ES3040200T3

ES3040200T3 - Inhibitors of mechanotransduction to treat pain and modulate touch perception

Info

Publication number: ES3040200T3
Application number: ES17829611T
Authority: ES
Inventors: Gary Richard Lewin; Kathryn Anne Poole; Christiane Wetzel; Liudmila Lapatsina
Original assignee: Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft
Current assignee: Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft
Priority date: 2016-12-07
Filing date: 2017-12-07
Publication date: 2025-10-29
Anticipated expiration: 2037-12-07
Also published as: US20190382386A1; WO2018104479A1; EP3551183B1; EP3551183A1; EP3551183C0; US11384071B2

Abstract

La invención se refiere a compuestos químicos útiles como inhibidores de la mecanotransducción en el tratamiento del dolor y la modulación de la percepción táctil. La invención también se refiere a la administración tópica de los compuestos aquí descritos para el tratamiento del dolor y la modulación de la percepción táctil. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Inhibidores de la mecanotransducción para tratar el dolor y modular la percepción táctil

La invención se refiere a compuestos químicos que son útiles como inhibidores de la mecanotransducción en el tratamiento del dolor y la modulación de la percepción táctil. La invención se refiere además a la administración tópica de los compuestos descritos en el presente documento en el tratamiento del dolor y la modulación de la percepción táctil.

Antecedentes de la invención

Toda sensación cutánea comienza con la transformación de un estímulo físico en una señal eléctrica denominada potencial receptor. El potencial receptor se codifica como potenciales de acción (PA), que transmiten información al cerebro para iniciar la percepción1. En la actualidad no se dispone de agentes farmacológicos que modulen el primer paso en la transformación de los estímulos táctiles en una señal eléctrica, un proceso denominado mecanotransducción sensorial.

Se ha demostrado que tanto el canal iónico mecanosensible Piezo2 como su modulador STOML32 son necesarios para que los mecanorreceptores transduzcan el tacto leve3-6. Paradójicamente, en condiciones fisiopatológicas, el tacto leve también puede desencadenar dolor intenso78, por ejemplo, tras una lesión nerviosa traumática9. En ratones mutantesStoml3-/-no se observó dolor inducido por el tacto debido a lesiones nerviosas6. STOML3 es un regulador endógeno de la sensibilidad de los canales iónicos mecanosensibles como Piezo en las neuronas sensoriales y la autoasociación de STOML3 parece ser necesaria para esta función1011.

Cristina Picci ("Exploitation of New Pharmacological Targets for Neuropathic Pain Relief", enero de 2014, XP055357989) describe moléculas pequeñas para su uso como inhibidores de STOML3 sin ninguna enseñanza o sugerencia de su estructura.

Pratimaet al.,(Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2014, vol. 24, n.° 10, p. 2251-2255) divulga derivados de benzofurano para su uso contra la inflamación, pero no menciona el tratamiento del dolor ni la modulación de la percepción táctil.

El documento US 2015/297602 divulga derivados de triazino[5,6-b]indol para su uso contra la infección por el virus del papiloma, pero no menciona el tratamiento del dolor ni la modulación de la percepción táctil.

Los compuestos OB-1 y OB-2 están divulgados por Chemical Abstracts Service (Chemical Library: Otava: "300803 69-4", n.° de acceso de STN 300803-69-4; número de acceso de la base de datos 300803-69-4; Chemical Library: Chemical Block Ltd.: "300689-25-2", n.° de acceso de STN 300689-25-2; número de acceso de la base de datos 300689-25-2), que no menciona el tratamiento del dolor ni la modulación de la percepción táctil.

Wetzelet al., (Nature Neuroscience,2016, vol. 20 n.° 2, p. 209-218) divulga la inhibición de STOML3 con moléculas pequeñas.

A la luz de la técnica anterior, sigue existiendo una necesidad significativa en la técnica de proporcionar medios adicionales para la inhibición de la mecanotransducción, para el tratamiento del dolor y la modulación de la percepción táctil.

Sumario de la invención

La presente invención se define por las reivindicaciones independientes.

Las reivindicaciones dependientes describen otras realizaciones de la invención.

Cualquier realización que no quede bajo el alcance de las reivindicaciones adjuntas no forma parte de la invención. Las referencias a los métodos de tratamiento en los párrafos posteriores de la presente descripción han de interpretarse como referencias a los compuestos, las composiciones farmacéuticas y los medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante tratamiento (o para diagnóstico).

La presente invención proporciona compuestos capaces de interrumpir la autoasociación y la función de STOML3, y pueden utilizarse para tratar el dolor, en particular, el dolor inducido por el tacto, y modulan la función de los receptores táctiles en condiciones normales y fisiopatológicas.

El dominio estomatina de la proteína STOML3 es necesario para la función normal de esta proteína en el mantenimiento de la mecanosensibilidad de los receptores táctiles de la piel. La presente invención proporciona moléculas pequeñas que inhiben la oligomerización del dominio estomatina y bloquean la función del receptor táctil. El bloqueo de los receptores del tacto y el dolor es una estrategia eficaz para tratar el dolor neuropático e inflamatorio. Los inventores demuestran que los compuestos descritos en el presente documento ejercen antagonismo de la función de STOML3 como resultado de su unión a una superficie de contacto intermolecular específica que media la autoasociación de STOML3. Los compuestos pueden bloquear la mecanotransducción y la mecanosensibilidad de los aferentes sensoriales. Los compuestos descritos en el presente documento son un ejemplo de una estrategia química novedosa para tratar una amplia variedad de afecciones dolorosas, incluido el dolor neuropático e inflamatorio.

Por lo tanto, la presente invención se refiere a inhibidores de molécula pequeña de la oligomerización de STOML3. Los inhibidores reducen de forma reversible la sensibilidad de las corrientes mecánicas en las neuronas sensoriales y silencian los mecanorreceptores. Los inhibidores de STOML3 descritos en el presente documento son capaces de atenuar reversiblemente la percepción del tacto en la piel de los sujetos.

En condiciones fisiopatológicas, por ejemplo, tras una lesión nerviosa o una neuropatía diabética, el más mínimo roce puede provocar un dolor intenso, y en estas condiciones se demuestra en el presente documento que los inhibidores de STOML3 pueden revertir la hipersensibilidad mecánica. Por tanto, los compuestos de la presente invención pueden administrarse, ya sea de forma sistémica o, preferentemente, local, por ejemplo, en la piel u otra superficie mucosa de un sujeto, para modular específicamente el tacto y/o la percepción sensorial. Los compuestos descritos en el presente documento representan medios para tratar preferentemente el dolor de origen táctil, tal como en el dolor neuropático, además de medios para la modulación de la percepción táctil en un sujeto.

El dolor neuropático suele ser muy difícil de tratar y el principal medicamento que se ha utilizado y se utiliza en la clínica es la gabapentina y la pregabalina (Lyrica). Este fármaco es eficaz para tratar los síntomas graves del dolor neuropático, pero solo en un pequeño subgrupo de pacientes. Se cree que este fármaco actúa modulando los canales de calcio en los terminales presinápticos de las aferencias sensoriales dentro de la médula espinal. El lugar de acción en el SNC de este fármaco se asocia con una variedad de efectos secundarios de origen en el sistema nervioso central.

Los fármacos que actúan para inhibir la mecanotransducción en la periferia tienen la ventaja de que no tienen que penetrar en el SNC para ser eficaces. Se prevé que el tratamiento descrito por la presente invención sea sintomático en el sentido de que es la activación periférica de los mecanorreceptores y los receptores del dolor lo que siempre desencadena los síntomas. Al reducir dichas señales, la presente invención permite un tratamiento sintomático eficaz. El origen fisiopatológico del dolor neuropático es muy diverso, lo que significa que un tratamiento dirigido a los síntomas (la estimulación mecánica desencadena la activación de las fibras sensoriales que inician el dolor) tiene altas probabilidades de éxito en cualquier paciente con dolor neuropático, independientemente del origen fisiopatológico del trastorno. Por lo tanto, los compuestos de la invención son capaces de reducir los efectos secundarios en comparación con los compuestos de acción central debido a su lugar de acción local en la periferia.

Los compuestos de la presente invención de acuerdo con las Fórmulas I-IX y, en particular, de acuerdo con OB-1, OB-2, MDC-D38, MDC-D30 y MDC-D33 representan medios eficaces en el tratamiento del dolor y la modulación de la percepción táctil. A pesar de las diferencias estructurales de los compuestos descritos en el presente documento, los compuestos de la invención representan materia objeto unitaria, ya que todos ellos se definen por la característica común de un inhibidor de la mecanotransducción de molécula pequeña que afecta directamente a la oligomerización y la función de STOML3. Según el conocimiento de los inventores, en la actualidad, no se conocen en la técnica inhibidores de molécula pequeña eficaces de esta naturaleza. Las características mecánicas y/o funcionales comunes de los compuestos descritos en el presente documento son novedosas y totalmente inesperadas. Los elementos estructurales comunes de los compuestos de acuerdo con las Fórmulas I-IX en el contexto de su función en el tratamiento del dolor y la modulación de la percepción táctil también representan características potencialmente unificadoras.

Se han divulgado previamente compuestos de estructura similar a la Fórmula I como agentes antiinflamatorios (Pratimaet al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters,2014, vol. 24, n.° 10, págs. 2251-2255). Los compuestos de estructura similar a la Fórmula III se han divulgado previamente como medios para inhibir las infecciones víricas por VPH (documento US 2015/0297602). No es evidente en la técnica que los compuestos descritos en el presente documento puedan ser adecuados para el tratamiento del dolor y la modulación de la percepción táctil.

A la luz de la técnica anterior, el problema técnico subyacente a la presente invención es proporcionar medios alternativos y/o mejorados para el tratamiento del dolor y/o para la modulación de la percepción táctil.

Este problema se resuelve por las características de las reivindicaciones independientes. Las realizaciones preferidas de la presente invención se proporcionan mediante las reivindicaciones dependientes.

La invención, por lo tanto, se refiere a un compuesto para el uso como medicamento en el tratamiento del dolor de acuerdo con la Fórmula I, en donde dicho dolor es dolor neuropático, o está inducido por y/o asociado con la estimulación táctil, o en donde el sujeto de tratamiento presenta neuropatía diabética dolorosa,

Fórmula I

en donde

R1= heterociclo aromático de 5 miembros, que comprende uno o más de N, O y/o S, opcionalmente sustituido con Yx, en donde x = 0, 1,2, 3, en donde Y puede ser igual o diferente, y en donde Y es nitro o alquilo C1-C7;

R2= H;

R3= H, alquilo C1-C7;

R4= fenilo, opcionalmente sustituido con uno o más halógenos.

También se divulga en el presente documento un compuesto para su uso como medicamento en el tratamiento del dolor de acuerdo con la Fórmula I,

Fórmula I

en donde

R1= heterociclo aromático de 5 miembros, que comprende uno o más de N, O y/o S, opcionalmente sustituido con Yx, en donde x = 0, 1, 2, 3, en donde Y puede ser igual o diferente, y en donde Y es nitro, halógeno (preferentemente Br, Cl o F), alquilo C1-C7 (preferentemente C1-C5 o C1-C3), alcoxi, opcionalmente sustituido con halógeno (preferentemente Br, Cl o F);

R2= puede ser igual o diferente, H, halógeno (preferentemente Br, Cl o F), alquilo C1-C7 (preferentemente C1-C5 o C1-C3), alcoxi;

R3= H, alquilo C1-C7 (preferentemente C1-C5 o C1-C3), cicloalquilo, alcoxi, arilo, opcionalmente sustituido con uno o más halógenos (preferentemente Br, Cl o F);

R4= H, alquilo C1-C7 (preferentemente C1-C5 o C1-C3), cicloalquilo, alcoxi, arilo, opcionalmente sustituido con uno o más halógenos (preferentemente Br, Cl o F).

Según el conocimiento de los inventores, los compuestos de Fórmula I descritos anteriormente no se han descrito previamente en el contexto del tratamiento del dolor. Los compuestos comprendidos en la Fórmula I están relacionados estructuralmente con el compuesto OB-1, que ha demostrado ser un inhibidor de la oligomerización y función de STOML3 tanto en ratones como en seres humanos, y es un inhibidor de las corrientes mecanosensibles, permitiendo así el tratamiento del dolor y la modulación de la percepción táctil en los sujetos. Según el conocimiento de los inventores, no existe ninguna sugerencia evidente en la técnica de que los compuestos de acuerdo con la Fórmula I presenten tales propiedades.

También se divulga en el presente documento un compuesto para su uso como medicamento de acuerdo con la Fórmula I-a,

Fórmula I-a

en donde

R1= heterociclo aromático de 5 miembros, que comprende 1-2 átomos de N,

opcionalmente sustituido con Yx, en donde x = 0, 1,2, 3, en donde Y puede ser igual o diferente, y en donde Y es nitro, halógeno (preferentemente Br, Cl o F), alquilo C1-C7 (preferentemente C1-C5 o C1-C3), opcionalmente sustituido con halógeno (preferentemente Br, Cl o F);

R2 = H,

R3= H, alquilo C1-C7 (preferentemente C1-C5 o C1-C3), opcionalmente sustituido con uno o más halógenos (preferentemente Br, Cl o F),

R4= H, alquilo C1-C7 (preferentemente C1-C5 o C1-C3), cicloalquilo, arilo, opcionalmente sustituido con uno o más halógenos (preferentemente Br, Cl o F).

La Fórmula I-a mencionada anteriormente representa un conjunto preferido de sustituyentes para cada uno de R1 a R4 para la Fórmula I. En algunas realizaciones de la invención, para cualquier realización de Fórmula I, los sustituyentes alquilo C1-C7, cicloalquilo y/o alcoxi, por ejemplo, la totalidad de dichos grupos de la realización, preferentemente alquilo, es C1-C5 o C1-C3, por lo que los sustituyentes restantes de la realización permanecen como se ha descrito anteriormente. Sin desear quedar ligados a teoría alguna, si se han de tener en cuenta restricciones estéricas en algunas realizaciones, pueden preferirse las cadenas laterales más pequeñas. En realizaciones adicionales, para cualquier realización de Fórmula I, uno o más halógenos, por ejemplo, todos los halógenos de la realización, es Br, Cl o F, por lo que los sustituyentes restantes de la realización permanecen como se ha descrito anteriormente. De acuerdo con la invención, en la Fórmula I, arilo es fenilo, por lo que los sustituyentes restantes de la realización permanecen como se ha descrito anteriormente.

En una realización, el compuesto para el uso descrito en el presente documento es de acuerdo con la Fórmula II,

Fórmula II

en donde

R2 = H;

R3= H, alquilo C1-C7;

R4= fenilo, opcionalmente sustituido con uno o más halógenos

R5= nitro;

R6 = H;

R7= H, alquilo C1-C7.

También se divulga en el presente documento un compuesto para su uso como medicamento como se describe en el presente documento, de acuerdo con la Fórmula II,

Fórmula II

en donde

R4= H, alquilo C1-C7 (preferentemente C1-C5 o C1-C3), cicloalquilo, alcoxi, arilo, opcionalmente sustituido con uno o más halógenos (preferentemente Br, Cl o F);

R5= H, nitro, halógeno (preferentemente Br, Cl o F), alquilo C1-C7 (preferentemente C1-C5 o C1-C3), cicloalquilo, alcoxi, opcionalmente sustituido con uno o más halógenos (preferentemente Br, Cl o F);

R6= H, halógeno (preferentemente Br, Cl o F), alquilo C1-C7 (preferentemente C1-C5 o C1-C3), cicloalquilo, alcoxi, opcionalmente sustituido con uno o más halógenos (preferentemente Br, Cl o F);

R7= H, alquilo C1-C7 (preferentemente C1-C5 o C1-C3), cicloalquilo, opcionalmente sustituido con uno o más halógenos (preferentemente Br, Cl o F).

Los compuestos comprendidos en la Fórmula II están relacionados estructuralmente con el compuesto OB-1, que ha demostrado ser un inhibidor de la oligomerización y función de STOML3 tanto en ratones como en seres humanos, y es un inhibidor de las corrientes mecanosensibles, permitiendo así el tratamiento del dolor y la modulación de la percepción táctil en los sujetos. No parece haber ninguna sugerencia en la técnica de que los compuestos de Fórmula II, similares a los de la Fórmula I, pero caracterizados por el heterociclo de 5 miembros en la posición R1 de Fórmula I, presentaría las propiedades deseadas.

También se divulga en el presente documento un compuesto para su uso como medicamento de acuerdo con la Fórmula II-a,

Fórmula II-a

en donde

R2 = H,

R5= H, nitro, halógeno (preferentemente Br, Cl o F), alquilo C1-C7 (preferentemente C1-C5 o C1-C3), opcionalmente sustituido con uno o más halógenos (preferentemente Br, Cl o F), lo más preferentemente nitro;

R6= H, halógeno (preferentemente Br, Cl o F), alquilo C1-C7 (preferentemente C1-C5 o C1-C3), opcionalmente sustituido con uno o más halógenos (preferentemente Br, Cl o F);

R7= H, alquilo C1-C7 (preferentemente C1-C5 o C1-C3), opcionalmente sustituido con uno o más halógenos (preferentemente Br, Cl o F).

La Fórmula II-a mencionada representa un conjunto preferido de sustituyentes para cada uno de R2 a R7 para la Fórmula II. En algunas realizaciones de la invención, para cualquier realización de la Fórmula II, los sustituyentes alquilo C1-C7, cicloalquilo y/o alcoxi, por ejemplo, la totalidad de dichos grupos de la realización, preferentemente alquilo, es C1-C5 o C1-C3, por lo que los sustituyentes restantes de la realización permanecen como se ha descrito anteriormente. Sin desear quedar ligados a teoría alguna, si se han de tener en cuenta restricciones estéricas en algunas realizaciones, pueden preferirse las cadenas laterales más pequeñas. En realizaciones adicionales, para cualquier realización de la Fórmula II, uno o más halógenos, por ejemplo, todos los halógenos de la realización, es Br, Cl o F, por lo que los sustituyentes restantes de la realización permanecen como se ha descrito anteriormente. De acuerdo con la invención, en la Fórmula II, arilo es fenilo, por lo que los sustituyentes restantes de la realización permanecen como se ha descrito anteriormente.

Para los fines de la presente invención, se prefieren las siguientes características junto con una cualquiera de las anteriores realizaciones de Fórmula I o II, o en algunas realizaciones se pueden combinar dos o más de las siguientes características, preferentemente con el resto de los sustituyentes como se ha descrito anteriormente para cualquier realización dada de la Fórmula I o II, para llegar a las realizaciones de la materia objeto de la presente invención: - En una realización preferida de la Fórmula I descrita en el presente documento, el heterociclo aromático de 5 miembros de R1 es un grupo imidazol opcionalmente sustituido, de modo que el resto de los sustituyentes son preferentemente como se ha descrito anteriormente para cualquier realización de la Fórmula I;

- En una realización preferida de la Fórmula I y/o la Fórmula II descritas en el presente documento, el sustituyente Y de la Fórmula I o R5, R6 y R7 de la Fórmula II comprenden al menos un sustituyente nitro, de modo que el resto de los sustituyentes son preferentemente los descritos anteriormente para la Fórmula I o II;

- En una realización preferida de la Fórmula I y/o la Fórmula II descritas en el presente documento, el sustituyente Y de la Fórmula I o R5, R6 y R7 de la Fórmula II comprenden al menos un sustituyente nitro, un alquilo C1 y un H, de modo que el resto de los sustituyentes son preferentemente los descritos anteriormente para la Fórmula I o II; - De acuerdo con la invención, en la Fórmula II como se describe en el presente documento, R5 es nitro, de modo que el resto de los sustituyentes son preferentemente los descritos anteriormente para la Fórmula II;

- En una realización preferida de la Fórmula II descrita en el presente documento, R5 es nitro, R7 es CH3, y R6 es preferentemente H, de modo que el resto de los sustituyentes son preferentemente los descritos anteriormente para la Fórmula II;

- De acuerdo con la invención, en la Fórmula I como se describe en el presente documento, R2 esH,de modo que el resto de los sustituyentes son preferentemente los descritos en la Fórmula I anterior;

- En una realización preferida de la Fórmula I y/o la Fórmula II descritas en el presente documento, R3 es alquilo C1-C7, C1-C5 o C1, C2 o C3, preferentemente alquilo C2, de modo que el resto de los sustituyentes son preferentemente los descritos en las Fórmulas I y/o II anteriores; y/o

- De acuerdo con la invención, en la Fórmula I y/o en la Fórmula II, como se describen en el presente documento, R4 es fenilo, de modo que el resto de los sustituyentes son preferentemente los descritos en las Fórmulas I y/o II anteriores.

En una realización de la invención, el compuesto de Fórmula I o II es:

Un aspecto adicional de la invención se refiere a un compuesto de acuerdo con la Fórmula V:

Fórmula V

en donde

R2= H;

R3= H, alquilo C1-C7;

R8= puede ser igual o diferente, H, halógeno (preferentemente CI), en donde al menos uno de R8 es halógeno. También se describe en el presente documento un compuesto, preferentemente para su uso como medicamento, como se describe en el presente documento, de acuerdo con la Fórmula V:

Fórmula V

en donde

R1= heterociclo aromático de 5 miembros, que comprende uno o más de N, O y/o S, opcionalmente sustituido con Yx, en donde x = 0 , 1, 2, 3, en donde Y puede ser igual o diferente, y en donde Y es nitro, halógeno (preferentemente Br, Cl o F), alquilo C1-C7 (preferentemente C1-C5 o C1-C3), alcoxi, opcionalmente sustituido con halógeno (preferentemente Br, Cl o F);

R8= puede ser igual o diferente, H, halógeno (preferentemente CI), en donde al menos uno de R8 es halógeno. En una realización, el compuesto de Fórmula V se caracteriza por los siguientes sustituyentes:

R1= heterociclo aromático de 5 miembros, que comprende 1-2 átomos de N,

opcionalmente sustituido con Yx, en donde x = 0, 1, 2, 3, en donde Y puede ser igual o diferente, y en donde Y es nitro, halógeno (preferentemente Br, Cl o F), alquilo C1-C7 (preferentemente C1-C5 o C1-C3), opcionalmente sustituido con halógeno (preferentemente Br, Cl o F);

R2= H,

R8= puede ser igual o diferente, H, halógeno (preferentemente CI), en donde al menos uno de R8 es halógeno. En una realización, el compuesto es conforme a la Fórmula VI:

Fórmula VI

en donde

R2= H;

R3 = H, alquilo C1-C7;

R5 = nitro;

R6 = H;

R7 = CH3;

R8 = puede ser igual o diferente, H, halógeno (preferentemente CI), en donde al menos uno de R8 es halógeno. También se describe en el presente documento un compuesto, preferentemente para su uso como medicamento, como se describe en el presente documento, de acuerdo con la Fórmula VI:

Fórmula VI

en donde

R2 = puede ser igual o diferente, H, halógeno (preferentemente Br, Cl o F), alquilo C1-C7 (preferentemente C1-C5 o C1-C3), alcoxi;

R3 = H, alquilo C1-C7 (preferentemente C1-C5 o C1-C3), cicloalquilo, alcoxi, arilo, opcionalmente sustituido con uno o más halógenos (preferentemente Br, Cl o F);

R5 = H, nitro, halógeno (preferentemente Br, Cl o F), alquilo C1-C7 (preferentemente C1-C5 o C1-C3), cicloalquilo, alcoxi, opcionalmente sustituido con uno o más halógenos (preferentemente Br, Cl o F);

R6 = H, halógeno (preferentemente Br, Cl o F), alquilo C1-C7 (preferentemente C1-C5 o C1-C3), cicloalquilo, alcoxi, opcionalmente sustituido con uno o más halógenos (preferentemente Br, Cl o F);

R7 = H, alquilo C1-C7 (preferentemente C1-C5 o C1-C3), cicloalquilo, opcionalmente sustituido con uno o más halógenos (preferentemente Br, Cl o F),

R8 = puede ser igual o diferente, H, halógeno (preferentemente CI), en donde al menos uno de R8 es halógeno. En el presente documento, se divulga también un compuesto de Fórmula VI, caracterizado por los siguientes sustituyentes:

R2 = H,

R3 = H, alquilo C1-C7 (preferentemente C1-C5 o C1-C3), opcionalmente sustituido con uno o más halógenos (preferentemente Br, Cl o F),

R5 = H, nitro, halógeno (preferentemente Br, Cl o F), alquilo C1-C7 (preferentemente C1-C5 o C1-C3), opcionalmente sustituido con uno o más halógenos (preferentemente Br, Cl o F), lo más preferentemente nitro; R6 = H, halógeno (preferentemente Br, Cl o F), alquilo C1-C7 (preferentemente C1-C5 o C1-C3), opcionalmente sustituido con uno o más halógenos (preferentemente Br, Cl o F);

R7 = H, alquilo C1-C7 (preferentemente C1-C5 o C1-C3), opcionalmente sustituido con uno o más halógenos (preferentemente Br, Cl o F),

R8 = puede ser igual o diferente, H, halógeno (preferentemente CI), en donde al menos uno de R8 es halógeno. También se describe en el presente documento un compuesto, preferentemente para su uso como medicamento, como se describe en el presente documento, de acuerdo con la Fórmula VII:

Fórmula VII

en donde

R8= puede ser igual o diferente, H, halógeno (preferentemente CI), en donde al menos uno de R8 es halógeno. En una realización, el compuesto de la invención es de acuerdo con la Fórmula VII, caracterizado por los siguientes sustituyentes:

R2= H,

R3= H, alquilo C1-C7 (preferentemente C2),

R8= puede ser igual o diferente, H, halógeno (preferentemente CI), en donde al menos uno de R8 es halógeno. Un aspecto adicional de la invención se refiere a un compuesto de acuerdo con la Fórmula I:

Fórmula I

en donde

R1= heterociclo aromático de 5 miembros, que comprende al menos un N y al menos un S;

R2= H;

R3= H, alquilo C1-C7;

R4= arilo, opcionalmente sustituido con uno o más halógenos (preferentemente Br, Cl o F).

También se describe en el presente documento un compuesto, preferentemente para su uso como medicamento, como se describe en el presente documento, de acuerdo con la Fórmula I:

Fórmula I

en donde

R1= heterociclo aromático de 5 miembros, que comprende al menos un N y al menos un S (preferentemente un N y un S),

opcionalmente sustituido con Yx, en donde x = 0, 1,2, 3, en donde Y puede ser igual o diferente, y en donde Y es nitro, halógeno (preferentemente Br, Cl o F), alquilo C1-C7 (preferentemente C1-C5 o C1-C3), alcoxi, opcionalmente sustituido con halógeno (preferentemente Br, Cl o F);

En una realización, el compuesto de Fórmula I se caracteriza por los siguientes sustituyentes:

R1= heterociclo aromático de 5 miembros, que comprende un N y un S,

R2= H,

También se describe en el presente documento un compuesto, preferentemente para su uso como medicamento, como se describe en el presente documento, de acuerdo con la Fórmula VIII:

Fórmula VIII

en donde

En el presente documento, se divulga también un compuesto de Fórmula VIII, caracterizado por los siguientes sustituyentes:

R2= H,

En una realización, el compuesto de Fórmula I es de acuerdo con la Fórmula IX:

Fórmula IX

en donde

R2 = H;

R3= H, alquilo C1-C7;

R8= puede ser igual o diferente, H, halógeno (preferentemente CI), preferentemente, en donde al menos uno de R8 es halógeno.

También se describe en el presente documento un compuesto, preferentemente para su uso como medicamento, como se describe en el presente documento, de acuerdo con la Fórmula IX:

Fórmula IX

en donde

En una realización, el compuesto de Fórmula IX se caracteriza por los siguientes sustituyentes:

R2 = H,

En realizaciones, en cada una de las Fórmulas I-II y V-lX, R3 es preferentemente alquilo C2.

De acuerdo con la invención, en cada una de las Fórmulas I-II y V-IX, R2 es H.

En una realización de la invención, el compuesto de Fórmula I-II o V-IX es:

La invención se refiere además a los compuestos de Fórmulas I-IX, como se describen en el presente documento, por ejemplo, OB-1, OB-2, MDC-D30, MDC-D34, MDC-D38, para su uso como un medicamento en el tratamiento del dolor, o para su uso en un método de modulación de la percepción táctil.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a un compuesto para su uso como un medicamento en el tratamiento del dolor de acuerdo con la Fórmula IV, en donde dicho dolor es dolor neuropático, o está inducido por y/o asociado con la estimulación táctil, o en donde el sujeto de tratamiento presenta neuropatía diabética dolorosa,

Fórmula IV

en donde

R4= puede ser igual o diferente, H, halógeno, alquilo C1-C7, opcionalmente sustituido con uno o más halógenos, en donde al menos 2 o 3 de R4 son H;

R7= puede ser igual o diferente, H, halógeno, alquilo C1-C7, opcionalmente sustituido con uno o más halógenos, en donde al menos 2 o 3 de R7 son H;

R8= puede ser igual o diferente, H, halógeno, alquilo C1-C7, opcionalmente sustituido con uno o más halógenos, en donde al menos 3 o 4 de R8 son H.

También se divulga en el presente documento un compuesto para su uso como un medicamento en el tratamiento del dolor de acuerdo con la Fórmula III,

Fórmula III

en donde

X= NR6, en donde R6 es H, alquilo C1-C7 (preferentemente C1-C5 o C1-C3), alcoxi, opcionalmente sustituido con uno o más halógenos (preferentemente Br, Cl o F);

R1= puede ser igual o diferente, H, alquilo C1-C7 (preferentemente C1-C5 o C1-C3), opcionalmente sustituido con uno o más halógenos (preferentemente Br, Cl o F);

R2= estructura de anillo de carbono de 5 o 6 miembros,

opcionalmente aromático, opcionalmente sustituido con Zx, en donde x = 0-5, en donde Z puede ser igual o diferente, y en donde Z se selecciona entre halógeno (preferentemente Br, Cl o F), alquilo C1-C7 (preferentemente C1-C5 o C1-C3), alcoxi, en donde Z es opcionalmente sustituido con uno o más halógenos (preferentemente Br, Cl o F);

R3= puede ser igual o diferente, H, alquilo C1-C7 (preferentemente C1-C5 o C1-C3), opcionalmente sustituido con uno o más halógenos (preferentemente Br, Cl o F);

R4= puede ser igual o diferente, H, halógeno (preferentemente Br, Cl o F), alquilo C1-C7 (preferentemente C1-C5 o C1-C3), alcoxi, opcionalmente sustituido con uno o más halógenos (preferentemente Br, Cl o F);

R5= heterociclo aromático de 6 miembros, que comprende uno o más de N, O y/o S, opcionalmente sustituido con Zx, en donde x = 0-5, en donde Z puede ser igual o diferente, y en donde Z se selecciona entre halógeno (preferentemente Br, Cl o F), alquilo C1-C7 (preferentemente C1-C5 o C1-C3), alcoxi, en donde Z es opcionalmente sustituido con uno o más halógenos (preferentemente Br, Cl o F);

Y= C, N.

Según el conocimiento de los inventores, las estructuras descritas anteriormente mediante la Fórmula III no han sido descritas previamente en el contexto del tratamiento del dolor. Los compuestos comprendidos en las Fórmulas III están relacionados estructuralmente con el compuesto OB-2, que ha demostrado ser un inhibidor de la oligomerización y función de STOML3, y es un inhibidor de las corrientes mecanosensibles, permitiendo así el tratamiento del dolor y la modulación de la percepción táctil en los sujetos.

También se divulga en el presente documento un compuesto para su uso como medicamento de acuerdo con la Fórmula III-a,

Fórmula III-a

en donde

X= NR6, en donde R6 es H, alquilo C1-C7 (preferentemente C1-C5 o C1-C3), opcionalmente sustituido con uno o más halógenos (preferentemente Br, Cl o F);

R2= estructura de anillo de carbono de 6 miembros,

opcionalmente aromático, opcionalmente sustituido con Zx, en donde x = 0-5, en donde Z puede ser igual o diferente, y en donde Z se selecciona entre halógeno (preferentemente Br, Cl o F), alquilo C1-C7 (preferentemente C1-C5 o Cl-C3), en donde Z es opcionalmente sustituido con uno o más halógenos (preferentemente Br, Cl o F);

R4= puede ser igual o diferente, H, halógeno (preferentemente Br, Cl o F), alquilo C1-C7 (preferentemente C1-C5 o C1-C3), opcionalmente sustituido con uno o más halógenos (preferentemente Br, Cl o F);

R5= heterociclo aromático de 6 miembros, que comprende 1 o 2 átomos de N, opcionalmente sustituido con Zx, en donde x = 0-5, en donde Z puede ser igual o diferente, y en donde Z se selecciona entre halógeno (preferentemente Br, Cl o F), alquilo C1-C7 (preferentemente C1-C5 o C1-C3), en donde Z es opcionalmente sustituido con uno o más halógenos (preferentemente Br, Cl o F);

Y= C, N, en donde al menos un (preferentemente 2 o 3) Y es N.

La Fórmula III-a mencionada anteriormente representa un conjunto preferido de sustituyentes para cada uno de X, Y y R1 a R5 para la Fórmula III. En algunas realizaciones de la invención, para cualquier realización de la Fórmula IIII, los sustituyentes alquilo C1-C7, cicloalquilo y/o alcoxi, por ejemplo, la totalidad de dichos grupos de la realización, preferentemente alquilo, es C1-C5 o C1-C3, por lo que los sustituyentes restantes de la realización permanecen como se ha descrito anteriormente. Sin desear quedar ligados a teoría alguna, si se han de tener en cuenta restricciones estéricas en algunas realizaciones, pueden preferirse las cadenas laterales más pequeñas. En realizaciones adicionales, para cualquier realización de la Fórmula III, uno o más halógenos, por ejemplo, todos los halógenos de la realización, es Br, Cl o F, por lo que los sustituyentes restantes de la realización permanecen como se ha descrito anteriormente.

En una realización preferida, la invención se refiere a un compuesto para su uso como un medicamento de acuerdo con la Fórmula IV,

en donde

R4= puede ser igual o diferente, H, halógeno (preferentemente Br, Cl o F), alquilo C1-C7 (preferentemente C1-C5 o C1-C3), opcionalmente sustituido con uno o más halógenos (preferentemente Br, Cl o F), en donde preferentemente al menos 2 o 3 de R4 son H;

R7= puede ser igual o diferente, H, halógeno (preferentemente Br, Cl o F), alquilo C1-C7 (preferentemente C1-C5 o C1-C3), opcionalmente sustituido con uno o más halógenos (preferentemente Br, Cl o F), en donde preferentemente al menos 2 o 3 de R7 son H, y preferentemente uno de R7 es CH3;

R8= puede ser igual o diferente, H, halógeno (preferentemente Br, Cl o F), alquilo C1-C7 (preferentemente C1-C5 o C1-C3), opcionalmente sustituido con uno o más halógenos (preferentemente Br, Cl o F), en donde preferentemente al menos 3 o 4 de R8 son H.

Según el conocimiento de los inventores, las estructuras descritas anteriormente mediante la Fórmula IV no han sido descritas previamente en el contexto del tratamiento del dolor. Los compuestos comprendidos en las Fórmulas IV están relacionados estructuralmente con el compuesto OB-2, que ha demostrado ser un inhibidor de la oligomerización y función de STOML3, y es un inhibidor de las corrientes mecanosensibles, permitiendo así el tratamiento del dolor y la modulación de la percepción táctil en los sujetos.

La realización mencionada anteriormente de la Fórmula IV representa una estructura preferida correspondiente a la Fórmula III. En algunas realizaciones de la invención, para cualquier realización de la Fórmula IV, los sustituyentes alquilo C1-C7, cicloalquilo y/o alcoxi, por ejemplo, la totalidad de dichos grupos de la realización, preferentemente alquilo, es C1-C5 o C1-C3, por lo que los sustituyentes restantes de la realización permanecen como se ha descrito anteriormente. Sin desear quedar ligados a teoría alguna, si se han de tener en cuenta restricciones estéricas en algunas realizaciones, pueden preferirse las cadenas laterales más pequeñas. En realizaciones adicionales de la fórmula IV, uno o más halógenos, por ejemplo, todos los halógenos de la realización, es Br, Cl o F, por lo que los sustituyentes restantes de la realización permanecen como se ha descrito anteriormente.

Para los fines de la presente invención, se prefieren las siguientes características junto con una cualquiera de las anteriores realizaciones de Fórmula III o IV, o en algunas realizaciones se pueden combinar dos o más de las siguientes características, preferentemente con el resto de los sustituyentes como se ha descrito anteriormente para cualquier realización dada de la Fórmula III o IV, para llegar a las realizaciones de la materia objeto de la presente invención:

- De acuerdo con la invención, en la Fórmula III como se describe en el presente documento, la estructura de anillo de carbono de 5 o 6 miembros de R2 es un fenilo opcionalmente sustituido, por lo que el resto de los sustituyentes son preferentemente como se ha descrito anteriormente para cualquier realización de la Fórmula III;

- De acuerdo con la invención, en la Fórmula III, los sustituyentes R1 y/o R3 son H, por lo que el resto de los sustituyentes son preferentemente como se ha descrito anteriormente para cualquier realización de la Fórmula III;

- En una realización preferida de la Fórmula III y/o la Fórmula IV descritas en el presente documento, los sustituyentes R4, R7 y/o R8 son H, de modo que el resto de los sustituyentes son preferentemente los descritos anteriormente para la Fórmula III o IV;

- De acuerdo con la invención, en la Fórmula III como se describe en el presente documento, R5 es un anillo de piridina opcionalmente sustituido, preferentemente sustituido con un alquilo C1-C3, preferentemente un sustituyente CH3, de modo que el resto de los sustituyentes son preferentemente los descritos anteriormente para la Fórmula III;

- En una realización preferida de la Fórmula IV descrita en el presente documento, El sustituyente R4 es H, de modo que el resto de los sustituyentes son preferentemente los descritos anteriormente para la Fórmula IV; y/o

- En una realización preferida de la Fórmula IV descrita en el presente documento, El sustituyente R4 es H, R8 es H y un R7 es alquilo C1-C3, y el resto de R7 son H, de modo que el resto de los sustituyentes son preferentemente los descritos anteriormente para la Fórmula IV.

En una realización de la invención, el compuesto de Fórmula III o IV es:

La invención se refiere a un compuesto como se describe en el presente documento para su uso como un medicamento en el tratamiento del dolor. Por lo tanto, la invención también se refiere a un método para la producción de una composición farmacéutica que comprende un compuesto como se describe en el presente documento para el tratamiento del dolor. Por lo tanto, la invención también se refiere a un método para el tratamiento del dolor en un sujeto que lo necesite, que comprende la administración de un compuesto como se describe en el presente documento a un sujeto que lo necesite.

Como se ha mencionado anteriormente, los agentes farmacológicos que modulan el primer paso en la transformación de los estímulos táctiles ligeros en una señal eléctrica, un proceso denominado mecanotransducción sensorial, no están disponibles actualmente.

Los compuestos de la presente invención de acuerdo con las Fórmulas I-IX y, en particular, de acuerdo con OB-1, OB-2, MDC-D38, MDC-D30 y MDC-D33, representan medios eficaces para modular la mecanotransducción sensorial y, por lo tanto, pueden aplicarse en el tratamiento del dolor y la modulación de la percepción táctil. A pesar de las diferencias estructurales de los compuestos descritos en el presente documento, los compuestos de la invención representan materia objeto unitaria, ya que todos ellos se definen por la característica común de un inhibidor de la mecanotransducción de molécula pequeña que afecta directamente a la oligomerización y la función de STOML3. Las características estructurales, mecanísticas y/o funcionales comunes de los compuestos descritos en el presente documento de las Fórmulas I a IV son novedosas y completamente inesperadas.

En una realización preferida, el compuesto descrito en el presente documento para su uso como un medicamento en el tratamiento del dolor, o el método para el tratamiento del dolor, se caracteriza por que dicho dolor es un dolor neuropático.

En una realización preferida, el compuesto descrito en el presente documento para su uso como un medicamento en el tratamiento del dolor, o el método para el tratamiento del dolor, se caracteriza por que dicho dolor es un dolor nociceptivo.

En una realización preferida, el compuesto descrito en el presente documento para su uso como un medicamento en el tratamiento del dolor, o el método para el tratamiento del dolor, se caracteriza por que dicho dolor es inducido por y/o está asociado a la estimulación táctil.

En una realización preferida, el compuesto descrito en el presente documento para su uso como un medicamento en el tratamiento del dolor, o el método para el tratamiento del dolor, se caracteriza por que el sujeto de tratamiento presenta una neuropatía diabética dolorosa.

En una realización preferida del compuesto descrito en el presente documento para su uso como un medicamento en el tratamiento del dolor, o el método para el tratamiento del dolor, se caracteriza por que dicho tratamiento comprende la administración tópica de un compuesto de la invención, o de una composición que comprende dicho compuesto, a un sujeto que lo necesita.

En una realización preferida del compuesto descrito en el presente documento para su uso como un medicamento en el tratamiento del dolor, o el método para el tratamiento del dolor, se caracteriza por que dicho tratamiento comprende la administración local de un compuesto de la invención, por ejemplo, localmente en la región del dolor, o una composición que comprende dicho compuesto, a un sujeto que lo necesita.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método no terapéutico para la modulación de la percepción táctil que comprende la administración de un compuesto de la invención, o una composición que comprende dicho compuesto, a un sujeto. En una realización preferida, la administración se realiza por vía tópica, por ejemplo, en la piel o una superficie mucosa. Esta realización se refiere, por ejemplo, a un uso no médico.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a una composición farmacéutica para su uso como un medicamento en el tratamiento del dolor que comprende uno o más compuestos de la invención, con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Preferentemente la composición es adecuada para la administración tópica. La invención se refiere, además, al uso de los compuestos de la invención en métodosin vitroy/o como herramientas de investigación, por ejemplo, como inhibidores de STOML3.

Descripción detallada de la invención

La invención se refiere a compuestos químicos que son útiles como inhibidores de la mecanotransducción en el tratamiento del dolor y la modulación de la percepción táctil. A continuación, se proporciona con más detalle una descripción de los compuestos reivindicados, la función y los usos de los compuestos de la invención.

La piel está dotada de mecanorreceptores especializados que permiten a los animales percibir contactos leves o incluso una suave brisa. De hecho, algunos mecanorreceptores son capaces de detectar movimientos a escala nanométrica. El movimiento se transforma en señales eléctricas a través de los canales iónicos activados mecánicamente en los terminales mecanorreceptores de la piel. La sensibilidad de los canales iónicos activados mecánicamente Piezo está controlada por la proteína similar a la estomatina 3 (STOML3), que es necesaria para el funcionamiento normal de los mecanorreceptores.

Por lo tanto, la presente invención se refiere a inhibidores de molécula pequeña de la oligomerización de STOML3 que reducen reversiblemente la sensibilidad de las corrientes activadas mecánicamente en neuronas sensoriales y silencian mecanorreceptoresin vivo.Los inhibidores de STOML3 en la piel también atenúan de forma reversible la percepción del tacto fino en ratones normales. En condiciones fisiopatológicas posteriores a una lesión nerviosa o a una neuropatía diabética, el más mínimo contacto puede provocar un dolor intenso, y en estas condiciones se ha demostrado que los inhibidores de STOML3 pueden revertir la hipersensibilidad mecánica. Por tanto, los compuestos de la presente invención pueden administrarse, preferentemente localmente en la piel de un sujeto, para modular específicamente el tacto. Los compuestos descritos en el presente documento representan medios para tratar preferentemente el dolor de origen táctil, tal como en el dolor neuropático.

La presente invención se dirige a los compuestos descritos en el presente documento y a su uso terapéutico y no terapéutico en métodos que comprenden su administración a un sujeto.

Cualquier referencia que se haga en el presente documento a nombres de proteínas o genes murinos pretende referirse explícitamente también a homólogos o análogos humanos, como puede determinarse por un experto en la materia basándose en el análisis funcional, estructural o de secuencia de la molécula relevante.

El término "sujeto" incluye sujetos tanto sujetos humanos como veterinarios. El término "tratamiento" se refiere a una intervención terapéutica que mejora un signo o síntoma de una enfermedad o afección patológica después de haber comenzado a aparecer. Como se describe en el presente documento, el dolor experimentado por un sujeto, incluidas las formas particulares de dolor descritas en el presente documento, se considera una enfermedad o afección patológica que puede mejorarse mediante la administración de los compuestos descritos en el presente documento. El dolor suele considerarse una experiencia sensorial desagradable, por ejemplo, asociada a un daño tisular real o potencial. Para los fines de la invención, el dolor como tal se puede tratar utilizando los compuestos descritos en el presente documento, en donde el dolor puede ser el cuadro clínico por tratar o un síntoma de un cuadro clínico.

Tal como se usa en el presente documento, el término "mejorar", con referencia a una enfermedad o afección patológica, tal como la sensación de dolor en un sujeto, se refiere a cualquier efecto beneficioso dado del tratamiento, tal como una reducción de la intensidad y/o duración del dolor. El efecto beneficioso se puede evidenciar, por ejemplo, por un inicio tardío de los síntomas clínicos de la enfermedad en un sujeto, una reducción en la gravedad de algunos o todos los síntomas clínicos de la enfermedad, una progresión más lenta de la enfermedad, una mejora en la salud general o el bienestar del sujeto, o por otros parámetros bien conocidos en la técnica que son específicos de la enfermedad en particular. Por lo tanto, la presente invención se refiere al alivio del dolor como síntoma de otra enfermedad, o al alivio del dolor como cuadro clínico en sí.

La presente invención abarca tanto el tratamiento terapéutico como el tratamiento profiláctico de un sujeto. Un tratamiento "profiláctico" es un tratamiento administrado a un sujeto que no presenta signos del cuadro clínico o que, preferentemente, presenta indicios de desarrollar o seguir desarrollando un cuadro clínico determinado, con el fin de disminuir el riesgo de desarrollar patologías o síntomas clínicos, tales como el dolor. Una administración profiláctica puede comprender la administración de los compuestos antes de sentir dolor, evitando o reduciendo así la aparición posterior de dolor.

El dolor es el síntoma más común de la enfermedad y la queja más frecuente con la que los pacientes acuden a los médicos. El dolor suele segmentarse en función de su duración (agudo frente a crónico), intensidad (leve, moderada y grave) y el tipo (nociceptiva o neuropática). El tratamiento del dolor, en general, y en particular los tipos específicos de dolor descritos en el presente documento son la materia objeto de la presente invención.

El dolor nociceptivo está causado por la estimulación nociva de los nociceptores (por ejemplo, un pinchazo con una aguja o un pellizco en la piel), que transmiten impulsos a través de vías nerviosas intactas a los nervios espinales y luego al cerebro. El dolor nociceptivo es el tipo de dolor más conocido y está causado por una lesión tisular detectada por nociceptores en el lugar de la lesión. Después de la lesión, el lugar se convierte en una fuente continua de dolor y sensibilidad. Este dolor y esta sensibilidad se consideran dolor nociceptivo "agudo". Este dolor y esta sensibilidad disminuyen gradualmente a medida que avanza la cicatrización y desaparecen cuando esta se completa. Algunos ejemplos de dolor nociceptivo agudo son las intervenciones quirúrgicas (dolor postoperatorio) y las fracturas óseas. Aunque no se produzcan daños permanentes en los nervios, el dolor nociceptivo "crónico" es el resultado de algunas afecciones cuando el dolor se prolonga más allá de seis meses. Entre los ejemplos de dolor nociceptivo crónico se incluye la inflamación, artrosis, artritis reumatoide y afecciones musculoesqueléticas (por ejemplo, dolor de espalda), dolor por cáncer, etc.

La Asociación Internacional para el Estudio del Dolor define el dolor neuropático como "dolor iniciado o causado por una lesión o disfunción primaria del sistema nervioso". El dolor neuropático no está asociado exclusivamente a la estimulación nociceptiva, aunque el paso de los impulsos nerviosos que el cerebro percibe finalmente como dolor es el mismo tanto en el dolor nociceptivo como en el neuropático. La expresión dolor neuropático engloba una amplia gama de síndromes dolorosos de diversas etiologías. Los tres tipos de dolor de naturaleza neuropática más comúnmente diagnosticados son la neuropatía diabética, neuropatía por cáncer y dolor por VIH. Además, el dolor neuropático se diagnostica en pacientes con una amplia gama de otros trastornos, incluida la neuralgia del trigémino, neuralgia posherpética, neuralgia traumática, miembro fantasma, así como una serie de otros trastornos mal definidos o, origen desconocido. El dolor neuropático es una forma de dolor crónico que puede persistir durante semanas, meses, años o décadas después de una lesión o una infección vírica tal como el herpes zóster (culebrilla) y suele ser consecuencia de daños en los nervios periféricos, raíces nerviosas, la médula espinal o determinadas regiones del cerebro. El dolor neuropático está causado por daños en las estructuras neurales, tales como daños en las terminaciones nerviosas periféricas o nociceptores, que se vuelven extremadamente sensibles a la estimulación y pueden generar impulsos en ausencia de estimulación (por ejemplo, dolor por herpes zóster tras la curación de la erupción o dolor por miembro fantasma).

Las lesiones de los nervios periféricos pueden dar lugar a estados patológicos en donde se reduce el umbral del dolor (es decir, alodinia), un aumento de la respuesta a los estímulos nocivos (hiperalgesia), o una duración prolongada de la respuesta (dolor crónico). Existen dos grandes tipos de dolor neuropático: dolor por desaferenciación (causado por la interrupción parcial o completa de la actividad neural central o periférica) y dolor mantenido por simpatía (debido a la actividad simpática eferente) (Véase "Neuropathic Pain", en The Merck Manual, 17.a Ed., M. H. Beers y R. Berkow, eds., Merck Research Laboratories, Whitehouse Station, N.J., 1999, pág. 1371-1372). Algunos ejemplos de dolor neuropático son la neuropatía diabética, neuralgia postherpética y trastornos musculoesqueléticos crónicos.

Una realización preferida de la invención se refiere al tratamiento de la alodinia táctil.

Una realización preferida de la invención se refiere al tratamiento de la neuropatía diabética dolorosa.

Una realización preferida de la invención se refiere al tratamiento del dolor inflamatorio.

Una realización preferida de la invención se refiere al tratamiento del dolor inducido por o asociado con daños en el sistema nervioso, como puede ocurrir en las infecciones víricas, diabetes, quimioterapia o esclerosis múltiple.

La invención se refiere además a métodos para la modulación, preferentemente la inhibición de la modulación de la percepción táctil.

La expresión "percepción táctil" se refiere a la capacidad del sujeto para sentir o registrar estímulos físicos a través de su sistema somatosensorial. El sistema somatosensorial se refiere a un sistema de células nerviosas que responde a cambios en la superficie o el estado interno del cuerpo. Las células nerviosas llamadas "receptores sensoriales" (incluidos los termorreceptores, mecanorreceptores, quimiorreceptores y nociceptores) envían señales a lo largo de una cadena de células nerviosas hasta la médula espinal, donde pueden ser procesadas por otras células nerviosas y, a continuación, retransmitidas al cerebro para su posterior procesamiento. Los receptores sensoriales se encuentran en muchas partes del cuerpo, incluida la piel, tejidos epiteliales, músculos esqueléticos, huesos y articulaciones, órganos internos y el sistema cardiovascular. En realizaciones preferidas, la invención se refiere a métodos para modular la percepción táctil, en particular, con respecto a la modulación de la función mecanorreceptora y/o nociceptora mediante la administración de los compuestos descritos en el presente documento.

Por lo tanto, la presente invención abarca tratamientos no médicos, por ejemplo, que comprenden la administración de un compuesto como el descrito en el presente documento para modular la percepción del tacto en un sujeto sin un trastorno médico, o en casos de administración profiláctica de un compuesto en situaciones en donde no se alcanzan o no se alcanzarán los umbrales del dolor, de forma que no se produzca un cuadro clínico.

Con respecto a los compuestos químicos descritos en el presente documento, el término "alquilo" se refiere a un grupo hidrocarburo saturado ramificado o no ramificado preferentemente de 1 a 7 átomos de carbono, tal como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, w-butilo, isobutilo, f-butilo, pentilo, hexilo, heptilo y similares. Los grupos alquilo preferidos tienen 1-7 átomos de carbono, más preferentemente 1-6, 1-5, 1-4 o 1-3, 2 o 1 átomos de carbono. Uno o varios de los grupos alquilo descritos en el presente documento pueden ser "alquilos sustituidos", en donde uno o más átomos de hidrógeno están sustituidos con un sustituyente tal como halógeno, cicloalquilo, alcoxi, hidroxilo, arilo o carboxilo.

El término "cicloalquilo" se refiere a una configuración derivada de un cicloalcano mediante la eliminación de un átomo de hidrógeno, formando así preferentemente ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo o cicloheptilo, o similares.

El término "alcoxi" se refiere a una configuración de hidrocarburo lineal, ramificada o cíclica y combinaciones de las mismas, incluyendo preferentemente, 1-7 átomos de carbono, más preferentemente 1-6, 1-5, 1-4 o 1-3 átomos de carbono, que incluyen un átomo de oxígeno en el punto de unión (tal como O-alquilo). Un ejemplo de un "grupo alcoxi" está representado por la Fórmula -OR o -ROR, en donde R puede ser un grupo alquilo, opcionalmente sustituido con halógeno, arilo, cicloalquilo, alquilo halogenado. Los grupos alcoxi adecuados incluyen metoxi, etoxi, n-propoxi, ipropoxi, n-butoxi, i-butoxi, sec-butoxi, ciclohexiloxi y similares.

El término "arilo" se refiere a cualquier grupo aromático basado en el carbono, incluyendo, pero sin limitación, benceno, naftaleno y similares. El término "aromático" también incluye "grupo heteroarilo", que se define como un grupo aromático que tiene al menos un heteroátomo incorporado dentro del anillo del grupo aromático. Los ejemplos de heteroátomos incluyen, pero sin limitación, nitrógeno, oxígeno, azufre. El grupo arilo puede estar sustituido por uno o más grupos incluyendo, pero sin limitación, alquilo, arilo, halógeno, nitro, hidroxi, ácido carboxílico o alcoxi, o el grupo arilo puede estar no sustituido.

Los grupos opcionalmente sustituidos, tales como "opcionalmente sustituidos" se refiere a grupos, tales como un grupo alquilo, que, cuando se sustituyen, tienen 1-5 sustituyentes, normalmente 1, 2 o 3 sustituyentes.

La expresión "heterociclo aromático de 5 miembros, que comprende uno o más de N, O y/o S" se refiere a una configuración que comprende una estructura de anillo de 5 miembros que comprende C y uno o más de N, O y/o S, preferentemente seleccionada de una configuración si se elimina un átomo de hidrógeno del furano, pirrol, oxazol, tiofeno, tiazol, pirazol, imidazol y similares.

En algunas realizaciones, el heterociclo aromático de 5 miembros, que comprende uno o más de N, O y/o S, de acuerdo preferentemente con las Fórmulas I, II y/o V, se selecciona de la lista, o un subgrupo de la lista, de la tabla siguiente:

Los heterociclos aromáticos de 5 miembros preferidos anteriormente pueden, preferentemente en el contexto de las realizaciones de las Fórmulas I, II y/o V, sustituirse opcionalmente por Yx, en donde x = 0, 1, 2, 3, en donde Y puede ser igual o diferente, y en donde Y es nitro, halógeno (preferentemente Br, Cl o F), alquilo C1-C7 (preferentemente C1-C5 o C1-C3), alcoxi, opcionalmente sustituido con halógeno (preferentemente Br, Cl o F). Los heterociclos aromáticos de 5 miembros preferidos anteriormente pueden, preferentemente en el contexto de las realizaciones de las Fórmulas I, II y/o V, estar unidos covalentemente (como R1) al O adyacente a R1 a través de cualquier átomo C del heterociclo aromático de 5 miembros. Los cambios correspondientes en la presencia y/o posición de dobles enlaces C=C u otros enlaces heteroaromáticos en los heterociclos aromáticos de 5 miembros pueden ajustarse adecuadamente y son del conocimiento de un experto.

La "estructura de anillo de carbono de 5 o 6 miembros, opcionalmente aromático", como se describe en el presente documento, se refiere preferentemente a un cicloalquilo, estructuras cíclicas no aromáticas de cicloalcanos, tales como ciclopentilo o ciclohexilo y, opcionalmente, a estructuras cíclicas aromáticas, tales como fenilo y similares.

La "estructura de anillo de carbono de 6 miembros, opcionalmente aromático", como se describe en el presente documento, se refiere preferentemente a un cicloalquilo, estructuras cíclicas no aromáticas de cicloalcanos, tales como ciclohexilo, o a estructuras cíclicas aromáticas, tales como fenilo y similares.

El "heterociclo aromático de 6 miembros, que comprende uno o más de N, O y/o S" como se describe en el presente documento se refiere a una configuración que comprende una estructura de anillo de 6 miembros que comprende C y uno o más de N, O y/o S, preferentemente seleccionada de una configuración si se elimina un átomo de hidrógeno de piridina, piridazina, pirimidina, pirazina, pirano, triazina, tiazina, tiopirano, oxazina y similares.

El "heterociclo aromático de 6 miembros, que comprende 1 o 2 átomos de N", como se describe en el presente documento, se refiere a una configuración que comprende una estructura de anillo de 6 miembros que comprende C y 1 o 2 átomos de N, seleccionada preferentemente entre piridina, piridazina, pirimidina, pirazina, triazina, tiazina, oxazina y similares. Los heterociclos preferidos solo comprenden 1 o 2 átomos de N.

Cuando se hace referencia a "alquilo C1-C7 (preferentemente C1-C5 o C1-C3), cicloalquilo, alcoxi, arilo", o similares, el número de átomos de carbono C1-C7 se refiere preferentemente a cada uno de los sustituyentes mencionados, aunque, en algunas realizaciones, los sustituyentes más cortos de C1-C5 o C1-C3 se aplican a los grupos alquilo, cicloalquilo y/o alcoxi, de modo que arilo puede seguir siendo preferentemente C1-C7, tal como fenilo C6.

El término "nitro" se refiere a un grupo -NO2, representado como NO2 o como

También se contemplan derivados protegidos del compuesto divulgado, por ejemplo, para su uso en la síntesis de los compuestos divulgados. Una variedad de grupos protectores convenientes para el uso con los compuestos divulgados se divulga en Greene y Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis"; 3.a Ed.; John Wiley & Sons, Nueva York, 1999. En general, los grupos protectores se retiran en condiciones que no afectarán a la parte restante de la molécula. Estos métodos son bien conocidos en la técnica e incluyen hidrólisis ácida, hidrogenólisis y similares.

Los ejemplos particulares de los compuestos desvelados en el presente documento incluyen uno o más centros asimétricos; por lo tanto, estos compuestos pueden existir en diferentes formas estereoisoméricas. Por consiguiente, los compuestos y las composiciones pueden proporcionarse como enantiómeros puros individuales o como mezclas estereoisoméricas, que incluyen las mezclas racémicas.

Los compuestos de la invención también pueden existir en diversas formas polimorfas, por ejemplo, como formas polimorfas amorfas y cristalinas. Todas las formas polimorfas de los compuestos de la invención pertenecen al marco de la invención y son un aspecto más de la invención.

El compuesto de la invención también puede comprender deuterio sustituyendo al hidrógeno. Esta sustitución puede dar lugar en algunas circunstancias a una mejor estabilidad metabólica (Nature Reviews Drug Discovery 15, 219-221 (2016)).

Se entiende que los sustituyentes y patrones de sustitución de los compuestos descritos en este documento pueden ser seleccionados por una persona con conocimientos habituales en la materia para proporcionar compuestos que sean químicamente estables y que puedan sintetizarse fácilmente mediante técnicas conocidas en la técnica y además mediante los métodos establecidos en esta divulgación.

La presente invención se refiere, además, a sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos descritos en el presente documento. La expresión "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a sales o ésteres de los compuestos descritos en el presente documento preparados por medios convencionales que incluyen sales básicas de ácidos inorgánicos y orgánicos, incluyendo pero sin limitarse a ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido málico, ácido acético, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido láctico, ácido fumárico, ácido succínico, ácido maleico, ácido salicílico, ácido benzoico, ácido fenilacético, ácido mandélico y similares. Cualquier compuesto químico mencionado en esta memoria descriptiva puede administrarse alternativamente como una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. También se incluyen las sales ácidas de bases inorgánicas y orgánicas, incluyendo, pero sin limitación, sodio, potasio, amonio, trietilamina y similares.

Las "sales farmacéuticamente aceptables" también incluyen las formas de ácido libre, base y zwitteriónica. Las descripciones de las sales farmacéuticamente aceptables adecuadas se pueden encontrar en Handbook of Pharmaceutical Salts, Properties, Selection and Use, Wiley VCH (2002). Para su uso terapéutico, las sales de los compuestos son aquellas en donde el contraión es farmacéuticamente aceptable. Sin embargo, las sales de ácidos y bases que no son farmacéuticamente aceptables también pueden encontrar uso, por ejemplo, en la preparación o purificación de un compuesto farmacéuticamente aceptable.

Otro aspecto de la divulgación incluye composiciones farmacéuticas preparadas para administración a un sujeto y que incluyen una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más de los compuestos divulgados en el presente documento. En determinadas realizaciones, las composiciones farmacéuticas son útiles para tratar el dolor. La cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto desvelado dependerá de la vía de administración, la especie del sujeto y las características físicas del sujeto que se está tratando. Los factores específicos que pueden tenerse en cuenta incluyen la gravedad y el estadio de la enfermedad, el peso, la dieta y los medicamentos concurrentes. Los expertos en la materia entienden la relación de estos factores para determinar una cantidad terapéuticamente eficaz de los compuestos desvelados.

Las composiciones farmacéuticas para la administración a un sujeto pueden incluir al menos otro aditivo farmacéuticamente aceptable tales como vehículos, espesantes, diluyentes, tampones, conservantes, agentes tensioactivos y similares además de la molécula de elección. Las composiciones farmacéuticas también pueden incluir uno o más principios activos adicionales tales como agentes antimicrobianos, agentes antiinflamatorios, anestésicos y similares. Los vehículos farmacéuticamente aceptables útiles para estas formulaciones son convencionales. "Remington's Pharmaceutical Sciences", de E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, Pensilvania, 19a Edición (1995), describe composiciones y formulaciones adecuadas para el suministro farmacéutico de los compuestos desvelados en el presente documento.

En general, la naturaleza del portador dependerá del modo particular de administración que se emplee. Por ejemplo, las formulaciones parenterales habitualmente contienen líquidos inyectables que incluyen líquidos farmacéutica y fisiológicamente aceptables tales como agua, solución salina fisiológica, soluciones salinas equilibradas, dextrosa acuosa, glicerol o similares, como vehículo. Para composiciones sólidas (por ejemplo, polvo, píldora, comprimido o cápsula), los excipientes sólidos no tóxicos convencionales pueden incluir, por ejemplo, calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón o estearato de magnesio. Además de los portadores biológicamente neutros, las composiciones farmacéuticas que han de administrarse pueden contener pequeñas cantidades de sustancias adyuvantes no tóxicas, tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes y agentes tampón del pH y similares, por ejemplo, acetato de sodio o monolaurato de sorbitán.

Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse a sujetos mediante una diversidad de modos de administración mucosal, incluyendo administración oral, rectal, intraocular, intranasal, intrapulmonar o transdérmica, o mediante administración tópica a otras superficies. Opcionalmente, las composiciones pueden administrarse por vías no mucosas, incluyendo las vías intramuscular, intraocular, subcutánea, intravenosa, intraarterial, intraarticular, intraperitoneal, intratecal, intracerebroventricular o parenteral.

Las composiciones de la divulgación pueden contener, como alternativa, como sustancias portadoras farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes de ajuste del pH y tampones, agentes de ajuste de la tonicidad, agentes humectantes y similares, por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, monolaurato de sorbitán y oleato de trietanolamina. Para composiciones sólidas, pueden usarse vehículos farmacéuticamente aceptables no tóxicos convencionales que incluyen, por ejemplo, calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio y similares.

En una realización preferida, la invención comprende la administración tópica y/o local de un compuesto como se describe en el presente documento y/o una composición que comprende un compuesto como se describe en el presente documento a un sujeto. La expresión "administración tópica" se refiere a la administración de un agente farmacológicamente activo en la piel o mucosa de un paciente. La administración tópica puede proporcionar un efecto local más que sistémico. Las expresiones "administración tópica" y "administración transdérmica" se utilizan indistintamente para referirse a la administración de un agente farmacológicamente activo en la piel o la mucosa de un paciente para conseguir un efecto terapéutico en el tratamiento o la prevención del dolor o las molestias en el lugar de la administración tópica o transdérmica. Los modos de administración preferidos se refieren a una solución tópica, loción, loción agitada, crema, pomada, gel, espuma, parche transdérmico, polvo, forma sólida, esponja, cinta, pasta o tintura. Las realizaciones preferidas se refieren a cremas, espumas, geles, lociones y pomadas.

Varios aditivos, conocidos por los expertos en la técnica, pueden incluirse en las composiciones tópicas de la presente divulgación. Por ejemplo, se pueden utilizar disolventes, incluidas cantidades relativamente pequeñas de alcohol, para solubilizar un compuesto de la invención. Otros aditivos opcionales incluyen antioxidantes, fragancias, colorante, agentes gelificantes, emulsionantes, agentes espesantes, estabilizantes, tensioactivos, tampones, agentes refrescantes (por ejemplo, mentol) y similares. También pueden añadirse otros agentes, tales como agentes antimicrobianos, para evitar el deterioro durante el almacenamiento, es decir, para inhibir el crecimiento de microbios tales como levaduras y mohos. Algunos ejemplos de agentes antimicrobianos adecuados son los ésteres metílicos y propílicos del ácido p-hidroxibenzoico (es decir, metil y propil parabeno), benzoato de sodio, ácido sórbico, imidurea y similares. Cuando se aplica sobre la piel, una composición tópica de la presente divulgación puede cubrirse con un apósito oclusivo o no oclusivo, que puede ser poroso o no poroso, para proteger la composición de la eliminación mecánica durante el período de tratamiento, por ejemplo, una película de plástico para envolver alimentos u otra película no absorbente. Pueden emplearse diversos revestimientos inertes. Pueden emplearse revestimientos no tejidos o tejidos, especialmente los revestimientos elastoméricos, que permiten el transporte de calor y vapor. Estos revestimientos pueden permitir enfriar la zona dolorida, lo que puede proporcionar un mayor confort, protegiendo al mismo tiempo la composición de la eliminación mecánica.

Las composiciones de la presente divulgación pueden incluirse en un emplasto o parche en contacto con la piel, es decir, un sistema transdérmico, en donde la composición está contenida dentro de un material, p. ej., una capa de reservorio de fármaco, que pueden adherirse a la piel. En determinadas realizaciones, el agente o agentes activos pueden estar contenidos en una capa de reservorio de fármaco subyacente a una capa de soporte superior. El sistema puede contener un único reservorio o puede contener múltiples reservorios. En estos sistemas, el (los) agente(s) activo(s) pueden formularse con el adhesivo utilizado para adherir el sistema a la piel. El sistema puede incluir una capa de soporte que funciona como el elemento estructural primario del sistema transdérmico y puede proporcionar al sistema flexibilidad y, preferentemente, oclusión. El material utilizado para la capa de soporte puede ser inerte e incapaz de absorber los componentes de la composición contenida en el sistema.

Otros métodos de administración se refieren a los empleados para los anestésicos. Considerando la acción de los compuestos descritos en el presente documento, en concreto, la inhibición de la oligomerización de STOML3 y la reducción reversible de la sensibilidad de las corrientes activadas mecánicamente en las neuronas sensoriales, los compuestos como se describen en el presente documento pueden, en algunas realizaciones, ser considerados o utilizados como anestésicos. Un anestésico es un fármaco que provoca una pérdida de sensibilidad (preferentemente reversible). Por ejemplo, los compuestos de la invención pueden considerarse o utilizarse como anestésicos locales, que provocan una pérdida reversible de sensibilidad en una región limitada del cuerpo, en otras palabras, como agentes que impiden la transmisión de los impulsos nerviosos sin causar inconsciencia.

Por ello, los métodos de administración abarcados por la presente invención incluyen, pero sin limitación, anestesia local, dirigida a tratamientos para detener temporalmente la sensación de dolor en una zona concreta del cuerpo, por ejemplo, para una cirugía menor, el compuesto puede administrarse mediante inyección en el lugar que se necesite, anestesia regional, destinada a adormecer eficazmente solo la parte del cuerpo que sufre dolor o que va a recibir, por ejemplo, una intervención quirúrgica, mediante lo que se administra una inyección de compuesto en la zona de los nervios que proporcionan sensibilidad a esa parte del cuerpo. Otros medios de administración se refieren a un anestésico espinal, por ejemplo, como el utilizado para la zona abdominal inferior, pelvis, cirugía rectal o de las extremidades inferiores. También puede contemplarse la administración epidural, mediante la que la epidural es similar a una administración raquídea y se utiliza habitualmente para la cirugía de los miembros inferiores y durante el parto. La epidural también puede utilizarse para intervenciones quirúrgicas torácicas o abdominales.

De acuerdo con los diversos métodos de tratamiento de la divulgación, el compuesto puede administrarse a un sujeto de manera consistente con las metodologías convencionales asociadas al tratamiento del trastorno para el que se busca tratamiento o prevención. De acuerdo con la divulgación en el presente documento, se administra una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz del compuesto y/u otro agente biológicamente activo a un sujeto que necesita dicho tratamiento durante un tiempo y en condiciones suficientes para prevenir, inhibir y/o mejorar una enfermedad o afección seleccionada o uno o más síntoma o síntomas de la misma.

Por "administración de" y "administrar un" compuesto debe entenderse proporcionar un compuesto, un profármaco de un compuesto o una composición farmacéutica como se describe en el presente documento. El compuesto o la composición puede ser administrado por otra persona al sujeto (por ejemplo, por vía intravenosa, gel, crema, pulverizado) o puede ser autoadministrado por el sujeto (p. ej., comprimidos, gel, crema, pulverizado).

El médico tratante puede variar la dosificación para mantener una concentración deseada en un sitio diana (por ejemplo, los pulmones o la circulación sistémica). Pueden seleccionarse concentraciones más altas o más bajas basándose en el modo de administración, por ejemplo, administración transepidérmica, rectal, oral, pulmonar o intranasal frente a la administración intravenosa o subcutánea. La dosificación también puede ajustarse en función de la velocidad de liberación de la formulación administrada, por ejemplo, de un aerosol intrapulmonar frente a polvo, formulaciones de suministro transdérmico o de partículas orales frente inyectadas de liberación sostenida y así sucesivamente.

La presente invención también se refiere a un método de tratamiento de sujetos que padecen los diferentes cuadros clínicos divulgadas en el presente documento. El método de tratamiento comprende preferentemente la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto divulgado en el presente documento a un sujeto que lo necesite.

Una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un agente específico suficiente para lograr un efecto deseado en un sujeto que está siendo tratado con ese agente. Por ejemplo, esta puede ser la cantidad de un compuesto en el presente documento divulgado útil para aliviar el dolor en un sujeto. La cantidad terapéuticamente eficaz o la cantidad diagnósticamente eficaz de un agente dependerá del sujeto tratado, la gravedad del dolor y la forma de administración de la composición terapéutica. Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar una respuesta profiláctica o terapéutica óptima. Una cantidad terapéuticamente eficaz también es una en la cual cualquier efecto secundario tóxico o perjudicial del compuesto y/u otro agente biológicamente activo se ve compensado en términos clínicos por los efectos terapéuticamente beneficiosos. Un intervalo no limitante para una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto y/u otro agente biológicamente activo dentro de los métodos y formulaciones de la divulgación es de aproximadamente 0,001 mg/kg de peso corporal a 50 mg/kg de peso corporal, de 0,01 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, tal como de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal o de aproximadamente 0,2 mg/kg a aproximadamente 2 mg/kg de peso corporal.

La presente divulgación también incluye kits, envases y unidades multirrecipiente que contienen las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento, principios activos y/o medios para administrar los mismos para su uso en la prevención y el tratamiento de enfermedades y otras afecciones en sujetos mamíferos.

Figuras

La invención se describe además por las siguientes figuras. Estas no pretenden limitar el alcance de la invención, sino que representan realizaciones preferidas de aspectos de la invención que se proporcionan para una mayor ilustración.

Breve descripción de las figuras

Figura 1:Cribado de moléculas pequeñas que modulan la oligomerización de STOML3.

Figura 2:Análisis cuantitativo del efecto de los compuestos activos sobre la mecanotransducción.

Figura 3:Los mecanorreceptores pueden silenciarse con tratamiento local con OB-1.

Figura 4:OB-1 reduce la percepción táctil en ratones.

Figura 5:El dolor provocado por el tacto puede tratarse con OB-1.

Figura 6:Regulación de STOML3 en la neuropatía dolorosa.

Figura 7:La inhibición de STOML3 alivia la neuropatía diabética dolorosa.

Figura 8:Efectos de las moléculas moduladoras de STOML3 sobre otras proteínas con dominio estomatina.Figura 9:Niveles de ARNm de Stoml3 tras el tratamiento con inhibidores y análisis cuantitativo de las corrientes activadas mecánicamente.

Figura 10:Efectos del OB-1 sobre las corrientes activadas mecánicamente en neuronas sensoriales de ratón.

Figura 11:OB-1 no tiene efecto sobre las corrientes mediadas por ASIC3, ni la inhibición de ASIC3 por la estomatina.

Figura 12:Los mecanorreceptores no silenciados son funcionales tras el tratamiento con OB-1.

Figura 13:Ultraestructura del nervio ciático tras LCC unilateral y efectos de OB-1.

Figura 14:Tratamiento con OB-1 en otros modelos de dolor.

Figura 15:Generación de las cepas de ratón Stoml3LacZ y Stoml3Strep.

Figura 16:Mediciones conductuales y electrofisiológicas en ratones hembra.

Figura 17:Ensayo TriGFP.

Descripción detallada de las figuras:

Figura 1: Cribado de moléculas pequeñas que modulan la oligomerización de STOML3.

a: Representación esquemática del análisis de BiFC(Bimolecular Fluorescence Complementaron,complementación de fluorescencia bimolecular )de interacciones proteína-proteína utilizado para el cribado de moléculas pequeñas.b: Desarrollo de la señal observado cuando se utilizó STOML3-VC como presa y variantes de STOML3 marcadas con VN que no oligomerizan correctamente como cebo (pendiente normalizada del desarrollo de la señal de BiFC, los datos representan la media ± EEM de triplicados). La pendiente del desarrollo de la señal se utilizó como una medida de la oligomerización (pendiente normalizada del desarrollo de la señal de BiFC, los datos se muestran como la media ± EEM).c: Estructuras de compuestos activos, los bloqueadores de la oligomerización, OB-1 y OB-2.d:e:Se muestra la pendiente normalizada del desarrollo de la señal de BiFC en células que sobreexpresan STOML3 deMus musculusuHomo sapiensen presencia de OB-1 y OB-2; los datos se presentan como la media ± EEMf: Imágenes dSTORM reconstruidas representativas de STOML3-FLAG sobreexpresado en células N2A.g: Distribución del tamaño del dominio STOML3-FLAG detectado mediante imágenes dSTORM. Cada punto de datos representa una única célula; para cada célula se midió el FHWM de 100 dominios elegidos al azar (**p<0,01; ***p<0,001; prueba de latde Student).

Figura 2: Análisis cuantitativo del efecto de los compuestos activos sobre la mecanotransducción.

a:Esquema del análisis por matriz de pilares de la mecanotransducción en células N2A.b: Curvas estímulo-respuesta para N2A tratadas con OB-1 u OB-2; ambos compuestos inhiben significativamente las corrientes mecánicamente activadas en las células N2A (número de células indicado en el gráfico; OB-1 **p <0,01, OB-2 *p<0,05; ANOVA bifactorial).c: Gráfico de Hill de la dependencia de la concentración del efecto de OB-1 sobre la corriente Piezo1 en células N2A, (*p <0,05; prueba de laUde Mann-Whitney; los números indican las células registradas, los datos se muestran como la media de los intervalos individuales ± EEM).d: Esquema del análisis de matriz de pilares de la mecanotransducción en neuronas de los GRD preparadas de forma aguda.e: Curvas estímulo-respuesta para mecanorreceptores tratados con OB-1 u OB-2; ambos compuestos inhiben significativamente las corrientes activadas mecánicamente por desviaciones de los pilares inferiores a 50 nm, OB-1 inhibe significativamente las corrientes activadas por desviaciones de hasta 250 nm (datos presentados como media ± EEM, números de células indicados en el gráfico, OB-1 ***p <0,001, OB-2 ** p<0,01; ANOVA bifactorial).f: Las curvas estímulo-respuesta de los nociceptores tratados con OB-1 inhiben significativamente las corrientes activadas mecánicamente en estas células (los números indican las células registradas, los datos se muestran como la media de los intervalos individuales ± EEM); OB-1 *p<0,05; ANOVA bifactorial).g-i, En presencia de OB-1 no hubo diferencias detectables en los potenciales de acción generados por la inyección de corriente ni en los mecanorreceptores(h)ni en los nociceptores (i) (ns; Prueba de laUde Mann-Whitney (mecanorreceptores), prueba de latde Student; los números indican las neuronas cultivadas registradas; los datos se muestran como la media de los intervalos individuales ± EEM).

Figura 3: Los mecanorreceptores pueden silenciarse con tratamiento local con OB-1.

a:Esquema del protocolo de búsqueda eléctrica. Se utilizó un microelectrodo (~1 MQ) para administrar estímulos eléctricos en dos puntos distantes del tronco del nervio safeno con el fin de rastrear eléctricamente las unidades identificadas hasta sus campos receptivos. Se muestran las proporciones de fibras mecano-/Wsensibles. Tres horas después del tratamiento local con OB-1 (250-500 pmol de OB-1 por pata), se observó un aumento de las fibras Ap /nsensibles mecánicamente; cabe señalar que la mecanosensibilidad se había recuperado 24 h después de la inyección. (***p <0,001; prueba exacta de Fisher; los números indican las fibras registradas).b: se muestra la proporción de cada clase de aferentes mecanosensibles. No se observaron diferencias significativas en las proporciones de los tipos de receptores en las fibras Ap, A6 y C.c: Se muestra la función de respuesta al estímulo de las fibras C-MH utilizando una serie de desplazamientos ascendentes (32-1024 pm). Las fibras C-MH fueron significativamente menos sensibles en los ratones tratados con OB-1 en comparación con los controles tratados con vehículo (*p<0,05, ANOVA bifactorial; los números indican las fibras registradas; los datos se muestran como número medio de potenciales de acción ± EEM).d: se muestran los umbrales medios de fuerza para la descarga de la fibra C-MH mostrando una elevación significativa de los umbrales mecánicos (*p<0,05; prueba de laUde Mann-Whitney; los datos se muestran como umbrales individuales y umbral medio ± EEM).e: para las fibras CM las funciones de respuesta al estímulo no fueron diferentes en la piel del vehículo y la piel OB-1 (ANOVA bifactorial).f: los umbrales medios de fuerza para la fibra C-M tampoco fueron diferentes entre los tratamientos con vehículo y con OB-1 (prueba de laUde Mann-Whitney).

Figura 4: OB-1 reduce la percepción táctil en ratones.

Una tarea de percepción táctil para ratones con la cabeza inmovilizada.a: los ratones fueron entrenados para reportar un solo estímulo de pulso táctil (el recuadro muestra el impulso de comando de tensión de estímulo para las 8 amplitudes). Estructura del ensayo: los ratones fueron entrenados para (1) sostener el sensor de reposo y esperar un estímulo; (2) al detectar el estímulo, alcanzar y pulsar el sensor objetivo en los 500 ms siguientes al inicio del estímulo; (3) obtener recompensa de agua lamiendo siempre que fuera un ensayo exitoso.b: Las curvas psicométricas a estímulos táctiles de diferente amplitud se ven afectadas por la inyección de OB-1 en la pata delantera. Las curvas se construyeron con un ajuste sigmoide de las tasas medias de aciertos a 7 amplitudes diferentes de estímulos táctiles y un ensayo sin estímulo (falsa alarma). Se muestran tres condiciones, inyección del vehículo (negro), inyección de OB1 (magenta) y una sesión de recuperación sin inyección previa (gris).c: la aplicación de OB-1 en la pata delantera atenúa la percepción de estímulos táctiles próximos al umbral. Los índices de aciertos agrupados a 3 valores de amplitud umbral (125, 175 y 275 |jm) de 5 ratones se redujeron significativamente tras la inyección de OB-1 en comparación con los índices de aciertos tras la inyección de vehículo o en la sesión de recuperación sin inyección previa. Se realizaron pruebas estadísticas de las tasas de aciertos tras restar las correspondientes tasas de falsas alarmas (*p<0,05; prueba del orden con signo de Wilcoxon; los números indican los ratones tratados, los datos se muestran como el promedio de las tasas de acierto individuales de cada ratón, agrupados para 3 amplitudes ± EEM).

Figura 5: El dolor provocado por el tacto puede tratarse con OB-1.

a:se muestra el desarrollo del dolor provocado por el tacto tras una lesión nerviosa traumática. Se midieron los umbrales de retirada de la pata (URT) a fuerzas variables de los filamentos de von Frey antes y después de la LCC unilateral. Obsérvese que, tras la lesión nerviosa, los ratonesStoml3-/-desarrollan un dolor provocado por el tacto significativamente menor en comparación con los animales de tipo silvestre (***p<0,001; ANOVA bifactorial; los números indican el número de ratones examinados los datos se muestran como la media de las medianas de los URT individuales; ± EEM).b: las latencias de retirada de la pata (LRT) a una fuente de calor radiante convencional aplicada a la pata trasera ipsilateral de ratones de tipo silvestre yStoml3-/-antes y después de la LCC no fueron diferentes entre los genotipos; los números indican los ratones tratados; los datos se muestran como la LRT media ± EEM).c: el tratamiento con OB-1 de ratones sin tratamiento previo no altera los URT.d: el URT medido antes y después de la lesión nerviosa muestra una clara hipersensibilidad que no se invierte con la inyección del vehículo farmacológico, cabe señalar que el tratamiento local ipsilateral de la pata neuropática con OB-1 normaliza eficazmente los URT, pero el tratamiento de la pata contralateral no. Cabe señalar que el alivio de la hipersensibilidad con el tratamiento con OB-1 es indistinguible del tratamiento con gabapentina (***p<0,001; **p<0,01; prueba de laUde Mann-Whitney; los números indican los ratones tratados; los datos se muestran como la media de las medianas de los URT individuales; las barras de error indican el EEM).e: medición de los URT a lo largo del tiempo; la eficacia analgésica máxima se desarrolló entre 3 h y 9 h después de la inyección local de OB-1 (los números indican los ratones tratados; los datos se muestran como la media de la mediana de los URT individuales).f: se muestra la relación de dosis-respuesta de OB-1, DE50 = 4,42 jM o aproximadamente 20 pmol (***p<0,001; **p<0,01; *p<0,05; prueba del orden con signo de Wilcoxon; los números indican tratamientos farmacológicos; los datos se muestran como la media de las medianas de los URT individuales; las barras de error indican el EEM).g: No se observaron cambios significativos en el URT en ratonesStoml3-/-con LCC tras la administración local de OB-1.h: número de copias deStoml3derivado de GRD lumbar L4-6 (dos ratones por preparación) determinado mediante PCR en tiempo real que muestra una regulación al alza ipsilateral de ARNm deStoml3.Cabe señalar que las dos últimas barras representan datos de ratonesStoml3'¡'(**p<0,01, *p<0,05; prueba de laUde Mann-Whitney; los números indican preparaciones de ARN; los datos representan el número medio de copias ± EEM).

Figura 6: Regulación de STOML3 en la neuropatía dolorosa.

a:citoquímica de GRD lumbares de ratones Stoml3+/lacZ que se habían sometido a una lesión nerviosa (LCC).b: cabe señalar que el número de neuronas que expresan lacZ aumentó tras una LCC unilateral predominantemente en las células grandes (***p <0,001; prueba exacta de Fisher; los números indican las células contadas).c: esquema del locus modificado de los ratones con inserción de Strepll.d: transferencias Western de extractos proteicos tomados del nervio ciático de ratones con inserción destoml3StrepII/StrepI1sometidos a LCC unilateral. Se hicieron extractos de dos ratones por punto temporal. Cabe señalar que se detectó una banda específica de Strepll-STOML3 ipsilateral y contralateral a la lesión en todos los puntos temporales (no se detectan bandas en extractos de proteínas de nervios ciáticos de ratonesStoml3-/-). El día 2 (d2), el día 6 (d6) y, en menor medida, el día 13 (d13) después de la lesión, se encontró claramente mucha más proteína en el lado lesionado en comparación con el nervio ciático no lesionado. Los mismos extractos de proteínas se analizaron con anticuerpos contra PGP9.5, un marcador neuronal que disminuyó drásticamente en el lado lesionado, en consonancia con la conocida pérdida y atrofia de axones en el modelo de LCC.

Figura 7: La inhibición de STOML3 alivia la neuropatía diabética dolorosa.

a:se indujo neuropatía diabética periférica mediante estreptozotocina (STZ). Tras el desarrollo de la neuropatía periférica, ratones diabéticos recibieron una única inyección de OB-1 o vehículo respectivamente en la superficie plantar de la pata trasera.a: tres horas después de la inyección, los ratones tratados con OB-1 mostraron una sensibilidad mecánica atenuada mostrada como porcentaje de retirada a filamentos de von Frey crecientes (***p<0,001; ANOVA bifactorial de OB-1 frente a STZ; los números indican los ratones tratados; los datos se muestran como la media de los URT individuales; las barras de error indican el EEM) ob: umbrales mecánicos necesarios para provocar una frecuencia de retirada del 60 % (**p<0,01, ***p<0,001; prueba del orden con signo de Wilcoxon; prueba t pareada; los números indican los ratones tratados; los datos se muestran como la media de los URT individuales; las barras de error indican el EEM).c,d: los ratones diabéticos del grupo tratado con vehículo no mostraron reversión de la hipersensibilidad mecánica (los números indican los ratones tratados; los datos se muestran como la media de los URT individuales; las barras de error indican el EEM).

Figura 8: Efectos de las moléculas moduladoras de STOML3 sobre otras proteínas con dominio estomatina.

(a) Desarrollo de la señal de BiFC observado cuando las células se transfectaron con estomatina -VC/-VN, STOML1-VC/-VN, STOML2-VC/-VN, STOML3-VC/-VN o Podocina-VC/-VN respectivamente. Cabe señalar que OB-1 inhibe significativamente la oligomerización de las Estomatinas(p<0,005, prueba de Mann Whitney), pero no se afecta con podocina. (b) Se probó OB-1 a dos concentraciones diferentes (2 jm y 20 |jm) utilizando el ensayo de BiFC en donde se utilizó STOML3 de tipo silvestre como cebo y presa. En comparación con los controles se presenta la pendiente normalizada calculada a partir de los datos de desarrollo de la señal y se redujo significativamente cuando OB-1 estaba presente (prueba de latde Student,p<0,001).

Figura 9: Niveles de ARNm de Stoml3 tras el tratamiento con inhibidores y análisis cuantitativo de las corrientes activadas mecánicamente.

(a) Las células N2A y los GRD aislados de forma aguda fueron tratados con cualquiera de entre vehículo, OB-1 u OE-1 (20 jM ) durante 3 horas antes de aislar el ARNm, se transcribieron inversamente y se analizaron mediante qPCR. No hubo diferencias detectables en los niveles de transcripción de Stoml3. (b) Análisis del curso temporal de la actividad de OB-1 en células N2A. Las células se trataron con OB-1 20 jM durante 0-3 horas y se monitorizó la mecanotransducción utilizando matrices de pilares. Se requirió un tratamiento de 3 horas para lograr la máxima inhibición de las corrientes activadas mecánicamente. (c) Representación de la corriente representativa con latencia (magenta), constante de tiempo de activación (<t>1, azul) y constante de tiempo de inactivación (<t>2, verde) indicadas por líneas discontinuas. Se muestra la constante de tiempo de inactivación de las corrientes activadas mecánicamente en los mecanorreceptores de GRD (mec) medida utilizando matrices de pilares elastoméricos. Hay una tendencia a constantes de tiempo de inactivación más prolongadas que no es significativa. (d) En los nociceptores (noci), el tratamiento con OB-2 condujo a latencias significativamente más prolongadas y constantes de tiempo de activación significativamente más lentas. Número de corrientes indicadas en el gráfico; los datos son la media ± EEM.

Figura 10: Efectos del OB-1 sobre las corrientes activadas mecánicamente en neuronas sensoriales de ratón.

(a) Diagrama esquemático de una neurona sensorial de ratón de gran diámetro con electrodo de registro (RE,Recording Electrode)y nanoestimulador (NS,NanoStimulator).(b) Corriente típica mecanosensible de adaptación rápida (AR) provocada al pinchar el soma celular (c) Corrientes típicas mecanosensibles RA(Rapidly-adapting,de adaptación rápida) provocadas a partir de neuronas preincubadas con OB-1 o vehículo (control). Las líneas rojas indican el ajuste exponencial de la inactivación de la corriente para determinar ^2 (d) Distribución de células encontradas con y sin corriente activada mecánicamente (corriente MA,Mechanically-Activated)en ambos grupos. Cabe señalar una pérdida significativa de las corrientes activadas mecánicamente en las neuronas tratadas con OB-1(p<0,01 en comparación con el control, prueba exacta de Fisher). (e) Las constantes medias de tiempo de inactivación (<t>2) de las corrientes activadas mecánicamente, cabe señalar la ralentización de<t>2 en las neuronas tratadas con OB-1.

Figura 11: OB-1 no tiene efecto sobre las corrientes mediadas por ASIC3, ni la inhibición de ASIC3 por la estomatina.

(a) Ni la fase transitoria (T), ni la sostenida (S) de las corrientes provocadas por el pH en células CHO que expresan ASIC3 fueron inhibidas por OB-1 (20 jm ). (b) La estomatina inhibe las corrientes activadas por pH mediadas por ASIC3, que no está modulada por OB-1.

Figura 12: Los mecanorreceptores no silenciados son funcionales tras el tratamiento con OB-1.

(a-d) Se muestran las propiedades del campo receptivo de aferentes cutáneos individuales en piel de control y tratada con OB-1. Se aplicaron series de estímulos de rampa y retención con velocidades crecientes (0,075, 0,15, 0,45, 1,5 y 15 mm/s a desplazamientos de 92 jm ) a mecanorreceptores de umbral bajo, es decir, mecanorreceptores de adaptación lenta (SAM,Slowly Adapting Mechanorecepto)(a), mecanorreceptores de adaptación rápida (RAM,Rapidly Adapting Mechanoreceptors)(b) y D-hairs (c). Las frecuencias medias de disparo durante la fase de rampa se representaron gráficamente en función de la velocidad del estímulo; los números indican las fibras registradas; los datos se presentan como número medio de potenciales de acción ± EEM. (d) Se aplicó a los mecanonociceptores A (AM) una serie ascendente de desplazamientos (32-1024 jm ) utilizando una velocidad de estímulo constante. Las frecuencias medias de disparo se representaron gráficamente en función de las amplitudes de desplazamiento, sin mostrar cambios en la mecanosensibilidad de los AM. Los números indican las fibras registradas; los datos se presentan como número medio de potenciales de acción ± EEM.

Figura 13: Ultraestructura del nervio ciático tras ICC unilateral y efectos de OB-1

(a, d) Dibujos esquemáticos del plano de sección. (b-f) Imágenes de micrografía electrónica de gran aumento del lado ipsilateral o contralateral proximal y distal a la ligadura. Fibras nerviosas mielinizadas y no mielinizadas que muestran una ultraestructura normal y vainas de mielina o haces de Remak intactos (c, f) se observó desmielinización y degeneración axonal ipsilateral a la lesión nerviosa (b, e). Muchos axones mielinizados permanecieron intactos sin mostrar desmielinización ni inflamación mitocondrial proximal a la lesión.

Figura 14: Tratamiento con OB-1 en otros modelos de dolor.

(a) Desarrollo del dolor provocado por el tacto utilizando el modelo de lesión de nervio preservado (SNI,Spared Nerve Injury).Se muestran los umbrales de retirada de la pata (URT); cabe señalar que los ratones de tipo silvestre desarrollan un dolor prolongado provocado por el tacto ipsilateral a la lesión. (b) Se muestran los URT, que no muestran alivio del comportamiento doloroso provocado por el tacto tras el tratamiento local con OB-1. (c) Número de copias de Stoml3 derivado del GRD lumbar L4-6 (dos ratones por preparación) determinado mediante PCR en tiempo real que no muestra una regulación al alza del ARNm de Stoml3 tras la SNI. (d-g) Se inyectó i.p. una dosis única de NGF (1 |jg/g de peso corporal) en ratones adultos para inducir hiperalgesia en ratones de tipo silvestre y Stoml3-/-. (d, e) Se muestran URT o latencias de retirada de la pata (LRT) antes y después de la hiperalgesia inducida por NGF en ratones de tipo silvestre y Stoml3-/-, lo que muestra que los síntomas prominentes de hiperalgesia térmica y mecánica no fueron diferentes entre los genotipos. (f, g) Se midieron tanto los URT como las LRT en respuesta al OB-1 antes y después de la inyección sistémica de NGF, cabe señalar que, obviamente, el OB-1 no alivia la hiperalgesia mecánica (g) o térmica (h) inducida por NGF. (***p<0,001; ANOVA bifactorial; los números indican los ratones examinados; los datos se muestran como la media de las medianas de los URT individuales; las barras de error indican el EEM).

Figura 15: Generación de las cepas de ratón Stoml3LacZ y Stoml3Strep.

(a) Representación esquemática del vector de direccionamiento, el locus de Stoml3 de tipo silvestre y el alelo mutado Stoml3LacZ, antes y después de la retirada del casete de autoescisión de neomicina (cre, neo). Se representan los sitios de restricción de la región genómica de 12 kb del locus de Stoml3 que contiene el exón 1 (E1, negro), NLS-LacZ (azul), DTA (amarillo), el casete de neomicina de autoescisión, loxP (punta de flecha roja) y Spel (S). Las líneas verdes indican los tamaños previstos de los fragmentos obtenidos tras la digestión con Spel del ADN genómico. Una barra verde muestra la secuencia 5' utilizada como sonda para los análisis de transferencia Southern mostrados en B. Las líneas azules indican los tamaños de fragmento predichos obtenidos mediante genotipado del ADN genómico de la cola como se muestra en C. (b) Análisis de transferencia Southern del ADN genómico de la cola digerido por Spel de ratones Stoml3+/LacZ y de tipo silvestre. (c) Análisis de genotipado del ADN genómico de la cola de ratones Stoml3+/LacZ, tipo silvestre y Stoml3LacZ/LacZ. Los cebadores Stoml3-LacZ F y LacZ int R amplificaron un fragmento de 649 pb del alelo mutante Stoml3LacZ. Los cebadores Stoml3-LacZ F y Stoml3-LacZ R amplificaron un fragmento de 875 pb del alelo Stoml3 de tipo silvestre, M: escalera de 100 bp (Invitrogen).(d) Representación esquemática del vector de direccionamiento, el locus de Stoml3 de tipo silvestre y el alelo mutado Stoml3Strep, antes y después de retirar el casete de neomicina (neo). Se representan los sitios de restricción de la región genómica de 12 kb del locus de Stoml3 que contiene el exón 1 (E1, negro), Strep-Tagll (rojo), DTA (amarillo), el casete de neomicina (neo), loxP (punta de flecha azul) y Spel (S). Las líneas verdes indican los tamaños previstos de los fragmentos obtenidos tras la digestión con Spel del ADN genómico. Una barra verde muestra la secuencia 5' utilizada como sonda para los análisis de transferencia Southern mostrados en E. Las líneas azules indican los tamaños de fragmento predichos obtenidos mediante genotipado del ADN genómico de la cola como se muestra en F. (e) Análisis de transferencia Southern del ADN genómico de la cola digerido por Spel de ratones Stoml3+/Strep y de tipo silvestre. (f) Análisis de genotipado del ADN genómico de la cola de ratones de tipo silvestre, Stoml3+/StrepII y Stoml3Strepll/Strepll. Los cebadores Stoml3-Strep F y Stoml3-Strep R2 amplificaron un fragmento de 321 pb del alelo mutante Stoml3Strepll. Los cebadores Stoml3-Strep F y Stoml3-Strep R1 amplificaron un fragmento de 438 pb del alelo Stoml3 de tipo silvestre, M: escalera de 100 bp (Invitrogen).

Figura 16: Mediciones conductuales y electrofisiológicas en ratones hembra.

(a) Se utilizó un protocolo de búsqueda eléctrica para rastrear las unidades identificadas eléctricamente hasta sus campos receptivos. Las proporciones de fibras Ap mecano-lNsensibles son casi idénticas en las hembras que, en los machos, (**p <0,01 ***p <0,001; prueba exacta de Fisher; los números indican las fibras registradas. (b, c) Se midieron los umbrales de retirada de la pata (URT) a fuerzas variables de los filamentos de von Frey antes y después de la lesión nerviosa, mostrando que el OB-1 revirtió la hipersensibilidad mecánica en una medida similar en ratones hembra que en ratones macho, (*p<0,05;**p<0,01; prueba de laUde Mann-Whitney; prueba del orden con signo de Wilcoxon; los números indican los ratones tratados; los datos se muestran como la media de las medianas de los URT individuales; las barras de error indican el EEM).

Figura 17: Ensayo TriGFP.

(a) El ensayo se basa en la asociación tripartita entre las dos etiquetas de GFP de veinte aminoácidos de longitud GFP10 y GFP11, que se fusionaron con las proteínas asociadas hsSTOML3, y el detector complementario GFP1-9 (Referencia 50). Cuando las proteínas hsSTOML3 interactúan, GFP10 y GFP11 se autoasocian con GFP1-9 y reconstituyen GFP funcional. La intensidad de la señal de GFP se mide utilizando la tecnología de citometría de flujo; la cuantificación de las medidas se muestra en (b) demostrando que, como resultado de la interacción proteínaproteína hsSTOML3, se ensambla GFP funcional mientras que las mutaciones insertadas en hsSTOML3 (hsSTOML3LR93,94EE), así como el compuesto inhibidor OB-1 y sus derivados reducen fuertemente la autoasociación de hsSTOML3 dando lugar a una intensidad de señal de GFP sustancialmente menor.

Ejemplos

La invención se describe además por los siguientes ejemplos. Estas no pretenden limitar el alcance de la invención, sino que representan realizaciones preferidas de aspectos de la invención que se proporcionan para una mayor ilustración.

Métodos empleados en los ejemplos

Evaluación del comportamiento:

Los experimentos de este estudio se llevaron a cabo en ratones macho endocriados adultos (C57BI6/6 adultos obtenidos de Charles River, Sulzfeld, Alemania) o ratones adultos generados y criados en el laboratorio (Stoml3-/-, o Stoml3lacZ). El alojamiento y cuidado de los animales, así como los protocolos de eutanasia humanitaria, están registrados y autorizados por las autoridades federales alemanas competentes (Estado de Berlín). Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las leyes alemanas y las directrices de la Comunidad Europea para el uso de animales en investigación y fueron aprobados por el comité ético local por las autoridades federales alemanas competentes (Estado de Berlín). Los animales se mantuvieron a temperatura controlada y en un ciclo de 12 h de luz y 12 h de oscuridad, con las luces encendidas a las 06:00 horas, todas las pruebas de comportamiento se realizaron durante la fase de luz.

Análisis estadístico:

Se comprobó la distribución normal de todos los datos. Las pruebas estadísticas aplicadas para el análisis de los datos se indican en la leyenda de la figura. Las comparaciones múltiples se realizaron mediante ANOVA bifactorial de medidas repetidas seguido de la pruebapost hocde Bonferroni. Se utilizaron niveles de significación dep<0,05 (*), p <0,01 (**) y p <0,001 (***). Los análisis estadísticos y los ajustes exponenciales se realizaron con los programas informáticos GraphPad Prism o Igor Pro 6.11.

Construcciones de expresión:

Las construcciones para el análisis de BiFC se crearon insertando el gen de interés, en fase, en el sitio de clonación múltiple de pBiFC-VC155 o pBiFC-VN173. Las mutaciones puntuales se introdujeron mediante mutagénesis dirigida basada en PCR. Las variantes marcadas con FLAG se generaron mediante técnicas de clonación convencionales.

Análisis por RT-PCR:

Se diseccionaron los ganglios de la raíz dorsal (GRD) lumbar L3-L6 y el bulbo olfatorio de ratones LCC y control, y el ARN total se extrajo por el método TRIzol (Invitrogen) siguiendo las recomendaciones del fabricante y se trató con el kit TURBO DNA-freeTM para evitar la contaminación por ADN. El ARN se cuantificó con el espectrofotómetro NanoDrop 2000 UV-Vis (Thermo Scientific) y se transcribió inversamente con la transcriptasa inversa SuperScript® III (Invitrogen). Se utilizó la RT-PCR cuantitativa TaqMan para detectar la expresión del ARNm de STOML3 con los cebadores apropiados junto con la sonda TaqMan n.° 53 de la Biblioteca Universal de Sondas de Roche. Cada muestra se realizó por triplicado en un sistema de detección de secuencias ABI Prism 7700 (Thermo Scientific).

Las células HEK-293 (números de pase 4-20) se cultivaron en DMEM más 10 % de suero de ternera fetal (FCS). Las células Neuro2A (N2A) se cultivaron en medio DMEM/Opti-MEM más 10 % de FCS. - Se aislaron neuronas sensoriales GRD deMus musculus(C57BI/6) de 4 semanas de vida. Se recogieron aproximadamente 20 ganglios de cada ratón y se aislaron células individuales tratando los ganglios con 1 pg/ml de colagenasa IV durante 30 min, seguido de 1 ml de tripsina al 0,05 %, en la PBS, durante 5-20 min a 37 °C. Los ganglios tratados con enzimas, en medio DMEM/F-12 que contenía un 10 % de suero de caballo (HS), se disgregaron pasándolos suavemente a través de una aguja 20G; a continuación, las células se recogieron por centrifugación (1000 rpm, 3 min), se lavaron y, por último, se volvieron a suspender en medio DMEM/F-12, 10% de HS (en ningún momento se añadieron neurotrofinas al cultivo). A continuación, las neuronas sensoriales se sembraron en un sustrato recubierto de EHS-laminina y se cultivaron durante la noche. Los experimentos con neuronas sensoriales aisladas se realizaron en las 24-36 horas siguientes al aislamiento de las células.

Cribado de alto rendimiento:

Se cultivaron células HEK-293 en matraces T-150 hasta alcanzar una confluencia aproximada del 70 %; las células se transfectaron conjuntamente con plásmidos que codificaban STOML3-VC y STOML3-VN utilizando Fugene-HD, según las instrucciones del fabricante. Se dejó que la reacción de transfección prosiguiera durante 8 h antes de recuperar las células de las placas y resuspenderlas en medio DMEM que contenía HEPES 25 mM y carecía de rojo de fenol. Las células se sembraron en placas de 384 pocillos recubiertas de PLL utilizando un dispensador automático (EL406 Microplate Washer Dispenser). Las placas ya contenían compuestos de la biblioteca 1 de compuestos ChemBioNet. El volumen final del ensayo fue de 40 pl de células con 10 pM de compuesto. Dos columnas de control positivo en cada placa individual no contenían compuesto y en su lugar se añadió la cantidad correspondiente de DMSO. El desarrollo de la señal de fluorescencia y Fp se monitorizó durante la noche (15 h), con lecturas tomadas cada 3 h (ex: 515 ± 8 nm, em: 535 ± 8 nm). Entre una lectura y otra, las células se mantuvieron a 37 °C, CO2 al 5%y 95 % de humedad. El seguimiento nocturno del desarrollo de la señal se realizó en una estación de trabajo Freedom Evo equipada con un brazo robótico para el transporte de las placas y un lector de placas Safirell para la medición de la fluorescencia (Tecan Group Ltd.), Mannedorf, Suiza), y un incubador de placas automatizado integrado STX44-ICSA (Liconic AG, Mauren, Liechtenstein) para el almacenamiento de las placas entre mediciones. Los experimentos se repitieron con 20 placas cada día hasta que se analizó toda la biblioteca de compuestos y los datos se normalizaron con respecto a los controles en placa.

Los compuestos de interés se seleccionaron a partir de la pendiente de la señal YFP frente al tiempo. Cada pocillo se comparó con la pendiente promedio de los controles positivos en placa (actividad porcentual normalizada), y se comparó con la media y la desviación estándar de todas las muestras en placa (sin los controles), dando una puntuación Z como medida de significación estadística. Inicialmente, los compuestos se volvieron a analizar por triplicado para confirmar si las diferencias observadas eran o no repetibles; los compuestos con actividad confirmada se seleccionaron para análisis posteriores.

Ensayo TriGFP

Se cultivaron células N2a en placas de 6 pocillos hasta una confluencia aproximada del 70 %; las células se cotransfectaron con plásmidos codificantes de GFP1-9, STOML3-GFP10 y STOML3-GFP11 utilizando PEI, según las instrucciones del fabricante. Se dejó que la reacción de transfección prosiguiera durante 8 h antes de incubar el compuesto a una concentración final de 20 pM. Veinticuatro horas después de la transfección se recogieron las células, se fijaron con PFA al 4 % durante 10 minutos y se volvieron a suspender en PBS. Las suspensiones celulares se utilizaron para el análisis por citometría de flujo.

Imágenes dSTORM:

Se cultivaron células N2A en cubreobjetos de precisión recubiertos de EHS-Laminina, espesor de 0,17, después se transfectaron con un plásmido codificante de STOML3-FLAG. Después de la incubación durante una noche, se trataron durante 3 horas con el compuesto 20 pM, o con DMSO como control. A continuación, se fijaron las células (15 min, 4 % de PFA), se permeabilizaron (0,05 % de TritonX 100, 5 min) y se bloquearon (solución salina tamponada con fosfato [PBS] con un 10 % de suero fetal de cabra [FGS]), 37 °C, 1 h). Las células se marcaron con anticuerpo anti-FLAG de ratón (clon M2, 1:100 en PBS que contenía un 10 % de FGS). El anticuerpo secundario fue un anticuerpo antirratón de cabra conjugado con Alexa647 (1:100 en PBS más 10 % de FGS, 1 h, 37 °C). Después de la tinción, las muestras se fijaron de nuevo. Antes de las imágenes dSTORM, los cubreobjetos se montaron en tampón PBS de dSTORM, pH 7,4, que contenía un secuestrador de oxígenos (0,5 mg/ml de glucosa oxidasa), 40 mg/ml de catalasa, 10 % (p/v) de glucosa y 100 mM de MEA2.

El sistema dSTORM, fabricado a medida, se basó en un microscopio Nikon Ti. Antes de la adquisición, se iluminó la muestra marcada con Alexa647 con 643 nm para cambiar los fluoróforos al estado desactivado. Después de que las moléculas empezaran a parpadear, se adquirió una secuencia de fotogramas (normalmente 10.000-20.000) utilizando un objetivo 100x 1,49 nA, un objetivo de 1,5 aumentos y una matriz de un detector EMCCD sin combinar píxeles. Se utilizó un tiempo de exposición de 30 ms para obtener una buena relación señal-ruido y un elevado número de moléculas individuales parpadeantes por fotograma.

Localización de dSTORM, corrección de la deriva y reconstrucción

Para facilitar la corrección de la desviación, se dejó que las perlas fluorescentes Tetra-speck recubiertas de PLL se adhirieran a la muestra durante la noche. Localización: las moléculas individuales se localizaron utilizando el programa informático de código abierto rapidSTORM 3.2. En resumen, las imágenes de origen se suavizan primero mediante el operador mediano, seguido de una operación de relleno para reducir el ruido. En estas imágenes "sin ruido", rapidSTORM realiza un ajuste gaussiano (estimación de parámetros de Levenberg-Marquardt) para cada punto de intensidad, mientras que la calidad del ajuste y los picos máximos se utilizaron como medida de calidad para la localización. Este ajuste permite obtener la posición exacta de la molécula con una precisión inferior al píxel, la intensidad total del evento de molécula única y el número de fotograma del evento dentro de la secuencia de imágenes. La desviación de la muestra se corrigió utilizando perlas fiduciarias en la muestra como puntos de referencia (algoritmo escrito a medida, GREGOR).

Para el análisis del tamaño del dominio STOML3, todas las imágenes reconstruidas se enmascararon y, a continuación, de cada célula fotografiada se recortaron 100 puntos individuales (tamaño: 20 * 20 píxeles). Se calculó un ajuste gaussiano 2D con el programa informático Igor (WaveMetrics, EE. UU.). La anchura x y la anchura y de cada punto se incluyeron en el conjunto de datos, ya que los dominios no eran necesariamente circulares. Una vez determinados los tamaños de los dominios para cada célula, se desenmascararon las imágenes y se normalizaron con respecto al tamaño medio de los dominios de las células de control preparadas y fotografiadas el mismo día.

Síntesis química de OB-1:

5-hidroxi-2-fenilbenzofuran-3-carboxilato de etilo:

Se solubilizaron 5,6 g (29,06 mmol) de etil-3-oxo-3-fenilpropanoato en 50 ml de tolueno y se añadieron 525 mg (1,45 mmol) de Cu(OTf)2. A continuación, se solubilizaron 1,57 g (14,5 mmol) de benzoquinona en 20 ml de tolueno y se añadieron gota a gota a la mezcla de reacción seguida de reflujo durante 3 h. La mezcla se inactivó con NH4Cl y se extrajo tres veces con acetato de etilo. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera y se secaron con Na2SO4. El producto en bruto se purificó por cromatografía sobre gel de sílice eluyendo con un gradiente de Hex/EE (10:1), dando 2,24 g de etil-5-hidroxi-2-fenilbenzofuran-3-carboxilato (rendimiento: 27 %).

RMN de 1H (300 MHz, DMSO-da) 89,48 (s, 1H), 7,93 (dd,J= 6,6, 2,9 Hz, 2H), 7,56-7,46 (m, 4H), 7,37 (d,J= 2,4 Hz, 1H), 6,85 (dd,J= 8,8, 2,5 Hz, 1H), 4,31 (c,J= 7,1 Hz, 2H), 1,31 (t,J= 7,1 Hz, 3H). CL-EM: Tr = 3,66 min; EM (IEN pos) m/z = 283,1 [M+H]+.

5-((1-Metil-4-nitro-1H-imidazol-5-il)oxi)-2-fenilbenzofuran-3-carboxilato de etilo (OB-1):

Se solubilizaron 0,5 g (1,77 mmol) de etil-5-h¡drox¡-2-fen¡lbenzofuran-3-carboxilato en 20 ml de DMF y se añadieron 1,2 eq de Cs2CO3 (0,7 g, 2,1 mmol), 0,1 eq de Cul (33 mg, 0,17 mmol) y 285 mg (1,77 mol) de 5-cloro-1-metil-4-nitro-1H-imidazol. La mezcla se agitó durante 3 h a TA. El disolvente orgánico se eliminó a presión reducida. El producto en bruto se purificó por cromatografía sobre gel de sílice eluyendo con un gradiente de Hex/EE (3:2), dando 644 mg de etil-5-(1-metil-4-nitro-1H-imidazol-5-iloxi)-2-fenilbenzofuran-3-carboxilato (Rendimiento: 89 %).

RMN 1H (300 MHz, DMSO-- d6) 88,01-7,95 (m, 2H), 7,85 (s, 1H), 7,77 (d,J= 9,0 Hz, 1H), 7,59-7,52 (m, 3H), 7,47 (d,J= 2,7 Hz, 1H), 7,25 (dd,J= 9,0, 2,8 Hz, 1H), 4,26 (c,J= 7,1 Hz, 2H), 3,61 (s, 3H), 1,21 (t,J= 7,1 Hz, 3H). CL-EM: Tr = 3,73 min; EM (IEN pos) m/z = 408,1 [M+H]+.

Ejemplos de preparación adicionales

Los siguientes ejemplos se sintetizaron de forma similar a la síntesis de OB-1.

Ejemplo: 2-fen¡l-5-(t¡azol-2-¡loxi)benzofuran-3-carbox¡lato de etilo (A1) (MDC-D38)

Se disolvió etil-5-hidroxi-2-fenilbenzofuran-3-carboxilato (50 mg, 0,177 mmol) en DMF (2 ml). Se añadieron CS2CO3 (70 mg, 0,21 mmol, 1,18 eq), Cul (3,3 mg, 0,0177 mmol, 0,1 eq) y 2-clorotiazol (15,19 pl, 0,177 mmol, 1 eq). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 15 h. Tras la HPLC solo se observó la formación de un producto menor, la mezcla se agitó a 80 °C durante 1 hora. La mezcla se agitó adicionalmente a 120 °C durante una noche. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente, se diluyó, se filtró y se purificó por HPLC preparativa (eluyentes: agua y acetonitrilo). Las fracciones deseadas se liofilizaron, produciendo el compuesto del título A1 (16 mg, 0,04 mmol, 25 %) en forma de un polvo blanco. C20H15NO4S. CL-EM: Tr =1,72min; EM (IEN pos) m/z = 366,1 [M+H]+.

Ejemplo: 2-(3-clorofen¡l)-5-((1-met¡l-4-n¡tro-1H-¡midazol-5-¡l)ox¡)benzofuran-3-carbox¡lato (B2)(MDC-D30)

Etapa 1: 2-(3-clorofenil)-5-hidroxibenzofuran-3-carboxilato de etilo (B1):

Se disolvió etil-(3-clorobenzoil)acetato (300 mg, 1,32 mmol) en tolueno (10 ml). Se añadió Cu(OTf)2 (48 mg, 0,132 mmol, 0,1 eq). A continuación, se añadió gota a gota a la solución benzoquinona (152 mg, 1,39 mmol, 1,05 eq) disuelta en tolueno (10 ml). La mezcla se agitó a la temperatura de reflujo durante 2 horas. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente. Se añadieron una solución saturada de NH4O (10 ml) y EtOAc (30 ml). Las capas se separaron y la fase acuosa se extrajo con EtOAc (2 x 20 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (20 ml), se secaron con Na2SO4y se concentraron al vacío. La mezcla se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida, produciendo el compuestoB1en forma de un sólido pardo claro (80 mg, 0,25 mmol, 19 %). C17H13CO4. CL-EM: Tr =1,55min; EM (IEN pos) m/z = 317,1 [M+H]+; EM (IEN neg) m/z = 315,1 [M-H]-.

Etapa 2: 2-(3-clorofenil)-5-((1-metil-4-nitro-1H-imidazol-5-il)oxi)benzofuran-3-carboxilato de etilo (B2):

Se disolvió 2-(3-clorofenil)-5-hidroxibenzofuran-3-carboxilato de etilo(B1)(70 mg, 0,22 mmol) en DMF (2 ml). Se añadió Cs2CO3 (85 mg, 0,261 mmol, 1,18 eq), seguido de Cul (4 mg, 0,022 mmol, 0,1 eq) y 5-cloro-1-metil-4-nitroimidazol (36 mg, 0,22 mmol, 1 eq). La mezcla se agitó durante toda la noche a 120 °C. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente, se diluyó con acetonitrilo, se filtró y se purificó por HPLC preparativa (eluyentes: agua y acetonitrilo). Las fracciones deseadas se liofilizaron, produciendo el compuesto del título B2 (5 mg, 0,01 mmol, 5 %) en forma de un polvo blanco. C21H-i6ClN3O6. CL-EM: Tr =1,59min; EM (IEN pos) m/z = 442,1 [M+H]+.

Ejemplo: 2-(4-clorofen¡l)-5-((1-met¡l-4-n¡tro-1H-¡m¡dazol-5-il)ox¡)benzofuran-3-carbox¡lato (C2)(MDC-D34)

Etapa 1: 2-(4-clorofenil)-5-hidroxibenzofuran-3-carboxilato de etilo (C1):

Se disolvió éster etílico del ácido 3-(4-clorofenil)-3-oxo-propiónico (200 mg, 0,88 mmol) en tolueno (10 ml). Se añadió Cu(OTf)2 (33,45 mg, 0,0925 mmol, 0,1 eq). A continuación, se añadió gota a gota a la solución benzoquinona (100 mg, 0,925 mmol, 1,05 eq) disuelta en tolueno (10 ml). La mezcla se agitó a la temperatura de reflujo durante 2 horas. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente. Se añadieron una solución saturada de NH4O (10 ml) y EtOAc (30 ml). Las capas se separaron y la fase acuosa se extrajo con EtOAc (2 x 20 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (20 ml), se secaron sobre Na2SO4 y se concentraron al vacío. La mezcla se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida, produciendo el compuestoC1en forma de un sólido pardo claro (117 mg, 0,37 mmol, 21 %). C-i/H-iaCO CL-EM: Tr =1,56min; EM (IEN pos) m/z = 317,1 [M+H]+; EM (IEN neg) m/z = 315,1 [M-H]-.

Etapa 2: 2-(4-clorofenil)-5-((1-metil-4-nitro-1H-imidazol-5-il)oxi)benzofuran-3-carboxilato de etilo (C2):

Se disolvió 2-(4-clorofenil)-5-hidroxibenzofuran-3-carboxilato de etilo(C1)(80 mg, 0,25 mmol) en DMF (2 ml). Se añadió Cs2CO3 (97 mg, 0,298 mmol, 1,18 eq), seguido de Cul (5 mg, 0,025 mmol, 0,1 eq) y 5-cloro-1-metil-4-nitroimidazol (40 mg, 0,25 mmol, 1 eq). La mezcla se agitó durante toda la noche a 120 °C. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente, se diluyó con acetonitrilo, se filtró y se purificó por HPLC preparativa (eluyentes: agua y acetonitrilo). Las fracciones deseadas se liofilizaron, produciendo el compuesto del título C2 (11mg, 0,02mmol, 10 %) en forma de un polvo blanco. C21H-i6ClN3O6. CL-EM: Tr =1,60min; EM (IEN pos) m/z = 442,1 [M+H]+.

Esquema de síntesis general:

El método general de síntesis puede emplearse para los compuestos de Fórmula I-II. En la síntesis, se utilizan diferentes grupos aromáticos y alquilos R1. Para la mayoría de los compuestos R2 = etilo. Los demás derivados del éster se obtienen por transesterificación del éster etílico. Los derivados de benzofurano3resultantes se arilarán en la posición fenólica con derivados de tiazol e imidazol4para producir las dianas finales5.

Electrofisiologia:

Los registros de pinzamiento zonal de células enteras se realizaron como se ha descrito previamente 5-7, utilizando pipetas zonales con una resistencia en la punta de 3-6 MQ, llenas de una solución de: KCl 110 mM, NaCl 10 mM, MgCl21 mM, EGTA 1 mM y HEPES 10 mM, ajustado a un pH de 7,3 con KOH. (Para los experimentos en neuronas GRD se añadió QX-314 10 mM a la pipeta para bloquear los canales de sodio activados por tensión8. Las soluciones extracelulares contenían NaCl 140 mM, KCl 4 mM, CaCh 2 mM, MgCh 1 mM, glucosa 4 mM, HEPES 10 mM, ajustado a un pH de 7,4 con NaOH. Se utilizó un microscopio invertido Zeiss 200 y un amplificador EPC-10 junto con el programa informático Patchmaster, los datos se analizaron con el programa informático Fitmaster (HEKA Electronik GmbH, Alemania). La capacitancia de la pipeta y de la membrana se compensó utilizando la función automática de Patchmaster, la resistencia en serie se compensó al menos en un 60 % para reducir al mínimo los errores de tensión. Los estímulos mecánicos se aplicaron utilizando una sonda de vidrio pulido accionada por el micromanipulador MM3A (Kleindiek Nanotechnik, Alemania). Los estímulos mecánicos se aplicaron mediante; indentando el soma celular o cultivando células en conjuntos de pilares elastoméricos y aplicando el estímulo a la superficie de contacto célulasustrato desviando un pelo individual. Resumiendo, se fundieron en PDMS matrices de pilares elastoméricos de dimensiones definidas con una elasticidad de 2 MPa. Las células cultivadas en estas matrices se controlaron mediante pinzamiento zonal de células enteras, mientras que se utilizó una sonda de vidrio para aplicar desviaciones repetidas (de diferentes magnitudes) a un pelo individual directamente debajo de la célula. Se obtuvieron imágenes del pelo antes y después de la deflexión y se analizaron las imágenes fuera de línea para determinar la deflexión exacta de cada punto de datos. Las imágenes se obtuvieron utilizando un objetivo LD 40x y una cámara CCD CoolSNAP EZ. Las imágenes se analizaron fuera de línea con el programa informático Igor (WaveMetrics, EE. UU.). La recogida de datos estímulo-respuesta mediante matrices de pilares genera conjuntos de datos con variación tanto en x como en y. Para poder comparar eficazmente los grupos de cada célula estudiada, dividimos los datos de respuesta por tamaño del estímulo en los siguientes intervalos: 0-10, 10-50, 50-100, 100-250, 250-500, 500-1000. Para cada célula, se promediaron las amplitudes de corriente dentro de cada intervalo y luego se promediaron los intervalos entre las células. A continuación, se comprobó la significación probando si la amplitud de corriente para un intervalo de estimulación determinado (es decir, intervalo) difería entre las muestras. Se utilizó un análisis de potencia para determinar que podían detectarse efectos de moderados a fuertes entre las muestras con un tamaño de muestra >4. Los conjuntos de datos superaban esta cifra. Para distinguir los mecanorreceptores de los nociceptores en la población mixta de neuronas GRD preparadas de forma aguda, se utilizó la forma del potencial de acción (PA) generado. Las células con PA que mostraban una joroba en la fase descendente se clasificaron como nociceptores. Para el análisis cuantitativo de la mecanosensibilidad, se midieron las respuestas en la subpoblación más sensible de mecanorreceptores, previamente definidos como mecanorreceptores Typell (Pooleet al.,2014). Esta población se identificó como aquellas células con PA que carecían de una joroba en la fase descendente y una anchura completa a medio máximo (FWHM,Full Width at Half Máximum)de al menos 0,7 ms, (media, ± EEM: 0,9 ± 0,04 ms)

Para comprobar el efecto de los compuestos sobre la modulación por la estomatina de las corrientes ASIC, se transfectaron células CHO con vectores que codificaban la estomatina y ASIC3, en una proporción de 4:1 utilizando lipofectamina, según las instrucciones del fabricante. Las células se incubaron con OB-1 20 pM durante 3 horas en tampón extracelular (véase más arriba), y OB-1 se mantuvo en el medio durante los experimentos electrofisiológicos. Los canales ASIC3 se activaron aplicando soluciones de pH6 y pH4, y se midió tanto la densidad de corriente pico transitoria como la sostenida.

Preparaciónex vivodel nervio cutáneo:

Los ratones fueron sacrificados mediante inhalación de CO2 durante 2-4 minutos seguida de dislocación cervical. El nervio safeno y la piel rasurada de la extremidad posterior se disecaron libres y se colocaron en un baño de órganos. La cámara se perfundió con un fluido intersticial sintético (tampón SIF) cuya composición era (en mM): NaCl, 123; KCI, 3,5; MgSO4, 0,7; NaH2PO4, 1,7; CaCl2, 2,0; gluconato de sodio, 9,5; glucosa, 5,5; sacarosa, 7,5; y HEPES, 10 a un pH de 7,4. La piel se colocó con el lado del corion hacia arriba en el baño de órganos. El nervio se colocó en una cámara adyacente sobre un espejo para facilitar la manipulación de las fibras bajo el microscopio estereoscópico. Se extrajeron finos filamentos del nervio safeno y se colocaron en el electrodo de registro. El aislamiento eléctrico se realizó con aceite mineral.

Para el protocolo de búsqueda eléctrica se maniobró suavemente un microelectrodo (1 MQ) hasta contactar con el epineurio del tronco nervioso y se administró una estimulación eléctrica a un intervalo de un segundo con pulsos de onda cuadrada de 50-500 ms de duración. En la mayoría de los filamentos se contaron 3-5 unidades individuales. La estimulación nerviosa eléctrica se realizó en 2 puntos distantes del nervio safeno para rastrear las unidades identificadas eléctricamente hasta sus campos receptivos. La sensibilidad mecánica de las unidades individuales se comprobó mediante estimulación mecánica con una varilla de vidrio. Para el protocolo de búsqueda mecánica, las unidades individuales se identificaron mediante una suave estimulación mecánica de su campo receptivo con una varilla de vidrio. Se visualizaron los picos provocados mecánicamente y se guardó la plantilla en un osciloscopio. Entonces, se colocó un electrodo metálico de tungsteno afilado en el campo receptivo y se provocó un pico eléctrico con pulsos de corriente supraumbral y se registró la latencia eléctrica, el tiempo desde el artefacto de estimulación hasta el pico. La distancia entre el electrodo de estimulación y el de registro se denominó distancia de conducción. Para cada fibra aislada, se calculó la velocidad de conducción dividiendo la distancia de conducción entre la latencia eléctrica del pico.

Se utilizó un nanomotor controlado por computadora (Kleindiek, Reutlingen, Alemania) para aplicar estímulos de desplazamiento controlado de amplitud y velocidad conocidas. La sonda era una varilla metálica de acero inoxidable y el diámetro de la zona de contacto circular plana era de 0,8 mm que contenía un transductor de fuerza (Kleindiek, Reutlingen, Alemania). La señal que impulsa el movimiento del motor lineal y los datos electrofisiológicos brutos se recogieron con un sistema Powerlab 4.0 (ADInstruments) y los picos se discriminaron fuera de línea con la extensión de histograma de picos del programa informático.

Tarea de percepción táctil:

Se anestesió a ratones macho C57BI6/J y se implantó en el cráneo un soporte craneal metálico ligero utilizando pegamento (Loctite 401, Henkel) y cemento dental (Paladur®, Heraeus). Los ratones se habituaron a la sujeción de la cabeza y a la configuración conductual durante 1-2 días. Se monitorizaron el lamido y el comportamiento de la pata delantera de los ratones con tres sensores de capacitancia hechos a medida: un sensor de lamido, un sensor de reposo y un sensor de objetivo que proporcionaban un monitor en línea del contacto de la pata o la lengua. El sensor de reposo consistía en una esfera (diámetro: 6 mm) montada sobre una varilla de vidrio de 30 mm de longitud, adherida a un doblador piezoeléctrico (PICMA® Multilayer Piezo Bender Actuator, Physik Instrumente). El piezoeléctrico generaba un pulso táctil de coseno de 30 ms mediante un sistema amplificador piezoeléctrico (Sigmann Elektronik). Se colocó un amortiguador de espuma de uretano (Poron®, Rogers Cooperation) entre el piezoeléctrico y la plataforma de soporte para reducir las oscilaciones de zumbido tras el pulso de estímulo. La amplitud del estímulo se calibró con una cámara de alta velocidad (300 Hz) (Dalsa Genie HM640). El sensor objetivo (diámetro: 6 mm) tenía una posición inicial de 10 mm horizontalmente frente al sensor de reposo y estaba fijado a un brazo articulado Fisso 3D en una platina de traslación lineal (ST9-100-2 eco-P, ITK Dr. Kassen GmbH, Alemania). A los ratones se les restringió el consumo de agua y se les administraron aproximadamente 4 recompensas de 0,6 pl de agua con la condición de que tocaran el sensor objetivo dentro de una latencia definida desde el inicio del estímulo y lamieran el dispensador de agua. El sensor objetivo se movió a la posición inicial al inicio de una nueva prueba y se alejó del ratón al final. El intervalo entre ensayos se aleatorizó entre 7 y 13 s. Durante todo el ensayo se reprodujo ruido blanco. La ventana de respuesta (latencia del estímulo recompensado al tacto) se redujo a 500 ms durante la sesión de prueba durante el entrenamiento conductual. Se entrenó a los ratones con estímulos de gran amplitud (620 pm) y luego se les sometió a pruebas en la misma sesión con siete amplitudes de estímulo diferentes (en pm: 45, 80, 125, 170, 275, 385, 620) y un ensayo sin estímulo para calcular la tasa de falsas alarmas. Los estímulos se presentaron en un orden aleatorio. La configuración se controló con un programa informático personalizado en LabView 10.0 (National Instruments 2010). Las inyecciones farmacológicas de OB-1 o DMSO solo se disolvieron en solución de Ringer (en mM: NaCl 135, KCI 5, HEPES 5, CaCl21,8, MgCh 1) para preparar la solución de OB-1 y vehículo. Para probar el impacto del OB-1 en la percepción táctil, realizamos inyecciones subcutáneas en la pata delantera derecha de OB-1 o de la solución de vehículo. Las inyecciones se realizaron entre 3 y 5 horas antes de las pruebas de comportamiento. Se inyectaron aproximadamente 5 pl en los dedos con una micropipeta de vidrio y 10 pl en la palma de la mano con una jeringa Hamilton, calibre 33. Durante el procedimiento de inyección, se anestesió al ratón con isoflurano (del 1,5 al 2,0 % en O2). El procedimiento de inyección duró aproximadamente 15 minutos, tras los que se trasladó al ratón a su jaula de origen para que se recuperara antes de las pruebas de comportamiento.

Para construir las curvas psicométricas, primero se promediaron las tasas de pulsación del sensor objetivo en los 500 ms siguientes al inicio del estímulo en 5 ratones. A continuación, se ajustaron los datos con una función sigmoidea en Igor Pro 6.11 (WaveMetrics):

máx

f W = b a s e —------ x750_ X n

exp (pendiente^

Se comparó el rendimiento conductual en la Figura 5H con una prueba de Wilcoxon bilateral del orden con signo (Igor Pro 6.11).

Modelos de dolor en ratones y experimentos conductuales:

Lesión por constricción crónica:

En ratones anestesiados profundamente con isoflurano administrado en O2 al 100%(unidad de anestesia Univentor 410; Univentor, Malta), se colocaron cuatro ligaduras de seda sueltas (5/0; Catgut GmbH Markneukirchen) alrededor del nervio ciático a nivel de la mitad del muslo derecho como se describió anteriormente (Wetzelet al.,2007).

Modelo de neuropatía diabética:

Para los experimentos con diabetes se utilizaron ratones C57BI/6 de ocho semanas de vida. Se indujo la diabetes. Resumiendo, se administraron 6 inyecciones intraperitoneales consecutivas de estreptozotocina (STZ, Sigma-Aldrich, n.° S0130) con intervalos de 24 horas a 60 mg/kg de peso corporal en tampón citrato (0,05 M, pH 4,5) para inducir la diabetes. La glucemia se mantuvo entre 400 y 500 mg/dl durante todo el periodo experimental. La sensibilidad mecánica se midió a intervalos regulares y solo se seleccionaron aquellos ratones que mostraban una mayor sensibilidad a los filamentos de von Frey en comparación con la sensibilidad basal para probar los efectos del OB-1.

Pruebas conductuales:

Se aplican filamentos de Von Frey de resistencia creciente (0,07, 0,16, 0,4, 0,6, 1,0 y 1,4 g) 5 veces con un intervalo de al menos 1 min a la superficie intraplantar de las patas traseras para comprobar la sensibilidad mecánica. El estímulo se aplicó hasta que el filamento se dobló y una retirada brusca de la pata se consideró una respuesta positiva. Se registró la frecuencia de respuestas positivas de cada 5 estímulos y se calculó el porcentaje de frecuencia de retirada. El umbral se calculó como la fuerza del filamento de von Frey necesaria para provocar una frecuencia de retirada del 60 %. Se inyectó vehículo u OB-1 (aproximadamente 20 pl de solución, 250 pmol por pata) por vía subcutánea en la superficie intraplantar de ratones diabéticos bajo anestesia suave de isoflurano y se midió la sensibilidad mecánica de las patas inyectadas (ipsilaterales) y no inyectadas (contralaterales) a las 4 y 24 horas tras la inyección.

Evaluación del dolor provocado por el tacto:

Se dejó que los ratones se habituaran al aparato de ensayo (cámaras acrílicas de 10 * 10 cm de tamaño, suspendido sobre una rejilla de malla metálica) una hora antes de la prueba de comportamiento. Solo una vez que el sujeto permaneció en reposo y sin moverse, se aplicaron monofilamentos de pelo de von Frey calibrados (juego Aesthesio® de 20 monofilamentos, Ugo Basil) en la superficie plantar de la pata trasera para aplicar fuerzas objetivo de 0,008 gramos a 4 gramos, aumentando en una escala aproximadamente logarítmica. Un único estímulo, indicado por una ligera flexión del filamento, duró dos segundos a menos que el ratón retirara la pata. Para medir la mecanosensibilidad, se adaptó el método de arriba a abajo descrito por Chaplan 13 de la siguiente manera: la prueba comenzó con un filamento que aplicaba una fuerza objetivo de 0,4 g, pero se aplicaron filamentos tres veces. Se observó una respuesta positiva si el sujeto retiraba la pata a las tres aplicaciones del filamento, de modo que el filamento más pequeño se presentara a continuación. Se observó una respuesta negativa si el sujeto no respondía a al menos una de las presentaciones del filamento, en este caso, se presentaba a continuación el filamento más grande. Los umbrales de retirada de la pata se calcularon como una mediana de 23 a 30 puntos de inflexión determinados de los estímulos de fuerza específicos aplicados al sujeto.

Las inyecciones farmacológicas de OB-1 o DMSO solo se disolvieron en solución de Ringer (en mM: NaCl 135, KCI 5, HEpES 5, CaCl21,8, MgCh 1) para preparar la solución de OB-1 y vehículo. Las inyecciones se realizaron 3 horas antes de la prueba de comportamiento, y se inyectó una solución de aproximadamente 20 pl, 250 pmol por pata, en la palma con una jeringa Hamilton, calibre 33. Durante el procedimiento de inyección, se anestesió al ratón con isoflurano (del 1,5 al 2,5 % en O2). El procedimiento de inyección duró aproximadamente 3 minutos, tras los que se trasladó al ratón a su jaula de origen para que se recuperara antes de las pruebas de comportamiento.

Evaluación del comportamiento del dolor provocado por la temperatura:

Se realizaron pruebas en la superficie plantar de la pata trasera mediante una fuente de luz de calor radiante y enfocada (IITC Life Science Inc.). El haz de luz se enfocó en la parte superior de una base calefactora integrada, controlada digitalmente para mantener temperaturas constantes (en este caso, 32 °C), y creó un punto intenso de 4 x 6 mm en la pata trasera del sujeto. Se determinó el tiempo transcurrido hasta la retirada de la pata en respuesta a un estímulo de calor en constante aumento (intensidad activa máxima = 25 % de la fuente de luz) con un límite de 20 segundos. Los estímulos de calor se repitieron 6 veces para cada pata, con un intervalo de 1 minuto.

Generación de ratones Stoml3LacZ:

Los clones BAC de ratón C57BL/6J (https:bacpac.chori.org) que contienen el gen /Stoml3/ se aislaron de la biblioteca RPCI-2314 Se aisló un fragmento de ADN de 12 kb que contiene el exón 1 y sus regiones flanqueantes del gen Stoml3 mediante reparación de gap15. Se utilizó recombinación homóloga en bacterias 1516 para fusionar un casete NLS-lacZ al ATG de Stoml3 e introducir el casete neo de autoescisión 17 en el locus de Stoml3. El casete MC1-toxina diftérica A (DTA) se colocó en el extremo 3' del vector y se utilizó para la selección negativa. Las colonias de la estirpe celular ES E14.1 (129/Ola) que habían incorporado el vector diana en su genoma fueron seleccionadas por G418 y analizadas para recombinación homóloga mediante transferencia Southern, utilizando sondas 5' y 3' externas al vector diana. Se microinyectaron dos clones en blastocistos C57BI/6 para generar quimeras que transmitían el alelo Stoml3lacZ. El genotipado rutinario se realizó mediante PCR (Stoml3-LacZ F: gac agt gtg atg tca ggg aag; LacZ int R: cct tcc tgt agc cag ctt tca tc; Stoml3-LacZ R: cct tgt aaa ctg ata gcg ggg ac) y, ocasionalmente, los genotipos se verificaron mediante hibridación de transferencia Southern.

Inmunohistoquímica:

Los ratones fueron perfundidos con PBS helado hasta blanquear el hígado, seguido de gluteraldehído al 0,5 % durante 20 minutos. Los GRD lumbares se diseccionaron, se fijaron posteriormente con glutaraldehído al 0,5 % en PBS durante 1 h a 4 °C, se lavaron varias veces con PBS y se crioprotegieron en sacarosa al 30 % durante la noche a 4 °C. Los GRD se integraron en la O.C.T. Tissue-Tek (Sakura Finetek, Países Bajos), se congelaron en hielo seco y se almacenaron a -80 °C. El tejido congelado incluido se cortó en un criostato CM3050S (Leica) y los portaobjetos se incubaron en tampón de reacción X-gal (ferrocianuro de potasio 35 mM, ferricianuro de potasio 35 mM, MgCh 2 mM, Nonidet P-40 al 0,02 %, desoxicolato de Na al 0,01 % y 1 mg/ml de X-Gal) durante 2 días a 37 °C. Los cortes se lavaron varias veces con PBS hasta que la solución dejó de amarillear, se secaron al aire y se sellaron con un cubreobjetos. Las secciones se observaron en un microscopio Zeiss Axiovert 135 utilizando el programa informático de imágenes Zen (Zeiss, Alemania). Se utilizó Image J (NIH, EE. UU.) para trazar manualmente los contornos de las células y obtener el área celular.

Microscopio electrónico:

Los ratones fueron perfundidos con formaldehído al 4 % recién preparado en tampón fosfato 0,1 M. Los nervios ciáticos se disecaron y se fijaron posteriormente en formaldehído al 4 %/glutaraldehído al 2,5 % en tampón de fosfato 0,1 M durante 3 días. Tras el tratamiento con OsO4 al 1 % durante 2 h, se deshidrataron en una serie graduada de etanol y óxido de propileno y se incluyeron en Poly/BedR 812 (Polysciences, Inc., Eppelheim, Alemania). Las secciones de semilina se tiñeron con azul de toluidina. Secciones ultrafinas (70 nm) se contrastaron con acetato de uranilo y citrato de plomo y se examinaron con un microscopio electrónico Zeiss 910. Las imágenes digitales se obtuvieron con una cámara<c>C<d>de barrido lento de alta velocidad de 1kx1k (Proscan) con un aumento original de 5600x. La obtención de imágenes fue realizada por Bettina Purfürst en el centro de microscopía electrónica del MDC.

Identificación de inhibidores de STOML3 de molécula pequeña

En los mamíferos, STOML3 pertenece a una familia de cinco proteínas de membrana estructuralmente conservadas, incluida la estomatina, STOML1, STOML2 y podocina1012'16, todas las cuales se autoasocian a través de su dominio de estomatina (Fig. 8a)10. La autoasociación de las proteínas del dominio de estomatina se puede monitorear en células HEK293 usando complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC), mediante la cual las mitades N y C-terminales de la molécula YFP se marcan con la proteína presa y cebo STOML3217 (Fig. 1a). La asociación irreversible de los fragmentos de YFP produce una fluorescencia que aumenta linealmente con el tiempo (Fig. 1 b). Las mutaciones en un par de STOML3 que interrumpen la oligomerización (V190P o LR89,90EE) reducen significativamente la velocidad de desarrollo de la señal (Fig. 1b)210. Se ha utilizado este ensayo celular en un formato de alto rendimiento para buscar moléculas pequeñas que inhiban significativamente la señal BiFC, una medida de la autoasociación de STOML3. En un cribado primario de aproximadamente 35.000 moléculas pequeñas (cada una a 10 pM), obtenidas de la colección central de compuestos de la unidad de cribado del Instituto Leibniz de Farmacología Molecular, se encontró que 21 moléculas disminuían de forma reproducible la autoasociación de STOML3 basándose en la pendiente de desarrollo de la señal YFP. Los dos compuestos inhibidores más efectivos fueron designados bloqueadores de oligomerización 1 y 2, (OB-1 y OB-2) (Fig. 1c,d). En ensayos de BiFC adicionales, el bloqueador de la oligomerización de STOML3, OB-1 fue un inhibidor eficaz de la autoasociación de estomatina, STOML1, STOML2, pero no la podocina (Fig. 8a). Las concentraciones menores de OB-1 (2 pM) también inhibieron la señal de BiFC (Fig. 8b). La molécula OB-1 también fue resintetizada y mostró la misma actividad en el ensayo de BiFC que la muestra disponible en el mercado. La secuencia del péptido STOML3 humano es un 92 % idéntica a la del ratón y un 100 % idéntica en el dominio central de la estomatina y esta secuencia probada en nuestro ensayo de BiFC también mostró autoasociación (Fig. 1e). Lo que es más importante para el desarrollo clínico, la autoasociación de la proteína STOML3 humana también fue inhibida por OB-1 (Fig. 1e).

La oligomerización de STOML3 dicta el tamaño del dominio en la membrana plasmática

A continuación, se determinó si la modulación por OB-1 y OB-2 del estado de oligomerización de STOML3 influye en la agrupación de la proteína en la membrana plasmática. Se utilizó microscopía dSTORM de superresolución18-20 para visualizar STOML3 marcada con FLAG en la membrana plasmática de células N2A transfectadas. Con el uso de dSTORM, se pudo demostrar que STOML3 estaba presente en microdominios en la membrana plasmática (Fig. 1f). El tamaño de los cúmulos de STOML3 era variable (anchura completa a la mitad máxima, FWHM= 24,6 ± 2,8 nm, media ± DE), pero estos dominios pueden contener más de un dímero STOML3 10 La introducción de la mutación V190P interrumpe la oligomerización de STOML3 y suprime su capacidad de modular la mecanosensibilidad de los canales Piezo12 Esta variante de STOML3 mostró agrupaciones significativamente más pequeñas en la membrana plasmática (Fig. 1f,g), demostrando que interrumpiendo la oligomerización de STOML3 podemos manipular y medir cambios a nanoescala en el tamaño de las agrupaciones de STOML3. La preincubación de células N2A que expresan STOML3-FLAG con OB-1 u OB-2 durante tres horas condujo a una reducción significativa del tamaño de los grupos de STOML3-FLAG en comparación con las células tratadas con vehículo (Fig. 1e,f). Los efectos de OB-1 no reflejaron cambios en los niveles de ARNm de Stoml3 en estas células (Fig. 9a). Por lo tanto, obtuvimos apoyo independiente de que OB-1 y OB-2 reducen el estado de oligomerización de STOML3, una consecuencia importante de la cual es una reducción del tamaño de la agrupación de STOML3 en la membrana plasmática.

Los inhibidores de STOML3 modulan las corrientes de mecanotransducción

La expresión endógena de STOML3 en células N2A es necesaria para mantener la sensibilidad del canal Piezo a la desviación de la membrana2. Mediante la deflexión precisa de áreas definidas de la interfaz membrana-sustrato utilizando una matriz de pilares pudimos activar corrientes Piezo1 en células N2A con desplazamientos que oscilaban entre 100 y 1000 nm (Fig. 2a). Tanto OB-1 como OB-2 redujeron la sensibilidad de las corrientes mecanosensibles a la desviación del pilar (Fig. 2b). La preincubación de las células con OB-1 durante periodos de entre 1 y 3 h redujo las amplitudes de la corriente Piezo1, pero el efecto solo fue máximo después de 3 h (Fig. 9b). El registro de las corrientes activadas mecánicamente en presencia de diferentes concentraciones de OB-1 reveló una fuerte dependencia de la concentración con un IC50 calculado de 10 nM, coeficiente de Hill 0,6 (Fig. 2c).

Se evaluaron los efectos de OB-1 y OB-2 sobre las corrientes mecanosensibles en neuronas sensoriales de ratón cultivadas de forma aguda. Las neuronas se clasificaron en función de su configuración de los PA como mecanorreceptores o nociceptores221. Encontramos que las corrientes activadas mecánicamente en mecanorreceptores comienzan a activarse con desviaciones de membrana de <50 nm2, pero esta sensibilidad se redujo sustancialmente tras la exposición a OB-1 u OB-2 (Fig.2 d,e). Por tanto, solo se observaron corrientes activadas mecánicamente significativas en células tratadas con OB-1 u OB-2 con desviaciones superiores a 100 nm. El umbral para la activación de corrientes mecanosensibles en neuronas sensoriales nociceptivas es normalmente considerablemente más alto que el encontrado en mecanorreceptores2, un hallazgo que los presentes inventores reproducido aquí (Fig. 2f). Sin embargo, también observamos que el tratamiento con OB-1 u OB-2 producía una reducción significativa en la amplitud de las corrientes mecano-sensibles en nociceptores con magnitudes de estímulo entre 100 y 500 nm (Fig. 2f). Además, la latencia de las corrientes mecánicamente activadas, así como la constante de tiempo de activación de la corriente T1, se redujeron significativamente en los nociceptores tras el tratamiento con OB-2 (Fig. 2c,d suplementaria). La exposición de las neuronas sensoriales a OB-1 durante 3 horas no condujo a ningún cambio en el nivel de transcritosStoml3(Fig. 9a), lo que sugiere que los compuestos probados en el presente documento no actúan regulando la expresión génica, o la estabilidad de las transcripciones. La indentación del soma celular también puede utilizarse para provocar las denominadas corrientes de adaptación rápida (corrientes RA, constante de inactivación T2 <5 ms) en neuronas sensoriales mecanorreceptoras2122 y, tras la exposición a OB-1, el 60% de las neuronas (12/21 neuronas) no mostraron ninguna corriente mecanosensible en comparación con las neuronas de control o tratadas con vehículo (21 %, 8/38 neuronas), este efecto fue estadísticamente significativo (prueba exacta de Fisherp<0,01 Fig. 10a-e). Ninguno de los dos compuestos ensayados tuvo efectos discernibles sobre las corrientes activadas por tensión o la excitabilidad de la membrana, como lo demuestra el hecho de que los PA eran de amplitud y forma normales después del tratamiento (Fig. 2h,i). Por ejemplo, las neuronas sensoriales cultivadas tratadas durante al menos 3 h con OB-1 20 pM no mostraron alteraciones en una serie de parámetros indicativos de la excitabilidad eléctrica (Fig 2g-i, Tabla 1). Resumiendo, utilizando dos ensayos independientes encontramos que la OB-1 es un fuerte inhibidor de las corrientes nativas mecanosensibles. Las proteínas con dominio de estomatina también pueden regular negativamente a los miembros de la familia de canales iónicos sensibles a ácidos (ASIC, Acid Sensing Ion Channel) de una manera específica para cada subunidad 6,10,23,24. Sin embargo, OB-1 no tuvo ningún efecto detectable sobre la modulación negativa de las corrientes mediadas por ASIC3 por la estomatina de ratón (Fig. 11).

Un inhibidor de STOML3 puede silenciar los receptores táctiles

Muchos mecanorreceptores cutáneos en ratonesStoml3-/-inervan la piel, pero no pueden ser activados por estimulación mecánica56. Se aplicaron inyecciones subcutáneas del compuesto OB-1 (250-500 pmol por pata) en la piel vellosa del pie lateral del ratón inervado por el nervio safeno y se registraron de aferentes sensoriales 3 h después utilizando una preparaciónex vivode piel-nervio525. En los ratones silvestres, la gran mayoría de las fibras mielinizadas y no mielinizadas son mecanosensibles4'6, lo que se demuestra trazando el pico provocado por la estimulación eléctrica local de las ramas nerviosas y buscando después el campo receptivo mecanosensible cercano (Fig. 3a). Por el contrario, en la piel pretratada con OB-1, más del 40% de las fibras Ap (19/44) carecían de un campo receptivo mecanosensible, y esto fue significativamente diferente de los controles inyectados con vehículo, en los que se observó que menos del 7%(5/69 fibras) eran insensibles a los estímulos mecánicos,p<0,001, prueba exacta de Fischer (Fig. 3a).

Entre las fibras A8, también se observó un aumento de la proporción de fibras para las que no se pudo encontrar ningún campo receptivo mecanosensible (21 %, 8/38 fibras frente al 5 %, 1/18 fibras en los controles, pero no hubo diferencias significativas; prueba exacta de Fisher,p>0,14). Tampoco hubo cambios en la proporción de fibras C que carecen de un campo receptivo mecanosensible (Fig. 3a). A continuación, se examinaron las propiedades fisiológicas de los aferentes mecanosensibles restantes en la piel tratada con OB-1. Sin embargo, la proporción de tipos de mecanorreceptores encontrados, así como la mecanosensibilidad del resto de mecanorreceptores de fibras Ap (mecanorreceptores de adaptación rápida y lenta, RAM y SAM) no se modificó en comparación con los controles (Fig. 3b-f, Fig. 12). El efecto de silenciamiento de mecanorreceptores del tratamiento local con OB-1 fue completamente reversible, ya que los registros de aferentes 24 h después del tratamiento no revelaron ninguna pérdida significativa de mecanosensibilidad, también en comparación con la piel tratada con vehículo (Fig. 3a). Por tanto, un inhibidor de la oligomerización de STOML3 puede silenciar de forma específica y reversible la actividad de los receptores táctiles sin modificar la excitabilidad axonal.

Aunque no se encontraron evidencias de que los nociceptores de fibras C sean silenciados por el tratamiento con OB-1 (Fig. 3a), sí se observó un efecto estadísticamente significativo del tratamiento local con OB-1 sobre la mecanosensibilidad de las fibras C aferentes que responden tanto a estímulos térmicos como mecánicos (fibras C-mecanotérmicas, C-MH, ANOVA bifactorial,p<0,05) (Fig. 3c). Las fibras C-mecanotérmicas también mostraron umbrales mecánicos significativamente elevados para la activación que fueron, en promedio, casi el doble que los de las fibras de control (196,5 ± 35,6 mN en la piel tratada con OB-1 frente a 106,9 ± 17,4 mN en la piel tratada con vehículo, prueba de laUde Mann-Whitney,p<0,05), según las mediciones realizadas utilizando un sistema de medición de fuerza acoplado a la sonda de estímulo (Fig. 3d). Las tasas de disparo de los mecanonociceptores C (C-Ms) que carecen de sensibilidad térmica, a estímulos mecánicos supralumbrales no se atenuaron significativamente en la piel tratada con OB-1 (Fig. 3e,f).

El tratamiento local con OB-1 atenúa la percepción del tacto

Se utilizó una tarea de percepción táctil en ratones con restricción craneal para evaluar los efectos de OB-1 sobre la sensación táctil. Los ratones con restricción de agua fueron entrenados para presionar un sensor con su pata delantera dentro de los 500 ms después del inicio de un estímulo mecánico coseno de 30 ms aplicado a la misma pata. Las respuestas correctas se recompensaron con agua. Los ratones aprendieron esta tarea con un alto grado de fiabilidad tras un periodo de entrenamiento de 10 días (Fig. 4a). Se utilizaron diferentes amplitudes de estímulo para determinar una curva psicométrica para cada ratón (Fig. 4a,b). A continuación, se inyectó la solución vehículo del fármaco en la pata delantera y se obtuvo una nueva curva psicométrica para cada ratón entre 3 y 5 horas después. Al día siguiente, se inyectó en la pata delantera el compuesto OB-1 (11 nmol por pata) y se realizaron pruebas de comportamiento. Al menos 24 h después del día de la prueba con OB-1, se comprobó el comportamiento de recuperación sin ninguna inyección previa. Tras el tratamiento con OB-1, la curva psicométrica se desplazó hacia la derecha para intensidades de estímulo entre 125-275 pm, indicando una detección de estímulos menos fiable (prueba del orden con signo de Wilcoxon, vehículo frente a OB-1,p= 0,026; OB-1 frente a la recuperación,p= 0,0043) (Fig. 4 b,c). El tratamiento con vehículo no produjo cambios significativos en la curva psicométrica (prueba del orden con signo de Wilcoxon, control frente al vehículo,p= 0,30). Las tasas de detección de estímulos umbrales volvieron a los niveles previos al tratamiento 1-4 d después del tratamiento farmacológico (prueba del orden con signo de Wilcoxont, vehículo frente a la recuperación,p= 0,12). Estos datos indican que el silenciamiento de un subconjunto de mecanorreceptores mediante la inhibición de STOML3 es suficiente para reducir la fiabilidad de la percepción táctil cercana al umbral en ratones.

El bloqueo periférico de STOML3 revierte la alodinia táctil

El dolorneuropáticoes una afección debilitante en la que un dolor intenso puede iniciarse con un simple roce de la piel, activando mecanorreceptores de bajo umbral7'92627. Se utilizó el modelo de lesión por constricción crónica (LCC), que implica un daño directo a los axones del nervio ciático (Fig. 13a-f) que inervan la piel hipersensible de la pata trasera plantar. Los umbrales basales de retirada de la pata en ratones de tipo silvestre yStoml3-/-no difirieron, medidos con pelos de von Frey mediante un método updown adaptado28 (Fig. 5a). Sin embargo, tras la inducción de una LCC9 unilateral, los umbrales de retirada de la pata disminuyeron profundamente en los ratones de tipo silvestre, pero solo se redujeron moderadamente en los ratonesStoml3-/-,ANOVA bifactorial,p<0,001 (Fig. 5a). Está bien descrito que la hiperalgesia térmica también acompaña a la lesión neuropática7929, un fenómeno que también se ha observado. Sin embargo, la hiperalgesia térmica observada en ratonesStoml3-/-fue idéntica a la de los controles de tipo silvestre (Fig. 5b).

A continuación, se comprobó si la aplicación local de OB-1 puede mejorar el comportamiento doloroso provocado por el tacto en modelos neuropáticos. No se encontraron cambios en los umbrales de retirada de la pata a estímulos mecánicos o en la latencia de retirada para estímulos de calor radiante en las patas de ratones sin tratamiento previo tratados con una dosis intraplantar de OB-1 (250-500 pmol por pata) (Fig. 5c). Sin embargo, cuando se aplicó una dosis intraplantar de OB-1 a las patas de ratones de tipo silvestre con dolor neuropático establecido (modelo LCC, 6 21 días después de la inducción), se observó una inversión completa del dolor o la alodinia provocados por el tacto,p<0,001; prueba de laUde Mann-Whitney (Fig. 5d). La reversión de la alodinia táctil observada con el tratamiento local con OB-1 fue indistinguible de la encontrada con el tratamiento sistémico con gabapentina (Fig. 5d), un fármaco convencional de acción central, de uso clínico para el tratamiento del dolor neuropático 30 También se aplicó OB-1 a la pata contralateral a la misma concentración que fue eficaz para revertir la alodinia presente en la pata ipsilateral a la lesión, pero no se observó ninguna reversión de la hipersensibilidad establecida (Fig 5d). Estos resultados indican claramente que las acciones del OB-1 en la reversión de la hipersensibilidad se deben a la inhibición de la mecanotransducción de las neuronas sensoriales en la piel y no a acciones sistémicas o centrales. Los efectos de una dosis única de OB-1 fueron máximos 3 h después de las inyecciones y desaparecieron lentamente durante las 12 h siguientes, de modo que el efecto desapareció a las 24 h (Fig. 5e). Utilizando una serie de concentraciones de OB-1 pudimos determinar una dosis eficaz semimáxima (DE50) de 4,42 pM (o aproximadamente 20 pmol por pata) (Fig. 5f). Se supone que la aplicación local de OB-1 revierte la hipersensibilidad mecánica tras la LCC principalmente mediante la inhibición de la oligomerización de STOML3. Se decidió probar esta idea más directamente probando los efectos de OB-1 local en la sensibilidad mecánica de ratonesStoml3-/-con LCC. La hipersensibilidad mecánica tras la LCC es mucho menos prominente en ratonesStoml3-/-(Fig. 5a,g), pero no se observó ningún cambio en el umbral de retirada de la pata tras el tratamiento de las patas neuropáticas de ratonesStoml3-/-con OB-1 (Fig. 5g). Los efectos fuera de diana son un problema para cualquier molécula pequeña activa biológicamente. Por lo tanto, se probaron los efectos de OB-1 20 pM en un panel farmacológicoin vitrodisponible en el mercado (www.cerep.fr) que consiste 79 receptores y canales iónicos. Se observó una inhibición significativa de la unión de ligandos específicos a los receptores seleccionados en unos cuantos casos (6/79), pero en la actualidad no hay datos que impliquen a ninguno de estos receptores en la nocicepción periférica. La concordancia entre los efectosin vitroein vivode la inhibición de STOML3 y los resultados de la ablación genética deStoml3en el ratón indican que OB-1 ejerce sus efectos biológicos principalmente sobre STOML3. La protección notable frente al dolor provocado por el tacto en animales que carecían de STOML3 nos llevó a plantear la hipótesis de que la lesión nerviosa podría provocar por sí misma un cambio en los niveles de expresión del ARNm deStoml3en el DRG. A su vez, la regulación al alza de STOML3 podría agravar el dolor provocado por el tacto al aumentar la sensibilidad de la mecanotransducción en los aferentes sensoriales lesionados. Mediante PCR cuantitativa en tiempo real, medimos una duplicación de los niveles de expresión de ARNm deStoml3(número de copias de ARNm 68,5± 4,6) en los DRG lumbares que proyectan axones al lugar de ligadura en comparación con el lado no lesionado de control (35,2 ± 3,6,p<0,01; Prueba de laUde Mann-Whitney) (Fig. 5h).

El modelo de LCC implica el daño directo a los axones que inervan la piel hipersensible, en este caso la pata trasera plantar31. También se induce hipersensibilidad neuropática al tacto en la misma zona cutánea cortando nervios adyacentes al nervio tibial que inerva el pie plantar 3233. Los ratones con lesión de nervio preservado (SNI) tibial desarrollan una hipersensibilidad duradera de magnitud similar a la observada tras la LCC (Fig. 14a). La administración de OB-1 en la piel plantar en el modelo SNI no produjo reversión de la alodinia (Figura 14b). Se extirparon los GRD lumbares de estos animales y no se encontraron cambios en los niveles de ARNm deStoml3entre el lado lesionado y el no lesionado en este modelo (Fig. 14c). Este hallazgo indica que los efectos de OB-1 en el alivio de la hipersensibilidad mecánica pueden depender en parte de si los niveles de STOML3 están regulados al alza.

La hiperalgesia mecánica es también una característica destacada del dolor inflamatorio, que depende en gran medida del aumento de los niveles del factor de crecimiento nervioso (NGF)34. Una dosis sistémica de NGF (1 mg/kg) es suficiente para provocar una hiperalgesia mecánica y térmica duradera3435, que no se modificó en los ratonesStoml3-/-inyectados con NGF (Fig. 14d,e). Adicionalmente, la hipersensibilidad mecánica después de NGF tampoco fue revertida por OB-1 local intraplantar (Fig. 14f,g). Estos datos concuerdan con la opinión predominante de que la hiperalgesia mecánica cutánea dependiente de NGF se debe principalmente a la sensibilización central3436.

Regulación de ARNm de Stom l3 y proteína tras lesión

Los niveles de ARNm deStoml3son muy bajos en el GRD y nunca se ha encontrado un anticuerpo que sea lo suficientemente sensible o específico para detectar STOML3 endógeno. Por lo tanto, se generaron dos nuevos modelos de ratón con inserción para monitorizar, en el primer caso, la expresión del genStoml3y, en el segundo, la proteína STOML3. Por tanto, se generó un alelo de inserción en el que se fusionó un casete de p-galactosidasa con una señal de localización nuclear (NLS) en el marco con el codón de inicio del genStoml3(ratones Stoml3lacZ) (Fig. 15 a-c). Este alelo indicador nos permitió visualizar subconjuntos de neuronas sensoriales que expresanStoml3(Fig. 6a). Se observó la tinción lacZ en alrededor de la mitad de las neuronas sensoriales con cuerpos celulares >20 pm de diámetro, una población conocida por estar formada por mecanorreceptores (Fig. 6a). El número de neuronas con expresión de lacZ fue más del doble en los ganglios L6-L4 después de una exposición a LCC unilateral y las células fueron predominantemente >20 pm de diámetro, prueba exacta de Fisher,p<0,0001 (Fig. 6b). Estos datos son coherentes con la idea de que la constricción nerviosa crónica conduce a un aumento en el número de neuronas sensoriales grandes y medianas que expresan niveles más altos deStoml3.En consonancia con nuestra observación de que los niveles de ARNm de Stoml3 son muy bajos en el GRD, las células con expresión de LacZ fueron difíciles de visualizar cuando se realizó el cribado de la actividad p-galactosidasa y los anticuerpos dirigidos contra la proteína p-galactosidasa no dieron ninguna tinción positiva.

En el segundo ratón con inserción se introdujeron nucleótidos que codifican la etiqueta Strepll373' del codón de inicio (Fig 6c, Fig. 15d-f). La fusión genómica tuvo éxito, ya que pudimos amplificar transcripciones de ARNm deStoml3que contenían la secuencia de nucleótidos que codificaba unStoml3marcado N-terminal con Strepll. Se realizó una transferencia de Western para la proteína marcada con Strepll en ratones con LCCStoml3StrepI1y extrajimos proteína del nervio ciático el día 2, día 6 y día 13 después de la lesión. Pudimos detectar una banda específica (ausente en el nervioStoml3-/-)del peso molecular apropiado en extractos de proteína del nervio ciático, pero solo después de utilizar un tampón desnaturalizante fuerte que contenía urea 8 M (Fig 6d). A veces se pudo detectar la banda Strepll-STOML3 en extractos hechos de GRD, pero era mucho más débil y menos fiable. De manera notable, se encontraron bandas Strepll-STOML3 positivas más intensas en el lado lesionado en el día 2, día 6 y, en menor medida, en el día 13 en comparación con el nervio contralateral no lesionado (Fig. 6d). El hecho de que la banda del marcador neuronal PGP9.5 disminuyera drásticamente en intensidad en el lado lesionado varios días después de la lesión, probablemente refleja la pérdida y atrofia de axones, pero a pesar de ello los niveles de STOML3 estaban aumentados. Estos resultados indican que STOML3 endógeno se transporta preferentemente a las terminaciones periféricas de las neuronas sensoriales38 para modular la mecanotransducción y que hay más STOML3 transportado a las terminaciones sensoriales después de una lesión nerviosa traumática.

Informes recientes han indicado que los mecanismos centrales de la hipersensibilidad asociada a la lesión nerviosa en roedores machos y hembras difieren39. La mayor parte de nuestras mediciones conductuales y electrofisiológicas se realizaron en ratones macho, pero comprobamos que una proporción casi idéntica de fibras Ap tratadas con OB-1 eran insensibles a estímulos mecánicos en ratones hembra que en ratones macho (Figura 16a). El tratamiento de las patas de ratones hembra con LCC con OB-1 también revirtió la hipersensibilidad mecánica en una medida similar a la observada en los machos (Fig. 16b,c).

STOML3 y neuropatía diabética dolorosa

La neuropatía es un síntoma prominente de la diabetes, y a menudo se caracteriza por dolor iniciado por estimulación táctil normalmente inocua en hasta el 20 % de todos los pacientes40. A continuación, nos preguntamos si OB-1 es eficaz en un modelo de ratón de neuropatía diabética dolorosa. Se utilizó el modelo de estreptozotocina (STZ) para inducir hipersensibilidad mecánica en ratones diabéticos41. Entre 6-7 semanas después del tratamiento con STZ, los ratones asignados al grupo del fármaco y del vehículo empezaron a mostrar hipersensibilidad a los estímulos mecánicos, como se refleja en el aumento de la frecuencia de retirada de la pata ante filamentos de von Frey de menos de 0,5 g (Fig. 7 a-d). El tratamiento local de la piel glabra de la pata trasera con OB-1 (250 pmol por pata) revirtió sustancialmente la hipersensibilidad mecánica 4 h después del tratamiento, mientras que el tratamiento con vehículo no tuvo efecto (Fig 7a-d). La hipersensibilidad mecánica volvió a los niveles previos al tratamiento con el fármaco 24 h después de un único tratamiento, según lo evaluado por el umbral medio de retirada del 60 % (Fig. 7a,b).

Ensayo de TriGFP para la validación de derivados

Se identificaron tres nuevos inhibidores de STOML3 estructuralmente relacionados con OB-1 utilizando un ensayo de interacción proteína-proteína basado en la asociación tripartita entre dos etiquetas GFP de veinte aminoácidos de longitud, GFP10 y GFP11, que se fusionaron con las proteínas asociadas hsSTOML3, y el detector complementario GFP1-9 (Referencia 50). En este ensayo, se cotransfectaron células N2a con plásmidos que codificaban GFP1-9, STOML3-GFP10 y St Om L3-GFP11 y se incubaron con vehículo (0,4 % de Dm SO) o derivados de OB-1 a una concentración final de 20 pM durante 16 h. Veinticuatro horas después de la transfección se recogieron las células, se fijaron con PFA al 4 % y se resuspendieron en PBS. La intensidad de la señal de GFP se midió utilizando la tecnología de citometría de flujo mostrando que los derivados de OB-1 reducen fuertemente la autoasociación de frsSTOML3 resultando en una intensidad de señal de GFP sustancialmente menor en comparación con las células tratadas con vehículo (Fig 17).

Análisis de los resultados

La sensación táctil en los mamíferos está empezando a desentrañarse a nivel molecular4243. Los canales iónicos mecanosensibles, tales como Piezo1 y Piezo2, pueden resultar objetivos difíciles de explotar para la intervención farmacológica44. Por ejemplo, la letalidad embrionaria o postnatal temprana asociada a la deleción de los genesPiezoloPiezo24546y el papel de Piezo2 en la propiocepción47 podrían resultar problemáticos para el desarrollo de antagonistas de Piezo con fines terapéuticos.

La presente invención describe un enfoque interseccional para modular la mecanotransducción sensorial, ya que los compuestos descritos en el presente documento son preferentemente eficaces en células en donde están presentes tanto los canales STOML3 como Piezo. Este enfoque tiene la ventaja de que las funciones esenciales de las proteínas Piezo no se verán directamente afectadas por los compuestos descritos en el presente documento y, sin embargo, podemos obtener una inhibición selectiva y potente de la mecanotransducción sensorial, especialmente en determinadas condiciones fisiopatológicas. Los presentes inventores demostraron que OB-1 tiene un potente efecto silenciador en aproximadamente el 40 % de los mecanorreceptores y concluyeron que la transformación del estímulo mecánico en potencial receptor está gravemente alterada en estas células. Las corrientes mecanosensibles también fueron inhibidas por OB-1 en algunos nociceptores en nuestros estudiosin vitro(Fig. 2f) y, en consonancia con esto, los umbrales mecánicos fueron significativamente elevados en muchas fibras C cutáneas utilizando la preparaciónex vivopiel-nervio (Fig. 3). Se propone que la inhibición de STOML3 silencia los mecanorreceptores principalmente reduciendo la sensibilidad al desplazamiento de los canales iónicos Piezo2 en los mecanorreceptores. Es posible que las corrientes activadas mecánicamente en los nociceptores no dependan de Piezo24, pero estudios de secuenciación profunda han detectado transcripciones Piezo1 en muchas neuronas sensoriales individuales de ratón48 y los canales Piezo1 también están fuertemente modulados por STOML32 La aplicación cutánea del inhibidor de STOML3 OB-1 muestra una eficacia notable en la reducción del comportamiento doloroso provocado por el tacto en dos modelos de ratón de dolor neuropático. Existe un daño directo en los axones que inervan la piel sensibilizada en el modelo LCC que se asocia con un aumento de la expresión deStoml3,así como con un aumento del transporte de la proteína STOML3 a la periferia (Fig. 6). Por tanto, los presentes inventores suponen que la notable eficacia del OB-1 en modelos de dolor, incluyendo la neuropatía diabética dolorosa está directamente relacionada con los cambios en la disponibilidad de STOML3 en las terminaciones sensoriales durante la progresión de la enfermedad. Resumiendo, la presente invención proporciona la validación de nuevos agentes farmacológicos para modular la mecanotransducción sensorial con el fin de tratar trastornos sensoriales, incluido el dolor.

Tabla 1.Falta de efecto del OB-1 sobre las propiedades del potencial de acción en neuronas de GRD de ratón disociadas:

Tipo de neurona Vreposo PAamp PPH (mV) PAtiempo Tpico Trep (ms) Umbral (pA) R de (mV) (mV) (ms) (ms) entrada (MO) Vehículo Nociceptores -57,1 ±1,6 118,7 ±2,3 -66,2 ± 1,3 10,0 ± 1,6 3,5 ± 1,5 6,5 ± 0,5 858,3 ± 231,3 86,2 ± 15,6 (n = 13)

OB-1 Nociceptores -59,5 ± 1,2 115,4 ± 4,0 -67,4 ± 1,3 10,0 ± 1,5 5,0 ± 0,7 5,0 ± 1,1 1276,4 ± 256,0 56,7 ± 5,2

Valor dep0,68 0,35 0,06 0,23 0,19 0,46 0,35 0,22 Vreposo (Potencial de reposo), PAamp (amplitud del potencial de acción), PPH (potencial de posthiperpolarización), PAtiempo (duración total del potencial de acción), Tpico (tiempo hasta el pico del potencial de acción), Trep (tiempo hasta el pico de repolarización). Todos los datos se presentaron como la media ± EEM.

Bibliografía

1. Bensmaia, S. J. "Tactile intensity and population codes".Behav. Brain Res.190, 165-173 (2008).

2. Poole, K., Herget, R., Lapatsina, L., Ngo, H.-D. y Lewin, G. R. "Tuning Piezo ion channels to detect molecularscale movements relevant for fine touch".Nat. Commun.5, 3520 (2014).

3. Woo, S.-H.et al."Piezo2 is required for Merkel-cell mechanotransduction".Nature(2014). doi:10.1038/nature13251

4. Ranade, S. S.et al."Piezo2 is the major transducer of mechanical forces for touch sensation in mice".Nature516, 121-125 (2014).

5. Moshourab, R. A., Wetzel, C., Martinez-Salgado, C. y Lewin, G. R. "Stomatin-domain protein interactions with acid-sensing ion channels modulate nociceptor mechanosensitivity".J. Physiol.591, 5555-5574 (2013).

6. Wetzel, C.et al."A stomatin-domain protein essential for touch sensation in the mouse".Nature445, 206-209 (2007).

7. Costigan, M., Scholz, J. y Woolf, C. J. "Neuropathic pain: a maladaptive response of the nervous system to damage".Annu. Rev. Neurosa.32, 1-32 (2009).

8. von Hehn, C. A., Baron, R. y Woolf, C. J. "Deconstructing the Neuropathic Pain Phenotype to Reveal Neural Mechanisms".Neuron73, 638-652 (2012).

9. Tal, M. y Bennett, G. J. "Extra-territorial pain in rats with a peripheral mononeuropathy: mechano-hyperalgesia and mechano-allodynia in the territory of an uninjured nerve".Pain57, 375-382 (1994).

10. Brand, J.et al."A stomatin dimer modulates the activity of acid-sensing ion channels".EMBO J.31, 3635-3646 (2012).

11. Poole, K.et al."Tuning Piezo ion channels to detect molecular-scale movements relevant for fine touch".Nat. Commun.5, 3520 (2014).

12. Wang, Y. y Morrow, J. S. "Identification and characterization of human SLP-2, a novel homologue of stomatin (band 7.2b) present in erythrocytes and other tissues".J. Biol. Chem.275, 8062-8071 (2000).

13. Boute, N.et al."NPHS2, encoding the glomerular protein podocin, is mutated in autosomal recessive steroidresistant nephrotic syndrome".Nat. Genet.24, 349-354 (2000).

14. Mairhofer, M., Steiner, M., Salzer, U. y Prohaska, R. "Stomatin-like protein-1 interacts with stomatin and is targeted to late endosomes".J. Biol. Chem.284, 29218-29229 (2009).

15. Da Cruz, S.et al."SLP-2 interacts with prohibitins in the mitochondrial inner membrane and contributes to their stability".Biochim. Biophys.Acta 1783, 904-911 (2008).

16. Lapatsina, L., Brand, J., Poole, K., Daumke, O. y Lewin, G. R. "Stomatin-domain proteins".Eur. J. Cell Biol.91, 240-245 (2012).

17. Hu, C.-D., Chinenov, Y. y Kerppola, T. K. "Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementaron".Mol. Cell9, 789-798 (2002).

18. Heilemann, M.et al."Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes".Angew. Chem. Int. Ed. Engl.47, 6172-6176 (2008).

19. Lampe, A., Haucke, V., Sigrist, S. J., Heilemann, M. y Schmoranzer, J. "Multi-colour direct STORM with red emitting carbocyanines".Biol. Cell104, 229-237 (2012).

20. Wolter, S.et al."rapidSTORM: accurate, fast open-source software for localization microscopy".Nat. Methods9, 1040-1041 (2012).

21. Hu, J. y Lewin, G. R. "Mechanosensitive currents in the neurites of cultured mouse sensory neurones".J. Physiol.577, 815-828 (2006).

22. McCarter, G. C., Reichling, D. B. y Levine, J. D. "Mechanical transduction by rat dorsal root ganglion neuronsin vitro". Neurosci. Lett.273, 179-182 (1999).

23. Price, M. P., Thompson, R. J., Eshcol, J. O., Wemmie, J. A. y Benson, C. J. "Stomatin modulates gating of acidsensing ion channels".J. Biol. Chem.279, 53886-53891 (2004).

24. Kozlenkov, A., Lapatsina, L., Lewin, G. R. y Smith, E. S. J. "Subunit-specific inhibition of acid sensing ion channels by stomatin-like protein 1".J. Physiol.592, 557-569 (2014).

25. Milenkovic, N., Wetzel, C., Moshourab, R. y Lewin, G. R. "Speed and temperature dependences of mechanotransduction in afferent fibers recorded from the mouse saphenous nerve".J. Neurophysiol.100, 2771 2783 (2008).

26. Lewin, G. R. y Moshourab, R. "Mechanosensation and pain".J. Neurobiol.61, 30-44 (2004).

27. Beggs, S., Trang, T. y Salter, M. W. "P2X4R+ microglia drive neuropathic pain".Nat. Neurosci.15, 1068-1073 (2012).

28. Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M. y Yaksh, T. L. "Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw".J. Neurosci. Methods53, 55-63 (1994).

29. Baron, R. "Neuropathic pain: a clinical perspective".Handb. Exp. Pharmacol.3-30 (2009). doi:10.1007/978-3-540-79090-7_1

30. Dworkin, R. H.et al."Recommendations for the pharmacological management of neuropathic pain: an overview and literature update".Mayo Clin. Proc.85, S3-14 (2010).

31. Basbaum, A. I., Gautron, M., Jazat, F., Mayes, M. y Guilbaud, G. "The spectrum of fiber loss in a model of neuropathic pain in the rat: an electron microscopic study".Pain47, 359-67 (1991).

32. Decosterd, I. y Woolf, C. J. "Spared nerve injury: an animal model of persistent peripheral neuropathic pain".Pain87, 149-158 (2000).

33. Shields, S. D., Eckert, W. A. y Basbaum, A. I. "Spared nerve injury model of neuropathic pain in the mouse: a behavioral and anatomic analysis".J. Pain Off. J. Am. Pain Soc.4, 465-470 (2003).

34. Lewin, G. R., Lechner, S. G. y Smith, E. S. J. "Nerve growth factor and nociception: from experimental embryology to new analgesic therapy".Handb. Exp. Pharmacol.220, 251-282 (2014).

35. Lewin, G. R.et al."Nerve growth factor-induced hyperalgesia in the neonatal and adult rat".J. Neurosa.13, 2136-48 (1993).

36. Lewin, G. R., Rueff, A. y Mendell, L. M. "Peripheral and central mechanisms of NGF-induced hyperalgesia".Eur. J. Neurosci.6, 1903-12 (1994).

37. Korndorfer, I. P. y Skerra, "A. Improved affinity of engineered streptavidin for the Strep-tag II peptide is due to a fixed open conformation of the lid-like loop at the binding site".Protein Sci.11, 883-93 (2002).

38. Lapatsina, L.et al."Regulation of ASIC channels by a stomatin/STOML3 complex located in a mobile vesicle pool in sensory neurons".Open Biol.2, 120096 (2012).

39. Sorge, R. E.et al."Different immune cells mediate mechanical pain hypersensitivity in male and female mice".Nat. Neurosci.18, 1081-1083 (2015).

40. van Hecke, O., Austin, S. K., Khan, R. A., Smith, B. H. y Torrance, N. "Neuropathic pain in the general population: a systematic review of epidemiological studies".Pain155, 654-662 (2014).

41. Bierhaus, A.et al."Methylglyoxal modification of Nav1.8 facilitates nociceptive neuron firing and causes hyperalgesia in diabetic neuropathy".Nat. Med.18, 926-933 (2012).

42. Abraira, V. E. y Ginty, D. D. "The sensory neurons of touch".Neuron79, 618-639 (2013).

43. Lechner, S. G. y Lewin, G. R. "Hairy sensation".Physiology(Bethesda). 28, 142-150 (2013).

44. Syeda, R.et al."Chemical activation of the mechanotransduction channel Piezo1".Elife4, (2015).

45. Li, J.et al."Piezo1 integration of vascular architecture with physiological force".Nature(2014). doi:10.1038/nature13701

46. Ranade, S. S.et al."Piezo1, a mechanically activated ion channel, is required for vascular development in mice".Proc. Natl. Acad. Sci.EE. UU. 111, 10347-10352 (2014).

47. Woo, S.-H.et al."Piezo2 is the principal mechanotransduction channel for proprioception".Nat. Neurosci.18, 1756-62 (2015).

48. Usoskin, D.et al."Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale singlecell RNA sequencing".Nat. Neurosci.18, 145-153 (2015).

49. Milenkovic, N.et al."A somatosensory circuit for cooling perception in mice".Nat. Neurosci.17, 1560-1566 (2014).

50. Cabantous S,et al."A new protein-protein interaction sensor based on tripartite split-GFP association".Sci Rep.

4 de oct. de 2013; 3:2854

Claims

REIVINDICACIONES 1. Compuesto para su uso como un medicamento en el tratamiento del dolor de acuerdo con la Fórmula I, en donde dicho dolor es dolor neuropático, o está inducido por y/o asociado con la estimulación táctil, o en donde el sujeto de tratamiento presenta neuropatía diabética dolorosa, Fórmula I en donde R1= heterociclo aromático de 5 miembros, que comprende uno o más de N, O y/o S, opcionalmente sustituido con Yx, en donde x = 0, 1,2, 3, en donde Y puede ser igual o diferente, y en donde Y es nitro o alquilo C1-C7; R2= H; R3= H, alquilo C1-C7; R4= fenilo, opcionalmente sustituido con uno o más halógenos.
2. El compuesto para su uso como un medicamento en el tratamiento del dolor de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el compuesto es de acuerdo con la Fórmula II,

Fórmula II en donde R2, R3 y R4 son de acuerdo con la reivindicación 1, y en donde R5= nitro; R6 = H; R7= H, alquilo C1-C7.
3. El compuesto para su uso como un medicamento en el tratamiento del dolor de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el compuesto es de acuerdo con:
4. Compuesto de acuerdo con la Fórmula V: Fórmula V en donde R1= heterociclo aromático de 5 miembros, que comprende uno o más de N, O y/o S, opcionalmente sustituido con Yx, en donde x = 0, 1,2, 3, en donde Y puede ser igual o diferente, y en donde Y es nitro o alquilo C1-C7; R2= H; R3= H, alquilo C1-C7; R8= puede ser igual o diferente, H, halógeno (preferentemente CI), en donde al menos uno de R8 es halógeno.
5. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el compuesto es de acuerdo con la Fórmula VI:

Fórmula VI en donde R2= H; R3= H, alquilo C1-C7; R5= nitro; R6= H; R7= CH3; R8= puede ser igual o diferente, H, halógeno (preferentemente CI), en donde al menos uno de R8 es halógeno.
6. Compuesto de acuerdo con la Fórmula I:

Fórmula I en donde R1= heterociclo aromático de 5 miembros, que comprende al menos un N y al menos un S; R2= H; R3= H, alquilo C1-C7; R4= arilo, opcionalmente sustituido con uno o más halógenos (preferentemente Br, Cl o F).
7. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el compuesto es de acuerdo con la Fórmula IX:

Fórmula IX en donde R2= H; R3= H, alquilo C1-C7; R8= puede ser igual o diferente, H, halógeno (preferentemente CI), preferentemente, en donde al menos uno de R8 es halógeno.
8. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 4, que comprende una estructura de acuerdo con:
9. Compuesto para su uso como un medicamento en el tratamiento del dolor de acuerdo con la Fórmula IV, en donde dicho dolor es dolor neuropático, o está inducido por y/o asociado con la estimulación táctil, o en donde el sujeto de tratamiento presenta neuropatía diabética dolorosa,
en donde R4= puede ser igual o diferente, H, halógeno, alquilo C1-C7, opcionalmente sustituido con uno o más halógenos, en donde al menos 2 o 3 de R4 son H; R7= puede ser igual o diferente, H, halógeno, alquilo C1-C7, opcionalmente sustituido con uno o más halógenos, en donde al menos 2 o 3 de R7 son H; R8= puede ser igual o diferente, H, halógeno, alquilo C1-C7, opcionalmente sustituido con uno o más halógenos, en donde al menos 3 o 4 de R8 son H. 10. El compuesto para su uso como un medicamento en el tratamiento del dolor de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el compuesto es de acuerdo con:
11. Compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso como un medicamento en el tratamiento del dolor, en donde dicho dolor es dolor neuropático, o está inducido por y/o asociado con la estimulación táctil, o en donde el sujeto de tratamiento presenta neuropatía diabética dolorosa, en donde dicho tratamiento comprende la administración tópica de un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, o una composición que comprende dicho compuesto, a un sujeto que lo necesita.
12. Un método no terapéutico para la modulación de la percepción táctil que comprende la administración de un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, o una composición que comprende dicho compuesto, a un sujeto, preferentemente por vía tópica.
13. Composición farmacéutica para su uso como un medicamento en el tratamiento del dolor que comprende uno o más compuestos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores con un portador farmacéuticamente aceptable, preferentemente una composición adecuada para la administración tópica, en donde dicho dolor es dolor neuropático, o está inducido por y/o asociado con la estimulación táctil, o en donde el sujeto de tratamiento presenta neuropatía diabética dolorosa.