ES3040675T3 - Methods and compositions for matrix preparation - Google Patents

Methods and compositions for matrix preparation

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ES3040675T3 ES18747153T ES18747153T ES3040675T3 ES 3040675 T3 ES3040675 T3 ES 3040675T3 ES 18747153 T ES18747153 T ES 18747153T ES 18747153 T ES18747153 T ES 18747153T ES 3040675 T3 ES3040675 T3 ES 3040675T3
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Abstract

La invención se refiere a métodos de preparación de matrices y composiciones para las mismas. En particular, la invención se refiere a métodos de preparación de matrices de colágeno y composiciones para las mismas, incluyendo kits y composiciones para injertos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos y composiciones para la preparación de matrices
Campo de la divulgación
Esta invención se refiere a métodos de preparación de matrices y composiciones para las mismas. En particular, la invención se refiere a métodos de preparación de matrices de colágeno y composiciones para las mismas, incluyendo kits y composiciones de injerto.
Antecedentes y sumario
La matriz extracelular juega un papel crucial en la función de los tejidos y órganos, tales como la comunicación entre células, la diferenciación durante la embriogénesis, la cicatrización de heridas, la adhesión y la migración y proliferación celulares. Las construcciones de injerto de matriz extracelular obtenidas a partir de fuentes naturales o fabricadas sintéticamente pueden usarse como composiciones de injerto de tejido, tanto en formas sólidas como inyectables, para remodelar tejidosin vivoo para aplicacionesin vitro,tal como para fines de investigación. El componente principal de la matriz extracelular es el colágeno. Algunas composiciones de colágeno solubilizado, incluyendo composiciones de colágeno purificado, tienen capacidad de formación de matrices y también pueden usarse como composiciones de injerto de tejido, tanto en formas sólidas como inyectables, para remodelar tejidosin vivoo para usosin vitro.De hecho, tales matrices basadas en colágeno tienen amplias aplicaciones médicas y de investigación, incluyendo apósitos para heridas y hemostáticos, uso como implantes quirúrgicos, sustratos para productos médicos de ingeniería tisular, vehículos de suministro de células o moléculas terapéuticas y como tridimensionales sistemas de tejidosin vitropara investigación básica, incluyendo el desarrollo de fármacos y pruebas de toxicidad.
El documento US 2015/367030 A1 divulga la preparación de una suspensión de colágeno neutralizado que más tarde se somete a temperatura elevada formando de este modo un armazón de colágeno que comprende fibras de colágeno autoensambladas. En particular, el documento US 2015/367030 A1 describe un protocolo multietapa para la preparación de colágeno, en donde se añade un ácido o una base a una suspensión de colágeno donde el colágeno se ha tratado con una enzima, tal como pepsina, y se añade el ácido o la base para inactivar la enzima y a continuación se añade ácido o base adicional o un tampón para llevar el pH al intervalo deseado para la polimerización e implantación de la composición de colágeno.
El documento US 2012/297559 A1 divulga la mezcla de colágeno con una solución tampón antes de la incubación (calentamiento a aproximadamente 37 grados Celsius) para formar fibrillas. En particular, el documento US 2012/297559 A1 describe un protocolo de mezcla multietapa, en donde el colágeno para la porción "central" del implante corneal se trata con un agente acilante o un agente esterificante, y el colágeno para la periferia del implante se neutraliza y a continuación se trata con un agente aglutinante. A continuación las composiciones de colágeno del núcleo y la periferia se mezclan y pueden polimerizarse como una unidad o la composición de colágeno de la periferia puede prepolimerizarse después de la neutralización y a continuación tratarse con un agente aglutinante.
El documento US 2009/280180 A1 describe una etapa de homogeneización después de dos etapas separadas, una añadiendo heparina y otra VEGF 189.
El documento EP 0443 094 divulga un implante corneal que comprende un núcleo de colágeno polimerizado, que tiene grupos amina acilados o carboloxilo esterificados y una periferia polimerizada que rodea el núcleo, comprendiendo dicha periferia colágeno fibroso en forma de fibrillas.
Rucha, "Designer collagen-fibril biograft materials for tunable molecular delivery", 1 de enero de 2016, divulga materiales de bioinjerto de fibrillas de colágeno, preparados en un proceso multietapa.
Para garantizar un alto nivel de consistencia en la fabricación de matrices basadas en colágeno y una baja variabilidad de lote a lote en las propiedades funcionales del colágeno para su uso en la fabricación de matrices basadas en colágeno para aplicaciones médicas y de investigación, se necesitan procedimientos y reactivos estandarizados para la inducción del autoensamblaje de colágeno y para la personalización de matrices basadas en colágeno.
Por consiguiente, los inventores han desarrollado un método robusto con una sola etapa de mezcla para la polimerización del colágeno, con reactivos que imitan las condiciones fisiológicas para apoyar el autoensamblaje supramolecular del colágeno como se observa en el cuerpo. Además, el método y los reactivos usados en el método descrito en el presente documento se basan en respuestas fisiológicas tales como las propiedades viscoelásticas de matrices autoensambladas (por ejemplo, el módulo de almacenamiento de cizalla medido en cizallamiento oscilatorio y la rigidez de la matriz) en función de la concentración de colágeno en la reacción de polimerización. Los métodos y las composiciones descritos en el presente documento producen matrices basadas en colágeno que tienen propiedades similares a los métodos de polimerización multietapa convencionales que implican múltiples etapas de mezcla para la polimerización de colágeno, incluyendo mezclar una composición de colágeno con una solución tampón y a continuación mezclar con, por ejemplo, con una base tal como NaOH para inducir la polimerización y a continuación mezclar opcionalmente con otros reactivos. Los métodos y composiciones desarrollados por los inventores han dado como resultado respuestasin vitroein vivodel hospedador altamente predecibles y reproducibles a matrices de colágeno autoensambladas. En otro aspecto, los inventores han desarrollado métodos para esterilizar el colágeno, las composiciones de colágeno, las matrices de colágeno, las soluciones de colágeno y el colágeno liofilizado descritos en el presente documento usando radiación ultravioleta, manteniendo las capacidades de polimerización (por ejemplo, módulo de almacenamiento por cizalla). El mantenimiento de las capacidades de polimerización es contrario a estudios previos que informan que la radiación ultravioleta afecta negativamente a la formación de fibrillas de colágeno (Mentoret al.,Photodermatology, Photoimmunology & Photomedicine, 2001; Miyataet al.,Biochem. Biophys. Acta, 1971; Sudoh y Noda, Connect. Tissue Res., 1972).
La presente invención se define por las reivindicaciones adjuntas. Se proporcionan:
[1] Un kit que comprende una composición de colágeno y una solución tampón en donde la solución tampón comprende una base y es capaz de polimerizar el colágeno usando una sola etapa de mezcla que comprende mezclar la composición de colágeno con la solución tampón.
[2] Un método que usa una sola etapa de mezcla que comprende mezclar una composición de colágeno con una solución tampón para formar una solución de colágeno en donde la solución tampón comprende una base, y polimerizar el colágeno en la solución de colágeno para formar la matriz.
[3] Un método para preparar una matriz, comprendiendo dicho método polimerizar colágeno mezclando una composición de colágeno con una solución tampón para formar una solución de colágeno en donde la solución tampón comprende una base, y polimerizar el colágeno en la solución de colágeno para formar la matriz en donde la solución tampón no contiene iones de magnesio o iones de manganeso.
[4] El método de [2] o [3] en donde la composición de colágeno, la solución de colágeno o la matriz de colágeno se esteriliza mediante un método seleccionado del grupo que consiste en
a) exposición a cloroformo,
b) filtración vírica,
c) filtración estéril,
d) radiación ultravioleta,
e) irradiación gamma,
f) haz de electrones, y
g) combinaciones de los mismos.
[5] El kit de [1] o el método de [2] o [3] en donde la solución tampón
a) comprende MgCh menos de aproximadamente 0,02 mM, o
b) no comprende MgCh.
[6] El kit de [1] o el método de [2] o [3] en donde la composición de colágeno, la solución de colágeno y/o la matriz de colágeno se esteriliza usando radiación ultravioleta.
[7] El método de [6] en donde la matriz de colágeno que resulta de la polimerización del colágeno mantiene una propiedad de polimerización con respecto a
a) una composición de colágeno que no esté irradiada,
b) una solución de colágeno que no esté irradiada,
c) o una matriz de colágeno que no esté irradiada, respectivamente, en donde la propiedad de polimerización se selecciona del módulo de almacenamiento de cizalla y una respuesta del tejidoin vivo.
[8] El kit de [6] o el método de [7] en donde la propiedad de polimerización es el módulo de almacenamiento de cizalla.
[9] El kit de [6] o el método de [6] en donde la dosis de radiación varía de aproximadamente 30 mJ/cm2 a aproximadamente 300 mJ/cm2.
[10] El kit de [6] o el método de [6] en donde la esterilización inactiva los virus.
[11] El método de [6] en donde la composición de colágeno, la solución de colágeno y/o la matriz de colágeno se esteriliza usando irradiación UVC.
[12] El método de [6] en donde la composición de colágeno, la solución de colágeno y/o la matriz de colágeno se esteriliza usando irradiación UVC y filtración estéril.
[13] El kit de [6] en donde la matriz de colágeno que resulta de la polimerización de colágeno produjo una propiedad de polimerización igual a una composición de colágeno que no está irradiada o a un colágeno liofilizado que no está irradiado, respectivamente, en donde la propiedad de polimerización se selecciona del módulo de almacenamiento de cizalla y una respuesta del tejidoin vivo.
[14] El kit de [13] en donde la propiedad de polimerización es el módulo de almacenamiento de cizalla.
[15] El método de uno cualquiera de [1] a [14] en donde el colágeno polimerizado usando un procedimiento de una sola etapa produjo la misma capacidad de polimerización que el colágeno polimerizado usando un procedimiento multietapa.
En una realización, se proporciona un método para preparar una matriz. El método comprende polimerizar colágeno usando una sola etapa de mezcla que comprende mezclar una composición de colágeno con una solución tampón para formar una solución de colágeno y polimerizar el colágeno en la solución de colágeno para formar la matriz. En otra realización, se proporciona un método para preparar una matriz. El método comprende polimerizar colágeno mezclando una composición de colágeno con una solución tampón para formar una solución de colágeno, y polimerizar el colágeno en la solución de colágeno para formar la matriz en donde la solución tampón no contiene iones de magnesio o iones de manganeso.
En otra realización más, se proporciona un método para preparar una matriz. El método comprende polimerizar colágeno usando una sola etapa de mezcla que comprende mezclar una composición de colágeno con una solución tampón para formar una solución de colágeno, en donde el colágeno en la solución de colágeno se polimeriza para formar la matriz.
En otras realizaciones más, se proporciona una matriz de colágeno preparada de acuerdo con cualquiera de los métodos anteriores. En otra realización más, se proporciona un kit que comprende una composición de colágeno y una solución tampón. En otra realización, se proporciona un kit que comprende colágeno liofilizado, una solución de ácido clorhídrico y una solución tampón.
Varias realizaciones adicionales se describen en las cláusulas enumeradas a continuación. También se contempla cualquier combinación aplicable de estas realizaciones.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 muestra el módulo de almacenamiento de cizalla para matrices basadas en colágeno polimerizadas a diferentes concentraciones de oligómeros. La capacidad de polimerización de un ensamblaje de una sola etapa es similar a la que se obtiene con un procedimiento convencional multietapa.
La Fig. 2 muestra que las matrices autoensambladas preparadas con procedimientos multietapa y de una sola etapa muestran una biocompatibilidad y una respuesta celular similares. Se usaron células madre derivadas de tejido adiposo humano para crear construcciones de tejido de fibrillas de colágeno tridimensionales mediante procedimientos multietapa (fig. 2a) o de una sola etapa (fig. 2b). Después de 4 días, las construcciones se fijaron, se tiñeron con faloidina y se visualizaron usando microscopía confocal.
La Fig. 3 muestra un procedimiento multietapa.
La Fig. 4 muestra un procedimiento de una sola etapa.
La Fig. 5 muestra el formulario que permite al usuario personalizar matrices de colágeno autoensambladas usando un procedimiento de una sola etapa basado en la concentración inicial de oligómeros de colágeno.
La Fig. 6 muestra que las formulaciones de oligómero de calidad de investigación y de calidad médica muestran respuestas de regeneración tisular no inflamatoria similares después de la inyección subcutánea en ratones. El oligómero de calidad de investigación, el oligómero de calidad médica e Integra Flowable se inyectaron por vía subcutánea (200 ul) en ratones. Después de 4 semanas, los sitios de los implantes se recogieron, se fijaron y se prepararon para el análisis histopatológico. Las imágenes muestran secciones transversales de piel sin tratar (control; A), Integra Flowable (B), oligómero de calidad de investigación (C) y oligómero de calidad médica (D).
La Fig. 7 muestra el módulo de almacenamiento de cizalla de matrices de colágeno polimerizadas a partir de colágeno tratado con irradiación UVC a dosis de 0 (control sin tratar), 30 mJ/cm2 (1 minuto de irradiación) y 300 mJ/cm2 (10 minutos de irradiación).
Descripción detallada de las realizaciones ilustrativas
Como se usa en el presente documento, "esterilizado" significa eliminar contaminantes incluyendo, pero no limitado a, agentes infecciosos. Por ejemplo, los contaminantes (por ejemplo, los virus) pueden eliminarse mediante inactivación, reducción en número o cantidad o por inhibición de la actividad de los agentes contaminantes, ya sean infecciosos o no.
Como se usa en el presente documento, "purificado" significa eliminar contaminantes incluyendo, pero no limitado a, contaminantes celulares, contaminantes de nucleótidos y endotoxinas, significa inactivar todos los virus, ya sean infecciosos o no, reducir el número de virus infecciosos o inhibir la actividad de los virus, ya sean infecciosos o no.
Como se usa en el presente documento "oligómero" u "oligómeros" con respecto al colágeno significa monómeros de colágeno (también conocidos como telocolágeno) unidos covalentemente entre sí (por ejemplo, monómeros de colágeno unidos entre sí para formar dímeros, trímeros, etc.).
En una realización, se proporciona un método para preparar una matriz. El método comprende polimerizar colágeno usando una sola etapa de mezcla que comprende mezclar una composición de colágeno con una solución tampón para formar una solución de colágeno y polimerizar el colágeno en la solución de colágeno para formar la matriz.
En otra realización, se proporciona un método para preparar una matriz. El método comprende polimerizar colágeno mezclando una composición de colágeno con una solución tampón para formar una solución de colágeno, y polimerizar el colágeno en la solución de colágeno para formar la matriz en donde la solución tampón no contiene iones de magnesio o iones de manganeso.
En otra realización más, se proporciona un método para preparar una matriz. El método comprende polimerizar colágeno usando una sola etapa de mezcla que comprende mezclar una composición de colágeno con una solución tampón para formar una solución de colágeno, en donde el colágeno en la solución de colágeno se polimeriza para formar la matriz.
En otras realizaciones más, se proporciona una matriz de colágeno preparada de acuerdo con cualquiera de los métodos anteriores. En otra realización más, se proporciona un kit que comprende una composición de colágeno y una solución tampón. En otra realización, se proporciona un kit que comprende colágeno liofilizado, una solución de ácido clorhídrico y una solución tampón.
Como entendería un experto en la materia, la polimerización, el autoensamblaje, el autoensamblado, la formación de fibrillas y la capacidad de formar matrices tienen el mismo significado y, como lo entendería un experto, la matriz puede estar en forma fibrilar. Para la preparación del colágeno para su uso en los métodos y composiciones descritos en el presente documento, puede usarse cualquier método conocido en la técnica para preparar colágeno. En realizaciones ilustrativas, el colágeno puede prepararse mediante los métodos descritos en Bailey JL, Critser PJ, Whittington C, Kuske JL, Yoder MC, Voytik-Harbin SL; Collagen oligomers modulate physical and biological properties of threedimensional self-assembled matrices, Biopolymers (2011) 95(2):77-93, Kreger ST, Bell BJ, Bailey J, Stites E, Kuske J, Waisner B, Voytik-Harbin SL; Polymerization and matrix physical properties as important design considerations for soluble collagen formulations, Biopolymers (2010) 93(8):690-707, Solicitud de Patente de EE. UU. Número de Publicación 20080268052 o Solicitud de Patente de EE. UU. Número de Publicación 20120027732.
En diversas realizaciones ilustrativas, el colágeno para su uso en los métodos y composiciones descritos en el presente documento puede obtenerse de cualquier fuente adecuada de colágeno conocida en la técnica. Las fuentes de colágeno ilustrativas incluyen tejidos submucosos (Patentes de EE. UU. N.° 4.902.508, 5.281.422 y 5.275.826), tejido pericárdico, tejido submucoso de la vejiga urinaria, tejido submucoso del estómago, tejido de la membrana basal del hígado, tejido placentario, tejido ovárico, tejido de la cola del animal, tejido de la piel (por ejemplo, Gallop,et al.,Preparation and Properties of Soluble Collagens, Meth. Enzymol. 6: 635-641 (1963) y tejidos de la matriz extracelular generalmente. En diversas realizaciones, el tipo de colágeno para su uso en los métodos y composiciones descritos en el presente documento puede ser cualquier tipo de colágeno adecuado, incluyendo, pero no limitado a, Colágeno tipo I, Colágeno tipo II, Colágeno tipo III o Colágeno tipo IV, o combinaciones de los mismos.
En una realización, también puede usarse un tejido enriquecido en oligómeros de colágeno (por ejemplo, tejido de piel de cerdo) para obtener el colágeno para su uso en los métodos y composiciones descritos en el presente documento, o el colágeno puede obtenerse a partir de células que producen oligómeros de colágeno (por ejemplo, células alteradas mediante técnicas recombinantes para expresar oligómeros de colágeno), o mediante reticulación química del colágeno para obtener oligómeros de colágeno (por ejemplo, usando un agente de reticulación conocido en la técnica). En diversas realizaciones, el colágeno para su uso en los métodos y composiciones descritos en el presente documento puede comprender oligómeros o puede consistir en oligómeros. En otra realización el colágeno puede comprender oligómeros y otras formas de colágeno tales como monómeros, telocolágeno y/o atelocolágeno.
En otra realización, el colágeno puede ser colágeno soluble o colágeno solubilizado. En las realizaciones donde el colágeno es colágeno soluble o colágeno solubilizado, el colágeno está sustancialmente libre de colágeno insoluble, pero puede contener algo de colágeno insoluble. En otra realización, el colágeno consiste en colágeno soluble o colágeno solubilizado.
En diversas realizaciones ilustrativas, el colágeno, la composición de colágeno, la matriz de colágeno, la solución de colágeno, el colágeno liofilizado y/o la solución tampón pueden esterilizarse usando técnicas de esterilización conocidas en la técnica, incluyendo pero no limitado a, tratamiento con óxido de propileno u óxido de etileno, esterilización por plasma de gas, radiación gamma (por ejemplo, 1-4mrad), radiación ultravioleta (por ejemplo, irradiación UVC), haz de electrones, filtración vírica, filtración estéril (por ejemplo, con un filtro de 0,22 pm), exposición a cloroformo y/o esterilización con ácido peracético y combinaciones de las mismas. En esta realización, el procedimiento de esterilización no debe afectar negativamente a la estructura del colágeno, las propiedades de polimerización del colágeno o las propiedades biológicas del colágeno que se esteriliza. En diversas realizaciones, el colágeno puede esterilizarse antes o después de la liofilización (los procedimientos de liofilización se describen a continuación).
En la realización de radiación ultravioleta (por ejemplo, irradiación UVC), la matriz de colágeno que resulta de la polimerización del colágeno puede mantener una propiedad de polimerización con respecto al colágeno que no está irradiado, una composición de colágeno que no está irradiada, una matriz de colágeno que no está irradiada, una solución de colágeno que no está irradiada o colágeno liofilizado que no está irradiado, respectivamente. En esta realización, la propiedad de polimerización puede seleccionarse de módulo de almacenamiento de cizalla, módulo de elasticidad (módulo de Young), módulo de tracción, módulo de compresión, arquitectura de fibrillas, degradación proteolítica, señalización celular y combinaciones de los mismos. En diversas realizaciones, la dosis de radiación ultravioleta (por ejemplo, irradiación UVC) puede variar de aproximadamente 5 mJ/cm2 a aproximadamente 800 mJ/cm2, de aproximadamente 5 mJ/cm2 a aproximadamente 700 mJ/cm2, de aproximadamente 5 mJ/cm2 a aproximadamente 600 mJ/cm2, de aproximadamente 5 mJ/cm2 a aproximadamente 500 mJ/cm2, de aproximadamente 5 mJ/cm2 a aproximadamente 400 mJ/cm2, de aproximadamente 5 mJ/cm2 a aproximadamente 300 mJ/cm2, de 5 mJ/cm2 a aproximadamente 200 mJ/cm2, de 5 mJ/cm2 a aproximadamente 100 mJ/cm2, de 5 mJ/cm2 a aproximadamente 50 mJ/cm2, de aproximadamente 30 mJ/cm2 a aproximadamente 800 mJ/cm2, de aproximadamente 30 mJ/cm2 a aproximadamente 700 mJ/cm2, de aproximadamente 30 mJ/cm2 a aproximadamente 600 mJ/cm2, de aproximadamente 30 mJ/cm2 a aproximadamente 500 mJ/cm2, de aproximadamente 30 mJ/cm2 a aproximadamente 400 mJ/cm2, de aproximadamente 30 mJ/cm2 a aproximadamente 300 mJ/cm2, de aproximadamente 30 mJ/cm2 a aproximadamente 200 mJ/cm2, de aproximadamente 30 mJ/cm2 a aproximadamente 100 mJ/cm2, de aproximadamente 30 mJ/cm2 a aproximadamente 50 mJ/cm2, de aproximadamente 200 mJ/cm2 a aproximadamente 800 mJ/cm2, de aproximadamente 300 mJ/cm2 a aproximadamente 800 mJ/cm2, de aproximadamente 400 mJ/cm2 a aproximadamente 800 mJ/cm2, de aproximadamente 500 mJ/cm2 a aproximadamente 800 mJ/cm2, de aproximadamente 600 mJ/cm2 a aproximadamente 800 mJ/cm2, de aproximadamente 50 mJ/cm2 a aproximadamente 300 mJ/cm2, de aproximadamente 100 mJ/cm2 a aproximadamente 300 mJ/cm2 o de aproximadamente 200 mJ/cm2 a aproximadamente 300 mJ/cm2. En todas las realizaciones de radiación ultravioleta (por ejemplo, irradiación UVC) descritas en el presente documento, la esterilización inactiva los virus. En esta realización, "inactiva los virus" significa inactivar todos los virus, ya sean infecciosos o no, reducir el número de virus infecciosos o inhibir la actividad de los virus, ya sean infecciosos o no.
En un aspecto, el colágeno para su uso en los métodos y composiciones descritos en el presente documento puede purificarse mediante métodos conocidos en la técnica para purificar colágeno. Como se usa en el presente documento, "purificado" significa eliminar contaminantes incluyendo, pero no limitado a, contaminantes celulares, contaminantes de nucleótidos y endotoxinas. En diversas realizaciones, el colágeno puede purificarse eliminando contaminantes de tal manera que sea al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 91 %, al menos aproximadamente el 92 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos aproximadamente el 94 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 99,5 %. En otra realización el colágeno puede aislarse. Como se usa en el presente documento "aislado" significa sustancialmente libre de contaminantes incluyendo, pero no limitado a, contaminantes celulares, contaminantes de nucleótidos y endotoxinas.
En una realización ilustrativa, el colágeno para su uso en los métodos y composiciones descritos en el presente documento puede liofilizarse y a continuación reconstituirse para formar la composición de colágeno para mezclar con la solución tampón como se describe en el presente documento. En esta realización, la reconstitución del colágeno liofilizado no es una etapa de mezcla para la polimerización del colágeno. Como se usa en el presente documento, el término "liofilizado" significa que se elimina el agua de la proteína, el compuesto o la composición, mediante, por ejemplo, liofilización al vacío. Puede usarse cualquier método de liofilización conocido por el experto en la materia. En un aspecto, el colágeno puede liofilizarse en un ácido, por ejemplo, ácido acético, ácido clorhídrico, ácido fórmico, ácido láctico, ácido cítrico, ácido sulfúrico o ácido fosfórico. En otra realización, el colágeno puede liofilizarse en agua. En otras realizaciones ilustrativas, pueden usarse crioprotectores o lioprotectores o combinaciones de los mismos durante la liofilización.
En un aspecto ilustrativo, el colágeno liofilizado puede reconstituirse para formar la composición de colágeno descrita en el presente documento para mezclar con la solución tampón para polimerizar el colágeno. En diversas realizaciones ilustrativas, el colágeno puede reconstituirse en una solución ácida o en agua. En diversas realizaciones, la solución ácida puede comprender ácido acético, ácido clorhídrico, ácido fórmico, ácido láctico, ácido cítrico, ácido sulfúrico o ácido fosfórico. En realizaciones ilustrativas, la solución ácida para reconstitución puede tener una concentración de ácido de aproximadamente 0,005 N a aproximadamente 0,1 N, de aproximadamente 0,005 N a aproximadamente 0,08 N, de aproximadamente 0,005 N a aproximadamente 0,06 N, de aproximadamente 0,005 N a aproximadamente 0,04 N, de aproximadamente 0,005 N a aproximadamente 0,02 N, de aproximadamente 0,005 N a aproximadamente 0,01 N o aproximadamente 0,01 N. En una realización, el ácido puede ser ácido clorhídrico y el ácido clorhídrico puede ser de aproximadamente 0,005 N a aproximadamente 0,1 N de ácido clorhídrico. En otra realización, el ácido puede ser ácido clorhídrico y el ácido clorhídrico puede ser ácido clorhídrico aproximadamente 0,01 N.
En un aspecto ilustrativo, la concentración de colágeno en la composición de colágeno o en la solución de colágeno puede ser de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 40 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml o de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 4 mg/ml. En otras realizaciones, la concentración de colágeno en la composición de colágeno o en la solución de colágeno puede ser de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 5,0 mg/ml, de aproximadamente 1,0 mg/ml a aproximadamente 3,0 mg/ml, de aproximadamente 0,05 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 20 mg/ml, de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 30 mg/ml, de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 40 mg/ml, de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 50 mg/ml, de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 60 mg/ml, de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 80 mg/ml, de aproximadamente 5 mg/ml a 10 mg/ml, de aproximadamente 5 mg/ml a 20 mg/ml, de aproximadamente 5 mg/ml a aproximadamente 40 mg/ml, de aproximadamente 5 mg/ml a 60 mg/ml, de aproximadamente 5 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml, de aproximadamente 20 mg/ml a aproximadamente 40 mg/ml, de aproximadamente 20 mg/ml a 60 mg/ml o de aproximadamente 20 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml.
En una realización ilustrativa, la composición de colágeno se mezcla en una sola etapa con la solución tampón para polimerizar el colágeno. En otra realización, la composición de colágeno se mezcla con la solución tampón en ausencia de iones de magnesio o de manganeso para polimerizar el colágeno. En una realización, la composición de colágeno se mezcla con la solución tampón para formar la solución de colágeno y la solución de colágeno se incuba a una temperatura mayo de aproximadamente 25 °C para promover la polimerización del colágeno en la solución de colágeno. En otra realización, la solución de colágeno puede incubarse a aproximadamente 37 °C para promover la polimerización del colágeno en la solución de colágeno. En diversas realizaciones distintas, la solución de colágeno puede incubarse a aproximadamente 25 °C, 26 °C, 27 °C, 28 °C, 29 °C, 30 °C, 31 °C, 32 °C, 33 °C, 34 °C, 35 °C, 36 °C, 38 °C, 39 °C o 40 °C, para promover la polimerización del colágeno en la solución de colágeno. En otra realización, la solución de colágeno puede incubarse a de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 40 °C para promover la polimerización del colágeno en la solución de colágeno. En otras realizaciones, la polimerización puede llevarse a cabo a temperaturas por encima de 20 °C o a una temperatura seleccionada del intervalo de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 40 °C. En estas realizaciones, el colágeno puede polimerizarse para formar fibrillas similares a las que se encuentran en el cuerpo.
En una realización, la solución tampón que se mezclará con la composición de colágeno para formar la solución de colágeno puede comprender MgCh. de aproximadamente 0,03 mM a aproximadamente 0,2 mM, MgCh de aproximadamente 0,002 mM a aproximadamente 0,02 mM, MgCh menos de aproximadamente 0,02 mM o nada de MgCl2. En otras realizaciones, la solución tampón que se mezclará con la composición de colágeno para formar la solución de colágeno puede comprender KH2PO4 de aproximadamente 0,3 mM a aproximadamente 3 mM, Na2HPO4 de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 10 M, KCl de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 4 mM, NaCl de aproximadamente 0,02 M a aproximadamente 0,3 M y NaOH de aproximadamente 0,002 N a aproximadamente 0,02 N. En otra realización, la solución tampón que va a mezclarse con la composición de colágeno para formar la solución de colágeno puede comprender de aproximadamente el 0,5 por ciento en peso a aproximadamente el 5 por ciento en peso de glucosa, aproximadamente el 0,5 por ciento en peso de glucosa o menos o nada de glucosa.
En un aspecto, la solución tampón puede diluirse desde 10X, 5X, 2X o cualquier concentración inicial adecuada, para preparar una solución tampón 1X que tenga cualquiera de las concentraciones de componentes del párrafo anterior. En un aspecto, el kit descrito en el presente documento puede contener una solución tampón con una concentración de 10X, 5X o 2X o cualquier concentración inicial adecuada, para dilución para preparar una solución tampón 1X. De acuerdo con una realización, la solución tampón 10X puede contener los siguientes ingredientes en las siguientes concentraciones:
NaCl 1,37 M
KCl 0,027 M
Na2HPO40,081 M
KH2PO40,015 M
NaOH 0,1 N
y, opcionalmente, glucosa 55,5 mM
En otra realización, una solución tampón 1X puede contener los siguientes ingredientes en las siguientes concentraciones:
NaCl 0,137 M
KCl 0,0027 M
Na2HPO40,0081 M
KH2PO40,0015 M
NaOH 0,01 N
y, opcionalmente, glucosa 5,55 mM
En estas realizaciones, NaOH está presente en la solución tampón. En los métodos convencionales anteriormente conocidos para polimerizar colágeno, el NaOH se añadió por separado como una etapa de mezcla adicional en los métodos de polimerización de colágeno. En otra realización ilustrativa, el cloruro cálcico puede estar presente en la solución tampón en una concentración de aproximadamente 0,4 mM a aproximadamente 2,0 mM.
En diversas realizaciones, el tampón en la solución tampón puede seleccionarse del grupo que consiste en solución salina tamponada con fosfato (PBS), Clorhidrato de tris (hidroximetil) aminometano (Tris-HCl), Ácido 3-(N-morfolino) propanosulfónico (MOPS), piperazin-n,n'-bis(ácido 2-etanosulfónico) (PIPES), Ácido [n-(2-acetamido)]-2-aminoetanosulfónico (ACES), Ácido N-[2-hidroxietil] piperazin-N'-[2-etanosulfónico] (HEPES) y 1,3-bis[tris(hidroximetil)metilamino]propano (Bis Tris Propano). En una realización el tampón es PBS.
En diversas realizaciones ilustrativas, el pH de la solución de colágeno para la polimerización del colágeno se selecciona del intervalo de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 11, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 9,0, de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 8,5 y en otra realización el pH es de aproximadamente 7,3 a aproximadamente 7,4.
En diversas realizaciones, los nutrientes, incluyendo minerales, aminoácidos, azúcares, péptidos, proteínas, vitaminas o glucoproteínas que facilitan la proliferación celular, tales como laminina y fibronectina, ácido hialurónico o factores de crecimiento tales como el factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento transformante beta o factor de crecimiento de fibroblastos, y glucocorticoides tales como dexametasona, pueden añadirse a la solución de colágeno antes o después de que se complete la polimerización del colágeno o durante la polimerización del colágeno. De acuerdo con otra realización, pueden añadirse células a la solución de colágeno antes o después de que se complete la polimerización del colágeno o durante la polimerización del colágeno. En diversas realizaciones, las células pueden seleccionarse del grupo que consiste en células epiteliales, células endoteliales, células derivadas mesodérmicamente, células mesoteliales, sinoviocitos, células neuronales, células gliales, osteoblastos, fibroblastos, condrocitos, tenocitos, células del músculo liso, células del músculo esquelético, células del músculo cardíaco, células progenitoras multipotenciales (por ejemplo, células madre incluyendo células progenitoras de la médula ósea), adipocitos y células osteogénicas.
En una realización, se proporciona una matriz de colágeno preparada de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos en el presente documento. En un aspecto, la matriz de colágeno puede ser un injerto médico. En una realización, el injerto médico tiene un uso seleccionado del grupo que consiste en un material de injerto de tejido, un material de injerto inyectable, un apósito para heridas, un apósito hemostático, un vehículo de suministro de células terapéuticas y un vehículo de suministro de un agente terapéutico. En otra realización, los métodos descritos en el presente documento pueden usarse para elaborar una formulación de biotinta para imprimir tejidos u órganos. En otra realización, la matriz de colágeno se usa con fines de investigación, tales como las pruebas de toxicidad de fármacos o el desarrollo de fármacos. En una realización, las matrices preparadas mediante los métodos descritos en el presente documento pueden servir como sustratos para el recrecimiento de tejidos endógenos en el sitio de implantación (por ejemplo, remodelación) y las matrices pueden tener las características de los tejidos dañados o enfermos que reemplazan en el sitio de implantación o inyección.
En una realización ilustrativa, las matrices descritas en el presente documento pueden contener fibrillas con una fracción de área de fibrillas (definida como el área porcentual del área total ocupada por fibrillas en una superficie transversal de la matriz) o una fracción de volumen de fibrillas (el área porcentual del área total ocupada por fibrillas en 3 dimensiones) de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 100%, de aproximadamente el 0,5% a aproximadamente el 100 %, de aproximadamente el 0,5 % a aproximadamente el 26 %, de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 100 %, de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 26 %, de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 7 %, de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 15 %, de aproximadamente el 7 % a aproximadamente el 26 %, de aproximadamente el 20 % a aproximadamente el 30 %, de aproximadamente el 20 % a aproximadamente el 50 %, de aproximadamente el 20 % a aproximadamente el 70 %, de aproximadamente el 20 % a aproximadamente el 100%, de aproximadamente el 30% a aproximadamente el 50%, de aproximadamente el 30 % a aproximadamente el 70 % o de aproximadamente el 30 % a aproximadamente el 100 %, y/o un módulo (por ejemplo, un módulo elástico o lineal (definido por la pendiente de la región lineal de la curva de tensión-deformación obtenida usando protocolos de pruebas mecánicas convencionales; es decir, rigidez), un módulo de compresión, o un módulo de almacenamiento de cizalla) de aproximadamente 0,5 kPa a aproximadamente 40 kPa, de aproximadamente 30 kPa a 100 kPa, de aproximadamente 30 kPa a aproximadamente 1000 kPa, de aproximadamente 30 kPa a aproximadamente 10000 kPa, de aproximadamente 30 kPa a aproximadamente 70000 kPa, de aproximadamente 100 kPa a 1000 kPa, de aproximadamente 100 kPa a aproximadamente 10000 kPa o de aproximadamente 100 kPa a aproximadamente 70000 kPa.
En otra realización, se describe un kit que comprende colágeno liofilizado, una solución de ácido clorhídrico y una solución tampón. En otra realización más, se proporciona un kit que comprende una composición de colágeno y una solución tampón. En estas realizaciones de kit, la solución tampón puede comprender MgCh de aproximadamente 0,03 mM a aproximadamente 0,2 mM, MgCh de aproximadamente 0,002 mM a aproximadamente 0,02 mM, MgCh menos de aproximadamente 0,02 mM o la solución tampón no comprende MgCh. En diversas realizaciones, la solución tampón comprende además KH2PO4 de aproximadamente 0,003 M a aproximadamente 0,03 M, Na2HPO4 de aproximadamente 0,01 mM a aproximadamente 0,1 M, KCl de aproximadamente 0,001 mM a aproximadamente 0,04 mM, NaCl de aproximadamente 0,2 M a aproximadamente 3,0 M y NaOH de aproximadamente 0,02 N a aproximadamente 0,2 N. En otro aspecto, la solución tampón puede comprender de aproximadamente el 0,2 por ciento en peso a aproximadamente el 5 por ciento en peso de glucosa, aproximadamente el 0,5 por ciento en peso de glucosa o menos o nada de glucosa.
En un aspecto, en la realización del kit que tiene una solución de ácido clorhídrico, la solución de ácido clorhídrico puede comprender ácido clorhídrico de aproximadamente 0,005 N a ácido clorhídrico aproximadamente 0,1 N. En un aspecto, en la realización del kit que tiene colágeno liofilizado, una solución de ácido clorhídrico y una solución tampón de colágeno liofilizado, la solución de ácido clorhídrico y la solución tampón están en recipientes separados. En un aspecto de la realización que tiene la composición de colágeno y la solución tampón, el colágeno en la composición de colágeno puede estar en una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 40 mg/ml o de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml. En esta realización, la composición de colágeno y la solución tampón pueden estar en recipientes separados, tal como viales esterilizados o compartimentos separados de una jeringa doble que comprende un elemento de mezcla. En cualquiera de las realizaciones del kit descritas en el presente documento, el kit puede incluir instrucciones de uso de los componentes del kit. En cualquiera de las realizaciones del kit descritas en el presente documento, la solución tampón es capaz de polimerizar colágeno usando una sola etapa de mezcla que comprende mezclar la solución tampón con el colágeno liofilizado reconstituido en la solución de ácido clorhídrico o con la composición de colágeno.
En otra realización, se proporciona un kit con colágeno en forma liofilizada y el kit comprende además una solución tampón como se describe en el presente documento y una solución de un ácido, tal como ácido acético u otro ácido diluido, incluyendo por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido fórmico, ácido láctico, ácido cítrico, ácido sulfúrico o ácido fosfórico para reconstituir el colágeno liofilizado.
Los siguientes ejemplos ilustran realizaciones específicas con más detalle. Estos ejemplos se proporcionan solo con fines ilustrativos y no deben interpretarse como limitantes de la invención de ninguna manera.
EJEMPLO 1
PREPARACIÓN DE LA COMPOSICIÓN DE COLÁGENO
Los oligómeros de colágeno tipo I derivaron de la dermis de cerdos de piaras cerradas y se prepararon como se describió anteriormente (Bailey JL, Critser PJ, Whittington C, Kuske j L, Yoder MC, Voytik-Harbin SL; Collagen oligomers modulate physical and biological properties of three-dimensional self-assembled matrices, Biopolymers (2011) 95(2):77-93 y Kreger ST, Bell BJ, Bailey J, Stites E, Kuske J, Waisner B, Voytik-Harbin SL; Polymerization and matrix physical properties as important design considerations for soluble collagen formulations, Biopolymers (2010) 93(8):690-707). Antes de su uso, los oligómeros de colágeno liofilizados se disolvieron en ácido clorhídrico 0,01 N. El oligómero de calidad de investigación se volvió aséptico mediante exposición al cloroformo a 4 °C. El oligómero de calidad médica se filtró de forma estéril usando un filtro de jeringa Millex-GP PES Express de 0,22 pm (Millipore, SLGPO33RS). Se usó un ensayo Sirius Red (Direct Red 80) para determinar la concentración de colágeno. Las formulaciones de oligómeros se estandarizaron en función de la pureza y la capacidad de polimerización de acuerdo con la norma de consenso internacional ASTM F3089-14 (Norma a St M F3089, 2014, "Guía estándar para la caracterización y estandarización de productos a base de colágeno polimerizables e interacciones asociadas entre colágeno y células", ASTM International, West Conshohocken, PA, F3089-14). La capacidad de polimerización se define por el módulo de almacenamiento de cizalla de la matriz (G') como una función de la concentración de colágeno de la reacción de polimerización. Se realizó un autoensamblaje multietapa que implicó 3 reactivos: tampón de polimerización 10X PLUS, NaOH 0,1 N de y suplemento de polimerización. El autoensamblaje de una sola etapa se realizó con reactivos de autoensamblaje 10X (diluidos 1:10) preparados de acuerdo con la siguiente receta en ausencia de MgCh:
2 g de KH2PO4 (FW 136,09)
11,5 g de Na2HPO4 (FW 141,96)
2 g de KCl (peso neto 74,55)
10 g de glucosa
80 g de NaCl (FW 58,44)
20 ml de NaOH 5 N
Todos los reactivos se añadieron al agua filtrada Milli-Q para lograr un volumen final de 1 litro y se filtraron de manera estéril (0,22 |jm). Integra Flowable se obtuvo de Integra Life Sciences (Plainsboro, NJ) y se manipuló de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
EJEMPLO 2
PRUEBAS DE PROPIEDADES VISCOELÁSTICAS
Las propiedades viscoelásticas de matrices de colágeno autoensambladas se determinaron usando el modo de cizalla oscilatoria en un reómetro AR2000 (TA Instruments, New Castle, DE) como se describió anteriormente (Kregeret al.,2010). Las muestras se polimerizaron en la platina del reómetro durante 30 minutos seguido de un barrido de deformación por cizalla del 0,1 % al 4 % de deformación a 1 Hz. El módulo de almacenamiento de cizalla (G') con una deformación del 1 % se usó como medida de la rigidez de la matriz.
EJEMPLO 3
CULTIVO CELULAR Y PREPARACIÓN DE CONSTRUCCIONES DE TEJIDO TRIDIMENSIONAL DE FIBRILLAS-COLÁGENO
Las células madre derivadas de tejido adiposo humano (human Adipose-Derived Stem Cells, hASC) de bajo pasaje se obtuvieron de Zen-Bio (Research Triangle Park, Carolina del Norte) y se cultivaron en un medio de crecimiento compuesto por medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM; Life Technologies, Carlsbad, CA), suero bovino fetal al 10 % (FBS), penicilina 100 U/ml y estreptomiosina 100 U/ml (Invitrogen, Grand Island, NY). Las hASC se cultivaron y se mantuvieron en un ambiente humidificado con 5 % de dióxido de carbono en el aire a 37 °C. Las células se mantuvieron por debajo del 80 % de confluencia y se usaron en experimentos en los pases 6 a 9.
Las construcciones de tejido de fibrillas de colágeno encapsuladas en células se prepararon suspendiendo hASC (300.000 células/ml) en soluciones de oligómeros neutralizados (200 Pa). La neutralización se logró usando procedimientos y reactivos de una sola etapa o multietapa. Las construcciones de tejido se fijaron en paraformaldehído al 3 % después de 3 días de cultivo y se tiñeron con faloidina para visualizar el citoesqueleto de actina. Para el análisis cualitativo 3D, se formaron imágenes de las construcciones de tejido usando un sistema confocal Olympus FluoView FV-1000 adaptado a un microscopio invertido (IX81, Olympus Corporation, Tokio, Japón).
EJEMPLO 4
INYECCIÓN SUBCUTÁNEA EN RATÓN
Los ratones C57BL/6 (n=5) obtenidos de Harlan Laboratories (Indianápolis, Indiana) fueron inicialmente anestesiados en una cámara de inducción de 1 l y a continuación se mantuvieron inconscientes con un sistema coaxial de cono nasal sin reinhalación que administraba isoflurano al 1-3 % en aire de calidad médica a 1,5 l/min. Se aplicó lubricante ocular estéril y los animales se colocaron en una platina calentada ajustable a 44 °C para mantener la temperatura corporal interna cerca de 37 °C. La frecuencia cardíaca, la frecuencia respiratoria y la temperatura corporal se controlaron cada 15 minutos con electrodos de platina y una sonda recta, respectivamente. El vello del lado dorsal se eliminó con cuchilla y crema depilatoria (Nair, Church & Dwight Co., Inc. Ewing, NJ). Los grupos experimentales incluyeron 1) oligómero de calidad de investigación (500 Pa), 2) oligómero de calidad médica (500 Pa), 3) Integra Flowable, 4) solución salina tamponada con fosfato (PBS) o 5) control sin tratamiento. Las formulaciones de oligómero, Integra Flowable y PBS (200 jl) se inyectaron por vía subcutánea en ambos lados de la espalda, paralelo al plano sagital. Se administraron formulaciones de oligómero y PBS usando agujas de 27G, 1,27 cm ( ^ pulgada), mientras que Integra Flowable requirió agujas de 18 G, 27 cm ( ^ pulgada) debido a la consistencia del material y la obstrucción de tamaños de agujas más pequeños. Después de cuatro semanas, los animales fueron sacrificados y se recolectaron los sitios de los implantes junto con márgenes generosos de tejido hospedador circundante. Todas las muestras se fijaron en formalina, se embebieron en parafina, se seccionaron finamente y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) y tricrómico de Masson.
EJEMPLO 5
DESARROLLO Y VALIDACIÓN DE UN PROCEDIMIENTO DE AUTOENSAMBLAJE EN UNA SOLA ETAPA Y REACTIVO
El procedimiento de autoensamblaje en una sola etapa y el reactivo incluyeron el mantenimiento de i) condiciones y reactivos fisiológicamente relevantes y ii) la capacidad de polimerización observada con un procedimiento multietapa establecido. Los intentos iniciales de combinar todos los reactivos usados en un procedimiento multietapa, incluyendo tampón de polimerización 10X PLUS, Suplemento de polimerización y NaOH, dieron como resultado una solución inestable que formó un precipitado floculante. Sin embargo, cuando se eliminó MgCh, no se observaron precipitaciones, incluso cuando se almacena a 4 °C durante períodos de tiempo prolongados. Basándose en estos resultados, se realizaron estudios de seguimiento para evaluar la capacidad de polimerización y la respuesta celularin vitro.En comparación con los procedimientos multietapa, el procedimiento en una sola etapa produjo curvas de capacidad de polimerización similares y un comportamiento y morfología celularin vitrosimilares como se muestra en las Figuras 1 y 2, respectivamente. También se han realizado estudios preliminares para demostrar la utilidad del autoensamblaje en una sola etapa para aplicaciones de bioimpresión tridimensional. Más específicamente, se han empleado Oligómero, reactivo de autoensamblaje 10X y un diluyente para imprimir construcciones de tejido que contienen gradientes continuos en densidad de fibrillas de colágeno usando un dispositivo de bioimpresión de boquilla única diseñado a medida. El nuevo procedimiento de autoensamblaje de colágeno en una sola etapa y el formulario asociado se muestran en las Figuras 3 y 4, respectivamente.
EJEMPLO 6
DESARROLLO Y VALIDACIÓN DE LA ESTERILIZACIÓN CON POLÍMERO DE COLÁGENO
Se realizaron estudios adicionales para evaluar métodos de esterilización que respaldarían la ampliación de la fabricación y la aprobación regulatoria de productos oligómeros de calidad médica. Se empleó filtración estéril usando un dispositivo de filtro convencional basado en jeringa de 0,22 pm. Debido a que el oligómero representa una solución molecular soluble, es susceptible de filtración estéril. La formulación de oligómero (500 Pa) mostró una cinética y capacidad de polimerización estadísticamente similares (p>0,05) antes (458 ± 55 Pa) y después (434 ± 49) de la filtración estéril. Estudios adicionales confirmaron que se obtuvieron respuestas tisulares similaresin vivocon formulaciones de oligómeros de grado médico y de investigación. Adicionalmente, la respuesta del tejidoin vivoobtenida mediante la polimerización de una sola etapa de oligómero de grado de investigación fue consistente con la obtenida mediante procedimientos de polimerización multietapa (véase la Fig. 5).
EJEMPLO 7
EFECTOS DE LA IRRADIACIÓN ULTRAVIOLETA DEL COLÁGENO SOBRE LAS PROPIEDADES DE LA MATRIZ DE COLÁGENO
La radiación ultravioleta monocromática a 254 nm (UVC) se produjo mediante un sistema de haz colimado de placa plana, empleando una fuente de lámpara de Hg de baja presión. Se colocaron capas delgadas (1 mm) de solución de colágeno en placas de Petri y se trataron con dosis de UVC de 0 (control sin tratamiento), 30 mJ/cm2 (1 minuto de irradiación) y 300 mJ/cm2 (10 minutos de irradiación). La capacidad de polimerización y las propiedades viscoelásticas asociadas de las muestras tratadas se midieron como se describe en el Ejemplo 2 y se compararon con controles no tratados. Las mediciones del módulo de almacenamiento de cizalla fueron estadísticamente similares para las soluciones de oligómeros expuestas a dosis de irradiación UVC de 0, 30 y 300 mJ/cm2 (Fig. 7).

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un kit que comprende una composición de colágeno y una solución tampón en donde la solución tampón comprende una base y es capaz de polimerizar el colágeno usando una sola etapa de mezcla que comprende mezclar la composición de colágeno con la solución tampón.
2. Un método que usa una sola etapa de mezcla que comprende mezclar una composición de colágeno con una solución tampón para formar una solución de colágeno en donde la solución tampón comprende una base, y polimerizar el colágeno en la solución de colágeno para formar la matriz.
3. Un método para preparar una matriz, comprendiendo dicho método polimerizar colágeno mezclando una composición de colágeno con una solución tampón para formar una solución de colágeno en donde la solución tampón comprende una base, y polimerizar el colágeno en la solución de colágeno para formar la matriz en donde la solución tampón no contiene iones de magnesio o iones de manganeso.
4. El método de la reivindicación 2 o 3 en donde la composición de colágeno, la solución de colágeno o la matriz de colágeno se esteriliza mediante un método seleccionado del grupo que consiste en
a) exposición a cloroformo,
b) filtración vírica,
c) filtración estéril,
d) radiación ultravioleta,
e) irradiación gamma,
f) haz de electrones, y
g) combinaciones de los mismos.
5. El kit de la reivindicación 1 o el método de las reivindicaciones 2 o 3 en donde la solución tampón
a) comprende menos de aproximadamente 0,02 mM de MgCl2, o
b) no comprende MgCl2.
6. El kit de la reivindicación 1 o el método de la reivindicación 2 o 3 en donde la composición de colágeno, la solución de colágeno y/o la matriz de colágeno se esteriliza usando radiación ultravioleta.
7. El método de la reivindicación 6 en donde la matriz de colágeno que resulta de la polimerización del colágeno mantiene una propiedad de polimerización con respecto a
a) una composición de colágeno que no esté irradiada,
b) una solución de colágeno que no esté irradiada,
c) o una matriz de colágeno que no esté irradiada, respectivamente,
en donde la propiedad de polimerización se selecciona del módulo de almacenamiento de cizalla y una respuesta del tejidoin vivo.
8. El kit de la reivindicación 6 o el método de la reivindicación 7 en donde la propiedad de polimerización es el módulo de almacenamiento de cizalla.
9. El kit de la reivindicación 6 o el método de la reivindicación 6 en donde la dosis de radiación varía de aproximadamente 30 mJ/cm2 a aproximadamente 300 mJ/cm2.
10. El kit de la reivindicación 6 o el método de la reivindicación 6 en donde la esterilización inactiva los virus.
11. El método de la reivindicación 6 en donde la composición de colágeno, la solución de colágeno y/o la matriz de colágeno se esteriliza usando irradiación UVC.
12. El método de la reivindicación 6 en donde la composición de colágeno, la solución de colágeno y/o la matriz de colágeno se esteriliza usando irradiación UVC y filtración estéril.
13. El kit de la reivindicación 6 en donde la matriz de colágeno que resulta de la polimerización de colágeno produjo una propiedad de polimerización igual a una composición de colágeno que no está irradiada o a un colágeno liofilizado que no está irradiado, respectivamente, en donde la propiedad de polimerización se selecciona del módulo de almacenamiento de cizalla y una respuesta del tejidoin vivo.
14. El kit de la reivindicación 13 en donde la propiedad de polimerización es el módulo de almacenamiento de cizalla.
15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 en donde el colágeno polimerizado usando un procedimiento de una sola etapa produjo la misma capacidad de polimerización que el colágeno polimerizado usando un procedimiento multietapa.
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