ES3041076T3 - Novel method for promoting nodulation in plants - Google Patents

Novel method for promoting nodulation in plants

Info

Publication number
ES3041076T3
ES3041076T3 ES16729952T ES16729952T ES3041076T3 ES 3041076 T3 ES3041076 T3 ES 3041076T3 ES 16729952 T ES16729952 T ES 16729952T ES 16729952 T ES16729952 T ES 16729952T ES 3041076 T3 ES3041076 T3 ES 3041076T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
plant
mipep
sequence
mipep172c
peptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES16729952T
Other languages
English (en)
Inventor
Jean-Philippe Combier
Olivier Andre
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Toulouse
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Toulouse III Paul Sabatier
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite Toulouse III Paul Sabatier filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Application granted granted Critical
Publication of ES3041076T3 publication Critical patent/ES3041076T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H17/00—Symbiotic or parasitic combinations including one or more new plants, e.g. mycorrhiza
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N65/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing material from algae, lichens, bryophyta, multi-cellular fungi or plants, or extracts thereof
    • A01N65/08—Magnoliopsida [dicotyledons]
    • A01N65/20—Fabaceae or Leguminosae [Pea or Legume family], e.g. pea, lentil, soybean, clover, acacia, honey locust, derris or millettia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

La presente invención se refiere al uso de micropéptidos (péptidos codificados por microARN o «miPEP») para promover la nodulación entre una planta y una bacteria. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Un nuevo método para promover la nodulación en las plantas
[0001] La presente invención se refiere al uso de micropéptidos (péptidos codificados por microARN o «miPEP») para promover la nodulación en plantas.
[0002] En las plantas, la adquisición de nutrientes del suelo es de suma importancia y puede ser un límite para su desarrollo. De este modo, algunas plantas han desarrollado la capacidad de establecer asociaciones simbióticas con los microorganismos del suelo para mejorar la adquisición de nutrientes.
[0003] Las plantas leguminosas son, por ejemplo, capaces de establecer una simbiosis con bacterias de la familiaRhizobiaceae.La planta huésped y la bacteria se reconocerán mutuamente mediante un intercambio de señales moleculares. En concreto, la planta genera flavonoides que activan la expresión de genes específicos en la bacteria, lo cual lleva a la síntesis de compuestos lipochito-oligosacáridos llamados factores Nod, que son los encargados de provocar diversos cambios en el desarrollo de la planta huésped. A continuación, las bacterias penetran en los pelos radiculares de la planta, dando lugar a la formación de nódulos. Este mecanismo de colonización de la planta por las bacterias se conoce como «nodulación».
[0004] La planta suministra a la bacteria tanto los nutrientes como una fuente de energía en forma de trifosfato de adenosina (ATP) producido a través de la fotosíntesis. A cambio, las bacterias transforman el nitrógeno atmosférico en amonio, ofreciendo así una fuente esencial de nitrógeno disponible para la planta.
[0005] El nitrógeno es un nutriente cuyo aporte resulta a menudo decisivo para el crecimiento de las plantas. En términos generales, cuanto mayor sea la fijación de nitrógeno en las plantas, mayores serán los rendimientos. Como resultado, la tasa de nodulación de las plantas a menudo se asocia con una mayor cosecha. Una nodulación efectiva de las plantas también facilita la disminución de las cantidades de abono y la fertilización del suelo con compuestos nitrogenados que las plantas pueden asimilar. Además, el contenido de proteínas también es mayor en las plantas leguminosas en comparación con otras familias de plantas, debido a la fijación de nitrógeno por las bacterias. El alto contenido de proteínas hace que las plantas leguminosas sean especialmente importantes tanto para el consumo humano como para la alimentación animal.
[0006] La inoculación de plantas con cepas específicas de bacterias promueve la nodulación. Sin embargo, aunque existen diferentes técnicas, la inoculación a menudo resulta ineficaz. Por consiguiente, es necesario proporcionar un tratamiento sencillo para mejorar la nodulación de las plantas.
[0007] Los microARN (miR) son pequeños ARN no codificantes, de aproximadamente 21 nucleótidos de longitud después de la maduración, que controlan la expresión de genes diana a nivel postranscripcional, degradando el ARNm diana o inhibiendo su traducción. Los miR se encuentran particularmente en plantas, y los genes a los que se dirigen son a menudo aquellos clave en los procesos de desarrollo.
[0008] La regulación de la expresión del miR es muy poco conocida, pero se ha demostrado que involucra, como la mayoría de los genes codificantes, a una ARN polimerasa II: esta enzima produce un transcrito primario, llamado «pri-MIR», que luego madura mediante un complejo proteico que contiene, en particular, enzimas de tipo Dicer. Esta maduración conduce primero a la formación de un precursor de miR llamado«pre-miR»,que tiene una estructura secundaria en forma de bucle que contienemiRy su secuenciamiR*complementaria. Luego, el precursor madura, lo que conduce a la formación de un ARN bicatenario más corto que contiene el miR y el miR*. A continuación, el miR es absorbido por el complejo RISC, que escinde el ARNm del gen diana o inhibe su traducción.
[0009] En particular, el miR172c se ha identificado en leguminosas como alfalfa, trebolillo, soja judía (Lelandais-Briére et al., Genome-wide Medicago truncatula small RNA analysis revealed novel microRNAs and isoforms differentially regulated in roots and nodules [El análisis del ARN pequeño deMedicago truncatulaen todo el genoma reveló nuevos microARN e isoformas reguladas de forma diferencial en raíces y nódulos], Plant Cell 21: 2780-2796, 2009 ; Wang et al., Identification and expression analysis of miRNAs from nitrogen-fixing soybean nodules [Identificación y análisis de la expresión de miARN de nódulos de soja fijadores de nitrógeno], Biochem Biophys Res Commun 378: 799-803, 2009; Valdes-López et al., Essential role of MYB transcription factor PvPHRI and microRNA: PvmiR399 in phosphorus deficiency signaling in common bean roots [Papel esencial del factor de transcripción MYB: PvPHRI y microARN: PvmiR399 en la señalización de la deficiencia de fósforo en las raíces de la judía común], Plant Cell Environ 31: 1834-1843, 2008; De Luis et al., Two microRNAs linked to nodule infection and nitrogen-fixing ability in the legume Lotus japonicus [Dos microARN relacionados con la infección de los nódulos y la capacidad de fijación de nitrógeno en la leguminosaLotus japonicus],Plant Physiol 160: 2137-2154, 2012).
[0010] Recientemente, se ha demostrado que el miR172c regula la formación de nódulos al reducir la expresión de su gen dianaNNC1(Nodule Number Control 1), un factor de transcripción del genAP2,que reduce la expresión del genNOD40,esencial en el proceso de nodulación de la soja (Wang et al., Soybean miR172c targets the repressive AP2 transcription factor NNC1 to actívate ENOD40 expression and regúlate module initiation [El miR172c de la soja tiene como objetivo el factor de transcripción represivo AP2 NNC1 para activar la expresión de ENOD40 y regular la iniciación del módulo], Plant Cell 26: 4782-4801,2014). Otro estudio reciente también ha demostrado que un aumento en la cantidad de miR172c conduce a un aumento en la nodulación y fijación de nitrógeno en judías (Nova-Franco et al., The miR172c-AP2-1 Node as a Key Regulator of the Common Bean - Rhizobia Nitrogen Fixation Symbiosis [El nodo como regulador clave de la simbiosis entre la judía común y las bacteriasRhizobiapara la fijación de nitrógeno], Plant Physiol. Doi:10.1104/pp. 114.255547, marzo de 2015).
[0011] Hasta ahora, los miR, y por extensión su transcrito primario, siempre se han considerado, debido a su particular modo de acción, como ARN reguladores no codificantes que no producen ningún péptido. Sin embargo, los inventores demostraron recientemente en la solicitud de patente FR 13/60727 la existencia de micropéptidos (o «miPEP»,péptidos codificados por microARN)capaces de modular la acumulación de miR en las células.
[0012] En este contexto, la presente invención tiene como objetivo proponer nuevas herramientas efectivas y ecológicas para promover la nodulación en plantas.
[0013] Un aspecto de la invención es proponer un nuevo uso de miPEP para promover la nodulación entre una planta y una bacteria.
[0014] Otro aspecto de la invención se refiere a un miPEP para promover la nodulación de las plantas.
[0015] Otro aspecto de la invención también se refiere a un nuevo método de cultivo de plantas en simbiosis con una bacteria.
[0016] Otro aspecto de la invención es proponer una composición de miPEP que permita promover la nodulación entre una planta y una bacteria.
[0017] La invención también se refiere a una planta transgénica y partes de plantas transgénicas, a un método para producirlas y a órganos, células y semillas de plantas transgénicas, a plantas modificadas ecológicamente y a inóculos bacterianos.
[0018] En resumen de lo que sigue, la invención es tal como se define en las reivindicaciones 1 a 15.
[0019] Por lo tanto, la invención se refiere al uso de un péptido para promover la nodulación entre una planta y una bacteria, introduciéndose ese péptido en la planta, teniendo una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia idéntica a la de un miPEP naturalmente presente en esa planta, donde el miPEP naturalmente presente en esa planta es un péptido de 3 a 100 ácidos, en particular de 4 a 100 aminoácidos, cuya secuencia está codificada por un marco de lectura abierto situado en el transcrito primario de un miR, siendo ese miPEP capaz de modular la acumulación de ese miR en esa planta, el cual regula la expresión de al menos un gen implicado en la nodulación en la planta.
[0020] De manera sorprendente e inesperada, los inventores han descubierto que el uso de péptidos cuya secuencia comprende o consiste en una secuencia idéntica a la de los miPEP codificados en las transcripciones primarias de miR, permite promover la nodulación entre una planta y una bacteria.
[0021] En la invención, los términos«microARN», «microARN no codificante» y «miR»son equivalentes y se pueden usar indistintamente. Definen pequeñas moléculas de ARN de aproximadamente 21 nucleótidos, que no se traducen y no conducen a un péptido o proteína. Sin embargo, en esta forma madura, los miR aseguran una función reguladora para ciertos genes mediante mecanismos postranscripcionales, como por ejemplo a través del complejo RISC.
[0022] El«transcrito de miR primario»(o«pri-miR»)corresponde a la molécula de ARN obtenida directamente de la transcripción de la molécula de ADN. En general, este transcrito primario sufre una o más modificaciones postranscripcionales, que, por ejemplo, dan como resultado una estructura particular del ARN o una escisión de ciertas partes del ARN mediante fenómenos de empalme, y que conducen a la forma precursora del miR o(«pre-miR»),y luego a la forma madura del miR.
[0023] Los términos«micropéptidos» y «miPEP» (péptidos codificados por microARN)son equivalentes y se pueden usar indistintamente. Definen un péptido que está codificado por un marco de lectura abierto presente en el transcrito primario de un miR, y que es capaz de modular la acumulación de ese miR. Para los fines de la presente invención, los miPEP no deben entenderse necesariamente como péptidos de tamaño pequeño, en la medida en que «micro» no corresponde al tamaño del péptido.
[0024] Como se indica en la solicitud de patente FR 13/60727, cuyo contenido debe considerarse como parte de la presente solicitud, los miPEP son péptidos:
- de 4 a 100 aminoácidos, preferiblemente de 4 a 60 aminoácidos, en particular de 4 a 59 aminoácidos,
- codificados por un marco de lectura abierto contenido en el transcrito primario de un miR, preferiblemente en la parte 5' del transcrito primario de ese miR, y
- capaces de modular la acumulación de ese miR en una célula eucariota.
[0025] Los términos«marco de lectura abierto»u«ORF» (open reading frame)son equivalentes y se pueden usar indistintamente. Corresponden a una secuencia de nucleótidos en una molécula de ADN o ARN que potencialmente puede codificar un péptido o una proteína: ese marco de lectura abierto comienza con un codón de inicio (el codón de inicio generalmente codifica la metionina), seguido de una serie de codones (cada codón codifica un aminoácido) y termina con un codón de parada (el codón de parada no se traduce).
[0026] En la invención, los ORF pueden denominarse específicamente«miORF»cuando están presentes en las transcripciones primarias del miR.
[0027] Los miORF, tal como se definen en la invención, pueden tener un tamaño de 15 a 303 nucleótidos. Dado que un aminoácido está codificado por un codón de 3 nucleótidos, los miORF de 15 a 303 nucleótidos codifican miPEPS de 4 a 100 aminoácidos.
[0028] En particular, los miORF tienen un tamaño de:
15, 18, 21,24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 47, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93, 96, 99, 102, 105, 108, 111, 114, 117, 120, 123, 126, 129, 132, 135, 138, 141, 144, 147, 150, 153, 156, 159, 162, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 198, 201, 204, 207, 210, 213, 216, 219, 222, 225, 228, 231, 234, 237, 240, 243, 246, 249, 252, 255, 258, 261, 264, 267, 270, 273, 276, 279, 282, 285, 288, 291, 294, 297, 300 o 303 nucleótidos, respectivamente, y codifican miPEPs con un tamaño de:
4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 aminoácidos.
[0029] Un miPEP también puede tener un tamaño de 3 a 100 aminoácidos.
[0030] Dada la degeneración del código genético, el mismo miPEP puede estar codificado por varias secuencias de nucleótidos. Esas secuencias de nucleótidos, que son diferentes entre sí en al menos un nucleótido pero que codifican el mismo péptido, se denominan«secuencias degeneradas».
[0031] En la invención, el término«planta»se refiere en general a la totalidad o parte de una planta cualquiera que sea su estado de desarrollo (incluida la planta en forma de semilla o brote joven), a uno o más órganos de la planta (como, por ejemplo, hojas, raíces, tallo, flores), a una o más células de la planta, o incluso a un grupo de células de la planta.
[0032] La expresión«nodulación»se refiere a la colonización de una planta por una bacteria simbionte que resulta en la formación de nódulos en las raíces.
[0033] De manera no limitativa, los parámetros que permiten determinar y cuantificar la nodulación entre una planta y una bacteria pueden ser, en particular:
- el tamaño y el número de los nódulos,
- el contenido de nitrógeno en la totalidad o en parte de la planta,
- o indirectamente, el desarrollo de ciertas partes de la planta, como las vainas o las raíces.
[0034] Los«nódulos»también pueden denominarse «nodosidades». Se trata de protuberancias que se forman en las raíces de las plantas bajo la acción de las bacterias. Su tamaño y su número se pueden medir a simple vista o al microscopio, usando técnicas conocidas por los expertos en la materia. Su tamaño se mide tras un cultivo de larga duración (más de 30 días) midiendo el tamaño de los nódulos en fotografías, utilizando programas informáticos como ImageJ.
[0035] El«contenido de nitrógeno»se refiere a la concentración de nitrógeno en la planta o en una parte de la planta. Por ejemplo, podría ser la concentración de nitrógeno en las partes aéreas en g de nitrógeno por kg de peso seco de hojas. Esta concentración de nitrógeno puede determinarse mediante técnicas conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, un método implica quemar una muestra de masa conocida a una temperatura alta (alrededor de 900 °C) en presencia de oxígeno, lo que produce la liberación de dióxido de carbono, agua y nitrógeno. A continuación, los gases pasan por columnas especiales (como una solución acuosa de hidróxido de potasio) que absorben el dióxido de carbono y el agua. Luego se utiliza una columna que contiene un detector de conductividad térmica en el extremo para separar el nitrógeno de cualquier dióxido de carbono y agua residual y se cuantifica el contenido de nitrógeno residual.
[0036] El«desarrollo de ciertas partes de la planta»corresponde al crecimiento o maduración de ciertas partes de la planta. El desarrollo de ciertas partes de la planta puede determinarse, por ejemplo, midiendo la tasa de crecimiento o el tamaño o el peso de ciertas partes de la planta. Este parámetro se puede medir fácilmente, por ejemplo, midiendo el peso seco de las raíces, vainas o partes aéreas.
[0037] Además, en la invención, la expresión «promover la nodulación» o«mejorar la nodulación»indica:
- una aceleración de la nodulación (como por ejemplo una formación más rápida de nódulos en una planta dada en comparación con una planta de referencia),
- un aumento de la nodulación (por ejemplo, un mayor número o tamaño de nódulos en una planta determinada en comparación con una planta de referencia),
- o a una aceleración y un aumento de la nodulación.
[0038] Es importante señalar que el uso según la invención tiene la ventaja de ser respetuoso con el medio ambiente, ya que el miPEP es un péptido que se produce de forma natural en las plantas.
[0039] La invención también se refiere al uso de un miPEP introducido exógenamente en una planta para promover la nodulación entre esa planta y una bacteria,
siendo ese miPEP exógeno un péptido que comprende, o consiste en, una secuencia idéntica a la de un miPEP presente de forma natural en esa planta,
donde el miPEP naturalmente presente es un péptido de 3 a 100 aminoácidos, en particular de 4 a 100 aminoácidos, cuya secuencia está codificada por un marco de lectura abierto situado en 5' en el transcrito primario de un miR,
siendo ese miPEP capaz de modular la acumulación de ese miR en esa planta, miR que regula la expresión de al menos un gen implicado en la nodulación en esa planta, siendo la suma de la cantidad del miPEP introducido exógenamente y la del miPEP naturalmente presente estrictamente mayor que la cantidad del miPEP naturalmente presente.
[0040] En la invención, la expresión«miPEP introducido de forma exógena»se refiere a un miPEP introducido artificialmente en la planta, exista o no de forma natural en la planta.
[0041] La introducción de un miPEP por vía exógena en la planta implica por tanto una etapa técnica, que no es un fenómeno natural y no corresponde ni a un cruce ni a una selección.
[0042] El miPEP introducido exógenamente puede ser un péptido producido fuera de la planta (tal como, por ejemplo, un péptido aislado y/o purificado, un péptido sintético o un péptido recombinante), o un péptido producido en la planta después de la introducción no natural de un ácido nucleico que codifica ese miPEP en esa planta.
[0043] Si el miPEP existe de forma natural en las plantas, es un«miPEP endógeno».Si el miPEP no existe de forma natural en las plantas, es un«miPEPde origen exógeno».
[0044] Cuandose introduce un «miPEP de origen exógeno»en la planta, es necesario introducir también el miR correspondiente y su transcrito primario.
[0045] La planta en la que no se ha introducido el miPEP tiene una cantidad basal de ese miPEP, que corresponde a la presente de forma natural. El uso de un miPEP que comprenda, o consista, en una secuencia idéntica a la de ese miPEP conduce a un aumento de la cantidad total de miPEP, que modula la acumulación del miR cuyo transcrito primario contiene la secuencia que codifica ese miPEP.
[0046] Además, el miPEP introducido se encuentra en la planta y su introducción no tiene impacto en su estabilidad.
[0047] En la invención,«acumulación»significa la producción de una molécula, como miR o miPEP, en la célula.
[0048] Por lo tanto, la«modulación de la acumulación»de una molécula en una célula corresponde a un cambio en la cantidad de esa molécula en la célula.
[0049] Además, el efecto de un miPEP se puede observar a través de la modulación de la acumulación del miR, pero también a través de la modulación de la acumulación del pri-miR o el pre-miR correspondiente.
[0050] En una modalidad, la invención se refiere al uso tal como se definió anteriormente, en el que la modulación de la acumulación de ese miR es una disminución o un aumento en la acumulación de ese miR, en particular un aumento.
[0051] Una«disminución en la acumulación de miR»corresponde a una disminución en la cantidad de esa molécula en la célula.
[0052] Por el contrario, un«aumento en la acumulación de miR»corresponde a un aumento en la cantidad de esa molécula en la célula.
[0053] En una modalidad, la invención se refiere al uso tal como se define anteriormente en el que ese gen implicado en la nodulación codifica un factor de transcripción de la familia AP2.
[0054] En una modalidad, la invención se refiere al uso tal como se definió anteriormente, en el que ese gen implicado en la nodulación es el factor de transcripciónNNC1.
[0055] En una modalidad, la invención se refiere al uso como se define anteriormente, en donde ese gen involucrado en la nodulación es el genNSP1.
[0056] En una modalidad, la invención se refiere al uso tal como se definió anteriormente, en el que ese gen implicado en la nodulación es el genNIN.
[0057] En una modalidad, la invención se refiere al uso tal como se definió anteriormente, en el que ese gen implicado en la nodulación es el genENOD40-1.
[0058] En una modalidad, la invención se refiere al uso como se define anteriormente, en donde ese gen involucrado en la nodulación es el genHb2.
[0059] En una modalidad, la invención se refiere al uso tal como se definió anteriormente, en el que ese gen implicado en la nodulación es el gennifH.
[0060] En particular, la invención se refiere al uso tal como se ha definido anteriormente, en el que ese miR172c tiene una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 80 % de identidad, preferiblemente al menos un 90 % de identidad, con la secuencia de nucleótidos N.° ID SEQ: 1.
[0061] En una modalidad, la invención se refiere al uso tal como se definió anteriormente, en el que ese miARN es miR172c, en particular, en el que ese miR172c tiene una secuencia de nucleótidos que comprende o consiste en N.° ID SEQ: 1.
[0062] En particular, la invención se refiere al uso tal como se define anteriormente, en donde ese miPEP172c tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad, preferiblemente al menos un 90 % de identidad, con la secuencia de aminoácidos N.° ID SEQ: 2.
[0063] En una modalidad, la invención se refiere al uso tal como se definió anteriormente, en el que ese miPEP es miPEP172C, en particular, en el que ese miPEP172c tiene una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste en N.° ID SEQ: 2.
[0064] En particular, se describe el uso tal como se define anteriormente, en el que ese miR167c tiene una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 80 % de identidad, preferiblemente al menos un 90 % de identidad, con la secuencia de nucleótidos N.° ID SEQ: 6.
[0065] En una modalidad, se describe el uso como se ha definido anteriormente, en el que ese miARN es miR167c, en particular, en el que ese miR167c tiene una secuencia de nucleótidos que comprende o consiste en N.° ID SEQ: 6.
[0066] En particular, se describe el uso tal como se define anteriormente, en donde ese miPEP167c tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad, preferiblemente al menos un 90 % de identidad, con la secuencia de aminoácidos N.° ID SEQ: 7.
[0067] En una modalidad, se describe el uso tal como se definió anteriormente, en el que ese miPEP es miPEP167c, en particular, en el que ese miPEP167c tiene una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste en la N.° ID SEQ: 7.
[0068] En una modalidad, la invención se refiere al uso definido anteriormente, en el que esa planta es una leguminosa, como loto(Lotus sp.),soja(Glycine max),cacahuete(Arachis hypogaea),judía(Phaseolus vulgaris),guisante(Pisum sativum),lenteja(Lens culinaris),garbanzo(Cicer arietinum),haba y alubias(Vicia faba),veza(Viciasp.), acelga(Lathyrussp.), alfalfa(Medicagosp.), trébol(Trifoliumsp.), altramuz(Lupinussp.), judía mungo(Vigna radiata),regaliz(Glycyrrhiza glabra),palisandro(Dalbergia),loto corniculado(Lotus corniculatus),esparceta(Onobrychis viciifolia),rooibos(Aspalathus linearis),fenogreco(Trigonella foenum-graecum).
[0069] En una modalidad, la invención se refiere al uso tal como se definió anteriormente, en el que esa planta es la remolacha azucarera(Beta vulgaris).
[0070] En una modalidad, la invención se refiere al uso tal como se definió anteriormente, en el que esa planta se selecciona entreMedicago truncatula, M. sativayGlycine max.
[0071] En una modalidad, la invención se refiere al uso tal como se definió anteriormente, en el que esa planta esGlycine max.
[0072] En una modalidad, la invención se refiere al uso tal como se definió anteriormente, en el que esa bacteria es una bacteria de la familiaRhizobiaceae.
[0073] En una modalidad particular, la invención se refiere al uso tal como se definió anteriormente, en el que esa bacteria se selecciona de los génerosRhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium, Bradyrhizobium o Azorhizobium.
[0074] En la invención, esas bacterias también pueden seleccionarse entre:
-Rhizobium alamii, Rhizobium alkalisoli, Rhizobium cellulosilyticum, Rhizobium daejeonense, Rhizobium endophyticum, Rhizobium etli, Rhizobium galegae, Rhizobium gallicum, Rhizobium giardinii, Rhizobium hainanense, Rhizobium herbae, Rhizobium huautlense, Rhizobium indigoferae, Rhizobium leguminosarum, Rhizobium loessense, Rhizobium lusitanum, Rhizobium mesosinicum, Rhizobium miluonense, Rhizobium mongolense, Rhizobium multihospitium, Rhizobium oryzae, Rhizobium phaseoli, Rhizobium pisi, Rhizobium tibeticum, Rhizobium sullae, Rhizobium tropici, Rhizobium tubonense, Rhizobium undicola, Rhizobium vignae, Rhizobium yanglingense, - Mesorhizobium albiziae, Mesorhizobium alhagi, Mesorhizobium amorphae, Mesorhizobium australicum, Mesorhizobium camelthorni, Mesorhizobium caraganae, Mesorhizobium chacoense, Mesorhizobium cicero, Mesorhizobium gobiense, Mesorhizobium huakuii, Mesorhizobium loti, Mesorhizobium mediterraneum, Mesorhizobium metallidurans, Mesorhizobium opportunistum, Mesorhizobium plurifarium, Mesorhizobium robiniae, Mesorhizobium shangrilense, Mesorhizobium septentrionale, Mesorhizobium tarimense, Mesorhizobium temperatum, Mesorhizobium tianshanense
- Ensifer abri, Sinorhizobium americanum, Ensifer arboris, Ensifer fredii, Ensifer garamanticus, Ensifer indiaense, Ensifer kostiensis, Ensifer kummerowiae, Ensifer medicae, Ensifer meliloti, Ensifer mexicanus, Sinorhizobium morelense, Ensifer adhaerens, Ensifer numidicus, Ensifer saheli, Ensifer sojae, Ensifer terangae,
-Bradyrhizobium canariense, Bradyrhizobium denitrificans, Bradyrhizobium elkanii, Bradyrhizobium iriomotense, Bradyrhizobium japonicum, Bradyrhizobium jicamae, Bradyrhizobium liaoningense, Bradyrhizobium pachyrhizi, Bradyrhizobium yuanmingense
-Burkholderia caribensis, Burkholderia cepacia, Burkholderia mimosarum, Burkholderia nodosa, Burkholderia phymatum, Burkholderia sabiae, Burkholderia tuberum
- Phyllobacterium trifolii, Phyllobacterium ifriqiyense, Phyllobacterium leguminum
- Microvirga lupine, Microvirga lotononidis, Microvirga zambiensis
-Azorhizobium caulinodans, Azorhizobium doebereinerae
-Ochrobactrum cytisi, Ochrobactrum lupini
-Methylobacterium nodulans,
-Cupriavidus taiwanensis,
- Devosia neptuniae,
- Shinella kummerowiae.
[0075] En una modalidad, la invención se refiere al uso definido anteriormente, en el que esa bacteria es una bacteria seleccionada entreRhizobium leguminosarum, Rhizobium etli, Rhizobium tropici, Rhizobium galegae, Sinorhizobiumsp. NGR234,Sinorhizobium meliloti, Sinorhizobium fredii, Sinorhizobium saheli, Sinorhizobium teranga, Mesorhizobium ciceri, Mesorhizobium huakuii, Mesorhizobium loti, Bradyrhizobium elkanii, Bradyrhizobium japonicum, Bradyrhizobium lupini, Bradyrhizobiumsp. "cowpea" yAzorhizobium caulinodans.
[0076] En particular, la bacteriaRhizobium eltipermite la nodulación de la judía.
[0077] En particular, la bacteriaRhizobium leguminosarumpermite la nodulación de guisantes, alfalfa, remolacha azucarera, veza y lentejas.
[0078] En particular, la bacteriaRhizobium pisipermite la nodulación de guisantes, judías y vezas.
[0079] En particular, la bacteriaRhizobium phaseolipermite la nodulación de judías secas.
[0080] En particular, la bacteriaRhizobium fabaepermite la nodulación de las habas.
[0081] En particular, la bacteriaRhizobium ciceripermite la nodulación del garbanzo.
[0082] En particular, la bacteriaRhizobium trifolipermite la nodulación del trébol.
[0083] En particular, la bacteriaSinorhizobium melilotipermite la nodulación de la alfalfa, el fenogreco o el trébol de olor.
[0084] En particular, la bacteriaSinorhizobium frediipermite la nodulación de la soja.
[0085] En particular, la bacteriaMesorhizobium lotipermite la nodulación del loto, el trébol, el altramuz o el garbanzo.
[0086] En particular, la bacteriaBradyrhizobium japonicumpermite la nodulación de la soja.
[0087] En particular, la bacteriaBradyrhizobiumsp.Vignapermite la nodulación del cacahuete.
[0088] En particular, la bacteriaBradyrhizobiumsp.Arachispermite la nodulación del cacahuete.
[0089] En una modalidad, la invención se refiere al uso definido anteriormente para promover la nodulación entre una plantaGlycinemax y una bacteriaBradirhizobium japonicum,en la que miPEP172c se introduce exógenamente en esa plantaGlycine max,donde ese miPEP172c también está presente de forma natural en esa plantaGlycine max,
ese miPEP172c introducido de forma exógena es un péptido cuya secuencia comprende o consiste en una secuencia idéntica a la de ese miPEP172c presente de forma natural, esa secuencia del miPEP172c naturalmente presente está codificada por un marco de lectura abierto situado 5' en el transcrito primario de miR172c, el cual regula la expresión de al menos un gen implicado en la nodulación enGlycine max,la suma de la cantidad de ese miPEP172c introducido exógenamente y la del naturalmente presente es estrictamente mayor que la cantidad de ese miPEP172c naturalmente presente en esa planta deGlycine max.
[0090] En una modalidad, la invención se refiere al uso de un miPEP para promover la nodulación entre una plantaGlycine maxy una bacteriaBradirhizobium japonicum,en la que el miPEP172c se introduce exógenamente en esa plantaGlycine max,ese miPEP172c también está presente de forma natural en esa plantaGlycine max,
ese miPEP172c introducido de forma exógena es un péptido cuya secuencia tiene al menos un 80 % de identidad, preferiblemente al menos un 90 % de identidad, con la secuencia N.° ID SEQ: 2, estando esa secuencia del miPEP167c naturalmente presente codificada por un marco de lectura abierto situado 5' en el transcrito primario de miR172c, el cual regula la expresión de al menos un gen implicado en la nodulación enGlycine max,
siendo la suma de la cantidad de ese miPEP167c introducido exógenamente y la del naturalmente presente estrictamente mayor que la cantidad de ese miPEP167c naturalmente presente en esa planta deGlycine max.
[0091] En una modalidad, la invención se refiere al uso de un miPEP para promover la nodulación entre una plantaGlycinemax y una bacteriaBradirhizobium japonicum,en la que el miPEP172c se introduce exógenamente en esa plantaGlycine max,
ese miPEP167c también está naturalmente presente en esa planta Glycine max, ese miPEP167c introducido exógenamente es un péptido cuya secuencia comprende o consiste en N.° ID SEQ: 2, esa secuencia de miPEP167c presente de forma natural está codificada por un marco de lectura abierto situado 5' en el transcrito primario de miR172c, el cual regula la expresión de al menos un gen implicado en la nodulación enGlycine max,
la suma de la cantidad de ese miPEP172c introducido exógenamente y la de ese miPEP172c presente de forma natural es estrictamente mayor que la cantidad de ese miPEP172c presente de forma natural en esa planta deGlycine max.
[0092] En una modalidad, la invención se refiere al uso de un miPEP para promover la nodulación entre una planta deGlycine maxy una bacteriaBradirhizobium japonicum,en el que el miPEP172c se introduce de forma exógena en esa planta deGlycine max.
ese miPEP172c también está naturalmente presente en esa plantaGlycine max,ese miPEP172c introducido exógenamente es un péptido cuya secuencia comprende o consiste en una secuencia idéntica a la de ese miPEP172c naturalmente presente, esa secuencia del miPEP172c naturalmente presente está codificada por un marco de lectura abierto situado 5' en el transcrito primario de miR172c, el cual regula la expresión de al menos un gen implicado en la nodulación enGlycine max,donde el miR172c comprende o consiste en N.° ID SEQ: 1,
la suma de la cantidad de ese miPEP172c introducido exógenamente y la del presente de forma natural es estrictamente superior a la cantidad de ese miPEP172c presente de forma natural en esa planta deGlycine max.
[0093] En una modalidad, se describe el uso definido anteriormente para promover la nodulación entre una plantaGlycine maxy una bacteriaBradirhizobium japonicum,en la que miPEP167c se introduce exógenamente en esa plantaGlycine max,
ese miPEP167c también está naturalmente presente en esa plantaGlycine max,ese miPEP167c introducido exógenamente es un péptido cuya secuencia comprende o consiste en una secuencia idéntica a la de ese miPEP167c naturalmente presente, esa secuencia del miPEP167c naturalmente presente está codificada por un marco de lectura abierto situado 5' en el transcrito primario de miR167c, el cual regula la expresión de al menos un gen implicado en la nodulación enGlycine max,
siendo la suma de la cantidad de ese miPEP167c introducido exógenamente y la del presente de forma natural estrictamente mayor que la cantidad de ese miPEP167c presente de forma natural en la plantaGlycine max.
[0094] En una modalidad, se describe el uso de un miPEP para promover la nodulación entre una plantaGlycine maxy una bacteriaBradirhizobium japonicum,en la que miPEP167c se introduce exógenamente en esa plantaGlycine max,estando ese miPEP167c también presente de forma natural en esa planta,
ese miPEP172c introducido de forma exógena es un péptido cuya secuencia tiene al menos un 80 % de identidad, preferiblemente al menos un 90 % de identidad, con la secuencia N.° ID SEQ: 7, estando esa secuencia del miPEP167c naturalmente presente codificada por un marco de lectura abierto situado 5' en el transcrito primario de miR167c, el cual regula la expresión de al menos un gen implicado en la nodulación enGlycine max,siendo la suma de la cantidad de ese miPEP167c introducido exógenamente y la del naturalmente presente estrictamente mayor que la cantidad de ese miPEP167c naturalmente presente en esa planta deGlycine max.
[0095] En una modalidad, se describe el uso de un miPEP para promover la nodulación entre una plantaGlycine maxy una bacteriaBradirhizobium japonicum,en la que miPEP167c se introduce exógenamente en esa plantaGlycine max,estando ese miPEP167c también presente de forma natural en esa plantaGlycine max,
ese miPEP167c introducido exógenamente es un péptido cuya secuencia comprende o consiste en N.° ID SEQ: 7, esa secuencia de miPEP167c presente de forma natural está codificada por un marco de lectura abierto situado 5' en el transcrito primario de miR167c, el cual regula la expresión de al menos un gen implicado en la nodulación enGlycine max,
la suma de la cantidad de ese miPEP167c introducido exógenamente y la del presente de forma natural es estrictamente superior a la cantidad de ese miPEP167c presente de forma natural en esa planta deGlycine max.
[0096] En una modalidad, se describe el uso de un miPEP para promover la nodulación entre una plantaGlycine maxy una bacteriaBradirhizobium japonicum,en la que el miPEP167c se introduce exógenamente en esa plantaGlycine max,
ese miPEP167c también está naturalmente presente en esa plantaGlycine max,ese miPEP167c introducido exógenamente es un péptido cuya secuencia comprende o consiste en una secuencia idéntica a la de ese miPEP167c naturalmente presente, esa secuencia del miPEP167c naturalmente presente está codificada por un marco de lectura abierto situado 5' en el transcrito primario de miR167c, el cual regula la expresión de al menos un gen implicado en la nodulación enGlycine max,cuyo miR167c comprende o consiste en N.° ID SEQ: 6,
la suma de la cantidad de ese miPEP167c introducido exógenamente y la del presente de forma natural es estrictamente mayor que la cantidad de ese miPEP167c presente de forma natural en esa planta deGlycine max.
[0097] En una modalidad, la invención se refiere al uso definido anteriormente, en el que ese miPEP se introduce externamente en la planta, preferiblemente mediante riego, pulverización o mediante la adición de un fertilizante, una tierra para macetas, un sustrato de cultivo o mediante un soporte en contacto con la planta.
[0098] En una modalidad, la invención se refiere al uso definido anteriormente, en el que ese miPEP se introduce externamente en una semilla o plántula, preferentemente mediante riego, pulverización o adición de un fertilizante, una tierra para macetas, un sustrato de cultivo o mediante un soporte en contacto con la semilla o plántula.
[0099] En una modalidad, la invención se refiere al uso definido anteriormente, en el que ese miPEP se utiliza para tratar la planta en forma de semilla.
[0100] En una modalidad, la invención se refiere al uso definido anteriormente, en el que ese miPEP se introduce por pulverización, en particular por pulverización.
[0101] En una modalidad, la invención se refiere al uso definido anteriormente, en el que ese miPEP se introduce mediante el riego y la adición de un fertilizante.
[0102] En una modalidad, la invención se refiere al uso definido anteriormente, en el que ese miPEP se introduce mediante la adición de un fertilizante.
[0103] En una modalidad, la invención se refiere al uso tal como se ha definido anteriormente, en el que ese miPEP se introduce, mediante riego, y mediante la adición de un fertilizante.
[0104] En una modalidad, la invención se refiere al uso definido anteriormente, en el que ese miPEP se introduce mediante la adición de gránulos.
[0105] Los inventores de hecho han descubierto inesperadamente que es posible aplicar directamente una composición que comprende un miPEP a la planta para modular la acumulación del miR correspondiente en la planta, lo que indica que el miPEP es absorbido por la planta.
[0106] En una modalidad, la invención se refiere al uso como se define anteriormente, en donde la planta se trata con una composición que comprende 10-9M a 10-4M de ese miPEP, en particular 10-9M, 10-8M, 10-7M, 10-6M, 10-5M 4M de ese miPEP
[0107] Preferiblemente, las composiciones tienen una concentración de 10-8M a 10-5M para aplicación mediante riego o pulverización sobre la planta.
[0108] De manera complementaria, se pueden prever composiciones más o menos concentradas para tratar la planta con miPEP Por ejemplo, y sin limitación, se pueden utilizar composiciones más concentradas que comprenden de 10-1M a 10-3M, especialmente 10-2M de miPEP, en el caso en que el miPEP introducido exógenamente se administre a la planta mediante esparcimiento.
[0109] Las propiedades de solubilidad de los miPEP están determinadas en particular por su composición de aminoácidos. Los miPEP hidrófilos se pueden solubilizar y envasar en soluciones acuosas, como el agua. Los miPEP hidrófobos se pueden solubilizar y envasar en solventes, como solventes orgánicos.
[0110] Para el tratamiento de plantas con miPEPs, los disolventes orgánicos no son tóxicos para las plantas en pequeñas cantidades, es decir, no tienen efectos nocivos sobre el desarrollo de la planta. De manera no limitativa, los disolventes orgánicos pueden elegirse entre acetonitrilo y ácido acético.
[0111] Los MiPEP también pueden solubilizarse y envasarse en mezclas de solventes orgánicos, como una mezcla de acetonitrilo y ácido acético. En particular, los miPEP se pueden solubilizar en una solución que comprende 50 % de acetonitrilo, 10 % de ácido acético y 40 % de agua (volumen/volumen/volumen).
[0112] En particular, miPEP172c se solubiliza en una solución que comprende 40 % de agua, 50 % de acetonitrilo, 10
% de ácido acético (volumen/volumen/volumen) o en agua.
[0113] En particular, miPEP167c se solubiliza en agua.
[0114] En una modalidad, la invención se refiere al uso definido anteriormente, en el que ese miPEP se introduce en la planta a través de un ácido nucleico que codifica ese miPEP, introduciéndose ese ácido nucleico en la planta.
[0115] En una modalidad, la invención se refiere al uso tal como se define anteriormente, en el que se aumenta el número de nódulos en la planta en la que se ha introducido ese miPEP en comparación con el número de nódulos en una planta idéntica de la misma edad en la que no se ha introducido ningún miPEP, o en comparación con el número de nódulos en una planta idéntica de la misma edad en la que no se ha introducido ese miPEP
[0116] En una modalidad, la invención se refiere al uso tal como se define anteriormente, en el que se aumenta la concentración de nitrógeno en las partes aéreas de la planta en la que se ha introducido ese miPEP en comparación con la concentración de nitrógeno en las partes aéreas de una planta idéntica de la misma edad en la que no se ha introducido ningún miPEP, o en comparación con la concentración de nitrógeno en las partes aéreas de una planta idéntica de la misma edad en la que no se ha introducido ese miPEP
[0117] En una modalidad, la invención se refiere al uso tal como se define anteriormente, en el que se aumenta el peso de las vainas en la planta en la que se ha introducido ese miPEP en comparación con el peso de las vainas de una planta idéntica de la misma edad en la que no se ha introducido ningún miPEP, o en comparación con el peso de las vainas de una planta idéntica de la misma edad en la que no se ha introducido ese miPEP
[0118] El aumento de los parámetros para determinar y cuantificar la nodulación en la planta en la que se introdujo el miPEP (como el número de nódulos, la concentración de nitrógeno o el peso de las vainas) se demuestra preferiblemente en comparación con una planta idéntica (es decir, una planta de la misma especie y/o variedad), de la misma edad y cultivada en las mismas condiciones, pero en la que no se introdujo el miPEP
[0119] La invención también se refiere al uso de un miPEP introducido exógenamente en una planta para promover la nodulación entre esa planta y una bacteria,
ese miPEP está codificado por el transcrito primario, introducido artificialmente en la planta, de un miR;
ese transcrito primario, ese miR y ese miPEP están naturalmente ausentes en la planta, ese miPEP es capaz de modular la acumulación de ese miR en esa planta, el cual regula la expresión de al menos un gen implicado en la nodulación en esa planta. En una modalidad particular, ese transcrito primario del miR, el miR y ese miPEP se introducen en la planta utilizando un vector.
[0120] En otro aspecto, la invención se refiere a un método para promover la nodulación entre una planta y una bacteria, que comprende una etapa de introducir un miPEP en una planta de forma exógena, estando ese miPEP también presente de forma natural en esa planta,
ese miPEP introducido exógenamente es un péptido de 3 a 100 aminoácidos, en particular de 4 a 100 aminoácidos, cuya secuencia comprende o consiste en una secuencia idéntica a la de ese miPEP naturalmente presente, la secuencia del miPEP naturalmente presente está codificada por un marco de lectura abierto situado 5' en el transcrito primario de un miR, ese miPEP es capaz de modular la acumulación de ese miR, el cual regula la expresión de al menos un gen implicado en la nodulación en esa planta,
siendo la suma de la cantidad de ese miPEP introducido exógenamente y la del naturalmente presente estrictamente mayor que la cantidad de ese miPEP naturalmente presente.
[0121] En una modalidad, la invención se refiere a un método tal como se definió anteriormente en el que ese gen implicado en la nodulación codifica un factor de transcripción de la familia AP2.
[0122] En una modalidad, la invención se refiere a un método tal como se definió anteriormente, en el que ese gen implicado en la nodulación es el factor de transcripciónNNC1.
[0123] En una modalidad, la invención se refiere a un método tal como se definió anteriormente, en el que ese gen implicado en la nodulación es el genNSP1.
[0124] En una modalidad, la invención se refiere a un método tal como se definió anteriormente, en el que ese gen implicado en la nodulación es el genNIN.
[0125] En una modalidad, la invención se refiere a un método tal como se definió anteriormente, en el que ese gen implicado en la nodulación es el genENOD40-1.
[0126] En una modalidad, la invención se refiere a un método tal como se definió anteriormente, en el que ese gen implicado en la nodulación es el genHb2.
[0127] En una modalidad, la invención se refiere a un método tal como se definió anteriormente, en el que ese gen implicado en la nodulación es el gennifH.
[0128] En una modalidad, la invención se refiere a un método tal como se definió anteriormente, en el que ese miARN es miR172c, en particular, en el que ese miR172c tiene una secuencia de nucleótidos que comprende o consiste en N.° ID SEQ: 1.
[0129] En una modalidad, la invención se refiere a un método como se ha definido anteriormente, en el que ese miPEP es miPEP172c, en particular, en el que ese miPEP172c tiene una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste en N.° ID SEQ: 2.
[0130] En una modalidad, se describe un método como se definió anteriormente, en donde ese miARN es miR167c, en particular, en donde ese miR167c tiene una secuencia de nucleótidos que comprende o consiste en N.° ID SEQ: 6.
[0131] En una modalidad, se describe un método como se definió anteriormente, en donde ese miPEP es miPEP167c, en particular, en donde ese miPEP167c tiene una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste en N.° ID SEQ: 7.
[0132] En una modalidad, la invención se refiere a un método tal como el definido anteriormente, en el que esa planta es una leguminosa, como loto(Lotus sp.),soja(Glycine max),cacahuete (Arachis hypogaea), judía(Phaseolus vulgaris),guisante(Pisum sativum),lenteja(Lens culinaris),garbanzo(Cicer arietinum),haba y alubia(Vicia faba),vezas(Viciasp.), acelgas(Lathyrussp.), alfalfa(Medicagosp.), trébol(Trifoliumsp.), altramuz(Lupinussp.), judía mungo(Vigna radiata),regaliz(Glycyrrhiza glabra),palisandro(Dalbergia),loto corniculado(Lotus corniculatus),esparceta(Onobrychis viciifolia),rooibos(Aspalathus linearis),fenogreco(Trigonella foenum-graecum).
[0133] En una modalidad, la invención se refiere a un proceso como el definido anteriormente, en el que esa planta es remolacha azucarera(Beta vulgaris).
[0134] En una modalidad, la invención se refiere a un proceso como el definido anteriormente, en el que esa bacteria es una bacteria de la familiaRhizobiaceae.
[0135] En una modalidad particular, la invención se refiere a un método como el definido anteriormente, en el que esa bacteria se selecciona de los génerosRhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium, Bradyrhizobium o Azorhizobium.
[0136] En una modalidad, la invención se refiere al uso definido anteriormente, en el que esa bacteria es una bacteria seleccionada entreRhizobium leguminosarum, Rhizobium etli, Rhizobium tropici, Rhizobium galegae, Sinorhizobiumsp. NGR234,Sinorhizobium meliloti, Sinorhizobium fredii, Sinorhizobium saheli, Sinorhizobium teranga, Mesorhizobium ciceri, Mesorhizobium huakuii, Mesorhizobium loti, Bradyrhizobium elkanii, Bradyrhizobium japonicum, Bradyrhizobium lupini, Bradyrhizobiumsp. "cowpea” yAzorhizobium caulinodans.
[0137] En una modalidad, la invención se refiere a un método como el definido anteriormente para promover la nodulación entre una plantaGlycinemax y una bacteriaBradirhizobium japonicum,en el que miPEP172c se introduce exógenamente en esa plantaGlycine max,
ese miPEP172c también está presente de forma natural en esa plantaGlycine max,ese miPEP172c introducido exógenamente es un péptido que comprende o consiste en una secuencia idéntica a la de ese miPEP172c presente de forma natural, el cual es un péptido de 3 a 100 aminoácidos cuya secuencia está codificada por un marco de lectura abierto situado 5' en el transcrito primario de miR172c, ese miPEP172c es capaz de aumentar la acumulación de ese miR172c, el cual regula la expresión de al menos un gen implicado en la nodulación enGlycine max,
siendo la suma de la cantidad de ese miPEP172c introducido exógenamente y la del naturalmente presente estrictamente mayor que la cantidad de ese miPEP172c naturalmente presente.
[0138] En una modalidad, se describe un método como el definido anteriormente para promover la nodulación entre una plantaGlycinemax y una bacteriaBradirhizobium japonicum,en el que miPEP167c se introduce exógenamente en esa plantaGlycine max,
ese miPEP167c también está presente de forma natural en esa plantaGlycine max,ese miPEP167c introducido exógenamente es un péptido que comprende o consiste en una secuencia idéntica a la de ese miPEP167c presente de forma natural, ese miPEP167c presente de forma natural es un péptido de 3 a 100 aminoácidos cuya secuencia está codificada por un marco de lectura abierto situado 5' en el transcrito primario de miR167c, el cual es capaz de aumentar la acumulación de ese miR167c, el cual regula la expresión de al menos un gen implicado en la nodulación enGlycine max,siendo la suma de la cantidad de ese miPEP167c introducido exógenamente y la del presente de forma natural estrictamente mayor que la cantidad de ese miPEP167c presente de forma natural.
[0139] En una modalidad, la invención se refiere a un método como el definido anteriormente, en el que ese miPEP se introduce externamente en la planta, preferiblemente mediante riego, pulverización o mediante la adición de un fertilizante, una tierra para macetas, un sustrato de cultivo o mediante un soporte en contacto con la planta.
[0140] En una modalidad, la invención se refiere al método como el definido anteriormente, en el que ese miPEP se introduce por vía externa en la planta, mediante el añadido de granulados.
[0141] En una modalidad, la invención se refiere a un método como el definido anteriormente, en el que ese miPEP se introduce externamente en una semilla o plántula, preferentemente mediante riego, pulverización o adición de un fertilizante, una tierra para macetas, un sustrato de cultivo o mediante un soporte en contacto con la semilla o plántula.
[0142] En una modalidad, la invención se refiere a un método como el definido anteriormente, en el que ese miPEP se utiliza para tratar la planta en forma de semilla.
[0143] En una modalidad, la invención se refiere a un método como se definió anteriormente, en donde ese miPEP se administra a la planta en forma de una composición que comprende 10-9 M a 10-4 M de ese miPEP, en particular 10 9, 10-8, 10-7, 10-6, 10-5 o 10-4 M de ese miPEP.
[0144] En una modalidad, la invención se refiere a un método como el definido anteriormente, en el que ese miPEP se introduce en la planta a través de un ácido nucleico que codifica ese miPEP, introduciéndose ese ácido nucleico en la planta.
[0145] En una modalidad, la invención se refiere a un método tal como se define anteriormente, en el que se aumenta el número de nódulos en la planta en la que se ha introducido ese miPEP en comparación con el número de nódulos en una planta idéntica de la misma edad en la que no se ha introducido ningún miPEP, o en comparación con el número de nódulos en una planta idéntica de la misma edad en la que no se ha introducido ese miPEP.
[0146] En una modalidad, la invención se refiere a un método tal como se define anteriormente, en el que se aumenta la concentración de nitrógeno en las partes aéreas de la planta en la que se ha introducido ese miPEP en comparación con la concentración de nitrógeno en las partes aéreas de una planta idéntica de la misma edad en la que no se ha introducido ningún miPEP, o en comparación con la concentración de nitrógeno en las partes aéreas de una planta idéntica de la misma edad en la que no se ha introducido ese miPEP.
[0147] En una modalidad, la invención se refiere a un método tal como se define anteriormente, en el que se aumenta el peso de las vainas en la planta en la que se ha introducido ese miPEP en comparación con el peso de las vainas de una planta idéntica de la misma edad en la que no se ha introducido ningún miPEP, o en comparación con el peso de las vainas de una planta idéntica de la misma edad en la que no se ha introducido ese miPEP
[0148] En otro aspecto, la invención se refiere a un método para producir una planta transgénica que comprende: a) una etapa de introducción de un ácido nucleico que codifica un miPEP de 3 a 100 aminoácidos, en particular de 4 a 100 aminoácidos, en una planta, o en al menos una célula de esa planta, en condiciones que permitan la expresión de ese miPEP,
ese miPEP también está presente de forma natural en esa planta, ese miPEP presente de forma natural es un péptido cuya secuencia está codificada por un marco de lectura abierto situado en 5' del transcrito primario de un miR, ese miPEP es capaz de modular la acumulación de ese miR en la planta, cuyo miR regula la expresión de al menos un gen implicado en la nodulación, y
b) una etapa de cultivo de la planta, o al menos una célula de esa planta, obtenida en la etapa a) en condiciones que permitan la producción de una planta transgénica.
[0149] En una modalidad, la invención se refiere a un método para producir una planta transgénica tal como se definió anteriormente, en el que esa planta transgénica obtenida en la etapa b) es más adecuada para la nodulación en comparación con una planta idéntica en la que no se ha introducido ese ácido nucleico.
[0150] En una modalidad, la invención se refiere a un método para producir una planta transgénica tal como se definió anteriormente, en el que la expresión de ese miPEP codificado por el ácido nucleico introducido en la planta da como resultado una mejor nodulación en comparación con una planta idéntica en la que no se introdujo ese ácido nucleico.
[0151] En una modalidad, la invención se refiere a un método para producir una planta transgénica tal como se definió anteriormente, en el que la etapa a) se lleva a cabo usando un vector que contiene ese ácido nucleico, preferiblemente un plásmido.
[0152] En una modalidad, la invención se refiere a un método para producir una planta transgénica tal como se definió anteriormente, en el que ese ácido nucleico no comprende la secuencia completa de ese miR.
[0153] En una modalidad, la invención se refiere a un método para producir una planta transgénica tal como se definió anteriormente, en el que la expresión de ese ácido nucleico de la etapa a) se coloca bajo el control de un promotor fuerte, preferiblemente un promotor constitutivo fuerte tal como el promotor 35S.
[0154] En una modalidad, la invención se refiere a un método para producir una planta transgénica tal como se definió anteriormente, en el que ese gen implicado en la nodulación codifica un factor de transcripción de la familia AP2.
[0155] En una modalidad, la invención se refiere a un método para producir una planta transgénica tal como se definió anteriormente, en el que ese gen implicado en la nodulación es un gen endógeno y codifica un factor de transcripción de la familia AP2.
[0156] En una modalidad, la invención se refiere a un método para producir una planta transgénica tal como se definió anteriormente, en el que ese gen implicado en la nodulación codifica el factor de transcripción NNC
[0157] En una modalidad, la invención se refiere a un método para producir una planta transgénica tal como se definió anteriormente, en el que ese gen implicado en la nodulación es un gen endógeno y codifica el factor de transcripción NNC1.
[0158] En una modalidad, la invención se refiere a un método para producir una planta transgénica tal como se definió anteriormente, en el que ese gen implicado en la nodulación es el genNSP1.
[0159] En una modalidad, la invención se refiere a un método para producir una planta transgénica tal como se definió anteriormente, en el que ese gen implicado en la nodulación es un genNSP1endógeno.
[0160] En una modalidad, la invención se refiere a un método para producir una planta transgénica tal como se definió anteriormente, en el que ese gen implicado en la nodulación es el genNIN.
[0161] En una modalidad, la invención se refiere a un método para producir una planta transgénica tal como se definió anteriormente, en el que ese gen implicado en la nodulación es un genNINendógeno.
[0162] En una modalidad, la invención se refiere a un método para producir una planta transgénica tal como se definió anteriormente, en el que ese gen implicado en la nodulación es el genENOD40-1.
[0163] En una modalidad, la invención se refiere a un método para producir una planta transgénica tal como se definió anteriormente, en el que ese gen implicado en la nodulación es un genENOD40-1endógeno.
[0164] En una modalidad, la invención se refiere a un método para producir una planta transgénica tal como se definió anteriormente, en el que ese gen implicado en la nodulación es el genHb2.
[0165] En una modalidad, la invención se refiere a un método para producir una planta transgénica tal como se definió anteriormente, en el que ese gen implicado en la nodulación es el genHb2endógeno.
[0166] En una modalidad, la invención se refiere a un método para producir una planta transgénica tal como se definió anteriormente, en el que ese gen implicado en la nodulación es el gennifH.
[0167] En una modalidad, la invención se refiere a un método para producir una planta transgénica tal como se definió anteriormente, en el que ese gen implicado en la nodulación es el gennifHendógeno.
[0168] En una modalidad, la invención se refiere a un método para producir una planta transgénica tal como se definió anteriormente, en el que ese miARN es miR172c, en particular, en el que ese miR172c tiene una secuencia de nucleótidos que comprende o consiste en N.° ID SEQ: 1.
[0169] En una modalidad, la invención se refiere a un método para producir una planta transgénica tal como se definió anteriormente, en el que ese miPEP es miPEP 172c, en particular, en el que ese miPEP 172c tiene una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste en N.° ID SEQ: 2.
[0170] En una modalidad, la invención se refiere a un método para producir una planta transgénica tal como se definió anteriormente, en el que ese ácido nucleico introducido en la etapa a) comprende una secuencia de nucleótidos que consiste en N.° ID SEQ: 3.
[0171] En una modalidad, se describe un método para producir una planta transgénica como se define anteriormente, en el que ese miARN es miR167c, en particular, en el que ese miR167c tiene una secuencia de nucleótidos que comprende o consiste en N.° ID SEQ: 6.
[0172] En una modalidad, se describe un método para producir una planta transgénica como se ha definido anteriormente, en el que esa miPEP es miPEP167c, en particular, en el que esa miPEP167c tiene una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste en N.° ID SEQ: 7.
[0173] En una modalidad, se describe un método de producción de una planta transgénica como se ha definido anteriormente, en el que ese ácido nucleico introducido en el paso a) comprende una secuencia de nucleótidos que consiste en N.° ID SEQ: 8.
[0174] En una modalidad, la invención se refiere a un método tal como el definido anteriormente, en el que esa planta es una leguminosa, como Loto(Lotus sp.),soja(Glycine max),cacahuete(Arachis hypogaea),judía(Phaseolus vulgaris),guisante(Pisum sativum),lenteja(Lens culinaris),garbanzo(Cicer arietinum),haba y alubias(Vicia faba),veza(Viciasp.), acelga(Lathyrussp.), alfalfa(Medicagosp.), trébol(Trifoliumsp.), altramuz(Lupinussp.), judía mungo(Vigna radiata),regaliz(Glycyrrhiza glabra),palisandro(Dalbergia),loto corniculado(Lotus corniculatus),esparceta(Onobrychis viciifolia),rooibos(Aspalathus linearis),fenogreco(Trigonella foenum-graecum).
[0175] En una modalidad, la invención se refiere a un proceso como el definido anteriormente, en el que esa planta es remolacha azucarera(Beta vulgaris).
[0176] En una modalidad, la invención se refiere a un proceso como el definido anteriormente, en el que esa bacteria es una bacteria de la familiaRhizobiaceae.
[0177] En una modalidad particular, la invención se refiere a un método como el definido anteriormente, en el que esa bacteria se selecciona de los génerosRhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium, Bradyrhizobium o Azorhizobium.
[0178] En una modalidad, la invención se refiere al uso definido anteriormente, en el que esa bacteria es una bacteria seleccionada entreRhizobium leguminosarum, Rhizobium etli, Rhizobium tropici, Rhizobium galegae, Sinorhizobiumsp. NGR234,Sinorhizobium meliloti, Sinorhizobium fredii, Sinorhizobium saheli, Sinorhizobium teranga, Mesorhizobium ciceri, Mesorhizobium huakuii, Mesorhizobium loti, Bradyrhizobium elkanii, Bradyrhizobium japonicum, Bradyrhizobium lupini, Bradyrhizobiumsp. "cowpea” yAzorhizobium caulinodans.
[0179] En una modalidad, la invención se refiere a un método para producir una planta transgénica tal como se definió anteriormente, que comprende:
a) una etapa de introducción de un ácido nucleico que contiene la secuencia de nucleótidos N.° ID SEQ: 3, que codifican el miPEP172c que comprende la secuencia de aminoácidos N.° ID SEQ: 2, en una planta deGlycine max, o en al menos una célula de esa planta deGlycine max,en condiciones que permitan la expresión de miPEP172c, estando ese miPEP172c también presente de forma natural en esa planta deGlycine max,el miPEP172c naturalmente presente es un péptido cuya secuencia está codificada por un marco de lectura abierto situado 5' en el transcrito primario de miR172c, ese miPEP172c es capaz de modular la acumulación de ese miR172c, el cual regula la expresión de al menos un gen implicado en la nodulación enGlycine max,y
b) una etapa de cultivo de la planta, o al menos una célula de esa planta, obtenida en la etapa a) en condiciones que permitan la producción de una planta transgénica deGlycine max.
[0180] En una modalidad, se describe un método para producir una planta transgénica tal como se definió anteriormente, que comprende:
a) una etapa de introducción de un ácido nucleico que contiene la secuencia de nucleótidos N.° ID SEQ: 8, que codifican el miPEP167c que comprende la secuencia de aminoácidos N.° ID SEQ: 7, en una planta deGlycine max, o en al menos una célula de esa planta deGlycine max,en condiciones que permitan la expresión de miPEP167c, estando esa miPEP167c también presente de forma natural en esa planta deGlycine max,ese miPEP167c naturalmente presente es un péptido cuya secuencia está codificada por un marco de lectura abierto situado 5' en el transcrito primario de miR167c, ese miPEP167c es capaz de modular la acumulación de ese miR167c, el cual regula la expresión de al menos un gen implicado en la nodulación enGlycine max,y
b) una etapa de cultivo de la planta, o al menos una célula de esa planta, obtenida en la etapa a) en condiciones que permitan la producción de una planta transgénica deGlycine max.
[0181] En una modalidad, la invención se refiere al método de producción como el definido anteriormente, en el que ese miPEP se introduce en la planta a través de un ácido nucleico que lo codifica, introduciéndose ese ácido nucleico en la planta.
[0182] En una modalidad, la invención se refiere al método de producción de una planta transgénica tal como se define anteriormente, en el que se aumenta el número de nódulos en la planta en la que se ha introducido ese miPEP en comparación con el número de nódulos en una planta idéntica de la misma edad en la que no se ha introducido ningún miPEP, o en comparación con el número de nódulos en una planta idéntica de la misma edad en la que no se ha introducido ese miPEP
[0183] En una modalidad, la invención se refiere al método de producción de una planta transgénica tal como se define anteriormente, en el que se aumenta la concentración de nitrógeno en las partes aéreas de la planta en la que se ha introducido ese miPEP en comparación con la concentración de nitrógeno en las partes aéreas de una planta idéntica de la misma edad en la que no se ha introducido ningún miPEP, o en comparación con la concentración de nitrógeno en las partes aéreas de una planta idéntica de la misma edad en la que no se ha introducido ese miPEP
[0184] En una modalidad, la invención se refiere al método de producción de una planta transgénica tal como se define anteriormente, en el que se aumenta el peso de las vainas en la planta en la que se ha introducido ese miPEP en comparación con el peso de las vainas de una planta idéntica de la misma edad en la que no se ha introducido ningún miPEP, o en comparación con el peso de las vainas de una planta idéntica de la misma edad en la que no se ha introducido ese miPEP
[0185] En un aspecto, la invención también se refiere a una planta transgénica obtenida mediante el método de producción definido anteriormente.
[0186] En otro aspecto, la invención se refiere a una planta en la que se ha introducido un miPEP de acuerdo con el uso o método para promover la nodulación descrito anteriormente.
[0187] En otro aspecto, la invención se refiere a un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad, preferentemente al menos un 90% de identidad, con la secuencia de aminoácidos N.° ID SEQ: 2.
[0188] En una modalidad particular, la invención se refiere a un péptido que comprende o consiste en la secuencia N.° ID SEQ: 2.
[0189] En una modalidad particular, ese péptido con la secuencia N.° ID SEQ: es un péptido aislado y/o purificado, un péptido sintético o un péptido recombinante.
[0190] En otro aspecto, la invención se refiere a una composición, en particular una composición fitosanitaria, que comprende miPEP172c como sustancia activa, ese miPEP172c preferentemente consiste en N.° ID SEQ: 2.
[0191] En otro aspecto, la invención se refiere a un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad, preferentemente al menos un 90% de identidad, con la secuencia de aminoácidos N.° ID SEQ: 7.
[0192] En una modalidad particular, la invención se refiere a un péptido que comprende o consiste en la secuencia N.° ID SEQ: 7.
[0193] En una modalidad particular, ese péptido con la secuencia N.° ID SEQ: 7 es un péptido aislado y/o purificado, un péptido sintético o un péptido recombinante.
[0194] En una modalidad, la invención se refiere a un péptido como se ha definido anteriormente, estando ese péptido marcado.
[0195] De manera no limitativa, un péptido marcado puede obtenerse en particular fusionando ese péptido con otra secuencia peptídica, con un marcador fluorescente (GUS, GFP, LacZ...), con una secuencia señal (que permite el direccionamiento del péptido), con una secuencia etiqueta (que permite la purificación del miPEP) o incluso con un isótopo radiactivo.
[0196] En el caso de que el péptido de la invención se marque usando otra secuencia peptídica, esto no se tiene en cuenta para calcular un porcentaje de identidad con respecto al péptido de la invención.
[0197] En otro aspecto, la invención se describe una composición, en particular una composición fitosanitaria, que comprende miPEP167c como sustancia activa, ese miPEP167c preferentemente consiste en N.° ID SEQ: 7.
[0198] En otro aspecto, la invención se refiere a una composición como la definida anteriormente, en la que ese miPEP172c se encuentra a una concentración de 10-9 M a 10-4 M, en particular 10-9, 10-8, 10-7, 10-6, 10-5 o 10-4 M.
[0199] Preferentemente, una composición como la definida anteriormente tiene una concentración de 10-8 M a 10-5 M para su aplicación mediante riego o pulverización sobre la planta o mediante la adición de un fertilizante, una tierra para macetas, un sustrato de cultivo o mediante un soporte en contacto con la planta.
[0200] Preferentemente, una composición como la definida anteriormente tiene una concentración de 10-8 M a 10-5 M para su aplicación mediante riego o pulverización sobre la semilla o mediante la adición de un fertilizante, una tierra para macetas, un sustrato de cultivo o mediante un soporte en contacto con la semilla o la plántula.
[0201] De manera complementaria, se pueden prever composiciones más o menos concentradas para tratar la planta con miPEP. Por ejemplo, y sin limitación, se pueden utilizar composiciones más concentradas que comprenden de 10-1M a 10-3M, especialmente 10-2M de miPEP, en el caso en que el miPEP introducido exógenamente se administre a la planta mediante esparcimiento.
[0202] En otro aspecto, la invención se refiere a una composición como la definida anteriormente, que comprende además un excipiente, un diluyente o un disolvente.
[0203] En una modalidad, la invención se refiere a una composición como la definida anteriormente formulada para formar un recubrimiento.
[0204] En una modalidad, la invención se refiere a una composición como la definida anteriormente:
- en forma granulada,
- formulado para formar un gránulo, o
- formulado de manera que esté contenido en un gránulo.
[0205] En otro aspecto, la invención se refiere a una composición que comprende en combinación una cantidad de semillas de una planta y una cantidad de un péptido cuya secuencia comprende o consiste en una secuencia idéntica a la de un miPEP presente de forma natural en esa planta.
[0206] En una modalidad, la invención se refiere a una composición que comprende en combinación una cantidad de semillas de plantas, en particularGlycine maxy una cantidad de un péptido cuya secuencia comprende o consiste en una secuencia idéntica a la de miPEP172c.
[0207] En una modalidad, se describe una composición que comprende, en combinación, una cantidad de semillas de una planta, en particularGlycine maxy una cantidad de un péptido cuya secuencia comprende o consiste en una secuencia idéntica a la de miPEP167c. En otro aspecto, la invención se refiere a una composición como la definida anteriormente, que comprende además un excipiente, un diluyente o un disolvente.
[0208] En una modalidad, la invención se refiere a una composición como la definida anteriormente formulada para formar una semilla o un grano recubiertos.
[0209] El recubrimiento puede realizarse según los procedimientos convencionalmente utilizados en la industria alimentaria y puede obtenerse mediante el uso de un material capaz de desintegrarse en un disolvente o en la tierra, tal como un aglutinante o arcilla.
[0210] La composición que contiene ese miPEP puede aplicarse en particular a la semilla, debajo, dentro o sobre la capa de recubrimiento.
[0211] Según la invención, el recubrimiento puede utilizarse, por ejemplo, para conferir propiedades particulares a una composición de miPEP, o a una composición de semillas en combinación con una miPEP.
[0212] En otro aspecto, la invención se refiere a una semilla recubierta con una composición que comprende un miPEP capaz de modular la acumulación de un miR en la planta resultante de la semilla, cuyo miR regula la expresión de al menos un gen implicado en la nodulación en esa planta.
[0213] En una modalidad, la invención se refiere a semillas recubiertas con una composición que comprende miPEP172C.
[0214] En una modalidad, la invención se refiere a una semilla recubierta con una composición que comprende un péptido cuya secuencia tiene al menos un 80 % de identidad, preferiblemente al menos un 90 % de identidad con la secuencia N.° ID SEQ: 2.
[0215] En una modalidad, la invención se refiere a una semilla recubierta con una composición que comprende el péptido N.° ID SEQ: 2.
[0216] En una modalidad, se describe una semilla recubierta con una composición que comprende miPEP167c.
[0217] En una modalidad, se describe una semilla recubierta con una composición que comprende un péptido cuya secuencia tiene al menos un 80 % de identidad, preferiblemente al menos un 90 % de identidad, con la secuencia N.° ID SEQ: 7.
[0218] En una modalidad, se describe una semilla recubierta con una composición que comprende el péptido N.° ID SEQ: 7.
[0219] En una modalidad, la invención se refiere a una semilla recubierta tal como se definió anteriormente, siendo esa planta una planta leguminosa, tal como Loto(Lotus sp.),soja(Glycine max),cacahuete(Arachis hypogaea),judía(Phaseolus vulgaris),guisante(Pisum sativum),lenteja(Lens culinaris),garbanzo(Cicer arietinum),haba y alubias(Vicia faba),veza(Viciasp.), acelga(Lathyrussp.), alfalfa(Medicagosp.), trébol(Trifoliumsp.), altramuz(Lupinussp.), judía mungo(Vigna radiata),regaliz(Glycyrrhiza glabra),palisandro(Dalbergia),loto corniculado(Lotus corniculatus),esparceta(Onobrychis viciifolia),rooibos(Aspalathus linearis),fenogreco(Trigonella foenum-graecum).
[0220] En otro aspecto, la invención se refiere a un protocolo para producir un péptido recombinante, cuya secuencia comprende o consiste en una secuencia idéntica a la de un miPEP como se ha definido anteriormente, que comprende una etapa de transformación de un organismo con un vector de expresión que codifica ese péptido recombinante.
[0221] En una modalidad, ese organismo se selecciona del grupo que incluye bacterias, levaduras, hongos (distintos de las levaduras), células animales, plantas y animales.
[0222] En una modalidad, ese organismo esEscherichia coli.
[0223] En particular, la invención se refiere a un protocolo para producir un péptido recombinante como se ha definido anteriormente, que comprende las siguientes etapas:
- el ácido nucleico que codifica ese péptido recombinante está unido a un ácido nucleico que codifica una etiqueta, como la GST,
- el vector de expresión que contiene ese ácido nucleico que codifica ese péptido recombinante se introduce en la bacteriaE. coli,
- la bacteriaE. colique contiene el vector de expresión se cultiva en medio LB, preferentemente hasta una DO comprendida entre 0,2 y 0,4,
- la producción del péptido recombinante se induce con IPTG, preferiblemente durante 4 a 5 horas,
- las bacteriasE. colise centrifugan y se lisan,
- se filtra el sobrenadante,
- ese péptido recombinante se purifica en una columna de afinidad de glutatión sefarosa,
- si es necesario, escindir la GST con una proteasa.
[0224] En otro aspecto, la invención se refiere a una bacteria transformada con una secuencia que codifica el miPEP tal como se ha definido anteriormente.
[0225] En una modalidad, la invención se refiere a una bacteria transformada con una secuencia que codifica el miPEP, siendo esa bacteria una bacteria de la familia de lasRhizobiaceae.En una modalidad, la invención se refiere a una bacteria transformada con una secuencia que codifica una miPEP, seleccionándose esa bacteria de los génerosRhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium, BradyrhizobiumoAzorhizobium.
[0226] En una modalidad, la invención se refiere a una bacteria transformada con una secuencia que codifica un miPEP, seleccionándose esa bacteria entreRhizobium leguminosarum, Rhizobium etli, Rhizobium tropici, Rhizobium galegae, Sinorhizobiumsp. NGR234,Sinorhizobium meliloti, Sinorhizobium fredii, Sinorhizobium saheli, Sinorhizobium teranga, Mesorhizobium ciceri, Mesorhizobium huakuii, Mesorhizobium loti, Bradyrhizobium elkanii, Bradyrhizobium japonicum, Bradyrhizobium lupini, Bradyrhizobiumsp. "cowpea” yAzorhizobium caulinodans.
[0227] En otro aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo que reconoce específicamente miPEP172c, en particular ese miPEP172c consistente en N.° ID SEQ: 2.
[0228] Ese anticuerpo puede obtenerse a partir de un método conocido por los expertos en la materia, tal como por ejemplo inyectando ese miPEP172c en un animal no humano para desencadenar una reacción de inmunización y la producción de anticuerpos por ese animal.
[0229] En otro aspecto, la invención se refiere a un método para la inmunolocalización de miPEP172c que comprende una etapa de marcado de una muestra biológica de una planta con un anticuerpo que reconoce específicamente ese miPEP172c.
[0230] En otro aspecto, se describe un anticuerpo que reconoce específicamente miPEP167c, en particular ese miPEP167c consistente en N.° ID SEQ: 7.
[0231] Ese anticuerpo puede obtenerse a partir de un método conocido por los expertos en la materia, tal como por ejemplo inyectando ese miPEP167c en un animal no humano para desencadenar una reacción de inmunización y la producción de anticuerpos por ese animal.
[0232] En otro aspecto, se describe un método para la inmunolocalización de miPEP167c que comprende una etapa de marcado de una muestra biológica de una planta con un anticuerpo que reconoce específicamente ese miPEP167c.
[0233] En otro aspecto, la invención se refiere a un método de cultivo de bacterias, que comprende una etapa de puesta en contacto de esas bacterias:
- con una mezcla que comprende una planta o una parte de una planta, en particular un cultivo de raíces, y un péptido cuya secuencia comprende o consiste en una secuencia idéntica a la de un miPEP presente de forma natural en esa planta, siendo ese miPEP de origen natural un péptido cuya secuencia está codificada por un marco de lectura abierto situado en 5' de la transcripción primaria de un miR, siendo ese miPEP capaz de modular la acumulación de ese miR, el cual regula la expresión de al menos un gen implicado en la nodulación en esa planta, o
- con una planta transgénica tal como se ha definido anteriormente,
siendo capaces la planta, la parte de la planta y la planta transgénica de formar una simbiosis con esa bacteria.
[0234] En una modalidad particular, la invención se refiere al método tal como se definió anteriormente, en el que las bacterias cultivadas pertenecen a la familiaRhizobiaceae.
[0235] En una modalidad particular, la invención se refiere al método definido anteriormente en el que esas bacterias se seleccionan de los génerosRhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium, BradyrhizobiumoAzorhizobium.
[0236] En una modalidad particular, la invención se refiere al método definido anteriormente en el que esas bacterias se seleccionan entreRhizobium leguminosarum, Rhizobium etli, Rhizobium tropici, Rhizobium galegae, Sinorhizobiumsp. NGR234,Sinorhizobium meliloti, Sinorhizobium fredii, Sinorhizobium saheli, Sinorhizobium teranga, Mesorhizobium ciceri, Mesorhizobium huakuii, Mesorhizobium loti, Bradyrhizobium elkanii, Bradyrhizobium japonicum, Bradyrhizobium lupini, Bradyrhizobiumsp. "cowpea” yAzorhizobium caulinodans.
[0237] En particular, el método de cultivo de esas bacterias tal como se define anteriormente se realiza en condiciones de cultivo que permiten el crecimiento, o incluso la mejora del crecimiento de la planta, de la parte de la planta, y de la planta transgénica, y el de las bacterias.
[0238] En particular, el método de cultivo de bacterias tal como se define anteriormente se lleva a cabo en condiciones de cultivo que permiten la simbiosis entre las bacterias y la planta, la parte de la planta o la planta transgénica.
[0239] En una modalidad, el péptido presente en la mezcla es un péptido aislado, un péptido aislado y/o purificado, un péptido sintético o un péptido recombinante.
[0240] En una modalidad, la invención se refiere a un método para cultivar bacterias tal como se definió anteriormente, en el que ese miR es miR172c, en particular, en el que ese miR172c tiene una secuencia de nucleótidos que consiste en N.° ID SEQ: 1.
[0241] En una modalidad, la invención se refiere a un método para cultivar bacterias como se ha definido anteriormente, en el que ese miPEP es miPEP172c, en particular, en el que ese miPEP172c tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en N.° ID SEQ: 2.
[0242] En una modalidad, se describe un método para cultivar bacterias como se definió anteriormente, en donde ese miARN es miR167c, en particular, en donde ese miR167c tiene una secuencia de nucleótidos que consiste en N.° ID SEQ: 6.
[0243] En una modalidad, se describe un método para cultivar bacterias como se definió anteriormente, en donde ese miPEP es miPEP167c, en particular, en donde ese miPEP167c tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en N.° ID SEQ: 7.
[0244] En particular, la invención se refiere a un método para cultivar bacterias tal como se definió anteriormente, en el que esa parte de la planta es una raíz o un fragmento de raíz.
[0245] En otro aspecto, la invención se refiere a un método para producir inóculo bacteriano, en particular bacterias de la familiaRhizobiaceae,que comprende:
- una etapa de cocultivo de bacterias con un material vegetal vivo, denominado planta huésped, correspondiente al menos en parte a una parte constituyente de la raíz de una planta capaz de formar una simbiosis con esas bacterias, y
- una etapa de puesta en contacto de una cantidad de un péptido con el cocultivo mencionado anteriormente, teniendo ese péptido una secuencia que comprende o consiste en una secuencia idéntica a la de un miPEP presente de forma natural en esa planta huésped, siendo ese miPEP presente de forma natural un péptido cuya secuencia está codificada por un marco de lectura abierto situado en 5' del transcrito primario de un miR, siendo ese miPEP capaz de modular la acumulación de ese miR, el cual regula la expresión de al menos un gen implicado en la nodulación en esa planta huésped.
[0246] La invención también se refiere a un método para producir inóculo de bacterias, en particular bacterias de la familiaRhizobiaceae,que comprende una etapa de cocultivo de las bacterias con un material vegetal vivo, denominado planta huésped, que corresponde al menos en parte a una parte constituyente de la raíz de una planta capaz de formar una simbiosis con esas bacterias, y siendo esa planta huésped una planta transgénica o una planta en la que se ha introducido un péptido, teniendo ese péptido una secuencia que comprende o consiste en una secuencia idéntica a la de un miPEP presente de forma natural en esa planta huésped, siendo ese miPEP presente de forma natural un péptido cuya secuencia está codificada por un marco de lectura abierto situado en 5' del transcrito primario de un miR, siendo ese miPEP capaz de modular la acumulación de ese miR, el cual regula la expresión de al menos un gen implicado en la nodulación en esa planta huésped.
[0247] La invención también se refiere a un método para producir un inóculo bacteriano, en particular bacterias de la familiaRhizobiaceae,que comprende una etapa de mezcla que reúne:
- bacterias,
- un material vegetal vivo, denominado planta huésped, que corresponde al menos en parte a una parte constituyente de la raíz de una planta capaz de formar una simbiosis con esas bacterias, y
- un péptido,
ese péptido que tiene una secuencia que comprende o consiste en una secuencia idéntica a la de un miPEP presente de forma natural en esa planta huésped, siendo ese miPEP presente de forma natural un péptido cuya secuencia está codificada por un marco de lectura abierto situado en 5' de la transcripción primaria de un miR, siendo ese miPEP capaz de modular la acumulación de ese miR, el cual regula la expresión de al menos un gen implicado en la nodulación en esa planta huésped.
[0248] En otro aspecto, la invención se refiere a un inóculo de bacterias, en particular un inóculo de bacterias de la familiaRhizobiaceae,adecuado para la inoculación de una planta huésped, que comprende al menos una bacteria y un péptido cuya secuencia comprende o consiste en una secuencia idéntica a la de un miPEP presente de forma natural en la planta huésped,
ese miPEP presente de forma natural en la planta huésped es un péptido cuya secuencia está codificada por un marco de lectura abierto situado en 5' de la transcripción primaria de un miR, ese miPEP siendo capaz de modular la acumulación de ese miR, el cual regula la expresión de al menos un gen implicado en la nodulación en esa planta huésped.
[0249] Preferiblemente, ese miPEP es miPEP172c.
[0250] Preferiblemente, ese miPEP es miPEP167c.
[0251] El péptido usado para producir el inoculo, o el péptido presente en el inoculo, es en particular un péptido aislado, un péptido aislado y/o purificado, un péptido sintético o un péptido recombinante.
[0252] Preferiblemente, el inóculo contiene adicionalmente una planta o una parte de planta, en particular una raíz, un cultivo de raíz o una parte de raíz.
[0253] Las secuencias de miPEP172c, su marco de lectura abierto, miR172c y el transcrito primario de miR172c enGlycine maxse muestran en la Tabla 1.
Tabla 1.
(suite)
[0254] Las secuencias de miPEP167c, su marco de lectura abierto, miR167c y el transcrito primario de miR167c enGlycine maxse muestran en la Tabla 2.
Tabla 2.
[0255] Las páginas 36 a 50 corresponden a extractos de la solicitud de patente francesa n.° FR 13/60727 presentado el 31 de octubre de 2013 por el título «Los micropéptidos y su uso para modular la expresión génica»
[0256]El objeto de la solicitudFR 13 60727se refiere a los micropéptidos (péptidos codificados por microARN o «miPEPs») y a su uso para modular la expresión génica.
[0257]Los microARN (miR) son pequeños ARN no codificantes, de aproximadamente 21 nucleótidos de longitud después de la maduración, que se controlan la expresión de genes diana a nivel postranscripcional, degradando el ARNm diana o inhibiendo su traducción. Los miR se encuentran en plantas y animales.
[0258]Los genes diana suelen ser genes clave en los procesos de desarrollo. Codifican, por ejemplo, los factores de transcripción o las proteínas del proteasoma.
[0259]La regulación de la expresión del miR es muy poco conocida, pero sabemos en particular que implica, como la mayoría de los genes codificantes, una ARN polimerasa II: esta enzima produce un transcrito primario, llamado «primiR», que luego madura mediante un complejo proteico que contiene en particular, enzimas de tipo Dicer. Esta maduración conduce primero a la formación de un precursor de miR llamado «pre-miR», que tiene una estructura secundaria en forma de bucle que contiene miR y su secuencia miR* complementaria. Luego, el precursor madura, lo que conduce a la formación de un ARN bicatenario más corto que contiene el miR y el miR*. A continuación, el miR es absorbido por el complejo RISC, que escinde el ARNm del gen diana o inhibe su traducción.
[0260]Además, se ha demostrado que la presencia de intrones en el transcrito primario de microARN aumenta la expresión de microARN maduro('Schwab et al., EMBO Rep., 14(7):615-21,2013).Sin embargo, debido a dificultades experimentales, las transcripciones de microARN primarios, o pri-miRs, han sido muy poco estudiadas.
[0261]Aproximadamente el 50 % de los genes eucariotas tienen, dentro de su región 5' UTR (región no traducida de 5') en la parte ascendente de la secuencia codificante, pequeños marcos de lectura abiertos. Estos pequeños marcos de lectura abiertos (o «uORF» para los ORF ascendentes) pueden desempeñar un papel en la regulación de la traducción, principalmente en cis, al modular la unión y la velocidad de los ribosomas en el ARNm, pero también en trans según un mecanismo que aún se desconoce, a través de péptidos codificados por esos uORF(Combier et al., Gene Dev, 22:1549-1559, 2008).Por definición, los uORF están presentes antes de genes codificantes.
[0262]Recientemente, también se han descubierto pequeños ORF en ARN no codificantes intergénicos largos (lincRNA) cuya función putativa, si la hay, se desconoce(Ingolia et al., Cell, 147(4):789-802, 2011; Guttman & Rinn, Nature, 482(7385):339-46, 2012).
[0263]Sin embargo, todavía no se han descrito ejemplos sobre la existencia de ORF que codifiquen péptidos dentro de microARN no codificantes. Hasta ahora, los microARN, y por extensión su transcrito primario, siempre se han considerado, debido a su particular modo de acción, como ARN reguladores no codificantes que no producen péptidos.
[0264]Uno de los aspectos del objeto de la solicitudFR 13 60727es proponer péptidos capaces de modular la expresión de microARN.
[0265]Otro de los aspectos del objeto de la solicitudFR 1360727es proponer un medio para modular la expresión de uno o más genes diana de microARN.
[0266]El objeto de la solicitudFR 1360727tiene la ventaja de permitir un control más fácil y eficaz de la expresión de los genes a los que se dirigen los microARN, utilizando un medio distinto del microARN.
[0267]El objeto de la solicitudFR 13 60727se refiere, por tanto, a un método para detectar e identificar un micropéptido (miPEP) codificado por una secuencia de nucleótidos contenida en la secuencia del transcrito primario de un microARN que comprende:
-a) una etapa de detección de un marco de lectura abierto de 15 a 303 nucleótidos contenido en la secuencia del transcrito primario de ese microARN y, a continuación,
-b) una etapa de comparación entre:
•la acumulación de ese microARN en una célula eucariota dada que expresa ese microARN, en presencia de un péptido codificado por una secuencia de nucleótidos idéntica o degenerada en comparación con la de ese marco de lectura abierto, estando ese péptido presente en la célula independientemente de la transcripción del transcrito primario de ese microARN, y
•la acumulación de ese microARN en una célula eucariota del mismo tipo que esa célula eucariota determinada que expresa ese microARN, en ausencia de ese péptido, donde, una modulación de la acumulación de ese microARN en presencia de ese péptido comparada con la acumulación de ese microARN en ausencia de ese péptido indica la existencia de un micropéptido codificado por ese marco de lectura abierto.
[0268]En un primer paso, el método de detección e identificación de un micropéptido consiste por tanto en detectar en el transcrito primario de un microARN la existencia de un marco de lectura abierto que potencialmente codifica un péptido.
[0269]La segunda etapa permite caracterizar ese péptido, es decir, determinar si corresponde a un péptido realmente producido en la célula, buscando un efecto de ese péptido sobre la acumulación del microARN.
[0270]Para demostrar un efecto del péptido sobre la acumulación de microARN, una gran cantidad de péptido se introduce en una primera célula que expresa ese microARN. La acumulación del microARN en esta primera célula se mide y se compara con la acumulación del microARN en una segunda célula idéntica a la primera, pero que no contiene ese péptido.
[0271]La observación de una variación en las cantidades de microARN entre las células en presencia y en ausencia del péptido indica así (i) que existe un péptido codificado en el transcrito primario de ese microARN, (ii) que la secuencia de este péptido está codificada por el marco abierto de lectura identificado en el transcrito primario de ese microARN, y (iii) que ese péptido actúa sobre la acumulación de ese microARN.
[0272]El objeto de la solicitudFR 1360727se basa por lo tanto en la doble observación inesperada hecha por los Inventores de que, por una parte, existen marcos de lectura abiertos capaces de codificar micropéptidos presentes enlos transcritos primarios de microARNs y, por otra parte, que esos micropéptidos son capaces de modular la acumulación de esos microARN.
[0273]En la solicitud FR 1360727, los términos «microARN», «microARN no codificante» y «miR» son equivalentes y se pueden usar indistintamente. Definen pequeñas moléculas de ARN de aproximadamente 21 nucleótidos, que no se traducen y no conducen a un péptido o proteína.
[0274]Sin embargo, en esta forma madura, los microARNs aseguran una función de regulación de ciertos genes a través de mecanismos postranscripcionales como, por ejemplo, a través del complejo RISC.
[0275]El transcrito primario del microARN o «pri-miR» es la molécula de ARN que se obtiene directamente de la transcripción de la molécula de ADN. Por lo general, este transcrito primario experimenta una o más modificaciones postranscripcionales, que resultan, por ejemplo, en una estructura particular del ARN o en el corte de ciertas partes del ARN mediante fenómenos de empalme, lo que lleva a la forma precursora del microARN o «pre-miR», y posteriormente a la forma madura del microARN o «miR».
[0276]Los términos «micropéptidos» y «miPEP» (péptidos codificados por microARN) son equivalentes y se pueden usar indistintamente. Definen un péptido que está codificado por un marco de lectura abierto presente en la transcripción primaria de un microARN, y que es capaz de modular la acumulación de ese microARN. Los micropéptidos en el sentido de la solicitud FR 13 60727 no deben entenderse necesariamente como péptidos de pequeño tamaño, en la medida en que «micro» no se refiere al tamaño del péptido.
[0277]Dada la degeneración del código genético, el mismo micropéptido puede estar codificado por varias secuencias de nucleótidos. Esas secuencias de nucleótidos, que son diferentes entre sí en al menos un nucleótido pero que codifican el mismo péptido, se denominan «secuencias degeneradas».
[0278]Los términos «marco de lectura abierto» u «ORF» (open reading frame) son equivalentes y se pueden usar indistintamente. Corresponden a una secuencia de nucleótidos en una molécula de ADN o ARN que pueden codificar potencialmente un péptido o proteína: ese marco de lectura abierto comienza con un codón de inicio, seguido de una serie de codones y termina con un codón de parada.
[0279]En la solicitudFR 1360727,los ORF pueden denominarse de manera específica «miORFs» cuando están presentes en transcritos primarios de microARN.
[0280]En la solicitudFR 1360727, «acumulación» significa la producción de una molécula, como microARN o un micropéptido, en la célula.
[0281]Por lo tanto, la «modulación» de la acumulación de una molécula en una célula corresponde a un cambio en la cantidad de esa molécula presente en la célula.
[0282] En una modalidad, el objeto de la solicitud FR 1360727 se refiere a un método de detección y de identificación de un miPEP tal como se definió anteriormente, en el que la modulación de la acumulación de ese microARN es una disminución o un aumento de la acumulación de ese microARN, en concreto un aumento.
[0283] Una «disminución de la acumulación» corresponde a una disminución en la cantidad de esa molécula en la célula.
[0284] Por el contrario, un «aumento en la acumulación» corresponde a un aumento en la cantidad de esa molécula en la célula.
[0285] En una modalidad ventajosa, el objeto de la solicitud FR 13 60727 se refiere a un método de detección e identificación de un miPEP como se ha definido anteriormente, en el que la modulación de la acumulación de ese microARN es un aumento en la acumulación de ese microARN
[0286] En una modalidad, el objeto de la solicitud FR 1360727 se refiere a un método de detección y de identificación de un miPEP tal como se definió anteriormente, en el que la presencia de ese péptido en la célula da como resultado: - la introducción en la célula de un ácido nucleico que codifica ese péptido, o
- la introducción de ese péptido en la célula.
[0287] Para caracterizar un miPEP, es necesario disponer de un modelo celular que exprese un microARNy en el que esté presente ese péptido a ensayar.Para ello, es posible introducir un péptido en la célula, ya sea poniendo la célula en contacto con ese péptido, o introduciendo en la célula un ácido nucleico que codifique ese péptido, cuyo ácido nucleico se traducirá entonces en un péptido dentro de la célula.
[0288] En una modalidad, el objeto de la solicitud FR 1360727 se refiere a un método de detección y de identificación de un miPEP tal como se definió anteriormente, en el que ese marco de lectura abierto de la etapa a) está contenido en la parte 5' o 3' de ese transcrito primario del microARN, preferentemente en la parte 5'.
[0289] Las partes 5' o 3' del transcrito primario del microARN corresponden a las partes terminales de la molécula de ARN que se escinden durante la maduración del microARN. En una modalidad, el objeto de la solicitud FR 1360727 se refiere a un método de detección y de identificación de un miPEP como se ha definido anteriormente, en el que ese microARN está presente en una célula vegetal de tipo silvestre.
[0290] En la solicitud FR 1360727, una célula vegetal de tipo silvestre corresponde a una célula vegetal que no ha sido modificada genéticamente por el hombre.
[0291] En una modalidad, el objeto de la solicitud FR 1360727 se refiere a un método de detección e identificación de un miPEP tal como se definió anteriormente, en el que esa célula eucariota determinada y esa célula eucariota del mismo tipo que la célula eucariota determinada anteriormente, utilizadas en la etapa b, son células vegetales, preferiblemente células de Medicago truncatula o de Arabidopsis thaliana.
[0292] En el método de detección e identificación de un micropéptido como se define anteriormente, después de haber identificado un ORF susceptible de codificar un péptido sobre el transcrito primario de un microARN, es necesario disponer de un modelo celular que posea ese microARN y ese péptido, con el fin de poder demostrar un posible efecto del péptido sobre el microARN.
[0293] Por lo tanto, hay dos opciones posibles:
- el modelo celular en el que se ha identificado el miORF y aquel en el que se ha demostrado el efecto del péptido sobre el miR son idénticos, o bien
- el modelo celular en el que se identificó el miORF y aquel en el que se demostró el efecto del péptido sobre el miR son diferentes.
[0294] En la primera opción, el modelo celular utilizado para observar un efecto del péptido es el mismo en el que se aisló el transcrito primario de ese microARN. En este modelo celular, las células eucariotas determinadas contienen de forma natural ese microARN y sólo es necesario introducir en ellas el péptido que se desea probar. En este contexto, ese microARN se califica como «de origen endógeno» porque existe de forma natural en las células. Sin embargo, en una célula se pueden incorporar otras copias de un microARN de origen endógeno, por ejemplo, introduciendo en la célula un vector que codifique el mencionado microARN de origen endógeno.
[0295] En la segunda opción, el modelo celular utilizado para observar un efecto del péptido es diferente de aquel en que se aisló el transcrito primario de ese microARN. En este modelo celular, las células eucariotas determinadas no contienen ni el microARN ni el péptido a ensayar. Por lo tanto, estos dos elementos deben introducirse en estas células.Eneste contexto, ese microARN se califica como «de origen exógeno» porque no existe de forma natural en las células.
[0296] En una modalidad, el objeto de la solicitud FR 1360727 se refiere a un método para detectar e identificar un miPEP tal como se definió anteriormente, en el que ese microARN es de origen endógeno en esa célula eucariota y en esa célula eucariota del mismo tipo que la célula eucariota determinada anteriormente, utilizada en la etapa b).
[0297] En una modalidad, el objeto de la solicitud FR 1360727 se refiere a un método para detectar e identificar un miPEP tal como se define anteriormente en el que ese microARN es de origen exógeno en esa célula eucariota y en esa célula eucariota del mismo tipo que la célula eucariota determinada mencionada anteriormente, utilizada en la etapa b), conteniendo esas células eucariotas un vector que permite la expresión de ese microARN.
[0298] En una modalidad, el objeto de la solicitud FR 1360727 se refiere a un método para detectar e identificar un miPEP tal como se define anteriormente en el que la acumulación de ese microARN se determina mediante una RT-PCR cuantitativa o un Northern blot.
[0299] En una modalidad, el objeto de la solicitud FR 1360727 se refiere a un método para detectar e identificar un miPEP tal como se define anteriormente en el que la acumulación de ese microARN se determina mediante un microchip de ADN o de ARN.
[0300] La acumulación de ese microARN puede determinarse mediante técnicas de biología molecular que permiten el ensayo de moléculas de ácido nucleico específicas.
[0301] En otro aspecto, el objeto de la solicitud FR 1360727 también se refiere a un método para detectar e identificar un microARN cuya secuencia de transcripción primaria contiene una secuencia de nucleótidos que codifica un miPEP, que comprende:
-a) una etapa de detección de un marco de lectura abierto de 15 a 303 nucleótidos contenido en la secuencia del transcrito primario de ese microARN y, a continuación,
- b) una etapa de comparación entre:
• la acumulación de ese microARN en una célula eucariota dada que expresa ese microARN, en presencia de un péptido codificado por una secuencia de nucleótidos idéntica o degenerada en comparación con la de ese marco de lectura abierto, estando ese péptido presente en la célula independientemente de la transcripción del transcrito primario de ese microARN, y
• la acumulación de ese microARN en una célula eucariota del mismo tipo que esa célula eucariota determinada que expresa ese microARN, en ausencia de ese péptido, donde, una modulación de la acumulación de ese microARN en presencia de ese péptido comparada con la acumulación de ese microARN en ausencia de ese péptido indica la existencia de un microARN cuyo transcrito primario contiene una secuencia de nucleótidos que codifica un micropéptido.
[0302] En una modalidad, el objeto de la solicitud FR 1360727 se refiere a un método de detección y de identificación de un microARN tal como se definió anteriormente, en el que la modulación de la acumulación de ese microARN es una disminución o un aumento de la acumulación de ese microARN, en concreto un aumento.
[0303] En una modalidad, el objeto de la solicitud FR 1360727 se refiere a un método de detección y de identificación de un microARN tal como se definió anteriormente, en el que la presencia de ese péptido en la célula da como resultado:
- la introducción en la célula de un ácido nucleico que codifica ese péptido, o
- la introducción de ese péptido en la célula.
[0304] En una modalidad, el objeto de la solicitud FR 1360727 se refiere a un método de detección y de identificación de un microARN tal como se definió anteriormente, en el que ese marco de lectura abierto de la etapa a) está contenido en la parte 5' o 3' de ese transcrito primario del microARN, preferentemente en la parte 5'.
[0305] En una modalidad, el objeto de la solicitud FR 1360727 se refiere a un método de detección y de identificación de un microARN como se ha definido anteriormente, en el que ese microARN está presente en una célula vegetal de tipo silvestre.
[0306] En una modalidad, el objeto de la solicitud FR 1360727 se refiere a un método de detección e identificación de un microARN tal como se definió anteriormente, en el que esa célula eucariota y esa célula eucariota del mismo tipo que la célula eucariota determinada anteriormente, utilizadas en la etapa b, son células vegetales, preferiblemente células de Medicago truncatula.
[0307] En una modalidad, el objeto de la solicitud FR 13 60727 se refiere a un procedimiento de detección e identificación de un microARN tal como se define anteriormente, en el que ese microARN es de origen endógeno en esa célula eucariota y en esa célula eucariota del mismo tipo que la citada célula eucariota determinada, utilizadas en la etapa b).
[0308] En una modalidad, el objeto de la solicitud FR 1360727 se refiere a un método para detectar e identificar un microARN tal como se define anteriormente en el que ese microARN es de origen exógeno en esa célula eucariota y en esa célula eucariota del mismo tipo que la célula eucariota determinada mencionada anteriormente, utilizada en la etapa b), conteniendo esas células eucariotas un vector que permite la expresión de ese microARN.
[0309] En una modalidad, el objeto de la solicitud FR 1360727 se refiere a un método para detectar e identificar un microARN tal como se define anteriormente en el que la acumulación de ese microARN se determina mediante una RT-PCR cuantitativa o un Northern blot.
[0310] En una modalidad, el objeto de la solicitud FR 1360727 se refiere a un método para detectar e identificar un microARN tal como se define anteriormente en el que la acumulación de ese microARN se determina mediante un microchip de ADN o de ARN.
[0311] En otro aspecto, el objeto de la solicitud FR 1360727 se refiere a un miPEP tal como se obtiene mediante la implementación del proceso tal como se define anteriormente.
[0312] Otro aspecto del objeto de la solicitud FR 1360727 se refiere también a un miPEP de 4 a 100 aminoácidos, preferiblemente de 4 a 40 aminoácidos, codificado por una secuencia de nucleótidos contenida en el transcrito primario de un microARN, siendo ese miPEP capaz de modular la acumulación de ese microARN en una célula eucariota.
[0313] Además, debe tenerse en cuenta que pueden identificarse varios miORFS en el transcrito primario de un microARN, lo que indica que un transcrito primario de un microARN puede codificar potencialmente varios miPEP [0314] También debe tenerse en cuenta que el efecto de un miPEP es generalmente específico de un solo microARN, es decir, el resultado del transcrito primario que codifica ese miPEP.
[0315] En una modalidad, el objeto de la solicitud FR 1360727 se refiere a un miPEP como se definió anteriormente, esa secuencia de nucleótidos está contenida en la parte 5' o 3’ de ese transcrito primario de un microARN, preferiblemente en la parte 5’.
[0316] En una modalidad, el objeto de la solicitud FR 1360727 se refiere a un miPEP como se definió anteriormente, esa secuencia de nucleótidos que corresponde al primer marco abierto de lectura presente en ese transcrito primario de un microARN.
[0317] En una modalidad, el objeto de la solicitud FR 1360727 se refiere a un miPEP como se definió anteriormente, donde ese miPEP tiene un punto isoeléctrico básico, preferiblemente mayor que 8.
[0318] En otro aspecto, el objeto de la solicitud FR 1360727 se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica un miPEP como se definió anteriormente.
[0319] En otro aspecto, el objeto de la solicitud FR 13 60727 se refiere a un vector que comprende al menos una molécula de ácido nucleico como se definió anteriormente.
[0320] En otro aspecto, el objeto de la solicitud FR 1360727 también se refiere al uso de al menos:
- un miPEP como se definió anteriormente,
- un ácido nucleico que codifica ese miPEP, o
- un vector que contiene ese ácido nucleico,
para modular la expresión de al menos un gen en una célula eucariota determinada, siendo esa célula eucariota determinada capaz de expresar un microARN, cuyo transcrito primario contiene al menos una secuencia nucleotídica que codifica ese al menos un miPEP y cuya acumulación es modulada por ese al menos un miPEP, estando regulada la expresión de ese al menos un gen por ese microARN.
[0321] En otro aspecto, el objeto de la solicitud FR 1360727 también se refiere al uso de al menos:
- un miPEP de 4 a 100 aminoácidos, preferiblemente de 4 a 40 aminoácidos, codificado por una secuencia de nucleótidos contenida en el transcrito primario de un microARN, siendo ese miPEP capaz de modular la acumulación de ese microARN en una célula eucariota,
- un ácido nucleico que codifica ese miPEP, o
- un vector que contiene ese ácido nucleico, para modular la expresión de al menos un gen en una célula eucariota determinada, siendo esa célula eucariota determinada capaz de expresar un microARN, cuyo transcrito primario contiene al menos una secuencia nucleotídica que codifica ese al menos un miPEP y cuya acumulación es modulada por ese al menos un miPEP, estando regulada la expresión de ese al menos un gen por ese microARN.
[0322] El objeto de la solicitud FR 1360727 se basa en la sorprendente observación realizada por los inventores de que es posible modular la expresión de uno o varios genes diana de un mismo microARN modulando la acumulación de ese microARN con la ayuda de un miPEP.
[0323]En una modalidad, el objeto de la solicitudFR 1360727se refiere al uso como se definió anteriormente en el que esa célula eucariota determinada es una célula vegetal.
[0324]En una modalidad, el objeto de la solicitudFR 1360727se refiere al uso como se definió anteriormente en el que ese microARN y ese gen son de origen endógeno en esa célula eucariota determinada.
[0325]En una modalidad, el objeto de la solicitudFR 1360727se refiere al uso como se definió anteriormente en el que ese microARN y ese gen son de origen exógeno en esa célula eucariota determinada, ya que esa célula eucariota determinada contiene al menos un vector que permite la expresión de ese microARN y ese gen.
[0326]En la solicitudFR 1360727,las expresiones «de origen endógeno» y «de origen exógeno» se utilizan para distinguir esos microARN y/o genes de diferentes especies, dada la conservación de las secuencias entre especies.
[0327]Por lo tanto, el término «de origen endógeno» indica que el microARN y/o el gen pueden estar presentes de formanatural en la célula en cuestión. Sin embargo, de forma artificial, se pueden añadir otras copias del microARN y//odel gen de origen endógeno a la célula en cuestión, como por ejemplo mediante clonación.
[0328]Por el contrario, el término «de origen exógeno» indica que el microARN y/o el gen nunca están presentes de forma natural en la célula en cuestión. Se trata de un microARN y/o o gen identificado en otro tipo celular o en unorganismo de otra especie, por lo que este microARN y/o gen necesariamente se introducen artificialmente en la célula en cuestión.
[0329]En la solicitudFR 1360727,una célula transformada genéticamente puede, por lo tanto, contener 2 grupos de microARN y/o genes potencialmente cercanos en términos de secuencia, uno de origen endógeno y otro de origen exógeno.
[0330]En otro aspecto, el objeto de la solicitudFR 1360727se refiere a un método para modular la expresión de un gen regulado por un microARN en una célula eucariota, que comprende la implementación de una etapa de acumulación de un miPEP en esa célula eucariota, teniendo ese miPEP:
- un tamaño de 4 a 100 aminoácidos, preferiblemente de 4 a 20 aminoácidos, y
- una secuencia peptídica idéntica a la codificada por una secuencia nucleotídica contenida en el transcrito primario de un microARN que regula la expresión de ese gen, y
-siendo capaz de modular la acumulación de ese microARN, en el cual, la acumulación de ese miPEP en esa célula eucariota induce una modulación de la expresión de ese gen con relación a la expresión de ese gen sin acumulación de ese miPEP.
[0331]En una modalidad, el objeto de la solicitudFR 1360727se refiere a un método para modular la expresión de un gen tal como se definió anteriormente, en el que la acumulación de ese miPEP en la célula da como resultado:-la introducción en la célula de un ácido nucleico que codifica ese miPEP, o
-la introducción de ese miPEP en la célula.
[0332]En una modalidad, el objeto de la solicitudFR 1360727se refiere a un método para modular la expresión de un gen como se definió anteriormente en el que esa célula eucariota es una célula vegetal.
[0333]En una modalidad, el objeto de la solicitudFR 1360727se refiere a un método para modular la expresión de un gen tal como se definió anteriormente en el que ese microARN y ese gen son de origen endógeno en esa célula eucariota.
[0334]En una modalidad, el objeto de la solicitudFR 1360727se refiere a un método para modular la expresión de un gen tal como se definió anteriormente en el que ese microARN y ese gen son de origen exógeno en esa célula eucariota, ya que esa célula eucariota contiene al menos un vector que permite la expresión de ese microARN y ese gen.
[0335]En otro aspecto, el objeto de la solicitudFR 1360727se refiere a una célula eucariota modificada que contiene un péptido idéntico a un miPEP como se definió anteriormente, el cual está presente en esa célula eucariota independientemente de la transcripción del transcrito primario del microARN que lleva la secuencia nucleótida que codifica ese miPEP.
[0336]En la solicitudFR 1360727,el término «célula eucariota modificada» significa que esa célula eucariota contiene un miPEP introducido artificialmente en la célula, ya sea como un péptido o mediante un vector que codifica ese miPEP.
[0337]En una modalidad, el objeto de la solicitudFR 1360727se refiere a una célula eucariota modificada tal como se definió anteriormente, en la que ese microARN es de origen endógeno.
[0338]En una modalidad, el objeto de la solicitud FR 1360727 se refiere a una célula eucariota modificada tal como se definió anteriormente, en la que ese microARN es de origen exógeno, ya que esa célula eucariota modificada contiene un vector que permite la expresión de ese microARN.
[0339] En una modalidad, el objeto de la solicitud FR 1360727 se refiere a una célula eucariota modificada tal como se definió anteriormente, siendo esa célula una célula vegetal.
[0340] En otro aspecto, el objeto de la solicitud FR 1360727 se refiere a una planta que comprende al menos una célula eucariota modificada como se definió anteriormente.
[0341] En otro aspecto, el objeto de la solicitud FR 1360727 se refiere a una composición que comprende al menos: - un miPEP como se definió anteriormente,
- un ácido nucleico que codifica ese miPEP, o
- un vector que contiene ese ácido nucleico.
[0342] En otro aspecto, el objeto de la solicitud FR 1360727 se refiere a una composición plaguicida que comprende al menos:
- un miPEP como se definió anteriormente,
- un ácido nucleico que codifica ese miPEP, o
-un vector que contiene ese ácido nucleico.
[0343] En otro aspecto, el objeto de la solicitud FR 1360727 se refiere a una composición fitosanitaria que comprende al menos:
- un miPEP como se definió anteriormente,
- un ácido nucleico que codifica ese miPEP, o
- un vector que contiene ese ácido nucleico.
[0344] En otro aspecto, el objeto de la solicitud FR 1360727 se refiere a una composición elicitadora que comprende al menos:
- un miPEP como se definió anteriormente,
- un ácido nucleico que codifica ese miPEP, o
- un vector que contiene ese ácido nucleico.
[0345] Por ««composición elicitadora» se designa una composición capaz de conferir a la planta una mejor aptitud para la simbiosis o una mejor resistencia a diferentes tensiones, ya sean de naturaleza térmica, hídrica o química.
[0346] Para este propósito, el objeto de la solicitud FR 1360727 también se refiere a composiciones que actúan sobre el crecimiento (inhibición del crecimiento o, por el contrario, aumento del crecimiento) y la fisiología (mejor capacidad para micorrizar, nodular, mejor tolerancia a diferentes tensiones) de la planta.
[0347] En otro aspecto, el objeto de la solicitud FR 1360727 se refiere a una composición herbicida que comprende al menos:
- un miPEP como se definió anteriormente,
- un ácido nucleico que codifica ese miPEP, o
- un vector que contiene ese ácido nucleico.
[0348] En otro aspecto, el objeto de la solicitud FR 1360727 se refiere a una composición insecticida que comprende al menos:
- un miPEP como se definió anteriormente,
- un ácido nucleico que codifica ese miPEP, o
- un vector que contiene ese ácido nucleico.
[0349] En otro aspecto, el objeto de la solicitud FR 1360727 se refiere al uso de una composición como la definida anteriormente, como herbicida para eliminar las plantas o ralentizar su crecimiento, preferiblemente como herbicida específico de una especie o género de plantas.
[0350] En otro aspecto, el objeto de la solicitud FR 1360727 se refiere al uso de una composición como la definida anteriormente, como agente fitosanitario,
- para favorecer el crecimiento y/o el desarrollo de las plantas, en particular para la modulación de los parámetros fisiológicos de una planta, en particular la biomasa, la superficie foliar, la floración, el calibre del fruto, la producción y/o la selección de semillas vegetales, en particular para controlar la partenocarpia o la monoecia de una planta, o para la modificación de los parámetros fisiológicos de semillas vegetales, en particular la germinación, la implantación radicular y la resistencia al estrés hídrico,
- o para prevenir o tratar enfermedades de las plantas, especialmente para promover la resistencia a enfermedades infecciosas.
[0351] En otro aspecto, el objeto de la solicitud FR 1360727 se refiere al uso de una composición como la definida anteriormente, para modular los parámetros fisiológicos de una planta, en particular la biomasa, la superficie foliar o el calibre del fruto.
[0352] En una modalidad, el objeto de la solicitud FR 1360727 se refiere al uso de una composición como la definida anteriormente, para el aclareo de huertos con el fin de aumentar el calibre de los frutos.
[0353] En una modalidad, el objeto de la solicitud FR 1360727 se refiere al uso de una composición como la definida anteriormente, para la producción y/o selección de semillas vegetales, esa composición se utiliza para controlar la partenocarpia o monoecia de una planta.
[0354] En una modalidad, el objeto de la solicitud FR 1360727 se refiere al uso de una composición como la definida anteriormente, esa composición se administra a esa planta por vía foliar o por vía radicular.
[0355] En una modalidad, el objeto de la solicitud FR 1360727 se refiere al uso de una composición como la definida anteriormente, para la producción y/o selección de semillas vegetales.
[0356] En una modalidad, el objeto de la solicitud FR 1360727 se refiere al uso de una composición como la definida anteriormente, en la que esa composición se usa para modificar los parámetros fisiológicos de esas semillas vegetales, en particular la implantación radicular, la germinación y la resistencia al estrés hídrico.
[0357] En una modalidad, el objeto de la solicitud FR 1360727 se refiere al uso de una composición como la definida anteriormente, en la que esa composición se aplica mediante recubrimiento o recubrimiento con película sobre esas semillas vegetales.
[0358] En otro aspecto, el objeto de la solicitud FR 1360727 se refiere al uso de una composición como la definida anteriormente, como plaguicida, para eliminar los organismos nocivos de las plantas o que puedan clasificarse</g> como tales, en particular como insecticida, aracnicida, limácido o rodonticida.
[0359] En una modalidad, el objeto de la solicitud FR 1360727 se refiere al uso de una composición como la definida anteriormente, como insecticida.
[0360] En una modalidad, el objeto de la solicitud FR 1360727 se refiere al uso de una composición como la definida anteriormente, para eliminar las plagas de insectos.
[0361] En una modalidad, el objeto de la solicitud FR 1360727 se refiere al uso de una composición como la definida anteriormente, para eliminar las especies animales clasificadas como nocivas o susceptibles de ser clasificadas como tales, en particular, los múridos, y en particular la rata.
[0362] En otro aspecto, el objeto de la solicitud FR 1360727 se refiere al uso de una composición como la definida anteriormente, en la que esa composición se aplica a una planta para protegerla de plagas de insectos.
LEYENDAS DE LAS FIGURAS
[0363]
FIGURA 1 Efectos del tratamiento con miPEP172c sobre la expresión de miR172c enGlycine max
El ejeyindica la expresión relativa del miR172c en una planta de control (columna de la izquierda) o en una planta regada con miPEP172c a 0,1 pM (columna de la derecha). La barra de error corresponde al error estándar en el promedio (número de individuos = 9).
FIGURA 2 Efectos de miPEP172c en el número de nodulos enGlycine max
El ejeymuestra el número de nódulos por gramo de peso fresco de raíz deGlycine maxtratada con disolvente (control, barra izquierda) o con disolvente que contiene 0,1 pM de miPEP172c (miPEP172c, barra derecha).
La barra de error corresponde al error estándar en el promedio (número de individuos = 9). Este experimento se repitió independientemente y arrojó resultados similares.
FIGURA 3 Efectos del miPEP172c sobre la concentración de nitrógeno en las partes aéreas deGlycine MaxEl ejeyindica la concentración de nitrógeno por peso seco de las hojas deGlycine max(en g/kg), tratadas con un disolvente (control, barra de la izquierda) o con un disolvente que contiene 0,1 pM de miPEP172c (miPEP172c, barra de la derecha).
La barra de error corresponde al error estándar en el promedio (número de individuos = 9).
FIGURA 4 Efectos de miPEP172c sobre el peso fresco de las vainas enGlycine max
El eje y indica el peso fresco seco de las vainas enGlycine max(en g), tratadas con un disolvente (control, barra de la izquierda) o con un disolvente que contiene 0,1 pM de miPEP 172c (miPEP172c, barra de la derecha).
La barra de error corresponde al error estándar en el promedio (número de individuos = 9).
FIGURA 5 Efectos de miPEP172c en el número de nódulos enGlycine max
El eje y muestra el número de nódulos por gramo de peso fresco de raíz deGlycine maxtratados con un disolvente que contiene un péptido control a 0,01 pM (barra de la izquierda) o con un disolvente que contiene 0,1 pM de miPEP 172c (barra de la derecha).
La barra de error corresponde al error estándar en el promedio (número de individuos = 12). La presencia de un asterisco indica una diferencia significativa en la expresión entre las dos condiciones probadas.
FIGURA 6 Efectos del miPEP172c sobre la expresión del miR172c y sobre la expresión de los genesNNC1, NSP1, NIN, ENOD40-1, Hb2ynitHenGlycine max.
El ejeyindica la expresión relativa de miR172c y los genesNNC1, NSP1, NIN, ENOD40-1, Hb2 y nifHen una planta de control regada con un disolvente que contiene un péptido de control a 0,01 pM (columnas blancas) o en una planta regada con un disolvente que contiene miPEP172c a 0,01 pM (columnas negras). La barra de error corresponde al error estándar en el promedio (número de individuos = 6). La presencia de un asterisco indica una diferencia significativa en la expresión entre las dos condiciones probadas.
FIGURA 7 Efectos de miPEP172c sobre la masa radicular enGlycine max
El ejeyindica el peso de la raíz fresca en gramos en una planta de control regada con un disolvente que contiene un péptido de control a 0,01 pM (columna de la izquierda) o en una planta rociada con un disolvente que contiene miPEP172C a 0,01 pM (columna de la derecha) (número de individuos = 6).
FIGURA 8 Expresión del genNifD.
Las fotografías representan la expresión denifDrevelada por fusiones nifD-LacZ en nódulos tratados con péptido de control (A) o miPEP172c (B).
FIGURA 9 Efectos de miPEP167c en el número de nódulos enGlycine max
El eje y muestra el número de nódulos por gramo de peso fresco de raíz deGlycine maxtratada con disolvente (control, barra izquierda) o con disolvente que contiene 0,1 pM de miPEP167c (miPEP167c, barra derecha).
La barra de error corresponde al error estándar en el promedio (número de individuos = 12).
EJEMPLOS
[0364] El miPEP172c aumenta la expresión de miR172c (Figuras 1 y 6). El efecto de miPEP172c es agonista al de miR172c, reduciendo la expresión del genNNC1(factor de transcripción represivo) y al provocar un aumento de la expresión de los genesNSP1, NIN, ENOD40-1, Hb2 y NifHimplicados en la nodulación (Figura 6).
[0365] Regar las plantas de soja(Glycine max)con bajas concentraciones de miPEP172c (0,1 pM) específicas del miR172c aumenta significativamente el número de nódulos (Figuras 2 y 5) y el contenido de nitrógeno de las partes aéreas (Figura 3) y el contenido de nitrógeno de las partes aéreas (Figura 3), así como el peso fresco de las vainas (Figura 4). No se observó ningún efecto sobre el desarrollo radicular (Figura 7). El aumento del número de nódulos inactivos a veces actúa como mecanismo de compensación en respuesta a la reducción de la fijación de nitrógeno. El análisis de la expresión del genNifHmediante RT-qPCR (Figura 6) y la observación de las fusionesnifD::LacZ(Figura 8) indican una fijación eficiente del nitrógeno en plantas tratadas con miPEP172c.
[0366] En conjunto, estos resultados indican que el tratamiento con miPEP172c imita los efectos de la sobreexpresión de miR172c, tanto a nivel molecular como fenotípico. Regar las plantas de soja(Glycine max)con bajas concentraciones de miPEP167c (0,1 pM) específicas para miR167c también aumenta significativamente el número de nódulos (Figura 9).
Material y métodos
•Medición de la expresión de miR172c y de los genes NNC1, NSP1, NIN et ENOD40-1 en Glycine max[0367] El ARN total de las raíces desojase extrajo utilizando el RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen). La transcripción inversa se realizó usando la transcriptasa inversa SuperScript II (Invitrogen) usando 500 ng de ARN total. Se realizaron tres repeticiones (n=3) con dos repeticiones técnicas cada una. Cada experimento se repitió dos o tres veces. Las amplificaciones de qPCR se llevaron a cabo utilizando un termociclador LightCycler 480 System (Roche Diagnostics) de acuerdo con el método descrito en Lauressergues et al. (Plant J., 72(3):512-22, 2012).ELF1bse utilizó como gen de mantenimiento para estandarizar los análisis qRT-PCR. Los cebadores utilizados para amplificar los genesELF1b, NNC1, NSP1, NIN, ENOD40-1, Hb2 y nifHse describen en los artículos de Wang et al. (Soybean miR172c targets the repressive AP2 transcription factor NNC1 to activate ENOD40 expression and regulate nodule initiation [El miR172c de soja dirige al factor de transcripción represivo AP2 NNC1 para activar la expresión de ENOD40 y regular la iniciación de nódulos], Plant cell 26(12): 4782-4801, 2014; MicroRNA167-directed regulation of the auxin response factors GmARF8a and GmARF8b is required for soybean nodulation and lateral root development [La regulación dirigida por microARN167 de los factores de respuesta de auxina GmARF8a y GmARF8b es necesaria para la nodulación de la soja y el desarrollo de raíces laterales], Plant Physiol 168(3): 984-999, 2015).
•Germinación de semillas de G. max:
[0368] Después de esterilizar las semillas durante 3 minutos en cloro diluido a %, luego enjuagar con agua estéril, las semillas se incuban durante 2 horas en agua. Por último, las semillas se colocan en una placa de Petri con papel húmedo a 28°C. Una vez que las semillas han germinado, se colocan en una pequeña maceta con medio oil dry® bajo una campana de vidrio.
Después de unos días de crecimiento, las plantas con un desarrollo uniforme se seleccionan para el experimento y se transfieren a una maceta más grande.
•Inoculación de plántulas germinadas con Bradirhizobium japonicum:
[0369] Las bacterias se cultivan en medio líquido Campbel (K2PO4: 0,5g/l, MgSO47H2O: 0,2g/l, NaCl: 0,1g/l, Manitol: 10g/l, extracto de levadura: 2,5g/l, casaminoácido: 0,5g/l) (5 ml) a 28°C, luego se transfieren a un matraz Erlenmeyer que contiene 100 ml de medio Campbel. Tras unos días de cultivo, cuando la DO era de 0,3 a 595 nm, los 100 ml de cultivo deB. japonicumse centrifugaron durante 30 min a 4000 rpm. El sobrenadante se desechó y el precipitado se suspendió de nuevo en el medio de cultivo «en caja» (Lullien et al., Plant gene expression in effective and ineffective root nodules of alfalfa (Medicago sativa) [Expresión génica en los nódulos radiculares eficaces e ineficaces de la alfalfa (Medicago sativa)], Plant Mol Biol 9: 469-478, 1987) para alcanzar la DO de 0,05 a 595 nm. Se inocula cada planta con 20 ml de esta solución. Las plantas se riegan regularmente con un medio en forma de «cajón».
•Tratamientos de las plantas con los miPEP:
[0370] El tratamiento se lleva a cabo rociando las plantas con la solución concentrada de miPEP o el equivalente de solución de disolvente para el tratamiento de control. También se llevó a cabo un tratamiento de control con una solución de disolvente que contenía un péptido de control (N.° ID SEQ: 5, VLWCSHCMGFLWPTYT). El péptido de control y miPEP172c tienen el mismo contenido en aminoácidos, pero secuencias diferentes. Los tratamientos se realizan cada dos días.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Uso de un miPEP introducido por vía exógena en una planta para favorecer la nodulación, entre esa planta y una bacteria, estando ese miPEP también presente de forma natural en esa planta,
ese miPEP introducido por vía exógena es un péptido producido fuera de la planta o un péptido producido en la planta tras la introducción no natural de un ácido nucleico que codifica ese miPEP en esa planta, siendo ese miPEP introducido por vía exógena un péptido que comprende, o que consiste en, una secuencia idéntica a la de ese miPEP presente de forma natural, siendo este último un péptido de entre 3 y 100 aminoácidos cuya secuencia está codificada por un marco de lectura abierto situado en la región 5' del transcrito primario de un miR, siendo ese miPEP capaz de modular la acumulación de ese miR en esa planta, regulando ese miR la expresión de al menos un gen implicado en la nodulación en esa planta, siendo la suma de la cantidad de ese miPEP introducido por vía exógena y de la cantidad de ese miPEP presente de forma natural estrictamente superior a la cantidad de ese miPEP presente de forma natural, siendo ese miPEP el miPEP172c que presenta una secuencia de aminoácidos con al menos un 80%de identidad con la secuencia N.° ID SEQ: 2,
en particular, ese miPEP172c presenta una secuencia de aminoácidos que consiste en la secuencia N.° ID SEQ: 2, preferiblemente, ese miR es el miR172c que posee en particular una secuencia de nucleótidos que consiste en N.° ID SEQ: 1.
2. Uso según la reivindicación 1, en la que esa planta es:
- una planta leguminosa, especialmente elegida entre: loto(Lotus sp.),soja(Glycine max),cacahuete(Arachis hypogaea),judía(Phaseolus vulgaris),guisante(Pisum sativum),lenteja(Lens culinaris),garbanzo(Cicerarietinum),haba y alubia(Vicia faba),vezas(Viciasp.), acelgas(Lathyrussp.), alfalfa(Medicagosp.), trébol(Trifoliumsp.), altramuz(Lupinussp.), judía mungo(Vigna radiata),regaliz(Glycyrrhiza glabra),palisandro(Dalbergia),loto corniculado(Lotus corniculatus),esparceta(Onobrychis viciifolia),rooibos(Aspalathus linearis),fenogreco(Trigonella foenum-graecum),o
- la remolacha azucarera(Beta vulgaris).
3. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que esa bacteria es una bacteria de la familiaRhizobiaceae,especialmente elegida entre los génerosRhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium, BradyrhizobiumoAzorhizobium.
4. Método para promover la nodulación entre una planta y una bacteria, que comprende una etapa de introducción artificial de un miPEP en una planta por medios exógenos,
ese miPEP está también presente de forma natural en esa planta, siendo ese miPEP introducido por vía exógena un péptido producido fuera de la planta o un péptido producido en la planta tras la introducción no natural de un ácido nucleico que codifica ese miPEP en esa planta, siendo ese miPEP introducido por vía exógena un péptido de entre 3 y 100 aminoácidos cuya secuencia comprende o consiste en una secuencia idéntica a la de ese miPEP presente de forma natural, cuya secuencia está codificada por un marco de lectura abierto situado en la región 5' del transcrito primario de un miR, siendo ese miPEP capaz de modular la acumulación de ese miR, regulando ese miR la expresión de al menos un gen implicado en la nodulación en esa planta, siendo la suma de la cantidad de ese miPEP introducido por vía exógena y de la cantidad de ese miPEP presente de forma natural estrictamente superior a la cantidad de ese miPEP presente de forma natural, siendo ese miPEP el miPEP172c que presenta una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 % de identidad con la secuencia N.° ID SEQ: 2, y en particular el miPEP172c que presenta una secuencia de aminoácidos que consiste en la secuencia N.° ID SEQ: 2,
preferiblemente, ese miR es el miR172c que posee en particular una secuencia de nucleótidos que consiste en N.° ID SEQ: 1,
esa bacteria pertenece a la familiaRhizobiaceae,
siendo esa planta en particular una planta leguminosa.
5. Método según la reivindicación 4, para promover la nodulación entre una plantaGlycine maxy una bacteriaBradirhizobium japonicum,en el que miPEP172c se introduce exógenamente en esa plantaGlycine max,
ese miPEP172c también está naturalmente presente en esa plantaGlycine max,siendo ese miPEP172c introducido por vía exógena un péptido que comprende o consiste en una secuencia idéntica a la de ese miPEP172c naturalmente presente, el cual miPEP172c naturalmente presente es un péptido de 3 a 100 aminoácidos cuya secuencia está codificada por un marco abierto de lectura situado en 5' en el transcrito primario del miR172c,
ese miPEP172c es capaz de modular la acumulación de ese miR172c, el cual miR172c regula la expresión de al menos un gen involucrado en la nodulación enGlycine max,
la suma de la cantidad de ese miPEP172c introducido exógenamente y la de ese miPEP172c presente de forma natural es estrictamente superior a la cantidad de ese miPEP172c presente.
6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 4 o 5, en el que ese miPEP se introduce en la planta:
- por vía externa, preferiblemente mediante riego, pulverización o mediante la adición de un fertilizante, un sustrato para macetas, un sustrato de cultivo o con la ayuda de un soporte en contacto con la planta, ese miPEP se administra a la planta en particular en forma de una composición que comprende de 10-9 M a 10-4 M de ese miPEP, en particular 10-9, 10-8, 10-7, 10-6, 10-5 o 10-4 M de ese miPEP,
- por vía externa, preferentemente mediante riego, pulverización o adición de un abono, una tierra para macetas, un sustrato de cultivo o mediante un soporte en contacto con una semilla o un plantón, administrándose ese miPEP a la semilla o al plantón en forma de una composición que comprende de 10-9 M a 10-4 M de ese miPEP, en particular 10-9, 10-8, 10-7, 10-6, 10-5 o 10-4 M de ese miPEP, o
- a través de un ácido nucleico que codifica ese miPEP, siendo ese ácido nucleico introducido por vía exógena en la planta, sin que ese ácido nucleico comprenda la secuencia completa del miR correspondiente.
7. Método para producir una planta transgénica que comprende:
a) una etapa de introducción de un ácido nucleico que codifica un miPEP de entre 3 y 100 aminoácidos en una planta, sin que ese ácido nucleico comprenda la secuencia completa del miR correspondiente, o en al menos una célula de esa planta, en condiciones que permitan la expresión de ese miPEP, estando ese miPEP presente también de forma natural en esa planta, siendo ese miPEP presente de forma natural un péptido cuya secuencia está codificada por un marco de lectura abierto situado en la región 5' del transcrito primario de un miR, siendo ese miPEP capaz de modular la acumulación de ese miR en la planta, regulando ese miR la expresión de al menos un gen implicado en la nodulación, y
b) una etapa de cultivo de la planta, o de al menos una célula de esa planta, obtenidas en la etapa a), en condiciones que permitan la obtención de una planta transgénica, siendo ese miPEP el miPEP172c, presentando ese miPEP172c una secuencia de aminoácidos con al menos un 80% de identidad con la secuencia N.° ID SEQ: 2,
en particular, ese miPEP172c presenta una secuencia de aminoácidos que consiste en la secuencia N.° ID SEQ: 2,
ese miR es, en particular, miR172c, que posee, en particular, una secuencia de nucleótidos que consiste en N.° ID SEQ: 1.
8. Planta transgénica obtenida mediante el método definido según la reivindicación 7.
9. Péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que muestra al menos un 80 % de identidad, preferiblemente al menos un 90 % de identidad, con la secuencia de aminoácidos N.° ID SEQ: 2, preferiblemente ese péptido que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos N.° ID SEQ: 2, siendo ese péptido capaz de modular 1 la acumulación de miR172c.
10. Composición que incluye:
- el miPEP172c como sustancia activa, comprendiendo ese miPEP172c o consistiendo en una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 % de identidad con la secuencia N.° ID SEQ: 2,
en particular, ese miPEP172c que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en la secuencia N.° ID SEQ: 2,
ese miPEP172c está en particular en una concentración de 10-9 M a 10-4 M, en particular 10-9, 10-8, 10-7, 10-6, 10-5 o 10-4 M, o
en particular, esa composición comprende además un excipiente, un diluyente o un disolvente, en particular, esa composición está formulada para formar un recubrimiento.
11. Una composición que comprende en combinación una cantidad de semillas de una planta y una cantidad de un péptido sintético cuya secuencia comprende o consiste en una secuencia idéntica a la de un miPEP presente de forma natural en esa planta,
ese péptido sintético tiene una secuencia que comprende o consiste en una secuencia idéntica a la del miPEP172c, ese miPEP172c tiene una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 % de identidad con la secuencia N.° ID SEQ: 2,
en particular, ese miPEP172c presenta una secuencia de aminoácidos que consiste en la secuencia N.° ID SEQ: 2,
en particular, esa composición está formulada para formar una semilla recubierta.
12. Una semilla recubierta con una composición que comprende un miPEP capaz de modular la acumulación de un miR en la planta resultante de la semilla, cuyo miR regula la expresión de al menos un gen implicado en la nodulación en esa planta,
ese miPEP es el miPEP172c, presentando ese miPEP172c una secuencia de aminoácidos con al menos un 80% de identidad con la secuencia N.° ID SEQ: 2,
en particular, ese miPEP172c presenta una secuencia de aminoácidos que consiste en la secuencia N.° ID SEQ: 2.
13. Uso de un miPEP para el cultivo de bacterias, en particular bacterias de la familiaRhizobiaceae,comprendiendo ese uso una etapa de puesta en contacto de esas bacterias con:
- una mezcla que comprenda una planta o parte de una planta, en particular un cultivo de raíces, y un péptido cuya secuencia comprenda o consista en una secuencia idéntica a la de un miPEP naturalmente presente en esa planta, siendo ese miPEP naturalmente presente un péptido cuya secuencia esté codificada por un marco de lectura abierto situado 5' en el transcrito primario de un miR, siendo ese miPEP capaz de modular la acumulación de ese miR, que miR regula la expresión de al menos un gen implicado en la nodulación en esa planta, o bien
- con una planta transgénica tal como se ha definido anteriormente,
siendo capaces la planta, la parte de la planta y la planta transgénica de formar una nodulación con esa bacteria.
ese miPEP es el miPEP172c, presentando ese miPEP172c una secuencia de aminoácidos con al menos un 80% de identidad con la secuencia N.° ID SEQ: 2,
en particular, ese miPEP172c presenta una secuencia de aminoácidos que consiste en la secuencia N.° ID SEQ: 2.
14. Uso de un miPEP para producir inóculo de bacterias, en particular de inóculo de bacterias de la familiaRhizobiaceae,comprendiendo ese uso:
- una etapa de cocultivo de bacterias con un material vegetal vivo, denominado planta huésped, correspondiente al menos en parte a una parte constituyente de la raíz de una planta capaz de formar una nodulación con esas bacterias, y
- una etapa de puesta en contacto de una cantidad de un péptido con el cocultivo mencionado anteriormente, teniendo ese péptido una secuencia que comprende o consiste en una secuencia idéntica a la de un miPEP presente de forma natural en esa planta, siendo ese miPEP presente de forma natural un péptido cuya secuencia está codificada por un marco de lectura abierto situado en 5' del transcrito primario de un miR, siendo ese miPEP capaz de modular la acumulación de ese miR, miR que regula la expresión de al menos un gen implicado en la nodulación en esa planta.
ese miPEP es el miPEP172c, presentando ese miPEP172c una secuencia de aminoácidos con al menos un 80% de identidad con la secuencia N.° ID SEQ: 2,
en particular, ese miPEP172c presenta una secuencia de aminoácidos que consiste en la secuencia N.° ID SEQ: 2.
15. Inóculo de bacterias, en particular un inóculo de bacterias de la familiaRhizobiaceae,adaptado para la inoculación de una planta huésped, que comprende al menos: una bacteria y un péptido cuya secuencia comprende o consiste en una secuencia idéntica a la de un miPEP presente de forma natural en la planta huésped.
ese miPEP presente de forma natural en la planta huésped es un péptido cuya secuencia está codificada por un marco de lectura abierto situado en 5' de la transcripción primaria de un miR, ese miPEP siendo capaz de modular la acumulación de ese miR, miR que regula la expresión de al menos un gen implicado en la nodulación en esa planta huésped,
ese miPEP es el miPEP172c, presentando ese miPEP172c una secuencia de aminoácidos con al menos un 80% de identidad con la secuencia N.° ID SEQ: 2,
en particular, ese miPEP172c presenta una secuencia de aminoácidos que consiste en la secuencia N.° ID SEQ: 2.
ES16729952T 2015-03-24 2016-03-24 Novel method for promoting nodulation in plants Active ES3041076T3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1552461A FR3034102B1 (fr) 2015-03-24 2015-03-24 Nouveau procede permettant de favoriser la nodulation chez les plantes
PCT/FR2016/050674 WO2016151262A1 (fr) 2015-03-24 2016-03-24 Nouveau procede permettant de favoriser la nodulation chez les plantes

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES3041076T3 true ES3041076T3 (en) 2025-11-07

Family

ID=54199737

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES16729952T Active ES3041076T3 (en) 2015-03-24 2016-03-24 Novel method for promoting nodulation in plants

Country Status (7)

Country Link
US (3) US10959393B2 (es)
EP (1) EP3274362B1 (es)
AR (1) AR104112A1 (es)
ES (1) ES3041076T3 (es)
FR (1) FR3034102B1 (es)
PL (1) PL3274362T3 (es)
WO (1) WO2016151262A1 (es)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR3034102B1 (fr) * 2015-03-24 2022-06-10 Univ Toulouse 3 Paul Sabatier Nouveau procede permettant de favoriser la nodulation chez les plantes
CN108586592B (zh) * 2018-04-23 2022-08-02 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 调控根瘤植物的根瘤数目的基因及其在高效固氮方面的应用
EP4066629A1 (en) * 2021-04-02 2022-10-05 Université de Rennes 1 Methods for altering the microbiome influenced by roots of a plant using micropeptides

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR1360727A (fr) 1964-08-21 Ibm Support connectable
FR3012471A1 (fr) * 2013-10-31 2015-05-01 Centre Nat Rech Scient Micropeptides et leur utilisation pour moduler l'expression de genes
CN103695432B (zh) * 2014-01-03 2016-01-20 中国科学院遗传与发育生物学研究所农业资源研究中心 一种促进植物结瘤固氮的microRNA及其应用
FR3034102B1 (fr) * 2015-03-24 2022-06-10 Univ Toulouse 3 Paul Sabatier Nouveau procede permettant de favoriser la nodulation chez les plantes

Also Published As

Publication number Publication date
EP3274362C0 (fr) 2025-08-27
US12185682B2 (en) 2025-01-07
EP3274362B1 (fr) 2025-08-27
BR112017020057A2 (pt) 2018-06-05
AR104112A1 (es) 2017-06-28
US20180049387A1 (en) 2018-02-22
EP3274362A1 (fr) 2018-01-31
US20210212281A1 (en) 2021-07-15
WO2016151262A1 (fr) 2016-09-29
FR3034102A1 (fr) 2016-09-30
US20250127136A1 (en) 2025-04-24
FR3034102B1 (fr) 2022-06-10
PL3274362T3 (pl) 2026-02-09
BR122023021437A2 (pt) 2023-12-26
US10959393B2 (en) 2021-03-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2729402T3 (es) Micropéptidos y su utilización para la modulación de la expresión de genes
US20250127136A1 (en) Novel method for promoting nodulation in plants
CN104178490B (zh) 用于生物防控的禾谷孢囊线虫RNAi位点序列及其载体和应用
CN108586592B (zh) 调控根瘤植物的根瘤数目的基因及其在高效固氮方面的应用
CN119080896B (zh) GmAIR12-2蛋白在提高豆科植物耐低磷胁迫能力中的应用
CN110484535A (zh) 对蚜虫高效致死的RNAi靶标基因及其应用
CN111602657B (zh) 壬二酸诱导拟南芥对灰霉病抗性的应用及其方法
CN109608530B (zh) 一种促进侧根形成的大豆低磷响应基因及其蛋白与应用
CN110093355A (zh) 一种参与豆科植物共生结瘤的豆血红蛋白GmLbc2基因及应用
ES2834576T3 (es) Uso de micropéptidos para favorecer el crecimiento de las plantas
CN113481222B (zh) 箭舌豌豆谷氨酰半胱氨酸合成酶基因的应用
CN104328127A (zh) 茎瘤芥抗逆基因BjEFh1及其植物表达载体及应用
CN101173286B (zh) 拟南芥耐盐基因srat2及其应用
Tsintzou et al. Peptide elicitors for defense against abiotic stress
CN107937433B (zh) OsNPF8.13基因在高氮下促进水稻生长的应用
CN114703223B (zh) 铁皮石斛瞬时转化方法
CN118207244A (zh) 一种获得高产且稳产大豆的方法
CN107142266B (zh) ZmRCI2-8基因及其在促进非生物胁迫条件下植物发芽和侧根生长中的应用
Hang et al. Cloning, expression, and characterization of a novel plant type cryptochrome gene from the green alga Haematococcus pluvialis
CN109354620A (zh) 水稻转录因子Os07g05010基因及其应用
CN116445499A (zh) 一种DsABCG6基因及其编码的蛋白质、重组表达载体、方法和应用
ES2534626B1 (es) Microorganismo con capacidad para producir compuestos que inducen respuesta sistémica en plantas y sus aplicaciones como promotor del crecimiento vegetal
WO2011116708A1 (zh) 一种改变植物性状的方法
CN101358198A (zh) 一种rna干扰载体及其应用
BR112017020057B1 (pt) Método para promover nodulação em plantas