ES3041027T3 - Process for removing an antifoam agent from a solution comprising a human milk oligosaccharide and related compositions - Google Patents

Process for removing an antifoam agent from a solution comprising a human milk oligosaccharide and related compositions

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ES3041027T3
ES3041027T3 ES20860372T ES20860372T ES3041027T3 ES 3041027 T3 ES3041027 T3 ES 3041027T3 ES 20860372 T ES20860372 T ES 20860372T ES 20860372 T ES20860372 T ES 20860372T ES 3041027 T3 ES3041027 T3 ES 3041027T3
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Abstract

Esta especificación se refiere a un proceso para preparar un oligosacárido de leche humana purificado ("HMO") a partir de una solución que contiene HMO (por ejemplo, un caldo de fermentación) mediante un proceso que comprende la eliminación de un agente antiespumante, y a un producto de dicho proceso. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimiento para retirar un agente antiespumante de una solución que comprende un oligosacárido de leche humana y composiciones relacionadas
CAMPO
Esta memoria descriptiva se refiere a la preparación de un oligosacárido de leche humana ("HMO") purificado a partir de una solución que contiene HMO (p. ej., un caldo de fermentación) mediante un procedimiento que comprende la retirada de un agente antiespumante, y a un producto de este procedimiento.
ANTECEDENTES
Los oligosacáridos de leche humana son importantes para nutrición y terapias. Los HMO incluyen, por ejemplo, 2'-fucosil-lactosa ("2'-FL"), 3-fucosil-lactosa ("3-FL''), lacto-N-tetraosa (''LNT''), 6'-sialil-lactosa ("6'-SL"), 3'-sialil-lactosa ("3'-SL"), difucosil-lactosa ("DiFL" o "LDFT"), lacto-N-neotetraosa ("LNnT"), lacto-N-fucopentaosa, lacto-N-difucohexaosa, lacto-N-neodifucohexaosa, lacto-N-neooctaosa, lacto-N-neofucopentaosa, 3'-sialil-3-fucosil-lactosa, sialil-lacto-N-tetraosa, LS-tetrasacárido, lacto-N-triosa, lacto-N-difucohexaosa, 6'-galactosil-lactosa, 3'-galactosillactosa, lacto-N-hexaosa y lacto-N-neohexaosa. Muchos HMO en la leche materna humana están fucosilados, a diferencia de los oligosacáridos producidos, por ejemplo, por animales lecheros. El HMO más abundante en la leche materna humana es 2'-FL.
Muchos enfoques recientes para sintetizar HMO implican procedimientos de fermentación microbiana, que producen<HMO (tales como 2'-FL,>3-F<l>,<LNT, 3'-SL y 6'-SL) a partir de lactosa. En un procedimiento tal, un HMO dado es>sintetizado por microorganismos cultivados, tales comoE. coIírecombinante. A continuación, el HMO se aísla desde el caldo de biomoléculas producidas mediante el cultivo a través de una serie de procedimientos de purificación. Aunque ha habido éxito con este enfoque, los procedimientos de fermentación generalmente producen una mezcla de productos compleja que incluye, además del o los HMO deseados, otros ingredientes, tales como sales monovalentes y divalentes, lactosa, oligosacáridos, monosacáridos, aminoácidos, polipéptidos, proteínas, ácidos orgánicos, ácidos nucleicos, adyuvantes de procesamiento, etc. Por consiguiente, sigue habiendo una necesidad de procedimientos de purificación posteriores eficaces, fiables y económicamente viables que proporcionen un producto de HMO purificado utilizable.
El documento EP 3450443 describe un procedimiento para purificar oligosacáridos sialilados a partir de un caldo de fermentación mediante separación de biomasa desde el caldo de fermentación, retirada de cationes del caldo de fermentación, retirada de impurezas aniónicas del caldo de fermentación y retirada de compuestos que tengan un peso molecular inferior al del oligosacárido sialilado que se va a purificar.
El documento EP 3 131 912 describe un procedimiento para la purificación de un HMO neutro desde un caldo de fermentación producido mediante fermentación microbiana, mediante separación de biomasa desde el caldo de fermentación, uso de una combinación de un tratamiento con intercambiador iónico catiónico, un tratamiento con intercambiador iónico aniónico y una etapa de nanofiltración y/o una etapa de electrodiálisis.
El documento WO 2019/063757 describe un procedimiento para la purificación de un HMO neutro desde un caldo de fermentación mediante separación de biomasa desde el caldo de fermentación y utilización de una combinación de un material de intercambio catiónico, un material de intercambio aniónico y una resina adsorbente de intercambio catiónico.
La fermentación aerobia sumergida se basa generalmente en la aireación para suministrar el oxígeno requerido por los microorganismos para crecer y producir el producto de interés. La introducción de aire en un caldo de fermentación para proporcionar oxígeno para los microorganismos típicamente genera espuma. La mezcladura del caldo de fermentación también genera espuma. La presencia de esta espuma puede afectar negativamente al rendimiento, incluyendo una reducción del volumen de trabajo o la productividad del fermentador, y un riesgo de contaminación asociado con una "espuma saliente" (es decir, la producción de una columna de espuma o cabeza de espuma por encima de un caldo de fermentación líquido que tenga una altura suficiente para salir del recipiente de fermentación a través del respiradero, conductos, etc.).
Se usan comúnmente aditivos, tales como antiespumantes o desespumantes, para mitigar la formación de espuma durante la fermentación. Pero estos aditivos, a su vez, pueden afectar negativamente a procedimientos posteriores para recuperar el producto de HMO deseado. Por ejemplo, los procedimientos de separación a base de membranas y las operaciones de intercambio iónico pueden verse afectados negativamente por estos aditivos debido a la formación de incrustaciones y la consiguiente ralentización del procedimiento. Así, dependiendo de la aplicación de uso final del producto de HMO recuperado, puede ser necesario retirar los aditivos (p. ej., agentes antiespumantes) empleados durante el procedimiento de producción.
Los HMO pueden ser incorporados en un alimento (p. ej., un alimento para seres humanos o mascotas), un suplemento dietético o un medicamento. Los HMO son particularmente útiles, por ejemplo, en la leche maternizada. Así, existe una necesidad de HMO que sean sustancialmente puros.
En los procedimientos actuales para fabricar HMO, la retirada del agente antiespumante requiere etapas de calentamiento y enfriamiento que consumen recursos como tiempo, energía y agua. Aunque la concentración de agente antiespumante precipitado se puede reducir, puede permanecer agente antiespumante solubilizado y finalmente acabar en el producto final. Según esto, continúa existiendo una necesidad de procedimientos fiables y económicamente y medioambientalmente viables para retirar agentes antiespumantes para proporcionar un producto de HMO de alta calidad y pureza.
SUMARIO
Brevemente, esta memoria descriptiva proporciona, en parte, un procedimiento para elaborar un oligosacárido de leche humana ("HMO") purificado derivado de un procedimiento de fermentación. El procedimiento comprende precipitar un agente antiespumante en una solución que comprende el HMO y el agente antiespumante calentando la solución hasta una temperatura de precipitación de 36 a 65°C, donde la temperatura de precipitación está dentro de 5°C de una temperatura a la que la solución de HMO presenta una turbidez máxima, y filtrar y/o centrifugar el agente antiespumante precipitado desde la solución HMO a la temperatura de precipitación para formar un filtrado que comprende el HMO.
El procedimiento descrito anteriormente también proporciona un HMO (o mezcla de HMO) purificado obtenido mediante un procedimiento referido anteriormente.
El HMO (o mezcla de HMO) purificado descrito anteriormente se puede usar en un procedimiento para elaborar un alimento, suplemento dietético o medicamento. Este procedimiento comprende preparar un HMO (o mezcla de HMO) purificado según un procedimiento descrito anteriormente y mezclar el HMO (o mezcla de HMO) purificado con un ingrediente adecuado para el alimento, suplemento dietético o medicamento.
El HMO (o mezcla de HMO) purificado descrito anteriormente se puede usar en un procedimiento para elaborar una leche de inicio. Este procedimiento comprende preparar un HMO (o mezcla de HMO) purificado según un procedimiento descrito anteriormente, y mezclar el HMO (o mezcla de HMO) purificado con un ingrediente de la leche de inicio.
Beneficios adicionales de las enseñanzas de esta memoria descriptiva serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la lectura de esta memoria descriptiva.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA FIGURA
La Figura 1 es una presentación gráfica de las curvas de turbidez de los diversos agentes antiespumantes según el Ejemplo 8.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Esta descripción detallada está destinada a familiarizar a otros expertos en la técnica con la invención del solicitante, sus principios y su aplicación práctica de modo que otros expertos en la técnica puedan adaptar y aplicar la invención del solicitante en sus numerosas formas, ya que pueden ser los más adecuados para los requisitos de un uso particular. Esta descripción detallada y sus ejemplos específicos, aunque indican ciertas realizaciones, solamente tienen fines ilustrativos. Por lo tanto, esta memoria descriptiva no se limita a las realizaciones descritas, y puede modificarse de forma variada, aunque la invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas.
Definiciones
El término "% superficie" se refiere a la pureza o concentración de la superficie del pico normalizada obtenida usando HPLC. Este es un porcentaje de la superficie del pico con relación a la superficie total de picos.
El término "temperatura del punto de opacificación" o "punto de opacificación" se refiere a la temperatura del punto de opacificación de un agente antiespumante.
Los términos "DiFL" o "LDFT" se refieren a difucosil-lactosa (también denominada “lactodifucotetraosa”).
El término "DS" se refiere a un contenido de sustancia seca expresado como porcentaje en peso.
El término "2'-FL" se refiere a 2'-fucosil-lactosa (también denominada "2'-O-fucosil-lactosa").
El término "3-FL" se refiere a 3-fucosil-lactosa (también denominada "3-O-fucosil-lactosa").
El término "HMO" se refiere a oligosacárido de leche humana.
El término "HPLC" se refiere a cromatografía de líquidos de alto rendimiento.
El término "ICUMSA" se refiere al sistema de gradación cromática de azúcares de la "International Commission for Uniform Process of Sugar Analysis".
El término "LNnT" se refiere a lacto-N-neotetraosa.
El término "LNT" se refiere a lacto-N-tetraosa.
El término "NTU" se refiere a unidad de turbidez nefelométrica. Esta es una unidad de turbidez que mide luz dispersada a 90 grados desde el rayo de luz incidente usando luz blanca.
El término "3'-SL" se refiere a 3'-sialil-lactosa (también denominada "N-acetilneuraminil-2-3-galactopiranosil-1-4-glucopiranosa").
El término "6'-SL" se refiere a 6'-sialil-lactosa.
Oligosacárido de leche humana
Existen más de 150 oligosacáridos de leche humana conocidos presentes generalmente en la leche materna humana. Un procedimiento descrito en esta memoria descriptiva se puede usar para preparar un solo HMO purificado o una mezcla purificada de dos o más HMO.
En algunas realizaciones, un procedimiento de esta memoria descriptiva comprende preparar un HMO purificado seleccionado de fucosil-lactosas (tales como 2'-fucosil-lactosa ("2'-FL"), 3-fucosil-lactosa ("3-FL") o difucosil-lactosa ("DiFL" o "LDFT")), sialil-lactosas (tales como 3'-sialil-lactosa ("3'-SL") o 6'-sialil-lactosa ("6'-SL")), lacto-N-tetraosa ("LNT"), lacto-N-neotetraosa ("LNnT"), lacto-N-fucopentaosa, lacto-N-difucohexaosa, lacto-N-neodifucohexaosa, lacto-N-neooctaosa, lacto-N-neofucopentaosa, 3'-sialil-3-fucosil-lactosa, sialil-lacto-N-tetraosa, LS-tetrasacárido, lacto-N-triosa, lacto-N-difucohexaosa, 6'-galactosil-lactosa, 3'-galactosil-lactosa, lacto-N-hexaosa o lacto-N-neohexaosa. En algunas realizaciones, un procedimiento de esta memoria descriptiva comprende preparar una mezcla de HMO purificada que comprende uno o más de los HMO enumerados anteriormente. En algunas realizaciones, un procedimiento de esta memoria descriptiva comprende preparar una mezcla de HMO purificada que comprende al menos dos de los HMO enumerados anteriormente.
En algunas realizaciones, un procedimiento de esta memoria descriptiva se usa para preparar un HMO purificado seleccionado de una fucosil-lactosa (p. ej., 2'-FL, 3-FL o DiFL), una sialil-lactosa (p. ej., 3'-SL o 6'-SL), LNT o LNnT. En algunas realizaciones, un procedimiento de esta memoria descriptiva se usa para preparar una fucosil-lactosa (también denominada "FL") purificada. A temperatura y presión ambiente, una fucosil-lactosa es típicamente un sólido de color blanco a marfil y soluble en agua. En algunas realizaciones, la fucosil-lactosa purificada es 2'-FL. En algunas realizaciones, la fucosil-lactosa purificada es 3-FL. En algunas realizaciones, un procedimiento de esta memoria descriptiva se usa para preparar una mezcla de HMO purificada que comprende una fucosil-lactosa. En algunas realizaciones, un procedimiento de esta memoria descriptiva se usa para preparar una mezcla de HMO purificada que comprende 2'-FL, 3-FL o DiFL. En algunas realizaciones, un procedimiento de esta memoria descriptiva se usa para preparar una mezcla de HMO purificada que comprende al menos dos fucosil-lactosas. En algunas realizaciones, un procedimiento de esta memoria descriptiva se usa para preparar una mezcla de HMO purificada que comprende 2'-FL y DiFL.
En algunas realizaciones, un procedimiento de esta memoria descriptiva comprende preparar una sialil-lactosa (también denominada "SL") purificada. En algunas realizaciones, la sialil-lactosa purificada es 3'-SL. En algunas realizaciones, la sialil-lactosa purificada es 6'-SL. En algunas realizaciones, un procedimiento de esta memoria descriptiva se usa para elaborar una mezcla de HMO purificada que comprende una sialil-lactosa. En algunas realizaciones, un procedimiento de esta memoria descriptiva se usa para preparar una mezcla de HMO purificada que comprende 3'-SL o 6'-SL. En algunas realizaciones, un procedimiento de esta memoria descriptiva se usa para preparar una mezcla de HMO purificada que comprende al menos dos sialil-lactosas. En algunas realizaciones, un procedimiento de esta memoria descriptiva se usa para preparar una mezcla de HMO purificada que comprende 3'-SL y 6'-SL.
En algunas realizaciones, un procedimiento de esta memoria descriptiva comprende preparar lacto-N-tetraosa ("LNT") purificada. En algunas realizaciones, el procedimiento de esta memoria descriptiva se usa para elaborar una mezcla de HMO purificada que comprende LNT.
En algunas realizaciones, un procedimiento de esta memoria descriptiva comprende preparar lacto-N-neotetraosa ("LNnT") purificada. En algunas realizaciones, el procedimiento de esta memoria descriptiva se usa para elaborar una mezcla de HMO purificada que comprende LNnT.
Solución de HMO
Una "solución de HMO" a partir de la cual se purifica un HMO según esta memoria descriptiva comprende generalmente un medio acuoso. El medio acuoso comprende tanto el HMO como otros ingredientes, por ejemplo, sales monovalentes y divalentes, lactosa, oligosacáridos, monosacáridos, aminoácidos, polipéptidos, proteínas, ácidos orgánicos, ácidos nucleicos y el agente antiespumante.
En algunas realizaciones, el medio acuoso es agua.
En algunas realizaciones, el HMO se selecciona de 2'-FL, 3-FL, LNT, 6'-SL, 3'-SL, DiFL, LNnT, lacto-N-fucopentaosa, lacto-N-difucohexaosa, lacto-N-neodifucohexaosa, lacto-N-neooctaosa, lacto-N-neofucopentaosa, 3'-sialil-3-fucosillactosa, sialil-lacto-N-tetraosa, LS-tetrasacárido, lacto-N-triosa, lacto-N-difucohexaosa, 6'-galactosil-lactosa, 3'-galactosil-lactosa, lacto-N-hexaosa y lacto-N-neohexaosa.
En algunas realizaciones, el HMO es una fucosil-lactosa.
En algunas realizaciones, el HMO es 2'-FL.
En algunas realizaciones, el HMO es 3-FL.
En algunas realizaciones, el HMO es DiFL.
En algunas realizaciones, el HMO es una sialil-lactosa.
En algunas realizaciones, el HMO es 3'-SL.
En algunas realizaciones, el HMO es 6'-SL.
En algunas realizaciones, el HMO es LNnT.
En algunas realizaciones, el HMO es LNT.
En algunas realizaciones, la solución de HMO comprende al menos dos HMO. En algunas realizaciones, la solución de HMO comprende al menos tres HMO. En algunas realizaciones, la solución de HMO comprende al menos cuatro HMO. En algunas realizaciones, la solución de HMO comprende al menos cinco HMO.
En algunas realizaciones, la solución de HMO comprende dos o más HMO seleccionados de fucosil-lactosas, sialillactosas, LNnT y LNT. En algunas de estas realizaciones, las fucosil-lactosas se seleccionan de 2'-FL, DiFL y 3-FL; y las sialil-lactosas se seleccionan de 3'-SL y 6'-SL.
En algunas realizaciones, la solución de HMO comprende 2'-FL y 3-FL.
En algunas realizaciones, la solución de HMO comprende 2'-FL y DiFL.
En algunas realizaciones, la solución de HMO comprende 3'-SL y 6'-SL.
Típicamente, la solución de HMO comprende además uno o más ingredientes además del o los HMO que se van a purificar. Estos otros ingredientes pueden incluir, por ejemplo, sales monovalentes y divalentes, lactosa, oligosacáridos, monosacáridos, aminoácidos, polipéptidos, proteínas, ácidos orgánicos, ácidos nucleicos, etc.
En algunas realizaciones, la solución de HMO comprende (además del o los HMO que se van a purificar) uno o más HMO adicionales y/o uno o más de otros tipos de carbohidratos.
En algunas realizaciones, la solución de HMO comprende (además del o los HMO que se van a purificar) uno o más oligosacáridos.
En algunas realizaciones, la solución de HMO comprende (además del o los HMO que se van a purificar) uno o más HMO adicionales.
En algunas realizaciones, la solución de HMO comprende (además del o los HMO que se van a purificar) uno o más HMO adicionales seleccionados de 2'-FL, 3-FL, LNT, 6'-SL, 3'-SL, DiFL, LNnT, lacto-N-fucopentaosa, lacto-N-difucohexaosa, lacto-N-neodifucohexaosa, lacto-N-neooctaosa, lacto-N-neofucopentaosa, 3'-sialil-3-fucosil-lactosa, sialil-lacto-N-tetraosa, LS-tetrasacárido, lacto-N-triosa, lacto-N-difucohexaosa, 6'-galactosil-lactosa, 3'-galactosillactosa, lacto-N-hexaosa, y lacto-N-neohexaosa.
En algunas realizaciones, la solución de HMO comprende (además del o los HMO que se van a purificar) 2'-O-fucosillactulosa.
En algunas realizaciones, la solución de HMO comprende (además del o los HMO que se van a purificar) DiFL. En algunas realizaciones, la solución de HMO comprende (además del o los HMO que se van a purificar) lactosa. En algunas realizaciones, la solución de HMO comprende (además del o los HMO que se van a purificar) lactulosa. En algunas realizaciones, la solución de HMO comprende (además del o los HMO que se van a purificar) uno o más monosacáridos.
En algunas realizaciones, la solución de HMO comprende (además del o los HMO que se van a purificar) fucosa. En algunas realizaciones, la solución de HMO comprende (además del o los HMO que se van a purificar y el segundo carbohidrato) glucosa.
En algunas realizaciones, la solución de HMO comprende (además del o los HMO que se van a purificar) galactosa. En algunas realizaciones, la solución de HMO comprende (además del o los HMO que se van a purificar) una o más sales monovalentes.
En algunas realizaciones, la solución de HMO comprende (además del o los HMO que se van a purificar) una o más sales divalentes.
En algunas realizaciones, la solución de HMO comprende (además del o los HMO que se van a purificar) uno o más aminoácidos.
En algunas realizaciones, la solución de HMO comprende (además del o los HMO que se van a purificar) una o más proteínas.
En algunas realizaciones, la solución de HMO comprende (además del o los HMO que se van a purificar) uno o más ácidos orgánicos.
En algunas realizaciones, la solución de HMO comprende (además del o los HMO que se van a purificar) uno o más ácidos nucleicos.
En algunas realizaciones, la solución de HMO comprende (o se deriva en todo o en parte de) un producto de una fermentación. En algunas de estas realizaciones, la solución de HMO es (o se deriva en todo o en parte de) el producto de una fermentación usada para elaborar el o los HMO que se van a purificar. En algunas de estas realizaciones, el otro o los otros carbohidratos en la solución proceden del medio de cultivo usado en la fermentación y/o formado durante y/o después de la fermentación. En algunas realizaciones, la fermentación comprende cultivar, en un medio acuoso que comprende un carbohidrato (tal como lactosa y/o fucosa), un microorganismo recombinante que comprende al menos una secuencia polinucleotídica recombinante que codifica una enzima capaz de producir un HMO. El producto del procedimiento de fermentación puede denominarse "producto" o "caldo" de fermentación. El producto comprende típicamente muchos ingredientes además del o los HMO que se van a purificar, incluyendo, por ejemplo, sales monovalentes y divalentes, lactosa, oligosacáridos, monosacáridos, aminoácidos, polipéptidos, proteínas, ácidos orgánicos, ácidos nucleicos, etc.
En algunas realizaciones, el o los HMO que se van a purificar son una fucosil-lactosa, y la solución de HMO comprende (o se deriva en todo o en parte de) un producto de un procedimiento de fermentación donde el procedimiento de fermentación comprende cultivar, en un medio de cultivo acuoso que comprende un carbohidrato (tal como lactosa y/o fucosa), un microorganismo recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica recombinante que codifica una a-1,2-fucosiltransferasa (EC 2.4.1.69) o a-1,3-fucosiltransferasa (EC 2.4.1.214).
En general, cuando la solución de HMO comprende (o se deriva en todo o en parte de) un producto de un procedimiento de fermentación, el procedimiento de esta memoria descriptiva comprende una o más etapas de procesamiento en las que la biomasa celular de los microorganismos usados en la fermentación se separa del producto de fermentación.
La biomasa se puede separar de un producto de fermentación usando, por ejemplo, filtración, centrifugación, sedimentación y/u otro procedimiento adecuado para retirar biomasa celular.
En algunas realizaciones, la separación de microorganismos de un producto de fermentación comprende ultrafiltración (también denominada "UF"). La ultrafiltración también puede ser particularmente beneficiosa, por ejemplo, para retirar biomoléculas grandes, tales como endotoxinas, proteínas, ácidos nucleicos y lipopolisacáridos.
En algunas realizaciones, la ultrafiltración se lleva a cabo usando una filtración de flujo cruzado. La configuración de membranas poliméricas usada puede ser, por ejemplo, un arrollamiento helicoidal, una fibra hueca o una unidad de placa y marco. La ultrafiltración también se puede llevar a cabo con membranas tubulares o de disco cerámico. Típicamente, el tamaño de poro de la membrana de ultrafiltración se puede elegir de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,001 gm, o de aproximadamente 200 kD a aproximadamente 1 kD.
En algunas realizaciones, la separación de microorganismos de un producto de fermentación comprende microfiltración (también denominada "MF") de flujo cruzado. Típicamente, el tamaño de poro de la membrana de MF es de aproximadamente 0,1 gm a aproximadamente 3 gm. La configuración de la membrana polimérica puede ser, por ejemplo, un arrollamiento helicoidal, una fibra hueca o una unidad de placa y marco. La microfiltración de flujo cruzado también se puede llevar a cabo con membranas tubulares cerámicas o de disco cerámico. Por otra parte, se pueden usar membranas de MF hechas de acero.
En algunas realizaciones, la separación de microorganismos de un producto de fermentación comprende centrifugación. Típicamente, esta centrifugación se lleva a cabo usando un separador de discos apilados que alcanza una fuerza de la gravedad de aproximadamente 3000 a aproximadamente 20000. La solución clarificada se puede purificar adicionalmente, por ejemplo, con tecnologías de filtración para obtener un líquido esencialmente libre de microbios.
En algunas realizaciones, la retirada de la biomasa celular se lleva a cabo a una temperatura de no más de aproximadamente 18°C. En algunas realizaciones, la retirada de la biomasa celular se lleva a cabo a una temperatura de no más de 16°C. En algunas realizaciones, la retirada de la biomasa celular se lleva a cabo a una temperatura de menos de 16°C. En algunas realizaciones, la retirada de la biomasa celular se lleva a cabo a una temperatura de no más de 15°C. En algunas realizaciones, la retirada de la biomasa celular se lleva a cabo a una temperatura de menos de 15 °C. En algunas realizaciones, la retirada de la biomasa celular se lleva a cabo a una temperatura de no más de 10°C. En algunas realizaciones, la retirada de la biomasa celular se lleva a cabo a una temperatura de menos de 10°C. En algunas realizaciones, la retirada de la biomasa celular se lleva a cabo a una temperatura de no más de 9°C. En algunas realizaciones, la retirada de la biomasa celular se lleva a cabo a una temperatura de menos de 9°C. En algunas realizaciones, la retirada de la biomasa celular se lleva a cabo a una temperatura de no más de 8°C. En algunas realizaciones, la retirada de la biomasa celular se lleva a cabo a una temperatura de menos de 8°C. En algunas realizaciones, la retirada de la biomasa celular se lleva a cabo a una temperatura de no más de 7°C. En algunas realizaciones, la retirada de la biomasa celular se lleva a cabo a una temperatura de menos de 7°C. En algunas realizaciones, la retirada de la biomasa celular se lleva a cabo a una temperatura de no más de 6°C. En algunas realizaciones, la retirada de la biomasa celular se lleva a cabo a una temperatura de menos de 6°C. En algunas realizaciones, la retirada de la biomasa celular se lleva a cabo a una temperatura de no más de 5°C. En algunas realizaciones, la retirada de la biomasa celular se lleva a cabo a una temperatura de menos de 5°C.
Agente antiespumante
Los agentes antiespumantes son aditivos químicos que reducen o impiden la formación de espuma o deshacen una espuma que ya se ha formado. En general, los agentes antiespumantes son tensioactivos. Los agentes antiespumantes se usan ampliamente en procedimientos de fermentación sumergida para controlar la acumulación de espuma en los fermentadores. Los agentes antiespumantes pueden ser bien naturales o bien sintéticos. Los agentes antiespumantes pueden ser, por ejemplo, a base de silicona, poliéteres, aceites naturales o polialcoholes. En algunas realizaciones, el agente antiespumante presenta un punto de opacificación. Estos agentes antiespumantes incluyen, por ejemplo, agentes antiespumantes a base de polialquilenglicol ("PAG"), tales como copolímeros de bloques de óxido de etileno/óxido de propileno ("EO/PO"); polialcoholes basados en copolímeros de bloques de EO/PO, y poliéteres de óxidos de etileno y propileno; y agentes antiespumantes a base de ésteres de ácido graso ("FE"), tales como ésteres de ácido graso alcoxilados.
En algunas realizaciones, el agente antiespumante se basa en ésteres de ácido graso. En algunas realizaciones, el agente antiespumante comprende uno o más ésteres de ácido graso alcoxilados sobre una base vegetal tal como, por ejemplo, STRUKTOL J673 o STRUKTOL J673A (Scill Seilacher "Struktol" GmbH, Hamburgo, Alemania) o aceites no minerales tales como, por ejemplo, FOAM BLAST 882 (DyStar Singapore Pte Ltd, Singapur). Los agentes antiespumantes se pueden usar solos o como una mezcla con otros agentes antiespumantes.
En algunas realizaciones, el agente antiespumante es iniónico.
Los agentes antiespumantes se pueden añadir al recipiente de fermentación antes del inicio de la fermentación para prevenir la formación de espuma. Alternativamente o adicionalmente, el agente antiespumante se añade durante la fermentación para prevenir la formación de espuma y/o destruir espuma que ya se ha formado. En algunos casos, un agente antiespumante añadido al recipiente de fermentación durante la fermentación se denomina desespumante. En algunos casos, un agente antiespumante se puede caracterizar como un "inhibidor de espuma" y/o un "rompedor de espuma". En la práctica, la mayoría de los productos químicos que dispersan la espuma pueden desempeñar cualquier papel.
El agente antiespumante generalmente debe ser seguro para los microorganismos usados en la fermentación. El agente antiespumante generalmente tampoco debe reaccionar con el producto de HMO deseado ni afectar al color o el olor del producto de HMO. En algunas realizaciones, el agente antiespumante es esterilizable mediante tratamiento en autoclave o calor seco en ciertas condiciones.
En algunas realizaciones, la concentración del agente antiespumante en la solución de HMO es de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 g/kg (DS). En algunas realizaciones, la concentración del agente antiespumante en la solución de HMO es de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 g/kg (DS). En algunas realizaciones, la concentración del agente antiespumante en la solución de HMO es de 3 a 45 g/kg (DS).
La concentración del agente antiespumante en las soluciones del procedimiento se puede determinar usando, por ejemplo, estuches de prueba disponibles comercialmente adecuados para medir agentes antiespumantes solubles, tales como la prueba de la cubeta para tensioactivos iniónicos LCK 433 (Hach Lange GmbH, Dusseldorf, Alemania).
Punto de opacificación
Cuando se incrementa la temperatura de una solución acuosa que comprende un agente antiespumante (particularmente un agente antiespumante tensioactivo iniónico), se alcanza una temperatura a la que la solución parece opaca. La temperatura mínima a la que la solución acuosa de agente antiespumante se vuelve opaca (o turbia) se denomina el "punto de opacificación". Los puntos de opacificación de los agentes antiespumantes varían típicamente de 0°C a 100°C, y generalmente está limitados por los puntos de congelación y ebullición del agua. La presencia de otros componentes, como sales, en una solución puede disminuir o incrementar el punto de opacificación del agente antiespumante.
El punto de opacificación de los agentes antiespumantes se puede medir con un turbidímetro. Una solución de agente antiespumante que presenta un punto de opacificación habitualmente es visiblemente turbia a temperaturas mayores que la temperatura del punto de opacificación. La turbidez se puede medir y usar como una indicación de la presencia de agente antiespumante y otros componentes que precipitan.
La temperatura del punto de opacificación se determina separadamente para cada agente antiespumante en cada solución de HMO diferente. Esto se realiza midiendo la turbidez de una solución de HMO que contiene agente antiespumante a diferentes temperaturas.
En general, el agente antiespumante usado en un procedimiento descrito en esta memoria descriptiva comprende un agente antiespumante que presenta un punto de opacificación. La temperatura del fermentador durante la fermentación puede ser mayor o menor que el punto de opacificación del agente antiespumante. En general, la temperatura de fermentación se selecciona basándose en los requisitos del producto que se vaya a producir y el microorganismo usado en la fermentación. En algunas realizaciones, la temperatura del fermentador durante una fermentación de HMO (p. ej., una fermentación de 2'-FL o una fermentación de 3-FL) es de aproximadamente 35 a aproximadamente 39°C. En general, una fermentación de HMO se mantiene a menos de 50°C. En algunas realizaciones, la temperatura de fermentación es un factor usado para elegir un agente antiespumante adecuado. En algunas realizaciones, la temperatura del punto de opacificación del agente antiespumante seleccionado es mayor que la temperatura de fermentación (o mayor que la temperatura usada durante al menos una parte de la fermentación). En algunas realizaciones, el uso de una temperatura de fermentación que sea menor que la temperatura del punto de opacificación del agente antiespumante hace al agente antiespumante más eficaz durante la fermentación.
En algunas realizaciones, la temperatura del punto de opacificación del agente antiespumante seleccionado es menor que la temperatura de fermentación (o menor que la temperatura usada durante al menos una parte de la fermentación). En algunas realizaciones, el uso de una temperatura de fermentación que es mayor que la temperatura del punto de opacificación del agente antiespumante hace al agente antiespumante más eficaz durante la fermentación.
Retirada del agente antiespumante
Después de la fermentación, generalmente se desea retirar sustancialmente el agente antiespumante del producto de HMO. En algunas realizaciones, se retira al menos aproximadamente 80% del agente antiespumante presente en la solución del producto de fermentación de HMO. En algunas realizaciones, se retira al menos 96% del agente antiespumante presente en la solución del producto de fermentación de HMO. En algunas realizaciones, se retira al menos 97% del agente antiespumante presente en la solución del producto de fermentación de HMO. En algunas realizaciones, se retira al menos 98% del agente antiespumante presente en la solución del producto de fermentación de HMO. En algunas realizaciones, se retira al menos 99% del agente antiespumante presente en la solución del producto de fermentación de HMO.
La biomasa celular se puede retirar del caldo de fermentación usando, por ejemplo, ultrafiltración y/o centrifugación. En algunas realizaciones, se llevan a cabo una o más etapas de purificación y/o concentración después de la retirada de las células. Estas etapas de purificación y/o concentración pueden incluir, por ejemplo, nanofiltración, intercambio iónico aniónico, intercambio iónico catiónico, tratamiento con carbono activado, cromatografía de filtración en gel, electrodiálisis, evaporación, cristalización o secado por pulverización.
En algunas realizaciones, el procedimiento comprende una etapa de retirada de agente antiespumante antes de la retirada de biomasa celular (p. ej., antes de la ultrafiltración). En algunas realizaciones, el procedimiento comprende una etapa de retirada de agente antiespumante después de la retirada de biomasa celular (p. ej., después de la ultrafiltración).
En algunas realizaciones, el procedimiento comprende una etapa de retirada de agente antiespumante antes de una etapa de nanofiltración. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende una etapa de retirada de agente antiespumante después de una etapa de nanofiltración. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende una etapa de retirada de agente antiespumante antes y después de una etapa de nanofiltración.
En algunas realizaciones, el agente antiespumante se precipita durante una etapa de retirada de agente antiespumante a una temperatura que es al menos la temperatura del punto de opacificación del agente antiespumante. En algunas realizaciones, el agente antiespumante se precipita durante una etapa de retirada de agente antiespumante a una temperatura que es de 0°C a 10°C mayor que la temperatura del punto de opacificación del agente antiespumante. En algunas realizaciones, el agente antiespumante se precipita durante una etapa de retirada de agente antiespumante a una temperatura que es de 0°C a 5°C mayor que la temperatura del punto de opacificación del agente antiespumante. En algunas realizaciones, el agente antiespumante se precipita durante una etapa de retirada de agente antiespumante a una temperatura que es de 0°C a 2°C mayor que la temperatura del punto de opacificación del agente antiespumante. En algunas realizaciones, el agente antiespumante se precipita durante una etapa de retirada de agente antiespumante a una temperatura que es de 0°C a 1°C mayor que la temperatura del punto de opacificación del agente antiespumante. En algunas realizaciones, el agente antiespumante se precipita durante una etapa de retirada de agente antiespumante a una temperatura que es aproximadamente igual a la temperatura del punto de opacificación del agente antiespumante.
En algunas realizaciones, la temperatura a la que se efectúa la retirada del agente antiespumante está dentro de aproximadamente 5°C de la temperatura a la que la solución de HMO presenta una turbidez máxima. En algunas realizaciones, la temperatura a la que se efectúa la retirada del agente antiespumante está dentro de 4°C de la temperatura la que la solución de HMO presenta una turbidez máxima. En algunas realizaciones, la temperatura a la que se efectúa la retirada del agente antiespumante está dentro de 3°C de la temperatura a la que la solución de HMO presenta una turbidez máxima. En algunas realizaciones, la temperatura a la que se efectúa la retirada del agente antiespumante está dentro de 2°C de la temperatura a la que la solución de HMO presenta una turbidez máxima. En algunas realizaciones, la temperatura a la que se efectúa la retirada del agente antiespumante está dentro de 1 °C de la temperatura a la que la solución de HMO presenta una turbidez máxima. En algunas realizaciones, la temperatura a la que se efectúa la retirada del agente antiespumante es aproximadamente la temperatura a la que la solución de HMO presenta una turbidez máxima.
En algunas realizaciones, la retirada del antiespumante se efectúa a una temperatura de 36 a 65°C. En algunas realizaciones, la retirada del antiespumante se efectúa a una temperatura de 40 a 65°C. En algunas realizaciones, la retirada del antiespumante se efectúa a una temperatura de 36 a 60°C. En algunas realizaciones, la retirada del antiespumante se efectúa a una temperatura de 43 a 55°C. En algunas realizaciones, la retirada del antiespumante se efectúa a una temperatura de 50 a 55°C. En algunas realizaciones, la retirada del antiespumante se efectúa a una temperatura de aproximadamente 50°C. En algunas realizaciones, la retirada del antiespumante se efectúa a una temperatura de aproximadamente 55°C.
En algunas realizaciones, después de que se haya precipitado la mayor parte del agente antiespumante, el agente antiespumante precipitado se separa de la solución de HMO usando, por ejemplo, filtración y/o centrifugación. En algunas realizaciones, se usa un adyuvante de filtración para permitir adicionalmente la separación. Este adyuvante de filtración puede incluir, por ejemplo, celulosa, carbono activado, tierra de diatomeas o una combinación de cualesquiera de los anteriores. En algunas realizaciones, se usa celulosa como adyuvante de filtración. En algunas realizaciones, se usa tierra de diatomeas como adyuvante de filtración. En algunas realizaciones, se usa carbono activado como adyuvante de filtración. En algunas realizaciones, se usa carbono activado en polvo como adyuvante de filtración.
Los adyuvantes de filtración se pueden mezclar en la solución de HMO que contiene agente antiespumante antes de la filtración de la solución. En algunas realizaciones, la cantidad de adyuvante de filtración usada es de 0,5 a 3% (en peso) del líquido de alimentación. En algunas realizaciones, la cantidad de adyuvante de filtración usada es de 0,5 a 2% (en peso) del líquido de alimentación. En algunas realizaciones, la cantidad de adyuvante de filtración usada es de 0,5 a 1% (en peso) del líquido de alimentación. En algunas realizaciones, la cantidad de adyuvante de filtración usada es aproximadamente 0,5% (en peso) del líquido de alimentación. En algunas realizaciones, la cantidad de adyuvante de filtración usada es aproximadamente 1% (en peso) del líquido de alimentación. En algunas realizaciones, la cantidad de adyuvante de filtración usada es aproximadamente 2% (en peso) del líquido de alimentación.
En algunas realizaciones, el adyuvante de filtración también se aplica como prerrevestimiento sobre el filtro. En algunas realizaciones, se aplican de 1 a 2 kg/m2 del adyuvante de filtración como prerrevestimiento sobre el filtro. En algunas realizaciones, se aplican de 1 a 1,5 kg/m2 del adyuvante de filtración como prerrevestimiento sobre el filtro. En algunas realizaciones, se aplican de 1,5 a 2 kg/m2 del adyuvante de filtración como prerrevestimiento sobre el filtro. En algunas realizaciones, se aplica aproximadamente 1 kg/m2 del adyuvante de filtración como prerrevestimiento sobre el filtro. En algunas realizaciones, se aplican aproximadamente 1,5 kg/m2 del adyuvante de filtración como prerrevestimiento sobre el filtro. En algunas realizaciones, se aplican aproximadamente 2 kg/m2 del adyuvante de filtración como prerrevestimiento sobre el filtro.
El equipo de filtración se puede seleccionar, por ejemplo, de un filtro de profundidad, un filtro de placa y marco o un filtro de vela. Además, se pueden usar separadores centrífugos.
En algunas realizaciones, el agente antiespumante soluble remanente se retira usando carbono activado en polvo.
En algunas realizaciones, una etapa de retirada de agente antiespumante se repite dos o más veces, particularmente cuando la solución contiene una gran cantidad de agente antiespumante. En algunas realizaciones, se usa el mismo adyuvante de filtración en la primera etapa de retirada de agente antiespumante y en la etapa posterior de retirada de agente antiespumante. En algunas realizaciones, se usa un adyuvante de filtración en la primera etapa de retirada de agente antiespumante y se usa otro adyuvante de filtración en la etapa posterior de retirada de agente antiespumante.
En algunas realizaciones, el punto o los puntos durante el procedimiento de purificación de HMO en los que se retira el agente antiespumante se seleccionan basándose en consideraciones medioambientales y económicas, p. ej., evitando etapas de calentamiento y/o enfriamiento adicionales.
En algunas realizaciones, el agente antiespumante se retira de un licor de procesamiento intermedio, tal como de un permeado de una filtración con membrana, un concentrado de una filtración con membrana, una solución intercambiada iónicamente, aguas madres de cristalización o similares. En realizaciones adicionales o alternativas, el agente antiespumante se retira de un producto final. Un producto final de HMO puede ser, por ejemplo, un jarabe, un polvo secado por pulverización o un producto cristalino. En algunos casos, cuando el agente antiespumante se retira de un producto cristalino o secado por pulverización, el producto se disuelve y la solución resultante se calienta a continuación hasta una temperatura mayor que el punto de opacificación del agente antiespumante para formar un precipitado, que, a su vez, se retira mediante filtración, usando opcionalmente un adyuvante de filtración, tal como, por ejemplo, tierra de diatomeas, carbono activado o celulosa.
En algunas realizaciones, el agente antiespumante se retira antes de una etapa de intercambio iónico para reducir la formación de incrustaciones de la resina de intercambio iónico. Si se usa carbono activado para la retirada del agente antiespumante, la solución de procesamiento resultante contendrá típicamente menos color, lo que puede ser útil durante la etapa de intercambio iónico posterior.
En algunas realizaciones, el agente antiespumante se retira después de una etapa de nanofiltración. En este caso, el contenido de sal del licor de procesamiento típicamente será menor que el contenido de sal antes de la etapa de nanofiltración, y el contenido de sustancia seca será típicamente superior. Un menor contenido de sal da como resultado una filtración mejor y más fácil del agente antiespumante durante la retirada del agente antiespumante. Una solución de procesamiento nanofiltrada concentrada tiene menos volumen, lo que, a su vez, se traduce típicamente en menos coste de filtración para retirar el agente antiespumante.
En algunas realizaciones, el agente antiespumante se precipita y se retira de la solución de HMO según se analiza en el presente documento, y a continuación la solución de HMO se somete a una etapa de evaporación, que también incluye de nuevo calentar hasta una temperatura mayor que la temperatura del punto de opacificación del agente antiespumante.
Durante el procedimiento de fabricación y purificación de HMO, la precipitación prematura no deseada del agente antiespumante se puede minimizar generalmente al procesar la solución de HMO a temperaturas que sean menores que la temperatura del punto de opacificación del agente antiespumante. En algunas realizaciones, la temperatura de procesamiento en las diversas etapas de procesamiento antes de la retirada del agente antiespumante se mantiene a de aproximadamente 1 a aproximadamente 25°C. En algunas realizaciones, la temperatura de procesamiento en las diversas etapas de procesamiento antes de la retirada del agente antiespumante se mantiene a de 5 a 20°C. En algunas realizaciones, la temperatura de procesamiento en las diversas etapas de procesamiento antes de la retirada del agente antiespumante se mantiene a de 5 a 15°C. En algunas realizaciones, la temperatura de procesamiento en las diversas etapas de procesamiento antes de la retirada del agente antiespumante se mantiene a de 5 a 10°C. En algunas realizaciones, la temperatura de procesamiento en las diversas etapas de procesamiento antes de la retirada del agente antiespumante se mantiene a de 5 a 8°C. En algunas realizaciones, la temperatura de procesamiento en las diversas etapas de procesamiento antes de la retirada del agente antiespumante se mantiene a menos de 10°C. En algunas realizaciones, la temperatura de procesamiento en las diversas etapas de procesamiento antes de la retirada del agente antiespumante se mantiene a menos de 8°C. En algunas realizaciones, la temperatura de procesamiento en las diversas etapas de procesamiento antes de la retirada del agente antiespumante se mantiene a menos de 7°C. En algunas realizaciones, la temperatura de procesamiento en las diversas etapas de procesamiento antes de la retirada del agente antiespumante se mantiene a menos de 6°C. En algunas realizaciones, la temperatura de procesamiento en las diversas etapas de procesamiento antes de la retirada del agente antiespumante se mantiene a menos de 5°C.
En algunas realizaciones, la concentración de sustancia seca en la solución de HMO que contiene agente antiespumante es de 3 a 30 g/100 g cuando la solución se alimenta a una etapa de retirada de agente antiespumante descrita en el presente documento. En algunas realizaciones, la concentración de sustancia seca en la solución de HMO que contiene agente antiespumante es de 3 a 20 g/100 g cuando la solución se alimenta a una etapa de retirada de agente antiespumante descrita en el presente documento. En algunas realizaciones, la concentración de sustancia seca en la solución de HMO que contiene agente antiespumante es de 10 a 30 g/100 g cuando la solución se alimenta a una etapa de retirada de agente antiespumante descrita en el presente documento. En algunas realizaciones, la concentración de sustancia seca en la solución de HMO que contiene agente antiespumante es de 14 a 30 g/100 g cuando la solución se alimenta a una etapa de retirada de agente antiespumante descrita en el presente documento.
En algunas realizaciones, se retira al menos 80% del agente antiespumante en la solución de HMO. En algunas realizaciones, se retira al menos 90% del agente antiespumante en la solución de HMO. En algunas realizaciones, se retira al menos 96% del agente antiespumante en la solución de HMO. En algunas realizaciones, se retira al menos 98% del agente antiespumante en la solución de HMO. En algunas realizaciones, se retira al menos 99% del agente antiespumante en la solución de HMO.
En algunas realizaciones, la concentración de agente antiespumante en la solución de HMO después de la etapa de retirada de agente antiespumante es de aproximadamente 5 a aproximadamente 12.500 mg/kg (DS). En algunas realizaciones, la concentración de agente antiespumante en la solución de HMO después de la etapa de retirada de agente antiespumante es de 6 a 12.200 mg/kg (DS). En algunas realizaciones, la concentración de agente antiespumante en la solución de HMO después de la etapa de retirada de agente antiespumante es menor de 12.500 mg/kg (DS). En algunas realizaciones, la concentración de agente antiespumante en la solución de HMO después de la etapa de retirada de agente antiespumante es menor de 12.200 mg/kg (DS). En algunas realizaciones, la concentración de agente antiespumante en la solución de HMO después de la etapa de retirada de agente antiespumante es menor de 12.000 mg/kg (DS). En algunas realizaciones, la concentración de agente antiespumante en la solución de HMO después de la etapa de retirada de agente antiespumante es menor de 10.000 mg/kg (DS). En algunas realizaciones, la concentración de agente antiespumante en la solución de HMO después de la etapa de retirada de agente antiespumante es menor de 7.000 mg/kg (DS). En algunas realizaciones, la concentración de agente antiespumante en la solución de HMO después de la etapa de retirada de agente antiespumante es menor de 6.000 mg/kg (DS). En algunas realizaciones, la concentración de agente antiespumante en la solución de HMO después de la etapa de retirada de agente antiespumante es menor de 5.000 mg/kg (DS). En algunas realizaciones, la concentración de agente antiespumante en la solución de HMO después de la etapa de retirada de agente antiespumante es menor de 4.000 mg/kg (DS). En algunas realizaciones, la concentración de agente antiespumante en la solución de HMO después de la etapa de retirada de agente antiespumante es menor de 3.000 mg/kg (DS). En algunas realizaciones, la concentración de agente antiespumante en la solución de HMO después de la etapa de retirada de agente antiespumante es menor de 2.000 mg/kg (DS). En algunas realizaciones, la concentración de agente antiespumante en la solución de HMO después de la etapa de retirada de agente antiespumante es menor de 1.000 mg/kg (DS). En algunas realizaciones, la concentración de agente antiespumante en la solución de HMO después de la etapa de retirada de agente antiespumante es menor de 900 mg/kg (DS). En algunas realizaciones, la concentración de agente antiespumante en la solución de HMO después de la etapa de retirada de agente antiespumante es menor de 800 mg/kg (DS). En algunas realizaciones, la concentración de agente antiespumante en la solución de HMO después de la etapa de retirada de agente antiespumante es menor de 600 mg/kg (DS). En algunas realizaciones, la concentración de agente antiespumante en la solución de HMO después de la etapa de retirada de agente antiespumante es menor de 400 mg/kg (DS). En algunas realizaciones, la concentración de agente antiespumante en la solución de HMO después de la etapa de retirada de agente antiespumante es menor de 200 mg/kg (DS). En algunas realizaciones, la concentración de agente antiespumante en la solución de HMO después de la etapa de retirada de agente antiespumante es menor de 100 mg/kg (DS). En algunas realizaciones, la concentración de agente antiespumante en la solución de HMO después de la etapa de retirada de agente antiespumante es menor de 50 mg/kg (DS). En algunas realizaciones, la concentración de agente antiespumante en la solución de HMO después de la etapa de retirada de agente antiespumante es menor de 10 mg/kg (DS).
En algunas realizaciones, la solución de HMO se enfría hasta una temperatura de menos de 20°C después de la retirada del agente antiespumante según se divulga en el presente documento. En algunas realizaciones, la solución de HMO se enfría hasta una temperatura de menos de 15°C después de la retirada del agente antiespumante según se divulga en el presente documento. En algunas realizaciones, la solución de HMO se enfría hasta una temperatura de menos de 10°C después de la retirada del agente antiespumante según se divulga en el presente documento. En algunas realizaciones, la solución de HMO se enfría hasta una temperatura de menos de 5°C después de la retirada del agente antiespumante según se divulga en el presente documento.
En algunas realizaciones, una etapa de retirada de agente antiespumante de una solución de HMO según se divulga en esta memoria descriptiva no afecta sustancialmente (p. ej., un cambio en más de aproximadamente 1%) al % de superficie de los carbohidratos (p. ej., azúcares) de la solución de HMO.
Tratamientos adicionales
En algunas realizaciones, el procedimiento comprende someter la solución de HMO a uno o más de los siguientes tratamientos: un tratamiento enzimático (p. ej., hidrólisis enzimática de lactosa), nanofiltración, electrodiálisis, cromatografía, intercambio iónico (p. ej., intercambio iónico catiónico, intercambio iónico aniónico o ambos), evaporación, carbono activado, cristalización, evaporación y/o secado por pulverización.
Los tratamientos adicionales pueden llevarse a cabo típicamente en diversos órdenes, así como repetirse en diferentes puntos en el procedimiento. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende una combinación de al menos tres de los tratamientos adicionales anteriores. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende una combinación de al menos cuatro de los tratamientos adicionales anteriores.
En algunas realizaciones, el procedimiento comprende al menos una etapa de intercambio catiónico. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende al menos una etapa de intercambio aniónico. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende tanto una etapa de intercambio catiónico como una etapa de intercambio aniónico.
En algunas realizaciones, la solución de HMO se somete a evaporación. Esto puede ser útil, por ejemplo, para concentrar el HMO al retirar un disolvente (p. ej., agua). En algunas realizaciones, la evaporación es la etapa de purificación final del HMO deseado.
En algunas realizaciones, la solución de HMO se somete a secado por pulverización. En algunas realizaciones, el secado por pulverización se lleva a cabo bajo las condiciones analizadas en el documento WO2019/160922. En algunas realizaciones, la alimentación de HMO al secador de pulverización tiene un valor Brix de aproximadamente 8 a aproximadamente 75% Brix. En algunas realizaciones, el valor Brix es de aproximadamente 30 a aproximadamente 65% Brix. En algunas realizaciones, el valor Brix es de aproximadamente 50 a aproximadamente 60% Brix. En algunas realizaciones, la alimentación al secador de pulverización está a una temperatura de aproximadamente 2 a aproximadamente 70°C inmediatamente antes de dispersarse en gotículas en el secador de pulverización. En algunas realizaciones, la alimentación al secador de pulverización está a una temperatura de aproximadamente 30 a aproximadamente 60°C inmediatamente antes de dispersarse en gotículas en el secador de pulverización. En algunas realizaciones, la alimentación al secador de pulverización está a una temperatura de aproximadamente 2 a aproximadamente 30°C inmediatamente antes de dispersarse en gotículas en el secador de pulverización En algunas realizaciones, el secado por pulverización se lleva a cabo a una temperatura de aproximadamente 20 a aproximadamente 90°C. En algunas realizaciones, el secado por pulverización es la etapa de purificación final para el HMO deseado.
En algunas realizaciones, el procedimiento comprende cristalización. En algunas realizaciones, no se usa disolvente orgánico durante la cristalización. En algunas realizaciones, la cristalización comprende un procedimiento de cristalización divulgado en el documento WO2018/164937. En algunas realizaciones, la cristalización es la etapa de purificación final del HMO deseado. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende tanto cristalización como evaporación. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende tanto cristalización como secado por pulverización.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos son meramente ilustrativos, y no limitan de ningún modo el resto de esta memoria descriptiva. Las turbideces de las soluciones de HMO se midieron a temperatura ambiente.
Las concentraciones de agente antiespumante en las soluciones de HMO se midieron a temperatura ambiente. Ejemplo 1
Retirada de agente antiespumante de una solución de 2'-FL
Se usó como alimentación una solución de 2'-FL, que contenía STRUKTOL J673 como agente antiespumante. Se usaron celulosa en polvo ARBOCEL B-800 (JRS Pharma GmbH & Co. KG, Rosenberg, Alemania) y carbono activado NORIT DX1 (Cabot Switzerland GmbH, Schaffuausen, Suiza) como adyuvantes de filtración para la retirada del agente antiespumante. El material de la alimentación se calentó hasta 55°C en un recipiente reactor encamisado con agitación. El adyuvante de filtración (1% del peso del líquido de alimentación) se añadió al reactor. La mezcla resultante se incubó a 55°C con agitación durante aproximadamente 1 h. Después de prerrevestir un filtro de profundidad SEITZ (Pall Corp., Hampshire, Reino Unido) con el adyuvante de filtración (1,5 kg/m2), la mezcla se hizo circular a través del filtro de profundidad durante 0,5 h, y el filtrado resultante se recogió a continuación. La concentración de agente antiespumante se midió en todas las muestras con un HACH LCK 433.
Las propiedades de la solución de 2'-FL antes de la retirada del antiespumante se muestran en la Tabla 1-1.
TABLA 1-1
Propiedades de la solución de 2'-FL antes de la retirada del antiespumante
Y las propiedades de la solución de 2'-FL después de la retirada del agente antiespumante se muestran en la Tabla 1-2.
TABLA 1 -2
Propiedades de la solución de 2'-FL después de la retirada del antiespumante
Como puede observarse, cuando se usaba tratamiento con celulosa en polvo ARBOCEL B-800, se retiraba 82,3% del agente antiespumante. Y cuando se usaba tratamiento con carbono activado NORIT DX1, se retiraba 98,8% del agente antiespumante. El tratamiento con NORIT DX1 también reducía el color. En ambos casos, la retirada del agente antiespumante no afectaba sustancialmente a los porcentajes de superficie de HPLC de los HMO.
Ejemplo 2
Retirada del agente antiespumante de una solución de 2'-FL
Se usó como alimentación una solución de 2'-FL, que contenía STRUKTOL J673 como agente antiespumante. Se usó carbono activado NORIT DX1 como adyuvante de filtración para la retirada del agente antiespumante. El material de la alimentación se calentó hasta 50-55°C con agitación. Se añadió al reactor el adyuvante de filtración (1% del peso del líquido de alimentación). La mezcla resultante se incubó a 50-55°C con agitación durante aproximadamente 1 h. A continuación, la mezcla se hizo circular a través de un filtro de profundidad SEITZ durante aproximadamente 0,5 h a 55°C, y el filtrado resultante se recogió a continuación. La concentración de agente antiespumante se midió a partir de la muestra de alimentación con un HACH LCK 433, y a partir del producto con un HACH LCK 333.
Las propiedades de la solución de 2'-FL antes de la retirada del agente antiespumante se muestran en la Tabla 2-1. TABLA 2-1
Propiedades de la solución de 2'-FL antes de la retirada del antiespumante
Y las propiedades de la solución de 2'-FL después de la retirada del agente antiespumante se muestran en la Tabla 2-2.
TABLA 2-2
Propiedades de la solución de 2'-FL después de la retirada del antiespumante
Con el tratamiento con carbono activado NORIT DX1, se retiraba 98,0% del agente antiespumante. Además, se retiraba 92,2% del color.
Ejemplo 3
Retirada de la turbidez de una solución de 2'-FL
Se usó como alimentación una solución de 2'-FL, que contenía STRUKTOL J673 como agente antiespumante. Se usaron como adyuvantes de filtración tierra de diatomeas KENITE 300 (Imerys, Paris, Francia), carbono activado NORIT DX1 y celulosa en polvo ARBOCEL B-800. El material de la alimentación se calentó hasta 50°C con agitación. El efecto de cada adyuvante de filtración se probó añadiéndolo como alimentación en masa a la solución de 2'-FL y a continuación incubando la mezcla a 50°C con agitación durante aproximadamente 1 h. En cada caso, la filtración se efectuaba usando un filtro de profundidad SEITZ prerrevestido con el adyuvante de filtración que se probaba.
Las propiedades de la solución de 2'-FL antes de la retirada del antiespumante se muestran en la Tabla 3-1.
TABLA 3-1
Propiedades de la solución de 2'-FL antes de la retirada del antiespumante
Las propiedades de las soluciones de 2'-FL después de cada tratamiento de retirada de antiespumante se muestran en la Tabla 3-2.
TABLA 3-2
Propiedades de la solución de 2'-FL después de la retirada del antiespumante
Ejemplo 4
Retirada del agente antiespumante de una solución de 2'-FL
Se usó como alimentación una solución de 2'-FL, que contenía STRUKTOL J673A como agente antiespumante. Se usaron como adyuvantes de filtración carbono activado NORIT DX1 y tierra de diatomeas CLARCEL CBR3 (Chemviron, Feluy, Bélgica). El material de la alimentación se calentó hasta 50°C con agitación. El efecto de cada adyuvante de filtración se probó añadiéndolo como alimentación en masa al material de alimentación y a continuación incubando la mezcla a 50°C con agitación durante aproximadamente 1 h. La filtración se efectuó usando un filtro de profundidad SEITZ prerrevestido con el adyuvante de filtración que se usa. El material se hizo circular a través del filtro durante aproximadamente 0,5 h, y a continuación se recogió el filtrado resultante. La concentración de agente antiespumante se midió en todas las muestras con un HACH LCK 433.
Las propiedades de la solución de 2'-FL antes de la retirada del antiespumante se muestran en la Tabla 4-1.
TABLA 4-1
Propiedades de la solución de 2'-FL antes de la retirada del antiespumante
Las propiedades de las soluciones de 2'-FL después de cada tratamiento se muestran en la Tabla 4-2.
TABLA 4-2
Propiedades de la solución de 2'-FL después de la retirada del antiespumante
Usando carbono activado NORIT DX1 como adyuvante de filtración, se retiraron 96,9% de agente antiespumante y 99,7% de turbidez. Usando tierra de diatomeas CLARCEL CBR3 como adyuvante de filtración, se retiraron 25,2% de agente antiespumante y 97,1% de turbidez. Se cree que la filtración usando el CLARCEL CBR3 retiraba esencialmente solo antiespumante insoluble, lo que daba como resultado un filtrado que tenía todavía una gran cantidad de agente antiespumante remanente. Se cree que la filtración usando el NORIT DX1, en contraste, ha retirado antiespumante tanto insoluble como soluble, dando como resultado un filtrado que contiene mucho menos agente antiespumante remanente.
Ejemplo 5
Retirada del agente antiespumante de la solución de 2'-FL
Se usó como alimentación una solución de 2'-FL, que contenía STRUKTOL J673 como agente antiespumante. Se usaron NORIT DX1 y carbono activado GBSP como adyuvantes de filtración para la retirada del agente antiespumante. El material de la alimentación se calentó hasta 55°C en un recipiente reactor encamisado con agitación. Se añadió al reactor el adyuvante de filtración (1% del peso del líquido de alimentación). La mezcla resultante se incubó a continuación a 55°C con agitación durante aproximadamente 1 h. La solución se hizo circular posteriormente a través de un filtro de vela FUNDABAC (DrM, Maennedorf, Suiza) durante 1 h, y a continuación se recogió el filtrado resultante. El filtrado se dirigió de nuevo al recipiente de alimentación. En ningún caso el filtro se prerrevestía con el adyuvante de filtración.
Las propiedades de la solución de 2'-FL antes de la retirada del antiespumante se muestran en la Tabla 5-1.
TABLA 5-1
Propiedades de la solución de 2'-FL antes de la retirada del antiespumante
Las propiedades de las soluciones de 2'-FL después de la retirada del agente antiespumante se muestran en la Tabla 5-2.
TABLA 5-2
Propiedades de la solución de 2'-FL después de la retirada del antiespumante
Como puede observarse, con el adyuvante de filtración de carbono activado NORIT GBSP, se retiraba 84,7% del agente antiespumante. Y con el adyuvante de filtración de carbono activado NORIT DX1, se retiraba 98,1% del agente antiespumante. El uso del adyuvante de filtración de carbono activado NORIT DX1 también reducía más el color. Para reducir el agente antiespumante y el color aún más, se efectuó una segunda retirada de antiespumante, de nuevo usando NORIT DX1 y GBSP como adyuvantes de filtración. El tratamiento se llevó a cabo con los mismos parámetros que con la primera filtración. Los resultados se muestran en la Tabla 5-3.
TABLA 5-3
Propiedades de la solución de 2'-FL después de dos etapas de retirada de antiespumante
Con dos etapas de retirada de antiespumante usando carbono activado NORIT DX1 como adyuvante de filtración, se retiraba 99,7% del agente antiespumante. Y con dos etapas de retirada de antiespumante usando NORIT GBSP como adyuvante de filtración, se retiraba 99,8% del agente antiespumante.
Ejemplo 6
Retirada del agente antiespumante de una solución de 2'-FL
Se usó como alimentación una solución de 2'-FL, que contenía STRUKTOL J673 como agente antiespumante. Se usó carbono activado NORIT DX1 como adyuvante de filtración para la retirada del agente antiespumante. El material de la alimentación se calentó hasta 50°C en un recipiente reactor encamisado con agitación. El adyuvante de filtración (1,15% del peso del líquido de alimentación) se añadió al reactor. La mezcla resultante se incubó a 50°C con agitación durante aproximadamente 1 h. A continuación, la mezcla se hizo circular a través de un filtro de placa y marco (filtro de profundidad SEITZ, sin prerrevestimiento con el adyuvante de filtración) durante 40 min, y a continuación el filtrado resultante se recogió. El filtrado se dirigió de nuevo al recipiente de alimentación, y a continuación se repitió el tratamiento con carbono activado.
Las propiedades de la solución de 2'-FL se muestran en la Tabla 6-1.
TABLA 6-1
Con el primer tratamiento con carbono activado NORIT DX1, se retiraba 95% del agente antiespumante. Con el segundo tratamiento con NORIT DX1, se retiraba 99% del agente antiespumante. La turbidez era mayor que el intervalo de medición (>1.000 NTU) en la alimentación. El primer tratamiento con carbono activado NORIT DX1 reducía la turbidez hasta 241 NTU, y el segunda tratamiento reducía la turbidez hasta 10 NTU. El primer tratamiento con carbono activado NORIT DX1 reducía el contenido de color de 49.200 ICUMSA a 23.400 ICUMSA, y el segundo tratamiento reducía el contenido de color hasta 8.500 ICUMSA. Los tratamientos no afectaban sustancialmente al perfil de % de superficie de HMO, el pH o la conductividad.
Ejemplo 7
Retirada de agente antiespumante de una solución de 3-FL
Se usó como alimentación una solución de 3-FL, que contenía STRUKTOL J673A como agente antiespumante. Se usó carbono activado NORIT DX1 como adyuvante de filtración para la reducción del agente antiespumante. El siguiente procedimiento de reducción de agente antiespumante se efectuó dos veces. El material de la alimentación se calentó hasta 55°C en un recipiente encamisado con agitación. El adyuvante de filtración (2% del peso del líquido de alimentación) se añadió a continuación al reactor. La mezcla resultante se incubó a 55°C con agitación durante aproximadamente 1 h. Después de la incubación, la mezcla se hizo circular a través de un filtro de profundidad SEITZ durante aproximadamente 0,5 h, y a continuación el filtrado resultante se recogió. La concentración de agente antiespumante se midió a partir de la alimentación con un HACH LCK 433, y a partir del producto con un HACH LCK 333.
Las propiedades de la solución de 3-FL antes de la retirada del antiespumante se muestran en la Tabla 7-1.
TABLA 7-1
Propiedades de la solución de 3-FL antes de la retirada del antiespumante
Las propiedades del concentrado de nanofiltración de 3-FL después de la reducción del agente antiespumante se muestran en la Tabla 7-2.
TABLA 7-2
Propiedades del concentrado de nanofiltración de 3-FL después de la retirada del antiespumante
Como puede observarse, se retiraba 99,8% del agente antiespumante. Además, se retiraba 93,6% del color.
Ejemplo 8
Curvas de turbidez de diferentes agentes antiespumantes
La turbidez (NTU) medida de diferentes soluciones de HMO procedentes de fermentaciones de HMO usando STRUKTOL J673, FOAM BLAST 882 o STRUKTOL J673A se muestran en la Tabla 8-1 y la Figura 1.
TABLA 8-1

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento para preparar un oligosacárido de leche humana (HMO) purificado derivado de un procedimiento de fermentación, donde el procedimiento comprende:
(a) precipitar un agente antiespumante en una solución que comprende el HMO y el agente antiespumante al calentar la solución hasta una temperatura de precipitación de 36 a 65°C, donde la temperatura de precipitación está dentro de 5°C de una temperatura a la que la solución de HMO presenta una turbidez máxima; y
(b) filtrar y/o centrifugar el agente antiespumante precipitado procedente de la solución de HMO a la temperatura de precipitación para formar un filtrado que comprende el HMO.
2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que la solución de HMO se mantiene a una temperatura menor que la temperatura del punto de opacificación del agente antiespumante entre la terminación del procedimiento de fermentación y la etapa (a).
3. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la solución de HMO se mantiene a de 1 a 25°C, de 5 a 20°C, de 5 a 15°C, de 5 a 10°C entre la terminación del procedimiento de fermentación y la etapa (a).
4. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el agente antiespumante se precipita a dentro de 5°C de la temperatura del punto de opacificación del agente antiespumante durante la etapa (a).
5. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que una parte del agente antiespumante se precipita a una temperatura de 40 a 65°C, de 36 a 60°C, de 43 a 55°C o de 50 a 55 °C durante la etapa (a).
6. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que:
la solución de HMO calentada de la etapa (a) comprende además un adyuvante de filtración cuando se filtra, y el adyuvante de filtración se selecciona de carbono activado, celulosa y tierra de diatomeas.
7. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que más de 90%, 96%, 97% o 99% del agente antiespumante en la solución de HMO a la terminación de la fermentación se retira de la solución de HMO.
8. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el agente antiespumante se retira usando al menos dos etapas de filtración.
9. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el HMO se selecciona de la lista que consiste en fucosil-lactosa, 2'-fucosil-lactosa, 3-fucosil-lactosa, di-fucosil-lactosa, sialil-lactosa, 3'-sialil-lactosa, 6'-sialil-lactosa, lacto-N-tetraosa y lacto-N-neotetraosa.
10. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la solución de HMO comprende más de un HMO.
11. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el procedimiento comprende además uno cualquiera o más seleccionados de la lista que consiste en ultrafiltración, intercambio iónico, intercambio iónico catiónico, intercambio iónico aniónico, nanofiltración, evaporación, evaporación al vacío, cristalización, secado por pulverización y disolución de un producto cristalino o secado por pulverización.
12. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la concentración del agente antiespumante en la solución que se va a filtrar es de aproximadamente 1 g/kg a aproximadamente 100 g/kg (DS), o de aproximadamente 3 g/100 g a aproximadamente 30 g/100 g (DS).
13. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se retira agente antiespumante adicional de la solución de HMO después de la filtración de la etapa (b) poniendo en contacto la solución de HMO con carbono activado.
14. El procedimiento según la reivindicación 13, en el que la solución de HMO se enfría hasta menos de 20°C o hasta menos de 10°C después de ponerse en contacto con el carbón activado.
15. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la solución de HMO se enfría hasta una temperatura de menos de 20°C o hasta menos de 10°C después de la etapa (b) de filtración.
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