ES3040079T3

ES3040079T3 - Biomimetic peptides and their use in bone regeneration

Info

Publication number: ES3040079T3
Application number: ES22760952T
Authority: ES
Inventors: Marco Biagiotti; Giuliano Freddi; Antonio Alessandrino; Maurizio Sironi; Stefano Pieraccini; Federico Dapiaggi
Original assignee: Klisbio Srl
Current assignee: Klisbio Srl
Priority date: 2021-08-09
Filing date: 2022-08-04
Publication date: 2025-10-28
Anticipated expiration: 2042-08-04
Also published as: PL4384540T3; JP2024530046A; CA3227954A1; EP4384540A1; IT202100021557A1; CN117999277A; US20250129123A1; EP4384540C0; WO2023016904A1; EP4384540B1

Abstract

La invención se refiere a péptidos biomiméticos con una secuencia pentapeptídica común que permiten la regeneración ósea mediante la activación del proceso de deposición de hidroxiapatita (Hap). También se describen sus usos como medicamento, específicamente en el campo de la regeneración ósea, dental (dentina y esmalte) y periodontal, y en la funcionalización de prótesis, tornillos, fijaciones, insertos o soportes de metal, cerámica o materiales poliméricos naturales o sintéticos. Se describen además una composición farmacéutica y una composición cosmética que comprenden dichos péptidos, su uso como medicamento en la regeneración ósea, dental y periodontal, su uso cosmético y su uso en la funcionalización de prótesis, tornillos, fijaciones, insertos o soportes de metal, cerámica o materiales poliméricos naturales o sintéticos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Péptidos biomiméticos y su uso en la regeneración ósea

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La invención se refiere a péptidos biomiméticos que tienen una secuencia pentapeptídica común, que permiten la regeneración ósea mediante la activación del proceso de depósito de hidroxiapatita (Hap). También se describen sus usos como medicamento y, específicamente, en el campo de la regeneración ósea, dental (dentina y esmalte) y periodontal, y en la funcionalización de prótesis, tornillos, fijaciones, insertos o soportes hechos de metal, cerámica o material polimérico natural o sintético. Se describen, además, una composición farmacéutica y una composición cosmética que comprenden dichos péptidos, el uso como medicamento, en la regeneración ósea, dental y periodontal, su uso cosmético y su uso en la funcionalización de prótesis, tornillos, fijaciones, insertos o soportes hechos de metal, cerámica o material polimérico natural o sintético.

ESTADO DE LA TÉCNICA

[0002] El ensamblaje de hidroxiapatita (HAp) y proteínas es un proceso crucial que subyace a la formación de huesos y dientes en los vertebrados. El cuerpo humano es capaz de producir estos compuestos híbridos orgánicos-inorgánicos estructurados jerárquicamente utilizando moléculas orgánicas como reguladores del depósito de HAp.

[0003] La HAp [Caio(PO4)a(OH)2], una forma cristalina de fosfato de calcio (CaP), es el componente principal de los huesos, la dentina y el esmalte. En estos tejidos duros, la HAp, en combinación con varios tipos de proteínas, forma estructuras jerárquicas altamente organizadas con propiedades morfológicas, estructurales y mecánicas únicas.

[0004] El hueso está formado por un 65-70 % de componentes minerales, principalmente HAp y por un 30-35 % de moléculas orgánicas. El componente orgánico comprende principalmente colágeno tipo I, otras diversas proteínas no colágenas y glicosaminoglicanos.

[0005] La organización del colágeno tipo I es importante para el depósito de HAp en el tejido óseo. Dos cadenas a-1 y una cadena a-2 de colágeno tipo I constituyen la unidad fundamental de las fibrillas de colágeno, el tropocolágeno. Las unidades de tropocolágeno forman una estructura altamente alineada y las regiones de hueco entre las fibrillas, denominadas "zonas de huecos" y que tienen una alta densidad de carga, son los sitios críticos donde tiene lugar la nucleación del componente mineral.

[0006] Las proteínas de tipo no colágeno, como la sialoproteína ósea, la osteonectina, la osteopontina, la osteocalcina y las proteínas de la matriz dentinaria, se unen al tropocolágeno y controlan la mineralización de HAp. Estas proteínas incluyen una alta densidad de residuos de aminoácidos ácidos en sus secuencias, que tienen una alta afinidad por los iones Ca2+.

[0007] El esmalte dental está constituido por componentes minerales en más del 95 % en peso y por menos del 1 % en componentes orgánicos. En lugar del colágeno tipo I presente en el hueso, el papel más importante en la mineralización de HAp en el esmalte lo desempeña la amelogenina, con la contribución de otras proteínas (ameloblastina, amelina, sheathlina, enamelina y metaloproteasa de matriz 20). Las nanoesferas de amelogenina autoensamblada y grupos de prenucleación mineral forman nanopartículas compuestas que luego se ensamblan en cadenas lineales y matrices paralelas, lo que conduce a la formación de haces de cristales alargados de esmalte.

[0008] La reparación de defectos y/o huecos óseos y dentales puede realizarse mediante autoinjerto (uso de hueso derivado del propio paciente, extraído de otras partes del cuerpo) o aloinjerto (material óseo derivado de un cadáver). En ambos casos, a menudo, pueden surgir problemas insuperables debido a una falta de sitios de extracción (autoinjerto) o a problemas de inmunogenicidad (aloinjerto). Por estas razones, la investigación y el desarrollo de nuevos materiales para la reparación ósea y dental es un tema de gran actualidad. Teniendo como referencia los principios de la ingeniería tisular, la regeneración de tejidos y órganos puede lograrse mediante la implantación de construcciones de ingeniería. El éxito de una construcción de ingeniería depende del uso de una combinación adecuada de estructuras base, factores estimulantes y, posiblemente, células.

[0009] La comprensión de los mecanismos que subyacen a la mineralización del HAp con moléculas orgánicas ha sido una fuente de inspiración para el diseño de nuevos materiales funcionales. Muchos investigadores han estudiado la formación de híbridos orgánicos de HAp utilizando moléculas orgánicas, principalmente proteínas, en condiciones biológicas que imitan el proceso de biomineralización.

[0010] En lo que respecta a las proteínas, las relacionadas con la biomineralización de HApin vivosiempre se han considerado candidatas ideales para la producción de híbridos de proteína-HAp. De hecho, se ha estudiado muy a fondo la mineralización de HAp con colágeno y amelogenina, que son los componentes orgánicos que regulan el depósito de HAp en los huesos y los dientes. Las proteínas de tipo no colágeno y las proteínas distintas de la amelogenina que ayudan a controlar el depósito de HAp en los huesos y el esmalte también se han utilizado para la preparación de híbridos de proteína-HAp. Todos estos híbridos orgánicos-inorgánicos, utilizados como estructuras base para la regeneración ósea, en presencia o ausencia de células, han proporcionado resultados positivos al promover la diferenciación osteogénica de las células y mejorar la formación de hueso nuevo y la integración.

[0011]Las proteínas utilizadas para generar híbridos orgánicos de HAp no se limitan a las relacionadas con la mineralización ósea y dental. Las proteínas de la seda se han utilizado como proteínas modelo para la nucleación y el depósito de HAp debido a su alta biocompatibilidad y a sus propiedades mecánicas y estructurales.

[0012]Además de las proteínas, otras macromoléculas naturales, como los polisacáridos (p. ej., la quitina, el quitosano y el sulfato de condroitina), han despertado cierto interés como sustratos capaces de inducir y regular la precipitación de HAp. Del mismo modo, las nanofibras de celulosa bacteriana se han utilizado como modelo capaz de reproducir estructuras a base de colágeno para inducir el depósito de HAp.

[0013]Una alternativa muy interesante que ha surgido recientemente es el uso de péptidos biomiméticos como sustratos capaces de activar la nucleación de HAp si se incluyen en estructuras base para la regeneración ósea. Los péptidos pueden producirse fácilmente tanto mediante la síntesis directa de las secuencias de interés como mediante métodos de ingeniería genética. Las secuencias de interés pueden diseñarsein silicoo derivarse de las de los dominios activos de las proteínas de la matriz extracelular y de la gran familia de proteínas directamente implicadas en los procesos de mineralización óseain vivo(p. ej., colágeno tipo I, proteínas no colágenas, amelogenina, etc.), y luego utilizarse para funcionalizar estructuras base para la regeneración ósea y/o directamente para preparar híbridos de péptido-HAp.

[0014]Estos péptidos biomiméticos pueden desempeñar diversas funciones dentro de la matriz para la regeneración ósea: pueden tener actividad osteoconductora y favorecer la nucleación y el depósito de HAp, pueden tener actividad osteoinductora y, por lo tanto, favorecer la adhesión de las células, su proliferación y diferenciación en líneas osteoblásticas, y también podrían estar implicados en los procesos de neovascularización, que representan una etapa crucial para la regeneración óseain vivo.Dependiendo de la función que desempeñen, los péptidos biomiméticos pueden incorporarse a la estructura base en diversas posiciones (en la superficie, en la masa) y en forma libre o unida, dependiendo de si se requiere o no su difusión en el entorno que rodea al implante.

[0015]El interés particular en el desarrollo de nuevos materiales para la reparación ósea, periodontal y dental, junto con las dificultades encontradas en el caso de los autoinjertos o aloinjertos, son la base de la necesidad de identificar nuevos enfoques para la reparación de defectos en el campo de la regeneración ósea.

[0016]Por lo tanto, el objeto de la presente invención es proporcionar péptidos biomiméticos novedosos que permitan la regeneración ósea mediante la activación y la aceleración de los fenómenos de nucleación de HAp, que no muestren las desventajas que se observan en otros péptidos o proteínas conocidos para la misma aplicación. En particular, las proteínas pertenecientes a la familia de las BMP (proteínas morfogénicas óseas) presentan varias desventajas relacionadas con su extrema reactividadin vivoy el elevado coste de producción. Se han explotado comercialmente dos miembros diferentes de esta familia: BMP-2 y b MP-7. Los productos que contienen BMP-7, tras haber recibido autorizaciones reglamentarias solo para su uso en áreas muy limitadas, fueron retirados del mercado tras surgir serias dudas sobre su seguridad; de hecho, se han notificado casos de diversos efectos secundarios, que van desde simples irritaciones hasta infecciones graves que requirieron intervenciones quirúrgicas reparadoras. En cambio, los productos a base de BMP-2 (en particular, su versión recombinante rH-BMP-2) se encuentran actualmente en el mercado y representan el estándar de atención para un cierto número de aplicaciones, a menudo compitiendo con el uso de hueso autólogo. Sin embargo, con el tiempo, un número bastante elevado de estudios ha puesto de relieve muchos efectos secundarios, algunos incluso bastante graves, que pueden correlacionarse directamente con el uso de este péptido y que no se identificaron en los primeros ensayos clínicos; entre los principales se puede mencionar: osteólisis, problemas urológicos, aparición de dolor y, en el caso de dosis más altas, un aumento del riesgo de desarrollar tumores [E.J. Carrageeet al.The Spine Journal 11 (2011) 471-491]. Además, los productos que contienen rH-BMP-2 tienen un coste extremadamente elevado. En lo que respecta a los péptidos, en cambio, actualmente se utiliza en la clínica una secuencia derivada del colágeno tipo 1 ; esta secuencia, conocida como P-15, tiene una capacidad muy elevada para estimular la adhesión celular [H. Nguyenet al.Biochemical and Biophysical Research Communications 311 (2003) 179-186]; sin embargo, para que sea eficaz para promover la formación de tejido óseo, debe unirse a un soporte preformado, normalmente una matriz ósea, que proporcione a las células atraídas un entorno favorable en el que desarrollarse y diferenciarse. El documento KR 2011 0121401 A describe un material de injerto óseo para regenerar rápidamente una parte dañada y perdida del hueso mediante la aplicación del material de injerto óseo a la parte dañada y perdida del hueso. Dicho material de injerto óseo incluye péptido de fibroína de seda como principio activo, en donde el péptido de fibroína de seda tiene un peso molecular medio de 100-4000 Da.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

[0017]La invención se define en el conjunto de reivindicaciones anexas.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0018]A continuación, se describirá la invención con detalle y haciendo referencia a las siguientes figuras adjuntas. Figura 1: Imágenes SEM de espumas de fibroína. A: Espuma de fibroína sin péptidos, incubada en SBF durante 14 días. B: Espuma de fibroína funcionalizada con el péptido biomimético SEQ ID NO:3, incubada en SBF durante 14 días. C: Detalle con mayor aumento de la imagen B, que muestra la morfología de los depósitos minerales. D: Espuma de fibroína funcionalizada con el péptido biomimético SEQ ID NO:4, incubada en SBF durante 14 días. E: Espuma de fibroína funcionalizada con el péptido biomimético SEQ ID NO:2, incubada en SBF durante 14 días. F: Detalle con mayor aumento de la imagen E, que muestra la acumulación de los depósitos minerales.

[0019]Figura 2: Espectros IR de espumas de fibroína. (a) Espuma de fibroína sin péptidos, no incubada en SBF. (b) Espuma de fibroína sin péptidos, incubada en SBF durante 14 días. (c) Espuma de fibroína funcionalizada con el péptido biomimético SEQ ID NO:3, incubada en SBF durante 14 días. (d) Espuma de fibroína funcionalizada con el péptido biomimético SEQ ID NO:4, incubada en SBF durante 14 días. (e) Espuma de fibroína funcionalizada con el péptido biomimético SEQ ID NO:2, incubada en SBF durante 14 días. El área delimitada por el rectángulo discontinuo identifica la región espectral 1100-900 cm-1 característica de las vibraciones de estiramiento de los grupos fosfato y carbonato.

[0020]Figura 3: Espectros SEM/ EDX de espuma de fibroína funcionalizada con el péptido biomimético SEQ ID NO:4 incubada en SBF durante 14 días. La imagen SEM de la parte superior muestra una zona de la muestra en la que están presentes las dos formas cristalinas: a la derecha predominan los cristales de gran tamaño y forma regular (objetos 10438), mientras que, a la izquierda, se observan claramente los agregados cristalinos que consisten en la unión de cristales de pequeño tamaño (objetos 10437). La composición química de los cristales "objetos 10438" está dominada por la presencia de los elementos sodio (Na) y cloro (CI), mientras que el calcio (Ca) y el fósforo (P) están completamente ausentes. Por el contrario, los agregados "objeto 10437" presentan señales intensas de calcio (Ca) y fósforo (P). Las señales relativas a los elementos carbono (C), oxígeno (O), nitrógeno (N), oro (Au) y paladio (Pd), que son comunes a ambos espectros, reflejan la naturaleza orgánica de la espuma de fibroína (C, O, N) y el método de preparación de la muestra (pulverización catódica de Au/Pd).

[0021]Figura 4: Las espumas de fibroína no funcionalizadas (SF) y funcionalizadas con los péptidos biomiméticos (SEQ ID<n>O:2; SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:4), incubadas en ausencia (NO MSC) o en presencia (+ MSC) de células madre mesenquimales humanas, se mantuvieron en un medio completo durante 7 días. Posteriormente, las espumas se descelularizaron y se tiñeron con tinción de von Kossa para resaltar los depósitos de calcio (A). El porcentaje de área cubierta por la tinción de von Kossa se calculó utilizando elsoftwareImageJ y se representó en los gráficos B y C. La cantidad de calcio depositado es siempre mayor en las espumas de fibroína funcionalizadas con los péptidos biomiméticos que en las espumas no funcionalizadas, tanto en ausencia (B) como en presencia (C) de células MSC.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0022]La presente invención se refiere a la identificación de péptidos biomiméticos novedosos de naturaleza sintética, que tienen la característica de permitir la regeneración ósea mediante la activación y aceleración de los procesos de nucleación y depósito de HAp.

[0023]Los péptidos biomiméticos consisten en la fórmula general (I):

Xaa1-Ser-Gly-Tyr-Glu-Tyr-Xaa2 (SEQ ID NO: 5), en donde:

- cuando Xaa1 es Val-Asn-Gly-Gly-Tyr (SEQ ID NO:6),

Xaa2 es Ala-Trp-Ser-Ser-Glu-Ser-Asp-Phe (SEQ ID NO:7)

o

Xaa2 es Ala-Trp;

- cuando Xaa1 está ausente,

Xaa2 es Ala-Trp-Ser-Ser-Glu-Ser-Asp-Phe (SEQ ID NO:7);

y

- cuando Xaa1 es Gly-Pro-Tyr-Val-Ala-His-Gly-Gly-Tyr (SEQ ID NO:8),

Xaa2 está ausente.

[0024]Todos los péptidos descritos en el presente documento tienen la secuencia pentapeptídica de SEQ ID NO:5 en común.

[0025]Ventajosamente, en una forma de realización preferida, los péptidos se seleccionan del grupo que consiste en: SEQ ID NO:1 Val-Asn-Gly-Gly-Tyr-Ser-Gly-Tyr-Glu-Tyr-Ala-Trp-Ser-Ser-Glu-Ser-Asp-Phe,

SEQ ID NO:2 Ser-Gly-Tyr-Glu-Tyr-Ala-Trp-Ser-Ser-Glu-Ser-Asp-Phe,

SEQ ID NO:3 Gly-Pro-Tyr-Val-Ala-His-Gly-Gly-Tyr-Ser-Gly-Tyr-Glu-Tyr, y

SEQ ID NO:4 Val-Asn-Gly-Gly-Tyr-Ser-Gly-Tyr-Glu-Tyr-Ala-Trp.

[0026]Todos los péptidos de SEQ ID NO:1-4 tienen el núcleo de aminoácido de SEQ ID NO:5 en común. Sin limitarse a ninguna teoría, parece que es precisamente este núcleo de cinco aminoácidos (pentapéptido) el que otorga a los péptidos la capacidad de regenerar los huesos activando y acelerando los fenómenos de nucleación del proceso de depósito de HAp. Estos péptidos fueron identificados por los inventores mediante pruebas en las que se añadieron a matrices de fibroína de seda los péptidos descritos en el documento US7193038, conocidos por facilitar la adhesión y proliferación celular.

[0027]Las matrices (en particular, superficies electrohiladas, geles, pastas y espumas) a las que se han añadido péptidos según la presente invención han favorecido la proliferación celular y un rápido inicio de los procesos de mineralización con depósito de precursores de hidroxiapatita, incluso en las matrices funcionalizadas incubadas en entornos favorables para el crecimiento óseo, tanto en presencia como en ausencia total de células.

[0028] Como confirmación de que este resultado era atribuible a la presencia de los péptidos utilizados para la funcionalización, se llevaron a cabo experimentos en el mismo entorno, pero con matrices no funcionalizadas y, como era de esperar, no se produjo ninguna nucleación (significativa) de componentes minerales.

[0029] Un segundo aspecto de la presente invención se refiere al uso como medicamento de los péptidos que tienen la fórmula general (I): Xaa1-Ser-Gly-Tyr-Glu-Tyr-Xaa2 (SEQ ID NO: 5)

en donde:

- cuando Xaa1 es Val-Asn-Gly-Gly-Tyr (SEQ ID NO:6),

Xaa2 es Ala-Trp-Ser-Ser-Glu-Ser-Asp-Phe (SEQ ID NO:7)

o

Xaa2 es Ala-Trp;

- cuando Xaa1 está ausente,

Xaa2 es Ala-Trp-Ser-Ser-Glu-Ser-Asp-Phe (SEQ ID NO:7);

y

- cuando Xaa1 es Gly-Pro-Tyr-Val-Ala-His-Gly-Gly-Tyr (SEQ ID NO:8),

Xaa2 está ausente.

[0030] En otro aspecto más, se describe el uso de los péptidos, que tienen la fórmula general (I) según la presente invención, en la regeneración ósea, dental (dentina y esmalte) y periodontal como sustrato para la nucleación de HAp.

[0031] En una forma de realización preferida, dicha regeneración ósea, dental y periodontal se produce en el tratamiento de una patología del tejido óseo, dental o periodontal o es necesaria para una técnica quirúrgica concreta.

[0032] En una forma de realización aún más preferida, dicha patología del tejido óseo, dental o periodontal se selecciona del grupo que comprende: fracturas, huecos óseos, sarcoma, hipersensibilidad dentinaria, piorrea, mientras que la técnica quirúrgica puede comprender fusión espinal posterolateral, discectomía cervical anterior con fusión, fusión intervertebral lumbar posterior, fusión intervertebral lumbar transforaminal, implantación de endoprótesis ortopédicas, elevación del seno maxilar, revisión de endoprótesis ortopédicas, vertebroplastia, implantación dental.

[0033] En un cuarto aspecto, la presente invención describe una composición que comprende uno o más péptidos, iguales o diferentes entre sí, sus sales y excipientes o aditivos aceptables en el campo biomédico, cosmético o farmacéutico.

[0034] La composición de la invención puede comprender, además, ácido hialurónico y/o sus sales, quitosano, ácido algínico, fibroína de seda, propilenglicol, alginato de propilenglicol, poloxámeros, sulfato de condroitina, colágeno, gelatina, elastina, ácido poliláctico (PLA), ácido poli(láctico-co-glicólico) (PLGa ), ácido poliglicólico (PGA), alcohol polivinílico (PVA), policaprolactona (PCL), biovidrios, hidroxiapatita y compuestos correlacionados, sales de calcio, matriz ósea descelularizada, pectina, sericina, celulosa y sus derivados, fibrina y sus combinaciones.

[0035] En una forma de realización preferida, la composición farmacéutica que comprende uno o más péptidos, iguales o diferentes entre sí, sus sales y excipientes farmacológicamente aceptables, se presenta en forma de gel, pasta, membrana, tejido, espuma, masilla, polvo, granos, sólido compacto, película o está contenida/adsorbida dentro de elementos micelares o particulados, fibras, nanofibras, fibras huecas, nanofibras huecas, membranas, cerámicas, nanotubos, estructuras metálicas porosas y/o trabeculares, productos textiles, nanoburbujas, sol-geles, combinaciones de estos sistemas y compuestos que contienen estos sistemas y sus combinaciones. Esta composición en forma de gel o pasta puede ser una pasta de dientes.

[0036] En otra realización preferida, la composición cosmética que comprende uno o más péptidos, iguales o diferentes entre sí, sus sales y excipientes aceptables para la formulación cosmética, se presenta en forma de gel, pasta, membrana, tejido, espuma, masilla, polvo, granos, sólido compacto, película o está contenida/adsorbida dentro de elementos micelares o particulados, fibras, nanofibras, fibras huecas, nanofibras huecas, membranas, cerámicas, nanotubos, estructuras metálicas porosas y/o trabeculares, productos textiles, nanoburbujas, sol-geles, combinaciones de estos sistemas y compuestos que contienen estos sistemas y sus combinaciones. Esta composición en forma de gel o pasta puede ser una pasta de dientes.

[0037] En otro aspecto más, la presente invención describe el uso de la composición en la regeneración ósea, dental y periodontal.

[0038] Los péptidos de la fórmula general (I):

Xaa1-Ser-Gly-Tyr-Glu-Tyr-Xaa2 (SEQ ID NO: 5), en donde:

- cuando Xaa1 es Val-Asn-Gly-Gly-Tyr (SEQ ID NO:6),

Xaa2 es Ala-Trp-Ser-Ser-Glu-Ser-Asp-Phe (SEQ ID NO:7)

o

Xaa2 es Ala-Trp;

- cuando Xaa1 está ausente,

Xaa2 es Ala-Trp-Ser-Ser-Glu-Ser-Asp-Phe (SEQ ID NO:7);

y

- cuando Xaa1 es Gly-Pro-Tyr-Val-Ala-His-Gly-Gly-Tyr (SEQ ID NO:8),

Xaa2 está ausente,

y se describen por medio de las secuencias SEQ ID NO:1-4 y se utilizan para la funcionalización de matrices de fibroína de seda como se ha descrito anteriormente.

[0039] También se describe el uso de la composición según la presente invención como medicamento.

[0040] En otro aspecto más, la presente invención describe el uso de la composición farmacéutica o cosmética que comprende los péptidos aquí descritos, para la funcionalización de la superficie de prótesis, tornillos, fijaciones, insertos o soportes hechos de metal, cerámica o material polimérico natural o sintético.

[0041] La presente invención describe, además, el uso de los péptidos de la invención, para la funcionalización de la superficie de prótesis, tornillos, fijaciones, insertos o soportes hechos de metal, cerámica o material polimérico natural o sintético. En otra forma de realización, se describe el uso cosmético de la composición, que comprende los péptidos que tienen la fórmula general (I):

Xaa1-Ser-Gly-Tyr-Glu-Tyr-Xaa2 (SEQ ID NO: 5) descrita en la presente invención.

[0042] A continuación se indican, a modo de ilustración, los siguientes ejemplos de formas de realización de la presente invención.

EJEMPLOS

Ejemplo 1:

Síntesis de los péptidos biomiméticos

[0043] Se han sintetizado varios péptidos en los que está presente el pentapéptido de SEQ ID NO:5. Las secuencias más prometedoras, y que han mostrado la capacidad de inducir un alto grado de mineralización con depósito de precursores de hidroxiapatita, son:

SEQ ID NO:1 Val-Asn-Gly-Gly-Tyr-Ser-Gly-Tyr-Glu-Tyr-Ala-Trp-Ser-Ser-Glu-Ser-Asp-Phe,

SEQ ID NO:2 Ser-Gly-Tyr-Glu-Tyr-Ala-Trp-Ser-Ser-Glu-Ser-Asp-Phe,

SEQ ID NO:3 Gly-Pro-Tyr-Val-Ala-His-Gly-Gly-Tyr-Ser-Gly-Tyr-Glu-Tyr, y

SEQ ID NO:4 Val-Asn-Gly-Gly-Tyr-Ser-Gly-Tyr-Glu-Tyr-Ala-Trp.

[0044] Los péptidos se sintetizaron siguiendo un protocolo de síntesis de péptidos en fase sólida con la ayuda de microondas. Se utilizó una resina de Wang como soporte. Cada acoplamiento se realizó trabajando con un exceso de 5 veces la carga inicial de la resina y se utilizaron como agentes de acoplamiento N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC) (0,5 M en dimetilformamida (DMF)) y el agente de acoplamiento Oxyma Pure ® (1 M en DMF). La escisión de la resina se llevó a cabo utilizando una mezcla de fenol, triisopropilsilano (TIS), tioanisol (TAN), H2O y ácido trifluoroacético (TFA) (4/4/4/2/86). Las secuencias se purificaron mediante RP-HPLC semipreparativa.

Ejemplo 2:

Preparación de espumas de fibroína funcionalizadas con los péptidos biomiméticos

[0045] Las matrices de fibroína funcionalizadas con los péptidos biomiméticos se prepararon en forma de espuma liofilizada, siguiendo el siguiente procedimiento:

a) para la preparación de la solución acuosa de fibroína, se añadieron 5 g de seda desgomada con 50 ml de una solución acuosa de bromuro de litio 9,3 M; la mezcla se incubó en un baño termostático a 60 °C durante 3 horas; al final del periodo de incubación, la solución se filtró y se diluyó con 100 ml de agua destilada, se transfirió a una bolsa de diálisis y se dializó durante 2 días contra agua destilada hasta que se eliminó completamente la sal; la solución acuosa de fibroína obtenida de este modo se recuperó de la bolsa de diálisis y se filtró antes de añadirle los péptidos biomiméticos;

b) para la preparación de las soluciones acuosas de péptidos biomiméticos, se solubilizaron 50 mg de péptido con 2,5 ml de agua destilada;

c) para la preparación de la solución de fibroína que contiene péptidos biomiméticos, se añadieron 10 ml de solución acuosa de fibroína con 2,5 ml de solución acuosa de péptido biomimético; para la preparación de la solución de fibroína sin péptidos biomiméticos (blanco), se añadieron 10 ml de solución acuosa de fibroína con 2,5 ml de agua;

d) para la preparación de las espumas liofilizadas, se tomaron 0,1 ml de la solución (c) con una micropipeta, se transfirieron a un recipiente de volumen correspondiente y se congelaron a -20 °C durante 24 horas; posteriormente, los recipientes se colocaron en un liofilizador y se dejaron liofilizar durante 48 horas, hasta que el hielo se eliminó por completo por sublimación; tras la liofilización, las espumas se consolidaron mediante inmersión en metanol y se dejaron secar a temperatura ambiente.

[0046]Las muestras de espuma de fibroína obtenidas de este modo se almacenaron en un desecador a temperatura ambiente hasta su uso posterior.

Ejemplo 3:

Incubación de espumas de fibroína funcionalizadas con los péptidos biomiméticos en un entorno favorable para el crecimiento óseo (en ausencia de células)

[0047]La solución en la que se incubaron las espumas funcionalizadas con péptidos biomiméticos se preparó según el método de Kokubo y Takadama (Kokubo T, Takadama H. ¿Hasta qué punto es útil el fluido corporal simulado (SBF, por sus siglas en inglés) para predecir la bioactividad ósea in vivo? Biomateriales 2006 27(15): 2907-2915). En adelante, la solución se identificará con el acrónimo SBF(Simulated Body Fluid,fluido corporal simulado).

[0048]La incubación de las espumas en SBF se realizó en las siguientes condiciones experimentales:

- peso de la espuma 4 mg

- volumen de la solución SBF: 40 ml

- temperatura: 37 °C

- duración máxima de la incubación: 14 días

- cambio de la solución SBF: cada 3 días

[0049]Al final del periodo de incubación, se retiraron las espumas, se enjuagaron suavemente con agua destilada y se dejaron secar a temperatura ambiente antes de realizar los análisis posteriores.

Ejemplo 4:

Caracterización morfológica mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) de las espumas de fibroína incubadas en SBF

[0050]Las muestras de espuma de fibroína se fijaron en soportes para muestras SEM(stubs)de 1 cm de diámetro utilizando cinta adhesiva de doble cara. A continuación, los soportes se recubrieron por pulverización catódica mediante exposición a plasma de oro/paladio (recubridor por pulverización catódica Desk IV, Denton Vacuum, LLC) y se analizaron con un microscopio electrónico de barrido (Zeiss<e>V<o>MA10). Los resultados obtenidos se indican en la figura 1.

[0051]Todas las muestras examinadas, tanto la espuma de fibroína no funcionalizada (blanco) como las espumas de fibroína funcionalizadas con los péptidos biomiméticos, presentan un depósito superficial de material con una estructura cristalina poliédrica, que parece mucho más brillante que el material polimérico del fondo que constituye la espuma. Estas características (estructura regular y alta intensidad de respuesta tras la exposición al haz electrónico) son típicas de los materiales inorgánicos.

[0052]La densidad del depósito inorgánico es significativamente mayor en las muestras de espuma de fibroína funcionalizada que en el blanco (espuma de fibroína no funcionalizada).

Ejemplo 5:

Caracterización mediante espectroscopia infrarroja (ATR-FTIR) de las espumas de fibroína incubadas en SBF[0053]Las muestras de espuma de fibroína se analizaron mediante espectroscopia infrarroja con un espectrómetro ALPHA FTIR (Bruker) equipado con un accesorio ATR Platinum Diamond, en el intervalo numérico de longitud de onda 4000-400 cm-1, con una resolución de 4 cm-1. Los espectros obtenidos se indican en la figura 2.

[0054]Al comparar los espectros de las muestras incubadas en SBF (blanco y espumas funcionalizadas con los péptidos biomiméticos) con la muestra de referencia (espuma de fibroína no incubada en SBF), se puede observar que las muestras incubadas presentan bandas IR en el intervalo espectral de 1100-900 cm'1 que no están presentes en la referencia. Estas bandas se atribuyen a la vibración de estiramiento de grupos como el fosfato y el carbonato. Por lo tanto, la presencia de estas bandas IR es atribuible al proceso de incubación en SBF. Todas las muestras de esponja incubadas en SBF, tanto las de blanco como las funcionalizadas con los péptidos biomiméticos, muestran estas bandas IR. Sin embargo, es interesante observar que la intensidad de las bandas es claramente mayor en las muestras funcionalizadas con péptidos biomiméticos, mientras que se mantiene en un nivel basal en las de blanco, según las observaciones morfológicas indicadas en el ejemplo 4.

Ejemplo 6:

Caracterización química mediante microscopía electrónica de barrido con detector de rayos X (SEM/EDX) de las espumas de fibroína incubadas en SBF

[0055]Las muestras de espuma de fibroína se analizaron en SEM/EDX con el fin de identificar morfológica y composicionalmente las formaciones minerales constituidas por sales de calcio y fosfato. Los resultados obtenidos se indican en la figura 3.

[0056]Como ya se ha destacado en la figura 1 (imágenes C y F), hay dos tipos de depósitos minerales: uno que consiste en cristales individuales y otro de agregados cristalinos de dimensiones variables. Mientras que los cristales únicos están compuestos principalmente por sodio (Na) y cloro (CI), los aglomerados se caracterizan principalmente por señales de calcio (Ca) y fósforo (P) y, con menor intensidad, magnesio (Mg). Cabe destacar que las señales de carbono (C), oxígeno (O), nitrógeno (N), oro (Au) y paladio (Pd) son comunes a todos los espectros, ya que reflejan la naturaleza orgánica de la espuma de fibroína (C, O, N) y el modo de preparación de la muestra (pulverización catódica de Au/Pd).

Ejemplo 7:

Prueba de mineralización de las espumas de fibroína incubadas en ausencia y en presencia de células madre mesenquimales humanas

[0057]Las células madre mesenquimales humanas (MSC) se adquirieron de Lonza y se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), suplementado con un 10 % de suplemento estimulante de MSC, 100 U/ml de penicilinaestreptomicina y aminoácidos no esenciales a 37 °C en una atmósfera totalmente humidificada al 5 % de CO2. Las espumas de fibroína se colocaron en una placa de 96 pocillos, se sumergieron en etanol al 70 % durante 30 minutos, se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS), se sumergieron en 100 U/ml de penicilinaestreptomicina durante toda la noche y se lavaron tres veces en PBS. Se sembraron MSC (104/50 pl) pipeteándolas en diferentes puntos de la espuma para mejorar la distribución de las células dentro de la espuma y se dejaron adherir durante 30 minutos. Posteriormente, se añadieron 150 pl de medio completo a cada pocillo. Como control negativo, las espumas de fibroína se mantuvieron en el medio completo sin células. El medio se cambió cada dos días.

[0058]El depósito de calcio en las espumas de fibroína descelularizadas se reveló mediante tinción de von Kossa. Las espumas se lavaron dos veces con PBS (sin contener iones de magnesio/calcio) antes de la lisis celular y la extracción de proteínas. La lisis celular se realizó utilizando el tampón HEPES (50 mM de HEPES, pH 7,4, 150 mM de NaCl, 10 % (v/v) de glicerol, 1 % (v/v) de Triton X-100, 1,5 mM de MgCh, 1 mM de EGTA) que contenía 100 mM de NaF, 1 mM de NaVO4, 1 pg/ml de leupeptina y 1 pg/ml de aprotinina. Tras 30 minutos en hielo, los extractos se centrifugaron durante 10 minutos a 13.000 g como lisado celular y se almacenaron a -20 °C. La matriz depositada restante se lavó dos veces con PBS (sin contener iones de magnesio/calcio). Para fijar la matriz en las espumas de fibroína, se añadió un 25 % de formaldehído en agua ultrapura a temperatura ambiente durante 10 minutos y, a continuación, se realizaron dos lavados con agua ultrapura. Se añadió una solución de nitrato de plata al 2,5 % a los pocillos que contenían las espumas de fibroína y, a continuación, se expusieron a rayos UV durante 30 minutos. Por último, se utilizó tiosulfato de sodio al 5 % para eliminar el exceso de plata sin reaccionar.

[0059]Las células madre mesenquimales humanas (MSC) se cultivaron durante 7 días en las espumas de fibroína funcionalizadas con los péptidos biomiméticos, utilizando como referencia una espuma de fibroína no funcionalizada. Las espumas sin células se incubaron durante un tiempo similar. El grado de depósito de calcio se estudió mediante tinción de von Kossa y se cuantificó mediante análisis de imagen con elsoftwareImageJ. En resumen, las imágenes se convirtieron a imágenes en escala de grises de 16 bits. El umbral se ajustó manualmente y se midió el porcentaje de área cubierta por la señal por encima del umbral.

[0060]Como se muestra en la figura 4, las espumas de fibroína funcionalizadas con los péptidos biomiméticos presentan mayores cantidades de depósitos de calcio que la espuma no funcionalizada. La cantidad de calcio depositado por la acción de los péptidos biomiméticos es mayor en las muestras incubadas en presencia de MSC que en las incubadas sin MSC. A partir de la descripción detallada y de los ejemplos anteriores, las ventajas que aportan los péptidos de la presente invención son evidentes. En particular, se ha mostrado que estos péptidos son sorprendentemente, y ventajosamente, adecuados para su uso en la regeneración ósea, dental y periodontal, favoreciendo una mineralización rápida y eficaz.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Péptidos que consisten en la fórmula general (I):

Xaa1-Ser-Gly-Tyr-Glu-Tyr-Xaa2 (SEQ ID NO: 5), en donde:

- cuando Xaa1 es Val-Asn-Gly-Gly-Tyr (SEQ ID NO:6),

Xaa2 es Ala-Trp-Ser-Ser-Glu-Ser-Asp-Phe (SEQ ID NO:7)

o

Xaa2 es Ala-Trp;

- cuando Xaa1 está ausente,

Xaa2 es Ala-Trp-Ser-Ser-Glu-Ser-Asp-Phe (SEQ ID NO:7);

y

- cuando Xaa1 es Gly-Pro-Tyr-Val-Ala-His-Gly-Gly-Tyr (SEQ ID NO:8),

Xaa2 está ausente, en donde dichos péptidos se seleccionan del grupo que consiste en:

SEQ ID NO:2 Ser-Gly-Tyr-Glu-Tyr-Ala-Trp-Ser-Ser-Glu-Ser-Asp-Phe,

SEQ ID NO:3 Gly-Pro-Tyr-Val-Ala-His-Gly-Gly-Tyr-Ser-Gly-Tyr-Glu-Tyr, y

SEQ ID NO:4 Val-Asn-Gly-Gly-Tyr-Ser-Gly-Tyr-Glu-Tyr-Ala-Trp.

2. Péptidos según la reivindicación 1, para su uso como medicamento.

3. Péptidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, para su uso en la regeneración ósea, dental y periodontal.

4. Los péptidos para uso según la reivindicación 3, en donde dicha regeneración ósea, dental y periodontal se produce en el tratamiento de una patología del tejido óseo, dental o periodontal.

5. Los péptidos para su uso según la reivindicación 4, en donde dicha patología del tejido óseo, dental o periodontal se selecciona del grupo que comprende: fracturas, huecos óseos, sarcoma, hipersensibilidad dentinaria, piorrea.

6. Composición que comprende uno o más péptidos según la reivindicación 1, sus sales y excipientes o aditivos aceptables en el campo biomédico, cosmético o farmacéutico.

7. La composición según la reivindicación 6, que comprende, además, ácido hialurónico y/o sus sales, quitosano, ácido algínico, fibroína de seda, propilenglicol, alginato de propilenglicol, poloxámeros, sulfato de condroitina, colágeno, gelatina, elastina, ácido poliláctico (PLA), ácido poli(láctico-co-glicólico) (PLG<a>), ácido poliglicólico (PGA), alcohol polivinílico (PVA), policaprolactona (PCL), biovidrios, hidroxiapatita, sales de calcio, matriz ósea descelularizada, pectina, sericina, celulosa, fibrina y sus combinaciones.

8. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 6 y 7, en donde dicha composición está en forma de gel, pasta, espuma, masilla, polvo, membrana, tejido, grano sólido compacto o película, o está contenida/adsorbida dentro de elementos o partículas micelares, fibras o nanofibras huecas, membranas, cerámicas o nanotubos, estructuras metálicas porosas y/o trabeculares, productos textiles, nanoburbujas, sol-geles o sus combinaciones.

9. La composición que comprende uno o más péptidos según la reivindicación 1, para su uso como medicamento.

10. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, para su uso en la regeneración ósea, dental y periodontal.

11. Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, para la funcionalización de prótesis, tornillos, fijaciones, insertos o soportes de metal, cerámica o material polimérico natural o sintético.

12. Uso cosmético de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8.

13. Uso de los péptidos según la reivindicación 1, para la funcionalización de prótesis, tornillos, fijaciones, insertos o soportes hechos de metal, cerámica o material polimérico natural o sintético.