ES3038644T3 - Systems and method for correction of positionally dependent electromagnetic radiation detected from objects within a fluid column - Google Patents

Systems and method for correction of positionally dependent electromagnetic radiation detected from objects within a fluid column

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ES3038644T3
ES3038644T3 ES21771941T ES21771941T ES3038644T3 ES 3038644 T3 ES3038644 T3 ES 3038644T3 ES 21771941 T ES21771941 T ES 21771941T ES 21771941 T ES21771941 T ES 21771941T ES 3038644 T3 ES3038644 T3 ES 3038644T3
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Todd Karin
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Abstract

Un sistema de discriminación que forma una columna de fluido e interroga los objetos dentro de ella con una fuente de excitación. Un sistema óptico capta la radiación electromagnética de salida que emana de los objetos excitados dispuestos dentro de la columna de fluido y la dirige a un detector. Un analizador reduce la dependencia posicional de la intensidad detectada normalizando el valor en función de la posición de cada objeto. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓ N
S is te m a s y m é to d o p a ra la co rre cc ió n de ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a d e p e n d ie n te de la p os ic ió n d e te c ta d a a p a rtir de o b je to s d e n tro de u n a c o lu m n a de flu id o
A N T E C E D E N T E S
Los d isp o s itivo s y té c n ica s de d is c rim in a c ió n de o b je to s d is tin g u e n e n tre o b je to s de d ife re n te s tipo s , co m o o b je to s con d ife re n te s c a ra c te rís tica s . E s tos d isp o s itivo s y té cn ica s son p a rticu la rm e n te ú tiles p a ra a n a liza r e inc lu so c la s if ica r c é lu la s según ca ra c te rís tic a s e sp e c ífica s de in te ré s. A lg u n o s e n fo q u e s de c la s if ica c ió n c e lu la r se b asan en la luz q ue e m a n a de las c é lu la s o c é lu la s te ñ id a s p a ra d e te rm in a r su tip o . En a lg u n a s im p le m e n ta c io n e s , las c é lu la s q u e se d e sp la za n en u na co lu m n a de flu id o se e xp o n e n a u na fu e n te de e xc ita c ió n p ara g e n e ra r u na ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a de sa lid a p a ra su d e te cc ió n . Las c é lu la s de un p rim e r tipo , o q ue tie n e n u na c a ra c te rís tic a p a rticu la r, p ro d u ce n ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a de sa lid a q u e es d ife re n te en a lg u n a c a ra c te rís tica , p o r e je m p lo lon g itu d de o n d a y /o in te ns id ad , en c o m p a ra c ió n con o tra s cé lu la s . T a le s d ife re n c ia s s irven co m o b ase de tip o de d is c rim in a c ió n y c la s if ica c ió n ce lu la r.
El d o c u m e n to U S 4643566 A d iv u lg a un s is te m a de d is c rim in a c ió n d e l e s ta d o de la té cn ica .
R E S U M E N
La inve nc ión se d e fin e m e d ia n te un s is te m a de d is c rim in a c ió n seg ún la re iv in d ica c ió n 1 y e l co rre sp o n d ie n te m é to do seg ún la re iv in d ica c ió n 7.
A lg u n a s re a liza c io n e s e s tá n d ir ig id a s a un s is te m a de d is c rim in a c ió n p a ra d is c r im in a r e n tre d ife re n te s t ip o s de o b je to s b a sa d o s en la ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a q ue e m a n a de o b je to s d is p u e s to s d e n tro de u na co lu m n a de flu id o . U na e s tru c tu ra de fo rm a c ió n de c o lu m n a de flu id o c re a u n a c o lu m n a de flu id o q ue c o n tie n e o b je to s en p o s ic io n e s d ife re n te s d e n tro de la c o lu m n a de flu id o y u n a fu e n te de e xc ita c ió n g e n e ra ra d ia c ió n e le c tro m a g n é tic a de e xc ita c ió n d ir ig id a h ac ia o b je to s en la c o lu m n a de flu id o en u n a reg ión de m e d ic ión . Los o b je to s d e n tro de la c o lu m n a de flu id o e m a n a n ra d ia c ió n e le c tro m a g n é tic a de sa lid a en re sp u e s ta a la ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a de e xc ita c ió n . U na d isp o s ic ió n ó p tic a re cog e la ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a de sa lid a de los o b je to s y e l d e te c to r g e n e ra u n a señ a l e lé c tr ic a q ue re sp o n d e a la in te ns id ad de la ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a de sa lid a . Un a n a liza d o r inc lu ye in s tru cc io n e s a lm a ce n a d a s en e l m ism o i) p a ra n o rm a liz a r la in te ns id ad de la ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a de sa lid a re p re se n ta d a en la seña l e lé c tr ic a b a sa d a en la p o s ic ió n d e l o b je to en la c o lu m n a de flu id o , y ii) p a ra d is c r im in a r un p rim e r tip o de o b je to de sus o b je to s .
De a cu e rd o con a lg u n a s re a liza c io n e s de un s is te m a de d e te cc ió n , u na d isp o s ic ió n ó p tica recoge ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a de sa lid a de o b je to s en u na c o lu m n a de flu id o y un d e te c to r g e n e ra u n a señ a l e lé c tr ic a q ue re spo nd e a la in te n s id a d de la ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a de sa lid a re co g id a p o r la d isp o s ic ió n ó p tica . Un a n a liza d o r tie n e in s tru cc io n e s a lm a ce n a d a s en el m ism o i) p a ra n o rm a liza r la in te ns id ad de la ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a de sa lid a re p re s e n ta d a en la señ a l e lé c tr ic a en fu n c ió n de la p os ic ió n d e l o b je to en la c o lu m n a de flu id o , y ii) p a ra d is c r im in a r un p r im e r tip o de o b je to de o tro s o b je to s .
De a cu e rd o con o tra s re a liza c io n e s , un m é to do de d is c rim in a c ió n de o b je to s c o m ie n z a c re a n d o u na c o lu m n a de flu id o q u e c o n tie n e o b je to s a d ife re n te s p o s ic io n e s d e n tro de la c o lu m n a de flu id o . La ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a de e xc ita c ió n se d ir ig e h ac ia o b je to s en la co lu m n a de flu id o en u n a re g ión de m e d ic ión . Los o b je to s en la reg ión de m e d ic ió n e m a n a n ra d ia c ió n e le c tro m a g n é tic a de sa lid a en re sp u e s ta a la ra d ia c ió n e le c tro m a g n é tic a de e xc ita c ió n q ue se re cog e y se u tiliza p a ra g e n e ra r u na señ a l e lé c tr ica q u e re spo nd e a la in te ns id ad de la ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a de sa lid a . La in te ns id ad de la ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a de sa lid a re p re se n ta d a en la señ a l e lé c tr ic a se n o rm a liza en fu n c ió n de la p os ic ió n de l o b je to en la co lu m n a de flu id o y se d is c rim in a un p rim e r tip o de o b je to de o tro s o b je to s .
B R E V E D E S C R IP C IÓ N DE LO S D IB U JO S
La FIG. 1 es un d ia g ra m a de un s is te m a de d is c rim in a c ió n según c ie rta s re a liza c io ne s .
La FIG . 2 m u e s tra u n a secc ión tra n s v e rsa l d e l p la n o x -y de la c o lu m n a de flu id o en la re g ión de m e d ic ió n del s is te m a de la FIG. 1.
La FIG. 3 m u e s tra la luz q ue e m a n a de un o b je to u b ica d o c e rca de l ce n tro de la c o lu m n a de flu id o con re fra cc ió n su s ta n c ia lm e n te u n ifo rm e de la luz de la in te rfaz flu id o -a ire de la co lu m n a de flu id o en re lac ión con el a p a ra to ó p tico q u e fu n c io n a co m o ó p tica de re co le cc ió n .
La FIG. 4 m u e s tra la luz q u e e m a n a de un o b je to u b ica d o en u n a p o rc ió n s u p e r io r de l n úc leo e líp tico de la co lu m n a de flu id o q u e e xh ib e u n a re fra cc ió n no u n ifo rm e de la luz en la in te rfa z flu id o -a ire en re lac ió n con el a p a ra to ó p tico q ue fu n c io n a co m o ó p tica de re co le cc ió n .
La FIG . 5 ilu s tra la g e o m e tría u tiliz a d a p a ra d e s a rro lla r u na fó rm u la a n a lít ica p a ra la d e p e n d e n c ia a n g u la r de la d e n s id a d de ra yos de luz en e l p la n o co m o fu n c ió n de la p os ic ió n x.
La FIG . 6 p ro p o rc io n a u n a fa m ilia de g rá fico s q ue m u es tra n la d e p e n d e n c ia a n g u la r de la ra d ia n c ia p a ra d ife re n te s p o s ic io n e s de l o b je to d e n tro de u na c o lu m n a de flu id o .
La F IG . 7 p ro p o rc io n a u na fa m ilia de g rá fico s de la in te ns id ad re la tiva de la luz re co g id a de la c o lu m n a de flu id o con re sp e c to a la p o s ic ió n de l o b je to a lo la rgo de l e je x p a ra d ife re n te s a p e rtu ra s n u m é rica s de la ó p tica de re co le cc ió n .
La FIG. 8 es un d ia g ra m a de f lu jo de un e n fo q u e p a ra id e n tif ic a r o b je to s q u e se d e sp la za n en u n a c o lu m n a de flu id o m e d ia n te co rre cc ió n de la va r ia c ió n p o s ic io n a l de la luz de sa lid a d e te c ta d a seg ún a lg u n a s re a liza c io n e s .
La FIG . 9 p ro p o rc io n a un e sq u e m a de u n a re a liza c ió n q ue inc lu ye d e te cc ió n de p o s ic ió n e in te ns id ad d esde un ú n ico de tec to r.
La FIG . 10 p ro p o rc io n a un e sq u e m a de u n a re a liza c ió n no seg ún la inve n c ió n q u e inc lu ye un p rim e r d e te c to r p a ra d e te c ta r la in te ns id ad y un se g u n d o d e te c to r p a ra d e te rm in a r la p o s ic ió n de l o b je to .
La FIG. 11 ilu s tra la sa lid a de u n a s im u la c ió n p a ra d e te rm in a r la u b ica c ió n de l o b je to con un d e te c to r de d iv is ió n .
La FIG. 12 ilus tra los re su lta d o s de un e xp e rim e n to q u e m e jo ra las m e d ic io n e s de in te ns id ad m e d ia n te c o rre cc ió n de va lo re s d e te c ta d o s en fu n c ió n de la p o s ic ió n d e l n úc leo de los e sp e rm a to zo id e s .
La FIG. 13 ilus tra los re su lta d o s de un e xp e rim e n to q u e m e jo ra las m e d ic io n e s de in te ns id ad m e d ia n te c o rre cc ió n de va lo re s d e te c ta d o s en fu n c ió n de la p o s ic ió n de la p o s ic ió n de c é lu la s e sp e rm á tic a s v ivas . La FIG. 14 ilus tra los re su lta d o s de un e xp e rim e n to q ue b u sca m e jo ra r e l re n d im ie n to de un in s tru m e n to m al a lin e a d o con un fa c to r de co rre cc ió n en fu n c ió n de la p os ic ió n d e l n úc leo de los e sp e rm a to zo id e s .
La FIG. 15 p ro p o rc io n a u na fa m ilia de g rá fic o s de la d e p e n d e n c ia a n g u la r de la ra d ia n c ia p a ra d ife re n te s p o s ic io n e s de l o b je to y m u e s tra re g io n e s de e xc lu s ió n .
La FIG. 16 m u e s tra la in te ns id ad re la tiva de la luz re co g id a de la c o lu m n a de flu id o con re sp e c to a la p os ic ió n d e l o b je to a lo la rgo de l e je x cu a n d o no se e xc lu ye n á ng u lo s , cu a n d o se e xc lu ye n ra yos con á n g u lo s e n tre -0 ,3 rad y 0 ,3 y cu a n d o se e xc lu ye n rayos con á n g u lo s e n tre -0 ,4 rad y 0 ,4 rad.
La FIG. 17 ilus tra los re su lta d o s de un e xp e rim e n to q u e u tiliza ta n to un fa c to r de co rre cc ió n co m o un e le m e n to p a ra re d u c ir ó p tic a m e n te la d e p e n d e n c ia p o s ic io n a l de m e d ic io n e s de in te ns id ad .
Las fig u ra s no e s tá n n e ce sa ria m e n te a e sca la . Los n ú m e ro s s im ila re s u tiliza d o s en las fig u ra s se re fie ren a c o m p o n e n te s s im ila re s . S in e m b a rg o , se e n te n d e rá q u e e l u so de un n ú m e ro p a ra re fe rirse a un co m p o n e n te en u na fig u ra d a d a no p re te n d e lim ita r e l co m p o n e n te en o tra fig u ra e tiq u e ta d a con e l m ism o núm ero .
D E S C R IP C IÓ N D E T A L L A D A
Las re a liza c io n e s d e sc rita s en e l p re se n te d o c u m e n to se re fie ren a d isp o s itivo s , s is te m a s y m é to d o s de d is c rim in a c ió n e n tre d ife re n te s tip o s de o b je to s . Los o b je to s e m a n a n luz de sa lid a en re sp u e s ta a u n a luz de e xc ita c ió n q ue se d ir ige h ac ia los o b je to s en u n a c o lu m n a de flu id o , co m o u n a co rrie n te de flu jo . Ta l co m o se u tiliza en e l p re se n te d o cu m e n to , e l té rm in o "e m a n a r" se re fie re a la ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a ta n to re fle ja d a co m o flu o re sc e n te , co m o la luz. T a l com o se u tiliza en e l p re se n te d o cu m e n to , e l té rm in o "luz" se re fie re a la ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a ta n to en e l e sp e c tro v is ib le co m o a lon g itu de s de o n d a en los e sp e c tro s in fra rro jo y u ltra v io le ta . Ta l ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a de sa lid a p u e d e in c lu ir luz re fle ja d a o flu o re sc e n te d ire c ta m e n te de un o b je to , a s í co m o luz re fle ja d a o flu o re sc e n te de u na t in c ió n o un co lo ra n te a so c ia d o al o b je to . En a lg u n a s re a liza c io n e s , los tip o s de c é lu la s se d is tin g u e n en fu n c ió n de la in te n s id a d de la ra d ia c ió n e le c tro m a g n é tic a de sa lid a q ue e m a n a de los o b je to s . La in te ns id ad se p ue de d e te rm in a r co m o p ico de in te ns id ad o in c lu so co m o u n a in te ns id ad to ta l, co m o e l á re a in te g ra d a b a jo u n a se ñ a l de in tens idad . Las re a liza c io n e s e sp e c ífica s d e sc rita s en e l p re se n te d o c u m e n to e s tá n d ir ig id a s a d is t in g u ir e n tre cé lu la s e sp e rm á tic a s de l c ro m o s o m a X y c é lu la s e sp e rm á tic a s de l c ro m o s o m a Y. O tras re a liza c io n e s se o cu p a n de d is tin g u ir c é lu la s e sp e rm á tic a s v ia b le s p o rta d o ra s de l c ro m o s o m a X de o b je to s d ife re n te s a c é lu la s e sp e rm á tic a s v ia b le s p o rta d o ra s d e l c ro m o s o m a X, in c lu ye n d o c é lu la s e sp e rm á tic a s v ia b le s p o rta d o ra s d e l c ro m o s o m a Y y cé lu la s no v ia b le s de a m b o s sexos.
Se a p re c ia rá q ue los e n fo q u e s de e s ta d ivu lg a c ió n se p u e d e n a p lic a r m ás g e n e ra lm e n te p a ra d is t in g u ir e n tre cu a lq u ie r o b je to de d ife re n te s tipo s , s ie m p re q u e la ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a de s a lid a q u e e m a n a de un tip o de o b je to g e n e re u na d ife re n c ia d is ce rn ib le en al m enos u na c a ra c te r ís tic a en c o m p a ra c ió n con la ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a q ue e m a n a de o tro tip o de o b je to . La inve n c ió n e s tá d ir ig id a al ca so en d o n d e los o b je to s son c é lu la s e sp e rm á tica s . De a cu e rd o con la inve nc ión , la c o lu m n a de flu id o es u na co rr ie n te de flu jo q u e tie n e un lím ite o in te rfa z c u rva d a d o n d e se p ue de p ro d u c ir re fra cc ió n o ra d ia c ió n e le c tro m a g n é tica . El lím ite cu rva d o de la c o lu m n a de flu id o es g e n e ra lm e n te c irc u la r en se cc ió n tra n sve rsa l. La co lu m n a de flu id o p u e d e e s ta r d e lim ita d a p o r p a re d e s só lid as , co m o d e n tro de u na cu b e ta o d e n tro de un can a l m ic ro flu íd ico , o p u e d e s e r la n za d a al a ire , co m o en un c itó m e tro de flu jo de ch o rro en el a ire . Los o b je to s se m u even a lo la rgo de la co lu m n a de flu id o a tra vé s de un n úc leo ce n tra l fo rm a d o p o r un flu id o de e n v o ltu ra q ue ro de a al m e no s p a rc ia lm e n te e l n úc leo ce n tra l. De a cu e rd o con la inve nc ión , e l n úc leo ce n tra l p uede c o m p re n d e r u n a co rr ie n te de n úc leo de flu id o de m u e s tra q u e c o n tie n e c é lu la s e sp e rm á tica s . La co rr ie n te de n úc leo tie n e u n a secc ión tra n s v e rsa l g e n e ra lm e n te e líp tica con e l fin de o r ie n ta r las c é lu la s e sp e rm á tic a s e s fé rica s . La ra d ia c ió n e le c tro m a g n é tic a q ue e m a n a de los o b je to s e n c u e n tra al m e no s un lím ite de re fra cc ió n ó p tica e n tre los o b je to s y o tro s m a te ria le s , co m o en la in te rfaz e n tre la c o lu m n a de flu id o y e l a ire .
D eb ido al m e no s en p arte a las d ife re n te s p ro p ie d a d e s re fra c tiva s de l flu id o de e n v o ltu ra y e l a ire , la e fic ie n c ia de re co le cc ió n de luz e x te rn a a la c o lu m n a de luz de flu id o q ue e m a n a de los o b je to s d e n tro de la c o lu m n a d e p e n d e de la p o s ic ió n de los o b je to s p a ra ta le s s is te m a s . La e fic ie n c ia de re co le cc ió n de luz q ue v a ría con la p o s ic ió n es p e rju d ic ia l en a p lica c io n e s d o n d e la luz q u e e m a n a de los o b je to s se d eb e c u a n tif ica r con p re c is ió n y ta l p re c is ió n e s tá lim itad a p o r la f lu c tu a c io n e s de p o s ic ió n a le a to ria s (no o b s e rva b le s d ire c ta m e n te ) de los o b je to s . En el ca so de e sp e rm a to zo id e s q u e d ife re n c ia n el sexo e sp e c ífica m e n te , ta le s s is te m a s b uscan d ife re n c ia r in te n s id a d e s de f lu o re sc e n c ia m uy b rilla n te s y re la c io n a d a s e s tre c h a m e n te . Las c é lu la s e sp e rm á tic a s y los n úc leo s de e sp e rm a to zo id e s se tiñe n g e n e ra lm e n te con H o e ch s t 33342 p a ra h a c e r ta le s d ife re n c ia c io n e s . H o e ch s t 33342 es un co lo ra n te b rilla n te y p e rm e a b le a c é lu la s q u e se u ne s e le c tiva m e n te a los p a re s de b ases A -T en el su rco m e n o r de A D N n u c le a r b ica te n a rio . La tin c ió n e s te q u io m é tric a de c é lu la s e sp e rm á tic a s con H o e ch s t 33342 d ife re n c ia el c ro m o s o m a X d e l c ro m o s o m a Y c o m o si tu v ie ra n ca n tid a d e s lig e ra m e n te d ife re n te s de A D N n uc lea r. P o r e je m p lo , m u ch o s a n im a le s d o m é s tic o s t ie n e n a lre d e d o r de u na d ife re n c ia de un cu a tro p o r c ien to . C u a n d o las cé lu la s e sp e rm á tic a s se tiñe n y se o rie n ta n a d e cu a d a m e n te , e s ta p e q u e ñ a d ife re n c ia se p ue de d is t in g u ir p o r la in te ns id ad de f lu o re sc e n c ia de H o e ch s t 33342 a so c ia d a al A D N n u c le a r de las c é lu la s e sp e rm á tic a s cu a n d o se irrad ian con u na fu e n te de e xc ita c ió n a de cu a d a , co m o un lá se r q ue fu n c io n a a u n a lon g itu d de o n d a de 355 nm o c e rca de la m ism a.
E s ta d ife re n c ia de l cu a tro p o r c ie n to es d ifíc il de d e te c ta r p o r d iv e rs a s ra zon es . En p rim e r lugar, e l A D N n u c le a r de l e sp e rm a to zo id e res ide d e n tro de la ca b e z a de l e sp e rm a to zo id e , q u e es a s fé rica o tie n e u n a fo rm a s im ila r a u n a p a le ta en la m a yo r p a rte de e sp e c ie s . E s ta a s im e tría hace q u e el e sp e rm a to zo id e e m ita f lu o re sc e n c ia de m a n e ra d ife re n te p o r el lado p la n o y e l lado m ás e s tre ch o . De hecho , e s ta f lu c tu a c ió n e xce d e la d ife re n c ia d e l cu a tro p o r c ie n to en el co n te n id o de A D N , lo q ue s ig n ifica q u e e l e sp e rm a to zo id e d eb e o rie n ta rse p a ra d ife re n c ia rse en fu n c ió n de l co n te n id o c ro m o s ó m ico n uc lea r. Las g e o m e tría s de o rie n ta c ió n tie n d e n a p ro d u c ir u na co rr ie n te ce n tra l q ue tie n e u n a fo rm a de c in ta o u na secc ión tra n sve rsa l e líp tica . Esta se cc ió n tra n s v e rsa l e líp tica p ro p o rc io n a e sp e rm a to zo id e s m ás g ra n d e s q u e la la titud n orm a l p a ra su c o lo ca c ió n en un e je .
Los e n fo q u e s d iv u lg a d o s en el p re se n te d o c u m e n to m e jo ran la p re c is ió n de s is te m a s q u e p ue de n e s ta r lim ita d o s p o r ta le s f lu c tu a c io n e s , co m o c itó m e tro s de flu jo de ch o rro en e l a ire . T a l co m o se d e sc rib e con m ás d e ta lle a co n tin u a c ió n , la va r ia b ilid a d p o s ic io n a l de la in te ns id ad de la luz re co g id a de o b je to s en u na c o lu m n a de flu id o se p u e d e a b o rd a r con un a lg o ritm o q u e co rrig e la d e p e n d e n c ia de la in te ns id ad con la p os ic ió n .
Los e n fo q u e s d e sc rito s en e l p re se n te d o c u m e n to son p a rtic u la rm e n te a p lica b le s a c ito m e tría de flu jo . S in e m b a rg o , los e n fo q u e s se p ue de n a p lica r a c u a lq u ie r s is te m a d o n d e la luz se recoge en un lado de u na in te rfaz de o b je to s que e m a n a n la luz de l o tro lado de la in te rfaz , en d o n d e la in te rfaz p ro vo ca u n a v a r ia c ió n de las tra ye c to ria s de ra yos de luz q u e e m a n a n de u n a m a n e ra d e p e n d ie n te de la p o s ic ió n d e l o b je to en re lac ió n con el d e te c to r. Los e n fo q u e s de l p re se n te d o c u m e n to c o rrig e n la v a r ia c ió n p o s ic io n a l d e n tro de la co lu m n a de flu id o , p ro p o rc io n a n d o de e s te m odo m e d ic io n e s m ás p re c isa s p a ra d is t in g u ir t ip o s de o b je to s .
El s is te m a de c itó m e tro de f lu jo "ch o rro en e l a ire " 100 ilu s tra d o e sq u e m á tic a m e n te en la FIG. 1 es un tip o de s is te m a de d is c rim in a c ió n q ue se p u e d e u tiliz a r p a ra d is c u tir los c o n ce p to s de la d ivu lg a c ió n . El s is te m a de c itó m e tro de flu jo "ch o rro en el a ire " 100 inc lu ye u n a e s tru c tu ra de fo rm a c ió n de c o lu m n a de flu id o q ue c re a u n a co rr ie n te de flu jo q ue co m p re n d e u n a c o lu m n a de flu id o 150 q u e sa le a ch o rro de la b o q u illa de sa lid a 160 de la cá m a ra 110 a a lta ve lo c id a d , p o r e je m p lo a lre d e d o r de 20 m /s. La c o lu m n a de flu id o 150 e xp u ls a d a d e sd e la b o q u illa de sa lid a 160 p u e d e se r a p ro x im a d a m e n te c irc u la r en se cc ió n tra n s v e rsa l y p u e d e te n e r un d iá m e tro de a lre d e d o r de 10 pm a a lre d e d o r de 100 pm en a lg u n a s im p le m e n ta c io n e s . En a lg u n a s re a liza c io n e s , e l in te rio r de la cá m a ra 110 y /o la b o q u illa de sa lid a 160 e s tá n co n fig u ra d o s con u n a g e o m e tría in te rn a q u e o rie n ta h id ro d in á m ica m e n te los e sp e rm a to zo id e s d e n tro de la co lu m n a de flu id o . C om o e je m p lo s no lim itan tes , las b o q u illa s co m o las d e sc rita s en las P a te n te s de EE. UU.
6 ,782 ,768 y 6 ,263 ,745 se p ue de n in c o rp o ra r con el fin de o r ie n ta r los e sp e rm a to zo id e s y g e n e ra r e l f lu jo c o a x ia l de u na c o lu m n a de flu id o . La c o lu m n a de flu id o 150 e s tá co m p u e s ta p o r u na co rr ie n te de n úc leo 151, d e n tro de u na co rr ie n te de e n v o ltu ra 152 d o n d e las fle c h a s de la FIG. 1 ind ican la d ire cc ió n de f lu jo de las c o rr ie n te s de n úc leo y e n v o ltu ra 151, 152. La co rr ie n te de e n v o ltu ra 152 p ue de te n e r u n a se cc ión g e n e ra lm e n te c ircu la r, m ie n tra s q u e la co rr ie n te de n úc leo tie n e g e n e ra lm e n te se cc ió n tra n s v e rsa l e líp tica con un e je m a yo r y un e je m ejor.
D en tro de la c á m a ra 110, un e le m e n to de inye cc ió n de m u e s tra 111 in tro d u ce la co rr ie n te de n úc leo 151 q ue co n tie n e o b je to s 171, 172 q ue p ue de n s e r de m ú ltip le s tip o s . La co rr ie n te de n úc leo 151 e s tá d e lim ita d a p o r u n a co rr ie n te de e n v o ltu ra 152 q u e co m p re n d e flu id o de e n v o ltu ra y e s tá fo rm a d a p o r fu e rz a s h id ro d in á m ica s en la cá m a ra 110. La co rr ie n te de e n v o ltu ra 152 ro de a al m e no s p a rc ia lm e n te la co rr ie n te de n úc leo 151 y la co rr ie n te de e n v o ltu ra 152 y la co rr ie n te de n úc leo 151 no se m e zc la n su s ta n c ia lm e n te . Las p a re d e s in c lin a d a s y a n g u la d a s 115 de la cá m a ra 110 im p a rte n fu e rz a s q u e c o n fo rm a n la co rr ie n te de n úc leo 151 y a ce le ra n o b je to s 171, 172 d e n tro de la co rr ie n te de n úc leo 151. El m o v im ie n to de la co rr ie n te de e n v o ltu ra 152 re s tr in g e los o b je to s 171, 172 en la co rr ie n te de n úc leo 151 p a ra q u e se m u evan h ac ia e l ce n tro de la co lu m n a de flu id o 150 cu a n d o la c o lu m n a de flu id o 150 es e xp u lsa d a de la c á m a ra 110. La co lu m n a de flu id o 150 s u m in is tra los o b je to s 171, 172 a u n a reg ión de m e d ic ió n 175 de la co lu m n a de flu id o 150, p o r e je m p lo en u n a ú n ica fila .
A m e d id a q ue los o b je to s p asan a tra vé s de la reg ión de m e d ic ió n 175 de la c o lu m n a de flu id o 150, la luz de u n a fu e n te de e xc ita c ió n 180 p ro p o rc io n a luz de e xc ita c ió n a los o b je to s 171 ,172. La fu e n te de e xc ita c ió n 180 p u e d e p ro p o rc io n a r luz en u na b a n d a de lon g itu d de o n d a a n ch a o u na b a n d a de lon g itu d de o n d a e s tre ch a . P or e je m p lo , la fu e n te de e xc ita c ió n 180 p u e d e s e r un láser. Se p ue de u tiliz a r c u a lq u ie r lá se r a d e cu a d o p a ra p ro d u c ir u n a re sp u e s ta de l o b je to o un co lo ra n te a so c ia d o al o b je to . Los lá se re s p u lsa d o s y los láse re s de o n d a co n tin u a en c a d a ca so son a d e cu a d o s p a ra p ro d u c ir re sp u e s ta s a d e cu a d a s . En a lg u n a s c o n fig u ra c io n e s , la ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a g e n e ra d a p o r la fu e n te de e xc ita c ió n , co m o la luz de e xc ita c ió n , p ue de s e r m o d ifica d a p o r un e le m e n to ó p tico 181. P o r e je m p lo , la luz de e xc ita c ió n p ue de e n fo ca rse en la reg ión de m e d ic ión 175 p o r u na o m ás len tes 181. Las len tes se p ue de n u tiliz a r p a ra e n fo c a r la ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a de e xc ita c ió n en u n a fo rm a de haz a d e cu a d a e n fo c a d a en la reg ión de m e d ic ió n . Los o b je to s 172a en la reg ión de m e d ic ión 175 e m a n a n luz, p o r e je m p lo luz d is p e rsa o f lu o re sce n te , en re sp u e s ta a la fu e n te de e xc ita c ió n 180.
Los o b je to s de un p rim e r tip o 171 e m a n a rá n ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a de sa lid a q ue d ifie re en al m e no s u na c a ra c te r ís tic a en c o m p a ra c ió n con la ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a de sa lid a q u e e m a n a de o b je to s de l se g u n d o tipo 172. P o r e je m p lo , en a lg u n o s e sce n a rio s , los o b je to s d e l p rim e r tip o 171 e m a n a rá n luz q u e tie n e u n a in te ns id ad m ás e le v a d a q u e la luz q u e e m a n a de o b je to s d e l s e g u n d o tip o 172.
Se c o lo ca u n a d is p o s ic ió n de re co le cc ió n ó p tica 190 p a ra re c o g e r la ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a de sa lid a 161 q ue e m a n a d e l o b je to 172 a d e n tro de la re g ión de m e d ic ión 175 q ue c ru za e l lím ite de re fra cc ió n ó p tica de la c o lu m n a de flu id o 150 en la in te rfa z flu id o -a ire 153. En a lg u n a s re a liza c io n e s , la d isp o s ic ió n ó p tica 190 p u e d e e s ta r co n fig u ra d a p a ra m o d ific a r la ra d ia c ió n e le c tro m a g n é tic a de sa lid a 161 con e l fin de p ro p o rc io n a r ra d ia c ió n e le c tro m a g n é tic a de s a lid a m o d ifica d a 162 q u e e n fo c a ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a de sa lid a q u e e m a n a de l o b je to 172a en la reg ión de m e d ic ió n 175 h ac ia un d e te c to r 185. En a lg u n a s re a liza c io n e s , la d isp o s ic ió n de re co le cc ió n ó p tica 190 p ue de in c lu ir un e le m e n to q ue re du ce la d e p e n d e n c ia de la ra d ia c ió n e le c tro m a g n é tic a de sa lid a 161. El d e te c to r 185 rec ibe la ra d ia c ió n e le c tro m a g n é tic a de sa lid a m o d ifica d a 162 y, en re spu es ta , g e n e ra u n a señ a l e lé c tr ic a re p re se n ta tiva de c a ra c te rís tic a s de la ra d ia c ió n e le c tro m a g n é tic a de s a lid a m o d ificad a . A m o do de e je m p lo , e l d e te c to r 185 p ue de se r un d e te c to r de f lu o re sc e n c ia d ire c ta . P o r su p u e s to , se p ue de n in c o rp o ra r o tro s d e te c to re s p a ra d e te c ta r c a ra c te rís tica s de in te rés, co m o d isp e rs ió n , d e ca im ie n to , d e s p la z a m ie n to s de fa se u o tra s ca ra c te rís tic a s de in te rés.
De a cu e rd o con la inve n c ió n , e l d e te c to r es un d e te c to r d iv id id o S iP M .
En a lg u n o s e sce n a rio s , la am p litud de la señ a l e lé c tr ica p u e d e s e r d ife re n te p a ra d ife re n te s tip o s de o b je to s . La señ a l e lé c tr ic a se u tiliza p o r un a n a liza d o r 187 p a ra d is tin g u ir e n tre d ife re n te s tip o s de o b je to s 171, 172. P o r e je m p lo , el a n a liza d o r 187 se p ue de c o n fig u ra r p a ra c o m p a ra r la a m p litu d de la se ñ a l e lé c tr ic a con un u m bra l p a ra d is c rim in a r e n tre o b je to s d e l p rim e r tip o 171 y o b je to s d e l se g u n d o tip o 172. El a n a liza d o r 187 p ue de in c lu ir u no o m ás c ircu ito s a n á lo g o s y /o p ro ce sa d o re s d ig ita le s p a ra m a n ip u la r u na o m ás se ñ a le s de u no o m ás d e te c to re s . A m o do de e je m p lo , un d e te c to r la te ra l p u e d e e m p le a r 90 g ra d o s en re lac ió n con el d e te c to r 185 p a ra d e te c ta r d isp e rs ió n la te ra l o f lu o re sc e n c ia la te ra l. En e l caso de c la s if ica c ió n de e sp e rm a to zo id e s , la f lu o re sc e n c ia la te ra l p e rm ite q ue e l a n a liza d o r 187 d ife re n c ie los e sp e rm a to zo id e s co rre c ta m e n te o rie n ta d o s de los e sp e rm a to zo id e s no o rie n ta d o s .
El a n a liza d o r 187 p u e d e in c lu ir un p ro c e sa d o r 188 q u e tie n e in s tru cc io n e s e je cu ta b le s a lm a ce n a d a s en el m ism o. A d e m á s de e sa s in s tru cc io n e s 198 c o n o c id a s con e l fin de recoger, c o m p a ra r y m a n ip u la r in fo rm a c ió n de las señ a le s d e l d e te c to r, el p ro c e sa d o r p u e d e in c lu ir in s tru cc io n e s 192 p a ra n o rm a liz a r e l v a lo r de in te ns id ad de la ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a de sa lid a en la re p re se n ta d a en la se ñ a l e lé c tr ic a de l d e te c to r en fu n c ió n de la p o s ic ió n d e l o b je to 172 a en la c o lu m n a de flu id o 150 en la reg ión de m e d ic ión 175. El v a lo r de in te ns id ad se p ue de n o rm a liza r de d ive rsa s m a n e ra s . A m o do de e je m p lo , un u su a rio p ue de in g re s a r líne as o cu rva s d ib u ja d a s a m a no en u n a in te rfa se g rá fica en fu n c ió n de un m u e s tre o in ic ia l de d a to s q u e inc lu ye n in te n s id a d e s de f lu o re sc e n c ia e in fo rm a c ión p os ic io na l.
El p ro c e sa d o r 188 ta m b ié n p ue de in c lu ir in s tru cc io n e s 182 p a ra d is c r im in a r o b je to s . La FIG. 2 m u e s tra u n a se cc ión tra n s v e rsa l d e l p la n o x -y de la c o lu m n a de flu id o 150 en la reg ión de m e d ic ión 175 re p re se n ta d a en la F IG . 1. En la se cc ió n tra n s v e rsa l x -y de la re g ión de m e d ic ión 175, la co rr ie n te de n úc leo 151 tie n e fo rm a e líp tica y e l flu id o de la co rr ie n te de n úc leo 151 co m p re n d e al m e no s un o b je to 172a su sp e n d id o en u n a d iso lu c ió n ta m p ó n , q ue ta m b ié n se p u e d e d e n o m in a r m u es tra . La co rr ie n te de e n v o ltu ra 152 ro de a su s ta n c ia lm e n te la co rr ie n te de n úc leo 151. En un e je m p lo p a rtic u la r u tiliz a d o p a ra e s ta d is cu s ió n en e s ta d ivu lg a c ió n , los o b je to s 171, 172 son c é lu la s e sp e rm á tic a s y e l s is te m a 100 se im p le m e n ta p a ra d is c r im in a r los e sp e rm a to zo id e s d e l c ro m o s o m a X de los e sp e rm a to zo id e s de l c ro m o s o m a Y.
Un haz lá se r e n fo ca d o g e n e ra d o p o r la fu e n te de e xc ita c ió n 180 irra d ia las c é lu la s e sp e rm á tic a s 172a d e n tro de la re g ión de m e d ic ión 175. Las c é lu la s 171, 172 se tiñ e n con un co lo ra n te flu o re sc e n te y la ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a de e xc ita c ió n hace q ue la c é lu la 172a d e n tro de la reg ión de m e d ic ión 175 e m a n e ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a de sa lid a flu o re sc e n te . El p ro p ó s ito de la co rr ie n te de n úc leo 151 g e n e ra lm e n te e líp tica es o r ie n ta r u na c é lu la e sp e rm á tic a 172a de ta l m a n e ra q ue los lados p la n o s de la c é lu la e sp e rm á tic a e s té n o rie n ta d o s h ac ia la izq u ie rd a y la d e re c h a co m o se m u e s tra en la FIG. 2. En e s ta o rie n ta c ió n , los lados p la n os de la c é lu la e sp e rm á tic a 172a e s tá n o rie n ta d o s h ac ia el lá s e r 180 y la d isp o s ic ió n de re co le cc ió n ó p tica 190, re sp e c tiva m e n te . C u a n d o c a d a cé lu la 171, 172 se p re se n ta en u na o rie n ta c ió n s im ila r en la re g ión de m e d ic ión 175, se p ue de re d u c ir en g ran m e d id a la va r ia b ilid a d a le a to ria en fu n c ió n de la o rie n ta c ió n . S in e m b a rg o , la se cc ión tra n s v e rsa l e líp tica q u e a yu d a en e s ta o rie n ta c ió n p ro p o rc io n a ta m b ié n u n a la titud s ig n ific a tiv a con re sp e c to a la p o s ic ió n de la cé lu la d e n tro de la c o lu m n a de flu id o 150.
P ara o b te n e r la o rie n ta c ió n d e se a d a , la co rr ie n te de n úc leo e líp tica 151 p re se n ta un e je m a yo r p a ra le lo al e je x re p re se n ta d o en la FIG. 2. La c é lu la e s p e rm á tic a 172a p ue de to m a r c u a lq u ie r n úm e ro de p o s ic io n e s a lo la rgo de l e je x d e n tro de la co rr ie n te de n úc leo 151. La FIG . 2 m u e s tra tre s p o s ib le s p o s ic io n e s re p re se n ta tiva s p a ra la cé lu la e s p e rm á tic a 172a en el n úc leo e líp tico 151, a u n q u e se p u e d e a p re c ia r q u e los e sp e rm a to zo id e s p ue de n e s ta r u b ica d o s en c u a lq u ie r lu g a r e n tre las p o s ic io n e s re p re se n ta d a s . En la o rie n ta c ió n m o s tra d a en la FIG . 2, la p rim e ra p os ic ió n p o s ib le p a ra la cé lu la e sp e rm á tic a 172a en la co rr ie n te de n úc leo 151 e s tá a p ro x im a d a m e n te en e l ce n tro de l núc leo e líp tico 151 (en e l e je ó p tico 199 de la d isp o s ic ió n de re co le cc ió n ó p tica 190), u n a s e g u n d a p os ic ió n p o s ib le e s tá en la p a rte s u p e r io r de la co rr ie n te de n úc leo 151 (p o r e n c im a d e l e je ó p tico 199), y u na te rce ra p o s ic ió n p o s ib le e s tá en el fo n d o de la co rr ie n te de n úc leo 151 (p o r d e b a jo de l e je ó p tico 199). U na re fra cc ió n d e p e n d ie n te de la p o s ic ió n de los ra yos de luz de sa lid a q ue e m a n a n de los e sp e rm a to zo id e s 172a se p ro d u ce en la in te rfa z f lu id o -a ire 153 en las d ife re n te s p o s ic io n e s d e n tro de la co rr ie n te de n úc leo 151. T a l co m o se u tilizan en el p re se n te d o cu m e n to , se d ebe e n te n d e r q u e los té rm in o s de p o s ic ió n re la tiva co m o "p a rte su p e rio r", "p a rte in fe rio r", "su p e rio r" e " in fe rio r" son d e sc rip tivo s con re spe cto a las re la c io n e s e n tre ca ra c te rís tic a s re p re se n ta d a s en las fig u ra s y no lim itan las re iv in d ica c io n e s , e sp e c ia lm e n te la p o s ic ió n de los e sp e rm a to zo id e s en u n a co rr ie n te de n úc leo 151.
C u a n d o la cé lu la e sp e rm á tic a 172a e s tá u b ica d a en la p rim e ra p o s ic ió n y la c o lu m n a de flu id o 150 tie n e u n a secc ión tra n s v e rsa l c irc u la r co m o se m u e s tra en la FIG. 2, los ra yos de luz en e l p la n o q ue e m a n a n de la c é lu la e sp e rm á tica 172a son n o rm a lm e n te in c id e n te s de m a n e ra a p ro x im a d a en la in te rfa z flu id o -a ire 153. Los rayos q ue e m a n a n de p u n to s de la cé lu la e s p e rm á tic a 172a a le ja d o s de su cen tro , o los ra yos q ue e m a n a n del p la n o de la fig u ra , no son n o rm a lm e n te in c id e n te s de m a n e ra e xa c ta en la in te rfa z 153; e s to s ra yos no se c o n s id e ra n en e s ta d iscu s ió n s im p lifica d a , p e ro un e xp e rto en la té c n ica p u e d e v e r có m o se p o d ría g e n e ra liz a r la d is cu s ió n p a ra inc lu irlo s . P o r lo ta n to , en la m e d id a en q u e se p ro d u ce u n a re fra cc ió n de luz en la in te rfaz flu id o -a ire 153, se p ro d u ce de m a ne ra u n ifo rm e con re sp e c to al d e te c to r 185.
El d ia g ra m a de la FIG. 3 m u e s tra re fra cc ió n de luz u n ifo rm e de la ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a de sa lid a 298 q u e e m a n a de u n a cé lu la e sp e rm á tic a 172a a m e d id a q u e la ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a c ru za la in te rfa z 153 cu a n d o la cé lu la e s p e rm á tic a 172a e s tá en la 1a p os ic ió n d e n tro d e l n úc leo e líp tico 151 m o s tra d o en la FIG 2. En c o n se cu e n c ia , la d e n s id a d en e l p la n o de los ra yos de luz 298 q u e sa len de la c o lu m n a de flu id o 150 en la FIG. 3 es u n ifo rm e con re sp e c to al á n g u lo de rayo. La d e n s id a d a n g u la r u n ifo rm e de los ra yos de luz co rre sp o n d e a ra d ia n c ia u n ifo rm e com o fu n c ió n de l á n g u lo de rayo.
P o r e l co n tra rio , cu a n d o u na c é lu la e sp e rm á tic a 172a e s tá fu e ra de l e je ó p tico 199 y e s tá m ás c e rca de la p a rte s u p e rio r o in fe rio r de l n úc leo e líp tico 151, p o r e je m p lo , en las p o s ic io n e s 2a y 3a d e l n úc leo e líp tico 151 m o s tra d o en la FIG. 2, al m e no s a lg u n o s de los rayos de sa lid a q u e e m a n a n de la cé lu la e sp e rm á tic a 172a se e n cu e n tra n con la in te rfaz flu id o -a ire 153 en un á n g u lo o b licu o . E s tos ra yos de s a lid a se re fra c ta n de m a n e ra no u n ifo rm e en la in te rfaz flu id o -a ire 153 en co n tra s te con el e sce n a rio de in c id e n c ia n orm a l d e sc rito a n te rio rm e n te . Los rayos m ás o b licu o s son los m ás in te n sa m e n te re fra c ta do s. La re fra cc ió n de los ra yos de luz h a ce q ue la d is tr ib u c ió n de ra d ia n c ia de la luz f lu o re sc e n te q ue sa le de la co lu m n a de flu id o 150 a tra vé s de la in te rfaz flu id o -a ire 153 se v u e lv a no u n ifo rm e y va ríe con la p o s ic ió n de la cé lu la 172a a lo la rgo d e l e je x. Es d ec ir, e s ta re fra cc ió n ca m b ia la d is trib u c ió n de ra d ia n c ia de la ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a de sa lid a q u e e m a n a de la c é lu la e s p e rm á tic a 172 a fu e ra de la c o lu m n a de flu id o 150.
P or e je m p lo , cu a n d o la cé lu la 172a e s tá u b ica d a fu e ra d e l e je ó p tico 199, p o r e je m p lo en las p o s ic io n e s 2a o 3a m o s tra d a s en la FIG. 2, la d e n s id a d de los ra yos de luz y, p o r lo ta n to , la ra d ia n c ia en el lado d e l a ire de la in te rfaz 153 es m ás e le v a d a en á n g u lo s de rayo p o s itivo s o n eg a tivo s re sp e c tiva m e n te , con re sp e c to al e je ó p tico 199 en c o m p a ra c ió n con la ra d ia n c ia en e l lado d e l a ire de la in te rfaz 153 en á n g u lo s p a ra le lo s al e je ó p tico 199 o en á n g u lo s de rayo n eg a tivo s o p o s itivo s re sp e c tiva m e n te . P os itivo y n e g a tivo se re fie ren al s ign o d e l á n g u lo de rayo y en la FIG.
5. La FIG. 4 es un d ia g ra m a q u e ilus tra rayos de luz 299 q u e e m a n a n de u n a c é lu la 172a y q u e sa len de la c o lu m n a de flu id o 150 a tra vé s de la in te rfa z flu id o -a ire 153 cu a n d o la cé lu la 172a e s tá u b ica d a en la 2a p o s ic ió n de l n úc leo e líp tico 151. En e s te e sce n a rio , la d e n s id a d de ra yos de luz, o ra d ia nc ia , en á n g u lo s de rayo p o s itivo s es m a yo r que la d e n s id a d de los ra yos de luz p a ra le lo s al e je ó p tico 199 o en á n g u lo s de rayo neg a tivos . P ara un s is te m a ó p tico con u n a a p e rtu ra n u m é rica (N A ) p re d e te rm in a d a , la can tid a d de luz re co g id a p o r e l s is te m a de c é lu la s d e l m ism o tip o (p o r e je m p lo la e fic ie n c ia de re co le cc ió n ) p ue de v a r ia r d e p e n d ie n d o de q u e la cé lu la e s té en la p rim e ra p o s ic ió n o en la s e g u n d a p o s ic ió n . La d e p e n d e n c ia p o s ic io n a l de la e fic ie n c ia de re co le cc ió n de l s is te m a co n d u c e a im p re c is io n e s en la d e te rm in a c ió n d e l tip o de cé lu la .
C on re fe re n c ia a la FIG . 5, se d e te rm in a u na fó rm u la a n a lít ica p a ra la d e n s id a d de ra yos de luz co m o fu n c ió n de l á n g u lo d e l rayo y y la p o s ic ió n x de l e sp e rm a to zo id e s se d e te rm in a u tiliza n d o la ley de S ne ll, d o n d e y es e l á n g u lo de un rayo de luz con re sp e c to al e je ó p tico q u e e m a n a d e l o b je to tra s re fra cc ió n en la in te rfaz flu id o -a ire . Este a ná lis is c o n s id e ra so lo rayos d e n tro de la se cc ió n tra n s v e rsa l b id im e n s io n a l de la co rr ie n te de flu jo o ta n g e n c ia le s a la m ism a.
S e d e s e a re s o lv e r la d e n s id a d de los ra yos de luz con re sp e c to al á n g u lo y , q u e se p u e d e u tiliz a r p a ra d e te rm in a r la d e n s id a d de ra yos en la p u p ila de e n tra d a de un s is te m a de re co le cc ió n ó p tica p a ra c a d a p o s ic ió n x de e sp e rm a to zo id e . Esto se p ue de e xp re sa r a sí:
P ara n u e s tro s p ro p ó s ito s , se p ue de s u p o n e r q ue la c é lu la e s p e rm á tic a e m a n a luz u n ifo rm e m e n te en to d a s las d ire cc io n e s , de m o do q ue la d e n s id a d de los rayos de luz e m a n a d o s con re sp e c to al á n g u lo 0 es:
es d ec ir, e s tá u n ifo rm e m e n te d is tr ib u id a de
<->6<= ->2 a 2 . P or a n á lis is g e o m é trico :
0 = ta n 1</COS0—X\>
V 51710 / ’O )
oc =n¡2- 0 - 0; y(4)
y = 7 2 - 0 - / ? , (5)
en d o n d e los á n g u lo s y, 9, $, a, p, y la d is ta n c ia x se m u es tra n en la FIG. 5. D ado q u e la co rr ie n te de flu jo tie n e un ín d ic e de re fra cc ió n n, la ley de S n e ll p ro d u ce o tra re lac ió n e n tre los á ng u lo s :
sinp = nsinoc (6)
La d e n s id a d de ra yos de luz e x te rn o s a la in te rfaz ¡p(p) e s tá re la c io n a d a con la d e n s id a d de ra yos de luz in te rn a a la in te rfa z ¡a(a) m e d ia n te la s ig u ie n te fó rm u la , con T(a) re p re se n ta n d o el p ro m e d io , a tra vé s de a m ba s p o la riza c io n e s , de la tra n s m is ió n a tra vé s de la in te rfaz :
La tra n s m is ió n e s tá re la c io n a d a con los c o e fic ie n te s de re flex ión de F resne l p a ra p o la riza c ió n s y p, Rs(a) y Rp(a), con las s ig u ie n te s fó rm u la s :
U tiliza n d o la Ec. (7) con la a n te r io r y la s ig u ie n te re lac io ne s a d ic io n a le s :
te n e m o s u na e xp re s ió n p a ra la d e n s id a d de ra yos con re sp e c to a y :
A h o ra , la N A d isp o s ic ió n de re co le cc ió n ó p tica v ie n e d a d a p o r e l seno de l á n g u lo de rayo m á x im o Y<0>, p o r lo q u e se p u e d e re s o lv e r e s te á n g u lo en té rm in o s de NA:
Yo — sinX(NA) (16)
F in a lm e n te , la in te ns id ad re la tiva de la luz re cog ida , co m o fu n c ió n de la p o s ic ió n x d e l e sp e rm a to zo id e s , v ie n e d ad a in te g ra n d o la Ec. (15) de -Y0 a Y0 y n o rm a liza n d o con re spe cto al v a lo r de e sa in te g ra l en x = 0:
Intensidad relativa
U tiliza n d o la fó rm u la p a ra la d is trib u c ió n de d e n s id a d de ra yos de la Ec. (15), la d e p e n d e n c ia a n g u la r de la d e n s id a d de ra yos (ra d ia n c ia ) p a ra d ife re n te s p o s ic io n e s de e sp e rm a to zo id e s se p u e d e tra z a r co m o en la FIG. 6. En la F IG . 6, ca d a u n a de las líne as re p re se n ta la d e n s id a d de ra yos co m o u na fu n c ió n de l á n g u lo y p a ra u na p o s ic ió n x de e sp e rm a to zo id e d ad a , d o n d e e l á ng u lo y e s tá en ra d ia ne s . Los tra za d o s co rre sp o n d e n a u n a se rie de p o s ic io n e s que se s itú a n en un rango s im é tr ico a lre d e d o r de x = 0, (co rre s p o n d ie n te al g rá fico 404 en la FIG. 6), q u e es d o n d e la d e n s id a d de ra yos (ra d ia n c ia ) es u n ifo rm e co m o fu n c ió n de l á ng u lo . C u a n d o x es p o s itivo (p o r e je m p lo 2a p o s ic ió n en la FIG. 2, co rre sp o n d ie n te al g rá fico 402 ), la ra d ia n c ia re la tiva es m ás e le va d a p a ra á n g u lo s de rayo<y>p o s itivo s y m ás b a ja p a ra á n g u lo s de rayo y neg a tivos , y lo co n tra r io es c ie rto cu a n d o x es n eg a tivo (p o r e je m p lo 3a p o s ic ió n en la FIG.
2, co rre sp o n d ie n te al g rá fico 403).
Si la a p e rtu ra n u m é rica de las ó p tic a s de re co le cc ió n (d isp o s ic ió n de re co le cc ió n ó p tica 190 en las F IG S. 1 y 2) es g ra n d e , p o r e je m p lo a p ro x im á n d o se a uno , la v a r ia c ió n en la in te ns id ad ó p tic a re co g id a con re spe cto a la p o s ic ió n de la luz q u e e m a n a de un o b je to d e n tro d e l n úc leo e líp tico es re la tiva m e n te p e q u e ñ a . Esto es d e b id o a q u e e se n c ia lm e n te to d a la luz q u e e m a n a de l o b je to y se d ir ig e h ac ia la d e re c h a se ría re co g id a p o r las ó p tica s de re co le cc ió n , in d e p e n d ie n te m e n te de la d ire cc ió n e xa c ta de l rayo, y la ca n tid a d to ta l de luz de e m a n a es in va ria b le a la p o s ic ió n de l o b je to (e xc ita c ió n u n ifo rm e d ad a ). P or el c o n tra rio , u na a p e rtu ra n u m é rica p e q u e ñ a da lu g a r a u na v a r ia c ió n de in te n s id a d re co g id a re la tiva m e n te g ra n d e con re sp e c to a la p o s ic ió n d e l o b je to , ya q u e los c a m b io s en la p o s ic ió n del o b je to a fe c ta n la d is tr ib u c ió n de ra d ia nc ia , y u na a p e rtu ra n u m é rica p e q u e ñ a im p lica so lo se re cog e u n a p o rc ió n de e s ta d is trib u c ió n de ra d ia n c ia ca m b ia n te . Los s is te m a s p rá c tico s p u e d e n te n e r N A q ue son s ig n ifica tiva m e n te m e no re s q u e uno, p o r e je m p lo m e n o re s q u e 0 ,5 o m e n o re s q ue 0,3. La fa m ilia de g rá fico s p ro p o rc io n a d a en la FIG. 7 ilus tra la in te n s id a d re la tiva de luz re co g id a de un o b je to co m o fu n c ió n de la p o s ic ió n x d e l o b je to a tra vé s de ó p tica s de re co le cc ió n con d ife re n te s NA. La F IG . 6 ilu s tra e l ra ng o de á n g u lo s<y>ca p tu ra d o s p o r las d ife re n te s a pe rtu ra s n u m é rica s de la FIG. 7.
En la fa m ilia de g rá fic o s de la FIG. 7, e l g rá fico 412 ilus tra la in te ns id ad re la tiva con re sp e c to a la p o s ic ió n a lo largo d e l e je x p a ra ó p tica s de re co le cc ió n (p o r e je m p lo d isp o s ic ió n de re co le cc ió n ó p tica 190 m o s tra d a en la FIG. 1 y 2) q u e tie n e u n a a p e rtu ra n u m é rica (N A) de 0 ,2 ; e l g rá fico 414 m u e s tra la in te ns id ad re la tiva con re sp e c to a la p os ic ió n a lo la rgo d e l e je x p a ra ó p tica s de re co le cc ió n q ue tie n e n u na N A de 0 ,4 ; el g rá fico 416 m u e s tra la in te ns id ad re la tiva con re sp e c to a la p os ic ió n a lo la rgo de l e je x p a ra ó p tica s de re co le cc ió n q u e tie n e n u na N A de 0 ,6 ; e l g rá fico 418 m u e s tra la in te ns id ad re la tiva con re spe cto a la p o s ic ió n a lo la rgo d e l e je x p a ra ó p tica s de re co le cc ió n q ue tie n e n u na N A de 0 ,8 ; y el g rá fico 419 m u e s tra la in te ns id ad re la tiva con re sp e c to a la p o s ic ió n a lo la rgo de l e je x p a ra ó p tica s de re co le cc ió n q ue tie n e n u n a N A de 0 ,9. De las FIG S . 6 y 7 se d e s p re n d e c la ra m e n te q u e las ó p tica s de re co le cc ió n q ue tie n e n N A m ás p e q u e ñ a s p ro d u ce n u n a m a yo r va r ia c ió n en la in te n s id a d de la luz re co g id a con re spe cto a la p os ic ió n d e l o b je to en c o m p a ra c ió n con las ó p tica s de re co le cc ió n q ue t ie n e n N A m ás g ra n d e s . A d ic io n a lm e n te , las ó p tica s de re co le cc ió n con N A m ás g ra n d e s re cog en ra yos de luz q ue tie n e n un rango m ás a m p lio de á n g u lo s de re fra cc ió n q ue las ó p tica s de re co le cc ió n q ue tie n e n N A m ás p e q u e ñ o s y, p o r lo tan to , tie n e n u n a e fic ie n c ia de re co le cc ió n g en e ra l m á s e le vad a .
C on re sp e c to a la a p lica c ió n de d is c rim in a c ió n o c la s if ica c ió n de e sp e rm a to zo id e s en p a rticu la r, se p ue de e n te n d e r q u e el e je m a yo r e líp tico de la co rr ie n te de n úc leo 151 (F IG S . 1 y 2) p ue de se r de a lre d e d o r de 50 gm de long itud , p ro p o rc io n a n d o a los e sp e rm a to zo id e s a lre d e d o r de 25 gm de la titud p a ra m o ve rse en c u a lq u ie r d ire cc ió n . V o lv ie n d o a la FIG. 7, se p u e d e v e r q u e u n a N A de 0 ,2 so lo c a p tu ra a p ro x im a d a m e n te el 90 % de un o b je to cu a n d o el o b je to e s tá a a lre d e d o r de 17 gm de l ce n tro . De m a n e ra s im ila r, u na N A de 0 ,4 ca p tu ra so lo el 92 % de la in te ns id ad re la tiva p a ra o b je to s q u e e s tá n a a lre d e d o r de 17 gm d e l ce n tro y u n a N A de 0 ,6 ca p tu re un p oco m ás d e l 94 % de la in te ns id ad re la tiva en la m ism a p os ic ió n . A d e m á s, se p u e d e a p re c ia r q ue la N A de ó p tica s de re co le cc ió n p a ra un c la s if ic a d o r de e sp e rm a to zo id e s p ue de e s ta r e n tre a lre d e d o r de 0 ,3 y 0 ,6. Si b ien la FIG . 7 ilus tra e l b e n e fic io de a p e rtu ra s n um é rica s c a d a ve z m á s g ra n d e s , ta le s a p e rtu ra s n u m é rica s son c a d a ve z m ás ca ra s y t ie n e n un ca m p o de p ro fu n d id a d m enos p ro fu n d o , lo q ue s ig n ifica q ue la a p e rtu ra m ás g ra n d e se d eb e u b ic a r fu e ra de la boq u illa . S in e m b a rg o , e x is te un lím ite en cu a n to a la p ro x im id a d de u b ica c ió n de la ó p tica de re co le cc ió n en a p lica c io n e s de c la s if ica c ió n de e sp e rm a to zo id e s . En in s tru m e n to s de c la s if ica c ió n de e sp e rm a to zo id e s típ ico s , las a p e rtu ra s p ue de n e s ta r e n tre a lre d e d o r de 0 ,5 y 0 ,6. Las re a liza c io n e s d e sc rita s en e l p re se n te d o c u m e n to co rrig e n la d e p e n d e n c ia p o s ic io n a l de la in te n s id a d m e d id a , lo q ue p e rm ite q ue la ó p tica de re co le cc ió n de a p e rtu ra n u m é rica m ás b a ja fu n c io n e co m o la ó p tica de re co le cc ió n de a p e rtu ra n u m é rica m ás a lta.
Los e sp e rm a to zo id e s u b ica d o s en la co rr ie n te ce n tra l 151 en p o s ic io n e s q u e se a ce rca n a la 2a y 3a p o s ic io n e s en la F IG . 2, p o r lo ta n to , e m a n a n u n a in te ns id ad g e n e ra l s ig n ific a tiv a m e n te m e n o r de ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a q ue se d e te c ta fin a lm e n te p a ra a n á lis is y d is c rim in a c ió n . De hecho , la co rr ie n te de n úc leo 151 p u e d e te n e r un e je m a yo r e líp tico q ue es de a lre d e d o r de 50 pm de lon g itu d a a lta s ta sa s de e ve n to s (en la m a gn itu d de 60.000 e ve n to s p o r s e g u n d o y m a yo re s). A lg u n o s e sp e rm a to zo id e s e s ta rá n d e sce n tra d o s en 20 pm o inc lu so h as ta a lre d e d o r de 25 pm a c a d a lado de la 1a p o s ic ió n . En e l co n te x to de se ñ a le s de flu o re sc e n c ia e x tre m a d a m e n te b rilla n te s y e s tre ch a m e n te re la c io n a d a s , e s ta v a r ia c ió n p u e d e e c lip s a r la d ife re n c ia de a p ro x im a d a m e n te el 4 % en e l A D N n u c le a r te ñ id o q ue d ife re n c ia los e sp e rm a to zo id e s p o rta d o re s de l c ro m o s o m a X de los e sp e rm a to zo id e s p o rta d o re s d e l c ro m o s o m a Y.
A d e m á s, a u m e n ta r e l n ú m e ro de e ve n to s a u n a c o n ce n tra c ió n de e sp e rm a to zo id e s d a d a d e n tro de u na m u e s tra de ta m p ó n re qu ie re a u m e n ta r e l vo lu m e n p o r u n id ad de tie m p o en la c o lu m n a de flu id o q ue p asa a tra vé s de la reg ión de m e d ic ió n . A u m e n ta r el n ú m e ro de e ve n to s d e te c ta d o s p o r s e g u n d o de e s ta m a n e ra ta m b ié n a u m e n ta la se cc ión tra n s v e rsa l e líp tica de la co rr ie n te de n úc leo d e n tro de la c o lu m n a de flu id o , in c lu ye n d o la long itud d e l e je m ayo r. C om o c o n s e c u e n c ia n a tu ra l, y co m o saben los e xp e rto s en la m a te ria , g e n e ra lm e n te a u m e n ta r la ve lo c id a d de c la s if ica c ió n a u m e n ta n d o la ta s a de flu jo de la m u e s tra d ism in u ye la s e n s ib ilid a d de l e q u ip o de c la s if ica c ió n de e sp e rm a to zo id e s . P or lo ta n to , las re a liza c io n e s d e s c rita s en el p re se n te d o c u m e n to no so lo m e jo ran la p re c is ió n de la c la s if ica c ió n de e sp e rm a to zo id e s a ve lo c id a d e s h ab itu a le s , s ino q u e ta m b ié n p u e d e n p ro p o rc io n a r u n a c la s if ica c ió n de e sp e rm a to zo id e s a u n a m a yo r ve lo c id a d g e n e ra l en té rm in o s de re n d im ie n to sin s u fr ir p é rd id a s de fid e lid a d .
En e l d ia g ra m a de f lu jo de la F IG . 8 se ilus tra un e n fo q u e p a ra id e n tif ic a r o b je to s q ue se d e sp la za n en u na c o lu m n a de flu id o en p re se n c ia de va r ia c ió n p o s ic io n a l. El p ro ce so inc lu ye la c re a c ió n 510 de u na co lu m n a de flu id o q ue co n tie n e o b je to s en p o s ic io n e s d ife re n te s d e n tro de la co lu m n a de flu id o . La c o lu m n a de flu id o p u e d e s e r u n a co rr ie n te c o a x ia l de flu id o c re a d a p o r un c itó m e tro de flu jo de ch o rro en e l a ire . Ta l c o lu m n a de flu id o p ue de c o m p re n d e r u na co rr ie n te de n úc leo con u n a se cc ión tra n s v e rsa l e líp tica q u e tie n e un e je m a yo r a lo la rgo d e l cu a l se p ue de n c o lo ca r o b je to s . La co rr ie n te de n úc leo p u e d e e s ta r c o n te n id a co a x ia lm e n te d e n tro de u n a co rrie n te de e n vo ltu ra . En a lg u n a s re a liza c io n e s , la c o lu m n a de flu id o p ue de te n e r u n a in te rfa z a ire -flu id o p o r la q u e se p ro d u ce la re fra cc ió n . En o tras re a liza c io n e s , la c o lu m n a de flu id o p ue de e s ta r fo rm a d a d e n tro de u na c u b e ta o un ca n a l m ic ro flu íd ico . En ta le s caso s, p u e d e h a b e r u na in te rfaz líq u id o -v id r io y p o s ib le m e n te u n a in te rfaz v id r io -a ire y la luz q ue e m a n a se p u e d e re fra c ta r d o s ve ce s . S e e sp e ra q u e ta l luz re fra c ta d a d o s v e ce s se b e n e fic ie e n o rm e m e n te de la co rre cc ió n de d e p e n d e n c ia a n g u la r de c ie rta s re a liza c io ne s .
El p ro ce so co n tin u a g e n e ra n d o 520 ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a de e xc ita c ió n y d ir ig ie n d o 530 la ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a de e xc ita c ió n h ac ia o b je to s en la c o lu m n a de flu id o en u n a reg ión de m e d ic ió n . Los o b je to s d en tro de la co lu m n a de flu id o e m a n a n ra d ia c ió n e le c tro m a g n é tic a de sa lid a en re sp u e s ta a la ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a de e xc ita c ió n en la reg ión de m e d ic ión . La ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a de sa lid a se re cog e 540 de los o b je to s en la co lu m n a de flu id o , in c lu id o s o b je to s q ue tie n e n d ife re n te p o s ic ió n d e n tro de la c o lu m n a de flu id o en u n a reg ión de m e d ic ión y un d e te c to r g e n e ra 550 u n a señ a l e lé c tr ic a q u e re spo nd e a la in te ns id ad de la ra d ia c ió n e le c tro m a g n é tic a de sa lid a re co g id a p o r la d isp o s ic ió n ó p tica .
A c o n tin u a c ió n , un a n a liza d o r u o tro m e d io a d e cu a d o n o rm a liza 560 la in te ns id ad re p re se n ta d a p o r la señ a l de sa lid a en fu n c ió n de la p o s ic ió n d e l o b je to en la c o lu m n a de flu id o . La n o rm a liza c ió n se p ue de re a liz a r p o r m e d io de u na co rre cc ió n , m e d ia n te la cua l las se ñ a le s g e n e ra d a s fu e ra de l e je ce n tra l, co m o h ac ia e in c lu ye n d o las p o s ic io n e s s e g u n d a y te rce ra de la F IG . 2, se a m p lifica n m e d ia n te un fa c to r de co rre cc ió n a p ro p ia d o en fu n c ió n de su p os ic ió n . La m a gn itu d de fa c to re s de co rre cc ió n a p ro p ia d o s se p u e d e v e r en la FIG. 7. U na ve z n o rm a liza d o p o r co rre cc ió n , el m é to do co n tin ú a d is c rim in a n d o 570 un p rim e r tip o de o b je to de o tro s o b je to s . La d is c rim in a c ió n p u e d e te n e r lu g a r en un a n a liza d o r de c itó m e tro de f lu jo y p ue de in c lu ir u na o m ás m a n ip u la c io n e s a d ic io n a le s . P o r e je m p lo , se p ueden g e n e ra r h is to g ra m a s u n iva r ia n te s ilus tra nd o u na d is trib u c ió n de in te n s id a d e s de flu o re sc e n c ia . T a m b ié n se p ueden g e n e ra r h is to g ra m a s b iva ria n te s con la señ a l co rre g id a y con va lo re s c a lcu la d o s a d ic io n a lm e n te . T a les va lo re s c o rre g id o s y c a lcu la d o s se p ue de n c o m p a ra r con re g io n e s de c o m p u e rta en un a n a liza d o r de c itó m e tro de f lu jo o c o m p a ra r con ta b la s de b ú sq u e d a p a ra d is c r im in a r un p rim e r tip o de o b je to de o tro s tip o s de o b je to s .
C o m o e je m p lo s de o b je to s se p u e d e n d is c r im in a r e sp e rm a to zo id e s co m o e sp e rm a to zo id e s p o rta d o re s d e l c ro m o s o m a X o d e l c ro m o s o m a Y. A d e m á s, los e sp e rm a to zo id e s se p ue de n te ñ ir con un co lo ra n te se le c tivo de A D N a d e m á s de un co lo ra n te de a p a g a m ie n to se cu n d a rio . Un co lo ra n te de a p a g a m ie n to p e rm e a n o rm a lm e n te c é lu la s e sp e rm á tica s c o m p ro m e tid a s de la m e m b ra n a , co m o c é lu la s e sp e rm á tic a s m u e rta s o m o rib u n d a s , y re du ce en g ran m e d id a la f lu o re sc e n c ia p ro d u c id a p o r e l co lo ra n te se le c tivo de A D N a so c ia d o a e sa s c é lu la s co m p ro m e tid a s . T a le s cé lu la s a p a g a d a s se e lim in a n de m a n e ra m uy e fe c tiv a de las p o b la c io n e s e s tre c h a m e n te re la c io n a d a s so m e tid a s a d is c rim in a c ió n /c la s if ica c ió n . De e s ta m a ne ra , un s is te m a p ue de d is c r im in a r e sp e rm a to zo id e s c é lu la s e sp e rm á tica s v iva s o v ia b le s de c é lu la s e sp e rm á tic a s m o rib u n d a s o co m p ro m e tid a s . El s is te m a ta m b ié n p u e d e d is c rim in a r e sp e rm a to zo id e s p o rta d o re s d e l c ro m o s o m a X de to d a s las c é lu la s re s ta n te s , e sp e rm a to zo id e s p o rta d o re s de l c ro m o s o m a Y de to d a s las cé lu la s re s ta n te s , o in c lu so e sp e rm a to zo id e s p o rta d o re s d e l c ro m o s o m a X y e sp e rm a to zo id e s p o rta d o re s d e l c ro m o s o m a Y v ia b le s s im u ltá n e a m e n te de o tra s c é lu la s e sp e rm á tica s .
La FIG . 9 ilu s tra u na p rim e ra re a liza c ió n de l s is te m a de d is c rim in a c ió n su s ta n c ia lm e n te s im ila r al s is te m a de d is c rim in a c ió n re p re se n ta d o en las FIG S . 1 y 2, en e l q ue la ra d ia c ió n e le c tro m a g n é tic a de sa lid a 161 q u e e m a n a de un o b je to 172a u b ica d o en la reg ión de m e d ic ió n se recoge p o r u n a d isp o s ic ió n de re co le cc ió n ó p tica 190. La d isp o s ic ió n de re co le cc ió n ó p tica 190 p u e d e in c lu ir u na len te de re co le cc ió n q ue e n fo c a u n a ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a de sa lid a en un d e te c to r 185. En la re a liza c ió n re p re se n ta d a , e l d e te c to r fu n c io n a ta n to p a ra m e d ir u n a c a ra c te r ís tic a de la ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a de sa lid a m o d ifica d a co m o p a ra un d e te c to r de p o s ic ió n 186 p ara d e te rm in a r la p o s ic ió n de l o b je to 172 a d e n tro de la co rr ie n te de n úc leo 151 de la c o lu m n a de flu id o 150.
El d e te c to r 185 a d e cu a d o p a ra d e te rm in a r ta n to u na c a ra c te r ís tic a de la ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a de sa lid a m o d ifica d a 162 co m o p a ra d e te rm in a r la u b ica c ió n de l o b je to 172a en la re g ión de m e d ic ión co m p re n d e un d e te c to r S iP M d iv id ido .
Este d e te c to r p u e d e e s ta r u b ica d o en el p la n o de im a ge n de l o b je to o en el p la n o de F o u rie r p a ra d e te rm in a r la p os ic ió n d e l o b je to . En e l p la n o de im a ge n , los d e te c to re s m id en d ire c ta m e n te la p os ic ió n d e l o b je to , m ie n tra s q ue en e l p lano de F o u rie r la in fo rm a c ió n de p o s ic ió n se e x tra e rá de la d is tr ib u c ió n de in te ns id ad la te ra l (p o r e je m p lo la a s im e tría izq u ie rd a -d e re ch a ).
Las a p lica c io n e s de c ito m e tría de f lu jo re qu ie ren fre cu e n te m e n te d e te c to re s m uy se n s ib le s (h as ta re cu e n to de fo to n e s in d iv id u a le s ) y rá p id o s (los o b je to s se m u even con ~ 20 m /s a 10p m ). Los d e te c to re s con la ve lo c id a d y se n s ib ilid a d re q u e rid a s son n o rm a lm e n te a q u e llo s d e te c to re s q u e p ro p o rc io n a n u na g a n a n c ia in te rn a . En e l tu b o fo to m u lt ip lic a d o r (P M T ) o un tu b o fo to m u lt ip lic a d o r (S iP M ), ta m b ié n co n o c id o co m o fo to d io d o de a va la n ch a p ixe la d o , un so lo fo tó n c re a u n a ca s c a d a de h as ta a lre d e d o r de 106 e le c tro n e s . A m b o s tip o s de d e te c to r e s tá n d isp o n ib le s co m e rc ia lm e n te com o m a trice s de d e te c to re s . S iP M p u e d e e s ta r m ás a d a p ta d o p a ra u so en m a trice s de d e te c to re s a d e cu a d o s p ara d e te rm in a r la p os ic ió n de l o b je to , ya q u e se fa b rica n m e d ia n te té cn ica s e s tá n d a r en o b le a s de s ilic io . A lg u n o s d e te c to re s , co m o S iP M , p ue de n e s ta r p a rtic u la rm e n te b ien a d a p ta d o s p a ra co lo ca rse en un p la n o de F o u rie r con el fin de d is tr ib u ir luz sob re un á re a m ás g ra n d e de l de tec to r.
La FIG. 10 ilus tra u n a re a liza c ió n a lte rn a tiva q ue no p e rte n e ce a la inve nc ión , en la q ue un d iv is o r de haz 191 u o tra ó p tica a d e cu a d a re d ir ige u na fra cc ió n de la p o te n c ia de la ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a de sa lid a m o d ifica d a 162. La m a yo r p a rte de la ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a de sa lid a m o d ifica d a 162 se d ir ig e y se e n fo c a en el d e te c to r 185. En e s ta re a liza c ió n , e l d e te c to r 185 co m p re n d e un p rim e r d e te c to r 176 p a ra d e te c ta r u na ca ra c te rís tic a de in te ré s. El p r im e r d e te c to r 176 p ue de s e r c u a lq u ie r d e te c to r a d a p ta d o co n v e n c io n a lm e n te p a ra c u a n tif ic a r la ca ra c te rís tic a p a rtic u la r de in te ré s. En a p lica c io n e s de c ito m e tría de f lu jo típ ica s , los fo to d io d o s , los tu b o s fo to m u ltip lic a d o re s (PM T) y los fo to m u ltip lic a d o re s de s ilic io p u e d e n e s ta r p a rtic u la rm e n te b ien a d a p ta d o s p a ra d e te c ta r in te ns id ad e le c tro m a g n é tic a d is p e rsa o flu o re sce n te .
El d iv is o r de haz 191 p ue de c o m p re n d e r un e sp e jo d ie lé c tr ico 197, a u n q u e los e xp e rto s en la té c n ica a p re c ia rá n que se p ue de n u tiliz a r o tro s c o m p o n e n te s ó p tico s a d e cu a d o s , co m o d iv is o re s de haz cú b ico , d iv iso re s de haz p rism á tico s y s im ila re s p a ra re d ire c c io n a r u n a p o rc ió n de la ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a de s a lid a m o d ifica d a 162. In d e p e n d ie n te m e n te de la m a n e ra en la q u e se d iv id e la p o te n c ia de sa lid a , u n a p rim e ra fra cc ió n de haz 164 se d irige a lo la rgo de u na p rim e ra tra ye c to ria al d e te c to r y u na s e g u n d a fra cc ió n de haz 165 se d ir ig e a lo la rgo de u na tra ye c to ria d ife re n te a un se g u n d o d e te c to r 173 en fo rm a de un d e te c to r de p os ic ió n 177. El d e te c to r de p o s ic ió n p uede s e r un d isp o s itivo se n s ib le a la p o s ic ió n ("P S D ") co m o un s e n s o r iso tró p ico o un d isp o s itivo a co p la d o c a rg a d o (C C D ), d e te c to re s d iv id id o s , u n a m a triz de d e te c to re s de PM T, S iP M , fo to d io d o s p in o s im ila res .
En cu a n to a la F IG . 11, se rea lizó u n a s im u la c ió n q u e ilus tra la v ia b ilid a d de un d e te c to r de d iv is ió n p a ra d e te rm in a r la in fo rm a c ió n p o s ic io n a l de un s is te m a de c ito m e tría de flu jo . La s im u la c ió n e m p le ó un d e te c to r S iP M q u e co m p re n d ía d e te c to re s S iP M de 3 m m m o n ta d o s u no al lado de l o tro . El b o rd e en e l q u e se e n co n tra b a n los d e te c to re s se ca lib ró co m o u na p os ic ió n ce n tra l de co o rd e n a d a s x, s im u la n d o el e je de l haz de un lá se r de a ná lis is , a s í co m o e l cen tro s im é tr ico de u n a c o lu m n a de flu id o . S e b a rr ió un ta m a ñ o de p un to de 1,5 m m a tra vé s de los d e te c to re s d iv id id o s d e sd e u n a p o s ic ió n x e n tre a lre d e d o r de -12 m m y 12 m m y se m id ió la in te ns id ad re la tiva de ca d a d e te c to r. Un p rim e r g rá fico 601 ilus tra la in te ns id ad re la tiva re g is tra d a p a ra e l p un to d e l haz de uno de los d e te c to re s de p o s ic io n e s x q ue o sc ila n de a lre d e d o r de -12 m m a a lre d e d o r de 12 m m , d o n d e la p o s ic ió n x c o rre sp o n d e a un p la n o del d e te c to r S iP M . Un g rá fico 602 ilus tra la co rre sp o n d ie n te in te ns id ad re la tiva d e te c ta d a p o r e l o tro d e te c to r p a ra e l p un to de l haz en un ra ng o de p o s ic io n e s x de a lre d e d o r de -12 m m a a lre d e d o r de 12 m m . C om o se p u e d e ver, la d ife re n c ia p o s ic io n a l en los d o s d e te c to re s d a lu g a r a d ife re n te s in te n s id a d e s m e d id a s en fu n c ió n de la p o s ic ió n x d e l p u n to de 1,5 m m . Estas d ife re n c ia s se c o rre la c io n a n con la p o s ic ió n y se p ue de n tra d u c ir a tra vé s de m e d io s de p ro ce sa m ie n to p a ra a p ro x im a r in fo rm a c ió n p os ic io n a l. El ru ido se in c lu yó en la s im u la c ió n , p e ro e ra in d e p e n d ie n te de la in te ns id ad . A m á x im a in te ns id ad , e l ru ido c o rre sp o n d e a un c o e fic ie n te de va r ia c ió n de l 0 ,8 % . La s im u la c ió n d e m o s tró q u e la p os ic ió n x se p u e d e d e te rm in a r en u n a d isp o s ic ió n de d e te c to r d iv id id o en fu n c ió n de la in te ns id ad re la tiva d e te c ta d a p o r c a d a S iP M en u n a d isp o s ic ió n de d e te c to r d iv id id o . Los e xp e rto s en la té c n ica p u e d e n a p re c ia r q u e las re a liza c io n e s de la p re se n te inve n c ió n no e s tá n lim ita d a s a e s ta co n fig u ra c ió n y q ue en e l p re se n te d o c u m e n to ta m b ié n se co n te m p la n o tras co n fig u ra c io n e s de d e te c to r a d e cu a d a s p a ra d e te rm in a r la p o s ic ió n de u n a p a rtícu la d e n tro de u n a co lu m n a de flu id o . A m o do de e je m p lo , en u na d isp o s ic ió n de d e te c to r d iv id id o se p u e d e n u tiliza r o tros d e te c to re s . Los e xp e rto s en la té c n ic a a p re c ia rá n q ue los d e te c to re s d eb en te n e r un n ive l b a jo de ru ido , ya q u e las se ñ a le s co m b in a d a s d eb en te n e r un co e fic ie n te de v a r ia c ió n su fic ie n te m e n te ba jo .
La F IG . 12 ilus tra e l re su lta d o de un e xp e rim e n to q ue in co rp o ra co rre cc ió n p o s ic io n a l p a ra n úc leo s de e sp e rm a to zo id e s en u na co lu m n a de flu id o , d a n d o lu g a r a m e jo ra s s ig n ifica tiva s en la d ife re n c ia c ió n de n ú c le o s de e sp e rm a to zo id e s p o rta d o re s de c ro m o s o m a s X e Y. Los n ú c le o s de e sp e rm a to zo id e s te ñ id o s con H o e ch s t 33342 se p ro ce sa ro n a tra vé s de un in s tru m e n to de c la s if ica c ió n de e sp e rm a to zo id e s G e n e s is III fa b ric a d o p o r C y to n o m e . El in s tru m e n to e s ta b a e q u ip a d o con un d e te c to r d iv id id o S iP M . La p re s ió n de la m u e s tra y de la e n v o ltu ra se a jus tó p a ra e s ta b le c e r u na ta sa de e ve n to s de 35.000 e ve n to s p o r seg un do . Los n ú c le o s fu e ro n a n a liza d o s con un lá se r C o h e re n t G e n e s is C W -355 a u na p o te n c ia p ro m e d io de 150 m W . El tra za d o 610 re p re se n ta un h is to g ra m a b iva ria n te q u e ilus tra u n a su m a de in te n s id a d e s de f lu o re sc e n c ia de ca d a d e te c to r en e l d e te c to r d iv id id o tra za d o fre n te al d e lta p o s ic io n a l de n ú c le o s en la c o lu m n a de flu id o . C om o se ha d e sc rito a n te r io rm e n te , e l ra ng o de l d e lta p o s ic io n a l re p re se n ta e l e je m a yo r de la co rr ie n te de n úc leo e líp tica a lo la rgo de la cu a l los n ú c le o s p ue de n e n tra r en la reg ión de m e d ic ió n . S e o b se rva una p o b la c ió n de n ú c le o s p o rta d o re s de l c ro m o s o m a X 612 en fo rm a de cu a rto c re c ie n te . C om o se e sp e ra b a , las in te n s id a d e s m e d id a s son m á x im a s c e rca de un d e lta de p o s ic ió n de 0 con re d u cc io n e s q ue se cu rva n h ac ia a ba jo a m e d id a q u e los n úc leo s se a le ja n de la p o s ic ió n cen tra l. Se o b s e rva u na p o b la c ió n de n ú c le o s p o rta d o re s del c ro m o s o m a Y 614 co m o un se g u n d o cu a rto c re c ie n te ju s to d e b a jo de la p o b la c ió n X y, de nuevo , se o b se rva n las in te n s id a d e s m ás a lta s en un d e lta de p o s ic ió n de 0 con p é rd id a s s ig n ifica tiva s en in te ns id ad re la tiva a m e d id a que los n ú c le o s se a le jan de la p o s ic ió n cen tra l.
El tra za d o 620 p re s e n ta un h is to g ra m a u n iva r ia n te de las in te n s id a d e s de f lu o re sc e n c ia su m a d a s q ue co rre sp o n d e n a las in te n s id a d e s re p re se n ta d a s en el tra za d o 610. Si b ien se p ue de o b s e rv a r la p o b la c ió n n ítid a de n úc leos p o rta d o re s de l c ro m o s o m a X 612 y la p o b la c ió n de n úc leo s p o rta d o re s d e l c ro m o s o m a Y 614 , u na c o m p a ra c ió n de l tra za d o 610 con el tra za d o 620 hace e v id e n te q ue los n úc leo s de e sp e rm a to zo id e s p o rta d o re s d e l c ro m o s o m a X d e sce n tra d o s se so la pa n en m e d id a c re c ie n te con los n ú c le o s de e sp e rm a to zo id e s p o rta d o re s de l c ro m o s o m a Y b ien ce n tra d o s . De h echo , la re lac ió n de p ico a v a lle se ca lc u la en 76 ,8 %.
S eg ú n re a liza c io n e s de la inve nc ión , un fa c to r de co rre cc ió n 616 se ilu s tra co m o u n a líne a c u rva d a en e l tra za d o 610. El fa c to r de co rre cc ió n 616 ilus tra e l g ra d o de c o rre cc ió n re q u e rid o a la in te ns id ad de f lu o re sc e n c ia d e te c ta d a p ara e lim in a r la v a ria c ió n in tro d u c id a p o r las p o s ic io n e s a le a to ria s de e ve n to s . Se a p licó u n a co rre cc ió n co rre sp o n d ie n te a los va lo re s de su m a de f lu o re sc e n c ia re p re se n ta d o s en el tra za d o 630 p a ra p ro d u c ir u na p o b la c ió n co rre g id a de n ú c le o s p o rta d o re s d e l c ro m o s o m a X 632 y u n a p o b la c ió n co rre g id a de n ú c le o s p o rta d o re s d e l c ro m o s o m a Y 634. La p o b la c ió n co rre g id a de n úc leo s p o rta d o re s de l c ro m o s o m a X 632 p ro d u ce u n a fo rm a g e n e ra lm e n te re c ta n g u la r y ya no m u e s tra f lu c tu a c ió n en fu n c ió n de la p o s ic ió n de los n úc leo s en la c o lu m n a de flu id o . S e p u e d e o b s e rva r una se p a ra c ió n m ás n ítid a en el tra za d o 630 e n tre la p ob la c ió n c o rre g id a de n úc leo s p o rta d o re s d e l c ro m o s o m a X 632 y u n a p o b la c ió n c o rre g id a de n úc leo s p o rta d o re s de l c ro m o s o m a Y 634. El tra za d o 640 ilu s tra e l co rre sp o n d ie n te h is to g ra m a u n iva ria n te , q u e tie n e u na re lac ió n de p ico a v a lle d e l 94 % e n tre la p ob la c ió n c o rre g id a de n úc leos p o rta d o re s d e l c ro m o s o m a X 632 y la p o b la c ió n c o rre g id a de n ú c le o s p o rta d o re s d e l c ro m o s o m a Y 634. El fue rte co n tra s te e n tre e l g rá fico 620 y e l g rá fic o 640 es e v id e n te v isu a lm e n te . A d e m á s, la d ife re n c ia es c u a n tif ica b le , s iendo 17,2 p u n to s m ás e le vad a .
La FIG . 13 ilus tra los re su ltad o s de un e je m p lo q u e in co rp o ra c o rre cc ió n según re a liza c io n e s d e sc rita s en e l p re se n te d o cu m e n to . Los e sp e rm a to zo id e s v ivo s te ñ id o s con H o e ch s t 33342 se p ro ce sa ro n a tra vé s de un in s tru m e n to de c la s if ica c ió n de e sp e rm a to zo id e s G e n e s is III fa b ric a d o p o r C y to n o m e . Las p re s io n e s de la m u e s tra y la e n v o ltu ra se a ju s ta ro n p a ra a lc a n z a r u na ta sa de e ve n to s de 43.000 e ve n to s p o r se g u n d o y los e sp e rm a to zo id e s se a n a liza ro n con un lá se r C o h e re n t G e n e s is C W -355 q ue fu n c io n a b a a u na p o te n c ia p ro m e d io de 100 m W . El tra za d o 710 ilus tra un h is to g ra m a b iva ria n te de la in te ns id ad de flu o re sc e n c ia su m a d a y la p os ic ió n re la tiva de e sp e rm a to zo id e s v ivo s en la co rr ie n te de núc leo . De nuevo , se p ue de o b s e rva r la p o b la c ió n de e sp e rm a to zo id e s p o rta d o re s de l c ro m o s o m a X 712 co m o u n a p rim e ra p ob la c ió n p o r e n c im a de u na p o b la c ió n de e sp e rm a to zo id e s p o rta d o re s de l c ro m o s o m a Y 714. T a m b ié n se re p re se n ta un fa c to r de co rre cc ió n 716 p a ra n o rm a liza r los va lo re s de in te ns id ad su m a d o s en el tra za d o 710. El tra za d o 720 ilu s tra e l h is to g ra m a u n iva r ia n te de in te n s id a d e s su m a d a s no c o rre g id a s y m u e s tra u n a re lac ión de p ico a v a lle de l 75 ,3 % e n tre la p o b la c ió n co rre g id a de e sp e rm a to zo id e s p o rta d o re s de l c ro m o s o m a X 712 y la p o b la c ió n c o rre g id a de e sp e rm a to zo id e s p o rta d o re s d e l c ro m o s o m a Y 714.
El tra za d o 730 p ro p o rc io n a un tip o de h is to g ra m a b iva ria n te co m ú n en a p lica c io n e s de c la s if ica c ió n de e sp e rm a to zo id e s . En e s te caso , se tra za u na in te ns id ad de flu o re sc e n c ia d ire c ta co rre g id a fre n te a u n a flu o re sc e n c ia la te ra l. Un h is to g ra m a de f lu o re sc e n c ia d ire c ta fre n te a f lu o re sc e n c ia la te ra l es ú til p a ra c la s if ic a r e sp e rm a to zo id e s v ivo s p o rq u e la f lu o re sc e n c ia la te ra l p ro p o rc io n a in fo rm a c ió n sob re la o rie n ta c ió n de c a d a cé lu la . P o r e l co n tra rio , los n ú c le o s de e sp e rm a to zo id e s se so m e te n so n ica c ió n y se e lim in a n de la ca b e z a de e sp e rm a to zo id e a s fé rica . C om o ta l, la o rie n ta c ió n no es un p ro b le m a en la c la s if ica c ió n de n ú c le o s de e sp e rm a to zo id e s . P o r e s ta razón , los n úc leos son m ás fá c ile s de c la s if ica r y se u tilizan fre cu e n te m e n te p a ra c a lib ra r c itó m e tro s de f lu jo de c la s if ica c ió n de e sp e rm a to zo id e s . El tra za d o 730 re p re se n ta u n a p o b la c ió n c o rre g id a de n ú c le o s p o rta d o re s de l c ro m o s o m a X 732 y u n a p o b la c ió n c o rre g id a de n úc leo s p o rta d o re s de l c ro m o s o m a Y 734
Al igua l q ue en e l e je m p lo an te rio r, el tra za d o 740 se co rre la c io n a aún en el e je Y con la f lu o re sc e n c ia d ire c ta co rre g id a d e l tra za d o 730. En el tra za d o u n iva r ia n te d e l g rá fico 740 , se p u e d e o b s e rva r la p ob la c ió n c o rre g id a de e sp e rm a to zo id e s p o rta d o re s d e l c ro m o s o m a X 732 y la p o b la c ió n c o rre g id a de e sp e rm a to zo id e s p o rta d o re s de l c ro m o s o m a Y 734 co m o p ico s m ás n ítid os q ue tie n e n u na re lac ió n de p ico a v a lle ca lc u la d a p o r e l s is te m a de un 81,0 % . Y n u e va m e n te , e l h is to g ra m a co rre g id o p re se n ta u na m e jo ra s ig n ific a tiv a con re sp e c to al tra za d o 720, lo q ue d e m u e s tra e l v a lo r de co rre cc ió n p o s ic io n a l p a ra e sp e rm a to zo id e s v ivo s .
En o tro a sp e c to , las re a liza c io n e s d e s c rita s en el p re se n te d o c u m e n to p ue de n p ro p o rc io n a r s is te m a s y m é to d o s que fa c ilita n su s ta n c ia lm e n te un p ro ce so de a lin e a c ió n en un c itó m e tro de flu jo . En e l ca so de e sp e rm a to zo id e s , p o r e je m p lo , la re g ión de m e d ic ión , los d e te c to re s e inc lu so la e s tru c tu ra q u e fo rm a e l f lu jo de e n v o ltu ra d eb en e s ta r a lin e a d o s de m a n e ra a d e cu a d a y p re c isa con e l fin de g e n e ra r y re c o g e r se ñ a le s su fic ie n te m e n te c la ra s p ara d ife re n c ia r las p o b la c io n e s de e sp e rm a to zo id e s p o rta d o re s de c ro m o s o m a s X e Y, m u y b rilla n te s y e s tre ch a m e n te re la c io n a d a s . Inc lu so en u n a a lin e a c ió n p re c isa y a de cu a d a , los e sp e rm a to zo id e s o rie n ta d o s en u n a c o lu m n a de flu id o p u e d e n a su m ir c u a lq u ie r n úm e ro de p o s ic io n e s a lo la rgo de l e je m a yo r de la co rr ie n te de n úc leo . C om o se d e sc rib ió a n te r io rm e n te con re sp e c to a las FIG S . 3 -7 , e s to s ig n ifica q u e inc lu so cu a n d o los c o m p o n e n te s de l c itó m e tro de flu jo e s tá n en p e rfe c to a lin e a m ie n to , e x is te u n a d e p e n d e n c ia a n g u la r de la ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a de sa lid a d e te c ta d a . E s ta d e p e n d e n c ia a n g u la r in tro d u ce v a r ia c io n e s s im ila re s a ru ido p o rq u e las c é lu la s se p ue de n c o lo ca r a le a to ria m e n te d e n tro de la co rr ie n te de núc leo .
En a p lica c io n e s de c la s if ica c ió n de e sp e rm a to zo id e s co m e rc ia le s , los té cn ico s re a liza n n o rm a lm e n te u n a serie de a ju s te s g ru e so s se g u id o s de u n a serie de a ju s te s fin o s p a ra c o m p o n e n te s m ú ltip le s en m ú ltip le s e je s con e l fin de a lin e a r e l in s tru m e n to . D eb ido a la se n s ib ilid a d de l in s tru m e n to a c a d a a ju s te , la n a tu ra le za m uy e s tre ch a m e n te re la c io n a d a de las se ñ a le s d e te c ta d a s y e l n úm e ro de p o s ib le s a ju s tes , ta le s a lin e a m ie n to s p ue de n s e r ta re a s q ue re q u ie re n m u ch o tie m p o p a ra los té c n ico s q u e o pe ra n in s tru m e n to s de c la s if ica c ió n de e sp e rm a to zo id e s . A l c a m b ia r e n tre m u es tra s , los a lin e a m ie n to s d e l s is te m a p a ra c la s if ica r e sp e rm a to zo id e s co m e rc ia lm e n te p ue de n ta rd a r unos m in u tos , inc lu so h as ta c inco m in u tos . D espu és de d e s o b s tru ir u n a boq u illa , re e m p la za r o a ju s ta r o tro s c o m p o n e n te s q u e re qu ie ren c a lib ra c ió n , un té c n ico p u e d e ta rd a r 5 m in u tos , 15 m in u tos , y en ca so s ra ros h as ta 30 m in u tos en p o n e r un in s tru m e n to en a lin e a m ie n to a d e cu a d o p a ra la c la s if ica c ió n c o m e rc ia l de e sp e rm a to zo id e s p o r sexo.
La FIG. 14 ilus tra los re su lta d o s de un e je m p lo en e l q u e e l p ro ce so de a lin e a m ie n to se re du ce en g ran m e d id a p ara d is c r im in a r n ú c le o s de e sp e rm a to zo id e s . Los n úc leo s de e sp e rm a to zo id e s te ñ id o s con H o e ch s t 33342 se p ro ce sa ro n a tra vé s de un c la s if ica d o r de e sp e rm a to zo id e s G e n e s is III fa b ric a d o p o r C y to n o m e . El in s tru m e n to e s ta b a e q u ip a d o con un d e te c to r d iv id id o S iP M . La d e te cc ió n de flu o re sc e n c ia d ire c ta se a lin e ó d u ra n te m e no s de un m in u to , d an do lu g a r a un a lin e a m ie n to a p ro x im a d o . Los n ú c le o s de e sp e rm a to zo id e s se p ro ce sa ro n a u n a ta s a de e ve n to s de 33.000 n ú c le o s p o r se g u n d o y se in te rro g a ro n con un lá se r C o h e re n t G e n e s is C W -355 q u e fu n c io n a b a a u n a p o te n c ia p ro m e d io de 150 m W . El tra za d o 810 ilus tra e l h is to g ra m a b iva ria n te q ue m u e s tra la f lu o re sc e n c ia de a va n ce su m a d a fre n te a la p o s ic ió n d e te c ta d a en ca d a e ve n to p o r e l S iP M . El a lin e a m ie n to d e fic ie n te es e v id e n te en c a d a u n a de las p o b la c io n e s de n úc leo s p o rta d o re s d e l c ro m o s o m a X 812 y la p o b la c ió n c o rre g id a de n ú c le o s p o rta d o re s del c ro m o s o m a Y 814. En un a lin e a m ie n to d e fic ie n te , las fo rm a s de cu a rto c re c ie n te son a s im é trica s y los va lo re s de in te ns id ad de f lu o re sc e n c ia caen d rá s tic a m e n te en la d ire cc ió n x p o s itiv a en c o m p a ra c ió n con la d ire cc ió n x n eg a tiva . La p o b la c ió n de n ú c le o s p o rta d o re s d e l c ro m o s o m a Y 814 m u e s tra e l m ism o sesgo.
El fa c to r de c o rre cc ió n 816 se ilus tra co m o u n a línea e n tre las d o s p o b la c io n e s . E s te fa c to r de co rre cc ió n 816 ilus tra e l g ra d o de co rre cc ió n q ue se re a liza rá p a ra s u m a r va lo re s de f lu o re sc e n c ia en c a d a u b ica c ió n x. D ich o de o tro m odo, e l fa c to r de co rre cc ió n 816 re p re se n ta u n a líne a c u rva d a q ue se n o rm a liza rá m e d ia n te co rre cc ió n a u na lín e a p lana. C a d a v a lo r de f lu o re sc e n c ia su m a d o a u n a c o rre sp o n d ie n te p o s ic ió n x a lo la rgo de la líne a rec ibe la m ism a m a gn itu d de a u m e n to o d ism in u c ió n q u e e l fa c to r de c o rre cc ió n 816.
La d is to rs ió n ca u s a d a p o r e l a lin e a m ie n to a p ro x im a d o es m ás p ro n u n c ia d a en el h is to g ra m a de in te n s id a d e s de f lu o re sc e n c ia d e l tra za d o 820 , d o n d e u n a m a yo r su p e rp o s ic ió n d a lu g a r a u n a re lac ió n de p ico a v a lle de l 72 ,3 % e n tre la p ob la c ió n de n úc leo s p o rta d o re s de l c ro m o s o m a X 812 y n ú c le o s p o rta d o re s d e l c ro m o s o m a Y 814.
En e l tra za d o 830 , e l v a lo r su m a d o co rre g id o de f lu o re sc e n c ia d ire c ta se tra za en un h is to g ra m a b iva ria n te fre n te a la p o s ic ió n d e te c ta d a de c a d a e ve n to . S e p ue de o b s e rva r n u e va m e n te q ue , al n o rm a liz a r los va lo re s de in te ns id ad de f lu o re sc e n c ia con un fa c to r de co rre cc ió n 816 en fu n c ió n de la p o s ic ió n de las cé lu la s , e m e rg e n d o s p o b la c io n e s lim p ias de cé lu la s . u n a p o b la c ió n co rre g id a de n úc leo s p o rta d o re s d e l c ro m o s o m a X 832 y n úc leo s p o rta d o re s de l c ro m o s o m a Y 834 se a g ru p a n de m a n e ra m ás c la ra y n ítid a en e l tra za d o 830. Es im p o rta n te q u e la re lac ió n o rto g o n a l de e s ta s p o b la c io n e s se tra d u ce en el h is to g ra m a de in te n s id a d de flu o re sc e n c ia u n iva r ia n te q u e se o b s e rva en el tra za d o 840 , d o n d e d o s p ico s u n iva r ia n te s n ítid os tie n e n u n a re lac ió n de p ico a va lle ca lc u la d a de un 94 ,4 % .
A d e m á s de l uso de la co rre cc ió n , a lg u n a s re a liza c io n e s d ivu lg a d a s en e l p re se n te d o cu m e n to inc lu ye n e le m e n to s q ue re du cen la v a r ia c ió n en la in te ns id ad de la luz re co g id a con re sp e c to a la p o s ic ió n d e l o b je to en u na co rr ie n te de flu jo . A lg u n a s re a liza c io n e s d e sc rita s en e l p re se n te d o c u m e n to p ue de n p ro p o rc io n a r luz de sa lid a m o d ifica d a q u e tie n e m e no s de a lre d e d o r de un 3 % o m e no s de a lre d e d o r de un 2 % o inc lu so m e no s de un 1 % de va r ia c ió n de in te ns id ad m e d id a p a ra u n a d e sv ia c ió n en la p os ic ió n de l o b je to q u e es m e n o r q u e e l 60 % de un rad io de la co rr ie n te de flu jo a le ja d a de un ce n tro de la c o rrie n te de f lu jo a lo la rgo de un e je p e rp e n d icu la r al e je ó p tico . M u ch as a p lica c io n e s son s e n s ib le s a e rro re s de m e d ic ión de in te ns id ad q u e p u e d e n s u rg ir de u n a v a r ie d a d de fu e n te s . D eb ido a la d ificu lta d de re d u c ir flu c tu a c io n e s de in te ns id ad m e d ia n te e l co n tro l p re c iso de la p o s ic ió n de o b je to s d e n tro de la co rr ie n te de flu jo , en su lu g a r es útil re d u c ir la va r ia c ió n en la in te ns id ad de la luz re co g id a con re sp e c to a la p o s ic ió n d e l o b je to m e d ia n te d ise ñ o c u id a d o so de la d is p o s ic ió n de re co le cc ió n ó p tica . P ara a p lica c io n e s co m o c la s if ica c ió n de e sp e rm a to zo id e s X /Y , fre cu e n te m e n te se d a e l ca so de q ue d o s o m ás p o b la c io n e s se d eb en se p a ra r en fu n c ió n de la d ife re n c ia en la in te ns id ad de f lu o re sc e n c ia m e d id a e n tre las p o b la c io n e s . Si las flu c tu a c io n e s de p os ic ió n a le a to ria s co n d u ce n a f lu c tu a c io n e s en la in te ns id ad de la luz re co g id a q u e son m a yo re s en m a gn itu d q u e la d ife re n c ia n om in a l en la in te n s id a d de f lu o re sc e n c ia de las d os p o b la c io n e s , no es p o s ib le d is tin g u ir la s con un a lto re n d im ie n to y u n a a lta p u re za s im u ltá n e a m e n te . N o rm a lm e n te , la d ife re n c ia de in te ns id ad de f lu o re sc e n c ia e n tre c é lu la s e sp e rm á tic a s X e Y es so lo un p e q u e ñ o p o rce n ta je (p o r e je m p lo , ~4 % p a ra e sp e rm a to zo id e s b ov ino s). Los a c tu a le s s is te m a s c la s if ica d o re s de e sp e rm a to zo id e s p ue de n o b te n e r en te o ría un a lto re n d im ie n to m e d ia n te a u m e n to de la ta s a de flu jo de la co rr ie n te de n úc leo , p e ro e s to tie n e el e fe c to de a u m e n ta r la a n ch u ra de la co rr ie n te de n úc leo . En co n se cu e n c ia , h a b ría u n a g ra n in ce rtid u m b re de la p o s ic ió n de e sp e rm a to zo id e s d e n tro de l n úc leo de la co rr ie n te de flu jo . E s ta in ce rtid u m b re de p os ic ió n y las flu c tu a c io n e s re su lta n te s en la in te ns id ad de f lu o re sc e n c ia re co g id a lim itan el re n d im ie n to m á x im o de los a c tu a le s s is te m a s c la s if ica d o re s de e sp e rm a to zo id e s a n ive les q ue no o scu re ce n la p e q u e ñ a d ife re n c ia de in te ns id ad e n tre e sp e rm a to zo id e s X e Y.
Un e n fo q u e p a ra la co rre cc ió n de la p os ic ió n de in te ns id ad se p u e d e e n te n d e r con re fe re n c ia a las F IG S . 6 y 7. Los c o rch e te s de la FIG. 6 re sa ltan las re g io n e s de in te g ra c ió n q ue co rre sp o n d e n a ó p tica s de re co le cc ió n de flu o re sc e n c ia con u n a N A d ad a . Los g rá fico s de v a r ia c ió n de in te n s id a d re co g id a con re spe cto a la p os ic ió n de l o b je to p a ra las N A de la FIG. 6 se p ro p o rc io n a n en la FIG. 7. En la FIG . 7, p a ra u n a N A d ad a , la in te g ra c ió n sob re la reg ión de re co le cc ió n de f lu o re sc e n c ia se re a liza de ta l m a n e ra q ue la in te n s id a d de la luz re co g id a se p ue de tra z a r co m o fu n c ió n de la p o s ic ió n de c a d a e sp e rm a to zo id e . En la FIG. 7 es e v id e n te q u e e l a u m e n to de la N A de la ó p tica de re co le cc ió n a yu da a d is m in u ir la in flu e n c ia de la p o s ic ió n de l o b je to en la in te ns id ad de f lu o re sc e n c ia re co p ila d a a tra vé s de la ó p tica de re co le cc ió n .
En a lg u n a s re a liza c io n e s , la ó p tica de re co le cc ió n (p o r e je m p lo la d isp o s ic ió n de re co le cc ió n ó p tica 190 en las FIG S .
1 y 2) se p ue de m o d ific a r con e le m e n to s q ue re du cen la v a r ia c ió n de in te ns id ad de la luz re co g id a con re sp e c to a la p o s ic ió n d e l o b je to com o se d e sc rib e a n te r io rm e n te . T a le s re a liza c io n e s se d e sc rib e n con m á s d e ta lle en la S o lic itud de P a ten te de E s ta d os U n id os N° 16 /133 ,531.
S eg ú n a lg u n a s re a liza c io n e s de e s te tip o , la ó p tica de re co le cc ió n fu n c io n a e n m a sc a ra n d o c ie rto s rayos en "e spa c io a n g u la r", es d e c ir, la ó p tica de re co le cc ió n re cog e s e le c tiva m e n te , a te n ú a y /o b lo q u e a ra yos de d ife re n te s á n g u lo s<y>con el fin de o b te n e r un perfil de in te n s id a d fre n te a p o s ic ió n d e se a d o . En la p rác tica , se p u e d e a p lic a r u n a fu n c ió n de e n m a sc a ra m ie n to de "e sp a c io a n g u la r" en u na p u p ila (p o r e je m p lo p u p ila de e n tra d a , p u p ila de sa lid a o p a ra d a de a p e rtu ra ) de un s is te m a ó p tico , d o n d e la p os ic ió n de u na in te rse cc ió n de ra yos con el p lano de la p u p ila c o rre sp o n d e al á n g u lo y. En a lg u n a s re a liza c io n e s , la d isp o s ic ió n ó p tica de re co le cc ió n o b tie n e un p erfil de in te n s id a d fre n te a p o s ic ió n d e se a d o , p o r e je m p lo m ás p lano , m e d ia n te re co le cc ió n p re fe re n te de rayos de luz de á n g u lo m ás e le va d o (a p u n ta n d o en d ire cc ió n o p u e s ta al e je ó p tico ) con e xc lu s ió n de c ie rto s rayos de luz de á n g u lo m enor.
Las FIG S . 15 y 16 ilus tra n có m o la e xc lu s ió n de ra yos re fra c ta d o s de á ng u lo ba jo , a u n a N A d ad a , h ace q ue la cu rva de in te n s id a d fre n te a p o s ic ió n se a p la ne . La e xc lu s ió n de rayos de á n g u lo b a jo e xc lu ye los rayos q u e p ro d u ce n la m a yo r va r ia c ió n en el p e rfil de in te ns id ad fre n te a p o s ic ió n , m ie n tra s q u e la va r ia c ió n a n g u la r de la ra d ia c ión en á ng u lo s p o s itivo s a lto s tie n d e a c a n c e la r la co rre sp o n d ie n te v a r ia c ió n en á n g u lo s n e g a tivo s a ltos . La FIG . 15 m u e s tra tra za d o s de la ra d ia n c ia re la tiva fre n te al á ng u lo de rayo, y, p a ra d ife re n te s p o s ic io n e s d e l o b je to a lo la rgo de l e je x, d o n d e el á n g u lo y e s tá en ra d ia ne s . En la FIG. 15, c a d a g rá fico c o rre sp o n d e a u na p o s ic ió n de o b je to , x, d e n tro d e l n úc leo de u n a co rr ie n te de flu jo , co m o se in d ica en la FIG. 5. Los co rch e te s en la FIG . 15 m u es tra n la p o rc ió n de los ra yos de luz q u e se e xc lu irá n p o r la ó p tica de re co le cc ió n p a ra ca d a p o s ic ió n x, cu a n d o se e xc lu ye n rayos q u e tie n e n m a gn itu d a n g u la r m e n o r q u e 0 ,3 rad (co rche te in fe rio r en la F IG . 15) y cu a n d o se e xc lu ye n ra yos q ue tie n e n m a g n itu d a n g u la r m e n o r q u e 0 ,4 rad (co rche te s u p e r io r en la FIG. 15).
La F IG . 16 m u e s tra la in te ns id ad re la tiva de la luz re co g id a fre n te a la p o s ic ió n d e l o b je to a lo la rgo d e l e je x cu a n d o no se e xc lu ye n á n g u lo s (g rá fico 900), cu a n d o se e xc lu ye n ra yos con á n g u lo s e n tre -0 ,3 rad y 0 ,3 (g rá fico 903 ) y cu a n d o se e xc lu ye n rayos con á n g u lo s e n tre -0 ,4 rad y 0 ,4 rad (g rá fico 904 ). El g rá fico 16 m u e s tra q u e cu a n d o se e xc lu ye n rayos con á n g u lo m e no r, e l g rá fico de in te n s id a d re la tiva fre n te a p o s ic ió n e xh ib e m e no s v a r ia c ió n de in te n s id a d con re sp e c to a la p os ic ió n .
La FIG . 17 ilus tra los re su lta d o s de un e xp e rim e n to q u e in co rp o ra ta n to u na co rre cc ió n p o s ic io n a l en fu n c ió n de so ftw a re co m o un e le m e n to en fu n c ió n de h a rd w a re en la tra ye c to ria de la luz de re co le cc ió n q ue re du ce la v a ria c ió n de la in te n s id a d de luz re co g id a con re sp e c to a la p o s ic ió n d e l o b je to co m o se ha d e sc rito . Los n úc leo s de e sp e rm a to zo id e s te ñ id o s con H o e ch s t 33342 se p ro ce sa ro n a tra vé s de un c la s if ica d o r de e sp e rm a to zo id e s G e n e s is III fa b ric a d o p o r C yto no m e. El c la s if ica d o r de e sp e rm a to zo id e s e s ta b a e q u ip a d o con un d e te c to r d iv id id o S iP M q ue te n ía un ca b le co lo ca d o en la tra ye c to r ia de re co le cc ió n de luz con el fin de e x c lu ir ra d ia c ió n e le c tro m a g n é tic a de á n g u lo b a jo de re co le cc ió n p ro d u c id a a p a rtir de los n úc leo s de e sp e rm a to zo id e s . En la S o lic itu d de P a te n te de EE.
UU. N° 16/133,531 se d e sc rib e n c a b le s a d e cu a d o s y o tro s e le m e n to s p a ra b lo q u e a r ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a de á n g u lo b a jo de re co le cc ió n .
Las p re s io n e s de la m u e s tra y la e n v o ltu ra se a ju s ta ro n p a ra a lc a n z a r u n a ta s a de e ve n to s de 60.000 e ve n to s p o r se g u n d o y los n ú c le o s se a n a liza ro n con un lá se r C o h e re n t G e n e s is C W -355 q ue fu n c io n a b a a u na p o te n c ia p ro m e d io de 90 m W . En e l tra za d o 1010 se p ue de o b s e rv a r q u e e l ca b le m itiga a lgún e fe c to de la d e p e n d e n c ia de la in te ns id ad en la p o s ic ió n de los n ú c le o s d e n tro de la c o lu m n a de flu id o . S in e m b a rg o , to d a v ía h ay u na d ism in u c ió n s ig n ifica tiva en la in te ns id ad re la tiva a m e d id a q ue los n úc leo s se m u even a d ic io n a lm e n te en la d ire cc ió n p o s itiva a lo la rgo d e l e je x. Se o b s e rva q u e u na p o b la c ió n de n ú c le o s p o rta d o re s d e l c ro m o s o m a X 1012 y u n a p o b la c ió n de n ú c le o s p o rta d o re s d e l c ro m o s o m a Y 1014 se h unden s ig n ific a tiv a m e n te en la d ire cc ió n p o s itiv a en e l e je x. La co rre sp o n d ie n te re lac ió n de p ico a v a lle c a lc u la d a a p a rtir d e l h is to g ra m a de in te ns id ad de f lu o re sc e n c ia d e l tra za d o 1020 es de l 81 ,5 %. N u e va m e n te , los n ú c le o s p o rta d o re s de l c ro m o s o m a X q ue e s tá n u b ica d o s h ac ia un e x tre m o de la c o lu m n a de flu id o no se d e te c ta n su fic ie n te m e n te . C om o re su ltad o , la in te ns id ad de f lu o re sc e n c ia s u m a d a de los n ú c le o s en e ste e x tre m o tie n e va lo re s de in te ns id ad s im ila re s a los n úc leo s p o rta d o re s de c ro m o s o m a s Y ce n tra d o s d e n tro de la p o b la c ió n de n ú c le o s p o rta d o re s de l c ro m o s o m a Y 1014. Este se sg o es e v id e n te en e l h is to g ra m a u n iva r ia n te del tra za d o 1020 en fo rm a de un h o m b ro q ue se d e s p la z a h ac ia a ba jo y un p ico e xa g e ra d o de la p o b la c ió n de n úc leo s p o rta d o re s d e l c ro m o s o m a Y 1014.
Un fa c to r de co rre cc ió n 1016 se ilus tra en e l tra za d o 1010. P ara ca d a p o s ic ió n , se a ñ a d e un v a lo r de co rre cc ió n a la in te n s id a d de flu o re sc e n c ia d e te c ta d a co rre sp o n d ie n te al fa c to r de co rre cc ió n . El tra za d o 1030 ilus tra un h is to g ra m a b iva ria n te q u e tie n e u n a p o b la c ió n c o rre g id a de n úc leo s p o rta d o re s de l c ro m o s o m a X 1032 y u na p o b la c ió n co rre g id a de n úc leo s p o rta d o re s d e l c ro m o s o m a Y 1034, q u e son p o b la c io n e s re c ta n g u la re s m ás n ítid as . El tra za d o 1040 p ro p o rc io n a e l co rre sp o n d ie n te h is to g ra m a u n iva r ia n te de va lo re s de in te ns id ad su m a d o s co rre g id o s in d e p e n d ie n te m e n te de la u b ica c ió n de c a d a e ve n to . La p o b la c ió n c o rre g id a de n úc leo s p o rta d o re s d e l c ro m o so m a 1032 y la p o b la c ió n co rre g id a de n úc leo s p o rta d o re s de l c ro m o s o m a U 1034 son m ás n ítid as al te n e r a ltu ra s de p icos a p ro x im a d a m e n te igu a les y u na re lac ió n de p ico a v a lle d e l 92 ,6 %.
La a n te r io r d e sc rip c ió n de va r ia s re a liza c io n e s ha e s ta d o p re se n te con fin e s de ilus tra c ión y d e sc rip c ió n .
Las re a liza c io n e s d ivu lg a d a s no p re te n d e n s e r e xh a u s tiva s o lim ita r las p o s ib le s im p le m e n ta c io n e s de las re a liza c io n e s d ivu lg a d a s . A la luz de la a n te r io r e n se ñ a n z a son p o s ib le s m u ch a s m o d ifica c io n e s y v a ria c io n e s .

Claims (11)

R EIV IN D IC A C IO N ES
1. Un s is te m a de d is c rim in a c ió n , q ue co m p re n d e :
u na c o lu m n a de flu id o (150 ) q u e fo rm a e s tru c tu ra q u e c re a u n a c o lu m n a de flu id o q u e co n tie n e cé lu la s e sp e rm á tic a s d e n tro de u na
se cc ió n tra n s v e rsa l g e n e ra lm e n te e líp tica de co rr ie n te de n úc leo (151 ) c o n te n id a d e n tro de u n a secc ión tra n s v e rsa l g e n e ra lm e n te c irc u la r de flu id o de e n vo ltu ra , en d o n d e las c é lu la s e sp e rm á tic a s e s tá n en p o s ic io n e s d ife re n te s d e n tro de la c o lu m n a de f lu id o ;
u na fu e n te de e xc ita c ió n (180 ) q u e g e n e ra ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a de e xc ita c ió n d ir ig id a h ac ia cé lu la s e sp e rm á tic a s en la c o lu m n a de flu id o (150 ) en u n a reg ión de m e d ic ió n , d o n d e las c é lu la s e sp e rm á tic a s d en tro de la c o lu m n a de flu id o e m a n a n ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a de sa lid a en re sp u e s ta a la ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a de e xc ita c ió n ;
u na d isp o s ic ió n ó p tica (190 ) q u e re cog e ra d ia c ió n e le c tro m a g n é tic a de sa lid a de las c é lu la s e sp e rm á tica s ; un d e te c to r d iv id id o S iP M (185 ) q u e i) g e n e ra u n a señ a l e lé c tr ica q u e re sp o n d e a la in te ns id ad de la ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a de sa lid a re co g id a p o r la d isp o s ic ió n ó p tica y ii) d e te c ta la p o s ic ió n de c é lu la s e sp e rm á tic a s en la c o lu m n a de flu id o ; y
un a n a liza d o r (187 ) q u e tie n e in s tru cc io n e s a lm a ce n a d a s en e l m ism o i) p a ra n o rm a liza r la in te ns id ad de la ra d ia c ió n e le c tro m a g n é tic a de sa lid a re p re se n ta d a en la señ a l e lé c tr ica en fu n c ió n de la p o s ic ió n de las c é lu la s e sp e rm á tic a s en la c o lu m n a de flu id o , y ii) p a ra d is c r im in a r un p rim e r tip o de e sp e rm a to zo id e s de o tra s c é lu la s e sp e rm á tica s .
2. El s is te m a de d is c rim in a c ió n de la re iv in d ica c ió n 1, en d o n d e e l p rim e r d e te c to r (176 ) no e s tá u b ica d o en un p lano de im agen de la d is p o s ic ió n ó p tica (190).
3. El s is te m a de d is c rim in a c ió n de la re iv in d ica c ió n 1, en d o n d e la c o lu m n a de flu id o (150 ) co m p re n d e cé lu las e sp e rm á tic a s en u n a se cc ió n tra n s v e rsa l g e n e ra lm e n te e líp tica de la co rr ie n te de n úc leo (151 ) c o n te n id a d e n tro de u n a secc ión tra n s v e rsa l g e n e ra lm e n te c irc u la r de flu id o de e n vo ltu ra , y en d o n d e los e sp e rm a to zo id e s en la c o lu m n a de flu id o e s tá n u b ica d o s en p o s ic io n e s d ife re n te s en un e je m a yo r de la se cc ió n tra n sve rsa l g e n e ra lm e n te e líp tica de la co rr ie n te de núc leo .
4. El s is te m a de d is c rim in a c ió n de la re iv in d ica c ió n 3, en d o n d e las in s tru cc io n e s a lm a ce n a d a s en e l a n a liza d o r (187) p a ra n o rm a liz a r la in te ns id ad de la ra d ia c ió n e le c tro m a g n é tic a de sa lid a re p re se n ta d a en la señ a l e lé c tr ic a en fu n c ió n de la p o s ic ió n de las c é lu la s e sp e rm á tic a s en la co lu m n a de flu id o a p lican u n a co rre cc ió n de la in te ns id ad de la ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a de sa lid a re p re se n ta d a en la señ a l e lé c trica .
5. El s is te m a de d is c rim in a c ió n de la re iv in d ica c ió n 4, en d o n d e se d e te rm in a un fa c to r de co rre cc ió n p a ra cad a p o s ic ió n en el e je m a yo r de la co rr ie n te de n úc leo , y en d o n d e el fa c to r de co rre cc ió n se a p lica a ca d a e ve n to en fu n c ió n de la p o s ic ió n de l e je m a yo r de la co rr ie n te de núc leo .
6. El s is te m a de d is c rim in a c ió n de la re iv in d ica c ió n 1, en d o n d e los e sp e rm a to zo id e s co m p re n d e n cé lu la s e sp e rm á tic a s u b ica d a s d e n tro de u na c o lu m n a e líp tica de flu id o de m u es tra , d o n d e e l flu id o de m u e s tra e s tá fo rm a d o co a x ia lm e n te con u na ca p a e x te rn a de flu id o de e n v o ltu ra y el flu id o de e n v o ltu ra co m p re n d e u n a fo rm a g e n e ra lm e n te c ilín d rica .
7. Un m é to do de d is c rim in a c ió n de o b je to s con el s is te m a de d is c rim in a c ió n de la re iv in d ica c ió n 1, q ue co m p re n d e :
c re a r u n a c o lu m n a de flu id o (150 ) q u e c o n tie n e c é lu la s e sp e rm á tic a s en p o s ic io n e s d ife re n te s d e n tro de la co lu m n a de flu id o ;
g e n e ra r ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a de e xc ita c ió n ;
d ir ig ir la ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a de e xc ita c ió n h ac ia c é lu la s e sp e rm á tic a s en la c o lu m n a de flu id o en una re g ión de m e d ic ión , d o n d e las c é lu la s e sp e rm á tic a s d e n tro de la c o lu m n a de flu id o e m a n a n ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a de sa lid a en re sp u e s ta a la ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a de e xc ita c ió n ;
re c o g e r ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a de s a lid a de las c é lu la s e sp e rm á tica s ;
g e n e ra r u n a señ a l e lé c tr ica q u e re sp o n d e a la in te n s id a d de la ra d ia c ió n e le c tro m a g n é tic a de sa lid a re cog ida ; d e te c ta r la p os ic ió n de las c é lu la s e sp e rm á tic a s en la c o lu m n a de flu id o ;
n o rm a liz a r la in te ns id ad de la ra d ia c ió n e le c tro m a g n é tic a de sa lid a re p re se n ta d a en la señ a l e lé c tr ica en fu n c ió n de la p o s ic ió n de los e sp e rm a to zo id e s en la c o lu m n a de flu id o ,
d is c r im in a r un p rim e r tip o de c é lu la s e sp e rm á tic a s de o tra s c é lu la s e sp e rm á tica s .
8. El m é to do de la re iv in d ica c ió n 7, en d o n d e la co lu m n a de flu id o co m p re n d e e sp e rm a to zo id e s en u na secc ión tra n s v e rsa l g e n e ra lm e n te e líp tica de la co rr ie n te de n úc leo (151 ) c o n te n id a d e n tro de u na secc ión tra n sve rsa l g e n e ra lm e n te c irc u la r de flu id o de e n vo ltu ra , y en d o n d e las c é lu la s e sp e rm á tic a s en la c o lu m n a de flu id o e s tán u b ica d a s en p o s ic io n e s d ife re n te s en un e je m a yo r de la secc ión tra n s v e rsa l g e n e ra lm e n te e líp tica de la co rr ie n te de núc leo .
9. El m é to d o de la re iv in d ica c ió n 7 q ue co m p re n d e a d e m á s a p lic a r u na co rre cc ió n de la in te ns id ad de la ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a de sa lid a re p re se n ta d a en la señ a l e lé c trica .
10. El m é to do de la re iv in d ica c ió n 8, q u e co m p re n d e a d e m á s d e te rm in a r un fa c to r de co rre cc ió n p a ra ca d a p os ic ió n en e l e je m a yo r de la c o rrie n te de n úc leo y a p lic a r e l fa c to r de c o rre cc ió n a c a d a e ve n to en fu n c ió n de la p o s ic ió n de l e je m a yo r de la c o rrie n te de núc leo .
11. El m é to d o de la re iv in d ica c ió n 7, q ue co m p re n d e a d e m á s un e le m e n to q ue m o d ifica la ra d ia c ión e le c tro m a g n é tic a de sa lid a p a ra a u m e n ta r la u n ifo rm id a d de la ra d ia c ió n e le c tro m a g n é tic a de sa lid a re co g id a de c é lu la s e sp e rm á tica s en p o s ic io n e s d ife re n te s .
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