ES3040135T3

ES3040135T3 - In vitro method for the diagnosis of synucleinopathies

Info

Publication number: ES3040135T3
Application number: ES19745075T
Authority: ES
Inventors: Katrin Beyer; Francesc Borràs; Valero Ana Gamez; Ramiro Alvarez
Original assignee: Fundacio Institut dInvestigacio en Ciencies de la Salut Germans Trias i Pujol IGTP
Current assignee: Fundacio Institut dInvestigacio en Ciencies de la Salut Germans Trias i Pujol IGTP
Priority date: 2018-07-19
Filing date: 2019-07-19
Publication date: 2025-10-28
Anticipated expiration: 2039-07-19
Also published as: EP4589015A2; EP3824290A1; EP3824290B1; EP4589015A3; WO2020016437A1; US20220162699A1; US12065701B2

Abstract

Método in vitro para el diagnóstico de sinucleinopatías. La presente invención se refiere a un método in vitro para el diagnóstico específico de una sinucleinopatía y/o para el diagnóstico diferencial de una sinucleinopatía con la enfermedad de Alzheimer (EA). En una realización preferida, la sinucleinopatía es la demencia con cuerpos de Lewy (DCL) o la enfermedad de Parkinson (EP). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodoin vitropara el diagnóstico de sinucleinopatías

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la medicina. Particularmente, se refiere a un métodoin vitropara el diagnóstico específico de sinucleinopatías y/o para el diagnóstico diferencial de sinucleinopatías frente a enfermedad de Alzheimer (EA). En una realización preferida, la sinucleinopatía diagnosticada es demencia con cuerpos de Lewy (DCL) y/o enfermedad de Parkinson (EP).

Estado de la técnica

La DCL es la segunda causa más común de demencia en todo el mundo después de la EA y tiene varias características patológicas y clínicas comunes con la EA y la EP. Este solapamiento entre estos trastornos neurodegenerativos implica que sólo 1 de cada 3 casos de DCL se diagnostica correctamente.

La demencia se define como el deterioro cognitivo progresivo de magnitud suficiente para interferir con las funciones sociales o laborales normales o con las actividades cotidianas habituales. La DCL pertenece, junto con la EP, al grupo de trastornos con cuerpos de Lewy. Además de la patología de los cuerpos de Lewy, los cerebros con DCL a menudo contienen patología concomitante de EA con depósitos de p-amiloide y tau, por tanto, la DCL presenta un importante solapamiento tanto con la EP como con la EA. Aproximadamente el 20-50 % de los pacientes con EP desarrollan demencia después de 10 años del diagnóstico de EP, siendo diagnosticados como enfermedad de Parkinson con demencia (EPD). Aunque muchos avances en este campo han permitido mejorar su caracterización, todavía es un reto diagnosticar precoz y específicamente la DCL, la EA y la EP. En particular, hasta el 80 % de los casos de DCL no se diagnostican o se diagnostican erróneamente, habitualmente como EA; y el tratamiento de pacientes con DCL con terapias específicas para EA o EP puede afectar negativamente a su cognición y a la evolución de la enfermedad. Por este motivo, se necesita urgentemente la identificación de biomarcadores y características moleculares implicados en la patobiología de estos trastornos para su diagnóstico diferencial y específico.

Además, tratando de minimizar el riesgo y las molestias de los pacientes, el estudio de la sangre ha ido creciendo recientemente, siendo una fuente prometedora de moléculas circulantes y biomarcadores basados en células. En este escenario basado en células, las plaquetas son liberadas a la circulación desde la médula ósea después de su diferenciación megacariocítica, esencial en procesos como la homeostasis. Aunque las plaquetas son células anucleadas, contienen un retículo endoplasmático rugoso, ribosomas, un sistema mitocondrial y apoptótico completo y muestran una ruta enzimática similar a la de las neuronas. Por tanto, la investigación de las enfermedades neurodegenerativas también se ha llevado a cabo mediante la investigación de los cambios biológicos y las características de las plaquetas. De hecho, las plaquetas se han considerado a lo largo de los años un tejido periférico adecuado para estudiar las enfermedades neurodegenerativas. La presencia de microARN (miARN, miR-) en estas células anucleadas, las convierte también en una prometedora fuente no invasiva de miARN como biomarcadores para varios trastornos.

El documento BR PI0903797-7 A2 divulga el usoin vitrodel aumento del nivel de expresión de miR-150-5p en sangre para el diagnóstico de sinucleinopatías. Sorensen SSet al.,“miRNA expression profiles in cerebrospinal fluid and blood of patients with Alzheimer's disease and other types of dementia - an exploratory study”, Transl Neurodegener, 5(6), 2016 divulga miR-15a-5p en sangre y líquido cefalorraquídeo para el diagnóstico diferencial de pacientes con enfermedad de Alzheimer y demencia con cuerpos de Lewy. También se sometió a prueba miR-150-5p, pero proporcionó resultados que no fueron significativos.

Precisamente, la presente invención se centra en resolver los problemas anteriormente citados mediante el análisis de miARN como biomarcadores prometedores para el diagnóstico de enfermedades neurodegenerativas y, más específicamente, para el diagnóstico específico y/o diferencial de sinucleinopatías.

Descripción de la invención

Breve descripción de la invención

La presente invención se refiere a un métodoin vitropara el diagnóstico específico de sinucleinopatías y/o para el diagnóstico diferencial de sinucleinopatías frente a enfermedad de Alzheimer (EA). En una realización preferida, la sinucleinopatía es DCL o EP.

Para implementar la invención, se analizó el contenido de miARN de plaquetas de DCL (n=7) y controles sanos (n=7) mediante secuenciación de próxima generación (NGS). Este análisis dio como resultado 22 miARN expresados de manera diferencial entre ambas cohortes, que se validaron mediante reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) en una cohorte diferente de 14 muestras de DCL y 14 de control. Se realizó una segunda validación de los 12 mejores miARN diferenciales en cohortes independientes, que incluían 10 muestras de control sanas adicionales, 12 pacientes con DCL y 10 pacientes con EA. Los resultados mostraron que, en general, los pacientes con DCL tienen menos expresión de miARN que los controles o los pacientes con EA. Los 12 miARN validados aparecieron regulados por disminución en las muestras de DCL, específicamente hsa-miR-150-5p. Por último, una validación ciega que usa muestras de EP mostró niveles de expresión similares para hsa-miR-150-5p en DCL y EP, distinguiendo ambas sinucleinopatías de la EA y los controles sanos. La predicción de genes diana para hsa-miR-150-5p revelóMYB, EGR2, MUC4yNOTCH3entre las predicciones con mayor puntuación. Así, la presente invención muestra hsa-miR-150-5p como biomarcador para el diagnóstico específico de sinucleinopatías (particularmente DCL o EP) frente a controles, y/o para el diagnóstico diferencial de sinucleinopatías (particularmente DCL o EP) frente a EA, con un área bajo la curva de 0,8692 y 1, respectivamente (véanse la figura 4 y la figura 5).

Aunque hsa-miR-150-5p, tal como se citó anteriormente, se cita en la presente invención como candidato preferido, la presente invención ofrece apoyo científico (véanse la figura 7, la figura 8, la figura 9 y la figura 10), para el uso de cualquiera de los siguientes miARN: miR-7d-5p, miR-142-3p, miR-26b-5p, miR-139-5p, miR-146a-5p, miR-128-3p, miR-6747-3p, miR-132-5p, miR-25-3p, hsa-miR-16-5p o hsa-miR-26a-5p como biomarcadores individuales para el diagnóstico específico de sinucleinopatías (particularmente DCL o EP) frente a controles, y/o para el diagnóstico diferencial de sinucleinopatías (particularmente DCL o EP) frente a EA. Además, la presente invención también se refiere al uso de cualquier combinación de los 12 biomarcadores citados anteriormente para el diagnóstico específico de sinucleinopatías (particularmente DCL o EP) frente a controles, y/o para el diagnóstico diferencial de sinucleinopatías (particularmente DCL o EP) frente a EA. En una realización preferida, dicha combinación de miARN comprende al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11 o al menos 12 de los siguientes miARN: miR-150-5p, miR-7d-5p, miR-142-3p, miR-26b-5p, miR-139-5p, miR-146a-5p, miR-128-3p, miR-6747-3p, miR-132-5p, miR-25-3p, hsa-miR-16-5p o hsa-miR-26a-5p.

Por tanto, hsa-miR-150-5p o, alternativamente, cualquiera de los siguientes miARN: miR-7d-5p, miR-142-3p, miR-26b-5p, miR-139-5p, miR-146a-5p, miR-128-3p, miR-6747-3p, miR-132-5p, miR-25-3p, hsa-miR-16-5p y hsa-miR-26a-5p, o cualquier combinación de los mismos, se identifican en la presente invención como constantemente subexpresados en pacientes con DCL en comparación con ambos, tanto EA como controles. Además, las curvas ROC reforzaron que hsa-miR-150-5p podría ser un biomarcador prometedor para la DCL, con una especificidad del 100 % y una sensibilidad del 100 % para diferenciar la DCL de la EA, y aproximadamente el 87 % para distinguir la DCL de los controles sanos. Cuando se incluyeron muestras de pacientes con EP, estas también mostraron una menor expresión de hsa-miR-150-5p que coincidía con la de la DCL. Por tanto, es una indicación de que este plaqueta-miARN tiene una relación potencial con el desarrollo de sinucleinopatías incluyendo tanto la DCL como la EP.

Por consiguiente, la presente invención proporciona evidencia para el uso del contenido de miARN, preferiblemente de plaquetas, como fuente prometedora de biomarcadores, y propone el uso de cualquiera de los miARN: hsa-miR-150-5p, miR-7d-5p, miR-142-3p, miR-26b-5p, miR-139-5p, miR-146a-5p, miR-128-3p, miR-6747-3p, miR-132-5p, miR-25-3p, hsa-miR-16-5p o hsa-miR-26a-5p, o cualquier combinación de los mismos, como biomarcadores que muestran una alta sensibilidad y sensibilidad, para la diferenciación entre sinucleinopatías, incluyendo DCL, y EA. La detección de estos miARN en plaquetas o sangre completa representa un procedimiento no invasivo, rápido y fácil para su implementación clínica.

Por tanto, la primera realización de la presente invención se refiere a un métodoin vitro(a continuación en el presente documento método de la invención) para el diagnóstico o pronóstico específicos de sinucleinopatías, que comprende determinar el nivel de expresión de al menos uno de los siguientes miARN: hsa-miR-150-5p, miR-7d-5p, miR-142-3p, miR-26b-5p, miR-139-5p, miR-146a-5p, miR-128-3p, miR-6747-3p, miR-132-5p, miR-25-3p, hsa-miR-16-5p o hsa-miR-26a-5p, o cualquier combinación de los mismos, aislados de plaquetas obtenidas del paciente, en donde un nivel de expresión reducido de cualquiera de los miARN citados anteriormente, en comparación con el nivel de expresión de cualquiera de los miARN citados anteriormente en sujetos de control sanos, es una indicación de que el paciente padece una sinucleinopatía.

La segunda realización de la presente invención se refiere a un métodoin vitro(a continuación en el presente documento método de la invención) para el diagnóstico diferencial de sinucleinopatías frente a EA, que comprende determinar el nivel de expresión de al menos uno de los siguientes miARN: hsa-miR-150-5p, miR-7d-5p, miR-142-3p, miR-26b-5p, miR-139-5p, miR-146a-5p, miR-128-3p, miR-6747-3p, miR-132-5p, miR-25-3p, hsa-miR-16-5p o hsa-miR-26a-5p, o cualquier combinación de los mismos, aislados de plaquetas obtenidas del paciente, en donde un nivel de expresión reducido de cualquiera de los miARN citados anteriormente, en comparación con el nivel de expresión de cualquiera de los miARN citados anteriormente en pacientes de control que padecen EA, es una indicación de que el sujeto padece una sinucleinopatía y no padece EA.

En una realización preferida, la presente invención se refiere a un métodoin vitropara el diagnóstico o pronóstico específicos de DCL y/o EP, que comprende determinar el nivel de expresión de al menos uno de los siguientes miARN: hsa-miR-150-5p, miR-7d-5p, miR-142-3p, miR-26b-5p, miR-139-5p, miR-146a-5p, miR-128-3p, miR-6747-3p, miR-132-5p, miR-25-3p, hsa-miR-16-5p o hsa-miR-26a-5p, o cualquier combinación de los mismos, aislados de plaquetas obtenidas del paciente, en donde un nivel de expresión reducido de cualquiera de los miARN citados anteriormente, en comparación con el nivel de expresión de cualquiera de los miARN citados anteriormente medido en sujetos de control sanos, es una indicación de que el paciente padece DCL y/o EP.

En una realización preferida, la presente invención se refiere a un métodoin vitropara el diagnóstico diferencial de DCL y/o EP frente a EA, que comprende determinar el nivel de expresión de al menos uno de los siguientes miARN: hsa-miR-150-5p, miR-7d-5p, miR-142-3p, miR-26b-5p, miR-139-5p, miR-146a-5p, miR-128-3p, miR-6747-3p, miR-132-5p, miR-25-3p, hsa-miR-16-5p o hsa-miR-26a-5p, o cualquier combinación de los mismos, aislados de plaquetas obtenidas del paciente, en donde un nivel de expresión reducido de cualquiera de los miARN citados anteriormente, en comparación con el nivel de expresión de cualquiera de los miARN citados anteriormente medido en pacientes de control que padecen EA, es una indicación de que el sujeto padece DCL y/o EP y no padece EA. La tercera realización de la presente invención se refiere al usoin vitrodel nivel de expresión de al menos uno de los siguientes miARN: hsa-miR-150-5p, miR-7d-5p, miR-142-3p, miR-26b-5p, miR-139-5p, miR-146a-5p, miR-128-3p, miR-6747-3p, miR-132-5p, miR-25-3p, hsa-miR-16-5p o hsa-miR-26a-5p, o cualquier combinación de los mismos, aislado de plaquetas obtenidas del paciente, para el diagnóstico o pronóstico específicos de sinucleinopatías, o el diagnóstico diferencial de sinucleinopatías frente a enfermedad de Alzheimer.

La cuarta realización de la presente invención se refiere al usoin vitrode un kit que comprende reactivos para la determinación del nivel de expresión de al menos uno de los siguientes miARN: hsa-miR-150-5p, miR-7d-5p, miR-142-3p, miR-26b-5p, miR-139-5p, miR-146a-5p, miR-128-3p, miR-6747-3p, miR-132-5p, miR-25-3p, hsa-miR-16-5p o hsa-miR-26a-5p, o cualquier combinación de los mismos, para el diagnóstico o pronóstico específicos de sinucleinopatías, o el diagnóstico diferencial de sinucleinopatías frente a enfermedad de Alzheimer.

En una realización preferida, la presente invención se refiere al usoin vitrodel nivel de expresión de al menos uno de los siguientes miARN: hsa-miR-150-5p, miR-7d-5p, miR-142-3p, miR-26b-5p, miR-139-5p, miR-146a-5p, miR-128-3p, miR-6747-3p, miR-132-5p, miR-25-3p, hsa-miR-16-5p o hsa-miR-26a-5p, o cualquier combinación de los mismos, para el diagnóstico o pronóstico específicos de DCL y/o EP, o el diagnóstico diferencial de DCL y/o EP frente a EA.

En una realización preferida, la presente invención se refiere al usoin vitrode un kit que comprende reactivos para la determinación del nivel de expresión de al menos uno de los siguientes miARN: hsa-miR-150-5p, miR-7d-5p, miR-142-3p, miR-26b-5p, miR-139-5p, miR-146a-5p, miR-128-3p, miR-6747-3p, miR-132-5p, miR-25-3p, hsa-miR-16-5p o hsa-miR-26a-5p, o cualquier combinación de los mismos, para el diagnóstico o pronóstico específicos de DCL y/o EP, o el diagnóstico diferencial de DCL y/o EP frente a EA.

En una realización preferida la invención se refiere a la determinación del nivel de expresión de al menos uno de al menos hsa-miR-150-5p, preferiblemente en combinación con cualquiera de los miARN comprendidos en el grupo: miR-7d-5p, miR-142-3p, miR-26b-5p, miR-139-5p, miR-146a-5p, miR-128-3p, miR-6747-3p, miR-132-5p, miR-25-3p, hsa-miR-16-5p o hsa-miR-26a-5p, para cualquiera de los propósitos citados anteriormente.

En una realización preferida, los miARN derivan de sangre completa o plaquetas.

En una realización preferida, los resultados obtenidos con el método de la invención citado anteriormente se confirman clínicamente mediante otras técnicas tales como: la determinación de la razón tau fosforilada/amiloide beta 1-42 en líquido cefalorraquídeo y PET amiloide. Por otro lado, una vez realizado el diagnóstico diferencial con el método de la invención, se confirma clínicamente que el paciente padece DCL o EP mediante técnicas tales como DatScan.

Según la quinta realización de la presente invención, los pacientes diagnosticados con el método de la invención pueden tratarse con cualquiera de los tratamientos usados actualmente en la práctica general para tratar o proporcionar alivio a aquellos pacientes que padecen sinucleinopatías, preferiblemente DCL y/o EP. Por ejemplo, la levodopa (precursor de la dopamina), a veces combinada con un inhibidor de la dopa descarboxilasa y a veces también con un inhibidor de la COMT (enzima que degrada la dopamina) puede usarse para tratar las sinucleinopatías, particularmente la EP. Otros ejemplos de tratamiento que podrían usarse para tratar las sinucleinopatías son los agonistas dopaminérgicos o los inhibidores de la MAO-B (enzima que descompone la dopamina) (safinamida, selegilina y rasagilina). Es importante destacar que el uso de tratamientos erróneos que surgen de diagnósticos equivocados de las sinucleinopatías, especialmente la DCL, tales como los neurolépticos para el tratamiento antipsicótico usados habitualmente en pacientes con EA, puede evitarse mediante el uso del método de la invención. Por otro lado, la presente invención puede usarse para identificar individuos (por ejemplo, pacientes con TCSRI, pacientes con hiposmia, portadores de la mutación LRRK2) que corren un riesgo elevado de desarrollar una sinucleinopatía como candidatos a recibir terapias de neuromodulación. Dado que el desarrollo de tratamientos de neuromodulación específicos para la enfermedad está en marcha en numerosos laboratorios, los pacientes identificados como clasificados para someterse a este tipo de terapias son directamente elegibles en el momento en que estas estén disponibles. La agregación de la proteína a-sinucleína es un acontecimiento clave en el desarrollo de las sinucleinopatías, tales como DCL y/o EP. Así, cualquier compuesto (incluyendo anticuerpos, vacunas, etc.) que sea capaz de prevenir la agregación de a-sinucleína podría usarse potencialmente para tratar sinucleinopatías, tales como DCL y/o EP. Por consiguiente, en una realización preferida de la presente invención, los pacientes que padecen sinucleinopatías, preferiblemente DCL y/o EP, a los que se les han diagnosticado con cualquiera de los métodos de la invención, pueden tratarse con compuestos antiagregación de alfa-sinucleína, por ejemplo (lista no exhaustiva): BIIB054, NPT200-11/ UCB0599, PRX002/RO7046015 o NPT088. Así, en una realización preferida, la presente invención se refiere a un método para tratar pacientes que padecen sinucleinopatías, preferiblemente DCL y/o EP, que comprende la administración de dosis terapéuticamente eficaces de compuestos antiagregación de alfa-sinucleína, una vez que se han diagnosticado mediante cualquiera de los métodos de la invención, preferiblemente un método que comprende determinar el nivel de expresión de al menos miR-150-5p aislado de plaquetas obtenidas del paciente, en donde un nivel de expresión reducido de al menos miR-150-5p, en comparación con el nivel de expresión de al menos miR-150-5p medido en sujetos de control sanos, es una indicación de que el paciente padece una sinucleinopatía. Además, la presente invención se refiere a terapias antiagregación de alfa-sinucleína para su uso en el tratamiento de sinucleinopatías, preferiblemente DCL y/o EP, una vez que se ha diagnosticado al paciente mediante el uso de cualquiera de los métodos de la invención, preferiblemente un método que comprende determinar el nivel de expresión de al menos miR-150-5p aislado de plaquetas obtenidas del paciente, en donde un nivel de expresión reducido de al menos miR-150-5p, en comparación con el nivel de expresión de al menos miR-150-5p medido en sujetos de control sanos, es una indicación de que el paciente padece una sinucleinopatía.

Además, la presente invención se refiere a un método para evaluar si la terapia basada en compuestos antiagregación de alfa-sinucleína es eficaz, o a un método para evaluar si un paciente que padece sinucleinopatías, preferiblemente DCL y/o EP, está respondiendo a un tratamiento con compuestos antiagregación de alfa-sinucleína que comprende determinar una sobreexpresión de los miARN sometidos a ensayo en las presentes invenciones, particularmente miR-150-5p, en comparación con el control. En una realización preferida, el método de la invención anteriormente citado puede llevarse a cabo determinando el nivel de expresión de al menos uno de los miARN descritos anteriormente, en combinación con cualquiera de los biomarcadores descritos en la solicitud de patente WO2011104023.

Específicamente, el método de la invención puede realizarse determinando el nivel de expresión de al menos uno de los miARN descritos anteriormente, en combinación con la determinación del genotipo de las siguientes alteraciones en el gen de la butirilcolinesterasa (BChE): el sitio polimórfico en la posición 68974 en el número de registro de NCBI NG_009031 y/o la región de politimina en las posiciones 4780 a 4786 en el número de registro de NCBI NG_00903. El método puede comprender además la determinación del genotipo de las siguientes alteraciones en el gen BChE: el sitio polimórfico en la posición 3687, el sitio polimórfico en la posición 4206, y el sitio polimórfico en la posición 4443, dichas posiciones con referencia al número de registro de NCBI NG_009031 (es decir, las posiciones 3687, 4206 y 4443 respectivamente en SEQ ID NO: 1). Téngase en cuenta que las secuencias citadas anteriormente se divulgan en la solicitud de patente WO2011104023.

En una realización preferida, el método de la invención citado anteriormente puede realizarse determinando el nivel de expresión de al menos uno de los miARN descritos anteriormente, en combinación con cualquiera de los biomarcadores descritos en la solicitud de patente WO2016180725.

Específicamente, el método de la invención puede realizarse determinando el nivel de expresión de al menos uno de los miARN descritos anteriormente, en combinación con la detección de al menos una variación en SEQ ID NO: 14, o alternativamente al menos una variación en SEQ ID NO: 15, o alternativamente al menos una variación en SEQ ID NO: 16, en donde SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 están comprendidas dentro de la posición 175.989.261 a la posición 176.003.107 en el cromosoma 5 deHomo sapienssegún la publicación de datos 28 de HapMap (SEQ ID NO: 1). Téngase en cuenta que las secuencias citadas anteriormente se divulgan en la solicitud de patente WO2016180725.

En una realización preferida, el método de la invención citado anteriormente puede realizarse determinando el nivel de expresión de al menos uno de los miARN descritos anteriormente, en combinación con cualquiera de los biomarcadores descritos en la solicitud de patente WO2016180726.

Específicamente, el método de la invención puede realizarse determinando el nivel de expresión de al menos uno de los miARN descritos anteriormente, en combinación con la determinación de la cantidad de transcritos SNCAtv3 (SEQ ID NO: 3) y SNCAtv2 (SEQ ID NO: 2) del gen de la alfa-sinucleína humana (SNCA) aislado de plaquetas obtenidas del paciente, en donde cuando la cantidad de ambos transcritos determinada para el paciente se reduce con respecto a un valor de referencia, esto es indicativo de la presencia de DCL en el paciente. Téngase en cuenta que las secuencias citadas anteriormente se divulgan en la solicitud de patente WO2016180726.

Por otro lado, la presente invención también se refiere a un métodoin vitropara el diagnóstico de EA, que comprende determinar el nivel de expresión de al menos un miARN incluido en la tabla 3, o cualquier combinación de los mismos, aislado de plaquetas obtenidas del paciente, en donde un nivel de expresión aumentado de al menos uno de los miARN incluidos en la tabla 3, en comparación con el nivel de expresión medido en sujetos de control sanos, es una indicación de que el paciente padece EA. Por tanto, la presente invención también se refiere al uso de cualquiera de los miARN incluidos en la tabla 3 para el diagnósticoin vitrode la EA.

Además, la presente invención también se refiere a un métodoin vitropara el diagnóstico diferencial de DCL respecto a EP, que comprende determinar el nivel de expresión de al menos un miARN incluido en la tabla 4, o cualquier combinación de los mismos, aislado de plaquetas obtenidas del paciente, en donde un nivel de expresión disminuido de al menos uno de los miARN incluidos en la tabla 4, en comparación con el nivel de expresión medido en pacientes con EP, es una indicación de que el paciente padece DCL y no EP. Por tanto, la presente invención también se refiere al uso de cualquiera de los miARN incluidos en la tabla 4 para el diagnóstico diferencialin vitrode DCL respecto a EP.

Con los propósitos de la presente invención, se definen los siguientes términos:

• El término “nivel de expresión medido en sujetos/pacientes de control”, cuando se refiere al nivel de expresión de los biomarcadores (miARN) descritos en la presente invención, puede referirse a dos situaciones diferentes: i) “nivel de expresión medido en sujetos de control sanos” o ii) “nivel de expresión medido en pacientes de control que padecen EA”. En la primera situación i), es probable que el sujeto padezca sinucleinopatías con una sensibilidad y especificidad dadas si el nivel de expresión del biomarcador (miARN) es estadísticamente inferior a dicho “nivel de expresión medido en sujetos de control sanos”. En la segunda situación ii), es probable que el sujeto padezca sinucleinopatías, y no EA, con una sensibilidad y especificidad dadas si el nivel de expresión del biomarcador (miARN) es estadísticamente inferior a dicho “nivel de expresión medido en pacientes de control que padecen EA”. Por tanto, puede decirse que en la presente invención se usan dos “valores de referencia” diferentes: i) “nivel de expresión medido en sujetos de control sanos” para realizar un “diagnóstico específico” o ii) “nivel de expresión medido en pacientes de control que padecen EA” para realizar un “diagnóstico diferencial”.

• Un “valor de referencia” puede ser un valor umbral o un valor de corte. Normalmente, un “valor umbral” o un “valor de corte” puede determinarse experimental, empírica, o teóricamente. Un valor umbral también puede seleccionarse arbitrariamente basándose en las condiciones experimentales y/o clínicas existentes, tal como reconocería un experto en la técnica. El valor umbral debe determinarse para obtener la sensibilidad y especificidad óptimas según la función de la prueba y el balance beneficio/riesgo (consecuencias clínicas de falsos positivos y falsos negativos). Preferiblemente, el experto en la técnica puede comparar los niveles (o puntuaciones) de biomarcadores obtenidos según el método de la invención con un valor umbral definido. Normalmente, la sensibilidad y especificidad óptimas (y, por tanto, el valor umbral) pueden determinarse usando una curva de eficacia diagnóstica (ROC) basada en datos experimentales. Por ejemplo, después de determinar los niveles de los biomarcadores en un grupo de referencia, puede usarse un análisis algorítmico para el tratamiento estadístico de las concentraciones medidas de los biomarcadores en las muestras biológicas que van a someterse a prueba, y obtener así una pauta de clasificación que tenga significación para la clasificación de las muestras. El nombre completo de la curva ROC es curva de eficacia diagnóstica, que también se conoce como curva de rendimiento diagnóstico. Se usa principalmente para pruebas de diagnóstico bioquímico clínico. La curva ROC es un indicador global que refleja las variables continuas de la tasa de verdaderos positivos (sensibilidad) y la tasa de falsos positivos (1-especificidad). Revela la relación entre la sensibilidad y la especificidad con el método de composición de la imagen. Una serie de valores de corte diferentes (umbrales o valores críticos, valores límite entre los resultados normales y anómalos de la prueba diagnóstica) se establecen como variables continuas para calcular una serie de valores de sensibilidad y especificidad. Luego se usa la sensibilidad como coordenada vertical y la especificidad como coordenada horizontal para trazar una curva. Cuanto mayor sea el área bajo la curva (AUC), mayor será la precisión del diagnóstico. En la curva ROC, el punto más cercano al extremo superior izquierdo del diagrama de coordenadas es un punto crítico que presenta valores de sensibilidad y especificidad elevados. El valor AUC de la curva ROC se sitúa entre 1,0 y 0,5. Cuando AUC>0,5, el resultado diagnóstico es cada vez mejor a medida que AUC se acerca a 1. Cuando el AUC está entre 0,5 y 0,7, la precisión es baja. Cuando el AUC está entre 0,7 y 0,9, la precisión es moderada. Cuando el AUC es superior a 0,9, la precisión es bastante alta. Este método algorítmico se realiza preferiblemente con un ordenador. Para el trazado de la curva ROC pueden usarse programas o sistemas existentes en la técnica, tales como: MedCalc 9.2.0.1 software estadístico médico, SPSS 9.0.

• “Diagnóstico específico o diagnóstico”, tal como se usa en la presente invención, se refiere únicamente a la identificación de sinucleinopatías en un sujeto. Para ello, el nivel de expresión de los miARN aislados del paciente se compara con el “nivel de expresión medido en sujetos de control sanos”.

• El “diagnóstico diferencial”, tal como se usa en la presente invención, tiene por objeto distinguir una enfermedad o afección particular, tal como las sinucleinopatías, de otras que presentan características clínicas similares, como la EA. Para ello, se compara el nivel de expresión de los miARN aislados del paciente con el “nivel de expresión medido en pacientes de control que padecen EA”. •

• El término “sinucleinopatía o sinucleinopatías” se refiere a enfermedades neurodegenerativas caracterizadas por la acumulación anómala de agregados de la proteína alfa-sinucleína en neuronas, fibras nerviosas o células gliales. Existen tres tipos principales de sinucleinopatías: EP, DCL, y atrofia multisistémica (AMS).

• El término “que comprende” pretende incluir, pero no se limita a, lo que sigue a la palabra “que comprende”.

Por tanto, el uso del término “que comprende” indica que los elementos enumerados son necesarios u obligatorios, pero que otros elementos son opcionales y pueden o no estar presentes.

• Por “que consiste en” pretende incluir, y se limita a, lo que sigue a la expresión “que consiste en”. Por tanto, la expresión “que consiste en” indica que los elementos enumerados son necesarios u obligatorios, y que no puede haber otros elementos presentes.

Descripción de las figuras

Figura 1. Flujo de trabajo completo del presente estudio. Después del aislamiento y la caracterización de los sedimentos enriquecidos en plaquetas, se aplicó NGS y se llevaron a cabo varias fases de validación de qPCR. Figura 2. Caracterización de los sedimentos enriquecidos en plaquetas mediante citometría de flujo. Se realizó la tinción de CD61 para identificar las plaquetas y se usó CD45 como marcador leucocitario para la tinción de la contaminación leucocitaria. Control negativo sin tinción de CD61 (izquierda); se observa tinción positiva para CD61 y negativa para CD45 en el sedimento enriquecido en plaquetas (derecha).

Figura 3. Expresión de miARN en DCL y controles. Se muestra la expresión de tres miARN como ejemplo de la expresión disminuida de miARN encontrada en la DCL en comparación con los controles. También se encontraron niveles de expresión superpuestos.

Figura 4. Expresión de hsa-miR-150-5p en DCL, EA y controles. (A) Expresión de cambio en veces mediante qPCR. (B) Curva ROC para la identificación diferencial de casos de DCL frente a muestras de control. (C) Curva ROC para la diferenciación de DCL y EA. (D) Curva ROC para la diferenciación de EA y controles sanos.

Figura 5. Resultado diagnóstico de hsa-miR-150-5p como biomarcador. Se realizó una validación ciega incluyendo muestras de EP. (A) Los cambios de expresión fueron similares en la EP y la DCL (círculo azul), difirieron de la EA (círculo verde), y se superpusieron parcialmente con los controles sanos (círculo naranja). (B) Se observaron mayores niveles de expresión para hsa-miR-150-5p en la EA en comparación con las muestras de DCL y EP (n=10 de DCL, n=5 de EA, n=5 de EP y n=16 de controles). (C) Se analizaron DCL y EP conjuntamente como sinucleinopatías. En todos los casos, se representan la media y la DE. (D) Curva ROC para la diferenciación de sinucleinopatías y controles. (E) Curva ROC para la diferenciación de sinucleinopatías y EA.

Figura 6. Las dianas predichas más interesantes se conectaron en red mediante la herramienta en línea String. (A) Las dianas más confirmadas estaban relacionadas con la regulación negativa de TP53 del ciclo celular, la transcripción y traducción pre-Notch y los factores implicados en el desarrollo y la producción de plaquetas. (B) Los genes diana más interesantes estaban relacionados con las enfermedades priónicas, la ruta de señalización MAPK y la ruta de señalización Pl3K-Akt. (C) Red propuesta para la interacción de a-sinucleína, hsa-miR-150-5p y genes diana interesantes.

Figura 7. Expresión de miARN en plaquetas. Curvas ROC de los miARN: hsa-miR-150-5p, hsa-let-7d-5p, hsa-miR-26b-5p y hsa-miR-142-3p para la diferenciación de DCL frente a controles. Eje X: especificidad. Eje Y: sensibilidad. Figura 8. Expresión de miARN en plaquetas. Curvas ROC de los miARN: hsa-miR-150-5p, hsa-let-7d-5p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-139-5p, hsa-miR-146-5p, hsa-miR-128-3p, hsa-miR-6747-3p, hsa-miR-132-5p y hsa-miR-25-3p para la diferenciación de DCL frente a EA. Eje X: especificidad. Eje Y: sensibilidad.

Figura 9. Expresión de miARN en sangre completa. Curvas ROC de los miARN: hsa-miR-16-5p, hsa-let-7d-5p, hsamiR-26b-5p, hsa-miR-139-5p y hsa-miR-26a-5p para la diferenciación de DCL frente a EA. Eje X: especificidad. Eje Y: sensibilidad.

Figura 10. Expresión de miARN en sangre completa. Curva ROC de hsa-miR-16-5p para la diferenciación de EP frente a EA. Eje X: especificidad. Eje Y: sensibilidad.

Figura 11. Niveles de expresión de miR-150-5p en plaquetas de pacientes con DCL, EA y EP en comparación con controles. Línea negra, diferencias entre DCL o EP y EA; línea discontinua, diferencias entre DCL o EP y controles; línea discontinua, diferencias entre DCL y EP. * p<0,05; ** p>0,01; *** p>0,001. Las diferencias se evaluaron con la prueba de Wilcoxon-Mann-Whitney.

Figura 12. Análisis de la curva ROC de la expresión de miR-150-5p. (A) Pacientes con DCL frente a controles. (B) Pacientes con sinucleinopatía frente a pacientes con Alzheimer.

Descripción detallada de la invención

Ejemplo 1. Pacientes.

En este estudio se incluyeron treinta y tres pacientes con DCL (intervalo de edad 57-86 años; media 71,8 años; razón hombre:mujer 1,4:1) del Hospital Universitario de Bellvitge, (L'Hospitalet de Llobregat, Barcelona), y 37 individuos de control sanos emparejados por edad y sexo (intervalo de edad 61-85; media 72,02 años; razón hombre:mujer 0,8:1) del mismo hospital y del Hospital Universitario Germans Trias i Pujol (Badalona, Barcelona). Los pacientes con DCL se diagnosticaron según los criterios del Consorcio para DCL de 2005 [McKeith IG, Dickson DW, Lowe J, Emre M, O'Brien JT, Feldman H,et al.Diagnosis and management of dementia with Lewy bodies: third report of the DLB Consortium. Neurology 2005; 65:1863-72] y la edad de inicio se definió como la edad en la que los familiares notaron por primera vez pérdida de memoria o parkinsonismo. También se reclutó una tercera cohorte de 10 pacientes con EA (intervalo de edad 65-85; media 73,9; razón hombre:mujer 1,5) con una Escala Global de Deterioro de 4,3±1,2 grados. El diagnóstico de EA se evaluó en el Hospital Universitario Germans Trias i Pujol (Badalona, Barcelona) siguiendo los criterios revisados en 2011 del National Institute on Aging y la Alzheimer's Association [Khachaturian ZS. Revised criteria for diagnosis of Alzheimer's disease: National Institute on Aging-Alzheimer's Association diagnostic guidelines for Alzheimer's disease. Alzh Dement 2011; 7(3):253-6]. También se reclutaron trece pacientes no dementes con EP (intervalo de edad 42-87 años; media 66,9 años; razón hombre:mujer 2,5:1) en el mismo hospital para el ensayo de validación final. El diagnóstico de EP se evaluó mediante los criterios del Banco de Cerebros de la Sociedad de Enfermedad de Parkinson del Reino Unido [Gibb W, Lees A. A comparison of clinical and pathological features of young- and old-onset Parkinson's disease. Neurology 1988; 38:1402-06]. El siguiente protocolo fue aprobado por el Comité Ético de Investigación Clínica de la institución y se realizó según los Principios de la Declaración de Helsinki [Lynoe N, Sandlund M, Dahlqvist G, Jacobsson L. Informed consent: study of quality of information given to participants in a clinical trial. BMJ 1991; 303:610-13]. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de cada sujeto.

Ejemplo 2. Recogida de sangre, purificación y caracterización de las plaquetas.

Se recogió sangre periférica siguiendo procedimientos convencionales para minimizar la coagulación y la activación plaquetaria [Zwicker JI, Lacroix R, Dignat-george F, Furie BC, Furie B. Platelets and Megakaryocytes. Methods 2012; 788:127-39; Witwer KW, Buzás EI, Bemis LT, Bora A, Lasser C, Lotvall J,et al.Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles 2013; 2:1-25; Gyorgy B, Pálóczi K, Kovács A, Barabás E, Beko G, Várnai K,et al.Improved circulating microparticle analysis in acid-citrate dextrose (ACD) anticoagulant tube, Thromb Res 2014; 133:285-92]. Brevemente, después de la punción venosa, se recogieron 12-15 ml de sangre en tubos pretratados con citrato de sodio (BD Vacutainer®, Nueva Jersey, EE. UU.), y se procesaron en el plazo de las 2 horas siguientes a la recogida. Después de la centrifugación a 500 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente para minimizar la contaminación por glóbulos rojos y leucocitos, se realizó centrifugación a 2.500 x g durante 15 minutos a temperatura ambiente [Sáenz-Cuesta M, Arbelaiz A, Oregi A, Irizar H, Osorio-Querejeta I, Muñoz-Culla M,et al.Methods for extracellular vesicles isolation in a hospital setting. Front in Immunology 2015; 6(50)] para obtener un sedimento enriquecido en plaquetas. El sedimento se resuspendió en 250 |jl de PBS y se caracterizó mediante citometría de flujo. Se incubaron 50 j l de las muestras durante 15 min a temperatura ambiente con 5 j l de anticuerpo CD61-FITC, como marcador de plaquetas, y 5 j l de anticuerpos CD45-APC para detectar una posible contaminación leucocitaria. Luego se congelaron las muestras y se conservaron a -80 °C hasta su procesamiento y aislamiento de miARN.

Ejemplo 3. Extracción de ARN pequeño derivado de plaquetas.

Se descongelaron lentamente en hielo los sedimentos enriquecidos en plaquetas obtenidos tras la centrifugación a 2.500 x g durante 15 minutos antes del aislamiento de miARN. La extracción de miARN se realizó usando el kit mirVana Paris (Invitrogen) a temperatura ambiente tal como describen los fabricantes. Brevemente, se añadieron 600 j l de tampón de lisis y 1/10 de mezcla de aditivo homogeneizado de miARN a cada sedimento y se incubaron después de agitar con vórtex durante 10 minutos en hielo. Después de añadir un volumen de fenol-cloroformo y mezclar, se realizó centrifugación a 10.000 x g durante 5 minutos. Se añadieron un tercio y 2/3 de volumen de etanol en 2 etapas consecutivas a la fase acuosa que contenía miARN, y se pasó a través de una columna de filtración. Después de las correspondientes etapas de lavado, se eluyeron los miARN con 100 j l de tampón de elución. El material extraído se mantuvo en hielo y se congeló a -80 °C hasta su próximo análisis.

Ejemplo 4. Aislamiento de miARN a partir de sangre completa.

Se realizó aislamiento de ARN después de la recogida de 3 ml de sangre completa en tubos de ARN en sangre PAXgene (PreAnalytiX, Hombrechtikon, Suiza) mediante el uso del kit de miARN en sangre PAXgene 50, v2 (PreAnalytiX) siguiendo las instrucciones del fabricante. La cantidad, pureza e integridad del ARN se comprobaron con el bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, EE. UU.).

Ejemplo 5. Fase de descubrimiento: secuenciación de microARN y análisis de datos de secuenciación.

Se precipitó el volumen total de los miARN obtenidos de 7 muestras de DCL y 7 de control durante la noche a -20 °C con 1 |jl de glucógeno (20 jg /jl), 10 % de AcNa 3 M (pH 4,8) y 2 volúmenes de etanol. Los miARN se resuspendieron en 10 j l de H<2>O libre de ARNasa y se calentaron a 65 °C durante 2-3 min. El control de calidad y la distribución de tamaño del ARN pequeño purificado se evaluaron mediante el bioanalizador 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, EE. UU.).

Se usaron seis j l de cada muestra (n=7 muestras de DCL; n=7 muestras de control) para la preparación de bibliotecas con el set de preparación de muestra de ARN pequeño NEBNext Multiplex para Illumina (New England Biolabs) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las bibliotecas individuales se sometieron al análisis de calidad usando un ensayo D1000 ScreenTape (TapeStation, Agilent Technologies), se cuantificaron mediante fluorimetría y se agruparon. La agrupación y la secuenciación se realizaron en un secuenciador Illumina (MiSeq, Illumina, San Diego, E<e>. UU.) en modo de lectura única 1 x 50c y se obtuvieron 200.000 lecturas para cada muestra.

Los datos sin procesar FastQ obtenidos de la plataforma Illumina se analizaron tal como sigue. En primer lugar, se eliminaron las secuencias adaptadoras de las lecturas obtenidas usando Trimmomatic [Bolger AM, Lohse M, Usadel B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics 2014; 30: 2114-20] y las lecturas se mapearon con respecto a secuencias de miARN usando el algoritmo Bowtie2 [Langmead B, Trapnell C, Pop M, Salzberg SL. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol 2009; 10(3):R25]. Para cada muestra, se contó el número de lecturas emparejadas con una secuencia de miARN concreta y la matriz de recuento final se normalizó mediante las medias recortadas ponderadas de los valores M (TMM) [Robinson MD, Oshlack A. A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data. Genome Biol 2010; 11(3):R25]. Para la posible selección de biomarcadores debían cumplirse los siguientes criterios: (a) un mínimo de 5 lecturas por muestra; (b) presente en todas las muestras de pacientes y ausente (menos de 5 lecturas) en más de la mitad de las muestras de control; (c) presente en todas las muestras de control y ausente en más de la mitad de las muestras de pacientes. En todos los casos, y cuando un miARN estaba presente en ambas cohortes, se realizaron análisis de expresión diferencial aplicando la prueba de bondad de ajuste compuesta de Lilliefors, la prueba de hipótesis de Jarque-Bera y la prueba de Shapiro-Wilk para comprobar si las muestras se ajustaban a distribuciones normales; y se usó la prueba de suma de rangos de Wilconxon (valor de p <0,05) [Lowry R. Concepts & Applications of Inferential Statistics. Recuperado en marzo de 2011] para determinar si los miARN se expresaban de manera diferencial entre ambas cohortes. El proceso de validación de las diferencias obtenidas se analizó mediante la metodología de validación cruzada dejando uno fuera (LOO,Leave-One-Out).Ejemplo 6. Fase de validación: Transcripción inversa y PCR cuantitativa en tiempo real.

Se transcribió inversamente el miARN usando el kit II de síntesis de ADNc universal MiRCURY LNA™ (Exiqon, Vedbaek, Dinamarca) según el protocolo del fabricante. La concentración de ARN se ajustó a 5 ng/jl con agua libre de nucleasas y se mezcló con el tampón de reacción y la mezcla enzimática según el volumen de trabajo especificado en el manual de instrucciones. La reacción de retrotranscripción tuvo lugar a 42 °C durante 60 minutos y la actividad enzimática se detuvo a 95 °C durante 5 min. La mezcla de ADNc se diluyó 1:80 y se usaron 4 j l para las reacciones de PCR cuantitativa (qPCR) con mezcla maestra ExiLENT SYBR Green (Exiqon, Vedbaek, Dinamarca) siguiendo las indicaciones del fabricante en un instrumento LightCycler 480 (Roche, Basilea, Suiza). Las muestras se prepararon por duplicado, se usó un agregado de miARN UniSp6 como control para la retrotranscripción. Se usaron paneles prediseñados de PCR de tecnología Pick&Mix de miARN con LNA (Exiqon) con miARN UniSp3 como control calibrador interplaca.

Ejemplo 7. Análisis estadístico.

Los valores para los datos y las lecturas de NGS se dan como media ± DE. Los niveles de expresión de los miARN seleccionados para la validación mediante qPCR se determinaron usando valores de cruce (Cp). Los valores de Cp se promediaron entre duplicados y se normalizaron frente a los valores de Cp de agregado UniSp6 para miARN derivado de plaquetas y frente a hsa-miR-191-5p en el caso de sangre completa. La expresión relativa en DCL, EA y EP se estimó con respecto a los controles sanos y se representó como cambios de expresión en veces tal como se obtiene mediante 2'ññCp. Los análisis estadísticos se realizaron usando GraphPadPrism 7 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, EE. UU.). Se aplicó individualmente la prueba de la t bilateral para datos independientes para cada miARN analizado para comparar los valores de Cp entre los grupos de control y con DCL. Cuando se compararon más de dos grupos (DCL, controles, EA y EP), se realizaron múltiples comparaciones aplicando la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis. En todos los casos, se consideró significativo un intervalo de confianza del 95 % y un valor de p inferior a 0,05. Para evaluar el potencial diagnóstico, se calculó el área bajo la curva ROC (AUC) para cada miARN usando los programas SPSS Statistics 15 (IBM, Armonk, NY, EE. UU.) y GraphPadPrism 7 para determinar la sensibilidad y especificidad diagnósticas y de caracterización (IC del 95 %, AUC > 0,750 se consideró como valor mínimo para que un miARN se definiera como buen biomarcador).

Ejemplo 8. Predicción y análisis de dianas de miARN.

Se buscaron candidatos a biomarcadores obtenidos a partir de NGS en varias bases de datos y se evaluó la relación con la demencia con cuerpos de Lewy y otros trastornos neurodegenerativos (EP, EA, deterioro cognitivo leve, demencia vascular, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Huntington y parálisis supranuclear progresiva) mediante una búsqueda bibliográfica manual en PubMed, The Nervous System Disease NcRNAome Atlas (NS<d>N<a>) [Wang J, Cao Y, Zhang H, Wang T, Tian Q, Lu X,et al.NSDNA: a manually curated database of experimentally supported ncRNAs associated with nervous system diseases. Nucleic Acids Res 2017; 45(D1):D902-D907], base de datos miR2Disease [Jiang Q, Wang Y, Hao Y, Juan L, Teng M, Zhang X,et al.miR2Disease: a manually curated database for microARN deregulation in human disease. Nucleic Acids Res 2009; 37: D98-104] y la base de datos Human microRNA Disease (HMDD) [Li Y, Qiu C, Tu J, Geng B, Yang J, Jiang T,et al.HMDD v2.0: a database for experimentally supported human microARN and disease associations. Nucleic Acids Res 2014; 42:D1070-4].

Las posibles dianas de hsa-miR-150-5p se predijeron usando las bases de datos irWalk 2.0 [Dweep H, Gretz N. miRWalk2.0: a comprehensive atlas of microRNA-target interactions. Nature Methods 2015; 12(8): 697], miRGate [Andrés-León E, Gómez-López G, Pisano DG. miRGate: a curated database of human, mouse and rat miRNA-mRNA targets. Database (Oxford) 2015; 8;2015:bav035] y miRTarBase [Hsu SD, Tseng YT, Shrestha S, Lin YL, Khaleel A, Chou CH,et al.miRTarBase update 2014: an information resource for experimentally validated miRNA-target interactions. Nucleic Acids Res 2014; 42:D78 D85]. La relación entre las dianas predichas confirmadas se analizó con la base de datos String [Szklarczyk D, Morris JH, Cook H, Kuhn M, Wyder S, Simonovic M,et al.The STRING database in 2017: quality-controlled protein-protein association networks, made broadly accessible. Nucleic Acids Res 2017; 45:D362-68] y la herramienta en línea del consorcio para GO [Ashburner M, Ball CA, Blake JA, Botstein D, Butler H, Cherry JM,et al.Gene ontology: tool for the unification of biology. Nat Genet 2000; 25(1):25-9; Gene Ontology Consortium, 2017] obteniendo procesos biológicos relacionados, componentes celulares y rutas KEEG. La descripción del gen y la información principal se examinaron a través de la base de datos Uniprot [Pundir S, Martin MJ, O'Donovan C. UniProt Protein Knowledgebase. Methods Mol Biol 2017; 1558:41-55]. También se usó la base de datos DAVID [Huang DW, Sherman BT, Lempicki RA. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID Bioinformatics Resources. Nature Protoc 2009; 4(1):44-57] para obtener una red agrupada basada en las rutas KEEG implicadas y las enfermedades relacionadas con un valor de p exacto de Fisher asignado a cada relación miARN-proceso (el punto de corte EASE, Explorador sistemático de análisis de expresión, se estableció por defecto en 0,1).

El flujo de trabajo completo de este estudio se muestra en la figura 1.

Ejemplo 9. Caracterización de plaquetas y descubrimiento de perfiles de miARN.

La caracterización del sedimento enriquecido en plaquetas obtenido después de centrifugaciones seriadas para determinar una posible contaminación leucocitaria no mostró casi tinción para el marcador leucocitario CD45 en las muestras. En su lugar, se obtuvo una alta señal fluorescente para el marcador plaquetario CD61 (figura 2).

Después de la extracción de ARN pequeño, el análisis con bioanalizador mostró un perfil enriquecido de moléculas de 20-40 nucleótidos característico de ARN pequeño y miARN que se usaron para construir bibliotecas mediante NGS. La NGS generó un total medio de 3.437.293 lecturas sin procesar con un tamaño de aproximadamente 65-75 nucleótidos (teniendo en cuenta los adaptadores ligados). Después de procesar los datos sin procesar y eliminar los adaptadores, el mapeo mediante el algoritmo Bowtie notificó un promedio de 1.488.791 ± 348.407 lecturas por muestra en el grupo de control, y 1.210.616 ± 706.346 lecturas por muestra de DCL que correspondían a 1.279 moléculas de miARN maduras ya conocidas. De ellos, 534 miARN cumplían los criterios previamente establecidos para el número mínimo de lecturas. Teniendo en cuenta las formas inmaduras precursoras del conjunto de datos (no se consideraron las formas -5p o -3p), se compararon 430 miARN precursores diferentes con la bibliografía disponible en contenido de miARN plaquetario. De ellos, 304 ya se habían descrito como asociados a plaquetas. De todos los miARN maduros identificados, el 58,9 % ya se había descrito en los primeros estudios de perfiles de miARN en plaquetas [Landry P, Plante I, Ouellet DL, Perron MP, Rousseau G, Provost P. Existence of a microRNA pathway in anucleate platelets. Nat Struct Mol Biol 2009; 16:961-66]; [Osman A, Falker K. Characterization of human platelet microRNA by quantitative PCR coupled with an annotation network for predicted target genes. Platelets 2011; 22:433-41]. También se encontró que las familias de miARN más representativas descritas en plaquetas, tales como la familia let-7 o los grupos miR-103, miR-21 [Plé H, Landry P, Benham A, Coarfa C, Gunaratne PH, Provost P. The repertoire and features of human platelet microRNAs. PIOs One 2012; 7:e50746], fueron también los más representativos en el análisis.

Los recuentos normalizados de los datos de NGS se analizaron usando la prueba de suma de rangos de Wilconxon (umbral de valor de p establecido en 0.05) y se seleccionó un total de 22 miARN que mostraban una buena capacidad clasificatoria y se expresaban de manera diferencial entre las cohortes de DCL y las de controles sanos, para su validación adicional mediante qPCR (hsa-miR-1343-3p, hsa-miR-191-3p, hsa-miR-6747-3p, hsa-miR-504-5p, hsa-miR-6741-3p, hsa-miR-128-3p, hsa-miR-1468-5p, hsa-miR-139-5p, hsa-let-7d-5p, hsa-let-7d-3p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-132-5p, hsa-miR-150-5p, hsa-miR-23a-5p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-1301-3p, hsa-miR-625-3p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-25-3p, hsa-miR-877-3p, hsa-miR-1908-5p, hsa-miR-744-5p).

Ejemplo 10. Validación de la expresión de miARN.

Los 22 miARN seleccionados expresados de manera diferencial se validaron mediante qPCR en cohortes independientes de DCL y control, cada una de ellas constituida por 14 individuos. La mayoría de los miARN validados estaban regulados por disminución en el grupo de DCL en comparación con los controles, tal como se muestra en la figura 3 para tres de los más representativos. Entre ellos, la disminución más importante se encontró para hsa-miR-150-5p en DCL frente a controles (0,03 ± 0,01 frente a 0,76 ± 0,34; p<0,0001). Luego los 12 miARN más expresados de manera diferencial entre ambas cohortes (hsa-miR-150-5p, hsa-miR-7d-5p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-139-5p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-128-3p, hsa-miR-6747-3p, hsa-miR-132-5p, miR-25-3p, hsa-miR-16-5p o hsa-miR-26a-5p) se sometieron a una validación de qPCR adicional en cohortes independientes de 12 pacientes con DCL y 10 controles de un hospital diferente, y donde también se incluyó un grupo de 10 pacientes con EA. Los niveles de expresión de todos los miARN analizados en la EA fueron similares a los de las muestras de control y muy diferentes de los de la DCL. Se confirmaron los resultados anteriores para los niveles de expresión de hsa-miR-150-5p, ya que disminuyó significativamente en repetidas ocasiones en la DCL en comparación con los controles, pero también en comparación con las muestras de EA (p<0,0001 y p=0,0047, respectivamente). El conjunto de ambos análisis de qPCR se representa en la figura 4A. Se calcularon las curvas ROC teniendo en cuenta los cambios en veces para cada cohorte. Se obtuvo una curva ROC con AUC= 0,8692 para la especificidad y sensibilidad distinguiendo entre controles (n=24) y muestras de DCL (n=26) (figura 4B). Cuando se consideraron la EA (n=10) y la DCL (n=26), se obtuvo una curva ROC con AUC=1 (figura 4C). No se alcanzó una sensibilidad y especificidad significativas para la determinación de la EA en comparación con los controles sanos (figura 4D).

Ejemplo 11. Validación ciega incluyendo pacientes con EP.

Luego se analizó la expresión de hsa-miR-150-5p en una qPCR ciega donde se incluyeron 16 controles (4 nuevos, no analizados previamente), 10 de DCL (5 nuevas muestras independientes), 5 de EP no dementes y 5 de los pacientes con EA. Los resultados los analizaron dos investigadores independientes que desconocían la identidad de las muestras y se agruparon en muestras con alta y baja expresión de hsa-miR-150-5p. Después de la identificación de las muestras, la<d>C<l>y la EP se localizaron dentro de la región de baja expresión de hsa-miR-150-5p y la EA dentro de la región de alta expresión de hsa-miR-150-5p. La expresión de hsa-miR-150-5p en los controles se superponía con ambas, tanto E<a>como DCL/EP (figura 5<a>). Los niveles de expresión diferían significativamente entre DCL y EA (p=0,0067), y también entre EP y EA (p=0,047) (figura 5B). Cuando la DCL y la EP se agruparon como sinucleinopatías, se observaron diferencias significativas en comparación con los grupos de control y con EA (p=0,02 y p=0,002, respectivamente) (figura 5C). Las curvas ROC mostraron una alta sensibilidad y especificidad para la diferenciación entre sinucleinopatías y controles (AUC=0,8146) y EA (AUC=0,9) (figura 5D y 5E).

Ejemplo 12. Panel de estratificación clínica basado en hsa-miR-150-5p.

Basándose en estos resultados, la expresión de hsa-miR-150-5p en sedimentos enriquecidos en plaquetas podría considerarse un biomarcador plausible para el diagnóstico diferencial de DCL frente a E<a>con una fácil aplicación en entornos clínicos. En el análisis basado en PCR, el Cp o punto de cruce, que se correlaciona inversamente con la expresión génica, corresponde al número de ciclos necesarios para que la fluorescencia asociada a la amplificación alcance un umbral específico. Por tanto, considerando los valores de qPCR-Cp después de la reacción en un instrumento LightCycler480 (activación térmica inicial a 95° C / 2 min; 45 ciclos: 10 s a 95 °C, 60 a 56 °C; y análisis de la curva de fusión desde 60-95° C), es posible evaluar un panel de estratificación basado en Cp para la clasificación de las muestras, tal como se expone en la tabla 1.

Tabla 1. Valores de Cp para la determinación de la expresión de has-miR-150-5p mediante qPCR.

Estado Cp esperado

Control sano 20-25

EA 19-23

DCL 23-31

EP 21-23

Control sano 20-25

EA19-23

Sinucleinopatía23-29

Ejemplo 13. Predicción de diana de hsa-miR-150-5p.

Se usó el software en línea MiRGate para el cribado de dianas específicas predichas de hsa-miR-150-5p. Se identificaron las posibles rutas afectadas usando el software DAVID. La predicción reveló 5.787 genes diana, pero sólo 9 de ellos(MYB, P2RX7, EGR2, MUC4, ZEB1, ATP13A3, EP300, TP53, NOTCH3)se confirmaron mediante herramientas independientes (miRTarbase, Mirecords y OncomiRBD). Estos 9 genes diana, junto con los más predichos computacionalmente (al menos 4 softwares diferentes los identificaron), se sometieron a la herramienta en línea String (https://string-db.org/), que definió un pequeño agolpamiento que implicaban 5 de las proteínas y se relacionaron con la actividad y la unión de factores de transcripción (p=0,03). Además, 5 de estas proteínas se asociaron a la generación de neuronas y a la regulación de la neurogénesis mediante el análisis GO para procesos biológicos (p=0,0381 en ambos casos). El análisis del reactoma definió estas proteínas como relacionadas con la regulación negativa de TP53 del ciclo celular (p=7,7-10'5), la transcripción y traducción de pre-Notch (p=8,6-10‘5) y con factores implicados en el desarrollo y producción de plaquetas (p=1,4-10-4) (figura 6A). El cribado de relación con enfermedades reconoció una asociación de estos genes a neuropatía (p=0,008) con alta implicación en procesos de sumoilación de proteínas y unión a ubiquitina-proteína ligasa (máxima puntuación de similitud obtenida -1 - mediante el análisis de la herramienta online DAVID). La búsqueda bibliográfica en varias bases de datos también reveló otros genes diana, incluyendoELK1, SUMO3yMAPK1,y su asociación con enfermedades priónicas (p=0,00252), la ruta de señalizaciónmAp K(p=0,01) y la ruta de señalización Pl3K-Akt (p=0,0095) en un análisis de ruta String-KEGG (figura 6B).

Ejemplo 14. Resultados de validación para miR-150-5p en muestras de plaquetas.

En el estudio de validación se incluyeron en el análisis 16 pacientes con DCL, 14 con EA, 20 con EP y 14 individuos de control. Los resultados de este estudio se analizaron en conjunto, después de la normalización conjunta de todas las muestras (total: 162; comprendiendo 59 pacientes con DCL, 24 pacientes con EP, 28 pacientes con EA y 51 individuos de control).

Tal como puede observarse en la figura 11, se obtuvieron resultados relevantes, especialmente para miR-150-5p. La figura 11 muestra un nivel reducido estadísticamente significativo de miR-150-5p en plaquetas aisladas de pacientes con DCL y EP (es decir, pacientes que padecen una sinucleinopatía) en comparación con el control sano. Esto significa que miR-150-5p es un potente biomarcador para el diagnóstico de sinucleinopatías.

Además, la figura 11 muestra un nivel reducido estadísticamente significativo de miR-150-5p en plaquetas aisladas de pacientes con DCL y EP (es decir, pacientes que padecen una sinucleinopatía) en comparación con pacientes con EA. Esto significa que miR-150-5p es un potente biomarcador para el diagnóstico diferencial de sinucleinopatías frente a EA.

Estos resultados se confirman mediante las curvas ROC mostradas en la figura 12.

Ejemplo 15. Resultados de validación para otros miARN.

Además, los miARN mostrados en la tabla 2 están significativamente disminuidos en la DCL en comparación con la EA.

Tabla 2

Diferencias en la expresión de miARN entre DCL y EA

Los valores en la primera línea de la tabla 2 representan el cambio de expresión relativa de cada miARN en DCL frente a EA obtenido mediante el método deltadeltaCt. Los valores por debajo de 0,5 representan una expresión disminuida en comparación con el otro grupo (en este caso EA). Los valores en la segunda línea representan el intervalo de desviación. El valor de p representado en la tercera línea se obtuvo con la prueba de Wilcoxon-Mann-Whitney.

Ejemplo 16. miARN aumentados en plaquetas de pacientes con EA respecto a controles sanos.

Seis miARN estaban significativamente aumentados en la EA en comparación con los controles sanos. Esto significa que cualquiera de los miARN incluidos en la tabla 3, o combinaciones de los mismos, podría usarse para el diagnóstico de EA. Así, la presente invención también se refiere a un métodoin vitropara el diagnóstico de E<a>, que comprende determinar el nivel de expresión de al menos un miARN incluido en la tabla 3, o combinación de los mismos, aislado de plaquetas obtenidas del paciente, en donde un nivel de expresión aumentado de al menos uno de los miARN incluidos en la tabla 3, en comparación con el nivel de expresión medido en sujetos de control sanos, es una indicación de que el paciente padece EA.

Tabla 3

Diferencias en la expresión de miARN entre EA y controles.

Los valores en la primera línea de la tabla 3 representan el cambio de expresión relativa de cada miARN en EA frente a controles sanos y se obtuvieron mediante el método deltadeltaCt. Los valores superiores a 1,5 representan una expresión aumentada en comparación con el otro grupo (en este caso, los controles). Los valores en la segunda línea representan el intervalo de desviación. Los valores de p representados en la tercera línea se obtuvieron con la prueba de Wilcoxon-Mann-Whitney.

Ejemplo 17. miARN disminuidos en plaquetas de pacientes con DCL con respecto a pacientes con EP.

Por otro lado, dos miARN mostrados en la tabla 4 estaban significativamente disminuidos en pacientes con DCL en comparación con pacientes con EP. Por tanto, podrían servir como marcadores diagnósticos para diferenciar a los pacientes con DCL de los pacientes con EP. Así, la presente invención también se refiere a un métodoin vitropara el diagnóstico diferencial de DCL respecto a EP, que comprende determinar el nivel de expresión de al menos un miARN incluido en la tabla 4, o combinación de los mismos, aislado de plaquetas obtenidas del paciente, en donde un nivel de expresión disminuido de al menos uno de los miARN incluidos en la tabla 4, en comparación con el nivel de expresión de medido en pacientes con EP, es una indicación de que el paciente padece DCL y no EP.

Tabla 4

Diferencias en la expresión de miARN entre DCL y EP.

Los valores en la primera línea de la tabla 4 representan el cambio de expresión relativa de cada miARN en DCL frente a EP y se obtuvieron mediante el método deltadeltaCt. Los valores por debajo de 0,5 representan una expresión disminuida en comparación con el otro grupo (en este caso EP). Los valores en la segunda línea representan el intervalo de desviación. Los valores de p representados en la tercera línea se obtuvieron con la prueba de Wilcoxon-Mann-Whitney.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Métodoin vitropara el diagnóstico de sinucleinopatías, que comprende determinar el nivel de expresión de al menos miR-150-5p aislado de plaquetas obtenidas del paciente, en donde un nivel de expresión reducido de al menos miR-150-5p, en comparación con el nivel de expresión de al menos miR-150-5p medido en sujetos de control sanos, es una indicación de que el paciente padece una sinucleinopatía.

2. Métodoin vitropara el diagnóstico diferencial de sinucleinopatías frente a enfermedad de Alzheimer, que comprende determinar el nivel de expresión de al menos miR-150-5p aislado de plaquetas obtenidas del paciente, en donde un nivel de expresión reducido de al menos miR-150-5p, en comparación con el nivel de expresión de al menos miR-150-5p medido en pacientes de control que padecen la enfermedad de Alzheimer, es una indicación de que el sujeto padece una sinucleinopatía y no padece enfermedad de Alzheimer.

3. Métodoin vitro,según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en donde la sinucleinopatía es demencia con cuerpos de Lewy o enfermedad de Parkinson.

4. Métodoin vitro,según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además la determinación del nivel de expresión de al menos uno de los miARN comprendidos en el grupo: miR-7d-5p, miR-142-3p, miR-26b-5p, miR-139-5p, miR-146a-5p, miR-128-3p, miR-6747-3p, miR-132-5p, miR-25-3p, hsa-miR-16-5p o hsa-miR-26a-5p.

5. Usoin vitrode al menos miR-150-5p aislado de plaquetas para el diagnóstico de sinucleinopatías, o el diagnóstico diferencial de sinucleinopatías frente a enfermedad de Alzheimer.

6. Usoin vitrode un kit que comprende reactivos para la determinación del nivel de expresión de al menos miR-150-5p aislado de plaquetas para el diagnóstico de sinucleinopatías, o el diagnóstico diferencial de sinucleinopatías frente a enfermedad de Alzheimer.

7. Usoin vitro,según cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, en donde la sinucleinopatía es demencia con cuerpos de Lewy o enfermedad de Parkinson.

8. Usoin vitro,según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en donde el nivel de expresión de miR-150-5p se usa en combinación con el nivel de expresión de al menos uno de los miARN comprendidos en el grupo: miR-7d-5p, miR-142-3p, miR-26b-5p, miR-139-5p, miR-146a-5p, miR-128-3p, miR-6747-3p, miR-132-5p, miR-25-3p, hsa-miR-16-5p o hsa-miR-26a-5p.