ES3037819T3 - Bremia lactucae resistance sg01 - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a nuevas plantas de lechuga resistentes a Bremia lactucae. También se refiere a semillas y partes de dichas plantas, como hojas y cabezas. Además, se refiere a métodos para la producción y el uso de dichas semillas y plantas. Asimismo, se refiere a nuevas secuencias genéticas asociadas con dicha resistencia a Bremia lactucae y a marcadores moleculares asociados a dichas nuevas secuencias genéticas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Resistencia a Bremia lactucae SG01

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a plantas de lechuga novedosas que presentan resistencia aBremia lactucae.La presente invención también se refiere a semillas y partes de dichas plantas, por ejemplo, hojas y cabezas. La presente invención se refiere además a métodos de producción y uso de dichas semillas y plantas. La presente invención también se refiere a secuencias genéticas novedosas asociadas con dicha resistencia aBremia lactucaey a marcadores moleculares asociados con dichas secuencias genéticas novedosas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Se sabe que los patógenos vegetales causan daños masivos a cultivos importantes, lo que genera pérdidas agrícolas significativas con consecuencias generalizadas tanto para el suministro de alimentos como para otras industrias que dependen de materiales vegetales. Por ello, desde hace tiempo se siente la necesidad de reducir la incidencia y/o el impacto de las plagas agrícolas en la producción de cultivos.

Un ejemplo de dicho patógeno es el hongoBremia lactucae,que provoca mildiú.B. lactucaese encuentra en todo el mundo y representa un gran problema tanto para el rendimiento como para la calidad de la lechuga cultivada(Lactuca sativa).El hongo puede infectar la planta de lechuga en cualquier fase de crecimiento, después de lo cual los primeros síntomas del mildiú se vuelven visibles como manchas amarillas cloróticas en la superficie de la hoja. Dentro de las 24-48 horas, se vuelve visible un crecimiento de hongo esponjoso blanco en la superficie inferior de la hoja como una indicación de la formación de esporas. Durante la infección, las manchas de lesiones se vuelven cada vez más grandes y más cloróticas hasta que las hojas se vuelven completamente marrones.

Bremia lactucaepertenece al grupo Oomicetos, una clase de hongos relativamente primitiva. Otros miembros de este grupo son, por ejemplo,PythiumyPhytophthora. B. lactucaecontiene diferentes especies fisiológicas ("fisios"), es un patógeno muy variable y es específico para el huésped. Nuevos fisios se producen con relativa frecuencia a través de la mutación de los genes de avirulencia durante la formación de esporas que precede a la propagación deB. lactucae.

Dentro del géneroLactucae,al que pertenece la lechuga cultivadaL. sativa,hay una serie de resistencias conocidas aB. lactucae.Estas resistencias son generalmente específicas de la raza y se basan en genes cualitativos, conocidos como genes de resistencia a DM (mildiú). El mecanismo de resistencia se conoce como mecanismo gen por gen basado en la interacción específica entre productos del gen de resistencia a Dm y el gen de avirulencia específica para el patógeno (reacción HR) que da como resultado la resistencia de la planta de lechuga.

Debido a la alta variabilidad de B.lactucaey la aparición frecuente de nuevos fisios, la resistencia específica de raza mediada por los diversos genes de resistencia a DM puede ser rápidamente rota por los nuevos fisios emergentes del patógenoBremia.

Sigue existiendo la necesidad de resistencias novedosas contra el patógeno fúngicoBremia lactucae,en particular resistencia de amplio espectro frente a este patógeno fúngico.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención aborda la necesidad de resistencias adicionales y mejoradas aBremia lactucaeproporcionando plantas de lechuga novedosas, y partes y semillas de las mismas, que comprenden un rasgo de resistencia aBremiadesignado como "SG01". También se proporcionan marcadores de ácido nucleico para identificar y producir plantas de lechuga (por ejemplo, plantas deL. sativa),y partes y semillas de las mismas, que comprenden el rasgo de resistencia aBremia.En realizaciones particulares, la invención divulga una nueva fuente de resistencia aBremia:CGN23091, un acceso deLactuca serriolasilvestre. Introgresando las secuencias que confieren resistencia aBremiade la fuente silvestre en plantas de lechuga cultivadas (por ejemplo,L. sativa),se confirió una resistencia cualitativa aBremiaa la planta de lechuga cultivada. La secuencia introgresada que confiere resistencia aBremia,ubicada en el cromosoma 2, es de naturaleza dominante; por lo tanto, una copia de la secuencia proporciona un fenotipo de resistencia aBremia.

En conjunto, las características de la planta de lechuga resistente aBremiadivulgada en la presente invención proporcionan a un cultivador de lechuga soluciones novedosas para mejorar la eficiencia económica y comercial cuando se despliegan variedades de lechuga en un campo sometido a la presión deBremia.Además, como bien entenderán los expertos en la técnica, se pueden apilar nuevas resistencias aBremiacon otras resistencias aBremiaen una sola planta y pueden proporcionar un espectro mejorado de resistencia contra múltiples razas/aislados, protección contra nuevas razas/aislados emergentes y pueden retrasar una ruptura en las resistencias aBremiaexistentes.

En un primer aspecto, la divulgación proporciona una planta de lechuga (por ejemplo, una planta de lechuga cultivada, tal como una planta deLactuca sativa)resistente aBremia lactucaeque comprende una secuencia introgresada deLactuca serriolaque confiere una resistencia cualitativa y dominante aBremia lactucae,en donde dicha secuencia introgresada está comprendida en el acceso CGN23091 deLactuca serriolao en la línea 18LEN002364 deLactuca sativa,y en donde dicha secuencia introgresada está ubicada en el cromosoma 2 y comprende uno o más de los siguientes marcadores de SNP:

a) un genotipo G en el estado heterocigótico u homocigótico para el marcador de SNP SL1831 en SEQ ID NO: 1;

b) un genotipo A en el estado heterocigótico<u>homocigótico para el marcador de SNP SL1847 en SEQ ID NO: 6;

c) un genotipo G en el estado heterocigótico u homocigótico para el marcador de SNP SL1887 en SEQ ID NO:

11; y/o

d) un genotipo C en el estado heterocigótico u homocigótico para el marcador de SNP SL1883 en SEQ ID NO:

16.

En un aspecto adicional, la divulgación proporciona una planta de lechuga (por ejemplo, una planta de lechuga cultivada, tal como una planta deLactuca sativa) con resistencia mejorada aBremia lactucaeque comprende una secuencia introgresada deLactuca serriolaque confiere una resistencia cualitativa y dominante aBremia lactucae,en donde dicha secuencia introgresada está comprendida en el acceso CGN23091 deLactuca serriolao en la línea 18LEN002364 deLactuca sativa,y en donde dicha secuencia introgresada está ubicada en el cromosoma 2 y comprende uno o más de los siguientes marcadores de SNP:

a) un genotipo G en el estado heterocigótico u homocigótico para el marcador de SNP SL1831 en SEQ ID NO: 1;

b) un genotipo A en el estado heterocigótico<u>homocigótico para el marcador de SNP SL1847 en SEQ ID NO: 6;

c) un genotipo G en el estado heterocigótico u homocigótico para el marcador de SNP SL1887 en SEQ ID NO:

11; y/o

d) un genotipo C en el estado heterocigótico u homocigótico para el marcador de SNP SL1883 en SEQ ID NO:

16;

en donde la resistencia de dicha planta de lechuga aB. lactucaese potencia en comparación con una planta de lechuga de control (por ejemplo, una planta deL. sativa)que no comprende dicha secuencia introgresada.

En realizaciones representativas:

a) el genotipo G para el marcador SL1831 puede identificarse en una PCR por amplificación de un fragmento de ácido nucleico con un par de cebadores oligonucleotídicos: cebador directo de SEQ ID NO: 2 y cebador inverso de SEQ ID NO: 5 y una sonda de SEQ ID NO: 3;

b) el genotipo A para el marcador de SNP SL1847 puede identificarse en una PCR por amplificación de un fragmento de ácido nucleico con un par de cebadores oligonucleotídicos: cebador directo de SEQ ID NO: 7 y cebador inverso de SEQ ID NO: 10 y una sonda de SEQ ID NO: 8;

c) el genotipo G para el marcador de SNP SL1887 puede identificarse en una PCR por amplificación de un fragmento de ácido nucleico con un par de cebadores oligonucleotídicos: cebador directo de SEQ ID NO: 12 y cebador inverso de SEQ ID NO: l5 y una sonda de SEQ ID NO: 13; y

d) el genotipo C para el marcador de SNP SL1883 puede identificarse en una PCR por amplificación de un fragmento de ácido nucleico con un par de cebadores oligonucleotídicos: cebador directo de SEQ ID NO: 17 y cebador inverso de SEQ ID NO: 20 y una sonda de SEQ ID NO: 18.

En aspectos, la planta según la divulgación es una planta cultivada.

En aspectos, la secuencia introgresada de la divulgación comprende una o más de SEQ ID NO: 1 que tiene un alelo marcador de resistencia representado por el nucleótido G en la posición 112, SEQ ID NO: 6 que tiene un alelo marcador de resistencia representado por el nucleótido A en la posición 112, SEQ ID NO: 11 que tiene un alelo marcador de resistencia representado por el nucleótido G en la posición 99 y/o SEQ ID NO: 16 que tiene un alelo marcador de resistencia representado por el nucleótido C en la posición 41, o una secuencia que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a una o más de las secuencias anteriores y comprende el alelo marcador de resistencia.

En aspectos, la planta según la divulgación es heterocigótica para el uno o más marcadores de SNP (por ejemplo, es heterocigótica para la secuencia introgresada y la resistencia aBremiaSG01).

En aspectos, la planta según la divulgación es homocigótica para el uno o más marcadores de SNP (por ejemplo, es homocigótica para la secuencia introgresada y la resistencia aBremiaSG01).

En aspectos, la planta según la divulgación comprende dos o más, tres o más o los cuatro marcadores de SNP SL1831, SL1847, SL1887 y/o SL1883 (cada uno en forma heterocigótica u homocigótica).

En aspectos representativos, la planta según la presente divulgación comprende al menos los siguientes marcadores de SNP (uno o ambos marcadores en forma heterocigótica u homocigótica):

• SL1831 y SL1847;

• SL1831 y SL1883;

• SL1831 y SL1887;

• SL1847 y SL1883;

• SL1847 y SL1887; o

• SL1883ySL1887.

Por ejemplo, los marcadores SL1883 y SL1887 se pueden usar juntos, opcionalmente con la adición de otros marcadores. Como otra ilustración a modo de ejemplo, los marcadores SL1847 y SL1887 se pueden usar combinados, opcionalmente con la adición de otros marcadores.

En aspectos, la secuencia introgresada de la divulgación confiere resistencia al menos contra las razasBremia lactucaeBI 16-36EU.

En aspectos, la planta según la presente divulgación se obtiene cruzando el acceso CGN23091 deLactuca serriolao lechuga 18LEN002364 con una segunda planta de lechuga que no comprende dicha secuencia introgresada que confiere resistencia aBremia lactucae(por ejemplo, no comprende la resistencia aBremiaSG01).

En aspectos, la planta según la divulgación es una planta endogámica, dihaploide o híbrida. Generalmente, las plantas de la invención son diploides.

Como un aspecto adicional, la divulgación proporciona una planta de la línea 18LEN002364 deLactuca sativa.

Es un aspecto adicional proporcionar una parte de planta, órgano o tejido obtenido de una planta de lechuga según cualquiera de las realizaciones descritas en la presente, que incluyen, pero no se limitan a, cabezas, hojas, núcleos, tallos, raíces, flores o partes de flores, brotes, gametofitos, esporofitos, polen, anteras, microesporas, óvulos, cigotos, embriones, regiones meristemáticas, tejido calloso, semillas, esquejes, cultivos de células o tejidos o cualquier otra parte o producto de la planta, que comprenden la secuencia introgresada. En aspectos, la parte de planta, órgano o tejido presente la resistencia aBremiasegún la invención, particularmente cuando se cultiva en una planta de lechuga que produce hojas y/o cabezas de lechuga.

Además, se proporciona una semilla que produce una planta según la divulgación.

Además, se proporciona una semilla producida por una planta según la divulgación.

En otro aspecto se considera el uso de una planta, parte de una planta o semilla de lechuga según cualquiera de las realizaciones de la invención para producir y cosechar una cabeza y/u hojas de lechuga.

En otro aspecto, la divulgación se refiere al uso de una planta de lechuga, parte de planta (por ejemplo, cabeza u hojas) o semilla según cualquier realización descrita en el presente documento, para producir una planta, parte de planta o semilla de lechuga adicional que tenga la resistencia aBremiade la invención.

En otro aspecto, la divulgación se refiere al uso de una planta, parte de planta o semilla de lechuga según cualquier realización de la invención, en donde la planta, parte de planta o semilla de lechuga es 18LEN002364 deL. sativa,o una descendencia o un ancestro de la misma.

En aún otro aspecto, la divulgación se refiere al uso de una planta, parte de planta o semilla de lechuga según cualquier realización de la invención, en donde la planta, parte de planta o semilla de lechuga es el acceso CGN23091 deL. serriola, o una descendencia o un ancestro de la misma.

Como otro aspecto, la divulgación proporciona un método de producción de una planta de lechuga con resistencia potenciada resistente aBremia lactucae(por ejemplo, en comparación con una planta de control), comprendiendo el método:

a) cruzar una planta de lechuga según la presente invención con una segunda planta de lechuga que carece de dicha secuencia introgresada que confiere resistencia aBremia lactucaepara producir plantas descendientes;

b) seleccionar una planta descendiente que comprende dicha secuencia introgresada que confiere resistencia aBremia lactucae,comprendiendo dicha etapa de selección detectar (por ejemplo, mediante genotipado) uno o más de los siguientes marcadores de SNP:

i) un genotipo G en el estado heterocigótico u homocigótico para el marcador de SNP SL1831 en SEQ ID NO: 1;

ii) un genotipo A en el estado heterocigótico u homocigótico para el marcador de SNP SL1847 en SEQ ID NO: 6;

iii) un genotipo G en el estado heterocigótico u homocigótico para el marcador de SNP SL1887 en SEQ ID NO: 11; y/o

iv) un genotipo C en el estado heterocigótico u homocigótico para el marcador de SNP SL1883 en SEQ ID NO: 16;

produciendo de este modo una planta con resistencia mejorada aBremia lactucae.

Opcionalmente, el método comprende además:

c) autofecundar la descendencia seleccionada o cruzar la planta descendiente seleccionada con otra planta de lechuga para producir descendencia adicional. En aspectos, la descendencia adicional se selecciona y se autofecunda/cruza durante 2 a 10 generaciones más.

En aspectos, dicha etapa de selección de b) comprende detectar (por ejemplo, mediante genotipado) dos o más, tres o más, o los cuatro marcadores de SNP SL1831, SL1847, SL1887 y/o SL1883. Opcionalmente, dicha etapa de selección comprende detectar al menos los siguientes marcadores de SNP (cualquiera o ambos marcadores en forma heterocigótica u homocigótica):

• SL1831 y SL1847;

• SL1831 y SL1883;

• SL1831 y SL1887;

• SL1847 y SL1883;

• SL1847 y SL1887; o

• SL1883ySL1887.

En aspectos, los marcadores SL1883 y SL1887 se pueden usar juntos, opcionalmente con la adición de otros marcadores. Como otra ilustración a modo de ejemplo, los marcadores SL1847 y SL1887 se pueden usar combinados, opcionalmente con la adición de otros marcadores.

En aspectos, la primera y/o segunda plantas de lechuga son plantas deL. sativa.

Un aspecto adicional proporciona un método de producción de una planta de lechuga con resistencia potenciada aBremia lactucae(por ejemplo, en comparación con una planta de control), comprendiendo el método:

a) cruzar una planta de acceso CGN23091 deLactuca serriolacon una segunda planta de lechuga (por ejemplo, una planta deL. sativa)que carece de una secuencia introgresada de acceso CGN23091 deL. serriolaque confiere resistencia aBremia lactucaepara producir plantas descendientes;

b) seleccionar una planta descendiente que comprende una introgresión en el cromosoma 2 de acceso CGN23091 deL. serriolaque confiere resistencia aBremia lactucae,comprendiendo dicha etapa de selección detectar (por ejemplo, mediante genotipado) uno o más de los siguientes marcadores de SNP:

i) un genotipo G en el estado heterocigótico u homocigótico para el marcador de SNP SL1831 en SEQ ID NO: 1;

ii) un genotipo A en el estado heterocigótico u homocigótico para el marcador de SNP SL1847 en SEQ ID NO: 6;

iii) un genotipo G en el estado heterocigótico u homocigótico para el marcador de SNP SL1887 en SEQ ID NO: 11; y/o

iv) un genotipo C en el estado heterocigótico u homocigótico para el marcador de SNP SL1883 en SEQ ID NO: 16;

produciendo de este modo una planta de lechuga resistente aBremia lactucae.

Opcionalmente, el método comprende además:

c) autofecundar la planta descendiente seleccionada o cruzar la progenie seleccionada con otra planta de lechuga (por ejemplo, una planta deL. sativa)para producir descendencia adicional. En realizaciones, la descendencia adicional se selecciona y se autofecunda/cruza durante 2 a 10 generaciones más.

En aspectos, dicha etapa de selección de b) comprende detectar (por ejemplo, mediante genotipado) dos o más, tres o más, o los cuatro marcadores de SNP SL1831, SL1847, SL1887 y/o SL1883. Opcionalmente, dicha etapa de selección comprende detectar al menos los siguientes marcadores de SNP (cualquiera o ambos marcadores en la forma heterocigótica u homocigótica):

• SL1831 y SL1847;

• SL1831 y SL1883;

• SL1831 y SL1887;

• SL1847 y SL1883;

• SL1847 y SL1887; o

• SL1883ySL1887.

En aspectos, los marcadores SL1883 y SL1887 se pueden usar juntos, opcionalmente con la adición de otros marcadores. Como otra ilustración a modo de ejemplo, los marcadores SL1847 y SL1887 se pueden usar combinados, opcionalmente con la adición de otros marcadores.

En aspectos adicionales, la divulgación proporciona un método de producción de una planta de lechuga híbrida F1 que tiene resistencia mejorada aBremia lactucae(por ejemplo, en comparación con una planta de control), comprendiendo el método cruzar una planta según la presente invención, que es una planta de lechuga endogámica (por ejemplo,Lactuca sativa),con una planta de lechuga endogámica diferente (por ejemplo,L. sativa)para producir una descendencia de lechuga híbrida F1. Según el método, la segunda planta de lechuga endogámica puede comprender o no una secuencia introgresada según la invención que confiere resistencia aBremia.

En realizaciones, la invención proporciona un método de identificación de una planta de lechuga (por ejemplo, planta deL. sativa)que tiene resistencia mejorada aBremia lactucae(por ejemplo, en comparación con una planta de control), comprendiendo dicho método la etapa de detectar (por ejemplo, mediante genotipado) uno o más de los siguientes marcadores de SNP:

a) un genotipo G en el estado heterocigótico<u>homocigótico para el marcador de SNP SL1831 en SEQ ID NO: 1; b) un genotipo A en el estado heterocigótico<u>homocigótico para el marcador de SNP SL1847 en SEQ ID NO: 6; c) un genotipo G en el estado heterocigótico u homocigótico para el marcador de SNP SL1887 en SEQ ID NO:

11; y/o

d) un genotipo C en el estado heterocigótico u homocigótico para el marcador de SNP SL1883 en SEQ ID NO: 16;

identificando de este modo una planta de lechuga que tiene resistencia mejorada aBremia lactucae.

En aspectos, el método anterior comprende además seleccionar una planta de lechuga que comprende dichos uno o más marcadores de SNP, y cruzar la planta de lechuga seleccionada con una segunda planta de lechuga (por ejemplo, una planta deL. sativa),que puede ser la misma o una planta de lechuga diferente, para producir una planta de lechuga descendiente que comprende el uno o más marcadores moleculares y tiene resistencia mejorada aBremia lactucae.En realizaciones, dicha etapa de selección comprende detectar por genotipado dos o más, tres o más, o los cuatro marcadores de SNP SL1831, SL1847, SL1887 y/o SL1883. Opcionalmente, dicha etapa de detección comprende detectar al menos los siguientes marcadores de SNP (cualquiera o ambos marcadores en forma heterocigótica u homocigótica):

• SL1831 y SL1847;

• SL1831 y SL1883;

• SL1831 y SL1887;

• SL1847 y SL1883;

• SL1847 y SL1887; o

• SL1883ySL1887.

En realizaciones, los marcadores SL1883 y SL1887 se pueden usar juntos, opcionalmente con la adición de otros marcadores. Como otra ilustración a modo de ejemplo, los marcadores SL1847 y SL1887 se pueden usar combinados, opcionalmente con la adición de otros marcadores.

Como otro aspecto más, la divulgación proporciona un método de producción de semillas de lechuga (por ejemplo, semilla deL. sativa),comprendiendo el método cultivar una planta de lechuga a partir de una semilla según la presente divulgación, permitir que la planta produzca más semillas de lechuga y opcionalmente recoger la semilla de lechuga adicional.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a un método para proporcionar una planta de lechuga, parte de una planta (por ejemplo, hoja y/o cabeza) o semilla con resistencia mejorada aBremia,en donde dicho método comprende las siguientes etapas:

a) cruzar una primera planta de lechuga (por ejemplo, planta deL. sativa)que carece de la secuencia introgresada que confiere resistencia aBremiade la invención con una segunda planta de lechuga (por ejemplo, una planta deL. sativa) según cualquier realización de la invención,

b) obtener una planta de lechuga descendiente y,

c) opcionalmente, seleccionar una planta de dicha descendencia caracterizada por que dicha planta descendiente presenta resistencia mejorada a la resistencia aBremia.

Según los aspectos anteriores, opcionalmente, la segunda planta de lechuga es una planta de acceso CGN23091 deL. serriolao 18LEN002364 deL. sativa,o una descendencia o un ancestro de la misma.

En otros aspectos, la divulgación se refiere a un método de identificación de una planta de lechuga (por ejemplo, una planta deL. sativa)que comprende una secuencia introgresada que confiere resistencia aBremiade la invención, en donde dicho método comprende las etapas de:

a) proporcionar una población de lechuga (por ejemplo,L. sativa)que segrega el rasgo de resistencia aBremia;

b) cribar la población segregante para una planta que presenta resistencia aBremia,en donde dicho rasgo de resistencia se puede identificar mediante la presencia de una secuencia introgresada de la invención que confiere resistencia aBremia; y

c) seleccionar una planta de la población segregante, en donde dicha planta comprende el rasgo de resistencia aBremia.

Estos y otros aspectos de la invención se describen con más detalle en la descripción de la invención que sigue.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente descripción no pretende ser un catálogo detallado de todas las diferentes formas en que se puede implementar la invención, o de todas las características que se pueden añadir a la presente invención. Por ejemplo, las características ilustradas con respecto a una forma de realización pueden incorporarse en otras formas de realización, y las características ilustradas con respecto a una forma de realización particular pueden eliminarse de esa forma de realización. Por lo tanto, la invención contempla que en algunas formas de realización de la invención, cualquier característica o combinación de características establecida en el presente documento pueda excluirse u omitirse. Además, para los expertos en la técnica, a la vista de la presente divulgación, resultarán evidentes numerosas variaciones y adiciones a las diversas formas de realización sugeridas en el presente documento que no se apartan de la presente invención. Por lo tanto, las siguientes descripciones pretenden ilustrar algunas formas de realización particulares de la invención, y no especificar exhaustivamente todas las permutaciones, combinaciones y variaciones de las mismas.

Las secuencias de nucleótidos proporcionadas en la presente se presentan en la dirección 5' a 3', de izquierda a derecha y se presentan usando el código estándar para representar bases de nucleótidos como se expone en el artículo 37 del CFR n.° 1.821 - 1.825 y la norma ST.25 de la Organización Mundial de la Propiedad Intelectual (OMPI), por ejemplo: adenina (A), citosina (C), timina (T) y guanina (G).

L<os>aminoácidos son asimismo indicados usando la norma ST.25 de la OMPI, por ejemplo: alanina (Ala; A), arginina (Arg; R), asparagina (Asn; N), ácido aspártico (Asp; D), cisterna (Cys; C), glutamina (Gln; Q), ácido glutámico (GI<u>; E), glicina (Gly; G), histidina (H<ís>; H), isoleucina (lie; 1), leucina (Leu; L), lisina (Lys; K), metionina (Met; M), fenilalanina (Phe; F), prolina (Pro; P), serina (Ser; S), treonina (Thr; T), triptófano (Trp; W), tirosina (Tyr; Y) y valina (Val; V).

Salvo que el contexto indique lo contrario, se pretende específicamente que las diversas características de la invención descritas en el presente documento pueden usarse en cualquier combinación. Además, la presente invención también contempla que, en algunas realizaciones de la invención, pueda excluirse u omitirse cualquier característica o combinación de características expuestas en el presente documento. Para ilustrarla, si la memoria descriptiva afirma que una composición comprende los componentes A, B y C, se pretende específicamente que pueda omitirse y rechazarse cualquiera de A, B o C, o una combinación de los mismos, de forma individual o en cualquier combinación.

DEFINICIONES

A las expresiones y términos técnicos usados dentro del alcance de la presente solicitud generalmente se les da el significado habitualmente aplicado a los mismos en la técnica relevante de mejoramiento y cultivo de plantas si no se indica lo contrario en el presente documento a continuación.

Como se usa en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un/o", "una" y "el/la" incluyen sus plurales, salvo que el contexto indique claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia a "una planta" incluye una o más plantas y la referencia a "una célula" incluye mezclas de células, tejidos y similares.

Como se usa en el presente documento, se entiende que el término "aproximadamente", cuando se refiere a un valor o a una cantidad de masa, peso, tiempo, volumen, concentración o porcentaje, abarca variaciones de, en algunas realizaciones ± 20 %, en algunas realizaciones ± 10 %, en algunas realizaciones ± 5 %, en algunas realizaciones ± 1 %, en algunas realizaciones ± 0,5 % y en algunas realizaciones ± 0,1 % de la cantidad especificada, ya que dichas variaciones son apropiadas para realizar el método divulgado.

Como se usa en el presente documento, una planta de "lechuga" se refiere a cualquier planta del géneroLactuca,que incluye, pero no se limita a,L. sativa, L. saligna, L. virosayL. serriola.En realizaciones, la planta de lechuga es una deL. sativa.En realizaciones, se cultiva la planta de lechuga.

Se entiende dentro del alcance de la invención que una planta de "lechuga cultivada" se refiere a una planta que ya no está en el estado natural, sino que se ha desarrollado y domesticado mediante cuidados humanos y para uso agrícola y/o consumo humano, y excluye accesos de lechuga silvestre, tales como el acceso CGN23091 deL. serriola.Como cuestión de ejemplo, en realizaciones, los tallos y/u hojas de una planta de lechuga cultivada no tienen espinas y tienen una flor cerrada. Como alternativa o adicionalmente, la planta de lechuga cultivada es una planta híbrida. Como alternativa o adicionalmente, la planta de lechuga cultivada es una planta deL. sativa.En el contexto de un cruce interespecífico entre una planta deL. sativay una lechuga silvestre, una planta descendiente de dicho cruce interespecífico se considera una planta de "lechuga cultivada" cuando dicha planta descendiente se ha retrocruzado al menos tres veces contra una planta deL. sativa.

Se entiende dentro del alcance de la invención que un "alelo" se refiere a formas alternativas o variantes de un gen u otro elemento genético. Dichas formas alternativas o variantes pueden ser el resultado de polimorfismos, inserciones, inversiones, translocaciones o deleciones de un solo nucleótido, o la consecuencia de la regulación génica provocada, por ejemplo, por modificación química o estructural, regulación de la transcripción o modificación/regulación postraduccional. En una célula u organismo diploide, los dos alelos de un gen o elemento genético dado normalmente ocupan los locus correspondientes en un par de cromosomas homólogos.

"Bremia lactucae".Oomycete que causa mildiú en lechuga, particularmente en regiones de crecimiento más frías.

Como se usa en el presente documento, los términos "resistencia" y "resistente" (y términos similares) se refieren a la capacidad de una planta de restringir el crecimiento y desarrollo de un patógeno específico y/o el daño causado por el patógeno cuando se compara con plantas susceptibles en condiciones ambientales y presión del patógeno similares. La resistencia puede ser cualitativa o cuantitativa. En realizaciones, una planta "resistente" presenta síntomas reducidos, esencialmente inexistentes o incluso ningún síntoma para un patógeno específico. En algunas realizaciones, las plantas "resistentes" muestran algunos síntomas, pero aún son capaces de producir un producto comercializable con un rendimiento aceptable, por ejemplo, el rendimiento puede reducirse y/o las plantas pueden atrofiarse en comparación con el rendimiento y/o crecimiento en ausencia del patógeno. En realizaciones, una planta de lechuga según la invención es resistente a al menos las razas BI 16-36EU deBremia lactucaetal como se caracteriza y clasifica según el código SEXTET por IBEB (International Bremia Evaluation Board). En realizaciones, una planta de lechuga resistente aBremiade la invención no presenta necrosis o muy pocas necrosis sin esporulación o esporulación muy escasa en condiciones de prueba estándar, por ejemplo, las condiciones de prueba definidas en el Ejemplo 1 a continuación, por ejemplo, cuando se inocula con cualquiera de las razas BI 16-36EU deBremia.En realizaciones, la resistencia aBremiade la invención es dominante. En realizaciones, la resistencia aBremiaes cualitativa. En realizaciones, la resistencia aBremiade la invención presencia herencia monogénica.

La expresión "resistencia mejorada aBremia"(y expresiones similares) se entiende en el presente documento que significa que una planta es más resistente a al menos una raza o aislado deBremia(por ejemplo, una mejora estadísticamente significativa en la resistencia aBremiaen comparación con una planta de lechuga de control que no comprende una secuencia introgresada de la invención, a p< 0,1, p < 0,05 o p < 0,01 usando la prueba de Student) y/o tiene un especto más amplio de resistencia aBremia(por ejemplo, tiene resistencia contra una o más razas/aislados deBremiaadicionales) en comparación con una planta de lechuga de control que no comprende una secuencia introgresada de la invención. En realizaciones, "resistencia mejorada aBremia"se refiere a la provisión de una resistencia adicional contra una o más razas o aislados deBremiaque la planta puede haber tenido ya (es decir, apilamiento de resistencia), reduciendo de este modo el riesgo de que la resistencia aBremiase rompa en comparación con una planta que carece de dicha secuencia introgresada (es decir, como una forma de gestión de la resistencia).

Se entiende dentro del alcance de la invención que una "planta de lechuga de control" significa una planta de lechuga de la misma especie que la planta de lechuga de la invención (por ejemplo,L. sativa)y no tiene la secuencia introgresada de la presente invención ligada a la resistencia aBremia(por ejemplo, una de las plantas de lechuga progenitoras que no tiene una secuencia introgresada de la invención). En realizaciones, la planta de lechuga de control tiene el mismo acervo genético que la planta de lechuga de la presente invención, y opcionalmente es una planta que pertenece a la misma variedad de planta que no comprende la secuencia introgresada de la presente invención. La variedad de planta en el presente documento se entiende según la definición de UPOV. Por tanto, una planta de lechuga de control puede ser una línea casi isogénica, una línea endogámica o un híbrido con la condición de que tengan el mismo acervo genético que la planta de lechuga de la presente invención, excepto que la planta de control no tiene la secuencia introgresada de la presente invención ligada a la resistencia aBremia.La planta de lechuga de control se cultiva durante el mismo periodo de tiempo y en las mismas condiciones que la planta de lechuga de la invención.

El término "rasgo" se refiere a una característica o un fenotipo (por ejemplo, una resistencia a enfermedades, tal como resistencia aBremia).Un rasgo puede heredarse de una manera dominante o recesiva, o de una manera dominante parcial o incompleta. En el contexto de la presente invención, la resistencia aBremiade la presente invención es un rasgo dominante. Por lo tanto, una planta de lechuga de la invención puede ser homocigótica u heterocigótica para el rasgo. Además, un rasgo puede ser monogénico o poligénico, o puede resultar de la interacción de uno o más genes con el medioambiente. En el contexto de la presente invención, la secuencia introgresada que confiere resistencia aBremiaubicada en el cromosoma 2 presenta herencia monogénica y es suficiente para conferir el rasgo de resistencia aBremia.

Las expresiones "híbrido", "planta híbrida" y "progenie híbrida" se refieren a un individuo producido a partir de progenitores genéticamente diferentes (por ejemplo, un individuo genéticamente heterocigótico o mayormente heterocigótico).

La expresión "línea endogámica" se refiere a una población genéticamente homocigótica o casi homocigótica. Una línea endogámica, por ejemplo, puede obtenerse mediante varios ciclos de reproducción entre hermanos o de autopolinización o mediante producción de dihaploides.

La expresión "línea dihaploide", se refiere a líneas endogámicas estables que han surgido de otro cultivo. Algunos granos de polen (haploides) cultivados en medio y circunstancias específicas pueden desarrollar plántulas que contienen n cromosomas. Estas plántulas entonces están "duplicadas" y contienen 2n cromosomas. La descendencia de estas plántulas se llama "dihaploide" y esencialmente ya no son segregantes (estables).

El término "cultivar" o "variedad" se refiere a una variedad creada de forma hortícola, como se distingue de una variedad de origen natural. En algunas realizaciones de la presente invención, los cultivares o variedades son comercialmente valiosos.

La expresión "fijo genéticamente" se refiere a un elemento genético que se ha incorporado de forma estable en el genoma de una planta que normalmente no contiene el elemento genético. Cuando se fija genéticamente, el elemento genético se puede transmitir de una manera fácil y predecible a otras plantas mediante cruces sexuales.

El término "planta" o "parte de la planta" se refiere en el presente documento a una parte de la planta, órgano o tejido que se puede obtener de una planta según la invención, que incluye, pero no se limita a, hojas, tallos, raíces, flores o partes de flores, frutos, brotes, gametofitos, esporofitos, polen, anteras, microesporas, óvulos, cigotos, embriones, regiones meristemáticas, tejido calloso, semillas, esquejes, cabezas, núcleos, cultivos de células o tejidos (incluidos los cultivos de callos) o cualquier otra parte o producto de la planta. En realizaciones, la parte de la planta comprende la secuencia introgresada de la invención. En realizaciones, la parte de la planta presenta el rasgo de resistencia aBremiasegún la invención, particularmente cuando se cultiva en una planta que produce hojas y/o cabezas de lechuga.

Una "planta" es cualquier planta en cualquier estado de desarrollo.

Una "semilla" de planta es una semilla que crece para obtener una planta según cualquiera de las realizaciones.

Una "célula vegetal" es una unidad estructural y fisiológica de una planta, que comprende un protoplasto y una pared celular. La célula vegetal puede estar en forma de una única célula aislada o de una célula cultivada, o como parte de una unidad con una organización superior tal como, por ejemplo, un tejido vegetal, un órgano vegetal o una planta entera. El "cultivo de células vegetales" significa cultivos de unidades vegetales tales como, por ejemplo, protoplastos, células de cultivo celular, células en tejidos vegetales, polen, tubos polínicos, óvulos, sacos embrionarios, cigotos y embriones en diferentes estados de desarrollo.

Un "órgano de una planta" es una parte distinta y visiblemente estructurada y diferenciada de una planta, tal como una raíz, tallo, hoja, yema floral, o embrión.

"Tejido vegetal", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo de células vegetales organizadas en una unidad estructural y funcional. Se incluye cualquier tejido de una plantain plantao en cultivo. Este término incluye, pero no se limita a, plantas enteras, órganos vegetales, semillas de plantas, histocultivo y cualquier grupo de células vegetales organizadas en unidades estructurales y/o funcionales. El uso de esta expresión junto con, o en ausencia de, cualquier tipo específico de tejido vegetal, como los enumerados anteriormente o que esté englobado de otra manera por esta definición, no pretende ser exclusivo de ningún otro tipo de tejido vegetal.

Se entiende dentro del alcance de la invención que "alimento procesado" significa alimento que se ha alterado de su estado natural. Los métodos usados para procesar alimentos incluyen, pero no se limitan a, corte, corte en rebanadas, troceado, molienda, enlatado, congelación, refrigeración, deshidratación, calentamiento y procesamiento aséptico.

Se entiende dentro del alcance de la invención que "mercado de productos frescos" significa hortalizas en el mercado que se han procesado mínimamente.

Como se usa en el presente documento, la expresión "alelo marcador" o "alelo de un locus marcador" (y expresiones similares) se refiere a un alelo (como se define en el presente documento) en un locus polimórfico que se usa como marcador para localizar y/o indicar la presencia de uno o más loci genéticamente ligados que contribuyen a la variabilidad de uno o más rasgos fenotípicos (por ejemplo, un locus de resistencia aBremia).

Como se usa en el presente documento, "locus marcador" se refiere a una región en un cromosoma, que comprende un nucleótido o una secuencia polinucleotídica que está presente en el genoma de un individuo y que está asociada genéticamente con uno o más locus de interés, que pueden comprender un gen o cualquier otro determinante o factor genético que contribuya a un rasgo. "Locus marcador" también se refiere a una región en un cromosoma, que comprende una secuencia polinucleotídica complementaria a una secuencia genómica, tal como una secuencia de un ácido nucleico usado como sonda. Un locus marcador puede usarse para rastrear la presencia de un segundo locus vinculado, por ejemplo, un locus vinculado que codifica o contribuye a la expresión de un rasgo fenotípico. Por ejemplo, un locus marcador puede usarse para controlar la segregación de alelos en un locus, tal como un QTL o gen individual, que están genética o físicamente vinculado al locus marcador.

Como se usa en el presente documento, el término "reproducción", y variantes gramaticales del mismo, se refieren a cualquier proceso que genere un individuo descendiente. La reproducción puede ser sexual o asexual, o cualquier combinación de las mismas. Tipos no limitativos a modo de ejemplo de reproducciones incluyen cruces, autopolinización, generación de derivados haploides duplicados, y combinaciones de los mismos.

Como se usa en el presente documento, la expresión "población reproductora establecida" se refiere a un conjunto de posibles parejas reproductoras producidas por y/o usadas como progenitores en un programa de reproducción; por ejemplo, un programa de reproducción comercial. Los miembros de la población reproductora establecida están normalmente bien caracterizados genética y/o fenotípicamente. Por ejemplo, varios rasgos fenotípicos de interés podrían haber sido evaluados, por ejemplo, en diferentes condiciones ambientales, en múltiples ubicaciones y/o en diferentes momentos. Alternativamente o además, uno o más loci genéticos asociados con la expresión de los rasgos fenotípicos podrían haber sido identificados, y uno o más de los miembros de la población reproductora podrían haber sido genotipados con respecto al uno o más loci genéticos, así como con respeto a uno o más marcadores genéticos que están asociados con uno o más loci genéticos.

Como se usa en el presente documento, el término "diploide" se refiere a una planta que tiene dos conjuntos de cromosomas, normalmente uno de cada uno de sus dos progenitores. Sin embargo, se entiende que, en algunas realizaciones, una planta diploide puede recibir sus conjuntos de cromosomas "maternos" y "paternos" del mismo organismo individual, tal como cuando una planta se autopoliniza para producir una generación posterior de plantas.

Se entiende, dentro del alcance de la invención, que "homocigótico" se refiere a alelos similares en uno o más locus correspondientes en cromosomas homólogos.

Se entiende, dentro del alcance de la invención, que "heterocigótico" se refiere a alelos diferentes en uno o más locus correspondientes en cromosomas homólogos.

Se entiende, dentro del alcance de la invención, que un alelo "dominante" se refiere a un alelo que determina el fenotipo cuando está presente en el estado heterocigótico u homocigótico.

Un alelo "recesivo" se refiere a un alelo que determina el fenotipo solo cuando está presente en el estado homocigoto.

Se entiende, dentro del alcance de la invención, que "retrocruzamiento" se refiere a un proceso en que una descendencia híbrida se retrocruza repetidamente con uno de los progenitores (el progenitor "recurrente"). Se pueden usar diferentes progenitores recurrentes en retrocruzamientos posteriores.

Se entiende, dentro del alcance de la invención, que "locus" se refiere a una región en un cromosoma, que comprende un gen o cualquier otro elemento o factor genético que contribuye a un rasgo.

Se entiende, dentro del alcance de la invención, que "ligamiento genético" se refiere a una asociación de caracteres de herencia debido a la ubicación de genes en la proximidad en el mismo cromosoma, medidos por porcentaje de recombinación entre loci (centi-Morgan, cM).

A efectos de la presente invención, el término "cosegregación" se refiere al hecho de que el alelo para el rasgo y el o los alelos para el o los marcadores tienden a transmitirse juntos, debido a que están físicamente cerca en el mismo cromosoma (es decir, recombinación reducida entre ellos debido a su proximidad física), lo que da como resultado una asociación no aleatoria de sus alelos como resultado de su proximidad en el mismo cromosoma. El término "asociado con" puede usarse con un significado igual.

Como se usa en el presente documento, la expresión "arquitectura genética en el locus del rasgo cuantitativo/cualitativo" se refiere a una región genómica que está correlacionada estadísticamente con el rasgo fenotípico de interés y representa la base genética subyacente del rasgo fenotípico de interés.

Como se usa en el presente documento, la expresión "marcador genético" o "marcador molecular" se refiere a una característica del genoma de un individuo (por ejemplo, un nucleótido o una secuencia polinucleotídica que está presente en el genoma de un individuo) que está asociada a uno o más locus de interés. En algunas realizaciones, un marcador genético es polimórfico en una población de interés, o el locus ocupado por el polimorfismo, dependiendo del contexto. Los marcadores genéticos incluyen, por ejemplo, polimorfismos mononucleotídicos (SNP), indeles (es decir, inserciones/deleciones), repeticiones de secuencia simple (SSR), polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), ADN polimórficos amplificados aleatoriamente (RAPD), marcadores de secuencia polimórfica amplificada y escindida (CAPS), marcadores de tecnología de matrices de diversidad (DArT) y polimorfismos de longitud de fragmentos amplificados (AFLP), entre muchos otros ejemplos. Los marcadores genéticos pueden usarse, por ejemplo, para localizar locus genéticos que contienen alelos en un cromosoma que contribuye a variabilidad de un rasgo o rasgos fenotípicos. La expresión "marcador genético" también se puede referir a una secuencia polinucleotídica complementaria a una secuencia genómica, tal como una secuencia de un ácido nucleico usado como sonda. En realizaciones, un marcador genético puede ubicarse físicamente en una posición en un cromosoma que está dentro o fuera del locus genético con el que está asociado (es decir, es intragénico o extragénico, respectivamente).

Como se usa en el presente documento, el término "genotipo" se refiere a la constitución genética de una célula u organismo. El genotipo para un conjunto de marcadores genéticos de un individuo incluye los alelos específicos para uno o más locus marcadores genéticos, presentes en el haplotipo de un individuo. Como se sabe en la técnica, un genotipo puede estar relacionado con un único locus o con múltiples locus, pudiendo estar los locus relacionados o no relacionados y/o ligados o no ligados. En algunas realizaciones, el genotipo de un individuo se refiere a uno o más genes que están relacionados, en que el uno o más genes están implicados en la expresión de un fenotipo de interés (por ejemplo, un rasgo cuantitativo como se define en el presente documento). Por lo tanto, en algunas realizaciones, un genotipo comprende uno o más alelos presentes dentro de un individuo en uno o más locus genéticos. En algunas realizaciones, un genotipo se expresa en término de un haplotipo (también definido en el presente documento).

Como se usa en el presente documento, el término "germoplasma" se refiere a la totalidad de los genotipos de una población u otro grupo de individuos (por ejemplo, una especie). El término "germoplasma" también se puede referir a material vegetal; por ejemplo, un grupo de plantas que actúan como depósito de diversos alelos. La expresión "germoplasma adaptado" se refiere a materiales vegetales de superioridad genética probada; por ejemplo, para un entorno o área geográfica dado, mientras que las expresiones "germoplasma no adaptado", "germoplasma bruto" y "germoplasma exótico" se refieren a materiales vegetales de valor genético desconocido o no probado, por ejemplo, para un entorno o área geográfica dado. Como tal, la expresión "germoplasma no adaptado" se refiere en algunas realizaciones a materiales vegetales que no forman parte de una población reproductora establecida y que no tienen una relación conocida con un miembro de la población reproductora establecida.

Un "haplotipo" es el genotipo de un individuo en una pluralidad de loci genéticos, es decir, una combinación de alelos. Normalmente, los loci genéticos que definen un haplotipo están vinculados física y genéticamente, es decir, múltiples loci a lo largo del mismo segmento cromosómico.

Como se usa en el presente documento, los términos "introgresión", "introgresar" e "introgresado" (y variantes gramaticales de los mismos) se refieren tanto a la transmisión natural como artificial de un alelo deseado o combinación de alelos deseados de un locus genético o loci genéticos de un acervo genético a otro. Por ejemplo, un alelo deseado en un locus específico puede transmitirse a al menos una descendencia a través de un cruce sexual entre dos progenitores, donde al menos uno de los progenitores tiene el alelo deseado en su genoma (el progenitor "donante") Alternativamente, por ejemplo, la transmisión de un alelo puede ocurrir por recombinación entre dos genomas donantes, por ejemplo, en un protoplasto fusionado, donde al menos uno de los protoplastos donantes tiene el alelo deseado en su genoma. La descendencia que comprende el alelo deseado se puede retrocruzar repetidamente con un progenitor recurrente para crear una línea que tenga un acervo genético deseado y se selecciona para el alelo deseado, siendo el resultado que el alelo deseado se fija en el acervo genético deseado. Por ejemplo, un marcador asociado con una resistencia mejorada aBremiapuede introgresarse desde un progenitor donante en un progenitor recurrente que no comprende la secuencia introgresada. La descendencia resultante puede retrocruzarse opcionalmente repetidamente con el progenitor recurrente y seleccionarse hasta que la progenie posea la secuencia introgresada que confiere resistencia aBremiaen el acervo del progenitor recurrente.

Como se usa en el presente documento, el término "ligamiento" y variantes gramaticales del mismo, se refiere a la tendencia de alelos en diferentes loci en el mismo cromosoma de segregar juntos más a menudo que lo que se esperaría por probabilidad si su transmisión fuera independiente, en algunas realizaciones como una consecuencia de su proximidad física.

Como se usa en el presente documento, la expresión "ácido nucleico" se refiere a cualquier cadena física de unidades monoméricas que puede corresponder a una cadena de nucleótidos, incluido un polímero de nucleótidos (por ejemplo, un polímero típico de ADN, ADNc o ARN), oligonucleótidos modificados (por ejemplo, oligonucleótidos que comprenden bases que no son típicas de ARN o ADN biológicos, tales como oligonucleótidos 2'-O-metilados), y similares. En algunas realizaciones, un ácido nucleico puede ser monocatenario, bicatenario, multicatenario, o combinaciones de los mismos. A menos que se indique lo contrario, una secuencia de ácido nucleico particular de la materia en cuestión divulgada en la presente comprende y/o codifica secuencias complementarias, además de cualquier secuencia explícitamente indicada.

Como se usa en el presente documento, el término "pluralidad" se refiere a más de uno. Por lo tanto, una "pluralidad de individuos" se refiere a al menos dos individuos. En algunas realizaciones, el término pluralidad se refiere a más de la mitad del total. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una "pluralidad de una población" se refiere a más de la mitad de los miembros de esa población. Estos usos del término "pluralidad" serán evidentes para los expertos en la materia dependiendo del contexto.

Como se usa en el presente documento, el término "descendencia" se refiere al o a los descendientes de un cruce particular. Normalmente, la descendencia resulta de la reproducción de dos individuos, aunque algunas especies (particularmente algunas plantas y animales hermafroditas) pueden autopolinizarse (es decir, la misma planta actúa como donadora de gametos tanto masculinos como femeninos). El o los descendientes pueden ser de cualquier generación, por ejemplo, de la generación F<1>, F<2>, o cualquier generación posterior.

Como se usa en el presente documento, la expresión "rasgo cualitativo" se refiere a un rasgo fenotípico que es controlado por uno o unos pocos genes que presentan efectos fenotípicos importantes. Debido a esto, los rasgos cualitativos normalmente se heredan simplemente. Ejemplos en plantas incluyen, pero no se limitan a, el color de la flor y varias resistencias a enfermedades conocidas, tales como, por ejemplo, la resistencia aBremiade la presente invención.

Como se usa en el presente documento, la expresión "rasgo cuantitativo" se refiere a un rasgo fenotípico que puede describirse numéricamente (es decir, cuantificarse o contabilizarse). Un rasgo cuantitativo normalmente muestra variación continua entre I<os>individuos de una población; es decir, las diferencias en el valor numérico del rasgo fenotípico son ligeras y se clasifican entre sí. Frecuentemente, la distribución de frecuencia en una población de un rasgo fenotípico cuantitativo muestra una curva con forma de campana (es decir, muestra una distribución normal entre dos extremos). Un "rasgo cuantitativo" normalmente es el resultado de un locus genético que interactúa con el entorno o de la interacción de múltiples locus genéticos entre sí y/o con el entorno. Ejemplos de rasgos cuantitativos incluyen la altura y el rendimiento de la planta.

Como se usan en el presente documento, las expresiones "locus de rasgo cuantitativo" y "asociación de rasgo marcador" se refieren a una asociación entre un marcador genético y una región cromosómica y/o gen que afecta al fenotipo de un rasgo de interés. Normalmente, esto se determina estadísticamente; por ejemplo, basándose en uno<o>más métodos publicados en la bibliografía. Un QTL puede ser una región cromosómica y/o un locus genético con al menos dos alelos que afectan diferencialmente un rasgo fenotípico (ya sea un rasgo cuantitativo o cualitativo).

La expresión "planta receptora" se usa en el presente documento para indicar una planta que va a recibir ADN obtenido de una planta donante que comprende una secuencia introgresada para un rasgo de interés (por ejemplo, resistencia aBremia).Dicha "planta receptora" puede comprender ya o no una o más secuencias nativas o introgresadas para resistencia aBremia,en cuyo caso la expresión indica una planta que va a recibir una secuencia introgresada adicional en un locus diferente.

La expresión "acervo genético natural" se usa en el presente documento para indicar el acervo genético original de una secuencia genética de interés. Dicho acervo genético puede ser, por ejemplo, el genoma de un acceso silvestre. Por ejemplo, las secuencias genéticas de la presente invención se encontraban en ubicaciones específicas en el cromosoma 2 de una planta deL. serriola.Por el contrario, un método que implica la transferencia de ADN, por ejemplo, mediante reproducción, que comprende esta secuencia genética desde , por ejemplo, el cromosoma 2 de una planta deL. serriolaa la misma posición en el cromosoma 2 de otra especie de lechuga (por ejemplo,L. sativa),dará como resultado que esta secuencia genética no esté en su acervo genético natural. Cuando las secuencias genéticas de la presente invención se transfieren desde un acervo deL. serriolaen otra especie de lechuga (por ejemplo,L. sativa),se las denomina "secuencia introgresada" o "secuencia genética introgresada" (o expresiones similares).

Se entiende, dentro del alcance de la invención, que una "planta donante" significa la planta que proporciona al menos una secuencia para una resistencia mejorada aBremia(es decir, que se va a introgresar en la planta receptora).

Se entiende, dentro del alcance de la invención, que "selección basada en marcadores" se refiere, por ejemplo, al uso de marcadores genéticos para detectar uno o más ácidos nucleicos de la planta, donde el ácido nucleico está asociado con un rasgo deseado para identificar plantas que portan alelo(s) que confieren rasgos deseables (o no deseables), de modo que esas plantas puedan usarse (o evitarse) en un programa de reproducción selectiva.

Un polimorfismo mononucleotídico (SNP), una variación en un solo sitio en el ADN, es el tipo más frecuente de variación en el genoma. Un SNP es una variación de secuencia de ADN que se produce cuando un solo nucleótido -A, T, C o G - en el genoma (u otra secuencia compartida) difiere entre miembros de una especie biológica o cromosomas emparejados en un individuo. Por ejemplo, dos fragmentos de ADN secuenciados de diferentes individuos, AAGCCTA a AAGCTTA, contienen una diferencia en un solo nucleótido. En este caso hay dos alelos: C y T Los principios básicos de la matriz de SNP son los mismos que la micromatriz de ADN. Estos son la convergencia de hibridación de ADN, microscopia de fluorescencia y captura de ADN. Los tres componentes de las matrices de SNP son: la matriz que contiene secuencias de ácido nucleico (es decir, secuencia amplificada o diana), una o más sondas oligonucleotídicas específicas de alelo marcadas y un sistema de detección que registra e interpreta la señal de hibridación. La presencia o ausencia del alelo deseado puede determinarse, por ejemplo, por PCR en tiempo real usando tintes de ADN bicatenario o el método de sonda indicadora fluorescente.

Se entiende, dentro del alcance de la invención, que "PCR (reacción en cadena de la polimerasa)" se refiere a un método de producción de cantidades relativamente grandes de regiones específicas de ADN o uno o más subconjuntos del genoma, haciendo posible de ese modo diversos análisis que se basan en esas regiones.

Se entiende, dentro del alcance de la invención, que "cebador de PCR" se refiere a fragmentos relativamente cortos de ADN monocatenario usados en la amplificación por PCR de regiones específicas de ADN.

Se entiende, dentro del alcance de la invención, que "fenotipo" se refiere a una o más características distinguibles de un rasgo genéticamente controlado.

Como se usa en el presente documento, la expresión "rasgo fenotípico" se refiere al aspecto u otra característica detectable de un individuo, que resulta de la interacción de su genoma, proteoma y/o metaboloma con el entorno.

Se entiende, dentro del alcance de la invención, que "polimorfismo" se refiere a la presencia en una población de dos o más formas diferentes de un gen, marcador genético o rasgo hereditario o un producto génico obtenible, por ejemplo, a través de empalme alternativo, metilación del ADN, etc.

"Sonda", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo de átomos o moléculas que es capaz de reconocer y unirse a una molécula o estructura celular diana específica, y por lo tanto de permitir la detección de la molécula o estructura diana. En realizaciones, una "sonda" se refiere a una secuencia de ADN o ARN marcada que puede usarse para detectar la presencia de y cuantificar una secuencia complementaria por hibridación molecular.

Como se usan en el presente documento, la expresiones "cruce sexual" y "reproducción sexual", en el contexto de la materia en cuestión divulgada en el presente documento, se refiere a la fusión de gametos para producir descendencia (por ejemplo, por fecundación, tal como para producir semillas por polinización en plantas). Un "cruce sexual" o "fecundación cruzada" es, en algunas realizaciones, la fecundación de un individuo con otro (por ejemplo, polinización cruzada en plantas).

Se entiende, dentro del alcance de la invención, que "reproducción selectiva" se refiere a un programa de reproducción que usa plantas que poseen o presentan rasgos deseables como progenitores.

El término "autopolinización" se refiere, en algunas realizaciones, a la producción de semillas por autofecundación o autotransferencia de polen es decir, el polen y el óvulo son de la misma planta.

Se entiende, dentro del alcance de la invención, que la planta "de prueba" se refiere a una planta del géneroSolanumusada para caracterizar genéticamente un rasgo en una planta a ensayar. Normalmente, la planta que se va a ensayar se cruza con una planta "de prueba" y se puntúa la relación de segregación del rasgo en la descendencia del cruce.

El término "hibridar", como se usa en el presente documento, se refiere a condiciones de hibridación convencionales, preferiblemente a condiciones de hibridación en las que se usa 5xSSPE, SDS al 1 %, disolución de Denhardt 1 x como disolución, y/o las temperaturas de hibridación están entre 35 °C y 70 °C, preferiblemente 65 °C. Después de la hibridación, el lavado se lleva a cabo preferiblemente primero con 2xSSC, SDS al 1 %, y posteriormente con 0,2xSSC a temperaturas entre 35 °C y 75 °C, particularmente entre 45 °C y 65 °C, pero especialmente a 59 °C (con respecto a la definición de SSPE, SSC y disolución de Denhardt, véase Sambrook et al., loc. cit.). Las condiciones de hibridación de alta rigurosidad, como se describen, por ejemplo, en Sambrook et al., arriba, son particularmente preferidas. Condiciones de hibridación rigurosas particularmente preferidas están presentes, por ejemplo, si la hibridación y el lavado se producen a 65 °C, como se indica anteriormente. Condiciones de hibridación no rigurosas, por ejemplo, con hibridación y lavado realizados a 45 °C, son menos preferidas y a 35 °C incluso menos.

Según la presente invención, la expresión "dicha posición correspondiente a la posición X", siendo X cualquier número que se encuentre en el contexto respectivo en la presente solicitud, no solo incluye la posición respectiva en SEQ ID NO a la que se hace referencia posteriormente, sino que también incluye cualquier secuencia que codifica una secuencia genética de la invención, donde, después del alineamiento con SEQ ID NO de referencia, la posición respectiva puede tener un número diferente, pero corresponde al indicado para SEQ ID NO. de referencia La alineación de secuencias genéticas se puede llevar a cabo aplicando diversas herramientas de alineación conocidas por el experto en la materia.

Las "condiciones de hibridación rigurosas" y las "condiciones de hibridación y lavado rigurosas", en el contexto de los experimentos de hibridación de ácidos nucleicos, tales como las hibridaciones de Southern y Northern, dependen de la secuencia y son diferentes para parámetros ambientales diferentes. Las secuencias más largas se hibridan específicamente a temperaturas más elevadas. Una guía extensa para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, parte I, capítulo 2, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays" Elsevier, Nueva York. En general, las condiciones de hibridación y lavado altamente rigurosas se seleccionan para que sean aproximadamente 5 °C más bajas que el punto de fusión térmico para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. Normalmente, en "condiciones rigurosas", una sonda se hibridará con su subsecuencia diana, pero no con otras secuencias.

El "punto de fusión térmico" es la temperatura (a una fuerza iónica y pH definidos) a la que el 50 % de la secuencia diana se hibrida con una sonda perfectamente emparejada. Las condiciones muy rigurosas se seleccionan para que sean iguales a la temperatura de fusión (T<m>) para una sonda particular. Un ejemplo de condiciones de hibridación rigurosas para la hibridación de ácidos nucleicos complementarios que tienen más de 100 restos complementarios en un filtro en una transferencia Southern o northern es formamida al 50 % con 1 mg de heparina a 42 °C, llevándose a cabo la hibridación durante la noche. Un ejemplo de condiciones de lavado altamente rigurosas es NaCl 0,15 M a 72 °C durante aproximadamente 15 minutos. Un ejemplo de condiciones de lavado rigurosas es un lavado 0,2 veces SSC a 65 °C durante 15 minutos (véase, Sambrook, más adelante, para una descripción del tampón SSC). A menudo, un lavado de rigurosidad alta va precedido por un lavado de rigurosidad baja para eliminar la señal de fondo de la sonda. Un ejemplo de lavado de rigurosidad media para una estructura bicatenaria de, por ejemplo, más de 100 nucleótidos, es 1 vez SSC a 45 °C durante 15 minutos. Un ejemplo de lavado de rigurosidad baja para una estructura bicatenaria de, por ejemplo, más de 100 nucleótidos, es 4-6 veces SSC a 40 °C durante 15 minutos. Para sondas cortas (por ejemplo, de aproximadamente 10 a 50 nucleótidos), las condiciones rigurosas implican normalmente concentraciones de sal de menos de aproximadamente 1,0 M de ion Na, normalmente de aproximadamente 0,01 a 1,0 M de ion Na (u otras sales) a pH 7,0 a 8,3, y la temperatura es normalmente de al menos aproximadamente 30 °C. También se pueden conseguir condiciones rigurosas con la adición de agentes desestabilizantes, tales como formamida. En general, una relación de señal a ruido de 2 veces (o mayor) que la observada para una sonda no relacionada en el ensayo de hibridación particular indica detección de una hibridación específica. Los ácidos nucleicos que no se hibridan entre sí en condiciones rigurosas siguen siendo sustancialmente idénticos si las proteínas que codifican son sustancialmente idénticas. Esto ocurre, por ejemplo, cuando se crea una copia de un ácido nucleico usando la degeneración máxima del codón permitida por el código genético.

PLANTAS, SEMILLAS, PRODUCTOS.

En un primer aspecto, la divulgación proporciona una planta de lechuga (por ejemplo, una planta deLactuca sativa)que tiene resistencia mejorada aBremia lactucae(por ejemplo, en comparación con una planta de control) que comprende una secuencia introgresada deLactuca serriolaque confiere una resistencia aBremia lactucae,en donde dicha secuencia introgresada está comprendida en un acceso deLactuca serriola(por ejemplo, acceso CGN23091) o en la línea 18LEN002364 deLactuca sativadepositada y en donde dicha secuencia introgresada está ubicada en el cromosoma 2. En realizaciones, la resistencia es una resistencia cualitativa. En realizaciones, la resistencia es una resistencia cualitativa. En aspectos, la resistencia presenta herencia monogénica.

En aspectos, la planta de la divulgación es una planta cultivada, opcionalmente una planta deL. sativacultivada.

En aspectos, dicha secuencia introgresada confiere resistencia al menos contra las razas BI 16-36EU deBremia lactucae.

En aspectos, la secuencia introgresada comprende uno o más de los marcadores de SNP mostrados en la Tabla 3 en la presente invención. En aspectos, la introgresión comprende uno o más, dos o más, tres o más o los cuatro siguientes marcadores de SNP:

a) un genotipo G en el estado heterocigótico<u>homocigótico para el marcador de SNP SL1831 en SEQ ID NO: 1;

b) un genotipo A en el estado heterocigótico u homocigótico para el marcador de SNP SL1847 en SEQ ID NO: 6;

c) un genotipo G en el estado heterocigótico u homocigótico para el marcador de SNP SL1887 en SEQ ID NO:

11; y/o

d) un genotipo C en el estado heterocigótico u homocigótico para el marcador de SNP SL1883 en SEQ ID NO:

16.

En un aspecto adicional:

a) el genotipo G para el marcador SL1831 puede identificarse en una PCR por amplificación de un fragmento de ácido nucleico con un par de cebadores oligonucleotídicos: cebador directo de SEQ ID NO: 2 y cebador inverso de SEQ ID NO: 5 y una sonda de SEQ ID NO: 3;

b) el genotipo A para el marcador de SNP SL1847 puede identificarse en una PCR por amplificación de un fragmento de ácido nucleico con un par de cebadores oligonucleotídicos: cebador directo de SEQ ID NO: 7 y cebador inverso de SEQ ID NO: 10 y una sonda de SEQ ID NO: 8;

c) el genotipo G para el marcador de SNP SL1887 puede identificarse en una PCR por amplificación de un fragmento de ácido nucleico con un par de cebadores oligonucleotídicos: cebador directo de SEQ ID NO: 12 y cebador inverso de SEQ ID NO: l5 y una sonda de SEQ ID NO: 13; y

d) el genotipo C para el marcador de SNP SL1883 puede identificarse en una PCR por amplificación de un fragmento de ácido nucleico con un par de cebadores oligonucleotídicos: cebador directo de SEQ ID NO: 17 y cebador inverso de SEQ ID NO: 20 y una sonda de SEQ ID NO: 18.

En aspectos representativos, la planta de la divulgación comprende al menos los siguientes marcadores de SNP (cada marcador individual está presente en forma heterocigótica u homocigótica):

• SL1831 y SL1847;

• SL1831 y SL1883;

• SL1831 y SL1887;

• SL1847 y SL1883;

• SL1847 y SL1887;

• SL1883y SL1887;

• SL1831, SL1847y SL1883;

• SL1831, SL1847 y SL1887;

• SL1847, SL1883 y SL1887; o

• SL1831, SL1847, SL1883 ySL1887.

Por ejemplo, los marcadores SL1883 y SL1887 se pueden usar juntos, opcionalmente con la adición de otros marcadores. Como otra ilustración a modo de ejemplo, los marcadores SL1847 y SL1887 se pueden usar combinados, opcionalmente con la adición de otros marcadores.

En aspectos representativos, la secuencia introgresada comprende una o más, dos o más, tres o más o las cuatro de SEQ ID NO: 1 que tiene un alelo marcador de resistencia representado por el nucleótido G en la posición 112, SEQ ID NO: 6 que tiene un alelo marcador de resistencia representado por el nucleótido A en la posición 112, SEQ ID NO: 11 que tiene un alelo marcador de resistencia representado por el nucleótido G en la posición 99 y/o SEQ ID NO: 16 que tiene un alelo marcador de resistencia representado por el nucleótido C en la posición 41, o una secuencia que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una o más de las secuencias anteriores y comprende el alelo marcador de resistencia.

En un aspecto adicional, la divulgación proporciona una planta según cualquiera de los aspectos descritos en el presente documento, en donde dicha planta comprende al menos una copia (por ejemplo, es heterocigótica) de dicha secuencia introgresada que confiere resistencia aBremia.

En un aspecto adicional, la divulgación proporciona una planta según cualquiera de los aspectos precedentes, en donde dicha planta comprende dos copias (por ejemplo, dicha planta es homocigótica) de dicha secuencia introgresada que confiere resistencia aBremia.

En un aspecto adicional, la planta de la invención es una planta endogámica, dihaploide o híbrida.

En aspectos, la divulgación proporciona una planta de la línea 18LEN002364 deLactuca sativadepositada.

En un aspecto adicional, la divulgación proporciona una semilla que produce una planta según la invención.

En un aspecto adicional, la divulgación proporciona una semilla producida por una planta según la divulgación. En un aspecto adicional, la planta de lechuga de la divulgación es una planta de lechuga según cualquier aspecto descrito en el presente documento, donde la línea 18LEN002364 deL. sativa,o una descendencia o un ancestro de la misma, es la fuente de dicha secuencia introgresada que confiere resistencia aBremia.

En un aspecto adicional, la planta de lechuga de la divulgación es una planta de lechuga según cualquiera de los aspectos precedentes, donde el acceso CGN23091 deL. serriola,o una descendencia o un ancestro de la misma, es la fuente de dicha secuencia introgresada que confiere resistencia aBremia.

En un aspecto adicional, la planta de lechuga de la divulgación es una planta de lechuga según cualquiera de los aspectos precedentes, en donde dicha planta se obtiene cruzando el acceso CGN23091 deL. serriolao 18LEN002364 deL. sativa, o una descendencia o un ancestro de la misma, con una planta de lechuga que no contiene dicha secuencia introgresada que confiere resistencia aBremia.

Es un aspecto adicional proporcionar una parte de planta, órgano o tejido que se puede obtener de una planta de lechuga según cualquiera de los aspectos precedentes, que incluyen, pero no se limitan a, hojas, núcleos, cabezas, tallos, raíces, flores o partes de flores, brotes, gametofitos, esporofitos, polen, anteras, microesporas, óvulos, cigotos, embriones, regiones meristemáticas, tejido calloso, semillas, esquejes, cultivos de células o tejidos o cualquier otra parte o producto de la planta. En realizaciones, la parte de planta, órgano o tejido comprende la secuencia introgresada que confiere resistencia aBremia.En aspectos, la parte de la planta, órgano o tejido presente la resistencia aBremiasegún la invención, particularmente cuando se cultiva en una planta que produce cabezas y/o hojas de lechuga.

En otro aspecto se considera el uso de una planta, parte de una planta o semilla de lechuga según cualquiera de los aspectos anteriores para producir, y opcionalmente cosechar, una cabeza y/u hojas de lechuga.

En otro aspecto, la divulgación se refiere al uso de una planta, parte de planta o semilla de lechuga según cualquier aspecto de la divulgación, en donde la planta, parte de planta o semilla de lechuga es 18LEN002364 deL. sativa,o una descendencia o un ancestro de la misma.

En un aspecto adicional, la divulgación se refiere al uso de una planta, parte de una planta o semilla de lechuga según cualquiera de los aspectos de la divulgación para sembrar un campo, un invernadero o una casa de plástico.

En otro aspecto, la planta según la divulgación es estéril masculina.

En otro aspecto, la planta según la divulgación cultiva cabezas y/u hojas de lechuga maduras.

En un aspecto, la divulgación proporciona hojas y cabezas de lechuga producidas por una planta de lechuga según cualquiera de los aspectos de la divulgación.

La presente divulgación se refiere además a una semilla de planta de lechuga, particularmente una semilla de planta de lechuga cultivada (por ejemplo, una semilla deL. sativa)que crece en una planta de lechuga según cualquiera de los aspectos de la divulgación.

La divulgación se refiere además al uso de una planta de lechuga según cualquiera de los aspectos para introducir (por ejemplo, introgresar) un rasgo de resistencia aBremiade la invención en una planta de lechuga (por ejemplo, una planta deL. sativa)que carece de dicho rasgo de resistencia aBremia.

SECUENCIAS GENÉTICAS, MARCADORES.

La presente invención se refiere además a una secuencia genética que dirige o controla la expresión del rasgo de resistencia aBremiaen la planta de lechuga. En una realización adicional, la secuencia genética de la presente invención está ubicada en el cromosoma 2. En una realización adicional de la presente invención, la secuencia genética se puede obtener de una planta donante que tiene el acervo genético de 18LEN002364 deL. sativa,o una descendencia o un ancestro de la misma, y que comprende dicha secuencia genética.

En una realización adicional, la secuencia genética de la presente invención está unida genética o físicamente a uno o más loci marcadores, que se cosegregan con el rasgo de resistencia aBremia.

En otra realización, dichas secuencias genéticas de la presente invención se caracterizan por uno o más marcadores de SNP tal como se describen en la Tabla 3, por ejemplo, uno o más, dos o más, tres o más o los cuatro marcadores de SNP SL1831, SL1847, SL1883 y SL1887 que comprenden:

a) un genotipo G en el estado heterocigótico<u>homocigótico para el marcador de SNP SL1831 en SEQ ID NO: 1; b) un genotipo A en el estado heterocigótico<u>homocigótico para el marcador de SNP SL1847 en SEQ ID NO: 6; c) un genotipo G en el estado heterocigótico u homocigótico para el marcador de SNP SL1887 en SEQ ID NO:

11; y/o

d) un genotipo C en el estado heterocigótico u homocigótico para el marcador de SNP SL1883 en SEQ ID NO:

16.

En realizaciones representativas:

a) el genotipo G para el marcador SL1831 puede identificarse en una PCR por amplificación de un fragmento de ácido nucleico con un par de cebadores oligonucleotídicos: cebador directo de SEQ ID NO: 2 y cebador inverso de SEQ ID NO: 5 y una sonda de SEQ ID NO: 3;

b) el genotipo A para el marcador de SNP SL1847 puede identificarse en una PCR por amplificación de un fragmento de ácido nucleico con un par de cebadores oligonucleotídicos: cebador directo de SEQ ID NO: 7 y cebador inverso de SEQ ID NO: 10 y una sonda de SEQ ID NO: 8;

c) el genotipo G para el marcador de SNP SL1887 puede identificarse en una PCR por amplificación de un fragmento de ácido nucleico con un par de cebadores oligonucleotídicos: cebador directo de SEQ ID NO: 12 y cebador inverso de SEQ ID NO: l5 y una sonda de SEQ ID NO: 13; y

d) el genotipo C para el marcador de SNP SL1883 puede identificarse en una PCR por amplificación de un fragmento de ácido nucleico con un par de cebadores oligonucleotídicos: cebador directo de SEQ ID NO: 17 y cebador inverso de SEQ ID NO: 20 y una sonda de SEQ ID NO: 18.

En una realización adicional, la presente invención divulga un kit para la detección (por ejemplo, mediante genotipado) del locus del rasgo de resistencia aBremiade la invención en una planta de lechuga, opcionalmente una planta de lechuga deL. sativacultivada, en donde dicho kit comprende al menos un par de cebadores y sonda oligonucleotídicos de PCR, seleccionados de:

i. un par de cebadores representado por un cebador directo de SEQ ID NO: 2 y un cebador inverso de SEQ ID No : 5 y una sonda de SEQ ID n O: 3;

ii. un par de cebadores representado por un cebador directo de SEQ ID NO: 7 y un cebador inverso de SEQ ID NO: 10 y una sonda de SEQ ID NO: 8;

iii. un par de cebadores representado por un cebador directo de SEQ ID NO: 12 y un cebador inverso de SEQ ID NO: 15 y una sonda de SEQ ID NO: 13; y/o

iv. un par de cebadores representado por un cebador directo de SEQ ID NO: 17 y un cebador inverso de SEQ ID NO: 20 y una sonda de SEQ ID NO: 18.

La presente invención también divulga el uso de los marcadores de SNP según la invención para la selección diagnóstica y/o genotipado del locus del rasgo de resistencia aBremiaen una planta de lechuga, particularmente una planta de lechuga cultivada (por ejemplo, unaL. sativa)

La presente invención divulga además el uso de algunos o todos estos marcadores de ADN para identificar en una planta de lechuga, particularmente una planta de lechuga cultivada, más particularmente una planta de lechuga deL. sativasegún la invención, la presencia de un locus de rasgo de resistencia aBremiay/o para monitorizar la introgresión del locus del rasgo de resistencia aBremiaen una planta de lechuga, particularmente una planta de lechuga cultivada, particularmente, una planta de lechuga deL. sativasegún la invención y como se describe en el presente documento.

La invención divulga además un polinucleótido (producto de amplificación) que se puede obtener en una reacción de PCR que implica al menos un cebador oligonucleotídico divulgado en el presente documento: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 20, y que reacciona con sondas de SEQ ID nO: 3, SEQ ID nO: 8, SEQ ID nO: 13 y/o SEQ ID NO: SEQ ID NO: 18, respectivamente. La invención también proporciona un polinucleótido (producto de amplificación) que se puede obtener en una reacción de PCR que implica un par de cebadores oligonucleotídicos de PCR seleccionados de: SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO. 7 y SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO. 12 y SEQ ID NO: 15; o SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 20, y que reacciona con sondas de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: SEQ ID NO: 18, respectivamente.

También se contempla en el presente documento un polinucleótido que tiene al menos 90 %, particularmente al menos 95 %, particularmente al menos 96 %, particularmente al menos 97 %, particularmente al menos 98 %, particularmente al menos 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de dicho producto de amplificación y/o un polinucleótido que presenta una secuencia de nucleótidos que se hibrida con las secuencias de nucleótidos de dicho producto de amplificación que se puede obtener en la reacción de PCR anterior.

En realizaciones, el producto de amplificación corresponde a un producto de amplificación que usa el mismo cebador/par de cebadores que se puede obtener de 18LEN002364 deL. sativa,o una descendencia o un ancestro de la misma que comprende la secuencia introgresada que confiere resistencia aBremiade la invención, o es al menos 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98% o 99 % idéntico a la misma.

El producto de amplificación según la invención y descrito en el presente documento se puede usar para generar o desarrollar nuevos cebadores y/o sondas que se pueden usar para identificar el locus del rasgo de resistencia aBremia.

Por lo tanto, la presente descripción se refiere además, en un realización, a marcadores derivados, particularmente a cebadores o sondas derivados, desarrollados a partir de un producto de amplificación según la invención y como se describe en el presente documento y por métodos conocidos en la técnica, marcadores derivados los cuales están genéticamente ligados al locus del rasgo de resistencia aBremiade la invención.

MÉTODOS DE REPRODUCCIÓN.

La divulgación también proporciona un método de producción de una planta de lechuga que tiene resistencia mejorada aBremia lactucae(por ejemplo, en comparación con un control). En aspectos, el método comprende:

a) cruzar una primera planta de lechuga (por ejemplo, una planta deL. sativa, particularmente una planta deL. sativacultivada) según la invención con una segunda planta de lechuga que carece de la secuencia introgresada de la invención que confiere resistencia aBremia lactucaepara producir plantas descendientes; y

b) seleccionar una planta descendiente que comprende dicha secuencia introgresada que confiere resistencia aBremia lactucae;

produciendo de este modo una planta con resistencia mejorada aBremia lactucae.

En realizaciones, dicha etapa de selección comprende detectar (por ejemplo, mediante genotipado) uno o más, dos o más, tres o más, o los cuatro siguientes marcadores de SNP:

i) un genotipo G en el estado heterocigótico u homocigótico para el marcador de SNP SL1831 en SEQ ID NO: 1; ii) un genotipo A en el estado heterocigótico<u>homocigótico para el marcador de SNP SL1847 en SEQ ID NO: 6; iii) un genotipo G en el estado heterocigótico u homocigótico para el marcador de SNP SL1887 en SEQ ID NO:

11; y/o

iv) un genotipo C en el estado heterocigótico u homocigótico para el marcador de SNP SL1883 en SEQ ID NO:

16.

En aspectos, la primera planta de lechuga es una planta de lechuga cultivada. En aspectos, la primera planta de lechuga es una planta deL. sativa.En aspectos, la segunda planta de lechuga es una planta deL. sativa.

En realizaciones de los métodos según la invención, el método comprende detectar (por ejemplo, mediante genotipado) el genotipo asociado a la resistencia (tal como se describe en el presente documento) en los siguientes marcadores de SNP (cada marcador individual está presente en forma heterocigótica u homocigótica):

• SL1831 y SL1847;

• SL1831y SL1883;

• SL1831y SL1887;

• SL1847y SL1883;

• SL1847y SL1887;

• SL1883y SL1887;

• SL1831, SL1847 y SL1883;

• SL1831, SL1847y SL1887;

• SL1847, SL1883 y SL1887; o

• SL1831, SL1847, SL1883 ySL1887.

Por ejemplo, los marcadores SL1883 y SL1887 se pueden usar juntos, opcionalmente con la adición de otros marcadores. Como otra ilustración a modo de ejemplo, los marcadores SL1847 y SL1887 se pueden usar combinados, opcionalmente con la adición de otros marcadores.

En un aspecto adicional, la divulgación se refiere al método de uno cualquiera de los aspectos descritos en el presente documento, en donde la primera planta de lechuga de la etapa a) es el acceso CGN23091 deL. serriolao una descendencia o un ancestro de la misma que comprende la secuencia introgresada de la invención, y la segunda planta de lechuga carece de una secuencia introgresada de la invención que confiere resistencia aBremia lactucae.En un aspecto adicional, la divulgación se refiere al método de uno cualquiera de los aspectos descritos en el presente documento, en donde la primera planta de lechuga de la etapa a) es 18LEN002364 deL. sativao una descendencia o un ancestro de la misma que comprende la secuencia introgresada de la invención, y la segunda planta de lechuga carece de una secuencia introgresada de la invención que confiere resistencia aBremia lactucae.

En aspectos, según cualquiera de los aspectos de la divulgación, el método comprende además:

c) autofecundar la planta descendiente seleccionada o cruzar con otra planta de lechuga para producir descendencia adicional. En aspectos, la descendencia adicional se selecciona y se autofecunda/cruza durante 2 a 10 generaciones más.

Como un aspecto adicional, la divulgación proporciona un método de producción de una planta de lechuga híbrida F1 con resistencia mejorada aBremia lactucae(por ejemplo, en comparación con una planta de control), comprendiendo el método cruzar una planta de lechuga endogámica (incluyendo dihaploide) de la invención con una planta de lechuga endogámica diferente para producir una progenie híbrida F1. Según este método, la segunda planta de lechuga puede comprender o no la secuencia introgresada que confiere resistencia aBremiade la invención.

En aspectos, la primera planta de lechuga es una planta de lechuga cultivada. En aspectos, la primera planta de lechuga es una planta deL. sativa.En aspectos, la segunda planta de lechuga es una planta deL. sativa.

MÉTODOS DE SELECCIÓN.

En una realización adicional, la invención proporciona un método de identificación de una planta de lechuga resistente aBremia lactucae,y que comprende al menos una copia de una secuencia introgresada de la invención (es decir, la planta es heterocigótica u homocigótica), comprendiendo dicho método la etapa de detectar (por ejemplo, mediante genotipado) uno o más, dos o más, tres o más, o los cuatro de los siguientes marcadores de SNP:

a) un genotipo G en el estado heterocigótico<u>homocigótico para el marcador de SNP SL1831 en SEQ ID NO: 1; b) un genotipo A en el estado heterocigótico<u>homocigótico para el marcador de SNP SL1847 en SEQ ID NO: 6; c) un genotipo G en el estado heterocigótico u homocigótico para el marcador de SNP SL1887 en SEQ ID NO:

11; y/o

d) un genotipo C en el estado heterocigótico u homocigótico para el marcador de SNP SL1883 en SEQ ID NO:

16;

Identificando de este modo una planta de lechuga resistente aBremia lactucae.

En realizaciones, la planta es una planta cultivada (por ejemplo, unaL. sativa) cultivada.

En aspectos, el comprende además seleccionar una planta de lechuga que comprende dichos uno o más marcadores de SNP, y cruzar la planta de lechuga seleccionada con una segunda planta de lechuga para producir plantas de lechuga descendientes que comprenden el uno o más marcadores moleculares y son resistentes aBremia lactucae(por ejemplo, comprenden la secuencia introgresada de la invención que confiere resistencia aBremia).En aspectos, la segunda planta de lechuga es diferente de la planta de lechuga seleccionada. En aspectos, la segunda planta de lechuga es unaL. sativa.En aspectos, la segunda planta de lechuga no comprende la secuencia introgresada que confiere resistencia aBremiade la invención. En aspectos, la segunda planta de lechuga comprende dicha secuencia introgresada.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a un método de identificación de una planta de lechuga que comprende la secuencia introgresada que confiere resistencia aBremiade la invención, en donde dicho método comprende las etapas de:

a) proporcionar una población que segrega el rasgo de resistencia aBremia;

b) cribar la población segregante para un miembro que presenta resistencia aBremia,en donde dicho rasgo se puede identificar mediante la presencia de la secuencia introgresada de la invención que confiere resistencia aBremia; y

c) seleccionar un miembro de la población segregante, en donde dicho miembro comprende el rasgo de resistencia aBremia.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a un método de identificación de una planta de lechuga que comprende la secuencia introgresada que confiere resistencia aBremiade la invención, en donde dicho método comprende las etapas de:

a) proporcionar una población que segrega el rasgo de resistencia aBremia,

b) cribar la población segregante para un miembro que presenta resistencia aBremia,en donde dicho rasgo se puede identificar mediante la presencia de la secuencia introgresada que confiere resistencia aBremiade la invención, en donde dicha secuencia introgresada de la invención se puede identificar detectando (por ejemplo, mediante genotipado) uno o más, dos o más, tres o más, o más, o los cuatro alelos asociados a la resistencia aBremiaen los marcadores SL1831, SL1847, SL1883 y/o SL1883 (tal como se describe en el presente documento); y

c) seleccionar un miembro de la población segregante, en donde dicho miembro comprende el rasgo de resistencia aBremia.

En un aspecto adicional, la divulgación proporciona un método de identificación de una planta de lechuga (por ejemplo, unaL. sativa,particularmente unaL. sativacultivada) que comprende una secuencia introgresada en el cromosoma 2, en donde dicha secuencia introgresada confiere resistencia aBremia,comprendiendo el método:

a) proporcionar una población que segrega la resistencia aBremia;

b) cribar dicha población usando un kit que detecta (por ejemplo, mediante genotipado):

i) un genotipo G en el estado heterocigótico u homocigótico para el marcador de SNP SL1831 en SEQ ID NO: 1;

ii) un genotipo A en el estado heterocigótico u homocigótico para el marcador de SNP SL1847 en SEQ ID NO: 6;

iii) un genotipo G en el estado heterocigótico u homocigótico para el marcador de SNP SL1887 en SEQ ID NO: 11; y/o

iv) un genotipo C en el estado heterocigótico u homocigótico para el marcador de SNP SL1883 en SEQ ID NO: 16;

c) identificar una planta que comprende uno o más de los genotipos de (b).

En un aspecto adicional, la divulgación proporciona un método de identificación de una fuente de lechuga silvestre de resistencia aBremiaen el cromosoma 2, que comprende:

a) proporcionar un acceso de lechuga silvestre o una pluralidad de accesos de lechuga silvestre;

b) cribar dicho acceso de lechuga o pluralidad de accesos de lechuga silvestre usando un kit que detecta (por ejemplo, mediante genotipado):

i) un genotipo G en el estado heterocigótico u homocigótico para el marcador de SNP SL1831 en SEQ ID NO: 1;

ii) un genotipo A en el estado heterocigótico u homocigótico para el marcador de SNP SL1847 en SEQ ID NO: 6;

iii) un genotipo G en el estado heterocigótico u homocigótico para el marcador de SNP SL1887 en SEQ ID NO: 11; y/o

iv) un genotipo C en el estado heterocigótico u homocigótico para el marcador de SNP SL1883 en SEQ ID NO: 16; y,

c) identificar un acceso de lechuga silvestre que comprende uno o más de los genotipos de (b).

En otra realización más, la invención se refiere al uso de un marcador de ADN amplificado a partir del genoma de una planta de lechuga según cualquiera de las realizaciones anteriores, preferiblemente del genoma de 18LEN002364 deL. sativa, o una descendencia o un ancestro de la misma, mediante amplificación por PCR con el par de cebadores oligonucleotídicos: Cebador directo de SEQ ID NO: 2 y cebador inverso de SEQ ID NO: 5 y una sonda de SEQ ID NO: 3; cebador directo de SEQ ID NO: 7 y cebador Inverso de SEQ ID NO: 10 y una sonda de SEQ ID NO: 8; cebador directo de SEQ ID NO: 12 y cebador inverso de SEQ ID NO: 15 y una sonda de SEQ ID NO: 13; o cebador directo de SEQ ID NO: 17 y cebador inverso de SEQ ID NO: 20 y una sonda de SEQ ID NO: 18, donde dicho fragmento de ADN es indicativo de la presencia del rasgo de resistencia aBremiaen una planta de lechuga, para identificar una planta de lechuga que comprende y presenta el rasgo de resistencia aBremia.

En realizaciones de los métodos según la invención, el método comprende detectar (por ejemplo, mediante genotipado) el genotipo asociado a la resistencia (como se describe en el presente documento) en los siguientes marcadores de SNP (cada marcador individual está presente en forma heterocigótica u homocigótica):

• SL1831 y SL1847;

• SL1831 y SL1883;

• SL1831 y SL1887;

• SL1847 y SL1883;

• SL1847y SL1887;

• SL1883y SL1887;

• SL1831, SL1847y SL1883;

• SL1831, SL1847 y SL1887;

• SL1847, SL1883 y SL1887; o

• SL1831, SL1847, SL1883 ySL1887.

Por ejemplo, los marcadores SL1883 y SL1887 se pueden usar juntos, opcionalmente con la adición de otros marcadores. Como otra ilustración a modo de ejemplo, los marcadores SL1847 y SL1887 se pueden usar combinados, opcionalmente con la adición de otros marcadores.

USOS.

La presente divulgación también se refiere al uso de material de propagación de resistencia aBremiaque puede obtenerse de una planta de lechuga según cualquiera de los aspectos de la divulgación para cultivar una planta de lechuga con el fin de producir plantas, semillas, cabezas y/u hojas de lechuga resistentes aBremia, en donde dicha resistencia aBremiase puede evaluar en un ensayo estándar, particularmente un ensayo como se describe en el Ejemplo 1 a continuación.

En aspectos, la divulgación proporciona un método de producción de semilla de lechuga, comprendiendo el método cultivar una planta de lechuga a partir de la semilla de la reivindicación 13, y permitir que la planta produzca semillas de lechuga adicionales y opcionalmente recoger la semilla.

La presente divulgación también se refiere al uso de material de propagación de resistencia aBremiaque puede obtenerse de una planta de lechuga según cualquiera de los aspectos de la divulgación para producir cabezas y/u hojas de lechuga.

La presente divulgación también contempla el uso de las secuencias genéticas de resistencia aBremiade la presente divulgación en asociación con otras secuencias genéticas asociadas con la resistencia aBremia,por ejemplo, aquellas secuencias genéticas divulgadas en el documento de patente WO2011/003783.

Basándose en la descripción de la presente invención, el experto que está en posesión de 18LEN002364 deL. sativa,o una descendencia o un ancestro de la misma, que comprende dicha secuencia genética introgresada, como se describe en el presente documento, no tiene dificultad para transferir dicha secuencia genética introgresada de la presente invención a otras plantas de lechuga de diversos tipos usando técnicas de reproducción bien conocidas en la técnica, por ejemplo, con el uso de loci marcadores de SNP divulgados en el presente documento.

INFORMACIÓN SOBRE LOS DEPÓSITOS DE SEMILLAS

Los solicitantes han realizado un depósito de al menos 2500 semillas de la línea 18LEN002364 deLactuca sativacon el NCIMB (NCIMB Limited, Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen AB21 9YA, Escocia) el 12 de junio de 2020, con el número de acceso de NCIMB NCIMB 43625.

Los solicitantes optan por la solución de expertos y solicitan que el material depositado sea entregado únicamente a un experto de conformidad con la Regla 32(1) CPE o las leyes y reglas correspondientes de otros países o tratados (cláusula de testigos expertos), hasta que se publique la mención de la concesión de la patente, o a partir de 20 años a partir de la fecha de presentación si la solicitud es rechazada, retirada o se considera retirada.

Este depósito de la línea 18LEN002364 deLactuca sativase mantendrá en el depositario del NCIMB, que es un depositario público, durante un período de 30 años, o 5 años después de la solicitud más reciente, o durante la vida efectiva de la patente, lo que sea más largo, y será reemplazado si alguna de las semillas depositadas resulta inviable durante ese periodo. Además, los solicitantes han satisfecho todos los requisitos del artículo 37 del C.F.R. n.° 1.801 1.809, incluyendo proporcionar una indicación de la viabilidad de las muestras. El acceso a este depósito se pondrá a disposición del Comisionado durante la tramitación de esta solicitud previa solicitud. Tras la expedición de una patente sobre la variedad, la variedad será liberada irrevocablemente y sin restricción al público, proporcionando acceso al depósito de al menos 2500 semillas de la variedad en el NCIMB. Los solicitantes no imponen restricciones a la disponibilidad del material depositado del NCIMB; sin embargo, I<os>solicitantes no tienen autoridad para renunciar a ninguna restricción impuesta por la ley a la transferencia de material biológico o su transporte en el comercio. Los solicitantes no renuncian a ninguna infracción de sus derechos otorgados bajo esta patente o bajo ningún derecho de protección de obtenciones vegetales (por ejemplo, la Ley de Protección de Variedades Vegetales de EE.UU., artículo 7 del USC n.° 2321 y siguientes).

La invención se describirá ahora con referencia a los siguientes ejemplos. Los expertos en la materia deben apreciar que estos ejemplos no pretenden limitar el alcance de las reivindicaciones de la invención, sino más bien que están destinados a ser ilustrativos de determinadas realizaciones.

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Prueba de enfermedad por Bremia laetueae

Las pruebas de enfermedad porBremia lactucaese realizan en cámaras climáticas con alta humedad. La duración del día es de 16 horas y durante el día la temperatura es de 18 °C y la humedad relativa (HR) es de aproximadamente el 85 %. Durante la noche, la temperatura es de 15 °C y la HR es de aproximadamente el 100 %. Antes de la inoculación de una prueba, las esporas del patógenoBremiase multiplican en variedades susceptibles al aislado específico. Se realizaron pruebas de resistencia aBremiausando varios aislados y razas deBremia.

Los aislados deBremiase caracterizan y clasifican según el código Sextet de conjuntos de C por IBEB (International Bremia Evaluation Board, véase laTabla 1).

Tabla 1. Reacciones de razas BI de Bremia: 16-36EU al con unto de C de IBEB de diferenciales

Antes de la inoculación del material de prueba, las hojas con esporas se recogen y las esporas se enjuagan de las hojas con agua. La concentración de la suspensión de esporas se ajusta a 100.000 esporas por ml. La suspensión de esporas se rocía sobre plantas de 1 semana de edad (en los cotiledones). Siete a 10 días después de la inoculación se puede hacer la observación/selección. En general, los cotiledones de las plantas susceptibles están completamente cubiertos de esporas. Dependiendo del aislado deBremiausado, los cotiledones de las plantas resistentes no mostrarán o mostrarán un poco de necrosis sin o con muy escasa esporulación.

Ejemplo 2. Historial reproductivo de una Lactuca sativa que contiene resistencia a Bremia de una Lactuca serriola silvestre

Los inventores determinaron que el acceso CGN23091 deLactuca serriolasilvestre tiene una resistencia de amplio espectro aBremia lactucae,designada como la resistencia "SG01". Se realizó un primer ciclo de retrocruzamiento para introducir la resistencia aBremiaSG01 a partir del acceso deL. serriolasilvestre en unaLactuca sativasusceptible. Esto fue seguido por un retrocruzamiento en un cultivar Dm0 deL. sativa,autofecundación, y otras cuatro rondas de retrocruzamiento, y finalmente tres autofecundaciones. La línea resultante se designó 18LEN002364 y fue depositada en NCIMB el 12 de junio de 2020 con el n.° de depósito NCIMB 43625. El historial de reproducción completo de la línea de reproducción B6F4 depositada se muestra en laTabla 2a continuación. Esta línea se fija para la resistencia aBremiade la fuente deL. serriolasilvestre, es decir, la línea 18LEN002364 comprende secuencias introgresadas que confieren resistencia aBremiaSG01 del acceso deL. serriolasilvestre en el estado homocigótico.

Tabla 2. Historial reproductivo de una B6F4 de L. sativa con introgresión de L. serriola que confiere resistencia a Bremia lactucae mildiú

Ejemplo 3. Fenotipado de resistencia a Bremia de una L. serriola silvestre transferida a L. sativa

La línea B6F4 deL. sativadescrita en el Ejemplo 2 contiene una introgresión del acceso CGN23091 deL. serriolaque contiene el locus de resistencia aBremiaSG01 y ha demostrado resistencia contra todas las razas y aislados deBremia lactucaeprobados.

Durante un periodo de al menos seis años, la resistencia SG01 se ha probado contra aproximadamente 400 aislados de campo y ha proporcionado protección contra todos los aislamientos evaluados. Además, la resistencia SG01 también protege contra todos los aislados europeos deBremiaoficiales actuales (BI: 16-36EU).

La resistencia a los aislados y razas deB. lactucaeantes mencionados conferida por SG01 es un nivel rápido y alto de resistencia sin necrosis observable en las plantas. Además, la resistencia se caracteriza como dominante (alta resistencia observada tanto en heterocigotos como en homocigotos), segregación como monogénica y cualitativa en naturaleza.

Ejemplo 4. La resistencia a Bremia SG01 es fija y protege en otros acervos genéticos

La resistencia aBremiaSG01 del acceso CGN23091 deL. serriolase ha fijado a partir de la BC6 y las generaciones posteriores mostradas en laTabla 1anterior. La resistencia SG01 se ha transferido con éxito a otros acervos genéticos deL. sativa.La línea depositada se retrocruzó adicionalmente en una variedad Butterhead comercial, seguido de dos autofecundaciones finales. Se usó una línea de retrocruzamiento avanzada como fuente para introducir la resistencia aBremiaen múltiples segmentos de lechuga (incluyendo baby leaf, multi leaf, romana, iceberg y butterhead interior y exterior). En cada etapa del proceso de reproducción selectiva, se probaron las plantas seleccionadas para la siguiente generación (mediante genotipado y fenotipado) y se confirmó la presencia de la resistencia contra un panel de aislados deBremia.Se mantuvo la resistencia cualitativa rápida y alta aBremiafrente al subconjunto de aislados probados y en todos los acervos genéticos y bajo todas las condiciones ambientales evaluadas. Estos resultados confirman la base genética hereditaria de la resistencia SG01.

Ejemplo 5. Mapeo y genotipado del locus de resistencia a Bremia SG01 de L. serriola

La introgresión de resistencia aBremiaSG01 deL. serriolase ha retrocruzado en un cultivar Dm0 deL. sativahasta la generación B6 (Tabla 1 anterior). Se ha demostrado que esta línea B6 tiene resistencia aBremiaen condiciones de campo (Ejemplo 2), con ausencia de arrastre de ligamiento.

Material y métodos

A: Desarrollo del ensayo

Etapa 1: Desarrollo de micromatrices

Se desarrolló una matriz compuesta por 2500 SNP esparcidos sobre el genoma deL. sativa.Las variantes se identificaron comparando secuencias obtenidas mediante secuenciación reducida de un panel de 17 variedades/accesos deL. sativaa través de diferentes segmentos (incluyendo batavia, butterhead, cos, iceberg y multileaf).

La matriz se usó para obtener la huella genética de líneas de retrocruzamiento (BC) y el progenitor recurrente derivado del programa deBremia.

Etapa 2: Obtención de la huella genética: Identificación de la introgresión

La pantalla de obtención de la huella genética indicó que las líneas BC (CGN23091: B7F2) son 96-98 % idénticas al progenitor recurrente. La resistencia aBremiaSG01 se asoció con una región de introgresión encontrada en líneas BC derivadas de CGN23091.

Una primera estimación del tamaño de introgresión fue de 33 MB en el grupo de enlace 2 desde la posición 4119137 hasta 37019114 pb usando el mapa físico v5 deLactuca sativade referencia (Reyes-Chin-Wo et al., (2017) Nat. Commun. 8, 14953). Esta región se localiza conjuntamente con el grupo de genes de resistencia principal que alberga Dm3, pero SG01 es un locus distinto de Dm3 y tiene un espectro de resistencia diferente.

Etapa 3: Desarrollo de marcadores específicos de resistencia a Bremia del cromosoma 2 SG01

Usando secuenciación de última generación (Mardis, (2008) Annual Review of Genomics and Human Genetics 9: 387), se realizó secuenciación de ADN del genoma completo (WGS) o secuenciación genómica reducida (RGS) en el progenitor Dm0 recurrente y un panel de variedades comerciales y accesos deL. serriolasilvestres que albergan una introgresión de resistencia aBremiaen el cromosoma 2.

El alineamiento con la secuencia v5 deLactuca sativade referencia y el progenitor de Dm0 susceptible recurrente identificó 147.465 variantes entre 4119137 nt y 10787672 nt en el grupo de enlace 2 (LG2). Además, 94.376 variantes reflejaron los diferentes estados alélicos entre el progenitor recurrente Dm0 susceptible y la línea de retrocruzamiento resistente dentro de la región de introgresión de interés.

Etapa 4: Cartografía y cartografía fina

Se seleccionaron variantes de la etapa 3 con diferentes estados alélicos entre la línea de retrocruzamiento resistente y el progenitor recurrente DM0 susceptible a través de la introgresión SG01 y se convirtieron en ensayos de PCR Taqman™ para detectar SNP. Complementarios al fenotipado para la resistencia aBremia, los marcadores se usaron para probar una población grande de CGN23091 B7F4 (295 individuos) del progenitor Dm0 recurrente. De los 37 candidatos de SNP putativos, dos SNP, SL1847 y SL1831, mostraron un 100% de cosegregación con resistencia aBremia, según se calcula mediante JoinMap® (Tabla 3). Los marcadores de SNP SL1883 y SL1887 también estaban estrechamente ligados a la resistencia. La especificidad de los marcadores se puede aumentar adicionalmente usando un haplotipo compuesto por 2 o más marcadores de la Tabla 3, por ejemplo, a una distancia de aproximadamente 1 cM del locus de resistencia (por ejemplo, dos cualesquiera o tres de los marcadores SL1887, SL1883, SL1847 y SL1831, o los cuatro de estos marcadores).

Estos marcadores se pueden usar individualmente, o en cualquier combinación, para identificar plantas de lechuga que comprenden la resistencia aBremiaSG01, para seguir la resistencia a la introgresión en nuevas líneas y similares. Por ejemplo, los marcadores SL1883 y SL1887 se pueden usar juntos, opcionalmente con la adición de otros marcadores. Como otra ilustración a modo de ejemplo, los marcadores SL1847 y SL1887 se pueden usar combinados, opcionalmente con la adición de otros marcadores.

Tabla 3. Mapa gené i

Las posiciones físicas de Ios marcadores de SNP SL1831, SL1847, SL1883 y SL1887, y Ios cebadores / sondas de PCR para la detección de estos SNP se muestran a continuación:

SNP SL1831 a 9490680 pb en LG2 (basado en la secuencia v5 de L. sativa de referencia)

Secuencia diana (SEQ ID NO: 1): TNTAAAGATTAGATACAGGGCAGGGAGGAATGCCTTTGAGATAAATGAGGNGATCGACAGTGTCATGAGACGAT ACAAAGAGATCAACCNGGCAGATCATNCAATTCCTCClA/GlGGAAGGGTTGATTCCATGAAGCCATCCACATCAAC

ACCATCAG

>ALELO d e r e s is t e n c ia : G

>CEBADOR d ir e c t o (subrayado)

AGATACAGGGCAGGGAGGAATG (SEQ id n o : 2)

>SONDA (subrayado doble)

Detectar alelo resistente: ACCCTTCCCGGAGGA (SEQ ID NO: 3)

Detectar alelo susceptible: CAACCCTTCCTGGAGG (SEQ ID NO: 4)

>CEBADOR INVERSO (subrayado)

TGATGTGGATGGCTTCATGGAAT (SEQ ID NO: 5)

SNP SL1847 a 8893684 pb en LG2 (basado en la secuencia v5 de L. sativa de referencia)

Secuencia diana(SEQ ID NO: 6):GGTACACGCTCGCAGTGAAAGCCTTGGAGATAACTCAGGAGATCGATCATGCCATGAAACAACTCTCTCAGATAGAA TG G A C TG ATG ATTCAG TTCCTTTN G G N AG A AATG IG /A1TTCCACAAAG G CATCCACCTCTACACCATCAAG TG ATTACAATGA

>ALELO DE RESISTENCIA: A

>CEBADOR<d ir e c t>o (subrayado)

CGCAGTGAAAGCCTTGGAGAT (SEQ ID NO: 7)

>SONDA (subrayado doble)

Detectar el alelo resistente: TGCCTTTGTGGAATCATTT (SEQ ID NO: 8)

Detectar el alelo susceptible: CCTTTGTGGAACCATTTC (SEQ ID NO: 9)

>CEBADOR INVERSO (subrayado)

c a c t t g a t g g t g t a g a g g t g g a (s e q id NO: 10)

SL1887 a 9514233 pb en LG2 (basado en la secuencia v5 de L. sativa de referencia) Secuencia diana(SEQ ID NO: 11)GCACTTGCAAGCATGAGACAGCTCGAAGAGTTAACTATAANATATTGCAAGGCCTTGAAAGNGATTGTGAAGAAG GAAGAAGACAATGCATCATCATCIA/G1TCATCGAAGGAGGTTGTGGTCTTGCCTCATCTAAAGTCC>ALELO DE RESISTENCIA: G

>CEBADOR DIRECTO (subrayado)

GCATGAGACAGCTCGAAGAGT (SEQ ID NO: 12)

>SONDA (subrayado doble)

Detectar el alelo resistente: CCTTCGATGACGATGATG (SEQ ID NO: 13)

Detectar el alelo susceptible: TCCTTCGATGATGATGATG (SEQ ID NO: 14)

>CEBADOR INVERSO (subrayado) TGAGGCAAGACCACAACC (SEQ ID NO: 15)SL1883 a 8857531 pb en LG2 (basado en la secuencia v5 de L. sativa de referencia) Secuencia diana(SEQ ID NO: 16)AGACGNTTTAACGACCTGGCCCAACATTCCATGAACCACCfA/ClGACTGGTTTTGGGCAATTTAGTCGGGTACCTG CCTTTGC

>ALELO d e r e s is t e n c ia : C

>CEBADOR d ir e c t o (subrayado) ACGACCTGGCCCAACATTCC (SEQ ID NO: 17) >SONDA (subrayado doble)

Detectar el alelo resistente: TGAACCACCCGACTG (SEQ ID NO: 18)

Detectar el alelo susceptible: TGAACCACCAGACTGG (SEQ ID NO: 19)

>CEBADOR INVERSO (subrayado)

GTACCCGACTAAATTGCCCAAA (SEQ ID NO: 20)

La información anterior se resume en la siguienteTabla 4:

Tabla 4.

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Un método de identificación de una planta de lechuga, preferiblemente una planta deLactuca sativa, con resistencia mejorada aBremia lactucae,comprendiendo dicho método la etapa de detectar uno o más de los siguientes marcadores de SNP:

a) un genotipo G en el estado heterocigótico<u>homocigótico para el marcador de SNP SL1831 en SEQ ID NO: 1; b) un genotipo A en el estado heterocigótico u homocigótico para el marcador de SNP SL1847 en SEQ ID NO: 6; c) un genotipo G en el estado heterocigótico u homocigótico para el marcador de SNP SL1887 en SEQ ID NO: 11; y/o d) un genotipo C en el estado heterocigótico<u>homocigótico para el marcador de SNP SL1883 en SEQ ID NO: 16; identificando de este modo una planta de lechuga con resistencia mejorada aBremia lactucaeen comparación con una planta de lechuga de control que no comprende al menos uno de dichos marcadores de SNP.

2. El método según la reivindicación 1, en donde dicha etapa de detección comprende detectar dos o más de dichos marcadores de SNP SL1831, SL1847, SL1887 y/o SL1883.

3. El método según la reivindicación 2, en donde dicha etapa de detección comprende detectar al menos los siguientes marcadores de SNP:

• SL1831 y SL1847;

• SL1831 y SL1883;

• SL1831 y SL1887;

• SL1847y SL1883;

• SL1847y SL1887; o

• SL1883 ySL1887.

4. Un método de identificación de una planta de lechuga, preferiblemente una planta deLactuca sativa,que comprende una secuencia introgresada en el cromosoma 2, en donde dicha secuencia introgresada confiere resistencia aBremia,que comprende:

a) proporcionar una población que segrega la resistencia aBremia;

b) cribar dicha población usando un kit que detecta:

) un genotipo G en el estado heterocigótico u homocigótico para el marcador de SNP SL1831 en SEQ ID NO: 1; i) un genotipo A en el estado heterocigótico u homocigótico para el marcador de SNP SL1847 en SEQ ID NO: 6; ii) un genotipo G en el estado heterocigótico<u>homocigótico para el marcador de SNP SL1887 en SEQ ID NO: 11; y/o v) un genotipo C en el estado heterocigótico u homocigótico para el marcador de SNP SL1883 en SEQ ID NO: 16; y, c) identificar una planta que comprende uno o más de los genotipos de (b).

5. Un método de identificación de una fuente de lechuga silvestre, preferiblemente unaLactuca serriola,de resistencia aBremiaen el cromosoma 2, que comprende:

a) proporcionar un acceso de lechuga silvestre o una pluralidad de accesos de lechuga silvestre;

b) cribar dicho acceso de lechuga o pluralidad de accesos de lechuga silvestre usando un kit que detecta:

) un genotipo G en el estado heterocigótico u homocigótico para el marcador de SNP SL1831 en SEQ ID NO: 1; i) un genotipo A en el estado heterocigótico u homocigótico para el marcador de SNP SL1847 en SEQ ID NO: 6; ii) un genotipo G en el estado heterocigótico<u>homocigótico para el marcador de SNP SL1887 en SEQ ID NO: 11; y/o<v>) un genotipo C en el estado heterocigótico<u>homocigótico para el marcador de SNP SL1883 en SEQ ID NO: 16; y, c) identificar un acceso de lechuga silvestre que comprende uno o más de los genotipos de (b).

6. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la planta es una planta cultivada.

7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicha planta es homocigótica para dichos uno o más marcadores de SNP.

8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en donde los marcadores SL1883 y SL1887 se pueden usar juntos, opcionalmente con la adición de otros marcadores o los marcadores SL1847 y SL1887 se pueden usar en combinación, opcionalmente con la adición de otros marcadores.

9. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, en donde el método comprende detectar el genotipo asociado a la resistencia en los siguientes marcadores de SNP:

• SL1831 y SL1847;

• SL1831 y SL1883;

• SL1831 y SL1887;

• SL1847 y SL1883;

• SL1847 y SL1887;

• SL1883 y SL1887;

• SL1831, SL1847 y SL1883;

• SL1831, SL1847 y SL1887;

• SL1847, SL1883 y SL1887; o

• SL1831, SL1847, SL1883 y SL1887.

10. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde:

a) el genotipo G para el marcador SL1831 puede identificarse en una PCR por amplificación de un fragmento de ácido nucleico con un par de cebadores oligonucleotídicos: cebador directo de SEQ ID NO: 2 y cebador inverso de SEQ ID NO: 5 y una sonda de SEQ ID NO: 3;

b) el genotipo A para el marcador de SNP SL1847 puede identificarse en una PCR por amplificación de un fragmento de ácido nucleico con un par de cebadores oligonucleotídicos: cebador directo de SEQ ID NO: 7 y cebador inverso de SEQ ID NO: 10 y una sonda de SEQ ID NO: 8;

c) el genotipo G para el marcador de SNP SL1887 puede identificarse en una PCR por amplificación de un fragmento de ácido nucleico con un par de cebadores oligonucleotídicos: cebador directo de SEQ ID NO: 12 y cebador inverso de SEQ ID NO: 15 y una sonda de SEQ ID NO: 13; y

d) el genotipo C para el marcador de SNP SL1883 puede identificarse en una PCR por amplificación de un fragmento de ácido nucleico con un par de cebadores oligonucleotídicos: cebador directo de SEQ ID NO: 17 y cebador inverso de SEQ ID NO: 20 y una sonda de SEQ ID NO: 18.

11. El uso de un marcador de SNP amplificado a partir del genoma de una planta de lechuga, preferiblemente del genoma de 18LEN002364 deL. sativa, o una descendencia o un ancestro de la misma, mediante amplificación por PCR con el par de cebadores oligonucleotídicos: Cebador directo de SEQ ID NO: 2 y cebador inverso de SEQ ID NO: 5 y una sonda de SEQ ID NO: 3; cebador directo de SEQ ID NO: 7 y cebador inverso de SEQ ID NO: 10 y una sonda de SEQ ID NO: 8; cebador directo de SEQ ID NO: 12 y cebador inverso de SEQ ID NO: 15 y una sonda de SEQ ID NO: 13; o cebador directo de SEQ ID NO: 17 y cebador inverso de SEQ ID NO: 20 y una sonda de SEQ ID NO: 18, en donde la presencia de dicho marcador de SNP amplificado en un fragmento de ADN es indicativa de la presencia del rasgo de resistencia aBremiaen una planta de lechuga, para identificar una planta de lechuga que comprende y presenta el rasgo de resistencia aBremia.