ES3040185T3 - Use of bmmf1 rep protein as a biomarker for breast cancer - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere al uso de la proteína BMMF Rep como biomarcador para el cáncer de mama. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Uso de la proteína BMMF1 Rep como biomarcador del cáncer de mama

La invención se refiere en general al uso de una proteína asociada a la replicación del ADN (Rep) como biomarcador del cáncer de mama. Más específicamente, la presente invención se refiere al uso de la proteína Rep del Grupo 1 de Factores de la Carne y la Leche Bovina (BMMF1, por sus siglas en inglés) como biomarcador del cáncer de mama, en donde la proteína Rep es una proteína Rep codificada en el genoma MSBI1 (MSBI1 Rep, por sus siglas en inglés) codificada por MSBI1.176 que tiene la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID NO: 1, una proteína Rep codificada en el genoma MSBI2 (MSBI2 Rep, por sus siglas en inglés) codificada por MSBI2.176 que tiene la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID NO: 8, una proteína Rep codificada en el genoma CMI1 (CMI1 Rep, por sus siglas en inglés) codificada por CMI1.252 que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID NO: 10, una proteína Rep codificada en el genoma CMI2 (CMI2 Rep, por sus siglas en inglés) codificada por CMI2.214 que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID NO: 11 o una proteína Rep codificada en el genoma CMI3 (CMI3 Rep, por sus siglas en inglés) codificada por CMI3.168 que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID NO: 12, o una variante de la proteína con la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 8 con una homología de al menos 90 %, en donde la variante tiene una o más deleciones, sustituciones o adiciones de aminoácidos y es capaz de unir un anticuerpo anti-Rep específico para una proteína Rep que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 8.

Antecedentes de la invención

El cáncer de mama invasivo es el cáncer más diagnosticado y la segunda causa de muerte por cáncer entre las mujeres de Europa y Estados Unidos. Aproximadamente una de cada tres mujeres, y en un porcentaje mucho menor también los hombres, reciben un diagnóstico de cáncer de mama a lo largo de su vida. Aunque la tasa de mortalidad de las pacientes con cáncer de mama ha descendido ligeramente en los últimos años, sigue siendo muy elevada, debido principalmente al escaso éxito para curar el cáncer una vez desarrollado. Una de las razones para disminuir la tasa de mortalidad de las pacientes con cáncer de mama es identificar y tratar a aquellas pacientes con un alto riesgo de desarrollar cáncer de mama. De este modo, sería ventajoso identificar a aquellas pacientes que tienen un mayor riesgo de desarrollar cáncer de mama, incluidos los sujetos que desarrollan tumores precancerosos de mama. Por esta razón, sería ventajoso comprender la biología de los tumores precancerosos que tienen potencial para convertirse en cáncer de mama invasivo, de modo que los sujetos con tumores precancerosos de mama con un riesgo elevado puedan ser tratados eficazmente para prevenir el desarrollo del cáncer de mama.

Es bien sabido que el desarrollo del cáncer de mama invasivo es un proceso que consta de varias etapas. Basado en experimentos con animales y en pruebas epidemiológicas en humanos, la teoría es que las células madre de las unidades lobulares de los conductos terminales experimentan una proliferación hasta producir hiperplasia, luego a carcinomain situy más tarde a cáncer de mama invasivo. Algunos estudios clínicos retrospectivos y prospectivos también han establecido que entre los sujetos diagnosticados de tumores de mama no cancerosos, los diagnosticados de hiperplasia atípica o hiperplasia no atípica tienen mayor riesgo de desarrollar cáncer de mama. En conjunto, las pruebas histológicas y epidemiológicas apuntan a que las lesiones hiperplásicas son las lesiones precursoras más tempranas que tienen un potencial significativamente mayor de desarrollar cáncer de mama invasivo.

Los pacientes suelen tratarse con cirugía de resección, seguida de radioterapia, quimioterapia sistémica y/o inmunoterapia, basándose la terapia en los rasgos macroscópicos del tumor y en el estadio en la que se encuentre. Las tasas de supervivencia sin recaída a 5 años han mejorado durante los últimos años en algunos pacientes, mientras que esta estadística no ha mejorado en otros.

A pesar del amplio uso de la mamografía y de los programas de cribado ofrecidos, muchas pacientes son diagnosticadas tarde debido a la falta de biomarcadores predictivos. Para potenciar la detección temprana, se necesitan biomarcadores que faciliten la detección temprana y profundicen en la patogénesis del cáncer de mama.

Zur Hausenet al.,2019 postula un vínculo entre los agentes BMMF (Factor de la Leche y la Leche Bovina) y el desarrollo del cáncer. Además, Falidaet al.,2017 hace referencia al aislamiento de dos ADN circulares similares a virus a partir de muestras de leche comercializadas, en donde los autores hablan de una serie de estudios que vinculan el consumo de leche y productos lácteos con la incidencia de cáncer de mama, así como de trastornos neurodegenerativos, como la esclerosis múltiple. Asimismo, Giovannaet al.,2013 se dirige al virus de la leucemia bovina (BLV), el cual es un virus diferente del BMMF y no guarda ninguna relación con él. La presencia de genes BLV en humanos y su localización en el tejido mamario se ha confirmado y clarificado como posible promotor de procesos de malignización en este tejido.

Además, Yanget al.,2015 se dirige a la investigación de la infiltración de macrófagos asociados a tumores (TAM) en el tejido mamario normal y maligno y en los ganglios linfáticos de drenaje, y a explorar su efecto en la invasión y la metástasis del cáncer de mama, en donde se observó la densidad de infiltración de los TAM mediante tinción inmunohistoquímica de CD68.

Descripción de la invención

En la presente solicitud, los inventores han creado un modelo de desarrollo del cáncer de mama que se muestra en la Fig. 1.

Los inventores descubrieron que la ingesta de agentes BMMF (Factores de la Carne y la Leche Bovina) en los primeros meses de vida, ya sea por la sustitución de la lactancia materna durante el destete por productos lácteos de vaca o por la ingesta de productos lácteos o cárnicos vacunos, en general, provoca una infección temprana con antígenos BMMF en los recién nacidos. Basado en la disminución de los anticuerpos maternos y en la debilidad del sistema inmunitario observada con frecuencia, a menudo unida a la inducción de tolerancia inmunitaria del recién nacido durante este periodo tan temprano de la vida, estos agentes podrían escapar directamente a la respuesta inmunitaria o podría inducirse una situación de tolerancia inmunitaria frente a estos agentes. En los años o décadas siguientes, dependiendo del sistema inmunitario del hospedero, se acumulan cada vez más antígenos BMMF en el estroma del tejido mamario. Esta acumulación puede desencadenarse también por la captación de moléculas específicas que pueden representar receptores para los BMMF. Estas moléculas también son capturadas por el consumo de productos derivados de la vaca y se metabolizan en los receptores de la superficie de las células del hospedero. Cuando se alcanza un cierto nivel de antígeno mediante la captación continua de BMMF en combinación con la propagación focal de la infección, la respuesta inmunitaria del hospedero induce un estado de inflamación crónica y local que produce un aumento estable de las especies reactivas del oxígeno (ROS, por sus siglas en inglés) y de la ciclooxigenasa-2 (Cox-2, por sus siglas en inglés), lo cual aumenta drásticamente la probabilidad de proliferación celular desregulada con fijación concomitante de mutaciones aleatorias en las células circundantes inducidas por las ROS. Especialmente, las células con una actividad replicativa intrínsecamente alta podrían representar objetivos que enriquezcan las mutaciones aleatorias del ADN permitiendo la manifestación estocástica de mutaciones como requisito básico para la génesis tumoral y el desarrollo del cáncer de mama. De este modo, los BMMF representan un desencadenante específico y local para la inducción de inflamación crónica dentro del estroma de tejido el cual conduce a un aumento de ROS que induce la proliferación y la mutación en las células replicativas circundantes que finalmente conducen a la formación de hiperplasia como precursores del cáncer.

En detalle, una selección de muestras de tejido de 7 pacientes con cáncer de mama con estadiaje tumoral conocido se sometieron a tinción IHC (por sus siglas en inglés) con anticuerpos monoclonales de ratón anti-Rep. Todos los tejidos dieron positivo en las pruebas de detección de las BMMF1 Rep dianas. De forma ejemplar, la tinción con anticuerpos anti-Rep (por ejemplo, mAb 10-3, mAb 3-6, por sus siglas en inglés) muestra la detección específica de dianas proteicas en regiones de tejido tumoral estromal dentro de las muestras de pacientes con cáncer de mama 7G6MJX y HHY7K (Figuras 2 y 3). En general, la detección de anti-Rep resultó en una tinción intensa de agregados de menor tamaño, principalmente dentro de las regiones citoplasmáticas de las células del estroma. Adicionalmente, se observó una colocalización de las señales teñidas anti-Rep con macrófagos CD68-positivos. Las regiones con mayor detección de anticuerpos específicos de Rep se correlacionan con las regiones con mayores niveles de detección de células CD68 positivas, lo que apunta hacia una localización de los antígenos específicos de Rep en áreas de tejido inflamatorio, es decir, regiones con niveles especialmente elevados de monocitos inflamatorios, macrófagos circulantes o macrófagos de tejido residentes. No se observó detección de señal en la tinción de control con un anticuerpo isotipo de control. Por otra parte, también se observaron patrones de tinción anti-Rep significativos en las células epiteliales que rodean las paredes de los lóbulos mamarios con localización citoplasmática en forma de agregados, las cuales podrían representar áreas de tejido que permiten la replicación/persistencia de BMMF. En el caso del cáncer de mama, los patrones de tinción anti-Rep se encontraron sobre todo en las regiones peritumorales (confróntese con la Fig. 5). En los tumores propiamente dichos, el patrón de tinción fue menos significativo.

Hasta ahora, se ha aislado un espectro de 18 moléculas de ADN diferentes, aunque parcialmente relacionadas, a partir de distintos materiales de prueba (suero bovino, leche, tejido cerebral de las autopsias de un paciente con esclerosis múltiple) (Funket al.2014, Gunstet al.2014, Lambertoet al.2014, Whitleyet al.2014; Eilebrechtet al.

2018; WO 2015/062726 A2; WO 2016/005054 A2). Los 18 aislados se dividieron en cuatro grupos diferentes BMMF1 a BMMF4, de acuerdo con sus características moleculares (zur Hausenet al.,2017). Tres de estos grupos revelaron un notable grado de similitud con los plásmidos deAcinetobacter baumanniiyPsychrobacter.El cuarto grupo comprendía 3 aislados que eran representantes deGemycirularviridae.Los genes Rep putativos se identificaron como parte de las secuencias de ADN del BMMF obtenidas por comparacionesin silicocon secuencias disponibles. La amplificación usando cebadores colindantes en el gen rep condujo al aislamiento de genomas circulares completos y parciales de ADN a partir de sueros bovinos (Funket al.,2014). Esto se amplió a muestras de productos de la leche disponibles comercialmente para detectar la presencia de genomas específicos de ADN circular de hebra única. Se clonaron y secuenciaron moléculas de ADN circular de hebra única de longitud completa de 14 aislados diferentes de (aproximadamente 1100 a 3000 nucleótidos) (Whitleyet al.,2014; Gunstet al.,2014; Funket al.,2014; Lambertoet al.,2014). Se obtuvieron cuatro aislados adicionales de cerebro y suero humanos (todos de pacientes con esclerosis múltiple) (Whitleyet al.,2014; Gunstet al.,2014; Lambertoet al.,2014).

Entre estos aislados se aislaron dos moléculas de ADN estrechamente relacionadas con el aislado de Esfinge 1.76 asociado a la encefalopatía espongiforme transmisible (TSE, por sus siglas en inglés) (1.758 pb; No. de acceso HQ444404 (Manuelidis L. 2011)) a partir de tejido cerebral de un paciente con MS (por sus siglas en inglés). Estos aislados fueron MSBI1.176 (m Sb I, aislado cerebral de esclerosis múltiple) (1.766 pb) y MSBI2.176 (1.766 pb), los cuales se designan como “genoma MSBI1” y “genoma MSBI2”, respectivamente. MSBI1.176 comparte 98 % de similitud nucleotídica con la secuencia de Esfinge 1.76. Los grandes marcos abiertos de lectura (ORF, por sus siglas en inglés) de los aislados codifican una proteína putativa de replicación del ADN que comparte una gran similitud entre ellos. Otro atributo común es la presencia de repeticiones en tándem similares a iterones. El alineamiento de esta región repetida indica una variación en el núcleo de nucleótidos individuales. Estas repeticiones similares a iterones pueden constituir los sitios de unión de las proteínas Rep. Las secuencias de los aislados se han depositado en el banco de datos EMBL (por sus siglas en inglés) con los números de acceso LK931491 (MSBI1.176) y LK931492 (MSBI2.176) (Whitley C.et al.2014) y se han alineado y descrito en el documento WO 2016/005054 A2.

Otros aislados se obtuvieron de la leche de vaca. Estos aislados de leche de vaca (CMI, por sus siglas en inglés) fueron CMI1.252, CMI2.214 y CMI3.168, los cuales se designan como “genoma CMI1”, “genoma CMI2” y “genoma CMI3”, respectivamente. Las secuencias de los aislados se han depositado en el banco de datos EMBL con números de acceso LK931487 (CMI1.252), LK931488 (CMI2.214) y LK931489 (CMI3.168) y se han alineado y descrito en el documento WO 2016/005054 A2.

Los presentes inventores han descubierto que tanto los genomas CMI como los genomas MSBI muestran una producción significativa de ARN transcrito, y la proteína Rep codificada se expresa en el tejido periférico alrededor del tejido canceroso. Los presentes inventores han descubierto que las proteínas Rep codificadas (MSBI1 Rep, MSBI2 Rep, CMI1 Rep, CMI2 Rep, CMI3 Rep) representan un biomarcador del cáncer de mama. Como proteína asociada a la replicación del ADN (RepB), la proteína Rep tiene actividad de unión al ADN y puede ser esencial para el inicio de la replicación de moléculas de ADN episomales o virales. Las proteínas Rep muestran un marcado potencial de auto-oligomerización y agregación, el cual fue descrito en sistemas procariotasin vivoein vitro(Giraldo, Moreno-Diaz de la Espinaet al.2011, Torreira, Moreno-Del Alamoet al.2015).

La presente invención se define en las reivindicaciones independientes 1 y 2. Las realizaciones preferidas se definen en las reivindicaciones dependientes.

En más detalle, la presente invención se refiere específicamente al usoin vitrode la proteína Rep BMMF1 como biomarcador del cáncer de mama, en donde la proteína Rep es una proteína Rep codificada en el genoma MSBI1 (MSBI1 Rep) codificada por MSBI1.176 que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID NO: 1, una proteína Rep codificada en el genoma MSBI2 (MSBI2 Rep, por sus siglas en inglés) codificada por MSBI2.176 que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID NO: 8, una proteína Rep codificada en el genoma CMI1 (CMI1 Rep, por sus siglas en inglés) codificada por CMI1.252 que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID NO: 10, una proteína Rep codificada en el genoma CMI2 (CMI2 Rep, por sus siglas en inglés) codificada por CMI2.214 que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID NO: 11 o una proteína Rep codificada en el genoma CMI3 (CMI3 Rep, por sus siglas en inglés) codificada por CMI3.168 que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID NO: 12, o una variante de la proteína con la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 8 con una homología de al menos 90 %, en donde la variante tiene una o más deleciones, sustituciones o adiciones de aminoácidos y es capaz de unir un anticuerpo anti-Rep específico para una proteína Rep que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 8.

Los inventores han creado anticuerpos monoclonales contra la proteína Rep. En realizaciones particulares, los anticuerpos anti-Rep se unen a epítopos de la proteína Rep que se ejemplifican en la Fig. 4. Los anticuerpos particularmente preferidos se unen a epítopos dentro de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los aminoácidos de 1 a 136, de 137 a 229 y de 230 a 324 de la SEQ ID NO: 1. Por ejemplo, el anticuerpo se une a un epítopo comprendido por la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 3.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1 muestra el modelo propuesto para el desarrollo del cáncer de mama.

Figura 2 detección IHC de BMMF1 Rep en tejido de paciente con cáncer de mama 7G6MJX (barra de escala = 100 gm) en secciones de tejido consecutivas.

Figura 3 detección IHC de BMMF1 Rep en tejido de paciente con cáncer de mama 1HHY7K (barra de escala = 100 gm) en secciones de tejido consecutivas.

Figura 4 muestra las características de los anticuerpos creados y la localización de epítopos dentro de

Rep.

Figura 5 diagrama de barras que muestra la Puntuación inmunorreactiva basada en la tinción de BMMF1 Rep (eje X: puntuación inmunorreactiva; eje Y: número de pacientes).

La invención proporciona la enseñanza de que las proteínas Rep pueden representar biomarcadores de un riesgo potenciado de desarrollar cáncer de mama y son útiles como marcador para determinar el pronóstico de supervivencia global de los pacientes con cáncer de mama.

El término “cáncer de mama” significa un cáncer que evoluciona como consecuencia de un crecimiento celular incontrolado en el tejido mamario femenino o masculino. Estas neoplasias malignas pueden desarrollarse como consecuencia de adenomas e hiperplasia benigna preexistentes en que las alteraciones genéticas promueven la transición del crecimiento normal al canceroso. El término “cáncer de mama” designa los estadios previos, iniciales o avanzados de la enfermedad y las metástasis derivadas de la misma.

En una realización alternativa, la presente invención también puede abarcar la prueba sistemática de tejido mamario sano (tejido de individuos sin diagnóstico de cáncer o un indicio específico de la enfermedad) para valorar el riesgo de enfermedad en el futuro. Esto significa que la presente invención también es adecuada para determinar la predisposición a desarrollar cáncer de mama.

La “proteína Rep”, como se usa en la presente, se refiere a una proteína asociada a la replicación del ADN (RepB). La proteína Rep posee actividad de unión al ADN y podría ser esencial para el inicio de la replicación de moléculas de ADN episomal/viral. En general, la proteína Rep se refiere a una proteína Rep del grupo del Genoma de la Esfinge Pequeña (Whitleyet al.,2014). De acuerdo con la presente invención, la proteína Rep es una proteína Rep codificada en el genoma MSBI1 (MSBI1 Rep), una proteína Rep codificada en el genoma MSBI2 (MSBI2 Rep), una proteína Rep codificada en el genoma CMI1 (CMI1 Rep), una proteína Rep codificada en el genoma CMI2 (CMI2 Rep) o una proteína Rep codificada en el genoma CMI3 (CMI3 Rep) codificada por las secuencias ejemplificadas en el conjunto de reivindicaciones anexo.

De acuerdo con la presente invención, la proteína MSBI1 Rep está codificada por MSBI1.176 depositado en el banco de datos EMBL con el No. de acceso LK931491 y tiene la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID NO: 1, la proteína MSBI2 Rep está codificada por MSBI2.176 depositada en el banco de datos EMBL con el No. de acceso LK931492 y tiene la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID NO: 8 (Whitley, Gunstet al.2014), la proteína CMI1 Rep está codificada por CMI1.252 depositada en el banco de datos EMBL con el No. de acceso LK931487 y tiene la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID NO: 10, la proteína CMI2 Rep está codificada por CMI2.214 depositada en el banco de datos EMBL con el No. de acceso LK931488 y tiene la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID NO: 11, o la proteína CMI3 Rep está codificada por CMI3.168 depositada en el banco de datos EMBL con el No. de acceso LK931489 y tiene la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID NO: 12.

En una realización particular preferida, la proteína Rep comprende una región del extremo N-terminal conservada entre los genomas BMMF1 que consiste esencialmente en aminoácidos de 1 a 229 de la SEQ ID NO: 1 y una región variable del extremo C-terminal específica para MSBI1.176 que consiste esencialmente en los aminoácidos 230 a 324 de la SEQ ID NO: 1. 1. La región conservada del extremo N-terminal comprende un primer dominio putativo de unión al ADN que consiste esencialmente en los aminoácidos del 1 al 136 de la SEQ ID NO: 1 y un segundo dominio putativo de unión al ADN formado esencialmente por los aminoácidos de 137 a 229 de la SEQ ID NO: 1. El dominio del extremo C-terminal muestra poca homología de secuencia con cualquier proteína conocida y consiste en los aminoácidos 230 a 324.

La “proteína Rep” de la presente invención también abarca fragmentos y variantes de la proteína con la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 8 los cuales son capaces de unir un anticuerpo anti-Rep específico para la proteína Rep que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 8. Preferentemente, tal fragmento es un fragmento inmunogénico de la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 8 la cual abarca al menos un epítopo para un anticuerpo contra la proteína Rep de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 8 y, preferentemente, comprende al menos 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o 50 aminoácidos contiguos. En realizaciones particulares, el fragmento comprende o consiste esencialmente en un dominio de la proteína Rep, por ejemplo, la región conservada del extremo N-terminal, la región variable del extremo C-terminal, el primer o segundo dominio de unión al ADN. Una variante de la proteína con la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 8 comprende una o más deleciones, sustituciones o adiciones de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 1 y tiene una homología de al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 8, en donde la variante es capaz de unir un anticuerpo anti-Rep específico para una proteína Rep que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 8. Se incluyen dentro de la definición de variante, por ejemplo, los polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, ácido nucleico peptídico (PNA, por sus siglas en inglés), etc.), polipéptidos con enlaces sustituidos, así como otras modificaciones conocidas en la técnica, tanto de origen natural como no natural.

El término proteína Rep incluye proteínas de fusión con una secuencia de aminoácidos heteróloga, con una secuencia líder o con una secuencia etiqueta y similares. En ciertas realizaciones de la invención, las etiquetas proteicas se injertan genéticamente en la proteína Rep descrita anteriormente, es decir, la proteína Rep seleccionada del grupo que consiste en MSBI1, MSBI2, CMI1, CMI2 o CMI3 codificada por las secuencias ejemplificadas en el conjunto de reivindicaciones anexo. En particular, al menos una etiqueta proteica puede estar unida a un polipéptido consistente en una secuencia de aminoácidos como la representada en cualquiera de las SEQ ID NO: 1-3, 8, 10-12. Tales etiquetas proteínicas pueden eliminarse por agentes químicos o por medios enzimáticos. Los ejemplos de etiquetas proteínicas son las etiquetas de afinidad o cromatografía para purificación. Por ejemplo, la proteína Rep puede fusionarse a una secuencia de etiqueta, por ejemplo, seleccionada del grupo que consiste en la Etiqueta His6 (SEQ ID NO: 4), la Etiqueta T7 (SEQ iD NO: 5), la Etiqueta FLAG (SEQ ID NO: 6) y la Etiqueta Strep-II (SEQ ID NO: 7), una etiqueta His (SEQ ID No:4), una etiqueta T7 (SEQ ID NO: 5), la Etiqueta FLAG (SEQ ID No : 6) o la Etiqueta Strep-II (SEQ ID NO: 7). Además, a una proteína Rep de acuerdo con la invención pueden unirse etiquetas de fluorescencia tales como la proteína verde fluorescente (GFP, por sus siglas en inglés) o sus variantes.

En general, la proteína Rep codificada en el genoma MSBI1 (MSBI1 Rep) puede estar optimizada en codones (por ejemplo, SEQ ID NO: 14) para la producción en líneas celulares humanas (por ejemplo, HEK-293, HEK293TT, HEK293T, HEK293FT, HaCaT, HeLa, SiHa, CaSki, HDMEC, L1236, L428, BJAB, MCF7, Colo678, cualquier línea celular primaria), así como en líneas celulares bovinas (por ejemplo, MAC-T) o murinas (por ejemplo, GT1-7). Esto se describe en detalle en el documento PCT/EP2017/075774.

La proteína Rep de la invención, incluidos los fragmentos Rep y las variantes Rep definidas anteriormente, puede prepararse por síntesis química clásica. La síntesis puede realizarse en solución homogénea o en fase sólida. Los polipéptidos de acuerdo con esta invención también pueden prepararse por medio de técnicas de ADN recombinante.

Un “sujeto” como se usa en la presente se refiere a un individuo o paciente mamífero, incluyendo murino, bovino, por ejemplo, bovinos, simios y humanos. Preferentemente, el sujeto es un paciente humano.

Un “anticuerpo anti-Rep” como se usa en la presente se refiere a un anticuerpo que se une a un nivel detectable a la proteína Rep cuya afinidad es más fuerte a la proteína Rep de la invención que a una proteína no-Rep. Preferentemente, la afinidad del antígeno por la proteína Rep es al menos 2 veces mayor que la unión de fondo. En particular, el anticuerpo anti-Rep es específico para el MSBI1 Rep que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o MSBI2 Rep con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8. En realizaciones particulares, el anticuerpo es específico cruzado para MSBI1 Rep, MSBI2 Rep, CMI1 Rep, CMI2 Rep y/o CMI3 Rep que comprende las secuencias de la presente invención. En ciertas realizaciones el anticuerpo anti-Rep es específico cruzado para al menos dos, preferentemente todos, de MSBI1 Rep, MSBI2 Rep, CMI1 Rep, CMI2 Rep y/o CMI3 Rep que comprenden las secuencias de la presente invención, las cuales se ejemplifican en el conjunto de reivindicaciones anexo.

Los inventores también probaron el nivel de anticuerpos de los pacientes con cáncer de mama poniendo en contacto la proteína Rep con una muestra sospechosa de contener anticuerpos contra la proteína Rep en condiciones que permitan que la proteína Rep se una a cualquier anticuerpo de este tipo presente en la muestra. Tales condiciones serán usualmente temperatura fisiológica, pH y fuerza iónica usando un exceso de proteína Rep. La incubación de la proteína Rep con la muestra va seguida de la detección de inmunocomplejos formados por el antígeno. En ciertas realizaciones, o bien la proteína Rep está acoplada a un compuesto generador de señales, por ejemplo, una etiqueta detectable, o bien se usa un agente de unión adicional, por ejemplo, un anticuerpo secundario antihumano, acoplado a un compuesto generador de señales para detectar el complejo inmunitario.

Los anticuerpos anti-Rep pueden detectarse y cuantificarse en ensayos basados en la proteína Rep como antígeno proteico, el cual sirve de objetivo para los anticuerpos de mamíferos, por ejemplo, humanos, que se sospechan en la muestra. Preferentemente, la proteína Rep está purificada, y la muestra puede ser, por ejemplo, suero o plasma. Los métodos incluyen la inmovilización de la proteína Rep en una matriz seguida de la incubación de la proteína Rep inmovilizada con la muestra. Por último, los anticuerpos unidos a Rep del complejo inmunológico formado entre la proteína Rep y los anticuerpos de la muestra se cuantifican mediante un agente de unión de detección acoplado a un compuesto generador de señales, por ejemplo, un anticuerpo de detección secundario acoplado a HRP (rábano-peroxidasa, por sus siglas en inglés) que permite una cuantificación basada en sustrato HRP. Este compuesto o etiqueta generador de señales es detectable por sí mismo o puede reaccionar con un compuesto adicional para generar un producto detectable.

El diseño del inmunoensayo está sujeto a una gran variación, y se conocen muchos formatos en la técnica. Los protocolos pueden, por ejemplo, usar soportes sólidos o inmunoprecipitación. La mayoría de los ensayos involucran el uso de agentes de unión acoplados a compuestos generadores de señales, por ejemplo, anticuerpos marcados o proteínas Rep marcadas; las etiquetas pueden ser, por ejemplo, moléculas enzimáticas, fluorescentes, quimioluminiscentes, radiactivas o tintadas. También se conocen ensayos los cuales amplifican las señales del complejo inmunitario; cuyo ejemplos son los ensayos los cuales usan biotina y avidina o estreptavidina, e inmunoensayos marcados y mediados por enzimas, tales como los ensayos ELISA (por sus siglas en inglés).

El inmunoensayo puede tener un formato heterogéneo u homogéneo, y ser de tipo estándar o competitivo. Tanto los formatos estándar como los competitivos son conocidos en la técnica.

En un formato de ensayo de inmunoprecipitación o aglutinación, la reacción entre la proteína Rep y el anticuerpo anti-Rep forma una red que precipita de la solución o suspensión y forma una capa o película visible de precipitado. Si no hay anticuerpos anti-Rep en la muestra, no se forma un precipitado visible.

En realizaciones adicionales, los inventores usaron métodos en donde una mayor cantidad de proteína Rep en una muestra se correlaciona con un diagnóstico o predisposición de cáncer de mama. En tales realizaciones, la proteína Rep en la muestra se detecta mediante anticuerpos anti-Rep.

Una “muestra”, como se usa en la presente, se refiere a una muestra biológica que abarca el tejido mamario canceroso, el tejido periférico que rodea al tejido canceroso y la hiperplasia (benigna). Las muestras abarcan muestras de tejidos tales como cultivos de tejidos o muestras de biopsias.

Tales métodos (métodosex vivooin vitro)comprenden los pasos de detectar la proteína Rep en una muestra de un sujeto mediante anticuerpos anti-Rep. En tales métodos, la proteína Rep se detecta en muestras de tejido mediante métodos inmunohistoquímicos o microscopía de inmunofluorescencia.

En ciertas realizaciones se usan anticuerpos anti-Rep para la detección o captura de la proteína Rep en la muestra.

El término “anticuerpo” se refiere preferentemente a anticuerpos los cuales consisten esencialmente en anticuerpos policlonales agrupados con diferentes especificidades epitópicas, así como preparaciones de anticuerpos monoclonales distintos. Como se usa en la presente, el término “anticuerpo” (Ab) o “anticuerpo monoclonal” (mAb) incluye moléculas de inmunoglobulina intactas, así como fragmentos de anticuerpos (tales como, por ejemplo, fragmentos Fab y F(ab')2 [por sus siglas en inglés respectivamente]) los cuales son capaces de unirse específicamente a la proteína Rep. Los fragmentos Fab y F(ab')2 carecen del fragmento Fc del anticuerpo intacto, se eliminan más rápidamente de la circulación y pueden tener una unión de tejido menos inespecífica que un anticuerpo intacto. De este modo, se prefieren estos fragmentos, así como los productos de una biblioteca de expresión de FAB u otras inmunoglobulinas. Asimismo, los anticuerpos útiles para los fines de la presente invención incluyen anticuerpos quiméricos, de cadena única, multifuncionales (por ejemplo, biespecíficos) y humanizados o anticuerpos humanos.

En ciertas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo está acoplado a un compuesto generador de señal, por ejemplo, porta una etiqueta detectable. El anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno puede marcarse directa o indirectamente de forma detectable, por ejemplo, con un radioisótopo, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, un quelante metálico o una enzima. Los expertos en la técnica conocerán otras etiquetas adecuadas para unirse al anticuerpo, o podrán determinarlas mediante experimentación rutinaria.

Los anticuerpos anti-Rep de la presente invención se producen (generan) contra una proteína Rep que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 8 o un fragmento del mismo por métodos bien conocidos por los expertos en la técnica.

En ciertas realizaciones se usan anticuerpos anti-Rep en los métodos de la invención los cuales son capaces de unirse a varios o todos los tipos de proteínas Rep del grupo del Genoma de la Esfinge Pequeña (anticuerpo anti similar a Esfinge Pequeña Rep o anticuerpo anti-SSLRep, por sus siglas en inglés). Tal anticuerpo anti-SSLRep se une a un epítopo dentro de la región conservada del extremo N-terminal de la proteína Rep de los aminoácidos 1 a 229 de la SEQ ID NO: 1. En realizaciones particulares se usan anticuerpos anti-Rep del tipo anti-SSLRep los cuales se unen a un epítopo dentro de la SEQ ID NO: 2 (aminoácidos 32-49 de la SEQ ID NO: 1) o la SEQ ID NO: 3 (aminoácidos 197-216 de la SEQ ID NO: 1). Los fragmentos peptídicos de la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 3 están altamente conservadas entre las proteínas Rep del grupo del Genoma de la Esfinge Pequeña y parecen estar expuestas debido a su carácter hidrofílico. Los anticuerpos anti-Rep del tipo anti-SSLRep pueden producirse por inmunización, por ejemplo, de ratones o cobayas, con péptidos que consistan esencialmente en las secuencias de aminoácidos representadas en las SEQ ID NO: 2 o 3; o por otros fragmentos inmunogénicos, preferentemente que comprendan al menos 8-15 aminoácidos, derivados de la región conservada del extremo N-terminal de la proteína Rep de los aminoácidos 1 a 229 de la SEQ ID NO: 1.

En otras realizaciones, se usan anticuerpos anti-Rep específicos para la proteína MSBI1 Rep. Tales anticuerpos pueden producirse, por ejemplo, por inmunización de un mamífero tales como ratones o cobayas con una proteína Rep de longitud completa que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.

Preferentemente, los métodos de la invención usan anticuerpos anti-Rep, los cuales son capaces de detectar la proteína Rep hasta un alcance de picogramo a femtogramo.

En la Tabla 1 se muestran ejemplos de tales grupos de anticuerpos anti-Rep:

Los anticuerpos anti-Rep del grupo A tienen un epítopo dentro de la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID NO: 3 (aa 198-217 de la SEQ ID NO: 1) y son capaces de detectar MSBI1 Rep y proteínas Rep que comprenden este epítopo conservado del grupo del Genoma de la Esfinge Pequeña (por ejemplo, MSBI2, CMI1, CMI4). En ensayos de inmunofluorescencia, tales anticuerpos anti-Rep detectan un patrón de localización específico de Rep, en donde la localización principal está homogéneamente distribuida por el citoplasma y la membrana nuclear; y se observa adicionalmente una localización débil y homogéneamente distribuida en el núcleo. Un ejemplo de tal anticuerpo del grupo A es el anticuerpo AB01 523-1-1 (también llamado anticuerpo 1-5; DSM ACC3327) el cual se empleó en los ejemplos como anticuerpo del grupo A.

Los anticuerpos anti-Rep del grupo B tienen un epítopo dentro de la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID NO: 2 (aa 33-50 de la SEQ ID NO: 1) y son capaces de detectar MSBI1 Rep y proteínas Rep que comprenden este epítopo conservado del grupo del Genoma de la Esfinge Pequeña (por ejemplo, MSBI2, CMI1, CMI4). En ensayos de inmunofluorescencia, tales anticuerpos anti-Rep detectan específicamente motas (agregaciones citoplasmáticas) de la proteína Rep (a menudo en la periferia de la membrana nuclear). Un ejemplo de tal anticuerpo del grupo B es el anticuerpo designado como AB02 304-4-1 (también llamado anticuerpo 5-2; DSM ACC3328) el cual se empleó en los ejemplos como anticuerpo del grupo B.

Los anticuerpos anti-Rep del grupo C detectan específicamente un epítopo estructural de MSBI1 (SEQ ID NO: 1). En ensayos de inmunofluorescencia, tales anticuerpos anti-Rep detectan un patrón de localización específico de Rep, en donde la localización principal está homogéneamente distribuida por el citoplasma y la membrana nuclear; y se observa adicionalmente una localización débil y homogéneamente distribuida en el núcleo. Un ejemplo de tal anticuerpo del grupo C es el anticuerpo MSBI1 381-6-2 (también llamado anticuerpo 3-6; DSM ACC3329) el cual se empleó en el Ejemplo como anticuerpo del grupo C con un epítopo en la secuencia de aa 230-324. Otro ejemplo de anticuerpo del grupo C es el anticuerpo MBSI1 572-13-19 (también llamado anticuerpo 10-3) que detecta un epítopo en el dominio del extremo C-terminal de MSBI 1 Rep (aa 230-324). Otro ejemplo de anticuerpo del grupo C es el anticuerpo MBSI1 617-1-3 (también llamado anticuerpo 11-5) que detecta un epítopo en el dominio del extremo N-terminal de MSBI 1 Rep (aa 1-136).

Los anticuerpos anti-Rep del grupo D detectan específicamente un epítopo estructural de MSBI1 (SEQ ID NO: 1), donde el anticuerpo MSBI1 961-2-2 designado como “D1” (también llamado anticuerpo 9-2; Ds M ACC3331) detecta un epítopo representado en la SEQ ID NO: 9 (aa 281 -287) en el dominio del extremo C-terminal de MSBI1. El anticuerpo MSBI1 761-5-1 (también denominado anticuerpo 13; DSM ACC3328) designado como “D2” detecta un epítopo estructural 3D de MSBI1 el cual es exclusivamente accesible en condicionesin vivoy no es accesible en inmunotransferencia tipo Western. En ensayos de inmunofluorescencia, tales anticuerpos anti-Rep detectan específicamente motas (agregaciones citoplasmáticas) de la proteína Rep (a menudo en la periferia de la membrana nuclear).

La invención se ilustra con los siguientes ejemplos:

Ejemplo 1: Detección de objetivos de la proteína BMMF en el tejido mamario

Todas las muestras de tejido fueron proporcionadas por el banco de tejidos del Centro Nacional de Enfermedades Tumorales (NCT, Heidelberg, Alemania y el Instituto de Patología, Hospital Universitario de Heidelberg, Alemania) de acuerdo con la normativa del banco de tejidos y la aprobación del comité ético de la Universidad de Heidelberg.

Tinción de tejidos

Las secciones de tejido incorporadas en parafina (aproximadamente 4 pm de grosor) se tiñeron con el kit Zytomed Chem-Plus HRP Polymer-Kit (Zytomed, POLHRP-100) y el kit DAB Substrate Kit High Contrast (Zytomed, DAB500plus) tras la recuperación de epítopos con EDT<a>[por sus siglas en inglés] (Sigma E1161) con las incubaciones de anticuerpos dadas (confróntese con la Tabla 1) y tinción de contraste de hematoxilina. Las rebanadas se escanearon con un escáner digital de rebanadas (Hamamatsu) y se analizaron basadas en elsoftwareNDP.view2 Plus (Hamamatsu).

Tabla 1

La tinción con anticuerpos anti-Rep (por ejemplo, mAb 10-3, mAb 3-6) muestra la detección específica de dianas proteicas en regiones de tejido tumoral estromal dentro de las muestras de pacientes con cáncer de mama 7G6MJX y HHY7K (Figura 2 y 3). En general, la detección de anti-Rep resultó en una tinción intensa de agregados de menor tamaño, principalmente dentro de las regiones citoplasmáticas de las células del estroma. Adicionalmente, se observó una colocalización de las señales teñidas anti-Rep con macrófagos CD68-positivos. Las regiones con mayor detección de anticuerpos específicos de Rep se correlacionan con las regiones con mayores niveles de detección de células CD68 positivas, lo que apunta hacia una localización de los antígenos específicos de Rep en áreas de tejido inflamatorio, es decir, regiones con niveles especialmente altos de monocitos inflamatorios, macrófagos circulantes o macrófagos residentes de tejido. No se observó detección de señal en la tinción de control con un anticuerpo isotipo de control.

Ejemplo 2: Tinción y análisis de tejidos

La micromatriz de tejidos ZTMA26 fue generada y proporcionada por cortesía de Universitatsspital Zürich. En este conjunto de datos 1 figuraba una mancha de tejido peritumoral por paciente.

ZTMA26 se tiñó de forma totalmente automática en una máquina BOND MAX (Leica Biosystems) con tampón de recuperación de epítopos EDTA (Abcam, #ab93680). El anticuerpo primario anti-BMMF1 Rep (#3-6, monoclonal, DKFZ Heidelberg) y el anticuerpo de control del isotipo (Biolegend IgG1, MG1-45) se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente (4 pg/mL). El anticuerpo secundario anti-ratón de conejo (Abcam #125904) se incubó por 20 minutos a temperatura ambiente. La detección se llevó a cabo usando el kit de detección Bond Polymer Refine (Leica #DS9800), que incluye cromógeno DAB y tinción de hematoxilina. Los portaobjetos se escanearon usando un escáner de portaobjetos Hamamatsu Nanozoomer (Hamamatsu) y se analizaron con elsoftwareNDP.view2 Plus (Hamamatsu).

Análisis de tejidos

Para analizar la tinción de BMMF1 Rep en los TMA, se caracterizó la tinción de anticuerpos basándose en dos parámetros: el porcentaje de células teñidas (positividad) y la intensidad (I) de la señal en las partes intersticiales/estromales de las manchas de tejido. Las partes epiteliales y las células tumorales no se incluyeron en el análisis porque, en general, no son el objetivo de la positividad de BMMF. La positividad (POS) de la tinción de BMMF1 Rep se valoró usando una escala de tres niveles en la cual 0 indicaba que no había partes de tejido positivas en absoluto, 1 indicaba 1 -10 % positivas, 2 indicaba 11 -30 %, 3 indicaba más de 30 % de células positivas distribuidas en varias regiones de la mancha de tejido. La intensidad (I) se clasificó del siguiente modo: 0 = sin detección, 1 = moderada, 2 = tinción intensa. Para el análisis estadístico, la puntuación inmunorreactiva (IRS, por sus siglas en inglés) se calculó de la siguiente manera: IRS = I x POS; valor mínimo = 0, valor máximo = 6 (Tabla 2).

Tabla 2: Parámetros de puntuación para la cuantificación de la tinción de BMMF Rep en losTMA

Positividad

Intensidad (proporción

Diana (Intensidad de células

de tinción, I) í PO S

positivas,

POS)

] 0 sin detección 0 0

1 modera 1 1 -10 %

2 fuerte

I3 > 31 % '

IRS = I x POS

IRS = puntuación inmunorreactiva

Usando estos criterios de puntuación las muestras de tejido peritumoral (16 pacientes) basadas en la tinción de BMMF1 Rep fueron:

12 % negativo (IRS 0).

88 % positivo (al menos IRS 1) [con 44 % significativamente positivo = al menos IRS 2].

Estos resultados se muestran como diagramas de barras en la Fig. 5

Resumen de la secuencia

Referencias:

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Claims (6)

REIVINDICACIONES

1. Usoin vitrode la proteína Rep del Grupo 1 de Factores de la Carne y la Leche Bovina (BMMF1) como biomarcador del cáncer de mama, en donde la proteína Rep es una proteína Rep codificada en el genoma MSBI1 (MSBI1 Rep) codificada por MSBI1.176 que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID NO: 1, una proteína Rep codificada en el genoma MSBI2 (MSBI2 Rep, por sus siglas en inglés) codificada por MSBI2.176 que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID NO: 8, una proteína Rep codificada en el genoma CMI1 (CMI1 Rep, por sus siglas en inglés) codificada por CMI1.252 que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID NO: 10, una proteína Rep codificada en el genoma CMI2 (CMI2 Rep, por sus siglas en inglés) codificada por CMI2.214 que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID NO: 11 o una proteína Rep codificada en el genoma CMI3 (CMI3 Rep, por sus siglas en inglés) codificada por CMI3.168 que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID NO: 12, o una variante de la proteína con la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 8 con una homología de al menos 90 %, en donde la variante tiene una o más deleciones, sustituciones o adiciones de aminoácidos y es capaz de unir un anticuerpo anti-Rep específico para una proteína Rep que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 8.

2. Un métodoin vitropara proporcionar un diagnóstico o predisposición para el cáncer de mama en un sujeto, que comprende el paso de detectar la proteína Rep en una muestra de un sujeto mediante anticuerpos anti-Rep, en donde los anticuerpos anti-Rep son específicos para MSBI1 Rep, MSBI2 Rep, CMI1 Rep, CMI2 Rep y/o CMI3 Rep de acuerdo con la reivindicación 1, o para la variante de la proteína con la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 8 con una homología de al menos 90 %, en donde la variante tiene una o más deleciones, sustituciones o adiciones de aminoácidos y es capaz de unir un anticuerpo anti-Rep específico para una proteína Rep que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 8.

3. El métodoin vitrode la reivindicación 2, en donde los anticuerpos anti-Rep se unen a un epítopo que se encuentra dentro de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los aminoácidos de 1 a 136, de 137 a 229 y de 230 a 324 de la SEQ ID NO: 1.

4. El métodoin vitrode acuerdo con la reivindicación 2 o 3, en donde el anticuerpo específico para la proteína Rep se une a un epítopo comprendido por la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 3.

5. El métodoin vitrode acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en donde la muestra de un sujeto se selecciona del grupo que consiste en un tejido mamario canceroso, tejido periférico que rodea al tejido canceroso, hiperplasia (benigna).

6. El métodoin vitrode acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en donde adicionalmente se detectan células CD68 positivas en la muestra por un anticuerpo anti-CD68.