ES3039826T3 - Targeting e coli cells - Google Patents

Targeting e coli cells

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ES3039826T3 ES23738642T ES23738642T ES3039826T3 ES 3039826 T3 ES3039826 T3 ES 3039826T3 ES 23738642 T ES23738642 T ES 23738642T ES 23738642 T ES23738642 T ES 23738642T ES 3039826 T3 ES3039826 T3 ES 3039826T3
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Abstract

La tecnología descrita en este documento se refiere a métodos y composiciones para dirigirse a células de E. coli, por ejemplo, para tratar o prevenir una infección por células de E. coli en seres humanos o animales. El método, en una realización, comprende administrar al sujeto un cóctel de partículas que comprende varias partículas de transducción diferentes para células de E. coli. El método, en una realización, comprende administrar al sujeto varias partículas de transducción que codifican una nucleasa para dirigirse a los genomas de células de E. coli del filogrupo B2. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Focalización en células deE. coli
Campo técnico
La tecnología descrita en la presente memoria se refiere a composiciones dirigidas a célulasde E. coliy a los usos de dichas composiciones, tales como el tratamiento o la prevención de una infección por célulasde E. colien sujetos humanos o animales. Los usos comprenden administrar al sujeto una composición que comprende un cóctel de partículas que comprende una pluralidad de partículas de transducción diferentes para célulasde E. coli.Los usos comprenden administrar al sujeto de una composición que comprende una pluralidad de partículas de transducción que codifican una nucleasa dirigida a los genomas de células deE. colidel filogrupo B2.
Antecedentes
La infección porE. colise ha identificado como dañina o potencialmente mortal en diversos entornos, tales como infecciones UTI, pacientes trasplantados, pacientes con cáncer y otros pacientes inmunodeprimidos o que toman inmunosupresores.
Se ha propuesto la focalización de nucleasas enE. coli,tal como mediante sistemas CRISPR/Cas, mediante la administración usando partículas de transducción que pueden dirigir la nucleasa a células deE. colipara el corte cromosómico o episomal, matando así las células o reduciendo su crecimiento o proliferación. Las partículas de transducción adecuadas son fagos o partículas diseñadas por ingeniería (tales como partículas de transducción no autorreplicativas) que comprenden cápsides que contienen ácido nucleico que codifica al menos ARNcr o ARNg (o adicionalmente una nucleasa Cas) para la focalización. Ventajosamente, se puede lograr la focalización selectiva, lo que no es posible utilizando antibióticos convencionales, tales como los antibióticos de amplio espectro. Dicha focalización selectiva puede evitar la muerte de especies y cepas beneficiosas en los pacientes tratados. De hecho, las alteraciones del microbioma con antibióticos de amplio espectro son un factor de riesgo en la gestión profiláctica de pacientes con cáncer con riesgo de neutropenia febril.
La terapia con bacteriófagos (fagos) se ha utilizado antes de la amplia disponibilidad de antibióticos, pero ahora ha vuelto a recuperar interés debido al aumento de la resistencia a los antimicrobianos (RAM) de las bacterias combinado con varios informes de casos individuales exitosos.
Los bacteriófagos (fagos) son un filo de virus que infectan bacterias y se distinguen de los virus animales y vegetales. Los fagos pueden tener un ciclo de vida “lítico”, un ciclo de vida “lisogénico” que potencialmente puede llegar a ser lítico, o un ciclo de vida “no lítico”. Los fagos que se replican mediante el ciclo lítico causan la lisis de la célula bacteriana huésped como parte normal de su ciclo de vida. Los fagos que se replican mediante ciclos lisogénicos se denominan fagos temperados y pueden replicarse mediante el ciclo de vida lítico y causar la lisis de la bacteria huésped, o bien pueden incorporar su ADN al ADN bacteriano huésped y convertirse en profagos no infecciosos.
La capacidad natural de los fagos para infectar y matar bacterias, junto con la especificidad de las interacciones fago-bacteria, es el fenómeno básico en el que se basa el concepto de terapia con fagos. Por lo tanto, los fagos que poseen un ciclo de vida lítico son candidatos adecuados para la terapia con fagos.
La Solicitud de Patente Internacional No. WO 00/69269 divulga el uso de una cierta cepa de fago para tratar infecciones causadas por cepas deEnterococcus faeciumresistentes y sensibles a Vancomicina, y la Solicitud de Patente Internacional No. WO 01/93904 divulga el uso de bacteriófagos, solos o en combinación con otros medios antimicrobianos, para prevenir o tratar enfermedades gastrointestinales asociadas con las especies del géneroClostridium.
La Solicitud de Patente de EE. UU. No. 2002/0001590 divulga el uso de terapia con fagos contra bacterias resistentes a múltiples fármacos, específicamenteStaphylococcus aureusresistente a la meticilina,y la Solicitud de Patente Internacional No. WO 02/07742 divulga el desarrollo de bacteriófagos que tienen un rango de múltiples huéspedes.
El uso de la terapia con fagos para el tratamiento de enfermedades infecciosas bacterianas específicas se divulga, por ejemplo, en las Solicitudes de Patente de EE. UU. No.2002/0044922; 2002/0058027 y la Solicitud de Patente Internacional No. WO 01/93904.
El documento US20160333348 describe el uso de sistemas CRISPR/Cas administrados a células bacterianas huéspedes utilizando fagos como vectores.
Entre los diversos filogrupos deE. coli,se ha observado que las cepas resistentes a los antibióticos (por ejemplo, resistentes a las fluoroquinolonas (FQ)) y resistentes a múltiples fármacos (MDR) se encuentran con frecuencia en el filogrupo B2. Se ha encontrado que las cepas B2 ST131 y ST1193 están asociadas con la resistencia a los antibióticos. ST131 es un clon resistente a múltiples fármacos dominante a nivel mundial asociado con altas tasas de rUTI. ST131 es un contribuyente principal de las UTI adquiridas en el hospital y la comunidad, así como de las infecciones del torrente sanguíneo porE. coliy las infecciones en animales de compañía y aves de corral. Originalmente identificada en 2008, ST131 está asociada con la propagación mundial del gen de resistencia a la β-lactamasa de espectro extendido (ESBL) CTX-M-15. ST131 ahora está fuertemente asociada con la resistencia a múltiples fármacos (MDR), incluida la resistencia a las fluoroquinolonas. Informes recientes también han identificado cepas que son resistentes a los carbapenémicos de última línea. El tipo de secuencia 1193 ha surgido recientemente como un linaje nuevo, virulento y resistente entre lasE. coliresistentes a las fluoroquinolonas.
Por lo tanto, los antibióticos clásicos, como la FQ y los antibióticos de amplio espectro, no son lo suficientemente eficaces para combatir estas infecciones. Por lo tanto, es necesario encontrar medios alternativos para abordar estas infecciones.
El documento WO 2021/092254 A1 (LOCUS BIOSCIENCES INC [EE. UU.]) se refiere a composiciones de fagos que comprenden sistemas crispr-cas y métodos de uso de los mismos.
El documento WO 2019/243373 A1 (ELIGO BIOSCIENCE [FR]) se refiere a un vehículo de administración bacteriano, su proceso de producción y usos del mismo.
Gencay Y et al. (Nature Biotech., 4 de mayo de 2023) se refiere a un fago diseñado por ingeniería con CRISPR-Cas antibacteriano que reduce selectivamente la carga deE. colien ratones.
Nath A et al: (Biomedical Pharmacotherapy., vol. 151, 2022) se refiere al sistema CRISPR-Cas administrado por fagos para combatir patógenos resistentes a múltiples fármacos en el microbioma intestinal.
Gibb B et al (Pharmaceuticals, vol.14, 2021, página 634) se refiere a una descripción general de las numerosas aplicaciones de los bacteriófagos diseñados por ingeniería.
Compendio
La invención proporciona composiciones para el tratamiento o la prevención de infeccionespor E. colidel filogrupo B2 en seres humanos y animales mediante la combinación de la eliminación selectiva con nucleasas dirigidas usando tipos específicos de partículas de transducción. Las partículas de la composición de la invención actúan mediante adhesión a LPS, LamB y Tsx, lo que se ha encontrado, sorprendentemente, que es muy ventajoso para matar e inhibir el crecimiento de células deE. coliB2 de muchas cepas diferentes (incluidas las cepas ST131 y ST1193, potencialmente letales). Como se ejemplifica en la presente memoria, sorprendentemente, se eliminaron más de 10 cepas diferentes de ST131 (formación de placas) y se eliminaron más de 10 cepas diferentes de ST1193 (formación de placas).
La invención encuentra utilidad, por ejemplo, para tratar o prevenir infecciones potencialmente mortales porE. colidel filogrupo B2 en pacientes, tales como pacientes inmunodeprimidos, con cáncer, trasplantados o con UTI, que son susceptibles a la infección por cepas B2 (y a menudo por múltiples cepas B2 diferentes). Como se demuestra en los Ejemplos, la invención es útil para prevenir la bacteriemiapor E. colidel filogrupo B2 (infección del torrente sanguíneo porE. coli)en un sujeto.
Cualquier referencia a métodos para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia debe interpretarse como referencias a las composiciones de la presente invención para su uso en un método para dicho tratamiento.
Declaraciones de la invención:
La invención es tal como se reivindica en las reivindicaciones 1 a 15.
Cualquier parte de la descripción que no esté dentro del alcance de las reivindicaciones 1-15 y estas declaraciones no forman parte de la invención, pero sirven para la comprensión de la invención reivindicada.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: Actividad de eliminación e inhibición del crecimiento de una composición de la invención cuando se ensaya contraE. colide varios filogrupos diferentes y diferentes cepas dentro de cada grupo(E. coliobtenida de muestras clínicas); la composición, sorprendentemente, fue altamente efectiva en la eliminación en diversos filogrupos (y en particular en el filogrupo B2, donde se eliminaron múltiples cepas - incluidas aquellas conocidas por ser potencialmente mortales y relacionadas con la resistencia a los antibióticos - o cuyo crecimiento se inhibió eficazmente). Los 6 resultados negativos comprendieron muestras sinE. coliy no resistentes a FQ.
Figura 2: Agrupamiento filogenético de las cepas utilizadas en el estudio y que muestra un direccionamiento particularmente ventajoso y extenso de muchas cepas del filogrupo B2 clínico.
Figura 3: A) Eliminación dirigida por CRISPR-Cas de un panel abreviado de 82 aislados clínicos de E. coli mediante la conjugación de CGV-EcCAS y un vector vacío. La eficiencia de la conjugación se determinó mediante la aplicación de diluciones seriadas de la reacción de conjugación en agar LB suplementado con antibióticos y se calculó como UFC/ml. El límite de detección (LOD) de este ensayo fue de 200 UFC/ml. El experimento se realizó por triplicado y se indica mediante puntos. Los experimentos de conjugación de CGV-EcCAS se indican con una flecha; las conjugaciones con vector vacío se indican sobre la línea punteada marcado con LOD. B) Fracción del fago con CRISPR™ (CAP) y el fago WT durante el cocultivo con una cepa huésped susceptible a ambos fagos. CAP α15.2 aumenta su abundancia relativa en comparación con el fago WT del 7 % al 86 % en dos subcultivos consecutivos. C) CAP α20.4 superó a WT α20 al aumentar su abundancia relativa durante el cocultivo con la cepa diana común de E. coli b230 del 10 % al 68 % en cuatro subcultivos consecutivos. B-C) La relación de fagos CAP y WT durante el cocultivo con una cepa huésped (E. coli b230) susceptible a α15.2, α15, α20.4 y α20. CAP α15.2 aumentó su abundancia relativa en comparación con el fago WT del 7 % al 86 % (G), mientras que CAP α20.4 superó a WT α20 del 10 % al 68 % (H).
Figura 4: Evaluación de la especificidad de SNIPR001 y CAP individuales frente a un panel de bacterias clínicamente relevantes y la cepa b2480 de E. coli (control positivo), que no muestra efectos fuera de la diana. Los valores positivos representan crecimiento bacteriano (ausencia de muerte observada), mientras que los valores negativos indican muerte bacteriana tras el tratamiento con fagos dentro del período de tiempo evaluado. Todos los valores se indican como medias de cuatro réplicas biológicas con desviaciones estándar, que miden el crecimiento durante un período de 4 horas, medido en UFC/ mL.
Figura 5: A) Árbol filogenético sin raíz de las cepas de JMI que muestra un panel clínico de 382 cepas de E. coli que abarcan nueve filogrupos y 118 MLST. Los datos de plaqueo reflejan una única réplica de plaqueo. Una cepa, E. coli b4038, con una rama larga se ha truncado al 37 % de la longitud original. Escala de distancia filogenética indicada debajo del árbol filogenético, según lo calculado por MASH. B) Se utilizó un ensayo puntual para analizar la eficacia de SNIPR001 contra el panel clínico de 382 cepas de E. coli (de JMI, North Liberty, IA, EE. UU.) aisladas de infecciones del torrente sanguíneo y el panel interno de 429 cepas de E. coli. El ensayo puntual se realizó como dos experimentos independientes, con resultados presentados como valores de media ± SD. La desviación estándar mostrada se basa en la discrepancia de los resultados entre las dos ejecuciones, calculada como la desviación absoluta promedio de la prevalencia media de un tipo de manchado dado, normalizado al tamaño del panel. C) La cobertura de SNIPR001 no depende de fenotipos resistentes a antibióticos; en consecuencia, SNIPR001 se dirige a >90 % de las cepas de E. coli que son resistentes a carbapenémicos, productoras de β-lactamasa de espectro extendido (ESBL) o resistentes a múltiples fármacos (MDR), y al 89 % de las cepas de E. coli resistentes a las fluoroquinolonas. Los números indicados en cada barra verde o gris indican el número de bacterias susceptibles o resistentes a SNIPR001, respectivamente, para cada categoría de resistencia. D) Un árbol filogenético con raíz de punto medio de las 72 cepas de E. coli resistentes a las fluoroquinolonas aisladas de muestras fecales de pacientes con cáncer hematológico. 67 de las 72 cepas son susceptibles a al menos uno de los cuatro CAPS en SNIPR001. E) Distribución de redundancia que muestra que el 82 % de las cepas de E. coli resistentes a las fluoroquinolonas (n = 72) del panel D son diana de al menos 2 CAP diferentes.
Figura 6: A) Recuperación de CAP en heces de minicerdos tras una dosis única p.o. de 2 x 10<12>UFP de SNIPR001 (n = 8, mostrado en verde) o vehículo (n = 6, mostrado en gris) durante una semana con muestreo diario. Las líneas de tendencia indican el fago recuperado promedio en UFP/g de heces; los puntos indican los puntos de medición individuales. El LOD de 33 UFP/g de heces se indica con la línea punteada. B) Recuperación de CAP en heces de minicerdos tras una dosis única p.o. de 2 x 10<12>UFP de un único CAP (n = 8 minicerdos recibieron α15.2, α20.4 o α51.5; n = 7 minicerdos recibieron α48.4) durante una semana con muestreo diario. Las líneas de tendencia indican la recuperación promedio, mientras que los puntos indican mediciones individuales. La recuperación se midió en UFP/g de heces. El LOD de 33 UFP/g de heces se indica con la línea punteada. C) Recuperación de CAP en heces de ratón 8 h, 24 h y 48 h después del inicio del tratamiento con administración tres veces al día de dosis variables de SNIPR001 (n = 10 para bajo, medio y alto, indicado en verde), vehículo (n = 10, indicado en gris) o gentamicina (n = 4, indicado en gris). La recuperación se mide en UFP/g de heces, el LOD de 371 UFP/g de heces se indica con la línea de puntos. D) La recuperación de E. coli b17 en heces de ratón indica un mayor efecto de SNIPR001 con el aumento de la dosis. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando pruebas bilaterales de Kruskal-Wallis para la comparación de los grupos tratados con SNIPR001, prueba U bilateral de Mann-Whitney para la comparación de los grupos tratados con vehículo. P < 0,05 = *, 0,01 = **, 0,001 = ***, FDR corregido utilizando el método de Holm por separado para cada día. La recuperación se mide en UFC/g de heces, con un límite de detección de 371 UFC/g de heces. Los animales que iniciaron el tratamiento con SNIPR001 se indican en verde, los demás en gris. E) Recuperación de E. coli b17 en heces de ratón 8 y 24 h después del inicio del tratamiento con la administración tres veces al día de las CAP α15.2, α20.4, α48.4 o α51.5, y en combinación con SNIPR001, lo que confirma la sinergia de las CAP.
Descripción detallada
La invención encuentra aplicación para combatir infecciones porE. coliB2 dañinas o potencialmente mortales en diversos entornos, tales como infecciones UTI, pacientes trasplantados, pacientes con cáncer y otros pacientes inmunodeprimidos o que toman inmunosupresores.
Cualquier referencia en la presente memoria a partículas de la invención debe entenderse como partículas comprendidas en una composición de la invención, según las reivindicaciones.
El tratamiento del cáncer continúa avanzando y las tasas de supervivencia de las personas con malignidades hematológicas están aumentando. Sin embargo, esta población está inmunocomprometida y los regímenes de quimioterapia causan supresión de la médula ósea y mucositis gastrointestinal con una mayor permeabilidad intestinal asociada. La translocación de bacterias intestinales, incluidaE. coli,desde el tracto gastrointestinal es una causa frecuente de infecciones del torrente sanguíneo (BSI). La mortalidad relacionada con las BSI puede ser de hasta el 50 %; por lo tanto, la profilaxis antimicrobiana se aplica en personas con riesgo de neutropenia febril. No existen terapias aprobadas para la prevención de las BSI en pacientes con cánceres hematológicos, sin embargo, las fluoroquinolonas se usan sin autorización en los Estados Unidos. Esta práctica de profilaxis antibiótica está en desacuerdo con el paradigma emergente de que mantener un microbioma normal es importante para mantener el tono inmunológico que potencialmente beneficia el resultado de los tratamientos oncológicos. De hecho, las alteraciones del microbioma con antibióticos de amplio espectro son un factor de riesgo en la gestión profiláctica de pacientes con riesgo de neutropenia febril. Más allá de los efectos secundarios de las fluoroquinolonas, incluidas las advertencias y precauciones de seguridad, la resistencia bacteriana está aumentando y se acerca al 60 % en EE. UU.
En pacientes inmunocomprometidos con malignidades hematológicas con riesgo de desarrollar neutropenia,E. colies responsable del 25,1-30 % de todos los casos de bacteriemia, con una tasa de mortalidad a los 90 días del 35,8 %. Además, hasta el 65 % de lasE. coliaisladas como patógeno causante de las BSI en pacientes con cánceres hematológicos sometidos a trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT) fueron resistentes a las fluoroquinolonas. Por consiguiente, se necesitan nuevas opciones terapéuticas y profilácticas de espectro reducido para prevenir infecciones en estos pacientes vulnerables. La invención aborda esta necesidad.
Para este fin, la divulgación proporciona composiciones, métodos y usos.
La invención proporciona una composición que comprende al menos 4 tipos diferentes de partículas de transducción, en donde cada una de dichas partículas comprende un ácido nucleico y dichas partículas son capaces de ponerse en contacto con células deE. colie introducir en ellas el ácido nucleico, en donde (a) dicho ácido nucleico de cada partícula comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un producto de interés (POI), en donde el ácido nucleico es capaz de expresar el POI en una célula deE. coli;y en donde el POI comprende:
(i) una nucleasa Cas para dirigirse y cortar el ADN de la célula deE. coli,modificando o matando así la célula; y
(ii) al menos un ARNcr o ARN guía que comprende cada uno una secuencia espaciadora que es complementaria a una secuencia protoespaciadora comprendida por un gen seleccionado de los genes del filogrupo B2 deE colifimH, bolA, rpoH, lptA y murA y cada uno de los cuales es operable con la nucleasa Cas para el direccionamiento al ADN en las células deE. coli;
(b) cada partícula comprende:
(iii) un resto de adhesión para reconocer y unirse a un resto cognado seleccionado de un LPS y Tsx mostrados en la superficie de las células de E. coli; y
(iv) una cápside de fago que contiene el ácido nucleico; y
(c) dichos al menos 4 tipos diferentes de partículas de transducción comprenden
A: partículas que comprenden un resto de adhesión a LPS y un resto de adhesión a LamB;
B: partículas que comprenden un resto de adhesión a LPS y un resto de adhesión a Tsx; y
C: partículas que comprenden un resto de adhesión a Tsx, pero que están desprovistas de restos de adhesión a LamB y LPS;
y en donde las partículas de la composición se dirigen a todos los genes deE. colifimH, bolA, rpoH, lptA y murA. En un primer ejemplo de la divulgación, las composiciones reivindicadas que comprenden una pluralidad de partículas de transducción son para su uso en un método para tratar o prevenir una infección por células deE. colien un sujeto humano o animal, en donde el método comprende administrar las partículas al sujeto, en donde (a) cada partícula comprende un ácido nucleico que codifica una nucleasa para dirigirse a los genomas de células deE. coli,en donde dichas partículas administradas entran en contacto con las células e introducen en ellas el ácido nucleico, en donde la nucleasa se expresa en las células y corta el ADN genómico de las células, matando así las células o reduciendo el crecimiento o la proliferación de las células en el sujeto;
(b) las células deE. colison células del filogrupo B2 deE. coli; y
(c) cada partícula comprende un resto de adhesión para reconocer y unirse a un resto cognado seleccionado de LPS, LamB y Tsx mostrado en la superficie de las células deE colidel filogrupo B2.
Opcionalmente, el ADN genómico es ADN cromosómico de las células. Adicionalmente o alternativamente, el ADN genómico es ADN plasmídico de las células.
Opcionalmente, cada partícula comprende un ácido nucleico que codifica una nucleasa para el direccionamiento cromosómico, en donde dichas partículas administradas entran en contacto con las células e introducen en ellas el ácido nucleico, en donde la nucleasa se expresa en las células y corta los cromosomas de las células, matando así las células o reduciendo el crecimiento o la proliferación de las células en el sujeto. El ser humano puede ser hombre o mujer. El ser humano puede ser un adulto o un niño. El ser humano puede tener 18 años o más, por ejemplo, 40, 50, 60, 70, 80 o más. El ser humano puede ser menor de 18 años, por ejemplo, un adolescente, por ejemplo, un bebé, por ejemplo, hasta 5 años de edad, por ejemplo, hasta 2 años de edad. El animal puede ser un ganado o un animal de compañía, por ejemplo, un perro o un gato). El animal puede ser un ave (por ejemplo, un ave de corral, por ejemplo, un pollo, pavo o pato, preferiblemente un pollo), una vaca, una oveja, una cabra o un cerdo (por ejemplo, un cerdo neonato o un cerdo menor de 6 meses de edad).
La infección puede ser una infección del torrente sanguíneo. La infección puede ser una infección nosocomial. En un ejemplo, cada resto de adhesión es una proteína de la fibra de la cola. En un ejemplo, cada partícula comprende una fibra de la cola de fago que comprende o está fusionada a dicho resto de adhesión. En un ejemplo, cada resto de adhesión es un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, un dominio variable único de anticuerpo. En un ejemplo, cada resto de adhesión es un nanocuerpo. En un ejemplo, cada resto de adhesión comprende un sitio de unión de anticuerpo que es capaz de unirse al resto cognado. Por ejemplo, cada resto de adhesión comprende un dominio variable único de anticuerpo (es decir, un dAb), tal como un nanocuerpo. En un ejemplo, cada partícula comprende una o más fibras o espigas de cola de fago, comprendiendo cada fibra o espiga dicho resto de adhesión.
Por ejemplo, se administran al sujeto lo al menos 4 tipos diferentes de dicha partícula de transducción, cada uno de los cuales comprende uno o una pluralidad de tipos de fibras de la cola que comprenden restos de adhesión, en donde los demás tipos de partículas no comprenden dicho uno o una pluralidad de tipos de fibras de la cola. En un ejemplo, cada tipo de dicha pluralidad de fibras de la cola se diferencia de los otros tipos por el tipo de resto de adhesión que comprende.
En las bacterias Gram-negativas, la capa de peptidoglicano es relativamente delgada y está localizada en la parte interna de la membrana externa, el componente principal de la pared celular. Estas dos capas están conectadas por las lipoproteínas de Braun. La membrana externa es una estructura sofisticada compuesta por una bicapa lipídica adornada con proteínas, polisacáridos y lípidos; estas dos últimas moléculas forman la capa de LPS. Los LPS son complejos que consisten en tres partes: lípido A, el polisacárido central y el polisacárido O. El lípido A, en general, está compuesto de ácidos grasos unidos a disacáridos de fosfato de glucosamina. El polisacárido central está conectado al lípido A mediante un enlace cetodesoxioctonato. El polisacárido central y el polisacárido O (cadena O o antígeno O) contienen varias unidades de residuos de azúcar que se extienden hacia fuera hacia la membrana externa. Las células que contienen los tres componentes del LPS se denominan tipo liso (S) y las que carecen de la porción de polisacárido O se distinguen como tipo rugoso (R).
Opcionalmente, el LPS es LPS liso o LPS rugoso.
Por ejemplo, las partículas comprenden al menos un tipo de partícula cuyo resto de adhesión es capaz de unirse al antígeno O de LPS.
E. colies una especie muy versátil cuya diversidad ha sido explorada desde varias perspectivas destacando, por ejemplo, agrupaciones filogenéticas, patovares, así como una amplia gama de serotipos O. El antígeno O altamente variable, la parte más externa del componente de lipopolisacárido de la membrana externa deE. coli,está unido al lípido A más interno a través de la región central de LPS de la cual se han caracterizado hasta ahora 5 estructuras diferentes, denominadas K-12, R1, R2, R3 y R4. Las cepas de los filogrupos B2 y C están dominadas principalmente por el tipo R1. Las cepas dentro del filogrupo B2 pueden portar un núcleo K-12, por ejemplo, perteneciente al complejo STc131, uno de los principales clones de cepas deE. colipatógenas extraintestinales (ExPEC).
Preferiblemente, el LPS comprende una región central R1. Por ejemplo, el LPS comprende una región central R2. Por ejemplo, el LPS comprende una región central R3. Por ejemplo, el LPS comprende una región central R4. Por ejemplo, el LPS comprende una región central K-12.
Opcionalmente, LamB comprende el aminoácido de la SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70, 80, 90 o 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 1. Opcionalmente, Tsx comprende el aminoácido de la SEQ ID NO: 2 o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70, 80, 90 o 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 2. Opcionalmente, LamB está codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 3 o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70, 80, 90 o 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 3. Opcionalmente, Tsx está codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 4 o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70, 80, 90 o 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 4.
El gen tsx de Escherichia coli codifica una proteína integral de membrana externa (Tsx) que funciona como un canal específico de sustrato para desoxinucleósidos y el antibiótico albicidina. En un ejemplo, la proteína formadora de canales específicos de nucleósidos Tsx deE. colitiene un Número de Acceso Uniprot de P0A927 o es un homólogo del mismo. En un ejemplo, la porina de membrana externa de maltosa (maltoporina) LamB deE. colitiene un Número de Acceso Uniprot de P02943 o es un homólogo del mismo.
Homólogo: Una secuencia génica, de nucleótidos o de proteínas relacionada con una segunda secuencia génica, de nucleótidos o de proteínas por descendencia de una secuencia ancestral común de ADN o proteína. El término homólogo puede aplicarse a la relación entre genes separados por el evento de, o a la relación entre genes separados por el evento de duplicación genética.
En un ejemplo, las células deE. colicomprendenE. coliUPEC. En un ejemplo, las células deE. colicomprenden células deE. colipatógenas intestinales (ExPEC).
El método puede ser para tratar o prevenir la infección del sujeto por una cepa deE coliseleccionada del grupo ST131, ST1193, ST648, ST315, ST405, ST361, ST88 y ST453.
En un ejemplo preferido, la cepa es ST1193. En otro ejemplo preferido, la cepa es ST131.
El método puede ser para tratar o prevenir la infección del sujeto por una pluralidad de diferentes cepas del filogrupo B2 deE coli;opcionalmente, en donde la pluralidad comprende células deE coliST131 y ST1193.Se ha encontrado queE. coliST131 y/o ST1193 son virulentas y se asocian con resistencia a las fluoroquinolonas. Como se muestra en la sección de Ejemplos de la presente memoria, las composiciones de la invención son útiles para tratar o prevenir la infección por dichas cepas. Opcionalmente, dicha pluralidad de cepas comprende las cepas deE. coliST131 y/o ST1193. Opcionalmente, dicha pluralidad de cepas comprende cepas resistentes a las fluoroquinolonas. Por ejemplo, dicha pluralidad de cepas comprende cepas deE. coliST131 y/o ST1193 resistentes a las fluoroquinolonas.
Se han encontrado las cepas deE. coliB2-ST73 (CH24-30); B2-ST73 (CH24-103); B2-ST131 (CH40-30); B2-ST141 (CH52-5);B2-ST372 (CH103-9); B2-ST404 (CH14-27); B2-ST404 (CH14-807) y B2-ST1193 (CH14-64) en entornos de UTI. En un ejemplo (por ejemplo, en donde el sujeto padece o está en riesgo de padecer UTI), las E. coli B2 comprenden una o más cepas seleccionadas de B2-ST73 (CH24-30); B2-ST73 (CH24-103); B2-ST131 (CH40-30); B2-ST141 (CH52-5); B2-ST372 (CH103-9); B2-ST404 (CH14-27); B2-ST404 (CH14-807) y B2-ST1193 (CH14-64).
El sujeto puede ser un paciente trasplantado o con cáncer (opcionalmente, un paciente con cáncer hematológico), o en donde el paciente padece o está en riesgo de padecer una infección del tracto urinario (UTI); y opcionalmente, en donde el trasplante es un trasplante de órgano sólido o de células madre (opcionalmente, un trasplante de células hematopoyéticas) o en donde el trasplante es un trasplante de un dispositivo médico.
Por ejemplo, el sujeto es un paciente con cáncer hematológico que padece neutropenia. Por ejemplo, el sujeto es un paciente con trasplante de células madre hematopoyéticas.
Un dispositivo médico adecuado puede ser, por ejemplo, un dispositivo cardíaco (por ejemplo, un dispositivo de asistencia ventricular, tal como un dispositivo de asistencia del ventrículo izquierdo (LVAD)), un catéter (por ejemplo, un catéter biliar) o una prótesis (por ejemplo, una prótesis articular).
En un ejemplo, el paciente padece una infección porE. colisecuestrada del filogrupo B2.En un ejemplo, lasE. colisonE. colisecuestradas del filogrupo B2.
Por ejemplo, el sujeto padece o está en riesgo de padecer sinusitis bacteriana aguda, neumonía, infecciones del tracto urinario, prostatitis crónica o gastroenteritis causadas porE. colidel filogrupo B2.Por ejemplo, el sujeto es un paciente humano masculino de cirugía de próstata.
El método puede llevarse a cabo antes de que el sujeto reciba un trasplante.
Por ejemplo, el trasplante es un trasplante de un órgano sólido o de células madre (opcionalmente, un trasplante de células hematopoyéticas).
Las células deE. coliB2 pueden comprender una cepa deE. colique causa sepsis, septicemia o diarrea en los seres humanos.
El serotipo O157:H7 deEscherichia colienterohemorrágica (EHEC) es un patógeno humano responsable de brotes de diarrea sanguinolenta y síndrome hemolítico urémico (HUS) en todo el mundo. Los antimicrobianos convencionales desencadenan una respuesta SOS en EHEC que promueve la liberación de la potente toxina Shiga que es responsable de gran parte de la morbilidad y mortalidad asociadas con la infección por EHEC. El ganado es un reservorio natural de EHEC, y aproximadamente el 75 % de los brotes de EHEC están ligados al consumo de productos derivados de bovinos contaminados. La EHEC causa enfermedad en los seres humanos, pero es asintomática en rumiantes adultos. Las características de la infección por el serotipo O157:H7 deE. coli(EHEC) incluyen calambres abdominales y diarrea sanguinolenta, así como la complicación potencialmente mortal del síndrome hemolítico urémico (HUS). Actualmente, existe la necesidad de un tratamiento para las infecciones por EHEC (Goldwater y Bettelheim, 2012). El uso de antibióticos convencionales exacerba la citotoxicidad mediada por la toxina Shiga. En un estudio epidemiológico realizado por los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades, los pacientes tratados con antibióticos para la enteritis por EHEC presentaron un mayor riesgo de desarrollar HUS (Slutsker et al., 1998). Estudios adicionales respaldan la contraindicación de los antibióticos en la infección por EHEC; los niños que recibían terapia antibiótica para la colitis hemorrágica asociada a EHEC presentaron una mayor probabilidad de desarrollar HUS (Wong et al., 2000; Zimmerhackl, 2000; Safdar et al., 2002; Tarr et al., 2005). Los antibióticos convencionales promueven la producción de toxina Shiga al mejorar la replicación y expresión de genesstxcodificados en un genoma de profago lambdoide cromosómicamente integrado. El enfoque de las composiciones de la presente invención se basa en el corte por nucleasas del ADN genómico de la célula diana. La inducción destxtambién promueve la lisis mediada por fagos de la envoltura celular de EHEC, lo que permite la liberación y diseminación de la toxina Shiga en el entono (Karch et al., 1999; Matsushiro et al., 1999; Wagner et al., 2002). Por lo tanto, ventajosamente, la divulgación proporciona medios alternativos para tratar EHEC del filogrupo B2 en sujetos humanos y animales. En un ejemplo, el sujeto (por ejemplo, un ser humano) padece o está en riesgo de padecer el síndrome hemolítico urémico (HUS); por ejemplo, el sujeto padece una infección por E. coli, tal como una infección porE. coliEHEC.
El método puede ser para prevenir el síndrome hemolítico urémico (HUS), una infección UTI, sepsis, septicemia o diarrea en el sujeto.
La composición o el método pueden ser para tratar o prevenir una infección del torrente sanguíneo por células patógenasde E. colidel filogrupo B2 en el sujeto.
En un ejemplo, cada partícula de la composición comprende una cápside de fago que contiene el ácido nucleico, en donde la cápside comprende proteínas de la cápside de un fago T-par (opcionalmente T4) o lambda.
Como es sabido por el destinatario experto, las partículas de transducción son capaces de operar para infectar sus células huésped cognadas para introducir en ellas ácido nucleico mediante transducción.
En un ejemplo, cada partícula de la composición es un fago (opcionalmente un fago lítico) o un fagémido empaquetado.
En un ejemplo, cada tipo de partícula en la composición comprende un tipo de resto de adhesión o colección de tipos de restos de adhesión que difiere de los otros tipos de partículas.
En un ejemplo, se administran al sujeto 5 tipos diferentes de partículas de transducción. En un ejemplo, se administran al sujeto 6 tipos diferentes de partículas de transducción.
En un ejemplo, cada partícula de la composición comprende una cápside de fago que contiene dicho ácido nucleico; en donde se administran al sujeto al menos 4 tipos diferentes de partículas de transducción; y en donde se administran al sujeto un primer tipo de partícula de transducción, un segundo tipo de partícula de transducción, un tercer tipo de partícula de transducción y un cuarto tipo de partícula de transducción, en donde el primer tipo de partícula comprende un primer resto de adhesión que es capaz de reconocer y unirse a LPS mostrado enE. coliB2, el segundo tipo de partícula comprende un segundo resto de adhesión que es capaz de reconocer y unirse a LamB mostrado enE. coliB2, el tercer tipo de partícula comprende un segundo resto de adhesión que es capaz de reconocer y unirse a Tsx mostrado enE. coliB2,y el cuarto tipo de partícula comprende un segundo resto de adhesión que es capaz de reconocer y unirse a LPS mostrado enE. coliB2, en donde los restos de adhesión de dichas partículas son diferentes entre sí.
En un ejemplo, cada partícula de la composición comprende una cápside de fago que contiene dicho ácido nucleico; en donde se administran al sujeto al menos 4 tipos diferentes de partículas de transducción; y en donde se administran al sujeto un primer tipo de partícula de transducción, un segundo tipo de partícula de transducción, un tercer tipo de partícula de transducción y un cuarto tipo de partícula de transducción, en donde el primer tipo de partícula comprende un primer resto de adhesión que es capaz de reconocer y unirse a LPS mostrado enE. coliB2, el segundo tipo de partícula comprende un segundo resto de adhesión que es capaz de reconocer y unirse a LamB mostrado enE. coliB2, el tercer tipo de partícula comprende un segundo resto de adhesión que es capaz de reconocer y unirse a Tsx mostrado enE. coliB2, y el cuarto tipo de partícula comprende un segundo resto de adhesión que es capaz de reconocer y unirse a LamB mostrado enE. coliB2, en donde los restos de adhesión de dichas partículas son diferentes entre sí.
En un ejemplo, cada partícula de la composición comprende una cápside de fago que contiene dicho ácido nucleico; en donde se administran al sujeto al menos 4 tipos diferentes de partículas de transducción; y en donde se administran al sujeto un primer tipo de partícula de transducción, un segundo tipo de partícula de transducción, un tercer tipo de partícula de transducción y un cuarto tipo de partícula de transducción, en donde el primer tipo de partícula comprende un primer resto de adhesión que es capaz de reconocer y unirse a LPS mostrado enE. coliB2, el segundo tipo de partícula comprende un segundo resto de adhesión que es capaz de reconocer y unirse a LamB mostrado enE. coliB2, el tercer tipo de partícula comprende un segundo resto de adhesión que es capaz de reconocer y unirse a Tsx mostrado enE. coliB2, y el cuarto tipo de partícula comprende un segundo resto de adhesión que es capaz de reconocer y unirse a Tsx mostrado enE. coliB2, en donde los restos de adhesión de dichas partículas son diferentes entre sí.
El ácido nucleico de cada partícula de la composición puede comprender una secuencia de nucleótidos (N1) que codifica dicha nucleasa, en donde cada partícula es un fago T-par sintético (opcionalmente un fago T4) que comprende una inserción de N1 en el genoma del fago, en donde la región está entre el genpin(inhibidor de proteasa) y el geniPII(proteína interna).
Opcionalmente, el fago es
(a) un fago T-par sintético (por ejemplo, un T4) que comprende una deleción de ADN de, y/o una inserción de ADN heterólogo en, una región del genoma del fago correspondiente a una región entre las coordenadas (i) 1887 y 8983;
(ii) 2625 y 8092;
(iii) 1904 y 8113;
(iv) 2668 y 7178;
(v) 7844 y 11117;
(vi) 8643 y 10313;
(vii) 9231 y 13383;
(viii) 9480 y 12224;
(ix) 8454 y 17479; o
(x) 9067 y 16673;
en donde las coordenadas son con referencia al genoma del fago T4 de tipo salvaje (SEQ ID NO: 5).
En un ejemplo, la nucleasa es una nucleasa tipo I, II, III, IV, V o VI, opcionalmente una Cas9 o una Cas3.
En un ejemplo, se administran al sujeto al menos 1 x 10<7>UFP de partículas.
En un ejemplo, se administran al sujeto de 1 x 10<8>a 1 x 10<13>UFP de partículas. En un ejemplo, se administran al sujeto de 1 x 10<8>a 1 x 10<12>UFP de partículas. En un ejemplo, se administran al sujeto de 1 x 10<10>a 1 x 10<12>UFP de partículas.
En un ejemplo, las partículas se administran al sujeto a una MOI (multiplicidad de infección) de al menos 0,01. Opcionalmente, las partículas se administran al sujeto a una MOI no superior a 1. Opcionalmente, las partículas se administran al sujeto a una MOI de entre 0,001 y 1. Opcionalmente, las partículas se administran al sujeto a una MOI de entre 0,01 y 1. Opcionalmente, las partículas se administran al sujeto a una MOI de entre 0,1 y 1. En un ejemplo, la cepa o al menos una cepa es una cepa resistente a los antibióticos o MDR; y/o en donde la cepa o al menos una cepa es una cepa B2-I.
Por ejemplo, la cepa o al menos una cepa es una cepa seleccionada de B2-I (STc131), B2-II, B2-IX y B2-VI. Por ejemplo, al menos una cepa MDR es resistente a la fluoroquinolona y la cepa es unaE. coliproductora de beta-lactamasa (ESBL).
En un ejemplo, cuando la cepa es una cepa resistente a antibióticos o MDR, el antibiótico es fluoroquinolona (opcionalmente levofloxacino), carbapenem o vancomicina; y/o en donde lasE. colisonE. coliproductoras de beta-lactamasa (ESBL).
Opcionalmente, el antibiótico se selecciona de ciprofloxacino (por ejemplo, Cipro<TM>), gemifloxacino (por ejemplo, Factive<TM>), levofloxacino (por ejemplo, Levaquin<TM>), moxifloxacino (por ejemplo, Avelox<TM>) y ofloxacino.
Por ejemplo, la E. coli produce CTX-M-15. CTX-M-15 es la enzima más abundante en E. coli productora de ESBL que causa infecciones humanas.
Preferiblemente, el antibiótico es fluoroquinolona (FQ). Por ejemplo, la FQ es levofloxacino. El levofloxacino, comercializado bajo la marca Levaquin™, entre otras, es una medicación antibiótica. Se utiliza para tratar diversas infecciones bacterianas, incluyendo la sinusitis bacteriana aguda, la neumonía, las infecciones del tracto urinario, la prostatitis crónica y algunos tipos de gastroenteritis. Se recomienda la profilaxis con levofloxacino para prevenir las infecciones del torrente sanguíneo (BSI) por bacterias gram-negativas en pacientes con neutropenia inducida por quimioterapia prolongada. Sin embargo, el aumento de la resistencia a las fluoroquinolonas puede disminuir la eficacia de este enfoque (por ejemplo, Clin Infect Dis.5 de octubre de 2021;73(7):1257-1265. doi: 10.1093/cid/ciab404, "Colonization With Fluoroquinolone-Resistant Enterobacterales Decreases the Effectiveness of Fluoroquinolone Prophylaxis in Hematopoietic Cell Transplant Recipients, Michael J Satlinet al.).Este estudio encontró que, en los pacientes evaluados, casi un tercio de los receptores de trasplante de células hematopoyéticas (HCT) con colonización antes del trasplantepor Enterobacteralesresistentes a fluoroquinolonas (FQRE) desarrolló infecciones del torrente sanguíneo (BSI) por bacterias gram-negativas mientras recibían profilaxis con levofloxacino, y las infecciones generalmente fueron causadas por sus cepas colonizadoras. Por el contrario, la profilaxis con levofloxacino fue altamente efectiva en pacientes que no estaban colonizados inicialmente con FQRE. Los autores encontraron que el 23 % de los pacientes ingresados para HCT estaban colonizados con FQRE yE. coliera la especie predominante. Los pacientes con malignidades hematológicas que reciben quimioterapia intensiva, incluidos aquellos sometidos a trasplante de células hematopoyéticas (HCT), con frecuencia desarrollan neutropenia grave y mucositis gastrointestinal, lo que los coloca en alto riesgo de desarrollar infecciones del torrente sanguíneo (BSI) por bacterias entéricas gram-negativas(Enterobacterales).Los pacientes neutropénicos a menudo sufren consecuencias graves por BSI causadas porEnterobacterales,con tasas de mortalidad tan altas como un 15 %-20 %. Además, muchas Enterobacterales resistentes a las fluoroquinolonas (FQRE) también albergan βlactamasas de espectro extendido (ESBL); por lo tanto, las infecciones en progreso que ocurren a pesar de la profilaxis con fluoroquinolonas pueden ser resistentes a las terapias antimicrobianas de primera línea para la fiebre y la neutropenia. Finalmente, los efectos adversos de las fluoroquinolonas se han vuelto cada vez más evidentes, incluyendo la infección porClostridioides difficile,la disección y rotura aórtica, la disglucemia, la tendinopatía, la prolongación del intervalo QT y los cambios en el estado mental. Por lo tanto, las fluoroquinolonas solo se deben administrar a los pacientes cuando sea probable que proporcionen un beneficio clínico que justifique estos posibles efectos adversos. Por lo tanto, aunque las fluoroquinolonas pueden disminuir el riesgo de BSI por gram-negativas en muchos pacientes, aquellos que están colonizados con FQRE pueden no beneficiarse de la profilaxis con fluoroquinolonas.
La alta tasa y la ausencia de factores de riesgo para la colonización por FQRE sugieren que los FQRE son prevalentes en la comunidad. De hecho, un estudio de aislados urinarios entre pacientes ambulatorios en los Estados Unidos demostró que el 12 % de los aislados deE. colide mujeres jóvenes y el 29 % de los aislados deE. colide mujeres mayores eran resistentes a las fluoroquinolonas. Un estudio de vigilancia de 1.831 aislados urinarios deE. colide 2017 encontró que una cuarta parte era resistente a FQ. Además, se encontró que el 13 %-16 % de los hombres sometidos a biopsias de próstata transrectales estaban colonizados conE. coliresistente a las fluoroquinolonas. Casi la mitad de los aislados deE. coliresistentes a las fluoroquinolonas en el estudio fueron ST131, un tipo de secuencia común que se ha extendido por todo el mundo y cuyos aislados son frecuentemente resistentes a las fluoroquinolonas y productores de ESBL.
La bacteriemia causada porEnterobacteriaceaeproductoras de β-lactamasa de espectro extendido (ESBL) (ESBL-E), tales comoE. coli,se asocia con una terapia empírica inadecuada y una mortalidad sustancial en pacientes neutropénicos (véase, por ejemplo, "Colonization With Levofloxacin-resistant Extended-spectrum β-Lactamase-producing Enterobacteriaceae and Risk of Bacteremia in Hematopoieic Stem Cell Transplant Recipients", Satlin MJ et al, Clin Infect Dis. 13 de noviembre de 2018;67(11):1720-1728. doi: 10.1093/cid/ciy363). El estudio encontró que los receptores de HSCT que están colonizados con ESBL-E resistente a levofloxacino antes del trasplante y que reciben profilaxis con levofloxacino tienen altas tasas de bacteriemia de su cepa colonizadora durante la neutropenia. En este estudio de centro único de 312 receptores de HSCT, se encontró que el 10 % de los pacientes presentaban colonización por ESBL-E antes del trasplante. Casi un tercio de los pacientes con colonización por ESBL-E antes del trasplante desarrollaron bacteriemia por ESBL-E posteriormente, mientras presentaban neutropenia tras el trasplante, en comparación con <1 % de los pacientes que no presentaban colonización inicial por ESBL-E. Además, los ESBL-E en el torrente sanguíneo y tracto gastrointestinal presentaron perfiles idénticos de MLST y PFGE en todos los casos, lo que sugiere que estos pacientes desarrollaron bacteriemia a partir de sus aislados colonizadores.
En un ejemplo, la composición o método es para prevenir la traslocaciónde E colidel filogrupo B2 desde el tracto gastrointestinal al torrente sanguíneo del sujeto, previniendo o reduciendo así la bacteriemia en el paciente.
En un ejemplo, la composición o método es para prevenir la translocaciónde E colidel filogrupo B2 del tracto urinario al torrente sanguíneo del sujeto, previniendo o reduciendo así la bacteriemia en el paciente.
En un ejemplo, laE. colise encuentra en el tracto gastrointestinal del sujeto. Opcionalmente, en estos ejemplos, la composición se administra al sujeto por vía oral.
En otro ejemplo, laE. colise encuentra en el tracto urinario del sujeto. Por ejemplo, la infección es una infección renal, vesical o uretral. Opcionalmente, en estos ejemplos, la composición se administra al tracto urinario del sujeto, tal como mediante un catéter.
En un segundo ejemplo, las composiciones reivindicadas son para su uso en un método para tratar o prevenir una infección por células deE. colien un sujeto humano o animal, comprendiendo el método administrar al sujeto una pluralidad de partículas de transducción, en donde
(a) cada partícula comprende un ácido nucleico que codifica un ARNcr o ARN guía que es operable con una nucleasa Cas para el direccionamiento cromosómico en las células, en donde dichas partículas administradas entran en contacto con las células e introducen en ellas el ácido nucleico, en donde el ARNcr o ARN guía se expresa y guía la nucleasa Cas, en donde la nucleasa corta los cromosomas de las células, matando así las células o reduciendo el crecimiento o la proliferación de las células en el sujeto;
(b) las célulasde E. colison célulasde E. colidel filogrupo B2;y
(c) cada partícula comprende un resto de adhesión para reconocer y unirse a un resto cognado seleccionado de LPS, LamB y Tsx mostrada en la superficie de las célulasde E. colidel filogrupo B2.
Cada ácido nucleico codifica preferiblemente una pluralidad de ARNc diferentes que comprenden secuencias espaciadoras que se dirigen a genes cromosómicosde E. coli.
Cada ARNcr o ARN guía comprende un espaciador que se dirige a un gen deE. coliseleccionado del grupofimH,bolA,rpoH,lptAymurA. Opcionalmente, cada ácido nucleico codifica una pluralidad de diferentes ARNc o ARN guía, en donde los ARNc o ARN guía se dirigen al menos a 2, 3 o 4 (o se dirigen a todos los) genes deE. coliseleccionados del grupofimH,bolA,rpoH,lptAymurA. Opcionalmente, cada ácido nucleico codifica una pluralidad de diferentes ARNc o ARN guía, en donde los ARNc o ARN guía se dirigen a fimH y bolA. Opcionalmente, cada ácido nucleico codifica una pluralidad de diferentes ARNc o ARN guía, en donde los ARNc o ARN guía se dirigen a rpoH e lptA. Opcionalmente, cada ácido nucleico codifica una pluralidad de diferentes ARNc o ARN guía, en donde los ARNc o ARN guía se dirigen a fimH y murA. Opcionalmente, cada ARNcr o ARN guía comprende una secuencia espaciadora complementaria a un gen deE. coliseleccionado del grupofimH,bolA,rpoH,lptAymurA. Opcionalmente, cada ARNcr o ARN guía comprende una secuencia espaciadora que es al menos un 80, 90 o 95 % idéntica a una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo SEQ ID NO: 6-10.
Opcionalmente, cada ácido nucleico codifica un primer ARNcr, un segundo ARNcr, un tercer ARNcr, un cuarto ARNcr y un quinto ARNcr, donde los ARNcr son diferentes entre sí y cada ARNcr se dirige a un gen deE. colidel filogrupo B2.Opcionalmente, cada ácido nucleico codifica un primer ARNcr, un segundo ARNcr, un tercer ARNcr, un cuarto ARNcr y un quinto ARNcr, en donde los ARNcr son diferentes entre sí y cada ARNcr es complementario a un gen deE. colidel filogrupo B2.Opcionalmente, cada ácido nucleico codifica un primer ARNcr, un segundo ARNcr, un tercer ARNcr, un cuarto ARNcr y un quinto ARNc, en donde los ARNc comprenden respectivamente la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10. Opcionalmente, cada ácido nucleico codifica un primer ARNcr, un segundo ARNcr, un tercer ARNcr, un cuarto ARNcr y un quinto ARNc, en donde los ARNc comprenden respectivamente una secuencia de nucleótidos que es al menos un 80 % idéntica a la SEQ ID NO: 6, una secuencia de nucleótidos que es al menos un 80 % idéntica a la SEQ ID NO: 7, una secuencia de nucleótidos que es al menos un 80 % idéntica a la SEQ ID NO: 8, una secuencia de nucleótidos que es al menos un 80 % idéntica a la SEQ ID NO: 9 y una secuencia de nucleótidos que es al menos un 80 % idéntica a la SEQ ID NO: 10. Opcionalmente, cada ácido nucleico codifica un primer ARNcr, un segundo ARNcr, tercer ARNcr, cuarto ARNcr y quinto ARNc, en donde los ARNc comprenden respectivamente una secuencia de nucleótidos que es al menos un 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 6, una secuencia de nucleótidos que es al menos un 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 7, una secuencia de nucleótidos que es al menos un 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 8, una secuencia de nucleótidos que es al menos un 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 9 y una secuencia de nucleótidos que es al menos un 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 10. Opcionalmente, cada ácido nucleico codifica un primer ARNcr, un segundo ARNcr, un tercer ARNcr, un cuarto ARNcr y un quinto ARNc, en donde los ARNc comprenden respectivamente una secuencia de nucleótidos que es al menos un 95, 96, 97, 98 o 99% idéntica a SEQ ID NO: 6, una secuencia de nucleótidos que es al menos 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 7, una secuencia de nucleótidos que es al menos un 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 8, una secuencia de nucleótidos que es al menos un 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 9 y una secuencia de nucleótidos que es al menos un 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 10.
En un tercer ejemplo, la composición que comprende una pluralidad de transducción es para su uso en un método para tratar o prevenir una infección por células deE. colien un sujeto humano o animal como se describe en el segundo ejemplo anterior, en donde
(a) cada partícula comprende un ácido nucleico que codifica un ARNcr o ARN guía que es operable con una nucleasa Cas para el direccionamiento cromosómico en las células, en donde dichas partículas administradas entran en contacto con las células e introducen en ellas el ácido nucleico, en donde el ARNcr o ARN guía se expresa y guía la nucleasa Cas en donde la nucleasa corta los cromosomas de las células, matando así las células o reduciendo el crecimiento o la proliferación de las células en el sujeto;
(b) las células deE. colison células deE. colidel filogrupo B2; y
(c) cada partícula comprende un resto de adhesión para reconocer y unirse a un resto cognado seleccionado de LPS, LamB y Tsx que se muestran en la superficie de las células deE. colidel filogrupo B2.
Las composiciones descritas en la presente memoria pueden ser útiles en un método para detectar la presencia de unaE. colidel filogrupo B2 en una muestra, comprendiendo el método poner en contacto la muestra que comprendeE. colidel filogrupo B2 con una composición que comprende una pluralidad de partículas de transducción, en donde
(a) cada partícula comprende un ácido nucleico que codifica una nucleasa para dirigirse a los genomas de dichas células deE. coli,en donde dichas partículas administradas entran en contacto con las células e introducen en ellas el ácido nucleico, en donde la nucleasa se expresa en las células y corta el ADN genómico de las células, matando así las células o reduciendo el crecimiento o la proliferación de las células en el sujeto; (b) cada partícula comprende un resto de adhesión para reconocer y unirse a un resto cognado seleccionado de LPS, LamB y Tsx mostrados en la superficie de las células deE. colidel filogrupo B2;y
(c) el método comprende detectar que las células deE. colidel filogrupo B2 han sido destruidas o que se ha reducido su crecimiento o proliferación.
Las composiciones descritas en la presente memoria pueden ser útiles en un método para detectar la presencia de unaE. colidel filogrupo B2 en una muestra, comprendiendo el método poner en contacto la muestra que comprendeE. colidel filogrupo B2 con una composición que comprende una pluralidad de partículas de transducción, en donde
(a) cada partícula comprende un ácido nucleico que comprende o codifica una etiqueta detectable, en donde dichas partículas administradas entran en contacto con las células e introducen en ellas el ácido nucleico, en donde opcionalmente la etiqueta se expresa en las células;
(b) cada partícula comprende un resto de adhesión para reconocer y unirse a un resto cognado seleccionado de LPS, LamB y Tsx mostrados en la superficie de las células deE. colidel filogrupo B2;y (c) el método comprende detectar células deE. colidel filogrupo B2 que comprenden la etiqueta.
Las composiciones utilizadas en los métodos de detección descritos anteriormente pueden comprender las características de las composiciones descritas en la presente memoria.
En los métodos de detección descritos anteriormente, laE. colipuede comprender una o más cepas deE. coliseleccionadas del grupo ST131, ST1193, ST648, ST315, ST405, ST361, ST88 y ST453.
En los métodos de detección descritos anteriormente, la muestra puede ser una muestra de un paciente (por ejemplo, muestra de sangre, orina, heces o saliva), en donde el sujeto es un paciente de trasplante o con cáncer (opcionalmente, un paciente con cáncer hematológico), o en donde el paciente padece o está en riesgo de padecer una infección del tracto urinario (UTI); y opcionalmente en donde el trasplante es un trasplante de órgano sólido o de células madre (opcionalmente, un trasplante de células hematopoyéticas).
En los métodos de detección descritos anteriormente, el ácido nucleico de cada partícula puede comprender una secuencia de nucleótidos (N1) que codifica dicha nucleasa, o que comprende o codifica la etiqueta en donde cada partícula es un fago T-par sintético (opcionalmente un fago T4) que comprende una inserción de N1 en el genoma del fago, en donde la región está entre el genpin(inhibidor de proteasa) y el geniPII(proteína interna).
En los métodos de detección descritos anteriormente, al menos 1 x 10<7>UFP de partículas pueden ponerse en contacto con la muestra.
En los métodos de detección descritos anteriormente, las partículas pueden ponerse en contacto con la muestra a una MOI (multiplicidad de infección) de al menos 0,01.
El etiquetado para métodos de detección es rutinario para el destinatario experto. La etiqueta puede ser, por ejemplo, una etiqueta de fluorescencia, por ejemplo, GFP. La muestra puede ser una muestra de sangre, saliva, esputo o células.
La divulgación también proporciona los ejemplos cuarto y quinto, que están totalmente respaldados por el Ejemplo 2. Los ejemplos cuarto y quinto se pueden combinar con cualquier otra característica divulgada en la presente memoria.
Los pacientes con malignidades hematológicas frecuentemente desarrollan infecciones del torrente sanguíneo debido a la translocación deE. coliy otras bacterias desde el intestino. El tratamiento antibiótico para prevenir estas infecciones tiene efectos perjudiciales sobre el microbioma y el tono inmunitario, y se ve dificultado aún más por el aumento de la resistencia a los antibióticos, en particular a las fluoroquinolonas. Como se describe en el Ejemplo 2, las composiciones de los Conceptos pueden dirigirse a bacterias en biopelículas, reducir la aparición deE. colitolerantes a fagos y superar a sus fagos WT ancestrales en experimentos de cocultivo. Las composiciones se proporcionan con un amplio rango de huéspedes en toda la filogenia deE. coli,incluyendo cepas resistentes a múltiples fármacos (filogrupo B2). Las composiciones que comprenden diferentes partículas, según los Conceptos, pueden reducir sorprendentemente la carga deE. colien el intestino murino mejor que las partículas constituyentes individuales. Las composiciones, métodos y dosis de los Conceptos encuentran utilidad para matar selectivamenteE. coli, que puede causar infecciones mortales en pacientes con cáncer hematológico, con trasplante o UTI. Las composiciones, métodos y dosis también encuentran utilidad para tratar o prevenir la infección en el torrente sanguíneo porE. coli.
En un cuarto ejemplo, las composiciones reivindicadas que comprenden una pluralidad de partículas de transducción son para su uso en un método para tratar o prevenir una infección por células deE. colien un sujeto humano o animal, en donde el método comprende administrar las partículas al sujeto, en donde (a) cada partícula comprende un ácido nucleico que codifica una nucleasa para dirigirse a los genomas de células deE. coli,en donde dichas partículas administradas entran en contacto con las células e introducen en ellas el ácido nucleico, en donde la nucleasa se expresa en las células y corta el ADN genómico de las células, matando así las células o reduciendo el crecimiento o la proliferación de las células en el sujeto;
(b) las células deE. colison células deE. colidel filogrupo B2; y
(c) cada partícula comprende un resto de adhesión para reconocer y unirse a un resto cognado seleccionado de LPS, LamB y Tsx (opcionalmente seleccionado de LPS y Tsx) mostrada en la superficie de las células deE. colidel filogrupo B2.
En un quinto ejemplo, las composiciones reivindicadas que comprenden una pluralidad de partículas de transducción son para su uso en un método para tratar o prevenir una infección por células deE. colidel filogrupo B2 en un sujeto humano o animal, en donde el método comprende administrar las partículas al sujeto, en donde
(a) cada partícula comprende un ácido nucleico que codifica una nucleasa para dirigirse a los genomas de células deE. coli,en donde dichas partículas administradas entran en contacto con las células e introducen en ellas el ácido nucleico, en donde la nucleasa se expresa en las células y corta el ADN genómico de las células, matando así las células o reduciendo el crecimiento o la proliferación de las células en el sujeto; y
(b) cada partícula comprendida por la composición es una cápside de fago T-par; opcionalmente una cápside de un fago T2, un fago similar a T2, un fago RB69 o un fago similar a RB69.
Las siguientes características son características opcionales que se pueden combinar con cualquier otra característica de la presente memoria.
Cada partícula de las composiciones reivindicadas comprende una cápside de fago que contiene el ácido nucleico. En un ejemplo, la cápside comprende proteínas de la cápside de un fago T-par (opcionalmente T2) o lambda. Opcionalmente, la cápside de cada partícula comprendida por la composición es una cápside de fago T-par; opcionalmente una cápside de un fago T2, un fago similar a T2, un fago RB69 o un fago similar a RB69. Opcionalmente, cada partícula es un fago (opcionalmente un fago lítico) o un fagémido empaquetado.
Según la invención, la composición comprende al menos 4 tipos diferentes de partículas de transducción. En un ejemplo, la composición tiene 4 (pero no más de 4) tipos diferentes de partículas de transducción.
Opcionalmente, el ácido nucleico de cada partícula comprende al menos una secuencia de nucleótidos (N1) que codifica dicho POI, en donde cada partícula es un fago T-par sintético que comprende una inserción de N1 en una Región Permisiva de Modificación (MPR) del genoma del fago, en donde la MPR se encuentra inmediatamente después delgen 49y algen Een comparación con un fago T2 de tipo salvaje de referencia. El ácido nucleico puede comprender una deleción de ADN del ADN del fago en la MPR. La inserción puede comprender hasta 5.000, 6.000, 7.000 u 8.000 pb de ADN y/o la deleción comprende hasta 5.000, 6.000, 7.000 u 8.000 pb de ADN. La MPR puede comprender ADN contiguo entre dichogen 49yel gen E, en donde el ADN contiguo tiene una longitud de al menos 1.000 pb. o en donde la MPR comprende al menos 100 pb de ADN entre dichogen 49yel gen E.
Opcionalmente, un fago T-par en la presente memoria es un fago seleccionado de T2, T4 o T6; o comprende un genoma que es al menos un 95 % idéntico al genoma de dicho fago seleccionado. Este porcentaje puede ser de al menos un 96, 97, 98 o 99 %.
En un ejemplo, el genoma del fago sintético comprende dicha inserción entre las coordenadas 9000 y 21000, en donde las coordenadas corresponden a las posiciones de nucleótidos contadas desde el nucleótido (coordenada número 1) inmediatamente posterior algen 49hacia elgen E, en comparación con un fago T2 de tipo salvaje de referencia. Opcionalmente, la inserción se encuentra entre las coordenadas 10300 y 19800, por ejemplo, entre 10359 y 19810 con referencia al genoma de T2.
Opcionalmente, la inserción se realiza en una ventana seleccionada de las siguientes ventanas (siendo los números las coordenadas con referencia al genoma de T2):
9000-21000; 10000-21000, 10100-21000, 10200-21000, 10300-21000, 10400-21000, 10500-21000, 11000-21000, 15000-21000;
9000-20000; 10000-20000, 10100-20000, 10200-20000, 10300-20000, 10400-20000, 10500-20000, 11000-20000, 15000-20000;
9000-19500; 10000-19500, 10100-19500, 10200-19500, 10300-19500, 10400-19500, 10500-19500, 11000-19500, 15000-19500;
9000-19000; 10000-19000, 10100-19000, 10200-19000, 10300-19000, 10400-19000, 10500-19000, 11000-19000, 15000-19000;
9000-18000; 10000-18000, 10100-18000, 10200-18000, 10300-18000, 10400-18000, 10500-18000, 11000-18000 y 15000-18000.
Opcionalmente, la nucleasa Cas es una nucleasa de ADNds, es decir, capaz de cortar ADNds. Opcionalmente, la nucleasa Cas es una nickasa, por ejemplo, una nickasa Cas9.
La nucleasa puede ser una nucleasa Cas tipo I, II, III, IV, V o VI, opcionalmente una Cas9 o una Cas3.
En un ejemplo preferido, el ácido nucleico comprende (opcionalmente en orden 5' a 3') un gencas3(ygcB) y un complejo génico en cascada cognado que comprendecasA(ygcL, cas8e),casB(ygcK, cas11),casC(ygcJ, cas7),casD(ygcl, cas5) ycasE(ygcH, cas6), y opcionalmente una matriz CRISPR o una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN guía que se dirige a un genoma deE. coli.
El POI comprende al menos un ARNcr o ARN guía que es operable con una Cas para el direccionamiento a ADN en célulasde E. coli. Opcionalmente, cada ARNcr o ARN guía comprende una secuencia espaciadora que es complementaria a una secuencia protoespaciadora deE. coli; opcionalmente, un protoespaciador de una célula deE. colidel filogrupo B2 o una célula deE. colide una cepa seleccionada del grupo ST131, ST1193, ST648, ST315, ST405, ST361, ST88 y ST453. Según la invención, las partículas de la composición se dirigen a todos los genes deE. coli fimH, bolA, rpoH,lptA.ymurA.
Cada ácido nucleico codifica preferiblemente una pluralidad de ARNc diferentes que comprenden secuencias espaciadoras dirigidas a genes cromosómicos deE. coli. Por ejemplo, cada ácido nucleico codifica preferiblemente una pluralidad de ARNc diferentes que comprenden secuencias espaciadoras dirigidas a 2, 3 o 4 genes cromosómicos deE. coliseleccionados defimH,bolA,rpoH,lptAymurA. En un ejemplo, la composición comprende un tipo de partícula de transducción dirigida a los genes deE. coli bolA, rpoH y fimH.Adicionalmente o alternativamente, la composición comprende un tipo de partícula de transducción dirigida a los genes deE. coli lptAymurA.Opcionalmente, la composición comprende un primer tipo de partícula de transducción dirigida a los genes deE. coli bolA, rpoH y fimH;y un segundo tipo de partícula de transducción dirigida a los genes deE. coli lptAymurA.Opcionalmente, el primer tipo de partícula es según cualquier otro primer tipo de partícula de la presente memoria que comprenda un resto de adhesión a LPS (por ejemplo, que comprenda restos de adhesión a LPS y Tsx). Opcionalmente, el segundo tipo de partícula es según cualquier otro primer tipo de partícula de la presente memoria que comprenda un resto de adhesión a Tsx. Opcionalmente, el segundo tipo de partícula comprende un resto de adhesión a LPS (por ejemplo, comprende restos de adhesión a LPS y LamB).
La secuencia protoespaciadora puede estar compuesta por un gen seleccionado de los genes deE. colifimH,bolA, rpoH, lptA.ymurA.
Según la invención, las partículas de la composición se dirigen a todos los genes deE. coli fimH, bolA, rpoH, lptA.ymurA.
La secuencia de nucleótidos que codifica el POI puede comprender un promotor activo en fase de estrés (SPA) para la expresión del POI en células deE. coli. El promotor puede ser un promotor debolAdeE. coli. El promotor puede comprender la SEQ ID NO: 13.
En un ejemplo, las células deE. colicomprenden una cepa deE. colique causa sepsis, septicemia o diarrea en seres humanos o animales.
Opcionalmente, las células deE. colison células del tracto GI. Opcionalmente, las células deE. coliestán comprendidas en un microbioma intestinal. Opcionalmente, las células deE. coliestán comprendidas en la sangre del sujeto. Opcionalmente, las célulasde E. coliestán comprendidas en el tracto urinario del sujeto. Opcionalmente, las células de E. coli están comprendidas en un microbioma seleccionado de un microbioma del tracto GI (por ejemplo, estómago), sangre, tracto urinario, boca, nariz, ojos, oídos, piel, ano o cabello. En un ejemplo, la composición es para su uso en un método para tratar o prevenir una infección por células deE. colien un sujeto humano o animal, en donde el método comprende administrar las partículas al sujeto. Opcionalmente, el método es para prevenir la translocación deE colidel filogrupo B2 del tracto gastrointestinal o urinario al torrente sanguíneo del sujeto, previniendo o reduciendo así la bacteriemia en el sujeto.
Opcionalmente, el método es para prevenir la infección porE. colien un sujeto con riesgo de neutropenia febril. El sujeto puede ser un paciente con cáncer, tal como un paciente con cáncer hematológico. La infección puede ser una infección del torrente sanguíneo en el sujeto. Por lo tanto, en un ejemplo, el método es para prevenir una infección del torrente sanguíneo porE. colien un sujeto con riesgo de neutropenia febril, en donde el sujeto es un paciente humano con cáncer, tal como un paciente con cáncer hematológico.
Se proporciona:
Un método para tratar o prevenir la sepsis, septicemia o diarrea en un sujeto humano o animal, comprendiendo el método administrar al sujeto la composición descrita en la presente memoria, en donde las célulasde E. colicomprenden una cepa deE. colique causa sepsis, septicemia o diarrea en seres humanos o animales. Un método para tratar o prevenir la infección por células deE. colien un sujeto humano o animal, en donde el método comprende administrar la composición descrita en la presente memoria al sujeto, en donde la infección se trata o se previene.
La infección puede reducirse o eliminarse. La infección puede reducirse al menos en un 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 %.
El sujeto puede ser un paciente con trasplante o cáncer (opcionalmente, un paciente con cáncer hematológico), o en donde el paciente padece o está en riesgo de padecer una infección del tracto urinario (UTI). Opcionalmente, el trasplante es un trasplante de órgano sólido o de células madre (opcionalmente, un trasplante de células hematopoyéticas) o en donde el trasplante es un trasplante de un dispositivo médico. El sujeto puede padecer un cáncer hematológico, por ejemplo, leucemia. El sujeto (por ejemplo, paciente con cáncer) puede estar en riesgo de neutropenia o puede padecer neutropenia. Preferiblemente, el sujeto padece un cáncer hematológico, por ejemplo, leucemia, y está en riesgo de neutropenia o padece neutropenia. Opcionalmente, el método se lleva a cabo antes de que el sujeto reciba un trasplante. El trasplante puede ser un trasplante de células madre, por ejemplo, cuando el sujeto es un paciente con cáncer.
La composición o el método pueden ser para prevenir el síndrome hemolítico urémico (HUS), una infección UTI, sepsis, septicemia o diarrea en un sujeto humano.
En la composición para su uso en un método, o cualquier método descrito en la presente memoria, se administran al sujeto al menos 1 x 10<7>UFP de partículas. También se proporciona una dosis de una composición descrita en la presente memoria, en donde la dosis es una dosis de al menos 1 x 10<7>UFP de dichas partículas. Por ejemplo, la dosis es al menos 1 x 10<7>, 1 x 10<8>, 1 x 10<9,>1 x 10<10>o 1 x 10<11>UFP de dichas partículas. Por ejemplo, la dosis es 1 x 10<7>, 2 x 10<9>, 2 x 10<11>UFP de dichas partículas. Por ejemplo, la dosis es de 1 x 10<7>a 2 x 10<11>UFP de dichas partículas. Por ejemplo, la dosis es de 1 x 10<7>a 2 x 10<11>UFP de dichas partículas por gramo de peso corporal del sujeto. En este método, laE. colipuede reducirse al menos en 3 o 4 log10UFC/g de peso corporal del sujeto.
La dosis puede estar comprendida por un dispositivo médico o un recipiente, por ejemplo, para administración oral o intravenosa. El dispositivo puede ser un dispositivo IV, una jeringa o comprender una aguja de inyección. El dispositivo o recipiente puede ser estéril.
Opcionalmente, las partículas se administran al sujeto a una MOI (multiplicidad de infección) de al menos 0,01. Por ejemplo, la MOI es de al menos 0,1 o 1.
Preferiblemente, las células deE. colicomprenden al menos una cepa que es una cepa resistente a antibióticos o MDR; y/o al menos una cepa B2-I. Opcionalmente, el antibiótico es una fluoroquinolona (opcionalmente levofloxacino), carbapenémico o vancomicina; y/o en donde las células deE. colicomprendenE. coliproductora de beta-lactamasa (ESBL).
Según la divulgación, se proporciona:
Un método para detectar la presencia deE. coli(opcionalmente células deE. colidel filogrupo B2) en una muestra, comprendiendo el método
(a) poner en contacto la muestra con una composición descrita en la presente memoria; y
(b) detectar que se han eliminado célulasde E. colio que se ha reducido su crecimiento o proliferación. Según la divulgación, se proporciona un método para detectar la presencia deE. coli(opcionalmente células deE. colidel filogrupo B2) en una muestra, comprendiendo el método
(a) poner en contacto la muestra con una composición descrita en la presente memoria; en donde las partículas de la composición comprenden un ácido nucleico que comprende o codifica una etiqueta detectable, en donde dichas partículas entran en contacto con las células e introducen en ellas el ácido nucleico, en donde opcionalmente la etiqueta se expresa en las células; y
(b) detectar que las células deE. colicomprenden la etiqueta.
Según la divulgación, se proporciona un método para modificar los genomas de células deE. coli,comprendiendo el método poner en contacto las células con una composición descrita en la presente memoria, en donde el ácido nucleico que codifica el POI se introduce en las células modificando así los genomas de las células.
Cuando el POI es una nucleasa, la nucleasa se expresa en las células y corta el ADN genómico de las células, matando así las células o reduciendo el crecimiento o la proliferación de las células en el sujeto.
Según la divulgación, se proporciona un método para tratar o prevenir una infección por células deE. colien un sujeto humano o animal, comprendiendo el método administrar al sujeto una composición descrita en la presente memoria.
Opcionalmente, la muestra es una muestra del paciente (por ejemplo, muestra de sangre, orina, heces o saliva), en donde el sujeto es un paciente con trasplante o cáncer (opcionalmente un paciente con cáncer hematológico), o en donde el paciente padece o está en riesgo de padecer una infección del tracto urinario (UTI); y opcionalmente en donde el trasplante es un trasplante de órgano sólido o de células madre (opcionalmente un trasplante de células hematopoyéticas).
El método puede llevarse a caboin vitro.El método puede llevarse a caboex vivo.
Opcionalmente, se pone en contacto con la muestra al menos 1 x 10<7>UFP de partículas. Opcionalmente, se pone en contacto con la muestra la UFP de partículas descrita anteriormente.
Opcionalmente, las partículas se ponen en contacto con la muestra a una MOI (multiplicidad de infección) de al menos 0,01.
Opcionalmente, cada partícula comprendida por la composición comprende una cápside de fago T-par; opcionalmente, una cápside de un fago T2, un fago similar a T2, un fago RB69 o un fago similar a RB69. Cada partícula puede comprender una cápside de un fagoTevenvirinae. Cada partícula puede ser un fagoTevenvirinaemodificado que comprende una inserción genómica de una secuencia de nucleótidos que codifica POI o dicha nucleasa (y opcionalmente un ARNcr cognado cuando la nucleasa es una Cas).
Cada partícula puede ser un fago o un fagémido empaquetado. Preferiblemente, el fago es un fago lítico. En otro ejemplo, el fago puede ser un fago no lítico. En otro ejemplo, el fago puede ser un fago temperado. Opcionalmente, el fago es un fago T2 modificado, un fago similar a T2, un fago RB69 o un fago similar a RB69. Preferiblemente, el fago es un fago similar a T2 o RB69. Preferiblemente, cada partícula es un primer fago modificado, en donde el genoma el primer fago es al menos un 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntico (por identidad de secuencia de nucleótidos) al genoma del T2 o RB69 de tipo salvaje. Preferiblemente, dicho porcentaje es al menos del 95 %. Preferiblemente, el porcentaje de identidad entre los genomas de los fagos se determina mediante análisis Mash utilizando un tamaño de kmer de 17 y 1.000.
Las células comprendenE. colidel filogrupo B2. Preferiblemente, las células son células patógenas. Preferiblemente, las células son patógenas para el sujeto. Las células pueden mediar una enfermedad o afección en el sujeto.
En un ejemplo, en las composiciones de la divulgación
(i) la nucleasa es una nucleasa Cas guiada para dirigirse al ADN de una célula deE. coli,en donde la nucleasa es capaz de expresarse en la célula para cortar el ADN de la célula, matando así la célula;
(ii) cada partícula comprende una cápside de fago que contiene el ácido nucleico; y
(iii) las partículas de la composición se dirigen a una pluralidad de genes diferentes deE. coli,seleccionados opcionalmente de genes esenciales y de virulencia.
La nucleasa es una nucleasa Cas y el ácido nucleico codifica al menos un ARNcr o ARN guía que es operable con Cas para el direccionamiento al ADN en célulasde E. coli.Opcionalmente, cada ARNcr o ARN guía comprende una secuencia espaciadora que es complementaria a una secuencia protoespaciadora deE. coli;opcionalmente, un protoespaciador de una célula deE. colidel filogrupo B2 o una célula deE. colide una cepa seleccionada del grupo ST131, ST1193, ST648, ST315, ST405, ST361, ST88 y ST453. Cada secuencia protoespaciadora puede estar comprendida por un gen seleccionado de los genesde E. coli fimH,bolA, rpoH,lptA.ymurA.Según la invención, las partículas de la composición se dirigen a todos los genes deE. coli fimH, bolA, rpoH,lptA.ymurA.
Opcionalmente, las partículas de la composición se dirigen a al menos un gen de virulencia y al menos un gen esencial. Según la invención, las partículas de la composición se dirigen a todos los genes deE. coli fimH, bolA, rpoH,lptA.ymurA.
La expresión del POI o nucleasa o ARNcr puede estar bajo el control de un promotor activo en fase de estrés (SPA). Opcionalmente, el promotor es un promotor debolAdeE. colio comprende la SEQ ID NO: 13. Adicionalmente o alternativamente, la expresión del POI o nucleasa o ARNcr puede estar bajo el control de un promotor de PJ23100de E. coli(SEQ ID NO: 14), por ejemplo, un promotor que tiene una secuencia de nucleótidos que es al menos un 80, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 14. Por ejemplo, el promotor tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 16.
Un espaciador en la presente memoria puede estar adyacente a una secuencia repetida directa en el ácido nucleico comprendido por las partículas. Por ejemplo, la repetición tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 15 (o dicha secuencia con hasta 5, 4, 3 o 2 cambios de nucleótidos en comparación con la SEQ ID NO: 15).
En un ejemplo, la expresión del POI o nucleasa o ARNcr puede estar bajo el control de un primer promotor y la expresión del resto o restos de adhesión está bajo el control de un segundo promotor que es diferente del primer promotor.
Un resto de adhesión en la presente memoria se encuentra en la superficie exterior de la partícula cognada. En un ejemplo, el resto está comprendido por una fibra de la cola, una espiga o una cápside de la partícula, preferiblemente una fibra de la cola.
En un sexto ejemplo, las composiciones reivindicadas que comprenden una pluralidad de partículas de transducción son para su uso en un método para tratar o prevenir una infección por células deE. colien un sujeto humano o animal, en donde el método comprende administrar las partículas al sujeto, en donde (a) cada partícula comprende un ácido nucleico que codifica una nucleasa para dirigirse a los genomas de células deE. coli,en donde dichas partículas administradas entran en contacto con las células e introducen en ellas el ácido nucleico, en donde la nucleasa se expresa en las células y corta el ADN genómico de las células, matando así las células o reduciendo el crecimiento o la proliferación de las células en el sujeto;
(b) las células deE. colison células deE. colidel filogrupo B2; y
(c) cada partícula comprende un resto de adhesión para reconocer y unirse a un resto cognado seleccionado de LPS, LamB y Tsx que se muestran en la superficie de las células deE. colidel filogrupo B2.
En un séptimo ejemplo, las composiciones reivindicadas son para su uso en un método para tratar o prevenir una infección por células deE. colien un sujeto humano o animal, comprendiendo el método administrar al sujeto una pluralidad de partículas de transducción, en donde el método comprende administrar las partículas al sujeto, en donde
(a) cada partícula comprende un ácido nucleico que codifica una nucleasa para dirigirse a los genomas de células deE. coli,en donde dichas partículas administradas entran en contacto con las células e introducen en ellas el ácido nucleico, en donde la nucleasa se expresa en las células y corta el ADN genómico de las células, matando así las células o reduciendo el crecimiento o la proliferación de las células en el sujeto;
(b) las célulasde E. colison células deE. colidel filogrupo B2; y
(c) cada partícula comprende un resto de adhesión para reconocer y unirse a un resto cognado seleccionado de LPS, LamB y Tsx que se muestran en la superficie de las células deE. colidel filogrupo B2.
El método puede ser para tratar o prevenir la infección del sujeto por una cepa deE coliseleccionada del grupo ST131, ST1193, ST648, ST315, ST405, ST361, ST88 y ST453.
El método puede ser para tratar o prevenir la infección del sujeto por una pluralidad de diferentes cepas deE colidel filogrupo B2; opcionalmente, en donde la pluralidad comprende células deE. coliST131 y ST1193. El sujeto puede ser un paciente con trasplante o cáncer (opcionalmente, un paciente con cáncer hematológico), o en donde el paciente padece o está en riesgo de padecer una infección del tracto urinario (UTI); y opcionalmente, en donde el trasplante es un trasplante de órgano sólido o de células madre (opcionalmente, un trasplante de células hematopoyéticas) o en donde el trasplante es un trasplante de un dispositivo médico. El método puede llevarse a cabo antes de que el sujeto reciba un trasplante.
Las células deE. coliB2 pueden comprender una cepa deE. colique causa sepsis, septicemia o diarrea en los seres humanos.
El método puede ser para prevenir el síndrome hemolítico urémico (HUS), una infección UTI, sepsis, septicemia o diarrea en el sujeto.
Cada partícula puede comprender una cápside de fago que contiene el ácido nucleico y en donde la cápside comprende proteínas de la cápside de un fago T-par (opcionalmente T4) o lambda.
Cada partícula puede ser un fago (opcionalmente un fago lítico) o un fagémido empaquetado.
Se administran al sujeto al menos 4 tipos diferentes de partículas de transducción.
El ácido nucleico de cada partícula en la composición puede comprender una secuencia de nucleótidos (N1) que codifica dicha nucleasa, en donde cada partícula es un fago T-par sintético (opcionalmente un fago T4) que comprende una inserción de N1 en el genoma del fago, en donde la región está entre el genpin(inhibidor de proteasa) y el geniPII(proteína interna).
La nucleasa puede ser una nucleasa Cas tipo I, II, III, IV, V o VI, opcionalmente una Cas9 o una Cas3.
Se puede administrar al sujeto al menos 1 x 10<7>UFP de partículas.
Las partículas pueden administrarse al sujeto a una MOI (multiplicidad de infección) de al menos 0,01.
La cepa, o al menos una cepa, puede ser una cepa resistente a antibióticos o MDR; y/o en donde la cepa, o al menos una cepa, es una cepa B2-I. Opcionalmente, el antibiótico es una fluoroquinolona (opcionalmente levofloxacino), carbapenémico o vancomicina; y/o en donde laE. coliesE. coliproductora de beta-lactamasa (ESBL).
En un octavo ejemplo, las composiciones reivindicadas son para su uso en un método para tratar o prevenir una infección por células deE. colien un sujeto humano o animal, comprendiendo el método administrar al sujeto una pluralidad de partículas de transducción, en donde
(a) cada partícula comprende un ácido nucleico que codifica un ARNcr o ARN guía que es operable con una nucleasa Cas para el direccionamiento cromosómico en las células, en donde dichas partículas administradas entran en contacto con las células e introducen en ellas el ácido nucleico, en donde el ARNcr o ARN guía se expresa y guía la nucleasa Cas en donde la nucleasa corta los cromosomas de las células, matando así las células o reduciendo el crecimiento o la proliferación de las células en el sujeto;
(b) las células deE. colison células deE. colidel filogrupo B2; y
(c) cada partícula comprende un resto de adhesión para reconocer y unirse a un resto cognado seleccionado de LPS, LamB y Tsx que se muestran en la superficie de las células deE. colidel filogrupo B2.
El método puede ser para prevenir la translocación deE colidel filogrupo B2 desde el tracto gastrointestinal o urinario al torrente sanguíneo del sujeto, previniendo o reduciendo así la bacteriemia en el paciente.
Las composiciones descritas en la presente memoria pueden ser útiles en:
Un método para tratar o prevenir una infección por células deE. colien un sujeto humano o animal, comprendiendo el método administrar al sujeto una pluralidad de partículas de transducción, en donde (a) cada partícula comprende un ácido nucleico que codifica una nucleasa para dirigirse a los genomas de células deE. coli,en donde dichas partículas administradas entran en contacto con las células e introducen en ellas el ácido nucleico, en donde la nucleasa se expresa en las células y corta el ADN genómico de las células, matando así las células o reduciendo el crecimiento o la proliferación de las células en el sujeto;
(b) las célulasde E. colison células deE. colidel filogrupo B2; y
(c) cada partícula comprende un resto de adhesión para reconocer y unirse a un resto cognado seleccionado de LPS, LamB y Tsx que se muestran en la superficie de las células deE. colidel filogrupo B2.
Las composiciones descritas en la presente memoria pueden ser útiles en:
Un método para tratar o prevenir una infección por células deE. colien un sujeto humano o animal, comprendiendo el método administrar al sujeto una pluralidad de partículas de transducción, en donde (a) cada partícula comprende un ácido nucleico que codifica un ARNcr o ARN guía que es operable con una nucleasa Cas para el direccionamiento cromosómico en las células, en donde dichas partículas administradas entran en contacto con las células e introducen en ellas el ácido nucleico, en donde el ARNcr o ARN guía se expresa y guía la nucleasa Cas en donde la nucleasa corta los cromosomas de las células, matando así las células o reduciendo el crecimiento o la proliferación de las células en el sujeto;
(b) las células deE. colison células deE. colidel filogrupo B2; y
(c) cada partícula comprende un resto de adhesión para reconocer y unirse a un resto cognado seleccionado de LPS, LamB y Tsx que se muestran en la superficie de las células deE. colidel filogrupo B2.
Las composiciones descritas en la presente memoria pueden ser útiles en:
Un método para tratar o prevenir la bacteriemia porE. colien un sujeto humano o animal, comprendiendo el método administrar al sujeto una pluralidad de partículas de transducción, en donde
(a) cada partícula comprende un ácido nucleico que codifica una nucleasa para dirigirse a los genomas de las células de dichaE. coli, en donde dichas partículas administradas entran en contacto con las células e introducen en ellas el ácido nucleico, en donde la nucleasa se expresa en las células y corta el ADN genómico de las células, matando así las células o reduciendo el crecimiento o la proliferación de las células en el sujeto; (b) las célulasde E. colison células deE. colidel filogrupo B2; y
(c) cada partícula comprende un resto de adhesión para reconocer y unirse a un resto cognado seleccionado de LPS, LamB y Tsx que se muestran en la superficie de las células deE. colidel filogrupo B2.
Las composiciones descritas en la presente memoria pueden ser útiles en:
Un método para tratar o prevenir la bacteriemia porE. colien un sujeto humano o animal, comprendiendo el método administrar al sujeto una pluralidad de partículas de transducción, en donde
(a) cada partícula comprende un ácido nucleico que codifica un ARNcr o ARN guía que es operable con una nucleasa Cas para el direccionamiento cromosómico en células de dichaE. coli, en donde dichas partículas administradas entran en contacto con las células e introducen en ellas el ácido nucleico, en donde el ARNcr o ARN guía se expresa y guía la nucleasa Cas en donde la nucleasa corta los cromosomas de las células, matando así las células o reduciendo el crecimiento o la proliferación de las células en el sujeto;
(b) las célulasde E. colison células deE. colidel filogrupo B2; y
(c) cada partícula comprende un resto de adhesión para reconocer y unirse a un resto cognado seleccionado de LPS, LamB y Tsx que se muestran en la superficie de las células deE. colidel filogrupo B2.
Las composiciones descritas en la presente memoria pueden ser útiles en:
El uso de una composición que comprende una pluralidad de partículas de transducción en un método para tratar o prevenir una infección por células deE. colidel filogrupo B2 en un sujeto humano o animal, comprendiendo el método administrar al sujeto la composición, en donde
(a) cada partícula comprende un ácido nucleico que codifica una nucleasa para dirigirse a los genomas de células deE. coli,en donde dichas partículas administradas entran en contacto con las células e introducen en ellas el ácido nucleico, en donde la nucleasa se expresa en las células y corta el ADN genómico de las células, matando así las células o reduciendo el crecimiento o la proliferación de las células en el sujeto; y
(b) cada partícula comprende un resto de adhesión para reconocer y unirse a un resto cognado seleccionado de LPS, LamB y Tsx que se muestran en la superficie de las células deE. colidel filogrupo B2.
Las composiciones descritas en la presente memoria pueden ser útiles en:
El uso de una composición que comprende una pluralidad de partículas de transducción en un método para tratar o prevenir una infección por células deE. colidel filogrupo B2 en un sujeto humano o animal, comprendiendo el método administrar al sujeto la composición, en donde
(a) cada partícula comprende un ácido nucleico que codifica un ARNcr o ARN guía que es operable con una nucleasa Cas para el direccionamiento cromosómico en las células, en donde dichas partículas administradas entran en contacto con las células e introducen en ellas el ácido nucleico, en donde el ARNcr o ARN guía se expresa y guía la nucleasa Cas en donde la nucleasa corta los cromosomas de las células, matando así las células o reduciendo el crecimiento o la proliferación de las células en el sujeto;
(b) las célulasde E. colison células deE. colidel filogrupo B2; y
(c) cada partícula comprende un resto de adhesión para reconocer y unirse a un resto cognado seleccionado de LPS, LamB y Tsx que se muestran en la superficie de las células deE. colidel filogrupo B2.
Las composiciones descritas en la presente memoria pueden ser útiles en:
El uso de una composición que comprende una pluralidad de partículas de transducción en un método para tratar o prevenir la bacteriemia porE. colidel filogrupo B2 en un sujeto humano o animal, comprendiendo el método administrar al sujeto la composición, en donde
(a) cada partícula comprende un ácido nucleico que codifica una nucleasa para dirigirse a los genomas de las células de dichaE. coli,en donde dichas partículas administradas entran en contacto con las células e introducen en ellas el ácido nucleico, en donde la nucleasa se expresa en las células y corta el ADN genómico de las células, matando así las células o reduciendo el crecimiento o la proliferación de las células en el sujeto; y
(b) cada partícula comprende un resto de adhesión para reconocer y unirse a un resto cognado seleccionado de LPS, LamB y Tsx que se muestran en la superficie de las células deE. colidel filogrupo B2.
Las composiciones descritas en la presente memoria pueden ser útiles en:
El uso de una composición que comprende una pluralidad de partículas de transducción en un método para tratar o prevenir la bacteriemia porE. colidel filogrupo B2 en un sujeto humano o animal, comprendiendo el método administrar al sujeto la composición, en donde
(a) cada partícula comprende un ácido nucleico que codifica un ARNcr o ARN guía que es operable con una nucleasa Cas para el direccionamiento cromosómico en células de dichaE. coli,en donde dichas partículas administradas entran en contacto con las células e introducen en ellas el ácido nucleico, en donde el ARNcr o ARN guía se expresa y guía la nucleasa Cas, en donde la nucleasa corta los cromosomas de las células, matando así las células o reduciendo el crecimiento o la proliferación de las células en el sujeto;
(b) las células deE. colison células deE. colidel filogrupo B2; y
(c) cada partícula comprende un resto de adhesión para reconocer y unirse a un resto cognado seleccionado de LPS, LamB y Tsx que se muestran en la superficie de las células deE. colidel filogrupo B2.
Las composiciones descritas en la presente memoria pueden ser útiles en:
Una composición que comprende una pluralidad de partículas de transducción para su uso en un método para tratar o prevenir una infección por células deE. coli(opcionalmente células deE. colidel filogrupo B2) en un sujeto humano o animal, en donde el método comprende administrar las partículas al sujeto, en donde (a) cada partícula comprende un ácido nucleico que codifica una nucleasa para dirigirse a los genomas de las células deE. coli,en donde dichas partículas administradas entran en contacto con las células e introducen en ellas el ácido nucleico, en donde la nucleasa se expresa en las células y corta el ADN genómico de las células, matando así las células o reduciendo el crecimiento o la proliferación de las células en el sujeto; y
(b) cada partícula comprendida por la composición es una cápside de fago T-par; opcionalmente una cápside de un fago T2, un fago similar a T2, un fago RB69 o un fago similar a RB69.
Las composiciones descritas en la presente memoria pueden ser útiles en:
Un método para tratar o prevenir la sepsis, septicemia o diarrea en un sujeto humano o animal, comprendiendo el método administrar al sujeto la composición descrita en la presente memoria, en donde las células deE. colicomprenden una cepa deE. colique causa sepsis, septicemia o diarrea en los seres humanos o animales. Las composiciones descritas en la presente memoria pueden ser útiles en:
Un método para tratar o prevenir la infección por células deE. colien un sujeto humano o animal, en donde el método comprende administrar la composición descrita en la presente memoria al sujeto, en donde la infección se trata o previene.
Los expertos en la técnica reconocerán, o podrán determinar utilizando únicamente un estudio de rutina, numerosos equivalentes a los procedimientos específicos descritos en la presente memoria.
El uso de la palabra "un" o "una" cuando se usa junto con el término "que comprende" en las reivindicaciones y/o la memoria descriptiva puede significar "uno", pero también es coherente con el significado de "uno o más", "al menos uno" y "uno o más de uno". El uso del término "o" en las reivindicaciones se usa para significar "y/o", a menos que se indique explícitamente que se refiere únicamente a alternativas o que las alternativas sean mutuamente excluyentes, aunque la divulgación respalda una definición que se refiere únicamente a alternativas y a "y/o". A lo largo de esta solicitud, el término "aproximadamente" se utiliza para indicar que un valor incluye la variación inherente del error del dispositivo, del método empleado para determinar el valor o la variación existente entre los sujetos del estudio.
Tal como se utiliza en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones, las palabras "que comprende" (y cualquier forma de que comprende, tal como "comprenden" y "comprende"), "que tiene" (y cualquier forma de que tiene, tal como "tienen" y "tiene"), "que incluye" (y cualquier forma de que incluye, tal como "incluye" e "incluyen") o "que contiene" (y cualquier forma de que contiene, tal como "contiene" y "contienen") son inclusivas o de extremos abiertos y no excluyen elementos o etapas del método adicionales no mencionados. El término "o combinaciones de los mismos" o similar, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a todas las permutaciones y combinaciones de los elementos enumerados que preceden al término. Por ejemplo, "A, B, C o combinaciones de los mismos" pretende incluir al menos uno de: A, B, C, AB, AC, BC o ABC, y si el orden es importante en un contexto particular, también BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC o CAB. Siguiendo con este ejemplo, se incluyen expresamente las combinaciones que contienen repeticiones de uno o más elementos o términos, tales como BB, AAA, MB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB, etc. El experto en la técnica comprenderá que, típicamente, no hay límite en el número de elementos o temas en cualquier combinación, a menos que sea evidente a partir del contexto.
Cualquier parte de esta divulgación puede leerse en combinación con cualquier otra parte de la divulgación, a menos que sea evidente a partir del contexto.
La presente invención se describe con más detalle en los siguientes Ejemplos no limitativos.
Ejemplos
Ejemplo 1: Composición de partículas para dirigirse sorprendentemente a una pluralidad de diferentes cepas deE. coli,incluido el filogrupo B2
Descripción general
Se pulsaron muestras de pacientes que contenían diversas cepas deE. colicon una composición de partículas. Esta composición comprendía una pluralidad de partículas de transducción que portaban restos de adhesión capaces de unirse a LPS, LamB o Tsx presentes en las célulasde E. coli.Las partículas comprendían cápsides que comprendían proteínas de cápsides de fagos, conteniendo las cápsides ácidos nucleicos que codificaban sistemas CRISPR/Cas para el direccionamiento cromosómico enE. coli.Cada ácido nucleico codificaba una pluralidad de ARNc diferentes que comprendían secuencias espaciadoras dirigidas a genes cromosómicos deE. coli.La capacidad de matar o reducir el crecimiento deE. colien las muestras se determinó usando un ensayo de placa, como se describe a continuación. Se utilizaron la secuenciación del genoma completo y el ensamblaje del genoma para asignar cepas deE. colisusceptibles a filogrupos. Sorprendentemente, se observó que el uso de dicha composición de partículas fue capaz de dirigirse de forma muy eficaz y extensa a una pluralidad de cepas diferentes deE. coli(siendo estas cepas clínicamente relevantes en muestras reales de pacientes). Además, ventajosamente, se tomó como diana y mató un gran número de cepas diferentes del filogrupo B2. Esto es significativo, ya que las cepas deE. coliB2 suelen presentar resistencia a los antibióticos (como la MDR), por ejemplo, resistencia a las fluoroquinolonas, que causan infecciones potencialmente mortales en pacientes, tales como en pacientes con cáncer, trasplantes y UTI. Además del grupo B2, sorprendentemente también logramos matar o inhibir el crecimiento de múltiples cepas deE. colide los filogrupos B1, D, F y G.
Muestreo de pacientes
Las muestras analizadas (n = 71) se obtuvieron de dos estudios observacionales prospectivos que reclutaron a pacientes adultos (≥18 años) que fueron ingresados en el hospital para un trasplante de células hematopoyéticas (HCT) autólogo o alogénico y que recibieron profilaxis con levofloxacino (una fluoroquinolona, FQ) empezando el día anterior al trasplante (Día -1) (Satlin 2021 y Satlin 2018). Se administró trimetoprimasulfametoxazol (TMP-SMX) a receptores de HCT alogénicos de 2 a 4 días antes del HCT. Los tratamientos antibióticos no erradican por completo laE. colien los pacientes; por ejemplo, laE. coliresistente a las fluoroquinolonas persistiría, por lo que se obtuvieron muestras deE. colide los pacientes. Los aisladosde E. colise obtuvieron de hisopos anales o muestras fecales obtenidas al ingreso para el trasplante. El momento del muestreo varió del Día -7 (7 días antes del trasplante) al Día 0 (día del trasplante).
Ensayo general de placa: detección para cobertura
Este procedimiento describe el método para evaluar la cobertura de lisados de partículas de fagos en un panel de cepas bacterianas.
La deposición se realizó según el ensayo general de placa descrito anteriormente. Las cepas bacterianas se prepararon inoculando 5 µl de una solución madre congelada en 250 µl de caldo LB en una placa de 96 pocillos. La placa se incubó a 37 °C y 250 rpm durante la noche. Al día siguiente, en un tubo de cultivo, se mezclaron 100 ml de la cepa de la noche anterior con 3 ml de agar superior precalentado (a 55 °C) que contenía CaCl25 mM y MgSO45 mM. La mezcla se vertió sobre la parte superior de una placa LB preaclimatada y se distribuyó uniformemente mediante movimientos circulares. Las placas se dejaron en la mesa de laboratorio durante 5-10 minutos para que solidificaran. Mientras tanto, la composición de partículas se diluyó en tampón PBS de 10<0>a 10<-9>y se depositaron 5 µl de cada dilución seriada sobre la parte superior de las coberturas. Las placas se dejaron en la mesa con la tapa abierta durante 20 minutos o hasta que las deposiciones fueran absorbidas completamente por el agar, y luego se incubaron boca abajo a 37 °C durante la noche.
Evaluación de los resultados:
Si aparecían plagas visibles, los resultados se registraban como positivos, las placas se contaban y se calculaba la concentración de fagos. Cálculo de la concentración de fagos: número de placas x 200 x dilución donde se observaron placas. Es decir: Si se contaban 5 placas en la dilución - 6: 5 x 200 x 1e6 = 1e9 pfu/ml Si no había placas visibles, pero se observó inhibición del crecimiento, el resultado se registró como zona de lisis y se anota la dilución más baja de inhibición.
Si no se observaron placas ni inhibición, los resultados se registraron como negativos.
Secuenciación del genoma completo
La extracción de ADN se realizó utilizando el kit Omega Bio-tek, Mag-Bind Bacterial DNA 96. Se siguió el protocolo y las muestras se eluyeron en 100 µL de tampón de elución.
Las bibliotecas de secuenciación se generaron usando Illumina Nextera XT y la secuenciación se realizó con extremos emparejados en un instrumento Illumina MiSeq con una celda de flujo V2 (300 ciclos). La profundidad de secuenciación promedio para todas las muestras fue de 48x (rango: 31-72x).
Ensamblaje del genoma y reconstrucción del árbol filogenético
Los datos brutos se recortaron para secuencias adaptadoras y bases de baja calidad utilizando fastp 0.22.0 (Chen et al., 2018). Los genomas se ensamblaron utilizando SKESA 2.4.0 (Souvorov et al., 2018). El filogrupo de cada muestra se determinó utilizando EzClermont 0.7.0 (https://github.com/nickp60/EzClermont). Las distancias genómicas se estimaron utilizando Mash 1.1 (Ondov et al., 2016) con un tamaño de kmer de 17 y 1.000 pruebas. Se construyó un árbol de unión vecinal utilizando rapidnj 2.3.2 (Simonsen et al., 2008). La visualización del árbol final se generó en Interactive Tree Of Life (iTOL) versión 6.5.3 (Letunic et al., 2021). El filotipado de cepas se realizó in silico utilizando el método divulgado en Microb. Genom.2018 jul; 4(7): e000192, Publicado en línea el 19 de junio de 2018. doi: 10.1099/mgen.0.000192, PMCID: PMC6113867, PMID: 29916797, "ClermonTyping: an easy-to-use and accurate in silico method for Escherichia genus strain phylotyping", Johann Beghain et al. Se utilizó el conjunto de secuencias de cebadores descrito en la Tabla S1 de esa referencia (disponible en la versión en línea de esteartículo).
Resultados
Se observó, sorprendentemente, que el uso de dicha composición de partículas era capaz de tomar como diana de manera muy efectiva y extensiva una pluralidad de diferentes cepas deE. coli(siendo estas cepas clínicamente relevantes a partir de muestras de pacientes reales), véase la Figura 1. Además (véase la Figura 2), ventajosamente, se tomó como diana y mató un gran número de diferentes cepas del filogrupo B2. Esto es significativo, porque las cepas deE. coliB2 a menudo muestran resistencia a los antibióticos (como MDR), por ejemplo, resistencia a la fluoroquinolona, que causa infecciones potencialmente mortales en pacientes, como en pacientes con cáncer, trasplantes y UTI. Se mataron más de 10 cepas diferentes de ST131 (se formaron placas) y se mataron más de 10 cepas diferentes de ST1193 (se formaron placas). El tipo de secuencia 1193 ha surgido recientemente como un nuevo linaje virulento y resistente entre lasE. coliresistentes a las fluoroquinolonas.Escherichia coli ST131 es un clon resistente a múltiples fármacos dominante a nivel mundial asociado con altas tasas de rUTI. LasE. coliuropatogénicas (UPEC) son la principal causa de infección del tracto urinario (UTI), siendo responsables del ~90 % de todos los casos. Las cepas de UPEC pertenecen en gran medida a los grupos filogenéticos deE. coliB2 o D y a menudo son clonales, siendo los tipos de secuencia (ST) aislados más comunes en todo el mundo ST69, ST73, ST95 y ST1312. El clon ST131, que ha surgido recientemente y diseminado globalmente, es un importante contribuyente a las ITU adquiridas en el hospital y la comunidad, así como a las infecciones del torrente sanguíneo e infecciones en animales de compañía y aves de corral. Originalmente identificado en 2008, el ST131 está asociado con la propagación mundial del gen de resistencia a la β-lactamasa de espectro extendido (ESBL) CTX-M-15. La mayoría de las cepas ST131 ahora están fuertemente asociadas con la resistencia a múltiples fármacos (MDR), incluyendo la resistencia a las fluoroquinolonas. Informes recientes también han identificado cepas que son resistentes a los carbapenémicos de última línea.
Significativamente, incluimos muestras clínicas de pacientes que desarrollaron bacteriemia porE. coli(a pesar del pretratamiento con FQ/TMP-SMX). La composición pudo matar o reducir el crecimiento de cepas deE. colien estas muestras (y esto es indicativo de la posibilidad de usar la composición para la profilaxis de la bacteriemia en sujetos). Esto incluyó cepas de los siguientes tipos de tipificación de secuencias de múltiples locus (MLST) (véase la Figura 2): ST648, ST315, ST405, ST361, ST88, ST453, ST1193 y ST131.
Además del grupo B2, sorprendentemente también fuimos capaces de matar o inhibir con éxito el crecimiento de múltiples cepas de deE. colide los filogrupos B1, D, F y G.
Referencias
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•<Martin Simonsen, Thomas Mailund y Christian N.S. Pedersen. Rapid Neighbour Joining. Proceedings of>the 8th Workshop in Algorithms in Bioinformatics (WABI), LNBI 5251, 113-122, Springer Verlag, octubre de 2008. doi:10.1007/978-3-540-87361-7_10
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•<Michael J. Satlin et al., Colonization with Fluoroquinolone-resistant Enterobacterales decreases the>effectiveness of fluoriquinolone prophylaxis in hematopoietic cell transplant recipients. Clinical Infectious Diseases 2021.
•<Michael J. Satlin et al., Colonization with Levofloxacin-resistant extended-spectrum β-lactamase->producing Enterobacteriaceae and risk of bacteremia in hematopoietic cell transplant recipients. Clinical Infectious Diseases 2018.
Ejemplo 2: Agente terapéutico CRISPR derivado de fagos diseñado para reducirE. colien pacientes con cáncer hematológico
Compendio
Los pacientes con malignidades hematológicas frecuentemente desarrollan infecciones del torrente sanguíneo debido a la translocación deE. coliy otras bacterias del intestino. El tratamiento antibiótico para prevenir estas infecciones tiene efectos perjudiciales sobre el microbioma y el tono inmunitario, y se ve dificultado aún más por el aumento de la resistencia a los antibióticos, en particular a las fluoroquinolonas. Cribamos una biblioteca de 162 fagos de tipo salvaje (WT), identificando 8 fagos con una amplia cobertura deE. coli.Los fagos seleccionados se diseñaron por ingeniería con nuevas fibras de la cola y una maquinaria CRISPR-Cas dirigida aE. coliclínicamente relevante. Los fagos diseñados por ingeniería se dirigen a las bacterias en biopelículas,reducen la aparición deE. colitolerantes a fagos y superan a sus fagos WT ancestrales en experimentos de cocultivo. SNIPR001 comprende cuatro bacteriófagos diseñados por ingeniería con una amplia gama de huéspedes en toda la filogeniade E. coli,incluyendo cepas resistentes a múltiples fármacos. SNIPR001 es bien tolerado en animales y reduce la carga deE. colien el intestino murino mejor que sus componentes constituyentes. SNIPR001 representa un nuevo agente terapéutico CRISPR-Cas diseñado para tomar como diana selectivamentea E. coli,que puede causar infecciones fatales en pacientes con cáncer hematológico.
Introducción
El tratamiento del cáncer continúa avanzando y las tasas de supervivencia de las personas con malignidades hematológicas están aumentando<1>. Sin embargo, los regímenes quimioterapéuticos que se utilizan con frecuencia en esta población inmunocomprometida causan supresión de la médula ósea y mucositis gastrointestinal, con el consiguiente aumento de la permeabilidad intestinal<2-4>. La translocación de bacterias intestinales, incluidala E. coli,desde el tracto gastrointestinal es una causa frecuente de infecciones del torrente sanguíneo<5>.
La mortalidad relacionada con infecciones del torrente sanguíneo causadas por bacterias entéricas comoE. colies del 15-20%<6>, por lo tanto, la profilaxis antimicrobiana se aplica en personas con riesgo de neutropenia febril<7>. No existen terapias aprobadas para la prevención de infecciones del torrente sanguíneo en pacientes con cánceres hematológicos, sin embargo, las fluoroquinolonas se usan sin aprobación en los Estados Unidos con base en dos ensayos aleatorizados que demostraron que disminuyen las infecciones bacterianas durante la neutropenia<7,8,9>. Más allá de los efectos secundarios de las fluoroquinolonas, incluidas las advertencias y precauciones de seguridad, la resistencia bacteriana está aumentando en pacientes oncológicos y se acerca al 60 % en las infecciones del torrente sanguíneo porE. colien los EE. UU.<10>. En pacientes inmunocomprometidos con malignidades hematológicas que desarrollan neutropenia inducida por quimioterapia,E. colies responsable del 25,1-30 % de todos los casos de bacteriemia<11,12>. Además, hasta el 65 % de laE. coliaislada como patógeno causante de infecciones del torrente sanguíneo<5>en pacientes con cánceres hematológicos sometidos a trasplante de células madre hematopoyéticas fue resistente a las fluoroquinolonas<13>. En consecuencia, se necesitan nuevas opciones profilácticas de espectro estrecho que también cubran laE. coliresistente a las fluoroquinolonas para prevenir infecciones en estos pacientes vulnerables.
La terapia con bacteriófagos se ha utilizado antes de la amplia disponibilidad de antibióticos<14>, pero ahora ha recuperado interés<15>debido al aumento de la resistencia bacteriana a los antimicrobianos combinada con varios informes de casos individuales exitosos<16-18>. Aun así, se han realizado pocos ensayos clínicos con fagos de tipo salvaje (WT)<19-22>y, aunque varios se han dirigido aE. coli,estos no han producido resultados convincentes en ensayos controlados aleatorizados más amplios, probablemente debido a la cobertura incompleta de las cepas diana por el cóctel de fagos<23>. Los esfuerzos recientes han implicado una caracterización más extensa de fagos(n =41) dirigidos a cepas deKlebsiella pneumoniae(n=17)<24>y fagos (n = 248) dirigidos a cepas deVibrio(n = 294)<25>, lo que sugiere que se puede lograr una mejor cobertura de las cepas diana con un cribado sistemático a gran escala. La biología sintética también se ha utilizado para diseñar por ingeniería fibras de la cola de fagos T3 que aumentan el espectro de cepas tomadas como diana del fago diseñado por ingeniería<26>. Finalmente, los sistemas de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR)-Cas pueden contribuir a la eficacia como una modalidad de eliminación complementaria a la actividad lítica del fago. Las nucleasas asociadas a CRISPR (Cas) y CRISPR-ARN forman un complejo que, en algunos sistemas CRISPR-Cas, puede unirse a una secuencia diana de ADN homóloga y dar como resultado la degradación del ADN<27,28>. Dado que los procariotas carecen de unión de extremos no homólogos propensos a errores y dependen únicamente de la recombinación homóloga para reparar el daño del ADN, son propensos a la muerte celular después de la degradación del ADN. Esta vulnerabilidad se ha explotado mediante el uso de CRISPR-Cas como una modalidad antimicrobiana para varias bacterias, incluidasStaphylococcus aureus, E. colioClostridium difficile<29-35>.
Para abordar la importante necesidad médica no satisfecha de nuevos agentes profilácticos para pacientes con malignidades hematológicas, informamos sobre el desarrollo de SNIPR001. Nuestro proceso de investigación para diseñar SNIPR001 incluye varias etapas (Fig.3). En resumen, se probó una biblioteca (n = 162) de fagos WTin vitroen un panel de cepas deE. colifilogenéticamente diversas que representan la biología de la bacteria dianaE. coli.Se seleccionaron los fagos WT con la cobertura de cepas diana más amplia y complementaria para su posterior diseño por ingeniería. Los fagos WT seleccionados se sometieron tanto a ingeniería de fibra de la cola como a armado con CRISPR-Cas para crear una biblioteca de fagos armados con CRISPR-Cas (CAP). Se evaluó la biblioteca CAP en cuanto a capacidad de fabricación, estabilidadin vitro,espectro de eficacia, farmacocinéticain vivoy eficacia. Se seleccionó una combinación de cuatro CAP para crear el candidato a desarrollo SNIPR001, que ahora ha entrado en desarrollo clínico (ClinicalTrials.gov ID NCT05277350).
Resultados
Los fagos líticos de tipo salvaje α15, α17, α20, α48 y α51 (todos miembros deTevenvirinae)fueron el punto de partida de la ingeniería de fagos para producir tipos de fagos sintéticos (fagos armados con CRISPR; CAP) α15.2,α20.4,α48.4 oα51.5. Las especificidades de la fibra de la cola para los ligandos de superficie cognadosde E. coliTSX, LPS y LamB fueron las siguientes:
α15.2 se une a LPS y Tsx
α20.4 se une a LPS y LamB
α48.4 se une a Tsx
α51.5 se une a Tsx
Se preparó un cóctel que comprendía estos tipos de fagos dirigidos a LPS, LamB y Tsx (en la presente memoria, el cóctel se denomina SNR001).
Armado de fagos con CRISPR-Cas para tomar como diana aE. coli
Para armar con CRISPR-Cas los fagos líticos seleccionados y generar una biblioteca de CAP, se diseñó por ingeniería el sistema CRISPR-Cas tipo I-E deE. coli39para dirigirse a cepas deE. colifilogenéticamente diversas.Se generó un vector guiado por CRISPR (CGV<TM>), que contenía el gencas3 (ygcB)y un complejo génico en cascada corriente abajo compuesto porcasA (ygcL, cas8e), casB (ygcK, cas11), casC (ygcJ, cas7), casD (ygcl, cas5)ycasE (ygcH, cas6),y una matriz CRISPR dirigida a una pluralidad de genes diferentes del genoma deE. coli(CGV-EcCas). Para evaluar la eficiencia de eliminación del sistema CRISPR-Cas, el CGV-EcCas se conjugó con la cepa b52 deE. coli,mostrando una reducción promedio de 3,5 log10UFC/ml, en comparación con el vector vacío. Como se esperaba, no se observó ningún efecto después de conjugar el CGV-EcCas con una cepa deE. colino diana. La eficiencia de eliminación de CGV-EcCas se evaluó además en un panel abreviado de 82 cepas deE. coli.La administración conjugativa del vector vacío se logró en el 75 % de los aislados. Para todas las cepas en las que se administró el CGV-EcCas, los recuentos bacterianos se redujeron por debajo del límite de detección (LOD, 200 UFC/ml) correspondiente a una reducción de 1-6 log10, destacando la potente eliminación mediada por CRISPR-Cas (Fig.3A).
Además del promotor PbolA,los sistemas CRISPR-Cas se diseñaron por ingeniería para expresarse a partir de un promotor sintético deE. coliexpresado de forma constitutiva (PJ23100). Las matrices CRISPR se diseñaron para dirigirse a múltiples genes de virulencia (espaciador 1, 2 y 3) o esenciales (espaciador 4 y 5) (SEQ ID NO: 6-10), ya que se ha demostrado que el direccionamiento a múltiples regiones, previene la evolución de la resistencia<43>. Para confirmar la actividad de CRISPR-Cas en los CAP, medimos los transcritos decas3en muestras obtenidas a los 5, 15 y 30 minutos después de una infección sincronizada con la mismo Mol de CAP α15.2 en comparación con WT α15 usando RT-qPCR y observamos niveles crecientes de ARN decas3solo tras la infección con CAP α15.2. A continuación, ampliamos este ensayo a los cuatro CAP (α15.2, α20.4, α48.4, α51.5) y demostramos niveles crecientes de transcritos decas3,destacando que los CAP expresaron el sistema CRISPR-Cas durante la infección de una cepa diana.
Para demostrar la superioridad competitiva de los CAP, realizamos experimentos de competición en los que los CAP (α20.4 y α15.2) y sus fagos ancestrales WT se cocultivaron con la cepa b230de E. coli,que sirvió como diana para ambos fagos competidores. Se cocultivaron relaciones iniciales aproximadas de 1 CAP por cada 9 fagos WT y se subcultivaron cuatro veces en células diana frescas en cultivos líquidos. Tras cada subcultivo, se evaluó la abundancia relativa de partículas de CAP y fago WT. Ambos CAP superaron a sus WT en cuatro rondas; el CAP α20.4 alcanzó el 68 % tras cuatro rondas y el CAP α15.2 alcanzó el 86 % tras dos rondas (Fig.3B-C), lo que demuestra una mejor aptitud en comparación con los fagos WT.
Cóctel de CAP SNIPR001
La actividad de los CAP se ensayó contra el panel deE. coli(n = 429) usando el ensayo de cinética de crecimiento. Para maximizar nuestra cobertura, combinamos los CAP, lo que resultó en una composición (SNR001) que comprendía los tipos de fagos α15.2, α20.4, α48.4 y α51.5.
Los ancestros de los CAP α15.2, α20.4, α48.4 y α51.5 se clasifican bajo la subfamiliaTevenvirinae. Específicamente, los ancestros α15, α48, α20 y α51 presentan similitud de secuencia con los fagos T2, T4 y RB69 deE. coli,como se muestra a continuación (como se determina por el análisis Mash). Los análisisin silicode los genomas de SNIPR001 mostraron que los CAP no codifican genes conocidos de transposasa o integrasa, lo que indica que los fagos no son temperados y, por lo tanto, no se prevé que sean capaces de insertar su ADN en células bacterianas.
Matriz de similitud:
Se calculó esta similitud en donde se calculó la distancia entre genomas utilizando Mash (v 1.1) con un tamaño de k-mer de 21 y un tamaño de prueba de 10.000.
Para más información sobre Mash véase Ondov, B.D., Treangen, T.J., Melsted, P.et al.,"Mash: fast genome and metagenome distance estimation using MinHash ",Genome Biol17, 132 (2016). https: //doi.org/10.1186/s13059-016-0997-x.
SNIPR001 no afecta a otras bacterias asociadas al intestino
Idealmente, una terapia basada en fagos no debería afectar a los géneros no diana del microbioma; por lo tanto, se evaluó la especificidad de SNIPR001 haciaE. coliinvestigando sus efectos en un panel de cepas que incluye especies no pertenecientes aE. coli,pero emparentadas conE. coli, así como en un rango de familias asociadas con la comunidad bacteriana comensal en las bacterias intestinales (yE. colicomo control positivo). Las bacterias se cultivaron sin CAP, con el cóctel SNIPR001 o con CAP SNIPR001 individuales (n =4). El crecimiento en UFC/ml se evaluó durante un período de 4 horas (DCFU/mL4h-0h). Paralelamente, se cultivóE. colib2480 en las mismas condiciones que un control positivo (Fig.4). No observamos ningún efecto significativo (p>0,05, prueba t de Student, corrección FDR con el método de Holm) del cóctel SNIPR001 ni de ninguno de los CAP de SNIPR001 sobre cepas no pertenecientes a E.coli, mientras que el crecimiento deE. colise inhibió significativamente (p<0,05, prueba t de Student, corrección FDR con el método de Holm). Por lo tanto, no se prevé que SNIPR001 afecte al microbioma intestinal más allá de laE. colidiana.
Rango de huéspedesin vitrode SNIPR001 en la población clínica diana
Para comprender el efecto potencial en cepas relevantes para pacientes con cáncer hematológico, la cobertura de SNIPR001 se ensayó contra nuestro panel interno deE. coli(429 cepas) y un conjunto de 382 cepas clínicas deE. coli(JMI Laboratories, North Liberty, IA, EE. UU.). Estas cepas de JMI se originaron a partir de pacientes con infecciones del torrente sanguíneo hospitalizados en unidades de hemato-oncología en cuatro regiones diferentes de 2018-2020 (Asia-Pacífico 54 aislados, Europa 161 aislados, América Latina 26 aislados y América del Norte 141 aislados). La distribución genotípica de las cepas deE. colien la población de pacientes se determinó usando secuenciación del genoma completo y se encontró que era diversa, representando nueve filogrupos y 118 tipos de secuencias de locus múltiples (MLST) (Fig. 5A). Usando un ensayo de manchado, registramos la infectividad del fago contra el panel de cepas de JMI.Las placas individuales visibles se diferenciaron de las zonas de lisis en los casos en que no se pudo verificar la presencia de placas individuales. Todos los ensayos de detección se realizaron por duplicado. Observamos coberturas generales del 90,4 ± 1,6 % de SNIPR001 en el panel de 382E. colide JMI y del 95,6 ± 0,3 % de SNIPR001 en el panel interno deE. coli(429 cepas). Además, observamos placas en el 53,1 ± 7,7 % y zonas de lisis en el 37,3 ± 6,1 % de las cepas del panel de JMI,y de forma similar, placas en el 60,5 ± 6,6 % y zonas de lisis en el 35,1 ± 6,3 % de las cepas del panel interno (Fig.5B). SNIPR001 mostró una cobertura del 100 % en el filogrupo B2, que representa el 53 % del panel de JMI.Este filogrupo se correlaciona con la resistencia a múltiples fármacos y la virulencia. Además, observamos que SNIPR001 cubría el 91,7 % (n =55) de las cepas clasificadas como resistentes a múltiples fármacos, el 100 % (n =5) de las cepas resistentes a carbapenémicos, el 92,2 % (n =95) de las cepas productoras de β-lactamasas de espectro extendido y el 88,9 % (n =176) de las cepas resistentes a fluoroquinolonas, tales como ciprofloxacino y levofloxacino (Fig.5C).
Finalmente, validamos SNIPR001 en un panel clínico (n= 72) de cepas deE. coliresistentes a fluoroquinolonas, que se aislaron de una muestra fecal o de un frotis perianal de pacientes con cáncer hematológico. Esta población representa la población de pacientes diana clínica esperada de interés (la FDA ha designado SNIPR001 como en estado de vía rápida). Un subconjunto de estas cepas provocó una infección del torrente sanguíneo (Fig.5D). El 82 % de las cepas deE. coli(n =72) fueron susceptibles a al menos dos o más de los CAP en SNIPR001, y el 93 % de las cepas fueron susceptibles al cóctel completo de SNIPR001 (Fig.5E). Estos datos demuestran el beneficio de SNIPR001 en comparación con laos CAP individuales en cuanto a la mejora del espectro de eficacia.
Tolerabilidad y recuperación gastrointestinal de SNIPR001 en minicerdos
Se evaluó la tolerabilidad y la recuperación gastrointestinal de SNIPR001 en minicerdos de Göttingen. Se tomaron muestras de sangre y heces durante 7 días tras la administración oral de 2 x 10<12>UFP de SNIPR001 o del vehículo. No se recuperaron CAP del plasma, lo que indica que no hubo exposición sistémica, mientras que sí se recuperaron CAP en las heces hasta 7 días después de la administración de SNIPR001, con un pico de 2 x 10<7>UFP a las 24 h después de la dosificación (Fig.6A). Los minicerdos no presentaron signos clínicos y no se observaron cambios significativos en los parámetros hematológicos ni bioquímicos; en particular, no se observaron cambios en las células inmunitarias, en comparación con el tratamiento con el vehículo, lo que respalda la buena tolerancia de SNIPR001. Se obtuvieron recuperaciones similares con cada CAP individual (Fig. 6B). En conclusión, SNIPR001 parece ser bien tolerado en minicerdos de Göttingen con recuperación gastrointestinal.
Eficacia de SNIPR001 y CAP constituyentes en un modelo de colonización en ratón
Para evaluar la eficaciain vivode los cuatro CAP seleccionados para reducir E. coli,adaptamos un modelo de colonización intestinal de ratón de Galtier et al.<44>para la cepa b17 deE. coli.Se administró estreptomicina durante 3 días para reducir las bacterias Gram-negativas del tracto gastrointestinal del ratón, después de lo cual se detuvo la administración de estreptomicina y los animales fueron inoculados una vez por vía peroral conE. colib17 (1 x 10<7>UFC). Esto permitió una colonización estable durante 3 a 4 días. Con el objetivo de evaluar la eficacia de los CAP en una colonización establecida, el tratamiento se inició 2 días después de la inoculación y el estudio finalizó el día 4 después de la inoculación, ya que la colonización comienza a disminuir. Para asegurar la máxima exposición a los CAP, los ratones fueron tratados con 3 dosis diarias, administradas con 8 h de diferencia, para un total de 6 dosis durante 2 días.
Los ratones fueron tratados por sonda oral con una dosis alta, media o baja (2 x 10<11>UFP, 2 x 10<9>UFP, 1 x 10<7>UFP, respectivamente) de SNIPR001, vehículo (control negativo) o gentamicina (control positivo). La recuperación de CAP en las heces varió de 3 x 10<7>UFP/g en la dosis baja a 1 x 10<10>UFP/g en la dosis alta, lo que confirmó el paso GI exitoso (Fig.6C). Estos niveles de CAP se asociaron con una reducción dependiente de la dosis significativa (p<0,05, prueba U de Mann-Whitney, con corrección FDR) en la población diana deE. colien comparación con los ratones tratados con vehículo, después de 24 h de tratamiento (Día 3). En la dosis alta, SNIPR001 condujo a una reducción de 4 log10UFC/g (Fig. 6D). A pesar de una mayor variabilidad en la recuperación bacteriana el día 4, posiblemente debido a la eliminación de la cepa colonizadora, como se ilustra en el grupo de vehículo, se observaron reducciones similares tras 2 días de tratamiento (Día 4). Si bien la dosis media no alcanzó la significación estadística (p< 0,05, prueba U de Mann-Whitney), sí hubo, sin embargo, una reducción numérica en comparación con el grupo de vehículo. Posteriormente, se compararon las eficacias de los CAP individuales con la del cóctel SNIPR001 en este modelo. En este experimento, se observó una mayor reducción en la colonización de la cepa diana con SNIPR001 en comparación con cualquier CAP individual (que mostró una reducción numérica, pero no estadísticamente significativa), lo que destaca un beneficio en la eficacia de la combinación (Fig. 6E). También ensayamos el perfil de resistencia de bacterias supervivientes muestreadas aleatoriamente y no encontramos ningún aislado resistente al cóctel SNIPR001. En general, estos datos demuestran la capacidad de SNIPR001 para disminuir laE. colidiana en el tracto GI de ratones colonizados.
Discusión
Aquí describimos el desarrollo de SNIPR001 diseñado para dirigirse aE. coliintestinal que frecuentemente se transloca en el torrente sanguíneo para causar infecciones del torrente sanguíneo en pacientes con cánceres hematológicos que son neutropénicos. Si bien las fluoroquinolonas se usan fuera de lo indicado, estos pacientes continúan teniendo una alta morbilidad y mortalidad. El uso de antibióticos tradicionales ha producido importantes beneficios para la salud durante el siglo pasado. Sin embargo, en paralelo, ahora estamos experimentando un desarrollo significativo de resistencia bacteriana, y el número de muertes atribuibles a la resistencia bacteriana a los antimicrobianos en 2019 se ha estimado en 1,27 millones, siendoE. coliel principal patógeno<45>. En consecuencia, se necesitan nuevas modalidades antibióticas para abordar la necesidad médica no satisfecha de infecciones resistentes a los antimicrobianos en esta población vulnerable. En este estudio, describimos el desarrollo de SNIPR001 un nuevo candidato de desarrollo con el potencial de abordar estos desafíos.
La confirmación de la eficacia de SNIPR001 en un amplio panel de cepas clínicamente relevantes respalda el potencial clínico de SNIPR001. La reducción observada de 4 log10enE. colien nuestro modeloin vivorepresenta una clara mejora con respecto a estudios previos<4950>.
SNIPR001 es un enfoque antimicrobiano ortogonal, ya que ha mostrado actividad en cepas resistentes a múltiples fármacos. Además, hay evidencias emergentes de que el mantenimiento de un microbioma normal es importante para sostener el tono inmunológico y potencialmente beneficiar el resultado de los tratamientos oncológicos<51>, y esto también ha sido reconocido en la guía más reciente sobre la gestión profiláctica de pacientes con riesgo de neutropenia febril<7>. En este contexto, los estudiosin vitrocon SNIPR001 han mostrado especificidad haciaE. colisin efectos fuera de la diana hacia ninguna de las cepas ensayadas que no sonE. coli,teniendo así un efecto menos perjudicial sobre el microbioma. En el futuro, las combinaciones individualizadas de antibióticos de espectro estrecho como SNIPR001 pueden usarse como primera línea en lugar de usarse además de antibióticos de amplio espectro como las fluoroquinolonas.
Actualmente, se está llevando a cabo en los EE. UU. un estudio clínico para evaluar la capacidad de SNIPR001 para confirmar su seguridad y su capacidad para reducirE. colien el intestino sin afectar el microbioma intestinal general (NCT05277350). Creemos que SNIPR001 ejemplifica un avance terapéutico potencialmente significativo en el campo de los antimicrobianos para poblaciones de pacientes de alto riesgo y puede servir como modelo para terapias de espectro reducido contra otros patógenos resistentes a los antimicrobianos potencialmente mortales en poblaciones de pacientes de alto riesgo.
Tabla 1a: Visión general de los cuatro CAP que componen SNIPR001. Los genes deE. colia los que se dirigen los cinco espaciadores individuales y su secuencia se enumeran en la Tabla 1b.
α15.2 comprende los espaciadores 1, 2, 3
α20.4 comprende los espaciadores 4, 5
α48.4 comprende los espaciadores 4, 5
α51.5 comprende los espaciadores 4, 5
Tabla 1b: Los genes deE. colia los que se dirigen los cinco espaciadores individuales comprendidos por los CAP SNR001 y las secuencias espaciadoras utilizadas en los CAP.
Métodos
El aislamiento de fagos se realizó utilizando paneles de cepas deE. coli. En resumen, se mezclaron 100 µL de cultivos de toda la noche de cada cepa deE. colicon 100 µL de cada cóctel de fagos o muestras de aguas residuales. Tras 6 minutos de incubación a RT (durante este período debería producirse la infección), se añadieron 3 mL de agar superior precalentado que contenía Ca<2+>a las mezclas deE.coli/fago o aguas residuales y se vertieron inmediatamente en una placa LB. Alternativamente, se aplicaron diluciones de 10 veces de cada cóctel sobre céspedes preparados con cepas de aislados. Tras el secado, las placas se incubaron a 37 °C durante la noche. Se recogieron las placas de cada placa y se resuspendieron en 500 µL de tampón SM, se agitaron en vórtex y se almacenaron a 4 °C. Se aplicaron diluciones de diez veces sobre la cepa de aislado de la que se había tomado originalmente la placa. Para aumentar la probabilidad de obtener placas correspondientes a fagos individuales, el procedimiento se repitió al menos tres veces. Se prepararon lisados a partir de placas individuales tomadas en la ronda de propagación anterior, se extrajo ADN y se secuenciaron sus genomas.
Paneles deE. coliy procedimientos de aislamiento
En este estudio, se incluyeron tres paneles deE. coli,un panel interno y dos paneles clínicamente relevantes. El panel interno consistió en 429 cepas deE. colifilogenéticamente diversas,aisladas de sangre de pacientes con infecciones del torrente sanguíneo e infecciones del tracto urinario, de heces de seres humanos sin enfermedad conocida, de animales y del medio ambiente. Las cepas abarcan siete filogrupos diferentes (A, B1, B2, C, D, E, F), 114 grupos de tipificación de secuencias de múltiples locus (MLST), serotipos (tipo K y O), perfiles de resistencia a antibióticos y diferentes ubicaciones geográficas de aislamiento.
El panel JMI comprende una colección clínica de 382 cepas deE. coliobtenidas de JMI Laboratories (North Liberty, IA, EE. UU.). Estas cepas se aislaron de pacientes con infecciones del torrente sanguíneo hospitalizados en unidades de hematología y oncología de cuatro regiones diferentes (Asia-Pacífico 54 aislados, Europa 161 aislados, Latinoamérica 26 aislados y América del Norte 141 aislados), a través del Programa de Vigilancia Antimicrobiana SENTRY (2018-2020), que está compuesto por una red de más de 150 centros médicos en más de 28 países de todo el mundo (https://www.jmilabs.com/sentry-surveillance-program). Finalmente, el panel que comprendía 72 cepas deE. coliresistentes a las fluoroquinolonas se aísla de muestras fecales o hisopos perianales de pacientes con cáncer hematológico hospitalizados para recibir un trasplante de células hematopoyéticas<53,54>.
Las cepas deE. colise cultivaron a 37 °C en caldo de lisogenia (LB) a 250 rpm en medio líquido o en placas de agar que contenían un 1,5 % (p/v) de agar. Cuando fue necesario, los cultivos se suplementaron con ampicilina (100 µg/mL), kanamicina (50 µg/mL), gentamicina (15 µg/mL) o amikacina (50 µg/mL). Todos los medios para el crecimiento del donante de conjugaciónE. coliJKE201<55>y sus derivados se suplementaron con ácido 1,6-diaminopimélico (DAP) (80 µg/mL) para complementar su auxotrofía.
Tanto la cepa deE. colib52, que se utilizó para producir α15.2, α48.4 y α51.5, como la cepa deE. colib2479, que se seleccionó para producir α20.4, pertenecen al filogrupo A. La cepa deE. colib17 se utilizó como cepa colonizadora en los modelos de eficaciain vivoya que la cepa es susceptible a todos los CAP SNIPR001 y es parte del banco de cepas del Bioma SNIPR.
Cribado de fagos mediante cinética de crecimiento
Se evaluó la susceptibilidadin vitrodel panel deE. coliinterno (n =429) a los 162 fagos WT utilizando un ensayo de cinética de crecimiento. El ensayo mide la actividad metabólica de una bacteria al rastrear la reducción de un colorante de tetrazolio a un compuesto púrpura que se agrega durante el crecimiento bacteriano. La lectura colorimétrica se registró cada 15 minutos durante un período de 24 horas utilizando el OmniLog® (Biolog, Hayward, CA, EE. UU.), adaptado de Henryet al.,2012<56>. El área inhibitoria bajo la curva (iAUC) se calculó a partir de las curvas cinéticas en el transcurso del experimento y se definió como la relación entre la AUC normalizada de la curva de crecimiento bacteriano tratado con fagos y el control de solo bacterias. La susceptibilidad se definió en valores de iAUC ≥0,2.
Cálculo de la inhibición del crecimiento bacteriano usando iAUC
El efecto inhibidor del crecimiento de SNIPR001 se determinó usando curvas cinéticas de crecimiento construidas usando el aparato OmniLog®. Para limitar la variabilidad técnica en la medición entre puntos de tiempo, se aplicó una función spline cúbica de suavizado a los datos en Scala usando el paquete "umontreal.ssj.functionfit". Para identificar las variables adecuadas ƿ y ponderación, se aplicó cada combinación de ƿ y ponderación de 0,1 y 0,5 en incrementos de 0,1 (es decir, 0,1, 0,2,...0,5). Se seleccionó la función spline con el menor error absoluto medio para el cálculo del AUC. La cantidad acumulada inicial de colorante fluorescente en el punto de tiempo inicial varía ligeramente entre pocillos, lo que provoca un aumento artificial del AUC de ciertos pocillos. Utilizando la función spline cuadrada mejor suavizada, se eliminó de todas las curvas de crecimiento la señal media de las primeras 1,5 h, antes de cualquier crecimiento medible, para aproximar una intersección de la señal de crecimiento cero. El AUC incremental total (iAUC) se calculó como la suma de las sumas de los puntos medios de Riemann para cada punto de tiempo a lo largo del spline cuadrado suavizado. Por último, calculamos el iAUC como iAUC = 1-AUCMuestra/AUCControl, donde AUCMuestraes el AUC del spline creado por una bacteria dada y SNIPR001, mientras que AUCControlse refiere al AUC del spline creado con una bacteria dada sin un fago o CAP dado, o una combinación de estos. Por lo tanto, los valores de iAUC suelen estar entre 0 y 1, donde 0 indica que no hay inhibición del crecimiento y 1 indica una inhibición completa del crecimiento. En ocasiones, cierto ruido biológico y técnico da como resultado valores de iAUC fuera de estos límites, pero se considera insignificante.
El rango de huéspedes se calculó como la fracción de un panel que tenía un iAUC<0,2 para cada repetición. Las desviaciones estándar reportadas se calcularon como la desviación en el número de cepas con un iAUC<0,2 y, posteriormente, se normalizaron al tamaño del panel, dividiendo la desviación estándar entre el tamaño del panel.
Fagos armados con CRISPR-Cas para dirigirse aE. coli
Los fagos se armaron con CRISPR-Cas usando recombinación homóloga. Insertamos la carga útil en la región inmediatamente posterior algen 49y algen Een comparación con un fago T2 de tipo salvaje de referencia. Por lo tanto, los genomas de los fagos sintéticos comprendían la inserción entre las coordenadas 9000 y 21000, en donde las coordenadas son las posiciones de nucleótidos contadas desde el nucleótido (coordenada número 1) inmediatamente posterior algen 49hacia elgen Een comparación con un fago T2 de tipo salvaje de referencia. La recombinación se llevó a cabo en células bacterianas durante la propagación de los fagos. Las células portaban un plásmido que servía como molde de recombinación. Los plásmidos con molde de recombinación portaban las secuencias que se pretendía insertar en el genoma del fago entre secuencias flanqueantes de ~200-700 pb que eran homólogas a las secuencias del fago en el sitio de inserción. Para cada fago, insertamos el sistema CRISPR-Cas tipo I-E endógeno deE. coli(Genbank CP032679.1), es decir, el gencas3 (ygcB)y los genes aguas abajo que codifican el complejo de cascada,casA (ygcL), casB (ygcK), casC (ygcJ), casD (ygcl)ycasE (ygcH),así como una matriz CRISPR dirigida a secuencias seleccionadas deE. coli.Para todos los CAP seleccionados, los genescasoriginados enE. colison idénticos. La inserción del sistema CRISPR-Cas dio lugar a la deleción de ~7 kpb de ADN del fago en elgen 49-gen E.Las secuencias de los CAP resultantes se verificaron mediante NGS (BaseClear, Leiden, Países Bajos).
Transducción de CGV en biopelículas
Se crecieron células deE. colib52 en placas de 96 pocillos y se permitió el desarrollo de biopelículas sobre tapas con clavijas. Cada pocillo contenía 180 µL de medio M9 (Sigma, M6030) suplementado con 20 mM de glucosa, 2 mM de MgSO₄, 0,1 mM de CaCl₂, 0,1 % de Amicasa (Sigma) y 0,1 % de manitol. Los pocillos se inocularon con 1 µL de cultivo de b52 de toda la noche. Se insertó la tapa con clavijas y la placa de microtitulación se incubó estáticamente durante 24 horas a 37 °C. A continuación, la tapa con clavijas se transfirió a una nueva placa con medio fresco sin lavar, y la placa se incubó durante 24 horas más. Tras la incubación, se preparó una nueva placa con 100 µL de medio y 100 µL de partículas de transducción de CGV (~10<8>partículas) en cada pocillo (3 réplicas). Las biopelículas cultivadas en las clavijas se enjuagaron 3 veces con H₂O estéril (200 µl) antes de transferirlas a la nueva placa. La placa se incubó estáticamente durante 5 horas a 37 °C.
Para analizar la actividad metabólica de las células en las biopelículas, las tapas se enjuagaron tres veces con H₂O estéril (200 µL) antes de colocarlas en una placa con 20 µL de tinción Alamarblue (ThermoFisher) y 180 µL de medio en cada pocillo. Las placas se incubaron durante 1,5 horas a 37 °C y se trasladaron a un lector de microplacas (Synergy Hl, Biotek). Se registraron la fluorescencia (excitación: 560 nm; emisión: 590 nm) y la absorbancia (600 nm) de cada pocillo.
Se reportaron las actividades metabólicas de las biopelículas tratadas con CGV que portaban el promotor PbolAen relación con las actividades metabólicas de las biopelículas tratadas con un CGV que no portaba un promotor que transcribiera los genescas.
Construcción de plásmidos y cepas
Los plásmidos se construyeron mediante clonación InFusion HD utilizando fragmentos de ADN generados por PCR. Para construir CGV-EcCas, se amplificaron los genescas3y cascada deE. coliy se clonaron en un plásmido de tipo ColE1, pZE21<57>. Además, se incluyó en el vector una matriz de 3 espaciadores dirigida a genes deE. colibajo el control del promotor constitutivo J23100. La matriz contiene nucleótidos del genoma deE. colipor locus diana, separados por repeticiones directas (secuencia de repetición, SEQ ID NO: 15). El motivo adyacente al protoespaciador (PAM) está localizado adyacente a las secuencias diana seleccionadas en el genoma deE. coli.
Ensayos de transformación
Los cultivos de toda la noche se diluyeron (1:100) en medio LB fresco y se cultivaron hasta la fase exponencial media (DO600≈ 0,6). Posteriormente, las células se prepararon para la electroporación y se concentraron 50 veces en agua MilliQ enfriada en hielo. A continuación, las células se electroporaron con los plásmidos apropiados, se dejaron recuperar durante 1 h a 37 °C en caldo superóptimo (SOB) y se sembraron en placas LB suplementadas con antibióticos.
Ensayos de conjugación
Se establecieron experimentos de conjugación que evaluaron la transferencia y la eficiencia de eliminación de CGV- EcCas utilizandoE. coliJKE201 como donante y aislados clínicos deE. colicomo receptores (incluyendo cepas diana y no diana, y cepas deE. colicomo controles). Los plásmidos se conjugaron en receptoresde E. colimediante apareamiento líquido. Brevemente, los cultivos de toda la noche se diluyeron (1:100) en medio LB fresco, se cultivaron hasta una DO600≈ 0,4, se lavaron y se suspendieron en LB fresco hasta una DO600≈ 0,25. Se mezclaron 125 µl de suspensiones celulares del donante y 25 µl de la receptora para un apareamiento 5:1 en una microplaca de 96 pocillos y se incubaron durante 16 h a 37 °C. La eficiencia de conjugación se determinó sembrando en placas una serie de diluciones de reacciones de conjugación en agar LB suplementado con antibióticos (para seleccionar los transconjugantes). La eficacia de la eliminación específica se cuantificó sembrando en placas 90 µL de las reacciones de conjugación en placas selectivas. El plásmido CGV-EcCas codifica la resistencia a la kanamicina, la gentamicina y la amikacina, lo que facilita la selección de transconjugantes. La viabilidad se calculó contando las UFC en las placas y los datos se registraron como concentración de células viables (UFC/mL).
infección sincronizada de CAP y expresión de cas3
Un cultivo de toda la noche de la cepa de ensayo en LB se diluyó 100 veces y se incubó hasta la fase estacionaria en LB a 37 °C con agitación, y se separaron posteriormente alícuotas de 10 mL en tubos falcon de 50 mL. Cada alícuota se sembró entonces con 50 µL de lisado de alta títulación de los CAP individuales, y la incubación continuó bajo las mismas condiciones. Además, un volumen de LB simulado de 10 mL para cada CAP también se sembró con 50 µL de lisados de CAP y se usó para la enumeración de fagos de 0 min. A los 5 min, 15 min y 30 min después de la siembra, se recogieron alícuotas para la extracción de ARN total y la enumeración de fagos. Las alícuotas de enumeración de fagos se filtraron con jeringa (0,2 µm, Sartorious, Göttingen, Alemania) y se sometieron a un ensayo de eficiencia de siembra en placas. Para la extracción de ARN total, se centrifugaron alícuotas de 1 mL de cultivos individuales a 13,3k xgutilizando una centrífuga de sobremesa durante 15s y se descartaron los sobrenadantes. A continuación, los sedimentos se resuspendieron inmediatamente en solución RNA Later fría (Thermo Fischer Scientific, AM7020) y se almacenaron a -20 °C hasta su extracción. El ARN total se extrajo utilizando un kit de ARN Total GeneElute (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) siguiendo el protocolo del fabricante para la extracción de ARN de bacterias. Tras la primera elución, se añadió 1 µL de ADNasa I (1 U/µL) y se incubó durante la noche a 37 °C. La reacción finalizó mediante incubación a 70 °C durante 15 min. El ARN se volvió a purificar en una columna GeneElute y se eluyó en 35 µL del tampón de elución del kit. La concentración de ARN total se estimó con un instrumento NanoDrop (Thermo Scientific, One/OneC) y se añadieron de 0,5 a 2 µg de ARN a una reacción de síntesis de ADNc que contenía la enzima RT SuperScriptIII (Thermo Fisher, Waltham, MA, EE. UU.) y decámeros aleatorios para cebar la síntesis en un volumen de reacción de 20 µL. La reacción de ADNc se diluyó a 100 µL en agua. La PCR en tiempo real se realizó por triplicado utilizando 5 µL de ADNc como molde, 10 µL de la mezcla maestra para PCR Power SYBR Green (Thermo Fisher) y 0,2 µM de cada cebador de PCR. Las PCR se realizaron en un sistema AB QuantStudio5 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.) utilizando el protocolo estándar de termociclado de dos etapas para la mezcla maestra para PCR Power SYBR Green con hibridación/extensión a 60 °C. Los cebadores directos e inversos paragapA(gen de referencia) fueron 5'-cgctaacttcgacaaatatgctggc-3' (SEQ ID NO: 17) y 5'-aggacgggatgatgttctgggaa-3' (SEQ ID NO: 18), y paracas3fueron 5'-caagtatgctaccaacggctaaag-3' (SEQ ID NO: 19) y 5'-ccaatcaaaatcaacgtcgagtga-3' (SEQ ID NO: 20). Los productos de PCR individuales se confirmaron para estos pares de cebadores mediante análisis de curvas de fusión. Los niveles relativos de transcritos se estimaron utilizando diluciones de 10 veces de productos de PCR purificados como estándares, y los valores se expresaron como la relación de los transcritos decas3agapA.
Ensayo de competencia de fagos
Los lisados de ambos fagos se mezclaron en una relación 9:1 (WT:CAP) y las mezclas de fagos se añadieron a 10 ml de medio 2xYT que contenía 10 mM de CaCl₂ y 20 mM de MgCl₂, y 100 µL de cultivo de toda la noche de la cepa deE. colib230, sirviendo como diana para ambos fagos competidores. Tras 2 h de incubación en una incubadora con agitación a 37 °C, los cultivos se centrifugaron y se añadió 1 µL del sobrenadante a un nuevo cultivo de b230. Las mismas etapas se repitieron dos veces.
La relación de fagos se evaluó mediante PCR con tres cebadores, lo que resultó en dos productos específicos, uno para el fago WT y otro para el CAP. Los productos de PCR se separaron en un gel de agarosa al 1 % y las bandas de ADN se tiñeron con SYBRsafe y se visualizaron y cuantificaron con el sistema ChemiDoc XRS+ (modelo 1708265, Biorad). La intensidad con corrección de fondo de la banda correspondiente al fago WT se dividió por la intensidad de la banda correspondiente al CAP en el mismo carril, para obtener la relación de las intensidades de las dos bandas (WT/CAP). La fracción de CAP en comparación con el contenido total de fagos (WT+CAP) se determinó con base en la curva de calibración, que se realizó utilizando un conjunto de diferentes mezclas de los dos fagos y ajustando una curva a las relaciones de intensidad de banda medidas (WT/CAP). El error estimado de los valores reportados es inferior al 20 %.
Ensayo de eliminación del césped
Un cultivo de toda la noche de la cepa de ensayo en LB se ajustó a 10<9>UFC / mL. Se mezclaron alícuotas de cien µL de la cepa ajustada con 100 µL de 10<9>UFP/ mL para lograr una multiplicidad de infección de 1 de CAP α15.2 o WT α15 en tubos Falcon de 15 mL, se mezclaron con 3 mL de agar superior fundido y pretemplado y se extendieron en placas LB. Después de que los céspedes se solidificaron, las placas se incubaron a 37 °C durante la noche y se contó el número total de colonias supervivientes para los grupos CAP α15.2 o WT α15 al día siguiente. Los ensayos se realizaron como duplicados biológicos independientes donde cada experimento comprendió diez réplicas técnicas. La significancia estadística se estableció utilizando ambas réplicas mediante una prueba U de Mann-Whitney.
Ensayo de transducción generalizada
La capacidad de transducción de cada CAP se evaluó mediante el ensayo de transducción generalizada. Brevemente, se prepararon lisados transductores propagando cada CAP enE. coliMG1655lamB::Cm.Esta cepa se modificó a partir de la WT MG1655 (Número de catálogo 700926, American Type Culture Collection, Manassas, VA, EE. UU.) para que llevara un marcador de selección de cloranfenicol. Los experimentos se llevaron a cabo en paralelo con el fago lítico T4 bien caracterizado (control negativo) y su mutante transductor T4GT7<58>(control positivo). Después de esta etapa, la cepa WTE. coliMG1655 se infectó a una DO600de 0,3 con cada lisado transductor a una Mol de 0,5, 0,1 y 0,01, y se extendió en placas LB que contenían cloranfenicol. Al día siguiente, se registró el número de colonias transductantes para cada CAP, controles y diferentes MOI. La frecuencia de transducción se calculó como el número de transductantes dividido por el título del lisado transductor.
Análisis de secuencias de los CAP
Se analizaron las secuencias de los CAP de SNIPR001 individuales para detectar la presencia de resistencia a antibióticos, genes de virulencia y genes asociados a la lisogenia (transposasas e integrasas) usando bases de datos (Tabla 2). Además, se analizaron muestras de fagos usando secuenciación de genoma completo. Esto suele resultar en una cobertura >1.000x de todo el genoma del fago. Los ensamblajes se construyen reduciendo la muestra de los datos a una cobertura promedio de 1.000x para el fago y el ensamblaje mediante SKESA. Para detectar diferencias entre muestras y para detectar mutaciones no mayoritarias, las lecturas sin procesar se mapearon de nuevo al ensamblaje usado BWA (versión 0.7.17).
Tabla 2: Lista de bases de datos utilizadas para el análisis de las secuencias de CAP SNIPR001
Ensayo de especificidad de fagos usando un ensayo de muerte en líquido
Se evaluó la especificidad de eliminación de los CAP SNIPR001 (α15.2, α20.4, α48.4 y α51.5) y de SNIPR001 mediante un ensayo de biopotencia frente a un panel de cepas bacterianas aerobias (n =6) y anaerobias (n =3) relevantes para los seres humanos. Se incluyó una cepade E. colib2480 como control positivo para la eliminación mediada por fagos (Tabla 3).
En resumen, los cultivos de toda la noche se ajustaron a 10<6>UFC /ml en caldo LB. Se añadieron los CAP SNIPR001 o SNIPR001 (en el que cada CAP se combinó en relaciones iguales) a una MOI de 1 antes de la incubación durante 4 h. Se cultivaron bacterias no tratadas en paralelo como control del crecimiento bacteriano. Los recuentos de UFC se registraron a las 0 y 4 h después del tratamiento con fagos, y los datos se representan como ∆log10UFC/ml, restando el inóculo inicial (0 h) del punto final del ensayo (4 h).
Tabla 3: Panel de cepas bacterianas (aeróbicas: n = 6, anaeróbicas: n = 3, aeróbicas/anaeróbicas: n = 1) ensayadas mediante un ensayo de biopotencia, que muestra la clasificación del tipo de Gram, las condiciones de crecimiento y la fuente/ID
Ensayo de deposición y eficiencia de siembra en placas (EoP)
Para el recuento de los títulos de fagos, los lisados de fagos o la mezcla de igual volumen de CAP SNIPR001 se diluyeron en serie 10 veces en tampón SM o PBS, respectivamente. Los céspedes bacterianos se prepararon añadiendo 100 o 300 µL de cultivo bacteriano de toda la noche a 3 o 10 mL de agar superior al 0,5 % (que contenía con Ca<2+>y Mg<2+>), que se agitó brevemente en vórtex y se vertió en una placa LB redonda o cuadrada. Se depositaron cinco µl de la serie de dilución de los fagos de ensayo sobre el césped y se dejaron secar a temperatura ambiente con la tapa abierta antes de la incubación a 37 °C durante la noche. Las cepas b52, b2479 y b17 se utilizaron como controles del ensayo y se incluyeron en cada ronda de ensayos.
Al día siguiente, se evaluaron los resultados (Tabla 4). En este ensayo, se define como cepa susceptible aquella que produce placas que se pueden contar en UFP/ml, así como aquella sin placas visibles, pero que muestra un deterioro del crecimiento bacteriano (es decir, zonas de lisis). La cobertura define el porcentaje del número total de cepas susceptibles. Se registraron imágenes de todas las placas. En las figuras que ilustran la eficiencia de los resultados de la siembra en placas, primero se transformaron los títulos log10y posteriormente se calcularon las desviaciones estándar y los promedios. Los paneles clínicos y las cepas control se ensayaron en dos experimentos independientes.
Tabla 4 Criterios utilizados para evaluar los resultados del ensayo de deposición y definición de la susceptibilidad de la cepa siguiendo los estándares<46,59>
Animales y alojamiento
Los estudios en ratones se realizaron con ratones hembra CD-1® IGS (aproximadamente 6-7 semanas de edad al llegar) de Charles River (Friburgo, Alemania). Los animales se alojaron en grupos de 3 a 5 ratones por jaula dentro de una habitación con clima controlado (temperatura 20-23 °C; humedad relativa 30-70 %) bajo un ciclo de luz-oscuridad de 12:12 h (iluminado 07:00-19:00). El pienso granulado estándar y el agua del grifo estaban disponiblesad libitum.A los animales se les permitió un período de aclimatación de al menos 7 días antes del inicio de los procedimientos experimentales. Su usaron 30 minicerdos hembras de Göttingen (aproximadamente 4-7 meses de edad al llegar) de Ellegaard Göttingen minicerdos A/S, Dinamarca, para estudios de tolerabilidad y cinética. A los animales se les permitió un período de aclimatación de al menos 14 días antes del inicio de los experimentos. Los cerdos se alojaron en grupos de 2 a 3 animales y se les administró dieta estándar para cerdos dos veces al día, con agua del grifo disponiblead libitum.Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de la Inspección Danesa de Experimentos con Animales, del Ministerio de Medio Ambiente y Alimentación de Dinamarca, y de acuerdo con la licencia institucional (BioAdvice, licencia para animales no.2015-15-0201-00540).
Modelo de colonización intestinal en ratones
El modelo de colonización intestinal en ratones se adaptó de Galtieret al.(2016)<44>. Brevemente, se administró un pretratamiento con estreptomicina (5 g/L) en el agua de bebida 3 días antes de la inoculación conE. colib17 para disminuir el nivel de bacterias nativas. El día 0, se preparó un inóculo de 3 x 10<7>UFC deE. colib17 a partir de una solución madre de glicerol congelada y se administró a todos los ratones en 0,25 mL mediante sonda oral.
El tratamiento se administró tres veces al día durante 2 días, comenzando 2 días después de la inoculación. Justo antes de cada administración, se mezclaron los cuatro CAP en una relación 1:1:1:1 para formar SNIPR001 en una concentración alta, media o baja, lo que resultó en niveles de dosis de 2 x 10<11>, 2 x 10<9>y 1 x 10<7>UFP. En el momento del tratamiento, se administró a los ratones 0,1 ml de bicarbonato de sodio al 10 % por sonda oral, seguido de la administración oral de 0,3 ml de SNIPR001, solución salina (vehículo) o 43,5 mg/kg de gentamicina.
Recuperación de CAP y estudios de tolerabilidad
Se administró a minicerdos de Göttingen primero un cóctel de antibióticos que comprendía neomicina (60 mg/kg, por vía oral, una vez al día durante 4 días) y cefquinoma (2 mg/kg, por vía intramuscular, una vez al día durante 3 días) antes de la administración de SNIPR001 o CAP único para disminuir el nivel de bacterias Gram-negativas en el tracto GI y, por lo tanto, limitar la replicación de fagos. Luego, los animales ayunaron durante la noche y se sedaron ligeramente antes de la administración de un solo CAP, o cóctel de SNIPR001, una vez por vía oral a 2 x 10<12>UFP en 100 ml, después de una administración oral de 50 ml de bicarbonato de sodio al 10 %. Se recogieron muestras fecales diariamente para la cuantificación de los CAP mediante un ensayo de placa. Además, para el estudio de tolerabilidad, se recogieron muestras de sangre para análisis hematológicos y químicos sanguíneos, incluyendo proteína C reactiva y ensayo de placa. Los animales fueron monitorizados de cerca después de la administración de SNIPR001, y su temperatura corporal se registró regularmente.
Cuantificación deE. colib17 y CAP en heces
Las muestras fecales se homogeneizaron y se diluyeron en serie en tampón SM. Se depositaron triplicados de 10 µl de cada dilución en placas de agar McConkey (Sigma, M7408) suplementado con estreptomicina (1 mg/mL) y se incubaron de 12 a 16 h a 37 °C para la enumeración deE. coli.
Se realizaron ensayos de placa para la enumeración de los CAP en muestras fecales. Brevemente, las muestras homogeneizadas se centrifugaron a 10.000 g durante 10 min y el sobrenadante se diluyó en serie. Se depositaron triplicados de 10 µl de cada dilución sobre una cobertura deE. colib17 y se incubaron de 12 a 16 h a 37 °C.
Para cuantificar la presencia de resistentesin vivo,se tomaron tres colonias de cada muestra fecal de ratones del grupo de dosis media en 3 puntos de tiempo diferentes de las placas de agar McConkey. Las colonias se incubaron de 12 a 16 h a 37 °C en caldo LB y se utilizaron para preparar coberturas de agar superior sobre las placas de agar LB. A continuación, las placas se secaron durante 15 minutos en la mesa LAF. El cóctel SNIPR001, así como los cuatro CAP individuales, se depositaron como una serie de diluciones a partir de preparaciones madre de 1 x 10<5>PUF/mL. Como control, se depositó de la misma forma una cobertura de agar superior de la cepa de colonizaciónE. colib17. Las placas se dejaron secar en la mesa LAF con la tapa puesta y, posteriormente, se incubaron boca abajo de 12 a 16 h a 37 °C.
Secuenciación del genoma completo de cepas deE. colide JMI
El ADN genómico total se extrajo y purificó utilizando el kit de ADN Celular y Tisular KingFisher (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) en una estación de trabajo robótica de procesador de partículas magnéticas KingFisher<TM>Flex (Thermo Scientific).
Se utilizó ADN genómico total como material de partida para la construcción de las bibliotecas. Las bibliotecas de ADN se prepararon utilizando el protocolo de construcción de bibliotecas y kit de indexación Nextera XT<TM>(Illumina, San Diego, CA, EE. UU.) y se secuenció en un secuenciador MiSeq (Illumina) utilizando Kits de Reactivo MiSeq v3 (600 ciclos).
Definiciones de fenotipos de resistencia
El fenotipo de β-lactamasa de espectro extendido (ESBL) se definió paraEscherichia colicomo un valor de concentración inhibitoria mínima (MIC) ≥2 mg/L para ceftriaxona, ceftazidima y/o aztreonam (https://clsi.org/). LasEnterobacteralesresistentes a los carbapenémicos (CRE) se definió como cualquier aislado que mostrara resistencia a imipenem, doripenem y/o meropenem con MCI > 2 mg/L (https://clsi.org/).
Ensamblaje de datos de secuenciación del genoma completo
Las lecturas de secuenciación sin procesar se recortaron usando Trimmomatic<60>(versión 0.39) con la configuración "LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:36". Las lecturas recortadas se ensamblaron usando SPAdes<61>(versión 3.14.1) con la configuración por defecto. Los cóntigos de menos de 500 pb o con una profundidad de secuenciación inferior a 2x se eliminaron de los ensamblajes finales.
Métodos genómicos comparativos para cepas clínicas deE. coli
La tipificación de secuencias de múltiples locus (MLST) se realizó utilizando MLST2<62>en los genomas ensamblados de la bacteriaE. coliutilizando la configuración por defecto, con la base de datos MLST descargada el 1 de julio de 2021, del repositorio MLST2 (https://bitbucket.org/genomicepidemiology/m1st_db/src/master/). La clasificación de filogrupos se realizó utilizando ClermonTyping<63>en los genomas ensamblados deE. coliutilizando la configuración por defecto. Las matrices de distancia para la construcción del árbol filogenético se generaron utilizando MASH<64>con un tamaño de k-mer de 21 y 10.000 pruebas por genoma. Luego, las pruebas se compararon para crear la distancia MASH de manera pareada para crear una matriz de distancia de los genomasde E. coli.
Análisis de sintenia de fagos
Para generar el diagrama de sintenia, se anotaron con RAST las secuencias de tipo salvaje de los cuatro fagos incluidos en el cóctel final, además de los dos fagos de referencia estrechamente relacionados y bien conocidos (RB69 AY303349.1 y T2 NC_054931.1), para extraer las secuencias proteicas predichas. Todas las secuencias proteicas de cada fago se consultaron de nuevo con los demás genomas de fagos usando tblastn. (v 2.12.0), con un valor E de corte de 1e-10. El gráfico de sintenia se generó entonces usando un script de Python personalizado (véase Disponibilidad de datos), utilizando la biblioteca drawSvg (v 1.9.0). El gráfico muestra los genomas de los fagos en orden de similitud y muestra todos los resultados de tblastn como bloques de sintenia sombreados según su identidad proteica. Las proteínas de los dos fagos de referencia se clasificaron manualmente según su pertenencia a cada uno de los grupos funcionales "Metabolismo del ADN", "Estructura" u "Otros", y se colorearon según correspondiera.
Procesamiento de los datos y visualización
Las figuras y las estadísticas clave se generaron usando R versión 4.1.0. Para la generación de figuras se utilizaron los siguientes paquetes: RcolorBrewer v. 1.1-2, ape v. 5.5, ggsignif v. 0.6.2, ggpubr v. 0.4.0, matrixStats 0.59, reshape2 v.1.4.4, ggimage v.0.3.0, here v.1.0.1, purr v.0.3.4, ggtree<65>v.3.0.2, systemfonts v. 1.0.2, Cairo v.1.5-12.2, cowplot v.1.1.1, reaxxl v.1.3.1 y ggplot2 v.3.3.3. Los promedios y las desviaciones estándar se calculan después de transformar los valores a la escala mostrada en una figura dada, por ejemplo, cuando se utiliza una escala log10, los promedios y las desviaciones estándar se calculan después de la transformación log10.
Disponibilidad de los datos
Los datos y resultados que se generaron durante este estudio se encuentran depositados en https://grthub.com/sniprbiome/SNIPR00l_paper. Las secuencias de los genomas de los fagos están depositadas en GenBank con los números de acceso OQ067373-76.
Disponibilidad del código
Todo el código necesario para producir este estudio está disponible en https://github.com/sniprbiome/SNIPR00l_paper.
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Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una composición que comprende al menos 4 tipos diferentes de partículas de transducción, en donde cada una de dichas partículas comprende un ácido nucleico y dichas partículas son capaces de entrar en contacto con células deE. colie introducir en ellas el ácido nucleico, en donde
(a) dicho ácido nucleico de cada partícula comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un producto de interés (POI), en donde el ácido nucleico es capaz de expresar el POI en una célula deE. coli; y en donde el POI comprende:
(i) una nucleasa Cas para dirigirse y cortar el ADN de la célula deE. coli, modificando o matando así la célula; y
(ii) al menos un ARNcr o ARN guía, cada uno de los cuales comprende una secuencia espaciadora que es complementaria a una secuencia protoespaciadora comprendida por un gen seleccionado de los genes deE. colidel filogrupo B2fimH,bolA, rpoH, lptAymurAy cada uno de los cuales es operable con la nucleasa Cas para dirigirse al ADN en las células deE. coli;
(b) cada partícula comprende:
(iii) un resto de adhesión para reconocer y unirse a un resto cognado seleccionado de un LPS y Tsx que se muestran en la superficie de las células deE. coli;y
(iv) una cápside de fago que contiene el ácido nucleico; y
(c) dichos al menos 4 tipos diferentes de partículas de transducción comprenden
A: partículas que comprenden un resto de adhesión a LPS y un resto de adhesión a LamB;
B: partículas que comprenden un resto de adhesión a LPS y un resto de adhesión a Tsx; y
C: partículas que comprenden un resto de adhesión a Tsx, pero que están desprovistas de restos de adhesión a LamB y LPS;
y en donde las partículas de la composición se dirigen a todos los genes deE. coli fimH,bolA, rpoH, lptAymurA.
2. La composición de la reivindicación 1, en donde la cápside de cada partícula comprendida por la composición es una cápside de fago T-par; opcionalmente una cápside de un fago T2 o un fago RB69.
3. La composición de cualquier reivindicación anterior, en donde cada partícula es un fago (opcionalmente un fago lítico) o un fagémido empaquetado.
4. La composición de cualquier reivindicación anterior, en donde el ácido nucleico de cada partícula comprende al menos una secuencia de nucleótidos (N1) que codifica dicho POI, en donde cada partícula es un fago T-par sintético que comprende una inserción de N1 en una Región Permisiva de Modificación (MPR) del genoma del fago, en donde la MPR se encuentra inmediatamente después delgen 49y algen Een comparación con un fago T2 de tipo salvaje de referencia;
(a) el ácido nucleico comprende una deleción de ADN del ADN del fago en la MPR;
(b) la inserción comprende hasta 8.000 pb de ADN y/o la deleción comprende hasta 8.000 pb de ADN;
(c) la MPR comprende ADN contiguo entre dichogen 49y elgen E,en donde el ADN contiguo tiene una longitud de al menos 1.000 pb; o en donde la MPR comprende al menos 100 pb de ADN entre dichogen 49y elgen E;y/o
(d) el genoma del fago sintético comprende dicha inserción entre las coordenadas 9000 y 21000, en donde las coordenadas son las posiciones de nucleótidos contadas desde el nucleótido (número de coordenada 1) inmediatamente posterior algen 49hacia elgen Een comparación con un fago T2 de tipo salvaje de referencia.
5. La composición de cualquier reivindicación anterior, en donde la nucleasa es una nucleasa Cas de tipo I, II, III, IV, V o VI, opcionalmente una Cas9 o una Cas3.
6. La composición de cualquier reivindicación anterior, en donde cada secuencia protoespaciadora es de la cepa ST131.
7. La composición de cualquier reivindicación anterior, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica el POI comprende un promotor debolAdeE colio comprende la SEQ ID NO: 13.
8. La composición de cualquier reivindicación anterior, en donde las células deE. colicomprenden una cepa deE. colique causa sepsis, septicemia o diarrea en seres humanos o animales.
9. La composición de cualquier reivindicación anterior para su uso en el tratamiento o prevención de una infección por células deE. colien un sujeto humano o animal, en donde el uso comprende administrar la composición al sujeto.
10. La composición de cualquier reivindicación anterior para su uso en el tratamiento o la prevención de sepsis, septicemia o diarrea en un sujeto humano o animal, comprendiendo el uso la administración al sujeto de la composición, en donde las células deE. colicomprenden una cepa deE. colique causa sepsis, septicemia o diarrea en seres humanos o animales.
11. La composición para su uso de las reivindicaciones 9 o 10, en donde el sujeto es un paciente con trasplante o cáncer (opcionalmente, un paciente con cáncer hematológico), o en donde el paciente padece o está en riesgo de padecer una infección del tracto urinario (UTI); y opcionalmente, en donde el trasplante es un trasplante de órgano sólido o de células madre (opcionalmente, un trasplante de células hematopoyéticas) o en donde el trasplante es un trasplante de un dispositivo médico; opcionalmente, en donde la administración se realiza antes de que el sujeto reciba un trasplante.
12. La composición para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 9-11 para prevenir el síndrome hemolítico urémico (HUS), una infección UTI, sepsis, septicemia o diarrea en un sujeto humano.
13. La composición para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 9-12, en donde se administran al sujeto al menos 1 x 10<7>UFP de partículas; o una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde la composición comprende una dosis de al menos 1 x 10<7>UFP de dichas partículas.
14. La composición para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 9-13, en donde las partículas se administran al sujeto a una MOI (multiplicidad de infección) de al menos 0,01.
15. La composición para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 9-14, en donde las células deE. colicomprenden al menos una cepa que es una cepa resistente a antibióticos o MDR; y/o al menos una cepa B2-I; opcionalmente, en donde el antibiótico es fluoroquinolona (opcionalmente, levofloxacino), carbapenem o vancomicina; y/o en donde las células deE. colicomprendenE. coliproductora de beta-lactamasa (ESBL).
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