ES3036961T3 - Method for quantitative co-expressing multiple proteins in vitro and application thereof - Google Patents

Method for quantitative co-expressing multiple proteins in vitro and application thereof

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Abstract

Se proporciona un método para coexpresar cuantitativamente múltiples proteínas en un sistema de síntesis de proteínas libres de células in vitro, que comprende los siguientes pasos: (1) establecer una curva estándar de la relación entre la concentración de proteína estándar y el valor de luminiscencia; (2) crear un vector que contiene un gen de proteína diana y obtener un sistema de síntesis de proteínas in vitro; (3) establecer una curva de la relación entre la concentración de proteína diana y la concentración del vector; (4) calcular la concentración o/y la relación de concentración del vector que coexpresa cuantitativamente múltiples proteínas diana; (5) coexpresar cuantitativamente las proteínas diana. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Método para coexpresar cuantitativamente múltiples proteínasin vitroy aplicación del mismo
La presente solicitud reivindica prioridad sobre la solicitud de patente china n.° CN 201910460987.8 presentada el 30 de mayo de 2019.
Antecedentes de la invención
Campo técnico
La presente invención se refiere al campo de la biotecnología, y más particularmente a un método para coexpresar cuantitativamente múltiples proteínasin vitroy a la aplicación del mismo.
Descripción de la técnica relacionada
Las proteínas fluorescentes se han usado ampliamente en muchos campos de investigación de la biología. Las sondas moleculares basadas en proteínas fluorescentes y los métodos de marcaje se han convertido en herramientas de investigación importantes para estudiar macromoléculas biológicas o funciones celulares a través de imágenes dinámicas en células vivas oin vivo.Desde que en 1992 se clonó por primera vez el gen de la proteína fluorescente verde a partir de medusas, se han clonado muchas proteínas fluorescentes nuevas de muchas especies marinas y se han obtenido nuevos mutantes a partir de la modificación de proteínas fluorescentes. Estas nuevas proteínas fluorescentes y mutantes pueden “iluminar” biomoléculas o células y presentar la actividad de las biomoléculas, ayudando de ese modo a revelar la ley de actividad y la naturaleza de estas moléculas o células. Los espectros de las proteínas fluorescentes notificadas están distribuidos en toda la región visible. Esas proteínas fluorescentes se usan ampliamente en áreas tales como la expresión y regulación génicas, el posicionamiento espacial y transporte de proteínas, el plegamiento de proteínas, la transducción de señales, el análisis de la actividad de las proteasas, y la interacción biomolecular. El descubrimiento y la aplicación de las proteínas fluorescentes proporcionan un poderoso medio de investigación para el estudio de la biología moderna.
Debido a los avances en biotecnología, los biólogos de síntesis son capaces de transformar de manera rápida y fiable sistemas biológicos y diseñar y producir macromoléculas biológicas, especialmente diseñar y producir macromoléculas de proteínas con funciones biológicas. En el desarrollo de la biología de síntesis en los últimos años, las proteínas se obtienen por ingeniería principalmente dentro de células, actuando las células como huéspedes, pero su obtención por ingeniería dentro de las células es una tarea que requiere mucho tiempo y es difícil. Esto se debe a que el proceso de crecimiento y adaptabilidad celular es habitualmente incompatible con el objetivo de diseño por ingeniería y la modificación de los componentes biológicos está muy limitada debido a la complejidad de los sistemas de células vivas, la dificultad de estandarización de los elementos genéticos, y la barrera creada por la membrana celular. Frente a estas limitaciones, se intenta explorar nuevas direcciones de desarrollo, que promuevan el desarrollo de una nueva disciplina de tecnología de ingeniería, es decir, la biología de síntesis libre de células. La biología de síntesis libre de células implica una tecnología emergente: el sistema de síntesis libre de células, también conocido como sistema de síntesisin vitro,que comprende la transcripción y traducciónin vitro.En el sistema de síntesis de proteínas libre de células, el ARNm o ADN exógeno diana actúa como molde para la síntesis de proteínas, y los sustratos y los factores proteicos relacionados con la transcripción y la traducción necesarios para la síntesis de proteínas se controlan manualmente para sintetizar las proteínas diana. El sistema de síntesis de proteínas libre de células elimina las etapas de construcción de plásmidos, transformación, cultivo celular, recolección de células, y fragmentación para sintetizar y expresar proteínas. Por tanto, es una forma rápida, cómoda y que ahorra tiempo de expresar proteínas.
Debido a las propiedades de las proteínas fluorescentes, las proteínas fluorescentes juegan un papel importante e irreemplazable en la investigación biológica. Cómo coexpresar cuantitativamente múltiples proteínasin vitroes un problema técnico importante al que se hace frente actualmente. Después de investigar y recuperar bibliografía, no se encontró ningún informe sobre la coexpresión cuantitativa de múltiples proteínas en el mismo sistema de reacción usando tecnología de síntesis de proteínas libre de célulasin vitro.Después de muchos experimentos e investigaciones sobre la presente invención, se ha descubierto cómo coexpresar cuantitativamente múltiples proteínas fluorescentes ajustando el volumen o la concentración del ADN molde. Puede usarse para moléculas indicadoras fluorescentes de alta eficiencia, la investigación y el desarrollo de células u organismos marcados con fluorescencia para diversas investigaciones u otros fines, y similares.
Sumario de la invención
En la presente invención se da a conocer un método para coexpresar cuantitativamente múltiples proteínasin vitro.En este método, es posible coexpresar cuantitativamente múltiples proteínas en el mismo sistema de reacción según la relación proporcional de concentración y dosis del molde (preferiblemente molde de ADN) de la proteína diana.
Según el primer aspecto, la presente invención proporciona un método para coexpresar cuantitativamente múltiples proteínasin vitro,que comprende las etapas de:
(1) Establecer una curva de calibración.
Establecer una curva de calibración de la relación entre la concentración de cada una de las proteínas patrón y el respectivo valor de luminiscencia.
En la etapa (1), según los tipos de múltiples proteínas diana que van a coexpresarse, se proporciona una proteína patrón correspondiente a cada proteína diana; cada una de las múltiples proteínas diana es independientemente una proteína con una función luminosa, y las múltiples proteínas diana pueden distinguirse entre sí basándose en las propiedades de luminiscencia, y pueden detectarse por separado “sin interferencia mutua”, por tanto, puede lograrse la detección cuantitativa de cada proteína diana.
En particular, la proteína patrón en la etapa (1) es una muestra patrón de las proteínas diana. Puede obtenerse mediante la separación y purificación de las proteínas diana después de su síntesis, o es posible adquirir productos puros analíticos disponibles comercialmente.
(2) Crear respectivamente vectores que contienen diferentes genes de proteínas diana, respectivamente para expresar múltiples proteínas diana diferentes.
La expresión “vectores que contienen genes de proteínas diana” significa que los vectores contienen secuencias codificantes de las proteínas diana, y también pueden denominarse “vectores de las proteínas diana”. Por ejemplo, los “vectores que codifican para la proteína GFP” pueden denominarse simplemente “vectores de GFP”. En esta etapa, se crean vectores separados que contienen genes de proteínas diana para expresar cada una de las proteínas diana respectivamente. Para cada una de las proteínas diana, se crea un vector separado que contiene su secuencia codificante, y las proteínas diana se expresan independientemente en un sistema de coexpresión a través de sus respectivos vectores separados.
(3) Establecer una ecuación de relación cuantitativa entre el porcentaje de concentración de cada una de las proteínas diana y el porcentaje de concentración de un vector correspondiente.
Los vectores separados que contienen los genes de proteína diana en la etapa (2) se añaden a un sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitroa diferentes razones de concentración para la reacción de síntesis de proteínasin vitro,es decir, la reacción de incubación, para sintetizar las múltiples proteínas diana; después de un tiempo de reacción especificado, se obtiene un valor de luminiscencia para cada proteína diana en una disolución de reacción; la concentración de cada producto de proteína diana se obtiene según la curva de calibración mostrada en la etapa (1), y se obtiene una ecuación de relación cuantitativa entre el porcentaje de concentración de cada producto de proteína diana y el porcentaje de concentración de un vector correspondiente mediante ajuste; en el sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitro,la concentración total de los vectores permanece igual.
Cuando los vectores separados que contienen los genes de proteína diana se añaden a diferentes razones de concentración, en el sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitro,la concentración total del vector durante múltiples reacciones de proteínasin vitropermanece igual.
La concentración total del vector se refiere a la suma de las concentraciones de vectores de todas las proteínas diana en el sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitro.
(4) Calcular la concentración y la razón de concentración de los vectores necesarias para coexpresar cuantitativamente las múltiples proteínas.
La relación de razón de concentración del producto (tal como la relación de razón de concentración en masa) de las múltiples proteínas diana que va a lograrse se establece como la razón de concentración diana de las múltiples proteínas diana; la concentración y la razón de concentración del vector para cada una de las múltiples proteínas diana que van a expresarse se calculan usando la ecuación establecida en la etapa (3).
(5) Coexpresar cuantitativamente las múltiples proteínas.
Según la concentración y/o la razón de concentración requerida de cada vector de proteína diana obtenido en la etapa (4), se añade una cantidad correspondiente del vector separado de cada proteína diana al sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitrotal como se describe en la etapa (3), y las múltiples proteínas diana coexpresadas se obtienen después de hacerse reaccionar durante el periodo de tiempo específico definido en la etapa (3).
Las múltiples proteínas diana son cada una independientemente una proteína luminiscente o una proteína de fusión que porta un marcador luminiscente.
Cuando la concentración de cada vector separado de proteína diana en cada disolución madre es la misma, la dosificación también puede controlarse simplemente por volumen o razón en volumen. Los ejemplos son tal como sigue:
Un método para coexpresar cuantitativamente múltiples proteínasin vitro,que comprende las etapas de: (1) establecer una curva de calibración: establecer una curva de calibración de la relación de concentración de proteína-intensidad de luminiscencia para cada proteína coexpresada usando la proteína patrón correspondiente; (2) crear vectores separados y disoluciones madre de los mismos que contienen cada gen de proteína diana para expresar cada proteína diana respectivamente, en donde la concentración de los vectores separados de cada proteína diana en cada disolución madre es la misma; (3) establecer una ecuación de relación cuantitativa entre el porcentaje de concentración de cada proteína diana y el porcentaje de volumen de un vector correspondiente; en donde los vectores separados que contienen los genes de proteína diana en la etapa (2) se añaden al sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitroa diferentes razones en volumen para la reacción de síntesis de proteínasin vitro;después de un tiempo de reacción especificado, se obtiene un valor de luminiscencia para cada proteína diana en una disolución de reacción; la concentración de cada producto de proteína diana se calcula según la curva de calibración mostrada en la etapa (1), y se obtiene la ecuación de relación cuantitativa entre el porcentaje de concentración de cada proteína diana y el porcentaje de volumen del vector correspondiente mediante ajuste; en el sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitro,la concentración total de los vectores permanece igual; (4) calcular el volumen del vector, y la correspondiente razón en volumen requerida para coexpresar cuantitativamente las múltiples proteínas; en donde, según la relación de razón de concentración diana de las múltiples proteínas diana que van a expresarse, el volumen y la razón en volumen del vector requeridos para cada una de las múltiples proteínas diana que van a expresarse se calculan usando la ecuación establecida en la etapa (3); (5) coexpresar cuantitativamente las múltiples proteínas; en donde, según el volumen y la razón en volumen requeridos para cada vector de proteína diana obtenido en la etapa (4), se añade una cantidad correspondiente del vector separado de cada proteína diana al sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitrotal como se describe en la etapa (3), y las múltiples proteínas diana coexpresadas se obtienen después de hacerse reaccionar durante el periodo de tiempo específico definido en la etapa (3); en donde las múltiples proteínas diana son, cada una, independientemente una proteína luminiscente o una proteína de fusión que porta un marcador luminiscente.
El sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitrocomprende al menos los componentes requeridos para la síntesis de proteínas, excepto el molde. El sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitropuede o no comprender el molde. El sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitrotambién puede prepararse en un laboratorio o puede ser un producto disponible comercialmente.
Como una de las realizaciones preferidas, el sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitrocomprende: (a) extracto de células de levadura;
(b) polietilenglicol;
(c) sacarosa exógena opcional; y
(d) disolvente opcional, en donde el disolvente es agua o disolvente acuoso.
En donde, la célula de levadura puede derivar de células de tipo natural o de células modificadas genéticamente. En donde, la palabra “opcional” en los componentes (c) y (d) se refiere a ser prescindible, y los componentes (c) y (d) son, cada uno, independientemente prescindibles.
En una realización preferida, el sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitrocomprende: extracto de células de levadura, trihidroximetilaminometano (Tris), acetato de potasio, acetato de magnesio, mezcla de trifosfatos de nucleósido (NTP), mezcla de aminoácidos, fosfato de potasio, amilasa, polietilenglicol, maltodextrina, etc.
En otra realización preferida, el sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitroproporcionado en la presente invención comprende: extracto de células de levadura, Tris, acetato de potasio, acetato de magnesio, mezcla de trifosfatos de nucleósido (NTP), mezcla de aminoácidos, fosfato de potasio, amilasa, polietilenglicol, maltodextrina, ADN de proteína fluorescente, etc.
En la presente invención, la proporción del extracto de células de levadura en el sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitrono está particularmente limitada. Generalmente, el contenido en volumen del extracto de células de levadura en el sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitroestá en un intervalo del 20 %-70 %, preferiblemente, en un intervalo del 30 %-60 %, más preferiblemente, en un intervalo del 40 %-50 %. Preferiblemente, el valor de luminiscencia de cada proteína diana en la etapa (3) no se ve interferido por otras proteínas en la longitud de onda de emisión máxima.
La concentración en el porcentaje de concentración de cada proteína diana en la etapa (3) se refiere a la concentración final de cada proteína diana sintetizada en la disolución de reacción después de un periodo de reacción desde que se añade el molde en el sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitro,es decir, la concentración de cada producto de proteína diana. Preferiblemente, la concentración se refiere a la concentración de cada proteína diana en la disolución de reacción después de que la reacción dure 16-23 horas. Preferiblemente, el tiempo de reacción en la etapa (5) es coherente con el tiempo de reacción definido en la etapa (3).
Más preferiblemente, los vectores de la etapa (2) son plásmidos que contienen secuencias codificantes de proteínas diana. Es decir, los vectores separados que contienen el gen de la proteína diana respectivo son plásmidos que contienen las secuencias codificantes de proteínas diana correspondientes, respectivamente. En otra realización preferida, el sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitroen la etapa (3) es uno seleccionado del grupo que consiste en un sistema de síntesis de proteínasin vitrobasado en células de levadura, un sistema de síntesis de proteínasin vitrobasado enEscherichia coli,un sistema de síntesis de proteínasin vitrobasado en células de mamífero, un sistema de síntesis de proteínasin vitrobasado en células de planta, un sistema de síntesis de proteínasin vitrobasado en células de insecto, y combinaciones de los mismos.
En otra realización preferida, la célula de levadura se selecciona del grupo que consiste enSaccharomyces cerevisiae, Pichia pastorisyKluyveromyces,y combinaciones de las mismas.
En otra realización preferida, el valor de luminiscencia es un valor de unidad de fluorescencia relativa (UFR). Preferiblemente, cuando se somete a prueba una determinada proteína que va a someterse a prueba entre una pluralidad de proteínas, el valor de luminiscencia de la proteína que va a someterse a prueba no se ve interferido por otras proteínas en la disolución cuando la proteína se somete a prueba en las condiciones de la longitud de onda de excitación máxima y la longitud de onda de emisión máxima de la proteína y adecuadas para el uso de filtros ópticos.
En algunas realizaciones preferidas, el marcador luminiscente es un poliaminoácido (que tiene al menos 2 unidades de aminoácidos) con función luminiscente, y puede ser un péptido o una proteína.
En otra realización preferida, la proteína diana es una proteína luminiscente. La proteína luminiscente se selecciona del grupo que consiste en proteína luminiscente natural, proteína luminiscente modificada y proteína luminiscente que contiene proteína de fusión, y combinaciones de las mismas.
En otra realización preferida, la proteína luminiscente es una proteína fluorescente. La proteína fluorescente se selecciona del grupo que consiste en proteína fluorescente natural, proteína fluorescente modificada y proteína fluorescente que contiene proteína de fusión, y combinaciones de las mismas.
En otra realización preferida, la proteína fluorescente es proteína fluorescente roja, proteína fluorescente naranja, proteína fluorescente amarilla, proteína fluorescente verde, proteína fluorescente cian, proteína fluorescente azul o proteína fluorescente púrpura.
En otra realización preferida, el método para coexpresar cuantitativamente múltiples proteínasin vitrocomprende además la separación y/o purificación de las proteínas diana, es decir, comprende al menos uno de los siguientes procedimientos: aislamiento de las proteínas diana, y purificación de las proteínas diana.
Según el segundo aspecto, la presente invención proporciona un uso del sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitroen el método para coexpresar cuantitativamente múltiples proteínasin vitrosegún el primer aspecto de la invención.
Según el tercer aspecto, la presente invención proporciona una o una pluralidad de proteínas fluorescentes expresadas mediante el uso del sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitro,en donde la pluralidad de proteínas fluorescentes se coexpresan en el mismo sistema de reacción.
Las principales ventajas de la presente invención incluyen:
(1) Por primera vez, la invención proporciona un método para coexpresar cuantitativamente múltiples proteínasin vitro.En este método, las proteínas múltiples se sintetizan usando un sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitro,que es simple, eficiente y rápido. Cuando se usa para sintetizar proteínas fluorescentes, puede generarse una intensidad de fluorescencia medible, detectable visualmente a simple vista. En comparación con los métodos convencionales, puede monitorizar proteínas expresadas en tiempo real de manera eficiente e intuitiva y permite simplificar fenómenos complejos.
(2) Se proporciona un método para coexpresar cuantitativamente múltiples proteínas fluorescentes, es decir, un método para sintetizar simultáneamente múltiples proteínas en el mismo sistema. En este método, las proteínas diana pueden sintetizarse cuantitativamente a una razón preestablecida.
(3) El método descrito en el presente documento puede usarse para sintetizar proteínas terapéuticas. Por ejemplo, el método puede configurarse para coexpresar cuantitativamente la proteína de cadena pesada y la proteína de cadena ligera de anticuerposin vitropara sintetizar la proteína de cadena pesada y la proteína de cadena ligera de anticuerpos a una razón.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es un gráfico que ilustra esquemáticamente la determinación del valor de unidad de fluorescencia relativa (UFR) de la proteína fluorescente sintetizadain vitrocuando la longitud de onda Ex/Em (excitación/emisión) máxima es de 488/507 nm para reconocer la serie verde (que contiene cian, verde, y amarillo). La figura 1 muestra el valor de UFR total (es decir, el valor de UFR de la disolución de reacción después de que se completa la reacción) de múltiples proteínas fluorescentes (incluyendo 19 proteínas, por ejemplo, moxCerulean3, AmCyan1, MiCy, mEGFP, Clover, mVenus, ZsYellow1 y mEos3.2) y el valor de UFR del sobrenadante de las proteínas sometidas a centrifugación, en donde el nivel de expresión de AmCyan1 y ZsYellow1 en el sobrenadante es relativamente menor.
La figura 2 es un gráfico que ilustra esquemáticamente la determinación del valor de unidad de fluorescencia relativa (UFR) de la proteína fluorescente sintetizadain vitrocuando la longitud de onda Ex/Em (excitación/emisión) máxima es de 569/593 nm para reconocer la serie roja (que contiene rojo, mandarina y rojo lejano). La figura 2 muestra el valor de UFR total (es decir, el valor de UFR de la disolución de reacción después de que se completa la reacción) de múltiples proteínas fluorescentes (incluyendo 17 proteínas, por ejemplo, mKO2, TurboRFP, tdTomato, eqFP611, mKate1.3, mNeptune2 y miRFP670) y el valor de UFR del sobrenadante de las proteínas sometidas a centrifugación, en donde el nivel de expresión de TurboRFP en el sobrenadante es relativamente menor.
La figura 3 muestra los resultados de la obtención de imágenes de fluorescencia de 9 proteínas. La figura 3a muestra un resultado de la obtención de imágenes de fluorescencia cuando la luz de excitación y la luz de emisión tienen una longitud de onda de 430 nm y 535 nm, respectivamente. La figura 3b muestra un resultado de la obtención de imágenes de fluorescencia cuando la luz de excitación y la luz de emisión tienen una longitud de onda de 530 nm y 605 nm, respectivamente. Según el peso molecular único que figura en la tabla 1, junto con el peso molecular mostrado por la proteína mediante electroforesis SDS-PAGE en la figura 3, se analizó la estructura agregada de la proteína, en donde AmCyan1 y ZsGreen son estructuras de tetrámero, MiCy es una estructura de dímero, y moxCerulean3, Clover, mVenus, mKO2, tdTomato, y mKate1.3 son estructuras de monómero.
La figura 4 muestra los resultados de la obtención de imágenes en gel de la tinción con azul brillante de Coomassie de la proteína purificada antes de la optimización de la purificación con perlas de Ni. Los resultados muestran que sólo las proteínas mAmetrine y mEOS3.2 obtienen una única proteína de alta pureza, y las bandas purificadas de AmCyan1, ZsGreen, MiCy, moxCerulean3, Clover, mVenus, mKO2, tdTomato, mKate1.3, mTagBFP2, ZsYellow1, mNeptune2 y PAmCherry son correctas y claramente visibles, y todas contienen proteínas de impureza, en donde la banda de miRFP670 es débil y eqFP611 no obtiene bandas purificadas. La figura 5 muestra los resultados de la obtención de imágenes en gel de la tinción con azul brillante de Coomassie de la proteína purificada después de la optimización de la purificación con perlas de Ni, en donde las proteínas purificadas comprenden 18 proteínas, a saber, AmCyan1, ZsGreen, MiCy, moxCerulean3, Clover, mVenus, mKO2, tdTomato, mKate1.3, mTagBFP2, ZsYellow1, mEOS3.2, TurboRFP, eqFP611, mNeptune2, miRFP670, mAmetrine y PAmCherry, y a excepción de tdTomato, todas las proteínas mencionadas anteriormente obtienen proteínas individuales de alta pureza. Los resultados de la tinción con azul brillante de Coomassie muestran que el tamaño de la banda es correcto y claramente visible, pero las bandas de eqFP611 y miRFP670 son débiles.
La figura 6 muestra la relación entre la concentración de una proteína y el valor de unidad de fluorescencia relativa (UFR). Tomando como ejemplos las proteínas fluorescentes tdTomato, Clover y MiCy, la concentración de una sola proteína está correlacionada positivamente con el valor de UFR, y la relación es sustancialmente lineal.
La figura 7 muestra la relación entre la razón de molde de ADN y el valor de unidad de fluorescencia relativa (UFR) cuando una proteína se expresa sola. Tomando como ejemplos las proteínas fluorescentes tdTomato, Clover y MiCy, cuando tdTomato, Clover o MiCy se expresan solas, el rendimiento proteico no está necesariamente asociado con la cantidad de molde. La razón de molde en este caso se refiere a una serie de diferentes razones obtenidas al diluir la concentración de la disolución de molde en diferentes grados según el valor de concentración al 100 % tal como se presenta en la figura.
La figura 8 muestra la relación entre la razón de molde de una proteína en un sistema donde se coexpresan dos proteínas y el valor de unidad de fluorescencia relativa (UFR). Cuando se coexpresan dos proteínas, tales como tdTomato y Clover, en el mismo sistema de reacción, el rendimiento proteico se correlaciona positivamente con la cantidad de molde, y la relación es sustancialmente lineal. La razón de molde en este caso se refiere a una serie de razones diferentes de la cantidad de molde de una de las proteínas en relación con la cantidad total de moldes de las dos proteínas coexpresadas.
La figura 9 muestra la relación entre la razón de molde de una proteína en un sistema donde se coexpresan tres proteínas, y el valor de unidad de fluorescencia relativa (UFR). Cuando se coexpresan tres proteínas, tales como tdTomato, Clover y mKate1.3, el rendimiento proteico se correlaciona positivamente con la cantidad de molde y la relación es sustancialmente lineal. A1, B1, C1, D1, E1, F1, G1 representan las razones de molde Clover:tdTomato:mKatel.3 que son 1:1:1, 1:2:3, 1:3:2, 2:1:3, 2:3:1, 3:1:2, 3:2:1, respectivamente; y A2, B2, C2, D2, E2, F2, G2 representan las razones de molde Clover:tdTomato:mNeptune2 que son 1:1:1, 1:2:3, 1:3:2, 2:1:3, 2:3:1, 3:1:2, 3:2:1, respectivamente, tal como se muestra en la figura 9. La razón de molde en este caso se refiere a una serie de diferentes razones de la cantidad de molde de una de las proteínas en relación con la cantidad total de moldes de las tres proteínas coexpresadas.
La figura 10 es un diagrama de flujo de un procedimiento para sintetizar proteínas fluorescentes. Se sintetizan 18 proteínas fluorescentes usando un sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitroy las proteínas sintetizadas se purifican para obtener proteínas fluorescentes de diferentes colores. Las proteínas fluorescentes obtenidas tienen una alta pureza y son visibles a simple vista.
La figura 11 muestra un perfil del plásmido pD2P. El plásmido pD2P tiene una longitud de 6384 pb, y comprende los siguientes elementos: elemento promotor (no marcado en la figura), 5'UTR (incluyendo potenciador Omega), secuencia codificante del péptido señal (SP12), gen codificante de proteína diana, terminador LAC4, sitio de clonación múltiple (MCS), terminador T7, origen de replicación (flori), promotor AmpR, gen de resistencia a la ampicilina (gen AmpR), origen de replicación de alto número de copias (ori), gen que controla el número de copias del plásmido (gen rop), promotor lacI, secuencia codificante de lacI, etc.
Descripción detallada
Términos
Tal como se usa en el presente documento, “sistema de síntesis de proteínasin vitro’’,“sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitro"y “sistema de síntesis de proteínas libre de células” tienen el mismo significado y pueden usarse de manera intercambiable.
Tal como se usa en el presente documento, el término “gen” se refiere a una secuencia de nucleótidos que codifica para una determinada proteína. El término “gen” comprende la secuencia codificante (CDS) de la proteína.
La secuencia codificante se abrevia como CDS. La secuencia de nucleótidos corresponde completamente al codón de la proteína y no contiene otras secuencias que no correspondan a la proteína (no se consideran los cambios de secuencia durante el procesamiento del ARNm ni otros procedimientos).
Tal como se usa en el presente documento, la expresión “que tiene una función luminosa” se refiere a tener fotosensibilidad y permite emitir luz de una longitud de onda detectable. Según las propiedades de luminiscencia, la luz emitida en el presente documento incluye, pero no se limita a, fluorescencia, fosforescencia, luz ultravioleta, luz infrarroja, y similares. Según el principio de luminiscencia, la función luminosa puede ser fotoluminiscencia, quimioluminiscencia, autoluminiscencia, etc.
En la presente invención, el método de caracterización de la concentración de sustancias no está particularmente limitado, siempre que la cuantificación pueda lograrse usando los siguientes métodos, que incluyen, pero no se limitan a, concentración de masa, concentración molar, concentración de volumen de masa y concentración de volumen. Para proteínas, vectores y otras sustancias, puede usarse de manera independiente una forma de concentración adecuada para la caracterización y cuantificación.
Tal como se usa en el presente documento, “concentración de proteína diana” es preferiblemente concentración de masa o concentración de volumen de masa, y también pueden seleccionarse otras formas de concentración cuantificables, tales como la concentración molar.
Tal como se usa en el presente documento, “múltiple” significa dos o más.
Tal como se usa en el presente documento, “múltiples veces” significa dos veces o más.
Tal como se usa en el presente documento, “opcional” significa que no es necesariamente una realización de la presente invención, pero puede aplicarse selectivamente dependiendo de las soluciones técnicas de la presente invención. Y si es adecuado para las soluciones técnicas de la invención se toma como base de selección. Tal como se usa en el presente documento, “combinaciones de los mismos” significa cualquier combinación adecuada, incluyendo al menos dos de los objetos enumerados anteriormente.
Debe entenderse que las características técnicas mencionadas anteriormente de la presente invención y las características técnicas descritas específicamente a continuación (tal como en los ejemplos) pueden combinarse entre sí para formar una solución técnica nueva o preferida.
Sistema de síntesis de proteínasin vitro
En algunas realizaciones preferidas, la invención proporciona un sistema de síntesis de proteínasin vitro,que comprende:
(a) extracto de células; preferiblemente, extracto de células de levadura;
(b) cualquier agente de aglomeración adecuado, por ejemplo, polietilenglicol;
(c) sacarosa exógena opcional; y
(d) disolvente opcional, en donde el disolvente es agua o disolvente acuoso.
La palabra “opcional” en los componentes (c) y (d) representa cada uno independientemente que los componentes (c) y (d) son prescindibles.
En una realización preferida, el sistema de síntesis de proteínasin vitrosegún la presente invención comprende extracto de células de levadura, Tris, acetato de potasio, acetato de magnesio, mezcla de trifosfatos de nucleósido (NTP), mezcla de aminoácidos, fosfato de potasio, amilasa, polietilenglicol, maltodextrina, etc. Pueden añadirse ADN de proteína fluorescente y otras sustancias al sistema de síntesis de proteínasin vitropara reacciones de síntesis de proteínasin vitro.
En la presente invención, la proporción del extracto de células de levadura en el sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitrono está particularmente limitada. Generalmente, el contenido en volumen del extracto de células de levadura en el sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitroestá en un intervalo del 20 %-70 %, preferiblemente, en un intervalo del 30 %-60 %, más preferiblemente, en un intervalo del 40 %-50 %. En la presente invención, el extracto de células preferiblemente no contiene células intactas. Pueden seleccionarse técnicas de preparación de extractos de células adecuadas para preparar el extracto de células. La preparación del extracto de células generalmente comprende al menos las siguientes etapas: proporcionar una cantidad adecuada de células de levadura, romper las células, realizar una separación sólido-líquido, y recoger el sobrenadante. El producto de extracción obtenido según el método de preparación del extracto de células puede tener una cantidad pequeña o muy pequeña de células intactas restantes, y este tipo de producto de extracción también se encuentra dentro del alcance del extracto de células de la presente invención. El extracto de células no excluye la presencia de células intactas.
El sistema de síntesis de proteínasin vitrode la presente invención tampoco excluye la existencia de células intactas siempre que no afecte a la realización del propósito de la presente invención, es decir, no afecte a la realización de la coexpresión cuantitativa. Existen muchos factores detrás de la presencia de esas células intactas. Las células intactas pueden ser residuos provocados por el procedimiento de preparación del extracto de células, o pueden introducirse intencionalmente, por ejemplo, los fragmentos de células obtenidos por simple fragmentación de células añadidas pueden ser una mezcla del producto completamente fragmentado y las células intactas; o las células intactas están presentes debido solamente a la adición de células intactas.
Un extracto de células típico (incluyendo el extracto de células de levadura) comprende ribosoma, ARNt y aminoacil ARNt sintetasa para la traducción de proteínas, factores de iniciación, factores de elongación y factores de liberación de terminación necesarios para la síntesis de proteínas. Además, el extracto de células (incluyendo el extracto de células de levadura) también comprende algunas otras proteínas derivadas del citoplasma, especialmente proteínas solubles.
En algunas realizaciones preferidas, el extracto de células de levadura es extracto de células deKluyveromyces.En algunas realizaciones preferidas,Kluyveromycesse selecciona del grupo que consiste enKluyveromyces lactis (K. lactis), Kluyveromyces lactisvar.drosophilarum, Kluyveromyces lactisvar.lactis, Kluyveromyces marxianus, Kluyveromyces marxianusvar.lactis, Kluyveromyces marxianusvar.marxianus, Kluyveromyces marxianusvar.vanudenii, Kluyveromyces dobzhanskii, Kluyveromyces aestuarii, Kluyveromyces nonfermentans, Kluyveromyces wickerhamii, Kluyveromyces thermotolerans, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces hubeiensis, Kluyveromyces polysporus, Kluyveromyces siamensis, Kluyveromyces yarrowii,y combinaciones de los mismos. Los componentes proteicos (por ejemplo, ARN polimerasa) requeridos en el sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitropueden proporcionarse de manera endógena o añadirse de manera exógena. Cuando se proporcionan de manera endógena, permite hacerse referencia a métodos de modificación genética proporcionados en los siguientes documentos existentes y documentos citados, incluyendo, pero sin limitarse a: CN108690139A, CN109423496A, CN106978439A, CN110408635A, CN110551700A, CN110093284A, CN110845622A, CN110938649A, CN2018116198190, “Molecular and Cellular Biology, 1990,10(1):353-360”. Estos métodos comprenden la inserción de las secuencias codificantes en un plásmido episomal intracelular, la integración del gen codificante en el genoma celular, o una combinación de las mismas. Cuando se proporcionan de manera exógena, su contenido puede controlarse y ajustarse según lo requiera el sistema.
En algunas realizaciones preferidas, el sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitrocomprende: extracto de células de levadura, Tris, acetato de potasio, acetato de magnesio, mezcla de trifosfatos de nucleósido (NTP), mezcla de aminoácidos, fosfato de potasio, azúcar (uno cualquiera de glucosa, sacarosa, maltodextrina y combinaciones de las mismas, y cuando contiene maltodextrina, preferiblemente también contiene amilasa), polietilenglicol, ARN polimerasa, etc. La ARN polimerasa puede proporcionarse de manera endógena o añadirse de manera exógena. Una de las formas más preferidas de la ARN polimerasa es la ARN polimerasa T7.
En algunas realizaciones preferidas, el sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitrocomprende ARN polimerasa añadida de manera exógena.
En algunas realizaciones preferidas, el sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitrocomprende ARN polimerasa T7 añadida de manera exógena.
En algunas realizaciones preferidas, el sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitrocomprende extracto de células deKluyveromyces lactisy ARN polimerasa T7 añadida de manera exógena. En algunas realizaciones preferidas, la concentración de la ARN polimerasa T7 está en un intervalo de 0,01-0,3 mg/ml. En otras realizaciones preferidas, la concentración de la ARN polimerasa T7 está en un intervalo de 0,02-0,1 mg/ml. En otras realizaciones preferidas, la concentración de la<a>R<n>polimerasa T7 está en un intervalo de 0,027-0,054 mg/ml. En otras realizaciones preferidas, la concentración de la ARN polimerasa T7 es de 0,04 mg/ml.
En la presente invención, el contenido proteico del extracto de células de levadura está preferentemente en un intervalo de 20 mg/ml-100 mg/ml, y más preferentemente en un intervalo de 50 mg/ml-100 mg/ml. El método para medir el contenido proteico es el ensayo con azul brillante de Coomassie.
La mezcla de trifosfatos de nucleósido en el sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitrocomprende preferiblemente trifosfato de adenosina, trifosfato de guanosina, trifosfato de citidina y trifosfato de uridina. En la presente invención, no existe limitación en cuanto a la concentración de diversos mononucleótidos. Generalmente, la concentración de cada mononucleótido está en un intervalo de desde 0,5 mM hasta 5 mM, preferiblemente en un intervalo de desde 1,0 mM hasta 2,0 mM.
La mezcla de aminoácidos en el sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitropuede comprender aminoácidos naturales o no naturales, y puede incluir aminoácidos de tipo D o aminoácidos de tipo L. Los aminoácidos representativos incluyen, pero no se limitan a, 20 tipos de aminoácidos naturales que incluyen: glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, prolina, triptófano, serina, tirosina, cisteína, metionina, asparagina, glutamina, treonina, ácido aspártico, ácido glutámico, lisina, arginina e histidina. La concentración de cada aminoácido está habitualmente en un intervalo de desde 0,01 mM hasta 0,5 mM, preferiblemente, en un intervalo de desde 0,02 mM hasta 0,2 mM, tal como, por ejemplo, de 0,05 mM, 0,06 mM, 0,07 mM y 0,08 mM. En algunas realizaciones preferidas, el sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitrocomprende además polietilenglicol (PEG) o análogos del mismo. La concentración de polietilenglicol o análogos del mismo no está particularmente limitada. Generalmente, la concentración (p/v) de polietilenglicol o análogos del mismo está en un intervalo de desde el 0,1 % hasta el 8 %, preferiblemente, en un intervalo de desde 0,5 % hasta el 4 %, más preferiblemente, en un intervalo de desde el 1 % hasta el 2 %, basándose en el volumen total del sistema de síntesis de proteínas. Los ejemplos representativos de PEG incluyen, pero no se limitan a, PEG3000, PEG8000, PEG6000 y PEG3350. Debe entenderse que el sistema según la presente invención puede comprender además polietilenglicol con otros pesos moleculares diversos (tales como PEG 200, 400, 1500, 2000, 4000, 6000, 8000, 10000, etc.).
En algunas realizaciones preferidas, el sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitrocomprende además sacarosa. La concentración de sacarosa no está particularmente limitada. Generalmente, la concentración (p/v) de sacarosa está en un intervalo de desde el 0,2 % hasta el 4 %, preferiblemente, en un intervalo de desde el 0,5 % hasta el 4 %, más preferiblemente, en un intervalo de desde el 0,5 % hasta el 1 %, basándose en el volumen total del sistema de síntesis de proteínas.
Además del extracto de levadura, algunos sistemas de síntesis de proteínas libre de célulasin vitroparticularmente preferidos comprenden además los siguientes componentes: Tris 22 mM (pH 8), acetato de potasio 30-150 mM, acetato de magnesio 1,0-5,0 mM, mezcla de trifosfatos de nucleósido 1,5-4 mM, mezcla de aminoácidos 0,08-0,24 mM, fosfato de potasio 20-25 mM, 0,001-0,005 mg/ml de amilasa, el 1 %-4 % de polietilenglicol, maltodextrina 320-360 mM (basándose en la cantidad molar de la unidad de glucosa), 8-25 ng/|jl de ADN de proteína fluorescente, etc. Además, el volumen total del sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitroestá en un intervalo de desde 10 j l hasta 10000 jl, en un intervalo de desde 15 j l hasta 100 jl, preferiblemente 30 jl. El extracto de levadura es, preferiblemente, extracto de células deKluyveromyces,y más preferiblemente, extracto de células deKluyveromyces lactis.
Además del extracto de levadura, algunos sistemas de síntesis de proteínas libre de célulasin vitroparticularmente preferidos comprenden además los siguientes componentes: Tris 22 mM (pH 8), acetato de potasio 30-150 mM, acetato de magnesio 1,0-5,0 mM, mezcla de trifosfatos de nucleósido 1,5-4 mM, mezcla de aminoácidos 0,08-0,24 mM, fosfato de potasio 20-25 mM, 0,001-0,005 mg/ml de amilasa, el 1 %-4 % de polietilenglicol, maltodextrina 320-360 mM (basándose en la cantidad molar de la unidad de glucosa), 0,027 0,054 mg/ml de ARN polimerasa T7, etc. Estos componentes pueden mezclarse con 8 a 25 ng/jl de ADN de proteína fluorescente para la reacción de síntesis de proteínasin vitro.El volumen de reacción está preferiblemente en un intervalo de desde 15 j l hasta 100 jl. Uno de los volúmenes preferidos es 30 jl.
Molde
En la presente invención, el término “molde” se refiere a un molde de ácido nucleico usado para dirigir la síntesis de proteínas, que puede ser ARNm, un molde de ADN o una combinación de los mismos, y preferiblemente es un molde de a Dn . Puede ser lineal o circular, y uno de los moldes preferidos es un plásmido circular.
Durante el procedimiento de síntesis de proteínasin vitro,el promotor en el molde para iniciar la síntesis de la proteína diana puede seleccionarse del grupo que consiste en AOD1, MOX, AUG1, AOX1, GAP, FLD1, PEX8, YPT1, LAC4, PGK, ADH4, AMY1, GAM1, XYL1, XPR2, TEF, RPS7, T7 y cualquier combinación adecuada de los mismos. Uno de los promotores preferidos es el promotor T7.
Sin interferencia mutua
En la presente invención, sin interferencia mutua significa que cuando se someten a prueba una o más proteínas que van a someterse a prueba (es decir, proteínas diana) en una pluralidad de proteínas que se miden en una disolución mixta que contiene una pluralidad de proteínas, el valor de luminiscencia de otras proteínas fluorescentes o proteínas de fusión tiene no coincide o escasamente coincide con el valor de luminiscencia de una o más proteínas que van a someterse a prueba en las condiciones de detección de luminiscencia del experimento, tales como, las condiciones de la longitud de onda de excitación máxima, la longitud de onda de emisión máxima y adecuadas para el uso de filtros ópticos. Debe tenerse en cuenta que, si los filtros ópticos usados no coinciden con las propiedades ópticas de las proteínas, puede conducir a una caracterización inexacta de algunas relaciones lineales, tales como la relación lineal entre la razón de proteínas y el porcentaje del vector correspondiente en las siguientes realizaciones.
Debe tenerse en cuenta que, en las condiciones de detección de fluorescencia de este experimento, si los valores de luminiscencia de otras proteínas fluorescentes o proteínas de fusión fluorescentes coinciden parcialmente con (es decir, interfieren con) el valor de luminiscencia de una o más proteínas que van a someterse a prueba, puede implementarse la solución técnica de la presente invención. La coincidencia parcial significa que, bajo ciertas condiciones de detección de fluorescencia, la señal de luminiscencia medida comprende señales de luminiscencia de las proteínas que van a someterse a prueba y de otras proteínas, y dicha coincidencia no afecta a la detección de las proteínas que van a someterse a prueba mediante el uso de la solución técnica de la presente invención.
Proteínas patrón
En la presente invención, las proteínas patrón se refieren a muestras de proteínas para calibrar la relación lineal entre la concentración de una o más proteínas diana y los valores de luminiscencia. Las proteínas patrón pueden ser proteínas fluorescentes o proteínas de fusión fluorescentes, que se determinan según la unidad emisora de luz contenida en la molécula de proteína diana que va a someterse a prueba. Por ejemplo, las proteínas patrón pueden ser las proteínas diana o las proteínas fluorescentes (cuando las proteínas diana son proteínas fluorescentes de fusión, significa que las moléculas de proteína diana están fusionadas con proteínas fluorescentes) contenidas en la estructura de las proteínas diana, o marcadores luminiscentes. La pureza y la concentración de las muestras de proteína patrón se conocen o determinan antes de su uso.
Coexpresión cuantitativa de múltiples proteínas
En la presente invención, un procedimiento de este tipo se refiere a uno en el que a la concentración del producto de las múltiples proteínas en un sistema de reacción se le asigna una razón específica, y la reacción de síntesis de proteínasin vitrose inicia en esta razón de concentración preestablecida, de modo que pueden obtenerse productos de las múltiples proteínas diana con una relación de proporción de concentración preestablecida; o, a la concentración del producto de las múltiples proteínas diana en el sistema de reacción se le asigna un valor específico, y la reacción de síntesis de proteínasin vitrose inicia en esta concentración, de modo que pueden obtenerse productos de las múltiples proteínas con una relación cuantitativa deseada.
Proteínas fluorescentes
Shimomura aisló la proteína verde fluorescente (GFP) de las medusas por primera vez, y Chalfie clonó GFP en otras especies para su expresión por primera vez. Tsien tomó la iniciativa en la elaboración del mecanismo químico de la luminiscencia de GFP y obtuvo un mutante de GFP (GFP-S65T) con una intensidad de fluorescencia y estabilidad lumínica enormemente mejoradas a través de la tecnología de mutación de punto único (S65T). Muchos científicos, representados por Tsien, introdujeron mutaciones genéticas en GFP para transformar adicionalmente GFP y obtener proteína fluorescente azul (BFP, FP azul), proteína fluorescente cian (CFP, FP cian), proteína fluorescente verde (GFP, FP verde) y proteína fluorescente amarilla (YFP, FP amarilla). Más tarde, los investigadores clonaron proteínas fluorescentes desplazadas al rojo de corales, anémonas de mar y otras especies, lo que amplió enormemente las aplicaciones de obtención de imágenes multicolor de las proteínas fluorescentes. En los últimos años, los científicos han aplicado hábilmente proteínas fluorescentes activadas y convertidas por luz a la obtención de imágenes de alta resolución, rompiendo el límite de difracción óptica y teniendo una resolución de decenas de nanómetros. Es un salto revolucionario en la historia de la tecnología de obtención de imágenes microscópicas. Desde entonces, las proteínas fluorescentes se han convertido en un motor para el desarrollo futuro de las ciencias de la vida.
En 1962, Qsamu Shimomura descubrió por primera vez la proteína verde fluorescente (GFP) en Aequorea victoria, una medusa que habita en las gélidas aguas del océano Ártico, y la aisló y purificó. Martin Chalfie descubrió los valores de la GFP y realizó una investigación experimental usando por primera vez la GFP, una herramienta mágica. En 1994, YongjianQian modificó GFP, lo que hizo que la fluorescencia de GFP se volviera más fuerte y cambiara de color. Estos tres científicos ganaron el Premio Nobel de Química en 2008. Desde entonces, las proteínas fluorescentes han dado lugar a una nueva revolución en la biotecnología. La GFP que se encuentra en las medusas está compuesta por 238 aminoácidos con un peso molecular de 26,9 kDa, y los aminoácidos en las posiciones 65, 66, y 67 forman espontáneamente un grupo luminiscente fluorescente, phidroxibencil imidazolidinona, que puede excitarse con la luz para producir fluorescencia. Muchos científicos usaron el mecanismo de luminiscencia de las proteínas fluorescentes para extraer el gen de la proteína fluorescente de las medusas y transferirlo a otros organismos, haciendo que los cambios biológicos sean más diversificados. Desde que se clonó la GFP en 1992, los investigadores científicos han diseñado muchas proteínas mutantes y no mutantes de GFP, proporcionando poderosos medios de investigación para la investigación biológica moderna.
Dado que las proteínas fluorescentes tienen una variedad de colores y su fluorescencia es estable y no tóxica, pueden desarrollar colores sin la adición de sustratos y cofactores, que no están limitados por especies, tipos de células y ubicaciones, y las proteínas fluorescentes pueden permitir la visualización de la estructura compleja del sistema y pueden detectarse en un momento regular y en posiciones específicas, por lo que las proteínas fluorescentes han sido ampliamente usadas. Los espectros de proteínas fluorescentes informados están distribuidos por toda la región visible y se usan ampliamente en campos de investigación biológica tales como la expresión y regulación genética, el posicionamiento espacial y transporte de proteínas, el plegamiento de proteínas, la transducción de señales, el análisis de la actividad de las proteasas y la interacción biomolecular, por lo que surgen ratones fluorescentes, conejos fluorescentes, y cerdos fluorescentes. Mientras tanto, también se usan en los campos de patogénesis de tumores, detección de fármacos, mejora de materiales alimenticios, detección de ambientes acuáticos e investigación del metabolismo nutricional, etc.
En la presente invención, teniendo en cuenta el uso práctico, se seleccionan proteínas con diferentes longitudes de onda de excitación y emisión, alto brillo, diferentes estructuras de agregado y diferentes colores. Se seleccionaron un total de 11 tipos de 18 proteínas que tienen las siguientes características de mutantes (proteínas modificadas en función de eGFP) mostradas en la tabla 1.
Tabla 1. Características de mutantes de proteína fluorescente
Otras citaciones
Un sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitroinformado, basado en los siguientes tipos de células deEscherichia coli,células de germen de trigo, lisado de reticulocitos de conejo (RRL),Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Kluyveromyces marxianusy otros tipos de células, puede incorporarse a la presente invención como una forma alternativa del sistema de síntesis de proteínasin vitrode la presente invención. Por ejemplo, el sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitrobasado enEscherichia coliregistrado en el documento WO2016005982A1, y el sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitroregistrado en el documento citado en secciones, incluyendo, pero no limitado a “2.1 Sistemas y ventajas” en las páginas 27-28 en la referencia “Lu, Y. Advances in Cell-Free Biosynthetic Technology. Current Developments in Biotechnoogy and Bioengineering, 2019, capítulo 2, 23-45”, puede usarse para implementar el sistema de síntesis de proteínasin vitrode la presente invención cuando sea apropiado.
El sistema de síntesis de proteínasin vitro,los moldes, los plásmidos, las proteínas diana, la reacción de síntesis de proteínasin vitro(reacción de incubación), diversos métodos de preparación, diversos métodos de detección y otros elementos técnicos de la presente invención pueden obtener independientemente métodos de implementación adecuados de los siguientes documentos, incluyendo, pero sin limitarse a: CN106978349A, CN108535489A, CN108690139A, CN108949801A, CN108642076A, CN109022478A, CN109423496A, CN109423497A, CN109423509A, CN109837293A, CN109971783A, CN109988801A, CN109971775A, CN110093284A, CN11048635A, CN110408636A, CN110551745A, CN110551700A, CN110551785A, CN110819647A (CN201808881848), CN110845622A (CN201809550734), CN110938649A (CN2018111131300), CN110964736A (CN2018111423277), CN2018110683534, CN2018116198186, CN2018116198190, CN201902128619, CN2019102355148, CN2019107298813, CN2019112066163, CN2018112862093, CN2019114181518, CN2020100693833, CN2020101796894, CN20201026933X, CN2020102693382, CN2020103469030. A menos que entren en conflicto con los propósitos de la presente invención, estos documentos y sus documentos citados se citan en el presente documento en su totalidad. La presente invención da a conocer además un método para coexpresar cuantitativamente múltiples proteínasin vitro,que comprende las etapas de:
etapa 1, determinar las múltiples proteínas diana que van a coexpresarse y el porcentaje de expresión diana de cada proteína diana; proporcionar un sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitro;
etapa 2, crear vectores que contienen los respectivos genes de proteína diana, respectivamente, para expresar cada proteína diana, respectivamente; un vector contiene sólo la secuencia codificante de una proteína diana; etapa 3, establecer una ecuación de relación cuantitativa entre el porcentaje de expresión de cada una de las proteínas diana y el porcentaje de cantidad de un vector correspondiente;
en donde, los vectores de las respectivas proteínas diana se añaden al sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitrosegún una determinada concentración total de vector y una determinada razón de cantidad, para la reacción de síntesis de proteínasin vitro;después de un tiempo de reacción especificado, se mide el nivel de expresión de cada producto de proteína diana; la reacción de síntesis de proteínasin vitrose lleva a cabo múltiples veces según la concentración total de vector preestablecida y una serie de diferentes razones de cantidad de vector hasta que sea eficiente para el análisis y permita obtener la ecuación de relación cuantitativa entre el porcentaje del nivel de expresión de cada uno de los productos de proteína diana y el porcentaje de cantidad del vector correspondiente mediante ajuste;
etapa 4, calcular el porcentaje de la cantidad de vectores requeridos para coexpresar cuantitativamente las múltiples proteínas;
según la razón del nivel de expresión diana de las múltiples proteínas diana que van a expresarse, la cantidad de vectores o la razón de cantidad de vectores necesaria para cada una de la pluralidad de proteínas diana que van a expresarse se obtiene usando la ecuación establecida en la etapa 3 bajo la condición de que se calcule la concentración total del vector;
etapa 5, coexpresar cuantitativamente la pluralidad de proteínas diana;
según la cantidad de vectores o el porcentaje de cantidad de vectores necesario para la pluralidad de proteínas diana que van a expresarse, se añade una cantidad correspondiente del vector de cada una de las proteínas diana al sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitrotal como se describe en la etapa 3 para la reacción de síntesis de proteínasin vitro,y las múltiples proteínas diana coexpresadas se obtienen después de hacerse reaccionar durante el periodo de tiempo específico definido en la etapa (3).
Bajo la guía de la presente invención, un método para coexpresar cuantitativamente múltiples proteínas mediante la determinación cuantitativa del nivel de expresión de un producto proteico de una manera no fluorescente o de una manera no luminiscente también se encuentra dentro del alcance de la presente invención. El nivel de expresión de proteínas se caracteriza cuantitativamente de manera no luminiscente, tal como la absorción ultravioleta y la absorción infrarroja.
La presente invención se describe además a continuación junto con ejemplos específicos y las figuras 1 a 11 adjuntas. El flujo técnico del procedimiento usado en los ejemplos 1-4 se muestra en la figura 10. Debe entenderse que estos ejemplos sólo se usan para ilustrar la presente invención y no para limitar el alcance de la presente invención. Con respecto a los métodos experimentales sin condiciones específicamente descritas en los siguientes ejemplos, una persona puede seguir generalmente las condiciones convencionales, tales como las condiciones descritas en Sambrooket al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), o seguir las condiciones recomendadas por el fabricante. A menos que se indique lo contrario, los porcentajes y porciones se refieren a porcentajes y porciones en peso. En los siguientes ejemplos,Kluyveromyces lactis (Kluyveromyces lactisNRRL Y-1140) es sólo un ejemplo ilustrativo, y no implica que la presente invención sólo se aplique aKluyveromyces lactis,sino que sólo se usa como un sistema de expresión específico de la presente invención para investigación; la solución técnica en los ejemplos también se aplica a otros sistemas de síntesis de proteínasin vitrobasados en células de levadura, sistemas de síntesis de proteínasin vitrobasados enEscherichia coli,sistemas de síntesis de proteínasin vitrobasados en células de mamífero, sistemas de síntesis de proteínasin vitrobasados en células de planta, sistemas de síntesis de proteínasin vitrobasados en células de insecto.
A menos que se especifique lo contrario, los materiales y reactivos usados en los ejemplos de la presente invención son todos productos disponibles comercialmente.
Ejemplo 1
Detección de ADN y optimización de codones de diferentes secuencias de expresión de proteínas fluorescentes Mediante la búsqueda en diferentes bases de datos, las secuencias codificantes de 18 genes de proteínas fluorescentes diferentes se sometieron a Blast, y se optimizaron los codones para que fueran adecuados para el sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitrobasado enKluyveromyces lactis.
Ejemplo 2
Construcción de plásmidos que contienen secuencia reguladora de la traducción eucariota, secuencia codificante de proteína fluorescente, etiqueta (secuencia de expresión y purificación de proteínas) para el sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitro
2.1 Síntesis de genes completos
Las secuencias de ADN optimizadas de la tabla 2 se usaron para la síntesis del genoma.
2.2 Diseño de cebadores
El diseño de cebadores se realizó mediante el software Oligo 7.0, y las secuencias de cebadores se muestran en la tabla 2.
Tabla 2. Secuencias de cebadores
2.3 Construcción de plásmidos
La inserción de secuencias de genes de proteínas diana que van a expresarse en plásmidos pD2P (véase la figura 11), y el procedimiento de construcción de plásmidos es tal como sigue:
Con el plásmido pD2P como molde, se llevó a cabo la construcción de plásmidos usando técnicas de clonación molecular. Se llevaron a cabo dos procedimientos de amplificación por PCR usando dos pares de cebadores, respectivamente. Se mezclaron 8,5 |jl del producto de cada procedimiento de amplificación por PCR, seguido de la adición de 1 j l de Dpnl y 2 j l de tampón Cutsmart 10 * y luego la mezcla se incubó a 37 °C durante 3 horas. Se añadieron 5 j l del producto tratado con Dpnl a 50 j l de células competentes DH5a. La mezcla se colocó en hielo durante 30 minutos, se sometió a un choque térmico a 42 °C durante 45 segundos, seguido de la adición de 1 ml de medio líquido LB, y luego se cultivó con agitación a 37 °C durante 1 hora. Posteriormente, la mezcla se recubrió sobre un medio sólido LB resistente a Amp y luego se realizó un cultivo invertido a 37 °C hasta que crecieron colonias monoclonales. Se seleccionaron tres colonias monoclonales y luego se cultivaron para su expansión. Después de que se confirmó que era correcto mediante secuenciación, se extrajeron y almacenaron los plásmidos, y la concentración de plásmidos se ajustó al mismo nivel. Antes de su uso, todos los plásmidos se midieron en función de los valores de DO, y la concentración se ajustó a la misma concentración (450 ng/jl), es decir, la concentración de la disolución madre del molde/vector de cada proteína diana es la misma.
El gen codificante de la proteína diana en el plásmido pD2P se inició con un promotor T7.
Ejemplo 3. Expresión de diferentes proteínas fluorescentes en el sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitrobasado en levadura
Todos los fragmentos entre la secuencia de iniciación de la transcripción 5' UTR y la secuencia de terminación 3' UTR en todos los plásmidos se amplificaron con el plásmido mencionado anteriormente como molde usando cebadores aleatorios de siete bases según un método para realizar el procedimiento de amplificación usando la ADN polimerasa phi29. Los productos amplificados se usaron como moldes de ADN para la síntesis de diversas proteínas fluorescentes. Se incluyeron una o más combinaciones en tándem entre la secuencia de iniciación de la transcripción (5' UTR) y la secuencia de terminación (3' UTR). Esta combinación en tándem comprende elementos reguladores que mejoran la traducción y elementos de expresión y de etiquetas de purificación de proteínas.
Según las instrucciones, los moldes de ADN preparados de las proteínas fluorescentes (la concentración de la disolución madre de los moldes de diferentes proteínas fluorescentes era la misma) se añadieron a un sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitrobasado enKluyveromyces lactisde elaboración propia.
El sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitro(que tiene un volumen total de 30 jl) usado en el ejemplo comprende: extracto de células deKluyveromyces lactisal 50 % (v/v), Tris 22 mM (pH 8), acetato de potasio 90 mM, acetato de magnesio 4,0 mM, mezcla de trifosfatos de nucleósido 3,0 mM, mezcla de aminoácidos 0,16 mM, fosfato de potasio 22 mM, 0,003 mg/ml de amilasa, polietilenglicol (PEG-8000) al 3 %, maltodextrina 340 mM (en unidad de glucosa, equivalente a aproximadamente 55 mg/ml), 0,04 mg/ml de ARN polimerasa añadida de manera exógena y 15 ng/jl de ADN de proteína fluorescente, etc. Cuando el tipo de ADN de proteína fluorescente es mayor de 1, 15 ng/jl en este caso es la concentración total de todo el ADN de proteína fluorescente.
El sistema de reacción mencionado anteriormente se colocó en un ambiente a 22-30 °C, y se incubó durante aproximadamente 20 horas. Durante el procedimiento de reacción, pueden observarse diferentes fluorescencias y el color de la fluorescencia se vuelve gradualmente más oscuro durante un determinado periodo de tiempo. Después de completarse la reacción, el sistema de reacción se colocó inmediatamente en el lector de microplacas multifuncional Tecan Infinite F200/M200. Se seleccionaron diferentes filtros ópticos y se establecieron las longitudes de onda de excitación y emisión máximas correspondientes según las características de las proteínas fluorescentes que van a medirse, se leyó el valor, se detectó la intensidad de cada señal de fluorescencia y se tomó el valor de unidad de fluorescencia relativa (UFR) como una unidad activa, y los resultados se muestran en las figuras 1 y 2.
Ejemplo 4. Purificación de proteína fluorescente
Las proteínas fluorescentes obtenidas por la reacción se optimizaron y purificaron mediante perlas de níquel disponibles comercialmente (Sangon, C600033). Remítase a las instrucciones para el método de purificación específico. Se determinó la pureza de la muestra de proteína purificada para obtener su concentración de proteína. La proteína purificada se convirtió en disolución. Se añadió 1 j l de tampón de carga 5*SDS (sin DTT) a 1 j l de la disolución para SDS-PAGE; luego se realizó la obtención de imágenes de fluorescencia. Varias proteínas con fluorescencia obvia se seleccionaron como ejemplos, tal como se muestra en la figura 3 (3a y 3b). Se extrajeron 10 j l de la proteína purificada anterior y se añadieron 2,5 j l de tampón de carga 5*SDS (que contenía DTT 500 mM) a 10 j l de la proteína purificada para SDS-PAGE; la tinción con azul brillante de Coomassie, la decoloración y la obtención de imágenes en gel se realizaron secuencialmente; en donde los resultados antes de la optimización se muestran en la figura 4 (4a y 4b), los resultados después de la optimización se muestran en la figura 5 (5a y 5b).
Ejemplo 5. Creación de una curva de calibración
1) Detección de la relación entre la concentración de una sola proteína y la unidad de fluorescencia relativa (UFR)
La muestra de proteína purificada mediante perlas de níquel en el ejemplo 4 se usó como muestra de proteína patrón. La muestra de proteína se diluyó con tampón (NaCl 500 mM Tris-HCl 20 mM (pH 8,0)) en diferentes gradientes y la proteína de diferentes concentraciones se colocó en el lector de microplacas multifuncional Tecan Infinite F200/M200. Se seleccionaron diferentes filtros ópticos y se establecieron las longitudes de onda de excitación y emisión máximas correspondientes según las características de las proteínas fluorescentes a medir y se leyó el valor de UFR. Se tomaron como ejemplos las proteínas fluorescentes tdTomato, clover y MiCy, y la concentración de una sola proteína se correlacionó positivamente con el valor de UFR, como se muestra en la figura 6 (6a-6d). Las curvas de calibración de concentración de masa de proteína se obtuvieron ajustando la curva trazando la intensidad de la señal contra la concentración de proteína, donde las curvas de calibración de concentración de masa de proteína fueron las siguientes:
y1 = 0,0326X1, R2 = 0,9994
y2 = 0,0433X2, R2 = 0,9994
ya = 0,1523X3, R2 = 0,998
En las fórmulas, yi, y<2>e y3 representan la concentración en masa (unidad: |jg/ml) de las proteínas tdTomato, Clover y MiCy que van a someterse a prueba, respectivamente; y Xi, X<2>, y X<3>representan los valores de luminiscencia (UFR) de tdTomato, Clover y MiCy, respectivamente.
2) Detección de la relación entre la razón de molde y el valor de unidad de fluorescencia relativa (UFR) cuando se expresó una sola proteína. Los moldes de ADN preparados de las proteínas fluorescentes (la concentración de la disolución madre de los moldes de diferentes proteínas fluorescentes era la misma) se añadieron a un sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitrobasado enKluyveromyces lactisde elaboración propia. El sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitro(que tiene un volumen total de 30 jl) usado en el ejemplo comprende: extracto de células deKluyveromyces lactisal 50 % (v/v), Tris 22 mM (pH 8), acetato de potasio 90 mM, acetato de magnesio 4,0 mM, mezcla de trifosfatos de nucleósido 3,0 mM, mezcla de aminoácidos 0,16 mM, fosfato de potasio 22 mM, 0,003 mg/ml de amilasa, polietilenglicol al 3 % (p/v), maltodextrina 340 mM (en unidad de glucosa, equivalente a aproximadamente 55 mg/ml), y 15 ng/jl de ADN de proteína fluorescente, etc.
El sistema de reacción mencionado anteriormente se colocó en un ambiente a 22-30 °C, y se incubó durante aproximadamente 20 horas. Después de completarse la reacción, el sistema de reacción se colocó inmediatamente en el lector de microplacas multifuncional Tecan Infinite F200/M200. Se establecieron las longitudes de onda de excitación y emisión máximas correspondientes según las características de las proteínas fluorescentes sometidas a prueba, y se leyó el valor de UFR. Se tomaron como ejemplos las proteínas fluorescentes tdTomato, Clover, y MiCy. Cuando tdTomato, Clover, o MiCy se expresan por separado, el rendimiento proteico fue independiente de la cantidad de molde (1 j l de molde por 30 j l de sistema), tal como se muestra en la figura 7 (7a-7c).
Ejemplo 6. Coexpresión cuantitativa de dos proteínas
Detectar la relación entre el porcentaje de volumen (es decir, el porcentaje obtenido en relación con la cantidad total de ADN molde de las dos proteínas fluorescentes) del ADN molde de una proteína en un sistema en el que se coexpresaron dos proteínas y el porcentaje de la cantidad de masa de la proteína (es decir, la razón de cada masa de proteína diana en la masa total de la proteína diana, en porcentaje). El porcentaje de volumen de cada molde de proteína en este caso fue coherente con el porcentaje de concentración de cada proteína.
Los moldes de ADN preparados de las proteínas fluorescentes (la concentración de la disolución madre de los moldes de diferentes proteínas fluorescentes era la misma) se añadieron a un sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitrobasado enKluyveromyces lactisde elaboración propia.
El sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitro(que tiene un volumen total de 30 jl) usado en el ejemplo comprende: extracto de células deKluyveromyces lactisal 50 % (v/v), Tris 22 mM (pH 8), acetato de potasio 90 mM, acetato de magnesio 4,0 mM, mezcla de trifosfatos de nucleósido 3,0 mM, mezcla de aminoácidos 0,16 mM, fosfato de potasio 22 mM, 0,003 mg/ml de amilasa, polietilenglicol al 3 %, maltodextrina 340 mM (en unidad de glucosa, equivalente a aproximadamente 55 mg/ml), y 15 ng/jl de ADN de proteína fluorescente (equivalente a la concentración total del molde), en donde el volumen total de las dos proteínas fluorescentes fue de 1 jl.
El sistema de reacción mencionado anteriormente se colocó en un ambiente a 22-30 °C, y se incubó durante aproximadamente 20 horas. Después de completarse la reacción, el sistema de reacción se colocó inmediatamente en el lector de microplacas multifuncional Tecan Infinite F200/M200. Se establecieron las longitudes de onda de excitación y emisión máximas correspondientes según las características de las proteínas fluorescentes sometidas a prueba, y se leyó el valor de UFR. Cuando se coexpresan dos proteínas, por ejemplo, cuando se coexpresan tdTomato y Clover, o tdTomato y MiCy en el mismo sistema de reacción, se encontró que el rendimiento proteico estaba correlacionado positivamente con la cantidad de molde, y la relación era sustancialmente lineal, tal como se muestra en la figura 8 (8a-8d). En la figura 8, se tomó como ejemplo la coexpresión de tdTomato y Clover para mostrar la relación lineal entre la proporción de una sola proteína y el porcentaje de su vector; además, la coexpresión de tdTomato y MiCy también mostró una relación lineal similar entre la proporción de una proteína y el porcentaje de un vector correspondiente.
Creación de una curva de calibración mediante el trazado del porcentaje de volumen del ADN molde (es decir, la razón de un determinado volumen de molde y el volumen total de molde, que es numéricamente igual a la relación entre una determinada concentración de molde y la concentración total de molde) frente al porcentaje de concentración de la proteína obtenido (es decir, la razón de cada proteína del sistema total con respecto a la proteína total) tal como sigue, con la coexpresión de tdTomato y Clover como ejemplo, combinando la curva de calibración del ejemplo 5.
Cuando se coexpresaron tdTomato y Clover,
y<1>= 1,0371x1, R2 = 0,9973 (0<x1<0,96)
y<2>= 0,9713(1-x1) = -0,9713x1 0,9713, R2 = 0,9969
En las fórmulas, y<1>e y<2>representan el porcentaje de proteínas tdTomato, Clover, x<1>representa el porcentaje de volumen del ADN molde de tdTomato cuando se coexpresan dos proteínas.
Ejemplo 7. Coexpresión cuantitativa de tres proteínas
Detectar la relación entre la razón de molde de una sola proteína en un sistema donde se coexpresaron tres proteínas y el valor de unidad de fluorescencia relativa (UFR).
Los moldes de ADN preparados de las proteínas fluorescentes (la concentración de la disolución madre de los moldes de diferentes proteínas fluorescentes era la misma) se añadieron a un sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitrobasado enKluyveromyces lactisde elaboración propia.
El sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitro(que tiene un volumen total de 30 |jl) usado en el ejemplo comprende: extracto de células deKluyveromyces lactisal 50 % (v/v), Tris 22 mM (pH 8), acetato de potasio 90 mM, acetato de magnesio 4,0 mM, mezcla de trifosfatos de nucleósido 3,0 mM, mezcla de aminoácidos 0,16 mM, fosfato de potasio 22 mM, 0,003 mg/ml de amilasa, polietilenglicol al 3 % (p/v), maltodextrina 340 mM (en unidad de glucosa, equivalente a aproximadamente 55 mg/ml), y 15 ng/jl de ADN de proteína fluorescente (equivalente a la concentración total del molde), en donde el volumen total de las tres proteínas fluorescentes fue de 1 jl.
El sistema de reacción mencionado anteriormente se colocó en un ambiente a 22-30 °C, y se incubó durante aproximadamente 20 horas. Después de completarse la reacción, el sistema de reacción se colocó inmediatamente en el lector de microplacas multifuncional Tecan Infinite F200/M200. Se establecieron las longitudes de onda de excitación y emisión máximas correspondientes según las características de las proteínas fluorescentes sometidas a prueba, y se leyó el valor de UFR. Cuando se coexpresaron tres proteínas, por ejemplo, tdTomato, Clover y mKate1.3, y cuando se coexpresaron tdTomato, Clover y mNeptune2, pareció existir una relación lineal similar a la que se muestra en el ejemplo anterior (es decir, ejemplo 6), es decir, el rendimiento proteico se correlacionó positivamente con la cantidad de molde, y la relación fue sustancialmente lineal. A1, B1, C1, D1, E1, F1, G1 representan la razón de molde de Clover:tdTomato:mKate1.3 que fueron 1:1:1, 1:2:3, 1:3:2, 2:1:3, 2:3:1, 3:1:2, 3:2:1, respectivamente; y A2, B2, C2, D2, E2, F2, G2 representan la razón de molde de Clover:tdTomato:mNeptune2 que fueron 1:1:1, 1:2:3, 1:3:2, 2:1:3, 2:3:1, 3:1:2, respectivamente, tal como se muestra en la figura 9 (9a-9d).
Las curvas de calibración de porcentaje de proteína ajustadas por la razón de molde y la razón de rendimiento proteico en este ejemplo fueron tal como sigue:
Cuando se coexpresaron tdTomato, Clover y mKate1.3,
y5 = 0,9147x3 0,1041, R2 = 0,973 (0< xa<0,979)
En la fórmula, y5 es el contenido de la proteína Clover que va a medirse (en relación con la cantidad total de todas las proteínas), x3 es el porcentaje de volumen del ADN molde de Clover cuando se coexpresan tres proteínas.
Cuando se coexpresaron tdTomato, Clover y mNeptune2,
y6 = 0,9664x4 0,0159, R2 = 0,9721 (0<x4<1)
En la fórmula, y6 es el contenido de la proteína Clover que va a medirse (en relación con la cantidad total de todas las proteínas), x4 es el porcentaje de volumen del ADN molde de Clover cuando se coexpresan tres proteínas.
En la figura 9, sólo se tomó Clover como ejemplo para mostrar la relación lineal entre la proporción de su proteína y el porcentaje de su vector; además, las otras dos proteínas coexpresadas también mostraron una relación lineal similar entre la proporción de una proteína y el porcentaje de un vector correspondiente.
Ejemplo 8. Coexpresión cuantitativa de dos proteínas fluorescentes, tdTomato y Clover
La razón de concentración en masa de las dos proteínas diana sintetizadas fue de 1:1 tal como se requería, es decir, la concentración de la proteína tdTomato fue del 50 % y la concentración de la proteína MiCy fue del 50 %. La relación de razón en volumen (coherente con la relación de razón de concentración) del ADN molde de las dos proteínas fluorescentes se calculó según la ecuación obtenida en el ejemplo 6 cuando se coexpresaron tdTomato y Clover:
y<1>= 1,0371x1, R2 = 0,973 (0<x1<0,96)
En la fórmula, y representa el porcentaje de proteína tdTomato, 1-y1 representa el porcentaje de proteína Clover, y x<1>es el porcentaje de volumen de ADN molde de tdTomato cuando las dos proteínas se coexpresan.
Es decir, cuando y<1>era del 50 %, se calculó que x1=50 %/1,0371=48 %, 1-x1=1-48 %=52 %, es decir, la razón en volumen de los vectores de las dos proteínas tdTomato y Clover era de 0,48:0,52. Cuando el volumen total de los dos vectores de proteína era de 1 pl, el volumen del vector tdTomato añadido en lo mismo era de 0,48 pl, y el volumen del vector Clover añadido en lo mismo era de 0,52 pl.
Según los resultados del cálculo anterior, se añadieron 0,48 pl y 0,52 pl de moldes de ADN (450 ng/pl) de las dos proteínas fluorescentes, tdTomato y Clover, que tenían la misma concentración de disolución madre de molde, a un sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitrobasado enKluyveromyces lactisde elaboración propia (que tiene un volumen total de 30 pl), en donde el sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitrocomprende extracto de células deKluyveromyces lactisal 50 % (v/v), Tris 22 mM (pH 8), acetato de potasio 90 mM, acetato de magnesio 4,0 mM, mezcla de trifosfatos de nucleósido 3,0 mM, mezcla de aminoácidos 0,16 mM, fosfato de potasio 22 mM, 0,003 mg/ml de amilasa, polietilenglicol al 3 % (p/v), maltodextrina 340 mM (en unidad de glucosa, equivalente a aproximadamente 55 mg/ml), y 15 ng/pl de ADN de proteína fluorescente (equivalente a la concentración total del molde), en donde el volumen total de los moldes de las dos proteínas fluorescentes, tdTomato y Clover, era de 1 pl.
El sistema de reacción mencionado anteriormente se colocó en un ambiente a 22-30 °C, y se incubó durante aproximadamente 20 horas. Después de completarse la reacción, el sistema de reacción se colocó inmediatamente en el lector de microplacas multifuncional Tecan Infinite F200/M200. Se establecieron las longitudes de onda de excitación y emisión máximas correspondientes según las características de las proteínas fluorescentes sometidas a prueba, y se leyó el valor de UFR. Los valores de UFR de tdTomato y Clover fueron de 1308 y 975, respectivamente. Sustituyendo los valores de UFR obtenidos en la expresión relacional de la curva de calibración descrita en el ejemplo 5:
y1 = 0,0326X1, R2 = 0,9994
y2 = 0,0433X2, R2 = 0,9994
En las fórmulas, y<1>e y<2>representan la concentración en masa (unidad: pg/ml) de las proteínas tdTomato y Clover que van a medirse, respectivamente; y X<1>, X<2>representan los valores de luminiscencia (UFR) de tdTomato y Clover. De las fórmulas anteriores puede obtenerse que las concentraciones en masa de tdTomato y Clover que van a someterse a prueba fueron de 42,64 pg/ml y 42,22 pg/ml, respectivamente, y que la razón de las concentraciones en masa de las dos proteínas fue de 42,64:42,22, similar a 1:1. Estos resultados fueron sustancialmente los mismos que se esperaban. Como resultado, el método de la presente invención es preciso y factible para coexpresar cuantitativamente múltiples proteínasin vitro.
Por primera vez, la invención proporciona un método para coexpresar cuantitativamente múltiples proteínasinvitro.En este método, las proteínas múltiples se sintetizan usando un sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitroque es simple, eficiente y rápido. Cuando se usa para sintetizar proteínas fluorescentes, puede generarse una intensidad de fluorescencia medible, detectable visualmente a simple vista. En comparación con los métodos convencionales, puede monitorizar la expresión de proteínas en tiempo real de una manera eficiente e intuitiva y permite simplificar fenómenos complejos. Se proporciona un método para coexpresar cuantitativamente múltiples proteínas fluorescentes, es decir, un método para sintetizar simultáneamente múltiples proteínas en el mismo sistema. En este método, según la razón preestablecida (razón diana), las múltiples proteínas diana pueden sintetizarse cuantitativamente en la razón diana.
Las descripciones anteriores sólo forman parte de las realizaciones de la presente invención; la invención no está limitada a esas realizaciones. Bajo la guía y enseñanzas de la solución técnica de la presente invención, muchas modificaciones y variaciones que tienen los mismos efectos técnicos serán evidentes para los expertos habituales en la técnica y se encuentran dentro del alcance de la presente invención.
Todos los documentos mencionados en la presente invención se citan como referencias en esta solicitud, así como cada documento se cita individualmente como referencia. Además, debe entenderse que los expertos en la técnica pueden realizar diversos cambios o modificaciones a la presente invención a la luz de las enseñanzas anteriores, y los equivalentes también se encuentran dentro del alcance tal como se define en las reivindicaciones adjuntas de esta solicitud.
Referencias:
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2. Smith M T, Wilding K M, Hunt J M,et al.The emerging age of cell-free synthetic biology [J]. FEBS letters, 2014, 588(17): 2755-2761.
3. Heim R, Cubitt A, Tsien RY. Improved green fluorescence. Nature, 1995, 373: 663-664.
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Aunque anteriormente se han descrito realizaciones específicas de la presente invención, los expertos en la técnica deben comprender que éstas son sólo ejemplos, y que pueden realizarse muchas modificaciones y variaciones a estas realizaciones sin apartarse del principio de la invención. Por tanto, el alcance de la invención queda definido por las reivindicaciones adjuntas.

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Método para coexpresar cuantitativamente múltiples proteínasin vitro,que comprende las etapas de:
(1) establecer una curva de calibración:
establecer una curva de calibración de la relación de concentración de proteína-intensidad de luminiscencia para cada proteína coexpresada usando la proteína patrón correspondiente;
(2) crear vectores separados que contienen cada gen de proteína diana para expresar cada proteína diana respectivamente;
(3) establecer una ecuación de relación cuantitativa entre el porcentaje de concentración de cada una de las proteínas diana y el porcentaje de concentración del vector correspondiente;
en donde los vectores separados en la etapa (2) que contienen los genes de proteína diana se añaden a diferentes razones de concentración al sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitropara la reacción de síntesis de proteínas; después de un tiempo de reacción especificado, se obtiene un valor de luminiscencia para cada proteína diana en la disolución de reacción; la concentración de cada producto de proteína diana se calcula según la curva de calibración mostrada en la etapa (1), y se obtiene una ecuación de relación cuantitativa entre el porcentaje de concentración de cada producto de proteína diana y el porcentaje de concentración del vector correspondiente mediante ajuste; en el sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitro,la concentración total de los vectores permanece igual;
(4) calcular la concentración y la razón de concentración de los vectores para coexpresar cuantitativamente múltiples proteínas;
en donde, según la relación de razón de concentración diana de las múltiples proteínas diana que van a expresarse, la concentración y la razón de concentración del vector para cada una de las múltiples proteínas diana que van a expresarse se calculan usando la ecuación establecida en la etapa (3);
(5) coexpresar cuantitativamente las múltiples proteínas;
en donde, según la concentración o la razón de concentración requerida de cada vector de proteína diana obtenido en la etapa (4), se añade la cantidad correspondiente del vector independiente de cada proteína diana al sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitrotal como se describe en la etapa (3), y después del periodo de tiempo específico definido en la etapa (3), se obtienen las múltiples proteínas diana coexpresadas; en donde las múltiples proteínas diana son cada una independientemente una proteína luminiscente o una proteína de fusión que porta un marcador luminiscente.
2. Método para coexpresar cuantitativamente múltiples proteínasin vitro,que comprende las etapas de:
(1) establecer una curva de calibración:
establecer una curva de calibración de la relación de concentración de proteína-intensidad de luminiscencia para cada proteína coexpresada usando la proteína patrón correspondiente;
(2) crear vectores separados y disoluciones madre de los mismos que contienen cada gen de proteína diana para expresar cada proteína diana respectivamente, en donde la concentración de los vectores separados de cada proteína diana en cada disolución madre es la misma;
(3) establecer una ecuación de relación cuantitativa entre el porcentaje de concentración de cada proteína diana y el porcentaje de volumen de un vector correspondiente;
en donde los vectores separados que contienen los genes de proteína diana en la etapa (2) se añaden al sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitroa diferentes razones en volumen para la reacción de síntesis de proteínasin vitro;después de un tiempo de reacción especificado, se obtiene un valor de luminiscencia para cada proteína diana en una disolución de reacción; la concentración de cada producto de proteína diana se calcula según la curva de calibración mostrada en la etapa (1), y se obtiene la ecuación de relación cuantitativa entre el porcentaje de concentración de cada proteína diana y el porcentaje de volumen del vector correspondiente mediante ajuste;
en el sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitro,la concentración total de los vectores permanece igual;
(4) calcular el volumen del vector y la razón en volumen correspondiente requerida para coexpresar cuantitativamente las múltiples proteínas;
en donde, según la relación de razón de concentración diana de las múltiples proteínas diana que van a expresarse, el volumen y la razón en volumen del vector requerido para cada una de las múltiples proteínas diana que van a expresarse se calculan usando la ecuación establecida en la etapa (3);
(5) coexpresar cuantitativamente las múltiples proteínas;
en donde, según el volumen y la razón en volumen requerido para cada vector de proteína diana obtenido en la etapa (4), se añade una cantidad correspondiente del vector separado de cada proteína diana al sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitrotal como se describe en la etapa (3), y las múltiples proteínas diana coexpresadas se obtienen después de hacerse reaccionar durante el periodo de tiempo específico definido en la etapa (3);
en donde las múltiples proteínas diana son cada una independientemente una proteína luminiscente o una proteína de fusión que porta un marcador luminiscente.
3. Método para coexpresar cuantitativamente múltiples proteínasin vitrosegún la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el valor de luminiscencia de cada proteína diana en la etapa (3) no se ve interferido por otras proteínas a una longitud de onda de emisión máxima.
4. Método para coexpresar cuantitativamente múltiples proteínasin vitrosegún la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde los vectores que contienen los respectivos genes de proteína diana en la etapa (2) son plásmidos que contienen secuencias codificantes de proteínas diana correspondientes, respectivamente.
5. Método para coexpresar cuantitativamente múltiples proteínasin vitrosegún una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitroen la etapa (3) es uno seleccionado del grupo que consiste en un sistema de síntesis de proteínasin vitrobasado en células de levadura, un sistema de síntesis de proteínasin vitrobasado enEscherichia coli,un sistema de síntesis de proteínasin vitrobasado en células de mamífero, un sistema de síntesis de proteínasin vitrobasado en células de planta, un sistema de síntesis de proteínasin vitrobasado en células de insecto, y combinaciones de los mismos.
6. Método para coexpresar cuantitativamente múltiples proteínasin vitrosegún la reivindicación 5, en donde la célula de levadura se selecciona del grupo que consiste enSaccharomyces cerevisiae, Pichia pastorisyKluyveromyces,y combinaciones de las mismas.
7. Método para coexpresar cuantitativamente múltiples proteínasin vitrosegún la reivindicación 3, en donde el valor de luminiscencia es un valor de unidad de fluorescencia relativa (UFR).
8. Método para coexpresar cuantitativamente múltiples proteínasin vitrosegún una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde la proteína luminiscente es una proteína fluorescente natural, una proteína fluorescente modificada o una proteína de fusión que contiene proteína fluorescente.
9. Método para coexpresar cuantitativamente múltiples proteínasin vitrosegún la reivindicación 8, en donde la proteína fluorescente es proteína fluorescente roja, proteína fluorescente naranja, proteína fluorescente amarilla, proteína fluorescente verde, proteína fluorescente cian, proteína fluorescente azul o proteína fluorescente púrpura.
10. Método para coexpresar cuantitativamente múltiples proteínasin vitrosegún una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, que comprende además el aislamiento y/o la purificación de las proteínas diana.
11. Uso de un sistema de síntesis de proteínas libre de célulasin vitroen el método para coexpresar cuantitativamente múltiples proteínasin vitrosegún una cualquiera de las reivindicaciones 1-10.
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