ES3037040T3 - Extracellular domain of alpha subunit of ige fc receptor, pharmaceutical composition comprising same and method for producing same - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona un dímero proteico polipeptídico compuesto por dos monómeros que comprenden un dominio extracelular de una subunidad alfa de un receptor Fc de IgE (FcεRIa-ECD). El dímero proteico, según la presente invención, presenta una excelente capacidad de unión a IgE y carece de funciones ADCC y CDC en comparación con un agente terapéutico convencional que comprende un anticuerpo anti-IgE. Además, presenta la ventaja de presentar menos efectos secundarios. Por lo tanto, puede aplicarse en medicamentos para uso terapéutico o profiláctico contra enfermedades alérgicas mediadas por IgE. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Dominio extracelular de la subunidad alfa del receptor Fc de IgE, composición farmacéutica que lo comprende y método para producir el mismo

Campo técnico

La presente invención se refiere a receptores Fc de IgE modificados y usos de los mismos.

Técnica antecedente

Las enfermedades alérgicas, como la rinitis alérgica, la dermatitis atópica y la alergia alimentaria, incluido el asma, se están propagando a un ritmo rápido en las sociedades modernas industrializadas y occidentalizadas, y el desarrollo de anafilaxia, una enfermedad alérgica grave, también está aumentando. Estas enfermedades inmunes crónicas deterioran gravemente la calidad de vida de las personas y los costes socioeconómicos aumentan en consecuencia. Existe, por tanto, una necesidad desesperada de adoptar medidas para superar estas enfermedades.

La mayoría de las enfermedades alérgicas son causadas por una respuesta inmune excesiva de inmunoglobulina E (IgE). La IgE es un anticuerpo que está presente en el suero en una concentración muy baja en condiciones normales. La IgE también suele ser producida por antígenos inocuos. Existe un caso en el que el número de IgE aumenta sin ningún estímulo particular. Un caso así puede dar lugar a enfermedades alérgicas. La cantidad anormalmente aumentada de IgE puede unirse a los receptores Fc de IgE de alta afinidad (FcsRIs) que se expresan en la superficie de los mastocitos, basófilos y similares. Esta unión hace que los mastocitos o basófilos liberen mediadores químicos como histamina, leucotrienos, prostaglandina, bradicinina y factores activadores de plaquetas. La liberación de estos mediadores químicos da como resultado síntomas alérgicos. En particular, las enfermedades alérgicas pueden presentar síntomas empeorados debido a la unión entre IgE y F<ce>RI. Se sabe que las células que expresan F<ce>RI aumentan en pacientes alérgicos.

En la actualidad, se utilizan diversos métodos, como la evitación de alérgenos, la administración de medicamentos antialérgicos, la modulación de la síntesis de IgE en el cuerpo, y el desarrollo de anticuerpos anti-IgE, se han propuesto para tratar enfermedades alérgicas. Sin embargo, los métodos terapéuticos conocidos hasta ahora tienen muchos inconvenientes, como la incapacidad de curar la causa subyacente de la alergia, la eficacia insuficiente del fármaco y la aparición de efectos secundarios graves.

Además, se han estudiado composiciones de inmunoglobulinas capaces de unirse a IgE y FcYRIIb con alta afinidad e inhibir las células que expresan IgE (KR10-1783272B1). Se ha informado que dichas composiciones son útiles para tratar trastornos mediados por IgE, incluida la alergia y el asma. Además, omalizumab (nombre comercial: Xolair), que se dirige a una porción Fc de un anticuerpo IgE, se ha desarrollado y utilizado como agente terapéutico para el asma grave intratable y la urticaria intratable.

Sin embargo, la administración de dosis altas de omalizumab para mantener los efectos terapéuticos conlleva una carga de costes elevada y efectos secundarios como angioedema y reacción anafiláctica (The Journal of Clinical Investigation Volumen 99, Número 5, marzo de 1997, 915-925). Además, a partir de los resultados posteriores a la comercialización, se han informado casos de vasculitis granulomatosa alérgica y trombocitopenia grave idiopática. Por consiguiente, existe una creciente necesidad de desarrollar agentes terapéuticos capaces de tratar eficazmente enfermedades alérgicas sin efectos secundarios.

El documento EP3260469 divulga una proteína de fusión Fc con utilidad como producto farmacéutico. En particular, la proteína de fusión comprende un FcsRIaECD y una región Fc derivada de IgG1, con una región de fragmento de enlace entre FcsRIaECD y una región Fc derivada de IgG1.

Saban R et al 1994 y Haak-Frendscho M et al., 1993 se refieren a dímeros de proteínas de fusión Fc, estos dímeros comprenden una región Fc derivada de IgG y el FcsRIaECD que están enlazados a través de un enlazador. Ambos Saban R et al., 1994 y Haak-Frendscho Met al., 1993 contemplan el uso de estos dímeros en el tratamiento de enfermedades relacionadas con IgE.

El documento WO2008/028068 se refiere a polipéptidos FcsRIa aislados de primates no humanos. El documento WO2008/028068 divulga específicamente un dímero polipeptídico que comprende un FcsRIaECD de primate no humano modificado y una región Fc derivada de IgG modificada.

Problema técnico

Un objeto de la presente invención es proporcionar una proteína dimérica polipeptídica para tratar una enfermedad alérgica mediada por IgE. Otro objeto de la presente invención es proporcionar una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína, un vector de expresión que contiene la molécula de ácido nucleico y una célula huésped que contiene el vector de expresión. Otro objeto más de la presente invención es proporcionar un método para preparar el dímero polipeptídico.

Solución al problema

Los diversos aspectos y realizaciones preferidas de la presente invención se establecen en las reivindicaciones adjuntas.

Para lograr los objetivos anteriores, se proporciona un dímero polipeptídico, que comprende dos monómeros, cada uno de los cuales contiene un dominio extracelular de una subunidad alfa de un receptor Fc de IgE que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. El monómero contiene una región Fc modificada que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y la región Fc modificada y el dominio extracelular de la subunidad alfa del receptor Fc de IgE están enlazados a través de una bisagra, donde la bisagra es una variante de una región bisagra derivada de la inmunoglobulina IgD, que es Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Xaa1 Xaa2 Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro (SEQ ID NO: 17) o Ala Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Xaa3 Xaa4 Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro (SEQ ID NO: 18), Xaa1 y Xaa3 son Gly, y Xaa2 y Xaa4 son Gly o Ser.. En otro aspecto, se proporciona una composición farmacéutica para tratar o prevenir una enfermedad alérgica, que comprende el dímero polipeptídico como ingrediente activo.

Efectos ventajosos de la invención

La proteína dimérica polipeptídica según la presente invención no solo tiene una excelente seguridad y persistencia en el cuerpo en comparación con los anticuerpos anti-IgE utilizados convencionalmente, sino que también se une a la IgE muy fuertemente debido a que tiene una capacidad de unión a la IgE que es 70 veces mayor que la del anticuerpo anti-IgE utilizado convencionalmente, omalizumab, lo que permite un ciclo de administración extendido. Además, la proteína dimérica polipeptídica según la presente invención es una sustancia obtenida mediante la aplicación de un Fc modificado, que tiene solo IgE como único objetivo y no se une a un receptor gamma de Fc, y por lo tanto carece de funciones de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Por lo tanto, a diferencia de los anticuerpos anti-IgE convencionales que contienen una región Fc de IgG1, la proteína dimérica polipeptídica no se une a un receptor gamma de Fc y, por lo tanto, puede inhibir la liberación de mediadores causada por la unión al receptor gamma de Fc en la superficie de los mastocitos, de modo que se pueden minimizar los efectos secundarios graves, como la aparición de anafilaxia que puede ser causada por la unión entre IgG1 y el receptor gamma de Fc III en los mastocitos. Por lo tanto, la proteína dimérica polipeptídica según la presente invención se puede utilizar como una nueva composición farmacéutica que puede reemplazar a los agentes terapéuticos que contienen un anticuerpo anti-IgE convencional.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1 muestra los resultados de SDS-PAGE y enfoque isoeléctrico en gel (IEF) para las proteínas producidas en cada línea celular. Aquí, se puede observar que no se genera una forma truncada tanto en condiciones de reducción como de no reducción, y que el contenido de proteínas ácidas aumenta debido a un aumento en el contenido de ácido siálico causado por la introducción de un gen de transferasa de ácido siálico.

La FIG. 2 ilustra los resultados de SDS-PAGE para formas reducidas y no reducidas de la proteína dimérica polipeptídica según una realización de la presente invención. En particular, se puede observar que el dímero polipeptídico tiene una alta pureza incluso en el sobrenadante de cultivo que corresponde a la entrada.

La FIG. 3 ilustra un gráfico que muestra la capacidad de unión de omalizumab a IgE. El gráfico muestra los resultados obtenidos al inmovilizar omalizumab y analizar su capacidad de unión dependiendo de las concentraciones de IgE tratadas.

La FIG. 4 ilustra un gráfico que muestra la capacidad de unión a IgE de la proteína dimérica polipeptídica según una realización de la presente invención. La gráfica muestra los resultados obtenidos al inmovilizar la proteína dimérica y analizar su capacidad de unión en función de las concentraciones de IgE tratadas.

La FIG. 5 ilustra los resultados obtenidos al identificar las interacciones de la proteína dimérica polipeptídica (IgETRAP), una realización de la presente invención, y omalizumab con receptores IgG FcyRI (FIG. 5A), FcyRIIA (FIG. 5B), F<cy>RIIB (FIG. 5C), F<cy>RIIIA (FIG. 5D) y F<cy>RIIIB (FIG. 5E) mediante ensayo de interferometría de biocapa (BLI).

La FIG. 6 ilustra un gráfico obtenido cuantificando la capacidad de unión entre los receptores IgETRAP e IgG, y entre omalizumab y los receptores IgG.

La FIG. 7 ilustra un gráfico que muestra la capacidad inhibitoria, sobre la actividad de mastocitos derivados de ratón, de la proteína dimérica polipeptídica (IgETRAP) según una realización de la presente invención dependiendo de sus concentraciones.

La FIG. 8 ilustra un gráfico que muestra una comparación entre las capacidades inhibitorias, sobre la actividad de mastocitos derivados de ratón que expresan Fc£Rl humano, de la proteína dimérica polipeptídica (IgETRAp) según una realización de la presente invención y Xolair (omalizumab) dependiendo de sus concentraciones.

La FIG. 9 ilustra un gráfico que muestra los efectos de la administración de la proteína dimérica polipeptídica según una realización de la presente invención en un modelo de alergia alimentaria.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a un dímero polipeptídico, que comprende dos monómeros, cada uno de los cuales contiene un dominio extracelular de una subunidad alfa de un receptor Fc de IgE (Fc£RlaECD), que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, en donde el monómero contiene una región Fc modificada, que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y la región Fc modificada y el FcsRIa-ECD están unidos a través de una bisagra, donde la bisagra es una variante de una región bisagra derivada de la inmunoglobulina IgD, que es Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Xaa1 Xaa2 Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro (SEQ ID No : 17) o Ala Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Xaa3 Xaa4 Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro (S<e>Q ID NO: 18), Xaa1 y Xaa3 son Gly, y Xaa2 y Xaa4 son Gly o Ser..

Tal como se utiliza en este documento, el término "IgE" significa una proteína de anticuerpo conocida como inmunoglobulina E. La IgE tiene afinidad por los mastocitos, los basófilos sanguíneos o similares. Además, la reacción entre un anticuerpo IgE y un antígeno (alérgeno) correspondiente provoca una reacción inflamatoria. Además, se sabe que la IgE es un anticuerpo que causa anafilaxia, que se produce debido a la secreción repentina de mastocitos o basófilos.

Tal como se utiliza en este documento, el término "receptor Fc de IgE" también se conoce como receptor Fc£ y se une a una porción Fc de IgE. Hay dos tipos de receptor. El receptor que tiene alta afinidad por la Fc de IgE se llama receptor Fc£ I (FceRI). El receptor que tiene baja afinidad por la Fc de IgE se llama receptor Fc£ II (FceRII). Fc£RI se expresa en mastocitos y basófilos. En el caso en que los anticuerpos IgE unidos a Fc£RI son reticulados por antígenos polivalentes, se produce una desgranulación en los mastocitos o basófilos, liberándose así diversas sustancias químicas transmisoras, incluida la histamina. Esta liberación provoca una reacción alérgica inmediata.

La Fc£RI es una proteína de membrana compuesta por una cadena a, una cadena p y o dos cadenas y unidas por un enlace disulfuro. Entre estas cadenas, una porción a la que se une la IgE es la cadena a (Fc£Rla). Fc£Rla tiene un tamaño de aproximadamente 60 kDa y está compuesto por un dominio hidrofóbico que existe dentro de la membrana celular y un dominio hidrofílico que existe fuera de la membrana celular. En particular, la IgE se une a un dominio extracelular de la cadena a.

En algunos ejemplos, específicamente, la subunidad alfa del receptor Fc de IgE puede tener la secuencia de aminoácidos establecida en NP_001992.1. Además, el dominio extracelular (Fc£Rla-ECD) de la subunidad alfa del receptor Fc de IgE tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. En la presente memoria descriptiva, el dominio extracelular de la subunidad alfa del receptor Fc de IgE puede ser un fragmento o variante del dominio extracelular de la subunidad alfa del receptor Fc de IgE, siempre que el fragmento o variante sea capaz de unirse a IgE.

La variante se puede preparar a través de un método de sustitución, eliminación o adición de una o más proteínas en el Fc£Rla-ECD de tipo salvaje (dominio extracelular), siempre que el método no altere una función de la cadena a de Fc£Rl. Estas diversas proteínas o péptidos pueden ser 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idénticos a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Además, el Fc£Rla-ECD de SEQ ID NO: 1 puede estar codificado por un polinucleótido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 5.

Además, tal como se utiliza en este documento, el término "región Fc modificada" significa una región en la que se ha modificado una parte de una porción Fc de un anticuerpo. Aquí, el término "región Fc" se refiere a una proteína que contiene la región constante de cadena pesada 2 (CH2) y la región constante de cadena pesada 3 (CH3) de una inmunoglobulina, y no contiene regiones variables de cadenas pesadas y ligeras y la región constante de cadena ligera 1 (CH1) de una inmunoglobulina. En particular, la región Fc modificada significa una región obtenida sustituyendo algunos aminoácidos en la región Fc o combinando diferentes tipos de regiones Fc. Específicamente, la región Fc modificada tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Además, la región Fc modificada de SEQ ID NO: 2 puede estar codificada por un polinucleótido que tenga la secuencia de SEQ ID NO: 6.

Además, la "región Fc modificada" de la presente invención puede estar en la forma de que tiene cadenas de azúcar en una forma nativa, cadenas de azúcar aumentadas en relación con una forma nativa, o cadenas de azúcar disminuidas en relación con una forma nativa, o puede estar en la forma de tener cadenas de azúcar eliminadas. Las cadenas de azúcar de inmunoglobulina Fc pueden modificarse mediante métodos convencionales, como métodos químicos, métodos enzimáticos y métodos de ingeniería genética utilizando microorganismos.

Aquí, la "región Fc modificada" de la presente invención puede ser una región que carece de funciones de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) debido a que no tiene un sitio de unión para FcyR o C1q. Además, la región Fc modificada y el FcsRIa-ECD pueden estar unidos a través de una bisagra de un anticuerpo IgD. La bisagra del anticuerpo IgD está compuesta por 64 aminoácidos y puede contener selectivamente de 20 a 60 aminoácidos consecutivos, de 25 a 50 aminoácidos consecutivos o de 30 a 40 aminoácidos. En una realización, la bisagra del anticuerpo IgD puede estar compuesta de 30 o 49 aminoácidos como se muestra a continuación. Además, la bisagra del anticuerpo IgD puede ser una variante de bisagra obtenida modificando la región de bisagra, en la que la bisagra puede contener al menos una cisteína. Aquí, la variante de bisagra se puede obtener modificando parte de una secuencia de bisagra del anticuerpo IgD para minimizar la generación de formas truncadas durante un proceso de producción de proteínas.

En una realización, la bisagra puede contener la siguiente secuencia:

Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Xaa1 Xaa2 Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro (SEQ ID NO: 17), donde Xaa1 puede ser Lys o Gly, y Xaa2 puede ser Glu, Gly, o Ser. Específicamente, en algunos ejemplos, la bisagra puede tener la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 19, minimizando así la generación de formas truncadas durante un proceso de producción de proteínas.

En otra realización, la bisagra puede contener la siguiente secuencia:

Ala Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Xaa3 Xaa4 Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro (S<e>Q ID NO: 18), donde Xaa3 puede ser Lys o Gly, y Xaa4 puede ser Glu, Gly, o Ser. Específicamente, la bisagra puede tener la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, minimizando así la generación de formas truncadas durante un proceso de producción de proteínas.

En particular, en la bisagra que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 4, al menos uno de los Thr puede estar glicosilado. En concreto, entre los aminoácidos de SEQ ID NO: 18, los 13°, 14°, 18°, o 19° Thr pueden estar glicosilados. Preferiblemente, los cuatro aminoácidos pueden estar glicosilados. Aquí la glicosilación puede ser O-glicosilación.

Además, como se describió anteriormente, el dímero polipeptídico proporcionado por la presente invención puede estar en una forma en la que dos monómeros están unidos entre sí y cada monómero se obtiene mediante la unión entre un dominio extracelular de una subunidad alfa de un receptor Fc de IgE y una región Fc modificada. El dímero polipeptídico puede estar en una forma en la que los mismos dos monómeros están unidos entre sí por la cisteína ubicada en un sitio de bisagra. Además, el dímero polipeptídico puede estar en una forma en la que dos monómeros diferentes estén unidos entre sí. Por ejemplo, en un caso en el que los dos monómeros son diferentes entre sí, el dímero polipeptídico puede estar en una forma en la que un monómero contiene el dominio extracelular de la subunidad alfa del receptor Fc de IgE, y el otro monómero contiene un fragmento del dominio extracelular de la subunidad alfa del receptor Fc de IgE. Aquí, una realización del monómero puede tener la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, o SEQ ID NO: 22.

Además, el dímero polipeptídico proporcionado por la presente invención exhibe una capacidad de unión a IgE que es de 10 a 100 veces, de 20 a 90 veces, de 20 a 70 veces, de 30 a 70 veces o de 40 a 70 veces mayor que omalizumab, un anticuerpo anti-IgE, y puede exhibir preferiblemente una capacidad de unión a IgE que es 70 veces mayor que omalizumab.

En otro aspecto más de la invención, se proporciona un polinucleótido que codifica un monómero del dímero polipeptídico de la invención que contiene un dominio extracelular de una subunidad alfa de un receptor Fc de IgE al que está unida una región Fc modificada.

Mientras tanto, el polinucleótido puede contener además una secuencia señal o una secuencia líder. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "secuencia señal" significa un ácido nucleico que codifica un péptido señal que dirige la secreción de una proteína objetivo. El péptido señal se traduce y luego se escinde en una célula huésped. Específicamente, la secuencia señal de la presente invención es un nucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos que inicia la translocación de proteínas a través de la membrana del retículo endoplásmico (ER). Las secuencias de señal útiles en la presente invención incluyen secuencias de señal de cadena ligera de anticuerpos, por ejemplo, el anticuerpo 14.18 (Gillies et al., J. Immunol. Meth 1989.

125:191-202), secuencias de señal de la cadena pesada del anticuerpo, por ejemplo, la secuencia de señal de la cadena pesada del anticuerpo MOPC141 (Sakano et al., Nature, 1980. 286:676-683) y otras secuencias de señales conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Watson et al., Nucleic Acid Research, 1984. 12:5145-5164).

Las secuencias de señales son bien conocidas en la técnica por sus características. Las secuencias de señal suelen contener entre 16 a 30 residuos de aminoácidos, y pueden contener más o menos residuos de aminoácidos. Un péptido señal típico consiste en tres regiones que son una región N-terminal básica, una región hidrofóbica central y una región C-terminal más polar. La región hidrofóbica central contiene de 4 a 12 residuos hidrofóbicos que inmovilizan la secuencia señal a través de la bicapa lipídica de la membrana durante la translocación de un polipéptido inmaduro.

Después de la iniciación, una secuencia señal se escinde en el lumen del ER por enzimas celulares comúnmente conocidas como peptidasas señal. Aquí, la secuencia señal puede ser una secuencia señal secretora para el activador del plasminógeno tisular (tPA), la glicoproteína D del virus del herpes simple (HSV gD) o la hormona del crecimiento. Preferiblemente, se pueden utilizar secuencias de señales secretoras utilizadas en células eucariotas superiores, incluidos mamíferos y similares. Además, la secuencia de señal secretora puede sustituirse por un codón que tenga una alta frecuencia de expresión en una célula huésped y utilizarse.

También se proporciona un monómero de dominio extracelular de la subunidad alfa del receptor Fc de IgE al que se unen una secuencia señal y una región Fc modificada, que puede tener la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 13. Las proteínas de SEQ ID<n>O: 11 y SEQ ID NO: 13 puede estar codificadas por polinucleótidos que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 14, respectivamente.

En otro aspecto más de la presente invención, se proporciona un vector de expresión cargado con un polinucleótido de la invención que codifica el monómero. Aquí, el polinucleótido puede tener la secuencia de SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 14.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "vector" pretende introducirse en una célula huésped y ser capaz de recombinarse con el genoma de una célula huésped e insertarse en el mismo. Alternativamente, el vector es un episoma y se entiende como una unidad de ácido nucleico que contiene una secuencia de nucleótidos que puede replicarse de forma autónoma. Los vectores incluyen ácidos nucleicos lineales, plásmidos, fagémidos, cósmidos, vectores de ARN, vectores virales y análogos de los mismos. Ejemplos de vectores virales incluyen, pero no se limitan a, retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados. Además, los plásmidos pueden contener un marcador seleccionable, como un gen resistente a los antibióticos, y las células huésped que albergan los plásmidos pueden cultivarse en condiciones selectivas.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "expresión genética" o "expresión" de una proteína objetivo se entiende que significa la transcripción de una secuencia de ADN, la traducción de una transcripción de ARNm y la secreción de un producto de proteína de fusión o un fragmento del mismo. Un vector de expresión útil puede ser RcCMV (Invitrogen, Carlsbad) o una variante del mismo. El vector de expresión puede contener un promotor del citomegalovirus (CMV) humano para promover la transcripción continua de un gen objetivo en células de mamíferos y una secuencia de señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina para aumentar el nivel de estabilidad del ARN después de la transcripción.

En otro aspecto más de la presente invención, se proporciona una célula huésped en la que se introduce el vector de expresión. Tal como se utiliza en este documento, el término "célula huésped" se refiere a una célula procariota o eucariota en la que se puede introducir un vector de expresión recombinante. Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "transducido", "transformado" y "transfectado" significan introducir un ácido nucleico (por ejemplo, un vector) en una célula utilizando técnicas conocidas en la técnica.

Las células huésped preferidas que se pueden utilizar en la presente invención incluyen células de hibridoma inmortales, células de mieloma N<s>/0, células 293, células de ovario de hámster chino (células CHO), células HeLa, células derivadas de líquido amniótico humano (células CapT) o células COS. Preferiblemente, las células huésped pueden ser células CHO. Por otra parte, la célula huésped puede ser aquella en la que se introduce el vector y un vector cargado con un gen de transferasa de ácido siálico. Aquí, la transferasa del ácido siálico puede ser la transferasa del ácido 2,3-siálico o la transferasa del ácido 2,6-siálico. Aquí, la transferasa del ácido 2,6-siálico puede tener la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15.

En otro aspecto más de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica para tratar o prevenir una enfermedad alérgica, que comprende el dímero polipeptídico como ingrediente activo.

En la presente memoria descriptiva, el término "enfermedad alérgica" significa un síntoma patológico causado por una reacción alérgica mediada por la activación de los mastocitos, tal como la desgranulación de los mastocitos. Estas enfermedades alérgicas incluyen alergia alimentaria, dermatitis atópica, asma, rinitis alérgica, conjuntivitis alérgica, dermatitis alérgica, dermatitis alérgica de contacto, anafilaxia, urticaria, prurito, alergia a insectos, urticaria idiopática crónica, alergia a fármacos y similares. En particular, las enfermedades alérgicas pueden estar mediadas por IgE.

En la composición para tratar o prevenir enfermedades alérgicas de la presente invención, un ingrediente activo puede estar contenido en cualquier cantidad (cantidad efectiva) dependiendo del uso, la formulación, el propósito de la mezcla y similares, siempre que el ingrediente activo pueda exhibir actividad antialérgica. Una cantidad efectiva típica del ingrediente activo se determinará dentro de un rango de 0.001 % en peso a 20.0 % en peso basado en el peso total de la composición. Aquí, "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad de un ingrediente activo que es capaz de inducir un efecto antialérgico. Una cantidad tan efectiva se puede determinar experimentalmente dentro de la habilidad normal de aquellos expertos en la técnica.

Aquí, la composición farmacéutica puede contener además un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como portador farmacéuticamente aceptable, se puede utilizar cualquier portador siempre que sea una sustancia no tóxica adecuada para su administración a un paciente. Pueden contener como portadores agua destilada, alcohol, grasa, cera y un sólido inerte. La composición farmacéutica también puede contener adyuvantes farmacéuticamente aceptables (tampones y dispersantes).

Específicamente, la composición farmacéutica de la presente invención contiene, además de un ingrediente activo, un vehículo farmacéuticamente aceptable, y puede prepararse en una formulación oral o parenteral dependiendo de una vía de administración mediante un método convencional conocido en la técnica. Aquí, el término "farmacéuticamente aceptable" significa que no tiene más toxicidad que la que el sujeto al que se le va a aplicar (prescribir) puede tolerar sin inhibir la actividad del ingrediente activo.

En un caso en el que la composición farmacéutica de la presente invención se elabora en una formulación oral, la composición farmacéutica puede elaborarse en formulaciones tales como polvos, gránulos, tabletas, píldoras, tabletas con recubrimiento de azúcar, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones y obleas, junto con portadores adecuados, de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. Aquí, los ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados pueden incluir azúcares tales como lactosa, glucosa, sacarosa, dextrosa, sorbitol, manitol y xilitol, almidones tales como almidón de maíz, almidón de patata y almidón de trigo, celulosas tales como celulosa, metilcelulosa, etilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica e hidroxipropilmetilcelulosa, polivinilpirrolidona, agua, metilhidroxibenzoato, propilhidroxibenzoato, estearato de magnesio, aceite mineral, malta, gelatina, talco, poliol, aceite vegetal y similares. En caso de preparación, la preparación puede realizarse, según sea necesario, incluyendo diluyentes y/o excipientes tales como un agente de relleno, un extensor, un aglutinante, un agente humectante, un desintegrante y un surfactante.

En un caso en que la composición farmacéutica de la presente invención se prepare en una formulación parenteral, la composición farmacéutica puede prepararse en preparaciones en forma de inyecciones, fármacos transdérmicos, inhaladores nasales y supositorios, junto con vehículos adecuados, de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. En caso de preparación en inyecciones, se puede utilizar como vehículo adecuado agua esterilizada, etanol, poliol como glicerol y propilenglicol, o una mezcla de los mismos. Para el portador se pueden utilizar preferiblemente soluciones isotónicas como la solución de Ringer o la solución salina tamponada con fosfato (PBS) contengan trietanolamina, agua estéril para inyección y dextrosa al 5%, y similares.

La preparación de la composición farmacéutica es conocida en la técnica y, específicamente, se puede hacer referencia a Remington's Pharmaceutical Sciences (19a ed., 1995) y similares. El documento se considera parte de la presente memoria descriptiva.

Una dosificación diaria preferible de la composición farmacéutica de la presente invención está en un rango de 0.01 ug/kg a 10 g/kg, y preferiblemente de 0.01 mg/kg a 1 g/kg, dependiendo de la condición del paciente, el peso corporal, el sexo, la edad, la gravedad de la enfermedad o la vía de administración. La administración puede realizarse una o varias veces al día. Tal dosificación no debe interpretarse en ningún caso como limitante del alcance de la presente invención.

El sujeto al que se puede aplicar (prescribir) la composición de la presente invención es un mamífero y un humano, siendo particularmente preferido el humano. La composición antialérgica de la presente invención puede comprender además del principio activo, cualquier compuesto o extracto natural, cuya seguridad ya haya sido verificada. y que se sabe que tiene actividad antialérgica, con el fin de aumentar y reforzar la actividad antialérgica.

Se proporciona una composición alimenticia para mejorar y aliviar un síntoma alérgico, que comprende el dímero polipeptídico como ingrediente activo.

Aquí, el dímero polipeptídico puede unirse a una unidad de administración apropiada para una administración eficiente a los intestinos. La composición alimenticia puede prepararse en cualquier forma y puede prepararse, por ejemplo, en forma de bebidas tales como té, jugo, bebida carbonatada y bebida iónica, productos lácteos procesados tales como leche y yogur, preparaciones alimenticias funcionales saludables tales como tabletas, cápsulas, píldoras, gránulos, líquidos, polvos, copos, pastas, jarabes, geles, jaleas y barras, o similares. Además, la composición del alimento puede caer dentro de cualquier categoría de producto en clasificación legal o funcional siempre que la composición del alimento cumpla con las regulaciones de cumplimiento en el momento de ser fabricado y distribuido. Por ejemplo, la composición del alimento puede ser un alimento funcional saludable de acuerdo con la Ley de Alimentos Funcionales Saludables, o puede estar dentro de la confitería, frijoles, tés, bebidas, alimentos para propósitos especiales o similares de acuerdo con cada tipo de alimento en el Código de Alimentos de la Ley de Sanidad Alimentaria (estándares y especificaciones para alimentos, notificados por la Food and Drug Administration). Respecto a otros aditivos alimentarios que puedan estar contenidos en la composición de los alimentos, se puede consultar el Código Alimentario o el Código de Aditivos Alimentarios según la Ley de Higiene Alimentaria.

En otro aspecto más de la presente invención, se proporciona un método para producir un dímero polipeptídico de la invención, que comprende una etapa de cultivo de una célula huésped en la que se han introducido un polinucleótido que codifica un monómero de la invención y un gen de transferasa de ácido siálico; y una etapa de recuperación de un dímero polipeptídico.

Aquí, el polinucleótido que codifica el monómero puede introducirse en la célula huésped cargándose en un vector de expresión. Además, el gen de la transferasa del ácido siálico puede introducirse en la célula huésped cargándose en un vector.

En primer lugar, se lleva a cabo una etapa de introducción, en una célula huésped, de un vector cargado con un polinucleótido que codifica un monómero y un vector cargado con un gen de transferasa de ácido siálico. Aquí, la transferasa del ácido siálico puede ser la transferasa del ácido 2,3-siálico o la transferasa del ácido 2,6-siálico.

A continuación, se realiza una etapa de cultivo de la célula transformada.

Finalmente se lleva a cabo una etapa de recuperación de un dímero polipeptídico. Aquí, el dímero polipeptídico puede purificarse a partir de un medio de cultivo o un extracto celular. Por ejemplo, después de obtener el sobrenadante de un medio de cultivo en el que se secreta el dímero de polipéptido, el sobrenadante se puede concentrar utilizando un filtro de concentración de proteínas disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Luego, el concentrado puede purificarse mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la purificación puede lograrse utilizando una matriz acoplada a la proteína A.

En otro aspecto más de la presente invención, se proporciona un dímero polipeptídico producido mediante el método descrito anteriormente para producir un dímero.

Aquí, el dímero polipeptídico tiene un alto contenido de ácido siálico y, por lo tanto, tiene un contenido muy alto de proteínas ácidas en relación con el valor pI teórico.

En otro aspecto más de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica para tratar o prevenir una enfermedad alérgica, que comprende, como ingrediente activo, el dímero polipeptídico producido por el método descrito anteriormente para producir un dímero.

Se proporciona una composición alimenticia para mejorar o aliviar un síntoma alérgico que comprende, como ingrediente activo, el dímero polipeptídico producido mediante el método descrito anteriormente para producir un dímero.

En otro aspecto más de la presente invención, se proporciona un método para tratar o prevenir una enfermedad alérgica, que comprende una etapa de administrar a un sujeto un dímero polipeptídico de la invención que contiene dos monómeros, cada uno de los cuales contiene el dominio extracelular (FcsRIa-ECD) de la subunidad alfa del receptor Fc de IgE.

El sujeto puede ser un mamífero, preferiblemente un ser. Aquí, la administración puede realizarse por vía oral o parenteral. Aquí, la administración parenteral puede realizarse mediante métodos como administración subcutánea, administración intravenosa, administración mucosa y administración muscular.

A continuación, la presente invención se describirá con más detalle con referencia a los siguientes ejemplos. Sin embargo, los siguientes ejemplos tienen como único fin ilustrar la presente invención, y el alcance de la presente invención no se limita únicamente a ellos.

Ejemplo 1. Preparación de polipéptido que contiene FccRIo-ECD y región de Fc modificada

Un polipéptido modificado en C-terminal del dominio extracelular (FcsRIa-ECD) de la subunidad alfa del receptor Fc de IgE se preparó de acuerdo con el método divulgado en la patente U.S. No. 7,867,491.

En primer lugar, para expresar una proteína (FcsRIaECD-Fc1), una proteína (FcsRIaECD-Fc2) y una proteína (FcsRIaECD-Fc3), en la que se encuentra el dominio extracelular de la cadena a de F<ce>RI que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y la Fc de inmunoglobulina modificada de SEQ ID NO: 2 están enlazados a través de una bisagra de SEQ ID NO: 19, una bisagra de SEQ ID NO: 3, y una bisagra de SEQ ID NO: 4, respectivamente, los casetes obtenidos mediante la unión del gen que codifica cada proteína se clonaron en los vectores pAD15 (Genexin, Inc.) para construir vectores de expresión de proteínas FcsRIaECD-Fc. Luego, cada uno de los vectores de expresión fue transducido en células CHO DG44 (del Dr. Chasin, Universidad de Columbia, USA).

Aquí, al momento de ser transducido en la línea celular, se transdujo simultáneamente un vector de expresión obtenido por clonación de un gen de transferasa de ácido a-2,6-siálico en el vector pCI Hygro (Invitrogen) para preparar por separado líneas celulares que sean capaces de expresar las proteínas Fc£RIaECD-Fc2ST y FcsRIa ECD-Fc3ST a las que se les agrega ácido siálico.

Como procedimiento de selección primaria, se llevó a cabo la selección de HT utilizando medio dFBS al 10% libre de 5-hidroxitriptamina (HT) (Gibco, USA, 30067-334), medio MEMa (Gibco, 12561, USA, No. de cat.

12561-049) y medio HT+ (Gibco, USA, 11067-030). Luego, se realizó la amplificación de metotrexato (MTX) utilizando clones seleccionados por HT para amplificar la productividad utilizando el sistema de dihidrofolato reductasa (DHFR).

Una vez completada la amplificación de MTX, se realizó un subcultivo aproximadamente 1 a 5 veces para estabilizar las células con el fin de evaluar la productividad. Posteriormente se realizó la evaluación de la productividad unitaria de las células amplificadas con MTX. Los resultados se muestran en la Tabla 1 a continuación.

[Tabla 1]

Como se muestra en la Tabla 1, la línea celular Fc£RIaECD-Fc3 exhibió una productividad de 16.9 ug/106 células después de la amplificación con metotrexato a 2 uM. Por otra parte, la línea celular Fc£RIaECD-Fc3 (Fc£RIaECD-Fc3ST) cotransducida con la transferasa del ácido 2,6-siálico exhibió una productividad de 17.5 ug/106 células después de la amplificación con metotrexato a 1 uM. Además, la línea celular Fc£RIaECD-Fc2 exhibió una productividad de 20.9 ug/106 células bajo la condición de amplificación de metotrexato a 0.5 uM. Además, la línea celular Fc£RIaECD-Fc2 (Fc£RIaECD-Fc2ST) cotransducida con la transferasa del ácido 2,6-siálico exhibió una productividad de 25.1 ug/106 células después de la amplificación con metotrexato a 0.1 uM. Es decir, se identificó que la línea celular Fc£RIaECD-Fc2 cotransfectada con la transferasa del ácido 2,6-siálico, que había sido seleccionada bajo la condición de amplificación con metotrexato a 0.1 uM, exhibe la productividad más excelente.

Ejemplo 2. Purificación de la proteína de fusiónFc£RIaECD e identificación de pureza de la misma

Entre las líneas celulares seleccionadas en el Ejemplo 1 anterior, i) Fc£RIaECD-Fc3, ii) Fc£RIaECD-Fc3ST y iii) Fc£RIaECD-Fc2ST se cultivaron a escala de 60 ml mediante un método de cultivo por lotes. Los cultivos resultantes se purificaron utilizando una columna de afinidad de proteína A y luego las proteínas purificadas se sometieron a SDS-PAGE y HPLC de exclusión por tamaño (SE-HPLC) para identificar la pureza de las proteínas.

Como se muestra en la FIG. 1, se identificó que todas las proteínas respectivas purificadas por el método SE HPLC tienen una pureza del 93% o superior. Además, como resultado del análisis SDS-PAGE, se identificó que se detectan proteínas con tamaños de aproximadamente 150 kDa y aproximadamente 75 kDa, respectivamente, en las condiciones no reductoras y reductoras (FIG. 1, Carriles 1 a 6). A partir de esto, se encontró que el Fc£RIaECD unido a Fc forma un dímero. Además, no se observaron impurezas como una forma truncada en los resultados de SDS-PAGE. En particular, incluso después del proceso de descongelación/congelación (FIG. 1, carriles 7 a 8), se identificó que todas las proteínas tienen una pureza del 93% o superior y no presentan impurezas. A partir de esto, se encontró que la producción de formas de proteína truncadas disminuye en relación con Fc£RIaECD-Fc1 a la que se le había aplicado la bisagra IgD de tipo salvaje.

Aquí, se realizó Gel-IEF en las siguientes condiciones de prueba para identificar un grado del contenido de ácido siálico en las proteínas tras la introducción de la transferasa del ácido siálico. A partir de esto, se identificó que el contenido de proteínas ácidas aumenta debido al aumento del contenido de ácido siálico.

[Tabla 2]

Para identificar la reproducibilidad del rendimiento de purificación, la línea celular FcsRIaECD-Fc2ST se cultivó por lotes en un matraz de 1 L a una escala de 250 ml y se purificó utilizando una columna de afinidad de proteína A. Posteriormente, el sobrenadante de cultivo y el producto purificado fueron sometidos a corrimiento en un gel TGX™ de 4% a 15% (Bio-Rad Laboratories, Inc.) durante 30 minutos en condición de tampón Tris-Glicina SDS (TGS) y 200 V, para luego sometidos a análisis SDS PAGE. Como resultado, se identificó que no solo las proteínas con una pureza muy alta (98 % o más) se purifican incluso solo con la primera etapa de purificación, sino que también las proteínas se expresan con una pureza muy alta incluso en el sobrenadante de cultivo. Esto indica que las etapas de desarrollo del proceso se pueden simplificar al desarrollar la proteína FcsRIaECD-Fc, que se había expresado en la línea celular en cuestión, en un producto médico y, como resultado, es muy probable que el coste de desarrollo del producto médico se reduzca notablemente.

Ejemplo 3. Identificación de la capacidad de unión de la proteína de fusión FccRIo ECD a IgE

Se midió comparativamente la capacidad de unión a IgE para las cuatro proteínas, i) Fc£RIaECD-Fc2, ii) Fc£RIaECD-Fc2ST, iii) Fc£RIaECD-Fc3 y iv) Fc£RIaECD-Fc3ST que se habían purificado mediante el método del Ejemplo 2 anterior, y el anticuerpo anti-IgE disponible comercialmente, omalizumab (nombre comercial: Xolair). Específicamente, la capacidad de unión a IgE se midió recubriendo con IgE el canal del chip sensor Protein GLC (Bio-Rad Laboratories, Inc., Cat# 176-5011) y haciendo que el omalizumab o cada proteína Fc£RIaECD-Fc en diversas concentraciones fluyera a una tasa de 30 pl por minuto.

Los experimentos se llevaron a cabo identificando la base cero utilizando 25 mM de NaOH como tampón de regeneración y luego repitiendo las etapas anteriores. Posteriormente, se identificó una curva de unión utilizando un analizador de unión a proteínas (ProteOn XPR36, Bio-Rad Laboratories, Inc., USA). Los resultados se muestran en la Tabla 3 y las FIGS. 3 y 4.

[Tabla 3]

Como se muestra en la Tabla 3, el valor de la tasa de asociación (ka) del dímero polipeptídico según una realización de la presente invención se midió como 1.5 a 2.0 veces menor que el de omalizumab. Es decir, se encontró que su capacidad de unión a sustancias distintas de IgE es 1.5 a 2.0 veces menor que la del omalizumab. Además, se midió que el valor de la tasa de disociación (kd) del dímero polipeptídico según una realización de la presente invención era de 40 a 106 veces mayor que el de omalizumab. Además, como se muestra en las FIGS. 3 y 4, se pudo identificar que el omalizumab pierde su unión a IgE en un caso en el que ha transcurrido un cierto período de tiempo después de la unión, mientras que una vez que el dímero polipeptídico de la proteína de fusión Fc£RIaECD de la presente invención se une a IgE, el dímero polipeptídico no se separa de la IgE.

Es decir, se puede ver que el dímero polipeptídico de la presente invención no se separa fácilmente de la IgE y tiene una capacidad mucho mejor para mantener su estado unido que el omalizumab. Como resultado, se puede observar que el dímero polipeptídico según una realización de la presente invención tiene un valor constante de disociación de equilibrio (KD <kd/ka>) que es de 22 a 69 veces mayor que el de omalizumab. A partir de esto, se identificó que la proteína de fusión Fc£RIaECD de la presente invención tiene una capacidad de unión notablemente mayor a IgE en comparación con omalizumab. En particular, se identificó que el Fc£RIaECD-Fc2 (Fc£RIaECD-Fc2ST) al que se agrega ácido siálico exhibe la mayor capacidad de unión a IgE, que es 69 veces mayor que el omalizumab.

Ejemplo 4. Identificación de la capacidad de unión de la proteína de fusión FccRIo ECD al receptor de IgG

Se identificó un grado de unión de IgEjRAP y omalizumab a los receptores de IgG utilizando el sistema Octet RED384 (ForteBio, CA, USA). Las proteínas recombinantes FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB, FcyRIIIA y FcyRIIIB (R & D Systems Inc., 5 pg/ml) se inmovilizaron en tampón de acetato 300 mM (pH 5) en el biosensor AR2G activado. Como tampón de ejecución se utilizó PBS que contenía 0.1% de Tween-20 y 1% de suero bovino. Todos los experimentos se llevaron a cabo a 30 °C con un agitador de placa de muestra a una tasa de 1,000 rpm. Los resultados se muestran en las FIGS. 5A a 5E, y se cuantifican las capacidades de unión de omalizumab e IgEjRAP a los receptores de IgG y se muestran en la FIG. 6.

Ejemplo 5. Identificación de la actividad de la proteína de fusión FccRIo ECD mediante ensayo de betahexosaminidasa en mastocitos derivados de médula ósea de ratón

Se realizó un ensayo de beta-hexosaminidasa para análisis de la actividadin vitrode la proteína de fusión Fc£RIaECD de la presente invención. Específicamente, la proteína Fc£RIaECD-Fc2 de acuerdo con una realización de la presente invención se mezcló, en cada concentración, con IgE de ratón (1 ug/mL), y se incubó a temperatura ambiente (20°C) durante 30 minutos para preparar muestras. Los mastocitos derivados de médula ósea de ratón en cultivo para la activación de los mastocitos se lavaron con tampón de solución salina equilibrada de Hank (HBSS) para eliminar el medio y se midió el número de células. Luego se hizo un ajuste para que 5 x 105 células se inyectaron en 40 pL de tampón HBSS.

Luego, se agregaron 50 uL de la solución de muestra preparada durante la preincubación a los mastocitos activados. Luego, el resultado se incubó en una incubadora con CO2 al 5% a 37°C durante 30 minutos. Posteriormente, tras la adición de cada 10 pL de DNP (2,4-dinitrofenol, 100 ng/mL), que es un antígeno extraño, se realizó nuevamente la incubación a 37°C durante 30 minutos en CO2 al 5%, y luego se separaron 30 pL del sobrenadante. Se mezclaron bien 30 uL del sobrenadante separado y 30 uL del sustrato (4-nitrofenil N-acetilp-D-glucosaminida, 5.84 mM) y luego se incubaron a 37 °C durante 20 minutos en CO2 al 5 %. Luego, se agregaron 140 pL de tampón de carbonato de sodio 0.1 M (pH 10) como solución de parada para finalizar la reacción. Posteriormente, se midió la absorbancia a 405 nm para identificar la cantidad de secreción de phexosaminidasa secretada por el antígeno extraño en los mastocitos activados. Los resultados se muestran en la FIG. 7.

Como se muestra en la FIG. 7, el dímero polipeptídico de una realización de la presente invención exhibió una relación de inhibición de mastocitos de aproximadamente 49.4% en un caso de tener la mitad (0.5 ug/mL) de la concentración de IgE de ratón, y exhibió una relación de inhibición de mastocitos de aproximadamente 99.4% en un caso de tener la misma concentración (1 ug/mL) de IgE de ratón. Es decir, se puede observar que la actividad inducida por IgE de los mastocitos derivados de la médula ósea se ve suprimida en gran medida por el dímero de polipéptido Fc£RIa-ECD de la presente invención.

Ejemplo 6. Comparación de la actividad de la proteína de fusión FccRIa ECD y anticuerpo anti-IgE humano mediante ensayo de p-hexosaminidasa en mastocitos derivados de médula ósea que expresan FccRIa humano

Se realizó un ensayo de p-hexosaminidasa para identificar la superioridad de la proteína de fusión Fc£RIa ECD en relación con Xolair a través de análisis de actividadin vitro.Los respectivos fármacos, Fc£RIaECD-Fc2ST (IgEjRAP) y Xolair, se prepararon en cada concentración y luego se mezclaron con IgE humana (1 ug/mL). Luego se realizó la incubación a temperatura ambiente durante 30 minutos. Durante la preincubación del fármaco, se introdujo un gen Fc£RI humano y se prepararon mastocitos derivados y diferenciados de médula ósea de ratón, en la que se había eliminado el gen Fc£RI de ratón. Los mastocitos preparados se lavaron con tampón HBSS y luego 5 x 105 células se inyectaron en 60 pL de tampón HBSS. Se agregaron 20 pL de la muestra preincubada a los mastocitos preparados y luego se incubaron en una incubadora con CO2 al 5 % a 37 °C durante 30 minutos.

Posteriormente, después se añadieron 20 uL de anticuerpo anti-IgE humano (BioLegend, Cat No. 325502, 0.5 ug/mL), y luego el resultado se incubó nuevamente en una incubadora con CO2 al 5% a 37°C durante 30 minutos. Posteriormente, después de centrifugar a 1,500 rpm a 4°C, se separaron 30 uL del sobrenadante. Se mezclaron bien 30 uL del sobrenadante separado y 30 uL del sustrato (4-nitrofenil N-acetil-p-glucosaminida, 5.84 mM) y luego se incubaron en una incubadora de CO2 al 5% a 37 °C durante 25 minutos. Luego, se agregaron 140 uL de tampón de carbonato de sodio 0.1 M (pH 10) para finalizar la reacción.

Posteriormente, se midió la absorbancia a 405 nm para comparar las cantidades relativas de p-hexosaminidasa secretada y se identificó un efecto inhibidor de la masa celular dependiendo de cada concentración del fármaco. Los resultados se muestran en la FIG. 8. Como se muestra en la FIG. 8, se midió que la IC50 de la proteína de fusión FcsRIa ECD era de aproximadamente 11.16 ng/mL, y la IC<50>de la proteína Xolair se midió que era aproximadamente 649.8 ng/mL. Por lo tanto, se identificó que la proteína de fusión FcsRIa ECD tiene una capacidad inhibitoria sobre la actividad de los mastocitos 58 veces mayor que Xolair.

Ejemplo 7. Ensayo In vivo de la proteína de fusión FccRIo ECD (modelo de alergia alimentaria)

Se administraron intraperitonealmente 50 ug de ovoalbúmina (OVA) y 1 mg de alumbre a ratones Balb/c (Orientbio Inc.) dos veces con un intervalo de 14 días para inducir la sensibilización. Posteriormente, se administraron por vía oral 50 mg de OVA cinco veces en total los días 28, 30, 32, 34 y 36, para inducir alergia alimentaria en los intestinos.

Después de administrar OVA por vía oral dos veces, es decir, el día 31, los ratones se dividieron en tres grupos, cada uno de los cuales contenía 7 ratones. Los tres grupos divididos fueron los siguientes: El primer grupo recibió la proteína de fusión FcsRIaECD-Fc2ST en una concentración alta (200 ug), el segundo grupo recibió la proteína de fusión FcsRIaECD-Fc2ST en una concentración baja (20 ug) y el tercer grupo no recibió nada. Durante la administración oral de OVA, se identificó si se produce diarrea debido a la inducción de alergia alimentaria. Los ratones fueron sacrificados el día 37 y se analizaron el número de mastocitos en el intestino delgado, la concentración de IgE en sangre y la concentración de enzima (proteasa de mastocitos-1 (MCPT-1)) con desgranulación de mastocitos en sangre para los ratones pertenecientes a cada grupo.

Como se muestra en la FIG. 9, se identificó que los ratones pertenecientes al grupo que recibió el FcsRIaECD-Fc2ST, que es un dímero polipeptídico, en alta concentración exhiben un efecto de alivio de la alergia alimentaria de manera dependiente de la concentración, en comparación con los ratones pertenecientes al grupo que no recibió nada.

[Texto de lista de secuencias]

SEQ ID NO: 1

VPQ KPKVSLN PPWNRTFKGE N VTLTCNG NN FFEVSSTKWF HNGSLSEETN SSLNIVNAKF

EDSGEYKCQH QQVNESEPVY LEVFSDW LLL QASAEVVM EG QPLFLRCHGW R N W D V YK V IY

YK D G E ALK YW YENHNISITN ATVEDSGTYY CTG KVW Q LD Y ESEPLN ITV IKAPREK YW LQ

SEQ ID NO: 2

SHTQPLGVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSQEDPE VQ FN W YVD G V EVH NAKTKPR

EEQFNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPSSI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP

PSQEEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSRLTV

DKSRWQEGNV FSCSVMHEAL HNHYTQK.SLS LSLGK

SEQ ID NO: 3

RNTGRGGEEK KGSKEKEEQE ERETK.TPECP

SEQ ID NO: 4

AQPQAEGSLA KATTAPATTR NTGRGGEEKK GSKEKEEQEE RETKTPECP

SEQ ID NO: 5

gtgccccaga agcccaaggt gagcctgaac cctccctgga acagaatctt caagggcgag aacgtgaccc tgacctgcaa cggcaacaac ttcttcgagg tgagcagcac caagtggttc cacaatggca gcctgagcga ggagaccaac agctccctga acatcgtgaa cgccaagttc gaggacagcg gcgaglacaa gtgccagcac cagcaggtga acgagagcga gcccgtgtac ctggaggtgt tcagcgactg gctgctgctg caggccagcg ccgaggtggt gatggagggc cagcccctgt tcctgagatg ccacggctgg agaaactggg acgtgtacaa ggtgatctac tacaaggatg gcgaggccct gaagtacígg lacgagaacc acaacatctc catcaccaac gccaccgtgg aggacagcgg cacctactac tgcacaggca aggtgtggca gctggactac gagagcgagc ccctgaacat caccgtgalc aaggctccca gagagaagta clggclgcag

SEQ ID NO: 6

tgcgtggtcg tggatgtgag ccaggaagat cccgaagtgc agttcaactg gtacgtggat ggcglggaag tgcacaacgc caagaccaag cccagagaag agcagttcaa ctccacctac agagtggtga gcglgctgac cgtgclgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtgt ccaacaaagg cctgcccagc tccatcgaga agaccatcag caaagccaaa ggccagccca gagaacccca ggtgtacacc ctgcctccca gccaggaaga gatgaccaag aaccaggtgl ccctgacclg cctggtgaaa ggcttctacc ccagcgacal cgccglggag tgggaaagca acggccagcc cgagaacaat tacaagacaa cccctcccgt gctggatagc gatggcagct tctttctgta cagcagactg accgtggaca agagcagatg gcaggaaggc

aacgtgttca gclgcagcgt gatgcacgaa gccctgcaca accactacac ccagaagagc clgtccctga gcctgggcaa g

SEQ TD NO: 7

aggaacaccg gcagaggagg cgaggaaaag aaaggaagca aggagaagga ggagcaggag

gaaagagaaa ccaagacccc cgagtgcccc agccacaccc agcccctggg cgtgttcctg

ttccccccca agcccaagga caccctgatg atcagcagaa cccccgaggt gacc

SEQ ID NO: 8

gcccagcccc aggccgaggg cagcctggct aaggccacca cagctcccgc caccaccagg

aacaccggca gaggaggcga ggaaaagaaa ggaagcaagg agaaggagga gcaggaggaa

agagaaacca agacccccga gtgccccagc cacacccagc ccctgggcgt gttcctgttc

ccccccaagc ccaaggacac cctgatgatc agcagaaccc ccgaggtgac c

SEQ ID NO: 9

M DAM LRGLCC VLLLCGAVFV SPSHA

SEQ TD NO: 10

atggacgcca tgctgagagg cclgtgctgt gtgctgctgc tgtgcggcgc cgtgttcgtg

tcccctagcc acgcc

SEQ ID NO: 11

M DAM LRGLCC VLLLCGAVFV SPSHAVPQKP KVSLNPPW NRIFKG ENVTLT CNGNNFFEVS STKWFHNGSL SEETNSSLNI VNAKFEDSGE YKCQHQQVNE SEPVYLEVFS D W LLLQASAE W M E G Q P LF L RCHGW RNW DV YK V IYY K D G E ALKYW YENH NISTTNATVED SG TYYCTG KV WQLDYESEPL N1TV1KAPRE KYW LQ RNTG R GGEEKKGSKE KEEQEERETK TPECPSHTQP LGVFLFPPKP KDTLM1SRTP EVTCVVVDVS QEDPEVQFNW YVD G VE VH NA KTKPREEQFN S T Y R W S V L T VLHQDW LNGK EYKCKVSNKG LPSSIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSQEE M TKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEW ESNGQP E N NYK TTPPV LDSDGSFFLY SRLTVDKSRW QEGNVFSCSV M H EALH NH YT QKSLSLSLGK

SEQ ID NO: 12

atggacgcca tgctgagagg cctgtgctgt gtgctgctgc tgtgcggcgc cgtgttcgtg

tcccctagcc acgccgtgcc ccagaagccc aaggtgagcc tgaaccctcc clggaacaga

atctlcaagg gcgagaacgl gaccctgacc tgcaacggca acaacttctt cgaggtgagc

agcaccaagt ggttccacaa tggcagcctg agcgaggaga ccaacagctc cctgaacatc

gtgaacgcca agttcgagga cagcggcgag tacaagtgcc agcaccagca ggtgaacgag

agcgagcccg tgtacctgga ggtgttcagc gaclggctgc tgctgcaggc cagcgccgag

gíggtgatgg agggccagcc cctgttcctg agatgccacg gctggagaaa ctgggacgtg

tacaaggtga tctactacaa ggatggcgag gccctgaagt actggtacga gaaccacaac

atctccatca ccaacgccac cgtggaggac agcggcaccí actaclgcac aggcaaggtg

tggcagctgg actacgagag cgagcccctg aacatcaccg tgatcaaggc tcccagagag

aagtactggc tgcagaggaa caccggcaga ggaggcgagg aaaagaaagg aagcaaggag

aaggaggagc aggaggaaag agaaaccaag acccccgagt gccccagcca cacccagccc

clgggcgtgt tcctgttccc ccccaagccc aaggacaccc tgatgatcag cagaaccccc

gaggtgacct gcgtggtcgt ggatgtgagc caggaagatc ccgaagtgca gttcaactgg

tacgtggatg gcgtggaagt gcacaacgcc aagaccaagc ccagagaaga gcagttcaac

tccacctaca gaglgglgag cgtgctgacc gtgclgcacc aggactggct gaacggcaag

gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaaggc ctgcccagct ccatcgagaa gaccatcagc

aaagccaaag gccagcccag agaaccccag gtgtacaccc tgcclcccag ccaggaagag

atgaccaaga accaggtgtc cclgacctgc ctggtgaaag gcttclaccc cagcgacalc

gccgtggagt gggaaagcaa cggccagccc gagaacaatt acaagacaac ccctcccgtg

ctggatagcg atggcagctt ctttctgtac agcagactga ccgtggacaa gagcagatgg

caggaaggca acglgttcag ctgcagcgtg atgcacgaag ccctgcacaa ccactacacc

cagaagagcc igtccclgag cclgggcaag

SEQ ID NO: 13

MDAMLRGLCC VLLLCGAW V SPSHAVPQKP KVSLNPPWNRIFKGENVTLT CNGNNFFEVS STKVVFHNGSL SEETNSSLN1 VNAKFEDSGE YKCQHQQVNE SEPVYLEVFS DWLLLQASAE VVMEGQPLFL RCHGWRNWDV YKV1YYKDGE ALKYWYENHN 1S1TNATVED SGTYYCTGKV WQLDYESEPL NITVIKAPRE KYWLQAQPQA EGSLAKATTA PATTRNTGRG GEEKKGSKEK EEQEERETKT PECPSHTQPL GW LFPPKPK DTLMTSRTPE V TC VW D VSQ EDPEVQFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQFNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKGL PSSIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSQEEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS RLTVDKSRWQ EGNWSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSLGK

SEQ ID NO: 14

atggacgcca tgclgagagg cctgtgctgl gtgctgclgc tgtgcggcgc cgtgttcgLg

tcccctagcc acgccgtgcc ccagaagccc aaggtgagcc tgaaccctcc ctggaacaga

atcttcaagg gcgagaacgt gaccctgacc tgcaacggca acaacttctt cgaggtgagc

agcaccaagl ggttccacaa tggcagcctg agcgaggaga ccaacagctc cclgaacatc

gtgaacgcca agttcgagga cagcggcgag tacaagtgcc agcaccagca ggtgaacgag

agcgagcccg tgtacctgga ggtgttcagc gactggctgc tgctgcaggc cagcgccgag

gtggtgatgg agggccagcc cctgttcctg agatgccacg gctggagaaa ctgggacgtg

tacaaggtga tclactacaa ggalggcgag gccclgaagt actgglacga gaaccacaac

atctccatca ccaacgccac cgtggaggac agcggcacct actactgcac aggcaaggtg

tggcagclgg actacgagag cgagcccctg aacatcaccg tgatcaaggc tcccagagag

aagtactggc tgcaggccca gccccaggcc gagggcagcc tggctaaggc caccacagcl

cccgccacca ccaggaacac cggcagagga ggcgaggaaa agaaaggaag caaggagaag

gaggagcagg aggaaagaga aaccaagacc cccgagtgcc ccagccacac ccagcccctg

ggcgtgttcc ígttcccccc caagcccaag gacaccctga tgatcagcag aacccccgag

gtgacctgcg tggtcgtgga tgtgagccag gaagatcccg aagtgcagtt caactggtac

gtggatggcg tggaagtgca caacgccaag accaagccca gagaagagca gttcaactcc

acctacagag tggtgagcgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag

tacaagtgca aggtgtccaa caaaggcctg cccagctcca tcgagaagac catcagcaaa

gccaaaggcc agcccagaga accccaggtg tacaccctgc ctcccagcca ggaagagatg

accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg gtgaaaggct tctaccccag cgacatcgcc

gtggagtggg aaagcaacgg ccagcccgag aacaatlaca agacaacccc tcccgtgclg

gatagcgatg gcagcttctt tctgtacagc agactgaccg tggacaagag cagatggcag

gaaggcaacg tgttcagctg cagcgtgatg cacgaagccc tgcacaacca ctacacccag

aagagcctgt ccclgagcct gggcaag

SEQ ID NO: 15

MIHTNLKKKF SCCVLVFLLF AVICVWKEKK KGSYYDSFKL QTKEFQVLKS LGKLAMGSDS QSVSSSSTQD PHRGRQTLGS LRGLAKAKPE ASFQVWNKDS SSKNLIPRLQ KIWKNYLSMN KYKVSYKGPG PGIKFSAEAL RCHLRDHVNV SMVEVTDFPF NTSEWEGYLP KES1RTKAGP WGRCAVVSSA GSLKSSQLGR EIDDHDAVLR FNGAPTANFQ QDVGTKTTIR LMNSQLVTTE KRFLKDSLYN EGILTVWDPS VYHSDIPKWY QNPDYNFFNN YKTYRKLHPN QPFYILKPQM PWELWDILQE ISPEEIQPNPPSSGMLG1I1MMTLCDQVDI YEFLPSKRKT DVCYYYQKFF DSACTMGAYH PLLYEKNLVK HLNQGTDED1YLLGKATLPG FRT1HC

SEQ ID NO: 16

atgatccaca ccaacctgaa gaagaagttc agctgctgcg tgctggtgtt cctgctgttc

gccgtgatct gcgtgtggaa ggagaagaag aaaggcagct actacgacag cttcaagctg

cagaccaagg agtlccaggt gctgaagagc ctgggcaagc tggccatggg cagcgacagc

cagagcgtgt ccagctcctc cacccaggat ccccacagag gcagacagac cctgggcagc

ctgagaggcc tggccaaggc caagcccgag gccagcllcc aggtgtggaa caaggacagc

agcagcaaga acctgalccc cagactgcag aagatclgga agaaclacct gagcatgaac

aaglacaagg tgagctacaa aggacccgga cccggcatca agttcagcgc cgaggccclg

aggtgccacc Igagagacca cgtgaacglg agcatggtgg aagtgaccga cttccccttc

aacaccagcg agtgggaagg ctacctgccc aaggagagca tcaggaccaa ggctggcccc

tggggcagat gcgccgtggt gagcagcgct ggcagcctga agagctccca gctgggcaga

gagatcgacg accacgatgc cgtgctgagg ttcaatggcg ctcccaccgc caacttccag

caggacgtgg gcaccaagac cacaatccgg ctgatgaaca gccagctggt gacaaccgag

aagcggttcc tgaaggacag cctgtacaac gagggcatcc igatcgtgtg ggatcccagc

gtgtaccaca gcgacatccc caagtggtac cagaatcccg actacaactt cttcaacaac

tacaagacct atagaaagct gcaccccaac cagcccttct acatcctgaa gccccagatg

ccctgggagc tgígggacat cctgcaggag atcagccclg aagagatcca gcccaaccct

ccctccagcg gcatgctggg cattatcatc atgatgaccc tgtgcgacca ggtggacatc

tacgagttcc tgcccagcaa gagaaagacc gacgtgtgct actactatca gaagttcttc

gacagcgcct gcaccatggg cgcctaccac cccctgctgt acgagaagaa cctggtgaag

cacctgaacc agggcaccga cgaggacatc tacclgctgg gcaaagccac cctgcccggc

ttcagaacca tccactgc

SEQ ID NO: 17

RNTGRGGEEK KXXKEKEEQE ERETKTPECP

SEQ ID NO: 18

AQPQAEGSLA KATTAPATTR NTGRGGEEKK XXKEKEEQEE RETKTPECP

SEQ ID NO: 19

RNTGRGGEEK KKEKEKEEQE ERETKTPECP

SEQ ID NO: 20

VPQKPKVSLN PPWNRTFKGE NVTLTCNGNN FFEVSSTKWF HNGSLSEETN SSLNTVNAKF EDSGEYKCQH QQVNESEPVY LEVFSDVVLLL QASAEVVMEG QPLFLRCHGW RNVVDVYKVIY YKDGEALKYW YENHNISITN ATVEDSGTYY CTGKVWQLDY ESEPLNITVIKAPREKYWLQ RNTGRGGEEK KKEKEKEEQE ERETKTPECP SHTQPLGVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSQEDPE VQFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQFNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPSSIEKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSQEEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSRLTV DKSRWQEGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSLGK

SEQ ID NO: 21

VPQKPKVSLN PPWNRIFKGE NVTLTCNGNN FFEVSSTKWF HNGSLSEETN SSLNTVNAKF EDSGEYKCQH QQVNESEPVY LEVFSDWLLL QASAEVVMEG QPLFLRCHGW RNWDVYKVIY YKDGEALKYW YENHNISITN ATVEDSGTYY CTGKVWQLDY ESEPLNITVI KAPREKYWLQ RNTGRGGEEK KGSKEKEEQE ERETKTPECP SHTQPLGVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSQEDPE VQFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQFNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPSSI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSQEEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSRLTV DKSRWQEGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSLGK

SEQ ID NO: 22

VPQKPKVSLN PPWNRIFKGE NVTLTCNGNN FFEVSSTKWF HNGSLSEETN SSLNIVNAKF EDSGEYKCQH QQVNESEPVY LEVFSDWLLL QASAEVVMEG QPLFLRCHGW RNVVDVYKVIY YKDGEALKYW YENHN1SITN ATVEDSGTYY CTGKVWQLDY ESEPLNITVIKAPREKYWLQ AQPQAEGSLA KATTAPATTR NTGRGGEEKK GSKEKEEQEE RETKTPECPS HTQPLGWLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSQEDPEV QFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQFNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKGLPSSIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SQEEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDTAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSRLTVD KSRWQEGNW SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SLGK

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Un dímero polipeptídico, que comprende:

dos monómeros, cada uno de los cuales contiene un dominio extracelular de una subunidad alfa de un receptor Fc de IgE (FcsRIaECD), que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1,

en donde el monómero contiene una región Fc modificada, que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y

la región Fc modificada y el FcsRIa-ECD están unidos a través de una bisagra,

en donde la bisagra es una variante de una región bisagra derivada de la inmunoglobulina IgD, que es Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Xaa1 Xaa2 Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro (SEQ ID NO: 17) o

Ala Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Xaa3 Xaa4 Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro (SEQ ID NO: 18),

Xaa1 y Xaa3 son Gly, y

Xaa2 y Xaa4 son Gly o Ser.

2. El dímero polipeptídico de la reivindicación 1,

en donde la bisagra tiene cualquier secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4.

3. Un polinucleótido que codifica el monómero de dímero polipeptídico según la reivindicación 1, que contiene un dominio extracelular de una subunidad alfa de un receptor Fc de IgE (FcsRIa-ECD).

4. Un vector de expresión que contiene el polinucleótido según la reivindicación 3.

5. Una célula huésped que comprende el vector de expresión de la reivindicación 4.

6. Una composición farmacéutica para uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad alérgica, en donde la composición farmacéutica comprende como ingrediente activo, un dímero polipeptídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, preferiblemente

en donde la enfermedad alérgica se selecciona del grupo que consiste en alergia alimentaria, dermatitis atópica, asma, rinitis alérgica, conjuntivitis alérgica, dermatitis alérgica, urticaria idiopática crónica y dermatitis alérgica de contacto.

7. Un método para producir un dímero polipeptídico según la reivindicación 1, que comprende:

una etapa de cultivo de una célula en la que se introducen el polinucleótido según la reivindicación 3 y un gen de transferasa de ácido siálico; y

una etapa de recuperación del dímero polipeptídico.

8. El dímero polipeptídico obtenido en la reivindicación 7.

9. Una composición farmacéutica para uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad alérgica, en donde la composición farmacéutica comprende como ingrediente activo el dímero polipeptídico según la reivindicación 8.

10. Un dímero polipeptídico según las reivindicaciones 1 y/u 8 para uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad alérgica, en donde el dímero polipeptídico es para administración a un sujeto.