ES3041158T3

ES3041158T3 - Multiphasic tissue scaffold constructs

Info

Publication number: ES3041158T3
Application number: ES18845151T
Authority: ES
Inventors: Cedryck Vaquette; Hei Man Hayman Lui; Saso Ivanovski; Randy Bindra
Original assignee: Gold Coast Hospital And Health Service; Griffith University; Queensland University of Technology QUT
Current assignee: Gold Coast Hospital And Health Service; Griffith University; Queensland University of Technology QUT
Priority date: 2017-08-11
Filing date: 2018-08-13
Publication date: 2025-11-07
Anticipated expiration: 2038-08-13
Also published as: AU2018315622B2; EP3664746B1; WO2019028494A1; JP2020530375A; AU2018315622A1; US11752002B2; EP3664746A4; EP3664746C0; US20200237520A1; JP7534752B2; EP3664746A1

Abstract

La presente invención se refiere a un andamio de tejido sintético multifásico tridimensional que comprende un primer, segundo y tercer compartimento, en el que: cada uno de dichos compartimentos comprende propiedades microestructurales, químicas o mecánicas distintas, y está conectado con al menos otro compartimento del andamio a través de una interfaz continua; el andamio de tejido es poroso; y la morfología externa del andamio de tejido imita la de una articulación de mamífero o un componente de la misma. La invención se refiere además a un método para producir el andamio de tejido sintético multifásico tridimensional utilizando un material polimérico, el método comprende el uso de una bioimpresora tridimensional (3D) para imprimir el andamio de tejido mediante la deposición continua del material polimérico sobre una plataforma hasta que el andamio de tejido se produce en su totalidad. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Constructos de andamios tisulares multifásicos

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere en general al campo de la modificación genética de tejidos, y más específicamente a los andamios de modificación genética de tejidos capaces de ayudar a la regeneración de tejidos. También se proporcionan en la presente métodos para la producción de los andamios y su uso en la regeneración de tejidos.

Antecedentes de la Invención

Los tendones y ligamentos pueden fallar por traumatismo o deterioro crónico, y ambos mecanismos conducen a una reducción sustancial de la funcionalidad musculoesquelética. Los tratamientos que potencian la reparación de tendones y ligamentos tendrán un impacto significativo en los resultados de la cirugía ortopédica, reduciendo los fallos de reparación y la repetición de cirugías, facilitando un retorno más rápido a la funcionalidad y reduciendo los costes sanitarios. Muchos de los tratamientos actuales se basan en el uso de tejidos del propio paciente como andamios regenerativos. Este enfoque suele asociarse a la morbilidad del sitio donante, así como a dificultades con la adaptación del tamaño, la forma anatómica y la fijación al hueso.

Se han fabricado andamios sintéticos utilizando diversos métodos de fabricación y polímeros como una alternativa para la reparación de tendones y ligamentos. Sin embargo, la producción de andamios sintéticos con la resistencia suficiente para soportar las fuerzas fisiológicas normales sigue siendo un reto, al igual que la réplica de la arquitectura articular existente. Mientras que los constructos de tejido sintético se han utilizado con éxito variable en articulaciones más grandes, tal como la rodilla (por ejemplo, la reparación del ligamento cruzado anterior), se han hecho muy pocos intentos, si es que se ha hecho alguno, de utilizar andamios sintéticos en el entorno más difícil de las articulaciones pequeñas. Por ejemplo, el ligamento interóseo escafolunar (SLIL), un ligamento en forma de C situado entre los huesos escafoides y semilunar del carpo, es un ligamento de la muñeca que se rompe con frecuencia. La lesión de este ligamento es la causa más común de inestabilidad carpiana tanto estática como dinámica, y da lugar a condiciones tales como el colapso escafolunar avanzado (SLA<c>) y la inestabilidad del segmento intercalar dorsal (DISI). Las opciones quirúrgicas actuales para los desgarros del SLIL no son óptimas y estas lesiones suelen dar lugar a un mal pronóstico con osteoartritis grave. Los procedimientos de tenodesis existentes a menudo no consiguen restablecer la cinemática del carpo. No existe un consenso actual ni un único método exitoso de reconstrucción del SLIL, ya que todos los métodos actuales provocan una pérdida de movimiento de la muñeca con un alivio incompleto del dolor, y a menudo es necesaria una segunda intervención para retirar el tornillo colocado entre los huesos. En el contexto de los tratamientos basados en autoinjertos son frecuentes los resultados clínicos deficientes, originados muy probablemente por una integración tisular inadecuada del autoinjerto y/o una regeneración inapropiada que da lugar a unas propiedades mecánicas inferiores incapaces de soportar la carga fisiológica. Sería ventajosa una estrategia en la que el ligamento se regenere por completo y se remodele con fijaciones óseas fuertes para sortear los problemas mencionados y mejorar la tasa de éxito de la reconstrucción actual del SLIL.

WO 2017/050837 describe un andamio que puede incluir tres o más compartimentos separados y distintos con características estructurales diferenciadas. El andamio es poroso y tiene la forma adecuada para imitar una serie de fibras; también incluye un material polimérico y puede fabricarse con una impresora 3D. El andamio puede utilizarse para la generación de tejido blando, en particular en el tratamiento de ligamentos.

Existe una necesidad de constructos sintéticos con atributos mejorados capaces de potenciar el elemento o elementos de reparación de tendones y ligamentos, y de métodos para su producción. Preferiblemente, los constructos sintéticos producidos pueden utilizarse eficazmente en la reparación de articulaciones pequeñas, incluyendo, por ejemplo, la reparación SLIL.

Breve descripción de la invención

La presente invención alivia al menos una de las deficiencias de los andamios de modificación genética de tejidos existentes y de los métodos para su producción.

Los bioandamios descritos en la presente son multifásicos y se fabrican de forma continua para imitar con precisión las características morfológicas del tejido que se va a regenerar. Los constructos de andamio sintético de la presente invención pueden (i) ser capaces de soportar fuerzas fisiológicas normales para la reparación integradora y funcional de lesiones de tejidos blandos, y/o (ii) imitar fielmente la arquitectura articular existente, y/o (iii) permitir la manipulación para promover la vascularización y la regeneración tisular, y/o (iv) reducir o eliminar la morbilidad del donante al recolectar autoinjertos.

La presente invención proporciona:

Un andamio tisular sintético multifásico tridimensional que comprende un primer, segundo y tercer compartimentos, en donde:

cada uno de dichos compartimentos comprende propiedades microestructurales, y/o químicas, y/o mecánicas distintas, y está conectado con al menos otro compartimento del andamio mediante una interfase continua; el andamio tisular es poroso;

la morfología externa del andamio tisular imita la de una articulación de mamífero o un componente de la misma; uno o más de los compartimentos primero, segundo y/o tercero comprende o consiste en una serie de fibras, en donde la serie de fibras comprende múltiples capas de fibras;

el segundo compartimento comprende una serie de fibras que imitan la morfología externa de una serie de ligamentos, y dicha serie de fibras están situadas entre el primer y el tercer compartimento y los conectan; las múltiples capas de fibras comprenden una primera y una segunda capas de fibras,

la primera capa de fibras está alineada a lo largo de un primer eje,

la segunda capa de fibras está alineada a lo largo de un segundo eje, y

el segundo eje gira en un ángulo con respecto al primer eje.

En ciertas realizaciones, en el andamio tisular multifásico tridimensional definido anteriormente, el segundo eje gira en un ángulo de:

- al menos: 2°, 3°, 4°, 5°, 6°, 7°, 8°, 9°, 10°, 11°, 12°, 13°, 14°, 15°, 16°, 17°, 18°, 19° o 20° con respecto al primer eje; o

- entre 20° y 50°, entre 25° y 45°, entre 30° y 40°, entre 25° y 35°, o aproximadamente 35°, con respecto al primer eje.

En ciertas realizaciones, en el andamio tisular multifásico tridimensional definido anteriormente, las múltiples capas de fibras comprenden una tercera capa alineada a lo largo de un tercer eje, y el tercer eje:

- se gira en un ángulo con respecto a uno o ambos del primer eje y/o segundo eje; o

- se gira en un ángulo igual o sustancialmente igual con respecto al primer eje y/o al segundo eje, o

- se gira en el sentido contrario a las agujas del reloj con respecto al primer eje, y se gira en el sentido de las agujas del reloj con respecto al segundo eje.

En ciertas realizaciones, en el andamio tisular multifásico tridimensional definido anteriormente,

- la morfología externa de cada uno de los compartimentos primero y tercero imita la de un hueso, y la morfología externa del segundo compartimento imita la de una serie de ligamentos situados entre el primer y el tercer compartimento y que los conectan; o

- la morfología externa del andamio tisular imita la de una articulación escafolunar o un componente de la misma; o

- la morfología externa del primer compartimento imita la de un escafoides, la morfología externa del tercer compartimento imita la de un semilunar, y la morfología externa del segundo compartimento imita la de una serie de ligamentos escafolunares.

En ciertas realizaciones, en el andamio tisular multifásico tridimensional definido anteriormente:

- la serie de ligamentos escafolunares son ligamentos escafolunares dorsales, y no son ligamentos escafolunares proximales o palmares, y/o

- el andamio comprende poros con una anchura máxima de entre 100 pm y 1000 pm, entre 100 pm y 1000 pm, entre 100 pm y 800 pm, entre 100 pm y 600 pm, entre 200 pm y 600 pm, entre 200 pm y 500 pm, entre 300 pm y 600 pm, entre 300 pm y 500 pm, entre 350 pm y 600 pm, entre 350 pm y 500 pm, entre 400 pm y 600 pm, o entre 400 pm y 500 pm.

En ciertas realizaciones, el andamio tisular sintético multifásico definido anteriormente comprende además células de mamífero, preferiblemente las células de mamífero se seleccionan del grupo que consiste en: células madre derivadas de ligamentos, células madre de cartílago, células madre mesenquimales (células estromales de médula ósea), células estromales derivadas del tejido adiposo (por ejemplo, células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea, células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo), osteoblastos, células similares a los osteoblastos, células madre, células progenitoras, o cualquier combinación de las mismas; o preferiblemente las células de mamífero son células madre mesenquimales humanas, o células madre mesenquimales de médula ósea humanas.

En ciertas realizaciones, las células de mamífero se encuentran dentro de una lámina celular envuelta y/o insertada en uno o más de los compartimentos del andamio tisular multifásico tridimensional definido anteriormente.

En ciertas realizaciones, uno o más de los compartimentos primero, segundo y/o tercero del andamio tisular multifásico tridimensional definido anteriormente comprenden un material polimérico, seleccionado preferiblemente del grupo que consiste en: colágeno, quitosano, ácido hialurónico, alginato, gelatina, dimetacrilato de polietilenglicol (PEG), metacriloilo de gelatina, matrigel, fibrinógeno, agarosa y policaprolactona, o preferiblemente el material polimérico es policaprolactona o poliuretano.

En ciertas realizaciones, el andamio tisular sintético multifásico tridimensional definido anteriormente se produce utilizando una bioimpresora tridimensional (3D) para depositar continuamente el material polimérico sobre una plataforma hasta que el andamio tisular se produce en su totalidad.

La presente invención proporciona además un método para producir un andamio tisular sintético multifásico tridimensional definido anteriormente, donde el método comprende el uso de una bioimpresora tridimensional (3D) para depositar continuamente material polimérico sobre una plataforma hasta que el andamio tisular se produce en su totalidad.

Un andamio tisular sintético multifásico tridimensional como se describe anteriormente para su uso en el tratamiento de un ligamento lesionado en un sujeto.

En ciertas realizaciones, en el uso del andamio tisular multifásico tridimensional definido anteriormente como se describe anteriormente

- el ligamento es un ligamento interóseo escafolunar o un equivalente mamífero del mismo; y/o

- el sujeto es un ser humano.

Definiciones

Como se utiliza en la presente, las formas singulares “un”, “una”, “el” y “la” incluyen referentes plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por ejemplo, el término “polímero” también incluye una pluralidad de polímeros.

Como se utiliza en la presente, el término “comprender” significa “incluir”. Las variaciones de la palabra “comprender”, tales como “comprende” y “comprenden”, tienen significados correspondientemente variados. De este modo, por ejemplo, un constructo de andamio tisular “que comprende” polímero de tipo A puede consistir exclusivamente en polímero de tipo A o puede incluir uno o más componentes adicionales (por ejemplo, polímero de tipo B y/o material/es no polimérico/s).

Como se utiliza en la presente, un andamio tisular “multifásico” se refiere a un andamio tisular que comprende al menos dos (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco o más) compartimentos, cada uno de los cuales comprende propiedades microestructurales, y/o químicas, y/o mecánicas distintas, en comparación con el compartimento o compartimentos adyacentes del andamio. Se entenderá que los compartimentos de un andamio tisular “multifásico” como se describe en la presente se producen de manera continua (por ejemplo, en la misma sesión de bioimpresión tridimensional), en lugar de producirse por separado y luego fusionarse y/o unirse.

Como se utiliza en la presente, un andamio tisular “sintético” pretende excluir los andamios tisulares formados naturalmente y requiere que el andamio se fabrique artificialmente.

Como se utiliza en la presente, la referencia a un andamio tisular o a un compartimento de andamio tisular con una “morfología externa” que “ imita” a un componente biológico (por ejemplo, una articulación, un hueso, un ligamento, un cartílago) se entenderá en el sentido de que la superficie externa/orientada hacia el exterior del andamio tisular o del compartimento de andamio tisular tiene una forma y/o un tamaño que imita al del componente biológico, de tal forma que un experto en la técnica reconocería que el andamio tisular o el compartimento de andamio tisular es representativo del componente biológico.

Como se utiliza en la presente, el término “articulación escafolunar” significa una articulación formada por el hueso escafoides, el ligamento escafolunar y el hueso semilunar.

Como se utiliza en la presente, el término “sujeto” incluye cualquier animal de importancia económica, social o de investigación, incluyendo las especies bovina, equina, ovina, primates, aves y roedores. Por lo tanto, un “sujeto” puede ser un mamífero, tal como, por ejemplo, un ser humano o un mamífero no humano.

Como se utiliza en la presente, el término “aproximadamente” cuando se utiliza en referencia a un valor numérico recitado incluye el valor numérico recitado y los valores numéricos dentro de más o menos el diez por ciento del valor recitado.

Como se utiliza en la presente, el término “entre” cuando se utiliza en referencia a un rango de valores numéricos abarca los valores numéricos en cada extremo del rango. Por ejemplo, un polipéptido con una longitud de entre 10 residuos y 20 residuos incluye un polipéptido de 10 residuos de longitud y un polipéptido de 20 residuos de longitud. Cualquier descripción de documentos de la técnica anterior en la presente, o declaraciones derivadas o basadas en dichos documentos, no constituye una admisión de que los documentos o declaraciones derivadas formen parte del conocimiento general común de la técnica pertinente.

Breve descripción de las figuras

Las realizaciones preferidas de la presente invención se describirán a continuación solamente a modo de ejemplo y con referencia a las figuras adjuntas, en donde:

LaFigura Unomuestra el proceso de recolección de láminas celulares bmMSC humanas y su siembra en andamios BLB. A) Se utilizaron pinzas estériles para raspar suavemente el borde exterior de la lámina celular y despegarla de las paredes del pozo. B) La lámina celular se enrolló hacia el centro del pozo utilizando las pinzas y se dobló para formar un haz. C-D) Se sembraron cuatro haces de láminas celulares entre las hebras de ligamento del andamio PCL (con la superficie dorsal hacia arriba). E) El andamio (con la superficie dorsal hacia abajo) se colocó sobre la quinta lámina celular que se envolvió alrededor de los compartimentos óseo y ligamentoso.F)Se dispensaron cuidadosamente 25 pl del hidrogel en el compartimento óseo.

LaFigura Dosmuestra imágenes SEM de los constructos BLB de 350 pm y 600 pm de porosidad, de los constructos BLB de 350 pm y 600 pm de porosidad. El hundimiento de las fibras PCL se indica con las flechas blancas. La fusión de fibras PCL entre capas adyacentes se indica con las flechas cuadradas.A)Vista inferior del compartimento óseo de 350 pm con un aumento de 40x.B-D)Vista transversal de compartimentos óseos de 350 pm con aumentos de 40x, l00x y 500x que ilustran la buena fusión entre las hebras p Cl de cada capa.E)Vista inferior del compartimento óseo de 600 pm con un aumento de 40x.F-H)Vista transversal de los compartimentos ligamentosos de 600 pm con aumentos de 40x, 100x y 500x.

LaFigura Tresmuestra los constructos BLB de 350 pm y 600 pm de porosidad.A)Andamios PCL impresos en 3D.B)Reconstrucciones en 3D de escáneres de microCT.C)Porosidad de los andamios de los andamios con 350 pm y 600 pm de porosidad.

LaFigura Cuatromuestra los resultados de la prueba de tracción del compartimento ligamentoso. Resultados de las pruebas de tracción a una tasa de alargamiento de 20 mm/min.A)Curvas de desplazamiento de fuerza frente a deformación de los andamios de 350 pm y 600 pm.B)Límite elástico de los andamios de 350 pm y 600 pm.C)Máxima resistencia de los andamios de 350 pm y 600 pm.D)Deformación límite de los andamios de 350 pm y 600 pm.E)Rigidez de los andamios de 350 pm y 600 pm.

LaFigura Cincomuestra gráficos que representan el comportamiento de compresión del compartimento óseo.A)Curvas representativas de tensión-deformación de los andamios de 350 pm y 600 pm,B)Módulo de compresión de los compartimentos óseos de porosidad de 350 pm y 600 pm.

LaFigura Seismuestra los bucles de histéresis de las pruebas cíclicas para los diseños de andamio al 5% y al 10% de deformación.

LaFigura Sieteproporciona gráficos indicativos de la rigidez del constructo. Se muestran los cambios en la máxima resistencia a lo largo de 1000 ciclos para cada diseño de andamio. Las curvas son representativas de las 5 muestras probadas.

LaFigura Ochomuestra los resultados de la cuantificación del ADN y del colágeno. Cuantificación del ADN y del colágeno de las láminas celulares. Los grupos AA demostraron una proliferación celular y una síntesis de colágeno significativamente mayores en comparación con los controles (-AA). Las barras muestran la significación estadística (p<0,05).

LaFigura Nuevemuestra los resultados de la tinción de inmunofluorescencia para las proteínas de ECM.ATinción de colágeno la (verde) /III (rojo);B-Tenascina C;C-Elastina;D-Agrecan;E-Control isotípico de ratón;F-Control isotípico de conejo;G-Sólo anticuerpo secundario anti-ratón;H-Sólo anticuerpo secundario anti-conejo. LaFigura Diezmuestra los resultados de un análisis de viabilidad celular en láminas celulares sembradas y no sembradas con FDA (verde, células vivas) y Pl (rojo, células muertas).A)Imágenes representativas de láminas celulares planas envueltas alrededor de la superficie dorsal del andamio BLB,B)haz de láminas celulares colocado entre las fibras PCL del compartimento ligamentoso yC)láminas celulares no recolectadas (control).D)Porcentaje de células vivas en lámina plana y haces de andamio de 350 pm y 600 pm.

LaFigura Oncemuestra imágenes SEM de un constructo BLB celularizado. SEM del constructo BLB celularizado.A)Andamios de 350 pm y 600 pm de tamaño de poro con lámina celular plana con un aumento de 100x y 500x. Las fibras de matriz extracelular densas son visibles.B)Andamios de 350 pm y 600 pm de tamaño de poro con haces de láminas celulares con un aumento de 100x y 500x.

LaFigura Docemuestra los resultados de un análisis por MicroCT de la mineralización ósea.A-B)Reconstrucciones en 3D de la mineralización ósea en andamios de porosidad de 350 pm y 600 pm.C)Volumen óseo en andamios de porosidad de 350 pm y 600 pm a las 2 semanas y 8 semanas.

LaFigura Trecemuestra imágenes histológicas de constructos óseos-ligamentosos-óseos teñidos con hemotoxilina y eosina (H y E) implantados durante 2 semanas. Algunas secciones del compartimento ligamentoso no muestran los puntales PCL, ya que estas secciones se tomaron entre los puntales. Las estrellas marcan la presencia de vasos sanguíneos.

LaFigura Catorcemuestra imágenes histológicas de constructos óseos-ligamentosos-óseos teñidos con H y E implantados durante 8 semanas. Las estrellas marcan la presencia de vasos sanguíneos.

LaFigura Quincemuestra los resultados de un análisis histomorfométrico de la formación ósea, la mineralización temprana y el alineamiento de los ligamentos en las muestras a las 2 y 8 semanas. Las barras muestran las diferencias estadísticas (p<0,05).

LaFigura Dieciséismuestra imágenes histológicas de la tinción H y E de la interfase ósea-ligamentosa en muestras implantadas durante 8 semanas. La línea discontinua representa la interfase entre el compartimento óseo y el ligamentoso.

LaFigura Diecisietemuestra imágenes SEM de constructos de andamio que comprenden capas individuales dispuestas en diferentes ángulos entre sí.

LaFigura Dieciochomuestra imágenes de MicroCT de constructos de andamio que comprenden capas individuales dispuestas en diferentes ángulos entre sí.

LaFigura Diecinueveproporciona un gráfico que indica el grado de rigidez observado en varios constructos de andamio que comprenden capas individuales dispuestas en diferentes ángulos entre sí.

LaFigura Veintemuestra un gráfico que indica la máxima resistencia de varios constructos de andamio que comprenden capas individuales dispuestas en diferentes ángulos entre sí.

LaFigura Veintiunoproporciona un gráfico que indica el límite elástico de varios constructos de andamio que comprenden capas individuales dispuestas en diferentes ángulos entre sí.

LaFigura Veintidósproporciona imágenes de andamios óseos-ligamentosos-óseos multifásicos modelados a partir del componente dorsal del SLIL, como se implantaron en conejos.

LaFigura Veintitréses una imagen tomada durante la preparación multifásica del andamio óseo-ligamentosoóseo.

LaFigura Veinticuatroes otra imagen tomada durante la preparación multifásica del andamio óseo-ligamentosoóseo.

LaFigura Veinticincoofrece una serie de imágenes que muestran la extirpación quirúrgica del MCL nativo de conejo y la implantación quirúrgica del andamio multifásico óseo-ligamentoso-óseo en la rodilla (A-L).

LaFigura Veintiséisproporciona imágenes que muestran la implantación del andamio, la fijación de la articulación de la rodilla y la mineralización ósea.A)Imágenes SEM del andamio multifásico que muestran los compartimentos óseos-ligamentosos-óseos.B)Radiografía que muestra la fijación con alambre de Kirschner de la articulación de la rodilla de conejo en flexión.C)Reconstrucciones por microCT que ilustran la nueva mineralización ósea en el fémur y la tibia después de 4 semanas.

LaFigura Veintisieteproporciona imágenes que muestran los resultados de MicroCT de la regeneración ósea en la articulación MCL de un conejo implantado con un andamio óseo-ligamentoso-óseo multifásico.A)4 semanas.B)yC)8 semanas.

LaFigura Veintiochomuestra una imagen de un aparato utilizado para las pruebas biomecánicas de los constructos óseos-ligamentosos-óseos generados con el andamio óseo-ligamentoso-óseo multifásico.

LaFigura Veintinuevees un gráfico que muestra las mediciones de resistencia mecánica derivadas de las pruebas de tracción de los constructos óseos-ligamentosos-óseos a las 4 y 8 semanas.

LaFigura Treintamuestra mapas de deformación generados a partir de(A)articulaciones de rodilla de conejo nativas y(B)articulaciones de rodilla de conejo a las que se les ha extirpado el MCL y se han sustituido por andamios óseos-ligamentosos-óseos multifásicos.

LaFigura Treinta y unomuestra imágenes histológicas (tinción con hematoxilina y eosina) de ligamentos colaterales mediales de conejo (rodilla):A)Ligamento MCL nativo (“276 nativo”).B)Arquitectura normal del MCL de conejo.C)Muestras de control a 4 semanas (“336 Ctrl”) Andamio completoin vivoque muestra fibras de ligamento intactas que atraviesan los compartimentos óseosD)Mineralización ósea del compartimento óseo alrededor de los puntales PCL.E)Compartimento ligamentoso 2x.F)Compartimento ligamentoso 10x (algunas fibras alineadas).G)8 semanas (“241 Ctrl”) Andamio completoin vivoque muestra fibras de ligamento intactas que atraviesan los compartimentos óseosH)Mayor mineralización ósea alrededor de los puntales PCL observada a 8 semanas en comparación con 4 semanas.I)Compartimento ligamentoso 2x.J)Compartimento ligamentoso 10x (más fibras alineadas).

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona andamios sintéticos y biocompatibles para su aplicación quirúrgica en la reparación de articulaciones y/o ligamentos.

Estos bioandamios multifásicos con biomimetismo estratégico pueden permitir la reparación integradora y funcional de lesiones de tejidos blandos de una manera superior a los autoinjertos equivalentes debido a factores que incluyen: (i) la capacidad de reproducir más fielmente la morfología externa del tejido sometido a tratamiento, lo que permite una adaptación idéntica o casi idéntica de los andamios a la arquitectura articular existente; y/o (ii) el mantenimiento de propiedades biomecánicas equivalentes a las de la articulación y/o el ligamento nativos; y/o (iii) la capacidad de manipulación para promover la vascularización y la regeneración tisular, minimizando así el tiempo total de cicatrización; y/o (iv) la eliminación de la morbilidad del donante al recolectar autoinjertos.

La presente invención se refiere a estos andamios, a los métodos para su producción, y a su uso en la reparación de tejidos (por ejemplo, la reparación de articulaciones y/o ligamentos). Las diversas características de la invención que se describen a continuación no deben considerarse limitativas a menos que el contexto lo indique claramente.

Polímeros

La presente invención proporciona andamios construidos a partir de polímeros y métodos para su producción.

Sin poner ninguna limitación particular al tipo de polímeros que pueden utilizarse en un método o andamio descrito en la presente, ciertas características pueden ser deseables. Por ejemplo, los polímeros pueden ser biocompatibles (es decir, no tóxicos), no inmunogénicos, tener capacidad para actuar como sustratos adhesivos para las células, promover el crecimiento celular y/o permitir la retención de la función de las células diferenciadas.

Adicional o alternativamente, los polímeros pueden comprender una o más características físicas que permitan una resistencia mecánica, una gran relación superficie/volumen y/o un procesamiento sencillo en las configuraciones de forma deseadas.

Un andamio construido a partir de un polímero puede ser lo suficientemente rígido como para mantener la forma deseada en condicionesin vivo.

Un polímero utilizado en un método o constructo descrito en la presente puede ser biodegradable o sustancialmente biodegradable. Preferiblemente, los productos degradados del polímero son biocompatibles. Alternativamente, un polímero utilizado en un método o constructo descrito en la presente puede ser un polímero no degradable. Sin limitación, los materiales poliméricos no degradables adecuados que pueden utilizarse incluyen el poli(tereftalato de etileno) (PET), el poliéter éter cetona (PEEK) y combinaciones de los mismos.

El polímero puede ser un homopolímero o un copolímero.

El polímero puede ser sintético o natural.

Entre los ejemplos no limitativos de polímeros sintéticos potencialmente adecuados se incluyen los poliésteres (por ejemplo, poli(ácido glicólico), poli(ácido l-láctico), poli(ácido d,l-láctico), poli(ácido d,l-láctico-co-glicólico), poli(caprolactona), poli(fumarato de propileno), poli(p-dioxanona), poli(carbonato de trimetileno), y sus copolímeros, polianhídridos (por ejemplo. Poli [1,6 - bis(carboxifenoxi) hexano]), poli(fosfoésteres) (por ejemplo, poli(bis(hidroxietil), tereftalato-etilo, cloruro de ortofosfato/tereftaloilo), poli(orto ésteres) (por ejemplo, Alzamer®), policarbonatos (por ejemplo, policarbonato derivado de tirosina), poliuretanos (por ejemplo, poliuretano basado en LDI y poli(glicolida-co-Y-caprolactona)) y polifosfazenos (por ejemplo, polifosfazeno de etilglicinato).

Los ejemplos no limitativos de polímeros naturales potencialmente adecuados se incluyen los derivados de proteínas, tales como el colágeno, la fibrina, la gelatina, la albúmina y polisacáridos, tales como la celulosa, el hialuronato, la quitina, los glucosaminoglicanos (por ejemplo, el ácido hialurónico), los proteoglicanos (por ejemplo, el sulfato de condroitina, la heparina), la fibronectina, la laminina y el alginato.

El polímero puede comprender proteínas. Las proteínas pueden ser proteínas fibrilares. Los ejemplos no limitativos de proteínas fibrilares adecuadas son el colágeno, la elastina, el fibrinógeno, la fibrina, la albúmina y la gelatina. Un polímero utilizado en un método o andamio descrito en la presente puede existir como un polímero en su estado natural. Dichos polímeros pueden polimerizarse aún más y/o reticularse con otros polímeros.

Adicional o alternativamente, un polímero utilizado en un método o andamio descrito en la presente puede prepararse a partir de unidades monoméricas utilizando cualquier técnica adecuada conocida en la técnica. Las cadenas poliméricas también pueden polimerizarse adicionalmente mediante la adición de otra(s) unidad(es) monomérica(s) y/o mediante el enlace con otras cadenas poliméricas.

Las unidades de monómero y/o las cadenas poliméricas separadas pueden enlazarse entre sí utilizando un agente polimerizante adecuado. Los agentes de polimerización y los métodos para su uso son bien conocidos por los expertos en la técnica. Los ejemplos no limitativos de agentes de polimerización potencialmente adecuados incluyen diisocianatos, peróxidos, diimidas, dioles, trioles, epóxidos, cianoacrilatos, enzimas (por ejemplo, polimerasas) y similares.

Un polímero utilizado en un método o andamio descrito en la presente puede reticularse para formar una red polimérica. Las redes de polímeros pueden ser bidimensionales o tridimensionales. Los agentes reticulantes potencialmente adecuados incluyen, pero no se limitan a, genipina, glutaraldehído, carbodiimidas (por ejemplo, EDC), imidoésteres (por ejemplo, suberimidato de dimetilo), ésteres de N-hidroxisuccinimida (por ejemplo, BS3), divinilsulfona, epóxidos, imidazol, azúcares (por ejemplo, pentosas o hexosas).

Únicamente a modo de ejemplo no limitativo, un polímero de fibrina puede formarse a partir de precursores de monómeros de fibrinógeno en presencia de una proteasa de serina (por ejemplo, trombina) para iniciar la agregación espontánea de monómeros de fibrina en una red nanofibrosa. A continuación, pueden utilizarse iones de calcio y factor XIII (una transglutaminasa) para reticular covalentemente los polímeros de fibrina.

Un polímero utilizado en un método o andamio descrito en la presente puede ser un “fotopolímero”. Como se utiliza en la presente, el término “fotopolímero” engloba un polímero, y unidades monoméricas capaces de ensamblarse en un polímero, que pueden hacerse polimerizar y/o reticular, tras la exposición a una forma de radiación electromagnética (por ejemplo, luz infrarroja, luz visible, luz ultravioleta, rayos X, rayos gamma). La polimerización y/o la reticulación pueden producirse espontáneamente tras la exposición a la radiación electromagnética, o pueden requerir (o verse potenciadas por) la presencia de uno o más compuestos adicionales (por ejemplo, un catalizador o un fotoiniciador).

Cualquier tipo de fotopolímero puede utilizarse en un método o andamio descrito en la presente. Los fotopolímeros adecuados pueden incluir, pero no se limitan a, resinas (por ejemplo, resinas epoxi, resinas de acrilato, Accura® SI 10), polímeros de dimetacrilato, poli(fumarato de propileno) (PPF), mezclas de PPF y fumarato de dietilo (DEF), poli(etilenglicol) (PEG) fotopolimerizado, metacrilato de 2-hidroxietilo (HEMA), diacrilato de poli(etilenglicol) (PEGDA), y similares.

Un fotopolímero utilizado en un método o andamio descrito en la presente puede inducirse a polimerizar, reticular y/o curar en presencia de un fotoiniciador. Como se utiliza en la presente, un “fotoiniciador” es una molécula que al absorber la luz a una longitud de onda específica produce una o más especies reactivas capaces de catalizar reacciones de polimerización, reticulación y/o curado. Por ejemplo, el fotoiniciador puede ser compatible con el agua y actuar sobre moléculas que contengan un grupo acrilato o estireno (por ejemplo, Irgacure 2959, 184 y 651; VA-086 o V-50). El fotoiniciador puede ser un cromóforo. Otros ejemplos no limittivos de fotoiniciadores adecuados son el cloruro de rutenio II trisbipiridilo [RuII(bpy)<3>]2+, la 2,2-dimetoxi-2-fenilacetofenona (Irgacure 651) y el cromóforo sensible a 2 fotones (AF240).

Andamios tisulares

Los andamios descritos en la presente son sintéticos y pueden diseñarse para imitar las propiedades del tejido biológico (por ejemplo, tejido de mamífero, tejido humano). Como ya se ha indicado, pueden producirse utilizando polímeros.

Los andamios pueden ser multifásicos, lo que significa que pueden comprender múltiples compartimentos con propiedades microestructurales, y/o químicas, y/o mecánicas distintas, en comparación con el compartimento o compartimentos adyacentes del andamio. Por consiguiente, los andamios pueden comprender dos, tres, cuatro, cinco o más de cinco compartimentos individuales. Los compartimentos individuales de los andamios pueden fabricarse de forma continua, de manera que el andamio completo, incluyendo todos sus compartimentos, se genere como una sola unidad en lugar de producir series de compartimentos individuales y posteriormente unirlos, fusionarlos o conectarlos entre sí para formar el andamio completo.

Los andamios multifásicos pueden comprender un compartimento o compartimentos que imiten la morfología externa de una articulación o de un componente de una articulación (por ejemplo, ligamento, hueso, cartílago y combinaciones de los mismos). La articulación puede ser una articulación de mamífero (por ejemplo, una articulación humana). Los ejemplos no limitativos de articulaciones incluyen las articulaciones fibrosas (por ejemplo, suturas, gonfosis, sindesmosis), las articulaciones cartiliginosas (por ejemplo, sincrondosis, sínfisis) y las articulaciones sinoviales (por ejemplo, deslizamiento, bisagra, pivote, condiloide, silla de montar, rótula). Por consiguiente, la articulación puede ser una articulación intervertebral (por ejemplo, una articulación cartilaginosa intervertebral, una articulación facetaria sinovial intervertebral, una articulación cigapofisaria), una articulación atlantoaxial, una articulación del codo, una articulación del dedo o del pulgar (por ejemplo, una articulación interfalángica, una articulación metacarpofalángica, una articulación interfalángica proximal, una articulación interfalángica distal), una articulación del antebrazo (por ejemplo, una articulación radiocubital proximal, una articulación radiocubital distal), una articulación de la cadera, una articulación del hombro (por ejemplo, una articulación glenohumeral, una articulación esternoclavicular, una articulación acromioclavicular) o una articulación de la muñeca (por ejemplo, una articulación radiocarpiana, una articulación intercarpiana, una articulación metacarpiana, una articulación carpometacarpiana, una articulación intermetacarpiana). Los andamios multifásicos pueden comprender un compartimento o compartimentos que imiten la morfología externa de componentes (por ejemplo, ligamentos, huesos, cartílagos) de las articulaciones. El destinatario experto conoce bien los diversos componentes de las articulaciones en los sujetos mamíferos (por ejemplo, humanos) que están bien caracterizados en la bibliografía (véase, a modo de ejemplo no limitativo, Marieb y Hoehn, Anatomía y fisiología humanas (10a adición); Harris, Mammal Anatomy, an illustrated guide, 2010, Marshall Cavendish; Jacob, Human Anatomy: A Clinically Oriented Approach, 2007, Elsevier; Dimon Rr, Anatomy of the Moving Bod (2a edición), 2012, North Atlantic Books; Agur & Dalley, Grant's Atlas of Anatomy (12a edición), 2009, Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins).

Algunos ejemplos no limitativos de los andamios multifásicos incluyen aquellos que comprenden, en secuencia, compartimentos óseos-ligamentosos, compartimentos ligamentosos-óseos, compartimentos óseos-ligamentososóseos, compartimentos óseos-cartilaginosos, compartimentos cartilaginosos-óseos, compartimentos óseoscartilaginosos-óseos, compartimentos musculares-tendinosos, compartimentos tendinosos-óseos, y compartimentos musculares-tendinosos-óseos.

De nuevo sin limitación, el andamio multifásico puede imitar la morfología externa de los ligamentos interóseos escafolunares, los ligamentos interóseos escafolunares en conexión con un escafoides, los ligamentos interóseos escafolunares en conexión con un semilunar, o los ligamentos interóseos escafolunares con unos primeros extremos en conexión con un escafoides y unos segundos extremos en conexión con un semilunar. Los ligamentos interóseos escafolunares pueden incluir ligamentos dorsales (posteriores), y/o proximales (intermedios, interóseos), y/o palmares (anteriores, volares).

Los andamios descritos en la presente pueden ser porosos. La porosidad del andamio es preferiblemente de un tamaño que permite la migración de componentes (por ejemplo, células, proteínas, factores de crecimiento, nutrientes y/o desechos celulares) dentro y/o a través del andamio. Los constructos pueden tener poros de entre aproximadamente 100 pm y aproximadamente 1000 pm de ancho o diámetro, entre aproximadamente 100 pm y aproximadamente 900 pm de ancho o diámetro, entre aproximadamente 100 pm y aproximadamente 800 pm de ancho o diámetro, entre aproximadamente 100 pm y aproximadamente 700 pm de ancho o diámetro, entre aproximadamente 100 pm y aproximadamente 600 pm de ancho o diámetro, menos de aproximadamente 800 pm de ancho o diámetro, o menos de aproximadamente 700 pm, 600 pm, 500 pm, 400 pm, 300 pm, 200 pm, 100 pm, o 50 pm de ancho o diámetro. Los constructos pueden comprender poros sustancialmente circulares de menos de aproximadamente 800 pm de diámetro, o de menos de aproximadamente 700 pm, 600 pm, 500 pm, 400 pm, 300 pm, 200 pm, 100 pm o 50 pm de diámetro.

Bioimpresión

Los andamios descritos en la presente pueden fabricarse mediante una técnica de bioimpresión adecuada. Preferiblemente, la técnica de bioimpresión es una técnica de bioimpresión tridimensional.

Los ejemplos no limitativos de técnicas de bioimpresión adecuadas incluyen la bioimpresión basada en chorro de tinta (por ejemplo, bioimpresión térmica por chorro de tinta, bioimpresión piezoeléctrica por chorro de tinta) en la que se generan gotas de biotinta en una boquilla mediante un accionador térmico o piezoeléctrico, la bioimpresión asistida por presión (por ejemplo, microextrusión) en la que los biomateriales se extruyen bajo presión (por ejemplo, mediante presión por tornillo o émbolo, o presión neumática) a través de una boquilla a microescala o una microaguja sobre un sustrato y pueden utilizarse para fabricar andamios tridimensionales capa por capa, la bioimpresión asistida por láser (por ejemplo, fotolitografía de escaneado láser, fotolitografía de escaneado láser de dos fotones) en la que se utiliza un láser como una fuente de energía para depositar biomateriales sobre un sustrato y fabricar el andamio, y la estereolitografía en la que se utiliza luz de patrón para polimerizar un fotopolímero líquido de forma selectiva, capa por capa.

Los expertos en la técnica conocen bien estas y otras técnicas de bioimpresión adecuadas que pueden utilizarse en los métodos descritos en la presente. Únicamente a modo de ejemplo, se hace referencia a las publicaciones de Boland et al. Biotechnol J. 2006 Sep 1(9):910-7; Chia & Wu, J Biol Eng. 2015; 9:4; Irvine & Venkatraman, Molecules 2016, 21, 1188; Jana & Lerman, Biotechnol Adv. 2015 Dic; 33(8):1503-21; Li et al. J Transl Med. 2016; 14: 271; Melchels, et al. Progr. Polymer Sci. 37(8) 2012: 1079-1104; Murphy & Atala Nat. Biotechnol. 32(8) 2014: 773-785; Skardal A. Bioprinting Essentials of Cell and Protein Viability. Essentials of 3D Biofabrication and Translation. Atala A, Yoo JJ, Eds. Academic Press: Cambridge, MA, enero de 2015: 1-17; y Wang et al. Biofabrication. 22 de Dic de 2015; 7(4):045009. Los Ejemplos de la presente solicitud también proporcionan una técnica de bioimpresión ejemplar que puede utilizarse para producir un andamio descrito en la presente.

También se contempla el uso de “CAD” (diseño asistido por ordenador) para ayudar a generar los constructos de andamio descritos en la presente. Como se utiliza en la presente, el término “CAD” incluye todo tipo de sistemas de diseño asistido por ordenador, incluyendo los sistemas CAD puros, los sistemas CAD/CAM y similares, siempre que dichos sistemas se utilicen al menos en parte para desarrollar o procesar un modelo de un constructo de andamio tridimensional descrito en la presente. Algunos ejemplos no limitativos sonSolidworks(Solidworks Corp.) y el software LSM (Zeiss).

Siembra de células

Los andamios descritos en la presente pueden sembrarse con células. Aunque no existe ninguna limitación particular en cuanto al tipo o tipos concretos de células que pueden utilizarse para sembrar los andamios, se prevé la inclusión de células madre y/o células precursoras capaces de diferenciarse en tipo o tipos de células dentro del tejido de interés (es decir, el tejido que el andamio pretende imitar). Únicamente a modo de ejemplos no limitativos, las células madre y/o precursoras pueden ser capaces de diferenciarse en una o más de las células mesenquimales osteoprogenitoras, osteoblastos, osteocitos, osteoclastos, condrocitos y células progenitoras de condrocitos.

Por ejemplo, los andamios que comprenden uno o más compartimentos que imitan un hueso pueden sembrarse con cualquier célula que sea capaz de diferenciarse o expandirse en una célula osteoblástica. Por ejemplo, pueden utilizarse para este fin células madre mesenquimales (células estromales de la médula ósea) y/o células estromales derivadas del tejido adiposo (por ejemplo, células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea, células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo).

Los andamios que comprenden uno o más compartimentos que imitan el cartílago pueden sembrarse con cualquier célula capaz de diferenciarse o expandirse en una célula cartilaginosa. Por ejemplo, pueden utilizarse para este fin células madre cartilaginosas, células madre mesenquimales (células estromales de la médula ósea) y/o células estromales derivadas del tejido adiposo (por ejemplo, células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea, células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo).

Los andamios que comprenden uno o más compartimentos que imitan los ligamentos pueden sembrarse con cualquier célula que sea capaz de diferenciarse o expandirse en una célula ligamentosa. Por ejemplo, pueden utilizarse para este fin células madre derivadas de ligamentos, células madre mesenquimales (células estromales de la médula ósea) y/o células estromales derivadas del tejido adiposo (por ejemplo, células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea, células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo).

Otros tipos celulares no limitativos que pueden utilizarse para sembrar los andamios descritos en la presente incluyen células madre de la sangre del cordón, células madre embrionarias, células madre pluripotentes inducidas, células madre adultas, células blásticas y/o células placentarias.

Otros ejemplos no limitativos de tipos celulares que pueden utilizarse para sembrar los andamios descritos en la presente incluyen cualquier célula como células mesenquimales osteoprogenitoras, osteoblastos, osteocitos, osteoclastos, condrocitos y células progenitoras de condrocitos. Preferiblemente, las células proceden de un donante humano compatible. Más preferiblemente, las células proceden del paciente (es decir, células autólogas).

No existe ninguna limitación en cuanto a los tiempos o la metodología utilizados para sembrar los andamios.

En consecuencia, las células pueden sembrarse durante la construcción del propio andamio. Por ejemplo, las células pueden incluirse o mezclarse con el material utilizado para fabricar el andamio (por ejemplo, en una mezcla líquida de material polimérico y células). Cuando se incluyen células en el material de bioimpresión o se mezclan con él, el constructo resultante puede estar celularizado con, por ejemplo, células distribuidas por todo el material, células distribuidas en compartimentos específicos y/o diferentes tipos de células colocadas y/u orientadas para imitar el tejido natural deseado.

Alternativamente, el andamio puede producirse independientemente de las células que pueden sembrarse posteriormente. Por ejemplo, las células pueden colocarse en un medio de cultivo adecuado y el andamio puede colocarse en el medio para facilitar la siembra del andamio. Los expertos en la técnica conocen diversas técnicas para potenciar la siembra de células en este contexto, que pueden incluir la agitación manual, técnicas para concentrar las células, la adición de factores de crecimiento, diferenciación y/o adhesión celular, y similares.

Los andamios multifásicos preformados pueden sembrarse utilizando la tecnología de láminas celulares. La tecnología de láminas celulares es conocida por los expertos en la técnica. Únicamente a modo de ejemplo no limitativo , se hace referencia a Costa et al. Journal of clinical periodontology. 2014; 41(3):283-94; Neo et al. Connect Tissue Res. 2016:1-15; Yamato & Okano, 2004, Today 7, 42-47; Yang et al. 2005, Biomaterials 26, 6415 6422). De este modo, las láminas celulares pueden prepararse, recolectarse y colocarse dentro y/o envolverse alrededor de un andamio previamente preparado descrito en la presente. La aplicación/siembra de láminas celulares en y/o alrededor de andamios tisulares puede realizarse utilizando métodos similares a los descritos en, por ejemplo, Carter et al. Ann Biomed Eng. 2017; 45(1): 12-22.

El número de células utilizadas para sembrar un constructo de andamio determinado dependerá generalmente de factores tales como las dimensiones del constructo junto con el tamaño y la morfología de las células utilizadas. Preferiblemente, los constructos de andamio comprenden una alta densidad de células, aunque la densidad de células dependerá de la aplicación particular.

El andamio puede sembrarse con entre aproximadamente 50 millones y 200 millones de células/ml, entre aproximadamente 100 millones y 200 millones de células/ml, entre aproximadamente 100 millones y 150 millones de células/ml, entre aproximadamente 1 millón de células/ml y aproximadamente 50 millones de células/ml, o entre aproximadamente 1 millón de células/ml y aproximadamente 10 millones de células/ml.

Los andamios pueden comprender además otros componentes bioactivos. Los ejemplos no limitativos de componentes bioactivos incluyen proteínas (por ejemplo, proteínas de la matriz extracelular, tales como colágeno, elastina, pikachurina; proteínas del citoesqueleto tales como actina, queratina, miosina, tubulina, espectrina; proteínas plasmáticas, tales como albúmina sérica; proteínas de adhesión celular, tales como cadherina, integrina, selectina, NCAM; y enzimas); neurotransmisores (por ejemplo, serotonina, dopamina, epinefrina, norepinefrina, acetilcolina); factores angiogénicos (por ejemplo, angiopoyetinas, factor de crecimiento de fibroblastos, factores de crecimiento óseo, tales como la proteína morfogénica ósea (por ejemplo, BMP-2), factores de crecimiento del cartílago, factores de crecimiento del ligamento, factores de crecimiento del menisco, factor de crecimiento endotelial vascular, enzimas metaloproteinasas de la matriz); aminoácidos; ligandos de galactosa; ácidos nucleicos (por ejemplo. ADN, ARN); fármacos (antibióticos, antiinflamatorios, antitrombóticos y similares); polisacáridos; proteoglicanos; hialuronato; agentes reticulantes, tales como el factor XIII; lisiloxidasa; anticoagulantes; antioxidantes; citocinas (por ejemplo, interferones (IFN), factores de necrosis tumoral (TNF), interleucinas, factores estimulantes de colonias (CSF)); hormonas o factores de crecimiento (por ejemplo, insulina, factor de crecimiento similar a la insulina, factor de crecimiento epidérmico, oxitocina, extracto de factor osteogénico (OFE), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento transformante (TGF) (por ejemplo, proteínas TGF-p, incluyendo la proteína morfogenética ósea 2, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB), factor de crecimiento de fibroblastos ácido (FGF), FGF básico, péptidos activadores del tejido conectivo (CTAP), tromboglobulina, eritropoyetina (EPO) y factor de crecimiento nervioso (NGF)); o combinaciones de los mismos.

Los componentes bioactivos adicionales pueden obtenerse de cualquier fuente (por ejemplo, seres humanos, otros animales, microorganismos). Por ejemplo, pueden producirse por medios recombinantes, o extraerse y purificarse directamente de una fuente natural.

Tratamientos

Los andamios descritos en la presente pueden utilizarse en la regeneración y/o reparación de tejidos dañados en un sujeto. Un experto en la técnica reconocerá fácilmente que los andamios descritos en la presente pueden bioimprimirse de manera que imiten un amplio número de tejidos de mamíferos (por ejemplo, humanos), incluyendo, por ejemplo, los que comprenden uno o más de los huesos, cartílagos y/o ligamentos, en cualquier combinación.

De acuerdo con los métodos de tratamiento descritos en la presente, los andamios pueden trasplantarse a un sujeto que lo necesite, en el sitio del tejido que requiera reparación y/o regeneración.

Los ejemplos no limitativos de tejidos que pueden tratarse de acuerdo con los métodos descritos en la presente incluyen una articulación o un componente de una articulación (por ejemplo, ligamento, hueso, cartílago y combinaciones de los mismos). La articulación puede ser una articulación de mamífero (por ejemplo, una articulación humana).

Los ejemplos no limitativos de articulaciones que pueden tratarse de acuerdo con los métodos descritos en la presente se incluyen las articulaciones fibrosas (por ejemplo, suturas, gonfosis, sindesmosis), las articulaciones cartiliginosas (por ejemplo, sincrondosis, sínfisis, menisco) y las articulaciones sinoviales (por ejemplo, deslizamiento, bisagra, pivote, condiloide, silla de montar, rótula). Por consiguiente, la articulación puede ser una articulación intervertebral (por ejemplo, una articulación cartilaginosa intervertebral, una articulación facetaria sinovial intervertebral, una articulación cigapofisaria), una articulación atlantoaxial, una articulación del codo, una articulación del dedo o del pulgar (por ejemplo, una articulación interfalángica, una articulación metacarpofalángica, una articulación interfalángica proximal, una articulación interfalángica distal), una articulación del antebrazo (por ejemplo, una articulación radiocubital proximal, una articulación radiocubital distal), una articulación de la cadera, una articulación del hombro (por ejemplo, una articulación glenohumeral, una articulación esternoclavicular, una articulación acromioclavicular) o una articulación de la muñeca (por ejemplo, una articulación radiocarpiana, una articulación intercarpiana, una articulación metacarpiana, una articulación carpometacarpiana, una articulación intermetacarpiana). Los componentes individuales (por ejemplo, ligamentos, huesos, cartílagos) de las articulaciones también pueden ser objetivo de los métodos de tratamiento. El destinatario experto conoce bien los diversos componentes de las articulaciones en los sujetos mamíferos (por ejemplo, humanos) que están bien caracterizados en la bibliografía (véase, a modo de ejemplo no limitativo, Marieb y Hoehn, Anatomía y fisiología humanas (10a adición); Harris, Mammal Anatomy, an illustrated guide, 2010, Marshall Cavendish; Jacob, Human Anatomy: A Clinically Oriented Approach, 2007, Elsevier; Dimon Rr, Anatomy of the Moving Bod (2a edición), 2012, North Atlantic Books; Agur & Dalley, Grant's Atlas of Anatomy (12a edición), 2009, Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins).

Las células sembradas en los andamios utilizados para el trasplante pueden proceder de un donante humano compatible o del propio sujeto (es decir, células autólogas). El sujeto puede ser cualquier animal de importancia económica, social o de investigación, incluyendo las especies bovina, equina, ovina, primates, aves y roedores. En consecuencia, el sujeto puede ser un mamífero, tal como, por ejemplo, un ser humano o un mamífero no humano.

Ejemplos

La presente invención se describirá a continuación con referencia a uno o más Ejemplos específicos, que no deben interpretarse en modo alguno como limitativos.

Ejemplo Uno:andamio óseo-ligamentoso-óseo multifásico de fabricación aditiva para la reconstrucción del ligamento interóseo escafolunar

-Descripción general

(i) Objetivo

El ligamento interóseo escafolunar (SLIL) es un ligamento de la muñeca que se rompe con frecuencia. Las opciones quirúrgicas actuales para los desgarros del SLIL no son óptimas y estas lesiones alteran la cinemática del carpo, lo que provoca una artrosis secundaria. El objetivo de esta investigación es desarrollar un novedoso andamio multifásico óseo-ligamentoso-óseo (BLB) mediante impresión en 3D y tecnología de láminas celulares para la reconstrucción del ligamento interóseo escafolunar dorsal (SLIL).

(ii) Metodología

Se imprimieron en 3D con policaprolactona (PCL) de calidad médica andamios óseos-ligamentosos-óseos multifásicos modelados a partir del componente dorsal del SLIL. Éstos comprendían dos compartimentos óseos unidos por puentes de fibras PCL alineadas que imitaban la arquitectura del ligamento nativo.

(iii) Resultados

Las pruebas mecánicas de los andamios BLB demostraron que eran capaces de soportar fuerzas fisiológicas. El constructo BLB se implantó ectópicamente en ratas atímicas y se recolectó a las 2 y 8 semanas. Se utilizaron tres grupos experimentales (i) sólo control del andamio BLB, (ii) proteína morfogenética ósea (BMP) en el compartimento óseo del andamio BLB, y (iii) BMP en el compartimento óseo y láminas celulares humanas en el ligamento del andamio BLB. Las láminas celulares se formaron cultivando células madre mesenquimales de médula ósea humanas en plástico de cultivo tisular durante 21 días con o sin medios suplementados con ácido ascórbico. Las láminas celulares tratadas con ácido ascórbico mostraron un alto contenido de ADN y deposición de ECMin vitroantes de la implantación, por lo que se utilizaron para los experimentos posteriores. El análisis de las láminas celularesin vitrodemostró que su recolección y colocación no comprometían la viabilidad celular y que las láminas se distribuían homogéneamente en el compartimento ligamentoso antes de su implantación. El análisis histológico de las muestrasin vivodemostró que los andamios eran biocompatibles, presentaban una buena integración tisular y estaban altamente vascularizados. La formación ósea sólo se observó en el punto de tiempo de la semana 8 y permaneció localizada en el compartimento óseo. Las células del compartimento ligamentoso se alinearon y el injerto experimentó una amplia remodelación tisularin vivo.

(iv) Conclusión

Este estudio de prueba de concepto demostró que se puede generar e implantar con éxito y de forma predecible un andamio óseo-ligamentoso-óseo multifásico impreso en 3D para su aplicación en la reconstrucción del ligamento escafolunar. La arquitectura específica del andamio proporcionó propiedades de guía para el alineamiento de las fibras del ligamento y la regeneración del tejido.

-Materiales y métodos

(i) Fabricación de andamios óseos-ligamentosos-óseos

La policaprolactona de grado médico (mPCL, 80 kDa) se adquirió de Corbion. Se diseñaron andamios BLB mPCL de fabricación aditiva compuestos por dos compartimentos óseos unidos por fibras mPCL alineadas (compartimento ligamentoso) que imitan la arquitectura y la organización del ligamento nativo. Se generaron dos diseños con una interdistancia de fibras de 350 pm y 600 pm en el compartimento ligamentoso para su caracterización física, pruebasin vitroe implantación ectópica. Los andamios tridimensionales mPCL se fabricaron utilizando un bioextrusor propio en las siguientes condiciones: el mPCL se colocó en un depósito inoxidable y se calentó a 110°C mediante una unidad de cartucho calentado y se extruyó a través de una aguja 22G para depositar las fibras mPCL en una etapa programable. El proceso de impresión continua dio como resultado la fabricación de fibras correctamente conectadas formando un constructo con 0/90° entre capas (en el compartimento óseo) y una disposición 0/0° en el compartimento ligamentoso (fibras alineadas) con un grosor de capa de 300 pm. El resultado fue la producción de andamios individuales con forma de U alargada en los que los compartimentos óseos tenían una dimensión de 5x5x10 mm3 y estaban puenteados por el compartimento ligamentoso con una dimensión de 5 mm de largo, 5 mm de ancho y 3 mm de alto. Estos andamios BLB se utilizaron como tales para el resto del estudio, excepto para las pruebas de tracción, en las que se utilizaron andamios rectangulares b Lb de 15x5x3 mm3, que seguían presentando los compartimentos óseos de 5 mm de longitud y un compartimento ligamentoso de 5 mm de longitud, debido a los requisitos experimentales.

(ii) Morfología y porosidad del BLB

La morfología del andamio se investigó mediante microscopía electrónica de barrido (SEM). El SEM se realizó en el Centre of Analytical Research Facility (CARF) utilizando un microscopio QUANTA200. Los andamios mPCL se recubrieron con oro mediante pulverización catódica durante 150 segundos antes de su visualización bajo microscopio (EHT= 10kV). La morfología junto con la porosidad del andamio (n=6) se investigaron mediante tomografía microcomputarizada (pCT). Los andamios BLB de 350 y 600 pm se analizaron con un pCT40 (SCANCO Medical AG,Brüttisellen, Suiza) con un voltaje de 55 kVp, una corriente de 120 pA y una potencia de 8W, un tiempo de integración de 300 ms y un tamaño de vóxel de 20 pm. Las imágenes en 3D se reconstruyeron utilizando el software pCT

(iii) Pruebas mecánicas

- Pruebas de tracción y pruebas cíclicas

Como preparación para las pruebas mecánicas, los compartimentos óseos se rellenaron cuidadosamente con una resina epoxídica de fraguado rápido (Selleys Araldite 5 Minute, Australia) para dar rigidez a los compartimentos óseos antes de introducirlos posteriormente en mordazas neumáticas. Esto evitó la compresión irreversible y la concentración de tensiones en la interfase del compartimento ligamentoso-óseo. Se tuvo cuidado de que la resina permaneciera contenida en los compartimentos óseos y de que no hubiera contacto con las fibras del ligamento. Los especímenes se secaron durante la noche a temperatura ambiente. La muestra se colocó en las mordazas, asegurándose de que las fibras del ligamento eran paralelas al eje longitudinal de las mordazas. Las propiedades mecánicas de tracción del constructo se midieron con un Microtester Instron 5848 equipado con una célula de carga de 500 N y una velocidad de cruceta de 20 mm.min-1 a temperatura ambiente. Se probaron cinco muestras repetidas para cada diseño y se calcularon la rigidez lineal (calculada a partir de la parte lineal inicial de la curva F/alargamiento), la fuerza de fluencia, y la máxima resistencia y deformación límite. Las pruebas cíclicas se realizaron en PBS a 37°C aplicando una precarga de 0,1 N. A continuación, las muestras se sometieron a 1,000 ciclos continuos a una frecuencia de 0,5 Hz en el rango de 0-5% o 0-10% de deformación. Se midieron la evolución de la rigidez y la fuerza en el pico y se representaron gráficamente en función del número de ciclos.

-Prueba de compresión

Los compartimentos óseos de los diseños de 350 pm y 600 pm se imprimieron y cortaron en cuadrados de 5x5 mm2. Las propiedades de compresión se valoraron utilizando un Microtester Instron 5848 equipado con una célula de carga de 500 N y a una velocidad de cruceta de 0,5 mm.min-1 a temperatura ambiente. El módulo de compresión se determinó a partir de la curva lineal inicial de la curva de tensión frente a la deformación (n=5).

(iv) Cultivo celular y generación de la lámina celular (CS)

En este experimento se utilizaron células madre mesenquimales de médula ósea humanas (bmMSCs) (PT-2501, Lonza Australia, Mt Waverley, VIC) entre los pasajes 5 y 7. El medio de cultivo celular fue una combinación de medio de Eagle modificado por Dulbecco<( D m e M ,>Gibco) con 10% de suero bovino fetal, 1% de penicilinaestreptomicina (Gibco), aminoácidos no esenciales MEM (Gibco) y con o sin 100 pg/mL de ácido L-ascórbico 2-fosfato (Sigma-Aldrich). Para generar la lámina celular, las bmMSC se sembraron a 40,000 células por pozo en una placa de 12 pozos y se cultivaron en medios suplementados con ácido ascórbico durante 21 días (a 37°C, CO2 al 5%). En este momento, las láminas celulares maduras se retrajeron visiblemente de la pared del pozo. A efectos comparativos, las células también se cultivaron en medios de expansión (medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Gibco) con un 10% de suero fetal bovino, un 1% de penicilina y estreptomicina (Gibco) con aminoácidos no esenciales MEM adicionales). El medio se cambió cada 2 días. A los 21 días, las muestras se utilizaron para los distintos experimentos: se fijaron con paraformaldehído al 4% para inmunofluorescencia, se congelaron a -80°C para la cuantificación del ADN y el colágeno, o se recolectaron inmediatamente para el análisis de células vivas y muertas o se utilizaron para sembrar los andamios antes de la implantación ectópica.

(v) Caracterización de la lámina celular

- Cuantificación de ADN y colágeno

La cuantificación del ADN se realizó según el protocolo utilizando el kit Quant-iTTM PicoGreen® dsDNA (Invitrogen) (n=6 para cada grupo). La fluorescencia de las muestras se midió utilizando un lector de placas de fluorescencia (BMG POLARstar Omega, Ottenberg, Alemania) con una longitud de onda de excitación de 480 nm y unas longitudes de onda de emisión de 480 nm y 520 nm. Del mismo modo, la cuantificación del colágeno se realizó según el protocolo utilizando el kit de ensayo colorimétrico de hidroxiprolina (Biovision) (n=6 para cada grupo). La absorbancia de las muestras se evaluó con un lector de placas (BMG POLARstar Omega, Ottenberg, Alemania) a una longitud de onda de 560 nm

-Inmunofluorescencia

Se realizó una tinción de inmunofluorescencia para valorar la morfología y la cantidad de matriz extracelular en las muestras (n=3 por tinción). Las láminas celulares se incubaron con BSA al 1%, 22,52 mg/mL de glicina en PBST durante 30 minutos para bloquear la unión inespecífica de los anticuerpos. Los anticuerpos primarios para el colágeno 1a (Santa Cruz Biotechnology; 1:250), el colágeno III (Abcam; 1:200), la elastina (Abcam; 1:200), la tenascina C (Abcam; 1:500) y el agrecano (Abcam; 1:50) se diluyeron en consecuencia en BSA al 1% y las muestras se incubaron a 4°C durante la noche. Las muestras se enjuagaron tres veces con PBS y se incubaron de nuevo con el anticuerpo secundario respectivo (1:200; Invitrogen, IgG de cabra anti-ratón Alexa Fluor, Santa Cruz Biotechnology, IgG de cabra anti-conejo PE) durante 30 minutos. A continuación, se les realizó una contratinción con HOECHST (ThermoFischer; 1:1000) antes de ser visualizadas mediante microscopía confocal (máquina confocal Nikon AR1+) utilizando longitudes de onda de 405 nm, 488 nm y 561 nm.

-SEM

La SEM se llevó a cabo utilizando el mismo método descrito anteriormente. Los andamios celularizados (n=3 por diseño) se procesaron según el protocolo estándar que incluye la infiltración de tetróxido de osmio, la deshidratación y la inmersión en hexametildisilazano antes del secado final a temperatura ambiente. De forma similar al método descrito anteriormente, los andamios BLB se recubrieron con oro mediante pulverización catódica durante 150 segundos antes de su visualización bajo microscopio (EHT= 5kV).

(vi) Caracterización in vitro del andamio

- Preparación de andamios y esterilización

En primer lugar, los andamios se grabaron por inmersión en NaOH 5M a 37°C durante 30 minutos antes de lavarlos tres veces (5 minutos de duración) con H2O destilada. En segundo lugar, los andamios se incubaron en etanol al 100% a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de esterilizarlos bajo luz ultravioleta durante 30 minutos. -Recolección de láminas celulares

Se utilizaron cinco láminas celulares cultivadas con ácido ascórbico (100 pg/mL) para celularizar el andamio BLB de acuerdo con el siguiente protocolo: a los 21 días, se retiró el medio de cada pozo, dejando aproximadamente 100 pL para evitar que la lámina celular se secara. Se utilizaron pinzas estériles para raspar suavemente el borde exterior de la lámina celular y despegarla de las paredes del pozo(Figura 1A)y crear posteriormente una forma rectangular(Figura 1B)que se dobló 2 veces a lo largo de su eje longitudinal, formando así un haz(Figura 1C).Se sembraron cuatro haces de láminas celulares entre las hebras de ligamento del andamio PCL (con la superficie dorsal hacia arriba)(Figuras 1C y D). La quinta lámina celular se colocó en la superficie dorsal del andamio BLB y, por lo tanto, no se dobló formando un haz. Esto se consiguió colocando el andamio BLB con la superficie dorsal hacia abajo sobre la lámina celular desprendida, que posteriormente se envolvió alrededor de los compartimentos óseo y ligamentoso(Figura 1E).Se añadieron 2 mL de medio fresco a un pozo y los andamios se incubaron a 37°C, CO2 al 5% durante 4-6 horas para facilitar la adhesión de las láminas celulares.

-Viabilidad celular

El impacto en la manipulación de la lámina celular y su colocación en el andamio se valoró midiendo la viabilidad celular. Los andamios se sembraron con cinco láminas celulares antes de incubarlos en medios a 37°C, CO2 al 5% durante seis horas. Los andamios sembrados (n=3 por diseño) y las láminas monocelulares de control, planas y no manipuladas (n=3) se tiñeron con diacetato de fluoresceína (FDA) y yoduro de propidio (PI) a 5 pg/mL y 2 pg/mL, respectivamente, y se incubaron durante cinco minutos antes de su visualización mediante microscopía confocal (máquina confocal Nikon AR1+) a 488 nm y 561 nm.

(vii) Implantación ectópica in vivo

El rendimiento regenerativo del constructo BLB se valoró mediante un modelo de implantación subcutánea en roedores. Para recapitular, los eventos de cicatrización que se producen en el escafoides y el hueso semilunar en el entorno clínico, se utilizó un gel de gelatina heparinizada-ácido hialurónico (HyStemTM-HP, Sigma Aldrich) cargado con una señal osteogénica (proteína morfogenética ósea-2 recombinante, BMP-2, producida enE. coli(Genscript, Hong Kong)) para lograr la formación ósea en los compartimentos óseos pertinentes.

-Preparación del andamio BLB:

Se crearon seis grupos diferentes para el estudioin vivo;1) Andamio BLB de 350 pm (350 pm Control), 2) Andamio BLB de 350 pm con BMP-2 en los compartimentos óseos (350 pm BMP), 3) Andamio Bl B de 350 pm con BMP-2 en los compartimentos óseos y láminas celulares (CS) en el compartimento ligamentoso (350 pm BMP-CS), 4) Andamio<b>L<b>de 600 pm (600 pm Control), 5) Andamio BLB de 600 pm con BMP-2 en los compartimentos óseos (600 pm BMP), 6) Andamio BLB de 600 pm con BMP-2 en los compartimentos óseos y láminas celulares (CS) en el compartimento ligamentoso (600 pm BMP-CS).

Para los grupos de control (350 pm Control y 600 pm Control), se reconstituyeron 25 pl del hidrogel de gelatina heparinizada-ácido hialurónico sin BMP-2 siguiendo las instrucciones del fabricante para alcanzar una composición de hidrogel al 1% en peso/vol, y se dispensaron cuidadosamente en cada uno de los compartimentos óseos(Figura 1F). Los andamios se incubaron a 37°C, CO2 al 5% durante aproximadamente 45 minutos, dejando que el gel se fraguara antes de la implantación. Las muestras que contenían BMP-2 se prepararon con el mismo método y se incorporaron 25 pg de BMP-2 humana recombinante en 25 pl de hidrogel manteniendo una concentración del 1% de hidrogel. Para evitar la presencia de medios en los especímenes sembrados con láminas celulares, se utilizó una pipeta de 200 |jl para eliminar cualquier líquido de los compartimentos óseos. Esto permitió la inyección del hidrogel cargado con BMP-2. Las láminas celulares se hidrataron regularmente cada 10 minutos colocando una gota de 20 j l de medio caliente en el compartimento ligamentoso.

-Modelo animal y cuidado de los animales

Las ratas atímicas desnudas CBH-rnu/Arc (n=6) de 8 semanas de edad procedentes del Animal Resource Centre (Australia Occidental) se aclimataron durante 7 días antes de ser sometidas a la cirugía. Todos los experimentos recibieron la aprobación ética para animales de la Universidad de Griffith (Potencial de regeneración de ligamentos del andamio de policaprolactona cargado de células en rata inmunocomprometida, número de aprobación DOH/04/15/AEC) y la experimentación se ciñó al código australiano para el cuidado y uso de animales con fines científicos.

-Implantación ectópica

Se proporcionó cobertura antibiótica profiláctica y alivio del dolor preoperatorio antes de la cirugía mediante una inyección subcutánea de Keflin® (cefalotina sódica) 20 mg/kg, gentamicina 5 mg/kg y buprenorfina, 0,01-0,05 mg/kg. Se colocó al animal en decúbito ventral y se le administró anestesia general (1-3% de inhalante a efecto, hasta el 5% para la inducción) con un vaporizador Mediquip de isoflurano. El campo quirúrgico se rasuró y desinfectó con betadine y se realizaron seis incisiones superficiales. Se utilizó un diseccionador romo para crear bolsas en el tejido subcutáneo lo suficientemente profundas como para encajar los andamios. Los andamios se asignaron aleatoriamente y se insertaron en una bolsa. Se utilizaron suturas de nailon 4-0 para cerrar la herida y betadine para desinfectar el sitio de la herida. La reanimación de los animales se asistió con oxígeno puro. Después de la cirugía, se administraron opiáceos multimodales (buprenorfina 0,01 - 0,05 mg/kg) y un AINE (carprofeno 4 -5 mg/kg) en combinación subcutánea para reducir el dolor. Las ratas se monitorearon diariamente para comprobar la progresión de la cicatrización de la herida durante 7 días y después periódicamente una vez a la semana. -Sacrificio de animales y recolección de muestras

En los puntos de tiempo de 2 y 8 semanas, se sacrificó a las ratas (n=3 por punto de tiempo), se recuperaron los andamios y se fijaron inmediatamente en paraformaldehído al 4% durante 24 horas antes de colocarlos en PBS para su posterior análisis.

(viii) MicroCT

Las muestras se analizaron mediante microCT (jCT40, SCANCO Medical AG, Brüttisellen, Suiza) con un voltaje de 55 kVp, una corriente de 120 jA y una potencia de 8W, un tiempo de integración de 300 ms y un tamaño de vóxel de 20 jm para determinar la mineralización ósea. Las imágenes en 3D se reconstruyeron utilizando el software de microCT

(ix) Histología

- Hematoxilina y eosina (H y E)

Las muestras se descalcificaron utilizando EDTA 5M a temperatura ambiente durante 3 semanas antes de su deshidratación e incrustación en parafina utilizando un procesador de tejidos (Shandon™ Excelsior ES, Thermo Scientific, Waltham, EE. UU.). Se seccionaron cortes longitudinales de 5 jm de los constructos y se recolectaron en portaobjetos recubiertos de polilisina. Estas muestras se desparafinaron con xileno antes de rehidratarlas con concentraciones decrecientes de etanol. Las secciones se tiñeron con H y E, y se escanearon con una consola Aperio AT2 (Leica Biosystems Imaging Inc., EE. UU.).

La histomorfometría se llevó a cabo utilizando la suite de histomorfometría Osteomeasure. Se midió la superficie ocupada por la mineralización ósea, las primeras fases de mineralización y el alineamiento de las fibras en el compartimento ligamentoso para cuantificar el rendimiento de los distintos diseños de andamio.

(x) Estadísticas

Se realizaron pruebas T no apareadas, paramétricas, de dos colas con la corrección de Welch para las pruebas de tracción, las pruebas de compresión, la porosidad del andamio y los resultados de cuantificación del ADN y el colágeno. Se utilizó el ANOVA unidireccional para determinar la significación estadística en la viabilidad celular, ya que se compararon más de 2 medios. Los datos del estudio in vivo ( jC t e histomorfometría) se analizaron mediante la Ecuación de Estimación General utilizando IBM SPSS Statistics para Windows versión 21,0 (IBM Corporation 2012©, Armonk, NY, EE. UU.) con animales individuales como la variable de agrupación. El tiempo y el grupo se utilizaron como variables explicativas junto con todas las interacciones bidireccionales. Se utilizó un procedimiento de eliminación hacia atrás para llegar al modelo más simplificado. Se consideró que un p < 0,05 representaba diferencias estadísticamente significativas.

-Resultados

(i) Morfología del andamio

La morfología de los andamios se investigó mediante SEM y esto reveló la producción de dos componentes arquitectónicamente muy distintos dentro del constructo; las dos extremidades (compartimentos óseos) del andamio BLB estaban formadas por la típica capa de puntales poliméricos alternados en ángulo 0/90(Figura 2AyE), mientras que el compartimento ligamentoso, según nuestro diseño de impresión, estaba compuesto por puntales alineados y superpuestos que creaban surcos macroscópicos(Figura 2ByF). Aunque la fabricación aditiva permite teóricamente la creación de diversas formas y dimensiones, es un reto que la estructura porosa interna o la disposición de los puntales varíen a lo largo de la impresión del andamio. Para lograr esta arquitectura dual, se utilizó un software propio de producción de código g que permitió modificar manualmente la disposición interna del andamio y dio lugar a la creación de puntales alineados. Es importante destacar que los puntales que componen el compartimento ligamentoso están completamente integrados dentro de los compartimentos óseos, lo que garantiza una cohesión mecánicamente fuerte, al tiempo que se mantiene una interfase porosa.

En este sentido, el andamio BLB es un andamio bifásico, con dos porciones arquitectónicamente diferentes, pero fabricado de forma continua de manera similar a un constructo monolítico impreso en 3D. La imagenología SEM mostró que el diámetro del puntal era de 420 pm ± 24,49 pm (n=5) y que había una fusión adecuada entre las capas para ambos diseños de 350 pm y 600 pm (Figura 2CyH, flechas cuadradas), asegurando así una fuerte interrelación entre las capas. Los puntales mPCL en el compartimento ligamentoso tenían una anchura homogénea, aunque se observó cierto hundimiento (Figura 2ByF, flechas blancas). Esto puede explicarse por el hecho de que el mPCL se extruyó muy por encima de su punto de fusión y, por lo tanto, se encontraba en un estado semifundido cuando se depositó. Además, había una falta de apoyo adyacente en toda la longitud del compartimento ligamentoso, lo que provocaba el hundimiento del filamento. Aunque se trataba de una limitación inherente al diseño, este evento se limitó a unos pocos puntales y no comprometió la funcionalidad del andamio.

El análisis por microCT de los andamios permitió determinar la porosidad del andamio BLB(Figura 3).Mientras que el diseño de 600 pm dio lugar a una porosidad del 70%, el de 350 pm mostró una porosidad de aproximadamente 60%. Este resultado era de esperar, ya que el diseño de 350 pm tenía más material por unidad de volumen impreso debido a una menor interdistancia entre fibras.

(ii) Propiedades mecánicas

Las propiedades mecánicas del constructo se valoraron tanto respecto a la tracción como a la compresión, bajo carga cuasiestática y cíclica. El andamio impreso en 3D mostraba una curva fuerza-deformación típica del material polimérico compuesta por una región lineal inicial seguida de un punto de fluencia y una región de deformación plástica(Figura 4A).Como era de esperar, el andamio BLB de 350 pm fue el constructo más resistente, con un límite elástico de aproximadamente 65 N y una máxima resistencia de 70 N, mientras que el de 600 pm mostró un límite elástico y una máxima resistencia de 40 N y 50 N, respectivamente. Del mismo modo, el andamio BLB de 350 pm, menos poroso, era significativamente más rígido que el andamio BLB de 600 pm, con una rigidez de 130 N.mm-1 y 90 N.mm-1, respectivamente. LaTabla 1enumera los parámetros mecánicos medidos en la prueba de tracción cuasiestática y los compara con las propiedades del tejido nativo humano. Es evidente que la máxima resistencia de ambos constructos es sustancialmente inferior a la del complejo SLIL anatómico. Sin embargo, la carga fisiológica soportada por el ligamento es del orden de 20 N, que sigue estando dentro del rango elástico del andamio BLB.

Tabla 1:Resultados de las pruebas de tracción del andamio de 350 ym/600 ym en comparación con el SLIL dorsal nativo.

- Pruebas de compresión del compartimento óseo

También se investigó el comportamiento mecánico compresivo del compartimento óseo(Figura 5)y esto reveló que, a pesar de los cambios en la microestructura interna del andamio, no había diferencias significativas entre el módulo de compresión de los dos diseños (350 pm: 29,03 ± 3,35 MPa; 600 pm: 26,94 ± 2,37 MPa (p >0,05)).

(iii) Pruebas cíclicas

Con el fin de seguir valorando la idoneidad del andamio BLB para la regeneración funcional del ligamento escafolunar, se investigó el comportamiento mecánico en condiciones dinámicas. Los parámetros de prueba, una deformación del 5 y del 10% a 0,5 Hz, se seleccionaron porque representaban, hasta cierto punto, la extensión fisiológica que soporta el tejido nativo durante el movimiento normal. Para ambos diseños, 350 pm y 600 pm, los andamios mostraron un alto nivel de recuperación, como muestra laFigura 6mediante la superposición de la histéresis de deformación. No se observó ninguna acumulación de deformación plástica a lo largo de los 1000 ciclos del experimento. Curiosamente, los andamios resistieron cierto nivel de compresión al volver a la deformación cero. Esto indica que el polímero no se recuperó totalmente del estiramiento y, por lo tanto, el andamio soportó cierto nivel de fuerzas de compresión. En particular, el nivel de compresión no cambió para un diseño determinado independientemente de la tinción aplicada (5 o 10%), sin embargo el constructo más rígido (350 pm) experimentó un mayor nivel de compresión. Se trazó la evolución de la fuerza en el pico frente al número de ciclos y esto demostró que la fuerza en el pico disminuyó bruscamente tras el primer ciclo y permaneció relativamente constante a partir de entonces, lo que indica que se produjo una relajación inducida por la deformación en el constructo BLB(Figura 7).Del mismo modo, se evaluó la rigidez del constructo, que reveló un comportamiento diferencial entre el diseño de 350 pm y el de 600 pm(Figura 7). De hecho, el diseño de 350 pm, que es el constructo más rígido, pudo conservar mejor su rigidez, ya que el porcentaje de disminución de este parámetro fue menor tanto al 5% como al 10% de deformación(Tabla 2).Sin embargo, el constructo menos rígido (600 pm) mostró una disminución de la rigidez de aproximadamente 20-30% para ambas deformaciones. Esto indica que, desde un punto de vista biomecánico, el de 350 pm es potencialmente un mejor candidato para la reconstrucción del SLIL. También cabe destacar que, a pesar del reblandecimiento de los constructos, la fuerza en el pico se mantuvo en el rango de la carga fisiológica experimentada por el ligamento nativo.

Tabla 2:Porcentaje de disminución entre los ciclos 1 y 1000 de la fuerza en el pico y de la rigidez de cada constructo al 5% al 10% de deformación * denota si nificación estadística a p<0,05 entre diseños .;; ;;; (iv) Caracterización de la lámina celular;;Una ventaja pertinente de la utilización de la tecnología de láminas celulares es que la mayor duración del cultivo celular facilita la maduración y una mayor deposición de la ECM propia de la célula antes de la implantación. Por ello, la lámina celular utilizada en el presente estudio se caracterizó midiendo el contenido de ADN como indicador del número relativo de células y de la deposición de colágeno(Figura 8).El contenido total de ADN y la síntesis de colágeno de las láminas celulares bmMsC humanas cultivadas en un medio suplementado con ácido ascórbico fueron significativamente superiores a los de las células de control cultivadas en medios de expansión. La baja cantidad de ADN detectada en las muestras de control puede atribuirse a la disminución de la proliferación y al aumento de la muerte celular durante el periodo de cultivo de 21 días, donde el ADN se desecha con cada cambio de medio. La inmunofluorescencia del colágeno la, el colágeno III, la elastina, la tenascina C, y el agrecano mostró una distribución densa y homogénea de la matriz extracelular con una estructura fibular en los grupos AA(Figura 9). Esto no se observó en el grupo de control cultivado sin ácido ascórbico. Los controles del isotipo y del anticuerpo secundario sólo mostraron un fondo mínimo. ;;(v) Ensamblaje del constructo celularizado;;Se realizó un ensayo de células vivas y muertas para evaluar el impacto del método de ensamblaje, utilizando la recolección mecánica y el enrollado de las láminas celulares, sobre la viabilidad celular(Figura 10).;;LaFigura 10A-Cpresenta las imágenes de microscopía láser confocal que indican que la mayoría de las células estaban vivas (tinción verde). Mientras que las láminas celulares de control no recolectadas presentaron la mayor viabilidad celular, con más del 90% de células vivas, ésta sólo disminuyó ligeramente hasta aproximadamente el 80% de células vivas en las láminas celulares sembradas de ambos diseños. No hubo diferencias estadísticamente significativas en la viabilidad celular entre las láminas celulares agrupadas y la lámina celular plana colocada en la superficie dorsal del compartimento ligamentoso, y esto se observó independientemente del diseño. Hubo una diferencia estadísticamente significativa en la viabilidad celular entre las láminas celulares de los constructos y las láminas celulares de control (p<0,05)(Figura 10D).;(vi) SEM (constructo celularizado);La visualización SEM de los andamios celularizados ilustró una extensa matriz ECM en las láminas celulares(Figura 11).;(vii) Implantación ectópica;El rendimiento regenerativo del constructo BLB se valoró ectópicamente en ratas atímicas utilizando un modelo ectópico. Los constructos celularizados se implantaron seis horas después del ensamblaje, y la formación ósea junto con la regeneración del tejido blando se midieron a las 2 y 8 semanas después de la implantación. ;-Mineralización ósea;La evaluación de la formación ósea dentro del constructo se realizó mediante tomografía microcomputarizada. Esto reveló que mientras que no se detectó ningún hueso a las 2 semanas después de la implantación, se observó una cantidad significativa de tejido mineralizado a las 8 semanas después de la implantación(Figura 12).Como era de esperar, el hueso nuevo siguió el patrón de la estructura impresa en 3D, formándose en el espacio que rodeaba al filamento polimérico(Figura 12A)y, lo que es más importante, quedó restringido al compartimento óseo. Esto demostró que el método de suministro de BMP-2 no produjo osificación dentro del compartimento ligamentoso, lo que indica que se consiguió un alto nivel de compartimentación a pesar de la presencia de una interfase porosa. La cuantificación de la formación ósea a las 8 semanas tras la implantación reveló que no había diferencias estadísticamente significativas entre los dos diseños. Del mismo modo, la presencia de las láminas celulares no afectó al grado de mineralización(Figura 12C).;(viii) Histología;La histología mostró que ambos compartimentos presentaban altas cantidades de infiltración tisular ya a las 2 semanas tras la implantación, como era de esperar para este tipo de andamio y tamaño de poro. También se confirmó la compartimentación del andamio, ya que no se observaron rastros de formación ósea en el compartimento ligamentoso en el punto de tiempo posterior(Figura 13).;-Compartimento óseo;Hubo una ausencia de formación ósea a las 2 semanas después de la implantación, aunque se identificaron algunos signos tempranos de mineralización en algunas muestras cargadas con BMP-2. De hecho, se observaron regiones celulares densas enriquecidas en matriz de colágeno(Figura 13)características de las primeras fases de mineralización. La médula grasa también estaba dispersa en los compartimentos óseos. A las 8 semanas(Figura 14),había cierta formación ósea localizada en los compartimentos óseos en las muestras tratadas con BMP-2, lo que corroboraba los hallazgos de la microCT ;Sin embargo, no hubo diferencias estadísticamente significativas en la formación ósea entre los grupos BMP y BMP-CS o entre los diseños 350 um y 600 um en este punto de tiempo posterior(Figura 15).;-Compartimento ligamentoso;El compartimento ligamentoso se vascularizó rápidamente y permaneció vascularizado, como indica la presencia de estructuras vasculares con eritrocitos en las secciones H y E de las semanas 2 y 8(Figuras 13y14,indicadas con *). En ambos puntos de tiempo, la presencia de las láminas celulares tuvo un impacto significativo en la morfología del tejido regenerado, que era más denso, enriquecido en colágeno y más estructurado, como se muestra en lasFiguras 13y14. Esto se reflejó mejor en la presencia de fibras colágenas alineadas en las secciones medias del compartimento ligamentoso de los constructos celularizados. Esto puso de manifiesto las propiedades de guía de fibras de la arquitectura del andamio durante la regeneración tisular. En general, no hubo diferencias significativas en el grado de alineamiento de los ligamentos entre todos los grupos a las 2 semanas(Figura 15).Sin embargo, se observó un grado significativamente mayor de alineamiento del ligamento en los grupos de 350 y 600 pm de BMP-CS a las 8 semanas, en comparación con los otros grupos, aunque no hubo diferencias significativas entre los dos diseños que contenían láminas celulares(Figura 15).Esto indicaba que la capacidad de guía de fibras del andamio y la presencia de láminas celulares funcionaban de forma sinérgica para orientar el ligamento recién formado. En algunos casos, las fibras alineadas se insertaron en cada compartimento óseo, formando así una interfase continua similar a un elemento óseo-ligamentoso(Figura 16).

(ix) Propiedades físicas de los constructos de andamios

En lasFiguras 17y18se muestran imágenes de andamios impresos en 3D que comprenden capas individuales dispuestas en diferentes ángulos entre sí. Se llevaron a cabo diversas pruebas, incluyendo la de porosidad(Tabla 3), pruebas mecánicas (cuasiestática, tracción):

- rigidez(Tabla 4, Figura 19)

- máxima resistencia(Tabla 5, Figura 20)

- límite elástico(Tabla 6, Figura 21)

Tabla 4:Ri idez

Tabla 5:Máxima resistencia

Tabla 6:Límite elástico

- Discusión

La falta de soluciones clínicas fiables para la lesión del SLIL contribuye a una importante carga sanitaria. La escasez de estrategias de medicina regenerativa en este ámbito pone de manifiesto los retos que plantea un constructo tisular modificado genéticamente (TEC) para este tipo de reconstrucción, tanto a nivel biológico como biomecánico, con el fin de lograr una incorporación satisfactoria. El andamio desarrollado en el presente estudio se diseñó para aumentar la regeneración utilizando un componente celular con una matriz extracelular madura y, al mismo tiempo, abordar los requisitos biomecánicos mediante la fabricación de un constructo capaz de soportar cargas fisiológicas.

Este estudio presenta el desarrollo de un constructo multifásico BLB que combina la fabricación aditiva y la tecnología de láminas celulares para la reconstrucción del SLIL dorsal. La posible utilización de este andamio concuerda en gran medida con la práctica clínica, ya que los procedimientos de reconstrucción pretenden sustituir el segmento dorsal del SLIL, el principal contribuyente a la estabilidad del carpo. Además, el uso de un enfoque de ingeniería tisular como un sustituto de los injertos mitiga el problema de la morbilidad del sitio donante. La traducibilidad clínica y el mayor número de pacientes que podrían beneficiarse de este novedoso enfoque justifican la creación y utilización de un andamio BLB sintético.

A pesar de los varios estudios destinados a desarrollar TEC para otras aplicaciones ortopédicas, existe una escasez de aplicaciones de la modificación genética tisular para la regeneración de hueso, ligamento y tendón en la mano y la muñeca, lo que pone de relieve los retos presentes en esta área en particular. Los aloinjertos cadavéricos descelularizados del ligamento colateral de la articulación interfalángica proximal presentan limitaciones que incluyen la disponibilidad del injerto, las diferencias en las dimensiones anatómicas y la posible transmisión de enfermedades. Además, se desconoce el rendimiento regenerativo y la capacidad de recelularización de dichos aloinjertos.

La implantación de células dentro de una red de ECM madura, desarrollada durante el cultivoin vitro,puede sortear significativamente las limitaciones relacionadas con la infiltración y diferenciación de las células hospederas dentro del constructo. La tecnología de láminas celulares es una forma eficaz de suministrar células comprometidas hacia un linaje de diferenciación específico mediante un paso prolongado de maduraciónin vitroen el que la deposición de la matriz extracelular propia de la célula mejora la calidad del tejido regenerado. Este estudio mostró una remodelación significativa de la lámina celular en el periodo inicial de la implantación, presentando un pico de muerte celular a los 3 días después de la implantación concomitante con un aumento de la infiltración de neutrófilos seguido de una densificación del colágeno en una fase posterior, coherente con la maduración del tejido. Además, la presencia de células implantadas disminuyó gradualmente en el injerto tisular modificado, mientras que el número total de células aumentó a los 28 días después de la cirugía, lo que sugiere la infiltración de nuevas células en esta fase de cicatrización más avanzada. Esto indica que las células participaron activamente tanto en el reclutamiento de células hospederas como en la creación de un molde de e Cm adecuado, necesario para que se produjera la maduración y cicatrización del injerto. De forma similar, la implantación ectópica de nuestro constructo BLB reveló una colonización tisular completa ya a las 2 semanas de la implantación, a la que siguió posteriormente una maduración significativa de la lámina celular, como demostró el aumento del alineamiento tisular dentro del compartimento ligamentoso. Por lo tanto, es razonable plantear la hipótesis de que las láminas celulares ejercieron funciones similares, es decir, tanto quimiotácticas como de instrucción celular a través de los constituyentes de la ECM.

Además de la presencia de láminas celulares, el diseño del andamio demostró tener propiedades de guía de los tejidos, como demuestra el ligero aumento del alineamiento de los tejidos dentro del compartimento ligamentoso con respecto al espécimen sin láminas celulares. Como se muestra aquí, la arquitectura del andamio desempeña un papel importante a la hora de guiar la regeneración tisular. De hecho, el desarrollo de tecnologías avanzadas de fabricación de andamios ha permitido la fabricación de complejos andamios multifásicos en los que la organización porosa interna puede controlarse y adaptarse para abordar las necesidades específicas de cada tejido. Tradicionalmente, los compartimentos de estos andamios multifásicos se fabrican por separado y posteriormente se ensamblan utilizando diversas metodologías. Esto puede dar lugar a una cohesión débil en la interfase de los diferentes compartimentos y afectar a la capacidad del constructo multifásico para soportar cargas fisiológicas sin una fatiga biomecánica excesiva. En la presente estrategia, los compartimentos óseos y ligamentosos se crean mediante un proceso continuo de fabricación aditiva que permite la formación de una interfase porosa pero totalmente integrada. Esta estrategia garantiza que los filamentos poliméricos del compartimento ligamentoso queden totalmente anclados en las capas adyacentes del compartimento óseo, permitiendo un elevado número de puntos de fusión y proporcionando así una excelente estabilidad biomecánica. El mejor ejemplo de ello fue la capacidad del andamio BLB para soportar cargas repetitivas sin fatiga excesiva ni deslaminación en la interfase ósea-ligamentosa bajo ciclos mecánicos repetidos. Otro aspecto importante del diseño BLB tiene su origen en la creación de una interfase porosa entre los compartimentos resultante de la impresión continua, que tuvo un impacto significativo en la integración del ligamento en el compartimento óseo. En el ligamento nativo, las fibras de colágeno están orientadas transversalmente y se insertan tanto en el hueso semilunar como en el escafoides, lo que permite la transmisión de la fuerza durante la flexión y la torsión de la muñeca. Tal organización se observó parcialmente en nuestro constructo con la formación de tejido colágeno alineado en el eje largo del BLB e insertado en el compartimento óseo. Aunque no se observó ninguna inserción directa en el hueso recién formado debido al pequeño volumen de hueso formado, estos resultados ilustran el potencial del constructo BLB para guiar la regeneración tisular en el compartimento ligamentoso al tiempo que permite la comunicación cruzada entre los tejidos duros y blandos en la interfase del compartimento.

Esta investigación ha demostrado que es factible fabricar un andamio BLB multifásico mediante la fabricación aditiva para su posible aplicación clínica en la reconstrucción del SLIL dorsal tras una lesión. Se formaron tejidos óseos y ligamentosos en sus compartimentos correspondientes con propiedades estructurales y mecánicas similares a las del ligamento nativo en un modelo animal. El andamio artificial puede proporcionar una alternativa a las técnicas actuales para la reconstrucción de la inestabilidad escafolunar.

Ejemplo Dos:Implantaciónin vivoy caracterización de un novedoso andamio multifásico impreso en 3D en la rodilla de conejo para la reconstrucción del ligamento escafolunar

-Descripción general

(i) Objetivo

Implantación del andamio multifásico óseo-ligamentoso-óseo (BLB) (que imita el ligamento interóseo escafolunar dorsal (SLIL)) en conejos. El ligamento colateral medial (MCL) de conejo tiene propiedades anatómicas similares a las del SLIL dorsal y, por lo tanto, puede utilizarse como un modelo animal para probar este novedoso andamioin vivo.Este andamio facilitará la regeneración del tejido compuesto y podrá implantarse para su uso clínico.

(ii) Métodos

Se imprimieron en 3D con policaprolactona (PCL) de calidad médica andamios óseos-ligamentosos-óseos multifásicos modelados a partir del componente dorsal del SLIL. Éstas simulaban un constructo BLB con dos compartimentos óseos puenteados por fibras PCL alineadas que imitaban la arquitectura del ligamento nativo estudiado a partir de especímenes cadavéricos. Para la implantación quirúrgica, se extrajo el MCL nativo del conejo y se perforaron orificios en los puntos de inserción y origen del ligamento en el fémur y la tibia utilizando un trépano de 5 mm. Los compartimentos óseos del andamio se introdujeron a presión en las cavidades y se graparon en su lugar. La articulación de la rodilla del conejo se fijó en flexión mediante alambre de Kirschner de 1,4 mm durante 4 semanas (n= 9) antes de la movilización durante otras 4 semanas (n= 9). En total, se implantaron 18 muestras en 18 conejos y se recolectaron a las cuatro y ocho semanas. Se realizaron pruebas mecánicas de tracción (n=5 por grupo) y la caracterizaciónin vivode los constructos.

(iii) Resultados

Tras 4 y 8 semanasin vivo,el andamio permanecía intacto. Las pruebas mecánicas de los andamios BLB demostraron que eran capaces de soportar las fuerzas fisiológicas normales del SLIL. Tras 4 semanas de movilización de la articulación de la rodilla, los andamios mejoraron su resistencia. El estudioin vivoen conejos demostró que el andamio era biocompatible y presentaba una buena integración tisular y vascularización. A las 4 y 8 semanas, se observó formación ósea y remodelación del ligamento en los compartimentos correspondientes.

-Materiales y métodos

(i) Objetivo de traducción clínica

- Se creó un producto sólo de andamio que podía utilizarse para la reconstrucción (con propiedades biomecánicas adecuadas)

ii T l 7: D l l r i

(iii) Cuidados preoperatorios y anestesia

1. Los animales se anestesiaron mediante inyección intramuscular de Ketamina (35 mg/Kg) y Xilacina (5 mg/Kg) utilizando también una jeringa con una aguja de calibre 25. Los conejos se intubaron durante el procedimiento quirúrgico.

2. Se proporcionó cobertura antibiótica profiláctica antes de la cirugía mediante inyección subcutánea de Kefzol® (cefazolina sódica) 20 mg/kg y Gentamicina 5 mg/kg utilizando una jeringa con una aguja de calibre 25.

3. Se proporcionó analgesia preventiva (meloxicam, 1 mg/kg, SC).

4. Se administró un antimuscarínico (glicopirrolato, 0,004 mg/kg, IM) antes de la anestesia para reducir la salivación y el riesgo de bradicardia.

5. Se utilizó isofluorano inhalado al 0,5-3% para mantener la anestesia durante toda la intervención. En el estudio propuesto, se suministró oxígeno suplementario a los conejos anestesiados que respiraban espontáneamente a través de un cono nasal del tamaño adecuado y un circuito respiratorio de tipo roedor. A través de AAS (Advanced Anaesthesia Specialists), se adquirió un cono nasal adecuado para conejos, que se utilizó específicamente para este proyecto.

6. Se estableció un acceso venoso (angiocatéter 22 G) a través de las venas marginales de la oreja de los conejos para la administración de fluidos intravenosos durante la anestesia (en caso necesario). [2,5-5 mL de disolución salina/kg/h utilizando una bomba de jeringa]

7. Se colocó a los conejos en una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal durante la cirugía.

(iv) Preparación del andamio

El compartimento ligamentoso de los andamios de conejo es de 10 mm (elongación necesaria para salvar la articulación de la rodilla)(Figura 22).

Grabado del andamio (Para disminuir la hidrofobicidad del PCL)

1. Colocar los andamios en NaOH 5 M a 37 grados (baño maría) durante 30 minutos.

2. Enjuagar con H2O milliQ hasta que el agua penetre fácilmente en el andamio

3. Colocar los andamios en la placa agitadora y dejarlos en agua durante 5 minutos.

4. Desechar y repetir la operación hasta que el pH del agua sea ~7.

Esterilización del andamio (la noche anterior)

1. Incubar los andamios en etanol al 100% a temperatura ambiente durante 30 minutos.

2. Colocar los andamios en los pozos con los compartimentos óseos tocando el fondo (formando una U invertida) y colocar bajo la luz ultravioleta durante 1 hora.

3. Deje bajo la campana extractora para que se evapore durante la noche.

(v) Ensamblaje de andamios

- Lista de comprobación del equipo

- Gradilla para tubos Falcon (para colocar pinzas estériles)

- Pinzas estériles x2

-Andamios

- Kit de cultivo celular Hystem-C (Sigma-Aldrich)

- Pipetas (1000 uL, 200 uL, 10 uL) puntas

- Tubos Eppendorf estériles

- Bisturí estéril (para cortar las puntas)

- Rodillo/placa agitadora (en el laboratorio principal)

- Placas de 6 pozos (se utilizan para fabricar/transportar andamios cargados)

-Reconstitución del sistema

•HA = 670 uL de H2O desgasificado (~700 uL de exceso)

• Gelina = 670 uL de H2O desgasificado (~700 uL de exceso)

1. Los viales se descongelaron a temperatura ambiente.

2. Se añadieron 700 uL de H2O desgasificado al Hystem-HA (¿vial plateado?), se sometió a vórtice y se colocó en un rodillo durante 30 min.

3. Se añadieron 700 uL de H2O desgasificado a la gelina (vial azul), se sometió a vórtice y se colocó sobre un rodillo durante 30 min.

4. El contenido de gelina se añadió a HA. (NOTA: el gel es muy viscoso, cortar la punta de la pipeta al medir) 5. Se añadieron 500 uL de H2O desgasificado al vial del agente reticulante.

6. El vial se comeitó a vórtice y se colocó sobre un rodillo durante 5-10 minutos antes de su uso.

-Adición de geles al andamio

1. El andamio se retiró del medio y se colocó en un pozo seco.

2. Se utilizó una pipeta de 200 uL para aspirar el medio del compartimento óseo.

3. Se dispensaron 50 uL de gel de control en el compartimento ligamentoso.

a. 25 uL de la parte inferior parte superior

4. Se dispersaron 12,5 uL de gel de control en cada interfase ósea-ligamentosa.

5. Se dispensaron 40 uL de gel de control en una punta de pipeta cortada de 200 uL (la disolución es muy viscosa) y se utilizó un pipeteo de arriba abajo para empujar el gel hacia el compartimento óseo.

a. Sujetar un tapón óseo con una pinza y dispensar gel en la parte superior y en el lado del compartimento 2x b. Repetir para el otro lado

6. Colocar los andamios inclinados entre los pozos durante 5 minutos para que se reticulen(Figura 23)

7. Dejar reposar durante 20-30 minutos en posición horizontal sobre una placa de Petri (implante en ~45 min)(Figura 24)

(vi) Implantación in vivo (35 conejos, ~1-1,5 horas)- Desarrollo de una técnica quirúrgica novedosa

1. Con el conejo colocado en decúbito lateral, se rasuró cuidadosamente la cara medial de la articulación de la rodilla izquierda y se desinfectó con aplicación de disolución de betadine. También se afeitó la articulación de la rodilla derecha para evitar la contaminación por pelo en el campo estéril. La rodilla del conejo estaba en flexión completa para la implantación. Se colocó un paño estéril sobre el conejo y se realizó una incisión sobre el campo quirúrgico.

2. Se realizó una incisión longitudinal superficial (utilizando cuchillas 15-C) (en línea con la posición de la rótula) para reflejar la piel y exponer la articulación de la rodilla. Los vasos sanguíneos superficiales de las capas de tejido posteriores se cauterizaron con diatermia. A continuación, se practicó una incisión en el retináculo, se disecó de forma roma del músculo subyacente y se reflejó cuidadosamente.

3. Fijación con alambre de Kirschner

a. Se fijó un alambre Kirshner de 1,6 mm al conductor y se introdujo longitudinalmente desde la mitad de la tibia hasta el fémur para asegurar la articulación de la rodilla en flexión completa. (Consejo: sujetar el tejido blando para evitar que se enganche en el alambre). El alambre de Kirschner se dobló y enganchó sobre el fémur y se dobló en el extremo tibial para evitar que se saliera el alambre y restringir el movimiento de la articulación.

4. Se expuso el MCL nativo y se extrajo el extremo proximal del tubérculo medial del fémur con un bisturí. El MCL se dejó unido a la tibia para poder suturar el extremo proximal sobre el andamio y asegurarlo adicionalmente tras la implantación(Figura 25).

5. Se utilizó una fresa trefina de 5 mm (fresa Stryker de 0,635 cm (%”)) para perforar una cavidad central (Consejo: iniciar la fresa antes de entrar en contacto con el hueso, de lo contrario la fresa resbalará de la superficie) para encajar los compartimentos óseos del andamio en el tubérculo medial del fémur en el lugar de fijación del MCL. (NOTA: Asegurarse de que se utilizó el riego)

6. Se utilizó un molde de andamio (para marcar la ubicación de la depresión ósea distal (cerca de la fijación distal del MCL en la tibia). Se utilizó una fresa trefina de 5 mm para perforar la cavidad central de la tibia.

7. Se utilizaron fresas redondas de 1,8 mm fresas ovaladas de 4 mm para ensanchar superficialmente las hendiduras (afeitar el hueso adyacente a la articulación de la rodilla) para encajar a presión el andamio. Utilizar elevadores para proteger los meniscos de la articulación de la rodilla; se aseguró de que el alineamiento del andamio fuera el mismo que el del MCL nativo.

8. Los constructosin vivose implantaron en la articulación de la rodilla encajando a presión los compartimentos óseos en las cavidades perforadas. (Nota: Evitar la manipulación excesiva de los constructosin vivo)

9. Se taladraron agujeros para la colocación de las grapas (empezando con la broca más pequeña), profundidad = 10 mm.

10. Se introdujeron a presión 2 grapas de 8 mm (colocadas a lo largo de cada compartimento óseo) en los orificios perforados para fijar el andamio al fémur y la tibia.

11. Se tiró del retináculo para cubrir el andamio y se suturó con monofilamento Vicryl 4-0 utilizando una técnica interrumpida simple.

12. La piel se suturó con suturas monofilamento de Vicryl 4-0 utilizando una técnica de sutura continua/interrumpida simple.

13. Se lavó el área con disolución salina y se frotó con betadine para desinfectar la herida.

(vii) Retirada del alambre de Kirschner (4 semanas)

1. Se afeitará el vello sobre el sitio operado y se desinfectará la piel con un antiséptico.

2. Se realizó una pequeña incisión de 1 cm sobre el extremo femoral del alambre de Kirschner.

3. El alambre de Kirschner se cortó y retiró con unos alicates.

4. La incisión se suturó con suturas monofilamento Vicryl 4,0.

(viii) Cuidados después de la cirugía

1. Al finalizar la cirugía, para revertir los efectos de la xilacina y acelerar la recuperación de la anestesia, se administrará Antisedan® (clorhidrato de atipamezol) (0,5-1 mg/kg, IM) a cada conejo.

2. Los conejos se monitorearon después de la cirugía hasta que se recuperaron por completo; todas las observaciones se registraron en las hojas de monitoreo después de la cirugía (adjuntas). La recuperación completa se alcanzó cuando el conejo recuperó la consciencia, la conducción neuromuscular y los reflejos protectores de las vías respiratorias.

3. El conejo se monitoreó constantemente hasta que el animal volvió a un estado de alerta, receptivo y consciente, el reflejo nauseoso regresó y el conejo era ambulatorio. También se comprobaron constantemente la frecuencia cardíaca, la frecuencia y el ritmo respiratorios, el tiempo de relleno capilar (CRT) y el color de las mucosas de los conejos hasta que recuperaron los valores normales.

4. Se proporcionó analgesia multimodal después de la cirugía utilizando una combinación de opiáceos (buprenorfina, 0,05-0,1 mg/kg, q 8-10 h, durante un máximo de 48 horas), tramadol (25 mg/l, oral, durante 5 días después de la cirugía), meloxicam (1 mg/kg, oral, durante 2 días después de la cirugía).

5. Se administraron antibióticos postoperatorios durante los primeros 5 días después de la cirugía.

6. La cicatrización de la herida se supervisó mediante la inspección de cualquier signo de inflamación, tal como enrojecimiento o pus en el lugar de la cirugía durante los controles después de la cirugía y a largo plazo. Se controlaron los puntos para garantizar el cierre completo de la herida.

(ix) Eutanasia y recuperación de muestras (4 y 8 semanas)

1. 36 animales fueron sometidos a eutanasia mediante inyección intravenosa de pentobarbital sódico (150 mg/kg de Lethabarb, aguja 25 G) a las 4 y 8 semanas.

2. El alambre de Kirschner se retiró de las muestras.

3. Se extrajo la articulación de la rodilla (que contenía la muestra) y se fijó en paraformaldehído.

-Resultados

LaFigura 26muestra la mineralización de hueso nuevo en una articulación de rodilla de conejo (MCL extirpado y andamio óseo-ligamentoso-óseo multifásico implantado) bajo fijación con alambre de Kirschner. LaFigura 27demuestra además la regeneración/mineralización ósea en la articulación a las 4 y 8 semanas.

Las pruebas biomecánicas mostraron que al comparar los andamios a las 4 y 8 semanas, la resistencia mecánica en las pruebas de tracción aumentó significativamente a lo largo del periodo de tiempo.(Figuras 28y29).

Los mapas de deformación(Figura 30)ilustran que el MCL nativo tenía regiones mucho más concentradas de deformación aumentada. Esto puede compararse con el mapa de deformación del andamio de control, que distribuyó la fuerza sobre una superficie mayor. El punto de fallo del andamio de control se encuentra dentro del compartimento ligamentoso en comparación con el del MCL nativo en la interfase ósea-ligamentosa. Esto sugiere que la interfase ósea-ligamentosa del andamio es lo suficientemente fuerte como para soportar una fuerza considerable.

Los resultados de histología se muestran en laFigura 31.

A.Ligamento MCL nativo (“276 nativo”)

B.Arquitectura normal del MCL de conejo

C.Muestras de CONTROL 4 SEMANAS (“336 Ctrl”) Andamio completoin vivoque muestra fibras de ligamento intactas que atraviesan los compartimentos óseos

D.Mineralización ósea del compartimento óseo alrededor de los puntales PCL

E.Compartimento ligamentoso 2x

F.Compartimento ligamentoso 10x (algunas fibras alineadas)

G.8 SEMANAS (“241 Ctrl”) Andamio completoin vivoque muestra fibras de ligamento intactas que atraviesan los compartimentos óseos

H.Mayor mineralización ósea alrededor de los puntales PCL observada a 8 semanas en comparación con 4 semanas

I.Compartimento ligamentoso 2x

J.Compartimento ligamentoso 10x (más fibras alineadas)

Los resultados de la histología respaldan los datos de la microCT. Muestras:

- No tuvo formación de hueso ectópico a las 4 u 8 semanas

- Mostró más mineralización ósea en los compartimentos óseos observados alrededor de los puntales PCL a las 8 semanas en comparación con las 4 semanas

- Se observó un mayor alineamiento del ligamento en el compartimento ligamentoso a las 8 semanas en comparación con las 4 semanas

En un modelo de desafío, con fuerzas biomecánicas superiores a las que se encuentran en los movimientos normales de la muñeca, el andamio no falló a las 8 semanas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un andamio tisular sintético multifásico tridimensional que comprende un primer, segundo y tercer compartimentos, en donde:

la primera capa de fibras está alineada a lo largo de un primer eje,

la segunda capa de fibras está alineada a lo largo de un segundo eje, y

el segundo eje gira en un ángulo con respecto al primer eje.

2. El andamio tisular sintético multifásico tridimensional de la reivindicación 1, en donde el segundo eje gira en un ángulo de:

3. El andamio tisular sintético multifásico tridimensional de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en donde las múltiples capas de fibras comprenden una tercera capa alineada a lo largo de un tercer eje, y el tercer eje:

4. El andamio tisular sintético multifásico tridimensional de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde: - la morfología externa de cada uno de los compartimentos primero y tercero imita la de un hueso, y la morfología externa del segundo compartimento imita la de una serie de ligamentos situados entre el primer y el tercer compartimento y que los conectan; o

5. El andamio tisular sintético multifásico tridimensional de la reivindicación 4, en donde:

- la serie de ligamentos escafolunares son ligamentos escafolunares dorsales, y no son ligamentos escafolunares proximales o palmares; y/o

- el andamio comprende poros con una anchura máxima de entre 100 pm y 1000 pm, entre 100 pm y 800 pm, entre 100 pm y 600 pm, entre 200 pm y 600 pm, entre 200 pm y 500 pm, entre 300 pm y 600 pm, entre 300 pm y 500 pm, entre 350 pm y 600 pm, entre 350 pm y 500 pm, entre 400 pm y 600 pm, o entre 400 pm y 500 pm.

6. El andamio tisular sintético multifásico tridimensional de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende además células de mamífero, preferiblemente las células de mamífero se seleccionan del grupo que consiste en: células madre derivadas de ligamentos, células madre de cartílago, células madre mesenquimales, tales como células estromales de médula ósea, células estromales derivadas del tejido adiposo, tales como células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea, células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo, osteoblastos, células similares a los osteoblastos, células madre, células progenitoras, o cualquier combinación de las mismas; o preferiblemente en donde las células de mamífero son células madre mesenquimales humanas o células madre mesenquimales de médula ósea humanas.

7. El andamio tisular sintético multifásico tridimensional de la reivindicación 6, en donde las células de mamífero están dentro de una lámina celular envuelta y/o insertada en uno o más de los compartimentos.

8. El andamio tisular sintético multifásico tridimensional de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde uno o más de los compartimentos primero, segundo y/o tercero comprenden un material polimérico, seleccionado preferiblemente del grupo que consiste en: colágeno, quitosano, ácido hialurónico, alginato, gelatina, dimetacrilato de polietilenglicol (p Eg ), metacriloilo de gelatina, matrigel, fibrinógeno, agarosa y policaprolactona; o, preferiblemente, en donde el material polimérico es policaprolactona o poliuretano.

9. El andamio tisular sintético multifásico tridimensional de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el andamio tisular se produce utilizando una bioimpresora tridimensional (3D) para depositar continuamente el material polimérico sobre una plataforma hasta que el andamio tisular se produce en su totalidad.

10. Un método para producir el andamio tisular sintético multifásico tridimensional de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende el uso de una bioimpresora tridimensional (3D) para depositar continuamente material polimérico sobre una plataforma hasta que el andamio tisular se produce en su totalidad.

11. Un andamio tisular sintético tridimensional de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para su uso en el tratamiento de un ligamento lesionado en un sujeto.

12. El andamio tisular sintético multifásico tridimensional para su uso de acuerdo con la reivindicación 11, en donde: - el ligamento es un ligamento interóseo escafolunar o un equivalente mamífero del mismo; y/o

- el sujeto es un ser humano.