ES3038535B2 - Nuevos compuestos derivados de benzoxazol, procedimiento de obtencion y su uso en la deteccion de ghb en bebidas - Google Patents

Description

[0001] DESCRIPCI N

[0002] NUEVOS COMPUESTOS DERIVADOS DE BENZOXAZOL, PROCEDIMIENTO DE

[0003] OBTENCIÓN Y SU USO EN LA DETECCIÓN DE GHB EN BEBIDAS

[0004] Campo de la invención

[0006] La presente invención se refiere a nuevos compuestos derivados de benzoxazol, a un procedimiento para su obtención y a su uso en la detección de ácido γ-hidroxibutírico (GHB) en bebidas.

[0008] Antecedentes

[0010] El ácido γ-hidroxibutírico (GHB) es una de las drogas empleadas en la sumisión química. Es un compuesto inodoro, incoloro y ligeramente salado que se usa en ocasiones con fines recreativos. Sin embargo, este compuesto, suministrado sin conocimiento de la víctima, ha sido utilizado en numerosas ocasiones con la finalidad de cometer un delito. En muchas de ellas, se emplea para anular la voluntad de la víctima y llevar a cabo una agresión sexual. En general, la ingesta de la droga por parte de la víctima se produce a través de una bebida que ha sido contaminada con el producto sin que ésta lo haya advertido. El tiempo de permanencia en el organismo es de 3 a 6 horas y sus metabolitos se excretan rápidamente, por tanto, es muy difícil detectar su presencia en el organismo tras la agresión.

[0012] En la bibliografía científica se han encontrado cuatro referencias que tratan este tema (J. Forensic. Sci.2004, 49, pág.379-387, Chem. Commun.2013, 49, pág.6170-6172, Chem. Commun.2014, 50, pág.2904-2906, J. Mat. Chem. B 2017, 8, pág.2736-2742).

[0014] En el primer caso (J. Forensic. Sci. 2004, 49, pág. 379-387) se trata de una reacción enzimática mientras que los otros tres trabajos hacen referencia a sensores químicos.

[0016] En el documento Chem. Commun. 2014, 50, 2904-2906 se describe el uso del compuesto A como quimiosensor para detectar GHB. La interacción con el analito se basó en una interacción de enlace de hidrógeno entre el grupo fenol en el sensor y la unidad de carboxilato en GHB.

[0018] Además, los mismos autores también describieron en Chem. Commun.2013, 49, 6170-6172 el uso del compuesto B para detectar la lactona correspondiente (GBL), pero nuevamente, la interacción se relacionó con la formación de un enlace de hidrógeno.

[0019] Sin embargo, en cualquier caso, los refrescos solos o mezclados con bebidas alcohólicas no se probaron como interferentes.

[0021] Por otro lado, en J. Mat. Chem. B 2017, 8, 2736-2742 se describe la preparación de un complejo de Ir (C) capaz de detectar GHB. El complejo mostró un apagado de luminiscencia en presencia del analito que se observó usando luz UV.

[0024]

[0027] Siguiendo un enfoque diferente, Bravo D. T.; Harris, D. O., Parsons S. M. J. Forensic. Sci. 2004, 49, pág. 379-387 describieron el uso de γ-hidroxibutirato deshidrogenasa (GHB-DH) para detectar GHB. La oxidación enzimática de GHB por NAD<+>se combina con la reducción de un colorante que muestra un cambio de color. El etanol es un interferente que se puede evitar secando la muestra a estudiar.

[0029] Los presentes inventores han sido capaces de desarrollar varios procedimientos que utilizan el compuesto de la invención y un dispositivo a base de celulosa que comprende absorbido el compuesto de la invención, donde dichos procedimientos son fiables y fáciles de usar y permiten determinar de forma visual si una bebida, ya sea alcohólica, no alcohólica o combinada, ha sido contaminada con GHB y/o una de sus sales antes de su ingesta. Adicionalmente, el dispositivo a base de celulosa puesto a punto sólo necesita una pequeña cantidad de la bebida bajo análisis de forma que en el caso de que la respuesta sea negativa, ello indica que la bebida no está contaminada y puede ingerirse sin ningún problema.

[0031] Características de la invención

[0033] En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un compuesto según la fórmula (I) siguiente:

[0034]

[0036] en la que R es H o un grupo alquilo C1-C4, tal y como se ha definido en la reivindicación 1.

[0038] En un segundo aspecto, la presente invención también se refiere a una composición que comprende un compuesto de fórmula (I) según el primer aspecto.

[0040] En un tercer aspecto, la presente invención también se refiere a un dispositivo a base de celulosa que comprende absorbido en la celulosa, a modo de soporte, un compuesto, según el primer aspecto.

[0042] En un cuarto aspecto, la presente invención también se refiere a un procedimiento para la obtención de un compuesto de fórmula (I) según el primer aspecto.

[0044] En un quinto aspecto, la presente invención también se refiere a un procedimiento para preparar un dispositivo a base de celulosa según el tercer aspecto.

[0046] En un sexto aspecto, la presente invención se refiere a la utilización de un compuesto de fórmula (I), según el primer aspecto, o una composición, según el segundo aspecto, o un dispositivo a base de celulosa, según el tercer aspecto, para la detección de GHB y/o una sal del mismo en bebidas.

[0048] La presente invención proporciona cuatro procedimientos independientes para detectar GHB y/o una sal del mismo en bebidas.

[0050] Así, en un séptimo aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para detectar GHB y/o una sal del mismo en bebidas que utiliza el dispositivo a base de celulosa, según el tercer aspecto.

[0051] En un octavo aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para detectar GHB y/o una sal del mismo en bebidas a partir de una solución acuosa de una base débil.

[0053] En un noveno aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para detectar GHB y/o una sal del mismo en bebidas a partir de una solución acuosa de una base débil con un disolvente orgánico.

[0055] En un décimo aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para detectar GHB y/o una sal del mismo en bebidas a partir de una tira de tejido no tejido.

[0057] En un undécimo aspecto, la presente invención se refiere a un equipo o kit para utilizar en la detección de GHB y/o una sal del mismo en bebidas.

[0059] Breve descripción de los dibujos

[0061] LaFIG 1muestra un esquema de preparación del dispositivo a base de celulosa según el quinto aspecto de la invención.

[0063] LaFIG 2muestra un esquema del procedimiento de detección de GHB mediante el dispositivo a base de celulosa según el séptimo aspecto de la invención.

[0065] LaFIG 3muestra la respuesta de una composición que comprende el compuesto de fórmula (I), en el que R=H o bien en el que R=CH<3>, disuelto en DMSO preparada según los Ejemplos 2 y 3.

[0067] LaFIG 4muestra los resultados de la detección de GHB mediante disolución en DMSO según el noveno aspecto de la invención. En este ensayo se caracterizaron las propiedades del compuesto, en el que R=H, disuelto en DMSO y en presencia o ausencia de GHB de acuerdo con los Ejemplos 2 y 3. La Figura 3 muestra los espectros normalizados de absorción UV-vis (línea continua) y emisión (línea punteada) del compuesto (derecha) y del compuesto GHB (2 equiv.) (izquierda), ambos a 10<-5>M en DMSO, λ<exc>=333 nm, λ<exc>= 490 nm, respectivamente.

[0069] LaFIG 5muestra (A) el espectro de emisión λ<exc>=490 nm; λ<em>=528nm de cada disco blanco impregnado con el compuesto de fórmula (I), en el que R=H, y cantidades crecientes de GHB (desde 0 a 180 mM); (B) la Curva de Calibración que representa la intensidad de emisión aa λ<em>=528 nm (λ<exc>=490 nm)vsConcentración de GHB, y (C) los cambios observados bajo una lámpara UV normal preparados según el Ejemplo 4.

[0071] LaFIG 6muestra los resultados de selectividad al GHB de diferentes discos blancos impregnados con el compuesto de fórmula (I), en el que (R=H), a los que se añadieron otras drogas de sumisión química como la escopolamina, la ketaminae, el diazepam y la efedrona. Tal y como se observa en la Figura 6, estas otras drogas no reaccionaron con el compuesto de la invención, no mostrando fluorescencia, mientras sí lo hicieron los discos a los que se les añadió GHB.

[0073] LaFIG 7muestra los resultados de estabilidad del compuesto de fórmula (I), en el que (R=H), impregnado en diversos discos blancos, en función del tiempo, los discos conteniendo GHB (90 mM) según el Ejemplo 4.

[0075] LaFIG 8muestra los resultados de la detección de GHB en bebidas mediante el dispositivo a base de celulosa (discos blancos) según el Ejemplo 5. Las rectas de calibrado obtenidas muestran la intensidad a 528 nmvsConcentración de GHB. Descripción: Horiba-Jobin-Yvon Fluoromax-4® fluorimetro usando una fibra óptica conectada al equipo (λ<exc>=330nm, λ<em>=528 nm).

[0077] Descripción detallada de la invención

[0079] En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (I) siguiente:

[0082]

[0084] en la que R es H o un grupo alquilo C1-C4.

[0086] El grupo alquilo C1-C4 preferible es metilo o etilo, más preferiblemente es metilo.

[0087] Sorprendentemente, el compuesto de fórmula (I) según el primer aspecto presenta un límite de detección de GHB sustancialmente inferior al requerido para inducir sumisión química. Por tanto, se trata de un compuesto de elevada sensibilidad al GHB.

[0089] Inesperadamente, el compuesto de fórmula (I) según el primer aspecto presenta elevada selectividad a GHB. El compuesto es especialmente selectivo a GHB incluso en presencia de otras sustancias distintas al GHB típicamente también empleadas para inducir sumisión química.

[0091] Ventajosamente, el compuesto de fórmula (I) según el primer aspecto puede utilizarse para la detección del GHB en bebidas en un medio líquido y en un medio sólido.

[0093] En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a una composición que comprende el compuesto de fórmula (I), tal como se ha definido anteriormente. En una realización preferida, dicha composición comprende o consiste en el compuesto de fórmula (I), tal como se ha definido anteriormente y un disolvente orgánico.

[0095] En la presente invención, los disolventes preferibles son el tetrahidrofurano (THF) y el dimetilsulfóxido (DMSO). Especialmente preferible es el tetrahidrofurano para la detección de GHB mediante un medio sólido tal como el dispositivo a base de celulosa de la invención y el dimetilsulfóxido para la detección de GHB mediante un medio líquido.

[0097] En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a un dispositivo a base de celulosa que comprende absorbido en la celulosa, a modo de soporte, un compuesto, según el primer aspecto.

[0099] Preferiblemente, el compuesto, según el primer aspecto, se encuentra absorbido en la celulosa preferiblemente a una concentración entre 0,5 mM y 5 mM, preferiblemente de 1 mM.

[0101] En una realización, se analizó la concentración del compuesto, según el primer aspecto, absorbido en la celulosa y se determinó la presencia de 10 - 11 microgramos.

[0103] Los autores de la presente invención han encontrado que los blanqueantes de celulosa interfieren en la detección del GHB en el dispositivo a base de celulosa. Por tanto, preferiblemente el dispositivo a base de celulosa está exento de blanqueantes de celulosa.

[0105] Ejemplos de dispositivos a base celulosa incluyen algodón puro, crudo, natural o sin blanquear, materiales de celulosa natural o sin blanquear.

[0107] Los materiales a base celulosa sin blanquear indica que no se han sometido a un procedimiento de blanqueo de la celulosa. Los métodos clásicos incluyen: método libre de cloro elemental (EFC), y el totalmente libre de cloro (TCF) y los métodos más modernos incluyen: métodos que utilizan oxígeno, peróxido de hidrógeno, ozono y ácidos peracéticos como agentes blanqueantes. Por tanto, presentan en su estructura concentraciones originales de lignina.

[0109] En una realización preferida, dicho dispositivo a base de celulosa es un disco de papel (por ejemplo, de Whatman<TM>) de 3 mm para cromatografía, “Blank Paper discs for inhibition tests (6mm diameter) from Liofilchem (Roseto degli Abruzzi, Italy)”.

[0111] En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para la obtención del compuesto de fórmula (I), que comprende la reacción de isotiocianato de fluoresceína con el compuesto según la fórmula (II):

[0114]

[0116] en la que R es H o un grupo alquilo C1-C4, preferiblemente el grupo alquilo es metilo o etilo y todavía más preferiblemente el grupo alquilo es metilo.

[0117] En particular, la síntesis del procedimiento comprende la etapa:

[0119] En una realización, R es H.

[0120]

[0122] En otra realización independiente de la anterior, R es un grupo alquilo C<1>-C<4>. En una realización preferible, el grupo alquilo es metilo o etilo, preferiblemente metilo.

[0124] Las condiciones de reacción no son particularmente relevantes ya que se puede llevar a cabo a P y T ambientales.

[0126] En un quinto aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para preparar un dispositivo a base de celulosa, según el tercer aspecto, en el que, a modo de soporte, comprende absorbido en la celulosa un compuesto, según el primer aspecto.

[0128] El procedimiento para preparar un dispositivo a base de celulosa comprende:

[0129] a) preparar una disolución en THF del compuesto de fórmula (I);

[0130] b) impregnar el dispositivo a base de celulosa con la disolución preparada en la etapa a); y

[0131] c) secado del dispositivo.

[0133] En la etapa a), el compuesto está a una concentración comprendida entre 0,5 mM y 5 mM. En una realización, la concentración es 1 mM. Preferiblemente, el compuesto, según el primer aspecto, es R=CH<3>.

[0135] En la etapa b), el dispositivo a base de celulosa puede impregnarse por inmersión en la disolución preparada en la etapa a). Sin embargo, existen otras formas de impregnar el dispositivo como, por ejemplo, por pulverización que son de conocimiento general para un conocedor en la materia y son también adecuadas para impregnar el dispositivo.

[0136] Los autores de la presente invención han observado que con tan sólo 3 segundos de inmersión del dispositivo de celulosa en la disolución preparada en la etapa a), el compuesto de formula (I) o la composición que lo contiene es absorbido en la celulosa, de modo que el dispositivo proporciona resultados cualitativos en la detección de GHB.

[0138] El tiempo de impregnación no es relevante y probablemente dependiendo de la técnica de impregnación empleada este tiempo puede variar.

[0140] Finalmente, en la etapa c), se seca el dispositivo a base de celulosa previamente impregnado con el compuesto. La etapa de secado incluye secar de manera forzada o simplemente dejar secar al aire o en un entorno controlado. Durante la etapa de secado, el THF se evapora.

[0142] Los autores de la presente invención han observado que el dispositivo se torna de un color anaranjado cuando el THF se ha evaporado y, por tanto, se ha secado el dispositivo, de manera que el dispositivo está a punto para utilizarse en la detección de GHB en bebidas (Fig.1).

[0144] En un sexto aspecto, la presente invención se refiere a la utilización de un compuesto o una composición, o un dispositivo a base de celulosa, tal como se han definido anteriormente, en la detección de ácido γ-hidroxibutírico (GHB) o una sal del mismo en bebidas. Entre dichas sales se pueden incluir, pero sin limitarse a las mismas, sales con metales alcalinos o alcalinotérreos, preferiblemente, sodio. En la presente invención, cuando se hace referencia a bebidas, tal como se indica posteriormente, se entenderán bebidas alcohólicas, bebidas no alcohólicas o mezclas de las mismas. Cuando se hace referencia a bebidas alcohólicas se incluyen destilados alcohólicos, tales como, por ejemplo, whisky o ginebra, y también bebidas alcohólicas que no son destilados, tales como vino y cerveza.

[0146] En un séptimo aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para la detección de GHB o una sal del mismo en bebidas, que comprende:

[0147] a) tomar una parte de la bebida a analizar y aplicarla sobre el dispositivo a base de celulosa según el tercer aspecto;

[0148] b) observar la reacción producida; y

[0149] c) determinar cualitativamente la presencia de GHB o/y una sal del mismo en la bebida a analizar según la observación de la etapa b).

[0150] En la etapa a), la parte tomada de la bebida a analizar y aplicada sobre el dispositivo puede ser tan pequeña como una gota o unos pocos microlitros, por ejemplo, de 5 µl a 30 µl, de modo que la bebida a analizar aplicada sobre el dispositivo reacciona con el compuesto (I) absorbido en la celulosa del dispositivo en el caso que ésta contenga GHB.

[0152] En la etapa b), la observación visual se realiza sobre el dispositivo a base de celulosa, bajo lámpara de fluorescencia. La reacción es inmediata.

[0154] En la etapa c), la reacción se considera positiva en GHB si en la etapa b) se observa un intenso aumento en la banda de emisión, cuya intensidad está relacionada con la concentración de GHB presente en la bebida.

[0156] Este procedimiento de detección con dispositivo a base de celulosa detecta el GHB en todo tipo de bebidas (alcohólicas y no alcohólicas) y combinados de bebidas alcohólicas y no alcohólicas (Fig.2), siempre que el GHB esté a una concentración igual o superior a 7,3 mM de acuerdo con el límite de detección de GHB de 7,3 mM (Fig.5).

[0158] Los autores de la presente invención han realizado ensayos para determinar la sensibilidad o límite de detección (LOD)vsGHB concentración, usando la ecuaciónLOD = 3σb/m(dondeσbes la desviación standard del blanco ymes la pendiente de la curva de valoración) en el dispositivo a base de celulosa, según el tercer aspecto de la invención (Fig 5).

[0160] Cabe destacar que la concentración de GHB requerida para generar sumisión química es, al menos, 92 mM.

[0162] Por tanto, el dispositivo según el tercer aspecto de la presente invención presenta elevada sensibilidad al GHB en presencia y en ausencia de otras sustancias de sumisión química.

[0164] Por lo tanto, el dispositivo a base de celulosa según el tercer aspecto de la invención proporciona una forma fácil, fiable y de elevada sensibilidad para detectar GHB en bebidas. Es destacable su límite de detección en 7,3 mM de GHB cuando para generar sumisión química se requiere 92 mM de GHB.

[0166] Los autores de la presente invención también han realizado ensayos para determinar la selectividad al GHB en presencia de otras sustancias de sumisión química en el dispositivo a base de celulosa; según el tercer aspecto de la invención.

[0168] En estos ensayos, se midió la emisión de otras sustancias empleadas típicamente en sumisión química, tal como escopolamina, ketaminae, diazepam y efedrona en el dispositivo a base de celulosa que comprende el compuesto según el primer aspecto absorbido. Sorprendentemente, no se observaron cambios apreciables en presencia de las sustancias mencionadas, a pesar de que las concentraciones empleadas fueron superiores a las requeridas para generar sumisión química. Sin embargo, al introducir GHB en la bebida y aplicar una parte de la bebida en el dispositivo a base de celulosa según el tercer aspecto se observó un incremento pronunciado de la intensidad de emisión (Fig.6). Así, el dispositivo es también selectivo al GHB frente a la presencia de las sustancias mencionadas típicamente también empleadas para sumisión química.

[0170] Por lo tanto, el dispositivo a base de celulosa según el tercer aspecto proporciona una forma fácil, fiable, sensible y selectivo para detectar GHB en una bebida tras aplicar una parte de dicha bebida en un medio sólido tal como el dispositivo a base de celulosa, a pesar de estar la bebida contaminada con otras sustancias de sumisión química.

[0172] En un octavo aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para la detección de GHB o una sal del mismo en bebidas, que comprende:

[0173] a) tomar una gota de la bebida a analizar y disolverla en una solución acuosa de una base débil;

[0174] b) añadir una alícuota de la solución obtenida en la etapa a) al compuesto, según el primer aspecto o a la composición, según el segundo aspecto,

[0175] c) observar la reacción producida; y

[0176] d) determinar cualitativamente la presencia de GHB o/y una sal del mismo en la bebida a analizar según la observación de la etapa c).

[0178] En una realización, la base débil se selecciona entre bicarbonato sódico, bicarbonato potásico, bicarbonato amónico y bicarbonato cálcico. La base débil preferible es bicarbonato amónico.

[0180] La base débil puede estar en una concentración comprendida entre 0,4 mM y 50 mM. La concentración preferible está comprendida entre 0,4 mM y 1 mM.

[0181] En una realización, la base débil es bicarbonato amónico en una concentración comprendida entre 0,4 mM y 50 mM.

[0183] En otra realización, la base débil es bicarbonato sódico, bicarbonato potásico, o bicarbonato cálcico en una concentración comprendida entre 0,4 mM y 1 mM.

[0185] En la etapa c) debe observarse si se produce una reacción entre el compuesto de fórmula (I), sólo o en la composición, con el posible componente GHB o una sal del mismo presente en la bebida a analizar. Si el compuesto de fórmula (I) reacciona positivamente con GHB o una sal del mismo, se observará fluorescencia, con un incremento pronunciado de la intensidad. De este modo, se puede concluir en la etapa d) la presencia o no de GHB en la bebida que se está analizando.

[0187] En otra realización alternativa del procedimiento, éste se puede modificar ligeramente en el orden de mezcla y utilizando además un disolvente orgánico, aunque el resultado final sea el mismo. En este sentido, el procedimiento alternativo comprende las etapas definidas en el noveno aspecto.

[0189] En el noveno aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para la detección de GHB o una sal del mismo en bebidas, que comprende:

[0190] a) mezclar una solución acuosa de una base débil con un disolvente orgánico;

[0191] b) añadir el compuesto, según el primer aspecto;

[0192] c) inmediatamente después de la etapa b), añadir una gota de la bebida a analizar; d) observar la reacción producida; y

[0193] e) determinar cualitativamente la presencia de GHB o/y una sal del mismo en la bebida a analizar según la observación de la etapa d).

[0195] Cabe indicar que en la etapa a) la mezcla de la solución acuosa de la base débil con el disolvente orgánico puede estar ya preparada o se puede producir en ese momento justo antes de añadir el compuesto según el primer aspecto.

[0197] La base débil y su concentración son como se han definido anteriormente.

[0199] Como disolvente orgánico para la etapa a) se puede utilizar, sin limitarse a los mismos, DMF (dimetilformamida), DMSO (dimetilsulfóxido) y THF (tetrahidrofurano), aunque para una detección de GHB mediante un medio líquido se prefiere el DMSO.

[0200] En una realización preferida, el disolvente orgánico es dimetilsulfóxido (DMSO). Preferiblemente, el compuesto, según el primer aspecto, es R=H.

[0202] La reacción se considera positiva en GHB si en la etapa d) se observa aparición de fluorescencia (Fig.3).

[0204] En otra realización alternativa del procedimiento, la detección visual se realiza sobre una tira de un tejido no tejido (TNT) con un 50 a 100 % de polipropileno, preferiblemente con un 100% de polipropileno. En este caso el procedimiento para la detección de GHB o una sal del mismo en bebidas comprende las etapas definidas en el décimo aspecto.

[0206] En el décimo aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para la detección de GHB o una sal del mismo en bebidas, que comprende:

[0207] a) introducir una tira de tejido no tejido provisto con al menos un 50% de polipropileno en una muestra de bebida;

[0208] b) introducir la tira impregnada de bebida de la etapa a) en un recipiente que contiene la composición de la invención, según el segundo aspecto, o, alternativamente, el compuesto, según el primer aspecto;

[0209] c) observar la reacción producida en el recipiente; y

[0210] d) determinar cualitativamente la presencia de GHB y/o una sal del mismo en la bebida a analizar según la observación de la etapa c).

[0212] La reacción se considera positiva en GHB si en la etapa c) se observa aparición de fluorescencia.

[0214] Este procedimiento con detección con tira de tejido detecta el GHB en todo tipo de bebidas puras (alcohólicas y no alcohólicas) y combinados de bebidas alcohólicas y no alcohólicas siempre que el GHB esté a una concentración superior a 35 mM.

[0216] En cualesquiera de los aspectos descritos en la presente invención, el compuesto según el primer aspecto puede estar en una concentración comprendida ente 50 μM y 500 μM, preferiblemente de 50 μM a 100 μM.

[0218] Si se desea conocer cuantitativamente la cantidad de GHB presente en la muestra se puede aplicar, por ejemplo, espectroscopía UV y con las rectas de calibración puede medirse la concentración de GHB.

[0219] En un undécimo aspecto, la presente invención se refiere a un equipo o kit para utilizar en la detección de GHB y/o una sal del mismo en bebidas que comprende:

[0220] - un primer recipiente transparente con apertura y cierre que contiene un compuesto, según el primer aspecto, o una composición, según el segundo aspecto,

[0221] - un segundo recipiente transparente con apertura y cierre que contiene una base débil en forma de solución acuosa,

[0222] opcionalmente, un tercer recipiente transparente con apertura y cierre que contiene un disolvente orgánico; y

[0223] - utensilio para la recogida de una muestra de la bebida a analizar.

[0225] En otra realización, la presente invención se refiere a un equipo o kit para utilizar en la detección de GHB y/o una sal del mismo en bebidas que comprende:

[0226] - una tira de tejido no tejido (TNT) provisto con un 50 a 100% de polipropileno;

[0227] - un recipiente transparente con apertura y cierre que contiene una composición, tal como se ha definido en el segundo aspecto, alternativamente, un compuesto, tal como se han definido en el primer aspecto, opcionalmente, en el que dicho recipiente que contiene el compuesto está acompañado de otro recipiente transparente con apertura y cierre que contiene un disolvente orgánico.

[0229] En todavía otra realización, la presente invención se refiere a un equipo o kit para utilizar en la detección de GHB y/o una sal del mismo en bebidas que comprende:

[0230] - una pluralidad de dispositivos a base de celulosa, tal como se ha definido en el tercer aspecto, y

[0231] - opcionalmente, un utensilio para la recogida de una muestra de la bebida a analizar.

[0233] Opcionalmente, dicho kit o equipo, según cualquiera de las realizaciones anteriores (basado en tiras, en el dispositivo o no), comprende, además, instrucciones para su utilización.

[0235] Tal como se ha indicado anteriormente en el presente documento, la base débil utilizada para el kit para muestras de bebidas sin detección con tira es preferiblemente bicarbonato amónico, aunque se podría utilizar cualquier base débil como, por ejemplo, bicarbonato potásico, sódico, cálcico. En otra realización preferida, la concentración de la solución acuosa de la base débil para la detección en bebidas está entre 0,4mM y 50 mM, aún más preferiblemente entre 0,4 mM y 1mM.

[0237] También, como se ha indicado anteriormente en el presente documento, para la detección en bebidas para cualquiera de las realizaciones del kit (basado o no en tiras o dispositivo para detección), el compuesto de fórmula (I) se encuentra en una concentración de 50 μM a 500 μM, preferiblemente de 50 μM a 150 μM, más preferiblemente de 50 µM a 100 μM.

[0239] En una realización preferida, dichos recipientes transparentes con apertura y cierre, según cualquiera de las realizaciones del kit (basado o no en tiras para detección), son microtubos, graduados o no, de polipropileno (por ejemplo, Eppendorf<TM>).

[0241] En otra realización preferida del kit no basado en tiras, dicho utensilio para la recogida de muestra puede ser un cuentagotas o una cucharita. En el caso del kit basado en tiras, no es necesario dicho utensilio.

[0243] En una realización más preferente, en la utilización, el procedimiento, o el kit o equipo, según se han definido en aspectos anteriores, la bebida es una bebida alcohólica. En otra realización más preferente, dicha bebida alcohólica está mezclada con una bebida no alcohólica, preferiblemente un refresco o zumo. En otra realización más preferente, dicha bebida es únicamente una bebida no alcohólica, preferiblemente un refresco o un zumo.

[0245] Preferiblemente, dicha bebida alcohólica se selecciona, a modo de ejemplo no limitativo, entre ginebra, vodka, ron, whisky, vino blanco, vermú y cerveza.

[0247] Preferiblemente, dicho refresco o zumo se selecciona, a modo de ejemplo no limitativo, entre tónica, refresco de naranja, refresco de limón, refresco de té, refresco de cola y cualquier zumo de frutas.

[0249] Cabe indicar que la presente invención abarca cualquier combinación de las realizaciones o casos o ejemplos anteriores que un experto en la materia entienda como viable en el contexto de la presente invención.

[0251] Los diferentes casos o ejemplos particulares citados anteriormente, así como los siguientes ejemplos, se proporcionan únicamente con fines ilustrativos y no pretenden limitar de ningún modo el alcance de la presente invención.

[0252] EJEMPLOS

[0254] Ejemplo 1. Síntesis del compuesto de fórmula (I)

[0257]

[0259] En un matraz de fondo redondo de 50 mL se disolvieron 1,64 mmoles del aminofenol correspondiente, 0,177 g del compuesto de fórmula (I), en el que R=H y 0,202 g del compuesto de fórmula (I), en el que R=CH<3>, junto con 1,64 mmoles de isotiocianato de fluoresceína (0,638) (ratio molar 1:1) en 10 mL de THF. A continuación, se dejó en agitación a temperatura ambiente hasta observar que todo estaba disuelto. Seguidamente, se añadieron 1,5 equivalentes de trietilamina y se dejó toda la noche en agitación. La mezcla de reacción presentó un color naranja.

[0261] Al día siguiente, se añadieron 2 equivalentes de H20230% junto a 0,01 equivalentes del TBAI y la disolución se volvió marrón. La reacción de oxidación se dejó 4h en agitación. Pasado ese tiempo, se obtuvo el producto puro tras la eliminación del disolvente en el rotavapor. El rendimiento para el compuesto de fórmula (I), en el que R=H fue del <10%, y el rendimiento para el compuesto de fórmula (I), en el que R=CH<3>fue de 45%, 349 mg.

[0263] Ejemplo 2. Preparación de una composición del compuesto de fórmula (I)

[0265] Se preparó 1L de composición disolviendo 0,05 mmoles del compuesto de fórmula (I) en 1L de DMSO. En particular, el compuesto de fórmula (I), en el que R=H. Se preparó también y de igual forma para el compuesto de fórmula (I), en el que R=CH<3>.

[0267] Se utilizaron 23,9 mg de metil-benzoxazol-fluoresceina (R=CH<3>) [nombre iupac 3',6'-dihydroxy-5-((5-methylbenzo[d]oxazol-2-yl)amino)-3H-spiro[isobenzofuran-1,9'-xanthen]-3-one ] y 23,2 mg de benzoxazol-fluoresceina (R=H) [nombre iupac 5-(benzo[d]oxazol-2-ylamino)-3',6'-dihydroxy-3H-spiro[isobenzofuran-1,9'-xanthen]-3-one].

[0268] Ejemplo 3. Detección de GHB en bebidas mediante disolución en DMSO

[0270] Para su utilización, se depositaron 20-50 microlitros de la bebida a testar sobre 0,2 mL de cualquiera de las disoluciones preparadas en el Ejemplo 2. Se observó un cambio inmediato de coloración o de fluorescencia en el caso de que la bebida estuviera contaminada con sal sódica de GHB en una concentración de 10 mM o superior.

[0271] Los resultados de la respuesta en la bebida se muestran en la Figura 3.

[0273] Caracterización y propiedades del compuesto de fórmula (I), en el que R=H

[0275] Se midieron los espectros de absorción y emisión del compuesto (R=H) en DMSO (10<-5>M), que muestran una banda de absorción a λ<máx>=333 nm (ε=17640 M<-1>cm<-1>), mientras que la emisión del compuesto mostró una fuerte banda a λ<em>= 428 nm (λ<exc>=490 nm) y un buen rendimiento cuántico de fluorescencia, medido en DMSO puro, (φ1=0,72, usando fluoresceína (φfl= 0,91 in aq NaOH 0,1 M) como referencia). Los compuestos mostraron cambios importantes en presencia de GHB, véase Figura 4.

[0277] Ejemplo 4. Preparación del dispositivo a base de celulosa que comprende el compuesto de fórmula (I) absorbido en la celulosa

[0279] En unEppendorfde1,5 mL, se prepararon 500 µL de una solución 1 mM en THF del compuesto de fórmula (I), para R=H y R=CH<3>. Los dispositivos a base de celulosa eran Discos Blancos de Liofilchem (Papel Whatman<TM>). Se introdujeron los discos durante 3 segundos en la disolución anterior y se dejaron secar durante 5 minutos (Figura 1). Con esta metodología, alrededor de 10-11 microgramos del compuesto de fórmula (I) se acumularon en cada disco. La reproducibilidad del método se cuantificó por UV-visible y resultó altamente satisfactoria (Figura 2).

[0281] Se prepararon varios discos y se obtuvieron discos de color Naranja a punto para su uso.

[0283] ENSAYOS

[0285] Límite de detección de GHB(Figura 5, A-B)

[0287] El límite de detección (LOD) se determinó mediante una gráfica del valor de la emisión a 528 nmvsconcentración GHB, usando la ecuación LOD = 3σ<b>/m(donde σ<b>es la desviación standard del blanco ymes la pendiente de la curva de valoración). Así se determinó que el límite de detección es de 7,3 mM.

[0289] Observación bajo lámpara UV(Figura 5, C)

[0291] Estos discos fueron fáciles de trasportar y se utilizaron evaluar la detección del GHB. En un experimento típico: una alícuota de 15 µL de disolución acuosa de GHB se añadió a cada uno de los discos (en un rango desde 0 a 180 mM de GHB). Tras la observación bajo lámpara UV se determinó cualitativamente la presencia de GHB en cada disco tratado con la disolución acuosa de GHB. Se observó bajo lámpara UV que la reacción producida en cada disco emitía mayor fluorescencia al aumentar la concentración de GHB.

[0293] Selectividad al GHB

[0295] Para determinar la selectividad del compuesto de la invención, se utilizaron los discos blancos impregnados con el compuesto de la invención. Se comparó la reacción de la escopolamina, la ketaminae, el diazepam y la efedrona frente a la reacción con GHB. Sorprendentemente, la presencia de las sustancias mencionadas, distintas al GHB, no mostraron cambios apreciables, no hubo emisión del compuesto de la invención, a pesar de que las concentraciones empleadas fueron superiores a las requeridas para generar sumisión química (15 mM en solución acuosa). Por el contrario, al introducir GHB como única droga de sumisión química o el GHB en combinación con alguna de dichas otras sustancias, se observó un incremento pronunciado de la intensidad de emisión a 528 nm (λ<exc>=490 nm) en los discos blancos impregnados con el compuesto de fórmula (I) tal y como se muestra en la Figura 6.

[0297] Estabilidad del compuesto de la invención absorbido en la celulosa

[0299] Para evaluar la estabilidad del compuesto de la invención soportado en el disco de celulosa, se utilizaron los discos empleados para testar las disoluciones conteniendo concentraciones crecientes de GHB preparados más arriba para la observación bajo lámpara UV y se fueron midiendo las intensidades a intervalos de 15 min durante 7 días. La respuesta a GHB se mantuvo estable hasta 2 días, independientemente de las condiciones de conservación. Se encontró que, manteniendo los discos en la oscuridad, la respuesta era la misma, pero la estabilidad aumentaba pues se mantenía la respuesta en cada disco transcurridos meses desde la adición de las disoluciones conteniendo GHB en concentraciones crecientes (Figura 7).

[0301] La respuesta de emisión máxima se obtuvo tras 1 hora de la adición de las disoluciones conteniendo GHB tal y como muestra la Figura 7.

[0303] Ejemplo 5. Detección de GHB en bebidas mediante dispositivo a base de celulosa

[0305] Se prepararon muestras de bebidas alcohólicas y no alcohólicas contaminadas con GHB. Los resultados revelaron que la metodología desarrollada utilizando el dispositivo a base de celulosa era válida para detectar, en todos ellos, bebida contaminada. Aunque el agua es el componente mayoritario en las muestras reales, ésta podría contener otros compuestos que podrían interferir en la detección y por esta razón se prepararon previamente rectas de calibrado que demuestran la capacidad del sistema en detectar el GHB independientemente de las características de la bebida.

[0307] Se emplearon los dispositivos a base de celulosa (discos) preparados en el Ejemplo 4. Seguidamente, tras preparar muestras de bebida en concentraciones crecientes de GHB (desde 0 mM hasta saturación de la señal), éstas se midieron depositando 15 μL de la bebida sobre el disco (en este caso comprendiendo el compuesto de fórmula (I), en el que R=H, absorbido en la celulosa. Se comprobó que funcionaba igual con el compuesto de fórmula (I), en el que R=CH<3>. Acto seguido, cada uno de los discos fue medido a través de una sonda de fibra óptica conectada a un fluorímetro. La medida se realizó en un entorno totalmente oscuro (en ausencia de luz) para que no hubiera interferencias en la señal. Se obtuvieron las rectas de calibrado, en las que se representa la intensidad a 528 nmvsConcentración GHB. Descripción: Horiba-Jobin-Yvon Fluoromax-4® fluorimetro usando una fibra óptica conectada al equipo (λ<exc>=330nm, λ<em>=528 nm).

Claims (36)

1. REIVINDICACIONES

1. Compuesto según la fórmula (I) siguiente:

en la que R es H o un grupo alquilo C1-C4.

2. Compuesto, según la reivindicación 1, en la que R es un grupo alquilo C1-C4, donde el grupo alquilo es metilo.

3. Composición que comprende el compuesto según la reivindicación 1 o 2.

4. Composición, según la reivindicación 3, que comprende el compuesto, según la reivindicación 1 o 2, y un disolvente orgánico.

5. Composición, según la reivindicación 3, que consiste en el compuesto, según la reivindicación 1 o 2, y un disolvente orgánico.

6. Composición, según la reivindicación 4 o 5, en la que el disolvente orgánico es dimetilsulfóxido (DMSO) o tetrahidrofurano (THF).

7. Dispositivo a base de celulosa que comprende absorbido en la celulosa, a modo de soporte, un compuesto, según la reivindicación 1 o 2.

8. Procedimiento para la obtención del compuesto según la reivindicación 1 o 2 que comprende la reacción de isotiocianato de fluoresceína con el compuesto según la fórmula (II):

en la que R es H o un grupo alquilo C1-C4, preferiblemente, el grupo alquilo es metilo o etilo.

9. Procedimiento para la preparación de un dispositivo a base de celulosa según la reivindicación 7 en el que, a modo de soporte, comprende absorbido en la celulosa un compuesto, según la reivindicación 1 o 2, en el que el procedimiento comprende: a) preparar una disolución del compuesto en THF;

b) impregnar el dispositivo con la disolución preparada en la etapa a); y

c) secado del dispositivo.

10. Utilización de un compuesto, según la reivindicación 1 o 2, o una composición, según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, o un dispositivo a base de celulosa según la reivindicación 7, en la detección de ácido γ-hidroxibutírico (GHB) o una sal del mismo en bebidas.

11. Utilización de un compuesto o una composición, según la reivindicación 10, en la que la bebida es una bebida alcohólica sola o mezclada con una bebida no alcohólica.

12. Utilización de un compuesto o una composición, según la reivindicación 10, en la que la bebida es una bebida no alcohólica sola.

13. Utilización de un compuesto o una composición, según la reivindicación 11, en la que la bebida alcohólica se selecciona entre ginebra, vodca, ron, whisky, vino blanco, vermú y cerveza.

14. Utilización de un compuesto o una composición, según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en la que la bebida no alcohólica es un refresco o zumo.

15. Utilización de un compuesto o una composición, según la reivindicación 14, en la que el refresco se selecciona entre tónica, refresco de naranja, refresco de limón, refresco de té y un refresco de cola.

16. Procedimiento para la detección de GHB o/y una sal del mismo en bebidas, que comprende:

a) tomar una parte de la bebida a analizar y aplicarla sobre el dispositivo a base de celulosa según la reivindicación 7;

b) observar la reacción producida; y

c) determinar cualitativamente la presencia de GHB o/y una sal del mismo en la bebida a analizar según la observación de la etapa b).

17. Procedimiento para la detección de GHB o/y una sal del mismo en bebidas, que comprende:

a) tomar una gota de la bebida a analizar y disolverla en una solución acuosa de una base débil;

b) añadir una alícuota de la solución obtenida en la etapa a) al compuesto, según la reivindicación 1 o 2 o a la composición, según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, c) observar la reacción producida; y

d) determinar cualitativamente la presencia de GHB o/y una sal del mismo en la bebida a analizar según la observación de la etapa c).

18. Procedimiento para la detección de GHB o/y una sal del mismo en bebidas, que comprende:

a) mezclar una solución acuosa de una base débil con un disolvente orgánico; b) añadir el compuesto, según la reivindicación 1 o 2;

c) inmediatamente después de la etapa b), añadir una gota de la bebida a analizar; d) observar la reacción producida; y

e) determinar cualitativamente la presencia de GHB o/y una sal del mismo en la bebida a analizar según la observación de la etapa d).

19. Procedimiento, según la reivindicación 18, en la que el disolvente orgánico es dimetilsulfóxido.

20. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, en el que la base débil es bicarbonato sódico, potásico, amónico o cálcico.

21. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, en el que la base débil está en una concentración entre 0,4 mM y 50 mM, preferiblemente entre 0,4 mM y 1 mM.

22. Procedimiento para la detección de GHB y/o una sal del mismo en bebidas que comprende las etapas de:

a) introducir una tira de tejido no tejido provisto con al menos un 50% de polipropileno en una muestra de bebida;

b) introducir la tira impregnada de bebida de la etapa a) en un recipiente que contiene

la composición de la invención, según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, o, alternativamente, el compuesto, según la reivindicación 1 o 2;

c) observar la reacción producida en el recipiente; y

d) determinar cualitativamente la presencia de GHB y/o una sal del mismo en la bebida a analizar según la observación de la etapa c).

23. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 22, en el que el compuesto está en una concentración ente 50 μM y 500 μM.

24. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 23, en la que la bebida es una bebida alcohólica sola o mezclada con una bebida no alcohólica.

25. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 23, en la que la bebida es una bebida no alcohólica sola.

26. Procedimiento, según la reivindicación 24, en la que la bebida alcohólica se selecciona entre ginebra, vodca, ron, whisky, vino blanco, vermú y cerveza

27. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26, en la que la bebida no alcohólica es un refresco o zumo.

28. Procedimiento, según la reivindicación 27, en la que el refresco se selecciona entre tónica, refresco de naranja, refresco de limón, refresco de té y un refresco de cola.

29. Kit para utilizar en la detección de GHB y/o una sal del mismo en bebidas que comprende

- un primer recipiente transparente con apertura y cierre que contiene un compuesto, según la reivindicación 1 o 2, o una composición, según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6,

- un segundo recipiente transparente con apertura y cierre que contiene una base débil en forma de solución acuosa,

opcionalmente, un tercer recipiente transparente con apertura y cierre que contiene un disolvente orgánico; y

- utensilio para la recogida de una muestra de la bebida a analizar.

30. Kit para utilizar en la detección de GHB y/o una sal del mismo en bebidas que comprende:

- una tira de tejido no tejido (TNT) provisto con un 50 a 100% de polipropileno;

- un recipiente transparente con apertura y cierre que contiene una composición, tal como se ha definido en las reivindicaciones 3 a 6, alternativamente, un compuesto, tal como se han definido en la reivindicación 1 o 2, opcionalmente, en el que dicho recipiente que contiene el compuesto está acompañado de otro recipiente transparente con apertura y cierre que contiene un disolvente orgánico.

31. Kit para utilizar en la detección de GHB y/o una sal del mismo en bebidas que comprende:

- una pluralidad de dispositivos a base de celulosa, tal como se ha definido en la reivindicación 7, y

- opcionalmente, un utensilio para la recogida de una muestra de la bebida a analizar.

32. Kit, según la reivindicación 29 o 30 o 31 que comprende, además, instrucciones para su utilización según el tipo de bebida sea una bebida alcohólica sola o mezclada con una bebida no alcohólica, en el que la bebida alcohólica se selecciona entre ginebra, vodca, ron, whisky, vino blanco, vermú y cerveza, o bien sea una bebida no alcohólica sola, en el que la bebida no alcohólica es un refresco o zumo y el refresco se selecciona entre tónica, refresco de naranja, refresco de limón, refresco de té y un refresco de cola.

33. Kit, según la reivindicación 29 o 32, en el que la base débil es bicarbonato sódico, potásico, amónico o cálcico.

34. Kit, según cualquiera de las reivindicaciones 29 o 32 o 33, en el que la base débil está en una concentración entre 0,4 mM y 1 mM.

35. Kit, según cualquiera de las reivindicaciones 29 a 34, en el que el compuesto (I) está en una concentración en la composición entre 50 μM y 500 μM.

36. Kit, según cualquiera de las reivindicaciones 29 o 32, en el que el disolvente orgánico es dimetilsulfóxido.