ES3038661T3 - Deoxy- cytidine derivatives for use in cancer therapies - Google Patents

Deoxy- cytidine derivatives for use in cancer therapies

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ES3038661T3
ES3038661T3 ES23174101T ES23174101T ES3038661T3 ES 3038661 T3 ES3038661 T3 ES 3038661T3 ES 23174101 T ES23174101 T ES 23174101T ES 23174101 T ES23174101 T ES 23174101T ES 3038661 T3 ES3038661 T3 ES 3038661T3
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deoxycytidine
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Abstract

La presente invención se refiere a un compuesto de Fórmula (I): o a un estereoisómero, solvato, tautómero o sal farmacéuticamente aceptable del mismo, donde X, W<Sub>1</Sub> , W<Sub>2</Sub> , Y, Z, R<Sub>1</Sub> , R<Sub>2</Sub> y R<Sub>3</Sub> son como se definen en la presente divulgación, para su uso en terapia, en particular para el tratamiento del cáncer. La presente invención también se refiere a métodos para el tratamiento del cáncer que comprenden la administración de un compuesto de Fórmula (I) a un sujeto que lo necesite, y a composiciones farmacéuticas y kits que comprenden dichos compuestos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Derivados de desoxicitidina para el uso en terapias contra el cáncer
La presente invención se refiere a compuestos para el uso en el tratamiento o la prevención de un cáncer en el que CDA no está sobreexpresado.el usoel uso
El cáncer es una enfermedad caracterizada por la pérdida de un control apropiado del crecimiento y proliferación celulares. La Sociedad Americana contra el Cáncer ha estimado que en 2010 aparecieron más de 1,5 millones de casos nuevos de cáncer en los Estados Unidos y que se produjeron aproximadamente 570.000 muertes ese año que estima eran atribuibles a cáncer. La Organización Mundial de la Salud ha estimado que el cáncer era la causa principal de muerte globalmente en 2010 y que el número de muertes causadas por cáncer crecerá hasta 12 millones al año para 2030.
Aunque se dispone de numerosos tratamientos, la resistencia a los fármacos anticáncer conocidos puede ser un problema para el tratamiento con éxito del cáncer en los/las pacientes. Sigue existiendo una necesidad de terapias adicionales para el cáncer.
En algunos contextos, los agentes anticáncer capaces de eliminar un amplio abanico de tipos de células de cáncer resultan deseables. El fluorouracilo (5-FU) es uno de estos agentes anticáncer, y se administra habitualmente para el tratamiento de una amplia diversidad de cánceres.
Sin embargo, muchos agentes anticáncer que son capaces de eliminar un amplio abanico de tipos de célula de cáncer también eliminan células no cancerosas, por ejemplo células sanas normales que estén en división. Lo anterior resulta problemático en algunos contextos, por lo que también existe una necesidad de agentes anticáncer ampliamente citotóxicos que no sean citotóxicos para las células no cancerosas. Además, existe una necesidad de agentes anticáncer con citotoxicidad más específica, es decir, que eliminan un abanico más pequeño de tipos de célula de cáncer. Dichos agentes anticáncer más específicos es menos probable que presenten efectos fuera de diana no deseables.
El glioblastoma multiforme es el cáncer más común y agresivo del sistema nervioso central. El glioblastoma multiforme es el segundo cáncer más común en niños/as. Los adultos con diagnóstico de glioblastoma multiforme presentan una de las necesidades no satisfechas más altas de la oncología. Con los tratamientos actualmente disponibles, la supervivencia media desde el diagnóstico es de 14,6 meses. Menos de 5 % de los pacientes con diagnóstico de glioblastoma multiforme sobreviven más de 5 años. La supervivencia a largo plazo después del diagnóstico de glioblastoma multiforme es rara y es más habitual en niños/as.
Las terapias actuales en gran medida son paliativas y están diseñadas para mejorar la calidad de vida. Después del diagnóstico, el tratamiento actual del glioblastoma multiforme sigue un curso similar: resección quirúrgica de la zona cerebral afectada, en donde sea esperable la supervivencia de la cirugía del/de la paciente, seguido de radiación y quimioterapias. El glioblastoma multiforme forma estructuras en forma de tentáculos en el cerebro enfermo; por lo tanto, incluso en los casos indicados, la resección quirúrgica completa es compleja y con frecuencia imposible. Aparte de la intervención quirúrgica y la terapia de radiación, existen tres fármacos aprobados para el tratamiento del glioblastoma multiforme:
1) Avastina (RTM) (bevacizumab) - un inhibidor de la angiogénesis con múltiples indicaciones oncológicas. Se cree que la avastina (RTM) inhibe el crecimiento tumoral mediante la inhibición del desarrollo de nuevos vasos sanguíneos dentro de los tumores, estrangulando efectivamente la nutrición del tumor. La avastina (RTM) está aprobada en EE. UU. y en Japón; sin embargo, la avastina (RTM) no está aprobada para el tratamiento del GBM en la UE. En efecto, los ensayos de fase II han indicado que la avastina (RTM) no rinde un beneficio global de supervivencia (NCI 06-C-0064E). Aunque la avastina (RTM) mejora ligeramente la supervivencia sin progresión en algunos ensayos, el beneficio para el/la paciente con frecuencia es nominal y el tratamiento de avastina (RTM) no proporciona ninguna ventaja para los/las pacientes de glioblastoma multiforme.2
2) Temozolomida (Temodal (RTM)/Temodar (RTM)) (4-metil-5-oxo-2,3,4,6,8-pentazabiciclo[4.3.0]nona-2,7,9-trieno-9-carboxamida) - un agente alquilante mutagénico del ADN; también se encuentran disponibles formulaciones genéricas. Se cree que la temozolomida inhibe el crecimiento del glioblastoma multiforme mediante la mutación intensa del a Dn tumoral, lo que induce la muerte celular. Debido a su mecanismo de acción, las células que expresan la proteína MGMT de reparación del ADN son resistentes prácticamente de manera universal al tratamiento de temozolomida. El tratamiento de temozolomida mejora la supervivencia global en 2,5 meses. Simultáneamente, el tratamiento de temozolomida con frecuencia provoca efectos secundarios significativos. La temozolomida es el tratamiento primario para el glioblastoma multiforme.
3) Gliadel (RTM) (oblea de carmustina)(1,3-bis(2-cloroetil)-1-nitrosourea) - una mostaza nitrogenada citotóxica. Se administra en forma de un disco biodegradable implantado directamente en el cerebro después de la resección quirúrgica. Un ensayo aleatorizado ha demostrado que Gliadel (RTM) mejora la mediana de supervivencia en 2,1 meses. Los pacientes tratados con Gliadel (RTM) informan de menos y menos graves efectos secundarios que los pacientes tratados con temozolomida; sin embargo, en comparación con la temozolomida, la supervivencia global es reducida.
El documento US2011/230433 describe la actividad antitumoral de la 5-hidroxi-2'desoxicitidina contra dos líneas celulares de carcinoma colorrectal.
Zauri et al., 2015 Nature 524 (7563): 114-118 Describe que la 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina y la 5-formil-2'-desoxicitidina tienen actividad citotóxica selectiva contra células tumorales que sobreexpresan CDA.
Sigue existiendo una necesidad de agentes anticáncer adicionales para el tratamiento del glioblastoma multiforme y otros cánceres. En particular, sigue existiendo una necesidad de agentes anticáncer que traten eficazmente cánceres que son resistentes al tratamiento con temozolomida.
La proteína humana citidina desaminasa (CDA) cataliza la desaminación hidrolítica de la citidina y la desoxicitidina en uridina y desoxiuridina, respectivamente. Algunos agentes anticáncer conocidos son análogos de nucleósido/nucleótido, por ejemplo la gemcitabina (2,2-difluorodesoxicitidina) y la citarabina (Ara-C, citosina arabinósido). La CDA problemáticamente inactiva dichos agentes anticáncer, incluyendo la gemcitabina y la citarabina. Sigue existiendo una necesidad de agentes anticáncer adicionales que no resulten inactivados por la CDA.
Las referencias a métodos de tratamiento o prevención en la presente descripción deben interpretarse como referencias a compuestos, composiciones farmacéuticas y kits de la presente invención para el uso en un método de tratamiento o prevención del cuerpo humano o animal mediante terapia.
La presente invención proporciona compuestos para el uso kits para el uso y composiciones farmacéuticas. para el uso como se define en las reivindicaciones adjuntas.
En un primer aspecto, la invención proporciona un compuesto de fórmula (IIa):
o un estereoisómero, solvato, tautómero o sal farmacéuticamente aceptable del mismo para el uso en el tratamiento o la prevención de un cáncer ; en el que:
X es -(CH2)n-X', en el que "n" es entre 0 y 6 y X' es -CHO,
R1 es -OH o -O(P(=O)(OH)O)nH, en el que "n" es entre 1 y 3, y
R2 es -OH.
El cáncer se define en términos generales en la presente memoria para incluir cualquier afección neoplásica, e incluye condiciones particularmente malignas o premalignas. El cáncer puede causar o dar como resultado o manifestarse en tumores sólidos, pero no se limita a estos, e incluye también cánceres del sistema hematopoyético. En toda la presente memoria los términos "cáncer" y "células cancerosas" se utilizan intercambiablemente. En toda la presente memoria los términos "tumor" y "células tumorales" se utilizan intercambiablemente. Los tumores benignos y los tumores malignos también se encuentran incluidos en el término cáncer tal como se utiliza en la presente memoria, es decir, los términos cáncer y tumor se utilizan intercambiablemente. El tratamiento de los tumores malignos resulta preferente.
De esta manera, desde una perspectiva alternativa, la presente invención proporciona un compuesto de fórmula (IIa) para el uso en el tratamiento o la prevención de un tumor en el que CDA no está sobreexpresado..
Desde una perspectiva alternativa, la presente invención proporciona un compuesto de fórmula (IIa) para el uso como agente contra un cáncer en el que CDA no está sobreexpresado .
Desde una perspectiva alternativa, la presente invención proporciona un compuesto de fórmula (IIa) para el uso como agente antitumoral contra cáncer en el que CDA no está sobreexpresado.
Desde una perspectiva alternativa, dicho aspecto de la presente invención proporciona el uso de un compuesto de fórmula (IIa) en la preparación de un producto terapéutico anticáncer (es decir, una preparación o medicamento, por ejemplo, una composición farmacéutica, formulación, producto combinado, producto coformulado o kit), o en otras palabras, para la preparación de un medicamento destinado a el uso como agente anticáncer o en el tratamiento o la prevención de un cáncer en el que CDA no está sobreexpresado.
Desde una perspectiva alternativa, dicho aspecto de la presente invención proporciona el uso de un compuesto de fórmula (IIa) en la preparación de un producto terapéutico antitumoral (es decir, una preparación o medicamento, por ejemplo, una composición farmacéutica, formulación, producto combinado, producto coformulado o kit), o en otras palabras, para la preparación de un medicamento destinado a el uso como agente antitumoral o en el tratamiento o la prevención de un tumor en el que CDA no está sobreexpresado.
En algunas realizaciones preferentes de la presente invención, el compuesto de fórmula (IIa) se utiliza como el único agente activo (único agente activo en el régimen de tratamiento). De esta manera, en algunas realizaciones preferentes, el tratamiento es una monoterapia. La monoterapia se refiere a el uso de un único fármaco para tratar una enfermedad o afección . De esta manera, en algunas realizaciones preferentes, el compuesto de fórmula (IIa) se utiliza solo. La expresión "único agente activo" (o único ingrediente activo) se refiere al único agente o ingrediente terapéuticamente activo (o biológicamente activo). De esta manera, componentes tales como conservantes, excipientes o agentes que no son relevantes a la enfermedad bajo tratamiento no se considera que son agentes activos.
En el tratamiento o la prevención del cáncer (es decir, un tumor), el compuesto de fórmula (IIa) puede utilizarse solo u opcionalmente en combinación con uno o más, es decir, otro u otros, agentes anticáncer (es decir, un segundo o más agentes anticáncer adicionales).
El compuesto de fórmula (IIa), solo o en combinación con un agente anticáncer adicional, puede utilizarse según la presente invención en cualquier método de tratamiento o prevención del cáncer (es decir, de un tumor) en un sujeto.
Tal como se demuestra en los Ejemplos, el uso de un compuesto de fórmula (IIa) en combinación con uno o más agentes anticáncer adicionales resulta en efectos citotóxicos sinérgicos.
De acuerdo con lo anterior, en un aspecto adicional, la presente invención proporciona un compuesto de fórmula (IIa) junto con un agente anticáncer adicional para el uso en el tratamiento o prevención del cáncer (es decir, de un tumor) en el que CDA no está sobreexpresado, o en otras palabras, un compuesto de fórmula (IIa) para el uso junto con un agente anticáncer adicional para el tratamiento o la prevención del cáncer (es decir, un tumor) en el que CDA no está sobreexpresado.
Desde una perspectiva alternativa, dicho aspecto de la presente invención proporciona el uso de un compuesto de fórmula (IIa) en la preparación de un producto terapéutico anticáncer (es decir, una preparación o medicamento, por ejemplo, una composición farmacéutica, formulación, producto combinado o kit), o en otras palabras, para la preparación de un medicamento destinado a el uso como agente anticáncer (es decir, agente antitumoral) o en el tratamiento o la prevención de un cáncer (es decir, de un tumor) en el que CDA no está sobreexpresado, en el que dicho tratamiento comprende, además, la administración de un agente anticáncer adicional.
El compuesto de fórmula (Ila) y el agente o agentes anticáncer adicionales pueden coformularse en una única composición. Sin embargo, lo anterior no resulta necesario. El medicamento puede ser una preparación combinada, composición o kit, etc., y no resulta necesario en cualquiera de los aspectos de la invención para el compuesto de fórmula (IIa) y el agente o agentes anticáncer adicionales que deben coformularse en una única composición: pueden formularse por separado o pueden administrarse por separado, incluyendo secuencial o simultáneamente.
De acuerdo con lo anterior, la invención proporciona, además, un kit que comprende un compuesto de fórmula (IIa) y uno o más agentes anticáncer adicionales (es decir, un segundo o más adicionales) para el uso en el tratamiento o la prevención de un cáncer (es decir, de un tumor) en el que CDA no está sobreexpresado. Más particularmente, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (IIa) y uno o más agentes anticáncer adicionales (es decir, un segundo o más adicionales) en forma de una preparación combinada para el uso separado, secuencial o simultáneo en el tratamiento o la prevención del cáncer. (es decir, de un tumor) en el que CDA no está sobreexpresado.
Adicionalmente, la presente invención proporciona un producto farmacéutico que comprende un producto de fórmula (IIa) coformulado con uno o más agentes anticáncer adicionales (es decir, un segundo o más adicionales) para el uso en el tratamiento o la prevención de un cáncer en el que CDA no está sobreexpresado. La presente invención proporciona una composición farmacéutica para el uso en el tratamiento o la prevención de un cáncer del SNC, que comprende un compuesto de fórmula (IIa) y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, que opcionalmente comprende, además, un agente anticáncer adicional. En relación a todos los aspectos de la invención, el compuesto de la invención es el compuesto de fórmula (IIa) tal como se indica en otros sitios de la presente memoria, y las realizaciones preferentes y opcionales referidas al compuesto indicado en relación con un aspecto de la invención se aplican,mutatis mutandis,a todos y cada uno de los demás aspectos de la invención.
En todos los aspectos y realizaciones de la invención, resulta preferente el tratamiento de tumores malignos .
X
X es -(CH2)n n-X', en la que n es de 0 a 6 y X' es -CHO.
Preferiblemente X es -(CH2)n n-X', en la que n es de 0 a 4 y X' es -CHO.
Preferiblemente X es -(CH2)n n-X', en la que n es de 0 a 2 y X' es -CHO.
Preferiblemente X es -(CH2)n n-X', en la que n es 0 ó 1 y X' es -CHO.
Más preferiblemente, X es -CHO.
Ri
R1 es -OH o -O(P(=O)(OH)O)n nH, en la que n es de 1 a 3, preferiblemente 3. Lo más preferiblemente R1 es -OH.
R2
R2 es -OH.
Realizaciones preferentes
En la fórmula (IIa), preferiblemente, X es -CHO o -CH2OH; lo más preferiblemente, CH2OH.
En la fórmula (IIa), R1 es -OH o -O(P(=O)(OH)O)nH, en el que "n" es un valor entre 1 y 3, preferiblemente 3, y R2 es -OH.
Más preferiblemente, el compuesto de fórmula (IIa) es un compuesto de fórmula (Illa) o (IIIc) o un estereoisómero, solvato, tautómero o sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
en donde X es tal como se ha definido anteriormente.
En la Fórmula (IIIa) y (IIIc), X es -(CH2)n n-X', en la que n es de 0 a 6 y X' es -CHO.
Preferiblemente X es -(CH2)n n-X', en la que 4 y X' es -CHO.
Preferiblemente X es -(CH2)n n-X', en la que 2 y X' es -CHO.
Preferiblemente X es -(CH2)n n-X', en la que ó 1 y X' es -CHO.
Más preferiblemente, X es -CHO.
Lo más preferiblemente, el compuesto de fórmula (IIa) es un compuesto de fórmula (IVa), (IVb), (IVe) o (IVf), o un estereoisómero, solvato, tautómero o sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
La fórmula (IVa) es 5-formil-2'-desoxicitidina (también denominada 5f2dC, 5fdC, 2d5fC y d5fC en el presente documento). La fórmula (IVe) es 5-formil-2'-desoxicitidina-5'-trifosfato.
Por tanto, preferiblemente, el compuesto de uso en la invención se selecciona de 5-formil-2'-desoxicitidina y 5-formil-2'-desoxicitidina-5'-trifosfato o un estereoisómero, solvato, tautómero o sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Más preferiblemente, el compuesto es 5-formil-2'-desoxicitidina o un estereoisómero, solvato, tautómero o sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Alternativamente, el compuesto de uso en la invención se selecciona preferiblemente de 5-formil-2'-desoxicitidina y 5-formil-2'-desoxicitidina-5'-trifosfato o un estereoisómero, solvato, tautómero o sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Lo más preferiblemente, el compuesto es 5-formil-2'-desoxicitidina o un estereoisómero, solvato, tautómero o sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
El término "tratamiento" o "terapia" incluye cualquier tratamiento o terapia que resulte en una mejora de la salud o estado de un/a paciente, o de un síntoma del cáncer que está sufriendo. El término "tratamiento" no se limita a terapias curativas (p. ej., aquellas que resultan en la eliminación de células de cáncer o tumores o metástasis del/de la paciente), sino que incluye cualquier tratamiento que presente un efecto beneficioso sobre el cáncer o el/la paciente, por ejemplo, regresión o reducción tumoral, reducción del potencial metastásico, supervivencia global incrementada, extensión o prolongación de la vida o remisión, inducción de la remisión, una ralentización o reducción de la progresión de la enfermedad o de la velocidad de progresión de la enfermedad, o del desarrollo tumoral, mejora subjetiva de la calidad de vida, reducción del dolor o de otros síntomas relacionados con la enfermedad, mejora del apetito, menores náuseas o un alivio de cualquier síntoma del cáncer.
De esta manera, tal como se utiliza en la presente memoria, "tratamiento" puede referirse a reducir, aliviar, mejorar o eliminar el cáncer, o uno o más síntomas del mismo, que está siendo tratado, respecto al cáncer o síntoma previamente al tratamiento. El tratamiento puede incluir una reducción o eliminación de células de cáncer, por ejemplo, en tumores, p. ej., en tumores sólidos. El tratamiento es tratamiento de un sujeto, es decir, un sujeto que lo necesita. De esta manera, el tratamiento puede incluir una reducción del tamaño tumoral, o la prevención del crecimiento tumoral o el crecimiento tumoral adicional, es decir, la estabilización del tamaño tumoral.
El término "prevención" se refiere a retrasar o prevenir la aparición de los síntomas del cáncer, p. ej., en el desarrollo de un tumor.
Preferiblemente, los compuestos de la invención presentan un efecto directo sobre las células de cáncer/tumorales. Un "efecto directo" tal como se utiliza en la presente memoria significa que los compuestos de la invención interactúan directamente con las células de cáncer/tumorales con el fin de ejercer sus efectos anticáncer/antitumorales. En otras palabras, preferiblemente los compuestos de la invención, es decir, los compuestos de fórmula (IIa), son citotóxicos para las células de cáncer/tumorales. Preferiblemente, los compuestos de la invención se administran en el/la sujeto con el fin de ejercer un efecto directo sobre las células de cáncer/tumorales.
Preferiblemente, los métodos de la invención no comprenden la administración de los compuestos de la invención con el fin de reducir el número de una población de células que se ha administrado como parte de una terapia a base de células. Las terapias a base de células son bien conocidas como terapias en las que se administra una población de células en un/a sujeto con el fin de inducir un efecto terapéutico particular. Entre las terapias a base de células bien conocidas se incluyen la terapia de linfocitos T, p. ej., la terapia de linfocitos T CAR.
Preferiblemente, los métodos de la invención no comprenden la administración de los compuestos de la invención después de la administración de una población de células que se ha administrado como parte de una terapia a base de células.
Preferiblemente, los métodos de la invención no comprenden terapia de linfocitos T CAR. Preferiblemente, los métodos de la invención no comprenden terapia de linfocitos T. Preferiblemente, los métodos de la invención no comprenden terapias a base de células.
Preferiblemente, los métodos de la invención comprenden la administración del compuesto de la invención en un sujeto no sometido a terapia de células T-CAR, preferiblemente terapia de células T, preferiblemente terapia a base de células. En otras palabras, preferiblemente el sujeto no ha recibido y no recibirá terapia de linfocitos T-CAR, preferiblemente terapia de linfocitos T, preferiblemente terapia a base de células como parte de su tratamiento.
Tal como se indica en la presente memoria, un/a sujeto puede ser cualquier animal humano o no humano, preferiblemente un animal mamífero, p. ej., una vaca, caballo, oveja, cerdo, cabra, conejo, gato o perro, especialmente preferiblemente un ser humano. De esta manera, preferiblemente los cánceres a los que se hace referencia en la presente memoria son cánceres humanos, y los tumores a los que se hace referencia en la presente memoria preferiblemente están presentes en un/a sujeto humano.
En algunas realizaciones, los tratamientos según la presente invención pueden utilizarse en sujetos en riesgo de recaída, recurrencia o metástasis del cáncer. De esta manera, desde una perspectiva alternativa, los compuestos de la fórmula (IIa) pueden utilizarse en la prevención de la recaída, recurrencia o metástasis del cáncer.
En realizaciones particulares, la invención puede implicar identificar o determinar en primer lugar que el/la sujeto que debe tratarse presenta cáncer (es decir, un tumor) o que es susceptible o está en riesgo de desarrollar cáncer.
Alternativa o adicionalmente, la invención puede implicar evaluar o realizar el seguimiento del efecto de la administración del compuesto de fórmula (IIa) y/o el otro u otros agentes anticáncer en el/la sujeto, o más particularmente sobre el cáncer (tumor), o sobre el desarrollo o progreso del cáncer (tumor). Los procedimientos y medios para evaluar y/o realizar el seguimiento de un efecto anticáncer son bien conocidos de la técnica, por ejemplo, mediante la determinación o seguimiento de los síntomas, el estado clínico, el tamaño o extensión tumoral (p. ej., mediante técnicas de obtención de imágenes) u otros indicadores de cáncer o tumor, p. ej., marcadores de cáncer/tumor, etc.
El cáncer se define ampliamente en el presente documento para incluir cualquier afección neoplásica, e incluye particularmente afecciones malignas o premalignas. El cáncer puede causar o dar como resultado o manifestarse en tumores sólidos, pero no se limita a estos, e incluye también cánceres del sistema hematopoyético. Los tumores benignos y tumores malignos también se incluyen en el término cáncer tal como se usa en el presente documento, es decir, los términos cáncer y tumor se usan indistintamente. Se prefiere el tratamiento de tumores malignos.
El cáncer/puede producirse en cualquier tejido u órgano del cuerpo. Por ejemplo, la presente invención puede usarse en el tratamiento o prevención de cualquiera de los siguientes cánceres en un paciente o sujeto: Cáncer del sistema nervioso central, preferiblemente cáncer cerebral, preferiblemente glioma; leucemia linfoblástica aguda (LLA); leucemia mieloide aguda (LMA); carcinoma adrenocortical; cáncer relacionado con el SIDA (por ejemplo sarcoma de Kaposi y linfoma); cáncer anal; cáncer de apéndice; carcinoma de células basales; cáncer de conductos biliares; cáncer de vejiga extrahepática; cáncer óseo (por ejemplo sarcoma de Ewing; osteosarcoma e histiocitoma fibroso maligno); cáncer de mama; tumores bronquiales; linfoma de Burkitt; tumor carcinoide; tumores cardíacos (corazón); cáncer de cuello uterino (adenocarcinoma de cuello uterino); cordoma; leucemia promielocítica aguda; Leucemia linfocítica crónica (LLC); leucemia mielógena crónica (LMC); trastorno mieloproliferativo crónico; cáncer de colon; cáncer colorrectal; linfoma cutáneo de células T ; cáncer de conductos biliares; carcinoma ductal extrahepático in situ (SIDC); tumores embrionarios; cáncer endometrial; cáncer esofágico; Esthesioneuroblastoma; sarcoma de Ewing; tumor de células germinales extracraneales; tumor de células germinales extragonadales; cáncer de conductos biliares extrahepáticos; cáncer ocular (incluyendo melanoma intraocular y retinoblastoma); histiocitoma fibroso de hueso; cáncer de vesícula biliar; cáncer gástrico (estómago); tumor carcinoide gastrointestinal; Tumores estromales gastrointestinales (GIST); tumor de células germinales; enfermedad trofoblástica gestacional; leucemia de células pilosas; cáncer de cabeza y cuello; cáncer de corazón; cáncer hepatocelular (hígado); histiocitosis; células de Langerhans; linfoma de Hodgkin; cáncer hipofaringe; melanoma intraocular; tumores de células de islotes; tumores neuroendocrinos pancreáticos; sarcoma de Kaposi; cáncer de riñón (incluyendo tumor de células renales y de Wilms); histiocitosis de células de Langerhans; cáncer de laringe; leucemia (incluyendo linfoblástica aguda (ALL); mieloide aguda (LMA); linfocítica crónica (LLC); mielógena crónica (LMC); cáncer de labios y de cavidad oral; Cáncer de hígado (primario); carcinoma lobular in situ (LCIS); cáncer de pulmón; linfoma; macroglobulinemia; Waldenstrom; melanoma (melanoma maligno); carcinoma de células de Merkel; mesotelioma; cáncer de cuello escamoso metastásico con primario oculto; carcinoma del tracto central que implica gen NUT; cáncer de boca; síndromes de neoplasia endocrina múltiple; infantil; neoplasia de células plasmáticas/mieloma múltiple; micosis fungoide; síndromes mielodisplásicos; neoplasias mielodisplásicas/mieloproliferativas; mieloma múltiple; trastornos mieloproliferativos; cáncer de cavidad nasal y de seno paranasal; cáncer nasofaríngeo; neuroblastoma; linfoma no hodgkiniano; Cáncer de pulmón de células no pequeñas; cáncer oral; cáncer de la cavidad oral; cáncer orofaríngeo; osteosarcoma; cáncer de ovario (adenocarcinoma de ovario); cáncer pancreático; tumores neuroendocrinos pancreáticos (tumores de células de islotes); papilomatosis; paraganglioma; cáncer de seno paranasal y de cavidad nasal; cáncer paratiroideo; cáncer de pene; cáncer faríngeo; feocromocitoma; adenocarcinoma epitelial; neoplasia de células plasmáticas/mieloma múltiple; blastoma pleuropulmonar; cáncer de embarazo y mama; cáncer de próstata; cáncer rectal; cáncer de células renales (riñón); pelvis renal y uréter; cáncer de células transicionales; retinoblastoma; Rhabdomyosarcoma; cáncer de glándulas salivares; sarcoma; Síndrome Sezary; Cáncer de Piel; Cáncer de Pulmón de Células Pequeñas; Cáncer de Intestino Delgado; Sarcoma de Tejidos Blandos; Carcinoma de Células Escamosas; Cáncer de Cuello Escamoso con Primario Oculto; Cáncer Metastásico; Cáncer de Estómago (Gástrico); Linfoma de Células T; Cáncer Testicular; Cáncer de Garganta; Timoma y Carcinoma Tímico; Cáncer de Tiroides; Cáncer de Células Transicionales de la Pelvis Renal y Uréter; Cáncer Uretral; Cáncer Uterino; Endometrio; Sarcoma Uterino; Cáncer Vaginal; Cáncer Vulvar; Macroglobulinemia de Waldenstrom; y Tumor de Wilms.
Las células de un embrión humano están dispuestas en distintas capas germinales: un ectodermo externo, un endodermo interno y el mesodermo, que se desarrolla entre el ectodermo y el endodermo. Todos los órganos del cuerpo se desarrollan o se diferencian de manera ordenada de estas tres capas germinales primarias.
En la presente invención, preferiblemente el cáncer/tumor es un cáncer/tumor de un tejido derivado del ectodermo, mesodermo paraxial o mesodermo de placa lateral, preferiblemente del ectodermo.
Preferiblemente, el cáncer es un cáncer del sistema nervioso central, preferiblemente cáncer cerebral. Para evitar dudas, se considera en el campo y en la presente memoria que cáncer cerebral es un cáncer del sistema nervioso central. El sistema nervioso central comprende el cerebro y la médula espinal. De esta manera, preferiblemente el tumor es un tumor del sistema nervioso central, preferiblemente un tumor cerebral. Preferiblemente, los cánceres/tumorales del SNC se seleccionan del grupo que consiste en linfoma del SNC, tumor rabdoide, tumores embrionarios, tumor de células germinales y cordoma, o es un cáncer/tumor cerebral. Preferiblemente, el cáncer/tumor cerebral se selecciona del grupo que consiste en glioma, neuroma acústico, linfoma del SNC, craniofaringioma, meduloblastoma, meningioma, tumor cerebral metastásico, tumores pituitarios, tumor neuroectodérmico primitivo (PNET, por sus siglas en inglés), schwanoma, tumor pineal, retinoblastoma trilateral y tumor rabdoide.
Lo más preferiblemente, el cáncer/tumor es cáncer cerebral/un tumor cerebral, más preferiblemente glioma. El glioma puede ser cualquier tipo de glioma, por ejemplo, astrocitoma, ependimoma, subependimoma, oligodendroglioma, glioma del tallo cerebral, glioma del nervio óptico o un glioma mixto.
Preferiblemente, el glioma es astrocitoma. El astrocitoma puede ser astrocitoma de grado I (preferiblemente, astrocitoma pilocítico o astrocitoma de células gigantes subependimario), grado II (preferiblemente astrocitoma de grado bajo, xantoastrocitoma pleomórfico u oligoastrocitoma mixto), grado III (astrocitoma anaplásico) o, lo más preferiblemente, grado IV (glioblastoma).
Los sistemas de clasificación para la clasificación del tumor del sistema nervioso central son bien conocidos por el experto ordinario en la materia. Preferiblemente, se utiliza el sistema de clasificación de la Organización Mundial de la Salud (OMS). El esquema de clasificación de la OMS es bien conocido en el campo y se basa en la aparición de determinadas características: atipia, mitosis, proliferación endotelial y necrosis, que reflejan el potencial maligno del tumor en términos de invasión y tasa de crecimiento.
Los gliomas también pueden clasificarse de acuerdo con su ubicación, sobre o bajo eltentorium,que es una membrana que separa el cerebro del cerebelo. Los gliomas supratentoriales se encuentran sobre eltentorium,en el cerebro, mientras que los gliomas infratentoriales se encuentran bajo eltentorium,en el cerebelo. El glioma tratado según la presente invención puede ser un glioma supratentorial o un glioma infratentorial.
De esta manera, particularmente preferiblemente en el contexto de la presente invención, el cáncer/tumor es un glioma; lo más preferiblemente, glioma de grado IV, es decir, glioblastoma multiforme. El glioblastoma multiforme es un astrocitoma maligno y el tumor cerebral primario más habitual en adultos. El glioblastoma multiforme también se conoce como glioma de grado IV, glioblastoma y GBM.
Preferiblemente, el cáncer/tumor se selecciona del grupo que consiste en cáncer cerebral (como se ha definido anteriormente, preferiblemente glioma, más preferiblemente glioblastoma), cáncer de estómago, cáncer pancreático, linfoma, cáncer de pulmón, cáncer de piel, leucemia promielocítica aguda, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de hueso y cáncer cervical.
Más preferiblemente, el cáncer/tumor se selecciona del grupo que consiste en cáncer cerebral (como se ha definido anteriormente, preferiblemente glioma, más preferiblemente glioblastoma), cáncer de estómago, linfoma, cáncer de mama y cáncer cervical.
Preferiblemente, el cáncer/tumor se selecciona del grupo que consiste en cáncer cerebral (como se definió anteriormente, preferiblemente glioma, más preferiblemente glioblastoma), cáncer de estómago, cáncer pancreático, cáncer de piel, leucemia promielocítica aguda, cáncer de mama y cáncer cervical.
Preferiblemente, el cáncer/tumor se selecciona del grupo que consiste en cáncer cerebral (como se definió anteriormente, preferiblemente glioma, más preferiblemente glioblastoma), cáncer de piel y cáncer de mama, más preferiblemente cáncer cerebral (como se definió anteriormente, preferiblemente glioma, más preferiblemente glioblastoma) y cáncer de piel.
En dichas realizaciones, los compuestos de uso de la invención son aquellos en los preferiblemente X es -(CH2)n-X', en donde X' es -CHO y "n" es un valor entre 0 y 6, más preferiblemente entre 0 y 4, más preferiblemente entre 0 y 2, más preferiblemente 0 o 1, lo más preferiblemente, en donde X es -CHO. Tal como se demuestra en los presentes Ejemplos, dichos compuestos de la invención presentan ventajosamente una amplia citotoxicidad contra un amplio abanico de tipos de cáncer, con citotoxicidad limitada frente a las células no cancerosas.
Alternativamente, preferiblemente el cáncer/tumor se selecciona del grupo que consiste en cáncer cerebral (como se ha definido anteriormente, preferiblemente glioma, más preferiblemente glioblastoma) y leucemia mielógena crónica.
Preferiblemente, el tumor estomacal es carcinoma gástrico. Preferiblemente, el tumor pancreático es carcinoma pancreático. Preferiblemente, el cáncer de piel es melanoma maligno. Preferiblemente, el cáncer de ovario es adenocarcinoma de ovario. Preferiblemente, el cáncer de mama es adenocarcinoma epitelial. Preferiblemente, el cáncer óseo es osteosarcoma óseo. Preferiblemente, el cáncer de pulmón es adenocarcinoma metastásico, preferiblemente adenocarcinoma no microcítico metastásico. Preferiblemente, el cáncer cervical es adenocarcinoma cervical.
Sin embargo, preferiblemente el cáncer no es cáncer de pulmón o cáncer de mama. Preferiblemente, el cáncer tampoco es cáncer pancreático, cáncer de estómago, cáncer de testículos o cáncer vaginal. Preferiblemente, el cáncer tampoco es cáncer de riñón o cáncer de intestino.
Preferiblemente, el cáncer no es cáncer de pulmón. Preferiblemente, el cáncer tampoco es cáncer de próstata, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de ovario o cáncer cervical. Preferiblemente, el cáncer/tumor no es cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de próstata o cáncer de riñón. Preferiblemente, el cáncer/tumor tampoco es cáncer pancreático. Preferiblemente, el cáncer/tumor tampoco es leucemia mielógena crónica.
i) cáncer de mama, preferiblemente tampoco cáncer pancreático, cáncer de estómago, cáncer de testículos o cáncer vaginal, más preferiblemente tampoco cáncer del intestino; y/o
ii) cáncer de hígado, cáncer de mama, cáncer de ovario o cáncer cervical.
Preferiblemente, el cáncer no es un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, leucemia mielógena crónica, cáncer pancreático, cáncer de estómago, cáncer de testículos, cáncer vaginal y cáncer del intestino. Preferiblemente, el cáncer no es ninguno de estos cánceres.
Preferiblemente, el cáncer de mama tratado de acuerdo con la presente invención
i) es carcinoma ductal invasivo; y/o
ii) expresa p53 de tipo silvestre; y/o
iii) no es triple negativo, es decir expresa uno o más de receptor de estrógeno (ER+) receptor de progesterona (PR+) y h Er 2 (HER2+), preferiblemente es ER+ y PR+; y/o
iv) es heterocigota para p53.
Los cánceres de mama preferiblemente no tratados según la presente invención son preferiblemente sólo aquellos cánceres de mama que:
i) son adenocarcinomas; y/o
ii) son triple negativos, es decir, no expresan el receptor de estrógenos (ER-), el receptor de progesterona (PR-) o HER2 (HER2-); y/o
iii) expresar una variante mutante de p53; y/o
iv) son homocigóticos para p53.
La proteína humana citidina desaminasa (CDA) cataliza la desaminación hidrolítica de la citidina y la desoxicitidina en uridina y desoxiuridina, respectivamente. Algunos agentes anticáncer conocidos son análogos de nucleósido/nucleótido, por ejemplo la gemcitabina (2,2-difluorodesoxicitidina) y la citarabina (Ara-C, citosina arabinósido). La CDA problemáticamente inactiva dichos agentes anticáncer, incluyendo la gemcitabina y la citarabina. Tal como se demuestra en los presentes Ejemplos, los compuestos de la invención ejercen sus efectos citotóxicos de manera independiente de la expresión de la CDA.
En el contexto de la expresión génica de las células de cáncer/tumorales, los términos "sobreexpresado" e ''infraexpresado'' presentan un significado claro y ampliamente entendido, es decir, a niveles incrementados/más altos o reducidos/más bajos, respectivamente.
La sobreexpresión (o niveles incrementados o más altos) o la infraexpresión (o niveles reducidos o más bajos) puede determinarse en comparación con cualquier control apropiado (p. ej., nivel de control, muestra de control o biopsia). Por ejemplo, el nivel de control puede ser el nivel en una muestra (p. ej., una muestra de sangre o suero o una muestra o biopsia de tejido) de un/a sujeto sano (p. ej., un sujeto que no presenta cáncer). Los niveles de control apropiados (o muestras o valores de control) podrían ser fácilmente seleccionados por el/la experto/a en la materia. Los "valores" de control apropiados también podrían determinarse fácilmente sin utilizar una "muestra" de control en cada ensayo, p. ej., mediante referencia al intervalo para sujetos normales. Preferiblemente, los términos sobreexpresado e infraexpresado se refieren a que el nivel de transcrito de ARN del gen en cuestión en las células cancerosas es más alto (sobreexpresado) o más bajo (infraexpresado) que el nivel en las células no cancerosas del mismo tejido que las células cancerosas, según evaluación utilizando el mismo método y condiciones en ambos casos. Los métodos y condiciones preferentes para evaluar el nivel de expresión génica, p. ej., la expresión de CDA, son los dados a conocer en otro sitio en la presente memoria.
Preferiblemente, la sobreexpresión o infraexpresión es significativa. Mediante la expresión "sobreexpresado/infraexpresado significativamente", es decir, significativamente más alto/más bajo, se hace referencia a una sobreexpresión/infraexpresión estadísticamente significativa (más alto/más abajo de manera estadísticamente significativa). "Estadísticamente significativo" significa que el nivel incrementado o reducido que se observa es superior al que podría esperarse que ocurra por azar solamente. La significancia estadística se determina mediante el uso de cualquier método conocido de la técnica. Por ejemplo, la significancia estadística se determina mediante un valor de probabilidad (valor de p). Los valores de p son una medida de la probabilidad de que una diferencia entre grupos durante un experimento haya ocurrido por azar. Por ejemplo, un valor de p de 0,01 significa que hay 1 caso de cada 100 de que el resultado haya ocurrido por azar. Cuanto menor sea el valor de p, más probable es que la diferencia entre grupos haya sido causada por el tratamiento. Preferiblemente, el valor de probabilidad es <0,05 o <0,01.
En algunas realizaciones, los niveles incrementados (es decir, la sobreexpresión) pueden ser un incremento de por lo menos 5 %, por lo menos 10 %, por lo menos 20 %, por lo menos 30 %, por lo menos 40 % o por lo menos 50 % (p. ej., en comparación con un nivel de control). En algunas realizaciones, los niveles reducidos (es decir, la infraexpresión) pueden ser una reducción de por lo menos 5 %, por lo menos 10 %, por lo menos 20 %, por lo menos 30 %, por lo menos 40 % o por lo menos 50 % (p. ej., en comparación con un nivel de control).
Preferiblemente, el nivel de expresión génica en una célula de interés se determina por referencia a una base de datos que contiene dicha información. Recursos tales como The Cancer Genome Atlas (TCGA, https://cancergenome.nih.gov/), el atlas de expresión de EMBL-EBI (https://www.ebi.ac.uk/gxa/home), el atlas de proteínas humanas (https://www.proteinatlas.org/), GENEVESTIGATOR® (https://genevestigator.com/gv/), la Cancer Cell Line Encyclopaedia (https://portals.broadinstitute.org/ccle ) y otros, contienen información sobre los niveles de expresión génica en un amplio abanico de tipos celulares, incluyendo cánceres, así como proporcionan datos estadísticos sobre si el nivel de expresión génica en un tipo de cáncer particular es significativamente más alto o más bajo que en células no cancerosas del mismo tejido (es decir, si el gen está sobreexpresado o infraexpresado en el tipo de cáncer). Dichas bases de datos resultan preferentes. De esta manera, pueden identificarse fácilmente tipos de cáncer con sobreexpresión o infraexpresión estadísticamente significativa de un gen de interés. Se encuentra comprendido dentro de los conocimientos del experto ordinario en la materia el uso de dichos recursos con este propósito.
De esta manera, preferiblemente, el cáncer/tumor es tal como se define en cualquier sitio en la presente memoria, en donde la expresión de CDA dentro de dicho cáncer/tumor se determina por referencia a una base de datos seleccionada de entre la base de datos del atlas de expresión de EMBL-EBI (https://www.ebi.ac.uk/gxa/home), la base de datos GENEVESTIGATOR® (https://genevestigator.com/gv/ ), la Cancer Cell Line Encyclopaedia (https://portals.broadinstitute.org/ccle ) y el atlas de proteínas humanas (https://www.proteinatlas.org/).
Preferiblemente, el cáncer/tumor no expresa CDA a un nivel más alto que el nivel de expresión en células no cancerosas del mismo tejido que el cáncer/tumor, en el que dicha sobreexpresión se determina por referencia a una base de datos seleccionada de entre la base de datos del atlas de expresión de EMBL-EBI (https://www.ebi.ac.uk/gxa/home), la base de datos GENEVESTIGATOR® (https://genevestigator.com/gv/ ), la Cancer Cell Line Encyclopaedia (https://portals.broadinstitute.org/ccle ) y el atlas de proteínas humanas (https://www.proteinatlas.org/).
Preferiblemente, el cáncer/tumor es uno en el que el nivel de expresión de CDA no es superior a 90 % del nivel de expresión de CDA en una línea celular de cáncer de referencia según se determina utilizando el mismo método bajo las mismas condiciones, en el que dicha línea celular de cáncer de referencia es MDA-MB-231.
MDA-MB-231 es una línea celular bien caracterizada que se encuentra ampliamente disponible a nivel comercial. La línea celular MDA-MB-231 es una línea celular de cáncer de mama humana epitelial que se estableció a partir de una efusión pleural de una mujer caucásica de 51 años con un adenocarcinoma mamario metastásico y es una de las líneas celulares de cáncer de mama más habitualmente utilizadas en los laboratorios de investigación médica. Puede obtenerse, por ejemplo, de la Colección europea de cultivos celulares autenticados (ECACC, por sus siglas en inglés), n.° de catálogo 92020424. Tal como se muestra en la Tabla 4A, el nivel de expresión de CDA en la línea celular MDA-MB-231 es 153 TPM.
MDA-MB-2231 es una línea celular de cáncer de mama triple negativo (TNBC, por sus siglas en inglés) poco diferenciado, altamente agresivo e invasivo, ya que carece de expresión de receptor de estrógeno (RE) y de receptor de progesterona (RP), así como de amplificación de HER2 (por sus siglas en inglés, receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano). Se reconoce la línea celular como perteneciente al subtipo claudinabajo peso molecular, ya que muestra una regulación negativa de claudina-3 y claudina-4, una baja expresión del marcador de proliferación Ki-67, enriquecimiento en marcadores asociados a la transición epitelialmesenquimal y la expresión de características asociadas a las células madre de cáncer mamario (CSC, por sus siglas en inglés), tal como el genotipo CD44+CD24-/low. En cultivo 3D, la línea celular muestra morfología similar a la endotelial y se distingue por su fenotipo invasivo; presenta proyecciones estrelladas que con frecuencia forman puentes entre colonias de múltiples células. Las condiciones estándares para el cultivo de esta línea celular son bien conocidas. Las condiciones de cultivo preferentes son 37 °C en medio L-15 de Leibovitz complementado con glutamina 2 M y suero de feto bovino (FBS, por sus siglas en inglés) al 15 %. Dicho medio permite el crecimiento de células en medios sin equilibrado del CO2. Las células de MDA-MB-231 preferiblemente se siembran a una densidad de 1-3x104 células/cm2 y se subcultivan cuando son confluentes al 70-80 %.
Preferiblemente, el cáncer/tumor es uno en el que el nivel de expresión de CDA no es superior a 80 %, preferiblemente no superior a 70 %, preferiblemente no superior a 60 %, preferiblemente no superior a 50 %, preferiblemente no superior a 40 %, preferiblemente no superior a 30 %, preferiblemente no superior a 25 % del nivel de expresión de CDA en una línea celular de cáncer de referencia según se determine utilizando el mismo método bajo las mismas condiciones, en el que dicha línea celular de cáncer de referencia es MDA-MB-231.
Preferiblemente, el cáncer/tumor es uno en el que el nivel de expresión de CDA es por lo menos 2 veces inferior, preferiblemente por lo menos 2,5 veces inferior, preferiblemente por lo menos 3 veces inferior, preferiblemente por lo menos 3,5 veces inferior, preferiblemente por lo menos 4 veces inferior, preferiblemente por lo menos 4,5 veces inferior al nivel de expresión de CDA en una línea celular de cáncer de referencia según se determine utilizando el mismo método bajo las mismas condiciones, en el que dicha línea celular de cáncer de referencia es MDA-MB-231. La expresión "por lo menos X veces inferior" en este contexto se refiere a que el nivel de expresión máximo de CDA en el cáncer/tumor es el valor que es exactamente X veces inferior al nivel de expresión en la línea celular de cáncer de referencia.
El método y condiciones utilizados para determinar el nivel de expresión de CDA en el cáncer/tumor y en la línea celular de cáncer de referencia puede ser cualquier método y condiciones adecuados, con la condición de que se utilice el mismo método y condiciones para determinar el nivel de expresión de CDA en el cáncer/tumor a los utilizados para determinar el nivel de expresión de CDA en la línea celular de cáncer de referencia. La línea celular de cáncer de referencia es, de esta manera, un control. El experto ordinario en la materia es fácilmente capaz de determinar el nivel de expresión de un gen de interés, p. ej., CDA, igualmente en células cancerosas y no cancerosas. Dichos métodos son parte de los conocimientos generales habituales en el campo y puede utilizarse cualquier método adecuado en el contexto de la presente invención.
Por ejemplo, el nivel de expresión puede medirse al nivel de las proteínas. los métodos para medir los niveles de expresión de proteínas son bien conocidos de la técnica. Dichos métodos generalmente implican poner en contacto una muestra biológica de interés con uno o más reactivos detectables que resultan adecuados para medir el nivel de expresión de la proteína, tal como un anticuerpo, y posteriormente determinar el nivel de expresión de la proteína basándose en el nivel de reactivo detectado, preferiblemente después de la normalización. Entre los ejemplos de métodos que generalmente implican el uso de un anticuerpo se incluyen, aunque sin limitación, la transferencia western, la inmunotransferencia, el ensayo de inmmunosorción ligada a enzima (ELISA, por sus siglas en inglés), ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas de puntos (ELISPOT, por sus siglas en inglés), radioinmunoensayo (RIA, por sus siglas en inglés), inmunohistoquímica e inmunoprecipitación. Pueden utilizarse otros métodos adecuados para medir el nivel de expresión de las proteínas, que no implican necesariamente el uso de un anticuerpo, incluyendo, aunque sin limitación, separación celular activada por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés), microscopía, tal como microscopía de fuerza atómica, citometría de flujo, microcitometría, ensayo de unión a proteínas, ensayo de unión de ligandos, micromatrices, electroforesis en gel de poliacrilamida, tal como SDS-PAGE, resonancia del plasmón superficial (SPR, por sus siglas en inglés), transferencia de energía por resonancia de Forster (FRET), transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET), quimioluminiscencia, polarización fluorescente, fosforescencia, espectrometría de masas, tal como cromatografía de líquidos-espectrometría de masas (CL-EM) o cromatografía líquida/espectrometría de masas/espectrometría de masas (CL-EM-EM), desorción láser asistida por matriz/ionización-tiempo de vuelo (MALDI-TOF, por sus siglas en inglés), desorción/ionización láser potenciada en superficie por tiempo de vuelo (SELDI-TOF, por sus siglas en inglés) y obtención de imágenes de resonancia magnética (RM).
Preferiblemente, sin embargo, el nivel de expresión génica, p. ej., el nivel de expresión de CDA, puede medirse al nivel del ARN. Los métodos para medir los niveles de ARN son bien conocidos de la técnica y puede utilizarse cualquier método adecuado en el contexto de la presente invención. Por ejemplo, micromatrices, pueden utilizarse métodos de RT-PCR, PCR cuantitativa en tiempo real, secuenciación del ARN, transferencias northern, extensión de cebadores, protección frente a ARNasas y de perfilado de la expresión de ARN. Preferiblemente, el método utilizado es la secuenciación de ARN o las micromatrices. La secuenciación de ARN es un método bien conocido que utiliza secuenciación de última generación (SUG) para determinar la presencia y cantidad de ARN en una muestra biológica en un momento dado.
Preferiblemente, el método utilizado para determinar el nivel de expresión de CDA en un cáncer/tumor de interés en comparación con el nivel de expresión de CDA en una línea celular de cáncer de referencia, en la que dicha línea celular de cáncer de referencia es MDA-MB-231, es el "Método de micromatrices A" al que se hace referencia posteriormente.
El Método de micromatrices A comprende las etapas siguientes:
1) extraer ARN de las células de cáncer/tumorales de interés, en el que dicha extracción preferiblemente se lleva a cabo utilizando un kit de purificación de ARN total Norgen (Norgen Biotek n.° de cat. 17200);
2) preparar ARN poli(A)+ a partir del ARN extraído, preferiblemente utilizando un kit MEGApure siguiendo las instrucciones del fabricante (Ambion);
3) preparar ADN complementario (ADNc) a partir del ARN poli(A)+ mediante tratamiento con transcriptasa inversa, es decir, realizar una transcripción inversa;
4) fragmentar el ADNc utilizando TdT (desoxinucleotidil transferasa terminal);
5) biotinilar los fragmentos de ADNc utilizando el kit de marcaje terminal GeneChip WT (Affymetrix);
6) repetir las etapas 1 a 5 con una línea celular de referencia, en la que dicha línea celular de referencia es MDA-MB-231;
7) hibridar 5,5 pg de los fragmentos de ADNc biotinilados que se han obtenido en la etapa 5 con una primera micromatriz de ADN a 45 °C durante 16 horas, e hibridar 5,5 pg de los fragmentos de ADNc biotinilados que se han obtenido en la etapa 6 con una micromatriz de ADN a 45 °C durante 16 horas, preferiblemente en donde dichas micromatrices son matrices Affymetrix GeneChip Human Gene 2.0 ST (Applied Biosystems);
8) lavar y teñir las micromatrices hibridadas, preferiblemente en la estación de fluidos Affymetrix GeneChip 450 (Applied Biosystems);
9) escanear dichas micromatrices teñidas con el escáner Affymetriz GeneChip 3000 7G utilizando el software Affymetrix GeneChip Command Console® para producir los valores de señal de datos en bruto en la forma de archivos CEL;
10) normalizar los archivos CEL para producir valores de expresión a nivel génico utilizando la implementación de "Robust Multiarray Average" (RMA) en el paquete de software de Affymetrix (versión 1.36.1), preferiblemente tal como se indica en R.A. Irizarry et al., Exploration, normalization, and summaries of high density oligonucleotide array probe level data. Biostatistics 4, 249-264 (2003);
11) evaluar la calidad de la matriz mediante el cálculo de la expresión logarítmica relativa (RLE, por sus siglas en inglés) y errores estándares no escalados normalizados (NUSE, por sus siglas en inglés) utilizando el paquete affyPLM (versión 1.34.0). La salida del paquete affyPLM son gráficos de cajas para las distribuciones tanto RLE como NUSE. Las matrices para las que los diagramas de cajas de RLE no están centrados en torno a 0 y las matrices para las que los diagramas de cajas de NUSE no están centrados en torno a 1, se marcan como de mala calidad y son excluidas del análisis posterior. Si se excluye la matriz, entonces se repiten las etapas anteriores del método.
12) evaluar ealizar el análisis de componentes principales (PCA, por sus siglas en inglés) utilizando la función Prcomp R con valores de expresión que han sido normalizados para todas las muestras respecto a una media de cero y una desviación estándar de uno. Se utiliza la PCA como un método de reducción de la dimensionalidad a fin de reducir la dimensionalidad elevada del grupo de datos de expresión génica, conservando simultáneamente la mayor parte de la variación en los datos. De esta manera, la realización de la PCA consigue una representación de menor dimensionalidad de los datos para el análisis y visualización posteriores.
13) evaluar de la expresión diferencial de CDA en las células de cáncer/tumorales de interés y en la línea celular de referencia MDA-MB-231 utilizando la prueba t moderada (Bayesiana empírica) implementada en el paquete Limma (versión 3.14.4, http://bioinf.wehi.edu.au/limma);
en la que las etapas de análisis de micromatrices 10 a 13 se llevan a cabo utilizando el entorno R para los cálculos estadísticos (versión 2.15.1).
Preferiblemente, el nivel de expresión de CDA en un cáncer/tumor en comparación con el nivel de expresión de CDA en una línea celular de cáncer de referencia, en la que dicha línea celular de cáncer de referencia es MDA-MB-231 se determina por referencia a una base de datos seleccionada de entre la base de datos del atlas de expresión de EMBL-EBI (https://www.ebi.ac.uk/gxa/home), la base de datos GENEVESTIGATOR® (https://genevestigator.com/gv/ ), la Cancer Cell Line Encyclopaedia (https://portals.broadinstitute.org/ccle ) y el atlas de proteínas humanas (https://www.proteinatlas.org/).
El nivel de expresión de un gen habitualmente se expresa en términos de cantidad relativa de transcrito de ARN para ese gen en comparación con la cantidad total de transcritos de ARN en la célula/tejido afectado. El nivel de expresión habitualmente se presenta en unidades de transcritos por millón (TPM), es decir, por cada 1 millón de moléculas de ARN en la célula/tejido de interés, [x] procedían del gen de interés. Nuevamente, el experto en la materia podrá obtener el nivel de transcrito de ARN en términos de TPM mediante métodos habituales, tales como los métodos de PCR cuantitativa en tiempo real o de secuenciación de ARN, y dicha información se encuentra disponible de recursos tales como TCGA, el atlas de expresión de EMBL-EBI, la base de datos GENEVESTIGATOR® (https://genevestigator.com/gv/ ), la Cancer Cell Line Encyclopaedia (https://portals.broadinstitute.org/ccle ) y el atlas de proteínas humanas (https://www.proteinatlas.org/), entre otros. Dichos métodos resultan preferentes en la presente memoria. La metodología para la determinación de los niveles de expresión génica en TPM está descrita en la literatura, por ejemplo, en Wagner et al., (2012) Theory Biosci 131 (4):281 -285 o en Mortazavi A et al., (2008) "Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq." Nature methods 5(7):621-8.
Preferiblemente, las células cancerosas/tumores que sobreexpresan CDA contienen transcritos de ARN de CDA a un nivel superior a 140 TPM. A la inversa, las células cancerosas/tumores que no sobreexpresan CDA preferiblemente contienen transcritos de ARN de CDA a un nivel <140 TPM (inferior o igual a 140 TPM). Desde una perspectiva alternativa, las células cancerosas/tumores preferentes de la invención presentan un nivel de expresión de CDA <140 TPM. De esta manera, los cánceres/tumores particularmente preferentes que deben tratarse de acuerdo con la presente invención son aquellos que expresan CDA a un nivel <140 TPM, más preferiblemente <100 TPM, más preferiblemente <50 TPM.
Preferiblemente, el nivel de expresión de CDA en un cáncer/tumor de interés, en unidades de TPM, se obtiene mediante referencia a una base de datos seleccionada de entre la base de datos del atlas de expresión de EMBL-EBI (https://www.ebi.ac.uk/gxa/home), la base de datos GENEVESTIGATOR® (https://genevestigator.com/gv/), la Cancer Cell Line Encyclopaedia (https://portals.broadinstitute.org/ccle) y el atlas de proteínas humanas (https://www.proteinatlas.org/).
Preferiblemente, el nivel de CDA en unidades de TPM en un cáncer/tumor de interés se determina mediante PCR cuantitativa en tiempo real o mediante secuenciación de ARN (RNA-seq) y cuantificación, utilizando células derivadas de dicho cáncer/tumor. Preferiblemente, el método utilizado es la secuenciación de ARN. Preferiblemente, el método utilizado es el "Método RNA-seq A" al que se hace referencia posteriormente.
El nivel de expresión de un gen en unidades de TPM puede determinarse utilizando cualquier método conocido, aunque preferiblemente se determina utilizando RNA-seq. Los métodos de RNA-seq. son bien conocidos de la técnica y se encuentran ampliamente disponibles a nivel comercial. Puede utilizarse cualquier método de RNA-seq. adecuado para determinar el nivel de expresión de CDA en unidades de TPM en un cáncer de interés. El método siguiente, denominado Método de RNA-seq. A, resulta preferente, y comprende las etapas siguientes:
1. Extracción de ARN total de las células de cáncer/tumorales de interés. Lo anterior puede llevarse a cabo utilizando kits de extracción de ARN estándares, preferiblemente el minikit de ADN/ARN QIAGEN All Prep (Hilden, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante.
2. Opcionalmente, cuantificación y evaluación del ARN extraído para pureza, preferiblemente mediante una herramienta de electroforesis automática, preferiblemente un 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). El Agilent Bioanalyzer es una plataforma de microfluidos utilizada para la estimación de tamaño, cuantificación y control de calidad del ARN (y ADN/proteínas) y proporciona un "número de integridad del ARN" (RIN, por sus siglas en inglés) que cuantifica la fragmentación de la muestra de ARN. Preferiblemente, solo se siguen utilizando las muestras posteriormente en el procedimiento si presentan un RIN de como mínimo 7, preferiblemente de como mínimo 8.
3. Preparación de una biblioteca de secuenciación de ARN, preferiblemente utilizando el kit de preparación de muestras de ARN Illumina TruSeq™ (Illumina, San Diego, CA, EE. UU.) y el protocolo asociado. Preferiblemente se utilizan 500 a 1000 pg de ARN total por muestra en este procedimiento. Dicho kit y protocolo son bien conocidos en el campo. Dicha etapa comprende las etapas siguientes:
3a. Tratar el ARN extraído para reducir la cantidad de ARN bacteriano y eucariótico ribosómico, preferiblemente utilizando el kit de eliminación de ARNr Ribo-Zero (Epicentre, Madison, WI, EE. UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante.
3b. Tratar el ARN restante con transcriptasa inversa y hexámeros aleatorios para crear fragmentos de ADNc de una sola cadena de entre 100 y 150 bases de longitud, o preferiblemente de entre 200 y 300 bases de longitud.
3c. T ratar los fragmentos de ADNc de una sola cadena con ADN polimerasa I y ARNasa H para producir fragmentos de ADN complementados de doble cadena (ADNc), y
3d. Ligar los adaptadores de RNA-seq. a los extremos de los fragmentos de ADNc para producir una biblioteca de secuencias de adaptador-ADNc capaces de ser analizadas mediante RNA-seq. Los adaptadores de RNA-seq. son bien conocidos en el campo y pueden utilizarse cualesquiera adaptadores adecuados. Los adaptadores contienen elementos funcionales que permiten la secuenciación; por ejemplo, un elemento de amplificación y un sitio de secuenciación primario. Preferiblemente, los adaptadores son adaptadores de indexación de Illumina. Los adaptadores pueden ligarse a un extremo de cada fragmento de ADNc para producir bibliotecas de un solo extremo (lo que resultará en una "lectura" por fragmento durante la secuenciación), en cuyo caso la longitud del fragmento de ADNc en la etapa 3b será de entre 100 y 150 bases. Preferiblemente, sin embargo, los adaptadores se ligan a ambos extremos de cada fragmento de ADNc para producir bibliotecas de extremos apareados (lo que resultará en dos "lecturas" por fragmento durante la secuenciación, denominadas "lecturas apareadas"), en cuyo caso la longitud del fragmento de ADNc en la etapa 3b será de entre 200 y 300 bases.
4. Opcionalmente, amplificación las secuencias de adaptador-ADNc mediante PCR. Esta etapa puede llevarse a cabo si la cantidad de ADN es insuficiente para llevar a cabo la etapa 5 del análisis de la secuencia. La cantidad de ADN requerida para el análisis de secuencia es bien conocida por el experto en la materia (preferiblemente se cargan 70 a 135 gl, más preferiblemente 125 gl, de una solución 20 pM de ADN, en la celda de flujo del secuenciador en la etapa 5). Los métodos de evaluación de las cantidades de ADN en una muestra son habituales y puede utilizarse cualquier método adecuado. Preferiblemente, el método utilizado es la fluorimetría, preferiblemente se utiliza un fluorímetro Qubit®.
5. Secuenciación de las secuencias de adaptador-ADNc, preferiblemente utilizando un secuenciador Illumina Flowcell, preferiblemente un secuenciador Illumina Flowcell HiSeq 2500 o un secuenciador Illumina Flowcell NovaSeq 6000, preferiblemente utilizando un ciclo de secuenciación de 100 a 150 pares de bases si se producen bibliotecas de un solo extremo en la etapa 3, más preferiblemente utilizando un ciclo de secuenciación de 200 a 300 pares de bases con bibliotecas de extremos apareados producidas en la etapa 3. Preferiblemente, se cargan 70 a 135 gl, más preferiblemente 125 gl, de una solución 20 pM de ADN en la celda de flujo. El grupo de datos en bruto obtenidos proporcionará un identificador de secuencia único para cada fragmento analizado, su secuencia (una denominada "lectura") y una indicación de la confianza en la determinación del secuenciador de la secuencia en cada posición de base dentro de la lectura (la denominada puntuación de calidad Phred).
6. Preparación de un grupo de datos de lecturas de calidad filtrada mediante extracción respecto del grupo de datos de secuencias determinadas:
i) aquellas bases dentro de una lectura que presenten una puntuación de calidad Phred inferior a 10:
ii) aquellas bases en una lectura que están cadena abajo (es decir, después en la dirección de secuenciación) de una base en la misma lectura que presenta una puntuación de calidad Phred inferior a 10;
iii) aquellas lecturas que contienen cualesquiera bases no determinadas ("no llamadas") ("N);
iv) aquellas lecturas que se localizan en un genoma de referencia contaminante, en el que dicho genoma de referencia contaminante es el genoma deE. coli,y
v) si la biblioteca de RNA-seq utilizada es una biblioteca de extremos apareados, aquellas lecturas cuya "lectura apareada" fue descartada en una de las etapas 6(iii) a 6(iv).
7. Alineación de las lecturas de calidad filtrada con el genoma de la especie sujeto, es decir, preferiblemente el genoma humano. Preferiblemente, se alinean lecturas de calidad filtrada con el genoma de referencia humano de la base de datos Ensembl versión 98, preferiblemente el genoma humano GRCh38 y la base de datos de elementos de referencia génica Ensembl (versión de Ensembl Genomes 45, GENCODE 32). Las herramientas de alineación adecuadas para esta etapa son bien conocidas, se encuentran ampliamente disponibles y puede utilizarse cualquier herramienta de alineación adecuada. Preferiblemente, la herramienta de alineación es TopHat2 (versión 2.1.1) [Trapnell et al., (2010) Nature Biotechnology 28, 511 -515].
8. Determinación del número de lecturas para el gen de CDA, y opcionalmente cualesquiera otros genes de interés. Las herramientas bioinformáticas para esta etapa son bien conocidas, se encuentran ampliamente disponibles y puede utilizarse cualquier herramienta adecuada. Preferiblemente, las lecturas por gen se determinan mediante el uso del paquete HTSeq (htseq-count). De esta manera, esta etapa proporciona datos en bruto de número de lecturas.
9. Conversión de los datos en bruto de número de lecturas obtenidos en la etapa 8 en unidades de transcrito por millón (TPM). Es una operación matemática estándar, utilizada habitualmente en el campo. La provisión de datos de recuento en unidades de TPM permite obtener una evaluación significativa de los niveles de expresión génica debido a que la determinación de los valores de TPM implica normalizar los datos en bruto para i) la longitud génica y ii) la profundidad de secuenciación.
i) Con respecto a la normalización de las longitudes génicas en los datos en bruto, puede observarse un recuento de lecturas más alto en los genes más largos simplemente porque los genes son más largos, por lo que se alinean más fragmentos con esos genes. La normalización respecto a la longitud génica comprende dividir los recuentos de lecturas de cada gen por la longitud del gen (en kilobases).
ii) La profundidad de secuenciación es un efecto entre muestras que altera la comparación entre recuentos de lecturas del mismo gen en diferentes muestras. Con el fin de normalizarla, los recuentos de lecturas por kilobase obtenidos en la etapa 9i) se dividen por un "factor de escalado por millón", que se obtiene a su vez dividiendo el número total de lecturas en una muestra por 1 millón.
Los datos de expresión génica obtenidos mediante el uso de RNA-seq. pueden presentarse en unidades de RPKM (por sus siglas en inglés, lecturas por millón de kilobases). Lo anterior se calcula del modo siguiente:
i. Se divide el número total de lecturas en la muestra por 1.000.000, proporcionando un "factor de escalado por millón";
ii. Se dividen los recuentos de lecturas por gen por el factor de escalado "por millón", que normaliza respecto a la profundidad de secuenciación, proporcionando de esta manera unidades de lecturas por millón (RPM), y
iii. Se dividen los valores de RPM por la longitud génica, en kilobases, lo que normaliza respecto a la longitud génica, proporcionando de esta manera unidades de RPKM.
Otra unidad de expresión génica son los Fragmentos por millón de kilobases (FPKM, por sus siglas en inglés), que es muy similar a RPKM. RPKM es aplicable en el caso de que se utilice RNA-seq. de un extremo, en donde cada lectura corresponde a un único fragmento que ha sido secuenciado. FPKM es aplicable a RNA-seq. de extremos apareados, en donde dos lecturas pueden corresponder a un único fragmento o, en el caso de que no se localice una lectura de la pareja, una lectura puede corresponder a un único fragmento. La única diferencia entre RPKM y FPKM es que FPKM considera las dos lecturas que pueden localizarse en un fragmento (y, por lo tanto, no cuenta este fragmento dos veces).
TPM es muy similar a RPKM y FPKM. La única diferencia es el orden de las operaciones (i) a (iii), anteriormente. De esta manera, TPM se determina del modo siguiente:
i. Se dividen los recuentos de lectura por gen por la longitud del gen, en kilobases, lo que normaliza respecto a la longitud génica, proporcionando de esta manera unidades de lectura por kilobase (RPK);
ii. Se divide el valor de RPK total en la muestra por 1.000.000, proporcionando un "factor de escalado por millón", y
iii. Se dividen los valores de RPK obtenidos en la etapa (i) por el factor de escalado "por millón" obtenido en la etapa (ii), lo que normaliza respecto a la profundidad de secuenciación, proporcionando de esta manera unidades de TPM.
La única diferencia al calcular TPM en comparación con RPKM o FPKM es que, al calcular TPM, en primer lugar, se realiza la normalización respecto a la longitud génica. Sin embargo, el resultado es que, al utilizar unidades de TPM, la suma de todas las TPM en cada muestra son iguales -1 millón. Lo anterior permite obtener una comparación más significativa de la proporción de lecturas que se localizan en un gen en cada muestra.
El método de RNA-seq. A anteriormente indicado de determinación del nivel de expresión de CDA en unidades de TPM también puede utilizarse para determinar el nivel de expresión de CDA en un cáncer/tumor de interés, en unidades de TPM, en comparación con un control, es decir, células de control, tal como se ha definido anteriormente, o una línea celular de referencia, en la que dicha línea celular de referencia es MDA-MB-231. En dichas realizaciones, el método RNA-seq. A puede llevarse a cabo utilizando las células de cáncer/tumorales de interés y repetirse con las células de control o de referencia, de manera que los valores de TPM determinados a continuación se comparan. Alternativamente, el método RNA-seq. A puede llevarse a cabo utilizando las células de cáncer/tumorales de interés y el nivel de expresión de CDA en unidades de TPM determinado compararse con un valor del nivel de expresión de CDA en unidades de TPM obtenido anteriormente utilizando la línea celular de control o de referencia utilizando el mismo método.
Alternativamente, puede determinarse el nivel de expresión de un gen mediante una micromatriz, que es una técnica estándar en el campo. Puede utilizarse cualquier técnica de micromatriz adecuada en el contexto de la presente invención. Las micromatrices permiten la detección de la expresión de miles de genes simultáneamente.
El nivel de expresión génica determinado mediante micromatrices puede expresarse en cualquier escala, p. ej., una escala lineal. Los datos de micromatrices también pueden transformarse, preferiblemente mediante la transformación con logaritmo de base 2, lo que presenta la ventaja de producir un espectro continuo de valores y el tratamiento similar de los genes regulados positiva y negativamente. Un gen regulado positivamente por un factor de 2 presenta un valor transformado mediante log2 de 1.
Preferiblemente, el cáncer/tumor es uno en el que el nivel de expresión de CDA transformado mediante logaritmo de base 2 es inferior a 11,75. Dichos cánceres/tumores se describen como no sobreexpresantes de CDA. Preferiblemente, el cáncer/tumor es uno en el que el nivel de expresión de CDA transformado con logaritmo de base 2 es inferior a 11,5, más preferiblemente inferior a 11, más preferiblemente inferior a 10,5, más preferiblemente inferior a 10 y más preferiblemente inferior a 9,5.
Preferiblemente, el cáncer/tumor es uno en el que el nivel de expresión de CDA lineal es inferior a 6500. Dichos cánceres/tumores se describen como no sobreexpresantes de CDA. Preferiblemente, el cáncer/tumor es uno en el que el nivel de expresión de CDA lineal es inferior a 6000, más preferiblemente inferior a 5000, más preferiblemente inferior a 4000, más preferiblemente inferior a 3000, más preferiblemente inferior a 2000 y más preferiblemente inferior a 1500.
Preferiblemente, el nivel de expresión de CDA lineal o transformado con logaritmo de base 2 en un cáncer/tumor de interés se obtiene mediante referencia a una base de datos seleccionada de entre la base de datos del atlas de expresión de EMBL-EBI (https://www.ebi.ac.uk/gxa/home), la base de datos GENEVESTIGATOR® (https://genevestigator.com/gv/), la Cancer Cell Line Encyclopaedia (https://portals.broadinstitute.org/ccle) y el atlas de proteínas humanas (https://www.proteinatlas.org/).
En una realización preferente, el cáncer/tumor es resistente al tratamiento de gemcitabina y/o citarabina. De esta manera, los cánceres/tumores descritos en otros sitios en la presente memoria como preferentes son preferiblemente cánceres/tumores de aquellos tipos que son resistentes al tratamiento de gemcitabina y/o citarabina. Preferiblemente, el cáncer/tumor resistente a gemcitabina y/o citarabina es cáncer cerebral, preferiblemente glioma, más preferiblemente glioblastoma multiforme.
La proteína O-6-metilguanina-ADN metiltransferasa (MGMT) humana elimina el daño de alquilación en el ADN. La expresión de MGMT convierte a las células de cáncer, tales como las células de glioblastoma, en casi totalmente resistentes a los efectos citotóxicos de la temozolomida, que ejerce su actividad quimioterapéutica del cáncer mediante la mutación de las células tumorales con una intensidad suficiente para matar las células tumorales. La temozolomida funciona mediante alquilación del ADN, causando de esta manera mutaciones.
Tal como se muestra en los presentes Ejemplos, los compuestos de fórmula (IIa) no son mutagénicos en un ensayo de HPRT. De acuerdo con lo anterior, los compuestos de fórmula (IIa) resultan de uso particular en el tratamiento de cánceres en los que se expresa MGMT, preferiblemente en las que se sobreexpresa. De esta manera, los cánceres/tumores descritos en otros sitios en la presente memoria como preferentes son preferiblemente cánceres/tumores de aquellos tipos en los que se expresa MGMT, preferiblemente en los que se sobreexpresa.
La temozolomida (4-metil-5-oxo-2,3,4,6,8-pentabiciclo[4.3.0]nona-2,7,9-trieno-9-carboxamida) es el tratamiento de primera línea para el glioblastoma multiforme y también se utiliza en el tratamiento de algunos otros cánceres cerebrales. Sin embargo, tal como se muestra en los presentes Ejemplos, la temozolomida mata eficazmente menos de la mitad de las líneas celulares de glioblastoma evaluadas, y las líneas celulares resistentes a la temozolomida resultan eficazmente eliminadas por los compuestos de la invención. De esta manera, en una realización preferente, el cáncer/tumor es un cáncer/tumor resistente a la temozolomida.
De esta manera, los cánceres/tumores indicados en otros sitios en la presente memoria como preferentes son preferiblemente cánceres/tumores de aquellos tipos que son resistentes al tratamiento de temozolomida. Preferiblemente, el cáncer/tumor resistente a temozolomida es cáncer cerebral, preferiblemente glioma, más preferiblemente glioblastoma multiforme.
Tal como se muestra en los presentes Ejemplos, las líneas celulares resistentes al 5-fluorouracilo resultan eficazmente eliminadas por los compuestos de la invención. De esta manera, en una realización preferente, el cáncer es un cáncer resistente a fluoropirimidina. De esta manera, los cánceres/tumores indicados en otros sitios de la presente memoria como preferentes son preferiblemente cánceres/tumores de aquellos tipos que son resistentes al tratamiento de fluoropirimidina, preferiblemente el cáncer/tumor resistente a fluoropirimidina es cáncer cerebral, preferiblemente glioma, más preferiblemente glioblastoma multiforme. Preferiblemente, la fluoropirimidina es el 5-fluorouracilo.
Preferiblemente, el cáncer/tumor es resistente al tratamiento tanto de temozolomida como de fluoropirimidina.
El término "resistente" en el contexto de la terapia del cáncer/tumoral presenta un significado claro y bien entendido en la técnica. El término "resistente" se refiere a que el cáncer/tumor no responde positivamente al tratamiento con el agente o agentes anticáncer en cuestión, es decir, que el tratamiento con el agente o agentes anticáncer no reduce, alivia, mejora o elimina el cáncer, o uno o más síntomas del mismo, ni reduce o elimina las células de cáncer dentro del tumor, respecto al cáncer, tumor o síntoma antes del tratamiento. Un cáncer/tumor puede ser resistente al inicio del tratamiento o puede adquirir resistencia durante el tratamiento.
Tal como se ha mencionado anteriormente, en el tratamiento o la prevención del cáncer, el compuesto de fórmula (IIa) puede utilizarse solo u opcionalmente en combinación con agentes anticáncer adicionales, es decir, uno o más. En todos los aspectos y realizaciones de la presente invención, el agente anticáncer adicional puede ser cualquier agente anticáncer adecuado conocido de la técnica. Se conoce o se ha propuesto un amplio abanico de diferentes tipos de agentes para el uso en el tratamiento del cáncer y puede utilizarse cualquiera de ellos con independencia de la naturaleza química o modo de acción.
Los agentes anticáncer incluyen de esta manera moléculas químicas, sean de origen natural, o derivadas o preparadas sintéticamente (p. ej., moléculas químicas pequeñas orgánicas) y moléculas biológicas tales como proteínas y péptidos (p. ej., agentes inmunoterapéuticos, tal como se comenta posteriormente). De esta manera, entre los fármacos anticáncer se incluyen agentes o fármacos quimioterapéuticos, que pueden encontrarse en un amplio abanico de diferentes clases químicas o funcionales, así como anticuerpos o derivados de anticuerpos y otras moléculas biológicas que actúan, por ejemplo, estimulando, activando o potenciando diversos procesos fisiológicos o células en el cuerpo, por ejemplo, respuestas o células inmunitarias y/o antiinflamatorias, etc.
Entre los ejemplos representativos de agentes anticáncer en la clase de "quimioterapia" se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, fludarabina, gemcitabina, capecitabina, metotrexato, taxol, taxotere, mercaptopurina, tioguanina, hidroxiurea, citarabina, ciclofosfamida, ifosfamida, nitrosoureas, complejos de platino, tales como cisplatino, carboplatino y oxaliplatino, mitomicina, dacarbazina, procarbazina, etopósido, tenipósido, camptotecinas, bleomicina, doxorrubicina, idarrubicina, daunorrubicina, dactinomicina, plicamicina, mitoxantrona, L-asparaginasa, epirubicina, 5-fluorouracilo, taxanos, tales como docetaxel y paclitaxel, leucovorina, levamisol, irinotecán, estramustina, etopósido, mostazas nitrogenadas, BCNU, nitrosoureas, tales como carmustina y lomustina, alcaloides vinca, tales como vinblastina, vincristina y vinorelbina, mesilato de imatinib, hexametilmelamina o topotecán.
Entre los agentes anticáncer pueden incluirse inhibidores de quinasa, inhibidores de fosfatasa, inhibidores de ATPasa, tirfostinas, inhibidores de proteasa, herbimicina A, genisteína, erbstatina y lavendustina A.
En una realización, el agente anticáncer puede seleccionarse de entre, aunque sin limitación, uno o una combinación de las clases siguientes de agentes: agentes alquilantes, alcaloides vegetales, inhibidores de ADN topoisomerasa, antifolatos, análogos de pirimidina, análogos de purina, antimetabolitos de ADN, taxanos, podofilotoxina, terapias hormonales, retinoides, fotosensibilizadores o agentes para el uso en terapias fotodinámicas, inhibidores de angiogénesis, agentes antimitóticos, inhibidores de isoprenilación, inhibidores del ciclo celular, actinomicinas, bleomicinas, antraciclinas, inhibidores de MDR e inhibidores de Ca2+-ATPasa.
Pueden seleccionarse agentes anticáncer adicionales de entre, aunque sin limitación, citoquinas, quimioquinas, factores de crecimiento, factores inhibidores del crecimiento, hormonas, receptores solubles, receptores señuelo, anticuerpos monoclonales o policlonales, anticuerpos monoespecíficos, biespecíficos o multiespecíficos, monocuerpos y policuerpos.
Los agentes anticáncer alternativos pueden seleccionarse de entre, aunque sin limitarse a ellos, factores de crecimiento o hematopoyéticos, tales como eritropoyetina o trombopoyetina, y miméticos de factor de crecimiento de los mismos.
En una realización representativa, el fármaco es una molécula pequeña, y más particularmente, un agente quimioterapéutico de molécula pequeña. Puede definirse un agente de molécula pequeña como una molécula con un peso molecular inferior a 2000 Da, más particularmente inferior a 1800, 1500, 1200, 1000, 900, 800 o 700 Da, habitualmente inferior a 1000 Da. Por ejemplo, un agente de molécula pequeña puede presentar un tamaño comprendido en el intervalo de entre 100 y 1000 Da, p. ej., de entre 100 y 800 Da o de entre 300 y 700 Da.
En una realización alternativa, el agente anticáncer adicional es un agente inmunoterapéutico. La inducción de una respuesta inmunitaria para tratar el cáncer se denomina "inmunoterapia" del cáncer. La inmunoterapia puede involucrar, por ejemplo, terapias a base de células, terapias de anticuerpos o terapias de citoquinas. La totalidad de los tres enfoques aprovecha el hecho de que las células de cáncer con frecuencia presentan diferentes marcadores de superficie celular, o antígenos de cáncer, los cuales son detectables por el sistema inmunitario. Dichos antígenos lo más habitual es que sean proteínas, aunque también se incluyen otras moléculas, tales como carbohidratos. Otro ejemplo de inmunoterapia es mediante la inhibición de un punto de comprobación, en el que las proteínas del punto de comprobación son inhibidas. Esto se comenta en mayor detalle posteriormente.
De esta manera, se utiliza la inmunoterapia para provocar que el sistema inmunitario ataque las células de cáncer, y tal como se comenta en mayor detalle posteriormente, diversas moléculas pueden ser la diana de los enfoques basados en la inmunoterapia. Por ejemplo, entre las dianas para la intervención inmunoterapéutica en el cáncer se incluyen las proteínas "CD" ("cúmulo de diferenciación"), tales como CD52, CD30, CD33, CD20, CD152 (también conocido como CTLA4) y CD279 (también conocido como proteína 1 de muerte celular programada, o PD-1, por sus siglas en inglés); factores de crecimiento, tales como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, por sus siglas en inglés); receptores de factor de crecimiento, tales como el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR, por sus siglas en inglés) o el receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2, por sus siglas en inglés); el gen 3 de activación linfocitaria (LAG3, por sus siglas en inglés) y las proteínas de la familia de B7, tales como B7-H3 y B7-H4. Sin embargo, estos son ejemplos meramente representativos y otras moléculas pueden ser dianas para la intervención inmunoterapéutica en el cáncer.
El agente inmunoterapéutico puede ser un péptido, polipéptido o proteína. El agente inmunoterapéutico puede seleccionarse de entre un anticuerpo, una citoquina y un inhibidor de punto de comprobación. Tal como se ha indicado anteriormente, un anticuerpo anticáncer terapéutico puede presentar un abanico de dianas, incluyendo proteínas de punto de comprobación. De esta manera, un anticuerpo puede ser un inhibidor de punto de comprobación.
De esta manera, en un primer ejemplo, el agente inmunoterapéutico es un anticuerpo. El anticuerpo puede seleccionarse de anticuerpos monoclonales o policlonales, anticuerpos monoespecíficos, biespecíficos o multiespecíficos, monocuerpos y policuerpos, o en efecto, de cualquiera de entre muchas moléculas de tipo anticuerpo o derivadas de anticuerpos conocidos actualmente en la técnica. De acuerdo con lo anterior, el término "anticuerpo" se utiliza en sentido general en la presente memoria e incluye cualquiera de estos anticuerpos y cualquier fragmento, derivado o variante de anticuerpo tal como es conocido de la técnica. El anticuerpo puede ser de cualquier especie, clase o subtipo conveniente o deseado. Además, el anticuerpo puede ser natural, derivatizado o sintético.
Por consiguiente, el anticuerpo puede ser:
(a) cualquiera de las diversas clases o subclases de inmunoglobulina, p. ej., IgG, IgA, IgM, IgD o IgE derivada de cualquier animal, p. ej., cualquiera de los animales utilizados convencionalmente, p. ej., ovejas, conejos, cabras o ratones, o yema de hueco;
(b) anticuerpos monoclonales o policlonales;
(c) anticuerpos intactos o fragmentos de anticuerpos, monoclonales o policlonales, siendo los fragmentos aquellos que contienen la zona de unión del anticuerpo, p. ej., fragmentos sin la parte Fc (p. ej., Fab, Fab', F(ab')2, Fv), los fragmentos denominados "de media molécula" obtenidos mediante corte reductor de los enlaces disulfuro que conectan los componentes de cadena pesada en el anticuerpo intacto. Fv puede definirse como un fragmento que contiene la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada expresadas como dos cadenas;
(d) anticuerpos producidos o modificados mediante ADN recombinante u otras técnicas sintéticas, incluyendo anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos o producidos sintéticamente o estructuras de tipo anticuerpo alteradas.
También se encuentran incluidos los derivados funcionales o "equivalentes" de anticuerpos, p. ej., anticuerpos de cadena sencilla. Puede definirse un anticuerpo de una sola cadena como una molécula manipulada genéticamente que contiene la región variable de la cadena ligera, la región variable de la cadena pesada, unidas mediante un conector polipeptídico adecuado en forma de una molécula de una sola cadena fusionada. Los métodos para producir anticuerpos y los fragmentos y derivados de los anticuerpos son bien conocidos de la técnica.
En una realización preferente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
En muchos casos, los anticuerpos monoclonales son anticuerpos sin modificación, y la mayoría de los anticuerpos terapéuticos utilizados actualmente se encuentran en esta categoría. Sin embargo, en una realización de la presente invención, el anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, se conjuga o se fusiona con una molécula adicional más, por ejemplo, una sustancia tóxica o una sustancia radioactiva. De esta manera, los anticuerpos conjugados o fusionados se unen a otra molécula, que es tóxica para las células (p. ej., un fármaco) o radioactiva. El anticuerpo se une a antígenos específicos sobre la superficie de las células de cáncer y dirige la toxina o radiación al tumor.
Entre los anticuerpos conocidos y aprobados se incluyen: alemtuzumab, bevacizumab, brentuximab vedotina, cetuximab, gemtuzumab ozogamicina, ibritumomab tiuxetán, ipilimumab, ofatumumab, panitumumab, rituximab, tositumomab y trastuzumab.
En un segundo ejemplo, el agente inmunoterapéutico es una citoquina. Entre las citoquinas se incluyen agentes inmunomoduladores, tales como interleuquinas (IL) e interferones (IFN) y también factores estimulantes de colonias, factores de necrosis tumoral (TNF) y otras moléculas reguladoras. Las citoquinas se han clasificado como linfoquinas, interleuquinas y quimioquinas, basándose en su función, células secretoras o diana de acción. Cada citoquina presenta un receptor de superficie celular coincidente, que inicia cascadas de señalización intracelular que alteran las funciones celulares. En el contexto del cáncer, muchos tipos celulares presentes dentro de un tumor producen citoquinas. Las citoquinas son bien conocidas de la técnica y la totalidad de dichas citoquinas están comprendidas para el uso según la invención. De esta manera, en una realización, el agente inmunoterapéutico es una citoquina. En una forma de realización preferente, la citoquina es una interleuquina o un interferón.
Las interleuquinas son un grupo de citoquinas con un amplio abanico de efectos sobre el sistema inmunitario. Son ejemplos de interleuquinas (IL) IL-1, IL-2, IL-3, IL-4,<i>L-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15 e IL-17.
Los interferones son citoquinas producidas por el sistema inmunitario habitualmente implicado en la respuesta antivírica, aunque también presentan utilidad en el tratamiento del cáncer. Existen tres grupos de interferones (IFN): de tipo 1 (IFNa e IFNp), tipo 2 (IFN<y>) y el identificado hace relativamente poco de tipo III (IFNA).
Pueden utilizarse en la presente invención todas las formas conocidas de las citoquinas anteriormente comentadas, incluyendo también variantes, derivados y fragmentos de las mismas funcionalmente equivalentes. De esta manera, el término "citoquina" tal como se utiliza en la presente memoria incluye variantes de secuencia de aminoácidos de polipéptidos citoquina conocidos, y fragmentos de un polipéptido citoquina, o derivados de los mismos, con la condición de que dichos fragmentos, variantes o derivados son activos, o "funcionales", es decir, conservan por lo menos una función o actividad (p. ej., actividad biológica) de la citoquina relevante. La citoquina puede ser un polipéptido recombinante, un polipéptido sintético o puede aislarse a partir de una fuente natural. Las citoquinas adecuadas se encuentran disponibles comercialmente y serán conocidas por el experto en la materia, por ejemplo, las citoquinas humanas se encuentran disponibles de GenScript (Piscataway, NJ, EE. UU.).
En un tercer ejemplo, el agente inmunoterapéutico es un agente con diana en un punto de comprobación inmunitaria, es decir, un inhibidor de punto de comprobación. Las proteínas de punto de comprobación mantienen el control del sistema inmunitario al indicar a este, qué células son sanas y qué células deben destruirse. Las proteínas de punto de comprobación actúan como un "freno" del sistema inmunitario mediante la prevención de la activación de las células T. Si una célula no dispone de suficientes proteínas de punto de comprobación sobre su superficie, puede resultar destruida por el sistema inmunitario. En el caso de las células de cáncer, aunque puede haber moléculas que señalicen que la célula es cancerosa, si existen suficientes proteínas de punto de comprobación sobre la superficie celular, la célula podría evitar la respuesta inmunitaria, y se ha conjeturado que las proteínas de punto de comprobación contribuyen a la falta de éxito en algunas inmunoterapias del cáncer.
Se conocen varios inhibidores de punto de comprobación y pueden utilizarse en la presente invención, por ejemplo, los inhibidores descritos en Creelan (2014) Cancer Control 21:80-89.
Entre los ejemplos de inhibidores de punto de comprobación se incluyen: tremelimumab (CP-675,206); Ipilimumab (MDX-010); nivolumab (BMS-936558); MK-3475 (anteriormente lambrolizumab); urelumab (BMS-663513); anticuerpo monoclonal anti-LAG-3 (BMS-986016) y bavituximab (3G4 quimérico). Pueden utilizarse la totalidad de dichos inhibidores de punto de comprobación en la presente invención.
Una opción alternativa de la inmunoterapia se refiere a terapias de células inmunitarias, y la presente invención también puede utilizarse en combinación con dichas terapias, por ejemplo, la transferencia de células adoptivas. Se han desarrollado varias terapias a base de linfocitos T para el tratamiento del cáncer, y estos tratamientos, conocidos como transferencia de células adoptivas (TCA), se han vuelto cada vez más atractivos durante los últimos años. Hasta el momento se han explotado tres estrategias principales de la TCA. La primera de ellas, y la más desarrollada, implica el aislamiento de los linfocitos T reactivos con tumores propios del/de la paciente respecto de sitios periféricos o tumorales (conocidos como linfocitos infiltrantes de tumores (LIT)). Estas células se expandenex vivoy se inyectan nuevamente en el/la paciente.
Se encuentran disponibles dos terapias alternativas, que implican la modificación de los propios linfocitos T del/de la paciente con receptores capaces de reconocer un tumor. En una opción, pueden aislarse y caracterizarse los TcR con actividad hacia un antígeno de cáncer y puede insertarse un gen codificante de TcR en los linfocitos T e inyectarse nuevamente en el/la paciente. Se ha mostrado que dicha terapia encoge los tumores sólidos en algunos/as pacientes, aunque se asocia a una desventaja significativa: los TcR utilizados deben ser compatibles con el tipo inmunitario del/de la paciente. De acuerdo con lo anterior, como alternativa a el uso de TcR, también se han propuesto terapias que implican la expresión de receptores de antígeno quimérico (CAR, por sus siglas en inglés) en los linfocitos T. Los CAR son proteínas de fusión que comprenden un anticuerpo unido al dominio de señalización del complejo TcR y pueden utilizarse para dirigir los linfocitos T contra un tumor en el caso de que se seleccione un anticuerpo adecuado. Al contrario que los TCR, los CAR no necesitan ser compatibles con el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC, por sus siglas en inglés) del/de la receptor/a.
Alternativamente, la célula puede ser una célula asesina natural (NK, por sus siglas en inglés), que opcionalmente puede modificarse para expresar un CAR.
De esta manera, según la presente invención, el agente inmunoterapéutico puede ser una célula, particularmente una célula inmunitaria, tal como un linfocito, particularmente un linfocito T o célula NK, tal como se ha indicado anteriormente, p. ej., el linfocito T puede ser un LIT o puede modificarse para expresar un TcR o CAR. El NK puede modificarse para expresar un CAR.
Una opción alternativa para el agente anticáncer adicional es un microARN (miARN). Los microARN son moléculas de ARN no codificantes pequeñas (que contienen aproximadamente 22 nucleótidos) que se encuentran en plantas, animales y en algunos virus, que actúan en el silenciamiento del ARN y la regulación post-transcripcional de la expresión génica. Los miARN funcionan mediante apareamiento de bases con secuencias complementarias dentro de las moléculas de ARNm. Como resultado, dichas moléculas de ARNm se silencian mediante el corte de la cadena de ARNm en dos trozos, la desestabilización del ARNm mediante acortamiento de su cola de poli(A) o una traducción menos eficiente del ARNm en proteínas. Los miARN son similares a los siARN mencionados anteriormente, excepto que los miARN se derivan de regiones de los transcritos de ARN que se pliegan sobre sí mismas para formar horquillas cortas, mientras que los ARNip derivan de regiones más largas de ARN de doble cadena. Se ha encontrado que muchos miARN están asociados a diversos tipos de cáncer y por lo tanto en ocasiones se denominan "oncomirs".
Los microARN pueden utilizarse en terapéuticos oncológicos basados en microARN en el tratamiento del cáncer. La justificación del desarrollo de terapéuticos de miARN se basa en la premisa de que los miARN expresados aberrantemente desempeñan un papel clave en el desarrollo de los cánceres, y que la correlación de estas deficiencias del miARN mediante antagonización o restauración de la función del miARN podría proporcionar una ventaja terapéutica, p. ej., mediante terapia de sustitución del miARN.
Puede utilizarse cualquier miARN adecuado como el agente anticáncer adicional según la presente invención. El miARN puede encontrarse en forma libre, es decir, no unido a otra molécula. Alternativamente, el miARN puede conjugarse o unirse a otra molécula, p. ej., un anticuerpo tal como se comenta en la presente memoria.
Lo más preferiblemente, el agente anticáncer adicional se selecciona del grupo que consiste en temozolomida, 5-fluorouracilo, gemcitabina, citarabina y gliadel (RTM). Preferiblemente, el agente anticáncer adicional es temozolomida. Preferiblemente, el agente anticáncer adicional es 5-fluorouracilo. Preferiblemente, el agente anticáncer adicional es gemcitabina. Preferiblemente, el agente anticáncer adicional es citarabina. Preferiblemente, el agente anticáncer adicional es gliadel (RTM).
El compuesto de fórmula (Ila) y el agente anticáncer adicional pueden utilizarse según la presente invención en la forma de una composición, es decir, una composición farmacéutica. La presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (IIa) y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, que opcionalmente comprende, además, un agente anticáncer adicional.
El producto (particularmente un producto farmacéutico) que comprende un compuesto de fórmula (IIa) y uno o más agentes anticáncer adicionales (es decir, un segundo o más adicionales) puede ser una preparación combinada para el uso separado, secuencial o simultáneo en el tratamiento o la prevención del cáncer (es decir, de un tumor) o puede ser un producto en el que el compuesto de fórmula (IIa) se coformula con un agente anticáncer adicional.
De esta manera, el compuesto de fórmula (IIa) y el agente anticáncer adicional pueden formularse juntos en una única composición o en composiciones separadas para la administración por separado. Lo anterior dependerá de la naturaleza del agente anticáncer adicional y su modo seleccionado o requerido de administración.
Las composiciones para el uso en la invención pueden formularse de cualquier manera conveniente según técnicas y procedimientos conocidos de la técnica farmacéutica, p. ej., utilizando uno o más diluyentes, portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables. Dichas formulaciones pueden ser para uso farmacéutico o veterinario. Los diluyentes, excipientes y portadores adecuados para el uso en dichas formulaciones son conocidos por el experto en la materia.
La expresión "farmacéuticamente aceptable" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a ingredientes que son compatibles con otros ingredientes de las composiciones, así como fisiológicamente aceptables para el receptor. La naturaleza de las composiciones y portadores o materiales excipientes, dosis, etc., pueden seleccionarse de manera habitual según la elección y vía de administración deseada, el objetivo del tratamiento, etc.
De esta manera, "farmacéuticamente" o "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción adversa, alérgica u otra reacción no deseada al administrarlas en un mamífero, especialmente un ser humano, según proceda. Un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable se refiere a un agente de carga, diluyente, material de encapsulación o auxiliar de formulación de cualquier tipo sólido, semisólido o líquido no tóxico.
Las composiciones farmacéuticas contienen vehículos que son farmacéuticamente aceptables para la formulación. Estos pueden, en particular, ser soluciones salinas isotónicas y estériles (fosfato monosódico o disódico, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio, y similares, o mezclas de dichas sales) o composiciones liofilizadas secas que tras la adición, según el caso, de agua esterilizada o solución salina fisiológica, permiten la administración de soluciones.
Los compuestos de la invención pueden presentarse en las formas farmacológicas convencionales de administración, tales como comprimidos, comprimidos recubiertos, esprays nasales, soluciones, emulsiones, liposomas, polvos, cápsulas o formas de liberación sostenida. Los excipientes farmacéuticos convencionales, así como los métodos habituales de producción pueden utilizarse para la preparación de dichas formas.
Para preparar composiciones farmacéuticas, puede disolverse o dispersarse una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula (IIa) o un fármaco anticáncer adicional según la invención en un portador o medio acuoso farmacéuticamente aceptable. Las composiciones pueden comprender cualquier portador, diluyente o excipiente conocido. Por ejemplo, las formulaciones que resultan adecuadas para la administración parenteral convenientemente comprenden soluciones y/o suspensiones acuosas estériles de ingredientes farmacéuticamente activos, preferiblemente preparados para que sean isotónicos con la sangre del receptor, generalmente utilizando cloruro sódico, glicerina, glucosa, manitol, sorbitol y similares.
Entre los excipientes que pueden incluirse en cualquier composición farmacéutica se incluyen conservantes (tales como p-hidroxibenzoatos), agentes quelantes (tales como EDTA), agentes estabilizadores, agentes de ajuste de la tonicidad, agentes antimicrobianos, agentes floculantes/de suspensión, agentes humectantes, solventes y sistemas de solventes, antioxidantes y agentes tamponadores, entre otros. Se encuentra comprendido dentro de las competencias del experto ordinario en la materia seleccionar y optimizar dichos excipientes y sus cantidades al formular una composición farmacéutica para un objetivo deseado particular.
Las composiciones preferiblemente se presentan en forma de soluciones acuosas. Dichas soluciones se preparan de acuerdo con métodos conocidos de la técnica y a continuación se utilizan para llenar viales o ampollas para inyección.
La forma de las composiciones farmacéuticas., la vía de administración, la dosis y la posología dependen naturalmente del a naturaleza del cáncer que debe tratarse, de la gravedad de la enfermedad, de la edad, peso y sexo del paciente, etc., o alternativamente, de la duración deseada de tratamiento.
El tratamiento implica la administración de un compuesto de fórmula (IIa), opcionalmente con un agente anticáncer adicional.
Los compuestos de fórmula (IIa) para el uso según la presente invención pueden administrarse en el sujeto por cualquier vía apropiada. Lo mismo se aplica a composiciones o formulaciones que comprenden los compuestos de fórmula (IIa).
Los compuestos de fórmula (IIa), y por lo tanto, las composiciones y formulaciones que los comprenden, pueden presentarse, por ejemplo, en una forma adecuada para la administración oral, nasal, parenteral, intravenosa, tópica, rectal o intratecal. Preferiblemente, los compuestos se presentan en una forma adecuada para la administración sistémica (p. ej., intravenosa).
Puede utilizarse cualquier modo de administración común o estándar de la técnica, p. ej., inyección, infusión, administración tópica, inhalación, administración transdérmica, en superficies corporales tanto internas como externas, etc., mediante cualquier método adecuado conocido de las técnicas médicas. De esta manera, entre los modos de administración se incluyen la administración oral, nasal, entérica, rectal, vaginal, transmucosal, tópica o parenteral, o mediante inhalación. La administración puede ser directa en el tumor (administración intratumoral).
La administración oral o parenteral resulta preferente. Los medios de administración parenteral preferentes son la administración intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intracraneal y subcutánea, y la administración en el líquido cefalorraquídeo (administración intratecal). Más preferiblemente, la administración es intraperitoneal o intravenosa; lo más preferiblemente, la administración es intravenosa.
Preferiblemente, la administración es oral o intravenosa.
La administración intravenosa puede ser la inyección intravenosa o la infusión intravenosa; lo más preferiblemente, es infusión intravenosa (p. ej., mediante bomba de infusión).
El compuesto de fórmula (IIa) y el agente anticáncer adicional pueden administrarse por la misma vía o por vías diferentes.
Tal como se ha indicado anteriormente, el compuesto de fórmula (IIa) y el agente anticáncer adicional puede administrarse simultánea, separada o secuencialmente. En una realización preferente, el compuesto de fórmula (IIa) y el agente anticáncer adicional se administran secuencialmente, p. ej., en tiempos separados, es decir, no juntos en la misma composición. En una realización alternativa, el compuesto de fórmula (IIa) y agente anticáncer adicional se administran juntos simultáneamente, por ejemplo, en la misma composición o en composiciones separadas. Los tiempos de las administraciones separadas pueden determinarse de acuerdo con el compuesto particular de fórmula (IIa) o el agente anticáncer adicional particular, las formulaciones y/o modos de administración utilizados. De esta manera, el compuesto de fórmula (IIa) puede administrarse antes o después del agente anticáncer adicional.
Por ejemplo, el agente anticáncer adicional puede administrarse en primer lugar y el compuesto de fórmula (IIa) puede administrarse en un intervalo de tiempo adecuado posteriormente para concordar con el tiempo óptimo de administración del agente anticáncer adicional en el sitio diana, o viceversa. Dichas determinaciones se encuentran totalmente comprendidas en los conocimientos rutinarios del médico clínico. De esta manera, por ejemplo, el compuesto de fórmula (IIa) puede administrarse preferiblemente por vía parenteral, más preferiblemente por vía intravenosa por lo menos o hasta 20, 30, 40, 50, 60, 70 o 90 minutos, o 2, 3, 4, 5 o 6 horas antes o después del agente anticáncer adicional.
Las dosis y posologías pueden determinarse de una manera rutinaria y pueden depender de la naturaleza de la molécula, el objetivo del tratamiento, la edad del/de la paciente, el modo de administración, etc. Puede combinarse cualquier agente terapéutico de la invención tal como se ha indicado anteriormente, con excipientes farmacéuticamente aceptables para formar composiciones terapéuticas. Una dosis se refiere a una cantidad especificada de medicamento que se administra de una vez, es decir, los términos "dosis única" y dosis se utilizan intercambiablemente. Un curso de tratamiento puede comprender múltiples dosis, es decir, múltiples dosis individuales, a lo largo de un periodo de tiempo.
Preferiblemente se administra una cantidad eficaz del compuesto de fórmula (IIa) y el agente anticáncer adicional opcional, en caso de estar presente. En otras palabras, una dosis preferiblemente comprende una cantidad eficaz del compuesto de fórmula (IIa) y el agente anticáncer adicional opcional, en caso de estar presente.
Tal como se muestra en los Ejemplos, los compuestos de fórmula (Ila) resultan tolerados a dosis altas en comparación con la dosis requerida para matar un tumor. Dicha propiedad difiere de muchos compuestos quimioterapéuticos; en efecto, los compuestos más quimioterapéuticos presentan efectos secundarios sustanciales a la dosis requerida para matar el cáncer. Los presentes Ejemplos indican que, ventajosamente, pueden administrarse los compuestos de fórmula (IIa) a dosis claramente en exceso de la dosis necesaria para matar el tumor.
Tal como se muestra en los Ejemplos, los ratones toleraron dosis individuales de los compuestos de fórmula (IIa) de 300 mg/kg y 2000 mg/kg, pero no toleraron una dosis única de 8000 mg/kg. Estos datos sugieren que en ratones la dosis máxima tolerada de los compuestos de fórmula (IIa) es de por lo menos 2000 mg/kg, aunque inferior a 8000 mg/kg. La conversión de dosis en ratón a dosis humana es un factor de 0,081 (Nair et al., (2016) Basic Clin. Pharm. 7(2): 27-31. Por lo tanto, los datos en los Ejemplos indican que en seres humanos la dosis máxima tolerada de los compuestos de fórmula (IIa) es de por lo menos 162 mg/kg, aunque inferior a 648 mg/kg.
De esta manera, preferiblemente, el compuesto de fórmula (IIa) se administra a una dosis <405 mg/kg, preferiblemente <324 mg/kg, más preferiblemente <243 mg/kg, más preferiblemente <162 mg/kg, más preferiblemente <81 mg/kg, más preferiblemente <40,5 mg/kg, más preferiblemente <24,3 mg/kg.
Preferiblemente, el compuesto de fórmula (IIa) se administra a una dosis de por lo menos 10 mg/kg, más preferiblemente de por lo menos 20 mg/kg, más preferiblemente de por lo menos 30 mg/kg, más preferiblemente de por lo menos 40 mg/kg, más preferiblemente de por lo menos 500 mg/kg, más preferiblemente de por lo menos 100 mg/kg.
Preferiblemente, el compuesto de fórmula (IIa) se administra a una dosis de entre 10 mg/kg y 405 mg/kg, preferiblemente de entre 20 mg/kg y 324 mg/kg, más preferiblemente de entre 20 mg/kg y 243 mg/kg, más preferiblemente de entre 30 mg/kg y 162 mg/kg, más preferiblemente de entre 40 mg/kg y 81 mg/kg.
Estas dosis son dosis preferentes para sujetos humanos.
Las dosis y posologías pueden modificarse basándose en parámetros tales como la edad, peso, condición y sexo del/de la sujeto, el objetivo del tratamiento, la enfermedad bajo tratamiento, la edad y/o la condición del/de la paciente, el modo de administración, etc.
Las dosis y posologías apropiadas pueden establecerse fácilmente. Pueden prepararse fácilmente las unidades de dosis apropiadas. Las posologías pueden determinarse de una manera habitual.
El tratamiento puede comprender una única administración del compuesto de fórmula (IIa), opcionalmente con un agente anticáncer adicional, o puede comprender administraciones repetidas del compuesto de fórmula (IIa), opcionalmente con un agente anticáncer adicional. La posología del compuesto de fórmula (IIa) y el agente anticáncer adicional, en caso de estar presente, no es necesario que sean iguales. Alternativamente, el tratamiento puede comprender una única administración del compuesto de fórmula (IIa) y administraciones repetidas del agente anticáncer adicional, o viceversa.
Preferiblemente, el compuesto de fórmula (IIa) se administra, preferiblemente a cualquiera de las dosis anteriormente indicadas, cada 1,2, 3, 4, 5 o 6 días, más preferiblemente cada 2, 3 o 4 días, más preferiblemente cada 3 días hasta un total de 2 a 10, más preferiblemente 3 a 8, más preferiblemente 4 a 6, más preferiblemente 5 administraciones.
Sin embargo, se encontrará comprendido dentro de las competencias del experto ordinario en la materia determinar la posología apropiada y las dosis relevantes en la misma, basándose en la naturaleza del compuesto, el objetivo del tratamiento, la enfermedad bajo tratamiento y/o la condición del paciente, el modo de administración, etc.
La presente invención proporciona, además, un producto o kit que comprende un compuesto de fórmula (IIa) y un agente anticáncer adicional. El kit o producto puede utilizarse en cualquiera de los usos o métodos indicados en la presente memoria, es decir, para el uso en el tratamiento o la prevención del cáncer. Particularmente, el kit o producto es para el uso simultáneo, separado o secuencial. Preferiblemente, el compuesto de fórmula (IIa), y opcionalmente, además, el agente anticáncer adicional, se formula para la administración parenteral, preferiblemente la administración i.v.
Cada componente de los kits de la presente invención (es decir, cada agente anticáncer) puede proporcionarse en un compartimiento o recipiente separado. En el caso en que resulte conveniente y práctico, pueden proporcionarse mezclas de componentes. Los componentes pueden proporcionarse en forma seca, p. ej., cristalizados, secos por congelación o liofilizados, o en solución, habitualmente dichas composiciones líquidas serán acuosas y tamponadas con un tampón estándar, tal como Tris, HEPES, etc.
Preferiblemente, los kits se utilizan en el tratamiento del cáncer, p. ej., para el uso en los métodos o usos de la presente invención, tal como se indica en la presente memoria.
Los compuestos de la invención (es decir, los compuestos de fórmulas (IIa), (IIIa), (IIIc), (IVa), y (IVe) se encuentran disponibles comercialmente, se conocen de la literatura o pueden obtenerse mediante procedimientos sintéticos convencionales, de acuerdo con técnicas estándares, a partir de materiales de partida disponibles utilizando reactivos y condiciones de reacción apropiados. A este respecto, el experto en la materia puede hacer referencia, entre otros, a "Comprehensive Organic Synthesis", de B. M. Trost y I. Fleming, Pergamon Press, 1991, y "Protective Groups in Organic Synthesis", 3a edición, T.W. Greene y P.G.M. Wutz, Wiley-Interscience (1999).
Los compuestos de la invención se encuentran disponibles comercialmente, por ejemplo, de Berry and Associates, Toronto Research Chemicals, Sigma Aldrich, Carbosynth, Trilink Biotech y otros proveedores comerciales bien conocidos.
A continuación, se describe la invención en mayor detalle en referencia a los ejemplos no limitativos siguientes, en loS que:
La figura 1 muestra que la 5-formil-2'-desoxicitidina y la 5-hidroximetilcitidina resultan bien toleradas en ratones y reducen los tumores de glioblastoma multiforme humano en modelos de xenoinjerto de ratón. Fig.1 A: protocolo de administración de dosis máxima tolerada única. Los ratones recibieron la administración de una sola inyección intraperitoneal a la dosis indicada. Si todos los ratones en el grupo relevante toleraban la dosis indicada, se escaló la dosis tal como se indica.
Fig. 1B: se midió el peso corporal de los ratones en el punto temporal indicado después de la inyección intraperitoneal en los ratones con la dosis indicada y el compuesto indicado cada tres días hasta un total de cinco dosis.
Figs. 1C-H: se implantaron células U87-MG en el flanco de 32 ratones inmunodeficientes. Una vez los tumores habían alcanzado 129 a 131 mm3, los ratones fueron divididos en cuatro grupos de 8 ratones. El grupo de control negativo se trató con el vehículo; el grupo de control positivo se trató con 40 mg/kg de temozolomida una vez al día durante cinco días; los grupos de tratamiento se trataron con 2000 mg/kg de 5-formil-2'-desoxicitidina o 2000 mg/kg de 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina una vez cada tres días hasta un total de cinco dosis. Se midieron los volúmenes tumorales cada tres días (fig. 1C) y se midió el peso corporal de los ratones cada tres días (fig. 1D). Al completar el estudio se calculó el porcentaje de inhibición del crecimiento tumoral (ICT(%)) (fig. 1E); se resecaron los tumores, se fotografiaron (fig. 1F), se midieron (fig. 1G) y se realizaron secciones y se tiñeron con hematoxilina y eosina (fig. 1H).
La figura 2 muestra que la 5-formil-2'-desoxicitidina y la 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina matal el glioblastoma multiforme mediante un mecanismo no relacionado con los análogos de nucleótido actuales:
Fig. 2A: citometría de flujo de las células tratadas con 5-formil-2'-desoxicitidina y 5'-hidroximetil-2'-desoxicitidina, teñidas con anexina-V y 7AAD.
Fig.2B: curvas de supervivencia de células HeLa tratadas con una titulación de 5-formilcitosina, 5-formilcitidina o 5-formil-2'-desoxicitidina.
Fig.2C: curvas de supervivencia de células U87-MG tratadas con una titulación de 5-hidroximetilcitosina, 5-hidroximetilcitidina o 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina.
La figura 3 muestra la cuantificación de mutaciones en el gen de la hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (HPRT) inducidas por 5-formil-2'-desoxicitidina y 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina en células de mamífero. Se mostró que la 5-formil-2'-desoxicitidina y la 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina no eran mutagénicas.
La figura 4 muestra el nivel de citotoxicidad (% de supervivencia) de 5-formil-2'-desoxicitidina, 5-formilcitidina y 5-cloro-2'-desoxicitidina para las células HeLa tras tres días de tratamiento.
La figura 5 muestra el nivel de citotoxicidad (% de supervivencia) de 5-formil-2'-desoxicitidina (d5fC), 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina (d5hmC), 5-cloro-2'-desoxicitidina (5CldC), 5-bromo-2'-desoxitidina (5BrdC), 5-yodo-2'-desoxicitidina (5IdC) y timidina vs. las células U87-MG.
La figura 6 muestra que los efectos citotóxicos (% de supervivencia) de 5-formil-2'-desoxicitidina y 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina no resultan rescatados por la adición de timidina a las células U87-MG, indicando que 5-formil-2'-desoxicitidina y 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina no actúan mediante inhibición de la timidina sintasa.
La figura 7 muestra los efectos citotóxicos (% de supervivencia) de 5-formil-2'-desoxicitidina en combinación con temozolomida en células U87-MG.
La figura 8 muestra los efectos citotóxicos (% de supervivencia) de 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina en combinación con temozolomida en células U87-MG.
La figura 9 muestra los efectos citotóxicos de 5-metoximetil-2'-desoxiuridina y 5-acetoximetil-2'-desoxiuridina sobre las células U87-MG. Tratamiento durante 72 h. La supervivencia se cuantificó utilizando un ensayo de MTT.
La figura 10 muestra el % de supervivencia de diversas células tras el tratamiento con d5fCTP o d5hmCTP.
Fig.10A: % de supervivencia de HeLa tras el tratamiento con 5-formil-2'-desoxicitidín-5'-trifosfato (d5fCTP) durante 72 h. Se cuantificó la supervivencia utilizando un ensayo de MTT.
Fig.10B: % de supervivencia de células U87-MG (Glioma, grado IV) tras el tratamiento con 5-formil-2'-desoxicitidina-5'-trifosfato o 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina-5'-trifosfato durante 72 horas. La supervivencia se cuantificó utilizando un ensayo de MTT.
La figura 11 muestra los niveles de expresión de CDA en diversas líneas celulares. Los valores son niveles de expresión de CDA normalizados mediante Log2. Los niveles de expresión se determinaron utilizando la plataforma de matriz Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 y la base de datos Genevestigator (https://genevestigator.com/gv/).
La figura 12 muestra los niveles lineales de expresión de CDA en diversas líneas celulares. Los niveles de expresión se determinaron utilizando la plataforma de matriz Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 y la base de datos Genevestigator (https://genevestigator.com/gv/).
Las figuras 13A y 13B muestran los niveles de expresión de CDA en diversos tumores cerebrales humanos. Los valores son niveles de expresión de CDA normalizados mediante Log2. Los niveles de expresión se determinaron utilizando la plataforma de matriz Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 y la base de datos Genevestigator (https://genevestigator.com/gv/).
Las figuras 14A y 14B muestran los niveles de expresión de CDA en diversos tumores cerebrales humanos. Los niveles de expresión se determinaron utilizando la plataforma de matriz Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 y la base de datos GENEVESTIGATOR® (https://genevestigator.com/gv/).
La figura 15 muestra los resultados de un ensayo de PAMPA que demuestra que 2d5hmC y 2d5fC pueden pasar la barrera hematoencefálica.
Ejemplos
Materiales y métodos
Animales
Todos los aspectos del presente trabajo, incluyendo las jaulas, experimentación y gestión de los animales se llevaron a cabo en general de acuerdo con "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" [Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio]: octava edición (National Academy Press, Washington, D. C., 2011) en unas instalaciones de animales de laboratorio acreditadas por AAALAC. El protocolo de cuidado y uso de los animales fue revisado y aprobado por la IACUC para Pharmacology Discovery Services Taiwan, Ltd.
Cultivos celulares
Se cultivaron células madre neurales de glioma (CMNG) primario (G7, G14, G144 y G166) en placas recubiertas con poli-D-lisina (Merck Millipore, n.° de cat. A-003-E) y laminina (R&D Systems, n.° de cat. 3446-005-01) en medio para células madre neurales (DMEM-F12 al 50 % (Thermofisher, n.° de cat. 21041025), medio neurobasal al 50 % (Thermofisher, nl.° de cat. 10888-022), suplementos N2 (Life Technologies, n.° de cat. A-003-E) y B27 (Life Technologies, n. ° de cat. 12587010), piruvato sódico 1 mM (Life Technologies, n. ° de cat.
11360-039), Glutamax 2 mM (Life Technologies, n. ° de cat. 35050038), HEPES 1 mM (Fisher Scientific, n. ° cat. BP299-1), p-mercaptoetanol 0,1 mM (Life Technologies, n.° de cat. 31350010), 1x aminoácidos no esenciales (Life Technologies, n.° de cat. 11140-035), albúmina de suero bovino al 0,006 % (Sigma, n.° de cat. A8577-10ML), 4 gg/ml de heparina (Sigma, n.° de cat. H3149-25KU), 100 U/ml de penicilina, 100 gg/ml de estreptomicina, 20 ng/ml de hEGF (R&D Systems, n.° de cat. 236-EG-200), 10 ng/ml de bFGF (Peprotech, n.° de cat. 100-18B).
Se cultivaron HCT116 en medio de McCoy 5a modificado (Life Technologies, n.° de cat. 36600021) complementado con suero de feto bovino al 10 % y 100 U/ml de penicilina y 100 U/ml de estreptomicina. Se cultivaron Arpe 19 en medio DMEM:F12 (Life Technologies, 21331-020) complementado con suero de feto bovino al 10 % y 100 U/ml de penicilina y 100 U/ml de estreptomicina.
Se cultivaron HAP1 en IMDM (Gibco, n.° de cat. 12440-05) complementado con suero de feto bovino al 10 %, 100 U/ml de penicilina y 100 U/ml de estreptomicina.
Las líneas celulares no mencionadas anteriormente se cultivaron en DMEM (Sigma, n.° de cat. D6429) complementado con suero de feto bovino al 10 %, 100 U/ml de penicilina y 100 U/ml de estreptomicina. Todas las células se mantuvieron en un incubador con camisa de agua humidificado y con 5 % de CO2 a 37 °C. Las células se cultivaron hasta una confluencia de entre 70 % y 90 %.
Fármacos
Los compuestos utilizados en los presentes Ejemplos se obtuvieron de la manera siguiente (n.° de CAT=número de catálogo).
Ensayo de supervivencia
En una placa de 96 pocillos, se sembraron 4000 células en 100 gl de medio correspondiente. Al día siguiente, se añadieron fármacos, diluidos en DMSO, a 8 concentraciones por triplicado. Se añadieron los fármacos en forma de una serie de dilución de 4 veces partiendo de 100 gM. Las células se incubaron con los fármacos durante 72 horas. Se evaluó la proliferación celular mediante ensayo de MTT siguiendo el protocolo del fabricante (ATCC n.° de cat. 30-1010K). La supervivencia celular se normalizó respecto a la supervivencia de las células tratadas con solo DMSO. El experimento se llevó a cabo tres veces; los datos representan medias de nueve pocillos ± SEM.
DMT (dosis máxima tolerada)
La 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina y la 5-formil-2'-desoxicitidina (Berry and Associates) se formularon en dimetilsulfóxido (DMSO)/Solutol (rTm ) R HS15/solución salina tamponada con fosfato (PBS) (5/5/90 v/v/v) a concentraciones de 30, 200 y 400 mg/ml para la administración IP de un volumen de dosis de 5 ml/kg. Se utilizó un volumen de dosis de 10 o 20 ml/kg.
Los ratones ICR macho, que pesaban 23 ± 3 g, fueron proporcionados por BioLasco Taiwan (bajo licencia de Charles River Laboratories). Los animales fueron aclimatados durante 3 días antes de su uso y se confirmó que presentaban buena salud. Todos los animales fueron mantenidos en un medio higiénico a temperatura controlada (20 °C a 24 °C), humedad controlada (30 % a 70 %) y ciclos de 12 horas de luz/12 horas de oscuridad. Se dejó libre acceso a dieta de laboratorio estándar esterilizada [MFG (Oriental Yeast Co., Ltd., Japón)] y agua corriente esterilizada en autoclave.
Se administró 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina y 5-formil-2'-desoxicitidina por vía IP en grupos de tres ratones ICR macho que pesaban 23 ± 3 g. Los animales recibieron una dosis inicial de 300 mg/kg. Si los animales sobrevivían 72 horas, se incrementaba la dosis para la siguiente cohorte. Si moría uno o más animales, se reducía la dosis para la siguiente cohorte. Los ensayos pararon cuando todos los animales sobrevivían con el límite superior, o cuando se habían sometido a ensayo tres niveles de dosis, o cuando se había alcanzado el límite superior o el límite inferior. En cada nivel de dosis se observó a los animales para la presencia de síntomas tóxicos agudos (mortalidad, convulsiones, temblores, relajación muscular, sedación, etc.) y efectos autonómicos (diarrea, salivación, lagrimeo, vasodilatación, piloerección, etc.) durante los primeros 30 minutos y nuevamente a 1, 24, 48 y 72 horas. Se registraron los pesos corporales antes de la dosis y a las 72 horas. Se observó a los animales y se registró la mortalidad diariamente después de la administración de compuesto. Se llevó a cabo necropsia gruesa de todos lso animales sin recolección de tejidos y se determinó el siguiente nivel de dosis basándose en la tabla de diseño del estudio.
DMT múltiple
La 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina y la 5-formil-2'-desoxicitidina (Berry and Associates) se formularon en dimetilsulfóxido (DMSO)/Solutol (<r>T<m>) R HS15/solución salina tamponada con fosfato (PBS) (5/5/90 v/v/v) a concentraciones de 15, 50 y 100 mg/ml para la administración IP de un volumen de dosis de 20 ml/kg. Se administraron los compuestos de ensayo cada tres días hasta un total de 5 dosis (q3dx5).
Los ratones ICR macho, que pesaban 23 ± 3 g, fueron proporcionados por BioLasco Taiwan (bajo licencia de Charles River Laboratories). Los animales fueron aclimatados durante 3 días antes de su uso y se confirmó que presentaban buena salud. Todos los animales fueron mantenidos en un medio higiénico a temperatura controlada (20 °C a 24 °C), humedad controlada (30 % a 70 %) y ciclos de 12 horas de luz/12 horas de oscuridad. Se dejó libre acceso a dieta de laboratorio estándar esterilizada [MFG (Oriental Yeast Co., Ltd., Japón)] y agua corriente autoclavada.
Se observó a los animales para la presencia de síntomas tóxicos agudos (mortalidad, convulsiones, temblores, relajación muscular, sedación, etc.) y efectos autonómicos (diarrea, salivación, lagrimeo, vasodilatación, piloerección, etc.) durante los primeros 30 minutos después de cada tratamiento (días 1, 4, 7, 10 y 13) y nuevamente a 1, 24, 48 y 72 horas de la dosis final (día 13). Se registró la mortalidad siguiendo el mismo esquema. Además, se registraron los pesos corporales antes de cada tratamiento y en las 24, 48 y 72 horas posteriores a la administración final. Se llevó a cabo necropsia gruesa de todos los animales sin recolección de tejidos.
Xenoinjertos
Se prepararon soluciones de administración de 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina y 5-formil-2'-desoxicitidina (Berry and Associates) inmediatamente antes de la administración de cada dosis mediante la adición en primer lugar del volumen adecuado de DMSO a compuesto previamente pesado; después se añadieron los volúmenes adecuados de Solutol (RTM) y PBS (DMSO al 5 %/Solutol al 5 % (RTM)/pBS al 90 %). El agente estándar, temozolomida, fue proporcionado por Oslo University Hospital en forma de polvos y se formuló inmediatamente antes de administrar cada dosis añadiendo en primer lugar el volumen apropiado de DMSO a compuesto previamente pesado y añadiendo después los volúmenes apropiados de Solutol (RTM) y PBS (DMSO al 5 %/Solutol al 5 % (RTM)/PBS al 90 %). Se administró 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina y 5-formil-2'-desoxicitidina a un volumen de dosis de 20 ml/kg. Se administró el agente estándar, temozolomida, a un volumen de dosis de 10 ml/kg.
Se obtuvo la línea celular de glioma maligno cerebral humano U87-MG (ATCC n.° HTB-14, glioblastoma epitelial) de la American Type Culture Collection (ATCC). Las células se cultivaron en medio esencial mínimo que contenía suero de feto bovino (FBS) al 5 % a 37 °C con 5 % de CO2 en un incubador.
Se utilizaron ratones desnudos (nu/nu) hembra de 6-7 semanas de edad obtenidos de BioLasco Taiwan (bajo licencia de Charles River Laboratories). Los animales se alojaron en jaulas individualmente ventiladas (IVC, 36 Mini Isolator System). La asignación para 5 animales fue 27x20x14 cm. Todos los animales fueron mantenidos en un medio higiénico bajo temperatura controlada (20 °C a 24 °C) y humedad controlada (entre 30 % y 70 %) con un ciclo luz/oscuridad de 12 horas. Se dejó libre acceso a dieta de laboratorio estándar esterilizada [MFG (Oriental Yeast Co., Ltd., Japón)] y agua corriente autoclavada.
Se implantaron por vía subcutánea (SC) células U87-MG viables (ATCC n.° HTB-14) (5x106 células/ratón en PBS a una dosis de 0,2 ml/ratón) en el flanco derecho de ratones nu/nu hembra. Al alcanzar los volúmenes tumorales medios de grupo aproximadamente 129 a 131 mm3, los ratones con implante tumoral fueron divididos en cuatro grupos de tratamiento, en donde cada grupo contenía ocho animales, y se iniciaron (el inicio se denota "día 1") las administraciones de dosis.
Se administró 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina y 5-formil-2'-desoxicitidina a una dosis de 2000 mg/kg y vehículo correspondiente (DMSO al 5 %/Solutol al 5 % (RTM)/PBS al 90 %) por vía intraperitoneal (IP) una vez cada tres días hasta un total de cinco administraciones. Se administró temozolomida a una dosis de 40 mg/kg por vía oral (PO) una vez al día hasta cinco administraciones en total.
Se realizó un seguimiento del volumen tumoral, el peso corporal, la mortalidad y los signos de toxicidad manifiesta, y se registraron dos veces a la semana durante 29 días. Se estimó el volumen tumoral (mm3) de acuerdo con la fórmula del elipsoide, como: longitud x (anchura)2 x 0,5. Se calculó la inhibición del crecimiento tumoral (T/C) mediante la fórmula siguiente:
% T/C = (Tn/Cn) x 100 %
Cn: peso tumoral medido el día "n" en el grupo de control
Tn: peso tumoral medido el día "n" en el grupo tratado
% de valor T/C <42 % se consideró actividad antitumoral significativa (recuento).
Se calculó además la inhibición del crecimiento tumoral (ICT) mediante la fórmula siguiente:
% ICT= (1 - (Tn/Cn)) x 100 %
% de valor ICT <58 % se consideró actividad antitumoral significativa (recuento).
También se utilizó una ANOVA bidireccional (RTM) seguido de pruebas de Bonferroni para determinar la diferencia estadísticamente significativa en comparación con el grupo de control negativo durante el estudio; días 1 a 29. Se consideró que las diferencias eran estadísticamente significativas con p<0,05 (%).
Tras completar el estudio, se extirparon los tumores de todos los animales en estudio y se obtuvieron fotografías.
Ensayo de HPRT
Se llevó a cabo el ensayo de mutagenicidad de HPRT en células V79. Se trataron 50.000 células V79 con tres concentraciones diferentes de d5hmC o d5fC (1, 10 o 100 pM) durante 24 horas en una placa de 6 pocillos. Se utilizó DMSO como control negativo. Tras el tratamiento, las células se subcultivaron según lo necesario en matraces T75 durante 9 días para permitir la expresión de los mutantes HPRT-. Se sembraron en placa nuevamente 10.000 células en 10 placas Petri de réplica (100x15 mm) con medio selectivo (2,5 pg/ml de 6TG). Se determinó la supervivencia (eficiencia relativa de siembra en placa) mediante la siembra de 200 células en cuatro placas Petri réplicas (60x15 mm) sin medio selectivo. Se fijaron las colonias, se tiñeron con Giemsa y se contaron 7 días después. La frecuencia de mutantes se expresa como número total de mutantes contado en todas las placas dividido por el número de células sembradas corregido para la eficiencia de resiembra en placa. El experimento se llevó a cabo tres veces; los datos representan medias de tres réplicas ± SEM. Citometría de flujo de apoptosis
Se sembraron 100.000 células en una placa de 6 pocillos y se incubaron con 100 pM de temozolomida, 2'-desoxi-5-hidroximetilcitidina, 5-formil-2'-desoxicitidina o DMSO durante 72 horas. La detección de células apoptóticas se evaluó utilizando un kit de detección apoptótica de anexina-V/7-amino-actinomicina D (7-AAD) (Nordic Biosite AS, n.° de cat. 640922) según el protocolo del fabricante.
Se llevó a cabo un análisis de separación celular activada por fluorescencia en un LSR Fortessa (BD Biosciences) y los datos se analizaron en el software FlowJo. Todos los experimentos se llevaron a cabo por triplicado.
Transferencias western
Se llevaron a cabo transferencias western tal como se ha indicado anteriormente (Towbin et al., 1979, Biotechnology, 24, 145-149). Se utilizó antisuero anti-CDA (Abcam, n.° de cat. Ab82346) siguiendo la concentración recomendada por el fabricante. Se cuantificaron las proteínas a partir de la señal generada por la oxidación del luminol por la peroxidasa de rábano picante conjugada con el anticuerpo secundario.
Ejemplo 1: citotoxicidad para las células tumorales
Se trataron células HeLa, cultivadas tal como se ha indicado anteriormente (sección de Materiales y métodos) con 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina y 5-formil-2'-desoxicitidina. T res días de tratamiento con dichos compuestos, se evaluó la supervivencia celular tal como se ha indicado anteriormente (Materiales y métodos). Aunque la supervivencia tras el tratamiento con 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina no difería de la de las células tratadas con DMSO, se encontró inesperadamente que la 5-formil-2'-desoxicitidina era citotóxica para las células HeLa.
Se comparó el efecto citotóxico de la 5-formil-2'-desoxicitidina con dos compuestos citotóxicos bien descritos: 5-fluorouracilo y temozolamida. Se determinó que la 5-formil-2'-desoxicitidina era más citotóxica para las células HeLa (IC50=0,76 pM) que 5-fluorouracilo (IC50>25 pM) y la temozolomida (IC50>25 pM).
Con el conocimiento de que la 5-formil-2'-desoxicitidina es citotóxica para las células de carcinoma cervical (HeLa), se expandió el estudio en dos direcciones: (i) se evaluó un compuesto adicional: la 5-carboxil-2'-desoxicitidina, y (ii) se evaluaron sus efectos citotóxicos contra un amplio abanico de líneas celulares de cáncer humanas (Tabla 1).
Tabla 1: evaluación de 5-formil-2'-desoxicitidina (2d5fC), 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina (2d5hmc) y 5-carboxi-2'-desoxicitidina (2d5caC) en un abanico de líneas celulares de cáncer humanas y en comparación con la temozolomida y el 5-fluorouracilo (5fU). IC50 es la concentración a la que muere la mitad de las células debido al compuesto relevante.
(continuación)
Tal como se muestra en la Tabla 1, la 5-carbox¡l-2'-desox¡cit¡d¡na no presentaba propiedades citotóxicas en ninguna de las líneas celulares de cáncer evaluadas. Cabe destacar que la 5-form¡l-2'-desox¡c¡t¡d¡na es citotóxica para un amplio abanico de células de cáncer humanas, indicando su posible uso en el tratamiento de una amplia gama de cánceres. La 5-h¡drox¡met¡l-2'-desox¡c¡t¡d¡na presenta un perfil de citotoxicidad más estrecho; en efecto, este derivado de la citidina solo era citotóxico para dos líneas celulares evaluadas: U87-MG, células de glioma de grado IV (IC5o>0,3340 pM) y células de leucemia mielógena crónica HAP1 (IC50>3,027 pM). Lo anterior sugiere que dicho compuesto podría ser bien tolerado por los/las pacientes. Se observó que 5-formil-2'-desoxicitidina y 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina eran los más citotóxicos para las líneas celulares de glioblastoma multiforme (U87-MG).
Debido a que el efecto citotóxico más grande de la 5-form¡l-2'-desox¡c¡t¡d¡na y la 5-h¡drox¡met¡l-2'-desox¡c¡t¡d¡na se observó en las células de glioma de grado IV (U87-MG), se evaluó la actividad citotóxica de dichos compuestos en un abanico más amplio de células de glioma de grado IV derivadas de paciente (Tabla 2). Debido a la falta de actividad en ensayos anteriores, no se incluyó la 5-carboxil-2'-desoxicitidina en este análisis más riguroso.
Tabla 2: evaluación de la citotoxicidad de la 5-form¡l-2'-desox¡c¡t¡d¡na (2d5fC) y la 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina (2d5hmc) contra líneas celulares de glioblastoma multiforme derivadas de paciente (Glioma de grado IV) y en comparación con temozolomida y 5-fluorouracilo (5fU). IC50 es la concentración a la que muere la mitad de las células debido al compuesto relevante.
Tal como se muestra en la Tabla 2, tras el tratamiento con el compuesto relevante, 5 de entre 12 líneas celulares de glioma de grado IV fueron eliminadas por 5-form¡l-2'-desox¡c¡t¡d¡na y 6 de entre 12 líneas celulares de glioma de grado IV fueron eliminadas por 5-h¡drox¡met¡l-2'-desox¡c¡t¡d¡na. Lo anterior indica la capacidad de estos compuestos contra un amplio abanico de gliomas. Estos resultados se compararon con la temozolomida, el tratamiento de primera línea actual para los gliomas de grado IV y el 5-fluorouracilo, un fármaco anticáncer ampliamente utilizado. La temozolomida eliminó eficazmente 5 de 12 líneas celulares de glioma de grado IV y 5-fluorouracilo eliminó 11 de 12 líneas celulares de glioma de grado IV. De esta manera, los datos demuestran que la 5-form¡l-2'-desox¡c¡t¡d¡na es tan eficaz como el tratamiento de primera línea actual para los gliomas de grado IV y que la 5-h¡drox¡met¡l-2'-desox¡c¡t¡d¡na es más eficaz que el tratamiento de primera línea actual para los gliomas de grado IV.
Además, la Tabla 2 demuestra que tanto la 5-form¡l-2'-desox¡c¡t¡d¡na como la 5-h¡drox¡met¡l-2'-desox¡c¡t¡d¡na son citotóxicos para líneas celulares que son resistentes al tratamiento de primera línea actual (temozolomida). Lo anterior proporciona evidencia de que estos compuestos podrían funcionar mejor que los tratamientos actuales para dichos tumores resistentes a temozolomida. Alternativamente, la Tabla 2 indica que la temozolomida en combinación con 5-form¡l-2'-desox¡c¡t¡d¡na y/o 5-h¡drox¡met¡l-2'-desox¡c¡t¡d¡na sería un tratamiento óptimo.
Ejemplo 2: citotoxicidad para las células normales
Tal como se muestra en el Ejemplo 1, la 5-formil-2'-desoxicitidina y la 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina son terapéuticos útiles para el tratamiento de cánceres, particularmente los gliomas de grado IV, y particularmente los que son resistentes al tratamiento de temozolomida.
Los presentes inventores han investigado, además, el grado en que dichos compuestos matan las células humanas normales; una baja citotoxicidad para las células humanas normales es una propiedad ventajosa de los agentes anticáncer. Por lo tanto, se investigó la citotoxicidad de estos compuestos para diversas líneas celulares normales humanas (Tabla 3). Las células se cultivaron y se llevó a cabo el ensayo de supervivencia tal como se ha indicado anteriormente (Materiales y métodos).
Tabla 3: evaluación de la citotoxicidad de la 5-formil-2'-desoxicitidina (2d5fC) y la 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina (2d5hmC) contra líneas celulares humanas normales (no cancerosas) y en comparación con temozolomida y 5-fluorouracilo (5fU). IC50 es la concentración a la que muere la mitad de las células debido al compuesto relevante.
Tal como se muestra en la Tabla 3, la 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina no era citotóxica para ninguna de las líneas celulares normales evaluadas. La 5-formil-2'-desoxicitidina era citotóxica solo para una línea celular humana normal (HaCat, queratinocitos). Estos resultados indican que estos compuestos no son solo quimioterapéuticos eficaces contra el cáncer, sino que también resultan bien tolerados por el ser humano.
Ejemplo 3: dosis máxima tolerada
Debido a que la 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina y la 5-formil-2'-desoxicitidina presentan efectos limitados sobre las células normales, los presentes inventores consideraron que los compuestos podrían administrarse a dosis relativamente altas sin provocar efectos secundarios normalmente asociados a la quimioterapia del cáncer. La dosis máxima tolerada (DMT) de estos compuestos en ratones se determinó tal como se ha indicado anteriormente (Materiales y métodos). Se desarrolló un esquema de DMT (figura 1A). Aunque el criterio de valoración del estudio era la supervivencia tras 72 horas, se realizó un seguimiento de la presencia de síntomas tóxicos agudos (mortalidad, convulsiones, temblores, relajación muscular, sedación, etc.) y efectos autonómicos (diarrea, salivación, lagrimeo, vasodilatación, piloerección, etc.) en los animales durante los primeros 30 minutos y nuevamente a 1,24, 48 y 72 horas. Se registraron los pesos corporales antes de la dosis y a las 72 horas.
Los resultados indicaron que los ratones pueden tolerar una única dosis de 300 mg/kg y 2000 mg/kg de 5-formil-2'-desoxicitidina y 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina. Los ratones no pudieron toleraron una única dosis de 8000 mg/kg de 5-formil-2'-desoxicitidina o 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina (no mostrado). Estos resultados sugieren que en ratones la dosis única máxima tolerada tanto de 5-formil-2'-desoxicitidina como de 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina es de por lo menos 2000 mg/kg, aunque inferior a 8000 mg/kg.
La conversión de dosis en ratón a dosis humana es un factor de 0,081 (Nair et al., (2016) Basic Clin. Pharm.
7(2): 27-31. Por lo tanto, los datos indican que en seres humanos la dosis única máxima tolerada de los compuestos de fórmula (IIa) es de por lo menos 162 mg/kg, aunque inferior a 648 mg/kg.
Los fármacos quimioterapéuticos del cáncer que pueden tolerarse después de múltiples dosis repetidas a lo largo de muchos días resultan ventajosos. Por lo tanto, los presentes inventores llevaron a cabo una evaluación de la dosis máxima tolerada repetida tanto para 5-formil-2'-desoxicitidina como para 5-hidroximetil-2'desoxicitidina tal como se ha indicado anteriormente (Materiales y métodos). Debido a que resultaron bien tolerados como dosis única en ambos grupos de tratamiento, se seleccionaron dosis de 300 mg/kg, 1000 mg/kg y 2000 mg/kg para una evaluación repetida de múltiples dosis toleradas.
En los ratones se inyectó el compuesto indicado a la dosis indicada por vía intraperitoneal una vez cada tres días hasta un total de 5 dosis. Aunque el criterio de valoración del estudio era la supervivencia, el criterio de valoración principal del estudio era el peso corporal, la presencia de síntomas tóxicos agudos (mortalidad, convulsiones, temblores, relajación muscular, sedación, etc.) y efectos autonómicos (diarrea, salivación, lagrimeo, vasodilatación, piloerección, etc.) en los animales durante los primeros 30 minutos y nuevamente a 1,24, 48 y 72 horas. Se registraron los pesos corporales antes de la dosis y a las 72 horas.
El peso corporal de los animales no tratados no era estadísticamente diferente de los animales tratados con 5-formil-2'-desoxicitidina o con 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina a ninguna de las dosis evaluadas (figura 1B). Estos resultados indican que estos compuestos resultan bien tolerados a las dosis indicadas a lo largo de periodos de tiempo prolongados.
Ejemplo 4: citotoxicidad in vivo
Se evaluó 5-formil-2'-desoxicitidina y 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina en un modelo de xenoinjerto de ratón de glioblastoma multiforme tal como se ha indicado anteriormente (Materiales y métodos). Se inyectaron células U87-MG por vía subcutánea en el flanco de ratones desnudos. Se dejó que se formasen tumores tal como se ha indicado anteriormente (Materiales y métodos). Una vez los tumores habían alcanzado entre 129 y 131 mm3, los animales fueron divididos en 4 grupos: dos grupos de tratamiento, un grupo de control negativo y un grupo de control positivo. Los dos grupos de tratamiento eran 5-formil-2'-desoxicitidina y 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina. Los ratones en los grupos de tratamiento recibieron una dosis de 2000 mg/kg de 5-formil-2'-desoxicitidina o 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina cada tres días hasta un total de 5 dosis. El grupo de control negativo se trató de manera idéntica al grupo de tratamiento, excepto en que la inyección IP contenía vehículo y no contenía compuesto. El grupo de control positivo se trató con 5 dosis diarias de 40 mg/kg de temozolomida.
Se realizó un seguimiento del volumen tumoral (figura 1C), el peso corporal (figura 1D), la mortalidad y los signos de toxicidad manifiesta, y se registraron dos veces a la semana durante 29 días. Se estimó el volumen tumoral (mm3) de acuerdo con la fórmula del elipsoide, como: longitud x (anchura)2 x 0,5. Se determinó la inhibición del crecimiento tumoral (% ICT) mediante la fórmula siguiente: % ICT=(1 - [(Tn)/(Cn)]) x 100, donde Tn=volumen tumoral medio del grupo tratado el día "n", y Cn=volumen tumoral medio del grupo de control el día "n". Un valor de %T/C <42 % o un valor de porcentaje de ICT>58 % en comparación con el del grupo de control negativo se consideró que indicaba una actividad antitumoral significativa. También se utilizó una ANOVA bidireccional (RTM) seguido de pruebas de Bonferroni para determinar las diferencias estadísticamente significativas en comparación con el grupo de control negativo durante el estudio; días 1 a 29 (* p<0,05).
La figura 1C indica que el tratamiento con 5-formil-2'-desoxicitidina o 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina resulta en una reducción acusada del volumen tumoral, comparable con la conseguida con temozolomida, en todos los puntos temporales.
Al final del estudio, tanto 5-formil-2'-desoxicitidina como 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina mostraron una actividad antitumoral significativa: 83 % y 93 % ICT, respectivamente (figura 1E). El grupo de control positivo, tratado con temozolomida, mostró una ICT de 94 %. Todos los compuestos resultaron bien tolerados por los ratones y no se observaron cambios significativos de peso corporal como consecuencia del tratamiento (figura 1D). Una vez completado este estudio se diseccionaron los tumores del ratón y se fotografiaron (figura 1F) y se midieron (figura 1G); se observaron efectos citotóxicos marcados en los dos grupos tratados.
Un ratón en el grupo de control murió durante este experimento; el volumen tumoral de este ratón no se informó el día 29; sin embargo, los volúmenes tumorales de este ratón se incluyeron para los días anteriores.
Conjuntamente, estos resultados inesperados demuestran que la 5-formil-2'-desoxicitidina y la 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina matan eficientemente las células de glioblastoma multiforme (glioma, grado IV) y que no resultan fuertemente citotóxicas para las células normales. Además, dichos compuestos resultan bien tolerados en ratones y consiguen una reducción marcada del volumen tumoral con mínimos efectos secundarios en ratones. Los resultados demuestran que los compuestos de la invención pueden utilizarse para tratar cánceres humanos y que pueden utilizarse a dosis elevadas para matar células tumorales sin matar células no cancerosas. De esta manera, existe una amplia ventana terapéutica para el uso de dichos compuestos como fármacos anticáncer.
Ejemplo 5: efecto citotóxico vs. citostático
Los ensayos de línea celular anteriormente indicados miden la actividad metabólica y de esta manera no distinguen entre inhibición de la división celular y la muerte celular. Por lo tanto, se evaluó si la 5-formil-2'desoxicitidina y la 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina estaban matando células sensibles o causando retrasos en el ciclo celular. Se trataron células de glioma de grado IV SF-188 con DMSO, temozolomida, 5-formil-2'-desoxicitidina o 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina a la concentración indicada. Se recolectaron células y se tiñeron con anexina-V (detecta las células apoptóticas por su capacidad de unirse a la fosfatidilserina) y 7AAD (una tinción de ADN que no pase fácilmente a través de las membranas celulares intactas; por lo tanto, las células con membranas comprometidas serán selectivamente teñidas) y se analizaron mediante citometría de flujo tal como se ha indicado anteriormente (Materiales y métodos). Las células SF-188 tratadas con DMSO o temozolomida rindienron perfiles citométricos similares, con un ligero incremento de la cantidad de células muertas en el control tratado con temozolomida. La mayoría de las células SF-188 tratadas con 5-formil-2'-desoxicitidina o 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina estaban muertas según el perfil de citometría de flujo (figura 2A). Resulta evidente que las células SF188 expuestas a 5-formil-2'-desoxicitidina o 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina están muertas y no que se hayan detenido en un punto de comprobación del ciclo celular.
Ejemplo 6: requisito de derivados de azúcar 2'-desoxi
El 5-fluorouracilo, un fármaco quimioterapéutico del cáncer ampliamente utilizado, presenta múltiples variantes que son citotóxicas; entre estas variantes se incluyen los nucleósidos 5-fluorouridina y 5-fluoro-2'-desoxiuridina, y la nucleobase 5-fluorouracilo. Los presentes inventores evaluaron si las variantes de ribonucleósido y nucleobase de 5-formil-2'-desoxicitidina y 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina también resultarían citotóxicas.
Tal como se muestra en la Tabla I, la 5-formil-2'-desoxicitidina es citotóxica para las células HeLa. Se evaluó la citotoxicidad de la 5-formilcitidina y la 5-formilcitosina para las células HeLa en un ensayo de supervivencia tal como se ha indicado anteriormente. Inesperadamente, y en contraste con la 5-fluorouridina y el 5-fluorouracilo, ni la 5-formilcitina ni la 5-formilcitosina eran citotóxicas para las células HeLa (figura 2B).
La Tabla I muestra que la 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina es citotóxica para las células U87-MG. Se evaluó la citotoxicidad de la 5-hidroximetilcitidina y la 5-hidroximetilcitosina para las células U87-MG en un ensayo de supervivencia tal como se ha indicado anteriormente. Inesperadamente, y en contraste con la 5-fluorouridina y el 5-fluorouracilo, la 5-hidroximetilcitidna y la 5-hidroximetilcitosina no se demostró que resultasen citotóxicas para las células U87-MG (figura 2C).
Estos resultados indican que el azúcar 2'-desoxirribosa resulta necesario para la citotoxicidad de los compuestos de la presente invención. A su vez, este resultado indica, inesperadamente, que la 5-formil-2'-desoxicitidina y la 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina aprovechan una ruta celular fundamentalmente diferente a la de las fluoropirimidinas.
Ejemplo 7: ausencia de efecto de la citidina desaminasa
Los análogos de nucleósido y nucleótido mutados con frecuencia resultan eliminados del agregado de nucleótidos por la citidina desaminasa (CDA). La CDA inactiva la gemcitabina y la citosina arabinósido: dos agentes anticáncer de análogo de nucleótido habituales. Resultarían deseables agentes anticáncer que no resultasen inactivados por la CDA. Debido a que la 5-formil-2'-desoxicitidina y la 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina son derivados de citidina, los presentes inventores plantearon la hipótesis de que las células que expresaban CDA serían resistentes al tratamiento con 5-formil-2'-desoxicitidina y 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina.
Sin embargo, inesperadamente, de hecho, no se observó ninguna correlación entre la expresión de CDA y la resistencia o la sensibilidad a 5-formil-2'-desoxicitidina o a 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina, tal como se muestra en la Tabla 4A. Los datos de IC50 en la Tabla 4 son idénticos a los de la Tabla 1. Los niveles de expresión de CDA en las líneas celulares especificadas se especificaron utilizando el atlas de expresión de EMBL (https://www.ebi.ac.uk/gxa/home, using the search term CDA). La expresión de CDA se informa como transcritos de ARN por millón (TPM), tal como se indica en Wagner et al., (2012) Theory Biosci 131 (4):281 -285 y en Mortazavi A et al., (2008) "Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq." Nature methods 5(7):621-8. En el caso de que se informase de más de un valor, se utilizó el más bajo.
Tabla 4A: falta de correlación entre el nivel de expresión de CDA y la sensibilidad al tratamiento con 5-formil-2'-desoxicitidina o 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina.
Una correlación lineal entre citotoxicidad y exposición a fármaco mostró un ajuste reducido (modelo lineal para 2d5fc; Rz=0,00173; modelo lineal para 2d5hmC, Rz=0,02262). Los datos, junto con los datos de<e>M<b>L, sugieren que la expresión de CDA no es relevante para la sensibilidad o resistencia de la 5-formil-2'-desoxicitidina o de la 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina.
Además, se determinó el nivel de expresión de CDA (TPM) de diversas líneas celulares de glioma y se muestra en la Tabla 4B. Se identificaron los niveles de expresión de CDA en las líneas celulares especificadas utilizando la Cancer Cell Line Encyclopaedia (https://portals.broadinstitute.org/ccle), que ha sido descrita en Barretina, J et al. (2012) The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity. Nature. 483:603-7. La expresión de CDA se informa como transcritos de ARN por millón (TPM), tal como se indica en Wagner et al., (2012) Theory Biosci 131 (4):281 -285. En el caso de que se informase de más de un valor, se utilizó el más alto.
Tabla 4B: nivel de expresión de CDA en diversas líneas celulares de glioma
Ejemplo 8: efecto no mutagénico
Un tratamiento de primera línea actual para el glioblastoma multiforme, la temozolomida, es un mutágeno potente. De hecho, la temozolomida ejerce su actividad quimioterapéutica del cáncer mediante una mutación tan intensa de las células tumorales que estas resultan eliminadas. La temozolomida funciona mediante alquilación del ADN, causando mutaciones. La expresión de MGMT, una proteína responsable de eliminar los daños por alquilación del ADN, provoca que las células de glioblastoma sean casi totalmente resistentes a los efectos citotóxicos de la temozolomida.
Por lo tanto, los presentes inventores investigaron si la 5-formil-2'-desoxicitidina y la 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina presentaban un mecanismo de acción similar. Se evaluó la mutagenicidad de dichos compuestos en un ensayo de hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (HPRT) tal como se ha indicado anteriormente (Materiales y métodos). Tal como se muestra en el ensayo de HPRT, ni la 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina ni la 5-formil-2'-desoxicitidina eran genotóxicas para las células de mamífero a ninguna de las concentraciones evaluadas (figura 3). Estos resultados indican que la 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina y la 5-formil-2'-desoxicitidina no son mutágenos, es decir, que sus efectos citotóxicos no se deben a la actividad mutagénica.
Ejemplo 9: citotoxicidad de otros compuestos vs. células HeLa
Se trataron células HeLa con 5-formil-2'-desoxicitidina, 5-formilcitidina o 5-cloro-2'-desoxicitidina. Tras tres días de tratamiento con estos compuestos a una concentración de 100, 25, 6,25, 1,56, 0,39, 0,1,0,02 o 0,006 pM, se evaluó la supervivencia celular mediante ensayo de MTT tal como se ha indicado anteriormente (Materiales y métodos).
Tal como se muestra en la figura 4, se observó un efecto citotóxico marcadamente superior tras el tratamiento con 5-formil-2'-desoxicitidina que tras el tratamiento con 5-formilcitidina o 5-cloro-2'-desoxicitidina.
Ejemplo 10: citotoxicidad de otros compuestos vs. células de glioma
Se trataron células U87-MG (glioma, grado IV) con 5-formil-2'-desoxicitidina, 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina, 5-carboxi-2'-desoxicitidina, temozolomida, 5-fluorouracilo, 5-bromo-2'-desoxicitidina, 5-yodo-2'-desoxicitidina o 5-cloro-2'-desoxicitidina, a una concentración de 100, 25, 6,25, 1,56, 0,39, 0,1, 0,02 o 0,006 pM. Tres días de tratamiento con dichos compuestos, se evaluó la supervivencia celular mediante ensayo de MTT tal como se ha indicado anteriormente (Materiales y métodos).
Cultivo celular
Las líneas celulares de U87-MG se cultivaron en DMEM (Sigma, n.° de cat. D6429) complementadas con suero de feto bovino al 10 %. Todas las células se mantuvieron en un incubador con camisa de agua, humidificado y con 5 % de CO2 a 372C. Las células se subcultivaron hasta una confluencia de entre 70 % y 90 %.
Ensayo de supervivencia
En una placa de 96 pocillos, se sembraron 4000 células en 100 pl de medio correspondiente. Al día siguiente, se añadieron fármacos, diluidos en DMSO, por triplicado a una concentración de 100, 25, 6,25, 1,56, 0,39, 0,1, 0,02 o 0,006 pM. Las células se incubaron con los fármacos durante 72 horas. Se evaluó la proliferación celular mediante ensayo de MTT siguiendo el protocolo del fabricante (ATCC n.° de cat. 30-1010K). La supervivencia celular se normalizó respecto a la supervivencia de las células tratadas con solo DMSO. El experimento se llevó a cabo tres veces; los datos representan medias de nueve pocillos ± SEM.
Tal como se muestra en la Tabla 5, tanto 5-formil-2'-desoxicitidina como 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina funcionaron inesperadamente mejor en términos de citotoxicidad contra las células U87-MG que los demás compuestos sometidos a ensayo, incluyendo la 5-bromo-2'-desoxicitidina, la 5-yodo-2'-desoxicitidina y la 5-cloro-2'-desoxicitidina.
Tabla 5: evaluación de la citotoxicidad de diversos compuestos a las células U87-MG. IC50 es la concentración a la que muere la mitad de las células debido al compuesto relevante.
Además, las células U87-MG fueron tratadas con 5-formil-2'-desoxicitidina (d5fC), 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina (d5hmC), 5-cloro-2'-desoxicitidina (5CldC), 5-bromo-2'-desoxitidina (5BrdC), 5-yodo-2'-desoxicitidina (5IdC) y timidina. Los resultados se muestran en la figura 5: d5hmC y d5fC eran marcadamente más citotóxicos que 5CldC, 5BrdC, dldC y timidina para las células de glioma.
En una placa de 96 pocillos, se sembraron 4000 células en 100 pl de medio correspondiente. Al día siguiente, se añadieron fármacos, diluidos en DMSO, por triplicado a una concentración de 100, 25, 6,25, 1,56, 0,39, 0,1, 0,02 o 0,006 pM. Las células se incubaron con los fármacos durante 72 horas. Se evaluó la proliferación celular mediante ensayo de MTT siguiendo el protocolo del fabricante (ATCC n.° de cat. 30-1010K). La supervivencia celular se normalizó respecto a la supervivencia de las células tratadas con solo DMSO. El experimento se llevó a cabo tres veces; los datos representan medias ± SD.
Ejemplo 11: efecto no mediado por timidina sintasa
Cultivo celular
Las líneas celulares de U87-MG se cultivaron en DMEM (Sigma, n.° de cat. D6429) complementadas con suero de feto bovino al 10 %. Todas las células se mantuvieron en un incubador con camisa de agua, humidificado y con 5 % de CO2 a 37 °C. Las células se subcultivaron hasta una confluencia de entre 70 % y 90 %.
Ensayo de supervivencia
En una placa de 96 pocillos, se sembraron 4000 células en 100 pl de medio correspondiente. Al día siguiente, se añadieron fármacos, diluidos en DMSO, a 8 concentraciones por triplicado. Se añadieron los fármacos en forma de una serie de dilución de 4 veces partiendo de 100 pM. Las células se incubaron con los fármacos durante 72 horas. Se evaluó la proliferación celular mediante ensayo de MTT siguiendo el protocolo del fabricante (ATCC n.° de cat. 30-1010K). La supervivencia celular se normalizó respecto a la supervivencia de las células tratadas con solo DMSO. El experimento se llevó a cabo tres veces; los datos representan medias de tres pocillos ± SD.
Los resultados se muestran en la figura 6. La citotoxicidad por 5-formil-2'-desoxicitidina y 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina no resultó rescatada por la adición de timidina en las células U87-MG. Este resultado indica que la 5-formil-2'-desoxicitidina y la 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina no actúan mediante inhibición de la timidina sintasa.
Ejemplo 12: terapia de combinación con temozolomida.
Cultivo celular
Se cultivaron líneas celulares de glioblastoma multiforme (U87-MG) en DMEM (Sigma, n.° de cat. D6429) complementadas con suero de feto bovino al 10 %. Todas las células se mantuvieron en un incubador con camisa de agua, humidificado y con 5 % de CO2 a 37 °C. Las células se subcultivaron hasta una confluencia de entre 70 % y 90 %.
Ensayo de supervivencia
En una placa de 96 pocillos, se sembraron 4000 células en 100 pl de medio correspondiente. Al día siguiente, se añadieron fármacos, diluidos en DMSO, a 8 concentraciones por triplicado. Se añadieron los fármacos en forma de una serie de dilución de 4 veces partiendo de 100 pM. Las células se incubaron con los fármacos durante 72 horas. Se evaluó la proliferación celular mediante ensayo de MTT siguiendo el protocolo del fabricante (ATCC n.° de cat. 30-1010K). La supervivencia celular se normalizó respecto a la supervivencia de las células tratadas con solo DMSO. El experimento se llevó a cabo tres veces; los datos representan medias de estos experimentos.
Tal como se muestra en la figura 7, se trató una línea celular de glioblastoma multiforme humano que es resistente a la temozolomida con solo temozolomida, 5-formil-2'-desoxicitidina (d5fC) o una combinación de d5fC y temozolomida. La combinación de temozolomida y d5fC resulta más eficaz en el tratamiento del glioblastoma multiforme humano que cualquiera de los compuestos químicos por sí solo.
Tal como se muestra en la figura 8, se trató una línea celular de glioblastoma multiforme humano que es resistente a la temozolomida con solo temozolomida, 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina (d5hmC) o una combinación de d5hmC y temozolomida. La combinación de temozolomida y d5hmC resulta más eficaz en el tratamiento del glioblastoma multiforme humano que cualquiera de los compuestos químicos por sí solo. De esta manera, 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina y 5-formil-2'-desoxicitidina actúan sinérgicamente con la temozolomida.
Ejemplo 13: análogos de uridina (ejemplo de referencia)
Se evaluaron los efectos citotóxicos de 5-metoximetil-2'-desoxiuridina y 5-acetoximetil-2'-desoxiuridina.
Cultivo celular
Las líneas celulares de U87-MG se cultivaron en DMEM (Sigma, n.° de cat. D6429) complementado con suero de feto bovino al 10 %. Todas las células se mantuvieron en un incubador con camisa de agua, humidificado y con 5 % de CO2 a 37 °C. Las células se subcultivaron hasta una confluencia de entre 70 % y 90 %.
Ensayo de supervivencia
En una placa de 96 pocillos, se sembraron 4000 células en 100 pl de medio correspondiente. Al día siguiente, se añadieron fármacos, diluidos en DMSO, a 8 concentraciones por triplicado. Se añadieron los fármacos en forma de una serie de dilución de 4 veces partiendo de 100 pM. Las células se incubaron con los fármacos durante 72 horas. Se evaluó la proliferación celular mediante ensayo de MTT siguiendo el protocolo del fabricante (ATCC n.° de cat. 30-1010K). La supervivencia celular se normalizó respecto a la supervivencia de las células tratadas con solo DMSO. El experimento se llevó a cabo tres veces; los datos representan medias de nueve pocillos ± SEM.
Tal como se muestra en la figura 9, la línea celular de glioblastoma multiforme U87-MG es incapaz de sobrevivir al tratamiento con concentraciones crecientes de 5-metoximetil-2'-desoxiuridina o 5-acetoximetil-2'-desoxiuridina. Por lo tanto, la 5-metoximetil-2-desoxiuridina y la 5-acetoximetil-2'-desoxiuridina son agentes anticáncer eficaces, particularmente contra el glioblastoma multiforme.
Ejemplo 14: citotoxicidad de 5-formil-2'-desoxicitidín-5'-trifosfato (HeLa)
Cultivo celular
Las líneas celulares HeLa se cultivaron en DMEM (Sigma, n.° de cat. D6429) complementado con suero de feto bovino al 10 %. Todas las células se mantuvieron en un incubador con camisa de agua, humidificado y con 5 % de CO2 a 37 °C. Las células se subcultivaron hasta una confluencia de entre 70 % y 90 %.
Ensayo de supervivencia
En una placa de 96 pocillos, se sembraron 4000 células en 100 pl de medio correspondiente. Al día siguiente, se añadieron fármacos, diluidos en DMSO, a 8 concentraciones por triplicado. Se añadieron los fármacos en forma de una serie de dilución de 4 veces partiendo de 100 pM. Las células se incubaron con los fármacos durante 72 horas. Se evaluó la proliferación celular mediante ensayo de MTT siguiendo el protocolo del fabricante (ATCC n.° de cat. 30-1010K). La supervivencia celular se normalizó respecto a la supervivencia de las células tratadas con solo DMSO. El experimento se llevó a cabo tres veces; los datos representan medias de nueve pocillos ± SEM.
Tal como se muestra en la figura 10A, las células de carcinoma cervical HeLa son incapaces de sobrevivir a un tratamiento con concentraciones crecientes de 5-formil-2'-desoxicitidín-5'-trifosfato. Lo anterior demuestra la utilidad del 5-formil-2'-desoxicitidín-5'-trifosfato en el tratamiento de cánceres humanos, por ejemplo, el carcinoma cervical.
Ejemplo 15: citotoxicidad de 5-formil-2'-desoxicitidina-5'-trifosfato y de 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina-5'-trifosfato (Glioma).
Se trataron células U87-MG (glioma, grado IV) con 5-formil-2'-desoxicitidina-5'-trifosfato o 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina-5'-trifosfato, a una concentración de 100, 25, 6,25, 1,56, 0,39, 0,1, 0,02 o 0,006 pM. Tres tres días de tratamiento con dichos compuestos, se evaluó la supervivencia celular mediante ensayo de MTT tal como se ha indicado anteriormente (Materiales y métodos).
Cultivo celular
Las líneas celulares de U87-MG se cultivaron en DMEM (Sigma, n.° de cat. D6429) complementado con suero de feto bovino al 10 %. Todas las células se mantuvieron en un incubador con camisa de agua, humidificado y con 5 % de CO2 a 37 °C. Las células se subcultivaron hasta una confluencia de entre 70 % y 90 %.
Ensayo de supervivencia
En una placa de 96 pocillos, se sembraron 4000 células en 100 pl de medio correspondiente. Al día siguiente, se añadieron fármacos, diluidos en DMSO, por triplicado a una concentración de 100, 25, 6,25, 1,56, 0,39, 0,1, 0,02 o 0,006 pM. Las células se incubaron con los fármacos durante 72 horas. Se evaluó la proliferación celular mediante ensayo de MTT siguiendo el protocolo del fabricante (ATCC n.° de cat. 30-1010K). La supervivencia celular se normalizó respecto a la supervivencia de las células tratadas con solo DMSO. El experimento se llevó a cabo tres veces; los datos representan medias de por lo menos tres pocillos ± SD.
Tal como se muestra en la figura 10B, tanto 5-formil-2'-desoxicitidín-5'-trifosfato como 5-hidroximetil-2'-desoxicitidín-5'-trifosfato eran citotóxicos para las células de glioma U87-MG.
Ejemplo 16: expresión de CDA
Se determinó el nivel de expresión de CDA lineal y transformado con logaritmo de base 2 de diversas líneas celulares de glioma. Se identificaron los niveles de expresión de CDA en las líneas celulares especificadas utilizando la base de datos GENEVESTIGATOR® (https://genevestigator.com/gv/), mediante la búsqueda de CDA, organismo:Homo sapiens,plataforma: Affymetrix Human Genome U133 2.0 Array. Se muestran los resultados en las figuras 11 a 13 y en la Tabla 6.
La figura 11 muestra los niveles de expresión de CDA normalizados mediante Log2 determinados para diversos cánceres. La figura 12 muestra los niveles de expresión de CDA determinados para diversos cánceres. Las figuras 13A y 13B muestran los niveles de expresión de CDA normalizados mediante Log2 en diversos tumores cerebrales humanos. Las figuras 14A y 14B muestran los niveles de expresión de CDA lineales en diversos tumores cerebrales humanos.
La Tabla 6 muestra los niveles de expresión de CDA de diversas líneas celulares y los valores de IC50 para 2d5hmC y/o 2d5fc en dichas líneas celulares. Los valores de IC50 se obtuvieron tal como se ha indicado anteriormente (Materiales y métodos y Ejemplo 1).
Tabla 6: niveles de expresión de CDA (valores normalizados mediante Log2) y valores de IC50 de 2d5hmC y/o 2d5fc en diversas líneas celulares.
La Tabla 7 muestra los niveles de expresión lineales de CDA de diversas líneas celulares y los valores de IC50 para 2d5hmC y/o 2d5fc en dichas líneas celulares. Los valores de IC50 se obtuvieron tal como se ha indicado anteriormente (Materiales y métodos y Ejemplo 1).
Tabla 7: niveles de expresión lineales de CDA y valores de IC50 de 2d5hmC y/o 2d5fc en diversas líneas celulares.
Conjuntamente, estos resultados demuestran que muchos cánceres, incluyendo todos los cánceres del sistema nervioso central sometidos a ensayo, no sobreexpresan CDA; por el contrario, expresan niveles bajos de CDA. Los resultados demuestran, además, que no existe ninguna correlación entre la expresión de CDA y la sensibilidad a 5-formil-2'-desoxicitidina o a 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina.
Ejemplo 17: permeabilidad de la barrera hematoencefálica
Se midió la permeabilidad de la barrera hematoencefálica utilizando un kit de ensayo de permeabilidad de membrana artificial paralela (PAMPA, por sus siglas en inglés) de BioAssay Systems. Se siguieron las instrucciones del fabricante para determinar la permeabilidad.
Instrucciones del fabricante: 1. En tubos de centrífuga separados, preparación de 500 pl de compuesto de ensayo 500 pM: mezcla de 25 pl de compuesto de ensayo 10 mM en DMSO 475 pl de PBS. En el caso de que se utilicen controles de permeabilidad, diluirlos también a 500 pM: mezcla de 25 pl de control de permeabilidad 475 pl de PBS. 2. En tubos separados, preparar patrones de equilibrio 200 pM para cada compuesto de ensayo y control: mezcla de 80 pl de compuesto de ensayo 500 pM o control con 120 pl de PBS. En el caso de que el compuesto sea capaz de permeabilizar la membrana y alcanzar totalmente el equilibrio, la concentración final de la solución en los pocillos donantes y aceptores será de 200 pM. A continuación, en un tubo separado, mezcla de 5 pl de DMSO 245 pl de PBS para preparar el control de blanco. Reservar los patrones de equilibrio y el control de blanco para el análisis al día siguiente. 3. Adición de 300 pl de PBS a pocillos en la placa aceptora. 4. Con la placa donante todavía en su bandeja, adición de 5 pl de lecitina al 4 % en dodecano directamente a las membranas en los pocillos de la placa donante. Procurar no atravesar las membranas con la punta de pipeta. 5. Adición de 200 pl de cada compuesto de ensayo 500 pM y controles de permeabilidad 500 pM a pocillos por duplicado de la placa donante. Observación: los presentes inventores recomiendan que todas las variables experimentales se analicen por duplicado5. Introducir cuidadosamente la placa donante en los pocillos de la placa aceptora. Incubar a TA o a 37 °C durante 18 horas o el periodo de tiempo de incubación deseado (p. ej., 16 a 24 horas) 6. Extraer cuidadosamente la placa donante y recoger el líquido en los pocillos de la placa aceptora para el análisis. Lo anterior se denominará Solución aceptora 7. Adición de 100 pl de Solución aceptora y patrones de equilibrio para cada compuesto de ensayo y control de permeabilidad. Adición, además, de 100 pl de control de blanco a los pocillos de la placa UV (n.° de cat. P96UV). 8. Lectura del espectro de absorbancia entre 200 nm y 500 nm a intervalos de 10 nm para determinar el pico de absorbancia de los compuestos de ensayo. El control de blanco sirve para confirmar que los picos se deben al compuesto de ensayo y no al DMSO en la solución. Los picos de absorbancia para los controles de permeabilidad elevada, permeabilidad intermedia y permeabilidad baja son 280, 270 y 270 nm, respectivamente.
Tal como se muestra en la figura 15, 2d5hmC y 2d5fC atraviesan la barrera hematoencefálica.

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un compuesto de fórmula (Ila):
    o un estereoisómero, solvato, tautómero o sal farmacéuticamente aceptable del mismo para el uso en el tratamiento o la prevención de un cáncer en el que el CDA no se sobreexpresa, en el que: X es -(CH2)n-X', en el que "n" es un valor entre 0 y 6 y X' es -CHO; R1 es -OH o -O(P(=O)(OH)O)nH, en donde "n" es un valor entre 1 y 3, y R2 es -OH.
  2. 2. El compuesto para el uso según la reivindicación 1, en el que el compuesto es un compuesto de fórmula (IIIa) o (IIIc), o un estereoisómero, solvato, tautómero o sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
    en el que X es tal como se define en la reivindicación 1.
  3. 3. El compuesto para el uso según la reivindicación 1 o 2, en el que X es -CHO
  4. 4. El compuesto para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el compuesto es 5-formil-2'-desoxicitidina o 5-formil-2'-desoxicitidina-5'-trifosfato, o un estereoisómero, solvato, tautómero o sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
  5. 5. El compuesto para su uso de la reivindicación 4, en donde el compuesto es 5-formil-2'-desoxicitidina, o un estereoisómero, solvato, tautómero o sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
  6. 6. El compuesto para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el cáncer expresa CDA a un nivel de < 140 transcritos por millón (TPM).
  7. 7. El compuesto para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el nivel de expresión de CDA en el cáncer no es mayor del 90 % del nivel de expresión de CDA en una línea celular cancerosa de referencia como se determina usando el mismo método en las mismas condiciones, en donde dicha línea celular cancerosa de referencia es MDA-MB-231.
  8. 8. El compuesto para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el cáncer es un cáncer de un tejido derivado del ectodermo, mesodermo paraxial o mesodermo de placa lateral, preferiblemente del ectodermo.
  9. 9. El compuesto para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de estómago, cáncer pancreático, adenocarcinoma de pulmón metastásico, cáncer de piel, leucemia, cáncer de mama, cáncer óseo y cáncer cervical.
  10. 10. El compuesto para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el cáncer es resistente al tratamiento con gemcitabina, citarabina, temozolomida o 5-fluorouracilo.
  11. 11. El compuesto para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde dicho tratamiento comprende administrar dicho compuesto a una dosis entre 10 mg/kg y 405 mg/kg.
  12. 12. El compuesto para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde dicho tratamiento comprende además la administración de un agente anticanceroso adicional.
  13. 13. Un kit que comprende un compuesto como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un agente anticanceroso adicional para su uso en el tratamiento o la prevención de un cáncer en el que el CDA no está sobreexpresado.
  14. 14. Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento o prevención de un cáncer en el que CDA no está sobreexpresado, que comprende un compuesto como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y opcionalmente un agente anticanceroso adicional, junto con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
  15. 15. El compuesto para el uso según la reivindicación 12, el kit para el uso según la reivindicación 13 o la composición para el uso según la reivindicación 14, en el que el agente anticáncer adicional se selecciona del grupo que consiste en gemcitabina, citarabina, temozolomida, 5-fluorouracilo y gliadel (RTM).
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