ES3040855T3 - Maize event mon87429 and methods of use thereof - Google Patents

Maize event mon87429 and methods of use thereof

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Michael Goley
Jintai Huang
Tracy Klingaman
Clayton Larue
Youlin Qi
Oscar Sparks
Scoyoc Brook Van
Heping Yang
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Abstract

La invención proporciona moléculas de ADN recombinante exclusivas del evento de maíz MON87429 y plantas de maíz transgénicas, partes de plantas de maíz, semillas de maíz, células de maíz y productos agrícolas que contienen el evento de maíz MON87429, así como métodos para su uso y detección. Las plantas de maíz transgénicas que contienen el evento de maíz MON87429 presentan tolerancia a los inhibidores de la acetil-CoA carboxilasa (ACCase) del grupo ariloxifenoxipropionato (FOP), auxinas sintéticas, inhibidores de la glutamina sintetasa e inhibidores de la 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintetasa (EPSPS). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Evento de maíz MON87429 y procedimientos de uso del mismo
Referencia cruzada a aplicaciones relacionadas
Estasolicitud reivindica el beneficio de prioridad de laSolicitud Provisional de EE UU. Núm. 62/625,537, presentada el 2 de febrero de 2018.
Lista de secuencias
El listado de secuencias que está contenido en el archivo denominado "MONS430US-seq.txt", que tiene 44,2 KB (medidos en Microsoft Windows®) y fue creado el 17 de enero de 2019, se presenta por vía electrónica.
Campo de la invención
La invención se relaciona con moléculas de ADN recombinante de evento de maíz MON87429. La invención también se relaciona con plantas, partes, semillas, células y productos agrícolas de maíz transgénico que contienen el evento de maíz MON87429, así como a procedimientos de utilización de plantas, partes, semillas, células y productos agrícolas de maíz transgénico que contienen el evento de maíz MON87429 y de detección del evento de maíz MON87429. Las plantas, partes, semillas y células de maíz transgénico que contienen el evento de maíz MON87429 muestran tolerancia a los inhibidores de la acetil CoA carboxilasa (ACCasa) del grupo del ariloxifenoxipropionato (FOP), tales como el quizalofop y el haloxifop; auxinas sintéticas tales como dicamba y 2,4-D; inhibidores de la glutamina sintetasa tales como glufosinato; e inhibidores de la 5-enolpiruvilsiquimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) tales como glifosato.
Antecedentes de la invención
El maíz(Zea mays)es un cultivo importante en muchas zonas del mundo, y el uso de herbicidas para el control de malas hierbas en la producción de cultivos es una herramienta bien establecida. Los procedimientos de la biotecnología se han utilizado para producir maíz transgénico tolerante a un herbicida específico gracias a la expresión de un gen heterólogo, también conocido como transgén. Un rasgo de tolerancia a herbicidas puede utilizarse solo o combinado con otros rasgos, tales como la tolerancia a otro herbicida o la resistencia a plagas o patógenos. Las combinaciones de rasgos de tolerancia a herbicidas son deseables para proporcionar opciones de control de malas hierbas que aumenten la flexibilidad del agricultor y permitan el uso de múltiples modos de acción herbicida para el control de malas hierbas difíciles. Se puede lograr una combinación de rasgos mediante la cría conjunta de cada rasgo individual. La combinación de rasgos individuales en el maíz y el mantenimiento de esta combinación durante la mejora con un conjunto diverso de germoplasma de élite es un proceso largo y costoso. También se puede lograr una combinación de rasgos combinando múltiples rasgos en un lugar, o locus, del genoma, lo que simplifica el proceso de cría. Una forma de conseguirlo es mediante una única inserción transgénica que contenga múltiples transgenes. La combinación de múltiples rasgos de tolerancia a herbicidas en un único locus en el maíz proporcionaría una herramienta útil en el control de las malas hierbas que es mucho más sencilla y menos costosa de mantener durante el cultivo con un conjunto diverso de germoplasma de élite.
La expresión de un transgén en una planta, parte, semilla o célula transgénica, y por lo tanto su eficacia, puede estar influenciada por muchos factores diferentes, tales como los elementos utilizados en el casete de expresión del transgén y la interacción de dichos elementos. Esto se complica aún más en el caso de una inserción transgénica que contenga dos o más casetes de expresión con cada casete de expresión que tenga un transgén que confiera un rasgo separado, también conocido como evento transgénico multigénico. Un evento transgénico multigénico comercialmente útil requiere que cada uno de los transgenes de la inserción transgénica se exprese de la manera necesaria para cada rasgo. Para lograrlo, primero se diseñan y prueban en plantas casetes de expresión individuales y se seleccionan los mejores casetes de expresión para cada rasgo. A continuación, los casetes de expresión seleccionados para un rasgo se combinan con los casetes de expresión seleccionados para otro(s) rasgo(s) en una construcción, y la construcción se prueba para garantizar que todos los casetes de expresión funcionan bien juntos y que cada transgén se expresa correctamente. A continuación, la combinación seleccionada de casetes de expresión se utiliza como un único inserto transgénico para producir cientos de eventos transgénicos multigénicos, cada evento el resultado de una inserción aleatoria del ADN extraño en una localización genómica diferente.
Cada evento transgénico es único. A continuación, los eventos únicos se analizan a través de múltiples generaciones de plantas para seleccionar un evento superior para uso comercial. El rendimiento de un evento en una planta, parte, semilla o célula transgénica, y por tanto su eficacia, puede verse influido por la localización genómica de la inserción transgénica. Los eventos pueden tener la misma inserción transgénica y, sin embargo, presentar diferentes niveles de expresión del transgén y rendimiento en distintos tejidos y fases de desarrollo, en diversos germoplasmas o en condiciones de crecimiento específicas. La creación de un evento multigénico para uso comercial requiere una caracterización molecular rigurosa, pruebas en invernadero y ensayos de campo a lo largo de varios años, en múltiples lugares y bajo una variedad de condiciones, de forma que puedan recopilarse datos agronómicos, fenotípicos y moleculares exhaustivos. Los datos resultantes deben ser analizados por científicos y agrónomos para seleccionar un evento que sea útil con fines comerciales. El evento comercial multigénico puede entonces introgresarse como un único locus con múltiples rasgos de tolerancia a herbicidas en nuevo germoplasma utilizando procedimientos de mejora vegetal.
Breve sumario de la invención
La invención proporciona moléculas de ADN recombinante que comprenden una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:2, y SEQ ID NO:1. En una realización, la molécula de ADN recombinante se deriva de una planta, semilla o célula que comprende el evento de maíz MON87429, habiéndose depositado una muestra representativa de semilla que comprende el evento como ATCC Accession No. PTA-124635. En otra realización, la molécula de ADN recombinante se encuentra en una planta, célula, semilla o parte de planta que comprende el evento de maíz MON87429, habiéndose depositado una muestra representativa de semilla que comprende el evento como ATCC PTA-124635. En otra realización, la molécula de ADN recombinante es un amplicón de diagnóstico de la presencia del evento de maíz MON87429.
La invención proporciona una molécula de ADN que tiene una longitud suficiente de nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:10 para funcionar como una sonda de ADN específica para SEQ ID NO:10 en una muestra de ADN derivada de una planta de maíz, semilla de maíz o célula de maíz en la que la sonda de ADN comprende cualquiera de las SEQ ID NO: 1-8, y SEQ ID NO:10.
La invención proporciona un par de moléculas de ADN que comprende una primera molécula de ADN y una segunda molécula de ADN, en el que la primera comprende un fragmento del inserto transgénico de SEQ ID NO: 10 desde la posición 1030 hasta la posición 15037 y la segunda molécula de ADN comprende un fragmento de la secuencia de ADN flanqueante de SEQ ID NO:10 desde la posición 1 hasta la posición 1029 o un fragmento de SEQ ID NO: 10 desde la posición 15038 hasta la 16068 y cada uno de ellos tiene la longitud suficiente para funcionar como cebadores de ADN cuando se utilizan juntos en una reacción de amplificación con ADN que contiene el evento de maíz MON87429 para producir un amplicón de diagnóstico del evento de maíz MON87429 en una muestra. En una realización, la primera molécula de ADN comprende SEQ ID NO:11 y la segunda molécula de ADN comprende SEQ ID NO:12.
La invención proporciona un procedimiento para detectar la presencia del evento de maíz MON87429 en una muestra de<a>D<n>derivada de una planta de maíz, semilla de maíz o célula de maíz, el procedimiento comprende: poner en contacto la muestra con una sonda de ADN según se reivindica; someter la muestra y la sonda de ADN a condiciones de hibridación rigurosas; y detectar la hibridación de la sonda de ADN con una molécula de ADN de la muestra, en la que la hibridación de la sonda de ADN con la molécula de ADN indica la presencia del evento de maíz MON87429 en la muestra de ADN.
La invención proporciona un procedimiento para detectar la presencia del evento de maíz MON87429 en una muestra de ADN derivada de una planta de maíz, semilla de maíz o célula de maíz, el procedimiento comprende: poner en contacto la muestra con un par de moléculas de ADN que funcionan como cebadores de ADN según se reivindica; realizar una reacción de amplificación suficiente para producir un amplicón de ADN que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ<i>D NO:10, SEQ ID NO:8, SEQ ID<n>O:7, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:1; y detectar la presencia del amplicón de ADN, en el que la presencia del amplicón de ADN indica la presencia del evento de maíz MON87429 en la muestra.
La invención proporciona un kit para detectar la presencia del evento de maíz MON87429 que comprende una sonda de ADN específica para SEQ ID NO: 10, un par de cebadores de ADN que producen un amplicón de diagnóstico para el evento de maíz MON87429.
La invención proporciona una planta, semilla, célula, parte de planta o producto básico que comprende el evento de maíz MON87429, habiéndose depositado una muestra representativa de semilla que comprende el evento como ATCC Accession No: PTA-124635 una molécula de ADN que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 10 o que comprenda una secuencia de SEQ ID NO:9 y una secuencia de cualquiera de SEQ ID Nos:1, 3, 5 y 7 y una secuencia de cualquiera de SEQ ID NO: 2, 4, 6 y 8. En una realización, la planta, semilla, célula o parte de la planta es tolerante al menos a un herbicida seleccionado del grupo que consiste en inhibidores de la acetil CoA carboxilasa (ACCasa) en el grupo del ariloxifenoxipropionato (FOP), auxinas sintéticas, inhibidores de la glutamina sintetasa e inhibidores de la 5-enolpiruvilsiquimato-3-fosfato sintasa (EPSPS), o cualquier combinación de los mismos. En otra realización, la planta, semilla, célula o parte de la planta es tolerante al quizalofop, haloxifop, dicamba, 2,4-D y glufosinato.
La invención proporciona un procedimiento para controlar las malas hierbas en una zona de cultivo que comprende plantar maíz que comprende el evento de maíz MON87429 en la zona de cultivo y aplicar a la zona de cultivo, o a cualquier porción de la misma, una cantidad eficaz de al menos un herbicida seleccionado del grupo que consiste en inhibidores de la acetil CoA carboxilasa (ACCasa) en el grupo del ariloxifenoxipropionato (FOP), auxinas sintéticas, inhibidores de la glutamina sintetasa, e inhibidores de la 5-enolpiruvilsiquimato-3-fosfato sintasa (EPSPS), o cualquier combinación de los mismos, para controlar las malas hierbas en la zona sin dañar el maíz.
En una realización, el procedimiento comprende la aplicación de al menos dos o más herbicidas seleccionados del grupo que consiste en inhibidores de la acetil CoA carboxilasa (ACCasa) en el grupo ariloxifenoxipropionato (FOP), auxinas sintéticas, inhibidores de la glutamina sintetasa, e inhibidores de la 5-enolpiruvilsiquimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) durante una temporada de crecimiento. En otra realización, el procedimiento comprende la aplicación de un herbicida seleccionado del grupo que consiste en quizalofop, haloxifop, dicamba, 2,4-D, glufosinato y glifosato, o cualquier combinación de los mismos. En una realización, la cantidad efectiva de dicamba es de aproximadamente 0,56 kg ae/ha a aproximadamente 2,24 kg ae/ha durante una temporada de cultivo. En una realización, la cantidad efectiva de glufosinato es de aproximadamente 0,45 kg ae/ha a aproximadamente 1,78 kg ae/ha durante una temporada de cultivo. En una realización, la cantidad efectiva de 2,4-D es de aproximadamente 0,84 kg ae/ha a 1,12 kg ae/ha durante una temporada de cultivo. En una realización, la cantidad eficaz del herbicida FOP es de aproximadamente 0,04 kg ai/ha a aproximadamente 0,09 kg ai/ha de quizalofop durante un período vegetativo. En una realización, la cantidad eficaz del herbicida FOP es de aproximadamente 0,02 kg ai/ha a aproximadamente 0,08 kg ai/ha de haloxifop durante una temporada de cultivo.
La invención proporciona un procedimiento para controlar el maíz voluntario que comprende el evento de maíz MON87429 en una zona que comprende aplicar una cantidad herbicidamente eficaz de al menos un herbicida ciclohexanodiona (DIM), en la que la aplicación del herbicida impide el crecimiento del maíz que comprende el evento de maíz MON87429. En una realización, el herbicida ciclohexanodiona (DIM) se selecciona del grupo que consiste en cletodim, setoxidim y tralcoxidim.
La invención proporciona un procedimiento de inducción de esterilidad masculina en una planta de maíz que comprende: cultivar una planta de maíz que comprende SEQ ID NO: 10 o que comprenda una secuencia de SEQ ID NO:9 y una secuencia de cualquiera de SEQ ID Nos:1, 3, 5 y 7 y una secuencia de cualquiera de SEQ ID NO: 2,4, 6 y 8; y; aplicar una cantidad eficaz de glifosato antes o durante el desarrollo del tejido reproductor masculino de la planta, induciendo así la esterilidad masculina en la planta. En una realización, el glifosato se aplica antes o durante el desarrollo en una cantidad eficaz de aproximadamente 0,56 kg ae/ha a aproximadamente 2,8 kg ae/ha en total en una o más aplicaciones. En una realización, la cantidad eficaz de glifosato se aplica en una fase de desarrollo seleccionada del grupo que consiste en las fases V4, V5, V6, V7, V8, V9, V10, V11, V12, V13 y V14 del desarrollo de la planta de maíz. La invención proporciona semillas híbridas que comprenden SEQ ID NO:10 y producidas mediante el procedimiento de producción de semillas híbridas que comprende: cultivar una planta que comprende SEQ ID NO: 10; aplicar una cantidad eficaz de glifosato antes o durante el desarrollo del tejido reproductor masculino de la planta, induciendo así la esterilidad masculina en la planta; fertilizar la planta con polen de una segunda planta; y cosechar semillas híbridas de la planta.
La invención proporciona un procedimiento para determinar la cigosidad de una planta para el evento de maíz MON87429 que comprende: poner en contacto una muestra que comprende ADN derivado de la planta con un conjunto de cebadores capaz de producir un primer amplicón diagnóstico para la presencia del evento de maíz MON87429 y un segundo amplicón diagnóstico para el ADN genómico de maíz de tipo silvestre que no comprende el evento de maíz MON87429; realizar una reacción de amplificación del ácido nucleico; detectar el primer amplicón y el segundo amplicón, en la que la presencia de ambos amplicones indica que la muestra es heterocigótica para el evento de maíz MON87429 y la presencia únicamente del primer amplicón indica que la muestra es homocigótica para el evento de maíz MON87429. En una realización, el conjunto de cebadores comprende SEQ ID NO:11 y SEQ ID NO: 12.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 representa la secuencia del evento de maíz MON87429. Las líneas horizontales corresponden a las posiciones de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 y SEQ ID NO:9 en relación con SEQ ID NO:10; las flechas horizontales etiquetadas como SQ51062 (SEQ ID<n>O:11) y SQ51053 (SEQ ID NO:12) representan la posición aproximada de un par de cebadores que pueden utilizarse para detectar el evento de maíz MON87429; y la línea horizontal denominada PB50370 (SEQ ID NO:13) representa la posición aproximada de una sonda de<a>D<n>que puede utilizarse para detectar el evento de maíz MON87429.
La Figura 2 representa los cuatro casetes de expresión del maíz del evento MON87429 en relación con la SEQ ID NO:9 con sus respectivos elementos genéticos etiquetados como se describe en la Tabla 1.
La figura 3 representa la creación, prueba, caracterización y selección del evento MON87429, tal como se describe en la presente memoria descriptiva. Todas las horas son aproximadas.
Breve descripción de las secuencias
SEQ ID NO:1 es una secuencia de ADN de treinta nucleótidos que representa la unión 5' del ADN genómico del maíz y el inserto transgénico. SEQ ID NO:1 corresponde a las posiciones nucleotídicas 1015 a 1044 de SEQ ID NO:10.
SEQ ID NO:2 es una secuencia de ADN de treinta nucleótidos que representa la unión 3' del ADN genómico del maíz y el inserto transgénico. SEQ ID NO:2 corresponde a las posiciones nucleotídicas 15023 a 15052 de SEQ ID NO:10.
SEQ ID NO:3 es una secuencia de ADN de sesenta nucleótidos que representa la unión 5' del ADN genómico del maíz y el inserto transgénico. La SEQ ID NO:3 corresponde a las posiciones nucleotídicas 1000 a 1059 de la SEQ ID NO:10.
SEQ ID NO:4 es una secuencia de ADN de sesenta nucleótidos que representa la unión 3' del ADN genómico del maíz y el inserto transgénico. SEQ ID NO:4 corresponde a las posiciones nucleotídicas 15008 a 15067 de SEQ ID NO:10.
SEQ ID NO:5 es una secuencia de ADN de cien nucleótidos que representa la unión 5' del ADN genómico del maíz y el inserto transgénico. SEQ ID NO:5 corresponde a las posiciones nucleotídicas 980 a 1079 de SEQ ID NO: 10. SEQ ID NO:6 es una secuencia de ADN de cien nucleótidos que representa la unión 3' del ADN genómico del maíz y el inserto transgénico. SEQ ID NO:6 corresponde a las posiciones nucleotídicas 14988 a 15087 de SEQ ID NO:10.
SEQ ID NO:7 es una secuencia de ADN de 1350 nucleótidos que representa 1029 nucleótidos del ADN genómico de maíz flanqueante 5' y 321 nucleótidos del extremo 5' del inserto transgénico.
SEQ ID NO:8 es una secuencia de ADN de 1069 nucleótidos que representa 38 nucleótidos del extremo 3' del inserto transgénico y 1031 nucleótidos del ADN genómico de maíz flanqueante 3'.
SEQ ID NO:9 es una secuencia de ADN de 14008 nucleótidos correspondiente al inserto transgénico del evento de maíz MON87429.
SEQ ID NO:10 es una secuencia de ADN de 16068 nucleótidos correspondiente al evento de maíz MON87429; la secuencia contiene la secuencia de ADN genómico de flanqueo 5' de las posiciones 1 a 1029, el inserto de ADN transgénico de las posiciones 1030 a 15037, y la secuencia de ADN genómico de flanqueo 3' de las posiciones 15038 a 16068.
La SEQ ID NO:11 es una secuencia de ADN de 29 nucleótidos correspondiente a un cebador denominado SQ51062 y utilizado para identificar el ADN del evento de maíz MON87429 en una muestra; corresponde a las posiciones 15038 a 15066 de la SEQ ID NO:10.
SEQ ID NO: 12 es una secuencia de ADN de 17 nucleótidos correspondiente a un cebador denominado SQ51053 y utilizado para identificar el ADN del evento de maíz MON87429 en una muestra; corresponde a las posiciones 14987 a 15003 de SEQ ID NO: 10.
SEQ ID NO: 13 es una secuencia de ADN de 16 nucleótidos correspondiente a una sonda denominada PB50370 y utilizada para identificar el ADN del evento de maíz MON87429 en una muestra; corresponde a las posiciones 15009 a 15024 de SEQ ID NO: 10.
Descripción detallada de la invención
Las siguientes definiciones y procedimientos se proporcionan para definir mejor la invención y guiar a aquellos de habilidad ordinaria en la materia en la práctica de la invención. A menos que se indique lo contrario, los términos deben entenderse de acuerdo con el uso convencional por parte de los expertos en la materia.
Las técnicas de transformación de plantas se utilizan para insertar ADN extraño (también conocido como ADN transgénico) aleatoriamente en un cromosoma del genoma de una célula para producir una célula modificada genéticamente, también denominada célula "transgénica" o "recombinante". Mediante esta técnica, se transforman muchas células individuales, cada una de las cuales da lugar a un evento transgénico único debido a la inserción aleatoria del ADN extraño en el genoma. A continuación, se regenera una planta transgénica a partir de cada célula transgénica individual. El resultado es que cada célula de la planta transgénica contiene el evento transgénico insertado de forma única como parte estable de su genoma. A continuación, esta planta transgénica puede utilizarse para producir plantas progenitoras, cada una de las cuales contiene el evento transgénico único. El evento de maíz M<o n>87429 fue producido por: (i) la transformación de miles de células de maíz con una construcción de ADN que incluye cuatro casetes de expresión (cada casete de expresión ha sido seleccionado tras pruebas individuales seguidas de pruebas en combinación con los otros tres casetes de expresión), (ii) la regeneración de una población de plantas transgénicas, cada una de las cuales contiene un único evento transgénico, y (iii) una rigurosa selección de eventos plurianual que implica la prueba y el análisis de las características moleculares, la eficacia de la tolerancia a los herbicidas y las propiedades agronómicas en una variedad de antecedentes genéticos para miles de eventos a través de decenas de miles de plantas. De este modo, se produjo y seleccionó el evento de maíz MON87429 como un evento superior único, útil para fines comerciales agronómicos a gran escala.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, un "evento transgénico" o un "evento" es una molécula de ADN creada por el acto de insertar una molécula de ADN transgénico en el ADN genómico de una célula vegetal utilizando procedimientos de transformación vegetal conocidos en la técnica. Esta inserción crea una nueva secuencia de ADN genómico transgénico formada por el ADN extraño insertado (denominado "inserto transgénico") y el ADN genómico inmediatamente adyacente, o "flanqueante", al inserto transgénico a ambos lados del lugar de inserción (denominado "ADN flanqueante"). La secuencia de ADN de un evento es única y específica para el evento y puede identificarse fácilmente cuando se compara con otras secuencias de ADN, tales como la de otros eventos o la de ADN genómico de maíz no transformado. El evento de maíz MON87429 tiene la secuencia de ADN nueva y única SEQ ID NO: 10, que contiene la secuencia de inserción transgénica proporcionada como SEQ ID NO:9 y la secuencia de ADN de flanqueo 5' y 3' proporcionada en SEQ ID NO:7 y s Eq ID NO:8, respectivamente. El evento de maíz MON87429 es, por tanto, una molécula de ADN que forma parte integrante del cromosoma de las células y plantas transgénicas de maíz que comprenden el evento y, como tal, es estática y puede transmitirse a las células y plantas de la progenie.
También se describe la progenie de la célula transformada original y la planta que comprende el evento de maíz MON87429. Dicha progenie puede producirse por cultivo de tejidos celulares, por autofecundación de una planta de maíz que contenga el evento MON87429 o por cruzamiento sexual entre una planta de maíz que contenga el evento MON87429 y otra planta que contenga o no el evento. Esa otra planta puede ser una planta transgénica que comprenda el mismo o diferentes evento(s) o una planta no transgénica, como una de una variedad diferente. El evento de maíz MON87429 se transmite del progenitor original a la descendencia en cada generación.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, el término "maíz" significaZea mays(también denominado maíz) e incluye todas las variedades de plantas que se pueden cruzar conZea mays.
La invención proporciona el evento de maíz MON87429, que proporciona a las células, plantas y semillas de maíz que comprenden el evento tolerancia a inhibidores de acetil CoA carboxilasa (ACCasa) en el grupo ariloxifenoxipropionato (FOP) tales como quizalofop y haloxifop; auxinas sintéticas tales como dicamba y 2,4-D; inhibidores de la glutamina sintetasa tales como glufosinato; y el inhibidor de la 5-enolpiruvilsiquimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) glifosato. El evento de maíz MON87429 contiene cuatro casetes de expresión. Tal y como se utiliza aquí, un "casete de expresión" o "casete" es una molécula de ADN recombinante que comprende una combinación de elementos distintos que van a ser expresados por una célula transformada. La Tabla 1 proporciona una lista de los elementos contenidos en SEQ ID NO: 10 y como se ilustra en la figura 2.
Tabla 1: Descripción del evento de maíz MON87429
Tal y como se utiliza en la presente memoria descriptiva, el término "recombinante" se relaciona con un ADN, proteína u organismo no natural que normalmente no se encontraría en la naturaleza y que fue creado a partir de la intervención humana. Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, una "molécula de ADN recombinante" es una molécula de ADN que comprende una combinación de moléculas de ADN que no se darían juntas de forma natural y que es el resultado de la intervención humana, por ejemplo, una molécula de ADN que está compuesta por una combinación de al menos dos moléculas de ADN heterólogas entre sí, tal como una molécula de ADN que comprende un transgén y el ADN genómico de la planta adyacente al transgén. Un ejemplo de molécula de ADN recombinante es una molécula de ADN que comprende al menos una secuencia seleccionada de SEQ ID NO:1-10. Tal y como se utiliza aquí, una "planta recombinante" es una planta que normalmente no existiría en la naturaleza, es el resultado de la intervención humana y contiene una molécula de ADN transgénico. Como resultado de dicha alteración genómica, la planta recombinante es algo nuevo y claramente diferente de la planta de tipo silvestre emparentada. Un ejemplo de planta recombinante es una planta de maíz que contiene el evento MON87429.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, el término "transgén" se relaciona con una molécula de ADN incorporada artificialmente al genoma de un organismo debido a la intervención humana, tal como un procedimiento de transformación de plantas. Un transgén puede ser heterólogo para el organismo. El término "inserto transgénico", tal y como se utiliza en la presente memoria descriptiva, hace referencia al ADN extraño insertado mediante técnicas de transformación vegetal en el genoma del maíz para producir el evento de maíz MON87429. La secuencia del inserto transgénico del maíz del evento MON87429 se proporciona como SEQ ID NO:9. El término "transgénico" se relaciona con que comprende un transgén, por ejemplo una "planta transgénica" se relaciona con una planta que comprende un transgén.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, el término "heterólogo" se relaciona con una primera molécula no asociada normalmente con una segunda molécula o un organismo en la naturaleza. Por ejemplo, una molécula de ADN puede proceder de una primera especie e insertarse en el genoma de una segunda especie. De este modo, la molécula de ADN sería heteróloga para el genoma y el organismo.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, el término "quimérico" se relaciona con una única molécula de ADN producida mediante la fusión de una primera molécula de ADN con una segunda molécula de ADN, en la que ni la primera ni la segunda molécula de ADN se encontrarían normalmente en esa configuración fusionadas entre sí. La molécula de ADN quimérico es, por tanto, una nueva molécula de ADN que no se encuentra normalmente en la naturaleza. Un ejemplo de molécula de ADN quimérico es una molécula de ADN que comprende al menos una secuencia seleccionada de SEQ ID NO:1-10.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, el término "aislado" se relaciona con la separación de una molécula de otras moléculas típicamente asociadas a ella en su estado nativo o natural. Así, el término "aislado" puede relacionarse con una molécula de ADN que ha sido separada de otra(s) molécula(s) de ADN a la(s) que está asociada en su estado nativo o natural. Tal molécula de ADN puede estar presente en un estado recombinado, como una molécula de ADN recombinante. Así, una molécula de ADN extraída de su estado natural y fusionada con otra molécula de ADN con la que no está normalmente asociada sería una molécula de ADN aislada. Tal molécula de ADN aislada podría ser el resultado del uso de técnicas biotecnológicas, tal como la fabricación de ADN recombinante o la integración de una molécula de ADN extraña en el cromosoma de una célula, planta o semilla.
La invención proporciona moléculas de ADN y sus correspondientes secuencias de ADN. En la presente memoria descriptiva, los términos "ADN" y "molécula de ADN" se relacionan con una molécula de ácido desoxirribonucleico (ADN). Una molécula de ADN puede ser de origen genómico o sintético y va, por convención, del extremo 5' (aguas arriba) al extremo 3' (aguas abajo). En la presente memoria descriptiva, el término "secuencia de ADN" se relaciona con la secuencia de nucleótidos de una molécula de ADN. La nomenclatura utilizada en la presente memoria descriptiva corresponde a la del Título 37 del Código de Reglamentos Federales de los Estados Unidos § 1.822, y a la establecida en las tablas de la Norma ST.25 (1998) de la OMPI, Apéndice 2, Tablas 1 y 3. Por convención, las secuencias de ADN de la invención y sus fragmentos se desvelan con referencia a una sola cadena de las dos cadenas de secuencias de ADN complementarias. Por implicación e intención, las secuencias complementarias de las secuencias aquí proporcionadas (las secuencias de la hebra complementaria), también denominadas en la técnica secuencias complementarias inversas, están dentro del alcance de la invención y se pretende expresamente que estén dentro del alcance del objeto reivindicado. Por lo tanto, tal y como se utilizan en la presente memoria descriptiva, las referencias a SEQ ID NO:1-10 y sus fragmentos incluyen y se relacionan con la secuencia de la cadena complementaria y sus fragmentos.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, el término "fragmento" se relaciona con una pieza más pequeña de un todo. Por ejemplo, los fragmentos de SEQ ID NO:10 incluirían secuencias que son al menos aproximadamente 10 nucleótidos consecutivos, al menos aproximadamente 11 nucleótidos consecutivos, al menos aproximadamente 12 nucleótidos consecutivos, al menos aproximadamente 13 nucleótidos consecutivos, al menos aproximadamente 14 nucleótidos consecutivos, al menos unos 15 nucleótidos consecutivos, al menos unos 16 nucleótidos consecutivos, al menos unos 17 nucleótidos consecutivos, al menos unos 18 nucleótidos consecutivos, al menos unos 19 nucleótidos consecutivos, al menos unos 20 nucleótidos consecutivos, al menos unos 25 nucleótidos consecutivos, al menos unos 30 nucleótidos consecutivos, al menos unos 35 nucleótidos consecutivos, al menos unos 40 nucleótidos consecutivos, al menos unos 45 nucleótidos consecutivos, al menos unos 50 nucleótidos consecutivos, al menos unos 60 nucleótidos consecutivos, al menos unos 70 nucleótidos consecutivos, al menos unos 80 nucleótidos consecutivos, al menos unos 90 nucleótidos consecutivos o al menos unos 100 nucleótidos consecutivos de la secuencia completa de SEQ ID NO: 10.
La secuencia de ADN para el inserto transgénico del evento MON87429 de maíz se proporciona como SEQ ID NO:9. La secuencia de ADN del inserto transgénico y del ADN genómico del maíz que flanquea cada lado del inserto transgénico se proporciona como SEQ ID NO: 10. Las secuencias de ADN de una porción de ADN de flanqueo y del extremo 5' del inserto transgénico se proporcionan como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, y SEQ ID NO:7. Las secuencias de ADN de una porción de ADN de flanqueo y del extremo 3' del inserto transgénico se proporcionan como SEQ ID NO:2, SEQ iD NO:4, SEQ ID NO:6 y Se Q ID NO:8.
La secuencia de ADN de la región que abarca la conexión por enlace fosfodiéster de un extremo del inserto transgénico al ADN genómico de maíz flanqueante se denomina en la presente memoria descriptiva "unión". Una unión es el punto de conexión del inserto transgénico y el ADN flanqueante como una molécula contigua. Una unión se encuentra en el extremo 5' del inserto transgénico y la otra en el extremo 3' del inserto transgénico, denominadas en la presente memoria descriptiva unión 5' y 3', respectivamente. Una "secuencia de unión" se relaciona con una secuencia de ADN de cualquier longitud que abarca la unión 5' o 3' de un evento. Las secuencias de unión del evento de maíz MON87429 son evidentes para un experto en la materia utilizando SEQ ID NO:10. Ejemplos de secuencias de unión de evento de maíz MON87429 se proporcionan como SEQ ID NO: 1-8. La Figura 1 ilustra la disposición física de la SEQ ID NO:1-10 dispuesta de 5' a 3'. Las secuencias de unión del evento de maíz MON87429 pueden estar presentes como parte del genoma de una planta, semilla o célula que contenga el evento de maíz MON87429. La identificación de uno o más de los SEQ iD NO: 1-8 o 10 en una muestra de una planta, parte de una planta, semilla o célula indica que el ADN se ha obtenido de maíz que contiene el evento del maíz MON87429 y es diagnóstico de la presencia del evento del maíz MON87429.
Las plantas, semillas, células, partes de plantas y productos básicos de la invención pueden utilizarse para la detección de moléculas de ADN o proteína indicativas de la presencia del evento de maíz MON87429. Se proporcionan moléculas de ADN ejemplares que pueden utilizarse como cebadores o sondas para detectar la presencia del evento de maíz MON87429 en una muestra. Tales cebadores o sondas son específicos para una secuencia de ácido nucleico diana y, como tales, son útiles para la identificación del evento de maíz MON87429 mediante los procedimientos aquí descritos. La detección de la presencia del evento MON87429 en el maíz puede realizarse mediante procedimientos conocidos en la técnica, tales como la amplificación térmica del ácido nucleico o técnicas de hibridación del ácido nucleico (tales como el northern blotting y el análisis southern).
Un "cebador" es una molécula de ADN que está diseñada para su uso en procedimientos de recocido o hibridación que implican una reacción de amplificación. Una reacción de amplificación es una reacciónin vitroque amplifica ADN molde para producir un amplicón. Tal y como se utiliza en la presente memoria descriptiva, un "amplicón" es una molécula de ADN que se ha sintetizado utilizando técnicas de amplificación. Los amplicones de la invención tienen una secuencia de ADN que comprende una o más de las SEQ ID NO:1-10, o fragmentos de las mismas. Un par de cebadores puede utilizarse con ADN molde, tal como una muestra de ADN genómico de maíz, en una reacción de amplificación, tal como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), para producir un amplicón, en el que el amplicón producido tendría una secuencia de ADN correspondiente a la secuencia del<a>D<n>molde localizada entre los dos sitios donde los cebadores hibridaron con el molde. Un cebador suele estar diseñado para hibridarse con una cadena de ADN diana complementaria para formar un híbrido entre el cebador y la cadena de ADN diana. La presencia de un cebador es un punto de reconocimiento por parte de una polimerasa para iniciar la extensión del cebador utilizando como molde la cadena de ADN diana. Los pares de cebadores se refieren al uso de dos cebadores que se unen a hebras opuestas de un segmento de nucleótidos de doble cadena con el fin de amplificar el segmento de nucleótidos entre ellos. Se proporcionan ejemplos de secuencias de cebadores como SEQ ID NO:11 (SQ51062) y SEQ ID NO: 12 (SQ51053). El par de cebadores SEQ ID NO:11 y SEQ ID NO: 12 son útiles como una primera molécula de ADN y una segunda molécula de ADN, donde la primera molécula de ADN es un fragmento de la secuencia de ADN de inserción transgénica de SEQ ID NO: 10 y la segunda molécula de ADN es un fragmento de la secuencia de ADN flanqueante de SEQ ID NO: 10, y cada uno de ellos tiene la longitud suficiente para funcionar como cebadores de ADN cuando se utilizan juntos en una reacción de amplificación con ADN que contiene el evento de maíz MON87429 para producir un amplicón de diagnóstico del evento de maíz MON87429 en una muestra. Los pares de cebadores de la presente invención también pueden definirse en ciertas realizaciones como que comprenden una primera y una segunda molécula de ADN, en las que la primera molécula de ADN es un fragmento de la porción genómica de maíz de SEQ ID NO:10 y la segunda molécula de ADN es un fragmento de la porción transgénica de SEQ ID NO: 10, y cada uno de ellos tiene la longitud suficiente para funcionar como cebadores de ADN cuando se utilizan juntos en una reacción de amplificación con ADN que contiene el evento de maíz MON87429 para producir un amplicón de diagnóstico del evento de maíz MON87429 en una muestra.
Una "sonda" es una molécula de ácido nucleico complementaria a una cadena de un ácido nucleico diana y útil en procedimientos de detección por hibridación. Las sondas según la invención incluyen no sólo ácidos desoxirribonucleicos o ribonucleicos sino también poliamidas y otros materiales de sonda que se unen específicamente a una secuencia de ADN diana y la detección de tal unión puede ser útil para detectar la presencia o ausencia de la secuencia de ADN diana. Una sonda puede estar unida a una etiqueta detectable convencional o a una molécula informadora, tal como un isótopo radiactivo, un ligando, un agente quimioluminiscente o una enzima. Una secuencia de ADN ejemplar útil como sonda para detectar el evento de maíz MON87429 se proporciona como SEQ ID NO: 13 (PB50370).
Los procedimientos para diseñar y utilizar cebadores y sondas son bien conocidos en la técnica. Las moléculas de ADN que comprenden la longitud completa o fragmentos de SEQ ID NO:1-10 son útiles como cebadores y sondas para detectar el evento de maíz MON87429 y pueden ser diseñadas fácilmente por un experto en la materia utilizando las secuencias aquí proporcionadas.
Las sondas y cebadores según la invención pueden tener identidad de secuencia completa con la secuencia diana, aunque los cebadores y sondas que difieren de la secuencia diana que retienen la capacidad de hibridar preferentemente con secuencias diana pueden diseñarse por procedimientos convencionales. Para que una molécula de ácido nucleico sirva como cebador o sonda, sólo necesita ser suficientemente complementaria en secuencia para poder formar una estructura de doble cadena estable en las concentraciones particulares de disolvente y sal empleadas. Puede utilizarse cualquier procedimiento convencional de hibridación o amplificación de ácidos nucleicos para identificar la presencia de ADN transgénico del evento de maíz MON87429 en una muestra. Las sondas y los cebadores suelen tener al menos 11 nucleótidos, al menos 18 nucleótidos, al menos 24 nucleótidos o al menos 30 nucleótidos o más de longitud. Estas sondas y cebadores hibridan específicamente con una secuencia de ADN diana en condiciones de hibridación estrictas. Las condiciones de rigurosidad convencionales se describen en MR Green y J Sambrook, Molecular cloning: a laboratory manual, 4th Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012). Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, dos moléculas de ácido nucleico son capaces de hibridarse específicamente entre sí si las dos moléculas son capaces de formar una estructura de ácido nucleico de doble cadena antiparalela. Una molécula de ácido nucleico es el "complemento" de otra molécula de ácido nucleico si presentan una complementariedad completa. Tal y como se utiliza aquí, dos moléculas presentan "complementariedad completa" si cuando se alinean cada nucleótido de la primera molécula es complementario a cada nucleótido de la segunda molécula. Dos moléculas son "mínimamente complementarias" si pueden hibridarse entre sí con la estabilidad suficiente para permitir que permanezcan recocidas entre sí en condiciones al menos convencionales de "baja estringencia". Del mismo modo, las moléculas son "complementarias" si pueden hibridarse entre sí con la suficiente estabilidad como para permitir que permanezcan recocidas entre sí en condiciones convencionales de "alta estringencia". Por lo tanto, las desviaciones de la complementariedad completa son permisibles, siempre que dichas desviaciones no impidan completamente la capacidad de las moléculas para formar una estructura de doble cadena.
Las condiciones de rigurosidad adecuadas que promueven la hibridación del ADN, por ejemplo, 6,0 x cloruro sódico/citrato sódico (SSC) a aproximadamente 45°C, seguido de un lavado de 2,0 x SSC a 50°C, son conocidas por los expertos en la materia o pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Por ejemplo, la concentración de sal en la etapa de lavado puede seleccionarse desde una baja rigurosidad de aproximadamente 2,0 x SSC a 50°C hasta una alta rigurosidad de aproximadamente 0,2 x SSC a 50°C. Además, la temperatura en la etapa de lavado puede aumentarse desde condiciones de baja rigurosidad a temperatura ambiente, unos 22°C, hasta condiciones de alta rigurosidad a unos 65°C. Tanto la temperatura como la sal pueden variar, o bien la temperatura o la concentración de sal pueden mantenerse constantes mientras se modifica la otra variable.
Se proporcionan kits de detección de ácido nuclei
También pueden desarrollarse variaciones de tales kits utilizando las composiciones y procedimientos aquí divulgados y los procedimientos bien conocidos en el arte de la detección de ácidos nucleicos. Los kits de detección de ácidos nucleicos pueden aplicarse a procedimientos de obtención con plantas que contengan el evento de maíz MON87429. Dichos kits contienen cebadores o sondas que comprenden fragmentos de SEQ ID NO:1-10
Un ejemplo de kit de detección comprende al menos una molécula de ADN de longitud suficiente de nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 10 para funcionar como una sonda de ADN útil para detectar la presencia o ausencia del evento de maíz MON87429 en una muestra. Una molécula de ADN ejemplar suficiente para su uso como sonda es la que comprende la secuencia proporcionada como SEQ ID NO: 13. Un experto en la materia puede diseñar fácilmente otras sondas. Otro ejemplo de kit de detección comprende al menos un par de cebadores útiles para producir un amplicón útil para detectar la presencia o ausencia del evento de maíz MON87429 en una muestra. Tal procedimiento también puede incluir la secuenciación del amplicón o de un fragmento del mismo. Ejemplos de moléculas de ADN suficientes para su uso como par de cebadores son las que comprenden las secuencias SEQ ID NO:11 y SEQ ID NO: 12, respectivamente. Un experto en la materia puede diseñar fácilmente otros pares de cebadores. Los kits de la invención también pueden comprender opcionalmente reactivos para llevar a cabo las reacciones de detección o diagnóstico descritas en la presente memoria descriptiva.
La invención proporciona plantas de maíz, semillas, células y partes de plantas que contienen el evento de maíz MON87429, y productos básicos producidos utilizando los mismos. Las plantas, progenie, semillas, células, partes de plantas y productos básicos de la invención contienen una cantidad detectable de ADN que tiene al menos una de las secuencias proporcionadas como SEQ ID NO: 1-8 y SEQ ID NO: 10.
Las plantas, semillas, células y partes de plantas de la invención también pueden contener uno o más rasgos transgénicos adicionales, en particular los introducidos mediante el cruce de una planta de maíz que contiene el evento de maíz MON87429 con otra planta que contiene el/los rasgo(s) transgénico(s) adicional(es). Tales rasgos incluyen, pero no se limitan a, una mayor resistencia a los insectos, un mayor rendimiento, una mayor resistencia a la sequía, una mayor calidad de las semillas, una mejor calidad nutricional, la producción de semillas híbridas y/o mayor tolerancia a los herbicidas, en los que el rasgo se mide con respecto a una planta de maíz de tipo salvaje que carece de tal rasgo transgénico.
Las plantas de la invención pueden utilizarse para producir progenie que contenga el evento de maíz MON87429. Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, "progenie" incluye cualquier planta, semilla y célula que comprenda el evento de maíz MON87429 heredado de una planta ancestro, indicado por la planta que comprende una molécula de ADN que tiene al menos una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 1-8 y SEQ ID NO: 10. Las plantas, semillas y células pueden ser homocigóticas o heterocigóticas para el evento de maíz MON87429. Las plantas progenitoras podrán cultivarse a partir de semillas producidas por una planta de maíz que contenga el evento MON87429 o a partir de semillas producidas por una planta de maíz fertilizada con polen que contenga el evento MON87429.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, una "parte de planta" de la invención es cualquier parte de una planta que contenga el evento de maíz MON87429. Las partes de plantas incluyen, entre otras, muestras de tejidos, polen, óvulos, vainas, flores, raíces, tallos, fibras y hojas en su totalidad o en parte. Las partes de la planta pueden ser viables o no viables.
La invención proporciona un producto básico que se produce a partir de plantas que contienen el evento de maíz MON87429. Los productos básicos de la invención contienen una cantidad detectable de ADN que comprende una secuencia de ADN seleccionada desde el grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-8, y 10. Tal y como se utiliza en la presente memoria descriptiva, un "producto básico" se relaciona con cualquier composición o producto que esté compuesto por material de una planta transgénica, semilla, célula o parte de la planta que comprenda al evento de maíz MON87429. Los productos básicos incluyen, pero no se limitan, a las semillas procesadas, los granos, las partes de plantas y las harinas. Un producto básico de la invención contendrá una cantidad detectable de ADN correspondiente al evento de maíz MON87429. La detección de uno o varios de estos ADN en una muestra puede servir para determinar el contenido o el origen del producto básico. Puede utilizarse cualquier procedimiento estándar de detección de moléculas de ADN, incluidos los procedimientos de detección aquí descritos.
El evento de maíz MON87429 contiene cuatro casetes de expresión que juntos proporcionan tolerancia a los inhibidores de la acetil CoA carboxilasa (ACCasa) en el grupo del ariloxifenoxipropionato (FOP); auxinas sintéticas; inhibidores de la glutamina sintetasa; e inhibidores de la 5-enolpiruvilsiquimato-3-fosfato sintasa (EPSPS).
Tal como se utilizan en la presente memoria descriptiva, los inhibidores de la acetil CoA carboxilasa (ACCasa) del grupo ariloxifenoxipropionato (FOP) (denominados "herbicida(s) FOP") incluyen, entre otros, clodinafop, clodinafop-etil, clodinafop-propargil, cihalofop, cihalofop-butilo, diclofop, diclofop-metilo, diclofop-P, diclofop-P-metilo, fenoxaprop, fenoxaprop-P, fenoxaprop-P-etilo, fentiaprop, fluazifop, fluazifop-butilo, fluazifop-P, fluazifop-P-butilo, fluroxipir, haloxifop, haloxifop.etótilo, haloxifop-metilo, haloxifop-P, haloxifop-P-metilo, isoxapirifop, metamifop, propaquizafop, quizalofop, quizalafop-etilo, quizalofop-P, quizalafop-P-etilo, quizalafop-P-tefurilo y trifop.
Tal como se utilizan en la presente memoria descriptiva, las auxinas sintéticas incluyen, pero no se limitan a, herbicidas de ácido benzoico, herbicidas de ácido fenoxi, herbicidas de arilpicolinato y herbicidas de ácido piridiniloxi. Ejemplos de herbicidas de ácido benzoico incluyen, pero no se limitan a, dicamba (ácido 3,6-dicloro-2-metoxibenzoico), sales de dicamba, dicamba-butilo, sal de dicamba-diglicolamina, dicambadimetilamonio, dicamba-dietanolamonio, dicamba-isopropilamonio, dicambapotasio, dicamba-sodio y dicamba-trolamina. Ejemplos de herbicidas fenoxiácidos son el 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético), 2,4-D-butil, 2,4-D-butil, 2,4-D-colina, 2,4-D-dimetilamonio, 2,4-D-diolamina, 2,4-D-etil, 2,4-D-2-etilhexil, 2,4-D-isobutil, 2,4-D-isoctil, 2,4-D-isopropilo, 2,4-D-isopropilamonio, 2,4-D-potasio, 2,4-D-sodio, 2,4-D-triisopropanolamonio, 2,4-D-trolamina, clomeprop, diclorprop, fenoprop, MC<p>A, MCPA-butilo, MCPA-dimetilamonio, MCPA-2-etilhexilo. MCPA-isopropilamonio, MCPA-potasio, MCPA-sodio, MCPA-tioetilo, 2,4-DB, MCPB, MCPB-metilo, MCPB-etilsodio y mecoprop. Ejemplos de herbicidas de arilpicolinato son el halauxifeno, el halauxifeno-metilo y el florpirauxifenobencil. Algunos ejemplos de herbicidas con piridiniloxiácidos son el triclopir, el fluroxipir, el aminopiralid, el clopiralid y el picloram.
Como se usa en la presente memoria descriptiva, los inhibidores de la glutamina sintetasa incluyen, pero no se limitan a, fosfinotricina, glufosinato, sales de glufosinato, glufosinato-amonio, glufosinato-sodio, glufosinato-P, L-glufosinato-amonio y L-glufosinato-sodio.
Como se usa en la presente memoria descriptiva, los inhibidores de 5-enolpiruvilsiquimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) incluyen, pero no se limitan a, glifosato, sales de glifosato, glifosatoisopropilamonio, glifosato-amonio, glifosato-dimetilamonio, glifosatetrimesio (=sulfosato), glifosato-diamonio, glifosato-potasio y glifosato-sodio.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, "tolerante a herbicida" o "tolerancia a herbicida" o "tolerancia" significa la capacidad de no verse afectado total o parcialmente por la presencia o aplicación de uno o más herbicida(s), por ejemplo para resistir los efectos tóxicos de un herbicida cuando se aplica. Una célula, semilla o planta es "tolerante a herbicidas" o tiene "tolerancia mejorada" si puede mantener al menos parte del crecimiento o fenotipo normal en presencia de uno o más herbicidas. Un rasgo es un rasgo de tolerancia a herbicidas si su presencia puede conferir una tolerancia mejorada a un herbicida a una célula, planta o semilla en comparación con la célula, planta o semilla de tipo silvestre o de control. Los cultivos que presentan un rasgo de tolerancia a herbicidas pueden seguir creciendo en presencia del herbicida y pueden verse mínimamente afectados por la presencia del herbicida. Una proteína confiere "tolerancia a los herbicidas" si la expresión de la proteína puede conferir a una célula, planta o semilla una tolerancia mejorada a un herbicida en comparación con la célula, planta o semilla de tipo salvaje o de control. Ejemplos de proteínas de tolerancia a herbicidas son la fosfinotricina N-acetiltransferasa, la secuencia codificante de la dicamba monooxigenasa, la proteína FT_T y la secuencia codificante de la 5-enolpiruvilsiquimato-3-fosfato sintasa tolerante al glifosato de la cepa CP4 deAgrobacterium sp.La tolerancia a los herbicidas puede ser una insensibilidad total o parcial a un herbicida concreto, y puede expresarse como un porcentaje (%) de tolerancia o insensibilidad a un herbicida concreto.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, una "mala hierba" es cualquier planta no deseada. Una planta puede considerarse generalmente indeseable para fines agrícolas u hortícolas (por ejemplo, la especieAmaranthus)o puede considerarse indeseable en una situación particular (por ejemplo, una planta de cultivo de una especie en un campo de una especie diferente, también conocida como planta voluntaria). Las malas hierbas son comúnmente conocidas en la técnica y varían de acuerdo con la geografía, la estación, el entorno de cultivo y el tiempo. Las listas de especies de malas hierbas están disponibles en sociedades y esfuerzos agrícolas y científicos (tales como la Weed Science Society of America, la Canadian Weed Science Society, la Brazilian Weed Science Society, la International Weed Science Society y el International Survey of Herbicide Resistant Weeds), organismos gubernamentales (tales como el Departamento de Agricultura de Estados Unidos y el Departamento de Medio Ambiente y Energía de Australia) y asociaciones industriales y de agricultores (tales como la National Corn Growers Association).
La invención proporciona procedimientos para controlar las malas hierbas en una zona de cultivo de maíz aplicando al menos un herbicida seleccionado del grupo que consiste en (i) inhibidores de la acetil CoA carboxilasa (ACCasa) en el grupo ariloxifenoxipropionato (FOP) tales como quizalofop y haloxifop; (ii) auxinas sintéticas tales como dicamba y 2,4-D; (iii) inhibidores de la glutamina sintetasa, tales como el glufosinato, y (iv) el inhibidor de la 5-enolpiruvilsiquimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) glifosato, cuando se planten semillas o plantas de maíz del evento MON87429 en la zona antes, en el momento o después de aplicar el herbicida, y la aplicación del herbicida impida o inhiba el crecimiento de las malas hierbas y no dañe las plantas de maíz. La zona de crecimiento de la planta puede o no incluir plantas de malas hierbas en el momento de la aplicación del herbicida. El (los) herbicida(s) utilizado(s) en los procedimientos de la invención puede(n) aplicarse solo(s) o en combinación con uno o más herbicida(s) durante el periodo vegetativo. El (los) herbicida(s) utilizado(s) en los procedimientos de la invención puede(n) aplicarse en combinación con uno o más herbicida(s) temporalmente (por ejemplo, como una mezcla de tanque o en aplicaciones secuenciales), espacialmente (por ejemplo, en diferentes momentos durante la temporada de crecimiento, incluyendo antes y después de la siembra de semillas de maíz), o ambos. Por ejemplo, se proporciona un procedimiento para controlar las malas hierbas que consiste en plantar semillas que comprenden el evento de maíz MON87429 en una zona y aplicar una cantidad herbicida eficaz durante el período vegetativo de uno o más de los herbicidas dicamba, glufosinato, glifosato, 2,4-D, o un herbicida FOP, solo o en cualquier combinación con otro herbicida, con el fin de controlar las malas hierbas en la zona sin dañar las plantas que contienen el evento de maíz MON87429. Tal aplicación de herbicida(s) puede ser previa a la plantación (en cualquier momento antes de plantar semillas que contengan maíz del evento MON87429, incluso con fines de quema, es decir, aplicación a malas hierbas emergentes o existentes antes de plantar las semillas), previa a la emergencia (en cualquier momento después de plantar las semillas que contengan maíz del evento MON87429 y antes de que emerjan las plantas que contengan maíz del evento MON87429) o posterior a la emergencia (en cualquier momento después de que emerjan las plantas que contengan maíz del evento MON87429). Se pueden utilizar múltiples aplicaciones de uno o más herbicidas, o una combinación de herbicidas juntos o individualmente, a lo largo de una temporada de cultivo, por ejemplo, dos aplicaciones (tales como una aplicación previa a la plantación y una aplicación posterior a la emergencia, o una aplicación previa a la emergencia y una aplicación posterior a la emergencia) o tres o más aplicaciones (tales como una aplicación previa a la plantación y dos aplicaciones posteriores a la emergencia).
La aplicación del herbicida en práctica de los procedimientos de la invención puede ser la dosis comercial recomendada o cualquier fracción o múltiplo de la misma, tal como el doble de la dosis comercial recomendada . Las dosis de herbicida pueden expresarse como equivalente ácido por kilogramo por hectárea (kg ae/ha) o ingrediente activo por kilogramo por hectárea (kg ai/ha), dependiendo del herbicida y de la formulación. La aplicación del herbicida puede ser la dosis comercial recomendada o una fracción o múltiplo de la misma. El uso de acres en las dosis de aplicación de herbicidas de acuerdo con lo dispuesto aquí es meramente instructivo; las dosis de aplicación de herbicidas en las dosis equivalentes a cualquier dosis prevista aquí pueden utilizarse para áreas mayores o menores que un acre. La aplicación herbicida comprende al menos un herbicida seleccionado del grupo que consiste en (i) inhibidores de la acetil CoA carboxilasa (ACCasa) en el grupo del ariloxifenoxipropionato (FOP)tales como quizalofop y haloxifop; (ii) auxinas sintéticas como dicamba y 2,4-D; (iii) inhibidores de la glutamina sintetasa tales como glufosinato; y (iv) el inhibidor de la 5-enolpiruvilsiquimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) glifosato. La zona de crecimiento de la planta puede o no incluir plantas de malas hierbas en el momento de la aplicación del herbicida. Una cantidad herbicida eficaz de los herbicidas FOP utilizada en la zona para controlar las malas hierbas debe oscilar entre 0,01 kg ai/ha y 1,12 kg ai/ha durante un período vegetativo (por ejemplo, el quizalofop puede aplicarse a una dosis de 0,04 kg ai/ha a 0,09 kg ai/ha y el haloxifop a una dosis de 0,02 kg ai/ha a 0,08 kg ai/ha).02 kg ai/ha a aproximadamente 0,08 kg ai/ha Una cantidad herbicida eficaz de los herbicidas de auxina sintética fenoxiácidos para su uso en la zona para el control de las malas hierbas debe consistir en un intervalo de aproximadamente 0,11 kg ae/ha a aproximadamente 11,21 kg ae/ha durante un período vegetativo (por ejemplo, el 2,4-D podría aplicarse a una dosis de aproximadamente 0,84 kg ae/ha a 1,1 kg ae/ha). Una cantidad herbicida eficaz de los herbicidas de auxina sintética piridiniloxiácidos para su uso en la zona para controlar las malas hierbas debe consistir en un intervalo de aproximadamente 0,06 kg ae/ha a aproximadamente 5,6 kg ae/ha durante una temporada de crecimiento (por ejemplo, fluroxipir podría aplicarse a una tasa de aproximadamente 0,16 kg ae/ha a aproximadamente 0,55 kg ae/ha). Una cantidad herbicida eficaz de un herbicida de ácido benzoico auxina sintética para su uso en la zona para el control de las malas hierbas debe consistir en un rango de alrededor de 0,11 kg ae/ha a tanto como alrededor de 17,93 ae/ha durante una temporada de crecimiento (por ejemplo, dicamba podría aplicarse a una tasa de alrededor de 0,56 kg ae/ha a alrededor de 2,24 kg ae/ha. Una cantidad herbicida eficaz de inhibidores de la glutamina sintetasa para su uso en la zona para el control de las malas hierbas debe consistir en un intervalo de aproximadamente 0,11 kg ae/ha a tanto como aproximadamente 11,21 kg ae/ha durante una temporada de crecimiento (por ejemplo, el glufosinato podría aplicarse a una tasa de aproximadamente 0,45 kg ai/ha a aproximadamente 1,78 kg ai/ha). Una cantidad herbicida eficaz de inhibidores de EPSPS para su uso en la zona para controlar las malas hierbas debe consistir en un intervalo de aproximadamente 0,56 kg ae/ha a aproximadamente 13,45 kg ae/ha durante una temporada de crecimiento (por ejemplo, el glifosato podría aplicarse a una tasa de aproximadamente 0,84 kg ae/ha a aproximadamente 2,52 kg ae/ha).
La invención proporciona procedimientos para controlar el maíz voluntario que comprende el evento de maíz MON87429 en una zona de cultivo aplicando una cantidad herbicida eficaz de al menos un herbicida de ciclohexanodiona (DIM), tal como cletodim, setoxidim y tralcoxidim, donde la aplicación del herbicida impide el crecimiento del maíz que comprende el evento de maíz MON87429. Una cantidad herbicida eficaz de un herbicida DIM para su uso en la zona para controlar el maíz voluntario podría aplicarse a una dosis de aproximadamente 0,03 kg ai/ha a aproximadamente 3,08 kg ai/ha durante un período vegetativo (por ejemplo, cletodim podría aplicarse de aproximadamente 0,07 kg ai/ha a aproximadamente 0,14 kg ai/ha y setoxidim podría aplicarse de aproximadamente 0,21 kg ai/ha a aproximadamente 0,31 kg ai/ha).
Se describen procedimientos para producir plantas y semillas que contienen el evento de maíz MON87429. Las plantas pueden criarse utilizando cualquier procedimiento conocido en la técnica, por ejemplo, pueden encontrarse descripciones de procedimientos de cría que se utilizan habitualmente en WR Fehr, in Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison WI (1987). Las plantas pueden ser autógamas (también conocidas como "autógamas") o alógamas (también conocidas como "cruzadas"). Las plantas que contengan el evento de maíz MON87429 pueden autopolinizarse para generar una verdadera línea de reproducción de plantas homocigóticas para el evento de maíz MON87429. La autofecundación da lugar a una progenie denominada "endogámica" y puede utilizarse para producir líneas endogámicas genéticamente uniformes. Alternativamente, las plantas que contengan el evento de maíz MON87429 pueden ser objeto de polinización cruzada (cruzadas con otra planta transgénica o no transgénica) para producir una semilla varietal o híbrida. Las semillas y plantas progenitoras obtenidas por los procedimientos de la invención contienen el evento de maíz MON87429. La aplicación de uno o más herbicidas a los que el maíz del evento MON87429 confiera tolerancia podrá utilizarse para seleccionar progenie que contenga maíz del evento MON87429. Alternativamente, la progenie puede analizarse utilizando procedimientos de diagnóstico para seleccionar plantas o semillas que contengan el evento de maíz MON87429. La progenie puede ser plantas varietales o híbridas; puede cultivarse a partir de semillas producidas por una planta que contenga el evento de maíz MON87429 o a partir de semillas producidas por una planta fertilizada con polen de una planta que contenga el evento de maíz MON87429; y puede ser homocigótica o heterocigótica para el evento de maíz MON87429.
Se proporcionan procedimientos para la esterilidad masculina utilizando el evento de maíz MON87429. Las plantas que comprenden el evento de maíz MON87429 tienen expresión de la proteína CP4-EPSPS tolerante al glifosato en todos los tejidos excepto en los tejidos reproductores masculinos. El resultado es la tolerancia al glifosato en los tejidos vegetativos y reproductivos femeninos y la sensibilidad al glifosato en los tejidos reproductivos masculinos. Esta sensibilidad al glifosato puede utilizarse para inducir la esterilidad masculina mediante la aplicación adecuada de glifosato. El glifosato es un herbicida sistémico que se transloca de los tejidos fuente a los tejidos sumidero de las plantas. Debido a la tasa de metabolismo del glifosato en el maíz, la aplicación a plantas que contengan el evento de maíz MON87429 antes del desarrollo del tejido reproductor masculino puede impedir el desarrollo del polen, el desprendimiento del polen o la extrusión de las anteras. Esta esterilidad masculina inducida por el glifosato puede utilizarse para aumentar la eficiencia de la producción de semillas híbridas, por ejemplo eliminando o reduciendo la necesidad de emascular físicamente la planta de maíz utilizada como hembra en un cruce dado durante la producción de semillas híbridas.
La invención proporciona un procedimiento de inducción de esterilidad masculina en una planta de maíz que comprende (a) cultivar una planta que comprende el evento de maíz MON87429, y (b) aplicar una cantidad eficaz de glifosato a la planta para inducir esterilidad masculina, en el que la aplicación del herbicida es anterior o durante el desarrollo del tejido reproductor masculino de la planta induciendo así esterilidad masculina en la planta. En una realización, el glifosato se aplica antes o durante el desarrollo en una cantidad eficaz de aproximadamente 0,28 kg ae/ha a aproximadamente 12,33 kg ae/ha en total, aplicado en una o más aplicaciones.Enotra realización, la etapa de fecundación puede llevarse a cabo permitiendo la fecundación pasiva (por ejemplo mediante polinización por el viento), por otros medios tales como polinización mecánica o manual, o mediante una combinación de los mismos. La aplicación del herbicida puede realizarse en una o más aplicaciones antes o durante el desarrollo del tejido reproductor masculino, tal como en una fase seleccionada del grupo que consiste en las fases V4, V5, V6, V7, V8, V9, V10, V11, V12, V13 y V14 del desarrollo de la planta de maíz, y puede impedir al menos el desarrollo del polen, el desprendimiento del polen o la extrusión de las anteras. La esterilidad masculina puede ser parcial o completa. En una realización, la cantidad efectiva de glifosato sería de unos 0,56 kg ae/ha a unos 2,8 kg ae/ha en total (en una aplicación o dividida en dos o más aplicaciones) aplicada en la fase V4 a V8 o hasta 100 unidades de grado de crecimiento (UGC) antes de la floración.
Las plantas, la progenie, las semillas, las células y las partes de plantas descritas en la presente memoria descriptiva también pueden contener uno o más rasgo(s) de maíz o eventos transgénicos adicionales, en particular los introducidos mediante el cruce de una planta de maíz que contiene el evento de maíz MON87429 con otra planta de maíz que contiene el rasgo o los eventos transgénicos adicionales. Tal(es) rasgo(s) transgénico(s) adicional(es) incluye(n), pero no se limitan a, una mayor resistencia a los insectos, una mayor eficiencia en el uso del agua, un mayor rendimiento, una mayor resistencia a la sequía, una mayor calidad de las semillas, una mejor calidad nutricional, la producción de semillas híbridas y la tolerancia a los herbicidas, en los que el rasgo se mide con respecto a una planta de maíz que carece de tal rasgo transgénico. Eventos transgénicos de maíz son conocidos por los expertos en la materia; por ejemplo, el Servicio de Inspección de Sanidad Animal y Vegetal (APHIS) del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA) proporciona una lista de tales rasgos y pueden ser encontradas en sus sitios web en www.aphis.usda.gov. De este modo, pueden combinarse dos o más eventos transgénicos en una semilla o planta progenitora cruzando dos plantas progenitoras que contengan cada una uno o más eventos transgénicos, recogiendo la semilla progenitora y seleccionando las semillas o plantas progenitoras que contengan los dos o más eventos transgénicos; estas etapas pueden repetirse hasta que se consiga la combinación deseada de eventos transgénicos en una progenie. También se contempla el retrocruzamiento con una planta parental y el retrocruzamiento con una planta no transgénica, así como la propagación vegetativa.
De conformidad con el Tratado de Budapest, se ha depositado una muestra representativa de semillas del evento de maíz MON87429 en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC®) con dirección en 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia USA, Código Postal 20110. La designación de depósito de patente ATCC (número de acceso) para las semillas que comprenden el evento de maíz MON87429 es<p>TA-124635 y la fecha de depósito fue el 12 de enero de 2018. El depósito se mantendrá en el depositario durante un periodo de 30 años, o 5 años después de la última solicitud, o durante la vida efectiva de la patente, si este periodo es más largo.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, el término "que comprende" significa "que incluye pero no se limita a".
Ejemplos
Los siguientes ejemplos resumen la construcción y prueba de treinta y cinco construcciones de expresión, la producción de más de quince mil eventos únicos y el análisis de cientos de miles de plantas individuales durante siete años a través de las rigurosas pruebas moleculares, agronómicas y de campo necesarias para la creación y selección final del evento de maíz MON87429.
Debe ser apreciado por aquellos de habilidad en el arte que se pueden hacer muchas modificaciones en los ejemplos específicos que se desvelan y aún obtener un resultado similar. Ciertos agentes relacionados química y fisiológicamente pueden ser sustituidos por los agentes descritos en la presente memoria descriptiva, obteniendo los mismos o similares resultados.
Ejemplo 1: Pruebas de casetes de expresión, diseño de constructos y pruebas en plantas R0
Este ejemplo describe el diseño y ensayo en plantas de maíz de treinta y cinco constructos diferentes. Cada construcción contenía cuatro casetes de expresión, cada uno de los cuales se utilizaba para expresar un transgén diferente. Estas pruebas se realizaron con el fin de seleccionar la mejor construcción para expresar los cuatro transgenes en el maíz. Cada construcción tenía una configuración única, que variaba de acuerdo con la orientación del casete de expresión y los elementos de expresión.
Se diseñaron varios casetes de expresión individuales con diferentes combinaciones de elementos de expresión y transgenes, se clonaron en vectores de transformación de plantas y se probaron para eficacia de rasgo en plantas de maíz para crear un conjunto de los mejores casetes de expresión individuales. Utilizando este conjunto de casetes de expresión individuales, se diseñaron 35 construcciones diferentes de forma que cada una contuviera cuatro casetes de expresión (cada casete de expresión con el transgén para PAT, DMO, CP4-EPSPS o FT) y pudiera utilizarse para probar la combinación cuádruple de los diferentes casetes de expresión. Las combinaciones de casetes de expresión variaban en función de los elementos de expresión, la secuencia de codificación de proteínas y la orientación. El resultado fue el ensayo de dos casetes de expresión PAT, 6 casetes de expresión DMO, 5 casetes de expresión FT, 18 casetes de expresión CP4-EPSPS.
Las 35 construcciones de cuatro casetes de expresión se clonaron en vectores de transformación de plantas, y estos vectores se usaron para la transformación mediada porAgrobacteriumde embriones inmaduros de maíz LH244 usando procedimientos conocidos en la técnica para producir 15 326 eventos de transformación únicos, cada uno realizado por una inserción aleatoria del inserto de transgén en el genoma de maíz. A continuación, se regeneraron plantas R0 a partir de las células transgénicas, y las plantas enraizadas con características fenotípicas normales se transfirieron al suelo para su crecimiento y posterior evaluación.
Las 15,326 plantas R0 se analizaron para tener una única copia del inserto transgénico y ausencia de secuencia de la columna vertebral del vector. Las plantas con una sola copia del inserto se adelantaron para las pruebas de eficacia de tolerancia a herbicidas. En el invernadero se evaluó la tolerancia de las plantas de copia única R0 al quizalofop (0,18 kg ai/ac del herbicida Assure II®) seguido de una mezcla de tanque de glufosinato (1,1 kg ae/ha del herbicida Ignite® 280), dicamba (2,24 kg ae/ha del herbicida Clarity®), o 2,4-D (2,24 kg ae/ha del herbicida 2,4-D Amine 4®) (o una combinación de cualquiera de ellos) pulverizado en la fase de crecimiento V1/V2. Se descartaron las plantas que mostraban una lesión superior al 30%.
De los 15.326 eventos de transformación únicos iniciales producidos usando los 35 vectores de transformación, se seleccionaron 1.945 eventos únicos después de analizar los datos de número de copias y pulverización de herbicida. Los datos están provistos en la Tabla 2. Las plantas R0 de los eventos seleccionados se autopolinizaron para producir semillas R1 o se cruzaron para producir semillas F1 que se adelantaron a los ensayos de campo de la primera temporada.
Tabla 2: Ensayo de campo de primera temporada de eficacia endogámica
Ejemplo 2: Pruebas de campo de la primera temporada
Se realizaron ensayos de campo durante muchos años con eventos avanzados del análisis R0 para cada una de las 35 construcciones, y el rendimiento de cada planta para cada construcción en su primera temporada de ensayos de campo se analizó entonces como un conjunto. Así, cada constructo estaba representado por muchos eventos únicos. Esto permitió probar un mayor número de constructos en los ensayos de campo de la primera temporada, al tiempo que sólo se avanzaba más allá del ensayo de la primera temporada con los constructos de mayor rendimiento. Se llevaron a cabo ensayos de campo de primera temporada por separado con plantas R2 (homocigóticas para cada evento) para (1) la eficacia endogámica para la tolerancia a glufosinato+dicamba, quizalofop, y 2,4-D, (2) la eficacia del Sistema de Hibridación Roundup (SHR), y (3) pruebas de presión herbicida para la tolerancia a mayores dosis de aplicación de los herbicidas quizalofop, 2,4-D, glufosinato, y dicamba.
Se llevó a cabo un cribado de eficacia endogámica de plantas para evaluar la tolerancia a herbicidas para glufosinato+dicamba, quizalofop y 2,4-D. Los tratamientos herbicidas consistieron en: una aplicación en mezcla de tanque de glufosinato a 0,9 kg ai/ha más dicamba a 2,24 kg ae/ha; quizalofop a 0,18 kg ai/ha; o 2,4-D a 2,24 kg ai/ha. A los 10-14 días del tratamiento herbicida, las parcelas se evaluaron visualmente en función de los daños sufridos por el cultivo, en una escala de 0-100, siendo "0" la ausencia de daños y "100" la destrucción completa del cultivo. También se recogieron datos sobre la altura de la planta (AP), la altura de la espiga (AE), los días hasta el 50% de seda (D50S), los días hasta el 50% de polen (D50P), el peso de la cáscara (PC), el peso hectolítrico (PH), la humedad (HUM) y el rendimiento en grano (REG). Todos los datos se sometieron a análisis de varianza y separación de medias a p<0,05. Se utilizaron los promedios globales de varias plantas que contenían el mismo evento, y la eficacia endogámica se resumió para glufosinato+dicamba, quizalofop y 2,4-D como excelente (4), buena (3), regular (2) o mala (1) o no aplicable (NA). Los datos están provistos en la Tabla 3.
Tabla 3: Ensayo de campo de primera temporada de eficacia endogámica
Se llevó a cabo un cribado de eficacia SHR de plantas para identificar diferencias en la tolerancia al glifosato y la esterilidad de la borla inducida por glifosato del material endogámico. Se utilizó un único tratamiento herbicida para el cribado y consistió en glifosato a 1,5 kg ae/ha aplicado a V2 seguido de 0,84 kg ae/ a aproximadamente V8 (875 grados-día de crecimiento) seguido de aproximadamente V10 (1025 grados-día de crecimiento). Las parcelas se evaluaron visualmente para determinar el % de daños en el cultivo (CIPV2, CIPV8, CIPV10 y CIPVT) 10-14 días después de la aplicación del herbicida en una escala de 0 a 100, más una calificación final de daños en VT (después de la emergencia de la borla). En las parcelas también se evaluó visualmente el % de emergencia de seda [(SES9A (S90) y SES9C (S90 más 4 días) SES9E (S90 más 8 días)] y el % de extrusión de anteras [(AES9A (S90), AES9C (S90 más 4 días), y AES9E (S90 más 8 días)] en una escala similar de 0 a 100, siendo "0" ausencia de emergencia de seda o extrusión de anteras y "100" emergencia completa de seda o extrusión de anteras. Se recogieron otros parámetros agronómicos, como en la pantalla de eficacia endogámica. Se utilizaron los promedios globales de varias plantas que contenían el mismo evento, y la tolerancia al glifosato, la esterilidad de la borla y el rendimiento se resumieron cada uno como excelente (4), bueno (3), regular (2) o pobre (1) o no aplicable (NA). Los datos están provistos en la Tabla 4.
Tabla 4: Ensayo de campo de primera temporada de eficacia SHR
Se realizó una prueba de presión de herbicidas para evaluar la tolerancia de los cultivos a nivel de construcción a tasas de aplicación más altas de herbicidas quizalofop, 2,4-D, glufosinato y dicamba como sigue. Los tratamientos de Quizalofop consistieron en: 1) quizalofop a kg ai/ha (4X) más 0,25% v/v de tensioactivo no iónico (SNI) aplicado a VE-V2 seguido de V4 seguido de V8; 2) quizalofop a 0,72 ai/ha (8X) más 0,25% v/v de NIS aplicado a VE-V2 seguido de V4 seguido de V8; o 3) quizalofop a 1,43 kg ai/ha (16X) más 0,25% v/v de NIS aplicado a VE-V2 seguido de V4 seguido de V8. Los tratamientos con 2,4-D consistieron en 1) 2,4-D amina a 2,24 kg ai/ha más 0,25% v/v de tensioactivo no iónico (NIS) aplicado a VE-V2 seguido de V4 seguido de V8; 2) 2,4-D amina a 4,48 kg ai/ha más 025% v/v de NIS aplicado a VE-V2 seguido de V4 seguido de V8; 3) 2,4-D amina a 8,97 kg ai/ha más 0,25% v/v de NIS aplicado a VE-V2 seguido de V4 seguido de V8; o 4) 2,4-D amina a 17,93 kg ai/ha más 0,25% v/v de NIS aplicado a VE-V2 seguido de V4 seguido de V8. Los tratamientos con glufosinato consistieron en: 1) glufosinato 1,12 kg ai/ha aplicado a V2 seguido de V4 seguido de V8; 2) glufosinato 2,24 kg ai/ha aplicado a V2 seguido de V4 seguido de V8; 3) glufosinato 4,48 kg ai/ha aplicado a V2 seguido de V4 seguido de V8; o 4) glufosinato 8,97 kg ai/ha aplicado a V2 seguido de V4 seguido de V8. Los tratamientos con Dicamba consistieron en: 1) dicamba a 2,24 kg/ha aplicado a V2 seguido de V4 seguido de V8; 2) dicamba a 4,48 kg/ha aplicado a V2 seguido de V4 seguido de V8; o 3) dicamba a 8,97 kg/ha aplicado a V2 seguido de V4 seguido de V8. 4) dicamba a 17,93 kg/ha aplicado a V2 seguido de V4 seguido de V8. Las parcelas se evaluaron visualmente en cuanto a daños en el cultivo y se recogieron parámetros agronómicos, como en el análisis de eficacia de las variedades endocriadas. Se utilizaron promedios globales para múltiples plantas que contenían el mismo evento, y la eficacia de tolerancia al herbicida se resumió para cada uno de los cuatro herbicidas como excelente (4), buena (3), regular (2), o pobre (1) o no aplicable (NA). Los datos están provistos en la Tabla 5.
Tabla 5: Prueba de presión de herbicidas en ensayos de campo de primera temporada
Los datos del rendimiento compuesto de las plantas R2 producidas con cada una de las 35 construcciones se recopilaron y analizaron para (1) la prueba de eficacia endogámica para la tolerancia a glufosinato+dicamba, quizalofop y 2,4-D, (2) la prueba de eficacia SHR para la tolerancia al glifosato, la esterilidad de la borla y el rendimiento, y (3) la prueba de presión de herbicidas para la tolerancia a mayores dosis de aplicación de los herbicidas quizalofop, 2,4-D, glufosinato y dicamba. A partir de estos datos, se seleccionaron 3 construcciones (HT4-14, HT4-32 y HT4-34) de entre las 35 probadas. A continuación, los eventos de estas 3 construcciones pasaron a los ensayos de campo de la segunda temporada.
Ejemplo 3: Análisis molecular
El análisis molecular se realizó simultáneamente con los ensayos de campo en los eventos que estaban avanzados. La amplificación y secuenciación del ADN se utilizaron para confirmar la secuencia del inserto, el número de copias y la ausencia de columna vertebral en el inserto. Se cartografió el lugar de inserción de cada evento en el genoma del maíz. Se realizaron análisis Northern para detectar y medir los transcritos de ARNm de los genespat, dmo, ft_t,ycp4-epsps. Se realizó la secuenciación proteica N-terminal de las proteínas PAT, DMO, FT_T y CP4-EPSPS purificadas a partir de plantas transgénicas para confirmar la secuencia de la proteína recombinante. El análisis Western blot para detectar las proteínas<p>A<t>, DMO, FT_T y CP4-EPSPS se realizó con muestras de plantas transgénicas. Se realizó un análisis Southern en profundidad del ADN genómico de las plantas R1 para confirmar el número de copias y la ausencia de columna vertebral.
Ejemplo 4: Pruebas de campo avanzadas
Se realizaron ensayos de campo avanzados (ensayos de segunda temporada y posteriores) durante muchos años con eventos avanzados de los ensayos de campo de primera temporada para las construcciones HT4-14, HT4-32 y HT4-34. El rendimiento de muchas plantas individuales para cada evento en cada ensayo de campo se analizó como un conjunto. Así, cada acontecimiento estaba representado por muchas plantas únicas. Esto permitió analizar el rendimiento de cada evento en muchas condiciones, en diferentes lugares y geografías, y para una variedad de propiedades.
Se realizaron ensayos de campo con plantas endocriadas (homocigóticas para el evento) y plantas híbridas (hemicigóticas para el evento) para evaluar (1) la eficacia del rasgo para tasas comerciales de glufosinato, dicamba, quizalofop, y 2,4-D, (2) el rendimiento agronómico, (3) la eficacia del Sistema de Hibridación Roundup (SHR) y el glifosato, y (4) las pruebas de presión de herbicidas para la tolerancia a mayores dosis de aplicación de los herbicidas quizalofop, 2,4-D, glufosinato y dicamba.
En los ensayos de la Temporada de Campo 1, se ensayaron 30 eventos para la construcción HT4-14, 41 eventos para la construcción HT4-32 y 21 eventos para la construcción HT4-34. A partir de los datos compuestos de estos ensayos, se seleccionaron los eventos para su avance. En los ensayos de la temporada de campo 2, se probaron 15 eventos para la construcción HT4-14, 38 eventos para la construcción HT4-32 y 38 eventos para la construcción HT4-34 (este número incluía algunos eventos no probados en la temporada de campo 1 debido a la escasez de semillas durante esa temporada). Los eventos para la construcción HT4-14 se caracterizaron mediante análisis molecular como se describe en el Ejemplo 3 y estos datos también se utilizaron para seleccionar eventos. Los datos compuestos de estos ensayos y la caracterización molecular en profundidad de los eventos para el constructo HT4-14 se utilizaron para seleccionar 3 eventos para el avance del constructo HT4-14. Los datos compuestos de estos ensayos se utilizaron para seleccionar 24 eventos para el avance del constructo HT4-32 y para decidir no avanzar ningún evento para el constructo HT4-34. En los ensayos de la temporada de campo 3, se probaron los 3 eventos de la construcción HT4-14 y los 24 eventos de la construcción HT4-34. Los datos compuestos de estos ensayos se utilizaron para seleccionar 2 eventos para el avance del constructo HT4-14 y para decidir no avanzar ningún evento para el HT4-32. Los ensayos de la Temporada de Campo 4 se utilizaron para comparar los dos eventos finales en un gran número de localizaciones, bajo una variedad de condiciones y en germoplasma híbrido y endogámico con el fin de producir los datos necesarios para seleccionar el evento superior. La tabla 6 proporciona el número de eventos únicos probados para cada construcción en los ensayos de campo realizados durante cada temporada.
Tabla 6: Sumario de los ensayos de campo avanzados
Los ensayos de campo de rendimiento agronómico se realizaron durante la misma temporada que los ensayos de campo de eficacia de rasgos. Todos los ensayos de campo utilizaron un diseño de bloques completos aleatorizados y se realizaron en varios lugares. Se realizaron pruebas de campo en lugares de Norteamérica y Sudamérica. Tanto en los ensayos de campo de eficacia como en los agronómicos, la puntuación agronómica se recogió a lo largo de la temporada del ensayo de campo, y al final de la temporada se determinó el rendimiento (rendimiento de eficacia o rendimiento agronómico). Se realizaron ensayos de campo de eficacia para evaluar los daños en los cultivos entre 10 y 14 días después de la aplicación del herbicida. El objetivo de daño a los cultivos era una puntuación inferior al 10% para el avance de un evento. Para los ensayos agronómicos de campo, las parcelas se mantuvieron libres de malas hierbas y no se aplicó ninguno de los herbicidas de ensayo durante el periodo vegetativo. Los ensayos agronómicos de campo de los híbridos incluyeron controles de un híbrido comparable (híbrido de control) producido utilizando las mismas líneas parentales de maíz utilizadas para realizar el cruce híbrido transgénico, pero que no contenían un evento transgénico. Los controles consanguíneos eran una línea consanguínea comparable a las líneas consanguíneas transgénicas.
Para comparar los datos de los ensayos de campo, se realizó un metaanálisis utilizando el agregado de todas las plantas en los datos de los ensayos de campo multitemporada y multiubicación. A modo de ejemplo, la Tabla 7 ilustra, a lo largo de varias temporadas, el número de réplicas (reps) en las que se repitió una observación para dos eventos HT4-14 seleccionados y el número total de plantas individuales analizadas en cada ensayo para cada evento.
Tabla 7: Réplicas del ensayo de campo
Se completó el metaanálisis de los múltiples ensayos de campo de eficacia híbrida para la comparación de las calificaciones de lesiones híbridas. Como ejemplo, la Tabla 8 proporciona la calificación de daño a lo largo de múltiples temporadas para dos eventos HT4-14 seleccionados calificados en V8 (en los que el análisis V8 abarca el daño acumulado de las aplicaciones de herbicidas V2, V4, V6 y V8) con una diferencia estadística mínima significativa a un nivel de confianza del 95% (LSD a p<0,05). Tanto las plantas que contenían maíz del evento MON87429 como las que contenían el evento 2 obtuvieron buenos resultados en estos ensayos.
Tabla 8: Metaanálisis del índice de lesiones de los ensayos de campo de eficacia híbrida
Se completó el metaanálisis de los ensayos de campo de eficacia de híbridos múltiples para la comparación del rendimiento como bushels/acre (Bu/ac). Como ejemplo, la Tabla 9 proporciona el rendimiento de los híbridos a lo largo de varias temporadas para dos eventos HT4-14 seleccionados con una diferencia estadística mínima significativa a un nivel de confianza del 95% (LSD a p<0,05). Tanto las plantas que contenían maíz del evento MON87429 como las que contenían el evento 2 obtuvieron buenos resultados en estos ensayos.
Tabla 9: Metaanálisis del rendimiento de los ensayos de campo sobre la eficacia de los híbridos
Se realizaron ensayos de campo de pruebas de presión con herbicida aplicado a tasas de aplicación superiores a las de uso comercial con plantas híbridas y endogámicas que contenían un único evento transgénico. Se aplicaron los herbicidas glufosinato (entre 1,79 y 7,17 kg ai/ha), dicamba (entre 2,24 y 17,93 ai/ha), quizalofop (entre 0,36 y 1,43 kg ai/ha) 2,4-D (en un intervalo de 2,24 a 8,97 kg ai/ha) y glifosato (a 3,36 kg ae/ha) en las pruebas de campo para pruebas de presión de la eficacia de los rasgos de la tolerancia a herbicidas. Al final de la temporada, se cosecharon los ensayos de campo de prueba de presión de híbridos y se determinó el rendimiento (Bu/ac). Como ejemplo, la Tabla 10 proporciona datos de rendimiento de híbridos y endogamias en diferentes ensayos para dos eventos HT4-14 seleccionados con una diferencia estadística mínima significativa a un nivel de confianza del 95% (LSD a p<0,05). Tanto las plantas con el evento de maíz MON87429 como las plantas con el evento 2 obtuvieron buenos resultados en los ensayos de rendimiento de híbridos y endogámicos en todos los tratamientos con herbicidas. Los resultados sugieren que nuevas pruebas de campo podrían identificar una ventaja en el rendimiento del maíz endogámico del evento MON87429 sobre el Evento 2.
Tabla 10: Rendimiento de los ensayos de campo de eficacia de las pruebas de presión de híbridos/razas
Se realizaron ensayos de campo agronómicos híbridos, se recogieron medidas agronómicas a lo largo de la temporada y se determinó el rendimiento agronómico al final de la temporada. Para comparar el rendimiento de los híbridos de control y de los híbridos se utilizó un metaanálisis de los ensayos agronómicos de campo con híbridos de varias estaciones y ubicaciones. A modo de ejemplo, la Tabla 11 proporciona datos de rendimiento (Bu/ac) para dos eventos HT4-14 seleccionados con una diferencia estadística mínima significativa a un nivel de confianza del 95% (LSD a p<0,05). Las plantas que contenían el evento de maíz MON87429 y las plantas que contenían el evento 2 obtuvieron buenos resultados en estos ensayos, y no se encontraron diferencias estadísticas en el rendimiento híbrido de las plantas que contenían cualquiera de estos eventos en comparación con las plantas de control.
Tabla 11: Metaanálisis del rendimiento de los ensayos agronómicos de híbridos en el campo
Se realizaron ensayos de campo de eficacia endogámica para la tolerancia al glifosato y el Sistema de Hibridación Roundup (SHR) y se determinó el rendimiento al final de la temporada. Se aplicó glifosato a una dosis de 1,68 kg ae/ha para el control de las malas hierbas, seguida de dos aplicaciones de esterilidad de glifosato a 0,84 kg ae/ha aproximadamente en V8, seguidas de 0,84 kg ae/ha aproximadamente en V10. Para comparar el rendimiento de las plantas se utilizó el metaanálisis de los ensayos de campo de eficacia endogámica en varias estaciones y ubicaciones. A modo de ejemplo, la Tabla 12 proporciona datos de rendimiento (Bu/ac) para dos eventos HT4-14 seleccionados con una diferencia estadística mínima significativa a un nivel de confianza del 95% (LSD a p<0,05). Los ensayos de las temporadas de campo 2 y 3 mostraron una disminución estadísticamente significativa en el rendimiento de las plantas que contenían el evento 2 en comparación con las plantas que contenían el evento MON87429. Estos datos indicaban el rendimiento superior en los ensayos de rendimiento de eficacia endogámica de las plantas que contenían el evento de maíz MON87429.
Tabla 12: Meta-análisis del rendimiento de los ensayos de campo de eficacia endogámica tratados con glifosato
Se realizaron ensayos de campo agronómicos endogámicos y se determinó el rendimiento al final de la temporada para plantas no tratadas. Los ensayos incluyeron controles de líneas endógamas comparables a las líneas endógamas transgénicas. Se llevó a cabo un metaanálisis de los ensayos agronómicos de razas endocriadas en varias estaciones y ubicaciones, comparando el rendimiento del control emparejado con el de las razas endocriadas transgénicas. A modo de ejemplo, la Tabla 13 proporciona datos de rendimiento (Bu/ac) para dos eventos HT4-14 seleccionados con una diferencia estadística mínima significativa a un nivel de confianza del 95% (LSD a p<0,05). No se encontraron diferencias estadísticas en el rendimiento agronómico endogámico entre las plantas de control y las plantas que contenían el evento de maíz MON87429. En cambio, en los ensayos de la temporada de campo 3, hubo una disminución estadísticamente significativa del rendimiento en las plantas que contenían el evento 2 en comparación con las plantas de control y las plantas que contenían el evento de maíz MON87429. Estos datos indicaban el rendimiento superior en los ensayos de rendimiento agronómico endogámico de las plantas que contenían el evento de maíz MON87429.
Tabla 13: Metaanálisis del rendimiento de los ensayos agronómicos de campo de variedades endocriadas
Se realizaron ensayos de eficacia de híbridos en cuatro localidades de Argentina para evaluar la tolerancia de las plantas a glufosinato, dicamba, quizalofop, haloxifop, 2,4-D y glifosato. Las plantas que contenían MON87429 se cruzaron con plantas que contenían tanto el evento de maíz MON88017 como el evento de maíz MON89034 para producir progenie que contenía los tres eventos (MON87429 x MON88017 x MON89034). Los tratamientos herbicidas consistieron en 1) un control no tratado; 2) glufosinato a 0,448 kg ai/ha aplicado en la fase V2 seguido de la misma aplicación en la fase V6; 3) glufosinato a 0,896 kg ai/ha aplicado en la fase V2 seguido de la misma aplicación en la fase V6; 4) dicamba a 0,63 kg ae/ha aplicado en la fase V2 seguido de la misma aplicación en la fase V6; 5) dicamba a 1,26 kg ae/ha aplicado en la fase V2 seguido de la misma aplicación en la fase V6.63 kg ae/ha en la fase V2, seguido de la misma aplicación en la fase V6; 5) dicamba a 1,26 kg ae/ha en la fase V2, seguido de la misma aplicación en la fase<v>6; 6) quizalofop a 0,09 kg ae/ha en la fase V2, seguido de la misma aplicación en la fase V6; 7) quizalofop a 0,18 kg ae/ha en la fase V6, seguido de la misma aplicación en la fase V6; 8) glufosinato a 0,896 kg ae/ha en la fase V2, seguido de la misma aplicación en la fase V6.18 kg ae/ha aplicado en la fase V2 seguido de la misma aplicación en la fase V6; 8) haloxifop a 0,1 kg ae/ha aplicado en la fase V2 seguido de la misma aplicación en la fase V6; 9) haloxifop a 0,2 kg ae/ha aplicado en la fase V2 seguido de la misma aplicación en la fase V6; 10) 2,4-D a 1,26 kg ae/ha aplicado en la fase V2 seguido de la misma aplicación en la fase V6.26 kg ae/ha aplicado en la fase V2 seguido de la misma aplicación en la fase V6; 11) 2,4-D a 2,51 kg ae/ha aplicado en la fase v 2 seguido de la misma aplicación en la fase V6; o 12) glifosato a 2,51 kg ae/ha aplicado en la fase V2 seguido de la misma aplicación en la fase V6. La recogida de datos consistió en daños en el cultivo entre 10 y 14 días después de las aplicaciones de herbicidas V2 y V6 y una clasificación final en VT, días hasta el 50% de polen, días hasta el 50% de seda, altura de la planta, altura de la mazorca, peso de la cáscara, peso hectolítrico, humedad y rendimiento en grano. Todos los datos se sometieron a análisis de varianza y las medias se separaron a p<0,05.
La tolerancia a herbicidas de las plantas que contenían MON87429 x MON88017 x MON89034 fue excelente (<10% de daños en el cultivo) con todas las dosis de glifosato, glufosinato, dicamba, quizalofop, haloxifop y 2,4-D probadas. Las dosis de tratamiento herbicida no produjeron diferencias con respecto a los daños visuales en los cultivos. La altura de las espigas no fue significativamente diferente en ninguno de los tratamientos en comparación con el tratamiento herbicida estándar 12 (glifosato a 2,51 kg ae/ha). En ningún tratamiento se observó una reducción significativa de la altura de la planta o del peso hectolítrico, un aumento de la humedad del grano, un retraso de la madurez (medido como aumento de los días hasta el 50% de polen o seda), ni una disminución del rendimiento en grano de las plantas que contenían MON87429 x MON88017 x MON89034 con respecto a las plantas no tratadas. Las plantas híbridas producidas mediante el cruce de una planta que contiene MON87429 con una planta que contiene un evento que proporciona tolerancia al glifosato en los tejidos masculinos (tales como los eventos de maíz disponibles comercialmente MON88017 o NK603) proporcionan una excelente tolerancia vegetativa al glifosato, glufosinato, dicamba, quizalofop, haloxifop y 2,4-D cuando se aplican a las dosis comerciales indicadas en la etiqueta.
Se utilizaron tres años de ensayos de campo para probar el control de plantas que comprendían el evento de maíz MON87429 utilizando cletodim. Estos ensayos evaluaron el uso en procedimientos de control voluntario de un herbicida DIM con plantas que contenían maíz del evento MON87429. Las plantas se trataron con cletodim en las dosis comerciales indicadas en la etiqueta y se observó un control completo de las plantas que contenían evento de maíz MON87429.
Los datos acumulados del análisis molecular y de los ensayos de campo con plantas endocriadas e híbridas que evalúan (1) la eficacia del rasgo para tasas comerciales de tolerancia a glufosinato, dicamba, quizalofop y 2,4-D, (2) el rendimiento agronómico, (3) la eficacia del Sistema de Hibridación Roundup (SHR) y la tolerancia al glifosato, y (4) las pruebas de presión de herbicidas para la tolerancia a mayores dosis de aplicación de los herbicidas quizalofop, 2,4-D, glufosinato y dicamba para todos los eventos probados para las construcciones HT4-14, HT4-32 y HT4-34. El análisis de los datos acumulados demostró el rendimiento globalmente superior del maíz MON87429 en comparación con los demás eventos y dio lugar a la selección de este evento con fines comerciales.
Ejemplo 5: Caracterización molecular del evento de maíz MON87429
El evento de maíz MON87429 se sometió a una amplia caracterización molecular tras su selección como evento comercial. El inserto transgénico del maíz evento MON87429 contiene los elementos y secuencias descritos en la Tabla 1.
Se realizó el análisis de la secuencia de ADN del evento de maíz MON87429. Se realizó un análisis de Southern blot para confirmar que las plantas que contenían el evento de maíz MON87429 contenían una copia única e intacta de todo el inserto transgénico sin ninguna columna vertebral de vector de transformación. El ADN de flanqueo se secuenció en los extremos 5' y 3' del inserto, y las uniones respectivas se determinaron mediante técnicas de captura de secuencias, enriquecimiento, secuenciación, PCR inversa y genoma caminante. Las secuencias del ADN de flanqueo para el evento de maíz MON87429 se mapearon en el ensamblaje físico conocido del genoma del maíz. La información de la secuencia del sitio de inserción se utilizó para el análisis bioinformático de la localización cromosómica del evento. La integridad del sitio de inserción se determinó mediante PCR a través del alelo de tipo salvaje utilizando cebadores específicos de las regiones flanqueantes del evento de maíz MON87429. El sitio de inserción de tipo silvestre se utilizó para mapear el sitio único de integración del transgén para el evento de maíz MON87429 en el genoma de referencia del maíz. Para garantizar que no se introdujeron alteraciones o mutaciones en ninguna región del transgén durante la transformación, se aisló de la planta todo el inserto transgénico del maíz evento MON87429 y se secuenció. La información de secuencias para la unión 5', la unión 3' y el inserto transgénico se proporciona en la presente memoria descriptiva como SEQ ID NOs:1-10.
Se realizó un análisis de ARN de plantas que comprendían la construcción del evento de maíz MON87429. El análisis Northern se realizó sobre ARN total aislado de grano de plantas que contenían maíz evento MON87429. Esto confirmó el tamaño y el número del transcrito para los productos de ARNmpat, dmo, ft_t,ycp4-epsps.Los niveles de expresión de ARN para CP4-EPSPS también se midieron mediante PCR en tiempo real utilizando muestras de tejidos vegetales que contenían maíz evento MON87429. Se utilizó la amplificación rápida de los extremos del ADNc (AREA) para identificar los productos de escisión de CP4-EPSPS con el fin de confirmar que la escisión del transcrito CP4-EPSPS se produce sólo en las borlas de las plantas que comprenden el evento de maíz MON87429 y que esto es desencadenado por pequeños ARN de interferencia (siARN) endógenos específicos del macho de maíz de una manera específica de la secuencia. Se realizaron análisis Northern de bajo peso molecular para demostrar que no hay siARNs CP4-EPSPS que puedan comprometer la tolerancia al glifosato en tejidos distintos de la borla.
Se realizó el análisis de proteínas de plantas que comprendían la construcción del evento de maíz MON87429. La secuenciación proteica N-terminal de las proteínas PAT, DMO, FT_T y CP4-EPSPS expresadas se realizó utilizando extractos proteicos inmunopurificados de grano para confirmar la secuencia aminoacídica N-terminal auténtica. Se realizaron análisis de Western blot en extractos de proteínas de granos que contenían maíz del evento MON87429 para confirmar que se estaba produciendo una única proteína del tamaño esperado para PAT, DMO, FT_T y CP4-EPSPS, respectivamente. Se utilizaron ELISA para determinar los niveles de proteína en la hoja, la semilla, las raíces y el polen de las plantas para las proteínas PAT, DMO, FT_T y CP4-EPSPS.
Ejemplo 6: Detección del evento de maíz MON87429
La detección del evento de maíz MON87429 en una muestra puede realizarse utilizando técnicas de detección de ADN, ARN o proteínas. A continuación se ofrecen ejemplos de procedimientos y materiales de detección. La detección puede determinar la presencia o ausencia del evento de maíz MON87429 en una muestra. La detección puede indicar el número de copias genómicas del evento de maíz MON87429 (es decir, hemicigoto, homocigoto o heterocigoto) en una muestra de ADN genómico.
Se desarrolló un procedimiento de amplificación térmica Applied Biosystems™ TAQMAN® de punto final específico de evento (Thermo Fisher Scientific) para identificar el evento de maíz MON87429 en una muestra. Los cebadores de ADN y la sonda utilizados en el ensayo de punto final son los cebadores SQ51062 (SEQ ID NO:11), SQ51053 (SEQ ID NO:12), y la sonda marcada con 6-FAM™ PB50370 (SEQ ID NO:13). 6-FAM es un colorante fluorescente producto de Applied Biosystems (Foster City, CA) unido a la sonda de ADN. Para las sondas TAQMAN MGB™, la actividad exonucleasa 5' de laTaqADN polimerasa escinde la sonda desde el extremo 5', entre el fluoróforo y el quencher. Cuando se hibridan con la cadena de ADN diana, el quencher y el fluoróforo se separan lo suficiente como para producir una señal fluorescente, liberando así fluorescencia. SQ51062 y SQ51053 cuando se utilizan con estos procedimientos de reacción y PB50370 producen un amplicón de ADN que es diagnóstico para el evento de maíz MON87429. Los controles para este análisis deben incluir un control positivo que contenga el evento de maíz MON87429, un control negativo de maíz no transgénico y un control negativo que no contenga ADN molde. Además, un control para la reacción PCR debería incluir de forma óptima cebadores de control interno y una sonda de control interno, específicos para un gen de copia única en el genoma del maíz. Estos ensayos están optimizados para su uso con el Applied Biosystems GeneAmp® PCR System 9700 (Thermo Fisher Scientific) funcionando a máxima velocidad, pero pueden utilizarse otros equipos.
Un ejemplo de condiciones útiles con los procedimientos TAQMAN para la detección del evento de maíz MON87429 es el siguiente. Etapa 1: Agua de 18 megaohmios ajustada para un volumen final de 5 jl. Etapa 2: 2,28 |jl de 2X Universal Master Mix (dNTPs, enzima, amortiguador) hasta una concentración final de 1X. Etapa 3: 0,05 j l de Event Primer-1 (SQ51062) y Event Primer-2 (SQ51053) (resuspendidos en agua de 18 megaohmios hasta una concentración de 100 uM para cada primer) hasta una concentración final de 0,9 jM . Etapa 4: 0,01 j l de sonda MGB Event 6-FAM PB50370 (resuspendida en agua de 18 megaohmios hasta una concentración de 100 jM ) hasta una concentración final de 0,2 jM . Etapa 5: 0,05 j l de mezcla de cebador-1 de control interno y cebador-2 de control interno (resuspendido en agua de 18 megaohmios hasta una concentración de 100 jM para cada cebador) hasta una concentración final de 0,9 jM . Etapa 6: 0,01 j l de sonda de control interno VIC™ (resuspendida en agua de 18 megaohmios hasta una concentración de 100 jM ) hasta una concentración final de 0,2 jM . Etapa 7: 2,5 j l de ADN extraído (molde) para cada muestra con uno de los siguientes componentes: (a) Muestras de hojas que se van a analizar; (b) Control negativo (ADN no transgénico); (c) Control negativo de agua (sin plantilla); y (d) Control positivo de maíz que contiene ADN del evento MON87429. Etapa 8: Las condiciones del termociclador son las siguientes: un ciclo a 95°C durante 20 segundos; cuarenta ciclos de 95°C durante 3 segundos y luego 60°C durante 20 segundos; y ciclo final de 10°C.
Se desarrolla un ensayo de cigosidad para determinar si una planta que comprende el evento de maíz MON87429 es heterocigótica u homocigótica para el evento o el alelo de tipo silvestre. Se puede diseñar un ensayo de reacción de amplificación utilizando la información de secuencia proporcionada en la presente memoria descriptiva. Por ejemplo, dicho ensayo PCR incluiría el diseño de al menos tres cebadores: cebador-1, cebador-2 y cebador-3, en el que el cebador-1 es específico del ADN genómico del maíz en el flanco 3' del evento de maíz MON87429; el cebador-2 es específico del inserto transgénico del evento de maíz MON87429; y el cebador-3 es específico del alelo de tipo silvestre. Cuando se utiliza como par de cebadores en una reacción de amplificación, el cebador-1 con el cebador-2 producirá un amplicón PCR específico para el evento de maíz MON87429. Cuando se utiliza como pareja de cebadores en una reacción de amplificación, el cebador-1 con el cebador-3 producirá un amplicón PCR específico para el alelo de tipo salvaje. En una reacción de PCR realizada con ADN genómico de maíz, los respectivos amplicones de PCR generados a partir del cebador-1 cebador-2 y el generado a partir del cebador-1 cebador-3 diferirán en la secuencia y el tamaño del amplicón. Cuando se incluyen los tres cebadores en una reacción de PCR con ADN extraído de una planta homocigótica para el evento de maíz MON87429, sólo se generará el amplicón cebador-1 cebador-2 (específico para la inserción de maíz MON87429). Cuando se incluyen los tres cebadores en una reacción de PCR con ADN extraído de una planta heterocigótica para el evento de maíz MON87429, se generará tanto el amplicón del cebador-1 cebador-2 (específico para la inserción de maíz MON87429) como el amplicón del cebador-1 cebador-3 (específico para el alelo de tipo silvestre o la ausencia de la inserción de maíz MON87429). Cuando los tres cebadores se mezclan en una reacción de PCR con ADN extraído de una planta nula para el evento de maíz MON87429 (es decir, de tipo silvestre), sólo se generará el amplicón cebador-1 cebador-3 (específico para el alelo de tipo silvestre). Los amplicones producidos mediante la reacción PCR pueden identificarse o distinguirse utilizando cualquier procedimiento conocido en la técnica.
Otro ensayo de cigosidad para el evento de maíz MON87429 es una reacción de amplificación térmica TAQMAN. Para este tipo de ensayo, además de los cebadores descritos anteriormente, el ensayo incluiría dos sondas marcadas con fluorescencia. La sonda-1 sería específica para el evento de maíz MON87429, y la sonda-2 sería específica para una planta de maíz nula para el evento de maíz MON87429 (de tipo silvestre), y en el que las dos sondas contienen diferentes etiquetas fluorescentes, por ejemplo la etiqueta 6-FAM o la etiqueta VIC™. Cuando se utilicen en una reacción TAQMAN, el cebador-1 cebador-2 sonda-1 producirán una primera señal fluorescente específica para el evento de maíz MON87429 y el cebador-1 cebador-3 sonda-2 producirán una segunda señal fluorescente específica para el maíz de tipo silvestre. Cuando los tres cebadores y las dos sondas se incluyen en una reacción TAQMAN con ADN extraído de una planta homocigótica para el evento de maíz MON87429, sólo se generará la primera señal fluorescente (específica del cebador-1 cebador-2 sonda-1). Cuando los tres cebadores se incluyen en una reacción TAQMAN con ADN extraído de una planta heterocigótica para el evento de maíz MON87429, se generarán tanto la primera señal fluorescente (específica del cebador-1 cebador-2 sonda-1) como la segunda señal fluorescente (específica del cebador-1 cebador-3 sonda-2). Cuando los tres cebadores se mezclan en una reacción TAQMAN con ADN extraído de una planta nula para el evento de maíz MON87429 (tipo salvaje), sólo se generará la segunda señal fluorescente (específica del cebador-1 cebador-3 sonda-2).
Otro procedimiento para detectar la presencia del evento de maíz MON87429 en una muestra vegetal sería el análisis Southern. Un experto en la materia entendería cómo diseñar sondas de hibridación meridional específicas para el evento de maíz MON87429 y una segunda sonda de hibridación meridional específica para una planta de maíz nula para el evento de maíz MON87429 (de tipo silvestre). Con el análisis Southern, una señal detectada únicamente a partir de la primera sonda de hibridación Southern será indicativa de una planta homocigótica para el evento de maíz MON87429; una señal detectada tanto a partir de la primera sonda de hibridación Southern como de la segunda sonda de hibridación Southern será indicativa de una planta heterocigótica para el evento de maíz MON87429; y una señal detectada únicamente a partir de la segunda sonda de hibridación Southern será indicativa de que el ADN se extrajo de una planta nula para el evento de maíz MON87429 (de tipo silvestre).
Sólo para referencia. Otro ejemplo de kit de detección comprende al menos un anticuerpo específico para al menos una proteína codificada por el evento de maíz MON87429. Por ejemplo, tal kit puede utilizar una tira de flujo lateral que comprende reactivos que se activan cuando la punta de la tira entra en contacto con una solución acuosa. Proteínas ejemplares suficientes para su uso en la producción de anticuerpos son las codificadas por la secuencia proporcionada como SEQ ID NO:10, o cualquier fragmento de la misma.
Sólo para referencia. Se desarrolla un procedimiento de detección de proteínas para determinar si una muestra procede de una planta, semilla, célula o parte de una planta que contiene el evento de maíz MON87429. Se utiliza al menos un anticuerpo específico para al menos una proteína codificada por el evento de maíz MON87429 para detectar una proteína codificada por el evento de maíz MON87429 en una muestra. Un kit de detección que comprenda uno o más anticuerpos específicos para una o más proteínas codificadas por el evento de maíz MON87429 puede utilizar una tira de flujo lateral que contenga reactivos activados cuando la punta de la tira entra en contacto con una solución acuosa. Las muestras de tejido de maíz pueden triturarse y extraerse proteínas para su análisis utilizando agua o un tampón acuoso (por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato que contenga detergente y albúmina de suero bovino). Tras la centrifugación, el sobrenadante acuoso se analiza mediante el procedimiento ELISA en formato sándwich en una tira de flujo lateral que contiene una almohadilla absorbente. La detección se activa sumergiendo la punta de la tira en la solución acuosa que contiene la muestra a analizar. La solución acuosa asciende por la tira por acción capilar y solubiliza los anticuerpos marcados con oro en la tira. Los anticuerpos marcados con oro son específicos de al menos una proteína codificada por el evento de maíz MON87429 y se unirán a un epítopo de la proteína en la muestra para formar un complejo anticuerpo-antígeno. A continuación, el complejo anticuerpo-antígeno marcado con oro asciende por la tira hasta una membrana de nitrocelulosa. La membrana comprende una línea de prueba de anticuerpos inmovilizados que se unen a un segundo epítopo separado de la proteína codificada por el evento de maíz MON87429, haciendo que aparezca una línea visible a través de la tira de prueba si la proteína codificada por el evento de maíz MON87429 está presente en la muestra.

Claims (19)

REIVINDICACIONES
1. Una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:1.
2. La molécula de ADN recombinante de la reivindicación 1, en la que:
a) la molécula de ADN recombinante se deriva de una planta, semilla o célula que comprende el evento de maíz MON87429, habiéndose depositado una muestra representativa de semilla que comprende el evento con el número de acceso ATCC PTA-124635;
b) la molécula de ADN recombinante se encuentra en una planta, célula, semilla o parte de planta que comprende el evento de maíz MON87429, habiéndose depositado una muestra representativa de semilla que comprende el evento como ATCC PTA-124635, o bien
c) la molécula de ADN recombinante es un amplicón diagnóstico de la presencia del evento de maíz MON87429.
3. Una molécula de ADN con una longitud suficiente de nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 10 para funcionar como una sonda de ADN específica para SEQ ID NO: 10 en una muestra de ADN derivada de una planta de maíz, una semilla de maíz o una célula de maíz, en la que la sonda de ADN comprende uno cualquiera de los SEQ ID NOs: 1 a 8, y SEQ ID NO:10.
4. Un par de moléculas de ADN que comprende una primera molécula de ADN y una segunda molécula de ADN, en las que la primera molécula de ADN comprende un fragmento del inserto transgénico de SEQ ID NO: 10 desde la posición 1030 hasta la posición 15037, y la segunda molécula de ADN comprende un fragmento de la secuencia de ADN flanqueante de SEQ ID NO: 10 desde la posición 1 hasta la posición 1029 o un fragmento de SEQ ID NO: 10 desde la posición 15038 hasta la 16068 y cada uno de ellos tiene la longitud suficiente para funcionar como cebadores de ADN cuando se utilizan juntos en una reacción de amplificación con ADN que contiene el evento de maíz MON87429 para producir un amplicón de diagnóstico del evento de maíz MON87429 en una muestra.
5. El par de moléculas de ADN de la reivindicación 4, en el que la primera molécula de ADN comprende SEQ ID NO: 11 y la segunda molécula de ADN comprende SEQ ID NO: 12.
6. Un procedimiento de detección de la presencia del evento de maíz MON87429 en una muestra de ADN derivada de una planta de maíz, una semilla de maíz o una célula de maíz, procedimiento que comprende:
a) poner en contacto la muestra con la sonda de ADN de la reivindicación 3;
b) someter la muestra y la sonda de ADN a condiciones de hibridación estrictas; y
c) detectar la hibridación de la sonda de ADN con una molécula de ADN de la muestra, en la que la hibridación de la sonda de ADN con la molécula de ADN indica la presencia del evento de maíz MON87429 en la muestra de ADN; o bien
i) poner en contacto la muestra con el par de moléculas de ADN de la reivindicación 4 o de la reivindicación 5; ii) realizar una reacción de amplificación suficiente para producir un amplicón de ADN que comprenda una secuencia seleccionada del grupo formado por SEQ iD NO: 10, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:2, y SEQ ID NO:1, y
iii) detectar la presencia del amplicón de ADN,
en la que la presencia del amplicón de ADN indica la presencia del evento de maíz MON87429 en la muestra.
7. Un kit para detectar la presencia del evento de maíz MON87429 que comprende una sonda de ADN específica para SEQ ID NO: 10 de la reivindicación 3, o un par de cebadores de ADN que produzcan un amplicón diagnóstico para el evento de maíz MON87429 de la reivindicación 4 o la reivindicación 5.
8. Una planta de maíz, semilla, célula, parte de planta, que comprende el evento de maíz MON87429, una muestra representativa de semilla que comprende el evento que ha sido depositada como ATCC Accession No. PTA-124635 que comprende una molécula de ADN que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 10 o que comprenda una secuencia de SEQ ID NO:9 y una secuencia de cualquiera de SEQ ID Nos: 1, 3, 5 y 7 y una secuencia de cualquiera de los SEQ ID NO: 2, 4, 6 y 8.
9. La planta, semilla, célula o parte de planta de la reivindicación 8, en la que:
a) la planta, semilla, célula o parte de la planta presenta tolerancia a al menos un herbicida seleccionado del grupo formado por inhibidores de la acetil CoA carboxilasa (ACCasa) del grupo del ariloxifenoxipropionato (FOP), auxinas sintéticas, inhibidores de la glutamina sintetasa e inhibidores de la 5-enolpiruvilsiquimato-3-fosfato sintasa (EPSPS), o cualquier combinación de los mismos; o bien
b) la planta, semilla, célula o parte de la planta es tolerante al quizalofop, haloxifop, dicamba, 2,4-D, glufosinato y glifosato.
10. Un procedimiento para controlar las malas hierbas en una zona de cultivo que comprende:
a) plantar maíz que comprenda el evento MON87429, una muestra representativa de semilla que comprenda el evento y que haya sido depositada con el número de acceso ATCC PTA-124635, en la zona de cultivo; y b) aplicar a la zona de cultivo, o a cualquier parte de la misma, una cantidad eficaz de al menos un herbicida seleccionado del grupo de los inhibidores de la acetil COA carboxilasa (ACCasa) del grupo del ariloxifenoxipropionato (FOP), auxinas sintéticas, inhibidores de la glutamina sintetasa e inhibidores de la 5-enolpiruvilsiquimato-3-fosfato sintasa (EPSPS), o cualquier combinación de los mismos, para controlar las malas hierbas de la zona sin dañar el maíz.
11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que:
i) la aplicación de la cantidad eficaz de al menos un herbicida comprende la aplicación de al menos dos o más herbicidas seleccionados del grupo que consiste en inhibidores de la acetil COA carboxilasa (ACCasa) en el grupo del ariloxifenoxipropionato (FOP), auxinas sintéticas, inhibidores de la glutamina sintetasa e inhibidores de la 5-enolpiruvilsiquimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) durante un período vegetativo; o bien
ii) la aplicación de la cantidad eficaz de al menos un herbicida comprende la aplicación de un herbicida seleccionado del grupo que consiste en quizalofop, haloxifop, dicamba, 2,4-D, glufosinato y glifosato, o cualquier combinación de los mismos.
12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que:
a) la cantidad efectiva de dicamba es de aproximadamente 0,56 kg ae/ha a aproximadamente 2,24 kg ae/ha de dicamba durante un período vegetativo;
b) la cantidad eficaz de glufosinato es de aproximadamente 0,45 kg ai/ha a aproximadamente 1,78 kg ai/ha durante un período vegetativo;
c) la cantidad efectiva de 2,4-D es de aproximadamente 0,84 kg ae/ha a 1,12 kg ae/ha durante un período vegetativo;
d) la cantidad eficaz de quizalofop es de aproximadamente 0,04 kg ai/ha a aproximadamente 0,09 kg ai/ha durante un período vegetativo; o
e) la cantidad eficaz de haloxifop es de aproximadamente 0,02 kg ai/ha a aproximadamente 0,08 kg ai/ha durante un período vegetativo.
13. Un procedimiento para controlar el maíz voluntario que comprende el evento de maíz MON87429, una muestra representativa de semilla que comprende el evento que se ha depositado con el número de acceso ATCC PTA-124635, en una zona que comprende la aplicación de una cantidad herbicida eficaz de al menos un herbicida ciclohexanodiona (DIM), donde la aplicación del herbicida impide el crecimiento del maíz que comprende el evento de maíz MON87429.
14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que la aplicación de la cantidad herbicida eficaz de al menos un herbicida ciclohexanodiona (DIM) comprende la aplicación de un herbicida ciclohexanodiona (DIM) seleccionado del grupo que consiste en cletodim, setoxidim y tralcoxidim.
15. Un procedimiento para inducir la esterilidad masculina en una planta de maíz que comprende:
a) cultivar una planta de maíz que contenga SEQ ID NO: 10 o que comprenda una secuencia de SEQ ID NO:9 y una secuencia de cualquiera de SEQ ID Nos:1, 3, 5 y 7 y una secuencia de cualquiera de SEQ ID NO: 2, 4, 6 y 8; y
b) aplicar una cantidad eficaz de glifosato antes o durante el desarrollo del tejido reproductor masculino de la planta de maíz, induciendo así la esterilidad masculina en la planta de maíz.
16. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que:
i) la aplicación de la cantidad efectiva de glifosato comprende la aplicación de glifosato antes o durante el desarrollo en una cantidad efectiva de aproximadamente 0,56 kg ae/ha a aproximadamente 2,8 kg ae/ha; o bien
ii) la aplicación de la cantidad eficaz de glifosato comprende la aplicación del glifosato en una fase de desarrollo seleccionada del grupo formado por las fases V4, V5, V6, V7, V8, V9, V10, V11, V12, V13 y V14 del desarrollo de la planta de maíz.
17. Una semilla híbrida de maíz producida por un procedimiento que comprende,
a) cultivar una planta de maíz que contenga SEQ ID NO: 10); o que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 9 y una secuencia de cualquiera de los SEQ ID Nos: 1, 3, 5 y 7 y una secuencia de cualquiera de los SEQ ID NO: 2, 4, 6 y 8
b) aplicar una cantidad eficaz de glifosato antes o durante el desarrollo del tejido reproductor masculino de la planta de maíz, induciendo así la esterilidad masculina en la planta de maíz;
c) fertilizar la planta de maíz con polen de una segunda planta de maíz; y
d) recolectar de semillas híbridas de la planta de maíz;
en el que la semilla híbrida comprende SEQ ID NO: 10 o comprende una secuencia de SEQ ID NO:9 y una secuencia de cualquiera de SEQ ID Nos: 1, 3, 5 y 7 y una secuencia de cualquiera de los SEQ ID NO: 2, 4, 6 y 8.
18. Un procedimiento de determinación de la cigosidad de una planta para el evento de maíz MON87429 que comprende:
a) Poner en contacto una muestra que comprenda ADN derivado de la planta con un conjunto de cebadores capaz de producir un primer amplicón diagnóstico de la presencia del evento de maíz MON87429 y un segundo amplicón diagnóstico del ADN genómico de maíz de tipo silvestre que no comprenda el evento de maíz MON87429; b) realizar una reacción de amplificación del ácido nucleico; y
c) detectar el primer amplicón y el segundo amplicón, en el que la presencia de ambos amplicones indica que la muestra es heterocigótica para el evento de maíz MON87429 y la presencia únicamente del primer amplicón indica que la muestra es homocigótica para el evento de maíz MON87429.
19. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que el conjunto de cebadores que produce un primer amplicón diagnóstico de la presencia del evento de maíz MON87429 comprende SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12.
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