ES3039441T3 - Ilt-binding agents and methods of use thereof - Google Patents

Ilt-binding agents and methods of use thereof

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ES3039441T3
ES3039441T3 ES21726775T ES21726775T ES3039441T3 ES 3039441 T3 ES3039441 T3 ES 3039441T3 ES 21726775 T ES21726775 T ES 21726775T ES 21726775 T ES21726775 T ES 21726775T ES 3039441 T3 ES3039441 T3 ES 3039441T3
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Dana Yen Mei Duey
Ebens, Jr
Daniel David Kaplan
Chia-Ying Kao Lam
Kalyani Mondal
Geoffrey William Stone
Yan Wang
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Abstract

La presente divulgación proporciona agentes de unión, como anticuerpos, que se unen específicamente a ILT2, ILT4 o a ambos, así como composiciones que comprenden dichos agentes de unión y métodos para su uso. La divulgación también proporciona polinucleótidos y vectores relacionados que codifican dichos agentes de unión y células que los comprenden. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Agentes aglutinantes de ILT y métodos de uso de los mismos
Campo de la invención
La presente invención se refiere, en general, a anticuerpos que se unen a proteínas transcritas de tipo inmunoglobulina (ILT), particularmente a anticuerpos que se unen tanto a ILT2 humano como a ILT4 humano. Específicamente, la invención se refiere a anticuerpos que tienen las seis CDR de cualquiera de los anticuerpos identificados como 73D1 y Hz73D1.v1 divulgados en el presente documento a continuación. La invención también se refiere a métodos para fabricar y usar los anticuerpos y a composiciones que comprenden los anticuerpos.
Antecedentes
La base de la inmunoterapia es la manipulación y/o la modulación del sistema inmunitario, incluidas las respuestas inmunitarias innatas y las respuestas inmunitarias adaptativas. El objetivo general de la inmunoterapia es tratar las enfermedades mediante el control de la respuesta inmunitaria a un “agente extraño”, por ejemplo, un patógeno o una célula tumoral. Sin embargo, en algunos casos, la inmunoterapia se usa para tratar enfermedades autoinmunitarias que pueden surgir de una respuesta inmunitaria anómala contra proteínas, moléculas y/o tejidos usualmente presentes en el cuerpo. La inmunoterapia puede incluir métodos para inducir o mejorar respuestas inmunitarias específicas o para inhibir o reducir respuestas inmunitarias específicas.
El sistema inmunitario es un sistema altamente complejo compuesto por un gran número de tipos de células, incluyendo, entre otros, células T, subconjuntos de células T, células B, células NK, células presentadoras de antígenos, células dendríticas, monocitos y macrófagos. Estas células poseen sistemas complejos y sutiles para controlar sus interacciones y respuestas. Las células utilizan mecanismos activadores e inhibidores y circuitos de retroalimentación para mantener las respuestas bajo control y no permitir las consecuencias negativas de una respuesta inmunitaria descontrolada (por ejemplo, enfermedades autoinmunitarias o una hipercitocinemia).
En algunos de los mecanismos inhibidores del sistema inmunitario se usan proteínas de la familia de receptores leucocitarios tipo Ig (LILR). La subfamilia B de receptores leucocitarios tipo Ig (LILRB) es un grupo de glucoproteínas transmembrana de tipo I con dominios extracelulares similares a Ig y motivos inhibidores basados en la tirosina (ITIM) de los inmunorreceptores citoplasmáticos. Este grupo de receptores que contienen ITIM incluye 5 miembros: LILRB1 (también conocido como CD85J, LIR1, ILT2), LILRB2 (también conocido como CD85D, LIR2, ILT4), LILRB3 (también conocido como CD85A, LIR3, ILT5), LILRB4 (también conocido como CD85K, LIR5, ILT3) y LILRB5 (también conocido como CD85C, LIR8). Las funciones biológicas y la importancia clínica de muchos de estos LILRB (ILT) aún se están investigando. También existe una subfamilia A del LILR (LILRA) que es un grupo de glucoproteínas transmembrana de tipo I con dominios extracelulares de tipo Ig y motivos activadores basados en la tirosina de los inmunorreceptores citoplasmáticos (ITAM). Este grupo de receptores que contienen ITAM incluye 6 miembros: LILRA1 (también conocido como CD85I, LIR6), LILRA2 (también conocido como CD85H, LIR7, ILT1), LILRA3 (también conocido como CD85E, LIR4, ILT6, receptor inhibidor de monocitos HM43/31), LILRA4 (también conocido como CD85G, ILT7), LILRA5 (también conocido como CD85F, LIR9, ILT11) y LILRA6 (también conocido como ILT8). Las proteínas inhibidoras y activadoras de la familia LILR parecen trabajar en conjunto para modular la homeostasis inmunológica.
El concepto de inmunovigilancia del cáncer se basa en la teoría de que el sistema inmunitario puede reconocer las células tumorales, generar una respuesta inmunitaria y suprimir el desarrollo y/o el crecimiento de un tumor. Sin embargo, está claro que muchas células cancerosas o tumorales han desarrollado mecanismos y/o han secuestrado los mecanismos inhibidores usuales para evadir el sistema inmunitario, lo que puede permitir el crecimiento desinhibido de las células tumorales. La inmunoterapia contra el cáncer y los tumores (inmunooncología) se centra en el desarrollo de agentes nuevos y novedosos que pueden activar y/o estimular el sistema inmunitario para lograr un ataque más eficaz contra las células cancerosas o tumorales, lo que resulta en una mayor destrucción de las células cancerosas o tumorales y/o en la inhibición del crecimiento del cáncer o tumor.
En la Publicación de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos número US2019194327A1 se divulgan anticuerpos que se unen a LILRB2 y su uso en métodos para tratar enfermedades como el cáncer. En la Publicación de la Solicitud de Patente Internacional WO2019144052A1 se divulgan anticuerpos específicos y planos que interactúan con uno o más miembros de la familia de receptores LILRB, así como composiciones farmacéuticas que comprenden dichos anticuerpos y métodos para modular la activación inflamatoria de los macrófagos, la activación de los linfocitos y la fagocitosis.
Breve compendio
La presente divulgación proporciona agentes que se unen al transcrito tipo inmunoglobulina 2 (ILT2) y/o al transcrito similar a inmunoglobulina 4 (ILT4). Aunque en las publicaciones se hace referencia a los miembros de la familia LILRB con muchos nombres, en el presente documento se usarán los términos “ILT2” (LILRB1) e “ILT4” (LILRB2). Los agentes incluyen, entre otros, polipéptidos tales como anticuerpos que se unen específicamente a ILT2, ILT4 o tanto a ILT2 como a ILT4. En general, los agentes denominados en el presente documento “agentes de unión a ILT” abarcan agentes de unión a ILT2, agentes de unión a ILT4 y agentes que se unen tanto a ILT2 como a ILT4 (denominados “agentes de unión a ILT2/ILT4”).
En un primer aspecto, la invención proporciona un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo que se une específicamente tanto al transcrito 2 similar a la inmunoglobulina humana (ILT2) como al transcrito 4 similar a la inmunoglobulina humana (ILT4), que comprende: una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 (VH-CDR1), una región variable de cadena pesada CDR2 (VH-CDR2) y una región variable de cadena pesada CDR3 (VH-CDR3) de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 144; y una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 (VL-CDR1), una región variable de cadena ligera CDR2 (VL-CDR2) y una región variable de cadena ligera CDR3 (VL-CDR3) de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 145; en donde las CDR se determinan de acuerdo con los sistemas de numeración Kabat, Chothia, Contact, IMGT o AbM.
En un segundo aspecto, la invención proporciona un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo que se une específicamente tanto al transcrito 2 similar a la inmunoglobulina humana (ILT2) como al transcrito 4 similar a la inmunoglobulina humana (ILT4), que comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, en donde
(1) la región variable de cadena pesada comprende una VH-CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 115, una VH-CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 112 y una VH-CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 107; y la región variable de cadena ligera comprende una VL-CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 89, una VL-CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 90 y una VL-CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 91;
(2) la región variable de cadena pesada comprende una VH-CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 111, una VH-CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 112 y una VH-CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 107; y la región variable de cadena ligera comprende una VL-CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 89, una VL-CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 90 y una VL-CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 91;
(3) la región variable de cadena pesada comprende una VH-CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 76, una VH-CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 113 y una VH-CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 107; y la región variable de cadena ligera comprende una VL-CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 89, una VL-CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 90 y una VL-CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 91;
(4) la región variable de cadena pesada comprende una VH-CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 111, una VH-CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 114 y una VH-CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 107; y la región variable de cadena ligera comprende una VL-CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 89, una VL-CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 90 y una VL-CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 91; o
(5) la región variable de cadena pesada comprende una VH-CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 116, una VH-CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 124 y una VH-CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 110; y la región variable de cadena ligera comprende una VL-CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 99, una VL-CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 100 y una VL-CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 101.
En algunas realizaciones, la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 144.
En algunas realizaciones, la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 145.
En algunas realizaciones, la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 144 y la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 145.
En algunas realizaciones, la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 144 y la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 145.
En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 156 y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 157.
En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 156 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 157.
En un tercer aspecto, la invención proporciona un anticuerpo, o un fragmento funcional del mismo, que se une específicamente tanto al transcrito 2 similar a la inmunoglobulina humana (ILT2) como al transcrito 4 similar a la inmunoglobulina humana (ILT4), que comprende: una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 (VH-CDR1), una región variable de cadena pesada CDR2 (VH-CDR2) y una región variable de cadena pesada CDR3 (VH-CDR3) de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 143; y una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 (VL-CDR1), una región variable de cadena ligera CDR2 (VL-CDR2) y una región variable de cadena ligera CDR3 (VL-CDR3) de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 142; en donde las CDR se determinan de acuerdo con los sistemas de numeración Kabat, Chothia, Contact, IMGT o AbM.
En un cuarto aspecto, la invención proporciona un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo que se une específicamente tanto al transcrito 2 similar a la inmunoglobulina humana (ILT2) como al transcrito 4 similar a la inmunoglobulina humana (ILT4), que comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, en donde
(1) la región variable de cadena pesada comprende una VH-CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 115, una VH-CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 112 y una VH-CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 107; y la región variable de cadena ligera comprende una VL-CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 89, una VL-CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 90 y una VL-CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 91;
(2) la región variable de cadena pesada comprende una VH-CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 111, una VH-CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 112 y una VH-CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 107; y la región variable de cadena ligera comprende una VL-CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 89, una VL-CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 90 y una VL-CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 91;
(3) la región variable de cadena pesada comprende una VH-CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 76, una VH-CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 113 y una VH-CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 107; y la región variable de cadena ligera comprende una VL-CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 89, una VL-CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 90 y una VL-CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 91;
(4) la región variable de cadena pesada comprende una VH-CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 111, una VH-CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 114 y una VH-CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 107; y la región variable de cadena ligera comprende una VL-CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 89, una VL-CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 90 y una VL-CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 91; o
(5) la región variable de cadena pesada comprende una VH-CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 116, una VH-CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 117 y una VH-CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 110; y la región variable de cadena ligera comprende una VL-CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 99, una VL-CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 100 y una VL-CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 101.
En algunas realizaciones, la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 143.
En algunas realizaciones, la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 142.
En algunas realizaciones, la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 143 y la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 142.
En algunas realizaciones, la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 143 y la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 142.
En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo biespecífico o un anticuerpo multiespecífico; un anticuerpo monocatenario, un anticuerpo de doble región variable o un diacuerpo.
En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo IgG1, tal como un anticuerpo IgG1 humano, o un anticuerpo IgG1 humano que tiene una función efectora reducida o nula.
En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo IgG2, tal como un anticuerpo IgG2 humano.
En algunas realizaciones, un anticuerpo IgG4, tal como un anticuerpo IgG4 humano.
En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una región constante de cadena ligera kappa, opcionalmente una región constante de cadena ligera kappa humana; o el anticuerpo comprende una región constante de cadena ligera lambda, opcionalmente una región constante de cadena ligera lambda humana; y/o
En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo se adhiere a un resto que prolonga la semivida.
En algunas realizaciones, el fragmento de anticuerpo funcional comprende al menos un sitio de unión al antígeno. En algunas realizaciones, el fragmento de anticuerpo es un Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, (scFv)2.
En un quinto aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento del mismo de los aspectos primero a cuarto y un portador farmacéuticamente aceptable.
En un sexto aspecto, la invención proporciona un polinucleótido aislado o un conjunto de polinucleótidos aislados que codifican el anticuerpo o fragmento del mismo de los aspectos primero a cuarto.
En un séptimo aspecto, la invención proporciona un vector o un conjunto de vectores que comprenden el polinucleótido o conjunto de polinucleótidos del sexto aspecto.
En un octavo aspecto, la invención proporciona una célula aislada que comprende el polinucleótido o conjunto de polinucleótidos del sexto aspecto o el vector o conjunto de vectores del séptimo aspecto; o que produce un anticuerpo del primer al cuarto aspecto.
En un noveno aspecto, la invención proporciona un anticuerpo o fragmento del mismo como se define en los aspectos primero a cuarto o una composición farmacéutica como se define en el quinto aspecto para su uso en un método para tratar el cáncer, inhibir el crecimiento tumoral o inhibir la recaída tumoral o el recrecimiento tumoral en un sujeto.
En algunas realizaciones, el cáncer es mesotelioma, glioblastoma, carcinoma renal, carcinoma broncopulmonar no microcítico, melanoma, adenocarcinoma ductal pancreático, cáncer gástrico, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, cáncer de vías biliares, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer endocervical, cáncer colorrectal o cáncer de esófago; o en donde el tumor es un tumor pancreático, un tumor de mama, un tumor de pulmón, un carcinoma broncopulmonar no microcítico, un tumor de cabeza y cuello, un tumor colorrectal, un tumor de próstata, un tumor de piel, un melanoma, un tumor gástrico, un tumor colorrectal, un tumor de ovario, un tumor cervical, un tumor uterino, un tumor de endometrio, un tumor endocervical, un tumor de vejiga, un tumor cerebral, un tumor de esófago, un tumor de hígado, un tumor de riñón, un tumor renal, un mesotelioma, un glioblastoma, un tumor de las vías biliares o un tumor testicular.
En algunas realizaciones, el método comprende la administración de un agente terapéutico adicional. En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional comprende un anticuerpo anti-PD-1 o un anticuerpo anti-PD-L1. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 es pembrolizumab, pidilizumab, nivolumab, durvalumab, cemiplimab, tislelizumab, spartalizumab o STI-A1110. En una realización específica, el método comprende la administración de pembrolizumab.
En un décimo aspecto, la invención proporciona una combinación que comprende un anticuerpo anti-PD-1 y el anticuerpo o fragmento funcional del mismo tal como se define en los aspectos primero a cuarto, o el producto farmacéutico tal como se define en el quinto aspecto.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 es pembrolizumab, pidilizumab, nivolumab, durvalumab, cemiplimab, tislelizumab, spartalizumab o STI-A1110. En una realización específica, el anticuerpo anti-PD-1 es pembrolizumab.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. La expresión de ILT2 e ILT4 en varias células inmunitarias se ensayó mediante citometría de flujo. Figura 2. Inhibición de la interacción entre ILT2 o ILT4 y las moléculas del MHC I por parte de los anticuerpos anti-ILT.
Figura 3. Unión de los anticuerpos anti-ILT2/ILT4 a los monocitos.
Figura 4A y 4B. Inhibición de la interacción entre ILT2 o ILT4 y las moléculas de MHC I por parte de los anticuerpos anti-ILT.
Figura 5. Inhibición de la interacción entre ILT2 deM. fascicularisy las moléculas del MHC I por parte de los anticuerpos anti-ILT.
Figura 6 . Efecto de los anticuerpos anti-ILT sobre la actividad citolítica de las células NKL.
Figura 7. Efecto de los anticuerpos anti-ILT sobre la actividad de las células NK primarias humanas.
Figura 8. Efecto de los anticuerpos anti-ILT sobre la actividad citolítica de las células NK primarias.
Figura 9. Efecto de los anticuerpos anti-ILT sobre la actividad citolítica de las células NK primarias en el ensayo de ADCC con células diana clásicas que expresan MHC-I.
Figura 10. Efecto de los anticuerpos anti-ILT sobre la actividad de las MDSC en el ensayo MLR.
Figuras 11A-11C. Efecto de los anticuerpos anti-ILT sobre la actividad de las MDSC en el ensayo MLR.
Figura 12. Efecto de los anticuerpos anti-ILT sobre la estimulación mediada por LPS de las PBMC humanas, examinado mediante la producción de citocinas.
Figura 13. Efecto de los anticuerpos anti-ILT sobre la estimulación mediada por LPS de las PBMC deM. fascicularis, examinado mediante la producción de citocinas.
Figura 14. Efecto de los anticuerpos anti-ILT sobre la estimulación mediada por LPS de las células dendríticas toleradas, examinado mediante la producción de citocinas.
Figura 15. Efecto de los anticuerpos anti-ILT sobre la producción de citocinas a partir de células tratadas con HMGB 1.
Figura 16. Efecto de los anticuerpos anti-ILT sobre la producción de citocinas a partir de células tratadas con agonistas de STING.
Figura 17. Efecto de los anticuerpos anti-ILT en la supresión de la estimulación de las células mieloides mediada por células T.
Figura 18. Efecto de los anticuerpos anti-ILT sobre la fagocitosis de los macrófagos.
Figura 19. Efecto de los anticuerpos anti-ILT sobre la producción de citocinas por las células dendríticas. Figura 20. Efecto de los anticuerpos anti-ILT sobre la producción de citocinas a partir de células sanguíneas humanas.
Figura 21. Efecto de los anticuerpos anti-ILT sobre la producción de citocinas a partir de células sanguíneas deM. fascicularis.
Figura 22. Efecto de los anticuerpos anti-ILT sobre la actividad citolítica de las células T.
Figuras 23A-23C. Efectos sinérgicos de un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 y un anticuerpo anti-PD-1 sobre la activación de las células T y la liberación de citocinas de las células T.
Figura 24. Efectos de los anticuerpos anti-ILT2/ILT4 sobre la polarización de los macrófagos derivados de monocitos mediante el ensayo de los marcadores de expresión mediante citometría de flujo.
Descripción detallada
La siguiente divulgación se refiere a diversos agentes de unión, anticuerpos y fragmentos funcionales de estos, sin embargo, solo los anticuerpos tal como se definen en las reivindicaciones forman parte de la invención. De los anticuerpos nombrados divulgados en este documento (27F9, 47C8, 48A5, 47H6, 51A1, 64A12, 73C4 y 73D1), solo se reivindican las CDR, los dominios variables y las cadenas completas del anticuerpo 73D1 y sus versiones humanizadas. Cualquier composición farmacéutica que comprenda, o polinucleótidos que codifiquen, dichos agentes de unión, anticuerpos o fragmentos funcionales de estos, o vectores que contengan dichos polinucleótidos, o células que comprendan dichos polinucleótidos o vectores forman parte de la invención solo si se refieren a los anticuerpos definidos en las reivindicaciones. Todas las demás combinaciones se incluyen solo con fines de referencia.
La presente divulgación proporciona agentes novedosos, incluyendo, entre otros, polipéptidos tales como anticuerpos, que se unen al transcrito similar a la inmunoglobulina 2 (ILT2), al transcrito similar a la inmunoglobulina 4 (ILT4) o tanto a ILT2 como a ILT4. Tal como se usa en el presente documento, el término “agentes de unión a ILT” se refiere a agentes de unión a ILT2, agentes de unión a ILT4 y agentes de unión a ILT2/ILT4. Como se usa en el presente documento, “agentes de unión a ILT2/ILT4” se refiere a agentes que se unen tanto a ILT2 como a ILT4, y también pueden denominarse aglutinantes dobles de ILT2/ILT4. Los agentes de unión a ILT incluyen, entre otros, polipéptidos, anticuerpos (incluidos sus fragmentos de unión a antígenos), proteínas de armazón y moléculas heterodiméricas. Los agentes de unión a ILT incluyen, entre otros, antagonistas de la actividad de ILT2 y/o ILT4, inhibidores de la actividad de ILT2 y/o ILT4 y/o agentes que inhiben la actividad depresora de ILT2 y/o ILT4. También se proporcionan polipéptidos, polinucleótidos, vectores, composiciones que comprenden los agentes, células que comprenden los polinucleótidos o vectores relacionados y métodos para fabricar los agentes. También se proporcionan métodos para usar los nuevos agentes de unión a ILT.
I. Definiciones
A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado que entienden habitualmente los expertos en la técnica. Cuando sea apropiado, los términos usados en singular también incluirán el plural y viceversa. En el caso de que cualquier descripción de un término establecido entre en conflicto con cualquier documento incorporado en el presente documento por referencia, prevalecerá la descripción del término establecida a continuación.
El término “agente de unión”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula que se une a un antígeno o diana específicos (por ejemplo, ILT2 y/o ILT4). Un agente de unión puede comprender una proteína, un péptido, un ácido nucleico, un carbohidrato, un lípido o un compuesto de peso molecular pequeño. En algunas realizaciones, un agente de unión comprende un anticuerpo de longitud completa. En algunas realizaciones, un agente de unión es un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo. En algunas realizaciones, un agente de unión comprende un armazón proteico alternativo o un armazón artificial (por ejemplo, una cadena principal que no es de inmunoglobulina). En algunas realizaciones, un agente de unión es una proteína de fusión que comprende un sitio de unión al antígeno. En algunas realizaciones, un agente de unión es una molécula biespecífica o multiespecífica que comprende al menos un sitio de unión al antígeno.
El término “anticuerpo” se usa en el presente documento en el sentido más amplio y abarca diversas estructuras de anticuerpos, incluyendo, entre otros, una molécula de inmunoglobulina que reconoce y se une a una diana a través de al menos un sitio de unión al antígeno, anticuerpos policlonales, anticuerpos recombinantes, anticuerpos monoclonales, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos multiespecíficos, diacuerpos, tricuerpos, tetracuerpos, anticuerpos Fv monocatenarios (scFv) y fragmentos de anticuerpos siempre que muestren la actividad de unión al antígeno deseada.
El término “anticuerpo intacto” o “anticuerpo de longitud completa” se refiere a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a la estructura de un anticuerpo natural. Esto incluye, por ejemplo, un anticuerpo que comprende dos cadenas ligeras, cada una de las cuales comprende una región variable y una región constante de cadena ligera (CL) y dos cadenas pesadas que comprenden cada una una región variable y al menos las regiones constantes de cadena pesada CH1, CH2 y CH3. En general, un anticuerpo intacto incluye una región bisagra (o una porción de esta) entre las regiones CH1 y CH2.
El término “fragmento de anticuerpo” o “fragmentos de anticuerpo”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo y, en general, un sitio de unión al antígeno. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, entre otros, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, moléculas de anticuerpos monocatenarios (por ejemplo, scFv), sc(Fv)2, scFv enlazados a disulfuro (dsscFv), diacuerpos, tricuerpos, tetracuerpos, minicuerpos, anticuerpos de dominio variable doble (DVD), anticuerpos de dominio variable único (por ejemplo, anticuerpos de camélido) y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.
El término “anticuerpo monoclonal”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una población de anticuerpos sustancialmente homogénea implicada en el reconocimiento y la unión altamente específicos de un único determinante antigénico o epítopo. El término “anticuerpo monoclonal” abarca anticuerpos monoclonales intactos y de longitud completa, así como fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), anticuerpos monocatenarios (por ejemplo, scFv), proteínas de fusión que comprenden un fragmento de anticuerpo y cualquier otra molécula de inmunoglobulina modificada que comprenda al menos un sitio de unión al antígeno. Asimismo, “anticuerpo monoclonal” se refiere a dichos anticuerpos preparados mediante cualquier número de procedimientos, incluyendo, entre otros, la producción de hibridomas, la presentación de bibliotecas de fagos, la expresión recombinante y los animales transgénicos.
El término “anticuerpo quimérico” se refiere a un anticuerpo en el que una porción de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una primera fuente o especie, mientras que el remanente de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie diferente.
El término “anticuerpo humanizado”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada humana y una región variable de cadena ligera en donde los residuos aminoacídicos de las CDR naturales se sustituyen por residuos de las CDR correspondientes de un anticuerpo no humano (por ejemplo, ratón, rata, conejo o primate no humano), en donde el anticuerpo no humano tiene la especificidad, la afinidad y/o la actividad deseadas. En algunas realizaciones, uno o más residuos aminoacídicos de la región marco de las regiones variables de la cadena pesada o ligera humana se reemplazan por los residuos correspondientes del anticuerpo no humano. Asimismo, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos aminoacídicos que no se encuentran en el anticuerpo humano o en el anticuerpo no humano. En algunas realizaciones, estas modificaciones se hacen para refinar y/u optimizar aún más las características de los anticuerpos. En algunas realizaciones, el anticuerpo humanizado comprende al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina humana (por ejemplo, CH1, CH2, CH3, Fc y/o región bisagra).
El término “anticuerpo humano” como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un ser humano y/o un anticuerpo que se ha preparado usando cualquiera de los procedimientos conocidos por un experto en la técnica para fabricar anticuerpos humanos. Estos procedimientos incluyen, entre otros, bibliotecas de presentación de fagos, bibliotecas de presentación de levaduras, animales transgénicos, producción de proteínas recombinantes y tecnología de hibridomas de células B.
Los términos “epítopo” y “determinante antigénico” se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a la porción de un antígeno o diana que puede ser reconocida y unida por un anticuerpo particular. Cuando el antígeno o la diana es un polipéptido, los epítopos pueden formarse tanto a partir de aminoácidos contiguos como de aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por el plegamiento terciario de la proteína. Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos (también denominados epítopos lineales) se retienen normalmente tras la desnaturalización de las proteínas, mientras que los epítopos formados por plegamiento terciario (también denominados epítopos conformacionales) se pierden normalmente tras la desnaturalización de las proteínas. Un epítopo normalmente incluye al menos 3, y más habitualmente, al menos 5, 6, 7 u 8 10 aminoácidos en una conformación espacial única. Los epítopos se pueden predecir usando cualquiera de las numerosas herramientas bioinformáticas de programas informáticos disponibles en Internet. La cristalografía de rayos X se puede usar para caracterizar un epítopo en una proteína diana mediante el análisis de las interacciones entre los residuos aminoacídicos de un complejo antígeno/anticuerpo.
El término “se une específicamente”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un agente que interactúa más frecuentemente, más rápidamente, con mayor duración, con mayor afinidad o con alguna combinación de los anteriores con un antígeno, un epítopo, una proteína o una molécula diana particular que con sustancias alternativas. Un agente de unión que se une específicamente a un antígeno puede identificarse, por ejemplo, mediante inmunoensayos, ELISA, resonancia de plasmones superficiales (SPR, por sus siglas en inglés) u otros procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. En algunas realizaciones, un agente que se une específicamente a un antígeno (por ejemplo, ILT2 humano) puede unirse a antígenos relacionados (por ejemplo, ILT2 deM. mulatta(“Rhesus”) y/o ILT2 deM. fascicularis(“cyno”)). En algunas realizaciones, un agente que se une específicamente a un antígeno (por ejemplo, ILT2 humano) puede unirse a un segundo antígeno (por ejemplo, ILT4 humano) y en el presente documento se denomina “aglutinante doble”. En algunas realizaciones, un agente de unión que se une específicamente a un antígeno puede unirse al antígeno diana con una afinidad mayor que su afinidad por un antígeno diferente. El antígeno diferente puede ser un antígeno relacionado. En algunas realizaciones, un agente de unión que se une específicamente a un antígeno puede unirse al antígeno diana con una afinidad que sea al menos 20 veces mayor, al menos 30 veces mayor, al menos 40 veces mayor, al menos 50 veces mayor, al menos 60 veces mayor, al menos 70 veces mayor, al menos 80 veces mayor, al menos 90 veces mayor o al menos 100 veces mayor que su afinidad por un antígeno diferente. En algunas realizaciones, un agente de unión que se une específicamente a un antígeno particular se une a un antígeno diferente con una afinidad tan baja que la unión no puede detectarse usando un ensayo descrito en el presente documento o conocido de otro modo en la técnica. En algunas realizaciones, la afinidad se mide usando la tecnología SPR en un sistema Biacore como se describe en el presente documento o como conocen los expertos en la técnica.
Los términos “polipéptido” y “péptido” y “proteína” se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados y puede estar interrumpido no por aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que se ha modificado de forma natural o mediante intervención; por ejemplo, la formación de uniones disulfuro, la glucosilación, la lipidación, la acetilación, la fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación. También se incluyen en la definición, por ejemplo, los polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido, incluyendo, entre otros, aminoácidos no naturales, así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Se entiende que, dado que los polipéptidos de esta divulgación pueden basarse en anticuerpos, el término “polipéptido” abarca los polipéptidos como una sola cadena y los polipéptidos de dos o más cadenas asociadas.
Los términos “polinucleótido” y “ácido nucleico” y “molécula de ácido nucleico” se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud e incluyen ADN y ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos o bases modificados, y/o sus análogos, o cualquier sustrato que pueda incorporarse en un polímero mediante la ADN o la ARN polimerasa.
Los términos “idéntico” o porcentaje de “identidad” en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje específico de nucleótidos o residuos aminoacídicos que son iguales, cuando se comparan y se alinean (introduciendo huecos, si es necesario) para una correspondencia máxima, sin considerar ninguna sustitución conservadora de aminoácidos como parte de la identidad de secuencia. El porcentaje de identidad se puede medir usando programas informáticos o algoritmos de comparación de secuencias o mediante inspección visual. En la técnica son bien conocidos diversos algoritmos y programas informáticos que pueden usarse para obtener alineamientos de secuencias de aminoácidos o nucleótidos. Estos incluyen, entre otros, BLAST, ALIGN, Megalign, BestFit, GCG Wisconsin Package y variantes de estos. En algunas realizaciones, dos ácidos nucleicos o polipéptidos de la divulgación son sustancialmente idénticos, lo que significa que tienen al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 % y, en algunas realizaciones, al menos un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % de identidad de residuos de nucleótidos o aminoácidos, cuando se comparan y alinean para lograr la máxima correspondencia, medida usando un algoritmo de comparación de secuencias o mediante inspección visual. En algunas realizaciones, la identidad existe en una región de las secuencias que tiene al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 20-40, al menos aproximadamente 40-60, al menos aproximadamente 60-80 nucleótidos o residuos aminoacídicos de longitud, o cualquier valor integral intermedio. En algunas realizaciones, la identidad existe en una región más larga que 60-80 nucleótidos o residuos aminoacídicos, tal como al menos aproximadamente 80-100 residuos de nucleótidos o aminoácidos, y, en algunas realizaciones, las secuencias son sustancialmente idénticas en toda la longitud de las secuencias que se comparan, por ejemplo, (i) la región codificante de una secuencia de nucleótidos o (ii) una secuencia de aminoácidos.
La expresión “sustitución conservadora de aminoácidos”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una sustitución en la que un residuo de aminoácido se reemplaza por otro residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos aminoacídicos que tienen cadenas laterales similares se han definido generalmente en la técnica, incluyendo cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales con ramificaciones beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo,tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por ejemplo, la sustitución de una alanina por una valina se considera una sustitución conservadora. En general, las sustituciones conservadoras en las secuencias de polipéptidos y/o anticuerpos no anulan la unión del polipéptido o anticuerpo al sitio de unión diana. Los métodos para identificar sustituciones conservadoras de nucleótidos y aminoácidos que no eliminan la unión son bien conocidos en la técnica.
El término “vector”, tal como se usa en el presente documento, significa una construcción que es capaz de suministrar, y habitualmente expresar, uno o más genes o secuencias de interés en una célula hospedadora. Los ejemplos de vectores incluyen, entre otros, vectores virales, vectores de expresión de ADN o ARN desnudos, vectores de plásmidos, cósmidos o fagos, vectores de expresión de ADN o ARN asociados con agentes fusionantes catiónicos y vectores de expresión de ADN o ARN encapsulados en liposomas.
El término “aislado”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un polipéptido, una proteína soluble, un anticuerpo, un polinucleótido, un vector, una célula o una composición que está en una forma que no se encuentra en la naturaleza. Un anticuerpo “aislado” está sustancialmente exento de material de la fuente celular de la que se deriva. En algunas realizaciones, los polipéptidos, proteínas solubles, anticuerpos, polinucleótidos, vectores, células o composiciones aislados son aquellos que se han purificado hasta el punto de que ya no están en la forma en la que se encuentran en la naturaleza. En algunas realizaciones, un polipéptido, una proteína soluble, un anticuerpo, un polinucleótido, un vector, una célula o una composición que se aísla son sustancialmente puros. Un polipéptido, una proteína soluble, un anticuerpo, un polinucleótido, un vector, una célula o una composición se puede aislar de una fuente natural (por ejemplo, tejido) o de una fuente tal como una estirpe celular modificada.
El término “sustancialmente puro”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un material que es al menos un 50 % puro (es decir, exento de contaminantes), al menos un 90 % puro, al menos un 95 % puro, al menos un 98 % puro o al menos un 99 % puro.
El término “sujeto” se refiere a un animal (por ejemplo, un mamífero), incluyendo, entre otros, seres humanos, primates no humanos, caninos, felinos, conejos, roedores y similares.
El término “farmacéuticamente aceptable”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una sustancia aprobada o que puede aprobarse por una agencia reguladora o incluida en la Farmacopea de los Estados Unidos, la Farmacopea Europea u otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en animales, incluidos seres humanos.
Los términos “excipiente, portador o adyuvante farmacéuticamente aceptable” o “portador farmacéutico aceptable”, tal como se usan en el presente documento, se refieren a un excipiente, un portador o un adyuvante que se puede administrar a un sujeto, junto con al menos un agente terapéutico, y que generalmente es seguro, no tóxico y no tiene ningún efecto sobre la actividad farmacológica del agente terapéutico. En general, los expertos en la técnica y las agencias gubernamentales consideran que un excipiente, un portador o un adyuvante farmacéuticamente aceptable es un ingrediente inactivo de cualquier formulación.
El término “formulación farmacéutica” o “composición farmacéutica”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una preparación que está en una forma tal que permite que la actividad biológica del agente sea eficaz. Una formulación o composición farmacéutica generalmente comprende componentes adicionales, tales como un excipiente, un portador, un adyuvante, tampones, etc. farmacéuticamente aceptables.
El término “cantidad eficaz” o “cantidad terapéuticamente eficaz”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la cantidad de un agente que es suficiente para reducir y/o mejorar la gravedad y/o la duración de (i) una enfermedad, un trastorno o una afección en un sujeto, y/o (ii) un síntoma en un sujeto. El término también abarca la cantidad de un agente necesaria para la (i) reducción o mejora del avance o la progresión de una enfermedad, un trastorno o una afección dada, (ii) reducción o mejora de la recurrencia, el desarrollo o la aparición de una enfermedad, un trastorno o una afección dada, y/o (iii) la mejora o el aumento de los efectos profilácticos o terapéuticos de otro agente o terapia(porejemplo, un agente distinto de los agentes de unión proporcionados en el presente documento).
El término “efecto terapéutico”, tal como se usa en el presente documento, se refiere al efecto y/o la capacidad de un agente para reducir y/o mejorar la gravedad y/o la duración de (i) una enfermedad, un trastorno o una afección en un sujeto, y/o (ii) un síntoma en un sujeto. El término también abarca la capacidad de un agente para (i) la reducción o la mejora del avance o la progresión de una enfermedad, un trastorno o una afección dada, (ii) la reducción o la mejora de la recurrencia, el desarrollo o la aparición de una enfermedad, un trastorno o una afección dada, y/o (iii) la mejora o el aumento de los efectos profilácticos o terapéuticos de otro agente o terapia (por ejemplo,un agente distinto de los agentes de unión proporcionados en el presente documento).
El término “tratar” o “tratamiento” o “que trata” o “para tratar” o “aliviar” o “alivio” o “que alivia” o “para aliviar”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a medidas terapéuticas que tienen como objetivo ralentizar, disminuir los síntomas y/o detener la progresión de una afección o un trastorno patológico. Así, las personas que necesitan tratamiento incluyen a las que ya padecen el trastorno.
El término “prevenir” o “prevención” o “que previene”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la inhibición parcial o total del desarrollo, la recurrencia, la aparición o la propagación de una enfermedad, un trastorno o una afección, o un síntoma de esta en un sujeto.
El término “respuesta inmunitaria”, tal como se usa en el presente documento, incluye respuestas tanto del sistema inmunitario innato como del sistema inmunitario adaptativo. Incluye respuestas inmunitarias mediadas por células y/o humorales. Incluye las respuestas de las células T y las células B, así como las respuestas de otras células del sistema inmunitario, como las células NK, los monocitos, los macrófagos, las células dendríticas, etc.
Tal como se usa en el presente documento, la referencia a “aproximadamente” o “alrededor de” un valor o parámetro incluye (y describe) las realizaciones que se refieren a ese valor o parámetro. Por ejemplo, una descripción que hace referencia a “aproximadamente X” incluye la descripción de “X”.
Tal como se usa en la presente divulgación y en las reivindicaciones, las formas en singular “un”, “uno/una” y “el/la” incluyen formas en plural a menos que el contexto dicte claramente de otro modo lo contrario.
Se entiende que siempre que las realizaciones se describan en el presente documento con el término “que comprende”, también se proporcionan realizaciones análogas descritas en términos de “que consiste en” y/o “que consiste esencialmente en”. Se entiende también que siempre que las realizaciones se describan en el presente documento con la expresión “que consiste esencialmente en”, también se proporcionan realizaciones análogas descritas de otro modo en términos de “que consiste en”.
El término “y/o”, como se usa en una expresión tal como “A y/o B” en el presente documento, incluye tanto A como B; A o B; A (solo) y B (solo). Igualmente, el término “y/o”, como se usa en una expresión tal como “A, B y/o C”, abarca cada una de las siguientes realizaciones: A, B y C; A, B o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B; B y C; A (solo); B (solo) y C (solo).
II. Agentes aglutinantes de ILT
Secuencias de aminoácidos (aa) para ILT2 humano (UniProtKB n.° Q8NHL6), ILT4 humano (UniProtKB n.° Q8N423), ILT2 deM. mulatta(número de referencia del NCBI XP_028694980.1), y ILT2 (la secuencia interna deM. fascicularistiene un 98 % de identidad con UniProtKB n.° AOA2K5VN04) se proporcionan en el presente documento como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:15 y SEQ ID NO:166, respectivamente. Como se usa en el presente documento, la referencia a las posiciones de aminoácidos de ILT2 o ILT4 se refiere a la numeración de las secuencias de aminoácidos incluida la secuencia de señales.
En el genoma del mono se encuentra un ortólogo genómico para ILT2 humano, sin embargo, no parece existir ningún ortólogo genómico para ILT4 humano. Los patrones de expresión del ortólogo de ILT2 de mono son comparables a los patrones de expresión combinados de ILT2 humano y ILT4 humano. Sin pretender imponer ninguna teoría, se cree que el ortólogo de ILT2 en monos puede tener capacidades biológicas/funcionales equivalentes a una combinación de las funciones biológicas de ILT2 humano y de ILT4 humano.
La ILT2 es una proteína transmembrana de tipo I de un solo paso con un peso molecular previsto de alrededor de 71 kDa. La ILT2 (humana, deM. mulattayM. fascicularis)se caracteriza por un dominio extracelular que comprende cuatro dominios de tipo C2 similares a Ig, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático largo que contiene 4 dominios ITIM (véase, por ejemplo, Borges et al., 1997,J. Immunol.,159:5192-5196). Los cuatro dominios de tipo C2 de tipo Ig pueden referirse en el presente documento como dominio 1 (D1), dominio 2 (D2), dominio 3 (D3) y dominio 4 (D4). El D1 está situado en la porción N-terminal de la proteína, luego D2, D3, con D4 situado más cerca de la región transmembrana. Como se caracteriza en UniProtKB, ILT2 humano es una proteína de 650 aminoácidos (aa): la secuencia señal tiene 1-23 aa, el dominio extracelular tiene 24 461 aa, la región transmembrana tiene 462-482 aa y el dominio citoplasmático tiene 483-650 aa. Dentro del dominio extracelular, el D1 tiene 27-115 aa, el D2 tiene 116-221 aa, el D3 tiene 222-312 aa, el D4 tiene 313 409 aa y la “región precursora” tiene 410-461 aa. Dentro del dominio citoplasmático, los ITIM tienen 531-536, 560-565, 612-617 y 642-647 aa. La ILT2 deM. mulattaes una proteína de 639 aminoácidos (aa); en comparación con la caracterización estructural de ILT2 humano, la secuencia señal tiene 1-23 aa, el dominio extracelular tiene 24-460 aa, la región transmembrana tiene 461 -481 aa y el dominio citoplasmático tiene 482 639 aa. Dentro del dominio extracelular, el D1 tiene 27-114 aa, el D2 tiene 115-220 aa, el D3 tiene 221-311 aa, el D4 tiene 312-408 aa y la “región precursora” tiene 409-460 aa. Dentro del dominio citoplasmático, los ITIM tienen 530-535, 559-564, 601 -606 y 631 -636 aa. La ILT2 deM. fascicularises una proteína de 651 aminoácidos (aa); en comparación con la caracterización estructural de ILT2 humano, la secuencia señal tiene 1-23 aa, el dominio extracelular tiene 24-461 aa, la región transmembrana tiene 462-482 aa y el dominio citoplasmático tiene 483-651 aa. Dentro del dominio extracelular, el D1 tiene 27-114 aa, el D2 tiene 115-220 aa, el D3 tiene 221-311 aa, el D4 tiene 312-408 aa y la “región precursora” tiene 409-461 aa. Dentro del dominio citoplasmático, los ITIM tienen 531-536, 561-566, 613-618 y 643-648 aa. La ILT2 se expresa (en diversos grados) en células NK, monocitos, macrófagos, eosinófilos, basófilos, células dendríticas (DC), subconjunto de células T y células B. Se sabe que varios ligandos interactúan con ILT2, incluidas las moléculas de h La de clase I (por ejemplo, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F y HLA-G). La ILT2 parece unirse más fuertemente a la molécula HlA-G del MHC I “no clásica” que a las moléculas de HLA de clase I clásicas.
La ILT4 tiene una estructura muy similar a la de ILT2. Es una proteína transmembrana de tipo I de un solo paso con un peso molecular previsto de alrededor de 65 kDa. La ILT4 se caracteriza por un dominio extracelular que comprende cuatro dominios de tipo C2 similares a Ig, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático largo que contiene 3 dominios ITIM (véase, por ejemplo, Borges et al., 1997,J. Immunol.,159:5192-5196). Como se describe para ILT2, los cuatro dominios de tipo C2 similares a Ig pueden referirse en el presente documento como D1, D2, D3 y D4. El D1 está situado en la porción N-terminal de la proteína, luego D2, D3, con D4 situados más cerca de la región transmembrana. Como se caracteriza en UniProtKB, ILT2 humano es una proteína de 598 aminoácidos (aa): la secuencia señal tiene 1-21 aa, el dominio extracelular tiene 22-461 aa, la región transmembrana tiene 462-482 aa y el dominio citoplasmático tiene 483-598 aa. Dentro del dominio extracelular, D1 es un 27-110, D2 es un 111 -229, D3 es un 230-318, D4 es un 330-419 y la “región precursora” es un 420-461. Dentro del dominio citoplasmático, los ITIM tienen 531 -536, 560-565 y 590-595 aa. La ILT4 se expresa en células mieloides tales como monocitos, macrófagos, células dendríticas, pero no en células linfoides. Se ha observado que ILT4 se une a una variedad de ligandos, sobre todo, moléculas de HLA de clase l, proteínas ANGPTL, inhibidores de la mielina y p-amiloide.
Se entiende que los dominios de ILT2 o ILT4 (por ejemplo, ILT2 humano, ILT2 deM. mulatta,ILT2 deM. fasciculariso ILT4 humano) pueden definirse de manera diferente por los expertos en la técnica, por lo que los aminoácidos N-terminales y los aminoácidos C-terminales de cualquier dominio o región de ILT2 o ILT4 pueden variar en 1, 2, 3, 4, 5 o más residuos aminoacídicos.
La presente divulgación proporciona agentes que se unen a ILT2, ILT4 o ILT2 e ILT4, es decir, agentes de unión a ILT. Los agentes que se unen tanto a ILT2 como a ILT4 (agentes de unión a ILT2/ILT4) pueden referirse en el presente documento como “aglutinantes dobles”. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a ILT2 o a un fragmento de ILT2. En algunas realizaciones, un fragmento de ILT2 comprende el dominio extracelular de ILT2. En algunas realizaciones, un fragmento de ILT2 comprende uno o más de los dominios de tipo C2 similares a Ig (por ejemplo, D1, D2, D3 y/o D4). En algunas realizaciones, un fragmento de ILT2 comprende D1 y D2. En algunas realizaciones, un fragmento de ILT2 comprende D2 y D3. En algunas realizaciones, un fragmento de ILT2 comprende D3 y D4. En algunas realizaciones, un fragmento de ILT2 comprende D1, D2 y D3. En algunas realizaciones, un fragmento de ILT2 comprende D2, D3 y D4. En algunas realizaciones, un fragmento de ILT2 comprende uno o más de los dominios de tipo C2 similares a Ig y la región precursora. En algunas realizaciones, un fragmento de ILT2 comprende el precursor D4, el precursor D3-D4 o el precursor D2-D3-D4.
En algunas realizaciones, el dominio extracelular de ILT2 humano comprende los aminoácidos 24-461 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el D1 de ILT2 humano comprende los aminoácidos 27-115 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el D2 de ILT2 humano comprende los aminoácidos 116-221 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el D3 de ILT2 humano comprende los aminoácidos 222-312 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el D4 de ILT2 humano comprende los aminoácidos 313-409 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el D1-D2 de ILT2 humano comprende los aminoácidos 27-221 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el D2-D3 de ILT2 humano comprende los aminoácidos 116-312 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el D3-D4 de ILT2 humano comprende los aminoácidos 222-409 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el D1-D2-D3 de ILT2 humano comprende los aminoácidos 27-312 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el D2-D3-D4 de ILT2 humano comprende los aminoácidos 116-409 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el precursor D4 de ILT2 humano comprende los aminoácidos 313-461 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el precursor D3-D4 de ILT2 humano comprende los aminoácidos 222-461 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el precursor D2-D3-D4 de ILT2 humano comprende los aminoácidos 116-461 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, un fragmento de ILT2 humano comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, un fragmento de ILT2 humano comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, un fragmento de ILT2 humano comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5. En algunas realizaciones, un fragmento de ILT2 humano comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6. En algunas realizaciones, un fragmento de ILT2 humano comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7. En algunas realizaciones, un fragmento de ILT2 humano comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:4 y la SEQ ID NO: 5. En algunas realizaciones, un fragmento de ILT2 humano comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:5 y la SEQ ID NO: 6. En algunas realizaciones, un fragmento de ILT2 humano comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:6 y la SEQ ID NO: 7. En algunas realizaciones, un fragmento de ILT2 humano comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:4, la SEQ ID NO:5 y la SEQ ID NO: 6. En algunas realizaciones, un fragmento de ILT2 humano comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:5, la SEQ ID NO:6 y la SEQ ID NO: 7.
En algunas realizaciones, el dominio extracelular de ILT2 deM. mulattacomprende los aminoácidos 24-460 de la SEQ ID NO: 15. En algunas realizaciones, el D1 de ILT2 deM. mulattacomprende los aminoácidos 27-114 de la SEQ ID NO: 15. En algunas realizaciones, el D2 de ILT2 deM. mulattacomprende los aminoácidos 115 220 de la SEQ ID NO: 15. En algunas realizaciones, el D3 de ILT2 deM. mulattacomprende los aminoácidos 221-311 de la SEQ ID NO: 15. En algunas realizaciones, el D4 de ILT2 deM. mulattacomprende los aminoácidos 312-408 de la SEQ ID NO: 15. En algunas realizaciones, el D1-D2 de ILT2 deM. mulattacomprende los aminoácidos 27-220 de la SEQ ID NO: 15. En algunas realizaciones, el D2-D3 de ILT2 deM. mulattacomprende los aminoácidos 115-311 de la SEQ ID NO: 15. En algunas realizaciones, el D3-D4 de ILT2 deM. mulattacomprende los aminoácidos 221-408 de la SEQ ID NO: 15. En algunas realizaciones, el D1-D2-D3 de ILT2 deM. mulattacomprende los aminoácidos 27-311 de la SEQ ID NO: 15. En algunas realizaciones, el D2-D3-D4 de ILT2 deM. mulattacomprende los aminoácidos 115-408 de la SEQ ID NO: 15. En algunas realizaciones, el precursor de D4 de ILT2 deM. mulattacomprende los aminoácidos 312-460 de la SEQ ID NO: 15. En algunas realizaciones, el precursor de D3-D4 de ILT2 deM. mulattacomprende los aminoácidos 221-460 de la SEQ ID NO: 15. En algunas realizaciones, el precursor de D2-D3-D4 de ILT2 deM. mulattacomprende los aminoácidos 115-460 de la SEQ ID NO: 15. En algunas realizaciones, un fragmento de ILT2 deM. mulattacomprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17. En algunas realizaciones, un fragmento de ILT2 deM. mulattacomprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18. En algunas realizaciones, un fragmento de ILT2 deM. mulattacomprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19. En algunas realizaciones, un fragmento de ILT2 deM. mulattacomprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20. En algunas realizaciones, un fragmento de ILT2 deM. mulattacomprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21. En algunas realizaciones, un fragmento de ILT2 deM. mulattacomprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18 y de la SEQ ID NO: 19. En algunas realizaciones, un fragmento de ILT2 humano comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19 y la SEQ ID NO: 20. En algunas realizaciones, un fragmento de ILT2 humano comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20 y la SEQ ID NO: 21. En algunas realizaciones, un fragmento de ILT2 humano comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:18, la SEQ ID NO:19 y la SEQ ID NO: 20. En algunas realizaciones, un fragmento de ILT2 humano comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19, la SEQ ID NO: 20 y la SEQ ID NO: 21.
En algunas realizaciones, el dominio extracelular de ILT2 deM. fasciculariscomprende los aminoácidos 24-461 de la SEQ ID NO: 166. En algunas realizaciones, el D1 de ILT2 deM. fasciculariscomprende los aminoácidos 27-114 de la SEQ ID NO: 166. En algunas realizaciones, el D2 de ILT2 deM. fasciculariscomprende los aminoácidos 115-220 de la SEQ ID NO: 166. En algunas realizaciones, el D3 de ILT2 deM. fasciculariscomprende los aminoácidos 221-311 de la SEQ ID NO: 166. En algunas realizaciones, el D4 de ILT2 deM. fasciculariscomprende los aminoácidos 312-408 de la SEQ ID NO: 166. En algunas realizaciones, el D1-D2 de ILT2 deM. fasciculariscomprende los aminoácidos 27-220 de la SEQ ID NO: 166. En algunas realizaciones, el D2-D3 de ILT2 deM. fasciculariscomprende los aminoácidos 115-311 de la SEQ ID NO: 166. En algunas realizaciones, el D3-D4 de ILT2 deM. fasciculariscomprende los aminoácidos 221-408 de la SEQ ID NO: 166. En algunas realizaciones, el D1-D2-D3 de ILT2 deM. fasciculariscomprende los aminoácidos 27-311 de la SEQ ID NO: 166. En algunas realizaciones, el D2-D3-D4 de ILT2 deM. fasciculariscomprende los aminoácidos 115-408 de la SEQ ID NO: 166. En algunas realizaciones, el precursor de D4 de ILT2 deM. fasciculariscomprende los aminoácidos 312-461 de la SEQ ID NO: 166. En algunas realizaciones, el precursor de D3-D4 de ILT2 deM. fasciculariscomprende los aminoácidos 221-461 de la SEQ ID NO: 166. En algunas realizaciones, el precursor de D2-D3-D4 de ILT2 deM. fasciculariscomprende los aminoácidos 115-461 de la SEQ ID NO: 166. En algunas realizaciones, un fragmento de ILT2 deM. fasciculariscomprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 168. En algunas realizaciones, un fragmento de ILT2 deM. fasciculariscomprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 169. En algunas realizaciones, un fragmento de ILT2 deM. fasciculariscomprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 170. En algunas realizaciones, un fragmento de ILT2 deM. fasciculariscomprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 171. En algunas realizaciones, un fragmento de ILT2 deM. fasciculariscomprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 172. En algunas realizaciones, un fragmento de ILT2 deM. fasciculariscomprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:169 y la SEQ ID NO: 170. En algunas realizaciones, un fragmento de ILT2 humano comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 170 y la SEQ ID NO: 171. En algunas realizaciones, un fragmento de ILT2 humano comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 171 y la SEQ ID NO: 172. En algunas realizaciones, un fragmento de ILT2 humano comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:169, la SEQ ID NO: 170 y la SEQ ID NO: 171. En algunas realizaciones, un fragmento de ILT2 humano comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:170, la SEQ ID NO: 171 y la SEQ ID NO: 172.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un fragmento de ILT2 (por ejemplo, ILT2 humano, ILT2 deM. mulattay/o ILT2 deM. fascicularis).En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une dentro de una región específica de ILT2. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une dentro del dominio extracelular de ILT2. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une dentro del dominio D1 de ILT2. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une dentro del dominio D2 de ILT2. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une dentro del dominio D3 de ILT2. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une dentro del dominio D4 de ILT2. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une dentro de la región de precursor de D4 de ILT2. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une dentro del dominio D1-D2 de ILT2. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une dentro del dominio D2-D3 de ILT2. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une dentro del dominio D3-D4 de ILT2. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une dentro de los dominios D1-D2-D3 de ILT2. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une dentro de los dominios D2-D3-D4 de ILT2. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un epítopo en ILT2. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un epítopo conformacional en ILT2. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 no se une a otras proteínas LILRB humanas (por ejemplo, ILT3, ILT4, ILT5 o LILRB5). En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 no se une a otras proteínas LILRB humanas (por ejemplo, ILT3, ILT5 o LILRB5). En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 no se une a una o más de las proteínas LILRA humanas (por ejemplo, LILRA1, LILRA2, LILRA4, LILRA5 o LILRA6). En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 no se une a LILRA2, LILRA4, LILRA5 o LILRA6.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a ILT2 humano. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a ILT2 deM. fascicularisy/o a ILT2 deM. mulatta.En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a ILT2 humano, ILT2M. fascicularisy/o a ILT2 deM. mulatta.En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a la SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a la SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un fragmento que comprende los aminoácidos 24-461 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un fragmento que comprende los aminoácidos 27-115 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un fragmento que comprende los aminoácidos 116-221 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un fragmento que comprende los aminoácidos 222-312 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un fragmento que comprende los aminoácidos 313-409 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un fragmento que comprende los aminoácidos 27-221 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un fragmento que comprende los aminoácidos 116-312 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un fragmento que comprende los aminoácidos 222-409 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a la SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a la SEQ ID NO: 5. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a la SEQ ID NO: 6. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a la SEQ ID NO: 7.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a la SEQ ID NO: 15. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a la SEQ ID NO: 16. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a la SEQ ID NO: 17. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un fragmento que comprende los aminoácidos 24-460 de la SEQ ID NO: 15. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un fragmento que comprende los aminoácidos 27-114 de la SEQ ID NO: 15. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un fragmento que comprende los aminoácidos 115-220 de la SEQ ID NO: 15. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un fragmento que comprende los aminoácidos 221 -311 de la SEQ ID NO: 15. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un fragmento que comprende los aminoácidos 312-408 de la SEQ ID NO: 15. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un fragmento que comprende los aminoácidos 27-220 de la SEQ ID NO: 15. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un fragmento que comprende los aminoácidos 115-311 de la SEQ ID NO: 15. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un fragmento que comprende los aminoácidos 221-408 de la SEQ ID NO: 15. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a la SEQ ID NO: 18. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a la SEQ ID NO: 19. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a la SEQ ID NO: 20. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a la SEQ ID NO: 21.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a la SEQ ID NO: 166. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a la SEQ ID NO: 167. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a la SEQ ID NO: 168. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un fragmento que comprende los aminoácidos 24-461 de la SEQ ID NO: 166. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un fragmento que comprende los aminoácidos 27-114 de la SEQ ID NO: 166. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un fragmento que comprende los aminoácidos 115-220 de la SEQ ID NO: 166. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un fragmento que comprende los aminoácidos 221-311 de la SEQ ID NO: 166. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un fragmento que comprende los aminoácidos 312-408 de la SEQ ID NO: 166. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un fragmento que comprende los aminoácidos 27-220 de la SEQ ID NO: 166. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un fragmento que comprende los aminoácidos 115-311 de la SEQ ID NO: 166. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un fragmento que comprende los aminoácidos 221-408 de la SEQ ID NO: 166. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a la SEQ ID NO: 169. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a la SEQ ID NO: 170. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a la SEQ ID NO: 171. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a la SEQ ID NO: 172.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 167. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 168. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 169. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 170. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 171. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 172.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un epítopo que comprende aminoácidos dentro de la SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un epítopo que comprende aminoácidos dentro de la SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un epítopo que comprende aminoácidos dentro de la SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un epítopo que comprende aminoácidos dentro de la SEQ ID NO: 5. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un epítopo que comprende aminoácidos dentro de la SEQ ID NO: 6. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un epítopo que comprende aminoácidos dentro de la SEQ ID NO: 7. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un epítopo que comprende aminoácidos en la SEQ ID NO: 16. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un epítopo que comprende aminoácidos en la SEQ ID NO: 17. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un epítopo que comprende aminoácidos dentro de la SEQ ID NO: 18. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un epítopo que comprende aminoácidos dentro de la SEQ ID NO: 19. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un epítopo que comprende aminoácidos dentro de la SEQ ID NO: 20. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un epítopo que comprende aminoácidos dentro de la SEQ ID NO: 21. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un epítopo que comprende aminoácidos en la SEQ ID NO: 167. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un epítopo que comprende aminoácidos en la SEQ ID NO: 168. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un epítopo que comprende aminoácidos dentro de la SEQ ID NO: 169. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un epítopo que comprende aminoácidos dentro de la SEQ ID NO: 170. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un epítopo que comprende aminoácidos dentro de la SEQ ID NO: 171. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un epítopo que comprende aminoácidos dentro de la SEQ ID NO: 172.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a ILT4 o a un fragmento de ILT4. En algunas realizaciones, un fragmento de ILT4 comprende el dominio extracelular de ILT4. En algunas realizaciones, un fragmento de ILT4 comprende uno o más de los dominios de tipo C2 similares a Ig (por ejemplo, D1, D2, D3 y/o D4). En algunas realizaciones, un fragmento de ILT4 comprende D1 y D2. En algunas realizaciones, un fragmento de ILT4 comprende D2 y D3. En algunas realizaciones, un fragmento de ILT4 comprende D3 y D4. En algunas realizaciones, un fragmento de ILT4 comprende D1, D2 y D3. En algunas realizaciones, un fragmento de ILT4 comprende D2, D3 y D4. En algunas realizaciones, un fragmento de ILT4 comprende uno o más de los dominios de tipo C2 similares a Ig y la región precursora. En algunas realizaciones, un fragmento de ILT4 comprende el precursor de D4, el precursor de D3-D4 o el precursor de D2-D3-D4. En algunas realizaciones, el dominio extracelular de ILT4 humano comprende los aminoácidos 22-461 de la SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, el D1 de ILT4 humano comprende los aminoácidos 27-110 de la SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, el D2 de ILT4 humano comprende los aminoácidos 111-229 de la SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, el D3 de ILT4 humano comprende los aminoácidos 230-318 de la SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, el D4 de ILT4 humano comprende los aminoácidos 330-419 de la SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, el D1-D2 de ILT4 humano comprende los aminoácidos 27-229 de la SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, el D2-D3 de ILT4 humano comprende los aminoácidos 111-318 de la SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, el D3-D4 de ILT4 humano comprende los aminoácidos 230-419 de la SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, el D1-D2-D3 de ILT4 humano comprende los aminoácidos 27-318 de la SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, el D2-D3-D4 de ILT4 humano comprende los aminoácidos 111-419 de la SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, el precursor de D4 de ILT4 humano comprende los aminoácidos 330-461 de la SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, el precursor de D3-D4 de ILT4 humano comprende los aminoácidos 230-461 de la SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, el precursor de D2-D3-D4 de ILT4 humano comprende los aminoácidos 111 -461 de la SEQ ID NO: 8.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un fragmento de ILT4. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une dentro de una región específica de ILT4. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une dentro del dominio extracelular de ILT4. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une dentro del dominio D1 de ILT4. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une dentro del dominio D2 de ILT4. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une dentro del dominio D3 de ILT4. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une dentro del dominio D4 de ILT4. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une dentro de la región de precursor de D4 de ILT4. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une dentro del dominio D1-D2 de ILT4. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une dentro del dominio D2-D3 de ILT4. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une dentro del dominio D3-D4 de ILT4. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une dentro del dominio D1-D2-D3 de ILT4. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une dentro del dominio D2-D3-D4 de ILT4. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un epítopo en ILT4. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un epítopo conformacional en ILT4. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 no se une a otras proteínas LILRB humanas (por ejemplo, ILT2, ILT3, ILT5 o LILRB5). En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 no se une a otras proteínas LILRB humanas (por ejemplo, ILT3, ILT5 o LILRB5). En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4 no se une a una o más de las proteínas LILRA humanas (por ejemplo, LILRA1, LILRA2, LILRA4, LILRA5 o LILRA6). En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4 no se une a LILRA2, LILRA4, LILRA5 o LELRA6.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a ILT4 humano. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a la SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a la SEQ ID NO: 9. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a la SEQ ID NO: 10. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un fragmento que comprende los aminoácidos 22-461 de la SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un fragmento que comprende los aminoácidos 27-110 de la SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un fragmento que comprende los aminoácidos 111-229 de la SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un fragmento que comprende los aminoácidos 230-318 de la SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un fragmento que comprende los aminoácidos 330-419 de la SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un fragmento que comprende los aminoácidos 27-229 de la SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un fragmento que comprende los aminoácidos 111-318 de la SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un fragmento que comprende los aminoácidos 230-419 de la SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a la SEQ ID NO: 11. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a la SEQ ID NO: 12. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a la SEQ ID NO: 13. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a la SEQ ID NO: 14. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a la SEQ ID NO:11 y la SEQ ID NO: 12. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a la SEQ ID NO: 12 y la SEQ ID NO:13. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a la SEQ ID NO: 13 y la SEQ ID NO:14. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a la SEQ ID NO: 11, la SEQ ID NO: 12 y la SEQ ID NO: 13. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a la SEQ ID NO: 12, la SEQ ID NO: 13 y la SEQ ID NO:14.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un epítopo que comprende aminoácidos dentro de la SEQ ID NO: 9. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un epítopo que comprende aminoácidos dentro de la SEQ ID NO: 10. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un epítopo que comprende aminoácidos dentro de la SEQ ID NO: 11. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un epítopo que comprende aminoácidos dentro de la SEQ ID NO: 12.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un epítopo que comprende aminoácidos dentro de la SEQ ID NO: 13. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a un epítopo que comprende aminoácidos dentro de la SEQ ID NO: 14.
En algunas realizaciones, un agente de unión al ILT se une a ILT2 humano, a ILT4 humano o a ILT2/ILT4 humano y tiene al menos una o más de las siguientes propiedades: (i) se une a ILT2 deM. mulatta; (ii) se une a ILT2M. fascicularis; (iii) no se une a ILT3, ILT5 y LILRB5; (iv) no se une a LILRA2, LILRA4, LILRA5 y LILRA6 ;
(v) es un antagonista de ILT2; (vi) es un antagonista de ILT4, (vii) inhibe la actividad de ILT2; (viii) inhibe la actividad de ILT4; (ix) inhibe la señalización de ILT2 en las células que expresan ILT2; (x) inhibe la señalización de ILT4 en las células que expresan ILT4; (xi) inhibe la unión de ILT2 a las moléculas del MHC I; (xii) inhibe la unión de ILT4 a las moléculas del MHC I; (xiii) inhibe la supresión de las células mieloides inducida por ILT2;
(xiv) inhibe la supresión de las células mieloides inducida por ILT4; (xv) inhibe la supresión de la actividad de las células mieloides inducida por ILT2; (xvi) inhibe la supresión de la actividad de las células mieloides inducida por ILT4; (xvii) restaura la activación del FcR en las células mieloides; (xviii) mejora la actividad de las células NK; (xix) mejora la actividad de CTL; y/o (xx) mejora la fagocitosis de los macrófagos.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT es un anticuerpo. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 es un anticuerpo. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 es un anticuerpo. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 es un anticuerpo. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT es un anticuerpo anti-ILT2. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT es un anticuerpo anti-ILT4. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT es un anticuerpo anti-ILT2/ILT4. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo recombinante. En ciertas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo humano. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo IgG. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo IgG1. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo IgG2. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo IgG3. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo IgG4. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una cadena pesada de IgG. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una cadena pesada de IgG1. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una cadena pesada de IgG2. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una cadena pesada de IgG4. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una cadena pesada de IgG humano. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una cadena pesada de IgG 1 humano. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una cadena pesada de IgG2 humano. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una cadena pesada de IgG4 humano. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una cadena ligera kappa.
En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una región constante de cadena ligera kappa. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una región constante de cadena ligera kappa humana. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una cadena ligera lambda. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una región constante de cadena ligera lambda. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una región constante de cadena ligera lambda humana. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo que comprende al menos un sitio de unión al antígeno. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un scFv. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un scFv enlazado a disulfuro. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un sc(Fv)2 enlazado a disulfuro. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo Fab, Fab' o F(ab)2. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un diacuerpo. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un nanocuerpo. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monoespecífico. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo multiespecífico. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monovalente. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo bivalente. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo tetravalente.
En algunas realizaciones, el anticuerpo se aísla. En algunas realizaciones, el anticuerpo es sustancialmente puro.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT (por ejemplo, un agente de unión a ILT2, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4) es un anticuerpo policlonal. Los anticuerpos policlonales se pueden preparar mediante cualquier método conocido por los expertos en la técnica. En algunas realizaciones, los anticuerpos policlonales se producen inmunizando un animal (por ejemplo, un conejo, una rata, un ratón, una cabra, un asno) con un antígeno de interés (por ejemplo, un fragmento peptídico purificado, una proteína recombinante o una proteína de fusión) usando múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales. En algunas realizaciones, el antígeno se conjuga con un portador tal como la hemocianina de la lapa común (KLH, por sus siglas en inglés), la albúmina sérica, la tiroglobulina bovina o un inhibidor de la tripsina de soja. El antígeno (con o sin una proteína portadora) se diluye en solución salina estéril y, habitualmente, se combina con un adyuvante (por ejemplo, un adyuvante de Freund completo o incompleto) para formar una emulsión estable. Después de un periodo de tiempo, los anticuerpos policlonales se recuperan a partir del animal inmunizado (por ejemplo, de la sangre o la ascitis). En algunas realizaciones, los anticuerpos policlonales se purifican del suero o la ascitis de acuerdo con los métodos estándar en la técnica, incluyendo, entre otros, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, electroforesis en gel y/o diálisis.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT (por ejemplo, un agente de unión a ILT2, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4) es un anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar mediante cualquier método conocido por los expertos en la técnica. En algunas realizaciones, los anticuerpos monoclonales se preparan usando métodos de hibridoma conocidos por un experto en la técnica. Por ejemplo, usando un método de hibridoma, se inmuniza un ratón, una rata, un conejo, un hámster u otro animal hospedador apropiado como se describió anteriormente. En algunas realizaciones, los linfocitos se inmunizanin vitro.En algunas realizaciones, el antígeno inmunizante es una proteína humana o un fragmento de esta. En algunas realizaciones, el antígeno inmunizante es una proteína de ratón o un fragmento de esta. En algunas realizaciones, el antígeno inmunizante es una proteína deM. mulattao un fragmento de esta. En algunas realizaciones, el antígeno inmunizante es una proteína deM. fasciculariso un fragmento de esta. En algunas realizaciones, el antígeno inmunizante es una combinación de dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4) proteínas relacionadas o fragmentos de estas.
Tras la inmunización, los linfocitos se aíslan y se fusionan con una estirpe celular de mieloma adecuada usando, por ejemplo, polietilenglicol. Las células del hibridoma se seleccionan usando medios especializados, tal como se conoce en la técnica, y los linfocitos no fusionados y las células de mieloma no sobreviven al proceso de selección. Los hibridomas que producen anticuerpos monoclonales contra un antígeno elegido pueden identificarse mediante una variedad de métodos incluyendo, entre otros, ensayos de inmunoprecipitación, inmunotransferencia y ensayos de uniónin vitro(por ejemplo, citometría de flujo, FACS, ELISA, SPR (por ejemplo, Biacore) y radioinmunoensayo). Una vez que se identifican las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones pueden subclonarse mediante procedimientos de dilución limitante. En algunas realizaciones, se usan métodos de alto rendimiento para distribuir células de hibridoma unicelulares en placas. Los hibridomas se pueden propagar en cultivoin vitrousando métodos estándar oin vivocomo tumores de ascitis en un animal. Los anticuerpos monoclonales se pueden purificar del medio de cultivo o del fluido ascítico de acuerdo con los métodos estándar en la técnica incluyendo, entre otros, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, electroforesis en gel y diálisis.
En algunas realizaciones, los anticuerpos monoclonales se preparan usando procedimientos de ADN recombinante conocidos por un experto en la materia. Por ejemplo, los polinucleótidos que codifican un anticuerpo se aíslan de células B maduras o células de hibridoma, tal como mediante RT-PCR usando cebadores oligonucleotídicos que amplifican específicamente los genes que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo, y su secuencia se determina usando procedimientos estándar. Los polinucleótidos aislados que codifican las cadenas pesada y ligera se clonan luego en vectores de expresión adecuados que producen los anticuerpos monoclonales cuando se transfectan en células hospedadoras tales comoE. coli,células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que de otro modo no producen proteínas de inmunoglobulina.
En algunas realizaciones, los anticuerpos monoclonales recombinantes se aíslan de bibliotecas de presentación de fagos que expresan dominios variables o CDR de una especie deseada. El cribado de bibliotecas de fagos se puede alcanzar mediante diversos procedimientos conocidos en la técnica.
En algunas realizaciones, un anticuerpo monoclonal se modifica mediante el uso de tecnología de ADN recombinante para generar anticuerpos alternativos. En algunas realizaciones, los dominios constantes de la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo monoclonal de ratón se sustituyen por regiones constantes de un anticuerpo humano para generar un anticuerpo quimérico. En algunas realizaciones, las regiones constantes se truncan o se retiran para generar un fragmento de anticuerpo deseado de un anticuerpo monoclonal. En algunas realizaciones, la mutagénesis dirigida al sitio o de alta densidad de las regiones variables se usa para optimizar la especificidad y la afinidad de un anticuerpo monoclonal.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT (por ejemplo, un agente de unión a ILT2, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4) es un anticuerpo humanizado. En la técnica, se conocen diversos métodos para generar anticuerpos humanizados. En algunas realizaciones, un anticuerpo humanizado comprende uno o más residuos aminoacídicos que se han introducido en él a partir de una fuente que no es humana. En algunas realizaciones, la humanización se efectúa sustituyendo una o más secuencias de CDR no humanas por las secuencias de CDR correspondientes de un anticuerpo humano. En algunas realizaciones, los anticuerpos humanizados se construyen sustituyendo las seis CDR de un anticuerpo no humano (por ejemplo, un anticuerpo de ratón) por las CDR correspondientes de un anticuerpo humano.
La elección de qué región variable de cadena pesada y/o región variable de cadena ligera humana usar para generar anticuerpos humanizados puede hacerse basándose en una variedad de factores y mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, el método de “mejor ajuste” se usa cuando la secuencia de la región variable de un anticuerpo no humano (por ejemplo, un roedor) se selecciona contra toda la biblioteca de secuencias de región variable humanas conocidas. La secuencia humana que es más similar a la de la secuencia no humana (por ejemplo, de roedor) se selecciona como el marco de la región variable humana para el anticuerpo humanizado. En algunas realizaciones, un marco de región variable particular derivado de una secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas se selecciona como marco de región variable. En algunas realizaciones, la secuencia marco de la región variable se deriva de las secuencias de consenso de las subclases humanas más abundantes. En algunas realizaciones, los genes de la estirpe germinal humana se usan como fuente de las secuencias marco de la región variable.
Otros métodos de humanización incluyen, entre otros, un método denominado “superhumanización” que se describe como la transferencia directa de las CDR a un marco de la estirpe germinal humana, un método denominado contenido de cadenas humanas (HSC, por sus siglas en inglés) que se basa en una métrica de la “humanidad de los anticuerpos”, los métodos basados en la generación de grandes bibliotecas de variantes humanizadas (incluidas bibliotecas de presentación de fagos, ribosomas y levaduras) y métodos basados en la mezcla de regiones marco.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT (por ejemplo, un agente de unión a ILT2, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4) es un anticuerpo humano. Los anticuerpos humanos se pueden preparar usando diversos procedimientos conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, los anticuerpos humanos se generan a partir de linfocitos B humanos inmortalizados inmunizadosin vitro.En algunas realizaciones, los anticuerpos humanos se generan a partir de linfocitos aislados de un sujeto inmunizado. En cualquier caso, se pueden generar y aislar células que producen un anticuerpo dirigido contra un antígeno diana. En algunas realizaciones, un anticuerpo humano se selecciona de una biblioteca de fagos, donde esa biblioteca de fagos expresa anticuerpos humanos. Alternativamente, la tecnología de presentación en fagos puede usarse para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerposin vitro,a partir de repertorios de genes de la región variable de inmunoglobulinas de donantes humanos no inmunizados. Los procedimientos para la generación y el uso de bibliotecas de fagos de anticuerpos son bien conocidas en la técnica. Una vez identificados los anticuerpos, las estrategias de maduración de la afinidad conocidas en la técnica, incluyendo, entre otros, la mezcla de cadenas y la mutagénesis dirigida al sitio, pueden emplearse para generar anticuerpos humanos de mayor afinidad. En algunas realizaciones, los anticuerpos humanos se producen en ratones transgénicos que contienen locus de inmunoglobulina humana. Tras la inmunización, estos ratones son capaces de producir el repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulinas endógenas.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT (por ejemplo, un agente de unión a ILT2, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4) es un fragmento de anticuerpo. El término “fragmento de anticuerpo”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo y, en general, al menos un sitio de unión al antígeno. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, entre otros, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, moléculas de anticuerpos monocatenarios (por ejemplo, scFv), scFv enlazados a disulfuro (dsscFv), nanocuerpos, diacuerpos, tricuerpos, tetracuerpos, minicuerpos, anticuerpos de dominio variable doble (DVD), anticuerpos de dominio variable único (por ejemplo, anticuerpos de camélido) y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT es un anticuerpo scFv. En algunas realizaciones, el scFv es un scFv enlazado a disulfuro (dsscFv), que es un scFv que comprende una unión disulfuro diseñada entre la región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada del scFv. En algunas realizaciones, la unión disulfuro aumenta la estabilidad de la molécula scFv. En algunas realizaciones, la unión disulfuro aumenta la termoestabilidad de la molécula scFv.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT es un Fv. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT es un Fab. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT es un F(ab')2. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT es un F(ab').
Los fragmentos de anticuerpos se pueden preparar mediante diversos procedimientos, incluyendo, entre otros, la digestión proteolítica de un anticuerpo intacto. Los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento pueden producirse usando tecnologías recombinantes conocidas en la técnica (por ejemplo, expresión deE. colio fagos).
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT (por ejemplo, un agente de unión a ILT2, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4) es un anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos son capaces de reconocer y unirse al menos a dos antígenos o epítopos diferentes. Los diferentes epítopos pueden estar dentro de esta molécula (por ejemplo, dos epítopos en ILT2) o en diferentes moléculas (por ejemplo, un epítopo en ILT2 y un segundo epítopo en una diana diferente). En algunas realizaciones, un anticuerpo biespecífico tiene una potencia mejorada en comparación con un anticuerpo individual o con una combinación de más de un anticuerpo. En algunas realizaciones, un anticuerpo biespecífico tiene una toxicidad reducida en comparación con un anticuerpo individual o con una combinación de más de un anticuerpo. Los expertos en la técnica saben que cualquier agente terapéutico puede tener una farmacocinética (FC) única (por ejemplo, semivida circulante). En algunas realizaciones, un anticuerpo biespecífico tiene la capacidad de sincronizar la FC de dos agentes de unión activos en donde los dos agentes de unión individuales tienen diferentes perfiles de FC. En algunas realizaciones, un anticuerpo biespecífico tiene la capacidad de concentrar las acciones de dos agentes en un área común (por ejemplo, un tejido) en un sujeto. En algunas realizaciones, un anticuerpo biespecífico tiene la capacidad de concentrar las acciones de dos agentes en un objetivo común (por ejemplo, un tipo de célula específico). En algunas realizaciones, un anticuerpo biespecífico tiene la capacidad de dirigir las acciones de dos agentes a más de una vía o función biológica. En algunas realizaciones, un anticuerpo biespecífico tiene la capacidad de dirigirse a dos células diferentes y acercarlas.
En algunas realizaciones, un anticuerpo biespecífico tiene una toxicidad y/o efectos secundarios disminuidos. En algunas realizaciones, un anticuerpo biespecífico tiene una toxicidad y/o efectos secundarios disminuidos en comparación con una mezcla de los dos anticuerpos individuales o los anticuerpos como agentes únicos. En algunas realizaciones, un anticuerpo biespecífico tiene un índice terapéutico aumentado. En algunas realizaciones, un anticuerpo biespecífico tiene un índice terapéutico aumentado en comparación con una mezcla de los dos anticuerpos individuales o los anticuerpos como agentes únicos.
Muchos procedimientos para preparar anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, un anticuerpo biespecífico comprende regiones constantes de cadena pesada con modificaciones en los aminoácidos que forman parte de la interfaz entre las dos cadenas pesadas. Estas modificaciones se hacen para mejorar la formación de heterodímeros y, en general, reducir o eliminar la formación de homodímeros. En algunas realizaciones, el anticuerpo biespecífico se genera usando una estrategia de nudos en agujeros (KIH, por sus siglas en inglés). En algunas realizaciones, el anticuerpo biespecífico comprende regiones bisagra variantes incapaces de formar enlaces disulfuro entre cadenas pesadas idénticas (por ejemplo, reducir la formación de homodímeros). En algunas realizaciones, el anticuerpo biespecífico comprende cadenas pesadas con cambios en los aminoácidos que dan como resultado interacciones electrostáticas alteradas. En algunas realizaciones, los anticuerpos biespecíficos comprenden cadenas pesadas con cambios en los aminoácidos que dan como resultado interacciones hidrófobas/hidrófilas alteradas.
Los anticuerpos biespecíficos pueden ser anticuerpos intactos o fragmentos de anticuerpos que comprenden sitios de unión al antígeno.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT es un anticuerpo que se une a ILT2. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT se une a ILT2 humano. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT se une a ILT2 deM. fascicularis.En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT se une a ILT2 deM. mulatta.En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT se une a ILT2 humano e ILT2 deM. fascicularis.En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT se une a ILT2 humano e ILT2 deM. mulatta.En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT se une a ILT2 humano, ILT2 deM. mulattae ILT2 deM. fascicularis.En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2 se une a un epítopo de ILT2. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2 se une a un epítopo de ILT2 dentro del dominio extracelular de ILT2 humano. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2 se une a un epítopo de ILT2 dentro del dominio extracelular de ILT2 deM. fascicularis.En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2 se une a un epítopo de ILT2 dentro del dominio extracelular de ILT2 deM. mulatta.En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2 se une a un epítopo que comprende al menos un aminoácido(porejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9) dentro de los aminoácidos 24-461 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2 se une a un epítopo que comprende al menos un aminoácido (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9) dentro de los aminoácidos 27-115 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2 se une a un epítopo que comprende al menos un aminoácido (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9) dentro de los aminoácidos 116-221 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2 se une a un epítopo que comprende al menos un aminoácido (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9) dentro de los aminoácidos 222-312 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2 se une a un epítopo que comprende al menos un aminoácido (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9) dentro de los aminoácidos 313-409 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2 se une a un epítopo que comprende aminoácidos dentro de la SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2 se une a un epítopo que comprende aminoácidos dentro de la SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2 se une a un epítopo que comprende aminoácidos dentro de la SEQ ID NO: 5. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2 se une a un epítopo que comprende aminoácidos dentro de la SEQ ID NO: 6. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2 se une a un epítopo que comprende aminoácidos dentro de la SEQ ID NO: 7. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2 se une a un epítopo que comprende al menos un aminoácido (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9) dentro de los aminoácidos 24-460 de la SEQ ID NO: 15. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2 se une a un epítopo que comprende al menos un aminoácido (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9) dentro de los aminoácidos 27-114 de la SEQ ID NO: 15. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2 se une a un epítopo que comprende al menos un aminoácido (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9) dentro de los aminoácidos 115-220 de la SEQ ID NO: 15. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2 se une a un epítopo que comprende al menos un aminoácido (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9) dentro de los aminoácidos 221-311 de la SEQ ID NO: 15. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2 se une a un epítopo que comprende al menos un aminoácido (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9) dentro de los aminoácidos 312-408 de la SEQ ID NO: 15. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2 se une a un epítopo que comprende aminoácidos dentro de la SEQ ID NO: 17. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2 se une a un epítopo que comprende aminoácidos dentro de la SEQ ID NO: 18. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2 se une a un epítopo que comprende aminoácidos dentro de la SEQ ID NO: 19. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2 se une a un epítopo que comprende aminoácidos dentro de la SEQ ID NO: 20. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2 se une a un epítopo que comprende aminoácidos dentro de la SEQ ID NO: 21. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2 se une a un epítopo que comprende al menos un aminoácido (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9) dentro de los aminoácidos 24-461 de la SEQ ID NO: 166. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2 se une a un epítopo que comprende al menos un aminoácido (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9) dentro de los aminoácidos 27-114 de la SEQ ID NO: 166. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2 se une a un epítopo que comprende al menos un aminoácido (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9) dentro de los aminoácidos 115-220 de la SEQ ID NO: 166. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2 se une a un epítopo que comprende al menos un aminoácido (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9) dentro de los aminoácidos 221-311 de la SEQ ID NO: 166. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2 se une a un epítopo que comprende al menos un aminoácido (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9) dentro de los aminoácidos 312-408 de la SEQ ID NO: 166. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2 se une a un epítopo que comprende aminoácidos dentro de la SEQ ID NO: 168. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2 se une a un epítopo que comprende aminoácidos dentro de la SEQ ID NO: 169. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2 se une a un epítopo que comprende aminoácidos dentro de la SEQ ID NO: 170. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2 se une a un epítopo que comprende aminoácidos dentro de la SEQ ID NO: 171. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2 se une a un epítopo que comprende aminoácidos dentro de la SEQ ID NO: 172. En algunas realizaciones, el epítopo es un epítopo conformacional. En algunas realizaciones, el epítopo es un epítopo lineal.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT es un anticuerpo que se une a ILT4. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT se une a ILT4 humano. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT4 se une a un epítopo de ILT4. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT4 se une a un epítopo de ILT4 dentro del dominio extracelular de ILT4 humano. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT4 se une a un epítopo que comprende al menos un aminoácido (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9) dentro de los aminoácidos 22-461 de la SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT4 se une a un epítopo que comprende al menos un aminoácido (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9) dentro de los aminoácidos 27-110 de la SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT4 se une a un epítopo que comprende al menos un aminoácido (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9) dentro de los aminoácidos 111-229 de la SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT4 se une a un epítopo que comprende al menos un aminoácido (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9) dentro de los aminoácidos 230-318 de la SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT4 se une a un epítopo que comprende al menos un aminoácido (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9) dentro de los aminoácidos 330-419 de la SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT4 se une a un epítopo que comprende aminoácidos dentro de la SEQ ID NO: 9. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT4 se une a un epítopo que comprende aminoácidos dentro de la SEQ ID NO: 10. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT4 se une a un epítopo que comprende aminoácidos dentro de la SEQ ID NO: 11. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT4 se une a un epítopo que comprende aminoácidos dentro de la SEQ ID NO: 12. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT4 se une a un epítopo que comprende aminoácidos dentro de la SEQ ID NO: 13. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT4 se une a un epítopo que comprende aminoácidos dentro de la SEQ ID NO: 14. En algunas realizaciones, el epítopo es un epítopo conformacional. En algunas realizaciones, el epítopo es un epítopo lineal.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT es un anticuerpo que se une a ILT2 e ILT4. Los expertos en la técnica entienden que un anticuerpo que se une a ILT2 e ILT4, descrito como un doble aglutinante, comprende al menos un sitio de unión al antígeno que se une a un epítopo tanto en ILT2 como en ILT4, en contraste con un anticuerpo biespecífico que comprendería un sitio de unión al antígeno que se une a un epítopo en ILT2 y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a un epítopo diferente en ILT4. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 se une a ILT2 humano y a ILT4 humano. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 se une a ILT2 humano, ILT4 humano, ILT2 deM. mulattae ILT2 deM. fascicularis.En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 se une a un epítopo de ILT2 y epítopo de ILT4. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 se une a un epítopo dentro del dominio extracelular de ILT2 humano y a un epítopo dentro del dominio extracelular de ILT4 humano, en donde el epítopo de ILT2 y el epítopo de ILT4 son iguales o esencialmente iguales. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 se une a un epítopo de ILT2 dentro del dominio extracelular de ILT2 humano, a un epítopo de ILT4 dentro del dominio extracelular de ILT4 humano, a un epítopo de ILT2 dentro del dominio extracelular de ILT2 deM. fascicularisy a un epítopo de ILT2 dentro del dominio extracelular de ILT2 deM. mulatta.En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 se une a un epítopo que comprende al menos un aminoácido (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9) dentro de los aminoácidos 24-461 de la SEQ ID NO: 1 y el mismo o esencialmente el mismo epítopo dentro de los aminoácidos 22-461 de la SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 se une a un epítopo que comprende al menos un aminoácido (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9) dentro de los aminoácidos 27-115 de la SEQ ID NO: 1 y el mismo o esencialmente el mismo epítopo dentro de los aminoácidos 27-110 de la SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 se une a un epítopo que comprende al menos un aminoácido (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9) dentro de los aminoácidos 116-221 de la SEQ ID NO: 1 y el mismo o esencialmente el mismo epítopo dentro de los aminoácidos 111-229 de la SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 se une a un epítopo que comprende al menos un aminoácido (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9) dentro de los aminoácidos 222-312 de la SEQ ID NO: 1 y el mismo o esencialmente el mismo epítopo dentro de los aminoácidos 230-318 de la SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 se une a un epítopo que comprende al menos un aminoácido (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9) dentro de los aminoácidos 313-409 de la SEQ ID NO: 1 y el mismo o esencialmente el mismo epítopo dentro de los aminoácidos 330-419 de la SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, el epítopo es un epítopo conformacional. En algunas realizaciones, el epítopo es un epítopo lineal.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT es un anticuerpo anti-ILT2, un anticuerpo anti-ILT4 o un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, el agente de unión a ILT es una variante de un anticuerpo anti-ILT2, un anticuerpo anti-ILT4 o un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, una variante de un anticuerpo anti-ILT comprende de una a treinta sustituciones de aminoácidos. En algunas realizaciones, una variante de un anticuerpo anti-ILT comprende de una a veinticinco sustituciones de aminoácidos. En algunas realizaciones, una variante de un anticuerpo anti-ILT comprende de una a veinte sustituciones de aminoácidos. En algunas realizaciones, una variante de un anticuerpo anti-ILT comprende de una a quince sustituciones de aminoácidos. En algunas realizaciones, una variante de un anticuerpo anti-ILT comprende de una a diez sustituciones de aminoácidos. En algunas realizaciones, una variante de un anticuerpo anti-ILT comprende de una a cinco sustituciones de aminoácidos. En algunas realizaciones, una variante de un anticuerpo anti-ILT comprende de una a tres sustituciones de aminoácidos. En algunas realizaciones, la(s) sustitución(es) de aminoácidos está(n) en una CDR del anticuerpo. En algunas realizaciones, la(s) sustitución(es) de aminoácidos no está(n) en una CDR del anticuerpo. En algunas realizaciones, la(s) sustitución(es) de aminoácidos está(n) en una región marco del anticuerpo. En algunas realizaciones, las sustituciones de aminoácidos son sustituciones conservadoras de aminoácidos.
Los expertos en la técnica definen las CDR de un anticuerpo usando una variedad de métodos/sistemas. Estos sistemas y/o definiciones se han desarrollado y perfeccionado durante varios años e incluyen Kabat, Chothia, IMGT, AbM y Contact. La definición de Kabat se basa en la variabilidad de la secuencia y se usa comúnmente. La definición de Chothia se basa en la ubicación de las regiones del circuito estructural. El sistema IMGT se basa en la variabilidad de la secuencia y la ubicación dentro de la estructura del dominio variable. La definición de AbM es un compromiso entre Kabat y Chothia. La definición de Contact se basa en los análisis de las estructuras cristalinas de los anticuerpos disponibles. Un sistema ejemplar es una combinación de Kabat y Chothia. Los expertos en la técnica disponen de programas informáticos (por ejemplo, abYsis) que son conocidos por los expertos en la técnica para el análisis de la secuencia de anticuerpos y la determinación de las CDR.
Las secuencias CDR específicas definidas en el presente documento se basan generalmente en una combinación de definiciones de Kabat y Chothia (definición ejemplar). Sin embargo, se entenderá que la referencia a una CDR o las CDR de la región variable de cadena pesada y/o a una CDR o las CDR de la región variable de cadena ligera de un anticuerpo específico abarcará todas las definiciones de CDR conocidas por los expertos en la técnica.
Los anticuerpos de la invención comprenden las seis CDR del anticuerpo 73D1 o Hz73D1.v1 de acuerdo con cualquiera de las definiciones de Kabat, Chothia, AbM, IMGT, Contact o ejemplares. Los anticuerpos que comprenden las seis CDR de los anticuerpos 27F9, 47C8, 48A5, 47H6, Hz47H6.v2, 51A1, 64A12, Hz64A12, 73C4 y 73D1 de acuerdo con cualquiera de las definiciones de Kabat, Chothia, AbM, IMGT, Contact o ejemplares se divulgan en el presente documento, pero no se reivindican.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT es un anticuerpo anti-ILT (por ejemplo, un anticuerpo anti-ILT2, un anticuerpo anti-ILT4 o un anticuerpo anti-ILT2/ILT4) que comprende una, dos, tres, cuatro, cinco y/o seis CDR de cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento. Un anticuerpo anti-ILT de acuerdo con la invención comprende las seis CDR de la tabla 8A o la tabla 8B. No se reivindica ningún anticuerpo divulgado en el presente documento que no comprenda las seis CDR de la tabla 8A o la tabla 8B.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2 comprende (i) una región variable de cadena pesada que comprende una, dos y/o tres CDR de región variable de cadena pesada de la tabla 1, y/o (ii) una región variable de cadena ligera que comprende una, dos y/o tres CDR de región variable de cadena ligera de la tabla 1. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT4 comprende (i) una región variable de cadena pesada que comprende una, dos y/o tres CDR de región variable de cadena pesada de la tabla 2, y/o (ii) una región variable de cadena ligera que comprende una, dos y/o tres CDR de región variable de cadena ligera de la tabla 2. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT4 comprende (i) una región variable de cadena pesada que comprende una, dos y/o tres CDR de región variable de cadena pesada de la tabla 3, y/o (ii) una región variable de cadena ligera que comprende una, dos y/o tres CDR de región variable de cadena ligera de la tabla 3. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 comprende (i) una región variable de cadena pesada que comprende una, dos y/o tres CDR de región variable de cadena pesada de la tabla 4A o la tabla 4B, y/o (ii) una región variable de cadena ligera que comprende una, dos y/o tres CDR de región variable de cadena ligera de la tabla 4A o la tabla 4B. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 comprende (i) una región variable de cadena pesada que comprende una, dos y/o tres CDR de región variable de cadena pesada de la tabla 5, y/o (ii) una región variable de cadena ligera que comprende una, dos y/o tres CDR de región variable de cadena ligera de la tabla 5. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 comprende (i) una región variable de cadena pesada que comprende una, dos y/o tres CDR de región variable de cadena pesada de la tabla 6A o la tabla 6B, y/o (ii) una región variable de cadena ligera que comprende una, dos y/o tres CDR de región variable de cadena ligera de la tabla 6A o la tabla 6B. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 comprende (i) una región variable de cadena pesada que comprende una, dos y/o tres CDR de región variable de cadena pesada de la tabla 7, y/o (ii) una región variable de cadena ligera que comprende una, dos y/o tres CDR de región variable de cadena ligera de la tabla 7. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 comprende (i) una región variable de cadena pesada que comprende una, dos y/o tres CDR de región variable de cadena pesada de la tabla 8A o la tabla 8B, y/o (ii) una región variable de cadena ligera que comprende una, dos y/o tres CDR de región variable de cadena ligera de la tabla 8A o la tabla 8B. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2 comprende (i) una región variable de cadena pesada que comprende tres CDR de región variable de cadena pesada de la tabla 1, y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende tres CDR de región variable de cadena ligera de la tabla 1. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT4 comprende (i) una región variable de cadena pesada que comprende tres CDR de región variable de cadena pesada de la tabla 2, y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende tres CDR de región variable de cadena ligera de la tabla 2. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT4 comprende (i) una región variable de cadena pesada que comprende tres CDR de región variable de cadena pesada de la tabla 3, y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende tres CDR de región variable de cadena ligera de la tabla 3. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 comprende (i) una región variable de cadena pesada que comprende tres CDR de región variable de cadena pesada de la tabla 4A, y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende tres CDR de región variable de cadena ligera de la tabla 4A. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 comprende (i) una región variable de cadena pesada que comprende tres CDR de región variable de cadena pesada de la tabla 4B, y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende tres CDR de región variable de cadena ligera de la tabla 4B. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 comprende (i) una región variable de cadena pesada que comprende tres CDR de región variable de cadena pesada de la tabla 5, y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende tres CDR de región variable de cadena ligera de la tabla 5. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 comprende (i) una región variable de cadena pesada que comprende tres CDR de región variable de cadena pesada de la tabla 6A, y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende tres CDR de región variable de cadena ligera de la tabla 6A. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 comprende (i) una región variable de cadena pesada que comprende tres CDR de región variable de cadena pesada de la tabla 6B, y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende tres CDR de región variable de cadena ligera de la tabla 6B. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 comprende (i) una región variable de cadena pesada que comprende tres CDR de región variable de cadena pesada de la tabla 7, y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende tres CDR de región variable de cadena ligera de la tabla 7. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 comprende (i) una región variable de cadena pesada que comprende tres CDR de región variable de cadena pesada de la tabla 8A, y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende tres CDR de región variable de cadena ligera de la tabla 8B. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 comprende (i) una región variable de cadena pesada que comprende tres CDR de región variable de cadena pesada de la tabla 8B, y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende tres CDR de región variable de cadena ligera de la tabla 8B.
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En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT (por ejemplo, un agente de unión a ILT2, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4) comprende una región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 y/o una región variable de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 de un anticuerpo descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT comprende una región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 de un anticuerpo descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 de un anticuerpo descrito en el presente documento.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT (por ejemplo, un anticuerpo anti-ILT2, un anticuerpo anti-ILT4 o un anticuerpo anti-ILT2/ILT4) comprende una o más sustituciones de aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, etc.) en una CDR de un anticuerpo descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, las sustituciones de aminoácidos son sustituciones conservadoras. En algunas realizaciones, una CDR comprende una sustitución de aminoácidos. En algunas realizaciones, una CDR comprende dos sustituciones de aminoácidos. En algunas realizaciones, una CDR comprende tres sustituciones de aminoácidos. En algunas realizaciones, una CDR comprende cuatro sustituciones de aminoácidos. En algunas realizaciones, la CDR es una región variable de cadena pesada CDR1. En algunas realizaciones, la CDR es una región variable de cadena pesada CDR2. En algunas realizaciones, la CDR es una región variable de cadena pesada CDR3. En algunas realizaciones, la CDR es una región variable de cadena ligera CDR1. En algunas realizaciones, la CDR es una región variable de cadena ligera CDR2. En algunas realizaciones, la CDR es una región variable de cadena ligera CDR3. En algunas realizaciones, las sustituciones se hacen como parte de un proceso de humanización. En algunas realizaciones, las sustituciones se hacen como parte de un proceso de humanización de estirpe germinal. En algunas realizaciones, las sustituciones se hacen como parte de un proceso de maduración por afinidad. En algunas realizaciones, las sustituciones se hacen como parte de un proceso de optimización.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT (por ejemplo, un agente de unión a ILT2, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4) comprende una o más CDR de región variable de cadena pesada o CDR de región variable de cadena ligera que se han modificado para reducir la desamidación dentro de la secuencia de CDR. La desamidación es una reacción química en la que un grupo funcional amido de la cadena lateral de los aminoácidos asparagina (Asn o N) o glutamina (Gln o Q) se retira o se convierte en otro grupo funcional. Generalmente, la asparagina se convierte en ácido aspártico o ácido isoaspártico y la glutamina se convierte en ácido glutámico o ácido poliglutámico. En algunas situaciones, la desamidación puede cambiar la estructura, la función y/o la estabilidad de un polipéptido, lo que puede resultar en una disminución de la actividad biológica. En algunas realizaciones, la región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y/o CDR3 de un anticuerpo descrito en el presente documento se modifica para reducir la desamidación. En algunas realizaciones, la región variable de cadena ligera CDR1, CDR2 y/o CDR3 de un anticuerpo descrito en el presente documento se modifica para reducir la desamidación.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT (por ejemplo, un agente de unión a ILT2, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4) comprende una o más CDR de región variable de cadena pesada o CDR de región variable de cadena ligera que se han modificado para reducir la isomerización. La isomerización es un proceso químico mediante el cual un compuesto se transforma en cualquiera de sus formas isómeras, es decir, formas con la misma composición química, pero con diferente estructura o configuración y, potencialmente, con diferentes propiedades físicas y químicas. Los estudios han demostrado que la isomerización del asparatato (Asp o D) dentro de una CDR puede afectar la unión y/o la estabilidad de los anticuerpos. En algunas realizaciones, la región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y/o CDR3 de un anticuerpo descrito en el presente documento se modifica para reducir la isomerización. En algunas realizaciones, la región variable de cadena ligera CDR1, CDR2 y/o CDR3 se modifica para reducir la isomerización.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT (por ejemplo, un agente de unión a ILT2, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4) comprende una o más CDR de región variable de cadena pesada o CDR de región variable de cadena ligera que se han modificado para reducir la oxidación. La oxidación es un proceso químico mediante el cual se añade oxígeno a un átomo, por ejemplo, la metionina se convierte en sulfóxido de metionina mediante la adición de un oxígeno al átomo de azufre. La oxidación de uno o más aminoácidos puede afectar potencialmente las propiedades físicas y químicas de una proteína. Los estudios han demostrado que la oxidación de la metionina (Met o M) dentro de una CDR tiene el potencial de afectar la unión y/o estabilidad de los anticuerpos. En algunas realizaciones, la región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y/o CDR3 de un anticuerpo descrito en el presente documento se modifica para reducir la oxidación (por ejemplo, oxidación de metionina). En algunas realizaciones, la región variable de cadena ligera CDR1, CDR2 y/o CDR3 de un anticuerpo descrito en el presente documento se modifica para reducir la oxidación (por ejemplo, oxidación de metionina).
Los agentes de unión a ILT2 que comprenden una región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 y/o una región variable de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo 27F9, una versión humanizada del mismo o variantes del mismo se divulgan en el presente documento, pero no se reivindican. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 comprende una región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 y/o una región variable de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo 27F9, una versión humanizada del mismo o variantes del mismo. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 comprende una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1, una región variable de cadena pesada CDR2 y una región variable de cadena pesada CDR3 del anticuerpo 27F9. En otras realizaciones, un agente de unión a ILT2 comprende una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1, una región variable de cadena ligera CDR2 y una región variable de cadena ligera CDR3 del anticuerpo 27F9. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1, una región variable de cadena pesada CDR2, una región variable de cadena pesada CDR3; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1, una región variable de cadena ligera CDR2 y una región variable de cadena ligera CDR3 del anticuerpo 27F9. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 es una versión humanizada del anticuerpo 27F9. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 es una variante del anticuerpo 27F9 o del 27F9 humanizada.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GFSLTNYGVS (SEQ ID NO:22), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos I<i>W<g>DGSTNYH<s>A<l>IS (SEQ ID NO:23) y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos PNWDTYAMDF (SEQ ID NO:24), y una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASQDISNFLN (SEQ ID NO:25), una región variable de cadena ligera<c>DR2 que comprende la secuencia de aminoácidos CTSKLHS (SEQ ID NO:26), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQGNTLPPT (SEQ ID NO:27); (b) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GFSLTNY (SEQ ID NO:28), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos WGDGS (SEQ ID NO:29), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos PNWDTYAMDF (SEQ ID NO:24), y una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASQDISNFLN (SEQ ID NO:25), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos CTSKLHS (SEQ ID NO:26), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQGNTLPPT (SEQ ID NO: 27); (c) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GFSLTNYGVS (SEQ ID NO:22), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos IIWGDGSTN (SEQ ID NO:30), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos PNWDTYAMDF (SEQ ID NO:24), y un región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASQDISNFLN (SEQ ID NO:25), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos CTSKLHS (SEQ ID NO:26) y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQGNTLPPT (SEQ ID NO:27); (d) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos NYGVS (SEQ ID NO:31), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos IIWGDGSTNYHSALIS (SEQ ID NO:23), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos PNWDTYAMDF (SEQ ID NO:24), y una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASQDISNFLN (SEQ ID NO:25), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos CTSKLHS (SEQ ID NO:26), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQGNTLPPT (SEQ ID NO:27); o (e) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos TNYGVS (SEQ ID NO:32), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos WLGIIWGd Gs TN (SEQ ID NO:33), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos AKPNWDTYAMD (SEQ ID NO:34), y una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos SNFLNWY (SEQ ID NO:35), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos LLIYCTSKLH (SEQ ID NO:36), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos Qq GNTLPP (s Eq ID NO:37).
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GFSLTNYGVS (SEQ ID NO:22), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos I<i>W<g>DGSTNYH<s>A<l>IS (SEQ ID NO:23), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos PNWDTYAMDF (SEQ ID NO:24), y/o (b) una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASQDISNFLN (SEQ ID NO:25), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos CTSKLHS (SEQ ID NO:26) y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQGNTLPPT (SEQ ID NO:27). En algunas realizaciones, el agente de unión a ILT2 comprende una región variable de cadena pesada que comprende la región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GFSLTNYGVS (SEQ ID NO:22), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos IIWGDGSTNYHSALIS (SEQ ID NO:23) y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos PNWDTYAMDF (SEQ ID NO:24). En algunas realizaciones, el agente de unión a ILT2 comprende una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASQDISNFLN (SEQ ID NO:25), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos CTSKLHS (SEQ ID NO:26) y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQGNTLPPT (SEQ ID NO:27). En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GFSLTNYGVS (SEQ ID NO:22), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos IIWGDGSTNYHSALIS (SEQ ID NO:23), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos PNWDTYAMDF (SEQ ID NO:24), y (b) una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASQDISNFLN (SEQ ID NO:25), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos CTSKLHS (SEQ ID NO:26) y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQGNTLPPT (SEQ ID NO:27).
En algunas realizaciones, un agente de unión anti-ILT2 comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo 27F9 y que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 125 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo 27F9 y que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 % de identidad con la secuencia de SEQ ID NO: 126.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 % o al menos un 99 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 125. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 comprende una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 % o al menos un 99 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 126. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 125. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 126.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 125 y una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 126. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 125 y una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 126. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 125 y una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 126. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 125 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 126.
Los agentes de unión a ILT4 que comprenden una región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 y/o una región variable de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo 47C8, una versión humanizada del mismo o variantes del mismo se divulgan en el presente documento, pero no se reivindican. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 comprende una región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 y/o una región variable de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo 47C8, una versión humanizada del mismo o variantes del mismo. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1, una región variable de cadena pesada CDR2 y una región variable de cadena pesada CDR3 del anticuerpo 47C8. En otras realizaciones, un agente de unión a ILT4 comprende una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1, una región variable de cadena ligera CDR2 y una región variable de cadena ligera CDR3 del anticuerpo 47C8. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1, una región variable de cadena pesada CDR2, una región variable de cadena pesada CDR3; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1, una región variable de cadena ligera CDR2 y una región variable de cadena ligera CDR3 del anticuerpo 47C8. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 es una versión humanizada del anticuerpo 47C8. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 es una variante del anticuerpo 47C8 o del 47C8 humanizado.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYSFTGYYMH (SEQ ID NO:38), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos RVYPNNGDTs Yn QKFKV (SEQ ID NO:39) y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos GATVVESLFAY (SEQ ID NO:40) y una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASESVDNYGNNFLH (SEQ ID NO:41), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos RTSNLES (SEQ ID NO:42) y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQSNEDPYT (SEQ ID NO:43); (b) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYSFTGY (SEQ ID NO:44), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos YPNNGD (SEQ ID NO:45), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos GATVVESLFAY (SEQ ID NO:40), y una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASESVDNYGNNFLH (SEQ ID NO:41), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos RTSNLES (SEQ ID NO:42), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQSNEDPYT (SEQ ID NO:43); (c) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYSFTGYYMH (SEQ ID NO:38), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos RVYPNNGDTS (SEQ ID NO:46), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos GATVVESLFAY (SEQ ID NO:40), y un región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASESVDNYGNNFLH (SEQ ID NO:41), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos RTSNLES (SEQ ID NO:42) y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQSNEDPYT (SEQ ID NO:43); (d) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYYMH (SEQ ID NO:47), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos RVYPNNGDTSYNQKFKV (SEQ ID NO:39), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos GATVVESLFAY (SEQ ID NO:40), y una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASESVDNYGNNFLH (SEQ ID NO:41), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos RTSNLES (SEQ ID NO:42) y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQSNEDPYT (SEQ ID NO:43); o (e) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos TGYYMH (SEQ ID NO:48), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos W iGRVYPNNg Dt S (SEQ ID NO:49) y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos ARGATVVESLFA (SEQ ID NO:50), y una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos DNYGNNFLHWY (SEQ ID NO:51), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos LLIYRTSNLE (SEQ ID NO:52) y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos q Qs NEDPY (SeQ ID NO:53).
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYSFTGYYMH (SEQ ID NO:38), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos RVYPNNGDTs Yn QKFKV (SEQ ID NO:39) y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos GATVVESLFAY (SEQ ID NO:40), y/o (b) una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASESVDNYGNNFLH (SEQ ID NO:41), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos RTSNLES (SEQ ID NO:42) y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQSNEDPYT (SEQ ID NO:43). En algunas realizaciones, el agente de unión a ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que comprende la región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYSFTGYYMH (SEQ ID NO:38), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos RVYPNNGDTSYNQKFKV (SEQ ID NO:39) y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos GATVVESLFAY (SEQ ID NO:40). En algunas realizaciones, el agente de unión a ILT4 comprende una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASESVDNYGNNFLH (SEQ ID NO:41), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos RTSNLES (SEQ ID NO:42) y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQSNEDPYT (SEQ ID NO:43). En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYSFTGYYMH (SEQ ID NO:38), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos RVYPNNGDTSYNQKFKV (SEQ ID NO:39) y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos GATVVESLFAY (SEQ ID NO:40), y (b) una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASESVDNYGNNFLH (SEQ ID NO:41), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos RTSNLES (SEQ ID NO:42) y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQSNEDPYT (SEQ ID NO:43).
En algunas realizaciones, un agente de unión anti-ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo 47C8 y que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 127 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo 47C8 y que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 % de identidad con la secuencia de SEQ ID NO: 128.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 % o al menos un 99 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 127. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 comprende una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 % o al menos un 99 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 128. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 127. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 128.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 127 y una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 128. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 127 y una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 128. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 127 y una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 128. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 127 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 128.
Los agentes de unión a ILT4 que comprenden una región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 y/o una región variable de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo 48A5, una versión humanizada del mismo o variantes del mismo se divulgan en el presente documento, pero no se reivindican. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 comprende una región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 y/o una región variable de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo 48A5, una versión humanizada del mismo o variantes del mismo. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1, una región variable de cadena pesada CDR2 y una región variable de cadena pesada CDR3 del anticuerpo 48A5. En otras realizaciones, un agente de unión a ILT4 comprende una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1, una región variable de cadena ligera CDR2 y una región variable de cadena ligera CDR3 del anticuerpo 48A5. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1, una región variable de cadena pesada CDR2, una región variable de cadena pesada CDR3; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1, una región variable de cadena ligera CDR2 y una región variable de cadena ligera CDR3 del anticuerpo 48A5. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 es una versión humanizada del anticuerpo 48A5. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 es una variante del anticuerpo 48A5 o del 48A5 humanizado.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTNYGMN (SEQ ID NO:54), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos WINTYIGEPIY<a>D<d>FKG (SEQ ID NO:55), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos RSDYDGYAMDY (SEQ ID NO:56), y una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos KSSQSLLYSGNQKNYLA (SEQ ID NO:57), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos WASTRES (SEQ ID NO:58), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQHDSYPT (SEQ ID NO:59); (b) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTNY (SEQ ID NO:60), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos NTYIGE (SEQ ID NO:61) y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos RSDYDGYAMDY (SEQ ID NO:56), y una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos KSSQSLLYSGNQKNYLA (SEQ ID NO:57), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos WASTRES (SEQ ID NO:58), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos Q QQHDSYPT (SEQ ID NO:59); (c) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTNYGMN (SEQ ID NO:54), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos WINTYIGEPI (SEQ ID NO:62), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos RSDYDGYAMDY (SEQ ID NO:56), y un región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos KSSQSLLYSGNQKNYLA (SEQ ID NO:57), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos WASTRES (SEQ ID NO:58), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQHDSYPT (SEQ ID NO:59); (d) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos NYGMN (SEQ ID NO:63), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos WINTYIGEPIYADDFKG (SEQ ID NO:55), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos RSDYDGYAMDY (SEQ ID NO:56), y una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos KSSQSLLYSGNQKNYLA (SEQ ID NO:57), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos WASTRES (SEQ ID NO:58), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQHDSYPT (SEQ ID NO:59) o (e) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos TNYGMN (SEQ ID NO:64), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos WMGWINTYiGe PI (SEQ ID NO:65), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos ARRSDYDGYAMD (SEQ ID NO:66), y una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos LYSGNQKNYLAWY (SEQ ID NO:67), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos LLIYWASTRE (SEQ ID NO:68), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQHDSYP (SEQ ID NO:69).
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTNYGMN (SEQ ID NO:54), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos WINTYIGEPIYADDFKG (SEQ ID NO:55), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos RSDYDGYAMDY (SEQ ID NO:56), y/o (b) una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos KSSQSLLYSGNQKNYLA (SEQ ID NO:57), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos WASTRES (SEQ ID NO:58), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQHDSYPT (SEQ ID NO:59). En algunas realizaciones, el agente de unión a ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que comprende la región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTNYGMN (SEQ ID NO:54), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos WINTYIGEPIYADDFKG (SEQ ID NO:55) y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos RSDYDGYAMDY (SEQ ID NO:56). En algunas realizaciones, el agente de unión a ILT4 comprende una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos KSSQSLLYSGNQKNYLA (SEQ ID NO:57), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos WASTRES (SEQ ID NO:58), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQHDSYPT (SEQ ID NO:59). En algunas realizaciones, el agente de unión a ILT4 comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTNYGMN (SEQ ID NO:54), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos WINTYIGEPIYADDFKG (SEQ ID NO:55), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos RSDYDGYAMDY (SEQ ID NO:56), y (b) una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos KSSQSLLYSGNQKNYLA (SEQ ID NO:57), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos WASTRES (SEQ ID NO:58), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQHDSYPT (SEQ ID NO:59).
En algunas realizaciones, un agente de unión anti-ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo 48A5 y que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 129 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo 48A5 y que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 % de identidad con la secuencia de SEQ ID NO: 130.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 % o al menos un 99 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 129. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 comprende una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 % o al menos un 99 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 130. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 129. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 130.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 129 y una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 130. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 129 y una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 130. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 129 y una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 130. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 129 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 130.
Los agentes de unión a ILT2/ILT4 que comprenden una región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 y/o una región variable de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo 47H6, una versión humanizada del mismo o variantes del mismo se divulgan en el presente documento, pero no se reivindican. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 (por ejemplo, un aglutinante doble) comprende una región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 y/o una región variable de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo 47H6, una versión humanizada del mismo (por ejemplo, Hz47H6.v2), o variantes del mismo. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1, una región variable de cadena pesada CDR2 y una región variable de cadena pesada CDR3 del anticuerpo 47H6 o el anticuerpo Hz47H6.v2. En otras realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1, una región variable de cadena ligera CDR2 y una región variable de cadena ligera CDR3 del anticuerpo 47H6 o el anticuerpo Hz47H6.v2. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1, una región variable de cadena pesada CDR2, una región variable de cadena pesada CDR3; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1, una región variable de cadena ligera CDR2 y una región variable de cadena ligera CDR3 del anticuerpo 47H6. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1, una región variable de cadena pesada CDR2, una región variable de cadena pesada CDR3; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1, una región variable de cadena ligera CDR2 y una región variable de cadena ligera CDR3 del anticuerpo Hz47H6.v2. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 es una versión humanizada del anticuerpo 47H6. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 es una variante del anticuerpo 47H6. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 es una variante del anticuerpo Hz47H6.v2.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTDYYMN (SEQ ID NO:70), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos DFNPNNGGTTYNQKFEG (SEQ ID NO:71) o DFNPNNAGTTYNQKFEG (SEQ ID NO:118), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos GRFYYGSLYSFDY (SEQ ID NO:72) y una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASGNIHNYLA (SEQ ID NO:73), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos NAKTLAD (SEQ ID NO:74) y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QHFWTSIT (SEQ ID NO:75); (b) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTDY (SEQ ID NO:76), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos NPNNGG (SEQ ID NO:77) o la secuencia de aminoácidos NPNNAG (SEQ ID NO:119), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos GRFYYGSLYSFDY (SEQ ID NO:72) y una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASGNIHNYLA (SEQ ID NO:73), una región variable de cadena ligera c DR2 que comprende la secuencia de aminoácidos NAKTLAD (SEQ ID NO:74) y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QHFWTSIT (SEQ ID NO:75); (c) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTDYYMN (SEQ ID NO:70), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos DFNPNNG<g>T<t>(SEQ ID NO:78) o la secuencia de aminoácidos DFNPNNAGTT (SEQ ID NO:120), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos GRFYYGSLYSFDY (SEQ ID NO:72) y una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASGNIHNYLA (SEQ ID NO:73), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos NAKTLAD (SEQ ID NO:74) y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QHFWTSIT (SEQ ID NO:75); (d) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos DYYMN (SEQ ID NO:79), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos DFNPNNGGTTYNQKFEG (SEQ ID NO:71) o<d>F<n>PNNAGTTYNQKFEG (SEQ ID NO:118), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos GRFYYGSLYSFDY (SEQ ID NO:72) y una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASGNIHNYLA (SEQ ID NO:73), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos NAKTLAD (SEQ ID NO:74) y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QHFWTSIT (SEq ID NO:75); o (e) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos TDYYMN (SEQ ID NO:80), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos WIGDFNPNNGGTT (SEQ ID NO:81) o la secuencia de aminoácidos WIGDFNPNNAGTT (SEQ ID NO:121), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos ARGRFYYGSLYSFD (SEQ ID NO:82) y una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos HNYLAWY (SEQ ID NO:83), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos LLVYNAKTLA (SEQ ID NO:84) o la secuencia de aminoácidos LLIYNAKTLA (SEQ ID NO:122) y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QHFWTSI (SEQ ID NO:85).
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTDYYMN (SEQ ID NO:70), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos DFNPNNGGTTYNQKFEG (SEQ ID NO:71) o DFNPNNAGTTYNQKFEG (SEQ ID NO:118), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos GRFYYGSLYSFDY (SEQ ID NO:72), y/o (b) una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASGNIHNYLA (SEQ ID NO:73), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos NAKTLAD (SEQ ID NO:74), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QHFWTSIT (SEQ ID NO:75). En algunas realizaciones, el agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que comprende la región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTDYYMN (SEQ ID NO:70), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos DFNPNNGGTTYNQKFEG (SEQ ID NO:71), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos GRFYYGSLYSFDY (SEQ ID NO:72). En algunas realizaciones, el agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que comprende la región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTDYYMN (SEQ ID NO:70), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos DFNPNNAGTTYNQKFEG (SEQ ID NO:118), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos GRFYYGSLYSFDY (SEQ ID NO:72). En algunas realizaciones, el agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASGNIHNYLA (SEQ ID NO:73), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos NAKTLAD (SEQ ID NO:74), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QHFWTSIT (SEQ ID NO:75). En algunas realizaciones, el agente de unión a ILT2/ILT4 comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTDYYMN (SEQ ID NO:70), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos DFNPNNGGTTYNQKFEG (SEQ ID NO:71), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos GRFYYGSLYSFDY (SEQ ID NO:72), y (b) una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASGNIHNYLA (SEQ ID NO:73), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos NAKTLAD (SEQ ID NO:74), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QHFWTSIT (SEQ ID NO:75). En algunas realizaciones, el agente de unión a ILT2/ILT4 comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTDYYMN (SEQ ID NO:70), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos DFNPNNAGTTYNQKFEG (SEQ ID NO:118), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos GRFYYGSLYSFDY (SEQ ID NO:72), y (b) una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASGNIHNYLA (SEQ ID NO:73), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos NAKTLAD (SEQ ID NO:74), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QHFWTSIT (SEQ ID NO:75).
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo 47H6 y que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 131 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo 47H6 y que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 % de identidad con la secuencia de SEQ ID NO: 132.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 % o al menos un 99 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 131. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 % o al menos un 99 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 132. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 131. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 132.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos el 80 % de secuencia de identidad para la SEQ ID NO:131 y una región variable de cadena ligera que tiene al menos el 80 % de secuencia de identidad para la SEQ ID NO:132.En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos el 90 % de secuencia de identidad para la SEQ ID NO:131 y una región variable de cadena ligera que tiene al menos el 90 % de secuencia de identidad para la SEQ ID NO:132. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos el 95 % de secuencia de identidad para la SEQ ID NO:131 y una región variable de cadena ligera que tiene al menos el 95 % de secuencia de identidad para la SEQ ID NO:132. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:131 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:132.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo Hz47H6.v2 y que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 133 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo Hz47H6.v2 y que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 % de identidad con la secuencia de SEQ ID NO: 134.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 % o al menos un 99 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 133. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 % o al menos un 99 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 134. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 133. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 134.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 133 y una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 134. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 133 y una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 134. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 133 y una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 134. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 133 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 134.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende GYTFTDYYMN (SEQ ID NO:70), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos DFNPNNGGTTYNQKFEG (SEQ ID NO:71) o DFNPNNAGTTYNQKFEG (SEQ ID NO:118), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos GRFYYGSLYSFDY (SEQ ID NO:72), y una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASGNIHNYLA (SEQ ID NO:73), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos NAKTLAD (SEQ ID NO:74), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QHFWTSIT (SEQ ID NO:75), en donde la cadena pesada comprende al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 148, y en donde la cadena ligera comprende al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 149. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende GYTFTDYYMN (SEQ ID NO:70), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos DFNPNNGGTTYNQKFEG (SEQ iD NO:71) o DFNPNNAGTTYNQKFEG (SEQ ID NO:118), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos GRFYYGSLYSFDY (SEQ ID NO:72), y una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASGNIHNYLA (SEQ ID NO:73), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos NAKTLAD (SEQ ID NO:74), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QHFWTSIT (SEQ ID NO:75), en donde la cadena pesada comprende al menos un 95 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 148, y en donde la cadena ligera comprende al menos un 95 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 149. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende (a) una cadena pesada que comprende los aminoácidos de la secuencia SEQ ID NO:148 y (b) una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende RASGNIHNYLA (SEQ ID NO:73), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos NAKTLAD (SEQ ID NO:74), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QHFWTSIT (SEQ ID NO:75), en donde la cadena ligera comprende al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 149. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende (a) una cadena pesada que comprende los aminoácidos de la secuencia SEQ ID NO:148 y (b) una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende RASGNIHNYLA (SEQ ID NO:73), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos NAKTLAD (SEQ ID NO:74), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QHFWTSIT (s Eq ID NO:75). En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende (a) una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende GYTFTDYYMN (SEQ ID NO:70), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos DFNPNNGGTTYNQKFEG (SEQ ID NO:71) o DFNPNNAGTTYNQKFEG (SEQ ID NO:118), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos GRFYYGSLYSFDY (SEQ ID NO:72), en donde la cadena pesada comprende al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 148, y (b) una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 149. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende (a) una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende GYTFTDYYMN (SEQ iD NO:70), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos DFNPNNGGTTYNQKFEG (SEQ ID NO:71) o DFNPNNAGTTYNQKFEG (SEQ ID NO:118), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos GRFYYGSLYSFDY (SEQ ID NO:72), y (b) una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:149. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 es un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 148 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 149.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una cadena pesada que tiene al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 148. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una cadena ligera que tiene al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 149. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una cadena pesada que tiene al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 148 y una cadena ligera que tiene al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 149. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una cadena pesada que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 148. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una cadena ligera que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 149. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una cadena pesada que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 148 y una cadena ligera que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 149. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 148. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 149. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 148 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 149. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 es un anticuerpo que comprende una cadena pesada de la SEQ ID NO: 148 y/o una cadena ligera de la SEQ ID NO: 149. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 es un anticuerpo que comprende una cadena pesada de la SEQ ID NO: 148. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 es un anticuerpo que comprende una cadena ligera de la SEQ ID NO: 149. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 es un anticuerpo que comprende una cadena pesada de la SEQ ID NO: 148 y/o una cadena ligera de la SEQ ID NO: 149.
Los agentes de unión a ILT2/ILT4 que comprenden una región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 y/o una región variable de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo 51A1, una versión humanizada del mismo o variantes del mismo se divulgan en el presente documento, pero no se reivindican. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 (por ejemplo, un aglutinante doble) comprende una región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 y/o una región variable de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo 51A1, una versión humanizada del mismo o variantes del mismo. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1, una región variable de cadena pesada CDR2 y una región variable de cadena pesada CDR3 del anticuerpo 51A1. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1, una región variable de cadena ligera CDR2 y una región variable de cadena ligera CDR3 del anticuerpo 51A1. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1, una región variable de cadena pesada CDR2, una región variable de cadena pesada CDR3; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1, una región variable de cadena ligera CDR2 y una región variable de cadena ligera CDR3 del anticuerpo 51A1. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 es una versión humanizada del anticuerpo 51A1. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 es una variante del anticuerpo 51A1 o 51A1 humanizado.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GFTFNTYAMH (SEQ ID NO:86), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos RIRSKSSNYAt Yy ADSVKD (SEQ ID NO:87), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos DGIYYYGTMYYYAMDY (SEQ ID NO:88), y una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos Ra SeSVDYYGNSFMY (SEQ ID NO:89), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos FASNLES (SEQ ID NO:90), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQNNEDPWT (SEQ ID NO:91); (b) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GFTFNTY (SEQ ID NO:92), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos RSKSSNYA (SEQ ID NO:93), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos DGIYYYGTMYYYAMDY (SEQ ID NO:88), y una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASESVDYYGNSFMY (SEQ ID NO:89), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos FASNLES (SEQ ID NO:90), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQNNEDPWT (SEQ ID NO:91); (c) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GFTFNTYAMH (SEQ ID NO:86), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos RIRSKSSNYATY (SEQ ID NO:94), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos DGIYYYGTMYYYAMDY (SEQ ID NO:88), y una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos R<a>S<e>SVDYYGNSFMY (SEQ ID NO:89), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos FASNLES (SEQ ID NO:90), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQNNEDPWT (SEQ ID NO:91); (d) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos TYAMH (SEQ ID NO:95), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos RIRSKSSNYATYYADSVKD (SEQ ID NO:87), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos DGIYYYGTMYYYAMDY (SEQ ID NO:88), y una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos rAs ESv Dy YGNSFMY (SEQ ID NO:89), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos FASNLES (SEQ ID NO:90), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQNNEDPWT (SEQ ID NO:91); o (e) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos NTYAMH (SEQ ID NO:96), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos w Va RIRSKSSNy At Y (SEQ ID NO:97), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos VRDGIYYYGTMYYYAMD (SEQ ID NO:98), y una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos DYYGNSFMYWY (SEQ ID NO:99), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos LLIYFASNLE (SEQ ID NO:100), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos Q<q>NNEDPW (S<e>Q ID NO:101).
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GFTFNTYAMH (SEQ ID NO:86), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos RIRSKSSNYAt Yy ADSVKD (SEQ ID NO:87), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos DGIYYYGTMYYYAMDY (SEQ ID NO:88), y/o (b) una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASESVDYYGNSFMY (SEQ ID NO:89), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos FASNLES (SEQ ID NO:90), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQNNEDPWT (SEQ ID NO:91). En algunas realizaciones, el agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que comprende la región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GFTFNTYAMH (SEQ ID NO:86), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos RIRSKSSNYAt Yy ADSVKD (SEQ ID NO:87), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos DGIYYYGTMYYYAMDY (SEQ ID NO:88). En algunas realizaciones, el agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASESVDYYGNSFMY (SEQ ID NO:89), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos FASNLES (SEQ ID NO:90), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQNNEDPWT (SEQ ID NO:91). En algunas realizaciones, el agente de unión a ILT2/ILT4 comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GFTFNTYAMH (SEQ ID NO:86), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos RIRSKSSNYATYYADSVKD (SEQ I<d>NO:87), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos DGIYYYGTMYYYAMDY (SEQ ID NO:88), y (b) una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASESVDYYGNSFMY (SEQ ID NO:89), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos FASNLES (SEQ ID NO:90), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQNNEDPWT (SeQ ID NO:91).
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo 51A1 y que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 135 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo 51A1 y que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 % de identidad con la secuencia de SEQ ID NO: 136.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 % o al menos un 99 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 135. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 % o al menos un 99 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 136. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 135. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 136.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 135 y una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 136. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 135 y una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencias con la SEQ ID NO: 136. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 135 y una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencias con la SEQ ID NO: 136. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 135 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 136.
Los agentes de unión a ILT2/ILT4 que comprenden una región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 y/o una región variable de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo 64A12, una versión humanizada del mismo o variantes del mismo se divulgan en el presente documento, pero no se reivindican. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 (por ejemplo, un aglutinante doble) comprende una región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 y/o una región variable de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo 64A12, una versión humanizada del mismo (por ejemplo, Hz64A12), o variantes del mismo. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1, una región variable de cadena pesada CDR2 y una región variable de cadena pesada CDR3 del anticuerpo 64A12 o Hz64A12. En otras realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1, una región variable de cadena ligera CDR2 y una región variable de cadena ligera CDR3 del anticuerpo 64A12 o Hz64A12. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1, una región variable de cadena pesada CDR2, una región variable de cadena pesada CDR3; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1, una región variable de cadena ligera CDR2 y una región variable de cadena ligera CDR3 del anticuerpo 64A12 o Hz64A12. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 es una versión humanizada del anticuerpo 64A12. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 es una variante del anticuerpo 64A12. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 es una variante del anticuerpo Hz64A12.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GFTFNTYAMH (SEQ ID NO:86), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos RIRSKSSNYAt Yy ADSVKD (SEQ ID NO:87), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos DGIYYYDTMYYYAMDY (SEQ ID NO: 102), y una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASESVDYYGNSFIY (SEQ ID NO: 103), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos FASNLES (SEQ ID NO:90), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQNNEDPWT (SEQ ID NO:91); (b) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GFTFNTY (SEQ ID NO:92), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos RSKSSNYA (SEQ ID NO:93), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos DGIYYYDTMYYYAMDY (SEQ ID NO: 102), y una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASESVDYYGNSFIY (SEQ ID NO: 103), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos FASNLES (SEQ ID NO:90), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQNNEDPWT (SEQ ID NO:91); (c) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GFTFNTYAMH (SEQ ID NO:86), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos RIRSKSSNYATY (SEQ ID NO:94), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos DGIYYYDTMYYYAMDY (SEQ ID NO: 102), y una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASESVDYYGNSFIY (SEQ ID NO: 103), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos FASNLES (SEQ ID NO:90), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQNNEDPWT (SEQ ID NO:91); (d) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos TYAMH (SEQ ID NO:95), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos RIRSKSSNYATYYADSVKD (SEQ ID NO:87), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos DGIYYYDTMYYYAMDY (SEQ ID NO:102), y una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASESVDYYGNSFIY (SEQ ID NO:103), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos FASNLES (SEQ ID NO:90), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQNNEDPWT (SEQ ID NO:91); o (e) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos NTYAMH (SEQ ID NO:96), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos WVARIRSKSSNYATY (SEQ ID NO:97), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos VRDGIYYYDTMYYYAMD (SEQ ID NO:104), y una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos DYYGNSFIYWY (SEQ ID NO:105), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos LLIYFASNLE (SEQ ID NO:100), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos Q<q>NNEDPW (S<e>Q ID NO:101).
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GFTFNTYAMH (SEQ ID NO:86), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos RIRSKSSNYAt Yy ADSVKD (SEQ ID NO:87), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos DGIYYYDTMYYYAMDY (SEQ ID NO:102), y/o (b) una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASESVDYYGNSFIY (SEQ ID NO:103), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos FASNLES (SEQ ID NO:90), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQNNEDPWT (SEQ ID NO:91). En algunas realizaciones, el agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que comprende la región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GFTFNTYAMH (SEQ ID NO:86), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos RIRSKSSNYAt Yy ADSVKD (SEQ ID NO:87), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos DGIYYYDTMYYYAMDY (SEQ ID NO:102). En algunas realizaciones, el agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASESVDYYGNSFIY (SEQ ID NO: 103), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos FASNLES (SEQ ID NO:90), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQNNEDPWT (SEQ ID NO:91). En algunas realizaciones, el agente de unión a ILT2/ILT4 comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GFTFNTYAMH (SEQ ID NO:86), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos RIRSKSSNYATYYADSVKD (SEQ ID NO:87), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos DGIYYYDTMYYYAMDY (SEQ ID NO: 102), y (b) una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASESVDYYGNSFIY (SEQ ID NO: 103), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos FASNLES (SEQ ID NO:90), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQNNEDPWT (SEQ ID NO:91).
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo 64A12 y que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 137 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo 64A12 y que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 % de identidad con la secuencia de SEQ ID NO: 138.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 % o al menos un 99 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 137. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 % o al menos un 99 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 138. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 137. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 138.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 137 y una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 138. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 137 y una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencias con la SEQ ID NO: 138. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 137 y una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencias con la SEQ ID NO: 138. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 137 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 138.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo Hz64A12 y que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 139 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo Hz64A12 y que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 % de identidad con la secuencia de SEQ ID NO: 140.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 % o al menos un 99 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 139. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 % o al menos un 99 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 140. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 139. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 140.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 139 y una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 140. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 139 y una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencias con la SEQ ID NO: 140. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 139 y una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencias con la SEQ ID NO: 140. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 139 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 140.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GFTFNTYAMH (SEQ ID NO:86), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos RIRSKSSNYATYYADSVKD (SEQ ID NO:87), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos DGIYYYDTMYYYAMDY (SEQ ID NO:102), y una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASESVDYYGNSFIY (SEQ ID NO:103), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos FASNLES (SEQ ID NO:90), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQNNEDPWT (SEQ ID NO:91), en donde la cadena pesada comprende al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 152, y en donde la cadena ligera comprende al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 153. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GFTFNTYAMH (SEQ ID NO:86), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos RIRSKSSNYATYYADSVKD (SEQ ID NO:87), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos DGIYYYDTMYYYAMDY (SEQ ID NO:102), y una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASESVDYYGNSFIY (SEQ ID NO:103), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos FASNLES (SEQ ID NO:90), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQNNEDPWT (SEQ ID NO:91), en donde la cadena pesada comprende al menos un 95 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 152, y en donde la cadena ligera comprende al menos un 95 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 153. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende (a) una cadena pesada que comprende los aminoácidos de la SEQ ID NO:152 y (b) una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASESVDYYGNSFIY (SEQ ID NO:103), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos FASNLES (SEQ ID NO:90), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQNNEDPWT (SEQ ID NO:91), en donde la cadena ligera comprende al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 153. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende (a) una cadena pesada que comprende los aminoácidos de la SEQ ID NO:152 y (b) una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASES<v>D<y>YGNSFIY (SEQ ID NO:103), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos FASNLES (SEQ ID NO:90), y una región variable de cadena ligera c DR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQNNEDPWT (SEQ ID NO:91). En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende (a) una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GFTFNTYAMH (SEQ ID NO:86), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos RIRSKSSNYATYYADSVKD (SEQ ID NO:87), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos DGIYYYDTMYYYAMDY (SEQ ID NO:102), en donde la cadena pesada comprende al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 152, y (b) una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 153. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende (a) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GFTFNTYAMH (SEQ ID NO:86), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos RIRSKSSNYATYYADSVKD (SEQ ID NO:87), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos DGIYYYDTMYYYAMDY (SEQ ID NO:102), y (b) una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 153. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 es un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:152 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 153.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una cadena pesada que tiene al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 152. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una cadena ligera que tiene al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 153. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una cadena pesada que tiene al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 152 y una cadena ligera que tiene al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 153. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una cadena pesada que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 152. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una cadena ligera que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 153. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una cadena pesada que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 152 y una cadena ligera que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 153. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 152. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 153. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 152 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 153. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 es un anticuerpo que comprende una cadena pesada de la SEQ ID NO: 152 y/o una cadena ligera de la SEQ ID NO: 153. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 es un anticuerpo que comprende una cadena pesada de la SEQ ID NO: 152. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 es un anticuerpo que comprende una cadena ligera de la SEQ ID NO: 153. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 es un anticuerpo que comprende una cadena pesada de la SEQ ID NO: 152 y/o una cadena ligera de la SEQ ID NO: 153.
Los agentes de unión a ILT2/ILT4 que comprenden una región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 y/o una región variable de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo 73C4, una versión humanizada del mismo o variantes del mismo se divulgan en el presente documento, pero no se reivindican. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 (por ejemplo, un aglutinante doble) comprende una región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 y/o una región variable de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo 73C4, una versión humanizada del mismo o variantes del mismo. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1, una región variable de cadena pesada CDR2 y una región variable de cadena pesada CDR3 del anticuerpo 73C4. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1, una región variable de cadena ligera CDR2 y una región variable de cadena ligera CDR3 del anticuerpo 73C4. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1, una región variable de cadena pesada CDR2, una región variable de cadena pesada CDR3; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1, una región variable de cadena ligera CDR2 y una región variable de cadena ligera CDR3 del anticuerpo 73C4. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 es una versión humanizada del anticuerpo 73C4. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 es una variante del anticuerpo 73C4 o 73C4 humanizado.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTDYYMN (SEQ ID NO:70), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos NVNPNNGGTSYNQKFKG (SEQ ID NO:106), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos REIYFYGTiYy Ya MDY (SEQ ID NO: 107), y una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos Ra SeSVDYYGNSFMY (SEQ ID NO:89), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos FASNLES (SEQ ID NO:90), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQNNEDPWT (SEQ ID NO:91); (b) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTDY (SEQ ID NO:76), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos NPNNGG (SEQ ID NO:77), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos REIYFYGTIYYYAMDY (SEQ ID NO: 107), y una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASESVDYYGNSFMY (SEQ ID NO:89), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos FASNLES (SEQ ID NO:90), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQNNEDPWT (SEQ ID NO:91); (c) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTDYYMN (SEQ ID NO:70), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos NVNPNNGGTS (SEQ ID NO: 108), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos REIYFYGTIYYYAMDY (SEQ ID NO:107), y una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos Ra SeSVDYYGNSFMY (SEQ ID NO:89), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos FASNLES (SEQ ID NO:90), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQNNEDPWT (SEQ ID NO:91); (d) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos DYYMN (SEQ ID NO:79), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos NVNPNNGGTSYNQKFKG (SEQ ID NO:106), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos REIYFYGTIYYYAMDY (SEQ ID NO:107), y una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASESVDYYGNSFMY (SEQ ID NO:89), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos FASNLES (SEQ ID NO:90), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQNNEDPWT (SEQ ID NO:91); o (e) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos TDYYMN (SEQ ID NO:80), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos WIGNVNPNNGGTS (SEQ ID NO:109), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos ARREIYFYGTIYYYAMD (SEQ ID NO:110), y una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos DYYGNSFMYWY (SEQ ID NO:99), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos LLIYFASNLE (SEQ ID NO:100), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos Qq NNEDPW (SeQ ID NO:101).
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTDYYMN (SEQ ID NO:70), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos NVNPNNGGTSYNQKFKG (SEQ ID NO:106), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos REIYFYGTIYYYAMDY (SEQ ID NO:107), y/o (b) una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASESVDYYGNSFMY (SEQ ID NO:89), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos FASNLES (SEQ ID NO:90), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQNNEDPWT (SEQ ID NO:91). En algunas realizaciones, el agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que comprende la región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTDYYMN (SEQ ID NO:70), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos NVNPNNGGTSYNQKFKG (SEQ ID NO: 106), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos REIYFYGTlYYYAMDY (SEQ ID NO: 107). En algunas realizaciones, el agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASESVDYYGNSFMY (SEQ ID NO:89), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos FASNLES (SEQ ID NO:90) y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQNNEDPWT (SEQ ID NO:91). En algunas realizaciones, el agente de unión a ILT2/ILT4 comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTDYYMN (SEQ ID NO:70), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos NVNPNNGGTSYNQKFKG (SEQ iD NO:106) y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos REIYFYGTIYYYAMDY (SEQ ID NO: 107) y (b) una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASESVDYYGNSFMY (SEQ ID NO:89), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos FASNLES (SEQ ID NO:90), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQNNEDPw T (SeQ ID NO:91).
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo 73C4 y que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 141 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo 73C4 y que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 % de identidad con la secuencia de SEQ ID NO: 142.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 % o al menos un 99 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 141. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 % o al menos un 99 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 142. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 141. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 142.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 141 y una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 142. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 141 y una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencias con la SEQ ID NO: 142. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 141 y una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencias con la SEQ ID NO: 142. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 141 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 142.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 (por ejemplo, un aglutinante doble) comprende una región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 y/o una región variable de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo 73D1, una versión humanizada del mismo (por ejemplo, Hz73D1), o variantes del mismo. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1, una región variable de cadena pesada CDR2 y una región variable de cadena pesada CDR3 del anticuerpo 73D1 o el anticuerpo Hz73D1.v1. En otras realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1, una región variable de cadena ligera CDR2 y una región variable de cadena ligera CDR3 del anticuerpo 73D1 o el anticuerpo Hz73D1.v1. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1, una región variable de cadena pesada CDR2, una región variable de cadena pesada CDR3; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1, una región variable de cadena ligera CDR2 y una región variable de cadena ligera CDR3 del anticuerpo 73D1 o el anticuerpo Hz73D1.v1. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 es una versión humanizada del anticuerpo 73D1. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 es una variante del anticuerpo 73D1. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 es una variante del anticuerpo Hz73D1.v1.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTDYYIN (SEQ ID NO:111), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos NVNPNDGGTTYNQKFKG (SEQ ID NO:112), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos REIYFYGTIYYYAMDY (SEQ ID NO:107), y una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASESVDYYGNSFMY (SEQ ID NO:89), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos FASNLES (SEQ ID NO:90), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQNNEDPWT (SEQ ID NO:91); (b) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTDY (SEQ ID NO:76), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos NPNDGG (SEQ ID NO:113), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos REIYFYGTIYYYAMDY (SEQ ID NO:107), y una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASES<v>D<y>YGNSFMY (SEQ ID NO:89), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos FASNLES (SEQ ID NO:90), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQNNEDPWT (SEQ ID NO:91); (c) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTDYYIN (SEQ ID NO:111), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos NVNPNDGGTT (SEQ ID NO:114), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos REIYFYGTIYYYAMDY (SEQ ID NO:107), y una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASESVDYYGNSFMY (SEQ ID NO:89), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos FASNLES (SEQ ID NO:90), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQNNEDPWT (SEQ ID NO:91); (d) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos DYYIN (SEQ ID NO:115), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos NVNPNDGGt Ty NQKFKG (SEQ ID NO:112), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos REIYFYGTIYYYAMDY (SEQ ID NO:107), y una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASESVDYYGNSFMY (SEQ ID NO:89), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos FASNLES (SEQ ID NO:90), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQNNEDPWT (SEQ ID NO:91); o (e) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos TDYYIN (SEQ ID NO:116), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos WIGNVNPNDGGTT (SEQ ID NO:117) o la secuencia de aminoácidos WMGNVNPNDGGTT (SEQ ID NO:124), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos ARREIYFYGTIYYYAMD (SEQ ID NO:110), y una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos DYYGNSFMYWY (SEQ ID NO:99), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos LLIYFASNLE (SEQ ID NO:100), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQNNEDPW (SEQ ID NO:101).
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTDYYIN (SEQ ID NO:111), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos NVNPNDGGTTYNQKFKG (SEQ ID NO:112), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos REIYFYGTIYYYAMDY (SEQ ID NO:107), y/o (b) una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASESVDYYGNSFMY (SEQ ID NO:89), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos FASNLES (SEQ ID NO:90), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQNNEDPWT (SEQ ID NO:91). En algunas realizaciones, el agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que comprende la región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTDYYIN (SEQ ID NO:111), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos NVNPNDGGTTYNQKFKG (SEQ ID NO:112), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos REIYFYGTIYYYAMDY (SEQ ID NO:107). En algunas realizaciones, el agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASESVDYYGNSFMY (SEQ ID NO:89), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos FASNLES (SEQ ID NO:90), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQNNEDPWT (SEQ ID NO:91). En algunas realizaciones, el agente de unión a ILT2/ILT4 comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTDYYIN (SEQ ID NO:111), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos NVNPNDGGTTYNQKFKG (SEQ iD NO:112), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos REIYFYGTIYYYAMDY (SEQ ID NO:107), y (b) una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASESVDYYGNSFMY (SEQ ID NO:89), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos FASNLES (SEQ ID NO:90), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQNNEDPWT (S<e>Q ID NO:91).
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTDYYIN (SEQ ID NO:111) o una variante de esta que comprende 1, 2, 3 o 4 sustituciones de aminoácidos; una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos NVNPNDGGTTYNQKFKG (SEQ ID NO:112), o una variante de esta que comprende 1, 2, 3 o 4 sustituciones de aminoácidos; y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos REIYFYGTIYYYAMDY (SEQ ID NO:107), o una variante de esta que comprende 1, 2, 3 o 4 sustituciones de aminoácidos; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASESVDYYGNSFMY (SEQ ID NO:89), o una variante de esta que comprende 1, 2, 3 o 4 sustituciones de aminoácidos; una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos FASNLES (SEQ ID NO:90), o una variante de esta que comprende 1, 2, 3, o 4 sustituciones de aminoácidos; y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQNNEDPWT (SEQ ID NO:91), o una variante de esta que comprende 1, 2, 3 o 4 sustituciones de aminoácidos.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo 73D1 y que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 143 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo 73D1 y que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 % de identidad con la secuencia de SEQ ID NO: 142.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 % o al menos un 99 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 143. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 % o al menos un 99 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 142. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 143. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 142.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 143 y una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 142. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 143 y una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencias con la SEQ ID NO: 142. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 143 y una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencias con la SEQ ID NO: 142. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 143 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 142.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo Hz73D1.v1 y que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 144 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo Hz73D1.v1 y que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 % de identidad con la secuencia de SEQ ID NO: 145.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 % o al menos un 99 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 144. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 % o al menos un 99 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 145. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 144. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 145.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 144 y una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 145. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 144 y una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 145. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 144 y una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 145. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 144 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 145.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende GYTFTDYYIN (SEQ ID NO:111), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos NVNPNDGGTTYNQKFKG (SEQ ID nO:112), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos REIYFYGTIYYYAMDY (SEQ ID NO:107), y una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASESVDYYGNSFMY (SEQ ID NO:89), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos FASNLES (SEQ ID NO:90), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQNNEDPWT (SEQ ID NO:91), en donde la región variable de cadena pesada comprende al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 143, y en donde la región variable de cadena ligera comprende al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 142. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende GYTFTDYYIN (SEQ ID NO:111), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos NVNPNDGGTTYNQKFKG (SEQ ID NO:112), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos REIYFYGTIYYYAMDY (SEQ ID NO:107), y una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASESVDYYGNSFMY (SEQ ID NO:89), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos FASNLES (SEQ ID NO:90), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQNNEDPWT (SEQ ID NO:91), en donde la región variable de cadena pesada comprende al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 144, y en donde la región variable de cadena ligera comprende al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 145.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende GYTFTDYYIN (SEQ ID NO:111), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos NVNPNDGGTTYNQKFKG (SEQ ID NO:112) y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos REIYFYGTIYYYAMDY (SEQ ID NO:107), y una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASESVDYYGNSFMY (SEQ ID NO:89), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos FASNLES (SEQ ID NO:90), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQNNEDPWT (SEQ ID NO:91), en donde la cadena pesada comprende al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 156, y en donde la cadena ligera comprende al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 157. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende GYTFTDYYIN (SEQ ID NO:111), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos NVNPNDGGTTYNQKFKG (SEQ ID NO:112), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos REIYFYGTIYYYAMDY (SEQ ID NO:107), y una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASESVDYYGNSFMY (SEQ ID NO:89), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos FASNLES (SEQ ID NO:90), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQNNEDPWT (SEQ ID NO:91), en donde la cadena pesada comprende al menos un 95 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 156, y en donde la cadena ligera comprende al menos un 95 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 157. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende (a) una cadena pesada que comprende los aminoácidos de la SEQ ID NO:156 y (b) una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende RASESVDYYGNSFMY (SEQ ID NO:89), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos FASNLES (SEQ ID NO:90), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQNNEDPWT (SEQ ID NO:91), en donde la cadena ligera comprende al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 157. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende (a) una cadena pesada que comprende los aminoácidos de la SEQ ID NO:156 y (b) una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende RASESVdYy GNSFMY (SEQ ID NO:89), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos FASNLES (SEQ ID NO:90), y una región variable de cadena ligera<c>DR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQNNEDPWT (SEQ ID NO:91). En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende: (a) una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTDYYIN (SEQ ID NO:111), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos NVNPNDGGTTYNQKFKG (SEQ ID NO:112), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos REIYFYGTIYYYAMDY (SEQ ID NO:107), en donde la cadena pesada comprende al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 156, y (b) una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 157. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende: (a) una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTDYYIN (SEQ ID NO:111), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos NVNPNDGGTTYNQKFKG (SEQ ID NO:112), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos REIYFYGTIYYYAMDY (SEQ ID NO:107), y (b) una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 157. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 es un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:156 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 157.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una cadena pesada que tiene al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 156. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una cadena ligera que tiene al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 157. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una cadena pesada que tiene al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 156 y una cadena ligera que tiene al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 157. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una cadena pesada que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 156. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una cadena ligera que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 157. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una cadena pesada que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 156 y una cadena ligera que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 157. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 156. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 157. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 156 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 157. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 es un anticuerpo que comprende una cadena pesada de la SEQ ID NO: 156 y/o una cadena ligera de la SEQ ID NO: 157. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 es un anticuerpo que comprende una cadena pesada de la SEQ ID NO: 156. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 es un anticuerpo que comprende una cadena ligera de la SEQ ID NO: 157. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 es un anticuerpo que comprende una cadena pesada de la SEQ ID NO: 156 y/o una cadena ligera de la SEQ ID NO: 157.
En algunas realizaciones, el agente de unión a ILT2/ILT4 es un anticuerpo 73D1. En algunas realizaciones, el agente de unión a ILT2/ILT4 es un anticuerpo Hz73D1.v1.
En el presente documento se proporcionan agentes que compiten con uno o más de los agentes de unión descritos en el presente documento por la unión a ILT2, ILT4 o tanto a ILT2 como a ILT4. En algunas realizaciones, un agente compite con uno o más de los anticuerpos descritos en el presente documento por unirse a ILT2, ILT4 o tanto a ILT2 como a ILT4. En algunas realizaciones, un agente que compite con uno o más de los anticuerpos descritos en el presente documento es un anticuerpo. En algunas realizaciones, un agente se une al mismo epítopo que uno de los anticuerpos descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, un agente se une a un epítopo que se superpone con un epítopo unido por uno de los anticuerpos descritos en el presente documento. Se espera que los anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno que compiten con el mismo epítopo, o se unen al mismo epítopo, que los anticuerpos descritos en el presente documento muestren propiedades funcionales similares.
En algunas realizaciones, un agente compite por unirse a ILT2, a ILT4 o tanto a ILT2 como a ILT4 humanos con un anticuerpo de referencia, en donde el anticuerpo de referencia comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTDYYIN (SEQ ID NO:111), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos NVNPNDGGTTYNQKFKG (SEQ ID NO:112), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos REIYFYGTIy Yy AMDY (SEQ ID NO:107), y (b) una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASESVDYYGNSFMY (SEQ ID NO:89), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos FASNLES (SEQ ID NO:90), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQNNEDPWT (SEQ ID NO:91). En algunas realizaciones, un agente compite por unirse a ILT2 humano con un anticuerpo de referencia, en donde el anticuerpo de referencia comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTDYYIN (SEQ ID NO:111), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos NVNPNDGGTTYNQKFKG (SEQ ID NO:112), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos REIYFYGTIYYYAMDY (SEQ ID NO:107), y (b) una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASESVDYYGNSFMY (SEQ ID NO:89), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos FASNLES (SEQ ID NO:90), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQNNEDPWT (S<e>Q ID NO:91).
En algunas realizaciones, un agente compite por unirse a ILT2, a ILT4 o tanto a ILT2 como a ILT4 humanos con un anticuerpo de referencia, en donde el anticuerpo de referencia comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTDYYMN (SEQ ID NO:70), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos DFNPNNGGTTYNQKFEG (SEQ ID NO:71) o DFNPNNAGTTYNQKFEG (SEQ ID NO:118), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos GRFYYGSLYSFDY (SEQ ID NO:72), y (b) una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASGNIHNYLA (SEQ ID NO:73), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos NAKTLAD (SEQ ID NO:74), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QHFWTSIT (SEQ ID NO:75). En algunas realizaciones, un agente compite por unirse a ILT4 humano con un anticuerpo de referencia, en donde el anticuerpo de referencia comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTDYYMN (SEQ ID NO:70), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos DFNPNNGGTTYNQKFEG (SEQ ID NO:71) o DFNPNNAGTTYNQKFEG (SEQ ID NO:118), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos GRFYYGSLYSFDY (SEQ ID NO:72), y (b) una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASGNIHNYLA (SEQ ID NO:73), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos NAKTLAD (SEQ ID NO:74), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QHFWTSIT (SEQ ID NO:75).
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT (por ejemplo, un agente de unión a ILT2, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4) descrito en el presente documento comprende un anticuerpo en el que al menos una o más de las regiones constantes del anticuerpo se han modificado o suprimido. En algunas realizaciones, un anticuerpo comprende una o más modificaciones en una o más de las tres regiones constantes de la cadena pesada (CH1, CH2 o CH3) y/o en la región constante de la cadena ligera (CL). En algunas realizaciones, un anticuerpo comprende una o más modificaciones en la región bisagra. En algunas realizaciones, la región constante de la cadena pesada del anticuerpo modificado comprende al menos una región constante humana. En algunas realizaciones, la región constante de la cadena pesada del anticuerpo modificado comprende más de una región constante humana. En algunas realizaciones, las modificaciones en la región constante comprenden adiciones, supresiones o sustituciones de uno o más aminoácidos en una o más regiones. En algunas realizaciones, una o más regiones se suprimen parcial o totalmente de las regiones constantes de un anticuerpo modificado. En algunas realizaciones, se ha retirado todo el dominio CH2 de un anticuerpo (construcciones ACH2). En algunas realizaciones, una o más regiones se suprimen parcial o totalmente de la región bisagra de un anticuerpo modificado. En algunas realizaciones, una región constante suprimida se reemplaza por un espaciador de aminoácidos corto que proporciona parte de la flexibilidad molecular que normalmente confiere la región constante ausente. En algunas realizaciones, una región bisagra suprimida se reemplaza por un espaciador de aminoácidos corto que proporciona parte de la flexibilidad molecular que normalmente confiere la región bisagra ausente. En algunas realizaciones, un anticuerpo modificado comprende un dominio CH3 fusionado directamente con la región bisagra del anticuerpo. En algunas realizaciones, un anticuerpo modificado comprende un espaciador peptídico insertado entre la región bisagra y los dominios CH2 y/o CH3 modificados.
Se sabe en la técnica que la región o regiones constantes de un anticuerpo median varias funciones efectoras y estas funciones efectoras pueden variar dependiendo del isotipo del anticuerpo. Por ejemplo, la unión del componente C1 del complemento a la región Fc de los anticuerpos IgG o IgM (unidos al antígeno) activa el sistema del complemento. La activación del complemento es importante en la opsonización y lisis de los patógenos celulares. La activación del complemento también estimula la respuesta inflamatoria y puede estar implicada en la hipersensibilidad autoinmunitaria. Es más, la región Fc de un anticuerpo puede unirse a un receptor Fc (FcR) en la superficie de una célula. Hay varios receptores Fc que son específicos para diferentes clases de anticuerpos, incluidos IgG (receptores gamma), IgE (receptores épsilon), IgA (receptores alfa) e IgM (receptores mu). La unión del anticuerpo a los receptores Fc en las superficies celulares desencadena una serie de respuestas biológicas importantes y diversas incluido el atrapamiento y la destrucción de las partículas recubiertas de anticuerpos, la depuración de los complejos inmunitarios, la lisis de las células diana recubiertas de anticuerpos por los linfocitos citolíticos (denominada citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos o ADCC), la liberación de mediadores inflamatorios, la transferencia placentaria y el control de la producción de inmunoglobulinas.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT comprende una región Fc variante. Los expertos en la técnica conocen las secuencias de aminoácidos de la región Fc de las IgG 1, IgG2, IgG3 e IgG4 humanas (por ejemplo, una región IgG1 humana representativa es la SEQ ID NO : 158). En algunos casos, se han identificado regiones Fc con variaciones de aminoácidos en los anticuerpos naturales. En algunas realizaciones, una región Fc variante se diseña con sustituciones en posiciones de aminoácidos específicas en comparación con una región Fc natural. Las regiones Fc variantes son bien conocidas en la técnica e incluyen, entre otras, la SEQ ID NO:159, la SEQ ID NO: 160, la SEQ ID NO: 161, la SEQ ID NO:162 y la SEQ ID NO:163.
En algunas realizaciones, un anticuerpo modificado proporciona funciones efectoras alteradas que, a su vez, afectan al perfil biológico del anticuerpo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la supresión o inactivación (mediante mutaciones puntuales u otros medios) de una región constante reduce la unión al receptor Fc de un anticuerpo modificado a medida que circula. En algunas realizaciones, las modificaciones constantes de la región aumentan la semivida sérica de un anticuerpo. En algunas realizaciones, las modificaciones constantes de la región reducen la semivida sérica de un anticuerpo. En algunas realizaciones, las modificaciones constantes de la región disminuyen o reducen la ADCC y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) de un anticuerpo. En algunas realizaciones, las sustituciones de aminoácidos específicas en una región Fc de la IgG 1 humana con los residuos de IgG2 o IgG4 correspondientes reducen las funciones efectoras (por ejemplo, ADCC y CDC) en un anticuerpo modificado. En algunas realizaciones, un anticuerpo modificado no tiene una o más funciones efectoras. En algunas realizaciones, un anticuerpo modificado no tiene ninguna función efectora detectable (por ejemplo, anticuerpos “sin efectores”). En algunas realizaciones, un anticuerpo modificado no tiene actividad de ADCC y/o no tiene actividad de CDC. En algunas realizaciones, un anticuerpo modificado no se une a un receptor Fc y/o a los factores del complemento. En algunas realizaciones, un anticuerpo modificado no tiene ninguna función efectora. En algunas realizaciones, las modificaciones constantes de la región aumentan o mejoran la ADCC y/o la CDC de un anticuerpo. En algunas realizaciones, la región constante se modifica para eliminar los enlaces disulfuro o los restos de oligosacáridos. En algunas realizaciones, la región constante se modifica para añadir/sustituir uno o más aminoácidos para proporcionar uno o más sitios de adhesión de citotoxinas, oligosacáridos o carbohidratos.
Las modificaciones en la región constante de los anticuerpos descritos en el presente documento pueden hacerse usando procedimientos de diseño bioquímicos o moleculares bien conocidos. En algunas realizaciones, las variantes de anticuerpos se preparan introduciendo cambios nucleotídicos apropiados en el ADN codificante y/o mediante la síntesis del anticuerpo o polipéptido deseado. Usando estos procedimientos de diseño para modificar un anticuerpo, puede ser posible trastornar la actividad o función efectora proporcionada por una secuencia o región específica mientras se mantiene sustancialmente la estructura, la actividad de unión y otras características deseadas del anticuerpo modificado.
La presente divulgación abarca además variantes y equivalentes adicionales que son sustancialmente homólogos a los anticuerpos recombinantes, monoclonales, quiméricos, humanizados y humanos, o fragmentos de anticuerpos de estos, descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, es deseable mejorar la afinidad de unión del anticuerpo. En algunas realizaciones, es deseable modular las propiedades biológicas del anticuerpo, incluyendo, entre otros, la especificidad, la termoestabilidad, el nivel de expresión, las funciones efectoras, la glucosilación, la inmunogenicidad y/o la solubilidad. Los expertos en la técnica apreciarán que los cambios de aminoácidos pueden alterar los procesos postraduccionales de un anticuerpo, tales como cambiar el número o la posición de los sitios de glucosilación o alterar las características de anclaje a la membrana.
Se pueden generar variaciones mediante la sustitución, supresión o inserción de uno o más nucleótidos en un polinucleótido que codifica el anticuerpo o polipéptido, lo que da como resultado un cambio en un aminoácido o la secuencia de aminoácidos en comparación con la secuencia de anticuerpos o polipéptidos naturales. En algunas realizaciones, las sustituciones de aminoácidos son el resultado de reemplazar un aminoácido por otro aminoácido que tiene propiedades estructurales y/o químicas similares, tales como el reemplazo de una leucina por una serina (es decir,reemplazos de aminoácidos conservadores). En algunas realizaciones, la sustitución, supresión o inserción incluye menos de 25 sustituciones de aminoácidos, menos de 20 sustituciones de aminoácidos, menos de 15 sustituciones de aminoácidos, menos de 10 sustituciones de aminoácidos, menos de 5 sustituciones de aminoácidos, menos de 4 sustituciones de aminoácidos, menos de 3 sustituciones de aminoácidos o menos de 2 sustituciones de aminoácidos con respecto a la molécula original. En algunas realizaciones, las variaciones en la secuencia de aminoácidos que son biológicamente útiles y/o relevantes se determinan haciendo sistemáticamente inserciones, supresiones o sustituciones en la secuencia y probando la actividad de las proteínas variantes resultantes en comparación con el anticuerpo original.
En algunas realizaciones, las variantes pueden incluir la adición de residuos aminoacídicos en el extremo amino y/o carboxilo terminal del anticuerpo o polipéptido. La longitud de los residuos aminoacídicos adicionales puede encontrarse entre un residuo y cien o más residuos. En algunas realizaciones, una variante comprende un residuo de metionilo N-terminal. En algunas realizaciones, la variante comprende un polipéptido/proteína adicional para crear una proteína de fusión. En algunas realizaciones, una variante se diseña para que sea detectable y puede comprender una marca y/o proteína detectable (por ejemplo, una etiqueta fluorescente, una proteína fluorescente o una enzima).
En algunas realizaciones, un residuo de cisteína que no participa en el mantenimiento de la conformación apropiada de un anticuerpo se sustituye o suprime para modular las características del anticuerpo, por ejemplo, para mejorar la estabilidad oxidativa y/o prevenir la reticulación anómala de disulfuro. Por el contrario, en algunas realizaciones, se añaden uno o más residuos de cisteína para crear una o más uniones disulfuro para mejorar la estabilidad.
En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente divulgación está “desinmunizado”. La desinmunización de los anticuerpos generalmente consiste en introducir mutaciones de aminoácidos específicas (por ejemplo, sustituciones, supresiones, adiciones) que dan como resultado la retirada de los epítopos de las células T (conocidos o predichos) sin reducir significativamente la afinidad de unión u otras actividades deseadas del anticuerpo.
Los anticuerpos o polipéptidos variantes descritos en el presente documento pueden generarse usando métodos conocidos en la técnica, incluyendo, entre otros, la mutagénesis dirigida al sitio, la mutagénesis por barrido con alanina y la mutagénesis por PCR.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT (por ejemplo, un agente de unión a ILT2, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4) descrito en el presente documento se modifica químicamente. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT es (i) un anticuerpo anti-ILT2, (ii) un anticuerpo anti-ILT4, o (iii) un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 que se modifica químicamente mediante glucosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisión proteolítica y/o enlace a un ligando celular u otra proteína. Cualquiera de las numerosas modificaciones químicas se puede llevar a cabo mediante procedimientos conocidos. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT es un fragmento de anticuerpo (por ejemplo, scFv, Fv, Fab, F(ab')2 o F(ab')), en donde el fragmento de anticuerpo está adherido (ya sea directa o indirectamente) a un resto que prolonga la semivida incluyendo, entre otros, polietilenglicol (PEG), un mimético de PEG, XTEN®, albúmina sérica, ácido polisiálico, N-(2-hidroxipropil)metacrilamida o dextrano.
La presente divulgación abarca los agentes de unión a ILT construidos sobre cadenas principales no inmunoglobulínicas, en donde los agentes se unen al mismo epítopo o esencialmente al mismo epítopo que un anticuerpo anti-ILT divulgado en el presente documento. En algunas realizaciones, un agente de unión no basado en inmunoglobulina es un agente que compite con (i) un anticuerpo anti-ILT2, (ii) un anticuerpo anti-ILT4, o (iii) un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 descrito en el presente documento en un ensayo de unión competitiva. En algunas realizaciones, los agentes de unión a ILT alternativos comprenden una proteína de armazón. En general, las proteínas de armazón se pueden asignar a uno de los tres grupos según la arquitectura de su cadena principal: 1) armazones que consisten en hélices a; (2) armazones pequeños con pocas estructuras secundarias o una arquitectura irregular de hélices a y láminas p; y (3) armazones que consisten predominantemente en láminas p. Las proteínas del armazón incluyen, entre otros, las anticalinas, que se basan en el armazón de la lipocalina; las adnectinas, que se basan en el décimo dominio de la fibronectina humana de tipo 3; los aficuerpos, que se basan en el dominio B en la región de unión a Ig de la proteína A delStaphylococcus aureus;las darpinas, que se basan en las proteínas del dominio repetido de la anquirina; los fynómeros, que se basan en el dominio SH3 de la proteína cinasa Fyn humana; las afitinas, que se basan en el Sac7d deSulfolobus acidocaldarius;las affilinas, que se basan en y-B cristalino humano o ubiquitina humana; los avimeros, que se basan en los dominios A de las proteínas receptoras de membrana; los nudos (miniproteínas del nudo de la cisteína), que se basan en un pliegue proteico estable de la cadena-p antiparalelo de 30 aminoácidos; y los armazones inhibidores del dominio de Kunitz, que se basan en una estructura que contiene tres uniones disulfuro y tres circuitos.
Los agentes de unión a ILT2 divulgados en este párrafo se incluyen como referencia, pero no se reivindican. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 comprende una proteína de armazón diseñada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 que se muestran en la tabla 1. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una proteína de armazón diseñada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GFSLTNYGVS (SEQ ID NO:22), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos IIWGDGSTNYH<s>A<l>IS (SEQ ID NO:23), una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos PNWDTYAMDF (SEQ ID NO:24), una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASQDISNFLN (SEQ ID NO:25), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos CTSKLHS (SEQ ID NO:26), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQGNTLPPT (SEQ ID NO:27). En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 comprende una proteína de armazón diseñada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1, c Dr 2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo 27F9.
Los agentes de unión a ILT4 divulgados en este párrafo se incluyen como referencia, pero no se reivindican. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 comprende una proteína de armazón diseñada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 que se muestran en la tabla 2. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 comprende una proteína de armazón diseñada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYSFTGYYMH (SEQ ID NO:38), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos RVYPNNGDTSYNQKFKV (SEQ ID NO:39), una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos GATVVESLFAY (SEQ ID NO:40), una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASESVDNYGNNFLH (SEQ ID NO:41), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos RTSNLES (SEQ ID NO:42), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQSNEDPYT (SEQ ID NO:43). En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 comprende una proteína de armazón diseñada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo 47C8.
Los agentes de unión a ILT4 divulgados en este párrafo se incluyen como referencia, pero no se reivindican. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 comprende una proteína de armazón diseñada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 que se muestran en la tabla 3. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 comprende una proteína de armazón diseñada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTNYGMN (SEQ ID NO:54), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos WINTYIGEPI<y>A<d>DFKG (SEQ ID NO:55), una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos RSDYDGYAMDY (SEQ ID NO:56), una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos KSSQSLLYSGNQKNYLA (SEQ ID NO:57), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos WASTRES (SEQ ID NO:58), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQHDSYPT (SEq ID NO:59). En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 comprende una proteína de armazón diseñada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo 48A5.
Los agentes de unión a ILT2/ILT4 divulgados en este párrafo se incluyen como referencia, pero no se reivindican. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una proteína de armazón diseñada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 que se muestran en la tabla 4A o la tabla 4B. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una proteína de armazón diseñada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTDYYMN (SEQ ID NO:70), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos DFNPNNGGTTYNQKFEG (SEQ ID NO:71) o DFNPNNAGTTYNQKFEG (SEQ ID NO:118), una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos GRFYYGSLYSFDY (SEQ ID NO:72), una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASGNIHNYLA (SEQ ID NO:73), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos NAKTLAD (SEQ ID NO:74), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QHFWTSIT (SEQ ID NO:75). En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una proteína de armazón diseñada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo 47H6 o el anticuerpo Hz47H6.v2.
Los agentes de unión a ILT2/ILT4 divulgados en este párrafo se incluyen como referencia, pero no se reivindican. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una proteína de armazón diseñada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 que se muestran en la tabla 5. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una proteína de armazón diseñada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GFTFNTYAMH (SEQ ID NO:86), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos RIRSKSSNYATYYADSVKD (SEQ ID NO:87), una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos DGIYYYGTMYYYAMDY (SEQ ID NO:88), una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASESVDYy Gn SFMY (SEQ ID NO:89), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos FASNLES (SEQ ID NO:90), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQNNEDPWT (SEQ ID NO:91). En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una proteína de armazón diseñada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera c Dr 1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo 51A1.
Los agentes de unión a ILT2/ILT4 divulgados en este párrafo se incluyen como referencia, pero no se reivindican. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una proteína de armazón diseñada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 que se muestran en la tabla 6A o la tabla 6B. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una proteína de armazón diseñada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GFTFNTYAMH (SEQ ID NO:86), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos RIRSKSSNYATYYADSVKD (SEQ ID NO:87), una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos DGIYYYDTMYYYAMDY (SEQ ID NO:102), una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASESVDYYGNSFIY (SEQ ID NO:103), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos FASNLES (SEQ ID NO:90), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQNNEDPWT (SEQ ID NO:91). En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una proteína de armazón diseñada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera<c>D<r>1 , CDR2 y CDR3 del anticuerpo 64A12.
Los agentes de unión a ILT2/ILT4 divulgados en este párrafo se incluyen como referencia, pero no se reivindican. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una proteína de armazón diseñada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 que se muestran en la tabla 7. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una proteína de armazón diseñada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTDYYMN (SEQ ID NO:70), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos NVNPNNGGTSYNQKFKG (SEQ iD NO:106), una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos REIYFYGTIYYYAMDY (SEQ ID NO:107), una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASESVDYYGNSFMY (SEQ ID NO:89), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos FASNLES (SEQ ID NO:90), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQNNEDPWT (SEQ ID NO:91). En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una proteína de armazón diseñada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera<c>D<r>1 , CDR2 y CDR3 del anticuerpo 73C4.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una proteína de armazón diseñada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 que se muestran en la tabla 8A o la tabla 8B. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una proteína de armazón diseñada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTDYYIN (SEQ ID NO:111), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos NVNPNDGGTTYNQKFKG (SEQ iD NO:112), una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos REIYFYGTIYYYAMDY (SEQ ID NO:107), una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASESVDYYGNSFMY (SEQ ID NO:89), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos FASNLES (SEQ ID NO:90), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQNNEDPWT (SEQ ID NO:91). En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una proteína de armazón diseñada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera<c>DR1 , CDR2 y CDR3 del anticuerpo 73D1 o el anticuerpo Hz73D1.v1.
En algunas realizaciones, una composición comprende un agente de unión a ILT descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, una composición comprende un agente de unión a ILT2 descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, una composición comprende un agente de unión a ILT4 descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, una composición comprende un agente de unión a ILT2/ILT4 descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, una composición comprende un anticuerpo anti-ILT2 descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, una composición comprende un anticuerpo anti-ILT2 monoclonal descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, una composición comprende un anticuerpo anti-ILT4 descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, una composición comprende un anticuerpo anti-ILT4 monoclonal descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, una composición comprende un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, una composición comprende un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 monoclonal descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, una composición comprende un anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en el anticuerpo 27F9, el anticuerpo 47C8, el anticuerpo 48A5, el anticuerpo 47H6, el anticuerpo 51A1, el anticuerpo 64A12, el anticuerpo 73C4 o el anticuerpo 73D1, o versiones humanizadas de estos; sin embargo, solo se reivindican el anticuerpo 73D1 y las versiones humanizadas del mismo.
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica comprende un agente de unión a ILT descrito en el presente documento y un portador farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica comprende un agente de unión a ILT2 descrito en el presente documento y un portador farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica comprende un agente de unión a ILT4 descrito en el presente documento y un portador farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica comprende un agente de unión a ILT2/ILT4 descrito en el presente documento y un portador farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica comprende un anticuerpo anti-ILT2 descrito en el presente documento y un portador farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, una composición comprende un anticuerpo anti-ILT2 monoclonal descrito en el presente documento y un portador farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica comprende un anticuerpo anti-ILT4 descrito en el presente documento y un portador farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, una composición comprende un anticuerpo anti-ILT4 monoclonal descrito en el presente documento y un portador farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica comprende un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 descrito en el presente documento y un portador farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, una composición comprende un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 monoclonal descrito en el presente documento y un portador farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica comprende un anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en: anticuerpo 27F9, anticuerpo 47C8, anticuerpo 48A5, anticuerpo 47H6, anticuerpo 51A1, anticuerpo 64A12, anticuerpo 73C4 o anticuerpo 73D1, o versiones humanizadas de estos y un portador farmacéuticamente aceptable. Sin embargo, solo se reivindican las composiciones farmacéuticas que comprenden el anticuerpo 73D1 y versiones humanizadas del mismo. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica comprende el anticuerpo Hz73D1.v1 y un portador farmacéuticamente aceptable.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT se aísla. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT es sustancialmente puro.
En términos generales, las interacciones antígeno-anticuerpo son no covalentes y reversibles, formadas por una combinación de enlaces de hidrógeno, interacciones hidrófobas y fuerzas electrostáticas y de van der Waals. Cuando se describe la fuerza de un complejo antígeno-anticuerpo, los términos afinidad y/o avidez se usan comúnmente. La unión de un anticuerpo a su antígeno es un proceso reversible, y la afinidad de la unión se informa normalmente como una constante de disociación en equilibrio (K<d>). La K<d>es la relación entre la tasa de disociación de un anticuerpo (kdisociación) (la rapidez con la que se disocia de su antígeno) y la tasa de asociación de anticuerpos (kasociación) (la rapidez con la que se une a su antígeno). En algunas realizaciones, los valores de Kd se determinan midiendo las tasas de kasociación y la kdisociación de una interacción anticuerpo/antígeno específica y, luego, usando una relación de estos valores para calcular el valor de KD. Los valores de KD se pueden usar para evaluar y clasificar la fuerza de las interacciones anticuerpo/antígeno individuales. Cuanto menor sea KD de un anticuerpo, mayor será la afinidad del anticuerpo por su diana. En algunas realizaciones, la afinidad se mide usando la tecnología SPR (por ejemplo, usando un sistema Biacore). La avidez da una medida de la fuerza global de un complejo anticuerpo-antígeno. Depende de tres parámetros principales: (i) afinidad del anticuerpo por la diana, (ii) la valencia tanto del anticuerpo como del antígeno, y (iii) disposición estructural de las partes que interactúan.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT se une a ILT2, ILT4 o tanto a ILT2 como a ILT4 con una constante de disociación (K<d>) de 1 pM o menos, 100 nM o menos, 40 nM o menos, 20 nM o menos, 10 nM o menos, 1 nM o menos, 0,1 nM o menos, 50 pM o menos, 10 pM o menos o 1 pM o menos. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT se une a ILT2, ILT4 o tanto a ILT2 como a ILT4 con una K<d>de aproximadamente 20 nM o menos. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT se une a ILT2, ILT4 o tanto a ILT2 como a ILT4 con una K<d>de 10 nM o menos. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT se une a ILT2, ILT4 o tanto a ILT2 como a ILT4 con una K<d>de 5 nM o menos. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT se une a ILT2, ILT4 o tanto a ILT2 como a ILT4 con una Kd de 3 nM o menos. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT se une a ILT2, ILT4 o tanto a ILT2 como a ILT4 con una Kd de 2 nM o menos. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT se une a ILT2, ILT4 o tanto a ILT2 como a ILT4 con una Kd de 1 nM o menos. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT se une a ILT2, ILT4 o tanto a ILT2 como a ILT4 con una Kd de 0,5 nM o menos. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT se une a ILT2, ILT4 o tanto a ILT2 como a ILT4 con una K<d>de 0,1 nM o menos. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT se une a ILT2, ILT4 o tanto a ILT2 como a ILT4 con una Kd de 50 pM o menos. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT se une a ILT2, ILT4 o tanto a ILT2 como a ILT4 con una Kd de 25 pM o menos. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT se une a ILT2, ILT4 o tanto a ILT2 como a ILT4 con una K<d>de 10 pM o menos. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT se une a ILT2, ILT4 o tanto a ILT2 como a ILT4 con una K<d>de 1 pM o menos. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT se une a ILT2, ILT4 o tanto a ILT2 como a ILT4 con una K<d>de 0,01 nM a 2,5 nM. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT se une a ILT2, ILT4 o tanto a ILT2 como a ILT4 con una Kd de 0,1 nM a 5 nM. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT se une a ILT2, ILT4 o tanto a ILT2 como a ILT4 con una K<d>de 1 nM a 5 nM. En algunas realizaciones, la constante de disociación del agente de unión para ILT2 y/o ILT4 es la constante de disociación determinada usando una proteína de ILT (por ejemplo, ILT2 o ILT4) inmovilizada en un chip Biacore y el agente de unión fluyó sobre el chip. En algunas realizaciones, la constante de disociación del agente de unión para ILT2 y/o ILT4 es la constante de disociación determinada usando el agente de unión capturado por un anticuerpo IgG antihumano en un chip de Biacore e ILT2 o ILT4 soluble fluyó sobre el chip.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT se une a ILT2, ILT4 o tanto a ILT2 como a ILT4 con una concentración efectiva máxima media (EC50) de 1 pM o menos, 100 nM o menos, 40 nM o menos, 20 nM o menos, 10 nM o menos, 1 nM o menos, o 0,1 nM o menos. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT se une a ILT2, ILT4 o tanto a ILT2 como a ILT4 con una concentración efectiva máxima media (EC50) de 1 pM o menos, 100 nM o menos, 40 nM o menos, 20 nM o menos, 10 nM o menos, 1 nM o menos o 0,1 nM o menos. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT se une a ILT2 deM. fascicularisoM. mulattacon una EC50 de 40 nM o menos, 20 nM o menos, 10 nM o menos, 1 nM o menos o 0,1 nM o menos. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT se une a ILT2 y/o a ILT4 con una EC50 de 0,1 nM a aproximadamente 3 nM, 0,1 nM a 2 nM, 0,1 nM a 1 nM, 0,5 nM a 3 nM, 0,5 nM a 2 nM o 0,5 nM a 1 nM.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT se une a ILT2 humano y a ILT4 humano y tiene al menos una o más de las siguientes propiedades: (i) se une a ILT2/4M. mulatta; (ii) se une a ILT2/4 deM. fascicularis; (iii) no se une a ILT3, ILT5 y LILRB5; (iv) no se une a LILRA2, LILRA4, LILRA5 y LILRA6; (v) es un antagonista de ILT2; (vi) es un antagonista de ILT4, (vii) inhibe la actividad de ILT2; (viii) inhibe la actividad de ILT4; (ix) inhibe la señalización de ILT2 en las células que expresan ILT2; (x) inhibe la señalización de ILT4 en las células que expresan ILT4; (xi) inhibe la unión de ILT2 a las moléculas del MHC I; (xii) inhibe la unión de ILT4 a las moléculas de MHC I; (xiii) inhibe la supresión de las células mieloides inducida por ILT2; (xiv) inhibe la supresión de la actividad de las células mieloides inducida por ILT4; (xv) inhibe la supresión de la actividad de las células mieloides inducida por ILT2; (xvi) inhibe la supresión de la actividad de las células mieloides inducida por ILT4; (xvii) restaura la activación del FcR en las células mieloides; (xviii) mejora la actividad de las células NK; (xix) mejora la actividad de CTL; y/o (xx) mejora la fagocitosis de los macrófagos.
Los agentes de unión a ILT (por ejemplo, agentes de unión a ILT2, agentes de unión a ILT4 o agentes de unión a ILT2/ILT4) descritos en el presente documento pueden producirse mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica. Dichos métodos van desde métodos de síntesis directa de proteínas hasta la construcción de una secuencia de ADN que codifica secuencias polipeptídicas y la expresión de esas secuencias en un hospedador adecuado. En algunas realizaciones, una secuencia de ADN se construye usando tecnología recombinante aislando o sintetizando una secuencia de ADN que codifica una proteína de referencia de interés. Opcionalmente, la secuencia se puede mutagenizar mediante mutagénesis específica del sitio para proporcionar variantes funcionales de esta. En algunas realizaciones, una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de interés se construye mediante síntesis química usando un sintetizador de oligonucleótidos. Los oligonucleótidos pueden diseñarse basándose en la secuencia de aminoácidos del polipéptido deseado y seleccionando aquellos codones que están favorecidos en la célula hospedadora en la que se producirá el polipéptido recombinante de interés. Se pueden aplicar métodos estándar para sintetizar una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido aislado de interés. Por ejemplo, se puede usar una secuencia de aminoácidos completa para construir un gen retrotraducido. Además, se puede sintetizar un oligómero de ADN que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido aislado particular. Por ejemplo, se pueden sintetizar y luego ligar varios oligonucleótidos pequeños que codifican porciones del polipéptido deseado. Los oligonucleótidos individuales contienen normalmente salientes de 5' o 3' para el ensamblaje complementario.
Una vez ensambladas (mediante síntesis, mutagénesis dirigida al sitio u otro método), las secuencias de polinucleótidos que codifican un polipéptido de interés particular pueden insertarse en un vector de expresión y enlazarse operativamente a una secuencia de control de la expresión apropiada para la expresión de la proteína en un hospedador deseado. El ensamblaje apropiado puede confirmarse mediante la secuenciación de nucleótidos, el mapeo de enzimas de restricción y/o la expresión de un polipéptido biológicamente activo en un hospedador adecuado.
En algunas realizaciones, los vectores de expresión recombinantes se usan para amplificar y expresar el ADN que codifica los agentes de unión a ILT descritos en el presente documento. Por ejemplo, los vectores de expresión recombinantes pueden ser construcciones de ADN replicables que tienen fragmentos de ADN sintéticos o derivados de cDNA que codifican una cadena polipeptídica de un agente de unión a ILT, tal como un anticuerpo anti-ILT2/ILT4, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, enlazados operativamente a elementos reguladores de la transcripción y/o traducción adecuados derivados de genes de mamíferos, microbios, virus o insectos. Una unidad transcripcional generalmente comprende un ensamblaje de (1) un elemento o elementos genéticos que tienen una función reguladora en la expresión génica, por ejemplo, promotores y/o potenciadores de la transcripción, (2) una secuencia estructural o codificante que se transcribe en ARNm y se traduce en proteína, y (3) secuencias apropiadas de inicio y terminación de la transcripción y la traducción. Los elementos reguladores pueden incluir una secuencia operadora para controlar la transcripción. Adicionalmente, se pueden incorporar la capacidad de replicarse en un hospedador, habitualmente conferida por un origen de replicación, y un gen de selección para facilitar el reconocimiento de los transformantes. Las regiones de ADN están “enlazadas operativamente” cuando están relacionadas funcionalmente entre sí. Por ejemplo, el ADN de un péptido señal (líder secretor) está enlazado operativamente al ADN de un polipéptido si se expresa como un precursor que participa en la secreción del polipéptido; un promotor está enlazado operativamente a una secuencia codificante si controla la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma está enlazado operativamente a una secuencia codificante si está posicionado a fin de permitir la traducción. En algunas realizaciones, los elementos estructurales destinados a usarse en sistemas de expresión de levaduras incluyen una secuencia líder que permite la secreción extracelular de la proteína traducida por una célula hospedadora. En algunas realizaciones, en situaciones en las que la proteína recombinante se expresa sin una secuencia líder o de transporte, un polipéptido puede incluir un residuo de metionina N-terminal. Este residuo puede escindirse de manera opcional posteriormente de la proteína recombinante expresada para proporcionar un producto final.
La elección de una secuencia de control de la expresión y un vector de expresión depende generalmente de la elección del hospedador. Se puede emplear una amplia variedad de combinaciones de hospedador / vector de expresión. Los vectores de expresión útiles para hospedadores eucariotas incluyen, por ejemplo, vectores que comprenden secuencias de control de la expresión del SV40, el virus del papiloma bovino, el adenovirus y el citomegalovirus. Los vectores de expresión útiles para hospedadores bacterianos incluyen plásmidos bacterianos conocidos, tales como los plásmidos deE. coli,incluidos pCR1, pBR322, pMB9 y sus derivados, y plásmidos de gama de hospedadores más amplia, como M13 y otros fagos filamentosos de ADN monocatenario.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT (por ejemplo,un agente de unión a ILT2, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4) de la presente divulgación se expresa a partir de uno o más vectores. En algunas realizaciones, una región variable de cadena pesada se expresa mediante un vector y una región variable de cadena ligera se expresa mediante un segundo vector. En algunas realizaciones, una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera se expresan mediante un vector. En algunas realizaciones, un vector codifica una región variable de cadena pesada de un agente de unión a ILT descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, un vector codifica una región variable de cadena ligera de un agente de unión a ILT descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, un vector codifica una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera de un agente de unión a ILT descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, un polipéptido de cadena pesada se expresa mediante un vector y un polipéptido de cadena ligera se expresa mediante un segundo vector. En algunas realizaciones, un polipéptido de cadena pesada y un polipéptido de cadena ligera se expresan mediante un vector. En algunas realizaciones, un vector codifica un polipéptido de cadena pesada de un agente de unión a ILT descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, un vector codifica un polipéptido de cadena ligera de un agente de unión a ILT descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, un vector codifica un polipéptido de cadena pesada y un polipéptido de cadena ligera de un agente de unión a ILT descrito en el presente documento.
Las células hospedadoras adecuadas para la expresión de un agente de unión a ILT (por ejemplo, agentes de unión a ILT2, agentes de unión a ILT4 o agentes de unión a ILT2/ILT4) o una proteína de ILT2 o ILT4 o fragmento de esta para su uso como antígeno o inmunógeno incluyen procariotas, células de levadura, células de insectos o células eucariotas superiores bajo el control de los promotores apropiados. Los procariotas incluyen organismos gramnegativos o grampositivos, por ejemploE. colioBacillus.Las células eucariotas superiores incluyen estirpes celulares establecidas de origen mamífero, tal como se describe en el presente documento. También se pueden emplear sistemas de traducción sin células. Vectores de clonación y vectores de expresión apropiados para su uso con hospedadores celulares bacterianos, fúngicos, de levaduras y de mamíferos, así como métodos de producción de proteínas, incluida la producción de anticuerpos, son bien conocidas en la técnica.
Se pueden usar varios sistemas de cultivo de mamíferos para expresar polipéptidos recombinantes. La expresión de proteínas recombinantes en células de mamíferos puede ser deseable porque estas proteínas en general se pliegan correctamente, se modifican apropiadamente y son biológicamente funcionales. Los ejemplos de estirpes celulares hospedadoras de mamíferos adecuadas incluyen, entre otros, COS-7 (derivado de riñón de mono), L-929 (derivado de fibroblastos murinos), C127 (derivado de tumor mamario murino), 3T3 (derivado de fibroblastos murinos), CHO (derivado de ovario de hámster chino), HeLa (derivado de cáncer de cuello uterino humano), BHK (derivado de fibroblastos de riñón de hámster), estirpes celulares HEK-293 (derivadas de riñón embrionario humano) y variantes de estas. Los vectores de expresión de mamíferos pueden comprender elementos no transcritos, tales como un origen de replicación, un promotor y un potenciador adecuados enlazados al gen que se va a expresar y otras secuencias no transcritas flanqueantes en 5' o 3', y secuencias no traducidas en 5' o 3', tales como los sitios de unión al ribosoma necesarios, un sitio de poliadenilación, sitios donantes y aceptores de empalme y secuencias de terminación de la transcripción.
La expresión de proteínas recombinantes en sistemas de cultivo de células de insectos (por ejemplo, baculovirus) también ofrece un método robusto para producir proteínas correctamente plegadas y biológicamente funcionales. Los expertos en la técnica conocen bien los sistemas de baculovirus para la producción de proteínas heterólogas en células de insectos.
Así, la presente divulgación proporciona células que comprenden los agentes de unión a ILT descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, las células producen los agentes de unión a ILT descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, las células producen un anticuerpo. En algunas realizaciones, las células producen un anticuerpo que se une a ILT2 humano. En algunas realizaciones, las células producen un anticuerpo que se une a ILT4 humano. En algunas realizaciones, las células producen un anticuerpo que se une a ILT2 e ILT4 humanos. En algunas realizaciones, las células producen un anticuerpo que se une a ILT2 humano e ILT2 deM. fascicularis.En algunas realizaciones, las células producen un anticuerpo anti-ILT2 denominado 27F9. En algunas realizaciones, las células producen un anticuerpo anti-ILT4 denominado 47C8. En algunas realizaciones, las células producen un anticuerpo anti-ILT4 denominado 48A5. En algunas realizaciones, las células producen un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 denominado 47H6. En algunas realizaciones, las células producen un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 humanizado denominado Hz47H6.v2. En algunas realizaciones, las células producen un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 denominado 51A1. En algunas realizaciones, las células producen un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 denominado 64A12. En algunas realizaciones, las células producen un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 humanizado denominado Hz64A12. En algunas realizaciones, las células producen un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 denominado 73C4. En algunas realizaciones, las células producen un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 denominado 73D1. En algunas realizaciones, las células producen un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 humanizado denominado Hz73D1.v1. En algunas realizaciones, la célula es una célula procariota. En algunas realizaciones, la célula es una célula eucariota. En algunas realizaciones, la célula es una célula de mamífero. En algunas realizaciones, la célula es una célula de hibridoma.
Las proteínas producidas por una célula hospedadora se pueden purificar de acuerdo con cualquier método adecuado. Los métodos estándar incluyen cromatografía (por ejemplo, cromatografía de columna de intercambio iónico, de afinidad y de dimensionamiento), centrifugación, solubilidad diferencial o mediante cualquier otro procedimiento estándar para la purificación de proteínas. Las etiquetas de afinidad, como la hexahistidina (His6; SEQ ID NO: 173), el dominio de unión a la maltosa, la secuencia de la cubierta de la gripe y la glutatión-S-transferasa, se pueden adherir a la proteína para permitir una fácil purificación pasándola por una columna de afinidad apropiada. Los métodos de cromatografía de afinidad usados para purificar inmunoglobulinas pueden incluir, entre otros, la cromatografía de proteína A, proteína G y proteína L. Las proteínas aisladas se pueden caracterizar físicamente usando procedimientos que incluyen, entre otros, proteólisis, cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), espectrometría de masas (MS), resonancia magnética nuclear (RMN), enfoque isoeléctrico (IEF), cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y cristalografía de rayos X (todas por sus siglas en inglés). La pureza de las proteínas aisladas se puede determinar usando procedimientos conocidos por los expertos en la técnica, incluidos, entre otros, SDS-PAGE, SEC, electroforesis en gel capilar, IEF y enfoque isoeléctrico capilar (cIEF).
En algunas realizaciones, los sobrenadantes de los sistemas de expresión que secretan proteína recombinante en los medios de cultivo se concentran primero usando un filtro de concentración de proteínas disponible en el mercado, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon® o Millipore Pellicon®. Tras la etapa de concentración, el concentrado se puede aplicar a una matriz de purificación adecuada. En algunas realizaciones, se emplea una resina de intercambio aniónico, por ejemplo, una matriz o un sustrato que tiene grupos dietilaminoetilo (DEAE) colgantes. Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos comúnmente empleados en la purificación de proteínas. En algunas realizaciones, se emplea una etapa de intercambio catiónico. Los intercambiadores catiónicos adecuados incluyen diversas matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. En algunas realizaciones, se emplea un medio de hidroxiapatita, incluyendo, entre otros, hidroxiapatita cerámica (CHT). En algunas realizaciones, se emplean una o más etapas de HPLC de fase inversa en que se emplean medios de RP-HPLC hidrófobos, por ejemplo, gel de sílice que tiene grupos colgantes metilo u otros grupos alifáticos, para purificar aún más una proteína recombinante. En algunas realizaciones, la cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) se usa para separar las proteínas recombinantes en función de su hidrofobicidad. La HIC es un procedimiento de separación útil para purificar proteínas mientras se mantiene la actividad biológica debido al uso de condiciones y matrices que operan en condiciones menos desnaturalizantes que otros procedimientos. Algunas o todas las etapas de purificación anteriores, en diversas combinaciones, pueden emplearse para proporcionar una proteína recombinante homogénea.
Los agentes de unión a ILT (por ejemplo, agentes de unión a ILT2, agentes de unión a ILT4 o agentes de unión a ILT2/ILT4) de la presente divulgación pueden analizarse para determinar sus propiedades físicas/químicas y/o actividades biológicas mediante diversos ensayos conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, se prueba la capacidad de un anticuerpo anti-ILT2 para determinar su capacidad para unirse a ILT2 (por ejemplo, ILT2 humano y/o ILT2 deM. fascicularis/M. mulatta).En algunas realizaciones, se prueba la capacidad de un anticuerpo anti-ILT4 para determinar su capacidad para unirse a ILT4 (por ejemplo, ILT4 humano). En algunas realizaciones, se prueba la capacidad de un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 para determinar su capacidad para unirse a ILT2 e ILT4 (por ejemplo, ILT2 humano, ILT4 humano e ILT2 deM. fascicularis/M. mulatta).Los ensayos de unión incluyen, entre otros, SPR (por ejemplo, Biacore), ELISA y FACS. En algunas realizaciones, se prueba la capacidad de un anticuerpo anti-ILT2 para inhibir, reducir o bloquear la unión de ILT2 a los antígenos del MHC de clase I. En algunas realizaciones, se prueba la capacidad de un anticuerpo anti-ILT4 para inhibir, reducir o bloquear la unión de ILT4 a los antígenos del MHC de clase I. En algunas realizaciones, se prueba la capacidad de un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 para inhibir, reducir o bloquear la unión de ILT2 e ILT4 a los antígenos del MHC de clase I. Es más, los anticuerpos pueden evaluarse para determinar su solubilidad, estabilidad, estabilidad térmica, viscosidad, niveles de expresión, calidad de expresión y/o eficiencia de purificación.
En algunas realizaciones, los anticuerpos monoclonales generados contra ILT2, ILT4 o ILT2 y ILT4 se agrupan en función del epítopo que reconoce cada anticuerpo individual, un proceso conocido como “agrupación de epítopos”. En general, los anticuerpos se prueban de forma combinatoria por pares y los anticuerpos que compiten entre sí se agrupan en agrupaciones. Por ejemplo, en un ensayo de agrupamientos de premezcla, se inmoviliza un primer anticuerpo sobre una superficie y se hace fluir una solución premezclada de un segundo anticuerpo y antígeno sobre el primer anticuerpo inmovilizado. En conjunto, el antígeno se inmoviliza en una superficie y los dos anticuerpos fluyen sobre el antígeno inmovilizado y compiten por unirse. Con estos procedimientos, se pueden identificar los anticuerpos que se bloquean entre sí. Se crea un perfil de bloqueo competitivo para cada anticuerpo en relación con los otros anticuerpos. Los resultados del bloqueo determinan en qué agrupación se coloca cada anticuerpo. Los métodos de agrupación de epítopos de alto rendimiento son conocidos en la técnica y permiten la selección y la caracterización de un gran número de anticuerpos en un corto período de tiempo. Los anticuerpos que se unen a epítopos similares a menudo comparten funciones y/o capacidades similares. Por el contrario, los anticuerpos que se unen a diferentes epítopos pueden tener diferentes actividades funcionales.
En algunas realizaciones, una agrupación de epítopos comprende al menos un anticuerpo del grupo que consiste en: 27F9, 47C8, 48A5, 47H6, 51A1,64A12, 73C4 y 73D1. En algunas realizaciones, una agrupación de epítopos comprende al menos los anticuerpos 27F9 y 73D1. En algunas realizaciones, una agrupación de epítopos comprende al menos los anticuerpos 27F9, 73C4 y 73D1. En algunas realizaciones, una agrupación de epítopos comprende al menos los anticuerpos 48A5 y 47H6.
El mapeo de epítopos es el proceso de identificación del sitio de unión, o epítopo, en una proteína/antígeno diana al que se une un anticuerpo (u otro agente de unión). Se conocen diversos métodos en la técnica para mapear epítopos en proteínas diana. Estos métodos incluyen (i) mutagénesis, incluidos, entre otros, la mutagénesis indiscriminada, la mutagénesis dirigida al sitio y el escaneo con alanina; (ii) escaneo de dominios o fragmentos; (iii) escaneo de péptidos (por ejemplo, tecnología Pepscan); (iv) métodos de visualización, incluyendo, entre otros, la presentación en fagos, la presentación microbiana y la presentación en ribosomas o ARNm; (v) métodos que impliquen proteólisis y espectroscopía de masas; (vi) métodos que impliquen el intercambio de amida, hidrógeno/deuterio; y (vii) determinación estructural, incluidas, entre otras, la cristalografía de rayos X y la RMN.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-ILT purificados (por ejemplo, anticuerpos anti-ILT2, anticuerpos anti-ILT4 o anticuerpos anti-ILT2/ILT4) se caracterizan mediante ensayos incluyendo, entre otros, la secuenciación N-terminal, el análisis de aminoácidos, la HPLC, la espectrometría de masas, la fluorimetría de barrido diferencial (DSF), la nanoDSF, el enfoque isoeléctrico capilar (cIEF), la cromatografía de intercambio iónico y la digestión de la papaína.
Los ensayosin vitroque caracterizan la función de las células inmunitarias incluyen, entre otros, ensayos de activación celular(porejemplo, ensayos de proliferación celular), ensayos de células T citotóxicas (CTL), ensayos de supresión de células T, ensayos de MDSC, ensayos de células NK, ensayos de reacción linfocítica mixta (MLR), ensayos de producción de citocinas/quimiocinas, ensayos de unión al FcR, ensayos de fagocitosis, y ensayos de migración celular. En algunas realizaciones, se proporcionan ensayos para identificar los anticuerpos contra ILT que afectan a la actividad de ILT. “Afectar o que afecta la actividad de ILT” puede incluir, por ejemplo, inhibir, reducir, bloquear, antagonizar, suprimir y/o interferir con la actividad de ILT2, la actividad de ILT4 o la actividad de ILT2 e ILT4. Como ILT2 y ILT4 actúan generalmente como moléculas reguladoras/inhibidoras negativas, en algunas realizaciones, la inhibición, la reducción, el bloqueo, la antagonización, la supresión y/o la interferencia con la actividad de ILT2 y/o de ILT4 da como resultado un bloqueo de la supresión de una función biológica inducida por ILT2 y/o por ILT4. Los expertos en la materia pueden referirse a esta capacidad como “liberar el freno”; por ejemplo, los anticuerpos anti-ILT descritos en el presente documento bloquean la señalización de ILT2 y/o ILT4 que, de otro modo, enviarían un mensaje supresor. Una vez que se liberan los “frenos”, el sistema inmunitario puede generar una respuesta o una respuesta más fuerte, por ejemplo, ante un tumor.
Como se describe en el presente documento, ILT2 se expresa en células mieloides, tales como monocitos, macrófagos, células dendríticas (CD) y APC, así como en células NK, células B y células T CD8+ (CTL). La actividad de ILT2 o la actividad de señalización de ILT2 incluyen, entre otros, la supresión de las células mieloides, la supresión de la actividad de las células mieloides, la supresión de las células mieloides asociadas a tumores, la supresión de las células NK y la supresión de las células T citolíticas (CTL). En algunas realizaciones, la inhibición, la reducción, el bloqueo, la antagonización, la supresión y/o la interferencia con la actividad de ILT2 da como resultado una liberación de la supresión de una señal de activación inducida por ILT2. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2 o un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 inhibe la señalización de ILT2. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2 o un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 inhibe la señalización de ILT2 revirtiendo de ese modo un efecto depresor inducido por ILT2. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2 o un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 inhibe una señal de extinción inducida por ILT2. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2 o un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 aumenta la actividad de las células mieloides. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2 o un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 aumenta la actividad de las APC. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2 o un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 aumenta la actividad de los macrófagos. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2 o un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 aumenta la fagocitosis de los macrófagos. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2 o un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 aumenta la actividad de las células NK. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2 o un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 aumenta la actividad de las CTL.
La ILT4 se expresa en células mieloides, tales como monocitos, macrófagos, células dendríticas (CD), células depresoras derivadas de mieloides (MDSC) y APC, así como en neutrófilos y eosinófilos. La actividad de ILT4 o la actividad de señalización de ILT4 incluyen, entre otros, la supresión de las células mieloides, la supresión de la actividad de las células mieloides y la supresión de las células mieloides asociadas a tumores. En algunas realizaciones, la inhibición, la reducción, el bloqueo, la antagonización, la supresión y/o la interferencia con la actividad de ILT4 da como resultado una liberación de la supresión de una señal de activación inducida por ILT4. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT4 o un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 inhibe la señalización de ILT4. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT4 o un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 inhibe la señalización de ILT4 revirtiendo de ese modo un efecto depresor inducido por ILT4. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT4 o un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 inhibe una señal de extinción inducida por ILT4. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT4 o un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 aumenta la actividad de las células mieloides. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT4 o un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 aumenta la actividad de los macrófagos. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT4 o un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 disminuye las MDSC. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT4 o un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 disminuye la supresión de las MDSC. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT4 o un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 induce un cambio de las MDSC a macrófagos activados.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2 o un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 interrumpe la vía de señalización de ILT2. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2 o un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 interrumpe la vía de señalización de ILT2 y activa las células mieloides. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2 o un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 interrumpe la vía de señalización de ILT2 y activa las APC. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2 o un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 interrumpe la vía de señalización de ILT2 y activa las células dendríticas. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2 o un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 interrumpe la vía de señalización de ILT2 y activa las células dendríticas primarias. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2 o un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 interrumpe la vía de señalización de ILT2 y aumenta la actividad de las células NK. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2 o un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 interrumpe la vía de señalización de ILT2 y aumenta la actividad de las CTL.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT4 o un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 interrumpe la vía de señalización de ILT4. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT4 o un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 interrumpe la vía de señalización de ILT4 y activa las células mieloides. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT4 o un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 interrumpe la vía de señalización de ILT4 y activa las APC. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT4 o un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 interrumpe la vía de señalización de ILT4 y activa las células dendríticas. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT4 o un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 interrumpe la vía de señalización de ILT4 y activa las células dendríticas primarias.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 interrumpe la vía de señalización de ILT2 y la vía de señalización de ILT4. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 interrumpe la vía de señalización de ILT2 y la vía de señalización de ILT4 y activa las células mieloides. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 interrumpe la vía de señalización de ILT2 y la vía de señalización de ILT4 y activa las APC. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 interrumpe la vía de señalización de ILT2 y la vía de señalización de ILT4 y activa las células dendríticas. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 interrumpe la vía de señalización de ILT2 y la vía de señalización de ILT4 y activa las células dendríticas primarias. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 interrumpe la vía de señalización de ILT2 y la vía de señalización de ILT4 y aumenta la actividad de las células mieloides. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 interrumpe la vía de señalización de ILT2 y la vía de señalización de ILT4 y aumenta la actividad de las células NK. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 interrumpe la vía de señalización de ILT2 y la vía de señalización de ILT4 y aumenta la actividad de las CTL. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 interrumpe la vía de señalización de ILT2 y la vía de señalización de ILT4 y disminuye la actividad de las MDSC.
En algunas realizaciones, los términos “inhibir”, “reducir”, “bloquear”, “antagonizar”, “suprimir” e “interferir” se refieren a los niveles y/o la actividad en ausencia de tratamiento con el agente de unión a ILT. En algunas realizaciones, los términos “inhibir”, “reducir”, “bloquear”, “antagonizar”, “suprimir” e “interferir” se refieren a los niveles y/o la actividad previos al tratamiento con el agente de unión a ILT.
En algunas realizaciones, los términos “activar”, “promover”, “aumentar” y “potenciar” se refieren a los niveles
y/o la actividad en ausencia de tratamiento con el agente de unión a ILT. En algunas realizaciones, los términos
“activar”, “promover”, “aumentar” y “potenciar” se refieren a los niveles y/o la actividad previos al tratamiento
con el agente de unión a ILT.
La presente divulgación también proporciona conjugados que comprenden un anticuerpo anti-ILT2, anti-ILT4 o
un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, el anticuerpo se
adhiere a una segunda molécula. En algunas realizaciones, el anticuerpo se conjuga con un agente o resto citotóxico. En algunas realizaciones, el anticuerpo se conjuga con un agente citotóxico para formar un ADC
(conjugado anticuerpo-fármaco). En una realización, el agente citotóxico es un agente quimioterapéutico
incluidos, entre otros, metotrexato, adriamicina/doxorrubicina, melfalán, mitomicina C, clorambucilo, duocarmicina, daunorrubicina, pirrolobenzodiacepinas (PBD) u otros agentes intercalantes. En algunas realizaciones, el agente citotóxico es un inhibidor de microtúbulos, incluyendo, entre otros, auristatinas, maitansinoides (por ejemplo, DM1 y DM4) y tubulisinas. En algunas realizaciones, el agente citotóxico es una
toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de estos, incluyendo, entre otros, la cadena A de la difteria, los fragmentos activos que no se unen de la toxina diftérica,
la cadena A de la exotoxina, la cadena A de la ricina, la cadena A de la abrina, la cadena A de la modecina, la
alfa-sarcina, las proteínas deAleurites fordii,las proteínas de la diantina, las proteínas de laPhytolaca americana(PAPI, PAPII y PAP-S), el inhibidor deMomordica charantia,la curcina, la crotina, inhibidor deSapaonaria officinalis,gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y tricotecenos. En algunas realizaciones, un anticuerpo se conjuga con una o más toxinas de moléculas pequeñas, tales como las caliqueamicinas, los maitansinoides, los tricotenos y la CC1065. Se puede usar un derivado de cualquiera de
estas toxinas siempre que el derivado conserve la actividad citotóxica de la molécula original.
Los conjugados que comprenden un anticuerpo anti-ILT (por ejemplo, un anticuerpo ILT2, un anticuerpo ILT4
o un anticuerpo ILT2/ILT4) descritos en el presente documento pueden prepararse usando cualquier método
adecuado conocido en la técnica. En algunas realizaciones, los conjugados se preparan usando una variedad
de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales, como el propionato de N-succinimidil-3-(2-piridiiditiol)
(SPDP), el iminotiolano (IT), los derivados bifuncionales de los imidoésteres (como el adipimidato de dimetilo
HCl), los ésteres activos (como el suberato de disuccinimidilo), los aldehídos (como glutaraldehído), compuestos de bis-azido (como bis(p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (como bis-(pdiazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (como 2,6-diisocianato de tolueno) y compuestos de flúor
bis-activos (como el 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno).
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT (por ejemplo, un anticuerpo anti-ILT2, un anticuerpo anti-ILT4
o un anticuerpo anti-ILT2/ILT4) descrito en el presente documento se conjuga con una sustancia o molécula detectable que permite que el anticuerpo se use para el diagnóstico y/o la detección. En algunas realizaciones,
se usa un anticuerpo anti-ILT marcado para monitorizar las células inmunitarias en un tumor o en el microambiente de un tumor. En algunas realizaciones, se usa un anticuerpo anti-ILT marcado para monitorizar
las células inmunitarias en un tumor o en el microambiente de un tumor después del tratamiento. Una sustancia detectable puede incluir, entre otros, enzimas, tales como peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina,
beta-galactosidasa y acetilcolinesterasa; grupos protésicos, tales como biotina y flavina(s); materiales fluorescentes, tales como umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína (FITC), rodamina, isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC), diclorotriazinilaminofluoresceína, cloruro de dansilo, cianina (Cy3)
y ficoeritrina; materiales bioluminiscentes, como la luciferasa; materiales radiactivos, como 212Bi, 14C, 57Co, 51Cr,
67Cu, 18F, 68Ga, 67Ga, 153Gd, 159Gd, 68Ge, 3H, 166Ho, 131I, 125I, 123I, 121I, 115In, 113In, 112In, 111In, 140La, 177Lu, 54Mn,
99Mo, 32P, 103Pd, 149Pm, 142Pr, 186Re, 188Re, 105Rh, 97Ru, 35S, 47Sc, 75Se, 153Sm, 113Sn, 117Sn, 8 133Xe, 90Y, 69Yb, 175Yb, 65Zn; metales emisores de positrones; e iones metálicos magnéticos.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT (por ejemplo, un anticuerpo anti-ILT2, un anticuerpo anti-ILT4
o un anticuerpo anti-ILT2/ILT4) descrito en el presente documento se usa en un inmunoensayo. Los expertos
en la materia conocen los inmunoensayos e incluyen, entre otros, ELISA, SPR (por ejemplo, Biacore),FACS e inmunohistoquímica (IHC). En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ILT descrito en el presente documento
se usa en una muestra de tejido o una muestra de tumor.
Un anticuerpo anti-ILT (por ejemplo, un anticuerpo anti-ILT2, un anticuerpo anti-ILT4 o un anticuerpo
anti-ILT2/ILT4) descrito en el presente documento también puede conjugarse con un segundo anticuerpo para
formar un anticuerpo heteroconjugado.
Un anticuerpo anti-ILT (por ejemplo, un anticuerpo anti-ILT2, un anticuerpo anti-ILT4 o un anticuerpo
anti-ILT2/ILT4) como se describe en el presente documento puede adherirse a un soporte sólido. Dichos
soportes sólidos incluyen, entre otros, vidrio, celulosa, poliacrilamida, nailon, poliestireno, poli(cloruro de vinilo)
o polipropileno. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-ILT inmovilizados se usan en inmunoensayos.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-ILT inmovilizados se usan en la purificación del antígeno diana.
III. Polinucleótidos
En algunas realizaciones, la divulgación abarca polinucleótidos que comprenden polinucleótidos que codifican un polipéptido (por ejemplo, un agente de unión a ILT) descrito en el presente documento. El término “polinucleótidos que codifican un polipéptido” abarca un polinucleótido que incluye solo secuencias codificantes para el polipéptido, así como un polinucleótido que incluye secuencias codificantes y/o no codificantes adicionales. Los polinucleótidos de la divulgación pueden estar en forma de ARN o en forma de ADN. El ADN incluye el ADNc, el ADN genómico y el ADN sintético; y puede ser bicatenario o monocatenario, y si es monocatenario puede ser la cadena codificante o la cadena no codificante (antisentido).
En algunas realizaciones, un polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica una región variable de cadena pesada y/o una región variable de cadena ligera de un agente de unión a ILT2 descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, un polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica una región variable de cadena pesada de un agente de unión a ILT2 descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, un polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica una región variable de cadena ligera de un agente de unión a ILT2 descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, un polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica una región variable de cadena pesada de un agente de unión a ILT2 descrito en el presente documento y un polinucleótido que codifica una región variable de cadena ligera del agente de unión a ILT2. En algunas realizaciones, un polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica una región variable de cadena pesada y/o una región variable de cadena ligera de un agente de unión a ILT4 descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, un polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica una región variable de cadena ligera de un agente de unión a ILT4 descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, un polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica una región variable de cadena pesada de un agente de unión a ILT4 descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, un polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica una región variable de cadena pesada de un agente de unión a ILT4 descrito en el presente documento y un polinucleótido que codifica una región variable de cadena ligera del agente de unión a ILT4. En algunas realizaciones, un polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica una región variable de cadena pesada y/o una región variable de cadena ligera de un agente de unión a ILT2/ILT4 descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, un polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica una región variable de cadena pesada de un agente de unión a ILT2/ILT4 descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, un polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica una región variable de cadena ligera de un agente de unión a ILT2/ILT4 descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, un polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica una región variable de cadena pesada de un agente de unión a ILT2/ILT4 descrito en el presente documento y un polinucleótido que codifica una región variable de cadena ligera del agente de unión a ILT2/ILT4.
En algunas realizaciones, un polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica una cadena pesada y/o una cadena ligera de un agente de unión a ILT2 descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, un polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica una cadena pesada de un agente de unión a ILT2 descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, un polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica una cadena ligera de un agente de unión a ILT2 descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, un polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica una cadena pesada de un agente de unión a ILT2 descrito en el presente documento y un polinucleótido que codifica una cadena ligera del agente de unión a ILT2. En algunas realizaciones, un polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica una cadena pesada y/o una cadena ligera de un agente de unión a ILT4 descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, un polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica una cadena pesada de un agente de unión a ILT4 descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, un polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica una cadena ligera de un agente de unión a ILT4 descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, un polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica una cadena pesada de un agente de unión a ILT4 descrito en el presente documento y un polinucleótido que codifica una cadena ligera del agente de unión a ILT4. En algunas realizaciones, un polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica una cadena pesada y/o una cadena ligera de un agente de unión a ILT2/ILT4 descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, un polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica una cadena pesada de un agente de unión a ILT2/ILT4 descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, un polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica una cadena ligera de un agente de unión a ILT2/ILT4 descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, un polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica una cadena pesada de un agente de unión a ILT2/ILT4 descrito en el presente documento y un polinucleótido que codifica una cadena ligera del agente de unión a ILT2/ILT4.
Un polinucleótido de la invención comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 142-145. Polinucleótidos que codifican un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: las SEQ ID NO: 125-141 no se reivindican y se incluyen únicamente con fines de referencia. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: las SEQ ID NO: 125-145. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 125. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 126. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 127. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 128. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 129. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 130. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 131. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 132. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 133. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 134. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 135. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 136. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 137. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 138. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 139. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 140. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 141. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 142. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 143. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 144. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 145.
Un polinucleótido de la invención comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 154-157. Polinucleótidos que codifican un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO 146-153 no se reivindican y se incluyen únicamente con fines de referencia. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: las SEQ ID NO: 146-157. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 146. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 147. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 148. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 149. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 150. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 151. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 152. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 153. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 154. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 155. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 156. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 157.
En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende más de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 125-145. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica (i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 125 y (ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 126. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica (i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 127 y (ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 128. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica (i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 129 y (ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 130. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica (i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 131 y (ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 132. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica (i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 133 y (ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 134. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica (i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 135 y (ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 136. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica (i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 137 y (ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 138. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica (i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 139 y (ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 140. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica (i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 141 y (ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 142. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica (i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 143 y (ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 142. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica (i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 144 y (i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 145.
En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende más de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 146-157. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica (i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 146 y (ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 147. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica (i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 148 y (ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 149. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica (i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 150 y (ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 151. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica (i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 152 y (ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 153. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica (i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 154 y (ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 155. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica (i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 156 y (ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 157.
La presente divulgación también proporciona variantes de los polinucleótidos descritos en el presente documento, en donde una variante codifica, por ejemplo, un fragmento, un análogo y/o un derivado de un polipéptido. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un polinucleótido que comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos al menos un 80 % idéntica, al menos un 85 % idéntica, al menos un 90 % idéntica, al menos un 95 % idéntica y, en algunas realizaciones, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % idéntica a un polinucleótido que codifica un polipéptido descrito en el presente documento.
En algunas realizaciones, un polinucleótido comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos al menos un 80 % idéntica, al menos un 85 % idéntica, al menos un 90 % idéntica, al menos un 95 % idéntica y, en algunas realizaciones, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % idéntica a un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 125-157. También se proporciona un polinucleótido que comprende un polinucleótido que se hibrida con un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ I<d>NO: 125-157. En algunas realizaciones, la hibridación se realiza en condiciones de alta rigurosidad, como saben los expertos en la materia.
Como se usa en el presente documento, la expresión “un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 95 % de identidad con una secuencia de polinucleótidos” quiere decir que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido es idéntica a la secuencia de referencia, excepto que la secuencia de polinucleótidos puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que tenga una secuencia de nucleótidos idéntica al menos en un 95 % a una secuencia de nucleótidos de referencia, hasta el 5 % de los nucleótidos de la secuencia de referencia se pueden suprimir o sustituir por otro nucleótido, o se pueden insertar una serie de nucleótidos de hasta el 5 % del total de nucleótidos de la secuencia de referencia en la secuencia de referencia. Los expertos en la materia entenderán que se hará un cálculo apropiado para otras afirmaciones de “porcentaje idéntico”, por ejemplo, idénticas en un 90 % o idénticas en un 85 %. Las mutaciones de la secuencia de referencia pueden aparecer en las posiciones terminales 5' o 3' de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los nucleótidos de la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.
Las variantes de polinucleótidos pueden contener alteraciones en las regiones codificantes, las regiones no codificantes o ambas. En algunas realizaciones, una variante de polinucleótido contiene alteraciones que producen sustituciones, adiciones o supresiones silenciosas, pero no altera las propiedades o actividades del polipéptido codificado. En algunas realizaciones, una variante de polinucleótido comprende sustituciones silenciosas que no producen ningún cambio en la secuencia de aminoácidos del polipéptido (debido a la degeneración del código genético). En algunas realizaciones, una variante de polinucleótido comprende uno o más codones mutados que comprenden una o más sustituciones (por ejemplo, 1, 2 o 3) en el codón que cambian el aminoácido codificado por ese codón. Los métodos para introducir una o más sustituciones en un codón son conocidos en la materia, incluyendo, entre otros, la mutagénesis por PCR y la mutagénesis dirigida al sitio. Las variantes de polinucleótidos se pueden producir por una variedad de razones, por ejemplo, para optimizar la expresión de codones para un hospedador particular (por ejemplo, cambiar los codones del ARNm humano por los preferidos por un hospedador bacteriano comoE. coli).En algunas realizaciones, una variante de polinucleótido comprende al menos una mutación silenciosa en una región codificante o no codificante de la secuencia.
En algunas realizaciones, se produce una variante de polinucleótido para modular o alterar la expresión (o los niveles de expresión) del polipéptido codificado. En algunas realizaciones, se produce una variante de polinucleótido para aumentar la expresión del polipéptido codificado. En algunas realizaciones, se produce una variante de polinucleótido para disminuir la expresión del polipéptido codificado. En algunas realizaciones, una variante de polinucleótido tiene una expresión aumentada del polipéptido codificado en comparación con una secuencia de polinucleótidos original. En algunas realizaciones, una variante de polinucleótido tiene una expresión disminuida del polipéptido codificado en comparación con una secuencia de polinucleótidos originales.
En algunas realizaciones, un polinucleótido comprende la secuencia codificante de un polipéptido fusionado en el mismo marco de lectura con un polinucleótido que ayuda a la expresión y secreción de un polipéptido de una célula hospedadora. En algunas realizaciones, el polinucleótido que ayuda a la expresión y la secreción es una secuencia líder que funciona como una secuencia secretora para controlar el transporte de un polipéptido. En algunas realizaciones, el polipéptido tiene una secuencia líder escindida por la célula hospedadora para formar una forma “madura” del polipéptido.
En algunas realizaciones, un polinucleótido comprende la secuencia codificante de un polipéptido fusionado en el mismo marco de lectura con una secuencia marcadora o etiqueta. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una secuencia marcadora es una etiqueta de hexahistidina (etiqueta His; SEQ ID NO: 173) que permite la purificación eficiente del polipéptido fusionado con el marcador. En algunas realizaciones, una secuencia marcadora es una etiqueta de hemaglutinina (HA) derivada de la proteína hemaglutinina de la gripe cuando se usa un hospedador mamífero. En algunas realizaciones, la secuencia marcadora es una etiqueta FLAG™. En algunas realizaciones, se puede usar un marcador junto con otros marcadores o etiquetas.
En algunas realizaciones, se aísla un polinucleótido. En algunas realizaciones, un polinucleótido es sustancialmente puro.
También se proporcionan vectores y células que comprenden todos y cada uno de los polinucleótidos descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, un vector comprende una molécula de polinucleótido que codifica un agente de unión a ILT (por ejemplo, un agente de unión a ILT2, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4) descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, un vector comprende una molécula de polinucleótido que codifica un polipéptido que forma parte de un agente de unión a ILT descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, una célula comprende un vector que comprende una molécula de polinucleótido que codifica un agente de unión a ILT descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, una célula comprende un vector que comprende una molécula de polinucleótido que codifica un polipéptido que forma parte de un agente de unión a ILT descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, una célula comprende una molécula de polinucleótido que codifica un agente de unión a ILT descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, una célula comprende uno o más polinucleótidos que codifican un agente de unión a ILT descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, una célula comprende un único polinucleótido que codifica un agente de unión a ILT descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, una célula comprende un primer polinucleótido que codifica una región variable de cadena pesada de un agente de unión a ILT descrito en el presente documento y un segundo polinucleótido que codifica una región variable de cadena ligera de un agente de unión a ILT descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, una célula comprende un polinucleótido que codifica una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera de un agente de unión a ILT descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, una célula comprende un primer polinucleótido que codifica una cadena pesada de un agente de unión a ILT descrito en el presente documento y un segundo polinucleótido que codifica una cadena ligera de un agente de unión a ILT descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, una célula comprende un polinucleótido que codifica una cadena pesada y una cadena ligera de un agente de unión a ILT descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, una célula comprende uno o más vectores que codifican un agente de unión a ILT descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, una célula comprende un vector que codifica un agente de unión a ILT descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, una célula comprende un primer vector que codifica una región variable de cadena pesada de un agente de unión a ILT descrito en el presente documento y un segundo vector que codifica una región variable de cadena ligera de un agente de unión a ILT descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, una célula comprende un único vector que codifica una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera de un agente de unión a ILT descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, una célula comprende un primer vector que codifica una cadena pesada de un agente de unión a ILT descrito en el presente documento y un segundo vector que codifica una cadena ligera de un agente de unión a ILT descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, una célula comprende un único vector que codifica una cadena pesada y una cadena ligera de un agente de unión a ILT descrito en el presente documento.
IV. Métodos de preparación de agentes aglutinantes
En la divulgación se proporcionan métodos para preparar los agentes de unión a ILT (por ejemplo, agentes de unión a ILT2, agentes de unión a ILT4 o agentes de unión a ILT2/ILT4) descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, un método comprende proporcionar una célula que comprenda uno o más polinucleótidos que codifiquen una cadena pesada y/o una cadena ligera de un agente de unión a ILT descrito en el presente documento, cultivar la célula en condiciones que permitan la expresión del agente de unión y aislar el agente de unión. En algunas realizaciones, el método comprende además purificar el agente de unión. En algunas realizaciones, un método comprende además formular el agente de unión como una composición farmacéutica.
En algunas realizaciones, una célula comprende uno o más polinucleótidos que codifican la cadena pesada y la cadena ligera de un agente de unión a ILT descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, una célula comprende un primer polinucleótido que codifica la cadena pesada de un agente de unión a ILT y un segundo polinucleótido que codifica la cadena ligera de un agente de unión a ILT. En otras realizaciones, una célula comprende un polinucleótido que codifica la cadena pesada y la cadena ligera de un agente de unión a ILT descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, un polinucleótido que codifica un agente de unión a ILT descrito en el presente documento se transfecta transitoriamente en una célula. En algunas realizaciones, un polinucleótido que codifica un agente de unión a ILT descrito en el presente documento se transfecta transitoriamente en una célula.
En algunas realizaciones, una célula comprende uno o más vectores que codifican la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera de un agente de unión a ILT descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, una célula comprende un primer vector que codifica la región variable de cadena pesada de un agente de unión a ILT y un segundo vector que codifica la región variable de cadena ligera de un agente de unión a ILT. En otras realizaciones, una célula comprende un vector que codifica la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera de un agente de unión a ILT. En algunas realizaciones, una célula comprende uno o más vectores que codifican la cadena pesada y la cadena ligera de un agente de unión a ILT descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, una célula comprende un primer vector que codifica la cadena pesada de un agente de unión a ILT y un segundo vector que codifica la cadena ligera de un agente de unión a ILT. En otras realizaciones, una célula comprende un vector que codifica la cadena pesada y la cadena ligera de un agente de unión a ILT descrito en el presente documento.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT (por ejemplo, un agente de unión a ILT2, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4) es un fragmento de anticuerpo que comprende al menos un sitio de unión al antígeno y el método implica proporcionar una célula que comprende un polinucleótido que codifica el fragmento del anticuerpo anti-ILT, incubar la célula en condiciones que permitan la expresión del fragmento de anticuerpo y aislar el fragmento de anticuerpo. En algunas realizaciones, la célula comprende un polinucleótido que codifica un fragmento de anticuerpo descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, la célula comprende un vector que codifica un fragmento de anticuerpo descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, el método comprende purificar el fragmento de anticuerpo. En algunas realizaciones, el fragmento de anticuerpo es un Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, (scFv)2, un anticuerpo monocatenario, un anticuerpo de doble región variable, un diacuerpo o un nanocuerpo.
En algunas realizaciones, el agente de unión a ILT es un scFv y el método implica proporcionar una célula que comprende el scFv, incubar la célula en condiciones que permitan la expresión del scFv y aislar el scFv. En algunas realizaciones, la célula comprende un vector descrito en el presente documento que codifica el scFv.
En algunas realizaciones, la célula comprende un polinucleótido descrito en el presente documento que codifica el scFv. En algunas realizaciones, el método comprende purificar el scFv.
En algunas realizaciones, la célula usada para preparar un agente de unión a ILT es una célula bacteriana. En algunas realizaciones, la célula usada para preparar un agente de unión a ILT es una célula de levadura. En algunas realizaciones, la célula usada para preparar un agente de unión a ILT es una célula de mamífero. En algunas realizaciones, la célula usada para preparar un agente de unión a ILT es una célula CHO. En otras realizaciones, la célula usada para preparar un agente de unión a ILT es una célula HEK-293.
V. Métodos de uso y composiciones farmacéuticas
Los agentes de unión a ILT (por ejemplo, agentes de unión a ILT2, agentes de unión a ILT4 o agentes de unión a ILT2/ILT4) de la divulgación son útiles en una variedad de aplicaciones, incluyendo, entre otros, métodos de tratamiento terapéutico, tales como el tratamiento del cáncer. En algunas realizaciones, los métodos de tratamiento terapéutico comprenden la inmunoterapia para el cáncer. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT descrito en el presente documento es útil para activar, promover, aumentar y/o potenciar una respuesta inmunitaria contra el cáncer o las células cancerosas. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT descrito en el presente documento es útil para activar, promover, aumentar y/o potenciar una respuesta inmunitaria contra un tumor o las células tumorales. Los métodos de uso pueden ser métodosin vitro, ex vivooin vivo.
La presente divulgación proporciona métodos para interrumpir, inhibir o bloquear la unión de ILT2 a una o más moléculas del MHC I. En algunas realizaciones, un método para interrumpir, inhibir o bloquear la unión de ILT2 a una o más moléculas del MHC I comprende poner en contacto las células con un agente de unión a ILT2 descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, un método para interrumpir, inhibir o bloquear la unión de ILT2 a una o más moléculas del MHC I comprende poner en contacto las células con un agente de unión a ILT2 descrito en el presente documento, en donde el método da como resultado interrumpir, inhibir o bloquear la actividad de ILT2 inducida por el MHC I. En algunas realizaciones, un método para interrumpir, inhibir o bloquear la unión de ILT2 a una o más moléculas del MHC I comprende poner en contacto las células con un agente de unión a ILT2 descrito en el presente documento, en donde el método da como resultado interrumpir, inhibir o bloquear la supresión de las células mieloides inducida por ILT2. En algunas realizaciones, un método para interrumpir, inhibir o bloquear la unión de ILT2 a una o más moléculas del MHC I comprende poner en contacto las células con un agente de unión a ILT2 descrito en el presente documento, en donde el método da como resultado interrumpir, inhibir o bloquear la supresión de las células mieloides inducida por ILT2. En algunas realizaciones, un método para interrumpir, inhibir o bloquear la unión de ILT2 a una o más moléculas del MHC I restaura la actividad de señalización del FcR en las células mieloides. En algunas realizaciones, la célula mieloide es un monocito. En algunas realizaciones, la célula mieloide es un macrófago. En algunas realizaciones, la célula mieloide es una célula dendrítica. En algunas realizaciones, la célula mieloide es una APC. En algunas realizaciones, un método para interrumpir, inhibir o bloquear la unión de ILT2 a una o más moléculas del MHC I comprende poner en contacto las células con un agente de unión a ILT2 descrito en el presente documento, en donde el método da como resultado un aumento de la actividad de las células NK. En algunas realizaciones, un método para interrumpir, inhibir o bloquear la unión de ILT2 a una o más moléculas del MHC I comprende poner en contacto las células con un agente de unión a ILT2 descrito en el presente documento, en donde el método da como resultado un aumento de la actividad de las CTL. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, la molécula del MHC I es una molécula del MHC I clásica. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, la molécula del MHC I es una molécula del MHC I no clásica. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, la molécula del MHC I es HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E y/o HLA-G.
En la presente divulgación se proporcionan métodos para interrumpir, inhibir o bloquear la unión de ILT4 a una 0 más moléculas del MHC I. En algunas realizaciones, un método para interrumpir, inhibir o bloquear la unión de ILT4 a una o más moléculas del MHC I comprende poner en contacto las células con un agente de unión a ILT4 descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, un método para interrumpir, inhibir o bloquear la unión de ILT4 a una o más moléculas del MHC I comprende poner en contacto las células con un agente de unión a ILT4 descrito en el presente documento, en donde el método da como resultado interrumpir, inhibir o bloquear la actividad de ILT4 inducida por el MHC I. En algunas realizaciones, un método para interrumpir, inhibir o bloquear la unión de ILT4 a una o más moléculas del MHC I comprende poner en contacto las células con un agente de unión a ILT4 descrito en el presente documento, en donde el método da como resultado interrumpir, inhibir o bloquear la supresión de las células mieloides inducida por ILT4. En algunas realizaciones, un método para interrumpir, inhibir o bloquear la unión de ILT2 a una o más moléculas del MHC 1 comprende poner en contacto las células con un agente de unión a ILT4 descrito en el presente documento, en donde el método da como resultado interrumpir, inhibir o bloquear la supresión de la actividad de las células mieloides inducida por ILT4. En algunas realizaciones, un método para interrumpir, inhibir o bloquear la unión de ILT4 a una o más moléculas del MHC I restaura la actividad de señalización del FcR en las células mieloides. En algunas realizaciones, la célula mieloide es un monocito. En algunas realizaciones, la célula mieloide es un macrófago. En algunas realizaciones, la célula mieloide es una célula dendrítica. En algunas realizaciones, la célula mieloide es una APC. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, la molécula del MHC I es una molécula del MHC I clásica. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, la molécula del MHC I es una molécula del MHC I no clásica. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, la molécula del MHC I es HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E y/o HLA-G.
En la presente divulgación se proporcionan métodos para interrumpir, inhibir o bloquear la unión de ILT2 e ILT4 a una o más moléculas del MHC I. En algunas realizaciones, un método para interrumpir, inhibir o bloquear la unión de ILT2 e ILT4 a una o más moléculas del MHC I comprende poner en contacto las células con un agente de unión a ILT2/ILT4 descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, un método para interrumpir, inhibir o bloquear la unión de ILT2 e ILT4 a una o más moléculas del MHC I comprende poner en contacto las células con un agente de unión a ILT2/ILT4 descrito en el presente documento, en donde el método da como resultado interrumpir, inhibir o bloquear la actividad de ILT2 e ILT4 inducida por el MHC I. En algunas realizaciones, un método para interrumpir, inhibir o bloquear la unión de ILT2 e ILT4 a una o más moléculas del MHC I comprende poner en contacto las células con un agente de unión a ILT2/ILT4 descrito en el presente documento, en donde el método da como resultado interrumpir, inhibir o bloquear la supresión de las células mieloides inducida por ILT2 y/o ILT4. En algunas realizaciones, un método para interrumpir, inhibir o bloquear la unión de ILT2 e ILT4 a una o más moléculas del MHC I comprende poner en contacto las células con un agente de unión a ILT2/ILT4 descrito en el presente documento, en donde el método da como resultado interrumpir, inhibir o bloquear la supresión de la actividad de las células mieloides inducida por ILT2 y/o ILT4. En algunas realizaciones, un método para interrumpir, inhibir o bloquear la unión de ILT2 y ILT4 a una o más moléculas del MHC I restaura la actividad de señalización del FcR en las células mieloides. En algunas realizaciones, la célula mieloide es un monocito. En algunas realizaciones, la célula mieloide es un macrófago. En algunas realizaciones, la célula mieloide es una célula dendrítica. En algunas realizaciones, la célula mieloide es una APC. En algunas realizaciones, un método para interrumpir, inhibir o bloquear la unión de ILT2 e ILT4 a una o más moléculas del MHC I comprende poner en contacto las células con un agente de unión a ILT2/ILT4 descrito en el presente documento, en donde el método da como resultado un aumento de la actividad de las células NK. En algunas realizaciones, un método para interrumpir, inhibir o bloquear la unión de ILT2 e ILT4 a una o más moléculas del MHC I comprende poner en contacto las células con un agente de unión a ILT2/ILT4 descrito en el presente documento, en donde el método da como resultado un aumento de la actividad de las CTL.
En la presente divulgación se proporcionan métodos para interrumpir, inhibir o bloquear la unión de ILT2 y/o ILT4 a las moléculas del MHC I en un sujeto. En algunas realizaciones, un método para interrumpir, inhibir o bloquear la unión de ILT2 y/o ILT4 a las moléculas del MHC I en un sujeto comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un agente de unión a ILT2/ILT4 descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, un método para interrumpir, inhibir o bloquear la actividad de ILT2 y/o ILT4 inducida por la MHC I en un sujeto comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un agente de unión a ILT2/ILT4 descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, un método para interrumpir, inhibir o bloquear la supresión de las células mieloides inducida por ILT2 y/o ILT4 en un sujeto comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un agente de unión a ILT2/ILT4 descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, un método para interrumpir, inhibir o bloquear la supresión de la actividad de las células mieloides inducida por ILT2 y/o ILT4 en un sujeto comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un agente de unión a ILT2/ILT4 descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, un método para interrumpir, inhibir o bloquear la supresión de la actividad celular presentadora de antígenos inducida por ILT2 y/o ILT4 en un sujeto restaura la actividad del FcR en las células mieloides. En algunas realizaciones, la célula mieloide es un monocito. En algunas realizaciones, la célula mieloide es un macrófago. En algunas realizaciones, la célula mieloide es una célula dendrítica. En algunas realizaciones, la célula mieloide es una APC.
En la presente divulgación se proporcionan métodos para activar una respuesta inmunitaria en un sujeto usando un agente de unión a ILT2/ILT4 descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, en la divulgación se proporcionan métodos para promover una respuesta inmunitaria en un sujeto usando un agente de unión a ILT2/ILT4 descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, en la divulgación se proporcionan métodos para aumentar una respuesta inmunitaria en un sujeto usando un agente de unión a ILT2/ILT4 descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, en la divulgación se proporcionan métodos para potenciar una respuesta inmunitaria en un sujeto usando un agente de unión a ILT2/ILT4 descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, la activación, la promoción, el aumento y/o la mejora de una respuesta inmunitaria comprende estimular las células mieloides. En algunas realizaciones, la activación, la promoción, el aumento y/o la mejora de una respuesta inmunitaria comprende estimular monocitos. En algunas realizaciones, la activación, la promoción, el aumento y/o la mejora de una respuesta inmunitaria comprende estimular macrófagos. En algunas realizaciones, la activación, la promoción, el aumento y/o la mejora de una respuesta inmunitaria comprende estimular las células dendríticas. En algunas realizaciones, la activación, la promoción, el aumento y/o la mejora de una respuesta inmunitaria comprende estimular las APC. En algunas realizaciones, la activación, la promoción, el aumento y/o la mejora de una respuesta inmunitaria comprenden aumentar la inmunidad mediada por células. En algunas realizaciones, la activación, la promoción, el aumento y/o la mejora de una respuesta inmunitaria comprenden aumentar la actividad de las células T efectoras. En algunas realizaciones, la activación, la promoción, el aumento y/o la mejora de una respuesta inmunitaria comprenden aumentar la actividad de las CTL. En algunas realizaciones, la activación, la promoción, el aumento y/o la mejora de una respuesta inmunitaria comprenden aumentar la actividad de las células NK. En algunas realizaciones, la activación, la promoción, el aumento y/o la mejora de una respuesta inmunitaria comprenden aumentar la actividad de las células NK. En algunas realizaciones, la activación, la promoción, el aumento y/o la mejora de una respuesta inmunitaria comprende inhibir o disminuir la actividad depresora de las Treg. En algunas realizaciones, la activación, la promoción, el aumento y/o la mejora de una respuesta inmunitaria comprende inhibir o disminuir la actividad depresora de las MDSC. En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria es el resultado de la estimulación antigénica. En algunas realizaciones, la estimulación antigénica es una célula tumoral. En algunas realizaciones, la estimulación antigénica es cáncer.
La invención se refiere a anticuerpos y fragmentos funcionales de estos tal como se definen en las reivindicaciones, que incluyen el anticuerpo 73D1 y el anticuerpo Hz73D1, así como su uso en diversos métodos. Los pasajes relacionados con el anticuerpo 27F9, el anticuerpo 47H6, el anticuerpo 51A1, el anticuerpo 64A12 y el anticuerpo 73C4 o su versión humanizada y su uso en varios métodos se incluyen únicamente con fines de referencia. Los métodos de tratamiento o prevención divulgados en el presente documento deben interpretarse en el sentido de que se refieren a un agente de unión o anticuerpo divulgado en el presente documento para su uso en ese método de tratamiento o prevención.
La divulgación también proporciona métodos para interrumpir y/o inhibir la señalización de ILT2 y/o ILT4 en una célula, que comprenden poner en contacto la célula con una cantidad eficaz de un agente de unión a ILT2, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4 descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, el método para interrumpir y/o inhibir la señalización de ILT2 en una célula comprende poner en contacto la célula con una cantidad eficaz del anticuerpo 27F9, el anticuerpo 47H6, el anticuerpo 51A1, el anticuerpo 64A12, el anticuerpo 73C4 o el anticuerpo 73D1, o una versión humanizada de estos. En algunas realizaciones, el método para interrumpir y/o inhibir la señalización de ILT4 en una célula comprende poner en contacto la célula con una cantidad eficaz del anticuerpo 47C8, el anticuerpo 48A5, el anticuerpo 47H6, el anticuerpo 51A1, el anticuerpo 64A12, el anticuerpo 73C4 o el anticuerpo 73D1, o una versión humanizada de estos. En algunas realizaciones, el método para interrumpir y/o inhibir la señalización de ILT2 e ILT4 en una célula comprende poner en contacto la célula con una cantidad eficaz del anticuerpo 47H6, el anticuerpo 51A1, el anticuerpo 64A12, el anticuerpo 73C4 o el anticuerpo 73D1, o una versión humanizada de estos. En algunas realizaciones, el método para interrumpir y/o inhibir la señalización de ILT2 y de ILT4 en una célula comprende poner en contacto la célula con una cantidad eficaz del anticuerpo Hz47H6.v2. En algunas realizaciones, el método para interrumpir y/o inhibir la señalización de ILT2 y de ILT4 en una célula comprende poner en contacto la célula con una cantidad eficaz del anticuerpo Hz64A12. En algunas realizaciones, el método para interrumpir y/o inhibir la señalización de ILT2 y de ILT4 en una célula comprende poner en contacto la célula con una cantidad eficaz del anticuerpo Hz73D1.v1. En algunas realizaciones, en la divulgación se proporciona el uso de un agente de unión a ILT2 descrito en el presente documento en la fabricación o preparación de un medicamento para interrumpir y/o inhibir la señalización de ILT2 en una célula. En algunas realizaciones, en la divulgación se proporciona el uso de un agente de unión a ILT4 descrito en el presente documento en la fabricación o preparación de un medicamento para interrumpir y/o inhibir la señalización de ILT4 en una célula. En algunas realizaciones, en la divulgación se proporciona el uso de un agente de unión a ILT2/ILT4 descrito en el presente documento en la fabricación o preparación de un medicamento para interrumpir y/o inhibir la señalización de ILT2 y de ILT4 en una célula. En algunas realizaciones, la célula es una célula mieloide. En algunas realizaciones, la célula es un monocito. En algunas realizaciones, la célula es un macrófago. En algunas realizaciones, la célula es una célula dendrítica. En algunas realizaciones, la célula es una célula presentadora de antígenos. En algunas realizaciones, las células son células NK. En algunas realizaciones, la célula es una CTL. En algunas realizaciones, el método es un métodoin vivo,en donde la etapa de poner en contacto la célula con el agente comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de unión a ILT a un sujeto. En algunas realizaciones, el método es un métodoin vitrooex vivo.
En la presente divulgación también se proporcionan métodos para inhibir el crecimiento de un tumor usando un agente de unión a ILT2, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4 descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, el método para inhibir el crecimiento de un tumor comprende usar un agente de unión a ILT2 descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, el método para inhibir el crecimiento de un tumor comprende usar el anticuerpo 27F9 o una versión humanizada del mismo. En algunas realizaciones, el método para inhibir el crecimiento de un tumor comprende usar un agente de unión a ILT4 descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, el método para inhibir el crecimiento de un tumor comprende usar el anticuerpo 47C8 o el anticuerpo 48A5 o una versión humanizada de estos. En algunas realizaciones, el método para inhibir el crecimiento de un tumor comprende usar un agente de unión a ILT2/ILT4 descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, el método para inhibir el crecimiento de un tumor comprende usar el anticuerpo 47H6, el anticuerpo 51A1, el anticuerpo 64A12, el anticuerpo 73C4 o el anticuerpo 73D1, o versiones humanizadas de estos. En algunas realizaciones, el método para inhibir el crecimiento de un tumor comprende usar el anticuerpo Hz47H6.v2. En algunas realizaciones, el método para inhibir el crecimiento de un tumor comprende usar el anticuerpo Hz64A12. En algunas realizaciones, el método para inhibir el crecimiento de un tumor comprende usar el anticuerpo Hz73D1.v1. En algunas realizaciones, el método para inhibir el crecimiento de un tumor comprende poner en contacto una mezcla de células con un agente de unión a ILTin vitro.Por ejemplo, una estirpe celular inmortalizada o una estirpe celular cancerosa mezclada con células inmunitarias (por ejemplo, una célula mieloide) se cultiva en un medio al que se añade un agente de prueba que se une a ILT2 y/o a ILT4. En algunas realizaciones, las células tumorales se aíslan de una muestra de un paciente, tal como, por ejemplo, una biopsia de tejido, un derrame pleural o una muestra de sangre, se mezclan con células inmunitarias (por ejemplo, células mieloides) y se cultivan en un medio al que se añade un agente de prueba que se une a ILT2 y/o a ILT4. En algunas realizaciones, en la divulgación se proporciona el uso de un agente de unión a ILT2 descrito en el presente documento en la fabricación o preparación de un medicamento para inhibir el crecimiento de un tumor o una célula tumoral. En algunas realizaciones, en la divulgación se proporciona el uso de un agente de unión a ILT4 descrito en el presente documento en la fabricación o preparación de un medicamento para inhibir el crecimiento de un tumor o una célula tumoral. En algunas realizaciones, en la divulgación se proporciona el uso de un agente de unión a ILT2/ILT4 descrito en el presente documento en la fabricación o preparación de un medicamento para inhibir el crecimiento de un tumor o una célula tumoral. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 aumenta, promueve y/o mejora la actividad de las células inmunitarias efectoras. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2 inhibe el crecimiento de las células tumorales al aumentar, promover y/o potenciar la actividad de las células inmunitarias efectoras. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 aumenta, promueve y/o potencia la actividad de las células inmunitarias efectoras. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT4 inhibe el crecimiento de las células tumorales al aumentar, promover y/o mejorar la actividad de las células inmunitarias efectoras. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 aumenta, promueve y/o mejora la actividad de las células inmunitarias efectoras. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 inhibe el crecimiento de las células tumorales al aumentar, promover y/o mejorar la actividad de las células inmunitarias efectoras.
En algunas realizaciones, un método para inhibir el crecimiento tumoral comprende poner en contacto el tumor y/o el microentorno tumoral con un agente de unión a ILT (por ejemplo, un agente de unión a ILT2, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4) descrito en el presente documentoin vivo.En algunas realizaciones, la puesta en contacto de un tumor y/o un microambiente tumoral con un agente de unión a ILT descrito en el presente documento se efectúa en un modelo animal. Por ejemplo, se puede administrar un agente de prueba (por ejemplo, un agente de unión a ILT2/ILT4) a ratones que tienen tumores. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 aumenta, promueve y/o mejora la actividad de las células inmunitarias en los ratones. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 inhibe el crecimiento tumoral. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 hace que un tumor remita. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 se administra al mismo tiempo o poco después de la introducción de las células tumorales en el animal para prevenir el crecimiento del tumor (“modelo preventivo”). En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 se administra después de que los tumores hayan crecido hasta un tamaño específico o se hayan “establecido” para el tratamiento (“modelo terapéutico”). En algunas realizaciones, se administra un agente de unión a ILT2/ILT4 a un animal transgénico (por ejemplo, un ratón transgénico) que expresa ILT2 y/o ILT4 humanos, en donde el animal transgénico tiene un tumor derivado de células humanas.
En algunas realizaciones, un método para inhibir el crecimiento tumoral comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de unión a ILT (por ejemplo, un agente de unión a ILT2, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4) descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, un método para inhibir el crecimiento tumoral comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de unión a ILT2/ILT4 descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, un método para aumentar o mejorar una respuesta inmunitaria a un tumor o células tumorales en un sujeto comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de unión a ILT2/ILT4 descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, un método para aumentar o mejorar una respuesta inmunitaria a un tumor o células tumorales en un sujeto comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de unión a ILT2/ILT4 descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, un método para inhibir la recidiva tumoral o que vuelva a crecer el tumor en un sujeto comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de unión a ILT2/ILT4 descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, un método para inducir una inmunidad persistente o a largo plazo para inhibir la recidiva tumoral o que vuelva a crecer el tumor en un sujeto comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de unión a ILT2/ILT4 descrito en el presente documento. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el tumor es un tumor sólido. En algunas realizaciones, el tumor es un tumor pancreático, un tumor de mama, un tumor de pulmón, un carcinoma broncopulmonar no microcítico, un tumor de cabeza y cuello, un tumor colorrectal, un tumor de próstata, un tumor de piel, un melanoma, un tumor de estómago, un tumor gástrico, un tumor intestinal, un tumor de ovario, un tumor cervical, un tumor uterino, un tumor de endometrio, un tumor de vejiga, un tumor cerebral, un tumor de esófago, un tumor de hígado, un tumor de riñón, un carcinoma de células renales o un tumor testicular. En algunas realizaciones, el tumor es un tumor pancreático. En algunas realizaciones, el tumor es un carcinoma broncopulmonar no microcítico. En algunas realizaciones, el tumor es un carcinoma renal (CCR). En algunas realizaciones, el sujeto tiene un tumor o el sujeto tenía un tumor que se retiró al menos parcialmente. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el sujeto es un ser humano.
En algunas realizaciones, en la divulgación se proporciona el uso de un agente de unión a ILT2, un agente de unión a ILT4, o un agente de unión a ILT2/ILT4, descrito en el presente documento en la fabricación o preparación de un medicamento para inhibir el crecimiento de un tumor o una célula tumoral. En algunas realizaciones, el método para inhibir el crecimiento de un tumor comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo 27F9, el anticuerpo 47C8, el anticuerpo 48A5, el anticuerpo 47H6, el anticuerpo 51A1, el anticuerpo 64A12, el anticuerpo 73C4 o el anticuerpo 73D1, o versiones humanizadas de estos. En algunas realizaciones, el método para inhibir el crecimiento de un tumor comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo Hz47H6.v2. En algunas realizaciones, el método para inhibir el crecimiento de un tumor comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo Hz64A12. En algunas realizaciones, el método para inhibir el crecimiento de un tumor comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo Hz73D1.v1. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el sujeto es un ser humano.
En la presente divulgación se proporcionan métodos para tratar el cáncer. En algunas realizaciones, un método para tratar el cáncer comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de unión a ILT2 descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, un método para tratar el cáncer comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de unión a ILT4 descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, un método para tratar el cáncer comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de unión a ILT2/ILT4 descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a ILT2 y/o a ILT4 e inhibe o reduce el crecimiento del cáncer. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a las células humanas que expresan ILT2 y/o a las células que expresan ILT4, mejora la respuesta inmunitaria contra un cáncer e inhibe o reduce el crecimiento del cáncer. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT2/ILT4 se une a las células humanas que expresan ILT2 y/o a las células que expresan ILT4, activa las células mieloides, mejora la respuesta inmunitaria contra un cáncer e inhibe o reduce el crecimiento del cáncer. En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un tumor canceroso. En algunas realizaciones, al sujeto se le ha extirpado el cáncer al menos parcialmente.
En algunas realizaciones, en la divulgación se proporciona el uso de un agente de unión a ILT2 descrito en el presente documento en la fabricación o preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer. En algunas realizaciones, en la divulgación se proporciona el uso de un agente de unión a ILT4 descrito en el presente documento en la fabricación o preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer. En algunas realizaciones, en la divulgación se proporciona el uso de un agente de unión a ILT2/ILT4 descrito en el presente documento en la fabricación o preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.
En algunos casos de los métodos descritos en el presente documento, el cáncer es cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de pulmón, carcinoma broncopulmonar no microcítico (NSCLC), cáncer de cabeza y cuello, cáncer colorrectal, cáncer de próstata, cáncer de piel, melanoma, cáncer de estómago, cáncer gástrico, cáncer intestinal, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de útero, cáncer de endometrio, cáncer de vejiga, cáncer de cerebro, cáncer de esófago, cáncer de hígado, cáncer de riñón, carcinoma renal (CCR), o cáncer testicular. En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer de páncreas. En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer de mama. En algunas realizaciones, el cáncer es carcinoma broncopulmonar no microcítico. En algunas realizaciones, el tumor es un carcinoma renal.
En algunas realizaciones, un método para tratar el cáncer en un sujeto comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo 27F9 o una versión humanizada del mismo. En algunas realizaciones, un método para tratar el cáncer en un sujeto comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo 47C8 o el anticuerpo 48A5 o una versión humanizada del mismo. En algunas realizaciones, un método para tratar el cáncer en un sujeto comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo 47H6, el anticuerpo 51A1, el anticuerpo 64A12, el anticuerpo 73C4 o el anticuerpo 73D1 o una versión humanizada de estos. En algunas realizaciones, un método para tratar el cáncer en un sujeto comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo Hz47H6.v2. En algunas realizaciones, un método para tratar el cáncer en un sujeto comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo Hz64A12. En algunas realizaciones, un método para tratar el cáncer en un sujeto comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo Hz73D1.v1.
En algunas realizaciones, en la divulgación se proporcionan métodos para activar las células mieloides en el microambiente tumoral. En algunas realizaciones, un método para activar las células mieloides en el microambiente tumoral en un sujeto con un tumor comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de unión a ILT2, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4 descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, un método para activar las células mieloides en el microambiente tumoral en un sujeto con un tumor comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de unión a ILT2/ILT4 descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, las células mieloides son células dendríticas primarias. En algunas realizaciones, las células mieloides son monocitos. En algunas realizaciones, las células mieloides son macrófagos. En algunas realizaciones, las células mieloides son APC.
En algunas realizaciones, en la divulgación se proporcionan métodos para activar las células NK en el microambiente tumoral. En algunas realizaciones, un método para activar las células NK en el microambiente tumoral en un sujeto con un tumor comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, un método para activar las células NK en el microambiente tumoral en un sujeto con un tumor comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de unión a ILT2 descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, un método para activar las células NK en el microambiente tumoral en un sujeto con un tumor comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de unión a ILT2/ILT4 descrito en el presente documento.
En algunas realizaciones, en la divulgación se proporcionan métodos para activar las CTL en el microambiente tumoral. En algunas realizaciones, un método para activar las CTL en el microambiente tumoral en un sujeto con un tumor comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de unión a ILT2 o un agente de unión a ILT2/ILT4 descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, un método para activar las CTL en el microambiente tumoral en un sujeto con un tumor comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de unión a ILT2 descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, un método para activar las CTL en el microambiente tumoral en un sujeto con un tumor comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de unión a ILT2/ILT4 descrito en el presente documento.
En algunas realizaciones, de los métodos descritos en el presente documento, un agente de unión a ILT2 comprende una región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 de un anticuerpo 27F9.
En algunas realizaciones del método descrito en el presente documento, un agente de unión a ILT2 es un anticuerpo anti-ILT2. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el anticuerpo anti-ILT2 comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GFSLTNYGVS (SEQ ID NO:22), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos IIWGDGSTNYHSALIS (SEQ ID NO:23), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos PNWDTYAMDF (SEQ ID NO:24), y (b) una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASQDISNFLN (SEQ ID NO:25), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos CTSKLHS (SEQ ID NO:26), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQGNTLPPT (SEQ ID NO:27). En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el anticuerpo anti-ILT2 comprende: (a) una región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 125 y (b) una región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 126. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el anticuerpo anti-ILT2 es el anticuerpo 27F9. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el anticuerpo anti-ILT2 es una versión humanizada de 27F9.
En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, un agente de unión a ILT4 comprende una región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 de un anticuerpo 47C8.
En algunas realizaciones del método descrito en el presente documento, un agente de unión a ILT4 es un anticuerpo anti-ILT4. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el anticuerpo anti-ILT4 comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYSFTGYYMH (SEQ ID NO:38), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos RVYPNNGDTSYNQKFKV (SEQ ID NO:39), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos GATVVESLFAY (SEQ ID NO:40), y (b) una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASESVDNYGNNFLH (SEQ ID NO:41), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos RTSNLES (SEQ ID NO:42), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQSNEDPYT (SEQ ID NO:43. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el anticuerpo anti-ILT4 comprende: (a) una región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 127 y (b) una región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 128. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el anticuerpo anti-ILT4 es el anticuerpo 47C8. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el anticuerpo anti-ILT4 es una versión humanizada del anticuerpo 47C8.
En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el agente de unión a ILT4 comprende una región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 de un anticuerpo 48A5.
En algunas realizaciones del método descrito en el presente documento, un agente de unión a ILT4 es un anticuerpo anti-ILT4. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el anticuerpo anti-ILT4 comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTNYGMN (SEQ ID NO:54), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos WINTYIGEPIYADDFKG (SEQ ID NO:55), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos RSDYDGYAMDY (SEQ ID NO:56), y (b) una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos KSSQSLLYSGNQKNYLA (SEQ ID NO:57), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos WASTRES (SEQ ID NO:58), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQHDSYPT (SEQ ID NO:59). En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el anticuerpo anti-ILT4 comprende: (a) una región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 129 y (b) una región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 130. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el anticuerpo anti-ILT4 es el anticuerpo 48A5. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el anticuerpo anti-ILT4 es una versión humanizada del anticuerpo 48A5.
En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 de un anticuerpo 47H6 o un anticuerpo Hz47H6.v2.
En algunas realizaciones del método descrito en el presente documento, un agente de unión a ILT2/ILT4 es un anticuerpo anti-ILT2/ILT4. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el anticuerpo anti-ILT2/ILT4 comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTDYYMN (SEQ ID NO:70), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos DFNPNNGGTTYNQKFEG (SEQ ID NO:71) o DFNPNNAGTTYNQKFEG (SEQ ID NO:118), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos GRFYYGSLYSFDY (SEQ ID NO:72), y (b) una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASGNIHNYLA (SEQ ID NO:73), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos NAKTLAD (SEQ ID NO:74), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QHFWTSIT (SEQ ID NO:75). En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el anticuerpo anti-ILT2/ILT4 comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTDYYMN (SEQ ID NO:70), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos DFNPNNGGTTYNQKFEG (SEQ ID NO:71), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos GRFYYGSLYSFDY (SEQ ID NO:72), y (b) una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASGNIHNYLA (SEQ ID NO:73), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos NAKTLAD (SEQ ID NO:74), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QHFWTSIT (SEQ ID NO:75). En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el anticuerpo anti-ILT2/ILT4 comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTDYYMN (SEQ ID NO:70), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos DFNPNNAGTTYNQKFEG (SEQ ID NO:118), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos GRFYYGSLYSFDY (SEQ ID NO:72), y (b) una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASGNIHNYLA (SEQ ID NO:73), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos NAKTLAD (SEQ ID NO:74), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QHFWTSIT (SEQ ID NO:75). En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el anticuerpo anti-ILT2/ILT4 comprende: (a) una región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 131 y (b) una región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 132. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el anticuerpo anti-ILT2/ILT4 comprende: (a) una región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 133 y (b) una región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 134. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el anticuerpo anti-ILT2/ILT4 comprende: (a) una cadena pesada de la SEQ ID NO: 148 y (b) una cadena ligera de la SEQ ID NO: 149. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el anticuerpo anti-ILT2/ILT4 es el anticuerpo 47H6. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el anticuerpo anti-ILT2/ILT4 es una versión humanizada del anticuerpo 47H6. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el anticuerpo anti-ILT2/ILT4 es el anticuerpo Hz47H6.v2.
En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 de un anticuerpo 51A1 o una versión humanizada del anticuerpo 51A1.
En algunas realizaciones del método descrito en el presente documento, un agente de unión a ILT2/ILT4 es un anticuerpo anti-ILT2/ILT4. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el anticuerpo anti-ILT2/ILT4 comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GFTFNTYAMH (SEQ ID NO:86), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos RIRSKSSNYATYYADSVKD (SEQ ID NO:87), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos DGIYYYGTMYYYAMDY (SEQ ID NO:88), y (b) una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASESVDYYGNSFMY (SEQ ID NO:89), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos FASNLES (SEQ ID NO:90), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQNNEDPWT (SEQ ID NO:91). En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el anticuerpo anti-ILT2/ILT4 comprende: (a) una región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 135 y (b) una región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 136. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el anticuerpo anti-ILT2/ILT4 es el anticuerpo 51A1. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el anticuerpo anti-ILT2/ILT4 es una versión humanizada del anticuerpo 51A1.
En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 de un anticuerpo 64A12, una versión humanizada del anticuerpo 64A12, o el anticuerpo Hz64A12.
En algunas realizaciones del método descrito en el presente documento, un agente de unión a ILT2/ILT4 es un anticuerpo anti-ILT2/ILT4. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el anticuerpo anti-ILT2/ILT4 comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GFTFNTYAMH (SEQ ID NO:86), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos RIRSKSSNYATYYADSVKD (SEQ ID NO:87), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos DGIYYYDTMy YYa MDY (SEQ ID NO:102), y (b) una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASESVDYYGNSFIY (SEQ ID NO:103), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos FASNLES (SEQ ID NO:90), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQNNEDPWT (SEQ ID NO:91). En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el anticuerpo anti-ILT2/ILT4 comprende: (a) una región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 137 y (b) una región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 138. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el anticuerpo anti-ILT2/ILT4 comprende: (a) una región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 139 y (b) una región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 140. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el anticuerpo anti-ILT2/ILT4 comprende: (a) una cadena pesada de la SEQ ID NO: 152 y (b) una cadena ligera de la SEQ ID NO: 153. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el anticuerpo anti-ILT2/ILT4 es el anticuerpo 64A12. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el anticuerpo anti-ILT2/ILT4 es una versión humanizada del anticuerpo 64A12. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el anticuerpo anti-ILT2/ILT4 es el anticuerpo Hz64A12.
En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 de un anticuerpo 73C4 o una versión humanizada del anticuerpo 73C4.
En algunas realizaciones del método descrito en el presente documento, un agente de unión a ILT2/ILT4 es un anticuerpo anti-ILT2/ILT4. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el anticuerpo anti-ILT2/ILT4 comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTDYYMN (SEQ ID NO:70), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos NVNPNNGGTSYNQKFKG (SEQ ID NO:106), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos REIYFYGTIYYYAMDY (SEQ ID NO:107), y (b) una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASESVDYYGNSFMY (SEQ ID NO:89), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos FASNLES (SEQ ID NO:90), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQNNEDPWT (SEQ ID NO:91). En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el anticuerpo anti-ILT2/ILT4 comprende: (a) una región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 141 y (b) una región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 142. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el anticuerpo anti-ILT2/ILT4 es el anticuerpo 73C4. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el anticuerpo anti-ILT2/ILT4 es una versión humanizada del anticuerpo 73C4.
En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el agente de unión a ILT2/ILT4 comprende una región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 de un anticuerpo 73D1, o una versión humanizada del anticuerpo 73D1, o el anticuerpo Hz73D1.v1.
En algunas realizaciones del método descrito en el presente documento, un agente de unión a ILT2/ILT4 es un anticuerpo anti-ILT2/ILT4. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el anticuerpo anti-ILT2/ILT4 comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTDYYIN (SEQ ID NO:111), una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos NVNPNDGGTTYNQKFKG (SEQ ID NO:112), y una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos REIYFYGTIYYYAMDY (SEQ ID NO:107), y (b) una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASESVDYYGNSFMY (SEQ ID NO:89), una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos FASNLES (SEQ ID NO:90), y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQNNEDPWT (SEQ ID NO:91). En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el anticuerpo anti-ILT2/ILT4 comprende: (a) una región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 143 y (b) una región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 142. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el anticuerpo anti-ILT2/ILT4 comprende: (a) una región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 144 y (b) una región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 145. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el anticuerpo anti-ILT2/ILT4 comprende: (a) una cadena pesada de la SEQ ID NO: 156 y (b) una cadena ligera de la SEQ ID NO: 157. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el anticuerpo anti-ILT2/ILT4 es el anticuerpo 73D1. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el anticuerpo anti-ILT2/ILT4 es una versión humanizada del anticuerpo 73D1. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el anticuerpo anti-ILT2/ILT4 es el anticuerpo Hz73D1.v1.
En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, un método comprende administrar un agente de unión a ILT (por ejemplo, un agente de unión a ILT2, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4) descrito en el presente documento en combinación con al menos un agente terapéutico o terapia terapéutica adicional. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, un método comprende administrar un agente de unión a ILT2/ILT4 descrito en el presente documento en combinación con al menos un agente terapéutico o terapia terapéutica adicional. En el tratamiento con dos o más agentes terapéuticos a menudo se usan agentes que funcionan mediante diferentes mecanismos de acción, aunque esto no es necesario. La terapia combinada en que se usan agentes con diferentes mecanismos de acción puede resultar en efectos aditivos o sinérgicos. La terapia combinada puede permitir una dosis más baja de cada agente que la que se usa en monoterapia, reduciendo de ese modo los efectos secundarios tóxicos y/o aumentando el índice terapéutico del agente o agentes. La terapia combinada puede disminuir la probabilidad de que se desarrolle resistencia a un agente.
En algunas realizaciones de los métodos descritos, la combinación de un agente de unión a ILT (por ejemplo, un agente de unión a ILT2, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4) descrito en el presente documento y al menos un agente terapéutico adicional da como resultado resultados aditivos o sinérgicos. En algunas realizaciones, la terapia combinada da como resultado un aumento en el índice terapéutico del agente de unión a ILT. En algunas realizaciones, la terapia combinada da como resultado un aumento en el índice terapéutico del agente o agentes terapéuticos adicionales. En algunas realizaciones, la terapia combinada da como resultado una disminución de la toxicidad y/o los efectos secundarios del agente de unión a ILT. En algunas realizaciones, la terapia combinada da como resultado una disminución de la toxicidad y/o los efectos secundarios de los agentes terapéuticos adicionales. En algunas realizaciones, la terapia combinada comprende un agente terapéutico que afecta a la respuesta inmunitaria (por ejemplo, potencia o activa la respuesta) y un agente terapéutico que afecta (por ejemplo, inhibe (o destruye) las células tumorales/cancerosas.
En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, un tratamiento combinado comprende un agente terapéutico adicional. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, un tratamiento combinado comprende un agente terapéutico adicional. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, un tratamiento combinado comprende dos o más agentes terapéuticos adicionales.
Las clases útiles de agentes terapéuticos incluyen, entre otros, agentes antitubulina, auristatinas, aglutinantes de surcos menores del ADN, inhibidores de la replicación del ADN, agentes alquilantes (por ejemplo, complejos de platino tales como cisplatino, complejos de platino mono(platino), bis(platino) y trinucleares de platino y carboplatino), antraciclinas, antibióticos, antifolatos, antimetabolitos, sensibilizadores de quimioterapia, duocarmicinas, etopósidos, pirimidinas tioradas, ionóforos, lexitropsinas, nitrosoureas, platinoles, antimetabolitos purínicos, puromicinas, sensibilizadores de radiación, esteroides, taxanos, inhibidores de la topoisomerasa, alcaloides de la vinca o similares. En algunas realizaciones, el segundo agente terapéutico es un agente alquilante, un antimetabolito, un antimitótico, un inhibidor de la topoisomerasa o un inhibidor de la angiogénesis.
Los agentes terapéuticos que pueden administrarse en combinación con los agentes de unión a ILT descritos en el presente documento incluyen agentes quimioterapéuticos. Así, en algunas realizaciones, el método o tratamiento implica la administración de un agente de unión a ILT de la presente divulgación en combinación con un agente quimioterapéutico o en combinación con un cóctel de agentes quimioterapéuticos.
Los agentes quimioterapéuticos útiles en la presente divulgación incluyen, entre otros, agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida (CYTOXAN); alquilsulfonatos tales como busulfán, improsulfán y piposulfán; aziridinas tales como benzodopa, carboquona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas, incluidas altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; mostazas nitrogenadas como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembicina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, caliqueamicina, carabinomicina, caminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos como el metotrexato y el 5-fluorouracilo (5-FU); análogos del ácido fólico como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, arabinósido de citosina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; andrógenos como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antisuprarrenales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reponedores de ácido fólico como el ácido folínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquina; elformitina; acetato de eliptinio; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK; razoxano; sizofurano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquina; 2,2',2"-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; mannomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinósido (Ara-C); taxoides, por ejemplo, paclitaxel (TAXOL) y docetaxel (TAXOTERE); clorambucilo; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; análogos del platino como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; tenipósido; daunomicina; aminopterina; ibandronato; CPT 11; inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); ácido retinoico; esperamicinas; capecitabina (XELODA); y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.
Los agentes quimioterapéuticos también incluyen agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal en tumores tales como los antiestrógenos, incluyendo, por ejemplo, tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazoles inhibidores de la aromatasa, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona y toremifeno (FARESTON), y antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina, y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.
En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el agente quimioterapéutico es un inhibidor de la topoisomerasa. Los inhibidores de la topoisomerasa son agentes de quimioterapia que interfieren con la acción de una enzima topoisomerasa (por ejemplo, la topoisomerasa I o II). Los inhibidores de la topoisomerasa incluyen, entre otros, doxorrubicina HC1, citrato de daunorrubicina, mitoxantrona HC1, actinomicina D, etopósido, topotecán HC1, tenipósido (VM-26) e irinotecán, así como sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de estos. En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es irinotecán.
En algunas realizaciones, el agente quimioterapéutico es un antimetabolito. Un antimetabolito es una sustancia química con una estructura similar a la de un metabolito necesario para las reacciones bioquímicas usuales, pero lo suficientemente diferente como para interferir con una o más funciones usuales de las células, como la división celular. Los antimetabolitos incluyen, entre otros, gemcitabina, fluorouracilo, capecitabina, metotrexato de sodio, ralitrexed, pemetrexed, tegafur, arabinósido de citosina, tioguanina, 5-azacitidina, 6-mercaptopurina, azatioprina, 6-tioguanina, pentostatina, fosfato de fludarabina y cladribina, así como sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de estos. En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es la gemcitabina.
En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el agente quimioterapéutico es un agente antimitótico, incluyendo, entre otros, los agentes que se unen a la tubulina. En algunas realizaciones, el agente es un taxano. En algunas realizaciones, el agente es paclitaxel o docetaxel, o una sal, un ácido o un derivado farmacéuticamente aceptable de paclitaxel o docetaxel. En algunas realizaciones, el agente es paclitaxel (TAXOL), docetaxel (TAXOTERE), paclitaxel unido a albúmina (nab-paclitaxel; AB<r>A<x>ANE), DHA-paclitaxel o PG-paclitaxel. En ciertas realizaciones alternativas, el agente antimitótico comprende un alcaloide de la vinca, tal como vincristina, vinblastina, vinorelbina o vindesina, o sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de estos. En algunas realizaciones, el agente antimitótico es un inhibidor de la cinesina Eg5 o un inhibidor de una cinasa mitótica tal como Aurora A o Plkl. En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es paclitaxel. En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es nab-paclitaxel.
En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, un agente terapéutico adicional comprende un agente tal como una molécula pequeña. Por ejemplo, el tratamiento puede implicar la administración combinada de un agente de unión a ILT de la presente divulgación con una molécula pequeña que actúa como un inhibidor contra los antígenos asociados a tumores, incluyendo, entre otros, EGFR, HER2 (ErbB2) y/o VEGF. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT (por ejemplo, un anticuerpo anti-ILT2, un anticuerpo anti-ILT4 o un anticuerpo anti-ILT2/ILT4) de la presente divulgación se administra en combinación con un inhibidor de la proteína cinasa se selecciona del grupo que consiste en: gefitinib (IRESSA), erlotinib (TARCEVA), sunitinib (SUTENT), lapatanib, vandetanib (ZAcT imA), AEE788, CI-1033, cediranib (RECENTIN), sorafenib (NEXAVAR) y pazopanib (GW786034B). En algunas realizaciones, un agente terapéutico adicional comprende un inhibidor de mTOR.
En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, un agente terapéutico adicional comprende una molécula biológica, tal como un anticuerpo. Por ejemplo, el tratamiento puede implicar la administración combinada de un agente de unión a ILT de la presente divulgación con anticuerpos contra los antígenos asociados a tumores, incluyendo, entre otros, anticuerpos que se unen a EGFR, HER2/ErbB2 y/o VEGF.
En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es un anticuerpo que es un inhibidor de la angiogénesis (por ejemplo, un anticuerpo anti-VEGF o receptor de VEGF). En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es bevacizumab (AVASTIN), ramucirumab, trastuzumab (HERCEPTIN), pertuzumab (OMNITARG), panitumumab (VECTIBIX), nimotuzumab, zalutumumab o cetuximab (ERBITUX).
En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el agente terapéutico adicional es un agente inmunoterapéutico. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el agente inmunoterapéutico se selecciona del grupo que consiste en: un modulador de la actividad de PD-1, un modulador de la actividad de PD-L1, un modulador de la actividad de PD-L2, un modulador de la actividad de CTLA-4, un modulador de la actividad de CD28, un modulador de la actividad de CD80, un modulador de la actividad de CD86, un modulador de la actividad de 4-1BB, un modulador de la actividad de OX40, un modulador de la actividad de KIR, un modulador de la actividad de Tim-3, modulador de la actividad de LAG3, modulador de la actividad de CD27, modulador de la actividad de CD40, modulador de la actividad de GITR, modulador de la actividad de TIGIT, modulador de la actividad de CD20, modulador de la actividad de CD96, modulador de la actividad de IDO1.
En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el agente inmunoterapéutico se selecciona del grupo que consiste en: un antagonista de PD-1, un antagonista de PD-L1, un antagonista de PD-L2, un antagonista de CTLA-4, un antagonista de CD80, un antagonista de CD86, un antagonista de KIR, un antagonista de Tim-3, un antagonista de LAG3, un antagonista de TIGIT, un antagonista de CD20, un antagonista de CD96 y/o un antagonista de IDO1.
En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el agente terapéutico adicional es un inhibidor de puntos de control. En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PD-Ll, un anticuerpo anti-PD-L2, un anticuerpo anti-CTLA-4 o un anticuerpo anti-TIGIT, un anticuerpo anti-CD28, un anticuerpo anti-CD80, un anticuerpo anti-CD86, un anticuerpo anti-4-1BB, un anticuerpo anti-OX40, un anticuerpo anti-KIR, un anticuerpo anti-TIM-3, un anticuerpo anti-LAG3, un anticuerpo anti-CD27, un anticuerpo anti-CD40, un anticuerpo anti-GITR, un anticuerpo anti-TIGIT, un anticuerpo anti-CD20, un anticuerpo anti-CD96 o un anticuerpo anti-IDO1. En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es un anticuerpo anti-HLA-G. En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es el ligando B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), 4-1BB o un anticuerpo anti-CD3.
En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el antagonista de PD-1 es un anticuerpo que se une específicamente a PD-1. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une a la PD-1 es el pembrolizumab (MK-3475; KEYTRUDA), el pidilizumab (CT-011), el nivolumab (OPDIVO), el durvalumab (MEDI0680), el cemiplimab (REGN2810), el tislelizumab (BGB-A317), el espartalizumab (p Dr-001), o STI-A1110. Se proporcionan ejemplos de anticuerpos anti-PD-1, por ejemplo, en las Patentes Estadounidenses núms. US10316089, US9580504, US9856320, US8609089, y US8952136. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une a PD-1 se describe en la Publicación PCT WO 2014/179664, por ejemplo, un anticuerpo identificado como APE2058, APE1922, APE1923, APE1924, APE 1950 o APE1963, o un anticuerpo que contiene las regiones CDR de cualquiera de estos anticuerpos. En otras realizaciones, el antagonista de PD-1 es una proteína de fusión que incluye PD-L2, por ejemplo, AMP-224. En otras realizaciones, el antagonista de PD-1 es un inhibidor peptídico, por ejemplo, AU P-12.
En algunas realizaciones, el antagonista del PD-L1 es un anticuerpo que se une específicamente al PD-L1. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une a PD-L1 es atezolizumab (TECENTRIQ), MEDI4736, BMS-936559 (MDX-1105), avelumab (BAVENCIO), durvalumab (IMFINZI), KD033, la porción de anticuerpo de KD033 o STI-A1014. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une a PD-L1 se describe en la Publicación PCT WO 2014/055897, por ejemplo, Ab-14, Ab-16, Ab-30, Ab-31, Ab-42, Ab-50, Ab-52 o Ab-55, o un anticuerpo que contiene las regiones c Dr de cualquiera de estos anticuerpos.
En algunas realizaciones, el antagonista del CTLA-4 es un anticuerpo que se une específicamente a CTLA-4. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une a CTLA-4 es el ipilimumab (YERVOY) o el tremelimumab (CP-675,206). En algunas realizaciones, el antagonista de CTLA-4 es una proteína de fusión de CTLA-4, por ejemplo, la KAHR-102.
En algunas realizaciones, el antagonista de LAG3 es un anticuerpo que se une específicamente a LAG3. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une a LAG3 es IMP701, IMP731, BMS-986016, LAG525 y GSK2831781. En algunas realizaciones, el antagonista de LAG3 incluye un receptor de LAG3 soluble, por ejemplo, IMP321.
En algunas realizaciones, el antagonista de KIR es un anticuerpo que se une específicamente a KIR. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une a KIR es el lirilumab.
En algunas realizaciones, un agente inmunoterapéutico se selecciona del grupo que consiste en: un agonista de CD28, un agonista de 4-1BB, un agonista de OX40, un agonista de CD27, un agonista de CD80, un agonista de CD86, un agonista de CD40 y un agonista de GITR.
En algunas realizaciones, el agonista de OX40 incluye el ligando de OX40, o una porción de unión a OX40 del mismo. Por ejemplo, el agonista de OX40 puede ser MEDI6383. En algunas realizaciones, el agonista de OX40 es un anticuerpo que se une específicamente a OX40. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une a OX40 es MEDI6469, MEDI0562, PF-8600 o MOXR0916 (RG7888). En algunas realizaciones, el agonista de OX40 es un vector (por ejemplo, un vector de expresión o un virus, tal como un adenovirus) capaz de expresar el ligando de OX40. En algunas realizaciones, el vector que expresa OX40 es Delta-24-RGDOX o DNX2401.
En algunas realizaciones, el agonista del 4-1BB (CD137) es una molécula de unión, tal como una anticalina. En algunas realizaciones, la anticalina es PRS-343. En algunas realizaciones, el agonista del 4-1BB es un anticuerpo que se une específicamente al 4-1 BB. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une al 4-1 BB es el utomilumab (PF-05082566) o el urelumab (BMS-663513).
En algunas realizaciones, el agonista de CD27 es un anticuerpo que se une específicamente a CD27. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une al CD27 es varlilumab (CDX-1127).
En algunas realizaciones, el agonista del GITR comprende un ligando del GITR o una porción de unión al GITR del mismo. En algunas realizaciones, el antagonista de GITR es un anticuerpo que se une específicamente a GITR. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une al GITR es TRX518, MK-4166 o INBRX-110.
En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el agente terapéutico adicional es una molécula biológica, tal como una citocina, una quimiocina, un factor de crecimiento, un interferón, una interleucina, una linfocina, un miembro de la familia del factor de necrosis tumoral (TNF) y un oligonucleótido inmunoestimulador (por ejemplo, dinucleótidos CpG). En algunas realizaciones, la molécula biológica se selecciona del grupo que consiste en: adrenomedulina (AM), angiopoyetina (Ang), BMP, BDNF, EGF, eritropoyetina (EPO), FGF, GDNF, factor estimulante de colonias de granulocus tos y macrófagos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), factor estimulante de colonias de granulocus tos (G-CSF), GDF9, HGF, HDGF, IGF, factor estimulante de la migración, miostatina (GDF-8), NGF, neurotrofinas, PDg F, trombopoyetina, TGF-a, TGF-p, TNF-a, VEGF, PIGF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15 e IL-18.
Asimismo, el tratamiento con un agente de unión a ILT (por ejemplo, un agente de unión a ILT2, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4) descrito en el presente documento puede ir acompañado de la extirpación quirúrgica de tumores, la extirpación de células cancerosas o cualquier otra terapia que el médico tratante considere necesaria.
En algunas realizaciones, el tratamiento con un agente de unión a ILT (por ejemplo, un agente de unión a ILT2, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4) puede producirse antes o después de la administración de los agentes terapéuticos adicionales, o concurrentemente a su administración. En algunas realizaciones, la administración combinada incluye la administración conjunta, ya sea en una única formulación farmacéutica o usando formulaciones separadas, o la administración consecutiva en cualquier orden, pero generalmente dentro de un período de tiempo de manera que todos los agentes activos puedan ejercer sus actividades biológicas. En algunas realizaciones, la preparación de los agentes y/o las pautas posológicas para agentes terapéuticos adicionales se realizan de acuerdo con las instrucciones del fabricante o según lo determine empíricamente el profesional experto.
En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, se administra un agente de unión a ILT (por ejemplo, un agente de unión a ILT2, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4) a un sujeto como parte de una terapia combinada.
Se apreciará que la combinación de un agente de unión a ILT (por ejemplo, un agente de unión a ILT2, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4) descrita en el presente documento y al menos un agente terapéutico adicional se puede administrar en cualquier orden o concurrentemente. En algunas realizaciones, se administra un agente de unión a ILT a sujetos que se han sometido previamente a un tratamiento con un agente terapéutico. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT y un segundo agente terapéutico se administran de forma sustancialmente simultánea o concurrente. Por ejemplo, a un sujeto se le puede administrar un agente de unión a ILT mientras se somete a un ciclo de tratamiento con un segundo agente terapéutico (por ejemplo, un agente quimioterapéutico). En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT se administra en un plazo de 1 año tras el tratamiento con un segundo agente terapéutico. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT se administra en un plazo de 10, 8, 6, 4 o 2 meses tras cualquier tratamiento con un segundo agente terapéutico. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT se administra en un plazo de 4, 3, 2 o 1 semanas tras cualquier tratamiento con un segundo agente terapéutico. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT se administra en un plazo de 5, 4, 3, 2 o 1 días tras cualquier tratamiento con un segundo agente terapéutico. Se apreciará además que los dos (o más) agentes o tratamientos se pueden administrar al sujeto en cuestión de horas o minutos (es decir,de forma sustancialmente simultánea).
Para el tratamiento de una enfermedad, la dosis apropiada de un agente de unión a ILT (por ejemplo, un agente de unión a ILT2, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4) de la presente divulgación depende del trastorno o la enfermedad que haya que tratar, de la gravedad y el curso del trastorno o la enfermedad, de si el agente se administra con fines terapéuticos o preventivos, de la terapia previa, la anamnesis del paciente, etc. Un agente de unión a ILT se puede administrar una vez o durante una serie de tratamientos que duran desde varios días hasta varios meses, o hasta que se consiga una cura o se logre una mejoría de la enfermedad.
La presente divulgación proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un agente de unión a ILT descrito en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En la presente divulgación se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden un agente de unión a ILT2 descrito en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En la presente divulgación se proporcionan también composiciones farmacéuticas que comprenden un agente de unión a ILT4 descrito en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En la presente divulgación se proporcionan también composiciones farmacéuticas que comprenden un agente de unión a ILT2/ILT4 descrito en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Las formulaciones se preparan para su almacenamiento y uso combinando de un anticuerpo o agente purificado de la presente divulgación con un vehículo farmacéuticamente aceptable (por ejemplo,un portador o excipiente). Los expertos en la materia generalmente consideran que los portadores, excipientes y/o estabilizantes farmacéuticamente aceptables son ingredientes inactivos de una formulación o composición farmacéutica.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, entre otros, tampones no tóxicos tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; sales tales como cloruro de sodio; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetil bencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metil- o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (por ejemplo, menos de aproximadamente 10 residuos de aminoácidos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; carbohidratos tales como monosacáridos, disacáridos, glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos tales como complejos Zn-proteína; y surfactantes no iónicos tales como TWEEN o polietilenglicol. (“Remington: The Science and Practice of Pharmacy”, 22a edición, 2012, Pharmaceutical Press, Londres). En algunas realizaciones, la formulación está en forma de una solución acuosa. En algunas realizaciones, la formulación se almacena en una forma liofilizada o en una forma seca alternativa.
Los agentes de unión a ILT de la presente divulgación pueden formularse en cualquier forma adecuada para su suministro a una célula/tejido diana. En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT (por ejemplo, un agente de unión a ILT2, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4) se puede formular como un liposoma, una micropartícula, una microcápsula, una microesfera de albúmina, una microemulsión, una nanopartícula, una nanocápsula o una macroemulsión.
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT (por ejemplo, un agente de unión a ILT2, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4) se formula con liposomas. Los expertos en la técnica conocen los métodos para producir liposomas. Por ejemplo, algunos liposomas pueden generarse mediante evaporación de fase inversa con una composición lipídica que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE).
En algunas realizaciones, un agente de unión a ILT (por ejemplo, un agente de unión a ILT2, un agente de unión a ILT4 o un agente de unión a ILT2/ILT4) se formula como una preparación de liberación sostenida. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos conteniendo un agente, estando dichas matrices en forma de artículos conformados, (por ejemplo,películas o micropartículas). Las matrices de liberación sostenida incluyen, entre otros, poliésteres, hidrogeles como el poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) o el poli(alcohol vinílico), polilactidas, copolímeros de ácido L-glutámico y 7-etil-L-glutamato, acetato de etilenvinilo no degradables, copolímeros degradables de ácido láctico y ácido glicólico, tales como el LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico y ácido glicólico y acetato de leuprolida), acetato-isobutirato de sacarosa y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
Las composiciones o formulaciones farmacéuticas de la presente divulgación se pueden administrar de varias maneras para el tratamiento local o sistémico. La administración puede ser tópica mediante parches epidérmicos o transdérmicos, pomadas, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, aerosoles, líquidos y polvos; pulmonar mediante inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, incluso por nebulizador, por vía intratraqueal e intranasal, oral o parenteral, incluidas las vías intravenosas, intraarteriales, intratumorales, subcutáneos, intraperitoneales, intramusculares (por ejemplo, inyección o perfusión) o intracraneal (por ejemplo, intratecal o intraventricular).
Ejemplos
Ejemplo 1
Generación de anticuerpos y selección de anticuerpos
Los anticuerpos anti-ILT se generaron usando el dominio extracelular de ILT2 humano, el dominio extracelular de ILT4 humano y/o el dominio extracelular de ILT2 deM. mulattacomo inmunógeno. Por ejemplo, los anticuerpos anti-ILT2 se generaron usando el dominio extracelular de ILT2 humano. De manera similar, los anticuerpos anti-ILT4 se generaron usando el dominio extracelular de ILT4 humano. Los anticuerpos anti-ILT2/ILT4 se generaron usando una mezcla del dominio extracelular de ILT2 humano, el dominio extracelular de ILT4 humano y el dominio extracelular de ILT2 deM. mulatta.Se obtuvieron suspensiones unicelulares de linfocitos de los bazos y los ganglios linfáticos de ratones inmunizados después de determinar que los animales individuales tenían títulos de anticuerpos adecuados. Los linfocitos se fusionaron con células de mieloma murino mediante métodos estándar. Las fusiones de hibridomas se colocaron en placas en medios semisólidos para la selección por HAT. Después de 5-7 días, se seleccionaron colonias individuales usando un sistema ClonePix™ y se colocaron en placas de 96 pocillos.
Los ensayos ELISA se usaron para seleccionar anticuerpos contra ILT2 humano, ILT4 humano y ILT2 deM. mulatta.Se seleccionaron los anticuerpos que se unieron solo a ILT2 humano, solo a ILT4 humano o a ILT2 humano, a ILT4 humano y a ILT2 deM. mulatta.
Ejemplo 2
Sintenia entre los genes ILT2 e ILT4 de humanos yM. fascicularis
En roedores, los receptores B de tipo Ig (PirB) emparejados y gp49B1 se han descrito como los posibles ortólogos de la familia de receptores LILR<b>humanos (Kang X, et al. Cell Cycle. (2016);15(1):25-40). Sin embargo, el PirB y el gp49B1 muestran menos del 50 % de identidad tanto con ILT2 humano como con ILT4 humano. Además, existen diferencias marcadas en el apareamiento receptor/ligando entre los miembros de la familia LILRB de roedores y seres humanos y la función biológica de los receptores de roedores no está clara. Así, los roedores no se consideran especies relevantes para probar los efectos biológicos de los anticuerpos anti-ILT.
Se usó un análisis de la estructura genómica (sintenia) para identificar los ortólogos candidatos tanto de ILT2 como de ILT4 humanos enM. fascicularis.La organización genómica del locus que contiene a los miembros de la familia LILR en seres humanos (hg38) yM. fascicularis (Macaca fascicularisv5.0.95) se comparó usando las anotaciones genéticas proporcionadas por Ensembl. En los casos en que no se encontraron anotaciones, se usó el análisis manual de la secuencia intermedia para confirmar la falta de un marco de lectura abierto. La secuencia proteica predicha de los genes en elM. fascicularissin símbolos genéticos previamente anotados se comparó con todos los genes humanos usando herramientas blastp en UniProt para encontrar el ortólogo humano más probable según la puntuación de identidad.
Se descubrió que a la organización genómica delM. fascicularisle falta un gen en la misma ubicación del genoma que el LILRB2 humano (ILT4), mientras que conserva un gen en la misma ubicación que el LILRB1 humano (ILT2). Se observó una organización similar conM. mulatta.La identidad de secuencia entre ILT2 humano, ILT4 humano y ILT2 deM. fascicularises entre el 73 % y el 80 %. La identidad de secuencia entre ILT2 humano y ILT2 deM. fascicularises del 73 %, mientras que la identidad de secuencia entre ILT4 humano y ILT2 deM. fascicularises del 78 %. En comparación, la identidad de secuencia entre ILT2 humano y ILT4 humano es del 80 %.
Ejemplo 3
Características de unión de los anticuerpos anti-ILT2, ILT4 e ILT2/ILT4 humanos
Las afinidades de unión de los anticuerpos anti-ILT2 y anti-ILT4 se midieron usando un sistema Biacore (GE Healthcare LifeSciences). Las mediciones de la constante de disociación en equilibrio (K<d>) se llevaron a cabo con anticuerpos purificados para evaluar su unión a ILT2 humano, a ILT4 humano y a ILT2 deM. mulatta.En resumen, el anticuerpo 27F9 anti-ILT2 purificado, los anticuerpos 47C8 y 48A5 anti-ILT4 y los anticuerpos 47H6, 51A1, 64A12, 73C4 y 73D1 anti-ILT2/ILT4 se capturaron en proteína A del chip sensor (GE HealthCare). La superficie de la proteína A del chip sensor Biacore consiste en una matriz de dextrano carboximetilado con una variante de proteína A recombinante adherida mediante enlaces covalentes. La ILT2-ECD humana soluble, ILT4-ECD humana o ILT2-ECDM. mulattase inyectaron a un caudal de 30 pl/min a 25 °C. Las proteínas ILT2 o ILT4 se usaron a concentraciones entre 1,6 nM y 200 nM en tampón PBS-P con diluciones de 2 veces. Los datos cinéticos se recopilaron a lo largo del tiempo y se ajustaron usando la ecuación de ajuste global simultánea para rendir constantes de afinidad (valores K<d>) para cada anticuerpo.
Los datos de unión se muestran en las tablas 9A y 9B.
Tabla 9A
Tabla 9B
Ejemplo 4
Análisis de secuencia de anticuerpos anti-ILT2, anti-ILT4 y anti-ILT2/ILT4
Se secuenciaron el anticuerpo anti-ILT2 27F9, los anticuerpos anti-ILT4 47C8 y 48A5 y los anticuerpos anti-ILT2/ILT447H6, 51A1,64A12, 73C4 y 73D1 y las secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera se divulgan en el presente documento y se resumen en la Tabla 10.
Tabla 10
Las CDR de la región variable de cadena pesada y cadena ligera para los anticuerpos individuales se divulgan en las tablas 1 -8 y como SEQ ID NO: 22-124.
Ejemplo 5
Generación de anticuerpos humanizados
Varios de los anticuerpos anti-ILT2/ILT4, es decir, 47H6, 64A12 y 73D1, se humanizaron mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Estos anticuerpos humanizados se denominan en el presente documento Hz47H6.v2, Hz64A12 y Hz73D1.v1, respectivamente. Durante el proceso de humanización del anticuerpo 47H6, la región variable de cadena pesada CDR2 se modificó de DFNPNNGGTTYNQKFEG (SEQ ID NO:71) a DFNPNNAGTTYNQKFEG (SeQ ID NO:118). La secuencia de la región variable de cadena pesada de Hz47H6.v2 es la SEQ ID NO: 133 y la secuencia de la región variable de cadena ligera de Hz47H6.v2 es la SEQ ID NO: 134; la secuencia de la región variable de cadena pesada de Hz64A12 es la SEQ ID NO: 139 y la secuencia de la región variable de cadena ligera de Hz64A12 es la SEQ ID NO: 140 y la secuencia de la región variable de cadena pesada de Hz73D1.v1 es la SEQ ID NO: 144 y la secuencia de la región variable de cadena ligera de Hz73D1.v1 es la SEQ ID NO: 145.
Las afinidades de unión de los anticuerpos humanizados a ILT2 humano y a ILT4 humano se midieron usando un sistema Biacore como se describe en el presente documento. Las afinidades de unión de los anticuerpos Hz47H6.v2, Hz64A12 y Hz73D1.v1 se muestran en la tabla 11 en comparación con los anticuerpos originales.
Tabla 11
Estos resultados demostraron que el proceso de humanización de los anticuerpos anti-ILT2/ILT4 ejemplares no tuvo un efecto significativo en las capacidades de unión de los anticuerpos a ILT2 humano o a ILT4 humano.
También se ensayó la reactividad cruzada de los anticuerpos humanizados anti-ILT2/ILT4 con ILT2 delM. fascicularis.Al igual que los anticuerpos anti-ILT2/ILT4, los anticuerpos anti-ILT2/ILT4 humanizados se unen a ILT2M. fascicularis.Las afinidades de unión de un clon ejemplar Hz73D1.v1 medidas mediante un sistema Biacore se muestran en la tabla 12. En el sistema Biacore, se capturó un anticuerpo humanizado anti-ILT2/ILT4 en un chip de proteína A. Las proteínas ILT se inyectaron a diferentes concentraciones en las celdas de flujo para evaluar los parámetros cinéticos a 25 °C. Se determinó que la afinidad de unión (K<d>) del Hz73D1.v1 a ILT2 y a ILT4 humanos era de 1,03 nM y 0,205 nM, respectivamente. Se determinó que la K<d>del Hz73D1.v1 a ILT2 deM. fascicularisera de 19,1 nM.
Tabla 12
Especies de ILT K<d>(nM) Kasociación (1/Ms) Kdisociación (1/s)
ILT2 humano 1,03 4,72 x 104 4,85 x 10-5
ILT4 humano 0,205 2,2 x 105 4,6 x 10-5
ILT2 deM. fascicularis19,1 3,4 x 106 0,06
Ejemplo 6
Expresión de ILT2 e ILT4 en subconjuntos de células inmunitarias
La expresión de ILT2 e ILT4 se ha descrito en varias células de origen hematopoyético, incluyendo células mieloides, granulocitos y linfocitos (Colonna M et al.J Exp Med.(1997) 1 de diciembre; 186 (11): 1809-1818; Colonna M et al.,J Immunol(1998), 160(7): 3096-3100). Los anticuerpos anti-ILT descritos en el presente documento se usaron para dilucidar aún más la expresión de ILT2 e ILT4 en subconjuntos de células inmunitarias humanas y deM. fascicularis.
El análisis de citometría de flujo de las células inmunitarias sanguíneas se realizó en PBMC humanas y deM. fascicularisy en sangre entera. Las PBMC se prepararon a partir de un leukopak (Allcells Inc.) mediante centrifugación a través de ficoll, lavando con PBS y congelando en tampón de crioconservación en nitrógeno líquido hasta su uso. Se obtuvo sangre entera (Allcells Inc.) fresca y se agotaron los glóbulos rojos (RBC) usando una solución de lisis de RBC de cloruro de amonio (Biolegend). Las muestras de sangre entera o PBMC se tiñeron con un panel de anticuerpos marcado con fluorescencia para distinguir varios subgrupos inmunitarios (monocitos, células B, células NK, células T CD4+ y CD8+, neutrófilos y eosinófilos). Las muestras se tiñeron además con los isotipos marcados con fluorescencia, 27F9 (específico para ILT2), 48A5 (específico para ILT4), 73D1 y Hz73D1.v1. El número de moléculas de ILT2 e ILT4 por célula de cada subconjunto inmunitario se estimó mediante incubación con microesferas Quantum Simply Cellular seguida de un análisis de citometría de flujo.
Como se muestra en la tabla 13 y la figura 1, se observó una alta expresión de ILT2 en monocitos, células B, un subconjunto de células NK (5-20 % de células NK totales) y un subconjunto de células T CD8+ (5-20 % de células T CD8+ totales). Se observó una alta expresión de ILT4 en monocitos, eosinófilos y neutrófilos. Los resultados mostraron que las células inmunitarias periféricas delM. fascicularisexpresan la proteína ILT2 con un nivel de expresión y distribución de células inmunitarias comparable con la combinación de ILT2 e ILT4 en la sangre periférica humana.
Tabla 13
Célula T CD8 Antígeno Monocito Neutrófilo Célula B<Célula NK>
(subconjunto)(subconjunto)
ILT2 humano 5,0 x 104 0 5,5 x 103
ILT4 humano 5,0 x 104 2,5 x 104 0 0 0
M. fascicularis
ILT21,3 x 105 5,0 x 104
Ejemplo 7
Inhibición de la interacción entre ILT2 o ILT4 y las moléculas del MHC I por parte de los anticuerpos anti-ILT
Como parte del proceso de caracterización, se evaluó la capacidad de los anticuerpos ejemplares para inhibir o bloquear la interacción de ILT2 o ILT4 con sus ligandos naturales en experimentos de competición usando un sistema Biacore. Como se describe en el presente documento, los ligandos naturales de ILT2 e ILT4 incluyen, entre otros, moléculas de HLA de clase I, incluidos HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E y HLA-G. El HLA-A*1101 biotinilado se capturó en grandes cantidades en la superficie de un chip de NeutraVidin. Los complejos antígeno-anticuerpo se prepararon con (i) anticuerpo anti-ILT2-ECD y anti-ILT2 27F9, anticuerpo anti-ILT4 48A5 o anticuerpo anti-ILT2/ILT4 Hz73D1.v1 y (i) anticuerpo anti-ILT4-ECD y anti-ILT2 27F9, anticuerpo anti-ILT4 48A5 o anticuerpo anti-ILT2/ILT4 Hz73D1.v1. La concentración de anticuerpos de cada anticuerpo se valoró entre 0,09-100 nM y la concentración de ILT2-ECD o ILT4-ECD humano se mantuvo constante a 20 nM. Los complejos se mezclaron en una microplaca de 96 pocillos y cada uno se inyectó en la superficie del chip recubierto con HLA-A. La señal medida (unidad de respuesta, RU) se representó gráficamente frente a la concentración de anticuerpos.
Los resultados se muestran en la figura 2. Se observó una disminución en la unión de ILT2 al HLA-A al aumentar las concentraciones del anticuerpo anti-ILT2 27F9 y del anticuerpo anti-ILT2/ILT4 Hz73D1.v1 de una manera dependiente de la dosis. Por el contrario, el anticuerpo 48A5 anti-ILT4 no tuvo ningún efecto sobre la unión de ILT2 al HLA-A. De manera similar, se observó una disminución en la unión de ILT4 al HLA-A al aumentar las concentraciones del anticuerpo anti-ILT4 48A5 y del anticuerpo anti-ILT2/ILT4 Hz73D1.v1, sin ningún efecto del anticuerpo anti-ILT2 27F9. Se observó que los anticuerpos inhibían las interacciones en las IC50 en el intervalo nanomolar. Se llevó a cabo otro conjunto de experimentos usando una superficie de chip revestida con HLA-G con resultados similares.
Estos datos demuestran que los anticuerpos anti-ILT2 y anti-ILT2/ILT4 descritos en el presente documento inhiben las interacciones entre ILT2 y sus ligandos naturales. Es más, los anticuerpos anti-ILT4 y anti-ILT2/ILT4 descritos en el presente documento inhiben las interacciones entre ILT4 y sus ligandos naturales. Es importante destacar que este experimento también mostró que el anticuerpo anti-ILT2/ILT4 no solo se unía a ambas dianas, es decir, ILT2 e ILT4, sino que era biológicamente funcional al bloquear las interacciones de ambas dianas con sus ligandos. Estos resultados muestran que los anticuerpos anti-ILT2/ILT4 pueden ser un agente terapéutico potencial para bloquear la supresión de las respuestas inmunitarias inducida por ILT2 e ILT4.
Ejemplo 8
Unión del anticuerpo anti-ILT2/ILT4 a las células
Se evaluó la unión de los anticuerpos anti-ILT2/ILT4 a los monocitos. La unión del ejemplo del anticuerpo anti-ILT2/ILT4 73D1 y la versión humanizada Hz73D1.v1 a la población de monocitos CD14+ de PBM<c>humanas y deM. fascicularisse determinó mediante análisis de citometría de flujo. En resumen, las PBMC humanas o deM. fascicularis(de 2 donantes cada una) se descongelaron, se lavaron en medios (RPMI, FBS al 10 %, L-glutamina, pen./estrep.) y se resuspendieron en medio fresco. Las PBMC se tiñeron con un cóctel de anticuerpos marcados para diferenciar entre los diferentes tipos de células. Se tiñeron 1 x 106 células/pocillo con el anticuerpo 73D1 o Hz73D1.v1 marcado con fluorescencia y se incubaron en hielo. Las células se lavaron con reactivos enfriados con hielo y se analizaron inmediatamente mediante citometría de flujo. La intensidad de fluorescencia media geométrica para los monocitos CD14+ se calculó para cada muestra. Como se muestra en la figura 3, se observó un aumento en la fluorescencia al aumentar las concentraciones de los anticuerpos 73D1 y Hz73D1.v1 tanto en células humanas como en células deM. fascicularis.Asimismo, la unión de los anticuerpos a las células humanas y a las células deM. fascicularisfue comparable. Por ejemplo, la concentración efectiva del 50 % (EC50) del Hz73D1.v1 fue de 8,8 nM con los monocitos humanos y de 1,8 nM con los monocitos deM. fascicularis.Las células teñidas con un anticuerpo de control no mostraron ningún cambio en la fluorescencia. Estos resultados demuestran que los anticuerpos anti-ILT2/ILT4 reconocen ILT2 y/o ILT4 en células intactas, es decir, monocitos primarios. Es importante destacar que estos resultados muestran que existe una unión comparable tanto a los monocitos humanos como a los monocitos deM. fascicularis,lo que sugiere que los monos serán un modelo adecuado para futuros estudios. Además, no se observó unión de los anticuerpos anti-ILT2/ILT4 descritos en el presente documento a monocitos y otras células inmunitarias de ratas y ratones, lo que confirma que los roedores no son una especie apropiada para las pruebas no clínicas.
Además de unirse a ILT2 e ILT4, los anticuerpos anti-ILT2/ILT4 muestran reactividad cruzada con LILRA1, pero no con IILLRB3, ILLRB4, ILLRB5, ILLRA2, ILLRA4, ILLRA5 e ILLRA6. La unión de los anticuerpos anti-ILT2/ILT4 a los miembros de la familia de ILT se evaluó mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) usando células 293T que expresan ILT2, ILT4, LILRA1, ILLRB3, ILLRB4, ILLRB5, ILLRA2, ILLRA4, ILLRA5 e ILLRA6, humanas y deM. fascicularis,respectivamente. Se ha demostrado que las afinidades de unión de un ejemplo de anticuerpo anti-ILT2/ILT4 Hz73D1.v1 con ILT2 humano, ILT4 humano, el LILRA1 humano y el LILRA1M. fascicularisexpresado en células 293T y medidas mediante citometría de flujo son de 1,2 nM, 1,4 nM, 2,64 nM y 1,97 nM, respectivamente.
Ejemplo 9
Inhibición de la interacción entre ILT2 o ILT4 y las moléculas del MHC I por parte de los anticuerpos anti-ILT
La capacidad de los anticuerpos anti-ILT2/ILT4 para inhibir la interacción entre las moléculas de ILT2 y/o ILT4 y MHC I se evaluó usando un sistema de células indicadoras. La estirpe celular Raji se estableció hace más de 50 años a partir de un linfoma de Burkitt y se ha demostrado que expresa moléculas MHC I y MHC II. La estirpe celular linfoblastoide (LCL) 721.221 es un mutante de la LCL 721 original, en donde la LCL 721.221 no expresa ninguna molécula del MHC I. Las células LCL 721.221 se transfectaron con la molécula no clásica HLA-G del MHC I y se estableció una estirpe celular estable, denominada en el presente documento 721.221 -HLA-G. Las células Raji o las células 721.221 -HLA-G se cocultivaron con células que expresaban un sistema indicador estable y un receptor de la superficie celular de interés (“células indicadoras”). En este sistema receptor quimérico, el dominio extracelular del receptor de interés (por ejemplo, ILT2 o ILT4) se fusiona con el dominio transmembrana/intracelular del PILRp, que se asocia a la proteína adaptadora DAP12. Cuando el receptor quimérico (por ejemplo, ILT2 o ILT-4) se activa uniéndose a un ligando (por ejemplo, la molécula MHC I), el DAP12 se fosforila y activa un promotor sensible al NFAT que impulsa la expresión de la GFP (véase, por ejemplo, Deng et al., 2014,Blood, 124:924-935).
Las células indicadoras ILT2 e ILT4 (que expresan ILT2 humano o ILT4 humano) se tiñeron con CellTracker Deep Red (ThermoFisher) para distinguirlas de las células Raji o 721.221-HLA-G tras el análisis. Las células indicadoras se lavaron después de la tinción y se resuspendieron a 1 x 106 células/ml en medio X-VIVO™ 15 (Lonza). Las células Raji o las células 721.221-HLA-G se lavaron y se resuspendieron en medio X-VIVO™ 15 a 1 x 106 células/ml. Para ensayos con células Raji: El anticuerpo anti-ILT227F9, el anticuerpo anti-ILT448A5, el anticuerpo anti-ILT2/ILT473D1 y Hz73D1.v1, y un anticuerpo de control se diluyeron en serie y se añadieron 50 pl a cada pocillo de una placa de cultivo celular de fondo plano de 96 pocillos. Para ensayos con células 721.221- HLA-G: el anticuerpo anti-ILT4 48A5, el anticuerpo anti-ILT2/ILT4 Hz73D1.v1, y un anticuerpo de control se diluyeron en serie y se añadieron 50 pl a cada pocillo de una placa de cultivo celular de fondo plano de 96 pocillos. Las células indicadoras que expresan ILT2 o que expresan ILT4 (100 pl/pocillo) se cocultivaron con células Raji o células 721.221-HLA-G (100 pl/pocillo). Las placas se incubaron durante la noche a 37 °C. Al día siguiente, las células indicadoras se ensayaron para determinar la expresión de GFP mediante FACS.
Como se muestra en la figura 4A, la expresión de la GFP se indujo cuando se expresó ILT2 o ILT4 en la superficie de las células indicadoras en presencia de células Raji. Con las células indicadoras que expresaban ILT2 en su superficie celular, se observó que una concentración creciente del anticuerpo 27F9 anti-ILT2 y del anticuerpo 73D1 anti-ILT2/ILT4 o Hz73D1.v1 inhibía la expresión de la GFP de una manera dependiente de la dosis (expresada como el porcentaje de células positivas para GFP). Se observó que el anticuerpo anti-ILT4 no tenía ningún efecto inhibidor. De manera similar, con células indicadoras que expresan ILT4 en su superficie celular, se observó que una concentración creciente del anticuerpo anti-ILT4 48A5 y del anticuerpo anti-ILT2/ILT4 73D1 o Hz73D1.v1, inhibía la expresión de la GFP de una manera dependiente de la dosis y el anticuerpo anti-ILT2 no tenía ningún efecto. Como se muestra en la figura 4B, la expresión de la GFP se indujo cuando se expresó ILT2 o ILT4 en la superficie de las células indicadoras en presencia de células 721.221- HLA-G. Con células indicadoras que expresaban ILT2 en su superficie celular, se observó que una concentración creciente del anticuerpo anti-ILT2/ILT4 Hz73D1.v1 inhibía la expresión de la GFP de una manera dependiente de la dosis. Con células indicadoras que expresaban ILT4 en su superficie celular, se observó que una concentración creciente del anticuerpo anti-ILT448A5 y el anticuerpo anti-ILT2/ILT4 Hz73D1.v1 inhibía la expresión de la GFP de una manera dependiente de la dosis. La tabla 14 muestra la IC50 del Hz73D1.v1 para bloquear la interacción de ILT2 humano, ILT4 humano y ILT2 deM. fasciculariscon las moléculas del MHC I en las células Raji. La tabla 15 muestra la IC50 del Hz73D1.v1 para bloquear la interacción de ILT2 humano, ILT4 humano con el HLA-G expresado en 721.221 células.
Tabla 14
Tabla 15
Estos resultados muestran que los anticuerpos anti-ILT2 o anti-ILT2/ILT4 son capaces de inhibir y/o bloquear la interacción funcional entre ILT2 y las moléculas del MHC I clásicas a un grado alto. Paralelamente, estos resultados muestran que los anticuerpos anti-ILT4 o anti-ILT2/ILT4 son capaces de inhibir y/o bloquear la interacción funcional entre ILT4 y las moléculas del MHC I clásicas y no clásicas (por ejemplo, HLA-G) a un grado alto. Estos resultados apoyan la idea de que un anticuerpo que se une a ILT2 e ILT4 modularía las vías inducidas por ambas moléculas. Por lo tanto, un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 puede ser un agente terapéutico más fuerte que un anticuerpo que se dirige solo a ILT2 o solo a ILT4.
Se efectuó un estudio adicional con células indicadoras que expresaban ILT2 deM. fascicularis.Como se describió anteriormente, las células indicadoras ILT2 deM. fascicularisse tiñeron con Cell Tracker Deep Red, se lavaron y se resuspendieron a 1 x 106 células/ml en medio X-VIVO™ 15 (Lonza). Las células Raji se lavaron y se resuspendieron en medio X-VIVO™ 15 a 1 x 106 células/ml. El anticuerpo anti-ILT2/ILT473D1 y Hz73D1.v1 y un anticuerpo de control se diluyeron en serie y se añadieron 50 pl a cada pocillo de una placa de cultivo celular de fondo plano de 96 pocillos. Las células indicadoras que expresaban ILT2 (100 pl/pocillo) se cocultivaron con células Raji (100 pl/pocillo). Las placas se incubaron durante la noche a 37 °C. Al día siguiente, las células indicadoras se ensayaron para determinar la expresión de GFP mediante FACS.
Como se muestra en la figura 5, la expresión de la GFP se indujo cuando se expresó ILT2/4 deM. fascicularisen la superficie de las células indicadoras en presencia de células Raji. En presencia de una concentración creciente del anticuerpo anti-ILT2/ILT4 73D1 o Hz73D1.v1, el porcentaje de células que expresan GFP disminuyó de una manera dependiente de la dosis. La tabla 14 muestra la IC50 del Hz73D1.v1 para bloquear la interacción de ILT2 deM. fasciculariscon las moléculas del MHC I en las células Raji. Estos resultados son una prueba más de que los monos serían un buen modelo para las pruebas.
Además del sistema de células indicadoras, se evaluó la actividad inhibidora de los anticuerpos anti-ILT2/ELT4 contra la interacción entre ILT2 y las moléculas de MHC I, y la interacción entre las moléculas de ILT4 y MHC I usando el sistema Biacore. El ILT2-Fc y ILT4-Fc humanos se usaron como receptores diana y su interacción con una molécula MHC-I ejemplar (HLA-A) se ensayó en presencia o ausencia de un anticuerpo ejemplar anti-ILT2/ILT4 Hz73D1.v1 a 25 °C. Los anticuerpos anti-ILT2 (clon 27F9) o ILT4 (clon 48A5) humanos se usaron como reactivos útiles para diseccionar las actividades de bloqueo específicas de ILT2 e ILT4. Los anticuerpos anti-IL2/ILT4 produjeron una reducción dependiente de la dosis en la interacción entre ILT2 y el HLA-A, así como entre ILT4 y el HLA-A. Las IC50 de los anticuerpos probados se muestran en la tabla 16.
Tabla 16
Ejemplo 10
Efecto de los anticuerpos anti-ILT sobre la actividad de las células NK
La NKL es una estirpe celular (NK) humana establecida a partir de la sangre periférica de un paciente con leucemia de linfocitos grandes (LGL) y proporcionada amablemente por el Dr. Louis Lanier. Como se divulga en el presente documento, las células NK expresan ILT2, pero generalmente no expresan ILT4. Se transfectaron 721.221 células con plásmidos que expresaban HLA-G o HLA-A*0201 y los contingentes de alta expresión se enriquecieron mediante selección con antibióticos, generando las estirpes celulares 721.221-HLA-G y 721.221 -A*0201. Las células 721.221-HLA-G (descritas en el presente documento) o las células 721.221 -HLA-A*0201 se usan como dianas en los ensayos con células citolíticas. Las células diana se marcaron con CellTracker Deep Red (ThermoFisher) para distinguirlas de las células NKL (después del cocultivo) y luego se resuspendieron a 5 x 105 células/ml en medios de ensayo (RPMI con FBS al 10 %, penicilina/estreptomicina, L-glutamina, suero humano al 5 % e IL-2 humana recombinante (rhIL-2) a 20 ng/ml).
Las células NKL se suspendieron a 7,5 x 106 células/ml en un medio de ensayo. Se prepararon diluciones en serie del anticuerpo anti-ILT2 27F9, el anticuerpo anti-ILT4 48A5, los anticuerpos anti-ILT2/ILT4 73D1 o Hz73D1.v1 y un anticuerpo de isotipo de control en el medio de ensayo y se añadieron 50 pl a los pocillos de una placa de 96 pocillos con fondo en V. Se añadieron células NKL (50 pl) a cada pocillo, seguidas de células diana (50 pl), lo que resultó en una relación de diana a NK de 1:15. Las placas se cultivaron durante 3,5 horas a 37 °C, seguidas de centrifugación a 360 x g durante 8 minutos a temperatura ambiente y eliminación del medio. Luego, las células se resuspendieron en PBS que contenía una dilución 1:1000 de Sytox Blue (ThermoFisher). Sytox Blue tiñe las células con membranas celulares comprometidas, lo que permite distinguir las células vivas de las células destruidas o dañadas. Las células se analizaron mediante FACS y el porcentaje de destrucción de las células diana se calculó basándose en el valor de un pozo de control positivo de las células diana permeabilizadas con detergente (lisis al 100 %).
Como se muestra en la figura 6, el anticuerpo anti-ILT227F9 y los anticuerpos anti-ILT2/ILT473D1 y Hz73D1.v1 mejoraron la actividad citolítica de las NK de una manera dependiente de la dosis. Los valores de EC50 para Hz73D1.v1 fueron de 2,4 nM para las células diana que expresaban HLA-G y de 0,13 nM para las células diana que expresaban HLA-A*0201. En comparación, la EC50 para 27F9 fue de 0,064 nM para las células diana que expresaban HLA-G. El anticuerpo 48A5 anti-ILT4 tuvo poco o ningún efecto sobre la actividad de las células NK. Estos resultados muestran que los anticuerpos anti-ILT2 y los anticuerpos anti-ILT2/ILT4 son capaces de bloquear la interacción funcional entre ILT2 en las células NK y las moléculas del MHC I en la superficie de las células diana, lo que lleva a la mejora de la actividad citolítica. Esto apoya la teoría de que los anticuerpos anti-ILT2/ILT4 podrían mejorar la destrucción de las células tumorales al inhibir la supresión de las células NK inducida por ILT2.
Se efectuaron experimentos similares usando células NK primarias humanas. En resumen, las células NK se aislaron de las PBMC mediante selección negativa, se lavaron en medios de ensayo (RPMI con FBS al 10 %, pen./estrep., suero humano al 5 %, rhIL-2 (40 ng/ml) e IL-15 (50 ng/ml)) y se resuspendieron a 7,5 x 106 células/ml en el medio de ensayo. Las células diana 721.221-HLA-G se marcaron con CellTracker Deep Red (ThermoFisher) y se resuspendieron a 5 x 105 células/ml en un medio de ensayo. Las células diana y las células NK (50 pl cada una) se combinaron en cada pocillo de una placa con fondo en V. Se añadieron a los pocillos el anticuerpo anti-ILT2 27F9, el anticuerpo anti-ILT4 48A5 o los anticuerpos anti-ILT2/ILT4 47H6, 73D1 o 64A12 a una concentración final de 1 pg/ml. Las placas se cultivaron durante la noche a 37 °C, seguido de centrifugación a 360 x g durante 8 minutos a temperatura ambiente y eliminación del medio. Luego, las células se resuspendieron en PBS que contenía una dilución 1:1000 de Sytox Blue (ThermoFisher). Las células se analizaron mediante FACS y el porcentaje de destrucción de las células diana se calculó basándose en el valor de un pozo de control positivo de las células diana permeabilizadas con detergente (lisis al 100 %).
Como se muestra en la figura 7, la presencia del anticuerpo anti-ILT227F9 o de los anticuerpos anti-ILT2/ILT4 47H6, 73D1 y 64A12, aumentó la destrucción por parte de las células NK primarias. De acuerdo con otros experimentos descritos en el presente documento, estos resultados muestran que ILT2 media la supresión de las células NK primarias y esta supresión puede revertirse con anticuerpos antagonistas que inhiben o bloquean las interacciones ILT2/MHC I.
Se realizaron experimentos adicionales para evaluar la actividad citolítica de las células NK mediante el análisis de la expresión del CD137, un marcador que se regula positivamente en las células NK durante la citólisis. Las células NK se aislaron de las PBMC y se cultivaron con una estirpe celular K562 transfectada para expresar la molécula no clásica HLA-G del MHC-I. La actividad citolítica de las células NK se evaluó mediante un análisis FACS de la expresión del marcador de activación CD137, centrándose en la población de NK CD3 negativos y CD56 positivos. La tinción con CD57 se realizó para enriquecer las células NK de memoria (adaptativas) conocidas por expresar preferiblemente ILT2 (Lopez-Verges S et al,Proc. Natl. Acad. Sci.(2011), 108 (36) 14725-14732). El CD137 se regula al alza en las células NK durante la citólisis, lo que proporciona una medida sustituta de la destrucción celular. El Hz73D1.v1 o el anti-ILT2 (27F9), pero no el anti-ILT4 (48A5), aumentaron significativamente la población de CD137+ (Figura 8). Este efecto fue más pronunciado en la población de células NK con memoria CD57+. Estos datos sugieren que los anticuerpos anti-IL2/ILT4 son capaces de bloquear la interacción de ILT2 en las células NK primarias con el MHC-I en las células diana, lo que conduce a una mayor activación y actividad citolítica.
Para evaluar la actividad de los anticuerpos anti-IL2/ILT4 en la destrucción de las células diana que expresan de forma natural el HLA-A/B/C (MHC-I clásico), se realizó un ensayo de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Las células NK se aislaron de las PBMC y se cultivaron con la estirpe celular de carcinoma de células escamosas CAL-27, que expresaba contenidos altos de HLA-A, HLA-B, HLA-C y el ligando NKG2A HLA-E (datos no mostrados). Se añadió un anticuerpo anti-EGFR para inducir la ADCC de estas células EGFR+ CAL-27. El CD137 se regula al alza en las células NK durante la citólisis, lo que proporciona una medida sustituta de la destrucción celular. El Hz73D1.v1 o el anti-ILT2 27F9, pero no el anti-ILT4 48A5, aumentaron significativamente el porcentaje de células NK CD137+ en la población CD57+ (Figura 9). En comparación, un anticuerpo anti-NKG2A aumentó significativamente el porcentaje de CD137+ en la población con CD57-, pero no en la población con CD57+. Ambos anticuerpos indujeron un aumento comparable de la activación (Hz73D1.v1 aumentó 1,8 veces el porcentaje de células CD137+, mientras que el anticuerpo anti-NKG2A aumentó 2,1 veces el porcentaje de células CD137+). Un anticuerpo anti-KIR2DL no mostró actividad en este ensayo. Estos datos sugieren que los anticuerpos anti-ILT2/ILT4 son capaces de bloquear la interacción de ILT2 en las células NK primarias con el MHC-I clásico en las células diana, lo que conduce a una mayor activación y actividad citolítica de las células NK.
Ejemplo 11
Efecto de los anticuerpos anti-ILT sobre la actividad de las MDSC en el ensayo MLR.
Se ha demostrado que las células depresoras derivadas de mieloides (MDSC) son fundamentales para regular las respuestas inmunitarias al suprimir las células presentadoras de antígenos (APC) y las células T. Asimismo, se ha observado que tienen un efecto negativo sobre la actividad antitumoral de las células inmunitarias. El efecto de los anticuerpos anti-ILT sobre la actividad de las MDSC se investigó mediante un ensayo de reacción linfocítica mixta (MLR). Para generar células similares a MDSC, se cultivaron monocitos periféricos humanos en medios X-VIVO™ 15 preacondicionados (Lonza). Los medios preacondicionados se generaron mediante cultivo con la estirpe celular OVISE. La estirpe celular OVISE es un adenocarcinoma de células claras de ovario que secreta una gran cantidad de factores en su medio de crecimiento. Los monocitos se cultivaron en medios que consistían en un 50 % de medio acondicionado con OVISE y un 50 % de X-VIVO™ 15 fresco durante 5 días; las células similares a las MDSC resultantes se denominan ovMDSC. Estas células similares a las MDSC muestran características funcionales de las MDSC, incluyendo el aumento de Arg1 e IDO y la supresión de la proliferación de células T y las citocinas proinflamatorias en los ensayos de MLR (reacción linfocítica mixta) en comparación con las células dendríticas derivadas de monocitos (datos no mostrados). Como control positivo para los ensayos, se generaron células dendríticas derivadas de monocitos (moCD) mediante el cultivo de monocitos periféricos humanos con GM-CSF e IL-4 durante 5 días. Para realizar el ensayo MLR, se cocultivaron 1 x 105 células T alogénicas con 2,5 x 104 ovMDSCo moCD en una placa de cultivo celular de fondo redondo de 96 pocillos. Las células se cocultivaron en presencia del anticuerpo anti-ILT2 27F9, el anticuerpo anti-ILT4 48A5, los anticuerpos anti-ILT2/ILT447H6 o 73D1, o un anticuerpo de control de isotipo (cada uno a 10 pg/ml). Los controles incluyeron solo células T, solo moCD, moDC con células T (MLR positiva), solo ovMDSC y ovMDSC con células T. Las células se incubaron a 37 °C y, después de 5 días, se añadieron 50 pl de medio que contenía 3H-timidina a cada pocillo. Después de 18 horas de incubación, las células de cada pocillo se recogieron y analizaron para determinar la incorporación de timidina como marcador de proliferación, y los sobrenadantes se analizaron para determinar la secreción de citocinas mediante una matriz de perlas múltiples.
Como se muestra en la figura 10, la proliferación de células T se suprimió mediante el cocultivo con ovMDSC. La presencia del anticuerpo 48A5 anti-ILT4 y de los anticuerpos 47H6 y 73D1 anti-ILT2/ILT4 aumentó la proliferación de células T cultivadas con ovMDSC hasta un nivel equivalente a la respuesta MLR de las células T con moDC. El anticuerpo anti-ILT2 27F9 no mostró capacidad para mejorar la proliferación de células T.
Se estableció otro ensayo de MLR, en donde se cocultivaron 1 x 105 células T alogénicas con 2,5 x 104 ovMDSC en una placa de cultivo celular de 96 pocillos de fondo redondo. Las células se cocultivaron en presencia de diluciones en serie del anticuerpo anti-ILT2 27F9, el anticuerpo anti-ILT4 48A5, los anticuerpos anti-ILT2/ILT473D1 o Hz73D1.v1, o un anticuerpo de isotipo de control. Las células se incubaron a 37 °C y, después de 5 días, se recogieron 50 pl de sobrenadante de cada pocillo para el análisis de citocinas usando un sistema Luminex. Posteriormente, se añadieron 50 pl de medio que contenía 3H-timidina a cada pocillo. T ras 18 horas de incubación, se recogieron las células de cada pocillo y se analizaron para determinar la incorporación de timidina.
De manera similar a los resultados descritos anteriormente, se demostró que el anticuerpo anti-ILT448A5 y los anticuerpos anti-ILT2/ILT4 73D1 y Hz73D1.v1 aumentaron la proliferación de células T (figura 11A). Es más, se determinó que la secreción de TNF-a y la secreción de GM-CSF aumentaron de manera dependiente de la dosis en presencia de anticuerpos anti-ILT4 y anti-ILT2/ILT4 (figura 11B-11C). Como en el experimento previo, no se observó ningún efecto con los anticuerpos anti-ILT2.
Estos resultados muestran que los anticuerpos anti-ILT4 y anti-ILT2/ILT4 son capaces de inhibir y/o bloquear la interacción funcional entre ILT4 en las MDSC y las moléculas del MHC I en las células vecinas (por ejemplo, las APC), lo que lleva a la reversión de la supresión de las MDSC y a la mejora de la activación de las células T. La reversión de la supresión inducida por MDSC también parece conducir a un aumento de la secreción de citocinas proinflamatorias como el TNF-a y el GM-CSF.
Ejemplo 12
Efecto de los anticuerpos anti-ILT2/4 sobre la estimulación celular mediada por LPS
El lipopolisacárido (LPS) estimula las respuestas inmunitarias innatas en las células mieloides a través de los receptores tipo Toll 2 y 4 (TLR2 y TLR4). Para determinar si los anticuerpos anti-ILT2 y/o anti-ILT4 pueden potenciar la estimulación mediada por LPS, se realizó un ensayo de PBMC/LPS. En resumen, las PBMC humanas congeladas se descongelaron, se lavaron en medios (RPMI con FBS al 10 %, L-glutamina y pen./estrep.) y se contaron. El anticuerpo anti-ILT2 27F9, el anticuerpo anti-ILT4 48A5, el anticuerpo anti-ILT2/ILT4 73D1 y Hz73D1.v1, y un anticuerpo de isotipo de control se diluyeron en serie y se añadieron 50 pl de medio a cada pocillo de una placa de cultivo tisular de fondo plano de 96 pocillos. Se añadieron PBMC a razón de 1 x 106 células/ml en un volumen de 100 pl y la placa se incubó a 37 °C durante 30 minutos. Se añadió LPS a 50 pl de medio (concentración final de 30 ng/ml) y la placa se incubó a 37 °C durante 2 días. Los sobrenadantes celulares se retiraron para el análisis de las citocinas usando un sistema Luminex®.
Como se muestra en la figura 12, la presencia de anticuerpos anti-ILT4 y anti-ILT2/ILT4 dio como resultado un aumento de la producción de GM-CSF y TNFa de una manera dependiente de la dosis. Por ejemplo, los valores de EC50 del Hz73D1.v1 fueron de 0,76 nM para la secreción de TNFa y de 1,5 nM para la secreción de GM-CSF. El anticuerpo 27F9 anti-ILT2 y el anticuerpo de control mostraron poca secreción de GM-CSF y TNFa (alrededor de 20 a 40 pg/ml). Estos resultados muestran que la expresión de ILT4 en células mieloides en el cultivo de PBMC puede suprimir fuertemente la producción de citocinas proinflamatorias inducida por el LPS y, lo que es más importante, que la supresión puede revertirse inhibiendo y/o bloqueando las interacciones ILT4/MHC I.
Se estableció un experimento similar usando PMBC deM. fascicularis.En resumen, las PBMC deM. fascicularisse lavaron en medios (RPMI con FBS al 10 %, L-glutamina y pen./estrep.) y se contaron. El anticuerpo anti-ILT2/ILT4 Hz73D1.v1 o un anticuerpo de control se diluyó en serie en el medio y se añadieron 50 pl a cada pocillo de una placa de cultivo tisular de fondo redondo de 96 pocillos. Se añadieron las PMBC a razón de 2 x 106 células/ml en 100 pl y las placas se incubaron a 37 °C durante 30 minutos. Se añadió LPS a 50 pl de medio (concentración final de 50 ng/ml) y las placas se incubaron a 37 °C durante 2 días. Los sobrenadantes celulares se retiraron para el análisis de las citocinas usando un sistema Luminex®.
De manera similar a los resultados con las PBMC humanas, el anticuerpo anti-ILT2/4 Hz73D1.v1 mejoró la secreción de GM-CSF por parte de las PBMC deM. fascicularis(Figura 13). Se determinó que la EC50 era de 14 nM. Estos resultados muestran que los anticuerpos anti-ILT2/ILT4 tenían un efecto biológico similar en las células inmunitarias deM. fascicularisy en las células inmunitarias humanas.
Para evaluar más a fondo el efecto de los anticuerpos anti-ILT en las células implicadas en la supresión de las respuestas inmunitarias a las células tumorales, se estableció un ensayo de LPS con células dendríticas tolerogénicas (tolDC). En resumen, los monocitos humanos aislados se colocaron en placas de cultivo tisular de 10 cm a razón de 4 x 106 células/placa en un volumen de 20 ml de medio (medio X-VIVO™ 15 (Lonza) complementado con 50 ng/ml cada uno de GM-CSF e IL-4 recombinantes (Peprotech)). Los monocitos se incubaron durante 5-7 días a 37 °C y luego se recogieron las células. Para el ensayo, las DC generadasin vitrose suspendieron en medio fresco que contenía una dilución 1:50 de Fc Block (Biolegend) a una concentración de 6 x 105 células/ml. Las DC se sembraron en placas de cultivo tisular de 96 pocillos a 50 pl/pocillo y se añadieron el anticuerpo anti-ILT4 48A5, el anticuerpo anti-ILT2/ILT4 Hz73D1.v1 o un anticuerpo de control en diluciones seriadas a 50 pl/pocillo. Se añadió LPS (concentración final de 6 pg/ml) junto con uno de una variedad de agentes tolerantes en un volumen de 50 pl de medio. Los agentes tolerantes incluían: vitamina D3/dexametasona (VitD3/dex) a 100 nM y 10 nM, respectivamente, ciclosporina A a 750 ng/ml, rapamicina a 100 ng/ml, prostaglandina E2 (PGE2) a 1 pg/ml, IL-6 a 20 ng/ml, IL-10 a 20 ng/ml o TGFa a 20 ng/ml. Las placas se incubaron a 37 °C durante 2 días y los sobrenadantes se recogieron para su análisis usando un sistema Luminex®.
Como se muestra en la figura 14, los anticuerpos anti-ILT4 y anti-ILT2/ILT4 mejoraron la secreción de citocinas mediada por LPS (por ejemplo, TNFa) de una manera dependiente de la dosis. Los valores de EC50 de la secreción de TNFa inducida por Hz73D1.v1 en presencia de LPS y un agente tolerante adicional se muestran en la tabla 17. Por el contrario, no hubo un aumento del TNF-a en las tolDC tratadas con un anticuerpo de control y un anticuerpo anti-ILT2 (datos no mostrados). Estos datos muestran que las tolDC presentes en el tumor de un paciente responderían a la reactivación por la presencia de anticuerpos anti-ILT4 y/o anti-ILT2/ILT4 que inhiben o bloquean las interacciones entre las moléculas de ILT4 y MHC I.
Tabla 17
Ejemplo 13
Efecto de los anticuerpos anti-ILT sobre la estimulación de las PBMC por HMGB1, STING y/o anti-CD3
La proteína B1 del grupo de alta movilidad (HMGB1) es una proteína nuclear que las células pueden liberar y unirse a los TLR. Se ha demostrado que la HMGB1 está presente en altas concentraciones en el tejido tumoral necrótico, lo que proporciona una fuente potencial de estimulación innata de las DC, los monocitos y los macrófagos que se infiltran en el tumor (véase, por ejemplo, Guerriero et al., 2011,J. Immunol.,186:3517-3526). Los experimentos se diseñaron para determinar si los anticuerpos anti-ILT podían mejorar la secreción de citocinas proinflamatorias de las PBMC tratadas con HMGB1. En resumen, el anticuerpo anti-ILT2 27F9, el anticuerpo anti-ILT448A5, el anticuerpo anti-ILT2/ILT447H6, 73D1 y 64A12, y un anticuerpo de isotipo de control se diluyeron en serie y se añadieron 50 pl de medio a cada pocillo de una placa de cultivo tisular de fondo redondo de 96 pocillos. Se añadieron PBMC a razón de 1 x 106 células/ml en un volumen de 100 pl y la placa se incubó a 37 °C durante 30 minutos. Se añadió HMGB1 recombinante (Biolegend) a una concentración de 2,5 pg/ml (una concentración que se prevé que esté presente en el microambiente de un tumor) y la placa se incubó a 37 °C durante 2 días. Los sobrenadantes celulares se retiraron para el análisis de las citocinas usando un sistema Luminex®.
Como se muestra en la figura 15, el anticuerpo anti-ILT4 48A5 y los anticuerpos anti-ILT2/ILT4 47H6, 73D1 y 64A12 mejoraron la secreción de TNF-a. Estos datos muestran que los anticuerpos anti-ILT4 y anti-ILT2/ILT4 mejorarán la función proinflamatoria de los monocitos infiltrantes dentro de un tumor.
De manera similar, la necrosis de las células tumorales y/o la muerte de las células tumorales por radioterapia dan como resultado la liberación de ADN nuclear. El ADN nuclear libre puede provocar la estimulación de las células mieloides mediante la señalización STING (estimulador de los genes del interferón). Los experimentos se diseñaron para determinar si los anticuerpos anti-ILT podían mejorar la producción de citocinas inflamatorias de las PBMC tratadas con agonista de STING. En resumen, las PBMC se colocaron en placas de cultivo tisular de fondo redondo de 96 pocillos y se añadieron el anticuerpo anti-ILT227F9, el anticuerpo anti-ILT448A5 y un anticuerpo de isotipo de control. Tras una incubación de 30 minutos, se añadió el agonista de STING 2'3'-CGAMP (Invivogen) a una concentración de 10 pg/ml (una concentración que se prevé que esté presente en el microambiente de un tumor necrótico). Las células se incubaron durante dos días y los sobrenadantes se analizaron usando un sistema Luminex®.
Como se muestra en la figura 16, el ejemplo del anticuerpo anti-ILT448A5 mejoró la secreción de IFNy, TNF-a e IL-1 p. Estos datos muestran que los anticuerpos anti-ILT4 y anti-ILT2/ILT4 mejorarán la función proinflamatoria de los monocitos infiltrantes dentro de un tumor.
Además de la supresión de los activadores inmunitarios innatos, ILT2 o ILT4 pueden desempeñar un papel en la supresión de la estimulación de las células mieloides mediada por células T. Para evaluar la estimulación de las células mieloides por parte de las células T, se activaron las PBMC con un anticuerpo anti-CD3 e IL-2 recombinante. En resumen, el anticuerpo anti-ILT2 27F9, el anticuerpo anti-ILT4 48A5, el anticuerpo anti-ILT2/ILT447H6 y 64A12, y un anticuerpo de isotipo de control se diluyeron en serie y se añadieron 50 pl de medio a cada pocillo de una placa de cultivo tisular de fondo redondo de 96 pocillos. Se añadieron PBMC a razón de 1 x 106 células/ml en un volumen de 100 pl y la placa se incubó a 37 °C durante 30 minutos. Se añadió el clon HIT3a del anticuerpo anti-CD3 (eBioscience) a una concentración de 10 ng/ml y se añadió IL-2 recombinante a una concentración de 100 U/ml (Peprotech). Las células se incubaron durante dos días y los sobrenadantes se analizaron usando un sistema Luminex®.
Como se muestra en la figura 17, el anticuerpo anti-ILT448A5 y los anticuerpos anti-ILT2/ILT447H6 y 64A12 mejoraron la secreción de TNF-a de una manera dependiente de la dosis. El anticuerpo 27F9 anti-ILT2 no tuvo ningún efecto sobre la producción de citocinas. Estos datos muestran que el bloqueo de ILT4 mejora la respuesta inmunitaria (es decir, la secreción de citocinas proinflamatorias) como resultado de la interacción entre las células T activadas y las células mieloides.
Ejemplo 14
Efecto de los anticuerpos anti-ILT sobre la fagocitosis de los macrófagos
Se realizaron ensayos de fagocitosis para caracterizar además el efecto de los anticuerpos anti-ILT2, anti-ILT4 y anti-ILT2/ILT4 sobre las funciones de los macrófagos. Los macrófagos se generaron mediante el cultivo de monocitos aislados en un medio (RPMI con FBS al 10 %, L-glutamina y pen./estrep.) que contenía 50 ng/ml de M-CSF recombinante (Peprotech) durante 5 días a 37 °C en placas de cultivo tisular de 12 pocillos. Los macrófagos se retiraron de la placa con un raspador celular y se colocaron en placas a 20000 células/pocillo en un medio de 100 pl en una placa de cultivo tisular de 96 pocillos de fondo plano. Los macrófagos se incubaron durante la noche a 37 °C. Al día siguiente, se añadió el anticuerpo a los macrófagos a una concentración de 2,5 pg/ml junto con 2,5 pg/ml de anticuerpo anti-CD47 para inducir la fagocitosis dependiente de los anticuerpos. Las células Raji se tiñeron durante 1 hora con una dilución 1:4000 de pH Rodo Red Dye (Essen Bioscience), se lavaron en un medio y se añadieron a 50 000 células/pocillo a los macrófagos. La fagocitosis se midió mediante la fluorescencia roja media en una máquina Incucyte a intervalos de 45 minutos. El anticuerpo de prueba se comparó con el anticuerpo de control de isotipo en el punto de tiempo máximo de respuesta (3 horas).
Como se muestra en la figura 18, los anticuerpos anti-ILT2/ILT4 (por ejemplo, Hz73D1.v1) y los anticuerpos anti-ILT2 (por ejemplo, 27F9) mejoraron la actividad fagocítica de los macrófagos contra las células tumorales de Raji opsonizadas con el anticuerpo anti-CD47. Los anticuerpos anti-ILT4 (por ejemplo, 48A5) no tuvieron ningún efecto sobre la fagocitosis por parte de los macrófagos. Para controlar la expresión de ILT2 por parte de las células Raji, se usó el anticuerpo 24E7, un aglutinante de ILT2 incapaz de bloquear la interacción de MHC-I. Estos datos muestran que los anticuerpos anti-ILT2 y anti-ILT2/ILT4 son capaces de mejorar la fagocitosis de los macrófagos al bloquear la interacción de ILT2 de los macrófagos con MHC-I en las células tumorales e inhibir la supresión de los macrófagos inducida por ILT-2, aumentando así la fagocitosis de macrófagos de los tumores. Esta actividad de los anticuerpos anti-ILT2 y anti-ILT2/ILT4 es específica para bloquear la interacción ILT2/MHC-I, pero no la interacción ILT4/MHC-1 a pesar de la expresión de ILT4 en los macrófagos.
Ejemplo 15
Efecto de los anticuerpos anti-ILT en las células dendríticas
Se cree que ILT2 y/o ILT4 actúan como depresores de la activación de las células mieloides y que la inhibición o el bloqueo de ILT2 y/o ILT4 inhibiría la supresión inducida por ILT2 y/o ILT4.
La activación de las células mieloides se puede lograr mediante la reticulación de los receptores Fc (FcR) en la superficie celular y la reticulación da como resultado la producción de citocinas; esto se usa como base para un ensayo de activación de células mieloides. Las células dendríticas se generaron como se describe en el presente documento. En resumen, los monocitos humanos aislados se colocaron en placas de cultivo tisular de 10 cm a razón de 4 x 106 células/placa en un volumen de 20 ml de medio (Lonza) complementado con 50 ng/ml cada uno de GM-CSF e IL-4 recombinantes (Peprotech)). Los monocitos se incubaron durante 5-7 días a 37 °C y se recogieron las células dendríticas resultantes. Las placas ELISA de 96 pocillos Maxisorp se recubrieron con anticuerpo anti-KLH (5 pg/ml) y se incubaron durante la noche a 4 °C. El anticuerpo anti-KLH contiene un dominio Fc capaz de unirse a los receptores Fc en las células dendríticas. Las placas se lavaron y se bloquearon con el medio X-VIVO™ 15 durante una hora. Se añadieron células dendríticas a razón de 7 x 104 células/pocillo. Se añadieron el anticuerpo anti-ILT2 27F9, el anticuerpo anti-ILT4 48A5, una combinación de anticuerpos 27F9 y 48A5, el anticuerpo anti-ILT2/ILT4 Hz73D1.v1 o un anticuerpo de control en diluciones en serie y las placas se incubaron a 37 °C durante 2 días. Los sobrenadantes se recogieron y se analizaron para determinar la secreción de TNF-a usando un sistema Luminex®.
Como se muestra en la figura 19, una combinación del anticuerpo anti-ILT227F9 y el anticuerpo anti-ILT448A5 y el anticuerpo anti-ILT2/ILT4 73D1 mejoró la secreción de TNF-a de las células dendríticas de una manera dependiente de la dosis. El anticuerpo 27F9 anti-ILT2 como agente único y el anticuerpo 48H6 anti-ILT4 como agente único tuvieron solo un efecto pequeño en el aumento de la producción de citocinas. Así, el fuerte aumento en la secreción de citocinas por la combinación del anticuerpo anti-ILT2 27F9 con el anticuerpo anti-ILT4 48A5 fue sorprendente. Esta respuesta se reflejó con el anticuerpo anti-ILT2/ILT4 de doble unión Hz73D1.v1. Estos datos muestran que tanto ILT2 como ILT4 inhiben la activación de las células dendríticas mediada por el receptor Fc y que estos efectos no son redundantes. Estos datos muestran que la inhibición de la supresión de las células dendríticas con agentes que se dirigen tanto a ILT2 como a ILT4 (es decir, un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 de doble unión) puede resultar en un efecto terapéutico mucho mejor que el tratamiento con anticuerpos monoespecíficos.
Ejemplo 16
Efecto de los anticuerpos anti-ILT sobre la secreción de citocinas de las células sanguíneas humanas y deM. fascicularis
Para investigar la posible toxicidad relacionada con la liberación de citocinas (es decir, una “hipercitocinemia”), se cultivaron una variedad de anticuerpos con células sanguíneas humanas o deM. fascicularisy se analizó la producción de citocinas. En resumen, los anticuerpos se añadieron a 10 pg/ml a placas de fondo plano de 96 pocillos y se agitaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Los anticuerpos probados incluyeron el anticuerpo anti-ILT4 48A5, los anticuerpos anti-ILT2/ILT4 47H6, 73D1 y Hz73D1.v1, el anticuerpo superagonista anti-CD28 clon 5D10 (Ancell), el anticuerpo policlonal anti-ILT2 (R&D Systems), el anticuerpo policlonal anti-ILT4 (R&D Systems), el anticuerpo anti-LILRA1 (R&D Systems), el anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo de control. Las placas se lavaron y se bloquearon con medios de cultivo (RPMI con FBS al 10 %, L-glutamina y pen./estrep.) durante 1 hora con agitación. La sangre se obtuvo de donantes humanos sanos yM. fascicularis.Los glóbulos rojos se extrajeron de la sangre mediante lisis en tampón de lisis RBC (eBioscience), seguida de centrifugación, y las células restantes se lavaron con medios de cultivo. Se añadieron 5 x 105 células por pocillo, se añadió LPS para replicar los pocillos como control positivo, y las placas se incubaron a 37 °C durante 24 horas. Los sobrenadantes se recogieron y se ensayaron para determinar la secreción de citocinas usando un sistema Luminex®.
Como se muestra en la figura 20, la incubación de células sanguíneas humanas con LPS soluble o anticuerpo anti-CD28 recubierto en placa indujo un aumento significativo en muchas citocinas, incluidos TNF-a, GM-CSF, MIP-1a, IL-6, IL-1 p e IL-10. Por el contrario, el anticuerpo policlonal anti-ILT2, el anticuerpo policlonal anti-ILT4, el anticuerpo anti-LILRA1, el anticuerpo anti-ILT448A5 y los anticuerpos anti-ILT2/ILT4 73D1 y Hz73D1.v1 no lograron inducir contenidos de citocinas por encima del de anticuerpo de control de isotipo en las células sanguíneas humanas. Como se muestra en la figura 21, la incubación de células sanguíneas deM. fasciculariscon LPS soluble indujo un aumento significativo de citocinas como TNF-a, IL-1 p, MIP-1a, IL-6 y MIP-1 p. Al igual que en el ensayo con células sanguíneas humanas, los anticuerpos policlonales anti-ILT2, los anticuerpos policlonales anti-ILT4, los anticuerpos anti-LILRA1, los anticuerpos anti-CD3 y los anticuerpos anti-ILT2/ILT4 47H6, 73D1 y Hz73D1.v1 no lograron inducir contenidos de citocinas por encima del contenido observado con el anticuerpo de control de isotipos de las células sanguíneas deM. fascicularis.Estos datos muestran que el potencial de los anticuerpos anti-ILT2, ILT-4 y anti-ILT2/ILT4 para producir una respuesta inmunitaria tóxica, como una hipercitocinemia, es bajo.
Se realizó otro ensayo de liberación de citocinasin vitropara evaluar la capacidad de los anticuerpos anti-ILT2/ILT4 para inducir las citocinas proinflamatorias IL-2, TNF-a, IL-6 e IFN-y. Se usaron muestras de sangre completa de 10 donantes sanos. Los anticuerpos anti-ILT2/ILT4 se compararon con varios controles positivos y negativos. Se usó un anticuerpo de control del isotipo anti-KLH como control negativo. Se usó un anticuerpo anti-CD28 superagonista (clon ANC28.1) como control positivo (Walker 2011). Es más, la enterotoxina B del estafilococo (SEB) se usó como control positivo para los cultivos de anticuerpos solubles. Se usaron dos formatos de ensayo. En el primer formato, las células se cultivaron con un anticuerpo (Hz73D1.v1, un anticuerpo de control de isotipo o un anticuerpo anti-CD28) o SEB a concentraciones crecientes. Los anticuerpos se probaron a 0,1 pg/ml, 1 pg/ml, 10 pg/ml y 100 pg/ml. El SEB se probó a 0,01 pg/ml, 0,1 pg/ml y 1 pg/ml. En el segundo formato, las placas de cultivo tisular de 96 pocillos se preincubaron con un anticuerpo durante la noche a 4 °C, se lavaron y luego se añadieron las células y se cultivaron. Luego, se recogió el sobrenadante del cultivo celular y se probó para determinar los contenidos de citocinas mediante un ensayo citométrico de matriz de perlas.
En el primer formato de ensayo, la SEB a 1 pg/ml indujo contenidos altos de todas las citocinas evaluadas (IL-2, IL-6, TNFa e IFNy), con contenidos de citocinas superiores al control de isotipo en los 10 donantes. El anticuerpo anti-CD28 soluble a 100 pg/ml indujo contenidos de citocinas superiores al del control de isotipo para la IL-6, el TNFa y el IFNy. Los valores medianos con Hz73D1.v1 fueron comparables con los del control de isotipo (Tabla 18). En el segundo formato de ensayo, el control positivo del anti-CD28 recubierto en placa (100 pg/ml) indujo IL-6 en 5 de los 10 donantes. Por el contrario, el Hz73D1.v1 recubierto con placas no indujo ninguna de las 4 citocinas a un contenido superior al del control de isotipo (Tabla 19).
Tabla 18
Anti-CD28 (pg/ml) SEB (pg/ml) Isotipo (pg/ml) Hz73D1.v1 (pg/ml)
10 100 0,1 1 10 100 10 100
IL-6 1115 8934 571 1422 7 5 3 6
IL-2 44 48 1309 3418 19 21 17 20
TNFa 52 605 614 1452 4 7 6 10
IFN-y 35 343 208 704 5 6 5 5
Tabla 19
Anti-CD28 (pg/ml) Isotipo (pg/ml) Hz73D1.v1 (pg/ml)
10 100 10 100 10 100
IL-6 17 93 10 9 9 7
IL-2 33 45 40 38 28 32
TNFa 18 26 17 19 16 12
IFN-y 12 21 13 13 12 14
Ejemplo 17
Efecto de los anticuerpos anti-ILT sobre la actividad de las células T
Se sabe que la expresión de ILT2 se enriquece en una población de células T CD45RA+ CD8+ de memoria efectora (células Temra CD8+) (Gustafson 2017). Esta población es solo una pequeña proporción de células T CD8+ en donantes sanos, lo que dificulta los ensayos de destrucción masiva de células T CD8+. Por lo tanto, para caracterizar la actividad citolítica de las células T CD8 de ILT2+, las células T CD8+ primarias se transdujeron con ILT2 y se expandieronin vitropara generar un número suficiente de células T CD8+ de ILT2+. La actividad citolítica se evaluó luego en un ensayo de destrucción de células T CD8+ usando células diana 721.221 -HLA-G marcadas con fluorescencia. En resumen, las PBMC congeladas se descongelaron, se lavaron en medio (RPMI con FBS al 10 %, L-glutamina y pen./estrep.) y las células T CD8+ se aislaron usando un kit de criba positiva de células T CD8+. Las células T CD8+ aisladas se cultivaron en medios básicos (medio Xvivo15 con HEPES 10 mM, glutamina 2 mM, pen./estrep. y suero humano normal al 5 %) y se estimularon durante 24 horas a 37 °C con perlas CD3/28 añadiendo 5 pl de perlas por millón de células. Las células T activadas (2 x 105) se recogieron luego y se resuspendieron en 1 ml de Lentivirus que expresaba ILT2 humano a una concentración vírica de 1 x 107 UFP/ml en presencia de polibreno para infectar las células. Luego, las células infectadas se resuspendieron en medios de células T (medios básicos complementados con 5 ng/ml de IL-7, 5 ng/ml de IL-15 y 25 ng/ml de IL-2) y se dejaron que se expandieran durante dos semanas. Luego, las células se clasificaron mediante FACS para la población de ILT2+ y se expandieron durante 6 semanas adicionales para generar suficientes células para el estudio. Para la evaluación de la actividad citolítica, se mezclaron 2,5 x 104 células HLAG 721.221 marcadas en rojo intenso con 2,5 x 105 de células T CD8+ transducidas con ILT2 en una relación de células T : diana de 10:1 y 0,1 pg/ml de anticuerpo biespecífico anti-CD3/CD19 en un medio RPMI con un 10 % de FBS. Se añadieron anticuerpos anti-ILT o anticuerpos de control a las células a una concentración de 10 pg/ml y se incubaron durante 18 horas. Las células diana se analizaron mediante FACS y el porcentaje de destrucción de las células diana se calculó como el número de células diana destruidas dividido por el número total de células diana.
Como se muestra en la figura 22, los anticuerpos anti-ILT2/ILT4 (por ejemplo, Hz73D1.v1) y los anticuerpos anti-ILT2 (por ejemplo, 27F9), pero no los anticuerpos anti-ILT4 (por ejemplo, 48A5), mejoraron la actividad citolítica de las células T CD8+ contra las células diana 721.221-HLA-G. Estos datos muestran que los anticuerpos anti-ILT2 y anti-ILT2/ILT4 mejoran la actividad citolítica de las células T CD8+ al bloquear la interacción de ILT2 de las células T CD8+ con el MHC-I en las células diana. Como tales, los anticuerpos anti-ILT2 y anti-ILT2/ILT4 alteran la actividad inmunodepresora de ILT2 en los linfocitos citolíticos, en particular en las células T efectoras de memoria que se sabe que participan en la destrucción de células antitumorales.
Ejemplo 18
Efecto sinérgico de los anticuerpos anti-ILT2/ILT4 y los anticuerpos anti-PD1 sobre la actividad de las células T
Se desarrolló un ensayo de reacción leucocitaria mixta para evaluar los posibles efectos sinérgicos o aditivos de los anticuerpos anti-ILT2/ILT4 en combinación con un anticuerpo anti-PD1 (pembrolizumab). Se generaron macrófagos derivados de monocitos y se cultivaron con células T CD4+ alogénicas de 11 donantes diferentes, junto con el control de isotipo, el Hz73D1.v1, el pembrolizumab o la combinación de Hz73D1.v1 y pembrolizumab. En resumen, los macrófagos derivados de monocitos se generaron cultivando 100 000 monocitos por pocillo durante 6 días con 50 ng/ml de M-CSF recombinante. El día 6, se añadieron células T CD4+ purificadas alogénicas (200 000 por pocillo) junto con 1 pg/ml de control del isotipo anti-KLH, 1 pg/ml de pembrolizumab, 1 pg/ml de Hz73D1.v1 o la combinación de anti-PD1 y Hz73D1.v1 a 1 pg/ml cada uno. Las células se cultivaron durante 6 días adicionales y se recolectó el sobrenadante para un análisis de matriz de perlas múltiples sobre las citocinas secretadas (IFN-y, TNF-a y GM-CSF).
Como se muestra en la figura 23A-23C, el anticuerpo anti-ILT2/ILT4 o el pembrolizumab solo normalmente inducen <2 ng/ml de interferón gamma en cultivos, induciendo 3 de 11 donantes >2 ng/ml de interferón gamma. Por el contrario, la combinación del anticuerpo anti-ILT2/ILT4 y el pembrolizumab indujo >2 ng/ml de interferón gamma en 7 de las 11 parejas de donantes de células T<c>D4+, con una respuesta superior a la aditiva en comparación con cada reactivo solo en estas 7 parejas de donantes. Se observaron respuestas similares con la secreción de GM-CSF y TNF-a. Estos datos muestran que el anticuerpo anti-ILT2/ILT4 y el pembrolizumab juntos tienen un efecto sinérgico sobre la secreción de citocinas inducida por las células T CD4+ alogénicas, posiblemente mediante una combinación de la estimulación de la actividad de la APC de los macrófagos mediada por el anticuerpo anti-ILT2/ILT4 y la liberación de la inhibición del punto de control de las células T CD4+ por el pembrolizumab. En total, un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 o un anticuerpo anti-PD-1 por sí solos mejoran modestamente la activación de las células T y el aumento de la secreción de citocinas. La combinación de un anticuerpo anti-ILT2/ILT4 o un anticuerpo anti-PD-1 conduce a un aumento sinérgico de la activación de las células T y la secreción de citocinas.
Ejemplo 19
Los anticuerpos anti-ILT2/ILT4 inducen una polarización de tipo M2 a tipo M1 de los macrófagos derivados de monocitos.
Los macrófagos se caracterizan tradicionalmente como proinflamatorios (M1) o inmunodepresores (M2) basándose en los marcadores de expresión superficial CD80, CD86 (M1), c D163, CD204 y c D206 (M2). Los anticuerpos anti-IL2/ILT4, así como los anticuerpos anti-IL2 y anti-ILT4, se evaluaron para determinar su capacidad para polarizar los macrófagos hacia un fenotipo similar a M1 o similar a M2.
Los macrófagos se generaron mediante cultivo de monocitos en medios (RPMI con FBS al 10 %, L-glutamina y pen./estrep.) que contenían Hz73D1.v1, 27F9, 48A5 o un anticuerpo de control de isotipo (1 ug/ml) y 50 ng/ml de M-CSF recombinante (Peprotech) durante 5 días a 37 °C en placas de cultivo tisular de 48 pocillos. El día 5, las muestras se analizaron mediante citometría de flujo para detectar varios marcadores de superficie indicativos de un fenotipo similar a M1 o similar a M2.
Como se muestra en la figura 24, el Hz73D1.v1 indujo una disminución en los marcadores fenotípicos CD163, CD204 y CD206 de macrófagos de tipo M2 adicionales y en los marcadores CD14 y CD209 de tipo M2 adicionales, consistente con una polarización de los monocitos de tipo M2 a tipo M1 durante la diferenciación. El anticuerpo 48A5 específico anti-ILT4, pero no el anticuerpo 27F9 específico anti-ILT2, indujo un aumento del marcador CD86 de tipo M1 y una disminución de los marcadores de tipo M2 CD163, CD204 y CD206, y de otros marcadores similares a M2 CD14, CD209 y CCR5, en consonancia con una polarización de tipo M2 a tipo M1 con bloqueo de ILT4. Globalmente, estos datos demuestran que los anticuerpos anti-ILT2/ILT4 inducen un fenotipo M1 más proinflamatorio durante la diferenciación de los macrófagos, y esta respuesta está mediada por la inhibición de la interacción de ILT4 con el MHC-I.
Aunque la presente divulgación anterior se ha descrito con cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo con fines de claridad de comprensión, las descripciones y los ejemplos no deben interpretarse como limitantes del alcance de la presente divulgación. Las realizaciones de la presente divulgación descritas en el presente documento son meramente ejemplares, y los expertos en la técnica reconocerán numerosos equivalentes a los procedimientos específicos descritos en el presente documento. Se considera que todos estos equivalentes están dentro del alcance de la presente divulgación y están cubiertos por las realizaciones.
Las siguientes son las secuencias divulgadas en la solicitud. Las secuencias de CDR se enumeran en las tablas 1-8.
Secuencia de aminoácidos de ILT2 humano con la secuencia de señal predicha subrayada (SEQ ID NO: 1)
MTPILTVLICLGLSLGPRTHVQAGHLPKPTLWAEPGSVITQGSPVTLRCQGGQETQEYRL YREKKT ALWTTRTPQELVKKGQFPTPSTTWEHAGRYRCYY GSDT AGRSESSDPLELVVTG AYIKPTLSAQPSPVVNSGGNVILQCDSQVAFDGFSLCKEGEDEHPQCLNSQPHARGSSRA IFSVGPVSPSRRWWYRCYAYDSNSPYEWSLPSDLLELLVLGVSKKPSLSVQPGPIVAPEE TLTLQCGSDAGYNRFVLYKDGERDFLQLAGAQPQAGLSQANFTLGPVSRSYGGQYRCYGA HNLSSEWSAPSDPLDILIAGQFYDRVSLSVQPGPTVASGENVTLLCQSQGWMQTFLLTKE GAADDPWRLRSTYQSQKYQAEFPMGPVTSAHAGTYRCYGSQSSKPYLLTHPSDPLELWS GPSCGPSSPTTGPTSTSGPEDQPLTPTGSDPQSGLGRHLGVVTGTLVAVILLLLLLLLLF LILRHRRQGKHWTSTQRKADFQHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKHTQ PEDGVEMDTRSPHDEDPQAVTYAEVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQMD TEAAA SEAPQD VTY AQLHSLTLRREATEPPP SQEGPSPAVPSIY ATLAIH
Secuencia de aminoácidos de ILT2 humano sin secuencia señal prevista (SEQ ID NO: 2)
GHLPKPTLWAEPGSVITQGSPVTLRCQGGQETQEYRLYREKKTALWITRIPQELVKKGQF
P1PSITWEFLAGRYRCYYGSDTAGRSESSDPLELVVTGAY1KPTLSAQPSPVVNSGGNVIL QCDSQVAFDGFSLCKEGEDEHPQCLNSQPHARGSSRAIFSVGPVSPSRRWWYRCYAYDSN SPYEWSLPSDLLELLVLGVSKKPSLSVQPGPIVAPEETLTLQCGSDAGYNRFVLYKDGER DFLQLAGAQPQAGLSQANFTLGPVSRSYGGQYRCYGAHNLSSEWSAPSDPLDILIAGQFY DRVSLSVQPGPTVASGENVTLLCQSQGWMQTFLLTKEGAADDPWRLRSTYQSQKYQAEFP MGPVTSAIIACTYRCYGSQSSKPYLLTIIPSDPLELVVSCPSGGPSSPTTGPTSTSGPEDQP LTPTGSDPQSGLGRHLGVVIGILVAVILLLLLLLLLFLILRHRRQGKHWTSTQRKADFQH PAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKHTQPEDGVEMDTRSPHDEDPQAVTYA EVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQMDTEAAASEAPQDVTYAQLHSLTLRREA TEPPPSQEGPSPAVPSIYATLAIH
Dominio extracelular ILT2 humano (aa 24-461) (SEQ ID NO: 3)GHLPKPTLWAEPGSVITQGSPVTLRCQGGQETQEYRLYREKKTALWITRIPQELVKKGQF
P1PSITWEFIAGRYRCYYGSDTAGRSESSDPLELVVTGAY1K.PTLSAQPSPVVNSGGNV1L QCDSQVAFDGFSLCKEGEDEHPQCLNSQPHARGSSRAIFSVGPVSPSRRWWYRCYAYDSN SPYEWSLPSDLLELLVLGVSKKPSLSVQPGPIVAPEETLTLQCGSDAGYNRFVLYKDGER DFLQLAGAQPQAGLSQANFTLGPVSRSYGGQYRCYGAHNLSSEWSAPSDPLDILIAGQFY DRVSLSVQPGPTVASGENVTLLCQSQGWMQTFLLTKEGAADDPWRLRSTYQSQKYQAEFP MGPVTSAHAGTYRCYGSQSSKPYLLTHPSDPLELVVSGPSGGPSSPTTGPTSTSGPEDQP LTPTGSDPQSGLGRHLGV
Secuencia de aminoácidos del dominio 1 de tipo C2 de tipo ILT2 Ig humana (aa 27-115) (SEQ ID NO: 4)PKPTLWAEPGSVITQGSPVTLRCQGGQETQEYRLYREK.KTALWITRIPQELVKKGQFPIP SITWEHAGRYRCYYGSDTAGRSESSDPLE
Secuencia de aminoácidos del dominio 2 de tipo C2 de tipo ILT2 Ig humana (aa 116-221) (SEQ ID NO: 5)LVVTGAYIKPTLSAQPSPVVNSGGNVILQCDSQVAFDGFSLCKEGEDEHPQCLNSQPHAR GSSRATFSVGPVSPSRRWWYRCYAYDSNSPYEWSLPSDLLELLVLG
Secuencia de aminoácidos del dominio 3 de tipo C2 tipo ILT2 Ig humana (aa 222-312) (SEQ ID NO: 6)VSKKPSLSVQPGPIVAPEETLTLQCGSDAGYNRFVLYKDGERDFLQLAGAQPQAGLSQAN FTLGPVSRSYGGQYRCYOAETNLSSEWSAPSD
Secuencia de aminoácidos del dominio 4 de tipo C2 tipo ILT2 Ig humana (aa 313-409) (SEQ ID NO: 7)PLDLL1AGQFYDRVSLSVQPGPTVASGENVTLLCQSQGWMQTFLLTKEGAADDPWRLRST
Y QSQKY QAEFPMGPVTSAELAGTYRCYGSQSSKPYLLT
Secuencia de aminoácidos de ILT4 humano con la secuencia de señal predicha subrayada (SEQ ID NO: 8)MTPIVTVLICLGLSLGPRTHVOTGTIPKPTLWAEPDSVITOGSPVTLSCOGSLEAOEYRL YREKKSASWITR1RPELVKNGQFH1PSITWEHTGRYGCQYYSRARWSELSDPLVLVMTGA YPKPTLSAQPSPVVTSGGRVTLQCESQVAFGGFILCKEGEEEHPQCLNSQPHARGSSRAI FSVGPVSPNRRWSHRCYGYDLNSPYVWSSPSDLLELLVPGVSKKPSLSVQPGPVVAPGES LTLQCVSDVGYDRFVLYKEGERDLRQLPGRQPQAGLSQANFTLGPVSRSYGGQYRCYGAH NLSSECSAPSDPLDILITGQIRGTPFISVQPGPTVASGENVTLLCQSWRQFHTFLLTKAG AADAPLRLRSIHEYPKYQAEFPMSPVTSAHAGTYRCYGSLNSDPYLLSHPSEPLELVVSG PSMGSSPPPTGPISTPAGPEDQPLTPTGSDPQSGLGRHLGVVIOILVAWLLLLLLLLLF LILRHRRQGKHWTSTQRKADFQHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKDTQ PEDGVEMDTRAAASEAPQDVTYAQLHSLTLRRKATEPPPSQEREPPAEPSIYATLAIH
Secuencia de aminoácidos de ILT4 humano sin secuencia señal prevista (SEQ ID NO: 9)QTGTIPKPTLWAEPDSVITQGSPVTLSCQGSLEAQEYRLYREKKSASWITRIRPELVKNG QFHIPSITWEHTGRYGCQYYSRARWSELSDPLVLVMTGAYPKPTLSAQPSPVVTSGGRVT LQCESQVAFGGFILCKEGEEEHPQCLNSQPHARGSSRAIFSVGPVSPNRRWSHRCYGYDL NSPYVWSSPSDLLELLVPGVSKKPSLSVQPGPVVAPGESLTLQCVSDVGYDRFVLYKEGE RDLRQLPGRQPQAGLSQANFTLGPVSRSYGGQYRCYGAHNLSSECSAPSDPLDILITGQI RGTPFISVQPGPTVASGENVTLLCQSWRQFHTFLLTKAGAADAPLRLRSfflEYPKYQAEF PMSPVTSAFLAGTYRCYGSLNSDPYLLSFIPSEPLELWSGPSMGSSPPPTGPISTPAGPED QPLTPTGSDPQSGLGRHLGVVIGILVAVVLLLLLLLLLFLILRHRRQGKHWTSTQRKADF QHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKDTQPEDGVEMDTRAAASEAPQDVT YAQLHSLTLRRKATEPPPSQEREPPAEPSIYATLAIH
Dominio extracelular ILT4 humano (aa 22-461) (SEQ ID NO: 10)
QTGTIPKPTLWAEPDSVITQGSPVTLSCQGSLEAQEYRLYREKKSASWITRIRPELVKNG QFHIPSITWEHTGRYGCQYYSRARWSELSDPLVLVMTGAYPKPTLSAQPSPVVTSGGRVT LQCESQVAFGGFILCKEGEEEHPQCLNSQPHARGSSRAIFSVGPVSPNRRWSHRCYGYDL NSPYVWSSPSDLLELLVPGVSKKPSLSVQPGPVVAPGESLTLQCVSDVGYDRFVLYKEGE RDLRQLPGRQPQAGLSQANFTLGPVSRSYGGQYRCYGAHNLSSECSAPSDPLDILITGQI RGTPFISVQPGPTVASGENVTLLCQ SWRQFHTFLLTKAGAADAPLRLRSIHEYPKY QAEF PMSPVTSAHAGTYRCYGSLNSDPYLLSHPSEPLELVVSGPSMGSSPPPTGPISTPAGPED QPLTPTGSDPQ SGLGRHLGV
Secuencia de aminoácidos del dominio 1 de tipo C2 de tipo ILT4 Ig humana (aa 27-110) (SEQ ID NO: 11)
PKPTLWAEPDSVITQGSPVTLSCQGSLEAQEYRLYREKKSASWITRIRPELVKNGQFEtlP SITWEHTGRYGCQYY SRARWSEES
Secuencia de aminoácidos del dominio 2 de tipo C2 de tipo ILT4 Ig humana (aa 111-229) (SEQ ID NO: 12)
DPLVLVMTGAYPKPTLSAQPSPVVTSGGRVTLQCESQVAFGGF1LCKEGEEEHPQCLNSQ PHARGSSRATFSVGPVSPNRRWSHRCYGYDLNSPYVWSSPSDLLELLVPGVSKKPSLSV
Secuencia de aminoácidos del dominio 3 de tipo C2 tipo ILT4 Ig humana (aa 230-318) (SEQ ID NO: 13)
QPGPVVAPGESLTLQCVSDVGYDRFVLYKEGERDLRQLPGRQPQAGLSQANFTLGPVSRS YOOQYRCYGAHNLSSECSAPSDPLDILIT
Secuencia de aminoácidos del dominio 4 de tipo C2 tipo ILT4 Ig humana (aa 330-419) (SEQ ID NO: 14)
QPGPTVASGENVTLLCQSWRQFHTFELTKAGAADAPLRLRS1HEYPKYQAEFPMSPVTSA
HAGTYRCY GSLNSDPYLLSHPSEPLELVV S
Secuencia de aminoácidos de ILT2 humano con la secuencia de señal predicha subrayada (SEQ ID NO: 15)MTPILMVLICLGLSLGSRTRVOAGTFPKPTLWAEPGSMISKGSPVTLRCOGSLPVODYRL QREKKTASWVRRIQQELVKKGYFPIASrTSEHAGQYRCQYYSHSWWSEPSDPLELVVTGA YSKPTLSALPSPVVASGGNVTLQCDSQVAXGGFVLCKEGEDEHPQCLNSQPHTRGSSRAV FSVGPVSPSRRWSYRCYGYDSRSPYVWSLPSDLLELLVPGVSKKPSLSVQPGPVVAPGDK LTLQCGSDAGYNRFALYKEGERDFLQRPGRQPQAGLSQANFLLDPVRRSHGGQYRCSGAH NLSSEWS APSDPLDILIAGQIRGRPSLLV QPGPTV VSGEN VTLLC'QSSWQFH VFLLTQ AG AADAHLHLRSMYKYPKYQAEFPMSPVTSAHAGTYRCYGSHSSDSYLLSIPSDPLELVVSC PSGGPSSPTTGPTSTCGPEDQPLTPTGSDPQSGLGRHLGVVTGVLVAFVLLLFLLLLLFL VLRHRRQGKRWTSAQRKADFQHPAGAVEPEPRDRGLQRRSSPAANTQEENLYAAVKDTQP EDGVELDSRSPHDEDPQAVTYARVKHSRPRREMASPPSPLSEEFLDTKDTQAAASEDPQD VTYAQLQSLTLRRETTEPPPSQEREPPVESSIYATLTIH
Secuencia de aminoácidos de ILT2 deM. mulattasin secuencia señal prevista (SEQ ID NO: 16)
GTFPKPTLWAEPGSMISKGSPVTLRCQGSLPVQDYRLQREKKTASWVRRIQQELVKKGYF PIASITSEHAGQYRCQYYSHSWWSEPSDPLELVVTGAYSKPTLSALPSPVVASGGNVTLQ CDSQVAXGGFVLCKEGEDEHPQCLNSQPHTRGSSRAVFSVGPVSPSRRWSYRCYGYDSRS PYVWSLPSDLLELLVPGVSKK.PSLSVQPGPVVAPGDKLTLQCGSDAGYNRFALYKEGERD FLQRPGRQPQAGLSQANFLLDPVRRSHGGQYRCSGAHNLSSEWSAPSDPLDILIAGQIRG RPSLLVQPGPTVVSGENVTLLCQSSWQFHVFLLTQAGAADAFÍLFrLRSMYKYPKYQAEFPM SPVTSAHAGTYRCYGSHSSDSYLLSIPSDPLELVVSGPSGGPSSPTTGPTSTCGPEDQPL TPTGSDPQSGLGRHLGVVTGVLVAFVLLLFLLLLLFLVLRHRRQGKRWTSAQRKADFQHP AGAVEPEPRDRGLQRRSSPAANTQEENLYAAVKDTQPEDGVELDSRSPHDEDPQAVTYAR VKHSRPRREMASPPSPLSEEFLDTKDTQAAASEDPQDVTYAQLQSLTLRRETTEPPPSQE REPPVESSIYATLTTH
Dominio extracelular ILT2 deM. m u la tta(aa 24-460) (SEQ ID NO: 17)CTFPKPTLWAEPGSMISKGSPVTLRCQGSLPVQDYRLQREKKTASWVRRIQQELVKKGYF PIASITSEHAGQYRCQYYSHSWWSEPSDPLELVVTGAYSKPTLSALPSPVVASGGNVTLQ CDSQVAXGGFVLCKEGEDEHPQCLNSQPHTRGSSRAVFSVGPVSPSRRWSYRCYGYDSRS PYVWSLPSDLLELLVPGVSKK.PSLSVQPGPVVAPGDKLTLQCGSDAGYNRFALYK.EGERD FLQRPGRQPQAGLSQANFLLDPVRRSHGGQYRCSGAHNLSSEWSAPSDPLDTLTAGQIRG RPSLLVQPGPTVVSGENVTLLCQSSWQFHVFLLTQAGAADAHLHLRSMYKYPKYQAEFPM SPVTSAHAGTYRCYGSHSSDSYLLSIPSDPLELVVSGPSGGPSSPTTGPTSTCGPEDQPL TPTGSDPQSGLGRHLGV
Secuencia de aminoácidos del dominio 1 de tipo C2 de tipo Ig de ILT2 deM. mulatta(aa 27-114) (SEQ ID NO: 18)PKPTLWAEPGSMISKGSPVTLRCQGSLPVQDYRLQREKKTASWVRRIQQELVKKGYFPIA SITSEHAGQYRCQYYSHSWWSEPSDPLE
Secuencia de aminoácidos n del dominio 2 de tipo C2 de tipo Ig de ILT2 deM. mulatta(aa 115-220) (SEQ ID NO: 19)LVVTGAYSKPTLSALPSPWASGGNVTLQCDSQVAXGGFVLCKEGEDEHPQCLNSQPHTR GSSRAVFS V GP V SPSRRW S YRCY GYD SRSPY VWSLPSDLLELL VPG
Secuencia de aminoácidos n (aa 221-311) del dominio 3 de tipo C2 tipo Ig de ILT2 deM. mulatta(SEQ ID NO: 20)VSKKPSLSVQPGPVVAPGDKLTLQCGSDAGYNRFALYKEGERDFLQRPGRQPQAGLSQAN FLLDPVRRSHGGQYRCSGAHNLSSEWSAPSD
Secuencia de aminoácidos n (aa 312-408) del dominio 4 de tipo C2 tipo Ig de ILT2 deM. mulatta(SEQ ID NO: 21)PLDILIAGQIRGRPSLLVQPGPTVVSGENVTLLCQSSWQFHVFLLTQAGAADAHLHLRSM YKYPKYQAEFPMSPVTSAHAGTYRCYGSHSSDSYLLS
Secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada 27F9 (SEQ ID NO: 125)QVQLKESGPGLVAPSQSLSlfCTVSGFSLTNYGVSWVRQPPGKGLEWLGIIWGDGSTNYII SALISRLSISKDNSKSQVFLKLNSLQADDTATYYCAKPNWDTYAMDFWGQGTSVTVSS
Secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera 27F9 (SEQ ID NO: 126)DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNFLNWYQQKPDGTVKLLIYCTSKLHSGVPS RF SGSGSE1DY SL l ISJNLEQEDlA'rYFCQQGJN FLPP1FGGGIKLE11
Secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada 47C8 (SEQ ID NO: 127)EVQLQQSGPDLVKPGASVK1SCKASGYSFTGYYMHWVKQSHGKSLEW1GRVYPNNGDTSY NQKFKVKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARGATVVESLFAYWGQGTLVTVSA
Secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera 47C8 (SEQ ID NO: 128)DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGNNFLHWYQQKPGQPPKLLIYRTSNLES GTPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYYCQQSNEDPYTFGGGTKLEIK
Secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada 48A5 (SEQ ID NO: 129)QTQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWTNTYTGEP1Y ADDFKORFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDMATYFCARRSDYDOYAMDYWGQGTSVTVSS
Secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera 48A5 (SEQ ID NO: 130)DTVMSQSPSSLAVSVGERVTMSCKSSQSLLYSGNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTR ESGVPDRFTGSGSGTDFTLTTSSVKAEDLAVYYC.QQHDSYPTFGGGSRLEIK
Secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada 47H6 (SEQ ID NO: 131)EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYYMNWVKQSHGKSLEWIGDFNPNNGGTTY NQKFEGKATLTVDKSSNTAYMDLRSLTSEDSAVYYCARGRFYYGSLYSFDYWGQGTTLTVSSSecuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera 47H6 (SEQ ID NO: 132)DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNniNYLAWYQQKQGKSPIILLVYNAKTLADGVPS RFSGSGSGTQYSLKINNLQPEDFGSYYCQHFWTSITFGAGTKLDLK
Secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada Hz47H6.v2 (SEQ ID NO: 133)QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQRLEWIGDFNPNNAGTTYN QKFEORVTTTVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGRFYYGSLYSFDYWGQCTL VTVSS
Secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera Hz47H6.v2 (SEQ ID NO: 134)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASGNHNYLAWYQQKPGKAPKLLIYNAKTLADGVPSR FSGSGSGTDFTLFISSLQPEDFATYYCQHFWFSITFGPGTKVDIK
Secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada 51A1 (SEQ ID NO: 135)EVQLVESGGGLVQPKG SLKLSCAASGFFFNTY AMHWVRQAPGKGLEWVAR1RSKSSNY ATY Y A D S V K D R F F I S R D D S Q S M L Y L Q M N N L K T E D T A M Y Y C V R D G I Y Y Y G T M Y Y Y A M D Y W G Q GTSVTVSS
Secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera 51A1 (SEQ ID NO: 136)
Secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada 64A12 (SEQ ID NO: 137)EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMHWVRQAPGKGLEWVARIRSKSSNYATY Y A D S V K D R E T I S R D D S Q S M L Y L Q M N N L K T E D T A M Y Y C V R D G T Y Y Y D T M Y Y Y A M D Y W G Q OTSVTVSS
Secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera 64A12 (SEQ ID NO: 138)N1VLTQSPASLAVSLGQRAT1SCRASESVDYYGNSF1YWYQQKPGQPPKLL1YFASNLES GVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEAADAASYYCQQNNEDPWTFGGGTKLE1K
Secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada Hz64A12 (SEQ ID NO: 139)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMHWVRQAPGKGLEWVARIRSKSSNYAT YYADSVKDRFTISRDDAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGIYYYDTMYYTAMDYWGQGTLVTVSS
Secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera Hz64A12 (SEQ ID NO: 140)NTVLTQSPDSLAVSLGERATrNCRASESVDYYGNSFIYWYQQKPGQPPKLLIYFASNLES GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNNEDPWTFGGGTKVEIK
Secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada 73C4 (SEQ ID NO: 141)AVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYYMNWVKQSHGKSLEWIGNVNPNNGGTSY NQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARREIYFYGTIYYYAMDYWGQGTS VTVSS
Secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera 73C4 y 73D1 (SEQ ID NO: 142)DTVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDYYGNSFMYWYQQKPGRPPNLLIYFASNLES GVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYCQQNNEDPWTFGGGTKLEIK
Secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada 73D1 (SEQ ID NO: 143)AVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYYINWVKQSHGKSLQWIGNVNPNDOGTTY NQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARREIYFYGTJYYYAMDYWGQGTS VTVSS
Secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada Hz73D1.v1 (SEQ ID NO: 144)QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYINWVRQAPGQGLEWMGNVNPNDGGTTY NQKFKGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRE1YFYGTIYYYAMDYWGQGTL VTVSS
Secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera Hz73D1.v1 (SEQ ID NO: 145)
DTQLTQSPSFLSASVGDRVTTTCRASESVDYYGNSFMYWYQQKPGKAPKLLIYFASNLES G VP SRFSG SGSGTEFTLTTSSLQPEDF ATYY CQQNNEDPWTFGGGTK VEIK
Secuencia de aminoácidos de cadena pesada de Hz47H6.v2 con la secuencia señal subrayada (SEQ ID NO: 146)MDMRVPAOLLGLLLLWLRGARCOVOLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVR QAPGQRLEWIGDFNPNNAGTTYNQKFEGRVT1TVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR
GRFYYGSLYSFDYWGQGTLVTVS S ASTKGPSVFPLAPS SKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK KVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV KFNWY VDGVE VHN AKTKPREEQY GSTYRV V S VLTVLHQDWLN GKEYKCKV SNKALP APIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Secuencia de aminoácidos de cadena ligera de Hz47H6.v2 con la secuencia señal subrayada (SEQ ID NO: 147)
MDMRVPAOLLGLLLLWLRGARCDIOMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASGNIHNYLAWYOO KPGKAPKLLIYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHFWTSITFG PGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Secuencia de aminoácidos de cadena pesada de Hz47H6.v2 sin secuencia señal (SEQ ID NO: 148)
QVQLVQSGAEVK.KPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQRLEWIGDFNPNNAGTTY NQKFEGRVTITVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGRFYYGSLYSFDYWGQGTLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Secuencia de aminoácidos de cadena ligera de Hz47H6.v2 sin secuencia señal (SEQ ID NO: 149)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTTTCRASGNIHNYLAWYQQKPGKAPKLLIYNAKTLADGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHFWTSITFGPGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPS DEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Secuencia de aminoácidos de cadena pesada de Hz64A12 con la secuencia señal subrayada (SEQ ID NO: 150)
MDMRVPAOLLGLLLLWLRGARCEVOLVESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMHWVR QAPGKGLEWVAR1RSKSSNYATYYADSVKDRFT1SRDDAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARDGIYYYDTMYYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSN TKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMiSRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDTAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNErYTQKSLSLSPGK
Secuencia de aminoácidos de cadena ligera de Hz64A12 con la secuencia señal subrayada (SEQ ID NO: 151)
MDMRV P AOLLGLLLLWLRG ARCNIV LTQ SPD SLA VSLGERAT1N CRASES V D Y Y GN SFJ Y WYQQKPGQPPKLLIYFASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNNED PWTFGGGTKVETKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Secuencia de aminoácidos de cadena pesada de Hz64A12 sin secuencia señal (SEQ ID NO: 152)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMHWVRQAPGKGLEWVAR1RSKSSNYAT YYADSVKDRFTISRDDAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGIYYYDTMYYYAMDYWGQG TLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF PAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCP
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVFTNAKTK PREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKHSKAKGQPREPQVYT LPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Secuencia de aminoácidos de cadena ligera de Hz64A12 sin secuencia señal (SEQ ID NO: 153)
NIVLTQSPD SL AVSLGERATTNCRASES VDYY GN SFIYWY QQKPGQPPKLLTYFA SNLES GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNNEDPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVF IFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Secuencia de aminoácidos de cadena pesada de Hz73D1.v1 con la secuencia señal subrayada (SEQ ID NO: 154)
MDMRVPAOLLGLLLLWLRGARCOVOLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYrNWVR QAPGQGLEWMGNVNPNDGGTTYNQKFKGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAR REIYFYGTIYYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTY1CNVNHKPSNTK VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ Y GSTYRV V S VLTVLFIQDWLNGKEYKCKV SNKALP A PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD1AVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Secuencia de aminoácidos de cadena ligera de Hz73D1.v1 con la secuencia señal subrayada (SEQ ID NO: 155)
MDMRVPAOLLGLLLLWLRGARCDTOLTOSPSFLSASVGDRVTITCRASESVDYYGNSFMY WYQQKPGKAPKLLIYFASNLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQNNED PWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Secuencia de aminoácidos de cadena pesada de Hz73D1.v1 sin secuencia señal (SEQ ID NO: 156)QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYINWVRQAPGQGLEWMGNVNPNDGGTTY NQKFKGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRE1YFYÜTIYYYAMDYWGQÜTL VTVSSASTKGPSVEPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVFITFPA VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYlCNVNilKPSNTKVDKKVEPKSCDKTIITCPPCPAP ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLP PSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Secuencia de aminoácidos de cadena ligera de Hz73D1.v1 sin secuencia señal (SEQ ID NO: 157)
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASESVDYYGNSFMYWYQQKPGKAPKLLIYFASNLES GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQNNEDPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVF
1FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSRDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Región constante de IgG1 humana (SEQ ID NO: 158)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYlCNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTTfrCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLM1SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Región constante de IgG1 humana E233A/L235A (SEQ ID NO: 159)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTY1CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPALAGG PSVFLFPPKPKDTLM1SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Región constante de IgG1 humana L234A/L235A (SEQ ID NO: 160)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYrCNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT1SKAKGQPREPQVYTLPPSR EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNCQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Región constante de IgG1 humana L234A/L235A/P329G (SEQ ID NO: 161)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNCQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Región constante de IgG1 humana N297G (SEQ ID NO: 162)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTY1CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PS VFLFPPKPKDTLMT SRTPEVT CVWDV SFIEDPEVKFNWYVDG VEVFTN AKTKPREEQ Y G STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP1EKT1SKAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Región constante de IgG1 humana N297G/H3 10A (SEQ ID NO: 163)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTY1CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYG STYRVVSVLTVLAQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Región constante de la cadena ligera Kappa humana (SEQ ID NO: 164)
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Región constante de la cadena ligera Lambda humana (SEQ ID NO: 165)
GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSK QSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
Secuencia de aminoácidos de ILT2 deM. fasciculariscon la secuencia de señal predicha subrayada (SEQ ID NO: 166)MTPILMVLICLGLSLGPRTHVOAGILPKPTLWAEPGSMISEGSPVTLRCOGSLOVOEYRL YREIGCPASWVRRIQQELVKKGYFAIGFrrWEHTGQYRCQYYSHSWWSEPSDPLELWTGA YSKPTLSALPSPVVASGGNVTLQCDSQVAFDSFTLCKEGEDEPiPQRLNCQSPLARGWSWAV FSVGPVSPSRRWSYRCYGYISSAPNVWSLPSDLLELLVPGVSKKPSLSVQPGPVVAPGDK LTLQCGSDAGYDRFALYKEGEGDFLQRPVRQPQAGLSQANFLLGPVSRSHGGQYRCSGAH NLSSEWSAPSDPLD1L1AGQIRGRPFLSVQPGPKVVSGENVTLLCQSSWQFF1AFLLTQAG AADAHLHLRSMYKYPKYQAEFPMSPVTSAHAGTYRCYGSRSSNPYLLSVPSDPLELVVSG PSGGPSSPTTGPTSTCAGPEDQPLTPTGSDPQSGLGRHLGVVTGILVAFVLLLFLLLLLF LVLRHQRQGKHWTSAQRKADFQHPAGAVEPEPRDRGLQRRSSPAADTQEENLYAAVKDTQ PEDGVELDSRQRPHDEDPQAVTYARVKHSRPRREMASPPSPLSEEFLDTKDTQAEEDRQM DTEAAASEDPQDVTYAQLQSLTLRRETTEPPPSQERAPPVESSIYATLTIH
Secuencia de aminoácidos de ILT2 deM. fascicularissin secuencia señal prevista (SEQ ID NO: 167)GILPKPTLWAEPGSMISEGSPVTLRCQGSLQVQEYRLYREKKPASWVRRIQQELVKKGYF AIGFITWEHTGQYRCQYYSHSWWSEPSDPLELVVTGAYSKPTLSALPSPWASGGNVTLQ CDSQVAFDSFTLCKEGEDEHPQRLNCQSHARGWSWAVFSVGPVSPSRRWSYRCYGYISSA PNVWSLPSDLLELLVPGVSKKPSLSVQPGPVVAPGDKLTLQCGSDAGYDRFALYKEGEGD FLQRPVRQPQAGLSQANFLLGPVSRSHGGQYRCSGAHNLSSEWSAPSDPLDILIAGQIRG RPFLSVQPGPKVVSGENVTLLCQSSWQFHAFLLTQAGAADAHLHLRSMYKYPKYQAEFPM SPVTSAHAGTYRCYGSRSSNPYLLSVPSDPLELVVSCPSGGPSSPITGPTSTCAGPEDQP LTPTGSDPQSGLGRHLGVVTGILVAFVLLLFLLLLLFLVLRHQRQGKHWTSAQRKADFQH PAGAVEPEPRDRGLQRRSSPAADTQEENLYAAVKDTQPEDGVELDSRQRPHDEDPQAVTY ARVKHSRPRREMASPPSPLSEEFLDTKDTQAEEDRQMDTEAAASEDPQDVTYAQLQSLTL RRETTEPPPSQERAPPVESSIYATLTIH
Dominio extracelular ILT2 deM. fascicularis(aa 24-461) (SEQ ID NO: 168)GILPKPTLWAEPGSMISEGSPVTLRCQGSLQVQEYRLYREKKPASWVRRIQQELVKKGYF AIGFITWEHTGQYRCQYYSHSWWSEPSDPLELVVTGAYSKPTLSALPSPWASGGNVTLQ CDSQVAFDSFTLCKEGEDEHPQRLNCQSHARGWSWAVFSVGPVSPSRRWSYRCYGYISSA PNVWSLPSDLLELLVPGVSKKPSLSVQPGPVVAPODKLTLQCOSDAGYDRFALYKEGEGD FLQRPVRQPQAGLSQANFLLGPVSRSHGGQYRCSGAHNLSSEWSAPSDPLD1LIAGQIRG RPFLSVQPGPKVVSGENVTLLCQSSWQFFIAFLLTQAGAADAHLHLRSMYKYPKYQAEFPM SPVTSAHAGTYRCYGSRSSNPYLLSVPSDPLELVVSGPSGGPSSPTTGPTSTCAGPEDQP LTPTGSDPQSGLGRHLGV
Secuencia de aminoácidos del dominio 1 de tipo C2 de tipo Ig de ILT2 deM. fascicularis(aa 27-114) (SEQ ID NO: 169)PKPTLWAEPGSMISEGSPVTLRCQGSLQVQEYRLYREKKPASWVRRIQQELVKKGYFAIG<P T I>WEHTGQ YRCQ Y<Y>SEIS W WSEPSDPLE
Secuencia de aminoácidos n del dominio 2 de tipo C2 de tipo Ig de ILT2 deM. fascicularis(aa 115-220) (SEQ ID NO: 170)LVVTGAYSKPTLSALPSPVVASGGNVTLQCDSQVAFDSFTLCKEGEDEHPQRLNCQSHAR OWSWAVFSVGPVSPSRRWSYRCYGYISSAPNVWSLPSDLLELLVPG
Secuencia de aminoácidos n (aa 221-311) del dominio 3 de tipo C2 tipo Ig de ILT2 deM. fascicularis(SEQ ID NO: 171)VSKKPSLSVQPGPWAPGDKLTLQCGSDAGYDRFALYKEGEGDFLQRPVRQPQAGLSQAN FLLGPVSRSHGGQYRCSGAFTNLSSEWSAPSD
Secuencia de aminoácidos n (aa 312-408) del dominio 4 de tipo C2 tipo Ig de ILT2 deM. fascicularis
V Q P G P K V V S G E N V T L L C Q S S W Q F H A F L L T Q A G A A D A H L H L R S M Y
A F L A G T Y R C Y G S R S S N P Y L L S
Etiqueta peptídica de hexahistidina (SEQ ID NO: 173)
HHHHHH

Claims (24)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo que se une específicamente tanto al transcrito 2 similar a la inmunoglobulina humana (ILT2) como al transcrito 4 similar a la inmunoglobulina humana (ILT4), que comprende una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 (VH-CDR1), una región variable de cadena pesada CDR2 (VH-CDR2) y una región variable de cadena pesada CDR3 (VH-CDR3) de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 144; y una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 (VL-CDR1), una región variable de cadena ligera CDR2 (VL-CDR2) y una región variable de cadena ligera CDR3 (VL-CDR3) de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 145;
en donde VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1, VL-CDR2 y VL-CDR3 se determinan de acuerdo con los sistemas de numeración de Kabat, Chothia, Contact, IMGT o AbM.
2. Un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo que se une específicamente tanto al transcrito 2 similar a la inmunoglobulina humana (ILT2) como al transcrito 4 similar a la inmunoglobulina humana (ILT4), que comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, en donde
(1) la región variable de cadena pesada comprende una VH-CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 115, una VH-CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 112 y una VH-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 107; y la región variable de cadena ligera comprende una VL-CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 89, una VL-CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 90 y una VL-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 91;
(2) la región variable de cadena pesada comprende una VH-CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 111, una VH-CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 112 y una VH-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 107; y la región variable de cadena ligera comprende una VL-CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 89, una VL-CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 90 y una VL-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 91;
(3) la región variable de cadena pesada comprende una VH-CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 76, una VH-CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 113, una VH-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 107; y la región variable de cadena ligera comprende una VL-CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 89, una VL-CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 90 y una VL-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 91;
(4) la región variable de cadena pesada comprende una VH-CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 111, una VH-CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 114 y una VH-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 107; y la región variable de cadena ligera comprende una VL-CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 89, una VL-CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 90 y una VL-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 91; o
(5) la región variable de cadena pesada comprende una VH-CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 116, una VH-CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 124 y una VH-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 110; y la región variable de cadena ligera comprende una VL-CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 99, una VL-CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 100 y una VL-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 101.
3. El anticuerpo o fragmento funcional del mismo de la reivindicación 1 o 2, en donde
(a) la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 144;
(b) la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 145; o
(c) la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 144 y la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 145.
4. El anticuerpo o fragmento funcional del mismo de la reivindicación 1 o 2, en donde la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 144 y la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 145.
5. El anticuerpo o fragmento funcional del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 156 y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 157.
6. El anticuerpo o fragmento funcional del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 156 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 157.
7. Un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo que se une específicamente tanto al transcrito 2 similar a la inmunoglobulina humana (ILT2) como al transcrito 4 similar a la inmunoglobulina humana (ILT4), que comprende una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada CDR1 (VH-CDR1), una región variable de cadena pesada CDR2 (VH-CDR2) y una región variable de cadena pesada CDR3 (VH-CDR3) de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 143; y una región variable de cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera CDR1 (VL-CDR1), una región variable de cadena ligera CDR2 (VL-CDR2) y una región variable de cadena ligera CDR3 (VL-CDR3) de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 142;
en donde VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1, VL-CDR2 y VL-CDR3 se determinan de acuerdo con los sistemas de numeración de Kabat, Chothia, Contact, IMGT o AbM.
8. Un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo que se une específicamente tanto al transcrito 2 similar a la inmunoglobulina humana (ILT2) como al transcrito 4 similar a la inmunoglobulina humana (ILT4), que comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, en donde
(1) la región variable de cadena pesada comprende una VH-CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 115, una VH-CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 112 y una VH-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 107; y la región variable de cadena ligera comprende una VL-CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 89, una VL-CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 90 y una VL-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 91;
(2) la región variable de cadena pesada comprende una VH-CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 111, una VH-CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 112 y una VH-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 107; y la región variable de cadena ligera comprende una VL-CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 89, una VL-CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 90 y una VL-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 91;
(3) la región variable de cadena pesada comprende una VH-CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 76, una VH-CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 113, y una VH-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 107; y la región variable de cadena ligera comprende una VL-CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 89, una VL-CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 90 y una VL-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 91;
(4) la región variable de cadena pesada comprende una VH-CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 111, una VH-CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 114 y una VH-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 107; y la región variable de cadena ligera comprende una VL-CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 89, una VL-CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 90 y una VL-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 91; o
(5) la región variable de cadena pesada comprende una VH-CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 116, una VH-CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 117 y una VH-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 110; y la región variable de cadena ligera comprende una VL-CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 99, una VL-CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 100 y una VL-CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 101.
9. El anticuerpo o fragmento funcional del mismo de las reivindicaciones 7 u 8, en donde
(a) la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 143; (b) la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 142; o
(c) la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 143 y la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 142.
10. El anticuerpo o fragmento funcional del mismo de las reivindicaciones 7 u 8, en donde la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 143 y la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 142.
11. El anticuerpo o fragmento funcional del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y 6 a 10, en donde
(i) el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo biespecífico o un anticuerpo multiespecífico; un anticuerpo monocatenario, un anticuerpo de doble región variable o un diacuerpo;
y/o
(ii) el anticuerpo es
(a) un anticuerpo IgG1, opcionalmente un anticuerpo IgG1 humano y, además, opcionalmente un anticuerpo IgG1 humano que tiene una función efectora reducida o nula;
(b) un anticuerpo IgG2, opcionalmente un anticuerpo IgG2 humano; o
(c) un anticuerpo IgG4, opcionalmente un anticuerpo IgG4 humano;
y/o
(iii) el anticuerpo comprende una región constante de cadena ligera kappa, opcionalmente una región constante de cadena ligera kappa humana; o el anticuerpo comprende una región constante de cadena ligera lambda, opcionalmente una región constante de cadena ligera lambda humana;
y/o
(iv) el anticuerpo o fragmento funcional del mismo está adherido a un resto que prolonga la semivida.
12. El anticuerpo o fragmento funcional del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el fragmento funcional comprende al menos un sitio de unión al antígeno y/o en donde el fragmento funcional es un Fab, un Fab', un F(ab')2, un Fv, un scFv o un (scFv)2.
13. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento funcional del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 y un portador farmacéuticamente aceptable.
14. Un polinucleótido aislado o un conjunto de polinucleótidos aislados que codifican el anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
15. Un vector o un conjunto de vectores que comprende el polinucleótido o conjunto de polinucleótidos de la reivindicación 14.
16. Una célula aislada que comprende el polinucleótido o conjunto de polinucleótidos de la reivindicación 14 o el vector o conjunto de vectores de la reivindicación 15; o que produce el anticuerpo o fragmento funcional de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
17. Un anticuerpo o fragmento funcional del mismo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o una composición farmacéutica como se define en la reivindicación 13 para su uso en un método para tratar el cáncer, inhibir el crecimiento tumoral o inhibir la recidiva tumoral o el recrecimiento tumoral en un sujeto que lo necesite.
18. El anticuerpo o fragmento funcional del mismo o la composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 17, en donde el cáncer es mesotelioma, glioblastoma, carcinoma renal, carcinoma broncopulmonar no microcítico, melanoma, adenocarcinoma ductal pancreático, cáncer gástrico, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, cáncer de vías biliares, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer endocervical, cáncer colorrectal o cáncer de esófago; o
en donde el tumor es un tumor pancreático, un tumor de mama, un tumor de pulmón, un carcinoma broncopulmonar no microcítico, un tumor de cabeza y cuello, un tumor colorrectal, un tumor de próstata, un tumor de piel, un melanoma, un tumor gástrico, un tumor colorrectal, un tumor de ovario, un tumor de cuello uterino, un tumor uterino, un tumor de endometrio, un tumor endocervical, un tumor de vejiga, un tumor cerebral, un tumor de esófago, un tumor de hígado, un tumor de riñón, un tumor renal, un mesotelioma, un glioblastoma, un tumor de las vías biliares o un tumor testicular.
19. El anticuerpo o fragmento funcional del mismo o la composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 17 o 18, en donde el método comprende la administración de un agente terapéutico adicional.
20. El anticuerpo o fragmento funcional del mismo o la composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 19, en donde el agente terapéutico adicional comprende un anticuerpo anti-PD-1 o un anticuerpo anti-PD-L1;
o en donde el agente terapéutico adicional es un anticuerpo anti-PD-1 se selecciona de pembrolizumab, pidilizumab, nivolumab, durvalumab, cemiplimab, tislelizumab, spartalizumab y STI-A1110.
21. El anticuerpo o fragmento funcional del mismo o la composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 19 o 20, en donde el agente terapéutico adicional es pembrolizumab.
22. Una combinación que comprende un anticuerpo anti-PD-1 y el anticuerpo o fragmento funcional del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o la composición farmacéutica de la reivindicación 13.
23. La combinación de la reivindicación 22, en donde el anticuerpo anti-PD-1 se selecciona de pembrolizumab, pidilizumab, nivolumab, durvalumab, cemiplimab, tislelizumab, spartalizumab y STI-A1110.
24. La combinación de la reivindicación 22 o 23, en donde el anticuerpo anti-PD-1 es pembrolizumab.
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