ES3040458T3 - Device and method for detecting and identifying extracellular vesicles in a liquid dispersion sample - Google Patents
Device and method for detecting and identifying extracellular vesicles in a liquid dispersion sampleInfo
- Publication number
- ES3040458T3 ES3040458T3 ES23207812T ES23207812T ES3040458T3 ES 3040458 T3 ES3040458 T3 ES 3040458T3 ES 23207812 T ES23207812 T ES 23207812T ES 23207812 T ES23207812 T ES 23207812T ES 3040458 T3 ES3040458 T3 ES 3040458T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- sample
- laser
- signal
- time periods
- nanoparticles
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Dispositivo y método para detectar vesículas extracelulares dispersas en una muestra de dispersión líquida. Dicho método utiliza un procesador electrónico de datos para clasificar la muestra según la presencia o ausencia de vesículas extracelulares. El método comprende el uso del procesador electrónico de datos para el preentrenamiento de un clasificador de aprendizaje automático con múltiples muestras de dispersión líquida de vesículas extracelulares. El método comprende los siguientes pasos: emitir un láser modulado por una frecuencia de modulación sobre cada muestra; capturar una señal temporal de la luz láser retrodispersada por cada muestra durante varios periodos temporales de duración predeterminada para cada muestra; calcular los coeficientes de la transformada discreta de coseno (DCT) o de transformada wavelet de la muestra a partir de la señal capturada para cada uno de los periodos temporales; y utilizar los coeficientes calculados para preentrenar el clasificador de aprendizaje automático. El método también comprende los siguientes pasos: utilizar un emisor láser con un sistema óptico de enfoque acoplado al emisor para emitir un láser modulado por una frecuencia de modulación sobre la muestra. Utilizar un receptor de luz para capturar una señal de luz láser retrodispersada por la muestra durante varios períodos temporales de duración predeterminada; calcular los coeficientes de la transformada DCT o Wavelet de la muestra a partir de la señal capturada para cada uno de los períodos temporales; utilizar el clasificador de aprendizaje automático preentrenado para clasificar los coeficientes de muestra calculados como presentes o no presentes en vesículas extracelulares. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)Device and method for detecting extracellular vesicles dispersed in a liquid dispersion sample. The method uses an electronic data processor to classify the sample according to the presence or absence of extracellular vesicles. The method comprises using the electronic data processor to pre-train a machine learning classifier with multiple liquid dispersion samples of extracellular vesicles. The method comprises the following steps: emitting a laser modulated at a specific modulation frequency onto each sample; capturing a time-domain signal of the laser light backscattered by each sample during several time periods of predetermined duration for each sample; calculating the discrete cosine transform (DCT) or wavelet transform coefficients of the sample from the captured signal for each time period; and using the calculated coefficients to pre-train the machine learning classifier. The method also comprises the following step: using a laser emitter with an optical focusing system coupled to the emitter to emit a laser modulated at a specific modulation frequency onto the sample. Use a light receiver to capture a laser light signal backscattered by the sample over several predetermined time periods; calculate the DCT or Wavelet transform coefficients of the sample from the captured signal for each time period; use the pre-trained machine learning classifier to classify the calculated sample coefficients as present or absent in extracellular vesicles.
Description
DESCRIPCIÓNDESCRIPTION
Dispositivo y método para detectar e identificar vesículas extracelulares en una muestra de dispersión líquida Device and method for detecting and identifying extracellular vesicles in a liquid dispersion sample
Campo técnicoTechnical field
La presente divulgación se refiere a un método y a un dispositivo para la detección de vesículas extracelulares (EV). This disclosure relates to a method and device for the detection of extracellular vesicles (EVs).
AntecedentesBackground
Las vesículas extracelulares (EV) han atraído un creciente interés tanto académico como industrial por su elevado potencial en la comunicación célula a célula y la utilización como biomarcadores traduccionales para el diagnóstico y evaluación de la salud. El término “EV” describe las vesículas membranarias derivadas de células y diámetro comprendido entre 30 y 1000 nm, aunque se cree que la mayoría son de un tamaño entre 100 y 150 nm. Extracellular vesicles (EVs) have attracted increasing academic and industrial interest due to their high potential in cell-to-cell communication and their use as translational biomarkers for health diagnosis and assessment. The term “EVs” describes cell-derived membrane vesicles with diameters between 30 and 1000 nm, although most are believed to be between 100 and 150 nm in size.
Debido a su pequeño tamaño y complejidad, las técnicas convencionales han encontrado difícil detectar e identificar las EV producidas por las diferentes poblaciones celulares. De hecho, con dimensiones comprendidas entre 100 y 150 nm, el uso de medios ópticos para detectar las EV resulta complicado, ya que es muy inferior al límite de difracción de la luz [1, 2]. Due to their small size and complexity, conventional techniques have found it difficult to detect and identify EVs produced by different cell populations. In fact, with dimensions between 100 and 150 nm, the use of optical means to detect EVs is complicated, as it is much smaller than the diffraction limit of light [1, 2].
Actualmente existe una falta de instrumentos compatibles con la detección de partículas en dichos intervalos de tamaño, y la microscopía electrónica12, la citometría de flujo convencional y de alta resolución12, el análisis de seguimiento de nanopartículas12, son enfoques de referencia (“gold standard”) para la detección y cuantificación de las EV presentes en una muestra. Currently there is a lack of instruments compatible with the detection of particles in these size ranges, and electron microscopy12, conventional and high-resolution flow cytometry12, nanoparticle tracking analysis12 are reference approaches (“gold standard”) for the detection and quantification of EV present in a sample.
La detección de vesículas extracelulares (principalmente exosomas) mediante la utilización de citometría de flujo de alta resolución se estima que se utiliza en 90 % de la investigación sobre nanopartículas de origen biológico [1,2]. A pesar de las mejoras de resolución que incluyen estos nuevos métodos respecto a los convencionales, todavía se basan en equipos voluminosos y todavía más caros (que requieren láseres de alta potencia, con un tamaño del punto del haz enfocado más pequeño que con el método convencional, por ejemplo)2. Además, continúan dependiendo del análisis de dos tipos de señales: las dispersadas y las señales de fluorescencia, que exigen caros sistemas computaciones y de control, y que están asociados a una técnica de análisis que requiere mucho tiempo. The detection of extracellular vesicles (mainly exosomes) using high-resolution flow cytometry is estimated to be used in 90% of research on bio-based nanoparticles [1,2]. Despite the resolution improvements offered by these newer methods compared to conventional ones, they still rely on bulky and even more expensive equipment (requiring high-power lasers with a smaller focused beam spot size than the conventional method, for example)2. Furthermore, they continue to depend on the analysis of two types of signals: scattered and fluorescence signals, which require expensive computational and control systems and are associated with a time-consuming analytical technique.
La cantidad de luz dispersada por una partícula se ha considerado una técnica de referencia para una caracterización simple de las partículas, dada su dependencia de características cruciales de la dispersión, tales como el diámetro de partícula, el índice de refracción, la forma/geometría, la composición, el tipo de contenido (sintético o biológico) y los tipos de interacción con el medio circundante [3-5]. Las diferentes células u orgánulos celulares con frecuencia son diferentes en términos de sus valores de índice de refracción debido a los tipos de proteína que se expresan y las diferencias de carga intracelular que existen entre ellas [5]. Paiva et al. [6] divulgan un método y un dispositivo para atrapar, manipular y detectar partículas; sin embargo, dicho documento no describe que las partículas se detectan mientras están en dispersión y que resulta necesario inmovilizar, o atrapar, previamente dichas partículas. The amount of light scattered by a particle has been considered a reference technique for simple particle characterization, given its dependence on crucial scattering characteristics such as particle diameter, refractive index, shape/geometry, composition, content type (synthetic or biological), and types of interaction with the surrounding medium [3-5]. Different cells or cell organelles often differ in their refractive index values due to the types of proteins they express and the differences in intracellular charge [5]. Paiva et al. [6] disclose a method and device for trapping, manipulating, and detecting particles; however, this document does not describe that particles are detected while in scattering and that it is necessary to immobilize, or trap, these particles beforehand.
Ninguno de dichos documentos enseña un método o un dispositivo que resulte adecuado para la detección de vesículas extracelulares en muestras líquidas. Estos hechos se dan a conocer con el fin de ilustrar el problema técnico al que se refiere la presente divulgación. None of these documents describes a method or device suitable for detecting extracellular vesicles in liquid samples. These facts are disclosed to illustrate the technical problem addressed in this disclosure.
ReferenciasReferences
[1] Steinbichler, T., Dudás, J., Riechelmann, H. y Skvortsova, I. The role of exosomes in cancer metastasis. Seminars in cancer biology 44, 170-181 (2017). [1] Steinbichler, T., Dudás, J., Riechelmann, H. and Skvortsova, I. The role of exosomes in cancer metastasis. Seminars in cancer biology 44, 170-181 (2017).
[2] Welsh, J., Holloway, J., Wilkinson, J. y Enlyst, N. Extracellular vesicle flow cytometry analysis and standardization. Frontiers in Cell and Developmental Biology 5, 78 (2017). [2] Welsh, J., Holloway, J., Wilkinson, J. and Enlyst, N. Extracellular vesicle flow cytometry analysis and standardization. Frontiers in Cell and Developmental Biology 5, 78 (2017).
[3] Mei, Z., Wu, T., Pion-Tonachini, L., Qiao, W., Zhao, C., Liu, Z. y Lo, Y., "Applying an optical space-time coding method to enhance light scattering signals in microfluidic devices," Biomicrofluidics 5(3), 034116 (2011). [3] Mei, Z., Wu, T., Pion-Tonachini, L., Qiao, W., Zhao, C., Liu, Z. and Lo, Y., "Applying an optical space-time coding method to enhance light scattering signals in microfluidic devices," Biomicrofluidics 5(3), 034116 (2011).
[4] Wu, T., Cho, S., Chiu, Y. y Lo, Y., "Lab-on-a-Chip Device and System for Point-of-Care Applications," Handbook of Photonics for Biomedical Engineering , 87-121 (2017). [4] Wu, T., Cho, S., Chiu, Y., and Lo, Y., “Lab-on-a-Chip Device and System for Point-of-Care Applications,” Handbook of Photonics for Biomedical Engineering, 87-121 (2017).
[5] Welsh, J., Holloway, J., Wilkinson, J. y Englyst, N., "Extracellular vesicle flow cytometry analysis and standardization," Frontiers in cell and developmental biology 5, 78 (2017). [5] Welsh, J., Holloway, J., Wilkinson, J. and Englyst, N., "Extracellular vesicle flow cytometry analysis and standardization," Frontiers in cell and developmental biology 5, 78 (2017).
[6] JOANA PAIVA ET AL: "Single Particle Differentiation through 2D Optical Fiber Trapping and Back-Scattered Signal Statistical Analysis: An Exploratory Approach", SENSORS, vol. 18, n.° 3, 27 de febrero de 2018 (2018 02-27), DOI: 10.3390/s18030710 [6] JOANA PAIVA ET AL: "Single Particle Differentiation through 2D Optical Fiber Trapping and Back-Scattered Signal Statistical Analysis: An Exploratory Approach", SENSORS, vol. 18, No. 3, February 27, 2018 (2018 02-27), DOI: 10.3390/s18030710
Descripción generalOverview
Un objeto principal de la presente divulgación es un método y un dispositivo para la detección de vesículas extracelulares (EV) en una muestra de dispersión líquida. A primary object of the present disclosure is a method and device for the detection of extracellular vesicles (EVs) in a liquid dispersion sample.
El método y el dispositivo propuestos pueden detectar la presencia de nanopartículas biológicas complejas (por ejemplo, tipos específicos de exosomas de cáncer) en soluciones líquidas complejas. El método y dispositivo divulgados cubren una gama de tamaños de detección entre 30 nm y 24 pm. The proposed method and device can detect the presence of complex biological nanoparticles (e.g., specific types of cancer exosomes) in complex liquid solutions. The disclosed method and device cover a detection size range between 30 nm and 24 pm.
La presente divulgación resulta extremadamente útil para diferenciar el tipo de EV en formas de realización rápidas y simples. This disclosure is extremely useful for differentiating the type of EV in quick and simple implementation forms.
En una forma de realización particular, dicho dispositivo puede estar incluido en microchips de microfluidos para el diagnóstico clínico rápido o para la integración en un sistema automatizado de producción de alimentos para la separación y selección de levaduras/otros microcompuestos de acuerdo con criterios de producto específicos. Es divulgado un dispositivo para la detección de vesículas extracelulares en una muestra de dispersión líquida, en el que dicho dispositivo comprende un emisor de láser, un sistema óptico de enfoque acoplado al emisor, un receptor de luz infrarroja y un procesador de datos electrónico dispuestos para clasificar la muestra de acuerdo con la presencia o no de vesículas extracelulares utilizando un clasificador de aprendizaje automático (“machine learning”) que ha sido preentrenado utilizando una pluralidad de especímenes de dispersión líquida de vesículas extracelulares, mediante un método que comprende: In one particular embodiment, this device can be incorporated into microfluidic microchips for rapid clinical diagnosis or for integration into an automated food production system for the separation and selection of yeasts/other microcompounds according to specific product criteria. A device for detecting extracellular vesicles in a liquid dispersion sample is disclosed, wherein the device comprises a laser emitter, an optical focusing system coupled to the emitter, an infrared light receiver, and an electronic data processor arranged to classify the sample according to the presence or absence of extracellular vesicles using a machine learning classifier that has been pre-trained using a plurality of liquid dispersion specimens of extracellular vesicles, by a method comprising:
emitir un láser modulado en una frecuencia de modulación, que incide sobre cada espécimen; emit a laser modulated at a modulation frequency, which impinges on each specimen;
capturar una señal temporal procedente de la luz láser retrodispersada por cada espécimen en una pluralidad de periodos temporales de una duración predeterminada para cada espécimen; capture a temporal signal from the laser light backscattered by each specimen over a plurality of time periods of a predetermined duration for each specimen;
calcular los coeficientes DCT o de transformada de ondícula (“wavelet”) de los especímenes a partir de las señales capturadas en cada uno de los periodos temporales; calculate the DCT or wavelet transform coefficients of the specimens from the signals captured in each of the time periods;
utilizar los coeficientes calculados para preentrenar el clasificador de aprendizaje automático; use the calculated coefficients to pre-train the machine learning classifier;
en el que el procesador de datos electrónico está dispuesto además para: in which the electronic data processor is further arranged to:
utilizar el emisor de láser para emitir un láser modulado por una frecuencia de modulación sobre la muestra; utilizar el receptor de luz para capturar una señal procedente de la luz láser retrodispersada por la muestra para una pluralidad de periodos temporales de una duración predeterminada; use the laser emitter to emit a laser modulated by a modulation frequency onto the sample; use the light receiver to capture a signal from the laser light backscattered by the sample for a plurality of time periods of a predetermined duration;
calcular los coeficientes DCT o de transformada de ondícula a partir de las señales capturadas en cada uno de los periodos temporales; calculate the DCT or wavelet transform coefficients from the signals captured in each of the time periods;
utilizar el clasificador de aprendizaje automático preentrenado para clasificar los coeficientes de muestra calculados como presencia o no presencia de vesículas extracelulares. Use the pre-trained machine learning classifier to classify the calculated sample coefficients as the presence or absence of extracellular vesicles.
Se divulga, además, un método para la detección de vesículas extracelulares en una muestra de dispersión líquida, en el que dicho método utiliza un procesador de datos electrónico para clasificar la muestra según la presencia o no de vesículas extracelulares, A method for detecting extracellular vesicles in a liquid dispersion sample is also disclosed, in which the method uses an electronic data processor to classify the sample according to the presence or absence of extracellular vesicles.
en el que el método comprende la utilización del procesador de datos electrónico para el preentrenamiento de un clasificador de aprendizaje automático con una pluralidad de especímenes de dispersión líquida de vesículas extracelulares, que comprende las etapas de: wherein the method comprises the use of an electronic data processor for the pre-training of a machine learning classifier with a plurality of liquid dispersion specimens of extracellular vesicles, comprising the steps of:
emitir un láser modulado en una frecuencia de modulación, que incide sobre cada espécimen; emit a laser modulated at a modulation frequency, which impinges on each specimen;
capturar una señal temporal procedente de la luz láser retrodispersada por cada espécimen en una pluralidad de periodos temporales de una duración predeterminada para cada espécimen; capture a temporal signal from the laser light backscattered by each specimen over a plurality of time periods of a predetermined duration for each specimen;
calcular los coeficientes DCT o de transformada de ondícula de los especímenes a partir de las señales capturadas en cada uno de los periodos temporales; calculate the DCT or wavelet transform coefficients of the specimens from the signals captured in each of the time periods;
utilizar los coeficientes calculados para preentrenar el clasificador de aprendizaje automático; en el que el método comprende, además, las etapas de: use the calculated coefficients to pre-train the machine learning classifier; wherein the method also comprises the following stages:
utilizar un emisor de láser que presenta un sistema óptico de enfoque acoplado al emisor para emitir un láser modulador en una frecuencia de modulación, que incide en la muestra; using a laser emitter that features a focusing optical system coupled to the emitter to emit a modulating laser at a modulation frequency, which impinges on the sample;
utilizar un receptor de luz para capturar la señal de la luz láser retrodisperada por la muestra en una pluralidad de periodos temporales de una duración predeterminada; use a light receiver to capture the laser light signal backscattered by the sample over a plurality of time periods of a predetermined duration;
calcular los coeficientes DCT o de transformada de ondícula a partir de las señales capturadas en cada uno de los periodos temporales; calculate the DCT or wavelet transform coefficients from the signals captured in each of the time periods;
utilizar el clasificador de aprendizaje automático preentrenado para clasificar los coeficientes de muestra calculados como presencia o no presencia de vesículas extracelulares. Use the pre-trained machine learning classifier to classify the calculated sample coefficients as the presence or absence of extracellular vesicles.
En una forma de realización, el procesador de datos electrónico está organizado adicionalmente para clasificar, en caso de estar presentes, las vesículas extracelulares en una pluralidad de clases de tipo de vesícula extracelular mediante la utilización del clasificador de aprendizaje automático que ha sido preentrenado utilizando una pluralidad de clases de tipo de espécimen en dispersión líquida de vesícula extracelular. In one embodiment, the electronic data processor is further arranged to classify, if present, extracellular vesicles into a plurality of extracellular vesicle type classes by utilizing the machine learning classifier that has been pre-trained using a plurality of specimen type classes in liquid dispersion of extracellular vesicles.
En una forma de realización, el láser es un láser de luz visible o un láser de infrarrojos, o una combinación, en particular un láser de infrarrojos, y el receptor es un receptor de luz visible e infrarrojos. In one embodiment, the laser is a visible light laser or an infrared laser, or a combination, in particular an infrared laser, and the receiver is a visible light and infrared receiver.
En una forma de realización, el láser está adicionalmente modulado en una o más frecuencias de modulación adicionales. In one embodiment, the laser is additionally modulated at one or more additional modulation frequencies.
En una forma de realización, la frecuencia de modulación de espécimen y la frecuencia de modulación de muestra son idénticas. In one embodiment, the specimen modulation frequency and the sample modulation frequency are identical.
En una forma de realización, la duración predeterminada de espécimen y la duración predeterminada de muestra son idénticas. In one embodiment, the default specimen duration and the default sample duration are identical.
En una forma de realización, la pluralidad capturada de periodos temporales de una duración predeterminada se obtiene mediante la división de una señal temporal capturada de una duración más larga que la duración predeterminada. In one embodiment, the captured plurality of time periods of a predetermined duration is obtained by dividing a captured time signal of a duration longer than the predetermined duration.
En una forma de realización, los periodos temporales divididos son periodos temporales solapantes. In one embodiment, the split time periods are overlapping time periods.
En una forma de realización, la duración temporal predeterminada se selecciona de entre 1,5 y 2,5 segundos, en particular 2 segundos. In one implementation, the default time duration is selected from between 1.5 and 2.5 seconds, specifically 2 seconds.
En una forma de realización, el procesador de datos electrónico está dispuesto además para preentrenar y clasificar a partir de la señal capturada utilizando características derivadas del histograma de dominios temporales o de los estadísticos de dominio temporal, en particular las características siguientes: wNakagami, pNakagami, entropía, desviación estándar o combinaciones de las mismas. In one embodiment, the electronic data processor is further arranged to pre-train and classify from the captured signal using features derived from the time-domain histogram or from time-domain statistics, in particular the following features: wNakagami, pNakagami, entropy, standard deviation, or combinations thereof.
En una forma de realización, el sistema óptico de enfoque es una lente convergente. In one embodiment, the focusing optical system is a converging lens.
En una forma de realización, el sistema óptico de enfoque es una lente convergente que es un fotoconcentrador polimérico dispuesto en la punta de una fibra óptica o guía de ondas. In one embodiment, the focusing optical system is a converging lens that is a polymeric photoconcentrator disposed at the tip of an optical fiber or waveguide.
En una forma de realización, el sistema óptico de enfoque es un sistema óptico de enfoque adecuado para proporcionar un patrón de gradiente de campo, en particular una lente polimérica, una fibra con estrechamiento gradual, placas de Fresnel de amplitud o fase, o cualquiera de ellas con una o más películas de oro añadidas que presentan un grosor y nano- o microorificios o una matriz de orificios para conseguir efectos plasmónicos. In one embodiment, the focusing optical system is a focusing optical system suitable for providing a field gradient pattern, in particular a polymer lens, a fiber with gradual tapering, amplitude or phase Fresnel plates, or any of them with one or more added gold films having a thickness and nano- or micro-holes or a hole array to achieve plasmonic effects.
En una forma de realización, la lente presente un punto de enfoque correspondiente a una cintura de haz de entre 1/3 y 1/4 del diámetro de base de la lente. In one embodiment, the lens features a focus point corresponding to a beam waist of between 1/3 and 1/4 of the lens base diameter.
En una forma de realización, la lente presenta una apertura numérica (AN) superior a 0,5. In one embodiment, the lens has a numerical aperture (NA) greater than 0.5.
En una forma de realización, la lente presenta un diámetro de base de entre 5 y 10 pm, en particular de entre 6 y 8 pm. In one embodiment, the lens has a base diameter of between 5 and 10 pm, particularly between 6 and 8 pm.
En una forma de realización, la lente es esférica y presenta una longitud de entre 30 y 50 |jm, en particular de entre 37 y 47 jm . In one embodiment, the lens is spherical and has a length of between 30 and 50 |jm, in particular between 37 and 47 jm.
En una forma de realización, la lente presente un radio de curvatura de entre 2 y 5 jm , en particular de entre 2,5 y 3,5 jm . In one embodiment, the lens has a radius of curvature of between 2 and 5 jm, in particular between 2.5 and 3.5 jm.
En una forma de realización, el receptor de luz infrarroja es un fotorreceptor que comprende un ancho de banda de entre 400 y 1000 nm. In one embodiment, the infrared light receiver is a photoreceptor comprising a bandwidth of between 400 and 1000 nm.
En una forma de realización, el cálculo de los coeficientes de transformada comprende seleccionar un subconjunto mínimo de coeficientes de transformada, de manera que la transformada conserva un porcentaje predeterminado de la energía total de la señal. In one embodiment, the calculation of the transform coefficients comprises selecting a minimal subset of transform coefficients, such that the transform retains a predetermined percentage of the total signal energy.
En una forma de realización, el número del subconjunto mínimo de coeficientes de transformada DCT se selecciona de entre 20 y 40, o de 20, 30 o 40. In one embodiment, the number of the minimum subset of DCT transform coefficients is selected from either 20 and 40, or 20, 30, or 40.
En una forma de realización, la captura de señal se lleva a cabo por lo menos con una frecuencia de muestreo de por lo menos cinco veces la frecuencia de modulación. In one embodiment, the signal capture is carried out at least with a sampling frequency of at least five times the modulation frequency.
En una forma de realización, la captura de señal comprende un filtro de paso alto. In one embodiment, the signal capture comprises a high-pass filter.
En una forma de realización, la frecuencia de modulación es igual o superior a 1 kHz. In one embodiment, the modulation frequency is equal to or greater than 1 kHz.
En una forma de realización, las vesículas extracelulares presentan un tamaño de partícula en cualquier dirección de partícula inferior a 1 jm o de entre 30 nm y 30 jm . In one embodiment, the extracellular vesicles have a particle size in any particle direction less than 1 jm or between 30 nm and 30 jm.
Es divulgado, además, un medio de almacenamiento no transitorio que incluye instrucciones de programa para implementar un método para la detección de vesículas extracelulares en una muestra de dispersión líquida, en el que las instrucciones de programa incluyen instrucciones ejecutables por un procesador de datos electrónico para llevar a cabo el método de cualquiera de las formas de realización divulgadas. A non-transient storage medium is also disclosed, which includes program instructions for implementing a method for detecting extracellular vesicles in a liquid dispersion sample, wherein the program instructions include instructions executable by an electronic data processor to carry out the method in any of the disclosed embodiments.
Alternativamente a la transformada DCT o de ondícula, pueden utilizarse tanto transformaciones DCT como de ondícula, u otra transformada de reducción de la dimensionalidad de las series temporales, o pueden utilizarse múltiples transformaciones de reducción de la dimensionalidad de las series temporales. Alternatively to the DCT or wavelet transform, either DCT or wavelet transforms, or another time series dimensionality reduction transform, or multiple time series dimensionality reduction transforms can be used.
En una forma de realización, la transformada de reducción de la dimensionalidad de las series temporales es la transformada de coseno discreta (DCT). In one realization, the time series dimensionality reduction transform is the discrete cosine transform (DCT).
En una forma de realización, la transformada de reducción de la dimensionalidad de series temporales es la transformada de ondícula. In one form of realization, the time series dimensionality reduction transform is the wavelet transform.
En una forma de realización, los tipos de ondícula son Haar y Daubechies (Db10). In one form of realization, the wave types are Haar and Daubechies (Db10).
La divulgación puede explicarse por la diferente respuesta de los distintos tipos de nanopartícula a un potencial electromagnético altamente enfocado. Dos tipos de fenómeno pueden contribuir a esta diferente respuesta de los diferentes tipos de nanoestructura: el patrón de movimiento browniano en dispersión líquida y/o la diferente polarizabilidad óptica, correlacionada intrínsecamente con el índice de refracción a escala microscópica. Por lo tanto, el patrón de movimiento browniano y/o la polarizabilidad óptica se ponen de manifiesto mediante los parámetros DCT y derivados de ondícula que se extraen de la luz retrodispersada, que son utilizados por dicho clasificador de aprendizaje automático preentrenado para la clasificación de las vesículas extracelulares. The discrepancy can be explained by the different responses of various nanoparticle types to a highly focused electromagnetic potential. Two phenomena can contribute to this difference in response: the Brownian motion pattern in liquid dispersion and/or the different optical polarizability, intrinsically correlated with the refractive index at the microscopic scale. Therefore, the Brownian motion pattern and/or optical polarizability are revealed by the DCT and wavelet-derived parameters extracted from the backscattered light, which are used by the pre-trained machine learning classifier for the classification of extracellular vesicles.
En esta caso, la divulgación utiliza las fluctuaciones distintivas dependientes del tiempo en la intensidad de dispersión causadas por interferencia constructiva y destructiva que resulta tanto del movimiento browniano relativo de las nanopartículas en la dispersión líquida, dictado por la difusividad de las partículas en la dispersión (parámetro que únicamente depende del tamaño de partícula) como de la respuesta al potencial electromagnético altamente enfocado, que depende de la polarizabilidad óptica de la partícula. La superposición de estos dos efectos permite distinguir las EV del mismo tamaño, lo que no resulta posible utilizando los métodos basados en la dispersión de la luz del estado de la técnica. In this case, the disclosure utilizes the distinctive time-dependent fluctuations in scattering intensity caused by constructive and destructive interference resulting from both the relative Brownian motion of the nanoparticles in the liquid dispersion, dictated by the diffusivity of the particles in the dispersion (a parameter that depends solely on particle size), and the response to the highly focused electromagnetic potential, which depends on the optical polarizability of the particle. The superposition of these two effects allows for the differentiation of EVs of the same size, which is not possible using prior art light-scattering-based methods.
La divulgación es aplicable a nanopartículas o micropartículas que muestran fluctuaciones distintivas dependientes del tiempo en la intensidad de dispersión causadas por interferencia constructiva y destructiva que resultan del movimiento browniano relativo de las nanopartículas en la muestra de dispersión líquida que afectan a la luz retrodispersada y las diferentes polarizabilidades ópticas (o índices de refracción a escala microscópica). The disclosure is applicable to nanoparticles or microparticles that show distinctive time-dependent fluctuations in scattering intensity caused by constructive and destructive interference resulting from the relative Brownian motion of the nanoparticles in the liquid dispersion sample affecting backscattered light and different optical polarizabilities (or refractive indices at the microscopic scale).
La divulgación detecta e identifica nanopartículas de diámetro, y/o índice de refracción y/o polarizabilidad óptica predeterminadas. The disclosure detects and identifies nanoparticles of predetermined diameter, and/or refractive index and/or optical polarizability.
La divulgación es aplicable, además, a células individuales, en las que el dispositivo puede utilizarse para detectar una célula individual en una muestra de dispersión líquida. Además, la divulgación asimismo es aplicable a la clasificación de una célula individual en una muestra de dispersión líquida. Éstas preferentemente pueden atraparse para la medición. La célula puede ser una célula individualizada, en particular una célula humana individualizada, o un microorganismo unicelular. Por ejemplo, las pinzas de fibra óptica con capacidades de detección son capaces de proporcionar información significativa y específica sobre una partícula diana individualizada, atrapada establemente durante la medición. The disclosure also applies to individual cells, where the device can be used to detect a single cell in a liquid dispersion sample. Furthermore, the disclosure also applies to the classification of an individual cell in a liquid dispersion sample. These cells can preferably be captured for measurement. The cell can be an individual cell, particularly an individual human cell, or a single-celled microorganism. For example, fiber optic tweezers with detection capabilities can provide meaningful and specific information about an individual target particle, stably captured during measurement.
En particular, la divulgación es aplicable a la detección de modificaciones postraduccionales, por ejemplo, incidentes de fosforilación o glucosilación como O-glicanos más cortos o truncados, los cuales se consideran marcadores predictivos de mal pronóstico en determinados cánceres. Estos fenómenos están frecuentemente asociados a una síntesis incompleta de glicanos durante la glucosilación celular. In particular, this disclosure applies to the detection of post-translational modifications, such as phosphorylation or glycosylation incidents like shorter or truncated O-glycans, which are considered predictive markers of poor prognosis in certain cancers. These phenomena are frequently associated with incomplete glycan synthesis during cellular glycosylation.
Breve descripción de los dibujosBrief description of the drawings
Las figuras siguientes proporcionan formas de realización preferidas para ilustrar la descripción y no deben considerarse limitativas del alcance de la invención, como se expone en las reivindicaciones independientes. The following figures provide preferred embodiments to illustrate the description and should not be considered limiting to the scope of the invention, as set forth in the independent claims.
Figura 1: representación esquemática de la configuración óptica según una forma de realización. Figure 1: Schematic representation of the optical configuration according to one embodiment.
Figura 2: representación esquemática del concentrador óptico según una forma de realización. Figure 2: Schematic representation of the optical concentrator according to one embodiment.
Figura 3: representación esquemática del flujo de procesamiento de señales según una forma de realización. Figure 3: Schematic representation of the signal processing flow according to one implementation.
Figura 4: representaciones gráficas de la distribución 2D de las dos características derivadas por DCT más significativas, extraídas de las señales retrodispersadas de EV tipo a y EV de tipo b simuladas (cruces frente a círculos). Figure 4: Graphical representations of the 2D distribution of the two most significant DCT-derived features, extracted from the simulated type a EV and type b EV backscattered signals (crosses versus circles).
Figura 5: representación esquemática según una forma de realización de cómo los datos se dividen para el entrenamiento y las pruebas, considerando un ejemplo de un experimento que incluye tres clases de partículas, en donde “n” pretende representar el número de tandas de evaluación/número de diferentes combinaciones entre grupos de entrenamiento y de prueba. Figure 5: Schematic representation according to one way of realizing how the data are divided for training and testing, considering an example of an experiment that includes three classes of particles, where “n” is intended to represent the number of evaluation rounds/number of different combinations between training and testing groups.
Figura 6: gráficos de señales para un experimento con soluciones complejas que contienen nanopartículas biológicas complejas. Figure 6: Signal graphs for an experiment with complex solutions containing complex biological nanoparticles.
Descripción detalladaDetailed description
La divulgación se describe con mayor detalle a continuación. The disclosure is described in more detail below.
En la figura 1, se ilustra una configuración óptica (100). En la configuración óptica se incluyó un láser de 980 nm con fibrapigtail(500 mW, Lumics, ref. LU0980M500) (105). Para conectar dos inputs se utilizó un acoplador de fibra 50/50 con una topología 1x2 (110): el láser (105) y el fotodetector (115) (módulo de adquisición de señal retrodispersada). A continuación, se dividió la punta (120) de la fibra óptica a la salida del acoplador de fibra (110) y se insertó en un capilar metálico (125) controlado por el micromanipulador motorizado (130). Esta configuración permitió tanto la guía con luz láser a la punta (120) de la fibra óptica a través de la fibra óptica como la adquisición de la señal retrodispersada a través del fotodetector (PDA 36A-EC, Thorlabs) (115). Además del fotodetector, el módulo de adquisición de la señal retrodispersada asimismo estaba compuesto por una placa de adquisición análoga-a-digital (National Instruments DAQ) (135), que se conectó al fotodetector (115) para la transmisión de la señal adquirida al ordenador portátil, en donde se almacenó para el procesamiento posterior (145). Asimismo se conectó una salida digital-a-análoga del DAQ (135) al láser para modular su señal utilizando una señal sinusoidal con una frecuencia fundamental de 1 KHz. Se cargó una muestra líquida (140) sobre un cubreobjetos de vidrio y se insertó en la muestra una fibra con el fotoconcentrador (120) en la punta. Figure 1 illustrates an optical configuration (100). The optical configuration included a 980 nm laser with a fiber pigtail (500 mW, Lumics, ref. LU0980M500) (105). A 50/50 fiber coupler with a 1x2 topology (110) was used to connect two inputs: the laser (105) and the photodetector (115) (backscattered signal acquisition module). The tip (120) of the optical fiber at the output of the fiber coupler (110) was then split and inserted into a metallic capillary (125) controlled by a motorized micromanipulator (130). This configuration allowed both laser guidance of the optical fiber tip (120) through the optical fiber and backscattered signal acquisition via the photodetector (PDA 36A-EC, Thorlabs) (115). In addition to the photodetector, the backscattered signal acquisition module also consisted of an analog-to-digital converter (National Instruments DAQ) (135), which was connected to the photodetector (115) for transmitting the acquired signal to the laptop computer, where it was stored for further processing (145). A digital-to-analog output of the DAQ (135) was also connected to the laser to modulate its signal using a sinusoidal signal with a fundamental frequency of 1 kHz. A liquid sample (140) was loaded onto a glass coverslip, and a fiber with the photoconcentrator (120) at its tip was inserted into the sample.
El tipo de fotoconcentrador se presenta en la figura 2 y consiste en una lente polimérica fabricada mediante un método de fotopolimerización de onda guiada. Este fotoconcentrador se caracteriza por una lente esférica convergente con una AN>0,5, capaz de enfocar el haz láser en un punto altamente enfocado correspondiente a una cintura de haz de entre aproximadamente 1/3 y 1/4 del diámetro de la base de la lente. Además, un diámetro de base de entre 6 y 8 pm (205) y un radio de curvatura de entre 2 y 3,5 pm asimismo resultan una solución adecuada. La punta de la fibra con el fotoconcentrador se sumerge en la muestra líquida y se adquiere la señal retrodispersada considerando diferentes localizaciones de la punta en la solución. The photoconcentrator type shown in Figure 2 consists of a polymer lens fabricated using a wave-guided photopolymerization method. This photoconcentrator is characterized by a converging spherical lens with a focal length (FL) > 0.5, capable of focusing the laser beam to a highly focused point corresponding to a beam waist of approximately 1/3 to 1/4 of the lens base diameter. A base diameter of 6 to 8 pm (205) and a radius of curvature of 2 to 3.5 pm are also suitable. The fiber tip containing the photoconcentrator is immersed in the liquid sample, and the backscattered signal is acquired considering different tip locations within the solution.
Se hace referencia a la figura 3 para explicar la adquisición y el procesamiento de la señal. Se adquirió la señal en bruto retrodispersada mediante un fotodetector (PDA 36A-EC, Thorlabs) conectado a un conversor analógico-adigital (National Instruments DQ) a una tasa de muestreo de 5 kHz para todos los experimentos (I-VII). Tras cada adquisición, se pasó la señal original a través de etapas de procesamiento. Durante el procesamiento de la señal, en primer lugar, se filtró la señal, utilizando un filtro de paso alto Butterworth de 500 Hz de segundo orden (350), ya que la radiación láser de entrada estaba modulada utilizando una señal sinusoidal de 1 kHz, y para eliminar componentes de baja frecuencia ruidosos en la señal adquirida (por ejemplo, el componente de 50 Hz de la red eléctrica). A continuación, la señal entera adquirida para cada partícula y condición se dividió en épocas de 2 segundos (310). La puntuación z de cada porción de señal de 2 segundos se calculó para eliminar las épocas de señal ruidosas (315). Las porciones de señal de 2 segundos con puntuación z que en magnitud excedían el valor umbral de entre 5 y 10 fueron eliminadas (315). Tras realizar dichas etapas, resultó posible obtener un conjunto de datos de porciones de señal de 2 s con una relación de señal a ruido (RSR) razonable para que resultase posible la identificación del tipo de EV (320). Figure 3 is used to explain signal acquisition and processing. The raw backscattered signal was acquired using a photodetector (PDA 36A-EC, Thorlabs) connected to an analog-to-digital converter (National Instruments DQ) at a sampling rate of 5 kHz for all experiments (I–VII). After each acquisition, the original signal was passed through processing stages. During signal processing, the signal was first filtered using a second-order 500 Hz Butterworth high-pass filter (350), since the input laser radiation was modulated using a 1 kHz sinusoidal signal, and to remove noisy low-frequency components in the acquired signal (e.g., the 50 Hz component from the power grid). The entire signal acquired for each particle and condition was then divided into 2-second epochs (310). The z-score of each 2-second signal slice was calculated to eliminate noisy signal epochs (315). 2-second signal slices with z-scores exceeding the threshold value of between 5 and 10 were eliminated (315). After performing these steps, it was possible to obtain a dataset of 2-second signal slices with a reasonable signal-to-noise ratio (SNR) to allow for the identification of the EV type (320).
Se extrajo un total de 54 características (figura 3, 325) a partir de la señal retrodispersada a fin de caracterizar cada clase que podía separarse en dos tipos principales: características de dominio temporal y características de dominio de frecuencia. El primer conjunto puede dividirse en dos subconjuntos: estadísticos de dominio temporal y características derivadas de histograma de dominio temporal. El conjunto de dominio de frecuencia asimismo se dividió en dos grupos: características derivadas mediante transformada de coseno discreta (DCT) y características de ondícula. Las 54 características se resumen en la tabla 1. A total of 54 features (Figure 3, 325) were extracted from the backscattered signal to characterize each class, which could be separated into two main types: time-domain features and frequency-domain features. The first set can be divided into two subsets: time-domain statistics and time-domain histogram-derived features. The frequency-domain set was also divided into two groups: discrete cosine transform (DCT)-derived features and wavelet features. The 54 features are summarized in Table 1.
Se extrajeron los estadísticos de dominio temporal siguientes de cada porción de señal de 2 segundos: desviación estándar (SD), valor cuadrático medio (RMS), asimetría(Skew),kurtosis(Kurt),intervalo intercuartil(IQR),entropía (E), considerando su idoneidad para diferenciar con significancia estadística entre partículas sintéticas de diferentes tipos y células de levadura. Considerando que la distribución de Nakagami se ha utilizado ampliamente para describir el eco retrodispersado en términos estadísticos, principalmente en el campo biomédico, asimismo se consideran los parámetros Nâkagami y Nakagami derivados de la función de densidad de probabilidad (PDF) que mejor aproximan la distribución de cada porción de señal de 2 segundos a la distribución de Nakagami. En la clasificación se consideraron los parámetros derivados de histograma de dominio temporal. En total, se utilizaron ocho características obtenidas mediante análisis de dominios temporales de la señal retrodispersada mediante el método propuesto. Considerando la capacidad de capturar periodicidades mínimas de la señal analizada, al no estar correlacionados los coeficientes asociados, y debido al hecho de que, en contraste con la transformada de Fourier rápida (FFT), no inyecta artefactos de alta frecuencia en los datos transformados, se aplicó la transformada de coseno discreta (DCT) en las porciones de señal a corto plazo originales para extraer la información derivada de la frecuencia. Considerando que los primeros n coeficientes de la DCT de la señal eco dispersada se definen mediante la ecuación siguiente: The following time-domain statistics were extracted from each 2-second signal segment: standard deviation (SD), root mean square (RMS), skewness (Skew), kurtosis (Kurt), interquartile range (IQR), and entropy (E), considering their suitability for statistically differentiating between synthetic particles of different types and yeast cells. Given that the Nakagami distribution has been widely used to statistically describe backscattered echo, primarily in the biomedical field, the Nakagami and Nakagami parameters derived from the probability density function (PDF) that best approximate the distribution of each 2-second signal segment to the Nakagami distribution were also considered. The classification considered parameters derived from the time-domain histogram. In total, eight features obtained through time-domain analysis of the backscattered signal using the proposed method were used. Considering the ability to capture minimal periodicities of the analyzed signal, due to the uncorrelated nature of the associated coefficients, and because, unlike the Fast Fourier Transform (FFT), it does not inject high-frequency artifacts into the transformed data, the Discrete Cosine Transform (DCT) was applied to the original short-term signal portions to extract frequency-derived information. The first n coefficients of the DCT of the scattered echo signal are defined by the following equation:
en la que £i es la envolvente de la señal estimada utilizando la transformada de Hilbert; mediante la ordenación de los coeficientes de DCT de valor de magnitud más alto a más bajo, y obteniendo el vector siguiente: where £i is the envelope of the signal estimated using the Hilbert transform; by ordering the DCT coefficients from highest to lowest magnitude value, and obtaining the following vector:
en el queEDCTi[ l1]representa el coeficiente de DCT de magnitud más alta, resulta posible determinar el porcentaje de la cantidad total de la energía de la señal representado por cada grupo de coeficientes (ordenados de más alto a más bajo). Cada valor de porcentaje referido a cada grupo de coeficientes (del primer al noveno coeficiente) puede obtenerse mediante división de la norma del vector formado por el primer coeficiente hasta el n-ésimo coeficiente por la norma del vector compuesto por la totalidad de losncoeficientes. De esta manera, se utilizaron las características derivadas de DCT siguientes para caracterizar cada porción de señal de 2 s: el número de coeficientes necesario para representar aproximadamente 98 % de la energía total de la señal original(Ndct),los primeros 20, 30 o 40 coeficientes de DCT extraídos del vector definido en (2), la superficie bajo la curva (AUC) del espectro de DCT para todas las frecuencias (de 0 a 2,5 kHz)(AUCdct),la amplitud máxima del espectro de DCT(Pícodct)y el espectro de potencias de la señal obtenido mediante la DCT considerando todos los valores dentro del intervalo de frecuencias analizado (de 0 a 2,5 kHz)(Pdct)(consultar la tabla 1). In which EDCTi[l1] represents the highest magnitude DCT coefficient, it is possible to determine the percentage of the total signal energy represented by each group of coefficients (ordered from highest to lowest). Each percentage value for each group of coefficients (from the first to the ninth coefficient) can be obtained by dividing the norm of the vector formed by the first to the nth coefficient by the norm of the vector composed of all the coefficients. In this way, the following DCT-derived characteristics were used to characterize each 2 s signal portion: the number of coefficients needed to represent approximately 98% of the total energy of the original signal (Ndct), the first 20, 30 or 40 DCT coefficients extracted from the vector defined in (2), the surface under the curve (AUC) of the DCT spectrum for all frequencies (from 0 to 2.5 kHz) (AUCdct), the maximum amplitude of the DCT spectrum (Picodct) and the power spectrum of the signal obtained by DCT considering all values within the analyzed frequency range (from 0 to 2.5 kHz) (Pdct) (see Table 1).
Las 12 características restantes se extrajeron tras la descomposición en porciones de señal de 2 segundos utilizando ondículas 21 (consultar la tabla 1). Se seleccionaron dos ondículas madre(HaaryDaubechies(Db10)) para caracterizar cada porción de señal retrodispersada. Por lo tanto, se extrajeron seis características para cada tipo de ondícula madre basándose en la potencia relativa de la señal reconstruida que se había derivado del paquete de ondículas (uno a seis niveles) a partir de cada señal a corto plazo de 2 segundos. The remaining 12 features were extracted after decomposition into 2-second signal slices using 21 wavelets (see Table 1). Two parent wavelets (HaaryDaubechies(Db10)) were selected to characterize each backscattered signal slice. Therefore, six features were extracted for each parent wavelet type based on the relative power of the reconstructed signal derived from the wavelet bundle (levels one to six) from each 2-second short-term signal.
La divulgación es capaz de detectar e identificar diferentes tipos de vesícula extracelular debido a que extrae características derivadas de la frecuencia a partir de la señal retrodispersada que son sensibles a las dimensiones de las partículas, a la polarizabilidad óptica y al índice de refracción a escala microscópica. Disclosure is able to detect and identify different types of extracellular vesicles because it extracts frequency-derived features from the backscattered signal that are sensitive to particle dimensions, optical polarizability, and refractive index at the microscopic scale.
Tal como se indica en la ecuación 3, el movimiento de las nanopartículas es influido tanto por la difusividadDcomo por la respuesta de las partículas al potencial óptico ejercido sobre ellas por el campo electromagnético altamente enfocado. Por lo tanto, la variabilidad de las posiciones de las partículas durante el tiempo viene dada por la ecuación 3: As indicated in equation 3, the movement of the nanoparticles is influenced both by the diffusivity D and by the response of the particles to the optical potential exerted on them by the highly focused electromagnetic field. Therefore, the variability of the particle positions over time is given by equation 3:
En la quekpotenciaidetermina la respuesta de las partículas al potencial óptico y depende de la polarizabilidad de las partículas, a, que se presenta en la ecuación 4: In the quekpotenciai, the response of the particles to the optical potential is determined and depends on the polarizability of the particles, a, which is presented in equation 4:
En la que V/representa el gradiente del campo electromagnético en 1D y x es la coordenada de un punto dado en 1D sometido a las fuerzas ejercidas por el campo electromagnético aplicado. La polarizabilidad de las partículas, a, se define como: Where V/ represents the gradient of the electromagnetic field in 1D and x is the coordinate of a given point in 1D subjected to the forces exerted by the applied electromagnetic field. The polarizability of the particles, α, is defined as:
En la que np es el índice de refracción a escala microscópica de las partículas y nm es el índice de refracción del medio. Where np is the refractive index at the microscopic scale of the particles and nm is the refractive index of the medium.
Las ecuaciones 3 y 4 contrastan con la formulación “más simple” utilizada para describir el movimiento browniano de las nanopartículas en los métodos del estado de la técnica (por ejemplo, la dispersión dinámica de la luz), que dependen exclusivamente de la difusividad D de las partículas en la dispersión. Este movimiento browniano simple es proporcionado por la variabilidad de la posición de las partículas durante el tiempo (o(t)): Equations 3 and 4 contrast with the “simpler” formulation used to describe the Brownian motion of nanoparticles in prior art methods (e.g., dynamic light scattering), which depend exclusively on the diffusivity D of the particles in the scattering. This simple Brownian motion is provided by the variability of the particle position over time (o(t)):
o(t) = 2 Dt. (5) o(t) = 2 Dt. (5)
y D: and D:
En la quekBes la constante de Boltzmann,Tes la temperatura absoluta,nes la viscosidad del fluido yres el radio de partícula. De esta manera, dicha formulación matemática del movimiento browniano afirma que la posición de las partículas durante el tiempo (o(t)) únicamente depende del radio de las nanopartículas. In this equation, B is the Boltzmann constant, T is the absolute temperature, n is the viscosity of the fluid, and r is the particle radius. Thus, this mathematical formulation of Brownian motion states that the position of the particles during time (o(t)) depends only on the radius of the nanoparticles.
Se hace referencia a la figura 4 para ilustrar los resultados obtenidos para la intensidad de la luz dispersada por un conjunto de dos poblaciones de diferentes EV de aproximadamente el mismo tamaño (poblaciones a y b) utilizando simulaciones teóricas. Se utilizaron dos poblaciones EV a y b y se caracterizaban por: ra=100 nm, rb=120 nm, y una proporción entre kpotencial,a y kpotencial,b de 2. La figura 4 subraya el papel esencial de considerar la polarizabilidad óptica y el índice de refracción a escala microscópica junto con las dimensiones de las partículas para obtener una separación perfecta entre dos clases diferentes de EV (figura 4A), recapitulando los resultados experimentales obtenidos en el laboratorio (figura 4B). No se consiguió separar las clases al considerar únicamente el movimiento browniano simple (figura 4C). Figure 4 illustrates the results obtained for the intensity of light scattered by two populations of different refractive inflections (RIs) of approximately the same size (populations a and b) using theoretical simulations. The two RI populations, a and b, were characterized by: ra = 100 nm, rb = 120 nm, and a potential ratio of k<sub>potential,a</sub> to k<sub>potential,b</sub> of 2. Figure 4 highlights the essential role of considering optical polarizability and refractive index at the microscopic scale, along with particle dimensions, to achieve perfect separation between two different RI classes (Figure 4A), summarizing the experimental results obtained in the laboratory (Figure 4B). Separation of the classes was not achieved when considering only simple Brownian motion (Figure 4C).
Se utilizó un algoritmo de clasificación para detectar las EV en muestras líquidas, es decir, el clasificador de bosques aleatorios. A classification algorithm was used to detect EVs in liquid samples, i.e., the random forest classifier.
Se hace referencia a la figura 5 para explicar el procedimiento de exclusión uno a uno (“Leave-One-Out'9 (400), que se llevó a cabo para garantizar que los datos utilizados para evaluar el rendimiento de un clasificador pertenecían a un sujeto/entidad que no había participado en ningún momento en el entrenamiento. De esta manera, si un conjunto de datos está compuesto por datos densujetos/entidades, el conjunto de prueba se divide ennrondas de prueba, en donde, en cada ronda, los datos de un sujeto se utilizan para pruebas y los datos de los n-1 sujetos restantes se utilizan para el entrenamiento del clasificador. En la siguiente ronda, el subconjunto de datos de otro sujeto que se ha seleccionado para el entrenamiento en la ronda previa se utiliza por separado para someter a prueba al clasificador. A continuación, se determina el rendimiento del clasificador basándose en los valores medios obtenidos tras lasnrondas de prueba. Figure 5 is used to explain the one-by-one exclusion procedure (“Leave-One-Out’9 (400),” which was implemented to ensure that the data used to evaluate a classifier’s performance belonged to a subject/entity that had not participated in the training at any point. Thus, if a dataset consists of data from n subjects/entities, the test set is divided into n test rounds, where, in each round, the data from one subject are used for testing and the data from the remaining n-1 subjects are used for classifier training. In the next round, the data subset from another subject that was selected for training in the previous round is used separately to test the classifier. The classifier’s performance is then determined based on the mean values obtained after the n test rounds.
El método y el dispositivo anteriormente mencionados se utilizaron en varios experimentos para demostrar su viabilidad y potencial para el objetivo deseado. De esta manera, los experimentos II, IV, V, VI y VII se diseñaron para no individualizar una partícula específica e identificarla, sino, por el contrario, para detectar la presencia de un tipo dado de nanopartícula en solución; el método basado en la exclusión de uno se modificó ligeramente. El factor que diferenciaba las porciones de señal de 2 segundos adquiridas durante los experimentos que incluían nanopartículas y micropartículas era el lugar en donde se habían obtenido entre adquisiciones. De esta manera, las porciones de señal utilizadas para las pruebas se adquirieron en localizaciones diferentes de las consideradas para el entrenamiento durante los experimentos con nanopartículas, un modo de evitar efectos de sobreajuste. Se observó que, en estos casos, no era posible individualizar las partículas debido a sus dimensiones a nanoescala y a la incapacidad de nuestras herramientas de fibra de atraparlas. The aforementioned method and device were used in several experiments to demonstrate their feasibility and potential for the intended purpose. Experiments II, IV, V, VI, and VII were designed not to isolate and identify a specific particle, but rather to detect the presence of a given type of nanoparticle in solution; the exclusion-based method was slightly modified. The differentiating factor between the 2-second signal portions acquired during the experiments involving nanoparticles and microparticles was their location between acquisitions. Thus, the signal portions used for testing were acquired from different locations than those used for training during the nanoparticle experiments, a way to avoid overfitting effects. It was observed that, in these cases, it was not possible to isolate the particles due to their nanoscale dimensions and the inability of our fiber tools to capture them.
La tasa de clasificación más exacta para cada uno de los experimentos/problemas y la n-ésima tanda de evaluación se obtuvo mediante la determinación de la combinación más adecuada de valores entre los tres parámetros (figura 5; 405): el número de árboles, el número de predictores que se deben muestrear y el tamaño de hoja mínimo; consultar la tabla 1. Por lo tanto, esta combinación produce un clasificador entrenado mediante la consideración de esa combinación de valores (figura 5, 405). A continuación, se determinó la combinación más eficaz de dichos parámetros utilizando la validación cruzada cinco veces (figura 5, 405), para cada experimento y tanda de evaluación, durante la etapa de entrenamiento. Sin embargo, las muestras de entrenamiento se normalizaron. Se restó el valor medio de las muestras de entrenamiento para cada característica de cada muestra de datos de esa característica, y después se dividió por la desviación estándar correspondiente de la característica. Las muestras de entrada de prueba asimismo debían normalizarse de acuerdo con este procedimiento, utilizando la media de entrenamiento y desviación estándar obtenidas previamente para cada característica. Lo anterior permitió localizar los nuevos vectores de características a prueba en el espacio de características de entrenamiento. The most accurate classification rate for each experiment/problem and the nth evaluation run was obtained by determining the most suitable combination of values among the three parameters (Figure 5, 405): the number of trees, the number of predictors to be sampled, and the minimum leaf size (see Table 1). This combination resulted in a classifier trained using that combination of values (Figure 5, 405). The most effective combination of these parameters was then determined using cross-validation five times (Figure 5, 405) for each experiment and evaluation run during the training stage. However, the training samples were normalized. The mean of the training samples for each feature was subtracted from each data sample for that feature and then divided by the corresponding standard deviation of the feature. The test input samples were also normalized according to this procedure, using the previously obtained training mean and standard deviation for each feature. The above allowed the new vectors of features to be tested to be located in the training feature space.
Tabla 1: lista de parámetros ajustados durante el estadio de entrenamiento del clasificador para la optimización del modelo. N: número; Mín.: mínimo. Table 1: List of parameters adjusted during the classifier training stage for model optimization. N: number; Min: minimum.
Las dos estirpes celulares seleccionadas y sus EV utilizadas en los experimentos II, VI y VII derivaron de la estirpe celular de cáncer gástrico MKN45:HST6,modificada genéticamente para presentar O-glicanos más cortos/truncados en su superficie, debido a la sobreexpresión de la sialiltransferasa ST6GalNAc1, yMock,es decir, las células de control correspondientes transfectadas con el vector vacío, que no inducía ningún cambio en los O-glicanos. Las estirpes celularesMocky de cáncerHST6indicadas solo diferían en los O-glicanos (carbohidratos) unidos a su superficie. The two selected cell lines and their vectors used in experiments II, VI, and VII were derived from the gastric cancer cell line MKN45:HST6, genetically modified to have shorter/truncated O-glycans on its surface due to overexpression of the sialyltransferase ST6GalNAc1, and Mock, i.e., the corresponding control cells transfected with the empty vector, which did not induce any change in the O-glycans. The Mock and HST6 cancer cell lines mentioned differed only in the O-glycans (carbohydrates) attached to their surface.
Los O-glicanos más cortos o truncados se consideran marcadores predictivos de mal pronóstico en determinados cánceres. Estos fenómenos están frecuentemente asociados a una síntesis incompleta de los glicanos durante la glucosilación celular, en comparación con la ruta celular bajo condiciones de salud. Shorter or truncated O-glycans are considered predictive markers of poor prognosis in certain cancers. These phenomena are frequently associated with incomplete glycan synthesis during cellular glycosylation, compared to the cellular pathway under healthy conditions.
El experimento II sometió a ensayo la identificación y clasificación de células eucarióticas en solución tamponada con fosfato (PBS) en un problema de cuatro clases. Se prepararon tres tipos de solución para someter a ensayo el método propuesto de identificación de células individuales. Dos de ellos estaban compuestos por las células de cáncer glucosiladas de manera diferente indicadas posteriormente(MockyHST6),suspendidas en PBS (solución tamponada con fosfato, 1x). La tercera solución contenía microesferas sintéticas de poliestireno (PS) de 8 pm asimismo suspendidas en PBS (1x). Experiment II tested the identification and classification of eukaryotic cells in phosphate-buffered saline (PBS) in a four-class problem. Three types of solutions were prepared to test the proposed method for identifying individual cells. Two of these solutions consisted of differently glycosylated cancer cells, as described below (MockyHST6), suspended in PBS (phosphate-buffered saline, 1x). The third solution contained 8 µm synthetic polystyrene (PS) microspheres, also suspended in PBS (1x).
El experimento IV sometió a ensayo la identificación y clasificación de células bacterianas en PBS en un problema de tres clases: (1) “ninguna partícula atrapada”, (2) “bacterias del yogurLactobacillus acidophilusatrapadas” y (3) “bacterias del yogurStreptococcus thermophilusatrapadas” (dimensiones de las dianas: 1,5 a 0,6 pm). Experiment IV tested the identification and classification of bacterial cells in PBS in a problem of three classes: (1) “no particles trapped”, (2) “Lactobacillus acidophilus yogurt bacteria trapped” and (3) “Streptococcus thermophilus yogurt bacteria trapped” (target dimensions: 1.5 to 0.6 pm).
Los experimentos VI y VII sometieron a ensayo la identificación y clasificación de vesículas extracelulares producidas por célulasHST6yMock.Experiments VI and VII tested the identification and classification of extracellular vesicles produced by HST6 and Mock cells.
El experimento VI sometió a ensayo exosomas derivados deMockyHST6suspendidos en PBS mediante el método y dispositivo propuestos; clases consideradas: “clase 1: ausencia de exosomas (únicamente solución de blanco)”; “clase 2: presencia de exosomas derivados deMock,en suspensión” y “clase 3: presencia de exosomas derivados deHST6,en suspensión”. Experiment VI tested Mocky HST6-derived exosomes suspended in PBS using the proposed method and device; classes considered: “class 1: absence of exosomes (blank solution only)”; “class 2: presence of Mock-derived exosomes in suspension” and “class 3: presence of HST6-derived exosomes in suspension”.
El experimento VII se llevó a cabo bajo condiciones de reto utilizando PBS suplementado con suero de feto bovino (FBS) para resuspender las EV, un medio líquido complejo con elevadas concentraciones de proteínas, azúcares y lípidos. Se trató este FBS para eliminar las EV nativas. La figura 6 muestra las señales retrodispersadas que se obtuvieron con tres tipos diferentes de muestra: FBS sin EV con medio de cultivo celular (A); FBS sin EV suplementado con EV deMockcon medio de cultivo celular (B) y sin EV-FBS suplementado con EV deHST6con medio de cultivo celular (C). Experiment VII was conducted under challenge conditions using PBS supplemented with fetal bovine serum (FBS) to resuspend EVs, a complex liquid medium with high concentrations of proteins, sugars, and lipids. This FBS was treated to remove native EVs. Figure 6 shows the backscattered signals obtained with three different sample types: EV-free FBS with cell culture medium (A); EV-free FBS supplemented with Mock EVs with cell culture medium (B); and EV-free FBS supplemented with HST6 EVs with cell culture medium (C).
La tabla 2 resume los resultados experimentales obtenidos en la presente divulgación, en particular los resultados referidos al rendimiento de la diferenciación entre células o EV mediante el método y el dispositivo propuestos. Table 2 summarizes the experimental results obtained in this disclosure, in particular the results related to the performance of cell differentiation or EV using the proposed method and device.
La expresión “que comprende” cuando aparezca en la presente memoria pretende indicar la presencia de las características, números enteros, etapas y componentes indicados, aunque sin excluir la presencia o la adición de una o más otras características, números enteros, etapas, componentes o grupos de los mismos. La divulgación no debe considerarse en modo alguno limitada a las formas de realización descritas, y el experto ordinario en la materia podrá concebir muchas posibilidades de modificación de las mismas. Las formas de realización anteriormente descritas son combinables. Las reivindicaciones, a continuación, explican adicionalmente formas de realización particulares de la divulgación. The expression “comprising” when it appears herein is intended to indicate the presence of the features, whole numbers, steps, and components indicated, without excluding the presence or addition of one or more other features, whole numbers, steps, components, or groups thereof. The disclosure should in no way be considered limited to the embodiments described, and a person skilled in the art may conceive of many possible modifications thereof. The embodiments described above are combinable. The claims that follow further explain particular embodiments of the disclosure.
Tabla 3. Diferencias de rendimiento de identificación de EV considerando una fibra óptica perpendicularmente cortada y expuesta y una fibra óptica con el fotoconcentrador en la punta. Table 3. Differences in EV identification performance considering a perpendicularly cut and exposed optical fiber and an optical fiber with the photoconcentrator at the tip.
Claims (15)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PT2018115123 | 2018-10-31 | ||
| EP19174940.7A EP3647765A1 (en) | 2018-10-31 | 2019-05-16 | Device and method for detecting and identifying extracellular vesicles in a liquid dispersion sample |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES3040458T3 true ES3040458T3 (en) | 2025-10-31 |
Family
ID=90825731
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES19806055T Active ES2967248T3 (en) | 2018-10-31 | 2019-10-31 | Device and method for detecting and identifying extracellular vesicles in a liquid dispersion sample |
| ES23207812T Active ES3040458T3 (en) | 2018-10-31 | 2019-10-31 | Device and method for detecting and identifying extracellular vesicles in a liquid dispersion sample |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES19806055T Active ES2967248T3 (en) | 2018-10-31 | 2019-10-31 | Device and method for detecting and identifying extracellular vesicles in a liquid dispersion sample |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (2) | ES2967248T3 (en) |
-
2019
- 2019-10-31 ES ES19806055T patent/ES2967248T3/en active Active
- 2019-10-31 ES ES23207812T patent/ES3040458T3/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2967248T3 (en) | 2024-04-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20240369463A1 (en) | Device and method for detecting and identifying extracellular vesicles in a liquid dispersion sample | |
| US9013692B2 (en) | Flow cytometer apparatus for three dimensional difraction imaging and related methods | |
| Martin et al. | In-line holographic microscopy with model-based analysis | |
| Lin et al. | Light-sheet-based 2D light scattering cytometry for label-free characterization of senescent cells | |
| Sawetzki et al. | Viscoelasticity as a biomarker for high-throughput flow cytometry | |
| Lee et al. | Fast dynamics and relaxation of colloidal drops during the drying process using multispeckle diffusing wave spectroscopy | |
| Kinnunen et al. | Overview of single-cell elastic light scattering techniques | |
| de Oliveira et al. | Damage induced in red blood cells by infrared optical trapping: an evaluation based on elasticity measurements | |
| ES3040458T3 (en) | Device and method for detecting and identifying extracellular vesicles in a liquid dispersion sample | |
| Yoon et al. | Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning. | |
| Konokhova et al. | Light-scattering gating and characterization of plasma microparticles | |
| CN120014636A (en) | Cell classification model training method and device, cell classification method and device | |
| US20240230508A1 (en) | Device and method for detecting and identifying molecularly imprinted polymers in a liquid dispersion sample | |
| Barros et al. | Single-cell and extracellular nano-vesicles biosensing through phase spectral analysis of optical fiber tweezers back-scattering signals | |
| Yoon et al. | Label-free identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning | |
| Yang et al. | Study of constrained Brownian motion of nanoparticles near an interface using optical tweezers | |
| Paiva et al. | Optical fiber-based sensing method for nanoparticles detection through back-scattering signal analysis | |
| Fontes et al. | Determination of femto Newton forces and fluid viscosity using optical tweezers: application to Leishmania amazonensis | |
| Fedosov et al. | Measurements of the diffusion coefficient of nanoparticles by selective plane illumination microscopy | |
| Dannhauser et al. | Peripheral blood mononuclear cells analysis in microfluidic flow by coherent imaging tools | |
| Ropert | Cell surface fluctuations studied with defocusing microscopy | |
| Wan | Non-invasive Label-free Cytometry Based on Laser Light Scattering Technique | |
| Shalaev et al. | Development of the experimental setup for multispectral nanoparticle tracking analysis | |
| Su et al. | A fiber-coupled microfluidic cytometer for the obtaining of nanostructural mitochondria information in single cells | |
| Chen | Label-free high-throughput cell screening in flow |