fisiológicas puede cuantificarse usando el ensayo de formación de hidrogel descrito en el ejemplo 2.
En algunos ejemplos, el polímero de alginato modificado forma hidrogeles de manera que la intensidad de fluorescencia medida usando el ensayo de formación de hidrogel de alto rendimiento descrito en el presente documento es mayor de 10.000, 15.000, 20.000, 25.000, 30.000, 35.000, 40.000, 45.000, 50.000, ó 55.000. En ejemplos preferidos, el polímero de alginato modificado forma hidrogeles de manera que la intensidad de fluorescencia medida usando el ensayo de formación de hidrogel de alto rendimiento descrito en el presente documento es mayor de 15.000. En ejemplos preferidos, el polímero de alginato modificado forma hidrogeles de manera que la intensidad de fluorescencia medida usando el ensayo de formación de hidrogel de alto rendimiento descrito en el presente documento es de entre 15.000 y 55.000, preferiblemente de entre 20.000 y 55.000, más preferiblemente de entre 25.000 y 55.000.
En ejemplos usados para la encapsulación de células, el polímero de alginato modificado forma un hidrogel con porosidad suficiente para permitir que los nutrientes, los residuos, y las hormonas y/o proteínas secretadas a partir de las células encapsuladas difundan libremente hacia el interior y el exterior de las cápsulas, mientras que simultáneamente se impide la incursión de células inmunitarias en la matriz de gel. La porosidad y el área de superficie de los hidrogeles de alginato modificado pueden medirse usando análisis BET. Antes del análisis BET, se eliminan el disolvente y las impurezas volátiles mediante calentamiento prolongado del gel de alginato modificado a vacío. Posteriormente, las muestras de hidrogel se enfrían a vacío, por ejemplo, mediante nitrógeno líquido, y se analizan midiendo el volumen de gas (normalmente gas de N<2>, Kr, CO<2>, o Ar) adsorbido al hidrogel a presiones específicas. El análisis de la fisisorción del gas a presiones variables se usa para caracterizar el área de superficie total y la porosidad de los geles formados por los polímeros de alginato modificados. El método preferido para determinar la porosidad del hidrogel es el análisis BET.
En ejemplos preferidos, el alginato modificado forma un hidrogel con porosidad suficiente para permitir que los nutrientes, los residuos, y las hormonas y/o proteínas secretadas a partir de las células encapsuladas difundan libremente hacia el interior y el exterior de las cápsulas, mientras que simultáneamente se impide la incursión de células inmunitarias en la matriz de gel. En algunos ejemplos, la porosidad del hidrogel formado por el polímero de alginato modificado se aumenta en un 5 %, 10 %, 15 %, o 20 % con respecto a la porosidad de un hidrogel formado a partir del polímero de alginato no modificado. En ejemplos alternativos, la porosidad del hidrogel formado por el polímero de alginato modificado se disminuye en un 5 %, 10 %, 15 %, o 20 % con respecto a la porosidad de un hidrogel formado a partir del polímero de alginato no modificado.
En ejemplos preferidos usados para la encapsulación de células, el alginato modificado es biocompatible. La biocompatibilidad de los alginatos modificados puede determinarse cuantitativamente usando el ensayo de biocompatibilidadin vivobasado en fluorescencia descrito en el ejemplo 5. En este ensayo, se midió la actividad catepsina usando un ensayo de fluorescenciain vivopara cuantificar la respuesta a cuerpos extraños con respecto al alginato modificado.
En algunos ejemplos, el polímero de alginato modificado es biocompatible de manera que la respuesta de fluorescencia normalizada con respecto al alginato no modificado medida usando el ensayo de biocompatibilidadin vivodescrito en el presente documento es menor del 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55 %, 50 %, 45 %, o 40 %. En ejemplos preferidos, el polímero de alginato modificado induce una menor respuesta a cuerpos extraños que el alginato no modificado. Esto se indica por una respuesta de fluorescencia normalizada con respecto al alginato no modificado de menos del 100%. En algunos ejemplos, el polímero de alginato modificado es biocompatible de manera que la respuesta de fluorescencia normalizada con respecto al alginato no modificado medida usando el ensayo de biocompatibilidadin vivodescrito en el presente documento es menor del 75 %, más preferiblemente menor del 65 %, y lo más preferiblemente menor del 50 %.
B. Cápsulas y morfología de partícula
Las cápsulas son partículas que tienen un diámetro medio de aproximadamente 150 |im a aproximadamente 5 cm. Las cápsulas divulgadas pueden estar formadas por hidrogel reticulado. Aparte del material encapsulado, las cápsulas, por ejemplo, pueden estar formadas únicamente por hidrogel reticulado, pueden tener un núcleo de hidrogel reticulado que está rodeado por una o más cubiertas poliméricas, pueden tener una o más capas de hidrogel reticulado, pueden tener un recubrimiento de hidrogel reticulado, o una combinación de los mismos. La cápsula puede tener cualquier forma adecuada para, por ejemplo, la encapsulación de células. La cápsula puede contener una o más células dispersas en el hidrogel reticulado, “encapsulando” de ese modo las células. Las cápsulas preferidas están formadas por o incluyen uno o más de los alginatos modificados divulgados. Las cápsulas preferidas tienen un diámetro medio de aproximadamente 150 |im a aproximadamente 8 mm.
Las cápsulas pueden tener cualquier diámetro medio desde aproximadamente 150 |im hasta aproximadamente 5 cm. Preferiblemente, las cápsulas tienen un diámetro medio que es mayor de 1 mm, preferiblemente de 1,5 mm o mayor. En algunas realizaciones, las cápsulas pueden ser tan grandes como de aproximadamente 8 mm de diámetro. Por ejemplo, la cápsula puede estar en un intervalo de tamaño de aproximadamente 1 mm a 8 mm, de 1 mm a 6 mm, de 1 mm a 5 mm, de 1 mm a 4 mm, de 1 mm a 3 mm, de 1 mm a 2 mm, de 1 mm a 1,5 mm, de 1,5 mm a 8 mm, de 1,5 mm a 6 mm, de 1,5 mm a 5 mm, de 1,5 mm a 4 mm, de 1,5 mm a 3 mm, o de 1,5 mm a 2 mm.
La tasa de moléculas que entran en la cápsula necesaria para la viabilidad celular y la tasa de productos terapéuticos y material residual que salen de la membrana de la cápsula pueden seleccionarse modulando la permeabilidad de la cápsula. La permeabilidad de la cápsula también puede modificarse para limitar la entrada de células inmunitarias, anticuerpos, y citocinas en la cápsula. En general, tal como muestran los ejemplos, los métodos conocidos para formar cápsulas de hidrogel pueden producir cápsulas cuya permeabilidad limita la entrada de células inmunitarias, anticuerpos, y citocinas en la cápsula. Dado que los diferentes tipos de células tienen diferentes requisitos metabólicos, la permeabilidad de la membrana puede optimizarse basándose en el tipo de célula encapsulada en el hidrogel. El diámetro de las cápsulas es un factor importante que influye tanto en la respuesta inmunitaria hacia las cápsulas celulares, así como en el transporte de masa a través de la membrana de la cápsula.
El creciente reconocimiento de los parámetros que impulsan la fibrosisin vivose ha aplicado al análisis del rendimiento de los alginatos modificados. La implantación intraperitoneal (IP) de cápsulas de alginato modificado reveló que los alginatos modificados pueden dar como resultado cápsulas con formas anómalas cuando se reticulan usando condiciones definidas para los alginatos no modificados. Estas cápsulas con formas anómalas pueden complicar la implementación y la interpretación de las cápsulas de alginato modificado implantadas IP. En un esfuerzo por mejorar la morfología de cápsula, se desarrollaron métodos de formulación para su uso con micropartículas de alginato modificado donde los alginatos modificados se mezclaron con una pequeña cantidad de alginato de alto peso molecular. Las partículas preparadas a partir de esta mezcla produjeron partículas con morfología y estabilidad mejoradas.
El alginato no modificado tiene normalmente un peso molecular promedio en peso de aproximadamente 50.000 Dalton a aproximadamente 500.000 Dalton; sin embargo, también pueden usarse alginatos no modificados que tienen pesos moleculares. En algunos ejemplos, el peso molecular promedio en peso es de desde aproximadamente 50.000 hasta aproximadamente 250.000 Dalton, más preferiblemente de desde aproximadamente 50.000 hasta aproximadamente 150.000 Dalton. En algunos ejemplos, el peso molecular promedio en peso es de aproximadamente 100.000 Dalton.
En otros ejemplos, se usan uno o más polímeros de formación de hidrogel adicionales en combinación con alginato no modificado o en lugar de alginato no modificado. Tales polímeros se conocen en la técnica. Los ejemplos incluyen PEG, quitosano, dextrano, ácido hialurónico, seda, fibrina, poli(alcohol vinílico), y poli(metacrilato de hidroxietilo).
Por ejemplo, las partículas preparadas a partir de micropartículas de alginato modificado 263_A12 formuladas con bario y manitol se compararon con partículas preparadas a partir de 263_A12 mezcladas con una pequeña cantidad de alginato SLG100 no modificado (16% en peso). Las partículas preparadas a partir de una mezcla de alginato modificado y alginato no modificado produjeron poblaciones de micropartículas más homogéneas en cuanto a forma y tamaño tal como se evalúa mediante microscopía electrónica de barrido (SEM). El análisis cuantitativo de fluorescencia con ProSense en varios puntos de tiempo con alginatos modificados mezclados con SLG100 mostró que varios alginatos modificados reformulados muestran una menor respuesta inflamatoria el día 7 en comparación con el alginato de control. Los experimentos iniciales con cápsulas grandes (1,5 mm de diámetro) fueron cápsulas comparablemente limpias después de 2 semanas en el espacio IP de ratones C57BL/6 inmunocompetentes. Experimentos posteriores (ejemplo 9) muestran que las células humanas encapsuladas pueden lograr una corrección glucémica a largo plazo y sensible a la glucosa (más de 170 días) en un animal diabético inmunocompetente sin inmunodepresión. Este resultado se logró usando un alginato modificado tal como se divulga para encapsular las células humanas. La cápsula resultante mitiga las respuestas inmunológicas a los implantes de células humanas, retrasando eficazmente la deposición fibrótica que conduce a la necrosis del tejido del implante. Esta formulación proporcionó una inmunoprotección suficiente para permitir una corrección glucémica a largo plazo, a pesar de la estimulación xenogénica que manifiestan estas células humanas en un roedor inmunocompetente receptor.
Dado que los alginatos modificados divulgados median en la reducción de fibrosis, las cápsulas constituidas por otros materiales, pero recubiertas con o encapsuladas en los alginatos modificados son una forma de cápsula útil para lograr una reducción de fibrosis. Es decir, las cápsulas pueden incluir cápsulas y partículas constituidas por una variedad de materiales que luego se recubren con o encapsulan en alginato que es o incluye un alginato modificado. Las composiciones divulgadas pueden fabricarse en órganos artificiales, tales como un páncreas artificial que contiene células de los islotes encapsuladas. En algunos de estos ejemplos, las células se encapsulan en un único compartimento de hidrogel. En otros ejemplos, la composición contiene una pluralidad de células encapsuladas dispersas o encapsuladas en una estructura biocompatible.
C. Preparación de polímeros de alginato modificados
Los alginatos modificados pueden prepararse a través de la modificación covalente de cualquier polímero de alginato disponible. Los monómeros modificados covalentemente pueden introducirse en los polímeros de alginato usando una variedad de procedimientos de síntesis conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, los monómeros de manuronato y guluronato se modifican covalentemente a través de esterificación y/o amidación de su resto ácido carboxílico. En realizaciones alternativas, los monómeros de manuronato y guluronato se modifican covalentemente a través de fosforilación o formación de acetal. Puede usarse la variación estequiométrica de los reactantes durante la modificación covalente para variar la cantidad de monómero modificado covalentemente incorporado en el alginato modificado.
Además de las reacciones comentadas a continuación, en la técnica se conocen metodologías de síntesis alternativas para la modificación covalente de monómeros de manuronato y guluronato (véase, por ejemplo, March, “Advanced Organic Chemistry”, 5a edición, 2001, Wiley-Interscience Publication, Nueva York).
1. Modificación a través del resto carboxilato de los monómeros de manuronato y guluronato
Esquema 1. Condiciones de reacción representativas: i. HO-Ri, 2-cloro-4,6-dimetoxi-1,3,5-triazina (CDMT), N-metilmorfolina (NMM); ii. HNR<1>R<7>, CDMT, NMM.
Los monómeros de manuronato y guluronato contienen un resto ácido carboxílico que puede servir como punto de modificación covalente. En realizaciones preferidas, el resto ácido carboxílico presente en uno o más residuos de manuronato y/o guluronato (1) se hace reaccionar tal como se muestra en el esquema 1.
Los residuos de manuronato y guluronato (A) pueden someterse a esterificación fácilmente mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica, formando el monómero modificado covalentemente B. Por ejemplo, usando una esterificación de Steglich, los residuos de manuronato y guluronato (A) pueden someterse a esterificación mediante reacción con cualquier alcohol adecuado (HO-R1) en presencia de una carbodiimida (por ejemplo, N,N’-diciclohexilcarbodiimida (DCC), N,N’-diisopropilcarbodiimida (DIC), o 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC)) y dimetilaminopiridina (DMAP). En un método preferido, los residuos de manuronato y guluronato (A) se sometieron a esterificación mediante reacción con un gran exceso molar de un alcohol (HO-R1) en presencia de 2-cloro-4,6-dimetoxi-1,3,5-triazina (CDMT) y N-metilmorfolina (NMM). Véase, por ejemplo, Garrett, C. E.et al.Tetrahedron Lett. 2002; 43(23): 4161-4164. Los alcoholes preferidos para su uso como reactivos en la esterificación incluyen los mostrados a continuación.
Los residuos de manuronato y guluronato (A) también pueden modificarse covalentemente a través de amidación, formando el monómero modificado C. Por ejemplo, los residuos de manuronato y guluronato (A) pueden someterse a amidación mediante reacción con cualquier amina adecuada (R<1>-NH<2>) en presencia de una carbodiimida y DMAP. En un método preferido, los residuos de manuronato y guluronato (A) se sometieron a amidación mediante reacción con una cantidad estequiométrica de una amina adecuada (R<1>-NH<2>) en presencia de CDMT y NMM. Las aminas preferidas para su uso como reactivos en las reacciones de amidación incluyen las mostradas a continuación.
2. Modificación de monómeros de manuronato y guluronato a través de química clic
En algunos ejemplos, los monómeros de manuronato y guluronato se modifican covalentemente para introducir un grupo funcional que puede hacerse reaccionar adicionalmente mediante química clic.
En ejemplos preferidos, se usa amidación y/o esterificación para introducir un grupo funcional que puede hacerse reaccionar adicionalmente usando una reacción de cicloadición 1,3-dipolar (es decir, una reacción de cicloadición de Huisgen). En una reacción de cicloadición 1,3-dipolar, una primera molécula que contiene un resto azida se hace reaccionar con una segunda molécula que contiene un alquino terminal o interno. Tal como se muestra a continuación, la azida y los grupos alquino experimentan una reacción de cicloadición 1,3-dipolar intramolecular, acoplando las dos moléculas juntas y formando un anillo de 1,2,3-triazol.
La regioquímica de la reacción de cicloadición 1,3-dipolar puede controlarse mediante la adición de un catalizador de cobre(I) (formadoin situmediante la reducción de CuSO4 con ascorbato de sodio) o un catalizador de rutenio (tal como Cp*RuCl(PPh3)2, Cp*Ru(COD), o Cp*[RuCl4]). Por ejemplo, usando un catalizador de cobre, las azidas y los alquinos terminales pueden hacerse reaccionar para proporcionar exclusivamente los regioisómeros 1,4 de 1,2,3-triazoles. De manera similar, en presencia de un catalizador de rutenio adecuado, las azidas pueden hacerse reaccionar con alquinos internos o terminales para formar exclusivamente los regioisómeros 1,5 de 1,2,3-triazoles.
En algunos ejemplos, se usa amidación y/o esterificación para formar un monómero modificado covalentemente que contiene un resto alquino. En estos ejemplos, el resto alquino presente en el monómero modificado covalentemente puede hacerse reaccionar adicionalmente con una segunda molécula que contiene un grupo funcional azida. Tras la reacción, la azida y los grupos alquino experimentan una reacción de cicloadición 1,3-dipolar intramolecular formando un anillo de 1,2,3-triazol, acoplando la segunda molécula al monómero modificado covalentemente.
Los ejemplos del reactante de amidación/esterificación que contiene alquino incluyen Xa-Rz-C=C-Rx; en donde Xa es -OH o -NH2; en donde Rz es grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, sulfonilo, sulfonilo sustituido, ácido sulfónico, fosforilo, fosforilo sustituido, fosfonilo, fosfonilo sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C3-C20, cíclico C3-C20 sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido; y en donde Rx es hidrógeno, grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, sulfonilo, sulfonilo sustituido, ácido sulfónico, fosforilo, fosforilo sustituido, fosfonilo, fosfonilo sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C3-C20, cíclico C3-C20 sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido.
En algunos ejemplos,
(1) Rz es hidrógeno,
(A)
en donde y es un número entero desde 1 hasta 11; en donde Re es independientemente grupo alcoxilo, amino, alquilamino, dialquilamino, hidroxilo, alquenilo, alquinilo, alquilo sustituido, alquenilo sustituido, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C3-C20, cíclico C3-C20 sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, y polipéptido; o junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un anillo carbocíclico o heterocíclico no sustituido o sustituido de 3 a 8 miembros; en donde un caso de Re es o contiene Xa; en donde Ri8, Ri 9, R2o, R2i , R22, y R23 son independientemente C, O, N, o S, en donde los enlaces entre Ri 8 a R23 adyacentes son dobles o sencillos según la valencia, y en donde Ri8 a R23 están unidos a ninguno, uno, o dos hidrógenos según la valencia; y en donde R24 es independientemente -(CR25R<25>)p- o -(CR25R<25>)p-Xb-(CR25R<25>)4-, en donde p y q son independientemente números enteros desde 0 hasta 5, en donde Xb está ausente, es -O-, -S-, - SO<2>-, o NR<4>, en donde cada R<25>está independientemente ausente, es hidrógeno, =O, =S, - OH, -SH, -NR<4>, en donde R<4>es grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C<3>-C<20>, cíclico C<3>-C<20>sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido;
(B) -(CH2)s-R26, en donde s es un número entero desde 0 hasta 20; en donde R26 es -Xa, -O-R27, -S-R27, -(CH2)r-R27, -CO-R27, o -CHR28R29, en donde r es un número entero desde 0 hasta 19; en donde R27 es -Xa, -(CH2)u-R30, en donde u es un número entero desde 0 hasta 18; en donde R28 es -(CH2)t-R30, R29 es -(CH2)v-R30, y t y v son números enteros desde 0 hasta 18, en donde t y v juntos totalizan de 0 a 18; en donde R30 es - Xa, metilo, -OH, -SH, o-COOH; o
(C)
Fórmula VII Fórmula VIII
en donde R3<i>, R32, R33, R34, R35, y R36 son, independientemente, hidrógeno, grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C<3>-C<20>, cíclico C<3>-C<20>sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido; y en donde un caso de R<31>, R<32>, R<33>, R<34>, R<35>, o R<36>es o contiene Xa;
(2) Rx es hidrógeno,
(A)
en donde y es un número entero desde 0 hasta 11; en donde Re es independientemente grupo alcoxilo, amino, alquilamino, dialquilamino, hidroxilo, alquenilo, alquinilo, alquilo sustituido, alquenilo sustituido, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C3-C20, cíclico C3-C20 sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, y polipéptido; o junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un anillo carbocíclico o heterocíclico no sustituido o sustituido de 3 a 8 miembros; en donde Ri8, Ri9, R2o, R2i , R22, y R23 son independientemente C, O, N, o S, en donde los enlaces entre Ri8 a R23 adyacentes son dobles o sencillos según la valencia, y en donde R<i>8 a R23 están unidos a ninguno, uno, o dos hidrógenos según la valencia; y en donde R24 es independientemente -(CR25R25)p- o -(CR25R2<5>)p-Xb-(CR25R2<5>)q-, en donde p y q son independientemente números enteros desde 0 hasta 5, en donde Xb está ausente, es -O-, -S-, -SO<2>-, o NR<4>, en donde cada R<25>está independientemente ausente, es hidrógeno, =O, =S, -OH, - SH, -NR<4>, en donde R<4>es grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C<3>-C<20>, cíclico C<3>-C<20>sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido;
(B) -(CH2)s-R26, en donde s es un número entero desde 0 hasta 20; en donde R26 es -O-R27, -S-R27, -(CH2)r R27, -CO-R27, o -CHR28R29, en donde r es un número entero desde 0 hasta 19; en donde R27 es -(CH2)u-R30, en donde u es un número entero desde 0 hasta 18; en donde R<28>es -(CH<2>)t-R<30>, R<29>es -(CH<2>V R<30>, y t y v son números enteros desde 0 hasta 18, en donde t y v juntos totalizan de 0 a 18; en donde R<30>es metilo, -OH, -SH, o -COOH; o
(C)
Fórmula VII Fórmula VIII
en donde R3i , R32, R33, R34, R35, y R36 son, independientemente, hidrógeno, grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C3-C20, cíclico C3-C20 sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido; y
(3) en donde Rz y Rx no son ninguno hidrógeno.
Los ejemplos de la segunda molécula que contiene azida incluyen Rw-N3, en donde Rw es grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, sulfonilo, sulfonilo sustituido, ácido sulfónico, fosforilo, fosforilo sustituido, fosfonilo, fosfonilo sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C3-C20, cíclico C3-C20 sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido.
En algunos ejemplos, Rw es
(A)
en donde k es independientemente un número entero desde 1 hasta 30; en donde z es un número entero desde 0 hasta 4; en donde X4 es O o S; en donde Ra es independientemente grupo alcoxilo, amino, alquilamino, dialquilamino, hidroxilo, alquenilo, alquinilo, alquilo sustituido, alquenilo sustituido, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C3-C20, cíclico C3-C20 sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido; o junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un anillo carbocíclico o heterocíclico no sustituido o sustituido de 3 a 8 miembros; y en donde Río, Rn, Ri 2, Ri3, Ri 4, R<15>, Ri 6, Ri 7 son independientemente hidrógeno, grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, sulfonilo, sulfonilo sustituido, ácido sulfónico, fosforilo, fosforilo sustituido, fosfonilo, fosfonilo sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C<3>-C<20>, cíclico C<3>-C<20>sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido; o
(B)
Fórmula VII Fórmula VIII
en donde R31, R32, R33, R34, R35, y R36 son, independientemente, hidrógeno, grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C3-C20, cíclico C3-C20 sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido.
En ejemplos alternativos, se usa amidación y/o esterificación para formar un monómero modificado covalentemente que contiene un resto azida. En estos ejemplos, el resto azida presente en el monómero modificado covalentemente puede hacerse reaccionar adicionalmente con una segunda molécula que contiene un alquino terminal o interno. Tras la reacción, la azida y los grupos alquino experimentan una reacción de cicloadición 1,3-dipolar intramolecular formando un anillo de 1,2,3-triazol, acoplando la segunda molécula al monómero modificado covalentemente.
Los ejemplos del reactante de amidación/esterificación que contiene azida incluyen Xc-Rw-N3, donde Xc es -OH o -NH<2>y Rw es grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, sulfonilo, sulfonilo sustituido, ácido sulfónico, fosforilo, fosforilo sustituido, fosfonilo, fosfonilo sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C<3>-C<20>, cíclico C<3>-C<20>sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido.
En algunos ejemplos, Xc no es -NH2 y Rw no es -CH2-Ar- o -CH2-CH2-(O-CH2-CH2)3-.
En algunos ejemplos, Rw es
(A)
Fórmula X Fórmula XI
en donde k es independientemente un número entero desde 1 hasta 30; en donde z es un número entero desde 0 hasta 4; en donde X4 es O o S; en donde Ra es independientemente grupo alcoxilo, amino, alquilamino, dialquilamino, hidroxilo, alquenilo, alquinilo, alquilo sustituido, alquenilo sustituido, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C3-C20, cíclico C3-C20 sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido; o junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un anillo carbocíclico o heterocíclico no sustituido o sustituido de 3 a 8 miembros; en donde un caso de Ra es o contiene Xc; en donde Río, Rn, R<i>2, R<i>3, R<i>4, R15, R<i>6, R<i>7 son independientemente hidrógeno, grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, sulfonilo, sulfonilo sustituido, ácido sulfónico, fosforilo, fosforilo sustituido, fosfonilo, fosfonilo sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C<3>-C<20>, cíclico C<3>-C<20>sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido; y en donde un caso de R<10>, R<11>, R<12>, R<13>, R<14>, R<15>, R<16>, o R<17>es o contiene Xc; o
(B)
Fórmula VII Fórmula VIII
en donde R31, R32, R33, R34, R35, y R36 son, independientemente, hidrógeno, grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C3-C20, cíclico C3-C20 sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido; y en donde un caso de R31, R32, R33, R34, R35, o R36 es o contiene Xc.
Los ejemplos de la segunda molécula que contiene alquino incluyen Rz-C=C-Rx, en donde Rz y Rx son, independientemente, hidrógeno, grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, sulfonilo, sulfonilo sustituido, ácido sulfónico, fosforilo, fosforilo sustituido, fosfonilo, fosfonilo sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C<3>-C<20>, cíclico C<3>-C<20>sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido.
En algunos ejemplos, Rz y Rx son independientemente hidrógeno,
(A)
en donde y es un número entero desde 0 hasta 11; en donde Re es independientemente grupo alcoxilo, amino, alquilamino, dialquilamino, hidroxilo, alquenilo, alquinilo, alquilo sustituido, alquenilo sustituido, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C<3>-C<20>, cíclico C<3>-C<20>sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, y polipéptido; o junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un anillo carbocíclico o heterocíclico no sustituido o sustituido de 3 a 8 miembros; en donde R<i>8, R<i>9, R20, R2<i>, R22, y R23 son independientemente C, O, N, o S, en donde los enlaces entre R<i>8 a R23 adyacentes son dobles o sencillos según la valencia, y en donde Ri8 a R23 están unidos a ninguno, uno, o dos hidrógenos según la valencia; y en donde R24 es independientemente -(CR25R25)p- o -(CR25R<25>)p-Xb-(CR25R<25>)q-, en donde p y q son independientemente números enteros desde 0 hasta 5, en donde Xb está ausente, es -O-, -S-, -SO2-, o NR4, en donde cada R25 está independientemente ausente, es hidrógeno, =O, =S, -OH, - SH, -NR4, en donde R4 es grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C3-C20, cíclico C3-C20 sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido;
(B) -(CH2)s-R26, en donde s es un número entero desde 0 hasta 20; en donde R26 es -O-R27, -S-R27, -(CH2)r-R27, -CO-R27, o -c Hr28R29, en donde r es un número entero desde 0 hasta 19; en donde R27 es -(CH2)u-R30, en donde u es un número entero desde 0 hasta 18; en donde R<28>es -(CH<2>VR<30>, R<29>es -(CH<2>V R<30>, y t y v son números enteros desde 0 hasta 18, en donde t y v juntos totalizan de 0 a 18; en donde R<30>es metilo, -OH, -SH, o -COOH; o
(C)
Fórmula VII Fórmula VIII
en donde R3i , R32, R33, R34, R35, y R36 son, independientemente, hidrógeno, grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C3-C20, cíclico C3-C20 sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido; y
en donde Rz y Rx no son ninguno hidrógeno.
En algunos ejemplos, el resto azida puede añadirse a un monómero modificado covalentemente que contiene un grupo saliente, tal como I, Br, OTs, OMs. En algunas realizaciones, se usa amidación y/o esterificación para formar el monómero modificado covalentemente que contiene el grupo saliente. Los ejemplos del reactante de amidación/esterificación que contiene grupo saliente incluyen Xc-Rw-L, donde Xc es -OH o -NH2, L es el grupo saliente, y Rw es grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, sulfonilo, sulfonilo sustituido, ácido sulfónico, fosforilo, fosforilo sustituido, fosfonilo, fosfonilo sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C3-C20, cíclico C3-C20 sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido.
En algunos ejemplos, Xc no es -NH2 y Rw no es -CH2-Ar- o -CH2-CH2-(O-CH2-CH2)3-.
En algunos ejemplos, Rw es
(A)
en donde k es independientemente un número entero desde 1 hasta 30; en donde z es un número entero desde 0 hasta 4; en donde Xd es O o S; en donde Ra es independientemente grupo alcoxilo, amino, alquilamino, dialquilamino, hidroxilo, alquenilo, alquinilo, alquilo sustituido, alquenilo sustituido, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C3-C20, cíclico C3-C20 sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido; o junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un anillo carbocíclico o heterocíclico no sustituido o sustituido de 3 a 8 miembros; en donde un caso de Ra es o contiene Xc; en donde R<10>, R<11>, R<12>, R<13>, R<14>, R<15>, R<16>, R<17>son independientemente hidrógeno, grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, sulfonilo, sulfonilo sustituido, ácido sulfónico, fosforilo, fosforilo sustituido, fosfonilo, fosfonilo sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C<3>-C<20>, cíclico C<3>-C<20>sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido; y en donde un caso de R<10>, R<11>, R<12>, R<13>, R<14>, R<15>, R<16>, o R<17>es o contiene Xc; o
(B)
Fórmula VII Fórmula VIII
en donde R31, R32, R33, R34, R35, y R36 son, independientemente, hidrógeno, grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C3-C20, cíclico C3-C20 sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido; y en donde un caso de R31, R32, R33, R34, R35, o R36 es o contiene Xc.
En algunos ejemplos, Xc no es -NH<2>y Rw no es -CH<2>-Ar- o -CH<2>-CH<2>-(O-CH<2>-CH<2>)<3>-.
En ejemplos preferidos, se usa amidación para formar un monómero modificado covalentemente que contiene un resto azida. Posteriormente, el resto azida presente en el monómero modificado covalentemente se hace reaccionar con una segunda molécula que contiene un alquino terminal o interno, formando un anillo de 1,2,3-triazol y acoplando la segunda molécula al monómero modificado covalentemente.
Tal como se muestra en el esquema 2, pueden emplearse diferentes estrategias para preparar monómeros modificados covalentemente que contienen un resto azida.
Esquema 2.
Por ejemplo, los residuos de manuronato y guluronato (A) pueden someterse a amidación mediante reacción con una amina sustituida con un resto azida (por ejemplo, 11-azido-3,6,9-trioxaundecan-1-amina) en presencia de una carbodiimida y DMAP, formando el monómero modificado funcionalizado con azida F en una única etapa de síntesis. Alternativamente, los residuos de manuronato y guluronato (A) pueden someterse a amidación mediante reacción con una amina sustituida con cualquier resto que pueda transformarse fácilmente en una azida. Por ejemplo, los residuos de manuronato y guluronato pueden someterse a amidación mediante reacción con 4-yodobencilamina en presencia de una carbodiimida y DMAP, formando el monómero funcionalizado con yodo D. Luego, el resto yodo puede convertirse fácilmente en la azida, por ejemplo, mediante tratamiento con azida de sodio.
Posteriormente, los monómeros funcionalizados con azida pueden hacerse reaccionar con una molécula que contiene una funcionalidad alquino. Por ejemplo, los monómeros funcionalizados con azida F y E pueden hacerse reaccionar con una molécula que contiene una funcionalidad alquino terminal en presencia de un catalizador de cobre(I) (formadoin situmediante la reducción de CuSO<4>con ascorbato de sodio), formando los monómeros modificados covalentemente G y H.
Los alquinos preferidos para su uso como reactivos en reacciones de cicloadición 1,3-dipolar incluyen los mostrados a continuación.
3. Modificación a través del resto hidroxilo de los monómeros de manuronato y guluronato
Los monómeros de manuronato y guluronato contienen restos hidroxilo que pueden servir como punto de modificación covalente. En ejemplos preferidos, los restos hidroxilo de los residuos de manuronato y guluronato (1) se hacen reaccionar tal como se muestra en el esquema 3.
Esquema 3.
Condiciones de reacción representativas: i. I-PO(OR5)2, piridina; ii. R2-CO-R3, H+.
Los residuos de manuronato y guluronato (A) pueden someterse a fosforilación mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica, formando el monómero modificado covalentemente I. Por ejemplo, los residuos de manuronato y guluronato pueden someterse a fosforilación mediante reacción con I-PO(o R5)2 en presencia de piridina (Stowell, J. K. y Widlanski, T. S. Tetrahedron Lett. 1995; 36(11): 1825-1826).
Los residuos de manuronato y guluronato (A) también pueden convertirse en un acetal cíclico usando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede formarse un acetal cíclico mediante reacción de los residuos de manuronato y guluronato con cualquier cetona (R2-CO-R3) adecuada en condiciones ácidas.
4. Métodos para preparar polímeros de alginato modificados de manera múltiple
En el caso de polímeros de alginato modificados de manera individual, sólo se realiza una única reacción o secuencia de reacciones, introduciendo un tipo de monómero modificado covalentemente.
En el caso de polímeros de alginato modificados de manera múltiple, se realizan una o más reacciones para introducir múltiples tipos diferentes de monómeros modificados covalentemente en el polímero de alginato modificado. En algunos ejemplos, los polímeros de alginato modificados de manera múltiple se preparan usando múltiples reacciones de síntesis secuenciales. Por ejemplo, el polímero de alginato modificado de manera múltiple mostrado a continuación puede prepararse usando dos reacciones secuenciales: (1) amidación de los monómeros de manuronato y guluronato con metilamina en presencia de CDMT y NMM; y (2) esterificación de los residuos de manuronato y guluronato con etanol en presencia de CDMT y NMM.
En ejemplos alternativos, los polímeros de alginato modificados de manera múltiple pueden prepararse usando una síntesis “en un solo recipiente”. En estos ejemplos, se introducen múltiples monómeros modificados covalentemente en el polímero de alginato en una única etapa de síntesis. Por ejemplo, el polímero de alginato modificado de manera múltiple mostrado anteriormente puede prepararse alternativamente en una única etapa de síntesis haciendo reaccionar un polímero de alginato con metilamina y etanol en presencia de CDMT y NMM.
Cualquier tipo o forma de alginato modificado, cualquier tipo o forma de modificación de alginato, y cualquier tipo o forma de reactivo para modificar el alginato pueden incluirse o excluirse específicamente, de manera independiente y en cualquier combinación, en cualquiera de los alginatos modificados, las modificaciones de alginato, los reactivos para las modificaciones de alginato, los métodos, y los kits divulgados, y en cualquier contexto, combinación, o uso. Por ejemplo, cualquier tipo o forma de reactivo de esterificación, reactivo de amidación, reactivo de química clic, reactivo que contiene alquino, reactivo que contiene azida, reactivo de fosforilación, y reactivo de cetona, tales como los descritos anteriormente y en los ejemplos, pueden incluirse o excluirse específicamente, de manera independiente y en cualquier combinación, del uso para modificar los alginatos, y cualesquiera modificaciones de alginato y cualesquiera alginatos modificados que incluyen o están basados en tales reactivos pueden incluirse o excluirse específicamente, de manera independiente y en cualquier combinación, en cualquiera de los alginatos modificados, las modificaciones de alginato, los reactivos para las modificaciones de alginato, los métodos, y los kits divulgados, y en cualquier contexto, combinación, o uso.
Como otro ejemplo, cualquiera de los reactivos descritos en la tabla 2 pueden incluirse o excluirse específicamente, de manera independiente y en cualquier combinación, del uso para modificar los alginatos, y cualesquiera modificaciones de alginato y cualesquiera alginatos modificados que incluyen o están basados en los reactivos descritos en la tabla 2 pueden incluirse o excluirse específicamente, de manera independiente y en cualquier combinación, en cualquiera de los alginatos modificados, las modificaciones de alginato, los reactivos para las modificaciones de alginato, los métodos, y los kits divulgados, y en cualquier contexto, combinación, o uso. Por ejemplo, la totalidad de los reactivos descritos en la tabla 2 en combinación pero excluyendo el reactivo Y3 pueden incluirse o excluirse específicamente del uso para modificar los alginatos, y cualesquiera modificaciones de alginato y cualesquiera alginatos modificados que incluyen o están basados en la totalidad de los reactivos descritos en la tabla 2 en combinación pero excluyendo el reactivo Y3 pueden incluirse o excluirse específicamente en cualquiera de los alginatos modificados, las modificaciones de alginato, los reactivos para las modificaciones de alginato, los métodos, y los kits divulgados, y en cualquier contexto, combinación, o uso.
Como otro ejemplo, cualquier alginato modificado, modificación de alginato, o reactivo para la modificación de alginato descrito en la solicitud de patente estadounidense n.° 20120308650 puede incluirse o excluirse específicamente, de manera independiente y en cualquier combinación. Por ejemplo, la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 20120308650 proporciona una guía detallada para la preparación de alginatos modificados, modificaciones de alginato, y reactivos para las modificaciones de alginato. Cualquiera de los sustituyentes de grupo R para cualquiera de los grupos R descritos en el presente documento puede incluirse o excluirse específicamente, de manera independiente y en cualquier combinación, como una opción o como la elección para el grupo R respectivo.
D. Purificación de alginatos
Los alginatos comerciales se obtienen generalmente a partir de algas. Los alginatos en bruto procedentes de algas marinas contienen numerosos contaminantes, incluyendo polifenoles, proteínas, y endotoxinas (de Vos, P,et al.Biomaterials 2006; 27: 5603-5617). Se ha mostrado que la presencia de estas impurezas limita la biocompatibilidad de los alginatos implantados.
Para optimizar la biocompatibilidad de los alginatos modificados químicamente descritos en el presente documento, se desarrolló una metodología de purificación rigurosa para eliminar las impurezas potencialmente irritantes. En ejemplos preferidos, se usó alginato ultrapuro de baja viscosidad (UPVLVG, FMC Biopolymer) como sustrato para la modificación covalente. Después de cada modificación covalente, los alginatos modificados se filtraron a través de columnas de sílice modificada, por ejemplo, columnas de sílice modificada con ciano, con el objetivo de capturar las impurezas orgánicas a granel. Finalmente, después de completarse la modificación covalente del polímero de alginato, los alginatos modificados se someten a diálisis para retirar cualquier impureza de bajo peso molecular o de molécula pequeña restante. En un método preferido, los alginatos modificados se someten a diálisis frente a una membrana con un corte de peso molecular (MWCO) de 10.000 para retirar cualquier impureza de molécula pequeña restante.
La pureza de los alginatos modificados puede determinarse mediante análisis por 1H-RMN. En un análisis de este tipo, se recopilan espectros de 1H-RMN del polímero de alginato modificado, y se integran los picos correspondientes al polímero de alginato modificado y a cualquier impureza para determinar la cantidad relativa de cada especie en la muestra. En algunos ejemplos, la pureza del polímero de alginato modificado, tal como se determina mediante 1H-RMN, es mayor del 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 %. En ejemplos preferidos, la pureza del polímero de alginato modificado, tal como se determina mediante 1H-RMN, es mayor del 90 %, más preferiblemente mayor del 95 %.
III. Materiales biológicos
El material biológico para su encapsulación en los alginatos divulgados puede ser cualquier sustancia biológica. Por ejemplo, el material biológico puede ser tejido, células, micromoléculas biológicas, o macromoléculas biológicas. Los ejemplos de macromoléculas biológicas incluyen nucleótidos, aminoácidos, cofactores, y hormonas. Los ejemplos de macromoléculas biológicas incluyen ácidos nucleicos, polipéptidos, proteínas, y polisacáridos. Los ejemplos de proteínas incluyen enzimas, receptores, proteínas secretoras, proteínas estructurales, proteínas de señalización, hormonas, y ligandos. Puede usarse cualquier clase, tipo, forma, o material biológico particular junto con cualesquiera otras clases, tipos, formas, o materiales biológicos particulares.
A. Células
Además, los productos médicos según la invención pueden usarse junto con células. El tipo de célula elegido para su encapsulación en las composiciones divulgadas depende del efecto terapéutico deseado. Las células pueden ser del paciente (células autólogas), de otro donante de la misma especie (células alogénicas), o de otra especie (xenogénicas). Las células xenogénicas son fácilmente accesibles, pero la posibilidad de rechazo y el peligro de la posible transmisión de virus al paciente restringe su aplicación clínica. Cualquiera de estos tipos de células puede proceder de fuentes naturales, células madre, células derivadas, o células genéticamente modificadas por ingeniería.
En algunos ejemplos, las células secretan una sustancia terapéuticamente eficaz, tal como una proteína o un ácido nucleico. En algunos ejemplos, las células producen un producto metabólico. En algunos ejemplos, las células metabolizan sustancias tóxicas. En algunas realizaciones, las células forman tejidos estructurales, tales como piel, hueso, cartílago, vasos sanguíneos, o músculo. En algunas realizaciones, las células son naturales, tales como células de los islotes que secretan insulina de manera natural, o hepatocitos que detoxifican de manera natural. En algunos ejemplos, las células están genéticamente modificadas por ingeniería para expresar una proteína o un ácido nucleico heterólogo y/o sobreexpresar una proteína o un ácido nucleico endógeno.
Los tipos de células para su encapsulación en las composiciones divulgadas incluyen células de fuentes naturales, tales como células de xenotejido, células de un cadáver, y células primarias; células madre, tales como células madre embrionarias, células madre mesenquimatosas, y células madre pluripotentes inducidas; células derivadas, tales como células derivadas de células madre, células de una línea celular, células reprogramadas, células madre reprogramadas, y células derivadas de células madre reprogramadas; y células genéticamente modificadas por ingeniería, tales como células genéticamente modificadas por ingeniería para expresar una proteína o un ácido nucleico, células genéticamente modificadas por ingeniería para producir un producto metabólico, y células genéticamente modificadas por ingeniería para metabolizar sustancias tóxicas.
Los tipos de células para su encapsulación en las composiciones divulgadas incluyen hepatocitos, células de los islotes, células paratiroideas, células endocrinas, células de origen intestinal, células derivadas del riñón, y otras células que actúan principalmente para sintetizar y secretar, o para metabolizar materiales. Un tipo de célula preferido es una célula de los islotes pancreáticos u otra célula productora de insulina. Las células productoras de hormonas pueden producir una o más hormonas, tales como insulina, hormona paratiroidea, hormona antidiurética, oxitocina, hormona del crecimiento, prolactina, hormona estimulante de la tiroides, hormona adrenocorticotrópica, hormona estimulante de los folículos, hormona luteinizante, tiroxina, calcitonina, aldosterona, cortisol, epinefrina, glucagón, estrógeno, progesterona, y testosterona. Las células genéticamente modificadas por ingeniería también son adecuadas para su encapsulación según los métodos divulgados. En algunos ejemplos, las células se modifican por ingeniería para producir una o más hormonas, tales como insulina, hormona paratiroidea, hormona antidiurética, oxitocina, hormona del crecimiento, prolactina, hormona estimulante de la tiroides, hormona adrenocorticotrópica, hormona estimulante de los folículos, hormona luteinizante, tiroxina, calcitonina, aldosterona, cortisol, epinefrina, glucagón, estrógeno, progesterona, y testosterona. En algunos ejemplos, las células se modifican por ingeniería para secretar factores de coagulación de la sangre (por ejemplo, para el tratamiento de hemofilia) o para secretar hormonas del crecimiento. En algunos ejemplos, las células están contenidas en tejido natural o modificado por bioingeniería. Por ejemplo, las células para su encapsulación son, en algunos ejemplos, un glomérulo renal bioartificial. En algunos ejemplos, las células son adecuadas para su trasplante al sistema nervioso central para el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa.
Las células pueden obtenerse directamente a partir de un donante, a partir de un cultivo celular de células de un donante, o a partir de líneas de cultivo celular establecidas. En los ejemplos preferidos, las células se obtienen directamente a partir de un donante, se lavan y se implantan directamente en combinación con el material polimérico. Las células se cultivan usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica de histocultivo.
La viabilidad celular puede evaluarse usando técnicas convencionales, tales como histología y microscopía de fluorescencia. La función de las células implantadas puede determinarse usando una combinación de estas técnicas y ensayos funcionales. Por ejemplo, en el caso de hepatocitos, pueden realizarse estudios de función hepáticain vivocolocando una cánula en el conducto colédoco del receptor. Luego puede recogerse bilis en incrementos. Los pigmentos biliares pueden analizarse mediante cromatografía de líquidos de alta presión en busca de tetrapirroles no derivatizados o mediante cromatografía en capa fina tras convertirse en azodipirroles mediante reacción con etilantranilato de azodipirrol diazotizado, con o sin tratamiento con P-glucuronidasa. También puede determinarse la bilirrubina diconjugada y monoconjugada mediante cromatografía en capa fina tras la metanólisis alcalina de los pigmentos biliares conjugados. En general, a medida que aumenta el número de hepatocitos trasplantados en funcionamiento, aumentan los niveles de bilirrubina conjugada. También pueden realizarse pruebas de función hepática sencillas en muestras de sangre, tal como la producción de albúmina. Pueden llevarse a cabo estudios de función orgánica análogos usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica, según se requiera, para determinar el grado de función celular tras la implantación. Por ejemplo, pueden implantarse células de los islotes pancreáticos y otras células productoras de insulina para lograr la regulación de glucosa mediante la secreción apropiada de insulina. También pueden implantarse otros tejidos y células endocrinos.
El sitio, o los sitios, donde deben implantarse las células se determina basándose en la necesidad individual, al igual que el número requerido de células. Para las células que reemplazan a o suplementan una función orgánica o glandular (por ejemplo, hepatocitos o células de los islotes), la mezcla puede inyectarse en el mesenterio, el tejido subcutáneo, el retroperitoneo, el espacio properitoneal, y el espacio intramuscular.
La cantidad y la densidad de células encapsuladas en las composiciones divulgadas, tales como cápsulas y microcápsulas, variarán dependiendo de la elección de la célula, del hidrogel, y del sitio de implantación. En algunos ejemplos, las células individuales están presentes en el hidrogel a una concentración de 0,1*106 a 4*10® células/ml, preferiblemente de 0,5*10® a 2*10® células/ml. En otros ejemplos, las células están presentes como agregados de células. Por ejemplo, los agregados de células de los islotes (o islotes completos) preferiblemente contienen aproximadamente 1500-2000 células por cada agregado de 150 |im de diámetro, que se define como un equivalente de islote (IE). Por tanto, en algunos ejemplos, las células de los islotes están presentes a una concentración de 100 10000 IE/ml, preferiblemente de 200-3.000 lE/ml, más preferiblemente de 500-1500 lE/ml.
1. Células de los islotes y otras células productoras de insulina
En ejemplos preferidos, las composiciones divulgadas contienen células de los islotes u otras células productoras de insulina. En la técnica se conocen métodos de aislamiento de células de los islotes pancreáticos. Fieldet al.,Transplantation 61:1554 (1996); Linetskyet al.,Diabetes 46:1120 (1997). El tejido pancreático nuevo puede dividirse mediante troceado, desmenuzado, conminución y/o digestión con colagenasa. Luego pueden aislarse los islotes a partir de las células y los materiales contaminantes mediante procedimientos de lavado, filtración, centrifugación o recogida. Los métodos y el aparato para aislar y purificar las células de los islotes se describen en las patentes estadounidenses n.os 5.447.863 concedida a Langley, 5.322.790 concedida a Scharpet al.,5.273.904 concedida a Langley, y 4.868.121 concedida a Scharpet al.Las células pancreáticas aisladas pueden cultivarse opcionalmente antes de la microencapsulación, usando cualquier método adecuado para cultivar células de los islotes tal como se conoce en la técnica. Véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 5.821.121 concedida a Brothers. Las células aisladas pueden cultivarse en un medio en condiciones que ayuden a eliminar los componentes antigénicos. Las células productoras de insulina también pueden derivarse de células madre y líneas celulares y pueden ser células genéticamente modificadas por ingeniería para producir insulina.
2. Células genéticamente modificadas por ingeniería
En algunos ejemplos, las composiciones divulgadas contienen células genéticamente modificadas por ingeniería para producir una proteína o un ácido nucleico (por ejemplo, una proteína o un ácido nucleico terapéutico). En estos ejemplos, la célula puede ser, por ejemplo, una célula madre (por ejemplo, pluripotente), una célula progenitora (por ejemplo, multipotente u oligopotente), o una célula terminalmente diferenciada (es decir, unipotente). Cualquiera de estos tipos de células divulgados puede estar genéticamente modificado por ingeniería. La célula puede modificarse por ingeniería, por ejemplo, para contener un ácido nucleico que codifica, por ejemplo, para un polinucleótido tal como miARN o iARN o un polinucleótido que codifica para una proteína. El ácido nucleico puede integrarse, por ejemplo, en el ADN genómico de las células para su expresión estable o puede estar, por ejemplo, en un vector de expresión (por ejemplo, ADN plasmídico). El polinucleótido o la proteína puede seleccionarse basándose en la enfermedad que va a tratarse (o el efecto que va a lograrse) y el sitio de trasplante o implantación. En algunos ejemplos, el polinucleótido o la proteína es antineoplásico. En otros ejemplos, el polinucleótido o la proteína es una hormona, un factor de crecimiento, o una enzima.
B. Hormonas
Las hormonas que van a incluirse en las cápsulas divulgadas o, lo más preferiblemente, producirse a partir de las células encapsuladas en las cápsulas divulgadas pueden ser cualquier hormona de interés.
Los ejemplos de hormonas endocrinas incluyen hormona antidiurética (ADH), que se produce por la hipófisis posterior, se dirige a los riñones, y afecta al equilibrio hidroelectrolítico y a la tensión arterial; oxitocina, que se produce por la hipófisis posterior, se dirige al útero y a las mamas, y estimula las contracciones uterinas y la secreción de leche; hormona del crecimiento (GH), que se produce por la hipófisis anterior, se dirige a las células corporales, a los huesos y a los músculos, y afecta al crecimiento y al desarrollo; prolactina, que se produce por la hipófisis anterior, se dirige a las mamas, y mantiene las secreciones de leche; hormona estimulante de la tiroides (TSH), que se produce por la hipófisis anterior, se dirige a la tiroides, y regula las hormonas tiroideas; hormona adrenocorticotrópica (ACTH), que se produce por la hipófisis anterior, se dirige a la corteza suprarrenal, y regula las hormonas de la corteza suprarrenal; hormona estimulante de los folículos (FSH), que se produce por la hipófisis anterior, se dirige a los ovarios/testículos, y estimula la producción de óvulos y espermatozoides; hormona luteinizante (LH), que se produce por la hipófisis anterior, se dirige a los ovarios/testículos, y estimula la ovulación y la liberación de hormonas sexuales; tiroxina, que se produce por la tiroides, se dirige a las células corporales, y regula el metabolismo; calcitonina, que se produce por la tiroides, se dirige a la corteza suprarrenal, y reduce el calcio en sangre; hormona paratiroidea, que se produce por la paratiroides, se dirige a la matriz ósea, y aumenta el calcio en sangre; aldosterona, que se produce por la corteza suprarrenal, se dirige al riñón, y regula el equilibrio hidroelectrolítico; cortisol, que se produce por la corteza suprarrenal, se dirige a las células corporales, y debilita el sistema inmunitario y las respuestas al estrés; epinefrina, que se produce por la médula suprarrenal, se dirige al corazón, a los pulmones, al hígado y a las células corporales, y afecta a las respuestas primarias de “lucha o huida”; glucagón, que se produce por el páncreas, se dirige al cuerpo del hígado, y aumenta el nivel de glucemia; insulina, que se produce por el páncreas, se dirige a las células corporales, y reduce el nivel de glucemia; estrógeno, que se produce por los ovarios, se dirige al aparato reproductor, y afecta a la pubertad, al ciclo menstrual y al desarrollo de las gónadas; progesterona, que se produce por los ovarios, se dirige al aparato reproductor, y afecta a la pubertad, al ciclo menstrual y al desarrollo de las gónadas; y testosterona, que se produce por la glándula suprarrenal y los testículos, se dirige al aparato reproductor, y afecta a la pubertad, al desarrollo de las gónadas y a los espermatozoides.
IV. Ensayos para la caracterización de polímeros de alginato modificados
La modificación covalente de los polímeros de alginato altera las propiedades fisicoquímicas y la compatibilidad biológica del polímero de alginato.
En algunos ejemplos, se usa un ensayo de formación de hidrogel para cuantificar la estabilidad de los hidrogeles formados a partir de alginatos o alginatos modificados. En ejemplos preferidos, el ensayo de formación de hidrogel se usa como herramienta de cribado para identificar alginatos modificados capaces de formar hidrogeles estables. Los ensayosin vivopueden ser útiles para caracterizar la biocompatibilidad de polímeros de alginato modificados. En algunos ejemplos, el ensayo de biocompatibilidadin vivode alto rendimiento descrito en el presente documento se usa para identificar alginatos modificados que inducen una menor respuesta a cuerpos extraños que el alginato no modificado.
Además, en el presente documento se describe un métodoin vivopara cuantificar la biocompatibilidad de alginatos modificados.
Los ensayos pueden usarse para evaluar la idoneidad y la biocompatibilidad de alginatos tanto modificados como no modificados para determinadas aplicaciones.
A. Ensayo de formación de hidrogel de alto rendimiento
La modificación covalente de los alginatos afecta a las propiedades físicas del alginato, incluyendo la capacidad del alginato de formar hidrogeles adecuados para la encapsulación de células y biomoléculas.
El ensayo de formación de gel aprovecha la capacidad de los hidrogeles de atrapar compuestos fluorescentes y retener de manera diferente los fluoróforos tras el lavado basándose en la estabilidad del hidrogel. En este ensayo, se forma un hidrogel mediante la reticulación iónica de un alginato modificado candidato en disolución acuosa que contiene un fluoróforo disuelto. Pueden usarse una variedad de fluoróforos en este ensayo. En ejemplos preferidos, los fluoróforos presentan máximos de emisión entre 480 y 750 nm. En ejemplos preferidos, el fluoróforo es un colorante de rodamina que presenta un máximo de emisión entre 550 y 600 nm.
Después de la reticulación, el hidrogel se lava repetidamente con agua. Los alginatos modificados candidatos que no se reticulan eficientemente se eliminan por lavado junto con cualquier fluoróforo presente. Los alginatos modificados que se reticulan eficientemente retienen el fluoróforo durante los lavados. Por consiguiente, midiendo la fluorescencia de los hidrogeles de alginato modificado después del lavado, pueden identificarse fácilmente alginatos modificados capaces de formar hidrogeles estables.
En algunos ejemplos, los valores de intensidad de fluorescencia relativa medidos para un alginato modificado se comparan con respecto a los niveles de fluorescencia medidos para el control negativo y el alginato no modificado para determinar si el alginato modificado es capaz de formar hidrogeles. En ejemplos alternativos, el ensayo de formación de hidrogel descrito en el presente documento se usa para cuantificar la estabilidad de hidrogeles formados a partir de alginatos o alginatos modificados. En estos ejemplos, la intensidad de fluorescencia medida para un alginato modificado se usa para indicar la estabilidad del hidrogel formado por el alginato.
En ejemplos preferidos, el polímero de alginato modificado forma hidrogeles de manera que la intensidad de fluorescencia medida usando el ensayo de formación de hidrogel de alto rendimiento descrito en el presente documento es mayor de 10.000, 15.000, 20.000, 25.000, 30.000, 35.000, 40.000, 45.000, 50.000 ó 55.000. En ejemplos preferidos, el polímero de alginato modificado forma hidrogeles de manera que la intensidad de fluorescencia medida usando el ensayo de formación de hidrogel de alto rendimiento descrito en el presente documento es mayor de 15.000. En ejemplos preferidos, el polímero de alginato modificado forma hidrogeles de manera que la intensidad de fluorescencia medida usando el ensayo de formación de hidrogel de alto rendimiento descrito en el presente documento es de entre 15.000 y 55.000, más preferiblemente de entre 25.000 y 55.000. B. Ensayo de biocompatibilidadin vivode alto rendimiento
Los métodos de análisis de biocompatibilidad actuales son lentos y requieren un análisis histológico. En el presente documento se describe un ensayo de biocompatibilidadin vivode alto rendimiento útil para evaluar la biocompatibilidad relativa de polímeros de alginato.
En el ensayo de biocompatibilidadin vivode alto rendimiento descrito en el presente documento, los polímeros de alginato modificados y un control de alginato no modificado se inyectan en un formato de matriz en el lomo de un sujeto de prueba animal para facilitar el cribado de alto rendimiento. En ejemplos preferidos, el sujeto de prueba animal es un ratón. Después de la inyección, la actividad catepsina en el punto de inyección de los alginatos modificados se comparó con la actividad catepsina en el punto de inyección del alginato no modificado para comparar la respuesta a cuerpos extraños con respecto a los alginatos implantados usando obtención de imágenes de fluorescenciain vivo.En ejemplos preferidos, la biocompatibilidad de los materiales se evaluó 14 días después de la inyección usando obtención de imágenes de fluorescenciain vivo.
En ejemplos preferidos, el ensayo de biocompatibilidadin vivode alto rendimiento descrito en el presente documento se usa para identificar alginatos modificados que inducen una menor respuesta a cuerpos extraños que el alginato no modificado. La intensidad de fluorescencia medida en el sitio de implantación de alginatos modificados se comparó con la intensidad de fluorescencia medida en el sitio de implantación de un alginato no modificado. En ejemplos preferidos, los alginatos modificados que muestran una intensidad de fluorescencia más pequeña en el sitio de implantación que la intensidad de fluorescencia medida en el sitio de implantación de alginatos no modificados se caracterizaron cualitativamente como biocompatibles. A la inversa, los alginatos modificados que muestran una intensidad de fluorescencia más alta en el sitio de implantación que la intensidad de fluorescencia medida en el sitio de implantación de alginatos no modificados se caracterizaron como no biocompatibles.
El ensayo de biocompatibilidadin vivode alto rendimiento descrito anteriormente también puede usarse para caracterizar la capacidad de los alginatos modificados de formar hidrogeles mecánicamente establesin vivo.En ejemplos preferidos, se evaluó la estabilidadin vivode los geles de alginato 28 días después de la inyección.
En ejemplos preferidos, los geles de alginato modificado que permanecieron en el sitio de inyección después de 28 días se caracterizaron como capaces de formar hidrogeles mecánicamente establesin vivo.A la inversa, los geles de alginato modificado que no estaban presentes en el sitio de inyección después de 28 días se consideraron incapaces de formar hidrogeles mecánicamente establesin vivo.
C. Cribadoin vivode alginatos modificados para cuantificar la biocompatibilidad
Además, en el presente documento se describe un métodoin vivopara cuantificar la biocompatibilidad de alginatos modificados.
En este método, se inyecta un polímero de alginato modificado en el lomo de un sujeto de prueba animal. En ejemplos preferidos, el sujeto de prueba animal es un ratón. Después de la inyección, se midió la actividad catepsina en el punto de inyección de los alginatos modificados usando un ensayo de fluorescenciain vivo.En ejemplos preferidos, el ensayo de fluorescencia se llevó a cabo 7 días después de la inyección usando obtención de imágenes de fluorescenciain vivo.En ejemplos preferidos, la intensidad de fluorescencia se midió y normalizó con respecto a la respuesta de fluorescencia medida usando alginato no modificado con el fin de cuantificar la biocompatibilidad de los alginatos modificados.
En ejemplos preferidos, el polímero de alginato modificado induce una menor respuesta a cuerpos extraños que el alginato no modificado (es decir, la respuesta de fluorescencia normalizada con respecto al alginato no modificado es menor del 100 %). En algunos ejemplos, el polímero de alginato modificado es biocompatible de manera que la respuesta de fluorescencia normalizada con respecto al alginato no modificado medida usando el ensayo de biocompatibilidadin vivodescrito en el presente documento es menor del 95 %, del 90 %, del 85 %, del 80 %, del 75 %, del 70 %, del 65 %, del 60 %, del 55 %, del 50 %, del 45 % o del 40 %. En ejemplos preferidos, el polímero de alginato modificado es biocompatible de manera que la respuesta de fluorescencia normalizada con respecto al alginato no modificado medida usando el ensayo de biocompatibilidadin vivodescrito en el presente documento es menor del 75 %, más preferiblemente menor del 65 % y lo más preferiblemente menor del 50 %.
V. Métodos de uso
Los alginatos se usan en una variedad de aplicaciones en las industrias alimentaria, farmacéutica, cosmética, agrícola, gráfica y textil. Los alginatos se emplean ampliamente en la industria alimentaria como agentes espesantes, gelificantes, estabilizantes, engrosantes, de suspensión y emulsionantes. Los alginatos pueden usarse como matriz para controlar la administración de agentes terapéuticos, profilácticos y/o diagnósticos. Los alginatos pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas como excipientes, donde actúan como viscosificantes, agentes de suspensión, emulsionantes, cargas y disgregantes. El alginato también puede usarse como material de impresión dental, como componente de apósitos para heridas y como agente de impresión. Un experto habitual en la técnica reconocerá que los alginatos modificados divulgados en el presente documento pueden usarse en cualquier aplicación para la que se empleen actualmente los alginatos.
Se contempla específicamente que los alginatos modificados descritos en el presente documento pueden usarse en aplicaciones donde se prefieren una biocompatibilidad y propiedades físicas mejoradas (tales como ser antifibróticos), en comparación con los alginatos disponibles comercialmente.
A. Encapsulación de células
El alginato puede reticularse iónicamente con cationes divalentes, en agua, a temperatura ambiente, para formar una matriz de hidrogel. Véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 4.352.883 concedida a Lim. En el procedimiento de Lim, una disolución acuosa que contiene los materiales biológicos que van a encapsularse se suspende en una disolución de un polímero soluble en agua, con la suspensión se forman gotitas que están configuradas en cápsulas discretas mediante el contacto con cationes multivalentes, luego la superficie de las microcápsulas se reticula con poliaminoácidos para formar una membrana semipermeable alrededor de los materiales encapsulados.
El polímero soluble en agua con grupos laterales cargados se reticula haciendo reaccionar el polímero con una disolución acuosa que contiene iones multivalentes de la carga opuesta, ya sean cationes multivalentes si el polímero tiene grupos laterales ácidos o aniones multivalentes si el polímero tiene grupos laterales básicos. Los cationes preferidos para la reticulación de los polímeros con grupos laterales ácidos para formar un hidrogel son cationes divalentes y trivalentes tales como cobre, calcio, aluminio, magnesio, estroncio, bario y estaño, aunque también pueden usarse cationes orgánicos difuncionales, trifuncionales o tetrafuncionales tales como sales de alquilamonio, por ejemplo, R<3>N+--VW--+NR<3>. Las disoluciones acuosas de las sales de estos cationes se añaden a los polímeros para formar hidrogeles y membranas blandos altamente hinchados. Cuanto mayor es la concentración de catión o mayor es la valencia, mayor es el grado de reticulación del polímero. Se ha demostrado que concentraciones tan bajas como de 0,005 M reticulan el polímero. Mayores concentraciones están limitadas por la solubilidad de la sal.
Los aniones preferidos para la reticulación de polímeros que contienen cadenas laterales básicas para formar un hidrogel son aniones divalentes y trivalentes tales como ácidos dicarboxílicos de bajo peso molecular, por ejemplo, ácido tereftálico, iones sulfato e iones carbonato. Las disoluciones acuosas de las sales de estos aniones se añaden a los polímeros para formar hidrogeles y membranas blandos altamente hinchados, tal como se describe con respecto a los cationes.
Pueden usarse una variedad de policationes para complejar y estabilizar de ese modo el hidrogel polimérico en una membrana de superficie semipermeable. Los ejemplos de materiales que pueden usarse incluyen polímeros que tienen grupos reactivos básicos tales como grupos amina o imina, que tienen un peso molecular preferido de entre 3.000 y 100.000, tales como polietilenimina y polilisina. Éstos están disponibles comercialmente. Un policatión es poli(L-lisina); ejemplos de poliaminas sintéticas son: polietilenimina, poli(vinilamina) y poli(alilamina). También hay policationes naturales tales como el polisacárido quitosano.
Los polianiones que pueden usarse para formar una membrana semipermeable mediante reacción con grupos superficiales básicos en el hidrogel polimérico incluyen polímeros y copolímeros de ácido acrílico, ácido metacrílico y otros derivados del ácido acrílico, polímeros con grupos SO<3>H colgantes tales como poliestireno sulfonado, y poliestireno con grupos ácido carboxílico.
En un método preferido, las células se encapsulan en un polímero de alginato modificado. En una realización preferida, las cápsulas de alginato modificado se fabrican a partir de una disolución de alginato modificado que contiene células suspendidas usando el dispositivo de encapsulación (tal como un dispositivo de encapsulación Inotech). En algunos ejemplos, los alginatos modificados se reticulan iónicamente con un catión polivalente tal como Ca2+, Ba2+, o Sr2+. En ejemplos particularmente preferidos, el alginato modificado se reticula usando BaCh. En algunos ejemplos, las cápsulas se purifican adicionalmente después de la formación. En ejemplos preferidos, las cápsulas se lavan con, por ejemplo, disolución de HEPES, disolución de Krebs y/o medio RPMm 640.
Las células pueden obtenerse directamente a partir de un donante, a partir de un cultivo celular de células de un donante o a partir de líneas de cultivo celular establecidas. En los ejemplos preferidos, las células se obtienen directamente a partir de un donante, se lavan y se implantan directamente en combinación con el material polimérico. Las células se cultivan usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica de histocultivo. En la realización preferida, las células son autólogas, es decir, derivan del individuo al que van a trasplantarse las células, pero pueden ser alogénicas o heterólogas.
La unión y la viabilidad celular pueden evaluarse usando microscopía electrónica de barrido, histología y evaluación cuantitativa con radioisótopos. La función de las células implantadas puede determinarse usando una combinación de las técnicas anteriores y ensayos funcionales. Por ejemplo, en el caso de hepatocitos, pueden realizarse estudios de función hepáticain vivocolocando una cánula en el conducto colédoco del receptor. Luego puede recogerse bilis en incrementos. Los pigmentos biliares pueden analizarse mediante cromatografía de líquidos de alta presión en busca de tetrapirroles no derivatizados o mediante cromatografía en capa fina tras convertirse en azodipirroles mediante reacción con etilantranilato de azodipirrol diazotizado, con o sin tratamiento con P-glucuronidasa. También puede determinarse la bilirrubina diconjugada y monoconjugada mediante cromatografía en capa fina tras la metanólisis alcalina de los pigmentos biliares conjugados. En general, a medida que aumenta el número de hepatocitos trasplantados en funcionamiento, aumentan los niveles de bilirrubina conjugada. También pueden realizarse pruebas de función hepática sencillas en muestras de sangre, tal como la producción de albúmina. Pueden llevarse a cabo estudios de función orgánica análogos usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica, según se requiera, para determinar el grado de función celular tras la implantación. Por ejemplo, pueden suministrarse células de los islotes del páncreas de manera similar a la usada específicamente para implantar hepatocitos, para lograr la regulación de glucosa mediante la secreción apropiada de insulina para curar la diabetes. También pueden implantarse otros tejidos endocrinos Pueden realizarse estudios que usan glucosa marcada, así como estudios que usan ensayos de proteínas, para cuantificar la masa celular en los armazones poliméricos. Luego, estos estudios de la masa celular pueden correlacionarse con estudios funcionales celulares para determinar cuál es la masa celular apropiada. En el caso de condrocitos, la función se define como proporcionar un soporte estructural apropiado para los tejidos unidos circundantes.
Esta técnica puede usarse para proporcionar múltiples tipos de células, incluyendo células genéticamente alteradas, dentro de un armazón tridimensional para la transferencia eficiente de un gran número de células y el fomento del injerto de trasplante con el propósito de crear un nuevo tejido o equivalente de tejido. También puede usarse para la inmunoprotección de trasplantes de células mientras está creciendo un nuevo tejido o equivalente de tejido excluyendo el sistema inmunitario del huésped.
Los ejemplos de células que pueden implantarse tal como se describe en el presente documento incluyen condrocitos y otras células que forman cartílago, osteoblastos y otras células que forman hueso, células musculares, fibroblastos y células orgánicas. Tal como se usa en el presente documento, “células orgánicas” incluye hepatocitos, células de los islotes, células de origen intestinal, células derivadas del riñón y otras células que actúan principalmente para sintetizar y secretar o para metabolizar materiales. Un tipo de célula preferido es una célula de los islotes pancreáticos.
La matriz polimérica puede combinarse con factores humorales para fomentar el trasplante y el injerto de células. Por ejemplo, la matriz polimérica puede combinarse con factores angiogénicos, antibióticos, antiinflamatorios, factores de crecimiento, compuestos que inducen la diferenciación y otros factores que son conocidos por los expertos en la técnica de cultivo celular.
Por ejemplo, pueden mezclarse factores humorales en una forma de liberación lenta con la suspensión de célulasalginato antes de la formación del implante para el trasplante. Alternativamente, puede modificarse el hidrogel para unir factores humorales o secuencias de reconocimiento de señales antes de la combinación con la suspensión de células aisladas.
Las técnicas descritas en el presente documento pueden usarse para la administración de muchos tipos de células diferentes para lograr diferentes estructuras de tejidos. En la realización preferida, las células se mezclan con la disolución de hidrogel y se inyectan directamente en un sitio donde se desea implantar las células, antes del endurecimiento del hidrogel. Sin embargo, la matriz también puede moldearse e implantarse en una o más zonas diferentes del cuerpo para adaptarse a una aplicación particular. Esta aplicación es particularmente relevante cuando se desea un diseño estructural específico o cuando la zona en la que deben implantarse las células carece de estructura o soporte específico para facilitar el crecimiento y la proliferación de las células.
El sitio, o los sitios, donde deben implantarse las células se determina basándose en la necesidad individual, al igual que el número requerido de células. Para las células que tienen una función orgánica, por ejemplo, hepatocitos o células de los islotes, la mezcla puede inyectarse en el mesenterio, el tejido subcutáneo, el retroperitoneo, el espacio properitoneal y el espacio intramuscular. Para la formación de cartílago, las células se inyectan en el sitio donde se desea la formación de cartílago. También podría aplicarse un molde externo para conformar la disolución inyectada. Adicionalmente, controlando la tasa de polimerización, es posible moldear el implante al cual se le han inyectado células-hidrogel como si se moldeara arcilla. Alternativamente, puede inyectarse la mezcla en un molde, dejar que se endurezca el hidrogel, luego implantarse el material.
B. Productos y superficies de recubrimiento
Los productos médicos pueden recubrirse con los polímeros de alginato modificados divulgados usando una variedad de técnicas, cuyos ejemplos incluyen pulverización, inmersión y recubrimiento con cepillo. Los recubrimientos poliméricos se aplican normalmente a la superficie que va a recubrirse mediante disolución un polímero en un disolvente apropiado, preferiblemente orgánico, y aplicación por pulverización, cepillado, inmersión, pintado u otra técnica similar. Los recubrimientos se depositan sobre la superficie y se asocian con las superficies a través de interacciones no covalentes. Se contemplan y divulgan específicamente los productos y las superficies recubiertos resultantes.
En algunos ejemplos, la superficie puede tratarse previamente con una disolución o suspensión apropiada para modificar las propiedades de la superficie, reforzando de ese modo las interacciones no covalentes entre la superficie modificada y el recubrimiento.
La disolución polimérica se aplica a una superficie a una temperatura apropiada y durante un periodo de tiempo suficiente para formar un recubrimiento sobre la superficie, en la que el recubrimiento es eficaz para formar una superficie antifibrótica. Las temperaturas típicas incluyen temperatura ambiente, aunque pueden usarse temperaturas más altas. Los periodos de tiempo típicos incluyen 5 minutos o menos, 30 minutos o menos, 60 minutos o menos y 120 minutos o menos. En algunos ejemplos, la disolución puede aplicarse durante 120 minutos o más para formar un recubrimiento con la actividad antifibrótica deseada. Sin embargo, preferiblemente se usan periodos de tiempo más cortos. La actividad antifibrótica puede medirse de cualquiera de las maneras divulgadas en el presente documento o conocidas en la técnica. Preferiblemente, la actividad antifibrótica puede ser la respuesta a cuerpos extraños determinada tal como se describe en el presente documento. Los polímeros de alginato modificados divulgados pueden asociarse de manera covalente o no covalente con los productos, los dispositivos y las superficies. Para aquellos ejemplos donde el polímero de alginato modificado se asocia de manera covalente con el producto, el dispositivo o la superficie, el polímero puede unirse al producto, al dispositivo o a la superficie, por ejemplo, funcionalizando el producto, el dispositivo o la superficie con un grupo funcional de reacción, tal como un grupo nucleófilo, y haciendo reaccionar el grupo nucleófilo con un grupo funcional de reacción del polímero, tal como un grupo electrófilo. Alternativamente, el polímero puede funcionalizarse con un grupo nucleófilo que se hace reaccionar con un grupo electrófilo del producto, del dispositivo o de la superficie. En ejemplos particulares, el polímero de alginato modificado se asocia de manera no covalente con el producto, el dispositivo o la superficie. El polímero puede aplicarse al producto, al dispositivo o a la superficie pulverizando, humectando, sumiendo, sumergiendo, pintando, uniendo, adhiriendo o proporcionando de otro modo un producto, un dispositivo o una superficie con un compuesto con el polímero de alginato modificado. En un ejemplo, el polímero se aplica mediante pulverización, pintado, sumersión o inmersión. Por ejemplo, una pintura polimérica puede prepararse disolviendo el polímero de alginato modificado en un disolvente adecuado (generalmente acuoso) y opcionalmente sometiendo a sonicación la disolución para garantizar la completa disolución del polímero. El producto, el dispositivo o la superficie que va a recubrirse puede sumergirse en la disolución polimérica durante un periodo de tiempo adecuado, por ejemplo, 5 segundos, seguido de secado, tal como secado al aire. El procedimiento puede repetirse tantas veces como sea necesario para lograr una cobertura adecuada. El grosor del recubrimiento es generalmente de desde aproximadamente 1 nm hasta aproximadamente 1 cm, preferiblemente de desde aproximadamente 10 nm hasta 1 mm, más preferiblemente de desde aproximadamente 100 nm hasta aproximadamente 100 micrómetros.
El recubrimiento puede aplicarse en el momento de fabricación del producto, del dispositivo o de la superficie o puede aplicarse después de la fabricación del producto, del dispositivo o de la superficie. En algunos ejemplos, el recubrimiento se aplica al producto, al dispositivo o a la superficie inmediatamente antes del uso del producto, del dispositivo o de la superficie. Esto se denomina recubrimiento intraoperatorio. “Inmediatamente antes”, tal como se usa en el presente documento, significa en el plazo de 1, 2, 5, 10, 15, 20, 30, 45, 60, 75, 90, 120, 150, 180 minutos o más de la implantación o del uso. En algunos ejemplos, el producto, el dispositivo o la superficie se recubre en el hospital, por ejemplo, en el quirófano, con 20, 15, 10 ó 5 minutos de implantación o uso. Recubrir inmediatamente antes del uso puede superar las limitaciones de los productos, los dispositivos y las superficies recubiertos en el momento de fabricación, tales como el daño del recubrimiento durante el almacenamiento y/o el transporte del producto, del dispositivo o de la superficie y/o la disminución de la eficacia del recubrimiento a lo largo del tiempo a medida que se expone el recubrimiento a las condiciones medioambientales, que pueden ser rigurosas (por ejemplo, altas temperaturas, humedad, exposición a luz UV, etc.).
Los productos médicos recubiertos pueden usarse para los usos y propósitos conocidos de las formas no recubiertas o recubiertas de manera diferente de los productos médicos.
1. Productos médicos
Los productos médicos útiles para el recubrimiento incluyen cualesquiera tipos de dispositivos médicos usados, al menos en parte, para su implantación en el cuerpo de un paciente. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, implantes, productos médicos implantables, dispositivos implantables, catéteres y otros tubos (incluyendo tubos urológicos y biliares, tubos endotraqueales, tubos de drenaje de heridas, catéteres de inyección con aguja, catéteres venosos centrales insertables de manera periférica, catéteres de diálisis, catéteres venosos centrales tunelados a largo plazo, catéteres venosos periféricos, catéteres venosos centrales a corto plazo, catéteres arteriales, catéteres pulmonares, catéteres de Swan-Ganz, catéteres urinarios, catéteres peritoneales), orificios de catéter vascular, filtros de coágulos sanguíneos, dispositivos urinarios (incluyendo dispositivos urinarios a largo plazo, dispositivos urinarios de unión a tejido, esfínteres urinarios artificiales, dilatadores urinarios), derivaciones (incluyendo derivaciones ventriculares o arteriovenosas, trasplantes de endoprótesis vascular, endoprótesis vasculares biliares, endoprótesis vasculares intestinales, endoprótesis vasculares bronquiales, endoprótesis vasculares esofágicas, endoprótesis vasculares ureterales, y derivaciones de hidrocefalia), globos, marcapasos, desfibriladores implantables, productos ortopédicos (incluyendo pasadores, placas, tornillos, e implantes), trasplantes (incluyendo órganos, trasplantes vasculares, vasos, aortas, válvulas cardiacas, y partes de sustitución de órganos), prótesis (incluyendo implantes mamarios, prótesis de pene, prótesis de injertos vasculares, válvulas cardiacas, articulaciones artificiales, laringes artificiales, implantes otológicos, corazones artificiales, vasos sanguíneos artificiales, y riñones artificiales), espirales de inserción en aneurismas y otros dispositivos de espiral, dispositivos de revascularización transmiocárdica, dispositivos de revascularización miocárdica percutánea, tubos, fibras, fibras huecas, membranas, recipientes para sangre, placas de titulación, medios adsorbentes, dializadores, piezas de conexión, sensores, válvulas, endoscopios, filtros, cámaras de bomba, bisturíes, agujas, tijeras (y otros dispositivos usados en procedimientos quirúrgicos, terapéuticos, o diagnósticos invasivos), y otros productos médicos y dispositivos destinados a tener propiedades antifibróticas. La expresión “productos médicos” es amplia y se refiere en particular a productos que entran en contacto con la sangre de manera breve (por ejemplo, endoscopios) o permanente (por ejemplo, endoprótesis vasculares).
Productos médicos útiles son catéteres de globo y prótesis endovasculares, en particular endoprótesis vasculares. Las endoprótesis vasculares de un diseño convencional tienen una estructura de soporte de filigrana compuesta por pilares metálicos. La estructura de soporte se proporciona inicialmente en un estado no expandido para su inserción en el cuerpo, y luego se ensancha hasta un estado expandido en el sitio de aplicación. La endoprótesis vascular puede recubrirse antes o después de que se rice sobre un globo. Se conocen una amplia variedad de endoprótesis médicas o productos médicos o implantes para aplicaciones muy diversas. Se usan, por ejemplo, para soportar vasos, órganos huecos, y sistemas ductales (implantes endovasculares), para unir y fijar de manera temporal implantes tisulares y trasplantes tisulares, y con propósitos ortopédicos tales como pasadores, placas, o tornillos.
Los polímeros de alginato modificados pueden aplicarse a, absorberse en, o acoplarse con, una variedad de sustratos y superficies diferentes. Los ejemplos de materiales adecuados incluyen metales, materiales metálicos, cerámicas, polímeros, fibras, materiales inertes tales como silicio, y combinaciones de los mismos.
Los materiales poliméricos adecuados incluyen, pero no se limitan a, estireno y estirenos sustituidos, etileno, propileno, poli(uretanos), acrilatos y metacrilatos, acrilamidas y metacrilamidas, poliésteres, polisiloxanos, poliéteres, poli(ortoéster), poli(carbonatos), poli(hidroxialcanoatos), copolímeros de los mismos, y combinaciones de los mismos.
Los sustratos pueden estar en forma de, o formar parte de, películas, partículas (nanopartículas, micropartículas, o perlas de diámetro milimétrico), fibras (apósitos para heridas, vendas, gasa, esparadrapo, almohadillas, esponjas, incluyendo esponjas tejidas y no tejidas y aquellas diseñadas específicamente para cirugías dentales u oftálmicas), sensores, electrodos de marcapasos, catéteres, endoprótesis vasculares, lentes de contacto, implantes óseos (artroplastias de cadera, pasadores, remaches, placas, cemento ósea, etc.), o dispositivos de regeneración tisular o cultivo celular, u otros dispositivos médicos usados dentro de, o en contacto con, el cuerpo.
En el presente documento se describen implantes recubiertos con recubrimientos de polímero de alginato modificado. Los “implantes” son cualquier objeto destinado a su colocación en el cuerpo de un mamífero, tal como un humano, que no es un tejido vivo. Los implantes son una forma de producto médico. Los implantes incluyen objetos derivados de manera natural que se han procesado de modo que sus tejidos vivos se han desvitalizado. Como un ejemplo, los injertos óseos pueden procesarse de modo que se retiren sus células vivas, pero de modo que se conserve su forma para servir como molde para el crecimiento infiltrante de hueso de un huésped. Como otro ejemplo, el coral que se produce de manera natural puede procesarse para producir preparaciones de hidroxiapatita que pueden aplicarse al cuerpo para determinadas terapias ortopédicas y dentales. Un implante también puede ser un artículo que comprende componentes artificiales. El término “implante” puede aplicarse a todo el espectro de dispositivos médicos destinados a su colocación en un cuerpo humano o el de un mamífero, incluyendo aplicaciones ortopédicas, aplicaciones dentales, aplicaciones al oído, a la nariz y a la garganta (“ENT”), y aplicaciones cardiovasculares.
En algunos ejemplos, “implante”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una composición macroscópica que incluye un dispositivo para su implantación o una superficie de un dispositivo para su implantación y un recubrimiento de polímero de alginato modificado. En estos ejemplos, el término “implante” no abarca nanopartículas y/o micropartículas. “Macroscópico”, tal como se usa en el presente documento, se refiere generalmente a dispositivos, implantes, o composiciones que pueden observarse a simple vista.
Los ejemplos de dispositivos médicos implantables y dispositivos médicos y estructuras mecánicas que pueden usar un recubrimiento biocompatible incluyen, pero no se limitan a, endoprótesis vasculares, conductos, armazones, anillos de válvula cardiaca, válvulas cardiovasculares, marcapasos, dispositivos de artroplastia de cadera, dispositivos de sensor implantados, endoprótesis vasculares esofágicas, implantes de corazón, revestimientos biocompatibles para válvulas cardiacas, equipos de diálisis y tubos de oxigenador para sistemas de circulación extracorporal.
En general, una endoprótesis vascular es un dispositivo, de forma normalmente tubular, que se inserta en una luz del cuerpo, tal como un conducto o vaso sanguíneo, para prevenir o contrarrestar una constricción de flujo localizada. El propósito de una endoprótesis vascular, en algunos casos, es mantener mecánicamente abierto un conducto de líquido corporal. A menudo, las endoprótesis vasculares se usan para aliviar un flujo sanguíneo disminuido a los órganos y a las extremidades con el fin de mantener un suministro adecuado de sangre oxigenada. El uso más habitual de las endoprótesis vasculares es en arterias coronarias, pero también se usan ampliamente en otros conductos corporales, tales como, por ejemplo, arterias y venas centrales y periféricas, vías biliares, esófago, colon, tráquea, bronquios grandes, uréteres, y uretra. Con frecuencia, las endoprótesis vasculares insertadas en una luz son capaces de expandirse tras su inserción o pueden autoexpandirse. Por ejemplo, las endoprótesis vasculares metálicas se despliegan en una arteria ocluida usando un catéter de globo y se expanden para restablecer el flujo sanguíneo. Por ejemplo, hay endoprótesis vasculares de malla de alambre de acero inoxidable disponibles comercialmente de Boston Scientific, Natick, Mass.
En algunos ejemplos, el implante es un implante ortopédico. Un “implante ortopédico” se define como un implante que reemplaza hueso o proporciona fijación al hueso, reemplaza superficies articuladas de una articulación, proporciona pilar para una prótesis, o combinaciones de los mismos, o ayuda en el reemplazo de hueso o la provisión de fijación al hueso, el reemplazo de superficies articuladas de una articulación, la provisión de pilar para una prótesis, y combinaciones de los mismos.
Los implantes ortopédicos pueden usarse para reemplazar hueso o proporcionar fijación al hueso, reemplazar superficies articuladas de una articulación, proporcionar pilar para una prótesis, o combinaciones de los mismos, o ayudar en el reemplazo de hueso o la provisión de fijación al hueso, el reemplazo de superficies articuladas de una articulación, la provisión de pilar para una prótesis, incluyendo aplicaciones dentales, y combinaciones de los mismos.
Los implantes ortopédicos adecuados incluyen, pero no se limitan a, alambre, alambre de Kirschner, placas óseas, tornillos, pasadores, tacos, varillas, clavos, tuercas, pernos, arandelas, púas, botones, alambres, placas de fractura, dispositivos de reconstrucción y estabilización, endoprótesis y exoprótesis (articuladas y no articuladas), prótesis transcutáneas intraóseas, espaciadores, malla, pilares de implante, anclajes, lengüetas, abrazaderas, sutura, dispositivos de fusión intercorporal, tubos de cualquier geometría, armazones, y combinaciones de los mismos. En otros ejemplos, el implante es un implante de oído, nariz y/o garganta (“ENT”). Los implantes de ENT a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, tubos para el oído, tubos endotraqueales, tubos de ventilación, implantes cocleares y dispositivos auditivos de anclaje al hueso.
En otros ejemplos, el implante es un implante cardiovascular. Implantes cardiovasculares a modo de ejemplo son válvulas cardiacas o soportes aloplásticos de paredes de vasos, implantes de corazón artificial total, dispositivos de asistencia ventricular, injertos vasculares, endoprótesis vasculares, dispositivos portadores de señales eléctricas tales como marcapasos y electrodos neurológicos, y/o electrodos de desfibrilador.
Los implantes pueden prepararse a partir de una variedad de materiales. En algunos ejemplos, el material es biocompatible. En algunos ejemplos, el material es biocompatible y no biodegradable. Los materiales a modo de ejemplo incluyen materiales metálicos, óxidos metálicos, materiales poliméricos, incluyendo materiales poliméricos degradables y no degradables, cerámicas, porcelanas, vidrio, hueso o matriz ósea alogénico o xenogénico; hueso obtenido por ingeniería genética; y combinaciones de los mismos.
Los materiales metálicos adecuados incluyen metales y aleaciones basadas en titanio (tales como nitinol, aleaciones de níquel-titanio, materiales de aleación con memoria térmica), acero inoxidable, tántalo, paladio, circonio, niobio, molibdeno, níquel-cromo, o determinadas aleaciones de cobalto incluyendo aleaciones de cobalto-cromo y cobaltocromo-níquel tales como ELGILOY® y PHYNOX®. Los ejemplos útiles incluyen acero inoxidable de calidad 316 (SS 316L) (compuesto por Fe, <0,3 % de C, 16-18,5 % de Cr, 10-14 % de Ni, 2-3 % de Mo, <2 % de Mn, <1 % de Si, <0,45 % de P, y <0,03 % de S), tántalo, aleaciones de cromo-molibdeno, aleaciones de níquel-titanio (tales como nitinol) y aleaciones de cobalto-cromo (tales como MP35N, designación de material según la ASTM: 35Co-35Ni-20Cr-10Mo). Los metales típicos actualmente usados para las endoprótesis vasculares incluyen acero SS 316L y MP35N. Véase también “Comparing and Optimizing Co-Cr Tubing for Stent Applications,” Poncin, P, Millet, C., Chevy, J, y Profit, J. L., Materials & Processes for Medical Devices Conference, agosto de 2004, ASM International. Los materiales cerámicos adecuados incluyen óxidos, carburos, o nitruros de los elementos de transición tales como óxidos de titanio, óxidos de hafnio, óxidos de iridio, óxidos de cromo, óxidos de aluminio, y óxidos de circonio. También pueden usarse materiales basados en silicio, tales como sílice.
Los materiales poliméricos adecuados incluyen poliestireno y poliestirenos sustituidos, polietileno, polipropileno, poliacetileno, poliestireno, TEFLON®, poli(cloruro de vinilo) (PVC), copolímeros de poliolefina, poli(uretanos), poliacrilatos y polimetacrilatos, poliacrilamidas y polimetacrilamidas, poliésteres, polisiloxanos, poliéteres, poli(ortoéster), poli(carbonatos), poli(hidroxialcanoatos) polifluorocarbonos, PEEK®, Teflon® (politetrafluoroetileno, PTFE), siliconas, resinas epoxídicas, Kevlar®, Dacron® (un polímero de condensación obtenido a partir de etilenglicol y ácido tereftálico), nailon, polialquenos, resinas fenólicas, elastómeros naturales y sintéticos, adhesivos y sellantes, poliolefinas, polisulfonas, poliacrilonitrilo, biopolímeros tales como polisacáridos y látex natural, colágeno, polímeros celulósicos (por ejemplo, alquilcelulosas, etc.), polisacáridos, poli(ácido glicólico), poli(ácido L-láctico) (PLLA), una polidioxanona (PDA), o poli(ácido láctico) racémico, policarbonatos (por ejemplo, poliamidas (nailon)); plásticos fluorados, fibra de carbono, y mezclas o copolímeros de los mismos.
El polímero puede estar asociado de manera covalente o no covalente con la superficie; sin embargo, en realizaciones particulares, el polímero está asociado de manera no covalente con la superficie. El polímero puede aplicarse mediante una variedad de técnicas en la técnica incluyendo pulverización, humectación, sumersión, inmersión, tal como recubrimiento por inmersión (por ejemplo, recubrimiento por inmersión intraoperatorio), pintado, o aplicación de otro modo de un polímero policatiónico hidrófobo a una superficie del implante.
Una superficie de un producto adaptado para su uso en un entorno médico puede ser capaz de esterilización usando autoclave, exposición a biocidas, irradiación, o técnicas de gasificación, como exposición a óxido de etileno. Las superficies encontradas en entornos médicos incluyen los aspectos interno y externo de diversos instrumentos y dispositivos, ya sean desechables o destinados a usos repetidos.
2. Hidrogeles
Los productos médicos también pueden estar realizados o hacer uso de hidrogeles. Los polímeros de alginato modificados divulgados pueden formar hidrogeles para estos y otros propósitos. Los productos realizados de otros hidrogeles también pueden recubrirse con los polímeros de alginato modificados divulgados. Por tanto, los polímeros de alginato modificados divulgados pueden usarse como recubrimiento sobre un producto o una superficie o pueden usarse como el propio producto. Los hidrogeles son redes poliméricas hidrófilas y tridimensionales capaces de incorporar grandes cantidades de agua o líquidos biológicos (Peppaset al.Eur. J. Pharm. Biopharm. 2000, 50, 27-46). Estas redes están compuestas por homopolímeros o copolímeros y son insolubles debido a la presencia de reticulaciones químicas o reticulaciones físicas, tales como enmarañamientos o cristalitos. Los hidrogeles pueden clasificarse como neutros o iónicos, basándose en la naturaleza de los grupos laterales. Además, pueden ser amorfos, semicristalinos, estructuras con enlaces de hidrógeno, estructuras supermoleculares y agregados hidrocoloidales (Peppas, N.A. Hydrogels. En: Biomaterials science: an introduction to materials in medicine; Ratner, B.D., Hoffman, A.S., Schoen, F.J., Lemons, J.E., Eds; Academic Press, 1996, págs. 60-64; Peppaset al.,Eur. J. Pharm. Biopharm. 2000, 50, 27-46). Los hidrogeles pueden prepararse a partir de monómeros o polímeros sintéticos o naturales. Los hidrogeles preferidos en el presente documento son los polímeros de alginato modificados divulgados.
Los hidrogeles pueden prepararse a partir de polímeros sintéticos tales como poli(ácido acrílico) y sus derivados [por ejemplo, poli(metacrilato de hidroxietilo) (pHEMA)], poli(N-isopropilacrilamida), poli(etilenglicol) (PEG) y sus copolímeros y poli(alcohol vinílico) (PVA), entre otros (Bell y Peppas, Adv. Polym. Sci. 122:125-175 (1995); Peppaset al.,Eur. J. Pharm. Biopharm. 50:27-46 (200); Lee y Mooney, Chem. Rev. 101:1869-1879 (2001)). En general, los hidrogeles preparados a partir de polímeros sintéticos no son degradables en condiciones fisiológicas. Los hidrogeles también pueden prepararse a partir de polímeros naturales incluyendo polisacáridos, proteínas y péptidos. Los polímeros de alginato modificados divulgados son un ejemplo preferido. En general, estas redes se degradan en condiciones fisiológicas por medios químicos o enzimáticos.
En algunos ejemplos, el hidrogel no es degradable en condicionesin vitroein vivorelevantes. Son necesarios recubrimientos de hidrogel estables para determinadas aplicaciones incluyendo recubrimientos de catéteres venosos centrales, válvulas cardiacas, marcapasos y recubrimientos de endoprótesis vasculares. En otros casos, la degradación del hidrogel puede ser un enfoque preferente tal como en constructos de ingeniería de tejidos.
En algunos ejemplos, el hidrogel puede estar formado por dextrano. El dextrano es un polisacárido bacteriano, que consiste esencialmente en residuos de D-glucopiranosa con uniones a-1,6 con un bajo porcentaje de cadenas laterales con uniones a-1,2, a-1,3 o a-1,4. El dextrano se usa ampliamente para aplicaciones biomédicas debido a su biocompatibilidad, baja toxicidad, coste relativamente bajo y modificación simple. Este polisacárido se ha usado clínicamente durante más de cinco décadas como expansor del volumen plasmático, promotor del flujo periférico y agente antitrombolítico (Mehvar, R. J. Control. Release 2000, 69, 1-25). Además, se ha usado como portador macromolecular para la administración de fármacos y proteínas, principalmente para aumentar la longevidad de los agentes terapéuticos en la circulación. El dextrano puede modificarse con grupos vinilo usando medios químicos o enzimáticos para preparar geles (Ferreiraet al.Biomaterials 2002, 23, 3957-3967).
Los hidrogeles a base de dextrano impiden la adhesión de células endoteliales vasculares, células de músculo liso y fibroblastos (Massia, S.P.; Stark, J. J. Biomed. Mater. Res. 2001, 56, 390-399. Ferreiraet al.2004, J. Biomed. Mater. Res. 68A, 584-596) y las superficies del dextrano impiden la adsorción de proteínas (Osterberget al.J. Biomed. Mat. Res. 1995, 29, 741-747).
Tal como se describe en el presente documento, los polímeros de alginato modificados divulgados pueden usarse para encapsular células. En algunos ejemplos, las células encapsuladas pueden fabricarse en un macrodispositivo. Por ejemplo, en algunos ejemplos, puede recubrirse una superficie, tal como una superficie plana, con las células encapsuladas en hidrogel de alginato modificado. En algunos ejemplos, las cápsulas que contienen células pueden adherirse al tejido de un sujeto usando un adhesivo biocompatible. En otros ejemplos, puede recubrirse un dispositivo médico adecuado para la implantación con las cápsulas que contienen células.
C. Tratamiento de enfermedades o trastornos
Las células encapsuladas pueden trasplantarse a un paciente que lo necesita para tratar una enfermedad o un trastorno. En algunos ejemplos, las células encapsuladas se obtienen a partir de un miembro genéticamente no idéntico de la misma especie. En ejemplos alternativos, las células encapsuladas se obtienen a partir de una especie diferente a la del paciente. En ejemplos preferidos, las células secretoras de hormonas o proteínas se encapsulan y trasplantan a un paciente para tratar una enfermedad o un trastorno.
En ejemplos preferidos, la enfermedad o el trastorno está provocado por o implica la disfunción de células secretoras de hormonas o proteínas en un paciente. En una realización preferida, la enfermedad o el trastorno es diabetes. Los productos médicos, los dispositivos y las superficies recubiertos con un polímero de alginato modificado pueden trasplantarse a o implantarse en un paciente que lo necesita para tratar una enfermedad o un trastorno.
Las cápsulas, los productos, los dispositivos y las superficies divulgados pueden permanecer sustancialmente libres de efectos fibróticos o pueden continuar mostrando una respuesta a cuerpos extraños reducida durante 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 9 semanas, 10 semanas, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8, meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 1 año, 2 años o más después de la administración o implantación.
Las cápsulas, los productos, los dispositivos y las superficies divulgados pueden administrarse o implantarse solos o en combinación con cualquier fármaco adecuado u otra terapia. Tales fármacos y terapias también pueden administrarse por separado (es decir, usarse en paralelo) durante el tiempo que las cápsulas, los productos, los dispositivos y las superficies están presentes en un paciente. Aunque las cápsulas, los productos, los dispositivos y las superficies divulgados reducen la fibrosis y la reacción inmunitaria a las cápsulas, los productos, los dispositivos y las superficies, no se excluye el uso de fármacos antiinflamatorios y supresores del sistema inmunitario junto con o en paralelo a las cápsulas, los productos, los dispositivos y las superficies. En realizaciones preferidas, sin embargo, las cápsulas, los productos, los dispositivos y las superficies divulgados se usan sin el uso de fármacos antiinflamatorios y supresores del sistema inmunitario. En realizaciones preferidas, la fibrosis permanece reducida después de que el uso, la concentración, el efecto o una combinación de los mismos de cualquier fármaco antiinflamatorio o supresor del sistema inmunitario que se usa se encuentre por debajo de un nivel eficaz. Por ejemplo, la fibrosis puede permanecer reducida durante 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 9 semanas, 10 semanas, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8, meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 1 año, 2 años o más después de que el uso, la concentración, el efecto o una combinación de los mismos de cualquier fármaco antiinflamatorio o supresor del sistema inmunitario que se usa se encuentre por debajo de un nivel eficaz.
La presente invención se entenderá adicionalmente por referencia a los siguientes ejemplos. Determinados ejemplos son bastante ilustrativos, tales como los ejemplos que se refieren a células encapsuladas y a sus aplicaciones, para demostrar la actividad antifibrótica de los alginatos modificados.
Ejemplos
Ejemplo 1: Síntesis combinatoria de alginatos químicamente modificados
Los parámetros determinados que rigen la biocompatibilidad del material se entienden escasamente. Por consiguiente, el diseño racional y la síntesis de alginatos modificados que presentan una biocompatibilidad mejorada son un desafío. En un esfuerzo por identificar alginatos modificados con una biocompatibilidad y propiedades físicas mejoradas, se usó un enfoque combinatorio para preparar una biblioteca de alginatos modificados que presentan una gama de modificaciones covalentes.
1. Estrategia combinatoria general
Como reactivos para la síntesis combinatoria de alginatos modificados se seleccionaron un conjunto de doce alcoholes, nueve aminas, dos aminas usadas para introducir un resto azida (una amina que contiene un resto azida y una amina que contiene un resto yoduro que va a convertirse en un resto azida después de la amidación) y diecinueve alquinos con una gama de estructuras químicas, hidrofobias/hidrofilias, potenciales de enlace de hidrógeno y estados de carga diferentes. Con el conocimiento de que se ha demostrado que las impurezas presentes en los polímeros de alginato limitan la biocompatibilidad de los alginatos implantados, se seleccionó un alginato ultrapuro de baja viscosidad (UPLVG, FMC Biopolymers) como material de partida para los experimentos de modificación.
Alquinos usados como reactivos para la cicloadición 1,3-dipolar
Alcoholes usados como reactivos para la esterificación
Aminas usadas como reactivos para la amidación
Aminas usadas como reactivos para introducir restos azida
El polímero de alginato no modificado se modificó covalentemente mediante reacción con uno, dos o tres los ésteres, las aminas y/o los alquinos mostrados anteriormente de manera combinatoria. La figura 1 muestra la estructura general de los alginatos modificados obtenidos usando este método.
2. Condiciones de reacción representativas
Debido a la naturaleza paralela y combinatoria del procedimiento de modificación, las reacciones de síntesis se realizaron usando un módulo central robótico. Se selección el alginato UPLVG como material de partida para los experimentos de modificación. En la primera reacción combinatoria, el alginato no modificado se hizo reaccionar con uno de los alcoholes, las aminas y las aminas usadas para introducir un resto azida en presencia de 2-cloro-4,6-dimetoxi-1,3,5-triazina (CDMT) y N-metilmorfolina (N<m>M). En una segunda etapa combinatoria, cada uno de los polímeros de alginato modificados formados anteriormente se hizo reaccionar con otro de los alcoholes, las aminas o las aminas usadas para introducir un resto azida en presencia de 2-cloro-4,6-dimetoxi-1,3,5-triazina (CDMT) y N-metilmorfolina (N<m>M). En una etapa combinatoria final, todos los miembros de la biblioteca que se hicieron reaccionar con una amina usada para introducir un resto azida se funcionalizaron adicionalmente usando una reacción de cicloadición 1,3-dipolar. Esos miembros de la biblioteca que se habían hecho reaccionar con 4-yodobencilamina se hicieron reaccionar en primer lugar con azida de sodio para convertir los restos yoduro en restos azida. Posteriormente, todos los miembros de la biblioteca que se hicieron reaccionar con una amina usada para introducir un resto azida se hicieron reaccionar con uno de los alquinos usados como reactivos para la cicloadición 1,3-dipolar en presencia de CuSO<4>/ascorbato de sodio.
Para optimizar la biocompatibilidad de los alginatos químicamente modificados, se desarrolló una metodología de purificación rigurosa para eliminar las impurezas potencialmente irritantes. Después de cada modificación covalente, los alginatos modificados se filtraron a través de columnas de sílice modificada con ciano con el objetivo de capturar las impurezas orgánicas a granel. Finalmente, después de completarse todas las etapas de modificación covalente, los alginatos modificados se sometieron a diálisis frente a una membrana con un MWCO de 10.000 para retirar cualquier impureza de bajo peso molecular o molécula pequeña restante.
La pureza de los alginatos modificados se determinó mediante análisis por<1>H-RMN. Se recogieron los espectros de<1>H-RMN de cada polímero de alginato modificado y se integraron los picos correspondientes al polímero de alginato modificado y a cualquier impureza para determinar la cantidad relativa de cada especie en la muestra.
Ejemplo 2: Cribado de alto rendimiento de alginatos modificados usando un ensayo de formación de hidrogel
La modificación covalente de los alginatos afecta a las propiedades físicas del alginato, incluyendo la capacidad del alginato de formar hidrogeles adecuados para la encapsulación de células y biomoléculas. Para eliminar los alginatos modificados que han perdido su capacidad de formar hidrogeles y centrar adicionalmente los presentes esfuerzos de cribado en los candidatos más fuertes, se usó un ensayo de reticulación basado en fluorescencia para cuantificar la capacidad de los alginatos modificados de formar hidrogeles.
El ensayo de formación de hidrogel descrito en el presente documento aprovecha la capacidad de los hidrogeles de atrapar compuestos fluorescentes y retener de manera diferente los fluoróforos tras el lavado basándose en la estabilidad del hidrogel. Se disolvió en agua cada uno de los alginatos modificados preparados usando el enfoque combinatorio descrito en el ejemplo 1. Se añadió a cada muestra un colorante de rodamina que tiene fluorescencia a 580 nm. Luego se reticuló la muestra de alginato modificado mediante la adición de una sal de bario o calcio, por ejemplo, BaCh, para inducir la formación de un hidrogel. Después de la incubación durante 10 minutos, se lavó repetidamente cada muestra con agua. Se midió la intensidad de fluorescencia de cada muestra usando un fluorímetro.
Se cribó cada alginato modificado tres veces y se promediaron los resultados obtenidos en los tres ensayos. Los valores de intensidad de fluorescencia promedio para cada alginato modificado se compararon con los niveles de fluorescencia del control negativo (agua) y del alginato no modificado (UPLVG). Los alginatos modificados que produjeron valores de fluorescencia inferiores al control negativo se consideraron inutilizables para aplicaciones donde la formación de hidrogel es crítica (es decir, la encapsulación de células).
Ejemplo 3: Cribadoin vitrode alginatos modificados para determinar la biocompatibilidad
Se evaluó la citotoxicidad de los polímeros de alginato modificados en células HeLa para analizar la biocompatibilidadin vitro.Se cargaron los alginatos modificados identificados en el ejemplo 2 como capaces de formar hidrogeles en los pocillos de placas de 96 pocillos que se recubrieron con poli-L-lisina. También se cargaron como controles alginato no modificado y solución salina en los pocillos de placas de 96 pocillos que se recubrieron con poli-L-lisina. Se dispensó una disolución de reticulación de BaCh 100 mM en todos los pocillos de la placa de 96 pocillos. Luego se aspiró el exceso de agente de reticulación. Se sembraron células HeLa en los pocillos y se incubaron durante 3 días a 37 °C en una cámara humidificada.
Se realizó un ensayo de viabilidad celular usando bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT), en el que se aspiró el medio de todos los pocillos y se añadieron 100 |il de medio DMEM sin rojo de fenol y 10 |il de MTT (5 mg/ml) a todos los pocillos de la placa de 96 pocillos. Se incubó la placa durante 4 horas a 37 °C en una cámara humidificada. Después de la incubación, se aspiraron 85 |il de disolución y se añadieron 100 |il de DMSO. Se forman cristales de formazano de color púrpura durante el ensayo en proporción al número de células HeLa viables presentes en cada pocillo. Se pipeteó el contenido de cada pocillo hacia arriba y hacia abajo para solubilizar los cristales de formazano antes de la medición. Se incubó la placa a 37 °C durante 10 minutos, tras lo cual se eliminaron las burbujas procedentes de la agitación. Se leyó la placa usando un lector de placas de UV/Vis a 540 nm con una referencia a 700 nm. La viabilidad se normalizó con respecto a las células sembradas en pocillos sin alginato.
Los resultados de la viabilidad celular se muestran en la figura 3, que representa gráficamente el efecto de alginatos modificados seleccionados sobre la viabilidad de la línea celular HeLa en comparación con el control positivo (sin alginato). El alginato (Alg) tiene una viabilidad del 53 %. El ensayo identificó polímeros de alginato modificados que mostraban una citotoxicidad disminuida con respecto al alginato no modificado. Éstos se seleccionaron para su posterior análisis.
Ejemplo 4: Cribadoin vivode alto rendimiento de alginatos modificados para evaluar la biocompatibilidad
Los métodos de análisis de biocompatibilidad actuales son lentos y requieren un análisis histológico. Con el fin de cribar el gran número de alginatos modificados preparados usando los métodos de síntesis combinatoria descritos en el presente documento, se usó un ensayo de biocompatibilidadin vivode alto rendimiento útil para evaluar la biocompatibilidad relativa de polímeros de alginato.
1. Protocolo de cribado in vivo de alto rendimiento
Se obtuvieron ratones SKH1 macho de 8-12 semanas de edad de Charles River Laboratories (Wilmington, MA). Los ratones se mantuvieron en las instalaciones para animales del Instituto de Tecnología de Massachusetts, acreditado por la Asociación Americana para el Cuidado de Animales de Laboratorio, y se alojaron en condiciones convencionales con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Se proporcionaron tanto agua como pienso a voluntad.Las inyecciones se realizaron según la norma ISO 10993-6: 2001. Antes de la inyección, todos los materiales se esterilizaron a través de filtración de 0,22 |im. Los ratones se anestesiaron a través de inhalación de isoflurano a una concentración del 1-4 % de isoflurano/resto de O<2>para minimizar el movimiento. Se lavaron sus lomos con alcohol isopropílico al 70 % y se inyectaron a los animales los alginatos modificados en un formato de matriz en el lomo de los animales para el cribado de alto rendimiento. Se realizaron seis inyecciones en cada ratón, siendo una de las inyecciones un control de alginato no modificado. Los volúmenes de inyección fueron de 100 |il.
Los días 1, 3, 7, 14, 21 y 28 después de la inyección, se obtuvieron imágenes cinéticamente de la actividad de células huésped en respuesta a la implantación de alginatos modificados usando obtención de imágenes de fluorescencia del animal completo. 24 horas antes de la obtención de imágenes de fluorescenciain vivo, se disolvieron 2 nmol de ProSense-680 (VisEn Medical, Woburn, MA, longitud de onda de excitación: 680 ± 10 nm, emisión: 700 ± 10 nm) en 150 |il de PBS estéril y se inyectaron en la vena de la cola de cada ratón para obtener imágenes de la actividad catepsina.
Se realizó obtención de imágenes de fluorescenciain vivocon un sistema de medición IVIS-Spectrum (Xenogen, Hopkinton, MA). Los animales se mantuvieron bajo anestesia inhalada usando isoflurano al 1-4% en oxígeno al 100 % a una velocidad de flujo de 2,5 l/min. Se usaron una agrupación de<8>*<8>y un campo de visión de 13,1 cm para la obtención de imágenes. Se optimizaron el tiempo de exposición y f/stop, que es el tamaño relativo del orificio de la abertura, para cada imagen adquirida. Se adquirieron datos y se analizaron usando el software Living Image 3.1 propiedad del fabricante. Todas las imágenes se presentan en cuanto a eficiencia de fluorescencia, que se define como la razón de la intensidad de fluorescencia recogida con respecto a un patrón interno de intensidad incidente en la configuración de obtención de imágenes seleccionada. Las regiones de interés (ROI) se designaron alrededor del sitio de cada inyección.
Se examinó la biocompatibilidad de los materiales 14 días después de la inyección. La intensidad de fluorescencia medida en el sitio de implantación de alginatos modificados se comparó con la intensidad de fluorescencia medida en el sitio de implantación de alginatos no modificados. Los alginatos modificados que muestran una intensidad de fluorescencia más pequeña en el sitio implantación que la intensidad de fluorescencia medida en el sitio de implantación de alginatos no modificados se caracterizaron como biocompatibles. Los alginatos modificados que muestran una intensidad de fluorescencia más alta en el sitio de implantación que la intensidad de fluorescencia medida en el sitio de implantación de alginatos no modificados se caracterizaron como no biocompatibles.
Se evaluó la estabilidadin vivode los geles de alginato 28 días después de la inyección. Los alginatos modificados que permanecieron en el sitio de inyección después de 28 días se caracterizaron como capaces de formar hidrogeles mecánicamente establesin vivo.Los alginatos modificados que no estaban presentes en el sitio de inyección después de 28 días se consideraron incapaces de formar hidrogeles mecánicamente establesin vivoy se clasificaron como “fracasos”.
Los alginatos modificados caracterizados tanto como biocompatibles como capaces de formar hidrogeles mecánicamente establesin vivose identificaron como “aciertos” y se seleccionaron para su estudio posterior.
2. Validación del protocolo de cribado in vivo de alto rendimiento
Con el fin de validar el ensayo de cribadoin vivode alto rendimiento descrito anteriormente, se inyectaron por vía subcutánea los alginatos modificados a ratones en un formato de matriz y se reticularonin situtal como se describió anteriormente. Se obtuvieron imágenes de los ratones los días 1, 3, 7, 14, 21 y 28 después de la inyección usando obtención de imágenes de fluorescencia del animal completo y se recogieron muestras de tejido después de la obtención de imágenes para el análisis histológico. Para obtener muestras de tejido para el análisis histológico, se sacrificaron los ratones a través de asfixia con CO<2>y se extirparon el biomaterial inyectado y el tejido circundante. Luego se fijaron los tejidos en formalina al 10 %, se incrustaron en parafina, se cortaron en cortes de 5 |im y se tiñeron usando hematoxilina y eosina (H&E) para el análisis histológico por parte de un patólogo certificado.
Se clasificó la fibrosis en una escala donde un cero no implicaba fibrosis, un uno indicaba una cobertura parcial con una o dos capas de fibrosis, un dos indicaba una capa fibrótica más gruesa que prácticamente cubría el implante y un tres indicaba una cobertura fibrótica concéntrica del polímero. Se clasificaron tanto las células polimorfonucleares (PMN) como los macrófagos en una escala donde ninguna célula observada se indicó con un cero, células dispersas tenían una puntuación de uno, numerosas agrupaciones de células en los lados del polímero tenían una puntuación de dos y numerosas células alrededor del material dieron como resultado un tres. Se examinaron tanto la puntuación histológica como la respuesta de fluorescencia normalizada con respecto al alginato para toda la biblioteca y se consideró que los materiales que superaban al alginato no modificado eran biocompatibles. Esto corresponde a una señal de fluorescencia normalizada de <100 % y una puntuación de fibrosis de <3.
Se demostró que los datos capturados usando obtención de imágenes del animal completo mostraban tendencias temporales similares en el reclutamiento celular de fagocitos a los biomateriales en comparación con el análisis histológico. Por consiguiente, se validó el método de cribadoin vivode alto rendimiento descrito anteriormente. Ejemplo 5: Cribadoin vivode alginatos modificados para cuantificar la biocompatibilidad
Se obtuvieron ratones SKH1 macho de 8-12 semanas de edad de Charles River Laboratories (Wilmington, MA). Los ratones se mantuvieron en las instalaciones para animales del Instituto de Tecnología de Massachusetts, acreditado por la Asociación Americana para el Cuidado de Animales de Laboratorio, y se alojaron en condiciones convencionales con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Se proporcionaron tanto agua como pienso a voluntad.Las inyecciones se realizaron según la norma ISO 10993-6: 2001. Antes de la inyección, todos los materiales se esterilizaron a través de filtración de 0,22 |im. Los ratones se anestesiaron a través de inhalación de isoflurano a una concentración del 1-4 % de isoflurano/resto de O<2>para minimizar el movimiento. Se lavaron sus lomos con alcohol isopropílico al 70 % y se inyectó a los animales un alginato modificado. El volumen de inyección fue de 100 |il.
Se midió la actividad catepsina 7 días después de la inyección usando un ensayo de fluorescenciain vivo paracuantificar la respuesta a cuerpos extraños con respecto al alginato modificado. 24 horas antes de la obtención de imágenes de fluorescenciain vivo,se disolvieron 2 nmol de ProSense-680 (VisEn Medical, Woburn, MA, longitud de onda de excitación: 680 ± 10 nm, emisión: 700 ± 10 nm) en 150 |il de PBS estéril y se inyectaron en la vena de la cola de cada ratón para obtener imágenes de la actividad catepsina.
Se realizó obtención de imágenes de fluorescenciain vivocon un sistema de medición IVIS-Spectrum (Xenogen, Hopkinton, MA). Los animales se mantuvieron bajo anestesia inhalada usando isoflurano al 1-4% en oxígeno al 100 % a una velocidad de flujo de 2,5 l/min. Se usaron una agrupación de<8>*<8>y un campo de visión de 13,1 cm para la obtención de imágenes. Se optimizaron el tiempo de exposición y f/stop, que es el tamaño relativo del orificio de la abertura, para cada imagen adquirida. Se adquirieron datos y se analizaron usando el software Living Image 3.1 propiedad del fabricante. Todas las imágenes se presentan en cuanto a eficiencia de fluorescencia, que se define como la razón de la intensidad de fluorescencia recogida con respecto a un patrón interno de intensidad incidente en la configuración de obtención de imágenes seleccionada. Las regiones de interés (ROI) se designaron alrededor del sitio de cada inyección.
Se capturaron imágenes de fluorescencia 7 días después de la inyección ilustrando la actividad catepsina relativa en el punto de inyección de alginatos modificados seleccionados. Se midió la intensidad de fluorescencia y se normalizó con respecto a la respuesta de fluorescencia medida usando alginato no modificado con el fin de cuantificar la biocompatibilidad de los alginatos modificados. Los resultados obtenidos para alginatos modificados seleccionados se incluyen en la figura 4.
Ejemplo<6>: Tratamiento de diabetes en ratones con diabetes inducida por STZ
El trasplante de células beta encapsuladas en alginatos biocompatibles ofrece potencial como tratamiento para la diabetes. Se encapsularon células de los islotes pancreáticos de rata usando catorce polímeros de alginato modificados biocompatibles identificados usando los ensayos detallados anteriormente (incluyendo PF_N287_B_B4, PF_N287_F2, PF_N287_G3, PF_N287_B3, PF_N287_B_B8, PF_N287_A4, PF_N287_B1, PF_N287_E3, PF_N263_C12, PF_N63_A12, PF_N287_E1, PF_N287_D3, PF_N263_A7 y PF_N263_C6). Se fabricaron cápsulas de islotes encapsulados en alginatos a partir de 750 |il de una disolución al 4 % (p/v) de cada alginato modificado en agua desionizada que contenía 1.000 islotes suspendidos usando el dispositivo de encapsulación Inotech (Inotech) ajustado a una tensión de 1,05 kV, una vibración de 1225 Hz y una velocidad de flujo de 10-25 ml/min con una boquilla de 300 |im. El alginato se reticuló en una disolución de BaCh 20 mM. Después de la encapsulación, las cápsulas se lavaron dos veces con disolución de HEPES, cuatro veces con disolución de Krebs y dos veces con medio RPMI-1640.
Las células de los islotes de rata encapsuladas se trasplantaron a ratones con diabetes inducida por STZ. Antes del trasplante, los ratones se anestesiaron bajo un flujo continuo de isoflurano al 1-4 % con oxígeno a 0,5 l/min. Se usó una afeitadora con una cuchilla cortadora de tamaño #40 para retirar el pelaje para revelar una zona de aproximadamente 2 cm * 2 cm en la línea media ventral del abdomen del animal. Se preparó asépticamente toda la zona afeitada con un mínimo de 3 ciclos de lavado con Povidine, seguido de aclarado con alcohol al 70 %. También se aplicó una pintura cutánea final con Povidine. Se cubrió el sitio quirúrgico con papel desechable estéril para impedir que el pelaje circundante tocara el sitio quirúrgico. Se usó una cuchilla quirúrgica afilada para realizar una incisión de la línea media de 0,5-0,75 cm a través de la piel y la línea alba en el abdomen. Se usó una pipeta de plástico estéril para transferir las cápsulas de alginato a la cavidad peritoneal. Se cerró el músculo abdominal mediante sutura con seda negra Ethicon 5-0 o hilo absorbible monofilamentoso 5.0-6.0 absorbible en PDS. Se cerró la capa cutánea externa usando grapas de sutura. Estas grapas de sutura se retiraron 7-10 días después de la cirugía tras confirmarse la curación completa.
Se monitorizaron diariamente los niveles de glucemia en los ratones con diabetes inducida por STZ durante entre 20 y 30 días después del trasplante usando una gota de sangre obtenida lavando la cola con alcohol isopropílico al 70 % y realizando un corte superficial en la piel de la cola para producir una gota de sangre. Los ratones se inmovilizaron durante la extracción de muestras en un inyector de cola giratorio.
Los niveles de glucemia en los ratones con diabetes inducida por STZ después del trasplante de los islotes se muestran en la figura 5. La línea negra a trazos representa la normoglucemia en ratones. Las células de los islotes pancreáticos de rata que se encapsularon en alginatos modificados fueron capaces de reducir los niveles de glucemia en todos los casos, y en algunos casos incluso pudieron inducir normoglucemia.
Ejemplo 7: Partículas preparadas a partir de una mezcla de alginato(s) modificado(s) y alginato no modificado El creciente reconocimiento de los parámetros que impulsan la fibrosisin vivose ha aplicado al análisis del rendimiento de los alginatos modificados. La implantación intraperitoneal (IP) de cápsulas de alginato modificado reveló que los alginatos modificados pueden dar como resultado cápsulas con formas anómalas cuando se reticulan usando condiciones definidas para los alginatos no modificados. Estas cápsulas con formas anómalas pueden complicar la implementación y la interpretación de las cápsulas de alginato modificado implantadas IP. En un esfuerzo por mejorar la morfología de las cápsulas, se desarrollaron métodos de formulación para su uso con micropartículas de alginato modificado donde los alginatos modificados se mezclaron con una pequeña cantidad de alginato de alto peso molecular. Las partículas preparadas a partir de esta mezcla produjeron partículas con morfología y estabilidad mejoradas.
Se combinó 1:1 en volumen una disolución al<6>% de alginato modificado (p/p) con una disolución al 1,15% de alginato no modificado (p/p). Después del mezclado, se formaron cápsulas siguiendo esta disolución a través de un generador electrostático de gotitas, seguido de la reticulación del polímero en una disolución acuosa de cloruro de bario 20 mM.
Las partículas preparadas a partir de micropartículas de alginato modificado 263_A12 formuladas con bario y manitol se compararon con partículas preparadas a partir de 263_A12 mezclado con una pequeña cantidad de alginato SLG100 no modificado (16 % en peso). Las partículas preparadas a partir de una mezcla de alginato modificado y alginato no modificado produjeron poblaciones de micropartículas más homogéneas. Se realizó el análisis cuantitativo de fluorescencia con ProSense en varios puntos de tiempo con alginatos modificados mezclados con SLG100. Los resultados se muestran en la figura<6>. Varios alginatos modificados reformulados mostraron una menor respuesta inflamatoria el día 7 en comparación con el alginato de control. Los experimentos iniciales con cápsulas grandes (1,5 mm de diámetro) muestran cápsulas comparablemente limpias después de 2 semanas en el espacio IP de ratones C57BL/6 inmunocompetentes.
Los datos recopilados hasta la fecha con estas cápsulas controladas indican que la reformulación y la morfología de las cápsulas pueden tener un efecto significativo sobre la inflamación tal como se mide mediante ProSense. Se observa una respuesta a la inflamación mejorada en algunos polímeros (figura<6>), mientras que otros se ven afectados negativamente.
Ejemplo<8>: Demostración de la actividad antifibrótica de alginatos modificados
En este ejemplo, se tomó un enfoque de modificación química para mitigar el reconocimiento inmunitario de las microesferas de alginato en modelos preclínicos de fibrosis, incluyendo NHP, que son relevantes para su traducción a humanos. Los materiales líderes evaden el reconocimiento inmunitario y la fibrosis en el espacio IP tanto de ratones C57BL/6 como de macacos cangrejeros. Este alginato bloquea la adhesión de macrófagos, retrasando la activación de la respuesta a cuerpos extraños y proporcionando información sobre las propiedades superficiales necesarias para superar la fibrosis de los materiales implantados.
I. Métodos
A. Modificación química de alginatos
1. Amidación de alginatos
Se disolvió alginato (Pronova UPVLVG de NovaMatrix, 1 eq., 100 mg = 0,52 mmol de COOH disponibles para la reacción) como disolución de alginato al 2 % en una mezcla de agua:acetonitrilo 3:2 (5 ml de volumen total). Luego se añadió amina (N1 a N9, Z1, Z2) (1 eq., Sigma Aldrich o TCI America) a la mezcla junto con el agente de acoplamiento 2-cloro-4,6-dimetoxi-1,3,5-triazina (CDMT, 0,5 eq., 45 mg, Sigma Aldrich) y 4-metilmorfolina (NMM, 1 eq., 56 |il, Sigma Aldrich). Se agitó la mezcla a 55 °C durante la noche y se eliminó el disolvente a presión reducida. Se disolvió el sólido resultante en agua y se filtró a través de gel de sílice modificada con ciano (Silicycle) para retirar el precipitado insoluble. Luego se sometió la disolución resultante a diálisis frente a una membrana de diálisis con un MWCo de 10.000 durante la noche con agua DI para purificar adicionalmente el polímero. Luego se liofilizó la disolución resultante para conseguir el compuesto purificado.
2. Esterificación de alginatos
Se disolvió alginato (Pronova UPVLVG de NovaMatrix, 1 eq., 100 mg = 0,52 mmol de COOH disponibles para la reacción) como disolución de alginato al 2 % en una mezcla de agua:alcohol 3:2 (O1 a O12) (5 ml de volumen total). Luego se añadió el agente de acoplamiento 2-cloro-4,6-dimetoxi-1,3,5-triazina (CDMT, 0,5 eq., 45 mg, Sigma Aldrich) y 4-metilmorfolina (NMM, 1 eq., 56 |il, Sigma Aldrich) y se agitó la mezcla a 55 °C durante la noche. Al día siguiente, se eliminó el disolvente a presión reducida. Se disolvió el sólido resultante en agua y se filtró a través de gel de sílice modificada con ciano (Silicycle) para retirar el precipitado insoluble. Luego se sometió la disolución resultante a diálisis frente a una membrana de diálisis con un MWCo de 10.000 durante la noche con agua DI para purificar adicionalmente el polímero. Luego se liofilizó la disolución resultante para conseguir el compuesto purificado.
3. Cicloadición de Huisgen (“química clic”)
En una segunda etapa, se disolvieron los alginatos que reaccionaron con Z2 en una disolución de agua:metanol 1:1 (5 ml en total). Se añadieron azida de sodio (0,25 eq., 19 mg, Sigma Aldrich), L-ascorbato de sodio (0,05 eq., 19 mg, Sigma Aldrich), trans-N,N'-dimetilcidohexano-1,2-diamina (0,25 eq., normalmente 20 |il, Sigma Aldrich), yoduro de cobre(I) (0,5 eq., 10 mg, Sigma Aldrich) como agentes de acoplamiento. Luego se añadieron 0,51 mmol del alquino respectivo (Y1 a Y20) y se agitó la mezcla a 55 °C durante la noche. Se eliminó el disolvente a presión reducida. Se disolvió el sólido resultante en agua y se filtró a través de gel de sílice modificada con ciano para retirar el precipitado insoluble. Se liofilizó la disolución transparente, se disolvió en 5 ml de agua y se sometió a diálisis. Luego se sometió la disolución resultante a diálisis frente a una membrana de diálisis con un MWCO de 10.000 durante la noche con agua DI para purificar adicionalmente el polímero. Luego se liofilizó la disolución resultante para conseguir el compuesto purificado.
En una segunda etapa, se disolvieron los alginatos que reaccionaron con Z1 en una disolución de agua:metanol 1:1 (5 ml en total). Se añadieron tris[(1-bencil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil]amina (TBTA, 0,2 eq., 50 mg, Sigma Aldrich), trietilamina (0,25 eq., normalmente 15 |il, Sigma Aldrich), yoduro de cobre(I) (0,25 eq., 5 mg, Sigma Aldrich) como agentes de acoplamiento. Luego se añadieron 0,51 mmol del alquino respectivo y se agitó la mezcla a 55 °C durante la noche. Se eliminó el disolvente a presión reducida. Se disolvió el sólido resultante en agua y se filtró a través de gel de sílice modificada con ciano para retirar el precipitado insoluble. Se liofilizó la disolución transparente, se disolvió en 5 ml de agua y se sometió a diálisis. Luego se sometió la disolución resultante a diálisis frente a una membrana de diálisis con un MWCO de 10.000 durante la noche con agua DI para purificar adicionalmente el polímero. Luego se liofilizó la disolución resultante para conseguir el compuesto purificado.
4. Síntesis optimizadas para la preparación de Z2-Y12, Z1-Y15 y Z1-Y19:
Amina Z2-Y12:
Se añadieron 10 g de 2-(2-propiniloxi)tetrahidropirano (1 eq., 71,36 mmol) a una disolución de 5,1 g de azida de sodio (1,1 eq., 78,5 mmol), 1,41 g de ascorbato de sodio (0,1 eq., 7,14 mmol), 2,29 ml de trans-N-N'-dimetilciclohexano-1,2-diamina (0,25 eq., 17,83 mmol), 3,4 g de yoduro de cobre(I) (0,025 eq., 17,83 mmol) en 75 ml de metanol. A esta mezcla se le añadieron 19,97 g de HCl de 4-yodobencilamida. Se agitó la reacción durante la noche a 55 °C. Se eliminó el disolvente a presión reducida. Se purificó la reacción en bruto mediante cromatografía de líquidos con mezcla de diclorometano:ultra (MeOH al 22 % en DCM con NH<4>OH al 3 %) 0 % ^ 40 % sobre gel de sílice. Luego se hizo reaccionar el producto con alginato tal como se describe a continuación.
Amina Z1-Y15:
Se añadieron 3,5 g de 1,1 -dióxido de 4-propagiltiomorfolina (1 eq., 20 mmol) a una disolución de 2,5 g de TBTA (0,2 eq., 4 mmol), 750 |il de trietilamina (0,5 eq., 10 mmol), 250 mg de yoduro de cobre(I) (0,06 eq., 1,3mmol) en 50 ml de metanol. Se enfrió la mezcla hasta 0 °C y se añadieron 5,25 ml de 11-azido-3,6,9-trioxaundecan-1-amina (1 eq., 20 mmol). Se agitó la reacción durante la noche a 55 °C. Se eliminó el disolvente a presión reducida. Se purificó la reacción en bruto mediante cromatografía de líquidos con mezcla de diclorometano:ultra (MeOH al 22 % en DCM con NH<4>OH al 3 %) 0 % ^ 100 % en una columna C18. Luego se hizo reaccionar el producto con alginato tal como se describe a continuación.
Amina Z1-Y19:
Se añadieron 3 g de 4-etinilanilina (1 eq., 20,2 mmol) a una disolución de 2,5 g de TBTA (0,2 eq., 4 mmol), 750 |il de trietilamina (0,5 eq., 10,1 mmol), 250 mg de yoduro de cobre(I) (0,06 eq., 1,31 mmol) en 50 ml de metanol. Se enfrió la mezcla hasta 0 °C y se añadieron 5,25 ml de 11-azido-3,6,9-trioxaundecan-1-amina (1 eq., 20 mmol). Se agitó la reacción durante la noche a 55 °C. Se eliminó el disolvente a presión reducida. Se purificó la reacción en bruto mediante cromatografía de líquidos con mezcla de diclorometano:ultra (MeOH al 22 % en DCM con NH<4>OH al 3 %) 0 % ^ 30 % en una columna de sílice funcionalizada con ciano. Luego se hizo reaccionar el producto con alginato tal como se describe a continuación.
Reacción de alginato:
Se disolvieron 1,5 g de UPVLVG (1 eq.) en 45 ml de agua y se añadieron 675 mg de 2-cloro-4,6-dimetoxi-1,3,5-triazina (CDMT, 0,5 eq.) y 840 |il de N-metilmorfolina (NMM, 1 eq.). Luego se disolvieron 7,65 mmol de la amina Z2-Y12, Z1-Y15 o Z1-Y19 en 22,5 ml de acetonitrilo y se añadieron a la mezcla. Se agitó la reacción durante la noche a 55 °C. Se eliminó el disolvente a presión reducida y se disolvió el sólido en agua. Se filtró la disolución a través de un lecho de sílice funcionalizada con ciano y se eliminó el agua a presión reducida para concentrar la disolución. Luego se sometió a diálisis frente a una membrana con un MWCO de 10.000 en agua DI durante la noche. Se eliminó el agua a presión reducida para dar el alginato funcionalizado.
B. Formación de cápsulas
Se configuró un generador electrostático de gotitas de la siguiente manera: se conecta un generador de potencia de alta tensión 0-100 kV, 20 Watt de la serie ES (serie Gamma ES, Gamma High Voltage Research, FL, EE. UU.) a la parte superior y a la parte inferior de una aguja de punta roma (SAI Infusion Technologies, IL, EE. UU.). Se une esta aguja a una jeringa Luer-Lock de 5 ml (BD, NJ, e E. UU.) que se sujeta con pinzas a una bomba de jeringa (bomba 11 PicoPlus, Harvard Apparatus, MA, EE. UU.) que está orientada verticalmente. La bomba de jeringa bombea el alginato hacia una placa de vidrio que contiene una disolución en manitol al 5 % de bario 20 mM (Sigma Aldrich, MO, EE. UU.). Los ajustes de la bomba de jeringa PicoPlus son un diámetro de 12,06 mm y una velocidad de flujo de 0,2 ml/min. Después de formarse las cápsulas, se recogen y luego se lavan con tampón HEPES (15,428 g de NaCl, 0,70 g de KCl, 0,488 g de MgCh*<6>H<2>O, 50 ml de disolución tampón HEPES (1 M) (Gibco, Life Technologies, California, EE. UU.) en 2 l de DiH<2>O) 4 veces. Se dejan las cápsulas de alginato durante la noche a 4 °C. Luego se lavan las cápsulas 2 veces en solución salina al 0,8 % y se mantienen a 4 °C hasta su uso.
Solubilización de alginatos: se disolvió SLG20 (NovaMatrix, Sandvika, Noruega) al 1,4% en peso con respecto a volumen en solución salina al 0,8%. Se disolvió SLG100 (NovaMatrix, Sandvika, Noruega) al 1,2% en peso con respecto a volumen en solución salina al 0,8 %. Se disolvió UPVLVG (NovaMatrix, Sandvika, Noruega) al 5 % en peso con respecto a volumen en solución salina al 0,8 %. Todos los alginatos modificados se disolvieron inicialmente al 5 % en peso con respecto a volumen en solución salina al 0,8 %. Luego se mezclaron los alginatos modificados con SLG100 al 3 % en peso con respecto a volumen, disueltos en solución salina al 0,8 % (véase la tabla 1 para las razones).
Formación de cápsulas de diferentes tamaños: para las cápsulas de 300 |im de diámetro, se usa una aguja de punta roma de calibre 30 (SAI Infusion Technologies) con una tensión de 7-8 kV. Para las cápsulas de 500 |im de diámetro, se usa una aguja de punta roma de calibre 25 (SAI Infusion Technologies) con una tensión de 5-7 kV. Para las cápsulas de 1,5 mm, se usa una aguja de punta roma de calibre 18 (SAI Infusion Technologies) con una tensión de 5-7 kV.
Tabla 1. Razones en volumen de mezclado de alginato modificado con respecto a SLG100
Leyenda de la tabla 1: se mezclan los alginatos modificados con SLG100 para preparar cápsulas. Se extraen el alginato modificado y SLG100 en una jeringa de 5 ml y se agitan con vórtice exhaustivamente antes de la encapsulación. Los diferentes alginatos modificados requieren un porcentaje en volumen diferente de SLG100 añadido para preparar cápsulas esféricas. *VLVG/SLG100 es una mezcla de control. Se mezcla el VLVG no modificado con SLG100.
C. Trasplante de las cápsulas de hidrogel y otras esferas de material
Todos los protocolos con animales fueron aprobados por el Comité para el Cuidado de Animales del MIT y todos los procedimientos quirúrgicos y cuidados posoperatorios fueron supervisados por el personal veterinario de la División de Medicina Comparativa del MIT. Los ratones C57BL/6 macho inmunocompetentes (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) se anestesiaron con isoflurano al 3 % en oxígeno y se afeitaron sus abdómenes y se esterilizaron usando Betadine e isopropanol. Se realizó una incisión de 0,5 mm a lo largo de la línea media del abdomen y se expuso la mucosa peritoneal usando disección roma. Luego se sujetó la pared peritoneal con fórceps y se realizó una incisión de 0,5-1 mm a lo largo de la línea alba. Luego se cargó un volumen deseado de cápsulas en una pipeta estéril y se trasplantó a la cavidad peritoneal a través de la incisión. Luego se cerró la incisión usando suturas absorbibles de polidioxanona con punta cónica 5-0 (PDS II). Luego se cerró la piel a lo largo de la incisión usando grapas de sutura y adhesivo tisular. Antes de la operación, todos los ratones también recibieron una dosis de 0,05 mg/kg de buprenorfina por vía subcutánea como analgésico prequirúrgico, junto con 0,3 ml de solución salina al 0,9%por vía subcutánea para evitar la deshidratación.
D. Recuperación de células, tejidos y materiales
En puntos de tiempo deseados después del trasplante, tal como se especifica en las figuras y los resultados, los ratones se sacrificaron mediante la administración de CO<2>, seguido de luxación cervical. En determinados casos, en primer lugar, se inyectaron 5 ml de PBS helada con el fin de realizar un lavado intraperitoneal para aclarar y recoger las células inmunitarias intraperitoneales de flotación libre. Luego se realizó una incisión usando fórceps y tejieras a lo largo de la piel abdominal y la pared peritoneal y se pipetearon volúmenes de lavado intraperitoneal en tubos Falcon de 15 ml nuevos (cada uno preparado con 5 ml de medio de cultivo celular RPMI). A continuación, se insertó una punta de botella de lavado en la cavidad abdominal. Luego se usó tampón de Krebs para arrastrar por lavado la totalidad de las cápsulas de material desde el abdomen hacia placas de Petri para su recogida. Después de garantizar que la totalidad de las cápsulas fueron arrastradas por lavado o recuperadas manualmente, si experimentaron fibrosis directamente en los tejidos intraperitoneales, se transfirieron a tubos cónicos de 50 ml para el procesamiento y la obtención de imágenes posteriores. Después del lavado intraperitoneal y la recuperación de cápsulas, también se extirparon los tejidos intraperitoneales con fibrosis restantes para los análisis de expresión y por FACS posteriores.
E. Obtención de imágenes de las cápsulas de material recuperadas
Para la obtención de imágenes de contraste de fases, los materiales recuperados se lavaron cuidadosamente usando tampón de Krebs y se transfirieron a placas de Petri de 35 mm para la microscopía de contraste de fases usando un microscopio Evos Xl (Advanced Microscopy Group).
F. Ensayo de ProSense
Se utilizaron ratones SKH1 hembra<( 6>semanas de edad) para este ensayo. Se resuspendieron 100 ul de cápsulas en<2 0 0>ul de solución salina y se inyectaron por vía subcutánea en el ratón en el lado izquierdo del lomo superior. Los ratones se alimentaron con dieta de roedor purificada AIN-93G (TD 94045, Harlan) para minimizar el fondo fluorescente después de la inyección. Seis días después, se inyectaron por vía intravenosa 100 ul (4 nmol) de ProSense 750 FAST (NEV11171, PerkinElmer Inc.) por ratón a través de la vena de la cola. El día 7 (es decir, 24 horas después de la administración intravenosa de ProSense 750 FAST), los ratones se examinaron mediante el sistema IVIS Spectrum (Xenogen, Caliper LifeScience). Los ratones se anestesiaron usando al isoflurano 3 % en oxígeno y se mantuvieron a la misma tasa durante todo el procedimiento, y los ajustes del sistema IVIS Spectrum fueron exposición=7,50, agrupación=media, FStop=2, excitación=605 y emisión=660. Las imágenes se analizaron con el software LivingImage, y se usó el lado derecho del lomo superior del mismo ratón como control durante la cuantificación de señales.
G. Tinción celular e inmunofluorescencia confocal
Las muestras recuperadas se almacenaron en paraformaldehído al 4 % durante la noche (diluidas en PBS 1x). Luego se lavaron las muestras en tampón de Krebs (7,889 g de NaCl, 0,35 g de KCl, 5,958 g de HEPES (Sigma-Aldrich, Montana, EE. UU.), 0,163 g de KH<2>PO<4>, 0,144 g de MgSO<4>*<7>H<2>O en 1000 ml de DH<2>O). Las muestras se lavaron con 10 ml de PBS. Se aspiró la PBS y se usaron 20 ml de disolución de Triton X-100 al 1 % (Sigma-Aldrich, Montana, EE. UU.) para permeabilizar las células. Se incubaron las muestras durante 10 minutos a temperatura ambiente. Luego se incubaron las muestras en 15 ml de disolución de albúmina al 1 % (Sigma-Aldrich, Montana, EE. UU.), diluidas en PBS 1x durante 30 minutos a temperatura ambiente. A cada muestra se le añadieron 3 ml de disolución de anticuerpo (anticuerpo de ratón anti-CD<6 8>488 1:200 (BioLegend California, EE. UU.), anticuerpo de ratón anti-a-actina de músculo liso-Cy3 1:200 (Sigma-Aldrich, Montana, EE. UU.), anticuerpo de ratón anti-faloidina 647 1:30 (Life Technologies, California, EE. UU.), DAPI (NucBlue Live Cell Stain ReadyProbes, Life Technologies, California, EE. UU.) 2 gotas por ml), todo ello diluido en disolución de albúmina al 1 %. Se incubaron las muestras en disolución de tinción durante 45 minutos a temperatura ambiente. Luego se aspiró la disolución de tinción. Luego se lavaron las muestras dos veces con 20 ml de disolución de Tween-20 al 0,1 % (Sigma-Aldrich, Montana, EE. UU.), diluida en PBS 1x. Luego se lavaron las muestras dos veces con 20 ml de PBS 1x. Luego se transfirieron las muestras a una placa con fondo de vidrio de 24 pocillos. Se aspiró el exceso de PBS y se añadió 1 ml de disolución de glicerol al 50 % (Sigma-Aldrich, Montana, EE. UU.). Se usó un sistema Zeiss LSM 700 con el software para microscopio ZEN para la obtención de imágenes y el análisis de las muestras teñidas. Las imágenes obtenidas se ajustaron linealmente para su presentación usando Photoshop (Adobe Inc., Seattle, WA).
H. Extracción de proteínas
Las células en cápsulas recuperadas se sometieron a lisis mediante sonicación durante 30 segundos en un ciclo de 30 segundos de descanso tres veces a una amplitud del 70 % (dispositivo de sonicación QSonica, modelo n.° Q125, QSonica LLC) en hielo en tampón de lisis celular NP40 (n.° de cat. FNN0021, Invitrogen) a la razón de 100 ul de cápsulas con respecto a 200 ul de tampón de lisis, con PMSF 100 mM e inhibidores de proteasas 1x (cóctel de un solo uso de inhibidores de proteasas Halt, n.° de cat. 78430, Thermo Scientific). Se centrifugaron los lisados durante 20 min a 12000 rpm a 4 °C; se aspiró el sobrenadante que contiene proteínas en un tubo nuevo mantenido en hielo. Se lavaron los sedimentos con el mismo volumen de tampón de lisis (es decir, los sedimentos de 100 ul de cápsulas se lavaron con 200 ul de tampón de lisis) y luego se centrifugaron durante 20 min a 12000 rpm a 4 °C, combinando el sobrenadante con el anterior. Las proteínas se almacenaron a -80 °C para su uso futuro.
I. Elispot (matriz de citocinas de ratón)
Este ensayo se logró con el kit de panel A de matriz de citocinas de ratón Proteome Profiler (n.° de cat. ARY006, R&D Systems). Para cada membrana, se mezclaron 200 ul de disolución de proteína con 100 ul de tampón de muestra (tampón de matriz 4) y 1,2 ml de tampón de bloqueo (tampón de matriz<6>), luego se añadieron 15 ul de cóctel de anticuerpos de detección de panel A de matriz de citocinas de ratón reconstituido y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Mientras tanto, se incubó la membrana de matriz con tampón de bloqueo (tampón de matriz<6>) durante<2>horas en un agitador de plataforma oscilante, y luego se aspiró el tampón de bloqueo, se añadió la mezcla de muestra/anticuerpo preparada sobre la membrana y se incubó durante la noche a 4 °C en un agitador de plataforma oscilante. Se lavó tres veces la membrana con 20 ml de tampón de lavado 1x durante<10>minutos en un agitador de plataforma oscilante y se aclaró con agua desionizada una vez, luego se sondeó con estreptavidina conjugada con fluoróforo (dilución 1:5.000, n.° de cat. 926-32230, Li-Cor) a temperatura ambiente durante 30 minutos en un agitador de plataforma oscilante, se lavó tres veces con tampón de lavado y se aclaró con agua desionizada una vez más como en las etapas anteriores. Los complejos de anticuerpo-antígeno se visualizaron usando detección con Odyssey (Li-Cor, n.° de serie ODY-2329) a la longitud de onda de 800 nm. Las densidades de los puntos se analizaron mediante el software Image J.
J. Inmunotransferencia de tipo Western
Se sometieron a ebullición 12 ul de disolución de proteína mezclada con tampón de carga 1x (tampón de muestra SDS, n.° de cat. BP-111R, Boston BioProducts) para cada carril a 95 °C durante 20 min y se sometieron a electroforesis en geles de SDS-poliacrilamida (minigel Any Kd 15-well comb, Biorad, n.° de cat. 456-9036), y se usaron 3 ul de Precision Plus Protein Dual Xtra Stands (n.° de cat. 161-0377, Bio-rad) como marcador de peso molecular para indicar la posición de las bandas, y luego se sometieron a inmunotransferencia sobre membranas de nitrocelulosa (Biorad, n.° de cat. 162-0213). Las inmunotransferencias se sondearon con anticuerpo anti-a-actina de músculo liso (dilución 1:400, anticuerpo policlonal de conejo contra alfa-actina de músculo liso; n.° de cat. ab5694, AbCam) y anticuerpo anti-p-actina (dilución 1:4000, anticuerpo monoclonal anti-p-actina producido en ratón; n.° de cat. A1978, Sigma Aldrich) como control de carga seguido de anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforo de burro anti-IgG de conejo (dilución de 1 a 15.000, n.° de cat. 926-32213, Li-Cor) y de cabra anti-IgG de ratón (dilución de 1 a 15.000, n.° de cat. 926-68070, Li-Cor). Los complejos de anticuerpo-antígeno se visualizaron usando detección con Odyssey (Li-Cor, n.° de serie ODY-2329) a las longitudes de onda de 700 y 800 nm. Las densidades de las bandas se analizaron mediante el software Image J.
K. Análisis de NanoString
Los ARN para controles con trasplante simulado (MT) o para ratones que portan cápsulas de alginato de 500 ó 1.500 |im (n = 5/grupo) se aislaron a partir de muestras de tejido tomadas en diversos puntos de tiempo después del trasplante. Se cuantificaron los ARN respectivos, se diluyeron hasta la concentración apropiada (100 ng/|il) y luego se procesaron 500 ng de cada muestra según los protocolos del fabricante de NanoString para el análisis de la expresión a través del panel de subtipado de macrófagos de ratón de 53 genes multiplexado personalizado de los presentes inventores. Se obtuvieron los niveles de ARN (números de copias absolutos) después de la cuantificación con nCounter (NanoString Technologies Inc., Seattle, WA), y se analizaron muestras de grupo usando el software de análisis nSolver (NanoString Technologies Inc., Seattle, WA).
L. Análisis por FACS
Se prepararon suspensiones de célula individual de tejidos recién extirpados usando un dispositivo de disociación gentleMACS (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) según el protocolo del fabricante. Se prepararon suspensiones de célula individual en tampón de disociación PEB (PBS 1X, pH 7,2, BSA al 0,5 % y EDTA 2 mM) y se hicieron pasar las suspensiones a través de filtros de 70 |im (n.° de cat. 22363548, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Luego se sometieron todas las poblaciones de célula individual derivadas de muestras de tejido y material a lisis de glóbulos rojos con 5 ml de tampón de lisis de RBC 1X (n.° de cat. 00-4333, eBioscience, San Diego, CA, EE. UU.) durante 5 min a 4 °C. Se terminó la reacción mediante la adición de 20 ml de PBS estéril 1X. Se centrifugaron las células restantes a 300-400 g a 4 °C y se resuspendieron en un volumen mínimo (~50 |il) de tampón de tinción eBioscience (n.° de cat. 00-4222) para la incubación de anticuerpos. Luego se tiñeron conjuntamente todas las muestras en la oscuridad durante 25 min a 4 °C con dos de los anticuerpos monoclonales etiquetados de manera fluorescente específicos para los marcadores celulares CD<6 8>(1 |il (0,5 |ig) por muestra; CD68-Alexa-647, clon FA-11, n.° de cat.
11-5931, BioLegend), Ly-<6>G (Gr-1) (1 |il (0,5 |ig) por muestra; Ly-6G-Alexa-647, clon RB6-8C5, n.° de cat. 108418, BioLegend), CD11b (1 |il (0,2 |ig) por muestra; o CD11b-Alexa-488, clon M1/70, n.° de cat. 101217, BioLegend). Luego se añadieron 2 ml de tampón de tinción de citometría de flujo eBioscience (n.° de cat. 00-4222, eBioscience) y se centrifugaron las muestras a 400-500 g durante 5 min a 4 °C. Se retiraron los sobrenadantes mediante aspiración y se repitió esta etapa de lavado dos veces más con tampón de tinción. Después del tercer lavado, se resuspendió cada muestra en 500 |il de tampón de tinción de citometría de flujo y se hizo pasar a través de un filtro de 40 |im (n.° de cat. 22363547, Fisher Scientific) para el eventual análisis por FACS usando un dispositivo BD FACSCalibur (n.° de cat. 342975), BD Biosciences, San José, CA, EE. UU.). Para unos ajustes apropiados del fondo y la intensidad del láser, también se hicieron pasar controles de anticuerpo individual no teñido e IgG (marcada con Alexa-488 o Alexa-647, BioLegend).
M. Obtención de imágenes intravital
Para la obtención de imágenes intravital, se cargaron hidrogeles de SLG20 con tamaños de 500 |im y 1500 |im con Qdot 605 (Life Technologies, Grand Island, NY) y se implantaron quirúrgicamente en ratones C57BL/6-Tg(Csflr-EGFP-NGFR/FKBP1A/TNFRSF6)2Bck/J tal como se describió anteriormente. 7 días después del trasplante, los ratones se colocaron bajo anestesia con isoflurano y se realizó una pequeña incisión en el sitio de la cirugía original para exponer las perlas. Se colocaron los ratones en un microscopio invertido y se obtuvieron imágenes usando un objetivo 25x, N.A. 1,05 en un microscopio multifotónico Olympus FVB-1000 MP a una longitud de onda de excitación de 860 nm. Se adquirieron apilamientos Z de 200 |im (pasos de 10 |im) a intervalos de 2 minutos para la serie temporal de 20-45 minutos dependiendo de la imagen. Los ratones se mantuvieron bajo anestesia con isoflurano constante y se monitorizaron durante toda la sesión de obtención de imágenes. Las imágenes obtenidas se analizaron usando el software de análisis de imágenes Velocity 3D (Perkin Elmer, Waltham, MA).
N. Espectroscopia Raman confocal
Preparación de muestras:se dejó caer una gota de cápsulas de hidrogel con disolución de tampón sobre el cubreobjetos de cuarzo (043210-K<j>, Alfa Aesar). Con el fin de retirar la sal a partir de la disolución tampón seca, se aplicó cuidadosamente una gota de agua destilada sobre la parte superior de la muestra seca y se absorbió inmediatamente por un tejido. Al hacer esto, se preparan cápsulas de hidrogel secas para el mapeo de Raman.Instrumentación:se notificó previamente un sistema de microscopía Raman confocal NIR personalizado (Kanget al.,Combined confocal Raman and quantitative phase microscopy system for biomedical diagnosis. Biomed. Opt. Exp.
2(9):2484-2492 (2011); Kanget al.,Measuring uptake dynamics of multiple identifiable carbon nanotube species via high-speed confocal Raman imaging of live cells. Nano Letters 12(12):6170-6174 (2012)). Brevemente, se usó un láser Ti:Sapphire con una longitud de onda de 785 nm (3900S, Spectra-Physics) para la excitación de la muestra. Se filtró el haz colimado por un filtro de paso de banda (BPF, LL01-785-12,5, Semrock) y se redirigió a los espejos del galvanómetro de doble eje. Se realizó barrido XY de alta velocidad mediante los espejos del galvanómetro (CT-6210, Cambridge Technology). Se usó una lente de objetivo de inmersión en agua de 1,2 NA (Olympus UPLSAPO60XWIR 60X/1.20) tanto para enfocar la luz láser sobre la muestra como para recoger la luz retrodispersada. Se usó un accionador piezoeléctrico combinado con un micrómetro diferencial (DRV517, Thorlabs) para realizar los ajustes gruesos y finos, respectivamente, del foco de la muestra. Se colocó un espejo plegable después de la lente del tubo de modo que el plano focal de la muestra desde la fuente de transmisión incoherente pueda observarse usando una videocámara con un aumento de 75X. La luz Raman retrodispersada desde la muestra pasa a través de dos espejos dicroicos (DM1: Semrock LPD01-785RU-25, DM2: Semrock LPD01-785RU-25*36*1,1) y se recogió mediante una fibra multimodal (Thorlabs M14L01). La señal recogida se envió al espectrógrafo (Holospec f/1,8i, Kaiser Optical Systems) y se detectó mediante un CCD termoeléctricamente refrigerado, retroiluminado y profundamente empobrecido (PIXIS: 100BR_eXcelon, Princeton Instruments). Se usaron el software LabView<8 . 6>(National Instruments), la tarjeta de adquisición de datos (PCI-6251, National Instruments) y el software MATLAB 2013 (Mathworks) para controlar el sistema, adquirir los datos y analizar los datos.
Medición por espectroscopia Raman:se enfocaron 60 mW de potencia láser de 785 nm a un tamaño de punto micrométrico y se usaron para examinar en tramas las muestras de hidrogel. Se adquirieron espectros de 30*30 a partir de un área de 45 |im*45 |im con un tiempo de integración de 1,0 s/píxel. El tiempo total de medición fue de aproximadamente 15 minutos.
Procesamiento de datos:se generan dos imágenes Raman basándose en las intensidades de dos bandas Raman. Estas imágenes Raman se redimensionan y superponen como colores rojo y verde en la parte superior de una imagen de cambio brillante correspondiente a partir de la misma área.
II. Caracterización de polímeros y compuestos
N7:<1>H (400 MHz; D<2>O): 3,10-4,10 (m, protones de alginato), 4,20 (2H, s, H<2>N-CH<2>-PIU 4,40-5,20 (m, protones de alginato), 7,41 (2H, m, fenilo), 7,49 (3H, m, fenilo).
IR (ATR): 3234, 1579, 1465, 1407, 1368, 1078, 810, 692, 517.
N<8>:<1>H (400 MHz; D<2>O): 3,00-3,20 (m, protones de alginato), 3,60 (<8>H, m, etoxilo), 3,60-5,10 (m, protones de alginato).
IR (ATR): 3233, 2927, 2358, 1591, 1405, 1318, 1022, 945, 810.
O3:<1>H (400 MHz; D<2>O): 1,90-2,10 (m, 4H, furfurilo), 3,23 (m, 2H, furfurilo) 3,26-4,00 (m, protones de alginato), 4,03 (3H, m, O-CH<2>-C[furfurilo]), 4,10-5,20 (m, protones de alginato).
IR (ATR): 3202, 3070, 2344, 1711, 1594, 1398, 1021, 715, 549
O<6>:<1>H (400 MHz; D<2>O): 3,60-4,52 (m, protones de alginato), 4,59 (2H, m, O-CH<2>-C[furfurilo]), 4,6-5,2 (m, protones de alginato), 6,45 (2H, m, CH-CH=CH-O furfurilo), 7,53 (1H, m, CH-CH=CH-O furfurilo).
IR (ATR): 3232, 2360, 1614, 1410, 1028, 538.
O9:<1>H (400 MHz; D<2>O): 0,20 (s, 9H, furfurilo) 3,10-5,20 (m, protones de alginato).
IR (ATR): 3310, 2939, 2360, 1592, 1406, 1316, 1081, 1020, 902, 770.
O11:<1>H (400 MHz; D<2>O): 3,05-4,50 (m, protones de alginato), 4,52 (2H, s, O-CH<2>-Ph), 4,52-5,2 (m, protones de alginato),<6 , 8 8>(<2>H, m, fenilo), 7,26 (<2>H, m, fenilo).
IR (ATR): 3370, 3089, 1597, 1517, 1454, 1235, 1207, 989, 835, 801, 561.
Z1-Y2:<1>H (400 MHz; D<2>O): 3,05-3,40 (m, protones de alginato), 3,40-3,66 (16H, m, etoxilo), 3,75 (3H, s, metoxilo), 3,8-5,1 (m, protones de alginato), 7,19 (1H, m, fenilo), 7,50 (1H, m, fenilo), 7,94 (1H, m, fenilo), 8,00 (1H, m, fenilo), 8,49 (1H, s, triazol).
IR (ATR): 3144, 2922, 1592, 1400, 13291019, 943.
Z1-Y15:<1>H (400 MHz; D<2>O): 3,07 (4H, s, N-CH<2>-CH<2>-S), 3,17-3,40 (m, protones de alginato), 3,46 (4H, s, N-CH<2>-CH<2>-S), 3,50-3,70 (16H, m, etoxilo), 3,7-5,2 (m, protones de alginato),<8 , 0 8>(1H, s, triazol).
IR (ATR):3268, 2933, 2250, 1602, 1409, 1292, 1119, 1023, 946.
Z1-Y19:<1>H (400 MHz; D<2>O): 3,05-3,40 (m, protones de alginato), 3,40-3,66 (16H, m, etoxilo), 4,4-5,1 (m, protones de alginato), 6,96 (2H, m, fenilo), 7,63 (3H, m, fenilo), 8,23 (1H, s, triazol).
IR (ATR): 3234, 2929, 2361, 1593, 1406, 13171024, 947, 810.
Z2-Y12:<1>H (400 MHz; D<2>O): 1,57-1,78 (m,<6>H, pirano), 3,10-4,40 (m, protones de alginato), 4,48 (4H, m, pirano), 4,50-5,10 (m, protones de alginato), 7,56 (2H, m, fenilo), 7,76 (3H, m, fenilo), 8,51 (1H, s, triazol).
IR (ATR): 3235, 2933, 2111, 1592, 1405, 1290, 1023, 946.
N4-N2:<1>H (400 MHz; D<2>O): 2,72 (s, 3H, N-CH<3>dioxolano) 2,77 (s, 3H, N-CH<3>bencilo), 3,36 (2H, d, N-CH<2>-dioxolano), 3,55-4,20 (m, protones de alginato), 4,22 (2H, m, N-CH<2>-Ph), 4,50-5,10 (m, protones de alginato), 5,19 (1H, m, CH2-CH-O dioxolano), 7,51 (5H, m, fenilo).
IR (ATR): 3250, 2894, 1601, 1409, 1127, 1088, 1029, 946.
O3-O10:<1>H (400 MHz; D<2>O): 1,60-2,20 (m, 4H, tetrahidrofurfurilo), 3,55-5,10 (m, protones de alginato), 3,78 (2H, m, CH<2>-CH<2>-O tetrahidrofurfurilo), 3,85 (3H, s, COO-CH<3>), 4,13 -4,30 (3H, m, N-CH<2>-tetrahidrofurfurilo).
IR (ATR): 3448, 2926, 2111, 1618, 1420, 1290, 1096, 948, 904.
N9-O8:<1>H (400 MHz; D<2>O): 1,28 (m, 3H, N-CH<2>-CH<3>), 1,32 (m, 3H, O-CH<2>-CH<3>), 1,63 (m, 3H, N-CH<2>-CH<2>-CH<2>-CH<2>-OH), 1,74 (m, 3H, N-CH<2>-CH<2>-CH<2>-CH<2>-OH), 3,09-3,40 (m,<6>H, CH<3>-CH<2>- N-CH<2>-CH<2>-CH<2>-CH<2>-OH), 3,55-5,10 (m, protones de alginato), 4,06 (m, 3H, O-CH<2>-CH<3>).
IR (ATR): 3422, 1709, 1655, 1611, 1474, 1395, 1042, 798.
Preparaciones de moléculas pequeñas:
Amina Z2-Y12:
<1>H (400 MHz; MeOD): 1,57 (m, 4H, pirano), 1,72 (m, 1H, pirano), 1,82 (m, 1H, pirano) 3,58 (m, 1H, pirano), 3,87 (s, 1H, NH<2>-CH<2>-Ph), 3,92 (m, 1H, pirano), 4,68 (d, 1H, J = 12 Hz, O-CH<2>-triazol), 4,79 (m, 1H, O-CH-O pirano), 4,97 (d, 1H, J = 12 Hz, O-CH<2>-triazol), 7,54 (m, 2H, aromático), 7,80 (m, 2H, aromático), 8,49 (s, 1H, triazol).
<13>C (400 MHz; MeOD): 20,3 (CH<2>pirano), 26,5 (CH<2>pirano), 31,5 (CH<2>pirano), 46,1 (NH<2>CH<2>), 61,0 (O-CH<2>-C), 63,3 (CH<2>-O pirano), 99,5 (O-CH-O pirano), 121,6 (Ch aromático), 123,17 (Ch triazol), 129,9 (CH aromático), 137,1 (Cq-N aromático), 144,9 (Cq-C aromático), 146,9 (C triazol).
EM de alta resolución: M+1 = 289,1665 3,1 ppm.
Amina Z1-Y15:
<1>H (400 MHz; D<2>O): 2,86 (2H, s, NH<2>), 3,01 (4H, m, N-CH<2>-CH<2>-S), 3,10 (4H, m, N-CH<2>-CH<2>-S), 3,55 (2H, t, J = 5,2 Hz, NH<2>-CH<2>), 3,61 (<8>H, m, PEG) 3,85 (2H, s, tiomorfolina-CH<2>-triazol), 3,90 (2H, t, J = 5,2 Hz, N-CH<2>-CH<2>-O), 4,59 (t, 2H, J = 5,2 Hz, N-CH<2>-CH<2>-O), 7,99 (1H, s, triazol).
<13>C (400 MHz; MeOH): 41,7 (NH<2>-CH<2>), 51,42 (N-CH<2>), 51,48 (N-CH<2>tiomorfolina) 52,1 (S-CH<2>tiomorfolina) 52,4 (tiomorfolina-CH<2>-triazol), 70,4-72,1 (m, PEG), 126,0 (CH triazol), 144,5 (C triazol).
EM de alta resolución: M+1 = 392,1968 - 6,1 ppm.
Amina Z1-Y19:
<1>H (400 MHz; MeOD): 2,79 (t, 2H, J = 5,2 Hz, NH<2>-CH<2>), 3,46 (t, 2H, J = 5,2 Hz, NH<2>-CH<2>-CH<2>), 3,53 (m, 4H, PEG), 3,61 (m, 4H, PEG), 3,91 (t, 2H, J = 5,2 Hz, N-CH<2>-CH<2>-O), 4,58 (t, 2H, J = 5,2 Hz, N-CH<2>-CH<2>-O) 6,76 (m, 2H, aromático), 7,54 (m, 2H, aromático), 8,14 (s, 1H, triazol).
<13>C (400 MHz; MeOD): 41,6 (NH<2>-CH<2>), 51,4 (N-CH<2>), 70,3-71,9 (m, PEG), 116,4 (CH aromático), 121,1 (Cq-C), 121,5 (CH triazol), 127,7 (CH aromático), 149,4 (C-NH<2>aromático), 149,5 (C triazol).
EM de alta resolución: M+1 = 336,2036 - 8,3 ppm.
III. Resultados
Se usaron las aminas y los alcoholes enumerados en la tabla 2 para preparar los alginatos modificados. En la primera reacción combinatoria, se hizo reaccionar alginato UPLVG con uno de los compuestos en la tabla 2 en presencia de 2-cloro-4,6-dimetoxi-1,3,5-triazina (CDMT) y N-metilmorfolina (NMM). Con el fin de preparar alginatos modificados de manera múltiple, se repitió la primera etapa usando un alcohol o una amina diferente de la tabla<2>. Luego se hicieron reaccionar los alginatos modificados con amina Z2 con azida de sodio para preparar el alginato modificado con azida correspondiente. Luego se hicieron reaccionar estos alginatos, junto con alginatos modificados con amina Z<1>, con uno de los alquinos enumerados en la tabla<2>en presencia de CuSO<4>y ascorbato de sodio con el fin de preparar alginatos modificados con tetrazol.
Después de cada modificación covalente, los alginatos modificados se filtraron a través de una columna de sílice modificada con ciano para capturar las impurezas orgánicas a granel. Finalmente, después de completarse todas las etapas de modificación covalente, los alginatos modificados se sometieron a diálisis frente a una membrana con un MWCO de 10.000 para retirar cualquier impureza de bajo peso molecular o molécula pequeña restante.
La pureza de los alginatos modificados se determinó mediante análisis por<1>H-RMN. Se recogieron los espectros de<1>H-RMN de cada polímero de alginato modificado y se integraron los picos correspondientes al polímero de alginato modificado y a cualquier impureza para determinar la cantidad relativa de cada especie en la muestra.
Tabla 2. Modificaciones químicas de las 73 formulaciones de cápsulas
N.° de alginato Modificaciones N.° de alginato Modificaciones
<1>O1-O7 38 N2-Z2-Y6
<2>O3-O10 39 N2
3 O1-O11 40 O5-O9
4 O9-O12 41 Z2-Y15
5 O3-O7 42 Z1-Y18
<6>Z2-Y8 43 O7
7 Z1-Y20 44 Z1-Y12
<8>SLG100 45 N9-Z1-Y18
9 Z2-Y16 46 O10
<10>Z2-Y13 47 Z2-Y7
<11>Z2-Y17 48 Z1-Y10
<12>O5 49 N<6>
13 O7-O9 50 Z2-Y13
14 Z2-Y15 51 O12
15 O<8>52 N3
16 O4-O1 53 O4
17 Z2-Y4 54 Z1-Y11
18 N9-Z1-Y16 55 Z1-Y17
19 Z1-Y4 56 Z1-Y1
<2 0>VLVG 57 Z1-Y9
<21>Z1-Y6 58 Z2-Y6
<2 2>Z2-Y11 59 SLG20
23 N1 60 N5
24 N9 61 Z1-Y3
25 Z2-Y3 62 Z2-Y5
26 N6-Z1-Y18 63 Z1
27 O9-O2 64 O<6>
28 Z2-Y2 65 Z1-Y15
29 Z1-Y7<6 6>Z1-Y2
30 O4-O7 67 N<8>
31 N4-N2<6 8>Z1-Y19
32 Z1-Y8 69 O3
33 Z2-Y16 70 Z2-Y12
34 V/S 71 N7
35 Z2 72 O9
36 Z1-Y14 73 O11
37 O9-O3
A. La modificación química del alginato restringe la respuesta a cuerpos extraños en ratones C57BL/6
Los parámetros fisicoquímicos que rigen las propiedades antifibróticas se entienden escasamente en la actualidad, haciendo que los enfoques racionalmente diseñados sean un desafío (Williams, Biomaterials 29:2941-2953 (2008)). Para entender mejor qué características estructurales son relevantes para las propiedades antifibróticas, se seleccionó un conjunto de diversos compuestos químicos que pueden modificar las funcionalidades y propiedades latentes en la estructura principal polimérica de alginato (figura7).Se construyó una biblioteca de análogo de alginato de 774 miembros con una variedad de aminas, alcoholes, azidas y alquinos (figura 9). De los 774 análogos de alginato, 35 análogos dieron como resultado rendimientos inaceptablemente bajos y se determinó que 634 alginatos eran capaces de gelificarse después de la modificación. Luego se evaluaron estos alginatos como hidrogeles a granel en un ratón de alto rendimiento subcutáneo para medir los niveles de inflamación aguda (tablas 3-7). 200 análogos de alginato mostraron niveles de actividad catepsina inferiores al alginato de control UPVLVG, el alginato usado como material de partida para la síntesis de la biblioteca. Las designaciones de componentes se refieren a los componentes de la tabla 2 y la figura 7. Este ensayo monitoriza la activación de neutrófilos por vía subcutánea con un agente de obtención de imágenes que produce una mayor fluorescencia en respuesta a una mayor actividad catepsina mediada por neutrófilos. Doscientos análogos mostraron niveles de fluorescencia que eran inferiores al alginato VLVG ultrapuro no modificado base (figura 11).
Dado que las microcápsulas han sido la geometría de alginato preferida tanto en aplicaciones de administración de fármacos como de encapsulación de células, se fabricaron 70 de los 200 polímeros con mejores rendimientos (tabla 2) del cribado inicial en cápsulas de 300 |im y volvieron a evaluarse en el ensayo de inflamación subcutánea (figura 12). Usar alginato químicamente modificado demostró ser problemático para construir microesferas, y se restableció una buena morfología de cápsula mezclando una pequeña cantidad de alginato SLG100 ultrapuro con la disolución de análogo de alginato.
Tabla 3. Actividad catepsina de polímeros de alginato modificados de manera individual
Tabla 4. Actividad catepsina de polímeros de alginato modificados de manera múltiple
Tabla 5. Actividad catepsina de polímeros de alginato modificados de manera múltiple
Tabla<6>. Actividad catepsina de polímeros de alginato modificados de manera múltiple
Tabla 7. Actividad catepsina de polímeros de alginato modificados de manera múltiple
Todas las formulaciones de microcápsulas modificadas requirieron esta mezcla, las cápsulas preparadas a partir de una disolución mixta de alginatos no modificados VLVG y SLG100 (V/S) y la formulación de cápsulas de SLG20 convencional sirvieron como controles. De las 70 microcápsulas de alginato formuladas, se observó una respuesta a la inflamación mejorada con varios polímeros (figura 12). Las 10 mejores microcápsulas modificadas mostraron niveles de inflamación un 10-40% menores que los alginatos de control. Para ver si estos menores niveles de inflamación aguda se traducían en menores niveles de fibrosis, se tomaron muestras de los sitios de implante de estos 10 mejores alginatos, se realizaron cortes y se procesaron histológicamente después de 28 días. Tres alginatos modificados, Z2-Y12, Z1-Y15 y Z1-Y19, mostraron un sobrecrecimiento fibrótico mínimo con cápsulas capaces de desprenderse totalmente del tejido circundante.
Para someter a prueba si los resultados subcutáneos se traducen en otros sitios de implantación, se implantaron cápsulas de 300 |im de los 10 alginatos modificados mejores principales en el espacio intraperitoneal (IP) de ratones C57BL/6. Las cápsulas se recuperaron después de 14 días y se evaluaron para determinar la acumulación de tejido celular y fibrótico. La obtención de imágenes de contraste de fases de las cápsulas de control recuperadas muestra una respuesta fibrótica robusta, con una deposición colagenosa fibrosa de color blanco observada en las cápsulas con aglomeraciones de cápsulas de color marrón. A modo de comparación, los diez alginatos modificados mejores principales muestran grados variables de fibrosis, mostrando los alginatos modificados Z2-Y12, Z1-Y15 y Z1-Y19 casi ninguna deposición fibrosa y resultando ser materiales con propiedades antifibróticas.
La tinción celular y la microscopía confocal de las cápsulas Z2-Y12, Z1-Y15 y Z1-Y19 mostraron poca o ninguna presencia de macrófagos (CD<6 8>), miofibroblastos (SMA) o deposición celular general (DAPI). Sin embargo, el alginato en microcápsulas convencional mostró cantidades significativas de estas poblaciones de células en las cápsulas recuperadas. La deposición celular es un componente mecanístico clave del reconocimiento de materiales y un iniciador de la deposición colagenosa, y la ausencia de células en la superficie de la cápsula es una ilustración adicional de las propiedades antifibróticas de estos alginatos modificados. Para confirmar estos resultados, se cuantificaron los niveles de SMA de las cápsulas Z2-Y12, Z1-Y15, Z1-Y19 y de control mediante inmunotransferencia de tipo Western. También se obtuvieron perfiles de 40 citocinas diferentes de las muestras de proteínas extraídas de las microcápsulas recuperadas. El perfil de citocinas de microcápsulas Z2-Y12 muestra los niveles más bajos de citocinas de todas las muestras sometidas a prueba, indicativo de una menor respuesta inflamatoria global. Y lo que es más importante, las cápsulas Z2-Y12 recuperadas tenían bajos niveles de proteína de TNF-a, IL-13, IL-<6>, G-CSF, GM-CSF, IL-4, CCL2 y CCL4 que son mediadores conocidos de la respuesta a cuerpos extraños y la fibrosis (Rodríguezet al.,J. Biomed. Mater. Res. A 89:152-159 (2009)). La cuantificación de setenta y nueve secuencias de ARN de factores de inflamación y marcadores de células inmunitarias conocidos aislados a partir de cápsulas recuperadas también respaldan los menores niveles de inflamación para implantes Z2-Y12. El perfil de ARN en el líquido IP circundante y el tejido adiposo de ratones a lo cuales se les implantó Z2-Y12 también se asemeja más estrechamente al tratamiento con simulación que los ratones a lo cuales se les implantaron cápsulas de control, lo que demuestra adicionalmente el menor potencial inflamatorio de este material.
B. Los alginatos antifibróticos muestran una menor adhesión de macrófagos
Se realizó análisis por FACS en las cápsulas recuperadas después de 14 días IP para caracterizar las diferentes poblaciones inmunitarias que se reclutan a cápsulas Z2-Y12 en comparación con cápsulas de control (figura<8>). Las cápsulas Z2-Y12 mostraron porcentajes significativamente más bajos de poblaciones de macrófagos y neutrófilos, lo que sugiere que las cápsulas Z2-Y12 pueden estar interfiriendo o bien en el reclutamiento de poblaciones de células inmunitarias o bien en la amplificación de una respuesta inflamatoria. Para ver si un menor reclutamiento de macrófagos era evidentein vivo,se realizó obtención de imágenes intravital IP 7 días después de la implantación de cápsulas Z2-Y12 fluorescentes en ratones MAFIA (donde los macrófagos expresan GFP) y se compararon con las cápsulas SLG20 fluorescentes. Las cápsulas SLG20 muestran una gran población de macrófagos que se agregan activamente en la superficie de estas cápsulas, una indicación de la formación de células gigantes de cuerpos extraños y un claro paso hacia la fibrosis. En comparación, las cápsulas Z2-Y12 mostraron niveles de macrófagos mucho menores cerca de las cápsulas y no hubo ninguna agregación visible de macrófagos.
La falta de reclutamiento/activación de células inmunitaria en la superficie de cápsulas Z2-Y12 es consistente con la modificación química de las cadenas poliméricas que crean superficies diferenciales. Se realizó mapeo por espectroscopía Raman confocal para determinar la distribución de la modificación química Z2-Y12 en la microcápsula. Sorprendentemente, la firma Raman de diagnóstico para la modificación de tetrahidropiranilo tenía una mayor intensidad en la superficie de la microcápsula que en el núcleo. Luego se realizó SEM criogénica de fractura por congelación en las microcápsulas Z2-Y12 para examinar tanto la topografía de superficie como la del núcleo de las microesferas de análogos de alginato y compararlas con las formulaciones de cápsulas de control. Las cápsulas Z2-Y12 muestran una porosidad más variable a lo largo de todo el núcleo de la cápsula en comparación con las cápsulas SLG20 convencional o de control mixtas, con poros que oscilan desde 1 |im hasta 10 |im en cuanto a tamaño. Las características superficiales entre las diferentes formulaciones de cápsulas son bastante distintas; la superficie de las cápsulas Z<2>-Y<12>muestra menos características de cráteres. Estas diferencias superficiales probablemente se crean por interacciones en la capa límite entre las cadenas poliméricas modificadas y la disolución acuosa circundante.
C. Z2-Y12, Z1-Y15 y Z1-Y19 resisten la fibrosis en primates no humanos
Los materiales principales, Z2-Y12, Z1-Y15 y Z1-Y19, avanzaron a estudios en primates para someter a prueba sus propiedades antifibróticas en un modelo de NHP. Informes previos del laboratorio de los presentes inventores han establecido que el tamaño de esferoide también es un parámetro clave para mitigar la fibrosis, mostrando las esferas más grandes (>1 mm) propiedades antifibróticas. Las cápsulas de 1,5 mm de las cápsulas SLG20 convencionales y las nuevas cápsulas formuladas Z2-Y12, Z1-Y15 y Z1-Y19 se trasplantaron por separado a primates no humanos (n=3 cada una) usando un procedimiento laparoscópico mínimamente invasivo. Las cápsulas se recuperaron mediante lavado IP a las 2 y 4 semanas, permitiendo que un primate de cada cohorte continuara durante<6>meses.
14 días después del trasplante, las cápsulas SLG20 de 1,5 mm también estaban en gran medida libres y tampoco estaban incorporadas en tejido a las 2 semanas. Sin embargo, numerosas cápsulas experimentaron fibrosis y se aglomeraron juntas. Z2-Y12, Z1-Y15 y Z1-Y19 de 1,5 mm conservaron una alta tasa de recuperación y una incorporación mínima en el tejido circundante. Tanto a las 2 como a las 4 semanas, las cápsulas Z2-Y12, Z1-Y15 y Z1-Y19 mostraron respuestas fibróticas significativamente reducidas en la obtención de imágenes de contraste de fases en comparación con las cápsulas SLG20 de 1,5 mm. La obtención de imágenes confocal y el análisis por FACS de cápsulas recuperadas mostraron que las grandes cápsulas SLG20 de 1,5 mm tenían una cobertura más extensa de miofibroblastos activados asociados a la fibrosis y de macrófagos inmunitarios, consistente con el sobrecrecimiento fibrótico visible observado en la obtención de imágenes de contraste de fases.
Para investigar si el creciente tamaño de las cápsulas y/o las químicas modificadas mantendrían una actividad antifibrótica mejorada a lo largo de un periodo de tiempo más largo, también se realizó tinción confocal en las cápsulas recuperadas a partir de NHP después de<6>meses. Las cápsulas SLG20 mostraron un sobrecrecimiento fibrótico significativo y extenso, mientras que las cápsulas Z2-Y12 todavía eran limpias, no mostrando macrófagos o miofibroblastos asociados. El análisis por FACS mostró resultados similares con una composición con menos macrófagos asociada con las cápsulas Z2-Y12 recuperadas.
La combinación tanto de mayor tamaño de cápsula (1,5 mm) como de química modificada (Z2-Y12) mejoró sustancialmente la biocompatibilidad incluso en el punto de tiempo de<6>meses. Las grandes cápsulas Z2-Y12 de 1,5 mm parecían tener niveles mínimos (prácticamente inexistentes) de fibrosis en todos los puntos de tiempo, lo que indica que los efectos antifibróticos del tamaño de cápsula grande tienen sinergia con los de la química modificada Z2-Y12.
Los resultados en este ejemplo demuestran que la modificación química de uno de los biomateriales más ampliamente usados, el alginato, produce hidrogeles que son capaces de resistir las reacciones a cuerpos extraños tanto en roedores como en primates no humanos. Los análogos de alginato principales, Z2-Y12, Z1-Y15 y Z1-Y19, muestran un reconocimiento mínimo por macrófagos y otras células inmunitarias, bajos niveles de citocinas inflamatorias y prácticamente ninguna deposición fibrosa visible ni en roedores ni en primates no humanos incluso después de<6>meses (Z2-Y12). La distribución de la modificación química Z2-Y12 da como resultado una superficie de hidrogel única que inhibe la adhesión de macrófagos, mitigando eficazmente la respuesta a cuerpos extraños con respecto al biomaterial. Los resultados muestran que la modificación química de los biomateriales existentes es una estrategia viable para superar sus respuestas a cuerpos extraños. Estos son los primeros biomateriales que resisten la respuesta a cuerpos extraños en primates no humanos y su versatilidad como materiales a base de alginato permite su uso en múltiples aplicaciones biomédicas.
Ejemplo 9: Demostración de la actividad antifibrótica de alginatos modificados que encapsulan células humanas en animales inmunocompetentes
Este ejemplo demuestra las propiedades antifibróticas de los alginatos modificados que encapsulan células humanas, que se implantan en ratones STZ C57BL/6J inmunocompetentes robustos durante un largo periodo de tiempo. Las células humanas encapsuladas están secretando de manera activa sustancias xenogénicas incluyendo, pero sin limitarse a, proteínas. Las sustancias xenogénicas deben provocar una respuesta inmunitaria intensa de los ratones. Por tanto, esta prueba representa un desafío inmunitario grave para los alginatos modificados implantados. No obstante, los alginatos modificados implantados resisten respuestas a cuerpos extraños y protegen las células humanas encapsuladas de las respuestas del huésped a cuerpos extraños durante largos periodos de tiempo. Como resultado, los efectos beneficiosos de las células humanas se ejercen durante largos periodos de tiempo. Este ejemplo describe las pruebas de alginatos modificados que encapsulan células humanas que secretan insulina para determinar su capacidad para reducir los niveles de glucemia y mantener la normoglucemia en ratones con diabetes inducida por STZ. Los implantes reducen los niveles de glucemia y mantienen la normoglucemia a largo plazo en los ratones STZ C57BL/6J sin la necesidad de inmunodepresores.
La diabetes es una pandemia global que afecta a más de 300 millones de personas (Shawet al.,Diabetes Res. Clin. Pract. 87:4-14 (2010)). Mientras que un régimen riguroso de monitorización de glucemia acoplada con inyecciones diarias de insulina exógena sigue siendo el tratamiento principal para los pacientes con diabetes de tipo uno, los pacientes todavía padecen los efectos adversos debido a los desafíos asociados con el cumplimiento terapéutico diario (Pickupet al.,N. Engl. J. Med. 366:1616-1624 (2012)). Además, la regulación de la secreción de insulina por las células beta de los islotes pancreáticos de Langerhans en respuesta al nivel de glucemia es un proceso altamente dinámico, que se simula de manera imperfecta mediante inyecciones de insulina periódicas (Robertsonet al.,N. Engl. J. Med. 350:694-705 (2004)). El trasplante de tejido de donante, o bien en forma de un trasplante de páncreas o de infusión de islotes procedentes de cadáveres, se implementan actualmente clínicamente como estrategia para lograr la independencia de la insulina para pacientes con diabetes de tipo 1 (Shapiroet al.,N. Engl. J. Med. 355:1318-1330 (2006); Shapiroet al.,N. Engl. J. Med. 343:230-238 (2000); Qiet al.,Acta Diabetologica 51:833-843 (2014)). Este enfoque se ha visto limitado por dos grandes inconvenientes: (1) el suministro limitado de tejido de donante disponible, y (2) los efectos adversos asociados con la duración de la inmunosupresión (Hirshberget al.,Current Diabetes Reports 7:301-303 (2007); Giblyet al.,Diabetologia, 54:2494-2505 (2011); O'Sullivanet al.,Endocrine Reviews 32:827-844 (2011)). Deben desarrollarse métodos para aliviar la necesidad de inmunosupresión para toda la vida para permitir una implementación clínica más amplia (Hirshberget al.,Current Diabetes Reports 7:301-303 (2007); Shapiroet al.,The Review of Diabetic Studies: RDS 9:385-406 (2012); Vogelet al.,Diabetologia 56:1605-1614 (2013)).
La encapsulación de células es una tecnología prometedora que supera la necesidad de inmunosupresión protegiendo tejidos terapéuticos del rechazo del huésped (Dolgin, Nat. Med. 20:9-11 (2014); Jacobs-Tulleneers-Thevissenet al.,Diabetologia 56:1605-1614 (2013)). El método investigado más habitualmente para la terapia de encapsulación de islotes es la formulación de islotes aislados en microesferas de alginato (Jacobs-Tulleneers-Thevissenet al.,Diabetologia 56:1605-1614 (2013); Scharpet al.,Advanced Drug Delivery Reviews 67-68:35-73 (2014)). La evaluación clínica de esta tecnología en pacientes con diabetes con islotes humanos procedentes de cadáveres sólo ha logrado la corrección glucémica durante periodos cortos (Jacobs-Tulleneers-Thevissenet al.,Diabetologia 56:1605-1614 (2013); Bastaet al.,Diabetes Care 34:2406-2409 (2011); Calafioreet al.,Diabetes Care 29:137-138, (2006)). Los implantes de estos estudios se caracterizan por respuestas a cuerpos extraños mediadas por el sistema inmunitario fuertes que dan como resultado deposición fibrótica, aislamiento de nutrientes y necrosis del tejido del donante (de Grootet al.,Journal of Surgical Research 121:141-150 (2004); Tuchet al.,Diabetes Care 32:1887-1889 (2009)). Se observan resultados similares se observan con islotes xenogénicos encapsulados y células progenitoras pancreáticas en modelos de ratón o primate no humano con diabetes presintomático, donde la eficacia terapéutica (Hirshberget al.,Current Diabetes Reports 7:301-303 (2007)) tanto de islotes humanos procedentes de cadáveres encapsulados como islotes de cerdo se ve obstaculizada por las respuestas inmunitarias (Elliotet al.,Trasplantation Proceedings 37:3505-3508 (2005); Omeret al.,Diabetes 52:69-75 (2003); Schneideret al.,Diabetes 54:687-693 (2005)).
Un factor contribuyente principal al rendimiento de implantes de células encapsuladas es la respuesta inmunitaria a los biomateriales usados para la encapsulación de células (Limet al.,Science 210:908-910 (1980); Jacobs-Tulleneers-Thevissenet al.,Diabetologia 56:1605-1614 (2013); Scharpet al.,Advanced Drug Delivery Reviews 67-68:35-73 (2014)). Las respuestas a cuerpos extraños mediadas por el sistema inmunitario con respecto a los materiales implantados conducen habitualmente a la formación de cápsulas de tejido que dan como resultado un fallo del implante (Kinget al.,Journal of Biomedical Materiales Research 57:374-383 (2001)). Cuando se implantaron en el espacio intraperitoneal de primates no humanos o roedores con sistemas inmunitarios robustos tales como C57BL/6J, (Kinget al.,Journal of Biomedical Materiales Research 57:374-383 (2001); Danget al.,Biomaterials 32, 4464-4470 (2011)) las microesferas de alginato provocan reacciones a cuerpos extraños y fibrosis (Kinget al.,Journal of Biomedical Materiales Research 57:374-383 (2001); Danget al.,Biomaterials 32:4464-4470 (2011)). Una gran biblioteca de alginatos químicamente modificados se desarrolló recientemente y se evaluó para determinar su potencial para resistir un rechazo al implante tanto en modelos de roedores como en primates no humanos. Este ejemplo extiende ese trabajo para mostrar que el alginato de dióxido de triazol-tiomorfolina (TMTD; figura 13) que encapsula células humanas es capaz de mitigar las respuestas a cuerpos extraños en ratones C57BL/6 inmunocompetentes (figuras 14 a 16). Como resultado, el alginato de TMTD que encapsula células humanas es capaz de proporcionar corrección glucémica y reactividad a la glucosa a largo plazo. Estos resultados demuestran que estos nuevos materiales pueden usarse para proporcionar corrección glucémica a largo plazo a través de la implantación de una célula humana microencapsulada, mejorando así el efecto terapéutico de tales células implantadas.
Este ejemplo demuestra el uso exitoso potencial de las células humanas encapsuladas en animales inmunocompetentes para el restablecimiento de la normoglucemia sin supresión inmunitaria. Esto muestra la expectativa de que los alginatos modificados divulgados pueden usarse para encapsular células y recubrir material y mantener las reacciones inmunitarias en las células y materiales a raya en sujetos en los que se implantan. Para asegurar una evaluación de la biocompatibilidad apropiada en estos estudios se usó un modelo de ratón C57BL/6 con diabetes inducido por estreptozotocina inmunocompetente porque se sabe que esta raza produce una respuesta fibrótica y a cuerpos extraños fuerte similar a las observaciones realizadas en pacientes humanos (Kolbet al.,J. Respir. Cell. Mol. Biol. 27: 141-150 (2002)). Las formulaciones que han mostrado corrección glucémica utilizando otras fuentes de tejido, tales como microencapsulación convencional con alginato (Limet al.,Science 210;908-910 (1980); Calafioreet al.,Diabetes Care 29:137-138, (2006)) y formulaciones de esferas más grandes (Veisehet al.,Nat. Mater., DOI: 10,1038/NMAT4290), son incapaces de apoyar la corrección glucémica con células humanas. Todos los materiales se implantaron por vía intraperitoneal y se recuperaron en tiempos especificados de ratones C57BL/6 oB6.129S6-Ccr6tml(EGFP)Irw/Jcon diabetes inducidos por estreptozotocina inmunocompetentes según los protocolos y las directrices federales aprobados. El procesamiento de muestras, tinción, FACS y obtención de imágenes se realizaron tal como se detalla a continuación.
I. Materiales
Todos los productos químicos se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) y los reactivos de cultivo celular de Life Technologies (Grand Island, NY), a menos que se indique lo contrario. Anticuerpos: anticuerpo anti-CD<6 8>de ratón conjugado con Alexa Fluor 488 (n.° de cat. 137012, clon FA-11) y anticuerpo anti-Ly-<6>G/Ly-<6>C de ratón conjugado con Alexa Fluor 647 (Gr-1) (n.° de cat. 137012, clon RB6-8C5) se adquirieron de BioLegend Inc. (San Diego, CA). El anticuerpo anti-actina de músculo liso alfa de ratón conjugado con Cy3 se adquirió de Sigma Aldrich (St. Louis MO). La faloidina conjugada con Alexa Fluor 488 específica de actina filamentosa (F-actina) se adquirió de Life Technologies (Grand Island, NY). Anticuerpo anti-glucagón n.° de cat. ab82270, anticuerpo anti-insulina n.° de cat. ab7842, anticuerpo de cabra anti-IgG de cobaya H&L conjugado con Alexa Fluor® 488 n.° de cat. ab150185, y anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón H&L conjugado con Alexa Fluor® 594 n.° de cat. ab150116 se adquirieron de Abcam (Cambridge, MA). El anticuerpo anti-péptido C humano n.° de cat. GN-1D4 se adquirió de Banco de Hibridomas de Estudios del Desarrollo (Universidad de lowa, lowa City, lowa). Un muestreo de las esferas usadas en este estudio se presentó para las pruebas de endotoxinas por un vendedor comercial (Charles River, Wilmington, MA) y los resultados mostraron que las esferas contenían < 0,05 EU/ml de niveles de endotoxina.
II. Métodos
A. Fabricación de cápsulas de hidrogel de alginato y encapsulación de células
Todos los tampones se esterilizaron mediante autoclave y las disoluciones de alginato se esterilizaron mediante filtración a través de un filtro de 0,2 |im. Después de esterilizarse las disoluciones, se implementó un procesamiento aséptico realizando la formación de cápsula en una cámara de bioseguridad de clase a 2 de tipo II para mantener la esterilidad de microcápsulas/esferas fabricadas para la implantación posterior. Las cápsulas de hidrogel siguieron el protocolo descrito en el ejemplo<8>.
Para solubilizar los alginatos, se disolvió SLG20 (NovaMatrix, Sandvika, Noruega) al 1,4 % en peso con respecto a volumen en solución salina al 0,8 %. Se disolvió inicialmente el alginato de TMTD al 5 % en peso con respecto a volumen en solución salina al 0,8%, y luego se mezcló con SLG100 al 3% en peso con respecto a volumen (también disuelto en solución salina al 0,8 %) a una razón volumétrica del 80 % de alginato de TMTD al 20 % de SLG100.
Para la formación de esferas de 0,5 mm se generaron con una aguja sin punta de calibre 25G, una tensión de 5kV y una velocidad de flujo de 200 |il/min. Para la formación de esferas de 1,5 mm, se usó una aguja con punta roma de calibre 18 (SAI Infusion Technologies) con una tensión de 5-7 kV.
Se usaron células humanas cultivadas para la encapsulación. Inmediatamente antes de la encapsulación, se centrifugaron los agrupamientos de células humanas cultivadas a 1.400 rpm durante 1 minuto y se lavaron con tampón de Krebs-Henseleit (KH) libre de Ca (KCl 4,7 mM, HEPES 25 mM, KH<2>PO<4>1,2 mM, MgSO<4>*<7>H<2>O 1,2 mM, NaCl 135 mM, pH“ 7,4, “ 290 mOsm). Después del lavado, se centrifugaron de nuevo las células humanas y se aspiró todo el sobrenadante. Luego se volvió a suspender el sedimento de células humanas en las disoluciones de SLG20 o alginato de TMTD (descritas anteriormente) a densidades de agrupamiento de 1.000, 250 y 100 agrupamientos por 0,5 ml de disolución de alginato. Se reticularon las esferas usando una disolución gelificante de BaCl<2>y se controlaron sus tamaños tal como se describió anteriormente. Inmediatamente después de la reticulación, se lavaron los agrupamientos de células humanas encapsuladas 4 veces con 50 ml de medio CMRLM y se cultivaron durante la noche en un matraz de centrifugado a 37 °C antes del trasplante. Debido a una pérdida inevitable de agrupamientos de células humanas durante el procedimiento de encapsulación, se volvió a contar el número total de agrupamientos encapsulados tras la encapsulación.
B. Cirugías de trasplante
Todos los protocoles con animales fueron aprobados por el Comité para el Cuidado de Animales del MIT, y todos los procedimientos quirúrgicos y el cuidado posoperatorio fueron supervisados por el personal veterinario de la División de Medicina Comparativa del MIT. Se anestesiaron ratones C57BL/6 con diabetes inducida por STZ machos inmunocompetentes (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) o ratones macho B6.129S6-Ccr6tm1(EGFP)Irw/J (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) con el 3 % de isoflurano en oxígeno y les afeitaron el abdomen y les esterilizaron usando Betadine e isopropanol. De manera preoperatorio, todos los ratones también recibieron una dosis de 0,05 mg/kg de buprenorfina por vía subcutánea como analgésico prequirúrgico, junto con 0,3 ml de solución salina al 0,9 % por vía subcutánea para prevenir la deshidratación. Se realizó una incisión de 0,5 mm a lo largo de la línea media del abdomen y se expuso la mucosa peritoneal usando disección roma. Luego se agarró con pinzas la pared peritoneal y se realizó una incisión de 0,5-1 mm a lo largo de la línea alba. Luego se cargó un volumen deseado de esferas (todos los materiales sin islotes, así como esferas de SLG20 que encapsulan islotes de rata) en una pipeta estéril y se implantaron en la cavidad peritoneal a través de la incisión. Luego se cerró la incisión usando suturas absorbibles de polidioxanona con punta cónica 5-0 (PDS II). Luego se cerró la piel sobre la incisión usando una grapa para heridas y pegamento para tejidos.
C. Monitorización de glucemia
Para crear ratones con diabetes dependientes de insulina, se trataron ratones C57BL/6 sanos con estreptozotocina (STZ) por el vendedor (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) antes del envió al MIT. Se volvieron a someter a prueba los niveles de glucemia de todos los ratones antes del trasplante. Sólo los ratones cuyos niveles de glucemia no en ayunas estaban por encima de 400 mg/dl durante dos días consecutivos se consideraron ratones con diabetes y se sometieron al trasplante.
Se monitorizaron niveles de glucemia tres veces a la semana tras el trasplante de cápsulas de alginato que contienen islotes. Se extrajo una gota pequeña de sangre de la vena de la cola usando un bisturí y se sometió a prueba usando un glucómetro comercial (Clarity One, Clarity Diagnostic Test Group, Boca Raton, f L). Los ratones con niveles de glucemia no en ayunas por debajo de 200 mg/dl se consideraron normoglucémicos. Se continuó la monitorización hasta que se alcanzaron puntos de tiempo experimentales, en cuyo momento se sacrificaron y se recuperaron las esferas.
D. Monitorización de péptido C humano
Se monitorizaron los niveles de péptido C humano cada tres semanas tras el trasplante de cápsulas de alginato que contienen células humanas. Los ratones ayunaron durante 1 hora antes de la extracción de sangre, en cuyo momento se extrajeron aproximadamente 100-150 |il de sangre por vía retro-orbital en un tubo de extracción de suero. Se centrifugó la sangre extraída durante 10 minutos a 13000 rpm, se retiró el suero, y se almacenó a 20 °C hasta que se sometió a ensayo. Se sometió a ensayo el suero para determinar el péptido C humano usando el kit péptido C humano de Alpco (n.° de catálogo : 80-CPTHU-E10) según las instrucciones del fabricante.
E. Recuperación de células, tejidos y materiales
La recuperación de células, tejidos y materiales se realizó tal como se describió anteriormente en el ejemplo<8>. F. Obtención de imágenes de las esferas de material recuperadas
La obtención de imágenes de contraste de fases de los materiales recuperados se realizó siguiendo el protocolo descrito en el ejemplo<8>.
Para la obtención de imágenes de campo claro de los materiales recuperados, se lavaron suavemente las muestras usando tampón de Krebs y se transfirieron a placas de Petri de 35 mm para la obtención de imágenes de campo claro usando un microscopio estereoscópico de Leica.
G. Inmunofluorescencia confocal
Se usó la obtención de imágenes por inmunofluorescencia para determinar las poblaciones inmunes unidas a las esferas. Se recuperaron los materiales de los ratones y se fijaron durante la noche usando paraformaldehído al 4 % a 4 °C. Luego se lavaron las muestras dos veces con tampón de KREBS, se permeabilizaron durante 30 min usando una disolución al 0,1 % de Triton X100, y se bloquearon posteriormente durante 1 hora usando una disolución de albúmina sérica bovina (BSA) al 1 %. A continuación, se incubaron las esferas durante 1 hora en una disolución de cóctel de inmunotinción que consiste en DAPI (500 nM), sondas de marcador específicas (dilución 1:200) en BSA. Después de la tinción, se lavaron las esferas tres veces con una disolución al 0,1 % de Tween 20 y se mantuvieron en una disolución al 50 % de glicerol. Luego se transfirieron las esferas a placas con fondo de vidrio y se obtuvieron imágenes usando un microscopio confocal de barrido de puntos LSM 700 (Carl Zeiss Microscopy, Jena, Alemania) equipado con objetivos 5 y 10<x>. Se ajustaron linealmente las imágenes obtenidas para la presentación usando Photoshop (Adobe Inc. Seattle, WA).
H. Análisis proteómico
I. Reducción, alquilación y digestión tríptica
Se suspendieron las muestras recuperadas en tampón de lisis celular de urea (urea<8>M, Tris pH 8,0) y se incubaron a 4 °C durante la noche. Se redujeron cantidades equivalentes de proteína (ditiotreitol 10 mM, 56 °C durante 45 min) y se sometieron a alquilación (yodoacetamida 50 mM, temperatura ambiente en la oscuridad durante 1 h). Se digirieron posteriormente las proteínas con tripsina (calidad de secuenciación, Promega, Madison, WI), en una razón enzima/sustrato de 1:50, a temperatura ambiente durante la noche en acetato de amonio 100 mM pH 8,9. Se extinguió la actividad tripsina añadiendo ácido fórmico hasta una concentración final del 5 %. Se desalaron los péptidos usando un dispositivo C18 SpinTips (Protea, Morgantown, WV) luego se liofilizaron y se almacenaron a -80 °C.
2. Marcaje con TMT
Se marcaron los péptidos con TMT<6>plex (Thermo) según las instrucciones del fabricante. Se disolvieron las muestras liofilizadas en 70 |il de etanol y 30 |il de bicarbonato de trietilamonio 500 mM, pH 8,5, y se disolvió el reactivo de TMT en 30 |il de acetonitrilo anhidro. Se agitó con vórtex la disolución que contiene péptidos y el reactivo de TMT, se incubó a temperatura ambiente durante 1 h. Se combinaron las muestras marcadas con los seis reactivos de TMT isotópicos diferentes y se concentraron para completar en una centrífuga de vacío. Para el primer análisis, se marcaron las muestras usando los canales de TMT<6>plex de la siguiente manera: 126 - RZA 1,5 mm 250 réplica biológica 1; 127- RZA 1,5 mm 250 réplica biológica 2; 128 - SLG20 1,5 mm 250 réplica biológica 1; 129 SLG20 1,5 mm 250 réplica biológica 2; 130 - SLG20 500 |im 250 réplica biológica 1; y 131 - SLG20 500 |im 250 réplica biológica 2. Para el segundo análisis, se marcaron las muestras usando los canales de TMT<6>plex de la siguiente manera: 126 - RZA 1,5 mm 250 réplica biológica 3; 127-RZA 1,5 mm 250 réplica biológica 4; 128 - SLG20 1,5 mm 250 réplica biológica 3; 129 - SLG20 1,5 mm 250 réplica biológica 4; 130 - SLG20 500 |im 250 réplica biológica 3; y 131 - SLG20500 |im 250 réplica biológica 4.
3. CL-EM/EM
Luego se cargaron péptidos en una precolumna y se separaron mediante HPLC de fase inversa (Thermo Easy nLC1000) a lo largo de un gradiente de 140 minutos antes de la nanoelectropulverización usando un espectrómetro de masas QExactive (Thermo). Se hizo funcionar el espectrómetro de masas en un modo dependiente de datos. Los parámetros para la EM de barrido completo fueron: resolución de 70.000 a lo largo de 350-2000 m/z, AGC 3e6, y IT máximo de 50 ms. El barrido completo de EM se siguió de EM/EM para los 10 iones precursores mejores en cada ciclo con un NCE de 32 y una exclusión dinámica de 30 s. Se buscaron archivos de datos de espectros de masas en bruto (.raw) usando Proteome Discoverer (Thermo) y Mascot versión 2.4.1 (Matrix Science). Los parámetros de búsqueda de Mascot fueron: tolerancia de masa de 10 ppm para iones precursores; tolerancia de masa de iones de fragmento de 0,8 Da; 2 escisiones omitidas de tripsina; la modificación fijada fue carbamidometilación de cisteína; la modificación variable fue oxidación de metionina. Se obtuvo la cuantificación de TMT usando Proteome Discoverer y se corrigió isotópicamente según las instrucciones del fabricante.
I. Procesamiento histológico para H y E y tinción tricrómica de Masson
Se fijaron los materiales recuperados durante la noche usando paraformaldehído al 4 % a 4 °C. Después de la fijación, se lavaron las muestras de esferas de alginato o de tejido recuperado usando alcohol al 70%. Luego se mezclaron los materiales con Histogel enfriado con calcio a 4 grados (VWR, n.° de CA 60872-486). Después de endurecerse los moldes, se procesaron los bloques para la incrustación en parafina, corte y tinción según los métodos histológicos convencionales.
J. Inmunotinción histológica
Se tiñeron las muestras cortadas incrustadas en parafina para lo siguiente: insulina humana (anticuerpo anti-insulina, n.° de cat. ab7842, Abcam), péptido C humano (péptido C, n.° de cat. GN-1D4, Banco de Hibridomas de Estudios del Desarrollo, Universidad de lowa), glucagón humano (anticuerpo anti-glucagón, n.° de cat. ab82270, Abcam). Se tiñeron los núcleos celulares con DAPI (n.° de cat. D1306, Life Technologies).
Se desparafinaron los portaobjetos de parafina a través de incubaciones posteriores en los siguientes disolventes (xileno 5 min 2x 100% de<e>T<o>H 2 min x2 95 % 2 min x2 70 % 2 min x2 de agua desionizada). Se realizó la recuperación de antígenos incubando los cortes durante 30 min en PBS enfriado con hielo, y luego se bloqueó con suero de caballo al 3 % para bloquear durante 30 min. Luego se aplicaron mezclas de anticuerpos de la siguiente manera: primaria A - mezclar junto con glucagón de 1 a 200 y péptido C de 1 a 500. Primaria B - mezclar junto con insulina humana de 1 a 500 y glucagón de 1 a 200, incubar durante 2 horas y luego lavar en PBS 10 min * 4. Secundaria A - Añadir anticuerpo anti-AF594 de ratón de 1 a 500 y anticuerpo anti-AF488 de rata de 1 a 500. Secundaria B - Añadir anticuerpo anti-AF488 de cobaya de 1 a 500 con anticuerpo anti-AF594 de ratón de 1 a 500, incubar durante 30 min, luego lavar 10 min 4x. Luego se tiñeron los portaobjetos con DAPI y se montó cubreobjetos usando Prolong Gold antidecoloración (Life Technologies, Carlsbad, CA).
K. Inmunotransferencia de tipo Western
Se extrajo proteína directamente de los materiales para el análisis por inmunotransferencia de tipo Western. Para los análisis de proteínas, se prepararon los materiales recuperados sumergiendo los materiales en tampón RIPA Pierce (n.° de cat. 89901, Thermo Scientific) con inhibidores de proteasa (cóctel de un solo uso de inhibidores de proteasa Halt, n.° de cat. 78430, Thermo Scientific) en hielo, y luego se lisaron mediante sonicación (encendida durante 30 segundos, apagado durante 30 segundos, dos veces a una amplitud del 70 %). Luego se sometieron las muestras a agitación constante durante 2 horas a 4 °C. Luego se centrifugaron los lisados durante 20 min a 12.000 rpm a 4 °C, y se recogieron los sobrenadantes que contenían proteínas en tubos frescos mantenidos en hielo. En muestras de tejido de grasa, se recuperó en primer lugar un exceso de grasa (una capa superior sobre el sobrenadante) antes de la transferencia del sobrenadante. Se hirvieron 20 |ig de proteína (cuantificada mediante ensayo de BCA, kit de ensayo de BCA de proteínas Pierce, n.° de cat. 23225, Thermo Scientific) para cada carril a 95 °C durante 5 min y se sometieron a electroforesis en geles de SDS-poliacrilamida (minigel, peine de 15 pocillos Any kD, Biorad, n.° de cat. 456-9036) y luego se sometió a inmunotransferencia en membranas de nitrocelulosa (Biorad, n.° de cat. 162-0213). Se realizó el sondeo de las inmunotransferencias con anticuerpo anti-a-actina de músculo liso (dilución 1:400, anticuerpo policlonal de conejo contra alfa actina de músculo liso; n.° de cat. ab5694, AbCam), anticuerpo anti-PDX1 (dilución 1:1000, anticuerpo policlonal de conejo contra proteína homeobox pancreática y duodenal 1; n.° de cat. 06-1379, EMD Millipore), y anticuerpo anti-p-actina (dilución 1:4000, anticuerpo monoclonal anti-p-actina producido en ratón; n.° de cat. A1978, Sigma Aldrich) como control de carga seguido de anticuerpos secundarios de burro anti-IgG de conejo (dilución 1:15.000, n.° de cat. 926-32213, Li-Cor) y de cabra anti-IgG de ratón (dilución 1:15.000, n.° de cat. 926-68070, Li-Cor) conjugados con fluoróforo. Se visualizaron los complejos anticuerpo-antígeno usando detección con Odyssey (Li-Cor, n.° de serie ODY-2329) a longitudes de onda de 700 y 800 nm.
L. Análisis por FACS
Se prepararon suspensiones de célula individual de tejidos recién extirpados usando un dispositivo de disociación gentleMACS (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) según el protocolo del fabricante. Se prepararon suspensiones de célula individual en tampón de disociación PEB pasivo (PBS 1X, pH 7,2, BSA al 0,5 % y EDTA 2 mM) y se hicieron pasar las suspensiones a través de filtros de 70 |im (n.° de cat. 22363548, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Este procedimiento retiró la mayoría de las células adheridas a la superficie (>90 %). Luego se sometieron todas las poblaciones de célula individual derivadas de muestras de tejido y de material a lisis de glóbulos rojos con 5 ml de tampón de lisis 1X RBC (n.° de cat. 00-4333, eBioscience, San Diego, CA, EE. UU.) durante 5 min a 4 °C. Se terminó la reacción mediante la adición de 20 ml de 1X PBS estéril. Se centrifugaron las células restantes a 300 400 g a 4 °C y se resuspendieron en un volumen mínimo (~50 |il) de tampón de tinción de eBioscience (n.° de cat.
00-4222) para la incubación de anticuerpos. Luego se tiñeron conjuntamente todas las muestras en la oscuridad durante 25 min a 4 °C con dos de los anticuerpos monoclonales marcados de manera fluorescente específicos para los marcadores celulares CD<6 8>(1 |il (0,5 |ig) por muestra; CD68-Alexa-647, clon FA-11, n.° de cat. 11-5931, BioLegend), Ly-<6>G (Gr-1) (1 |il (0,5 |ig) por muestra; Ly-6G-Alexa-647, clon RB6-8C5, n.° de cat. 108418, BioLegend), CD11b (1 |il (0,2 |ig) por muestra; o CD11b-Alexa-488, clon M1/70, n.° de cat. 101217, BioLegend), CD19 (1 |il (0,2 |ig) por muestra; CD19-Alexa-647, clon HIB19, n.° de cat. 302222, BioLegend), o IgM (1 |il (0,2 |ig) por muestra; IgM-FITC, clon RMM-1, n.° de cat. 406505, BioLegend), CD<8>+ (1 |il (0,2 |ig) por muestra, BioLegend). Luego se añadieron dos ml de tampón de tinción de citometría de flujo de eBioscience (n.° de cat. 00-4222, eBioscience), y se centrifugaron las muestras a 400-500 g durante 5 min a 4 °C. Se retiraron los sobrenadantes mediante aspiración, y se repitió esta etapa de lavado dos veces más con tampón de tinción. Tras el tercer lavado, se resuspendió cada muestra en 500 |il de tampón de tinción de citometría de flujo y se hizo pasar a través de un filtro de 40 |im (n.° de cat. 22363547, Fisher Scientific) para el eventual análisis por FACS usando un dispositivo BD FACSCalibur (n.° de cat. 342975), BD Biosciences, San José, CA, EE. UU.). Para unos ajustes apropiados del fondo y la intensidad del láser, también se hicieron pasar controles de anticuerpo individual no teñido e IgG (marcada con Alexa-488 o Alexa-647, BioLegend).
M. Obtención de imágenes intravital
Para la obtención de imágenes intravital, se fabricaron hidrogeles que contenían células humanas de tamaños de 0,5 mm y 1,5 mm con Qdot 605 (Life technologies, Grand Island,<n>Y) y se implantaron quirúrgicamente en ratonesB6.129S6-Ccr6tm1(EGFP)Irw/Jtal como se describió anteriormente.
14 días después de la implantación, los ratones se colocaron bajo anestesia con isoflurano y se realizó una pequeña incisión en el sitio de la cirugía original para exponer las perlas. Se colocaron los ratones en un microscopio invertido y se obtuvieron imágenes usando un objetivo 25x, N.A. 1,05 en un microscopio multifotónico Olympus FVB-1000 MP a una longitud de onda de excitación de 860 nm. Se adquirieron apilamientos Z de 200 |im (pasos de 10 |im) a intervalos de 2 minutos para la serie temporal de 20-45 minutos dependiendo de la imagen. Los ratones se mantuvieron bajo anestesia con isoflurano constante y se monitorizaron durante toda la sesión de obtención de imágenes. Las imágenes obtenidas se analizaron usando el software de análisis de imágenes Velocity 3D (Perkin Elmer, Waltham, MA).
N. Pruebas de tolerancia a la glucosain vivo(GSIS)
Los ratones ayunaron durante la noche (12 horas) antes de la prueba de tolerancia a la glucosa. En el día de la prueba de tolerancia, se midieron los niveles de glucemia en ayuno y luego se inyectó a los ratones a través de la vena de la cola una disolución de glucosa 30 g/l a una dosis de 200 mg/kg. Luego se monitorizó la glucemia cada 15 minutos durante<2>horas.
O. Extirpación del páncreas y cuantificación de insulina
Después de 174 días, se sacrificaron los ratones tratados con células humanas encapsuladas en TMTD-alginato y se extirpó el páncreas de cada ratón. Se pesó cada páncreas y luego se colocó en un vial con una bola de acero inoxidable mientras se mantenían las muestras congeladas en nitrógeno líquido. Se añadió un volumen de 3 ml de etanol ácido a cada vial y se homogeneizaron las muestras en un dispositivo GenoGrinder a 1000 rpm en incrementos de 1 min hasta que se pulverizó el tejido. Se mantienen los viales de muestra en bloques de aluminio que puede colocarse en nitrógeno líquido entre cada ciclo para mantenerlos fríos. Luego se centrifugaron los viales a 2400 rpm a 4 °C durante 30 min. Se retiró el sobrenadante (que contiene ahora insulina) y se almacenó, mientras que el vial se llenó con más etanol ácido y se agitó con vórtex. Se dejaron reposar los viales durante la noche agitando a 4 °C. De nuevo, se centrifugaron los viales a 2400 rpm a 4 °C durante 30 min y se recogió el sobrenadante y se añadió al sobrenadante almacenado previamente. Se añadió de nuevo etanol ácido, se agitó con vórtex, se incubó durante la noche, se centrifugó y se recogió el sobrenadante y se combinaron. Se evaporó la disolución de sobrenadante usando un dispositivo Genevac EZ-2 plus. Se almacenaron las muestras a -80 °C hasta su uso. Antes de la cuantificación de insulina, se resuspendieron las muestras en PBS y se cuantificaron usando un kit de ELISA de insulina de ratón (n.° de catálogo de Alpco: 80-INSMS-E10) según las instrucciones del fabricante. Se repitió el mismo procedimiento para ratones C57BL/6 de tipo natural sanos y ratones C57BL/6 tratados con STZ. P. Análisis estadísticos
Los datos se expresan como media ± EEM, y N = 5 ratones por punto de tiempo y por grupo de tratamiento. Para estudios con ratas N = 3 por tratamiento. Estos tamaños de muestra se eligieron basándose en la bibliografía previa. Todos los animales se incluyeron en los análisis excepto en los casos de enfermedad o morbilidad imprevistas. Se seleccionaron al azar las cohortes de animales. Los investigadores conocían los experimentos realizados. Los datos de FACS se analizaron para determinar la significación estadística o bien mediante una prueba de la t bilateral para datos independientes o bien ANOVA de un factor con corrección de comparación múltiple de Bonferroni, a menos que se indique lo contrario, tal como se implementa en GraphPad Prism 5; *: p < 0,05, **: p < 0,001, y ***: p <<0>,<0 0 0 1>.
Los datos cuantificados mostrados son valores medios de grupo ± EEM.
II. Resultados
A. El alginato de TMTD mitiga las respuestas inmunológicas a células humanas encapsuladas.
Se ha demostrado recientemente que el tamaño de microesfera puede tener un impacto beneficioso en la resistencia a las respuestas inmunológicas a los alginatos implantados, con esferas de diámetros de 1,5 mm y mayores y alginatos de TMTD, mitigando las respuestas fibróticas tanto en roedores como en primates no humanos (Veisehet al.en prensa y Vegaset al.presentado). La estructura química del TMTD se muestra en la figura 13.
Para evaluar las respuestas inmunitarias a estas esferas, se implantaron i.p. células humanas encapsuladas en ratones C57BL/6 y se recuperaron después de 14 días. Se aislaron las células asociadas con el exterior de las esferas y se analizaron por FACS (figuras 14 y 15). Se midieron niveles de manera estadística significativamente menores de macrófagos, neutrófilos, células B y células T CD<8>+ para células humanas encapsuladas en alginato de TMTD (formulación 3) en comparación con los controles de SLG20 (formulación 1, 2). Los implantes recuperados después de 80-90 días en ratones STZ-C57BL/6J revelaron que las esferas de alginato de TMTD tenían niveles mucho menores de deposición fibrótica. La tinción de inmunofluorescencia de estas esferas recuperadas para deposición celular (DAPI, F-actina) y miofibroblastos (a-SMA) mostraron niveles significativamente menores de deposición celular en esferas de alginato de TMTD. Los análisis proteómicos de estos extractos de proteína detectaron 18 isoformas de colágeno, y<10>de las 18 proteínas de colágeno detectadas se redujeron significativamente en trasplantes de alginato de TMTD, lo que muestra adicionalmente que estos materiales son capaces de mitigar las respuestas fibróticas (figura 16).
La cuantificación mediante inmunotransferencia de tipo Western de proteína a-SMA extraída de los implantes recuperados es consistente con menores niveles de fibrosis en esferas de TMTD (figura 10).
Finalmente, consistente con estos resultados, el procesamiento histológico y la inmunotinción de agrupamientos de células humanas encapsulados en TMTD recuperados después de más de 90 días de ratones STZ-C57BL/6 revelaron agrupamientos celulares con tinción localizada conjuntamente positiva de insulina y péptido C humanos marcadores de células humanas maduras. Se observó una tinción mínima o ninguna tinción localizada conjuntamente entre el péptido C humano y glucagón o insulina humana y glucagón, consistente con las células humanas que retienen su estado de diferenciación a lo largo de todo el estudio.
A continuación se caracterizó la capacidad de las esferas de alginato de TMTD para proporcionar inmunoaislamiento de las células humanas encapsuladas. La microscopía electrónica de barrido criogénica de fractura por congelación (crio-SEM) de las esferas presentan una estructura de poro heterogénea con tamaños de poro que oscila desde submicrómetros hasta un tamaño de 1-3 |im, un intervalo capaz de impedir la permeación por las células y las proteínas grandes. La obtención de imágenes intravital de esferas trasplantadas después de 14 días en ratonesB6.129S6-Ccr6tm1(EGFP)Irw/J(donde las células T, B y dendríticas expresan EGFP) mostraron la localización de células CCR<6>+ en regiones de esferas que contienen células humanas, pero una incapacidad de estas células para entrarse en contacto e iniciar eventos citotóxicos.
B. Encapsulación de células humanas con alginato de dióxido de triazol-tiomorfolina (TMTD) permite la corrección glucémica en STZ-C57BL/6J.
Para investigar el potencial de microencapsulación de células humanas para proporcionar corrección glucémica, se usaron células en tres formulaciones diferentes: (1) microcápsulas de alginato de 500 |im usadas convencionalmente para encapsulación de islotes (Limet al.,Science 210:908-910 (1980); Calafioreet al.,Diabetes Care 29: 137-138 (2006)), (2) esferas de alginato de 1,5 mm (Veisehet al.en prensa), y (3) esferas de alginato de TMTD de 1,5 mm. Se trasplantó cada una de estas formulaciones en ratones C57BL/6J tratados con estreptozotocina (STZ) en tres dosis diferentes de agolpamientos de células humanas y se evaluaron para determinar su capacidad para reestablecer la normoglucemia. Las células humanas no encapsuladas desnudas no son capaces de proporcionar corrección glucémica en este modelo de diabetes independientemente del sitio de implantación.
La encapsulación en microcápsulas de alginato de bario de 500 |im es una formulación implementada habitualmente para el trasplante de islotes (Limet al.,Science<2 1 0>, 908-910 (1980); Calafiore,et al.,Diabetes Care 29:137-138, (2006)). Los ratones a los cuales se trasplantaron las células humanas encapsuladas en microcápsulas de 500 |im mostraron los menores niveles de control glucémico, siendo sólo la dosis más alta de agrupamientos trasplantados capaz de reestablecer la normoglucemia durante 15 días. Las células humanas encapsuladas en esferas de alginato de 1,5 mm obtuvieron mejores resultados que la formulación de microcápsulas de 500 |im, manteniéndose normoglucemia durante 20-30 días para las dos dosis mayores, consistente con los resultados anteriores obtenidos usando islotes de rata (Veisehet al. en prensa). Se logró una normoglucemia sostenida durante más de 70 días con esferas de alginato de TMTD de 1,5 mm en las tres dosis sometidas a prueba. Se midieron niveles robustos de péptido C humano en los días 21, 43 y 63 durante el transcurso de este estudio, consistentes con la función de las células humanas, mostrándose las esferas de alginato de TMTD los niveles más altos de péptido C humano.
C. Las células humanas encapsuladas soportan la normoglucemia sostenida y reactividad a la glucosa en STZ-C57BL/6J.
Para evaluar la capacidad de los trasplantes de células humanas encapsuladas en alginato de TMTD para sostener la normoglucemia, se sometió a seguimiento una cohorte de ratones con diabetes y trasplante durante<6>meses. Los ratones con trasplante mantuvieron exitosamente la corrección glucémica a lo largo de un periodo de<6>meses, y 5 coincidieron estrechamente con los niveles de glucemia de los ratones C57BL/6J de tipo natural sometidos a seguimiento a lo largo de un periodo similar. Además, se registraron niveles robustos de péptido C humano por encima de 100pmol/l en múltiples puntos en todo el estudio. También se realizó una prueba de tolerancia a la glucosa en estos ratones 150 días después del trasplante, y las células humanas encapsuladas reestablecieron la normoglucemia de manera comparable a los ratones de tipo natural. También se analizaron los niveles de insulina en el páncreas del huésped para cada cohorte para confirmar el tratamiento exitoso con STZ y una falta de regeneración endógena de células pancreáticas. Los implantes de células humanas recuperados después de<6>meses no presentaban signos de sobrecrecimiento fibrótico, con poca deposición de colágeno y celular evidente en la cápsula. Puesto que las esferas recuperadas después de 3 meses mostraron niveles de fibrosis mínimos, esto indica que el alginato de TMTD mitiga las respuestas inmunológicas alterando la cinética inmunitaria de reconocimiento/activación.
Los resultados muestran que las células humanas encapsuladas pueden lograr una corrección glucémica a largo plazo reactiva a la glucosa (más de 170 días) en un animal con diabetes inmunocompetente sin inmunosupresión. Este resultado se logró implementando una nueva formulación de alginato de TMTD que mitiga las respuestas inmunológicas a los implantes de células humanas, retrasando eficazmente la deposición fibrótica que conduce a la necrosis del tejido del implante. Esta formulación proporcionó suficiente inmunoprotección para permitir la corrección glucémica a largo plazo, a pesar de la estimulación xenogénica que estas células humanas manifiestan en un receptor roedor inmunocompetente. Estos resultados apoyan la expectación de que las células humanas encapsuladas en los alginatos modificados divulgados pueden proporcionar independencia de la insulina para pacientes que padecen de diabetes tipo 1. Estos resultados apoyan la expectación de que las células humanas encapsuladas en los alginatos modificados divulgados pueden proporcionar productos producidos por las células encapsuladas a los pacientes durante largos periodos de tiempo.

Claims (6)

  1. REIVINDICACIONES 1. Producto médico, en donde el producto médico es un dispositivo implantable, un marcapasos cardiaco, un catéter, un filtro de coágulos sanguíneos, un globo, un trasplante de endoprótesis vascular, una endoprótesis vascular biliar, una endoprótesis vascular intestinal, una endoprótesis vascular bronquial, una endoprótesis vascular esofágica, una endoprótesis vascular ureteral, un dispositivo de espiral, una malla de reparación quirúrgica, un dispositivo de revascularización transmiocárdica, un dispositivo de revascularización miocárdica percutánea, una prótesis, una válvula cardiaca, un tubo, un implante, una fibra, una membrana, un material textil, un recipiente para sangre, una placa de titulación, un medio adsorbente, un dializador, una pieza de conexión, un sensor, una válvula, un endoscopio, un filtro, una cámara de bomba, u otro dispositivo médico destinado a tener propiedades hemocompatibles, y en donde la totalidad o una porción del producto médico está recubierta con un alginato modificado que comprende uno o más monómeros modificados covalentemente definidos por la fórmula I
    Fórmula I en donde, X es oxígeno, azufre, o NR4; Ri es, independientemente en el uno o más monómeros modificados,
    -<6>- , en donde a es un número entero desde 1 hasta 30, z es un número entero desde 0 hasta 5, n es un número entero desde 1 hasta 12, m es un número entero desde 3 hasta 16, Ra se selecciona independientemente de grupo alcoxilo, amino, alquilamino, dialquilamino, hidroxilo, alquenilo, alquinilo, alquilo sustituido, alquenilo sustituido, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, sulfonilo, sulfonilo sustituido, ácido sulfónico, fosforilo, fosforilo sustituido, fosfonilo, fosfonilo sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C3-C20, cíclico C<3>-C<20>sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido, y en donde Rb es
    Fórmula XIII en donde Y<1>e Y<2>son independientemente hidrógeno o -PO(ORs)<2>; o Y<2>está ausente, e Y1, junto con los dos átomos de oxígeno a los que Y<1>e Y<2>están unidos, forman una estructura cíclica tal como se muestra en la fórmula II
    en donde R<2>y R<3>son, independientemente, hidrógeno o una agrupación orgánica que contiene cualquier número de átomos de carbono, 1-30 átomos de carbono, 1-20 átomos de carbono, o 1-14 átomos de carbono, y que opcionalmente incluye uno o más heteroátomos tales como agrupación de oxígeno, azufre, o nitrógeno en formatos estructurales lineales, ramificados, o cíclicos, siendo agrupaciones de R<2>y R<3>representativas grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C<3>-C<20>, cíclico C<3>-C<20>sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido; o R<2>y R<3>, junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un anillo carbocíclico o heterocíclico no sustituido o sustituido de 3 a<8>miembros; y R<4>y R<5>son, independientemente, hidrógeno o una agrupación orgánica que contiene cualquier número de átomos de carbono, 1-30 átomos de carbono, 1-20 átomos de carbono, o 1-14 átomos de carbono, y que opcionalmente incluye uno o más heteroátomos tales como agrupación de oxígeno, azufre, o nitrógeno en formatos estructurales lineales, ramificados, o cíclicos, siendo agrupaciones orgánicas representativas grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C<3>-C<20>, cíclico C<3>-C<20>sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido; en donde R<6>, R<8>, y R<9>son, independientemente, hidrógeno o una agrupación orgánica que contiene cualquier número de átomos de carbono, 1-30 átomos de carbono, 1-20 átomos de carbono, o 1-14 átomos de carbono, y que opcionalmente incluye uno o más heteroátomos tales como agrupación de oxígeno, azufre, o nitrógeno en formatos estructurales lineales, ramificados, o cíclicos, siendo agrupaciones orgánicas representativas grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, sulfonilo, sulfonilo sustituido, ácido sulfónico, fosforilo, fosforilo sustituido, fosfonilo, fosfonilo sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C<3>-C<20>, cíclico C<3>-C<20>sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), péptido, o polipéptido.
  2. 2. Producto médico según la reivindicación 1, en donde R<6>es -CH<2>-Ar- o -CH<2>-CH<2>-(O-CH<2>-CH<2>)<3>-; R<4>es hidrógeno; R<8>es hidrógeno, metilo, o -CH<2>-OH; y R<9>es metilo, -COCH<3>, -CH<2>-N(CH<2>-CH<3>)<2>,
  3. 3. Producto médico según la reivindicación 2, en donde R<8>es hidrógeno; y
  4. 4. Producto médico según la reivindicación 2, en donde R<8>es hidrógeno; y
  5. 5. Producto médico según la reivindicación 2, en donde R<9>es metilo, -COCH<3>, o -CH<2>-N(CH<2>-CH<3>)<2>.
  6. 6. Producto médico según la reivindicación 1, en donde X es oxígeno o NR<4>, en donde R<4>es hidrógeno, metilo, o -CH<2>-CH<3>; y R<1>es -CH<2>-CH<2>-CH<2>-CH<2>-OH, -CH<2>-CH<2>-(O-CH<2>-CH<2>)m-O-CH<3>, donde m es un número entero desde 3 hasta 16, -CH<2>-CH<2>-O-CH<2>-CH<2>-OH, -(CH<2>-CH<2>)<3>-NH-CH<3>, • 7. Producto médico según la reivindicación 1, en donde el uno o más monómeros modificados son
    <8>. Producto médico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde Yi e Y<2>son hidrógeno. 9. Producto médico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, para su uso en el tratamiento de una enfermedad o un trastorno en un paciente humano o animal, en donde el producto médico se implanta en o se trasplanta a un paciente humano o animal.
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