ES3040436T3

ES3040436T3 - Pharmaceutical composition comprising pyronaridine or a salt thereof, artemisinin or a derivative thereof or a combination of both for preventing or treating a respiratory disease caused by a coronavirus

Info

Publication number: ES3040436T3
Application number: ES21775231T
Authority: ES
Inventors: Jei Man Ryu; Chung Ju; Hyun Kyu Chung; Geum Sil Cho
Original assignee: Shin Poong Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Shin Poong Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2020-03-26
Filing date: 2021-03-25
Publication date: 2025-10-30
Anticipated expiration: 2041-03-25
Also published as: AU2021244009A1; EP4129290A1; US20230132036A1; CL2022002588A1; JP2023519277A; CO2022014992A2; CN115666572A; KR102910416B1; IL296721A; BR112022019198A2; CN115666572B; MX2022011885A; CR20220508A; EP4129290B1; UA130231C2; EP4129290C0; PH12022552516A1; US12485116B2; PL4129290T3; WO2021194290A1

Abstract

La presente invención se refiere al uso de pironaridina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, y/o artemisinina o un derivado de la misma, para la prevención o el tratamiento de una enfermedad infecciosa viral epidémica causada por ARN, y más específicamente, a una composición farmacéutica para la prevención o el tratamiento de una enfermedad infecciosa viral epidémica causada por ARN, en particular, la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19), dicha composición comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de pironaridina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, y/o artemisinina o un derivado de la misma, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composición farmacéutica que comprende pironaridina o una sal de la misma, artemisinina o un derivado de la misma, o una combinación de ambos para la prevención o el tratamiento de una enfermedad respiratoria causada por un coronavirus

Campo técnico

La presente invención se relaciona al uso de pironaridina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, y/o artemisinina o ciertos derivados de la misma para la prevención o tratamiento de una enfermedad respiratoria causada por una infección por coronavirus. Más específicamente, la presente invención se relaciona a una composición farmacéutica para la prevención o tratamiento de infecciones por coronavirus, específicamente, enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19), que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de pironaridina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, y/o artemisinina o tal derivado de la misma seleccionado del grupo que consiste en dihidroartemisinina, artesunato, artemeter y arteether, junto con un portador farmacéuticamente aceptable.

Técnica antecedente

Los virus de ARN que tienen genomas de ARN tienen una velocidad de mutación más alta que los virus de ADN y fácilmente generan mutantes adaptados a los cambios en el hospedero y el ambiente. Debido a esta propiedad, es difícil controlar los virus de ARN a través de agentes antivirales o vacunas profilácticas. Además, los virus de ARN codifican una ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp) que sintetiza ARN utilizando ARN como una plantilla en el genoma viral, y las ARN polimerasas de las células hospederas que sintetizan ARN utilizando ADN como una plantilla no pueden actuar en la replicación de los virus de ARN. Los virus de ARN se dividen en virus de ARN de una sola hebra de sentido positivo, de una sola hebra de sentido negativo y de doble hebra dsARN de acuerdo con la polaridad del genoma y sí o no el ARN genómico es de una polaridad idéntica a mARN.

Las infecciones virales agudas que se han dispersado recientemente alrededor del mundo y causado una crisis de salud pública global están dispersándose rápidamente a través del transporte y comercio del país donde el virus se origina a otros países, y hay una gran demanda global para el desarrollo de agentes terapéuticos. En particular, las epidemias por gripe de influenza H1N1 en el 2009, Ébola en África Occidental en el 2014 así como en la República Democrática del Congo en 2019, y Zika en el 2016 todas son infecciones por virus de ARN. El documento US 2007/142459 A1 describe métodos para inhibir la replicación de diversos virus mediante la administración de derivados relacionados con la artemisinina. El documento US 2014/011829 A1 describe la combinación de dos agentes, un primer derivado de artemisina y un segundo derivado de artemisina, para su uso en el tratamiento del dengue. El documento CN101857613B describe el uso de un derivado de éster de azúcar de artemisinina para el tratamiento de infecciones por los virus de la influenza A o B. De forma similar, el documento CN101898966B describe un derivado de artemisina obtenido de Artemisia rupestris para el tratamiento de infecciones por los virus de la influenza A o B. M. Waxman et al., 2017 (DOI: 10,1016/S1473-3099(17)30112-3) describen el tratamiento de pacientes con infección por el virus del Ébola con artemeter o artesunato parenteral, o artemeter-lumefantrina oral. T. R. Lane et al., 2019 (DOI: 10,1371/journal.pntd.0007890) analizan la eficacia del tetrafosfato de pironaridina como inmunomodulador durante la infección por el virus del Ébola. G. Mori et al., 2018 (DOI: 10,1016/J.TUBE.2018.08.004) mencionan que la pironaridina podría ser activa contra el virus del Ébola.

Shin Poong Pharm. Co. Ltd. comercializa un producto llamado “PYRAMAX”, una composición farmacéutica que contiene 180 mg de pironaridina y 60 mg de artesunato en un portador farmacéuticamente aceptable como agente antipalúdico (véase, por ejemplo, https://fdaghana.gov.gh/img/pils/Pyramax%20180mg+60mg%20Filmcoated%20Tablet%20(Pyronaridine%20tetraphosphate,%20Artesunate).pdf).

Los coronavirus son virus que pertenecen a la familia de virus de ARN de hebra positiva similar al virus Zika, tienen un genoma de ARN de una sola hebra de sentido positivo con un tamaño de 25-32 kb, y son virus zoonóticos capaces de infectar células tanto humanas como de animales, tales como células de aves y de mamíferos. Los coronavirus tienen una estructura en la cual las proteínas de espiga en forma de maza características sobresalen de sus envolturas exteriores. Los coronavirus son una familia de virus con varios miembros que incluyen SARS-CoV, MERS-CoV o SARS-CoV-2 (2019-nCoV) que causa Síndrome Respiratorio Agudo Severo (SARS) surgido en el 2003, Síndrome Respiratorio del Oriente Medio (MERS) recientemente surgido en Arabia Saudita en el 2012, o Enfermedad de Coronavirus 2019 (COVID-19, infección 2019-nCoV) recientemente declarada como una emergencia de salud pública de problema internacional (PHEIC) por la Organización Mundial de la Salud (WHO), respectivamente.

SARS-CoV causa Síndrome Respiratorio Agudo Severo, que se originó en China en el 2002 y se dispersó mundialmente, registrando una tasa de mortalidad de aproximadamente 10% en 8,096 pacientes. Usualmente está acompañado por alta fiebre y mialgia, y después de 2-7 días aparece una tos seca sin esputo, causando falla respiratoria en 10-20% de los pacientes. Puesto que un tratamiento apropiado todavía no se ha establecido, se pueden administrar agentes antibacterianos para neumonía atípica, en combinación con agentes antivirales tales como oseltamivir o ribavirina, o esteroides.

MERS-CoV se asume que es un virus transmitido de hospederos animales, tales como camellos a humanos, causando síndrome respiratorio agudo severo y falla renal, causando alrededor de 2,000 infecciones en 26 países que incluyen el Oriente Medio, con una tasa de mortalidad de 35.6% (WHO, 2016). El período de incubación es de aproximadamente 5 días, y está acompañado por fiebre, tos, dificultad para respirar y neumonía. Estuvo prevalente en una manera de transmisión limitada entre miembros familiares o miembros dentro de instituciones médicas, y comúnmente progresó a enfermedad severa en personas con enfermedades implícitas tal como diabetes.

SARS-CoV-2 (2019-nCoV) es un virus que causa COVID-19, y el primer caso se identificó en Wuhan, China en el 2019. Después de un período de incubación de 1-14 días, aparecen varios síntomas respiratorios, que varían de leves a severos, tal como tos, fiebre, malestar, dificultad para respirar, neumonía o síndrome de angustia respiratoria aguda, y raramente aparece esputo, dolor de garganta y diarrea. Debido a que no hay agente antiviral selectivo para este, está siendo utilizado el manejo sintomático solo o en combinación con el tratamiento con agentes antivirales previamente indicados para otras enfermedades virales.

Específicamente, COVID-19, el brote más reciente entre ellos, está dispersándose muy rápidamente sin algún tratamiento o vacuna actualmente disponible (Li y colaboradores, 2020), y un sistema de ensayo de células o en animal apropiado para la enfermedad todavía no se ha establecido. Actualmente, las medicaciones que se han reportado para ser utilizadas clínicamente o que se sugieren en recomendaciones por expertos en China y Corea incluyen cloroquina, remdesivir (Wang y colaboradores, 2020), lopinavir, favipiravir, ribavirina, interferón, etc., y más de 80 experimentos clínicos están en progreso (Maxmen y colaboradores, 2020). En particular, puesto que SARS-CoV-2 pertenece a la familia de coronavirus, los reactivos previamente conocidos que tienen efectos antivirales contra MERS-CoV o SARS-CoV, que tiene aproximadamente 79.5% de homología en la secuencia de nucleótidos a SARS-CoV-2 están atrayendo la atención (Zhou y colaboradores, 2020), que incluyen reactivos tal como niclosamida (Xu y colaboradores, 2020).

En vista de los casos de SARS o COVID-19, cuando se tiene estrecho contacto con un paciente, el riesgo de infección es muy alto: los virus tienen una transmisibilidad muy alta a muchas personas en un ambiente densamente poblado por gotitas respiratorias aerosolizadas. Además, las infecciones virales agudas causadas por estos coronavirus están dispersándose rápidamente a través del transporte y comercio del país donde se origina el virus a otros países, para de esta manera causar una crisis de salud pública global.

No obstante, el desarrollo de regímenes apropiados para efectivamente inhibir, tratar o prevenir tales patógenos de virus respiratorio que causan epidemia ha sido insuficiente hasta la fecha. Como tal, hay una necesidad urgente por desarrollar un fármaco para contrarrestar estas enfermedades para la salud y bienestar de seres humanos alrededor del mundo.

Además, aunque los síntomas clínicos de sus infecciones respiratorias son un poco similares y pertenecen a la misma familia de virus de ARN, hay diferencias de acuerdo con los niveles genéticos y estructurales entre los virus, y se reporta que estas diferencias afectan la sensibilidad y eficacia de los fármacos antivirales. Además, estas diferencias moleculares-genéticas en los virus causan diferencias en las rutas de transmisión, los receptores hospederos para el enlace de virus, velocidades de transmisión, períodos de incubación y/o sitios de infección, conduciendo a diferencias en los síntomas clínicos y en la eficacia terapéutica, y de esta manera el desarrollo y aplicación de reactivo apropiado contra el virus objetivo son muy importantes.

También, dada la transmisión rápida, la alta mortalidad y los riesgos de salud y económicos globales causados por la enfermedad infecciosa respiratoria, además del desarrollo de nuevos fármacos y vacunas que toma por lo menos uno a varios años, puede ser una estrategia muy efectiva y efectiva en costo para explorar la posibilidad de prevención, mejora o tratamiento de infecciones por virus de ARN, específicamente enfermedades respiratorias inducidas por coronavirus, en base al reposicionamiento de fármacos cuya seguridad se ha garantizado por experimentos clínicos previos y la experiencia de uso práctico.

Descripción de la invención

La invención se refiere a una composición farmacéutica para su uso en la prevención o el tratamiento de una enfermedad respiratoria causada por una infección por coronavirus, de acuerdo con se define en las reivindicaciones adjuntas. Esta invención también se refiere a la pironaridina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma y/o a la artemisinina o tal derivado de la misma seleccionado del grupo que consiste en dihidroartemisinina, artesunato, artemeter y arteéter para su uso en la prevención o el tratamiento de una enfermedad respiratoria causada por una infección por coronavirus, de acuerdo con se define en las reivindicaciones adjuntas.

Problema técnico

Un objetivo de la presente invención es proporcionar pironaridina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, y/o artemisinina o tal derivado de la misma seleccionado del grupo que consiste en dihidroartemisinina, artesunato, artemeter y arteéter en la prevención o tratamiento de infecciones por coronavirus.

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar una composición farmacéutica para la prevención o tratamiento de infecciones por coronavirus que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de pironaridina o una sal farmacéuticamente aceptable en la misma, y/o artemisinina o tal derivado de la misma, junto con un portador farmacéuticamente aceptable.

Solución al problema

Con el fin de lograr el objetivo anterior, la presente descripción proporciona una composición farmacéutica para la prevención o tratamiento de infecciones por coronavirus que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de pironaridina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, y/o artemisinina o tal derivado de la misma seleccionado entre dihidroartemisinina, artesunato, artemeter y arteether junto con un portador farmacéuticamente aceptable.

Además, la presente descripción proporciona el uso de pironaridina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, y/o artemisinina o tal derivado de la misma en la prevención o tratamiento de infecciones por coronavirus. Además, la presente invención proporciona pironaridina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, y/o artemisinina o tal derivado de la misma seleccionado entre dihidroartemisinina, artesunato, artemeter y arteéter para su uso en la prevención o el tratamiento de infecciones por coronavirus, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz a un sujeto que lo necesite.

La presente invención se describe en detalle después en la presente.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica para la prevención o tratamiento de infecciones por coronavirus que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de pironaridina de la siguiente Fórmula 1 o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, junto con un portador farmacéuticamente aceptable:

[Fórmula 1]

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica para la prevención o tratamiento de infecciones por coronavirus que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de artemisinina de la siguiente Fórmula 2 o tal derivado de la misma, junto con un portador farmacéuticamente aceptable:

[Fórmula 2]

en donde el derivado de artemisinina se selecciona entre dihidroartemisinina, artesunato, artemeter y arteether. De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica para la prevención o tratamiento de infecciones por coronavirus que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de pironaridina de la Fórmula 1 anterior o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, y artemisinina de la Fórmula 2 anterior o tal derivado de la misma seleccionado entre dihidroartemisinina, artesunato, artemeter y arteether junto con un portador farmacéuticamente aceptable.

En una realización de acuerdo con la presente invención, ejemplos de la sal farmacéuticamente aceptable de pironaridina pueden incluir una sal de adición de ácido que se forma de ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido clorhídrico, ácido acético, ácido metanosulfónico, ácido bencensulfónico, ácido toluensulfónico, ácido maleico o ácido fumárico, pero está limitado a los mismos. En otra realización de acuerdo con la presente invención, la sal farmacéuticamente aceptable de pironaridina puede ser tetrafosfato de pironaridina.

En donde el compuesto es un derivado de la artemisinina, seleccionado entre dihidroartemisinina, artesunato, artemeter y arteéter. En una realización de la presente invención, el derivado de la artemisinina puede ser artesunato.

De acuerdo con otra realización de la presente invención, en la composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de pironaridina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, y artemisinina o un tal de la misma, junto con un portador farmacéuticamente aceptable, una relación en peso de la pironaridina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma a la artemisinina o tal derivado de la misma puede ser 10:1 a 1:10. En otra realización de acuerdo con la presente invención, la relación en peso de la pironaridina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma a la artemisinina o tal derivado de la misma puede ser 1:1 a 6:1. En otra realización de acuerdo con la presente invención, la relación en peso de la pironaridina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma a la artemisinina o tal derivado de la misma puede ser 1:1 a 4:1. En otra realización de acuerdo con la presente invención, la relación en peso de la pironaridina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma a la artemisinina o tal derivado de la misma puede ser 3:1.

Como se utiliza en la presente, el término “farmacéuticamente aceptable” se refiere a nada de toxicidad que es fisiológicamente aceptable y no limita la acción de un ingrediente activo cuando se administra a humanos, y usualmente no causa trastornos gastrointestinales, reacciones alérgicas tal como mareo o reacciones similares. La composición farmacéutica de la presente invención se puede formular en varias maneras de acuerdo con la ruta de administración por métodos conocidos en la técnica junto con un portador farmacéuticamente aceptable. La ruta de administración no se limita a lo mismo, pero se puede administrar oralmente o parenteralmente. Las rutas parenterales de administración incluyen, por ejemplo, varias rutas tales como transdérmica, nasal, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intravenosa y los similares.

Cuando la composición farmacéutica de la presente invención se administra oralmente, la composición farmacéutica de la presente invención se puede formular en la forma de polvo, gránulo, tableta, píldora, gragea, cápsula, líquido, gel, jarabe, suspensión, oblea, inyección, supositorio y los similares de acuerdo con el método conocido en la técnica junto con un portador de administración oral adecuado. Ejemplos de portadores adecuados pueden incluir azúcares que incluyen lactosa, glucosa, sacarosa, sorbitol, manitol, xilitol, eritritol y maltitol; almidones que incluyen almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz y almidón de papa; celulosas que incluyen celulosa, metilcelulosa, carboximetil celulosa de sodio, hidroxipropil metilcelulosa e hidroximetil celulosa reducidamente sustituida; y rellenadores tales como gelatina y polivinilpirrolidona. Además, si es necesario, crospovidona, almidón glicolato de sodio, croscarmelosa sódica, carboximetil celulosa de sodio, agar, ácido algínico o alginato de sodio se puede adicionar como desintegrante. Además, la composición farmacéutica adicionalmente puede incluir un deslizante, un agente anti-agregante, un plastificante, un lubricante, un agente humectante, un agente saborizante, un emulsionante, un conservador y los similares.

También, cuando se administra parenteralmente, la composición farmacéutica de la presente invención se puede formular en la forma de inyección, supositorio, administración transdérmica e inhalante nasal de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica junto con un portador parenteral adecuado. En el caso de la inyección, se debe esterilizar y proteger de la contaminación de microorganismos tales como bacterias y hongos. Ejemplos de portadores adecuados para inyección incluyen, pero no están limitados a, un solvente o medio de dispersión que contiene agua, etanol, polioles (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y los similares), una mezcla de los mismos y/o aceite vegetal. Más de preferencia, los portadores adecuados incluyen solución de Hanks, solución de Ringer, solución salina amortiguada de fosfato (PBS) o agua estéril para inyección que contiene trietanolamina, etanol al 10%, propilenglicol al 40%, y soluciones isotónicas tal como glucosa al 5%. Con el fin de proteger la inyección de la contaminación microbiana, esta además puede comprender varios agentes antibacterianos y antifúngicos tales como parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y los similares. Además, en la mayoría de los casos, la inyección además puede comprender un agente isotónico tal como azúcar o cloruro de sodio.

Estas formulaciones se describen en el documento (Remington's Pharmaceutical Science, 15a Edición, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania) comúnmente conocido de prescripción en la química farmacéutica.

En el caso de administración por inhalación, los compuestos para el uso de acuerdo con la presente invención se pueden suministrar convenientemente en la forma de un rocío de aerosol de un envase presurizado o un nebulizador al utilizar un propelente adecuado por ejemplo, diclorofluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación se puede determinar al proporcionar una válvula para suministrar una cantidad dosificada. Por ejemplo, las cápsulas y cartuchos para el uso en inhaladores o insufladores se pueden formular para contener una mezcla de polvo con respecto a una base de polvo adecuada.

Como otros portadores farmacéuticamente aceptables, la referencia se puede hacer a aquellos descritos en el siguiente documento (Remington's Pharmaceutical Sciences, 19a Edición, 1995 Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania).

En otra realización de la presente invención, la pironaridina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma se formuló junto con portadores farmacéuticamente aceptables.

Como es descrito en lo anterior, el “portador farmacéuticamente aceptable” que se puede utilizar en la presente invención puede ser cualquiera de uno convencionalmente utilizado en el campo farmacéutico. Ejemplos representativos pueden incluir lactosa, dextrina, almidón, almidón pregelatinizado, celulosa microcristalina, hidroxipropil metilcelulosa, hidroxipropil celulosa, hidroxipropil celulosa de baja sustitución, hidroxietil celulosa, etil celulosa, metil celulosa, polietilenglicol, dióxido de silicio, hidrotalcita, silicato de aluminio magnesio, hidróxido de aluminio, silicato de aluminio, aluminometasilicato de magnesio, bentonita y una mezcla de los mismos. Además del portador, la composición farmacéutica de la presente invención además puede comprender un desintegrante para la desintegración rápida y la disolución en contacto con un medio acuoso cuando se administrain vivo,un solubilizante o surfactante para incrementar la disolución o absorción, y un deslizante o lubricante para incrementar la fluidez o lubricación. Ejemplos del desintegrante pueden incluir crospovidona, almidón glicolato de sodio, croscarmelosa sódica, carboximetilcelulosa de sodio, agar, ácido algínico o alginato de sodio. Ejemplos del deslizante o lubricante pueden incluir dióxido de silicio coloidal, dióxido de silicio, talco, estearato de magnesio, estearato de calcio, estearato de zinc, fumarato de estearato de sodio, ácido esteárico o dióxido de silicio. Sin embargo, no se limita a los ejemplos mencionados. De acuerdo con otra realización de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende 40 a 80% en peso de pironaridina o una sal farmacéuticamente aceptable de la mismas, 1 a 30% en peso de celulosa microcristalina, 0,1 a 5% en peso de dióxido de silicio, 1 a 10% en peso de hidroxipropil celulosa, 1 a 10% en peso de hidroxipropil celulosa de baja sustitución, 2 a 20% en peso de almidón glicolato de sodio y 1 a 10% en peso de estearato de magnesio.

En otra realización de la presente invención, la artemisinina o el derivado de la misma como se definió anteriormente en la presente se formuló junto con portadores farmacéuticamente aceptables. Además del portador, la composición farmacéutica de la presente invención además puede comprender un desintegrante para la desintegración rápida y disolución en contacto con un medio acuoso cuando se administrain vivo, un solubilizante o surfactante para incrementar la disolución o absorción, y un deslizante o lubricante para incrementar la fluidez o lubricación. Ejemplos del portador pueden incluir celulosa microcristalina, hidrato de lactosa, manitol, almidón, almidón pregelatinizado, hidroxicelulosa de baja sustitución, hidroxicelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilcelulosa de baja sustitución o hidroxipropil metilcelulosa. Ejemplos del desintegrante pueden incluir crospovidona, almidón glicolato de sodio, croscarmelosa sódica, carboximetil celulosa de sodio, agar, ácido algínico o alginato de sodio. Ejemplos del deslizante o lubricante pueden incluir dióxido de silicio coloidal, dióxido de silicio, talco, estearato de magnesio, estearato de calcio, estearato de zinc, estearil fumarato de sodio, ácido esteárico o dióxido de silicio. Ejemplos representativos del surfactante pueden incluir lauril sulfato de sodio y un derivado del mismo, poloxámero y un derivado del mismo, glicérido poliglicolizado saturado (también llamado gelucire), labrasol, varios de polisorbato (por ejemplo monolaurato de polioxietilen sorbitán (después en la presente, Tween 20), monopalmitato polioxietilen sorbitán (después en la presente, Tween 40), monoestearato de polioxietilen sorbitán (después en la presente, Tween 60), monooleato de polioxietilen sorbitán (después en la presente, Tween 80)), ésteres de sorbitán (por ejemplo, monolaurato de sorbitán (después en la presente, Span 20), monopalmitato de sorbitán (después en la presente, Span 40), monoestearato de sorbitán (después en la presente, Span 60), monooleato de sorbitán (después en la presente, Span 80), trilaurato de sorbitán (después en la presente, Span 25), trioleato de sorbitán (después en la presente, Span 85), triestearato de sorbitán (después en la presente, Span 65)), cremofor, aceite de ricino hidrogenado de PEG-60, aceite de ricino hidrogenado de PEG-40, lauril glutamato de sodio o cocoanfodiacetato de disodio. Sin embargo, no se limita a los ejemplos mencionados. De acuerdo con otra realización de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende 10 a 50% en peso de artemisinina o tal derivado de la misma, 30 a 70% en peso de celulosa microcristalina, 2 a 20% en peso de hidroxipropil celulosa de baja sustitución, 2 a 20% en peso de almidón glicolato de sodio, 0,1 a 5% en peso de dióxido de silicio, 0,5 a 15% en peso de lauril sulfato de sodio y 0,1 a 5% en peso de estearato de magnesio.

En otra realización de la presente invención, la pironaridina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma y la artemisinina o tal derivado de la misma se formularon junto con portadores farmacéuticamente aceptables. Además del portador, la composición farmacéutica de la presente invención puede comprender adicionalmente un desintegrante para la desintegración rápida y disolución en contacto con un medio acuoso cuando se administrain vivo,un solubilizante o surfactante para incrementar la disolución o absorción, y un deslizante o lubricante para incrementar la fluidez o lubricación. Ejemplos del portador pueden incluir lactosa, dextrina, almidón, almidón pregelatinizado, celulosa microcristalina, hidroxipropil metilcelulosa, hidroxipropil celulosa, hidroxipropil celulosa de baja sustitución, hidroxietil celulosa, etil celulosa, metil celulosa, polietilenglicol, dióxido de silicio, hidrotalcita, silicato de aluminio magnesio , hidróxido de aluminio, silicato de aluminio, metasilicato de magnesio aluminio, bentonita, butilhidroxitolueno y una mezcla de los mismos. Ejemplos representativos del surfactante pueden incluir lauril sulfato de sodio y un derivado del mismo, poloxámero y un derivado del mismo, glicérido poliglicolizado saturado (también conocido como gelucire), labrasol, varios de polisorbato (por ejemplo, monolaurato de polioxietilen sorbitán (después en la presente, Tween 20), monopalmitato de polioxietilen sorbitán (después en la presente, Tween 40), monoestearato de polioxietilen sorbitán (después en la presente, Tween 60), monooleato de polioxietilen sorbitán (después en la presente, Tween 80)), ésteres de sorbitán (por ejemplo, monolaurato de sorbitán (después en la presente, Span 20), monopalmitato de sorbitán (después en la presente, Span 40), monoestearato de sorbitán (después en la presente, Span 60), monooleato de sorbitán (después en la presente, Span 80), trilaurato de sorbitán (después en la presente, Span 25), trioleato de sorbitán (después en la presente, Span 85), triestearato de sorbitán (después en la presente, Span 65)), cremofor, aceite de ricino hidrogenado de PEG-60, aceite de ricino hidrogenado de PEG-40, lauril glutamato de sodio o cocoanfodiacetato de disodio, pero no están limitados a los mismos. Ejemplos del desintegrante pueden incluir crospovidona, almidón glicolato de sodio, croscarmelosa sódica, carboximetilcelulosa de sodio, agar, ácido algínico o alginato de sodio. Ejemplos del deslizante o lubricante pueden incluir dióxido de silicio coloidal, dióxido de silicio, talco, estearato de magnesio, estearato de calcio, estearato de zinc, fumarato de estearato de sodio, ácido esteárico o dióxido de silicio. Sin embargo, no se limita a los ejemplos mencionados. De acuerdo con otro aspecto de la presente descripción, se proporciona una composición farmacéutica que comprende 15 a 60% en peso de pironaridina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, 5 a 20% en peso de artemisinina o tal derivado de la misma, 5 a 30% en peso de celulosa microcristalina, 10 a 40% en peso de crospovidona, 2 a 15% en peso de hidroxipropil celulosa de baja sustitución, 1 a 10% en peso de lauril sulfato de sodio, 5 a 30% en peso de polietilenglicol, 0,1 a 5% en peso de hidroxipropil celulosa, 0,001 a 1% en peso de butilhidroxitolueno, 0,1 a 5% en peso de dióxido de silicio y 0,5 a 10% en peso de estearato de magnesio.

La composición farmacéutica de la presente invención se puede formular en polvo, gránulo, tableta, cápsula, jarabe seco, preparación de recubrimiento, inyección, supositorio, administración transdérmica, administración por inhalación y los similares.

En otra realización de la presente invención, la composición farmacéutica de la presente invención se puede administrar en combinación con uno o más fármacos adicionales que tienen eficacia antiviral para prevenir y tratar infecciones por coronavirus.

En otra realización de la presente invención, ejemplos de los otros agentes antivirales pueden incluir inhibidores de replicación viral, inhibidores de helicasa, inhibidores de proteasa viral e inhibidores de entrada de célula viral, pero no están limitados a los mismos. En otra realización de la presente invención, el otro agente antiviral puede ser, por ejemplo, ribavirina, interferón, niclosamida o una combinación de los mismos, pero no se limita a estos. En otra realización de la presente invención, ejemplos de las enfermedades respiratorias causadas por las infecciones de coronavirus pueden incluir, pero no están limitadas a, Síndrome Respiratorio Agudo Severo (SARS), Síndrome Respiratorio del Oriente Medio (MERS) o Enfermedad de Coronavirus 2019 (COVID-19). En otra realización de la presente invención, la enfermedad respiratoria causada por la infección de coronavirus puede ser la Enfermedad de Coronavirus 2019 (COVID-19).

En la presente invención, el término “prevención” se refiere a cualquier acción que inhibe o retarda la ocurrencia, dispersión y recurrencia de infecciones por coronavirus al administrar la composición farmacéutica de la presente invención, y el término “tratamiento” se refiere a cualquier acción en el cual los síntomas de la enfermedad se mejoran o se cambian benéficamente al administrar la composición farmacéutica de la presente invención.

Además, como se utiliza en la presente, el término “cantidad terapéuticamente efectiva” se refiere a una cantidad que exhibe una respuesta más alta que un control negativo, y de preferencia se refiere a una cantidad suficiente para prevenir o tratar infecciones por coronavirus. La dosis terapéutica para un paciente es generalmente de 50 a 2,000 mg/día, y más de preferencia 100 a 1,000 mg/día, dependiendo de la severidad de la condición o si se administra solo o en combinación, o en combinación con otros fármacos. Esta se puede administrar una vez al día o en dosis divididas por la vía de ruta oral o parenteral. Sin embargo, la cantidad terapéuticamente efectiva se puede cambiar apropiadamente dependiendo de varios factores, tales como el tipo y severidad de la enfermedad, la edad, peso corporal, estado de salud y género en un paciente, ruta de administración y período de tratamiento.

La presente invención puede ser útil para el tratamiento de coronavirus, específicamente virus enCoronaviridaeque causa enfermedades respiratorias, y más específicamente el virus que causa COVID-19, en animales y humanos.

Los problemas de la presente invención no se limitan a los problemas técnicos mencionados en lo anterior, y otros problemas técnicos no mencionados serían claramente entendidos por una persona experta en la técnica a partir de la siguiente descripción y las reivindicaciones adjuntas.

Efectos ventajosos de la invención

La presente invención proporciona una composición farmacéutica para la prevención o tratamiento de infecciones por coronavirus que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de pironaridina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, y/o artemisinina o un derivado de la misma Seleccionado del grupo que consiste en dihidroartemisinina, artesunato, artemeter y arteether como ingrediente(s) activo. La composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención se puede utilizar efectivamente para la prevención o tratamiento al inhibir efectivamente infecciones por coronavirus, por ejemplo, enfermedades respiratorias tal como COVID-19 causado por coronavirus.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una curva de concentración-respuesta que considera los efectos inhibidores contra SARS-CoV-2 y citotoxicidad mediante el pretratamiento con tetrafosfato de pironaridina que es uno de los ingredientes activos de la presente invención cuando se mide en 24 horas de post-infección.

La Figura 2 es una curva de concentración-respuesta que considera los efectos inhibidores contra SARS-CoV-2 y citotoxicidad mediante el co-tratamiento con tetrafosfato de pironaridina cuando se mide en 24 horas de post infección.

La Figura 3 muestra los resultados en los cuales los efectos inhibidores contra SARS-CoV-2 mediante el cotratamiento de artesunato uno de los ingredientes activos de la presente invención se midió en 24 horas y 48 horas de post-infección y comparados con aquellos por cloroquina como un control.

La Figura 4 muestra los resultados que comparan los efectos inhibidores mediante la combinación en varias relaciones de tetrafosfato de pironaridina y artesunato en células infectadas con SARS-CoV-2 mediante las combinaciones, y en la relación óptima, se compararon los efectos inhibidores contra virus en 24 horas y 48 horas de post-infección.

La Figura 5 es curvas de concentración-respuesta que consideran los efectos inhibidores contra SARS-CoV-2 y citotoxicidad medida 24 horas y 48 horas de post-infección en la línea celular de pulmón humano, células Calu-3, en comparación con aquellos por hidroxicloroquina como un control, cuando tetrafosfato de pironaridina o artesunato se trató simultáneamente con la infección del virus.

La Figura 6 es una curva de concentración-respuesta que considera los efectos inhibidores contra SARS-CoV-2 mediante el tratamiento de post-infección con tetrafosfato de pironaridina o artesunato en la línea celular de pulmón humano, células Calu-3, cuando se mide 48 horas después del tratamiento con fármaco.

La Figura 7 muestra los resultados en los cuales los hámsters se infectaron con SARS-CoV-2 y se administraron oralmente con bajas o altas dosis de tetrafosfato de pironaridina y artesunato en combinación en relación 3:1 en 1 hora de post-infección una vez al día durante 3 días, o con alta dosis de tetrafosfato de pironaridina solo en 25 horas de post-infección, y cuando los títulos virales en los pulmones se analizaron en el día 4 de post-infección y se compararon el grupo de control inoculado con virus en el cual no se administraron los fármacos.

Modo para la invención

Después en la presente, las constituciones y efectos de la presente invención serán descritos en más detalle a través de ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos son únicamente ilustrativos, y el alcance de la presente invención no se limita a los mismos.

Ejemplo 1: Preparación de la monotableta de tetrafosfato de pironaridina

Hidroxipropil celulosa se disolvió en etanol para preparar una solución aglutinante. Después de la granulación en húmedo de tetrafosfato de pironaridina utilizando la solución aglutinante preparada, el producto obtenido se secó y se granuló. Se mezclaron hidroxipropil celulosa de baja sustitución, almidón glicolato de sodio, celulosa microcristalina y dióxido de silicio. Después de la lubricación al adicionar estearato de magnesio, las tabletas se prepararon mediante la formación de tabletas.

[Tabla 1]

Ejemplo 2:Preparación de la monotableta de artesunato

Dióxido de silicio y lauril sulfato de sodio se tamizaron utilizando un tamiz. El dióxido de silicio y lauril sulfato de sodio tamizados se mezclaron con artesunato, celulosa microcristalina, hidroxipropil celulosa de baja sustitución y almidón glicolato de sodio, se lubricaron al adicionar estearato de magnesio, y luego se formaron en tabletas para preparar tabletas. El producto obtenido se recubrió con un agente de recubrimiento de película.

[Tabla 2]

Ejemplo 3: Preparación de la tableta de combinación de tetrafosfato de pironaridina/artesunato Polietilenglicol como un portador dispersante de fusión, butilhidroxitolueno y artesunato como un ingrediente activo se mezclaron, se fundieron mediante calentamiento, y luego se enfriaron rápidamente y se pulverizaron finamente. Luego, celulosa microcristalina, hidroxipropil celulosa de baja sustitución, crospovidona y estearato de magnesio se mezclaron con el mismo para obtener la Mezcla 1. Después de disolver hidroxipropil celulosa en etanol, tetrafosfato de pironaridina se granuló en húmedo, se secó y se granuló para obtener la Mezcla 2. La Mezcla 1, la Mezcla 2, lauril sulfato de sodio, dióxido de silicio y crospovidona se mezclaron, y luego estearato de magnesio se adicionó al mismo para lubricar la mezcla, seguido por la formación de tabletas para preparar tabletas. El producto obtenido se recubrió con un agente de recubrimiento de película.

[Tabla 3]

Con el fin de determinar si la pironaridina o una sal de la misma, y artemisinina o tal derivado de la misma de la presente invención tienen actividad antiviral contra coronavirus, los reactivos se trataron solos y en combinación como en los siguientes Ejemplos Experimentales, y se evaluaron las tasas inhibidoras contra la infección viral. Ejemplo Experimental 1: Evaluación de los efectos antivirales de tetrafosfato de pironaridina (pretratamiento) En el Ejemplo Experimental 1, antes de infectar las células con SARS-CoV-2 (un aislado Coreano), tetrafosfato de pironaridina se pretrató durante 1 hora, y se evaluó la eficacia inhibidora contra la infección del virus.

1) Preparación de virus y células hospederas

Células Vero se compraron de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) y se incubaron a 37°C con CO<2>al 5% en Medio de Eagle's Modificado de Dulbecco (DMEM), suplementado con suero bovino fetal inactivado con calor al 10% (FBS) y un antibiótico. SARS-CoV-2 se proporcionó por los Centros de Corea par el Control y Prevención de Enfermedad (KCDC). Después de la amplificación del virus, los títulos virales se determinaron mediante un ensayo de placa al contar las placas virales formadas en las células utilizadas para la amplificación del virus en la infección con el virus.

2) Determinación de la eficacia antiviral utilizando imágenes de manchado de inmunofluorescencia

Las células Vero se sembraron en 1,2 * 10<4>células por cavidad en placas |iClear, y 24 horas antes del experimento las células se pre-trataron durante 1 hora con una serie de 10 diluciones de fármacos en el medio de cultivo en el intervalo de 0,05-50 |iM, y luego SARS-CoV-2 se inoculó a las células en una multiplicidad de infección (MOI) de 0,0125. Veinticuatro horas después de la infección, las células se fijaron con formaldehído al 4%, y las células infectadas se analizaron mediante el manchado de inmunofluorescencia utilizando un anticuerpo contra la proteína N de SARS-CoV-2. La tasa de infección se calculó como la relación de número de células infectadas al número total de células comparadas con los controles positivo y negativo a través del programa de análisis de imagen. El efecto antiviral del fármaco se representa como una curva de concentraciónrespuesta, y utilizando el programa de análisis Graph Prism (Ver. 8), 50% de concentración efectiva (EC<50>, concentración que inhibe la citotoxicidad inducida por la infección del virus por 50%) y 50% de concentración citotóxica (CC<50>, la concentración del compuesto que causa daño en 50% de células en comparación con las células normales) se calculó como se muestra en la Ecuación 1.

<Ecuación 1>

Modelo sigmoidal, Y= Fondo (Superior - Fondo)/(1 (IC<50>/X)<Pendiente>)

Como un resultado, como se muestra en la Figura 1, en el caso de células Vero infectadas con SARS-CoV-2, se observó una tasa de inhibición de virus del 70% en una concentración de 50 |iM de pironaridina, pero la citotoxicidad también se incrementó por 17% mediante el pretratamiento con fármaco. Las células Vero se aislaron de las células epiteliales de riñón de monos verdes africanos(Chlorocebussp.) y se han conocido como células deficientes de IFN tipo 1. En el estudio previo, cuando se mide la eficacia antiviralin vitrode pironaridina contra el virus de Ébola en células Vero, no se observó actividad antiviral en una concentración abajo de CC<50>(CC<50>= 1,3 |iM), pero cuando se inoculó en células Hela derivadas de humano, se reportó que la CC<50>es más alta y la actividad antiviral se mostró en una concentración no tóxica (EC<50>= 0,42-1,12 |iM, CC<50>= 3,1 |iM). Además, la pironaridina significativamente inhibió la mortalidad y tasa de infección viral en modelos de ratón estimulados con el virus de Ébola (Lane y colaboradores, 2015). Es bien conocido que la eficacia de agentes antivirales puede diferir en sistemas de ensayoin vitrooin vivodependiendo de las diferencias en las características de las células hospederas probadas y sus rutas de señalización inmune intracelulares (Lane y colaboradores, 2015), y de esta manera los ensayos a base de células hospederas derivadas de humano se establecieron adicionalmente, y la eficacia antiviral de pironaridina además se confirmó en varias líneas celulares y estudios en animales.

Ejemplo Experimental 2: Efectos inhibidores de tetrafosfato de pironaridina contra el virus SARS-CoV-2 (cotratamiento)

En el Ejemplo Experimental 2, los efectos inhibidores de pironaridina contra la infección viral se evaluaron cuando se co-trataron las células en el momento de la infección con SARS-CoV-2 (un aislado Coreano). La cloroquina se conoce que exhibe eficacia antiviral al incrementar el pH endosomal que conduce a la inhibición del enlace viral a las células y la glicosilación de receptores del hospedero al SARS-CoV (Vincent y colaboradores, 2005). Puesto que la pironaridina que tiene una estructura similar a la cloroquina también se esperó que actué por la vía de un mecanismo similar, la pironaridina se trató simultáneamente en el momento de la infección viral y se midió su eficacia antiviral. Al optimizar algunas condiciones experimentales utilizadas en el Ejemplo Experimental 1, el experimento se llevó a cabo bajo condiciones de prueba con citotoxicidad relativamente baja.

1) Preparación de virus y células hospederas

Las células Vero se incubaron a 37°C con CO<2>al 5% en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), suplementado con suero bovino fetal inactivado con calor al 10% (FBS) y un antibiótico. SARS-CoV-2 se proporcionó por los Centros de Corea para el Control y Prevención de Enfermedad (KCDC). Después de la amplificación viral, los títulos virales se determinaron a través de qRT-PCR que mide los números de copias de ARN.

2) Medición de la eficacia antiviral utilizando números de copias de ARN

Después de disolver tetrafosfato de pironaridina en DMSO, este se diluyó a una concentración de 0,033-100 |iM utilizando el medio de cultivo. Veinticuatro horas antes del experimento, SARS-CoV-2 se inoculó en células Vero sembradas en una placa de 96 cavidades a una densidad de 2*10<4>células/cavidad (MOI=0,01), y el medio de cultivo que contiene varias diluciones de fármaco se adicionaron a cada cavidad. Veinticuatro horas después de la infección, el sobrenadante celular se recolectó, se extrajo el ARN y la qRT-PCR se realizó contra el gen RdRp. La eficacia antiviral del fármaco se analizó al comparar el número de copias del ARN viral con el fármaco con aquel con el control. Una curva de concentración de fármaco-respuesta se dibujó con la tasa de inhibición de infección viral (% de inhibición) del título de virus inversamente calculado del número de copias de ARN, y 50% de concentración efectiva (EC<50>, la concentración que inhibe el título del virus por 50%) se calculó utilizando el programa de análisis Graph Prism (Ver. 8), como en el Ejemplo Experimental 1.

3) Medición de la citotoxicidad (% de citotoxicidad)

La citotoxicidad se midió utilizando un ensayo a base de sales de tetrazolio (WST-1). WST-1 se convierte en una sustancia cromogénica llamada formazán por deshidrogenasas mitocondricas, que están presentes únicamente en células vivas. Después de adicionar 10 |iL de la premezcla de WST-1 a cada cavidad, las células se incubaron durante 1 hora adicional, y la cantidad de formazán producido se calculó con su absorbancia medida por ELISA. El 50% de concentración citotóxica (CC<50>, la concentración del compuesto que causa daño en 50% de células comparadas con células normales) se calculó.

Como un resultado, como se muestra en la Figura 2, pironaridina exhibió el efecto antiviral en una manera dependiente de concentración cuando se co-trató, y la citotoxicidad se observó en algunas de las altas concentraciones, pero la actividad antiviral contra el virus SARS-CoV-2, más de 90% de inhibición, en concentraciones no citotóxicas (EC<50>= 8,27 |iM, CC<50>= 11,54 |iM; índice de selectividad, SI>1,40).

Ejemplo Experimental 3: Efectos inhibidores del artesunato contra SARS-CoV-2 (co-tratamiento)

En el Ejemplo Experimental 3, la eficacia antiviral del artesunato se midió bajo las mismas condiciones experimentales como en el Ejemplo Experimental 2.

1) Preparación del virus y célula hospedera

Las células Vero y los virus se prepararon de la misma manera como se muestra en el Ejemplo Experimental 2.

2) Medición de la eficacia antiviral utilizando números de copias de ARN

Artesunato se disolvió en DMSO y luego se diluyó a concentraciones de 3,13, 12,5 y 50 |iM utilizando el medio. Veinticuatro horas antes del experimento, SARS-CoV-2 se inoculó en las células Vero sembradas en una placa de 96 cavidades a una densidad de 2*10<4>células/cavidad (MOI=0,01), y el medio de cultivo que contiene varias diluciones de fármaco se adicionaron a cada cavidad. En 24 horas y 48 horas después de la infección, el sobrenadante celular se recolectó, y la qRT-PCR se realizó contra el gen RdRp para calcular el título de virus y para calcular la tasa de inhibición de infección del virus (% de inhibición) como se muestra en el Ejemplo Experimental 2. Como el control, se utilizó cloroquina.

3) Medición de la citotoxicidad (% de citotoxicidad)

La citotoxicidad se midió de la misma manera como se muestra en el Ejemplo Experimental 2.

Como un resultado, como se muestra en la Figura 3, el artesunato exhibió la actividad antiviral en una manera dependiente de concentración y mostró una tasa de inhibición del 83% contra el virus en una concentración de 50 |iM. En 12,5 |iM, las tasas de inhibición fueron 40% y 51% en 24 horas de post-infección (24 hpi) y 48 horas de post-infección (48 hpi), respectivamente. Además, en 3,13 |iM, la tasa de inhibición fue 39% a 48 horas de post-infección. No hubo citotoxicidad significativa en todas las condiciones probadas. El artesunato tuvo una EC<50>inferior y tiempo de inicio más lento para la inhibición de SARS-CoV-2 comparado con pironaridina o cloroquina utilizada como el control, pero tuvo un efecto antiviral de duración más larga, que muestra un patrón en el cual la tasa de inhibición de virus se incrementó lentamente a través del tiempo.

Ejemplo experimental 4: Efectos inhibidores de la combinación de tetrafosfato de pironaridina/artesunato contra SARS-CoV-2

Distinto a la cloroquina, que no mostró efecto antiviral en los modelos de conejillo de Indias infectados con el virus Ébola, la pironaridina mejoró significativamente el título de virus y la tasa de supervivencia en los modelos de ratón estimulados con el virus Ébola. Como tal, se supuso que la cloroquina puede tener mecanismos diferentes de acción además, entre los cuales se sugirieron mecanismos inmunomoduladores tal como la ruta de IFN-1 de tipo 1 (Lane y colaboradores, 2019). El artesunato también mostró una eficacia antiviral contra el virus Ébola en ensayosin vitropero más débil que pironaridina (Gignox y colaboradores, 2016). Por lo tanto, en el Ejemplo Experimental 4, se evaluaron los cambios en la eficacia antiviral de acuerdo con el tratamiento en combinación en diferente relación de combinación de los dos fármacos.

1) Preparación de virus y células hospederas

Las células Vero y el virus se prepararon de la misma manera como se muestra en el Ejemplo Experimental 2.

2) Medición de la eficacia antiviral utilizando números de copias de ARN

Tetrafosfato de pironaridina y artesunato se disolvieron en DMSO, se diluyeron a varias concentraciones utilizando medios en varias relaciones de combinación tales como 1:1, 3:1, 10:1, etc. Veinticuatro horas antes de los experimentos, SARS-CoV-2 se inoculó en células Vero sembradas en una placa de 96 cavidades a una densidad de 2x104 células/cavidad (MOI=0,01), y los medios de cultivo que contienen varias diluciones de fármaco se adicionaron a cada cavidad. En 24 horas después de la infección, el sobrenadante celular se recolectó, y la qRT-PCR se realizó contra el gen RdRp para calcular el título de virus y la tasa de inhibición de infección de virus (% de inhibición) como se muestra en el Ejemplo Experimental 2. Cuando 10 |iM de tetrafosfato de pironaridina y 3,3 |iM de artesunato se trataron en combinación, los títulos de virus se midieron en 24 y 48 horas después de la infección cada uno, y se compararon con cloroquina y lopinavir utilizados como los controles.

3) Medición de la citotoxicidad (% de citotoxicidad)

Como un resultado, como se muestra en la Figura 4, el efecto antiviral de artesunato tratado en combinación con pironaridina fue más alto que aquel del artesunato tratado solo, y el efecto antiviral se incrementó a medida que la relación de pironaridina en la combinación fue más alta. Específicamente, cuando se combinaron 10 |iM de tetrafosfato de pironaridina y 3,3 |iM de artesunato (relación 3:1), este exhibió la tasa de inhibición de 90-100% contra la infección del virus, que es un efecto antiviral más alto que aquel de cloroquina o lopinavir utilizados como los controles. En este caso, la tasa de inhibición contra la infección se mantuvo hasta 48 horas. No se observó citotoxicidad significativa en todas las relaciones de combinación mostradas en la Figura 4, y cuando 10 |iM de tetrafosfato de pironaridina y 3,3 |iM de artesunato se trataron en combinación, se observó citotoxicidad menor en comparación al tratamiento con 10 |iM de tetrafosfato de pironaridina solo (disminución de 49.5%). Ejemplo Experimental 5: Efectos inhibidores de tetrafosfato de pironaridina o artesunato contra SARS-CoV-2 en líneas celulares de pulmón humano (co-tratamiento)

Se ha reportado que puede haber diferencia de especie entre las acciones antivirales en humanos y otros animales, tales como estructuras receptoras. Por lo tanto, con el fin de confirmar la eficacia en líneas celulares de pulmón humano, en el Ejemplo Experimental 5, cuando SARS-CoV-2 (un aislado Coreano) se inoculó en células Calu-3 (línea celular de pulmón humano), el fosfato de pironaridina o artesunato se trató y se evaluó para la eficacia en inhibir la infección viral. Los efectos inhibidores del tetrafosfato de pironaridina o artesunato contra la infección viral se evaluaron en líneas celulares de pulmón humano, células Calu-3, cuando se co-trataron las células en el momento de la infección de SARS-CoV-2 (un aislado Coreano).

1) Preparación de virus y células hospederas

Las células Calu-3 se incubaron a 37°C con CO<2>al 5% en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), suplementado con suero bovino fetal inactivado con calor al 10% (FBS) y un antibiótico. SARS-CoV-2 se proporcionó por los Centros de Corea para Control y Prevención de Enfermedad (KCDC).

2) Medición de la eficacia antiviral utilizando números de copias de ARN

Después de disolver en DMSO, el tetrafosfato de pironaridina se diluyó a una concentración de 0,033-100 |iM utilizando el medio. Veinticuatro horas antes del experimento, SARS-CoV-2 se inoculó en células Vero sembradas en una placa de 96 cavidades a una densidad de 2*104 células/cavidad (MOI=0,01), y los medios de cultivo que contienen varias diluciones del fármaco se adicionaron a cada cavidad. En 24 horas y 48 horas después de la infección, la qRT-PCR se realizó contra el gen RdRp como se muestra en el Ejemplo Experimental 2. Una curva de concentración de fármaco-respuesta se dibujó con la tasa de inhibición de infección viral (% de inhibición) del título de virus inversamente calculado del número de copias de ARN, y 50% de concentración efectiva (EC<50>, la concentración que inhibe el título de virus por 50%) se calculó utilizando el programa de análisis Graph Prism (Ver. 8), como se muestra en el Ejemplo Experimental 1.

3) Medición de la citotoxicidad (% de citotoxicidad)

La citotoxicidad se midió de la misma manera como en el Ejemplo Experimental 2.

Como un resultado, como se muestra en la Figura 5, tanto la pironaridina como el artesunato exhibieron efectos antivirales en líneas celulares de pulmón humano en una manera dependiente de concentración cuando se co trataron en el momento de las infecciones. Además, en tanto 24 horas de post-infección (24 hpi) como 48 horas de post-infección (48 hpi), exhibieron actividades antivirales contra SARS-CoV-2, más de 90% de inhibición, en concentraciones no citotóxicas (pironaridina 48 horas de post-infección IC<50>= 8,58<|>iM, CC<50>> 100<|>iM, índice de selectividad SI>11,66, artesunato 48 horas de post-infección IC<50>= 0,45 |iM, CC<50>> 100 |iM, índice de selectividad SI>220,8). Específicamente, en el caso de artesunato, el efecto se incrementó significativamente en las líneas celulares de pulmón humano comparado con aquel en las líneas celulares de riñón de mono, células Vero. Contrario a esos, la hidroxicloroquina no mostró efecto antiviral en menor que 50 |iM en las líneas celulares de pulmón humano, mientras que la hidroxicloroquina mostró eficacia antiviral en las líneas celulares de mono. Ejemplo Experimental 6: Efectos inhibidores del tratamiento de post-infección con tetrafosfato de pironaridina o artesunato contra SARS-CoV-2 en líneas celulares de pulmón humano

En el Ejemplo Experimental 6, el tetrafosfato de pironaridina o artesunato se trató cada uno en las células Calu-3 en 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24 y 36 horas después de la inoculación de SARS-CoV-2 (un aislado Coreano) y se evaluó cuántas horas el efecto inhibidor de cada fármaco se retuvo contra las infecciones del virus.

1) Preparación de virus y células hospederas

Las células Calu-3 y los virus se prepararon de la misma manera como se muestra en el Ejemplo Experimental 5.

2) Determinación de la eficacia antiviral utilizando el ensayo de placa viral

Después de disolver tetrafosfato de pironaridina y artesunato en DMSO cada uno, este se diluyó a 12.5 |iM utilizando el medio. En 1 hora después de la inoculación con SARS-CoV-2 (MOI=0,1), el sobrenadante se removió, y las células Calu-3 se lavaron, seguido por la adición del medio de cultivo DMEM que contiene suero bovino al 2%. Los medios de cultivo que contienen fármacos se adicionaron en 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24 y 36 horas cada uno. En 48 horas después de cada tratamiento con fármaco, los sobrenadantes celulares se recolectaron y se realizó un ensayo de placa en el cual las placas generadas por la infección del virus infeccioso se contaron en células Vero, las células utilizadas para la amplificación del virus. La capa del medio DMEM-F12 que contiene agarosa al 2% se colocó en la capa de células Vero infectadas, y el número de placas se contaron al utilizar el contramanchado con violeta cristal, después de la incubación durante 72 horas. La eficacia antiviral del fármaco se analizó con la tasa de inhibición de infección viral (% de inhibición) del título de virus inversamente calculado del número de placas formadas y se comparó con el control.

Como un resultado, como se observa en la Figura 6, la eficacia antiviral máxima se mostró cuando 12,5 |iM de pironaridina se trató (>99% de inhibición cuando se adicionó en hasta 6 horas de post-infección, >94% de inhibición cuando se adicionó en hasta 12 horas de post-infección, y 90% de inhibición cuando se adicionó en hasta 24 horas de post-infección). Por otra parte, el tratamiento con 12,5 |iM de artesunato mostró 92-96% de inhibición cuando se adicionó en hasta 6 horas de post-infección, >90% de inhibición cuando se adicionó en hasta 12 horas de post-infección y 48% de inhibición cuando se adicionó en hasta 24 horas de post-infección. Ejemplo Experimental 7: Efectos inhibidores de la combinación de tetrafosfato de pironaridina/artesunato contra SARS-CoV-2 en modelos de animales con COVID-19

En el Ejemplo Experimental 7, tetrafosfato de pironaridina y artesunato (combinación en una relación 3:1) se administraron oralmente a hámsters infectados con SARS-CoV-2 (un aislado Coreano) para evaluar la eficacia antiviralin vivoen animales.

1) Preparación de virus y hámsters para la inoculación con SARS-CoV-2

El virus SARS-CoV-2 se proporcionó por los Centros de Corea para Control y Prevención de Enfermedad (KCDC). Como modelos de animales experimentales, hámsters Sirios -que mostraron alta susceptibilidad a SARS-CoV-2 y tuvieron baja restricción en el suministro- se utilizaron, y SARS-CoV-2 (1 * 106 PFU/100 |iL) se inoculó a cada uno de ambos pasajes de nasales del hámster con una cantidad de 50 |iL.

2) Medición de la eficacia antiviralin vivoutilizando el ensayo de placa

En 1 hora después de la inoculación nasal con SARS-CoV-2, tetrafosfato de pironaridina (180 mg/kg o 360 mg/kg) y artesunato (60 mg/kg o 120 mg/kg) se administraron oralmente como la combinación de relación 3:1 una vez al día durante 3 días, y se evaluó la eficacia antiviralin vivode la combinación de dos fármacos contra SARS-CoV-2. Como el grupo experimental comparativo, pironaridina 360 mg/kg sola se administró oralmente una vez en 25 horas después de la infección para evaluar la duración de la eficacia de post-infección de la pironaridina sola. Ambos del tetrafosfato de pironaridina y artesunato se prepararon precisamente antes del uso, se disolvieron completamente en bicarbonato de sodio al 5% y se administraron oralmente. Como los grupos de control, un grupo de control normal (Simulado) en el cual el virus no se inoculó y un grupo de control de portador en el cual únicamente un solvente se inoculó al mismo tiempo se utilizaron. En 4 días de post-infección, ambos de los lóbulos izquierdo y derecho de los pulmones se extirparon, el virus se extrajo, y los títulos de virus en los tejidos de pulmón se analizaron mediante un ensayo de placa como es descrito en el Ejemplo Experimental 6. El título viral en los pulmones cuantificado por un ensayo de placa se normalizó al peso total (g) de los tejidos de pulmón, y luego se convirtieron al valor log para calcular el título final (Log-iü unidad formadora de placa/g, Log1t)PFU/g).

Como un resultado, como se muestra en la Figura 7, en 4 días de post-infección, la reducción en el título del virus infeccioso en los tejidos de pulmón fue estadísticamente significativa en ambos de los grupos de co administración de tetrafosfato de pironaridina (P)-artesunato (A) 180/60 mg/kg y 360/120 mg/kg [Log-iüPFU mediana: 8.30 para el grupo de control de portador estimulado con virus contra 7,22 para el grupo de co administración de PA 180/60 mg/kg (p<0,001); contra 7,61 para el grupo de co-administración de pA 360/120 mg/kg (p=0,046)]. Por otra parte, cuando tetrafosfato de pironaridina solo se administró oralmente, una disminución significativa en el título de virus infeccioso se observó en el tejido de pulmón cuando la alta dosis alta de 360 mg/kg se administró, y un efecto inhibidor significativo se observó aún si se administró una vez en 25 horas de post-infección [Log-iüPFU mediana 8,30 para el grupo de control de portador estimulado con virus contra el grupo de administración de 25 hpi de una sola alta dosis 7.22 (p<0,001)].

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica para su uso en la prevención o el tratamiento de una enfermedad respiratoria causada por una infección por coronavirus, que comprende:

(i) una cantidad terapéuticamente eficaz de pironaridina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, junto con un portador farmacéuticamente aceptable; o

(ii) una cantidad terapéuticamente eficaz de artemisinina o un derivado de la misma, junto con un portador farmacéuticamente aceptable; o

(iii) una cantidad terapéuticamente eficaz de pironaridina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, y artemisinina o un derivado de la misma, junto con un portador farmacéuticamente aceptable,

en donde el derivado de artemisinina se selecciona del grupo que consiste en dihidroartemisinina, artesunato, artemeter y arteéter.

2. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 (i) o (iii), en donde la sal farmacéuticamente aceptable de pironaridina se selecciona del grupo que consiste en fosfato, sulfato, clorhidrato, acetato, metanosulfonato, bencenosulfonato, toluenosulfonato, maleato y fumarato;

opcionalmente, en donde la sal farmacéuticamente aceptable de pironaridina es tetrafosfato de pironaridina.

3. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 (iii), en donde la relación en peso entre la pironaridina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma y la artemisinina o un derivado de la misma es de 10:1 a 1:10;

opcionalmente, la relación en peso entre la pironaridina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma y la artemisinina o un derivado de la misma es de 1:1 a 6:1; o

en donde la relación en peso entre la pironaridina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma y la artemisinina o un derivado de la misma es de 3:1.

4. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 1 (ii) o (iii), en donde el derivado de artemisinina es artesunato.

5. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende además al menos otro agente antiviral;

opcionalmente, el otro agente antiviral se selecciona del grupo que consiste en un inhibidor de la replicación viral, un inhibidor de la helicasa, un inhibidor de la proteasa viral y un inhibidor de la entrada celular viral; preferiblemente, el otro agente antiviral se selecciona del grupo que consiste en ribavirina, interferón, niclosamida y una combinación de los mismos.

6. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la enfermedad respiratoria causada por una infección por coronavirus se selecciona del grupo que consiste en el síndrome respiratorio agudo severo (SARS), el síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS) y la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19);

preferiblemente en donde la enfermedad respiratoria causada por la infección por coronavirus es la Enfermedad por Coronavirus 2019 (COVID-19).

7. Pironaridina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma para su uso en la prevención o el tratamiento de una enfermedad respiratoria causada por una infección por coronavirus.

8. Artemisinina o un derivado de la misma para su uso en la prevención o el tratamiento de una enfermedad respiratoria causada por una infección por coronavirus,

9. Pironaridina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, y artemisinina o un derivado de la misma para su uso en la prevención o el tratamiento de una enfermedad respiratoria causada por una infección por coronavirus,

10. La pironaridina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 o 9, en donde la sal farmacéuticamente aceptable de pironaridina se selecciona del grupo que consiste en fosfato, sulfato, clorhidrato, acetato, metanosulfonato, bencenosulfonato, toluenosulfonato, maleato y fumarato;

11. La pironaridina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 o 9, en donde una relación en peso de la pironaridina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma a la artemisinina o un derivado de la misma es de 10:1 a 1:10;

la relación en peso entre la pironaridina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma y la artemisinina o un derivado de la misma es de 3:1.

12. Artemisinina o un derivado de la misma para el uso de acuerdo con la reivindicación 8 o la reivindicación 9, en donde el derivado de artemisinina es artesunato.

13. Los compuestos para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, en donde el medicamento comprende además al menos otro agente antiviral;

opcionalmente en donde el otro agente antiviral se selecciona del grupo que consiste en un inhibidor de la replicación viral, un inhibidor de la helicasa, un inhibidor de la proteasa viral y un inhibidor de la entrada celular viral; preferiblemente en donde el otro agente antiviral se selecciona del grupo que consiste en ribavirina, interferón, niclosamida y una combinación de los mismos.

14. Los compuestos para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13, en donde la enfermedad respiratoria causada por la infección por coronavirus se selecciona del grupo que consiste en el síndrome respiratorio agudo severo (SARS), el síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS) y la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19);

opcionalmente, en donde la enfermedad respiratoria causada por la infección por coronavirus es la Enfermedad por Coronavirus 2019 (COVID-19).