ES3041296T3 - Vectors for transforming mycoplasma hyopneumoniae, transformed m.hyopneumoniae strains, and use thereof - Google Patents

Vectors for transforming mycoplasma hyopneumoniae, transformed m.hyopneumoniae strains, and use thereof

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ES3041296T3
ES3041296T3 ES19174710T ES19174710T ES3041296T3 ES 3041296 T3 ES3041296 T3 ES 3041296T3 ES 19174710 T ES19174710 T ES 19174710T ES 19174710 T ES19174710 T ES 19174710T ES 3041296 T3 ES3041296 T3 ES 3041296T3
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Giralt Jordi Montane
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Abstract

La presente invención se refiere a cepas mutantes de Mycoplasma hyopneumoniae y a un método para su preparación. También se refiere a vectores portadores utilizados en dicho método, a composiciones vacunales y a kits de vacunación que comprenden dichas composiciones contra la neumonía enzoótica porcina y otras enfermedades porcinas. Asimismo, se refiere al uso de M. hyopneumoniae como huésped para la expresión de proteínas recombinantes y otras secuencias de ADN de interés. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Vectores para la transformación deMycoplasma hyopneumoniae,cepas deM. hyopneumoniae transformadas,y uso de las mismas
Campo técnico
La presente invención forma parte del campo del desarrollo de métodos y herramientas para la manipulación genética deMycoplasma hyopneumoniaecon el fin de preparar cepas mutantes transformadas de dicha especie bacteriana que puedan usarse como vacunas contra enfermedades porcinas.
Técnica anterior
En el ámbito veterinario, las enfermedades causadas por microorganismos tales como bacterias, virus o parásitos, causan graves pérdidas económicas debido a la muerte de los animales, o a un bajo rendimiento en los procesos de crecimiento y engorde.
Una de las formas de proteger a los animales contra futuras infecciones consiste en la administración de vacunas para generar una respuesta inmunológica.
Las vacunas basadas en microorganismos inactivados o microorganismos vivos atenuados han sido hasta ahora la principal base inmunológica para el control y la erradicación de la mayoría de las enfermedades infecciosas.
Sin embargo, a pesar de los buenos resultados obtenidos con este tipo de vacunas, presentan problemas tales como la posible reversión a la virulencia de las vacunas atenuadas, la imposibilidad de diferenciar los animales vacunados de los infectados o la dificultad de conseguir una vacuna eficaz para todas las enfermedades.
El desarrollo de herramientas para la manipulación genética de microorganismos ha permitido normalmente preparar vacunas más eficaces que las mencionadas anteriormente, talas como, por ejemplo, vacunas de subunidades, vacunas vivas o inactivadas modificadas genéticamente, vacunas con marcadores (DIVA,Differentiating Infected from Vaccinated Animals",diferenciación entre animales infectados y vacunados) o vacunas de ADN.
No obstante, no todos los microorganismos causantes de enfermedades en el ámbito veterinario pueden manipularse genéticamente con facilidad.
Los micoplasmas figuran entre los microorganismos difíciles de manipular a nivel genético.
Los micoplasmas pertenecen a la claseMollicutes,un amplio grupo de microorganismos estrechamente relacionados con las bacterias Gram positivas.
Los micoplasmas tienen genomas circulares pequeños con tamaños generalmente inferiores a 1000 kb, con un número de genes que varía entre 500 y 1000.
Este grupo de bacterias también carece de muchas de las vías metabólicas que suelen encontrarse en todos los organismos vivos, probablemente como resultado de su adaptación a un estilo de vida parasitario. Por consiguiente, los micoplasmas son microorganismos exigentes muy difíciles de cultivar tanto en medio líquido como sólido.
Los micoplasmas incluyenMycoplasma hyopneumoniae(en lo sucesivo en el presente documento,"Mhyo"),que es una bacteria responsable de enormes pérdidas económicas en la industria porcina. Aunque la mayoría de las infecciones por Mhyo no son graves, los animales infectados porMhyoestán predispuestos a infecciones secundarias del sistema respiratorio que pueden reducir la tasa diaria de aumento de peso o incluso causar la muerte.
Mhyoes el agente causante de la neumonía enzoótica porcina (en lo sucesivo en el presente documento "NEP"), una enfermedad respiratoria crónica muy extendida en todo el mundo. La enfermedad se caracteriza por una elevada morbilidad y una baja mortalidad. La prevalencia de la NEP es particularmente elevada en los cerdos de engorde y la gravedad de los signos clínicos depende de la cepa deMhyocausante de la infección, de las condiciones ambientales, del estado de salud de los animales y de la aparición de infecciones secundarias debidas a otros agentes patógenos. En algunos casos, la NEP se presenta de una manera subclínica sin signos clínicos evidentes. En los casos en que no hay complicaciones, los animales muestran una tos crónica, no productiva asociada a una tasa diaria de aumento de peso reducida, con la consiguiente reducción de la eficiencia de conversión alimenticia. Cuando se producen infecciones secundarias, los signos clínicos se hacen más evidentes, presentando síntomas respiratorios agudos y pirexia, que puede incluso causar la muerte del animal. No obstante, incluso en ausencia de complicaciones debidas a infecciones secundarias, la NEP provoca graves pérdidas económicas debido a los bajos índices de conversión de los piensos y a los costes derivados del uso de la medicación. Una vez que la enfermedad se establece en una granja, se transmite horizontalmente a otros animales por medio de los aerosoles generados por la tos y verticalmente desde las hembras reproductoras a los lechones.
Además del cultivo problemático, la manipulación genética de los micoplasmas se ve dificultada por las escasas herramientas disponibles.
Las dificultades de la manipulación genética de los micoplasmas, en particular deMhyo,se han descrito en el estado de la técnica.
La secuencia del genoma de la cepa 232 deMhyose describe en el artículo de Minionet al., The Genome Sequence of Mycoplasma hyopneumoniae Strain 232, the Agent of Swine Mycoplasmosis,J. Bacteriol., 2004, 186(21), 7123 7133. El autor afirma queMhyoes un microorganismo exigente y que faltan herramientas y protocolos para transformarlo.
En el contexto del estudio de las modificaciones que se producen enMhyocuando se somete a un cambio de temperatura, en el artículo de Madsenet al., Transcriptional Profiling of Mycoplasma hyopneumoniae during Heat Shock Using Microarrays,Infect. Immun., 2006, 74(1), 160-166, los autores afirman que, a pesar de la enorme importancia deMhyoen la producción porcina, se han realizado pocos estudios sobre los posibles mecanismos moleculares de su patogenia en respuesta a cambios ambientales, y que esto se debe probablemente a sus dificultades de crecimiento y al hecho de que se trata de un microorganismo resistente a la manipulación genética.
En el artículo de Pichet al., Comparative analysis of antibiotic resistance marker genes in Mycoplasma genitalium: application to studies of the minimal gene complement,Microbiology, 2006, 152, 519-527, se describe la modificación genética deMycoplasma genitaliumcon diferentes plásmidos mediante electroporación, pero no se encuentra ninguna referencia aMhyo.
La disertación de B. Machado,Construgao de vetor oriC de Mycoplasma hyopneumoniae - uma ferramenta para estudos geneticos do agente da Pneumonia Enzoótica Suina,Porto Alegre, 2007, describe la transformación de la cepaMhyo7448 con el plásmido replicativo pOSTM mediante electroporación. Para construir este plásmido, la regiónoriCdeMhyoy el casete de expresión que contiene el gen de resistencia a la tetraciclina(tetM),bajo el control del gen promotor deSpiroplasma citri,se introdujeron en el vector pUC18. Aunque la parte experimental muestra mediante PCR, la incorporación del plásmido y la resistencia a antibióticos conferida por dicho vector, en este trabajo no se proporcionan resultados concluyentes que demuestren que el plásmido pOSTM se incorporó realmente de forma estable enMhyo,ya que no se describe el aislamiento de los plásmidos desde las cepas transformantes resistentes a la tetraciclina. Además, también se describe que las cepas transformantes tenían dificultades para crecer después de dos pases en un medio selectivo. En consecuencia, estos resultados muestran que, utilizando la transformación divulgada en este documento, no sería posible introducir de forma estable una secuencia de ADN exógena en una cepa deMhyo,ya que no puede recuperarse tras múltiples generaciones de la bacteria transformada.
A pesar de esta divulgación en 2007, no se ha demostrado que el problema de la modificación genética deMhyose resolviera en estudios posteriores.
En el informe de M. Calcutt sobre el proyecto tituladoDevelopment of genetic manipulation protocols for Mycoplasma hyopneumoniae clade of animal pathogens,Universidad de Missouri, correspondiente al periodo comprendido entre el 01.10.2009 y el 30.09.2010 (descargado de la página web http://www.reeis.usda.gov/web/crisprojectpages/220630.html, recuperado el 16.02.2012), se describe que los objetivos del proyecto es desarrollar metodología para la manipulación genética deMhyo.También se describe que estaba previsto electrotransformarMhyocon plásmidos que incluyen el gen de resistencia a la tetraciclina. Sin embargo, los resultados de los análisis de ADN realizados en las bacterias transformantes no fueron positivos y llevaron a los autores a considerar que la transformación no se había producido. Tampoco se describieron los resultados sobre la expresión de este gen de resistencia.
En el artículo de Browninget al., Developing attenuated vaccines to control mycoplasmoses,Microbiology Australia, 2011, 121-122, se describe el desarrollo de vacunas que contienen cepas deMycoplasmatermosensibles que no crecen a la temperatura corporal del hospedador. Dichas cepas se obtuvieron por mutación química a partir de cepas de referencia(wild type).Los autores afirman que la manipulación genética dirigida enMhyoyM. synoviaesigue siendo un reto y que no se había logrado en dichas especies. En la solicitud de patente internacional WO 2010/132932, del mismo grupo de trabajo, también se hace referencia a cepas deMhyotermosensibles.
En el artículo de Maboniet al., Mycoplasma hyopneumoniae Transcription Unit Organization: Genome Survey and Prediction,DNA Research, 2011, 18, 413-422, se realizó una revisión comparativa del genoma de tres cepas deMhyo(7448, J y 232) con el fin de identificar marcos abiertos de lectura. Los autores afirman que, a pesar del desarrollo de la transformación artificial y otras herramientas genéticas para algunas especies deMycoplasma,estas metodologías aún no se han desarrollado paraMhyo.
En el documento WO 2011/143706 A1 se hace referencia a una cepa deM. hyopneumoniaeatenuada y temosensible (ts 19). Entre las condiciones atenuantes descritas, se menciona la transformación de bacterias con un elemento genético insertable en el genoma, tal como un transposón.
Por lo tanto, en el estado de la técnica no se han descrito métodos para la transformación deMhyo,aunque ha habido varios intentos infructuosos de realizar dicha transformación.
Por lo tanto, sigue siendo necesario proporcionar un método para preparar cepas mutantes deMhyomediante herramientas de genomodificación, proporcionando así cepas mutantes adecuadas para preparar composiciones vacunales contra la neumonía enzoótica porcina y, finalmente junto con otros componentes antigénicos, para la prevención y/o el tratamiento de otras enfermedades porcinas.
Divulgación de la invención
El objeto de la presente invención es un método para preparar cepas mutantes deMhyo.
Otro objeto de la invención es un vector transposónico utilizado en dicho método.
Otro objeto de la invención es el uso de dicho vector para preparar cepas mutantes deMhyo.
Otro objeto de la invención es una cepa mutante deMhyoobtenible por dicho método.
Otro objeto de la invención es una cepa mutante deMhyoque comprende una secuencia de ADN exógena. Otro objeto de la invención es una cepa mutante deMhyoque comprende el vector de la invención.
Otro objeto de la invención es una cepa deMhyotransformada con el vector de la invención.
Otro objeto de la invención es el uso de dicha cepa mutante como hospedador de expresión.
Otro objeto de la invención es una vacuna que comprende dicha cepa mutante.
Otro objeto de la invención es el uso de la cepa mutante deMhyode la invención para preparar una vacuna.
Otro objeto de la invención es un kit de vacunación que comprende dicha cepa mutante.
Los autores de la presente invención han desarrollado un método para preparar cepas mutantes deMhyomediante el cual, sorprendentemente, pueden introducirse de forma estable secuencias de ADN exógenas en el genoma de una cepa deMhyoy se expresa el contenido de dichas secuencias.
Por la expresión "una secuencia de ADN exógena introducida de forma estable en el genoma de una cepa de Mhyo" se entiende que dicha secuencia no se pierde a lo largo de las sucesivas generaciones de la bacteria que ha sido transformada con dicha secuencia exógena. Esta estabilidad significa que la secuencia de ADN exógena puede replicarse dentro de la bacteria transformada y en sus descendientes, y que puede recuperarse tras múltiples generaciones de la bacteria transformada.
Con el método desarrollado, se abre una puerta para modificar cepas deMhyopor primera vez mediante herramientas de genomodificación.
Con dicho método pueden prepararse cepas mutantes deMhyoque incluyan secuencias de ADN exógenas. Dichas cepas mutantes pueden tener características diferentes tales como, por ejemplo, que expresen una proteína específica, o que tengan un menor grado de virulencia con respecto a la cepa progenitora de referencia.
Dichas cepas mutantes pueden usarse como vacunas, por ejemplo, vacunas vivas atenuadas, vacunas inactivadas, vacunas marcadoras, que permiten diferenciar los animales vacunados de los infectados, o vacunas polivalentes contra la neumonía enzoótica porcina y otra enfermedad adicional que puede afectar a los cerdos, tal como las infecciones causadas por el circovirus porcino de tipo 2 (PCV2,porcine circovirus type2), por ejemplo.
El proceso de la invención permitió por primera vez modificar genéticamenteMhyoen forma estable, y con ello se ha conseguido, entre otras cosas, el uso de estas cepas transformadas como vector de expresión de secuencias de ADN exógenas como, por ejemplo, secuencias de nucleótidos que codifican proteínas de interés terapéutico o preventivo tales como la secuencia de la cápside del PCV2, entre otras. Mediante la tecnología divulgada en la presente invención, se han diseñado y preparado nuevas vacunas candidatas, que también son polivalentes, porque pueden usarse para impedir diferentes enfermedades administrando una única cepa modificada mediante el proceso de la invención.
En la presente descripción y en las reivindicaciones, las formas en singular "un", "uno(a)" y "el/la" incluyen referencias en plural salvo que el contexto indique claramente lo contrario.
Del mismo modo, en el contexto de la invención, el término "secuencia" se refiere a una secuencia de ADN, excepto cuando se indica explícitamente que se refiere a una secuencia de aminoácidos.
Descripción de los dibujos
Las figuras 1, 2, 4, 9, 10 y 11 no son de acuerdo con la invención y se presentan únicamente a título ilustrativo. Figura 1
La figura 1 muestra un diagrama de los plásmidos replicativos utilizados para modificar genéticamenteMhyoy lograr la producción de proteínas recombinantes o de transcritos antisentido. Los promotores, los genes y los sitios de restricción enzimáticos utilizados para las operaciones de clonación se indican con flechas.
El plásmido pOG contiene los elementos necesarios para que este vector pueda replicarse enMhyoa la vez que permite la selección de las células portadoras de dicho plásmido. Este plásmido tiene la regiónoriCdeMhyo(bases 2096 a 4043) y el gen marcador de resistencia a la gentamicina(aac,bases 1 a 1816) bajo el control del promotor del gen de la proteínaMhyoP97(pp97,bases 1823 a 2087).
El plásmido pOGCRE procede directamente del plásmido pOG y contiene además el gencredel fago P1 (bases 1 a 1032) bajo el control del promotorpp97(bases 1039-1303).
A diferencia de los plásmidos anteriores, el plásmido pOGA159 contiene el gen de resistencia a la tetraciclina(tetM,bases 945 a 2883) bajo el control del promotorpp97(bases 674-938). La regiónoriCdeMhyoestá situada entre las bases 2901-4848. Por último, contiene un segmento del genomaMhyocorrespondiente al extremo 5' del gentlyA (a159,bases 4855 a 4980) orientado inversamente y bajo el control del promotorpp97(bases 4996-5260).
Figura 2
La figura 2 muestra un diagrama de los plásmidos replicativos utilizados para modificar genéticamenteMhyoy lograr la producción de diferentes versiones recombinantes de la proteína de la cápside del virus PCV2. Los promotores, los genes y los sitios de restricción enzimáticos utilizados para las operaciones de clonación se indican con flechas. El plásmido pOGC contiene exactamente los mismos elementos que el plásmido pOG (Figura 1) y además incluye una copia adicional del promotorpp97(bases 7654-7918) que controla la expresión del gen sintético que codifica la cápside del circovirus incluido en el ORF2V2 (bases 6946-7647) de la cápside del virus PCV2. Este plásmido permite la expresión de la proteína de la cápside del PCV2 en el citoplasma de la célula portadora.
El plásmido pOGL contiene exactamente los mismos elementos que el plásmido pOG (Figura 1) y además incluye la secuencia promotora del gen de la proteína P46 deMhyo (pp46:bases 8918-9181) que controla la expresión de una fusión del gen de la proteína de la cápside del virus PCV2 (ORF2) dentro del gen que codifica la proteína de membrana P46 deMhyo(bases 8642-8917 y 6946-7930). Este plásmido produce una proteína híbrida que se caracteriza por que los aminoácidos 1 a 92 son del extremo aminoterminal de la proteína P46, los aminoácidos 95 a 327 corresponden a la proteína de la cápside del virus PCV2 y los aminoácidos 330-656 son del extremo carboxiterminal de la proteína P46 deMhyo.
El plásmido pOGT contiene exactamente los mismos elementos que el plásmido pOG (Figura 1) y además incluye la secuencia promotorapp46(bases 8905- 9169) que controla la expresión de una fusión del gen de la proteína de la cápside del virus PCV2 (ORF2) en el extremo 3' del gen que codifica la proteína de membrana P46 deMhyo(bases 7648-8904). Este plásmido produce una proteína híbrida que se caracteriza por que los aminoácidos 1 a 419 son de la proteína P46 y los aminoácidos 420 a 652 corresponden a la proteína de la cápside del virus PCV2, versión ORF2 (bases 6946-7647).
Figura 3
La figura 3 muestra un diagrama de los plásmidos portadores de minitransposones utilizados para obtener inserciones en el cromosoma deMhyo.Los promotores, los genes y las dianas de las enzimas de restricción utilizados para la construcción de los plásmidos y otras secuencias de ADN importantes se indican con flechas.
El plásmido pTC3 contiene los elementos necesarios para obtener cepas deMhyoportadoras de inserciones transposónicas. Este plásmido se ha construido sobre la secuencia troncal del plásmido pMTn4001. El primer elemento de este plásmido es el promotorpp97(bases 7-271) que controla la expresión de la transposasa del plásmido pMTn4001 (bases 284-1261). Las bases 1461-1486 y 3774-3799 corresponden a las repeticiones invertidas y se indican en el diagrama como IRI(Inverted Repeat Internal,Repetición Invertida Interna) e IRO(Inverted Repeat Outer,Repetición Invertida Externa), respectivamente. El último elemento de este plásmido corresponde al gen marcador de resistencia a la tetraciclina (bases 1761-3692), que también está bajo el control del promotor de la proteína P97 deMhyo(1502-1766).
El plásmido pTC366 procede directamente del plásmido pTC3 y contiene las secuenciasIox66(sustrato de la recombinasa Cre, bases 1485-1518 y 3762-3795) flanqueando el gen marcador de resistencia a la tetraciclinaTetM(bases 1791-3722).
El plásmido pTC3C procede directamente del plásmido pTC366 y contiene el gen que codifica la proteína de la cápside del virus PCV2ORF2V2(bases 4078- 4779) del virus PCV2, bajo el control del promotorpp97(bases 3808-4071). Este plásmido promueve la síntesis de la proteína recombinante correspondiente a la proteína de la cápside del PCV2 en el citoplasma de la cepa deMhyotransformada por dicho plásmido.
El plásmido pTC3L procede directamente del plásmido pTC366 y contiene una fusión del gen de la proteína de la cápside del virus PCV2(ORF2)dentro del gen que codifica la proteína de membrana P46 deMhyo(bases 4347-5045 y 4066-4340 y 5052-6036, respectivamente), bajo el control del promotorpp46(bases 3801-4065). Este plásmido promueve la síntesis de una proteína híbrida, que se caracteriza por que los aminoácidos 1 a 92 son del extremo aminoterminal de la proteína P46, los aminoácidos 95 a 327 corresponden a la proteína de la cápside del virus PCV2 y los aminoácidos 330-656 son del extremo carboxiterminal de la proteína P46 deMhyo.
El plásmido pTC3T procede directamente del plásmido pTC366 y contiene una fusión entre el gen de la proteína de la cápside del virus PCV2(ORF2)y el gen que codifica la proteína de membrana P46 deMhyo(bases 5322-6031 y 4065 5321, respectivamente), bajo el control del promotor del gen que codifica la proteína P46 deMhyo(bases 3801-4065). Este plásmido promueve la síntesis de una proteína híbrida que se caracteriza porque los aminoácidos 1 a 419 son de la proteína P46 y los aminoácidos 420 a 652 corresponden a la proteína de la cápside del virus PCV2.
Figura 4
La figura 4 muestra la estabilidad de los plásmidos replicativos y su uso en la producción de proteínas recombinantes.
Esta figura está dividida en 3 paneles. El panel A muestra una electroforesis en gel de agarosa al 0,7 % realizada a una tensión de 6 V/cm durante 2 horas. El marcador de peso molecular 1kb plus ladder (Invitrogen) se encuentra en el carril M. El plásmido pOG, aislado deE. coliXL1-blue y digerido con la enzima de restricción Seal, se encuentra en el carril 1. En el carril 2 se encuentra una extracción de ADN total de la cepa 232POGc9 deMhyodigerida con la enzima de restricciónScal. Las bandas esperadas del plásmido pOG digerido con la enzima de restricciónScal son de 3564 pb, 2225 pb y 1143 pb (Figura 4, Panel A). Mediante la comparación con el marcador de peso molecular y las bandas del plásmido aislado deE. coliXL1-blue, se confirma que el plásmido pOG se propaga de forma estable en la cepa 232POGc9. A la izquierda de la figura se indican las longitudes de los distintos fragmentos relevantes del marcador de ADN.
El panel B muestra una transferencia de Western de una electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante con muestras de proteínas de diferentes cepas deMhyodetectadas mediante un anticuerpo policlonal específico de la recombinasa Cre del bacteriófago P1. El carril 1 muestra un extracto de proteína de la cepa 232POGCREc1 donde se observa la banda esperada de 39 kDa. El carril 2 muestra un extracto de la cepa 232 donde no se observan bandas y el marcador de peso molecular Precision Plus Protein Dual Xtra (Biorad) se encuentra en el carril M. Los pesos moleculares relevantes se muestran en kDa a la derecha de la figura. Estos resultados indican que el plásmido pOGCRE puede producir la proteína Cre una vez transformado en la cepa 232 deMhyo.
El panel C muestra una electroforesis en gel de agarosa en la que se utilizaron muestras de ADN de la cepa progenitora 6314 deMhyo(carril 1) y de la cepa 6314pOGAc4, que es producto de la transformación de la cepa 6314 con el plásmido pOGA159 (carril 2). Las flechas indican la posición de las dos conformaciones adoptadas por el plásmido pOGA159 en la cepa mutante transformada deMhyo.
Figura 5
La figura 5 muestra la recuperación de cepas deMhyoportadoras de inserciones transposónicas y la utilidad de las mismas en la producción de proteínas recombinantes.
Esta figura está dividida en 3 paneles. El panel A (carriles M y 1 a 4) muestra una electroforesis en gel de agarosa al 0,7 % realizada a una tensión de 6 V/cm durante 2 horas, mientras que la parte derecha del panel A (carriles 5 a 8) muestra una transferencia de Southern de este gel sobre una membrana de nailon. Las bandas observadas en la transferencia de Southern corresponden a las bandas reconocidas por una sonda diseñada contra la secuenciaTetMbajo el control del promotor de la proteína P97 deMhyo.El marcador de peso molecular 1kb Plus Ladder (Invitrogen) se encuentra en el carril M. Los carriles 1 y 5 corresponden a una extracción de ADN total de la cepa 232TC3hlyC digerida con la enzima de restricción EcoRI. Los carriles 2 y 6 corresponden a una extracción de ADN total de la cepa 232 digerida con la enzima de restricción EcoRI. Los carriles 3 y 7 corresponden a una extracción de ADN total de la cepa 232TC3hlyC digerida con la enzima de restricción EcoRV. Los carriles 4 y 8 corresponden a una extracción de a Dn total de la cepa 232 digerida con EcoRV. La banda de 6,3 kb del carril 5 y la banda de 2 kb del carril 7 demuestran la presencia del transposón que contiene la resistenciaTetMbajo el promotor de la proteína P97 en el genoma deMhyomientras que la ausencia de estas bandas en los carriles 6 y 8 corroboran estos resultados.
El panel B muestra los resultados de un ensayo ELISA realizado con el kit INGEZIM PCV DAS (Ingenasa, España) con diferentes muestras de proteínas procedentes deMhyo.La dilución utilizada en cada uno de los ensayos se indica en la columna izquierda de la tabla, mientras que la cepa analizada se muestra en la fila superior. Los resultados numéricos son los valores de las lecturas de absorbancia a una longitud de onda de 450 nm normalizados por la cantidad de proteína introducida en cada pocillo. Todas las cepas deMhyotransformadas con los vectores pTC3C, pTC3L y pTC3T, presentan una absorbancia claramente superior a la del control negativo, lo que indica que la expresión de la proteína recombinante de la cápside del PCV2 tiene lugar en cada una de estas cepas.
El panel C muestra una transferencia de Western de una electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante con muestras de proteínas de diferentes cepas deMhyodetectadas mediante un anticuerpo monoclonal específico de la proteína de la cápside del PCV2. El carril 1 contiene un extracto de proteínas de la cepa 232Cc6 donde se observa la banda esperada de 28 kDa. El carril 2 contiene un extracto de proteínas de la cepa 232 donde no se observan bandas. El carril 3 contiene una muestra de proteínas de la cápside del PCV2 suministrada como control positivo en el kit INGEZIM PCV DAS (Ingenasa, España) donde se observa la banda esperada de 28 kDa. El carril 4 contiene un extracto de proteínas de la cepa 6314 donde no se observan bandas, mientras que el extracto de proteínas de la cepa 6314Cc1 se encuentra en el carril 5, donde se observa la banda esperada de 28 kDa, aunque la intensidad de esta banda es más débil que la observada en los carriles 1 y 3. Estos resultados indican que tanto en la cepa 6314 como en la 232, la inserción del transposón presente en el plásmido pTC3C en el genoma deMhyo,induce la expresión de la proteína de la cápside del PCV2, codificada porORF2v2.
Figura 6
La figura 6 muestra la respuesta serológica aMhyoobtenida con las vacunas experimentales, grupos 1 a 4 del Ejemplo 7.1. Los grupos 5 y 6 corresponden, respectivamente, al grupo de control no vacunado pero infectado y al grupo de control no vacunado y no infectado.
El día del estudio en que se realizó el análisis, se representa en el eje de abscisas (x), y la relación M/P (muestra/positivo) expresada como el % medido por ELISA, se representa en el eje de ordenadas (y) como indicador de la respuesta de anticuerpos IgG contraMhyo.
El asterisco indica que la diferencia con respecto al grupo de control no vacunado pero infectado es estadísticamente significativa (p<0,05, según la prueba de la U de Mann-Whitney).
Figura 7
La figura 7 muestra la respuesta serológica al circovirus porcino (PCV2) obtenida con las vacunas experimentales, grupos 1 a 4 del Ejemplo 7.1. Los grupos 5 y 6 corresponden, respectivamente, al grupo de control no vacunado pero infectado y al grupo de control no vacunado y no infectado.
El día del estudio en que se realizó el análisis, se representa en el eje de abscisas (x), y la relación M/P (muestra/positivo) expresada como el % medido por ELISA, se representa en el eje de ordenadas (y) como indicador de la respuesta de anticuerpos IgG contra el PCV2.
El asterisco indica que la diferencia con respecto al grupo de control no vacunado pero infectado es estadísticamente significativa (p<0,05, según la prueba ANOVa unidireccional).
Figura 8
La figura 8 muestra la carga vírica en suero de los grupos de tratamiento 1 a 4, y de los grupos de control 5 y 6 del Ejemplo 7.1.
El día del estudio en que se realizó el análisis, se representa en el eje de abscisas (x), y el log-10 de la carga vírica en suero del circovirus porcino de tipo 2 (PCV2) expresada en copias/ml, se representa en el eje de ordenadas (y). El asterisco indica que la diferencia con respecto al grupo de control (no vacunado e infectado) es estadísticamente significativa (p<0,05, según la prueba de la U de Mann-Whitney).
Figura 9
La Figura 9 muestra la respuesta serológica a la infección porMhyosegún el Ejemplo 8.2. El grupo 1 corresponde a los animales infectados con la cepa mutante del Ejemplo 4.8, el grupo 2 corresponde a los animales infectados con la cepa progenitora de referencia y el grupo 3 es el grupo de control no infectado.
El día del estudio en que se realizó el análisis, se representa en el eje de abscisas (x), y la relación M/P (muestra/positivo) expresada como el%medido por ELISA, se representa en el eje de ordenadas (y), como indicador de la respuesta de anticuerpos IgG contraMhyo.
El asterisco indica que la diferencia con respecto al grupo infectado con la cepa progenitora de referencia es estadísticamente significativa (p<0,05, según la prueba ANOVA unidireccional).
Figura 10
La figura 10 muestra el porcentaje de animales positivos a PCP(Peribronchiolar Cuffing Pneumonía,neumonía con infiltrado peribronquiolar) porMhyodel Ejemplo 8.2. El grupo 1 corresponde a los animales infectados con la cepa mutante del Ejemplo 4.8, el grupo 2 corresponde a los animales infectados con la cepa progenitora de referencia y el grupo 3 es el grupo de control no infectado.
El día del estudio en que se realizó el análisis, se representa en el eje de abscisas (x) así como el tipo de muestra analizada (nasal o bronquial), y el porcentaje de animales positivos a la PCR, se representa en el eje de ordenadas (y).
El asterisco indica que la diferencia con respecto al grupo infectado con la cepa progenitora de referencia es estadísticamente significativa (p<0,05, según la prueba exacta de Fisher).
Figura 11
La figura 11 muestra la superficie media del pulmón afectada por lesiones que pueden atribuirse a infección porMhyosegún el ensayo del Ejemplo 8.2. El grupo 1 corresponde a los animales infectados con la cepa mutante del Ejemplo 4.8, el grupo 2 corresponde a los animales infectados con la cepa progenitora de referencia y el grupo 3 es el grupo de control no infectado.
El valor medio de la superficie pulmonar afectada se representa en el eje de ordenadas (y).
El asterisco indica que la diferencia con respecto al grupo infectado con la cepa progenitora de referencia es estadísticamente significativa (p<0,05, según la prueba de la U de Mann-Whitney).
Figura 12
La figura 12 muestra la carga vírica en suero determinada en el grupo de tratamiento 1, y en los grupos de control 2 y 3 del Ejemplo 7.2.
En el eje de abscisas (x) se representa el día posterior a la infección en que se realizó el análisis, y en el eje de ordenadas (y), el log-10 de la carga vírica en suero del circovirus porcino de tipo 2 (PCV2) expresada en copias/ml y determinada mediante PCR cuantitativa.
Figura 13
La figura 13 muestra el porcentaje de animales que presentan viremia por PCV2 en el grupo de tratamiento 1, y en los grupos de control 2 y 3 del Ejemplo 7.2.
En el eje de abscisas (x) se representa el día posterior a la infección en que se realizó el análisis y en el eje de ordenadas (y) el porcentaje de animales positivos.
Figura 14
La figura 14 muestra la mediana de la superficie de pulmón afectada por lesiones similares a las causadas porMhyoexpresada en porcentaje para el grupo de tratamiento 1, y para los grupos de control 2 y 3 del Ejemplo 7.2 el día 28 posterior a la infección.
El grupo se representa en el eje de abscisas (x) y en el eje de ordenadas (y) se representa la mediana de la superficie de pulmón afectada por lesiones tipoMhyo.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se define por las reivindicaciones adjuntas. En particular, la presente invención proporciona: 1. Un método para preparar una cepa mutante deMycoplasma hyopneumoniae (Mhyo),caracterizado por que comprende la etapa de transformar una cepa deMhyoutilizando un vector transposónico que comprende al menos una secuencia de ADN exógena, estando dicha secuencia bajo el control de una secuencia de ADN de una región promotora deMhyo,
en donde el vector transposónico comprende:
1) una secuencia de ADN que codifica una transposasa,
2) una secuencia de ADN exógena que comprende un gen marcador, y
3) opcionalmente, una secuencia de ADN exógena adicional,
en donde la secuencia de ADN que codifica una transposasa y al menos una de las secuencias de ADN exógenas están bajo el control de una secuencia de ADN de una región promotora deMhyo,
en donde la región promotora deMhyocorresponde a un segmento de ADN que comprende entre 50 pares de bases y 300 pares de bases situado en el lado 5' del gen de una proteína deMhyoseleccionada del grupo formado por las proteínas P36, P46, P65, P76, P97, P102, P146 y P216, en donde la región promotora deMhyoinicia o promueve la transcripción de una secuencia de ADN deMhyo,y
en donde la secuencia de ADN exógena se introduce de forma estable en el genoma de la cepa deMhyo.
2. El método del punto 1, caracterizado por que la secuencia de ADN exógena se selecciona del grupo que comprende un gen de resistencia a un antibiótico, un gen que codifica una recombinasa, un gen que codifica una transposasa, una secuencia diana de la transposasa, un fragmento de ADN deMhyo,un gen que codifica un componente antigénico de un microorganismo causante de enfermedades porcinas, y combinaciones de los mismos.
3. El método del punto 1 o 2, caracterizado por que el vector transposónico comprende una secuencia de ADN exógena adicional, que se selecciona del grupo formado por la secuencia de ADN que codifica la proteína de la cápside del circovirus porcino de tipo 2 (PCV2) y la secuencia de ADN que codifica una proteína que comprende la proteína de la cápside del circovirus porcino de tipo 2 (PCV2) que lleva adicionalmente los aminoácidos MetSerGlySer en el extremo aminoterminal de dicha proteína, preferentemente en donde dicha secuencia de ADN exógena adicional que codifica la proteína de la cápside del PCV2 se selecciona del grupo formado por SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5.
4. Un vector transposónico que comprende:
1) una secuencia de ADN que codifica una transposasa,
2) una secuencia de ADN exógena que comprende un gen marcador, y
3) opcionalmente, una secuencia de ADN exógena adicional,
en donde la secuencia de ADN que codifica una transposasa y al menos una de las secuencias de ADN exógenas están bajo el control de una secuencia de ADN de una región promotora deMycoplasma hyopneumoniae (Mhyo),en donde la región promotora deMhyocorresponde a un segmento de ADN que comprende entre 50 pares de bases y 300 pares de bases situado en el lado 5' del gen de una proteína deMhyoseleccionada del grupo formado por las proteínas P36, P46, P65, P76, P97, P102, P146 y P216, en donde la región promotora deMhyoinicia o promueve la transcripción de una secuencia de ADN deMhyo.
5. El vector transposónico del punto 4, caracterizado por que la secuencia de ADN exógena adicional se selecciona del grupo formado por la secuencia que codifica la proteína de la cápside del circovirus porcino de tipo 2 (PCV2) y la secuencia que codifica una proteína que comprende la proteína de la cápside del circovirus porcino de tipo 2 (PCV2) que lleva adicionalmente los aminoácidos MetSerGlySer en el extremo aminoterminal de dicha proteína, preferentemente en donde dicha secuencia de ADN exógena adicional que codifica la proteína de la cápside del PCV2 se selecciona del grupo formado por SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y s Eq ID NO: 5.
6. El método de uno cualquiera de los puntos 1 a 3, o el vector transposónico del punto 4 o 5, caracterizado por que el vector transposónico es un plásmido.
7. Uso del vector transposónico como se ha definido en uno cualquiera de los puntos 4 a 6, para preparar una cepa mutante deMycoplasma hyopneumoniae (Mhyo).
8. Una cepa mutante deMycoplasma hyopneumoniae (Mhyo),caracterizada por que comprende el vector transposónico como se ha definido en uno cualquiera de los puntos 4 a 6.
9. La cepa mutante deMycoplasma hyopneumoniae (Mhyo)del punto 8, que se selecciona del grupo formado por una cepa mutante deMhyodepositada en el Instituto Leibniz - D<s>M<z>con el número de registro DSM 26020; una cepa mutante deMhyocon el número de registro DSM 26027; una cepa mutante deMhyocon el número de registro DSM 26033; una cepa mutante deMhyocon el número de registro DSM 26034; y una cepa mutante deMhyocon el número de registro DSM 26049.
10. Uso de una cepa mutante deMycoplasma hyopneumoniae (Mhyo)como se ha definido en el punto 8 o 9, o preparada de acuerdo con el método del punto 1, para preparar una vacuna contra la neumonía enzoótica porcina causada porMhyo,y opcionalmente contra otra enfermedad o procesos patológicos adicionales que afecten a los cerdos.
11. Una vacuna para proteger a los cerdos contra la neumonía enzoótica porcina causada porMycoplasma hyopneumoniae (Mhyo),y opcionalmente contra otra enfermedad o procesos patológicos adicionales que afectan a los cerdos, que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de la cepa mutante deMhyocomo se ha definido definida en el punto 8 o 9, o preparada de acuerdo con el método del punto 1.
12. La vacuna del punto 11, caracterizada por que la otra enfermedad o procesos patológicos adicionales que afectan a los cerdos, están causados por un microorganismo, que se selecciona del grupo formado porActinobacillus sp., Brachyspira sp., Pasteurella multocida, Salmonella sp., Streptococcus sp., Isospora sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Leptospira sp., Staphylococcus sp., Haemophilus parasuis, Bordetella bronchiseptica, Clostridium sp., Mycoplasma sp., Lawsonia intracellularis, Escherichia coli,virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino, virus de la gripe porcina, virus de la gastroenteritis contagiosa, parvovirus porcino, virus de la encefalomiocarditis, coronavirus, rotavirus, circovirus porcino, agente causante del síndrome del fracaso en el desarrollo peri-destete porcino, virus de la peste porcina clásica, virus de la peste porcina africana, calicivirus y torque teno virus (TTV).
13. Un kit de vacunación para vacunar a cerdos contra una infección o enfermedad causada porMycoplasma hyopneumoniae (Mhyo),y opcionalmente contra otra enfermedad o procesos patológicos causados por microorganismos que afectan a los cerdos, que comprende un recipiente que contiene una cantidad inmunológicamente eficaz de la cepa mutante deMhyocomo se ha definido en los puntos 8 o 9.
14. La vacuna del punto 11 o 12, o el kit de vacunación del punto 13, que es para administración intradérmica o intramuscular.
La materia relativa al aspecto de "vectores plasmídicos replicativos" no forma parte de la invención.
En el presente documento se divulga un método para preparar una cepa mutante deMycoplasma hyopneumoniaeque comprende la etapa de transformar una cepa deM. hyopneumoniaeutilizando un vector portador que comprende al menos una secuencia de ADN exógena, estando dicha secuencia bajo el control de una secuencia de<a>D<n>que tiene un grado de identidad de al menos 80 % con una región promotora deM. hyopneumoniae.
Una cepa mutante deMhyo,que incorpora de forma estable una secuencia de ADN exógena en el genoma de la misma y que expresa el contenido de dicha secuencia, puede obtenerse mediante el método divulgado en el presente documento.
El método puede comprender adicionalmente etapas que son habituales en los métodos para preparar cepas mutantes de bacterias, que el experto en la materia conoce bien y que no son esenciales para dicho método.
Por tanto, el método comprende adicionalmente las etapas de:
a) construir un vector antes de transferirlo a la bacteria en la etapa de transformación, y
b) seleccionar las bacterias mutantes que se han transformado con la secuencia de ADN exógena después de la etapa de transformación.
La eficacia del método divulgado en el presente documento se determina mediante el aislamiento y la caracterización de las secuencias de ADN presentes en las cepas transformadas, así como también, por ejemplo, mediante la comprobación de las características genotípicas o fenotípicas de la cepa mutante o mediante la comprobación de la producción de las proteínas recombinantes por la misma, como se describirá más adelante en el apartado de Ejemplos.
Una cepa mutante deMhyo,que incorpora de forma estable una secuencia de ADN exógena en el genoma de la misma y que expresa el contenido de dicha secuencia, puede obtenerse mediante el vector portador utilizado en el método de la invención.
En la presente invención, el vector portador es un vector transposónico.
Como se describe adicionalmente en el presente documento, pero que no forma parte de la invención, por "vector plasmídico replicativo" o "plásmido replicativo" se entiende un vector portador de secuencias de ADN que se replica como un elemento episomal en la bacteria hospedadora, en donde un elemento episomal es una unidad extracromosómica autorreplicante.
Como se describe adicionalmente en el presente documento, pero que no forma parte de la invención, un vector plasmídico replicativo es aquel que permite incorporar de forma estable una secuencia de ADN exógena en el citosol de una bacteriaMhyoy, opcionalmente, expresar un ARN o una proteína codificada por dicha secuencia en el citosol de la bacteria.
El vector portador es un vector, preferentemente un plásmido, en donde al menos una secuencia de ADN exógena comprendida en el mismo, se incorpora por transposición en el genoma de la cepa deMhyo.Esto quiere decir que el vector portador transforma la cepa por transposición de forma que se obtiene una cepa mutante deMhyoque incorpora por transposición en el genoma una parte sustancial del vector, que es la parte comprendida entre las secuencias repetitivas invertidas denominadas IRI e IRO, y que comprende al menos una secuencia de ADN exógena. Dichas repeticiones invertidas son las secuencias diana de la transposasa.
En el contexto de la invención, por "vector transposónico" se entiende que es un vector portador de secuencias de ADN en donde al menos una de ellas se incorpora al genoma del hospedador por transposición.
En el método de la invención, un vector transposónico es aquel que permite incorporar de forma estable una secuencia de ADN exógena en el genoma de una bacteria deMhyo.
Dicha incorporación tiene lugar de forma aleatoria en el genoma de la bacteria. Por lo tanto, en función del lugar específico donde se produce dicha inserción, cualquiera de los genes de la bacteria puede inactivarse porque su secuencia se interrumpe por la inserción del transposón. Si el gen inactivado está implicado en factores de virulenciaMhyo,la cepa resultante puede utilizarse para preparar una vacuna atenuada contra la NEP, y permite además obtener vacunas marcadoras contra la NEP. Adicionalmente, y al igual que en el caso de los vectores replicativos, el transposón puede contener otros genes bajo el control de una región promotora deMhyopara la expresión de proteínas recombinantes con diferentes funciones.
Dado que la modificación genética realizada mediante el método de la invención se integra en el genoma, la cepa transformada es estable en las siguientes generaciones.
Secuencia de ADN exógena
En el contexto de la invención, "secuencia de ADN exógena" se entiende como un fragmento de ADN que se introduce de forma estable en el genoma de la cepa deMhyo.
Se ha descubierto que mediante el método de la invención se puede introducir de forma estable una secuencia de ADN exógena en una cepa deMhyoporque dicha secuencia no se pierde a lo largo de sucesivas generaciones de la bacteria que ha sido transformada con dicha secuencia exógena. Esta estabilidad significa que la secuencia de ADN exógena puede replicarse dentro de la bacteria transformada y en su descendencia y puede recuperarse tras múltiples generaciones de la bacteria transformada.
La secuencia de ADN exógena puede ser muy diversa y tiene una definición amplia, como se explica a continuación.
En el contexto de la invención, dicha secuencia puede ser, por ejemplo, un gen marcador. El vector que comprende la secuencia de ADN exógena suele comprender dicho marcador para poder seleccionar fácilmente las cepas mutantes que se han transformado. Dicho marcador genético puede ser, por ejemplo, un gen de resistencia a antibióticos. Pueden incluir, por ejemplo, el genTetM,que confiere resistencia a la tetraciclina del plásmido plVT-1, descrito en Dybviget al.,J. Bacteriol, 2000, 182, 4343- 4347 o el genaac(6)-aph(2"),que confiere resistencia a los antibióticos aminoglucósidos, tal como la gentamicina, por ejemplo, y que se describe en Chowet al.,Antimicrob. Agents Chemother., 2001, 45/10), 2691-2694. El gen para la selección fenotípica es preferentemente el genTetM.
La secuencia de ADN exógena puede ser también un gen que codifique proteínas recombinantes tales como, por ejemplo, la recombinasa Cre del bacteriófago P1, o la transposasa del transposón Tn4001, o secuencias diana de la transposasa tales como, por ejemplo, IRI o IRO.
La secuencia de ADN exógena también puede ser un gen que codifique una proteína recombinante de interés terapéutico o preventivo. Dicha proteína puede estar relacionada con factores de virulencia o determinantes antigénicos de microorganismos causantes de enfermedades en cerdos, y puede inducir o contribuir a la inducción de una respuesta protectora contra enfermedades o procesos patológicos que puedan afectar a los cerdos. La secuencia de ADN exógena codifica preferentemente una proteína recombinante que induce una respuesta protectora contra enfermedades o procesos patológicos que afectan a los cerdos, causados por los microorganismos del grupo formado porActinobacillus sp., Brachyspira sp., Pasteurella multocida, Salmonella sp., Streptococcus sp., Isospora sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Leptospira sp., Staphylococcus sp., Haemophilus parasuis, Bordetella bronchiseptica, Clostridium sp., Mycoplasma sp., Lawsonia intracellularis, Escherichia coli,virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino, virus de la gripe porcina, virus de la gastroenteritis contagiosa, parvovirus porcino, virus de la encefalomiocarditis, coronavirus, rotavirus, agente causante del síndrome del fracaso en el desarrollo peri-destete porcino, virus de la peste porcina clásica, virus de la peste porcina africana, calicivirus, torque teno virus (TTV) y circovirus porcino. Entre ellos, por ejemplo, el gen que codifica la glucoproteína 5 (gp5) del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS,porcine reproductive and respiratory syndrome),el gen que codifica la proteína de la cápside del circovirus porcino de tipo 2 (PCV2), el gen que codifica la glucoproteína E (gpE) del virus de la peste porcina clásica, el gen que codifica la proteína sp1 del parvovirus porcino (PPV), el gen que codifica la toxina dePasteurella multocida,el gen que codifica la dermonecrotoxina deBordetella bronchiseptica,los genes que codifican las toxinas deClostridiumspp,Escherichia colioActinobacillus pleuropneumoniae.En una realización preferida, dicha proteína induce una respuesta protectora contra las enfermedades mencionadas.
Un fragmento de ADN deMhyo,opcionalmente reordenado o recombinado con otros fragmentos de ADN, también se considera que es una secuencia de ADN exógena. Son ejemplos de esta secuencia de ADN exógena, por ejemplo, el origen de replicaciónoriCdeMhyo,una secuencia de ARN antisentido, o el gen que codifica la proteína P97 o P46 deMhyo,para aumentar la tasa de transcripción y traducción de dicho gen.
La secuencia de ADN exógena se selecciona preferentemente del grupo que comprende un gen de resistencia a antibióticos, un gen que codifica una recombinasa, un gen que codifica una transposasa, una secuencia diana de la transposasa, un fragmento de ADN deMhyo,preferentemente, cuyo fragmento se ha reordenado o recombinado con uno o varios fragmentos de ADN, un gen que codifica un componente antigénico de un microorganismo causante de enfermedades porcinas, y combinaciones de los mismos; más preferentemente se trata de un gen marcador que confiere resistencia a un antibiótico, un gen que codifica un componente antigénico de un microorganismo causante de enfermedades porcinas, y/o combinaciones de los mismos; y aún más preferentemente se trata de un gen de resistencia a antibióticos junto con un gen que codifica un componente antigénico de un microorganismo causante de enfermedades porcinas, preferentemente un gen que codifica la proteína de la cápside del circovirus porcino de tipo 2 (PCV2), y opcionalmente junto con un gen que codifica una proteína de membrana deMhyo,preferentemente la proteína P46 deMhyo.
Región promotora de Mhyo
En el contexto de la invención, "región promotora deMhyo"se entiende como una secuencia de ADN característica deMhyoque inicia o promueve la transcripción de una secuencia de ADN deMhyo.
La secuencia de ADN que inicia o promueve la transcripción de la secuencia de ADN exógena tiene un grado de identidad de al menos 80 %, preferentemente de al menos 85 %, más preferentemente de al menos 90 %, aún más preferentemente de al menos 95 %, más preferentemente de al menos 99 % y aún más preferentemente del 100 %, con una región promotora deMhyo.
La secuencia de ADN que inicia o promueve la transcripción de la secuencia de ADN exógena puede tener un grado de identidad del 100 % con una región promotora deMhyo.
Una secuencia, que induce la síntesis de un ARN mensajero (transcrito) hacia su extremo 3' una vez identificado por la holoenzima ARN polimerasa, se entiende como región promotora. Este transcrito se traduce normalmente y produce una proteína con una función específica, o da lugar a un ARN que interviene en la síntesis de proteínas o en la regulación de dicha actividad transcripcional.
El experto en la materia conoce el significado de la expresión "una región promotora" y puede identificarla por medios estándar.
La región promotora deMhyocorresponde a un segmento de ADN que comprende preferentemente al menos 50 pares de bases, preferentemente al menos 100 pares de bases, más preferentemente al menos 200 pares de bases, y aún más preferentemente entre 200 y 300 pares de bases, situadas en el lado 5' de secuencias codificantes deMhyobien establecidas.
Como se describe en el presente documento, la secuencia de ADN utilizada como promotor en el método y en el vector portador de la invención, puede tener un grado de identidad del 100 % con una región promotora deMhyo,que comprende al menos 50 pares de bases.
Más específicamente, la secuencia de ADN utilizada como promotor en el método y en el vector portador de la invención, puede tener un grado de identidad del 100 % con una región promotora deMhyo,que comprende entre 200 y 300 pares de bases.
En el contexto de la invención, "secuencias codificantes bien establecidas" se entiende como aquellas secuencias de ADN que codifican proteínas deMhyoo regiones transcripcionalmente activas del genoma deMhyoque dan lugar a, por ejemplo, un ARN que interviene en la síntesis de proteínas o en la regulación de la actividad transcripcional. Estas secuencias incluyen, por ejemplo, las proteínas de superficie P46, P65, P97 y P102, descritas en Minionet al.,J. Bacteriol., 2004, 186(21), 7123-7133; las adhesinas<p>76, P146, P216 o la proteína de membrana P95, descritas en Vasconceloset al.,J. Bacteriol., 2005, 187(16), 5568-5577, o la proteína citosólica P36 descrita en Caronet al.,J. Clin. Microbiol., 2000, 38(4), 1390-1396, o ARN ribosómico.
Como se describe en el presente documento, la región promotora deMhyopuede comprender la región promotora del gen de una proteína deMhyoseleccionada del grupo formado por las proteínas P36, P46, P65, P76, P97, P102, P146 y P216, más preferentemente las proteínas P46 y P97, aún más preferentemente se selecciona del grupo que comprende la región promotora del genmhj_0194de la cepa J deMhyoque codifica la proteína P97 y corresponde a la secuencia de ADN comprendida entre las bases 214293 y 214557 de la cepa J deMhyo(SEQ ID NO: 1), y la región promotora del genmhj_0511de la cepa J deMhyo(SEQ ID NO: 2), que codifica para la proteína P46 y corresponde a la secuencia de ADN comprendida entre las bases 656451 y 656713 de la cepa J deMhyodepositada en la base de datos GenBank con el número AE017243 y descrita en Vasconceloset al.,mencionados anteriormente.
La región promotora deMhyo,que controla las secuencias exógenas, puede ser la misma para todas las secuencias o puede ser diferente. Preferentemente es la misma.
El experto en la materia puede identificar fácilmente una secuencia promotora de ADN seleccionando una secuencia de ADN que tenga un grado de identidad de al menos 80 %, más preferentemente de al menos 90 %, más preferentemente de al menos 95 %, incluso más preferentemente de al menos 99 %, y aún más preferentemente del 100%, con una región promotora deMhyo,que comprenda preferentemente al menos 50 pares de bases, preferentemente al menos 100 pares de bases, más preferentemente al menos 200 pares de bases, y aún más preferentemente entre 200 y 300 pares de bases, situadas en el lado 5' de secuencias codificantesMhyobien establecidas, y llevar a cabo el método de la invención. Los métodos para identificar una secuencia promotora de ADN se describen, por ejemplo, en el manual de Sambrook y Russell,Molecular Cloning3a Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor Nueva York (2001).
Vector plasmídico replicante(no forma parte de la invención pero se presenta únicamente con fines ilustrativos)
En el presente documento se divulga un vector plasmídico replicativo que comprende:
1) una secuencia de ADN que comprende la regiónoriCde una cepa deMycoplasma sp.,y
2) una secuencia de ADN exógena que comprende un gen marcador y, opcionalmente, una secuencia de ADN exógena adicional, que están bajo el control de una secuencia de ADN que tiene un grado de identidad de al menos 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % con una región promotora deMhyo.
La secuencia de ADN, que inicia o promueve la transcripción de la secuencia de ADN exógena, puede comprender entre 200 y 300 pares de bases y tiene un grado de identidad del 100 % con una región promotora deMhyo.
En el plásmido replicativo, una región promotora deMhyo,seleccionada del grupo que comprende la región promotora del gen de la proteína P97 deMhyoy la región promotora del gen de la proteína P46 deMhyo,se usa preferentemente, la región promotora deMhyocomprende preferentemente la región promotora del gen de la proteína P97 deMhyoo alternativamente la región promotora del gen de la proteína P46 deMhyomencionada anteriormente.
La región promotora deMhyo,que controla las secuencias comprendidas en el plásmido replicativo, puede ser igual en todas las secuencias o puede ser diferente. Preferentemente es la misma secuencia.
La regiónoriCpermite que el fragmento de ADN introducido se replique como un elemento episomal y mantenga de forma estable este fragmento de ADN en la descendencia de la célula transformada, manteniendo preferentemente las condiciones de selección fenotípica.
En el vector plasmídico replicativo la regiónoriCes la regiónoriCde una cepa deMycoplasma sp.
Como se describe en el presente documento, porMycoplasma sp.se entiende cualquier bacteria del géneroMycoplasma,tal como, por ejemplo,M. pneumoniae, M. hyopneumoniae, M. hominis, M. genitalium, M. pulmonis, M. capricolum, M. mycoides, M. ovipneumoniae, M. haemofelis, M. gallisepticum, M. laboratoriumoM. bovis,entre otras.
La regiónoriCpuede pertenecer a una cepa deMhyo,más preferentemente pertenece a la cepa J, y más preferentemente comprende la secuencia de ADN comprendida entre las bases 897262 y 1802 de la cepa J deMhyo.
El gen marcador, también denominado gen de selección fenotípica, permite seleccionar los clones que han incorporado el plásmido con la secuencia de ADN exógena, como se ha explicado anteriormente.
El vector puede comprender una secuencia exógena de ADN adicional. Las cepas mutantes deMhyo,que pueden utilizarse para preparar vacunas monovalentes o polivalentes, opcionalmente vacunas marcadoras, y que también pueden expresar herramientas genéticas útiles para la modificación posterior de dichos mutantes, tales como, por ejemplo, la recombinasa Cre del fago P1, la recombinasa FLP deSaccharomyces cerevisiae,la proteína represora de tetraciclina (TetR), o que pueden bloquear total o parcialmente la traducción de un genMhyoespecífico, pueden obtenerse mediante dicha secuencia exógena de ADN adicional.
Las secuencias de ADN exógenas adicionales, que puede incorporarse al plásmido replicativo, incluyen, por ejemplo, el gencredel ORF(open reading frame,marco abierto de lectura) que codifica la recombinasa Cre del fago P1.
La recombinasa Cre tiene la capacidad de dividir regiones de ADN flanqueadas por secuencias de tipoloxP.Por lo tanto, por ejemplo, si el plásmido replicativo incluye el gencredel ORF, y un gen de resistencia a un antibiótico flanqueado por secuencias de tipoloxP,por ejemplo, lox66, cuando se expresa la recombinasa Cre, la bacteria transformada elimina la resistencia a los antibióticos. En otras palabras, en etapas posteriores se puede eliminar el gen marcador. Esto es importante en el caso de preparar cepas mutantes transformadas deMhyoque tengan una virulencia atenuada y se usen para preparar vacunas vivas, en las que la presencia de un gen de resistencia a un antibiótico es una característica no deseable.
El plásmido replicativo puede comprender además una secuencia de ADN exógena adicional que codifique una proteína recombinante de interés terapéutico o preventivo. Dicha proteína puede estar relacionada con factores de virulencia o determinantes antigénicos de microorganismos causantes de enfermedades en cerdos, y puede inducir o contribuir a la inducción de una respuesta protectora frente a enfermedades o procesos patológicos que puedan afectar a los cerdos causados por los microorganismos descritos anteriormente.
El plásmido replicativo puede comprender al menos dos veces la secuencia de ADN exógena adicional que codifica una proteína recombinante de interés terapéutico o preventivo, preferentemente dos veces, y más preferentemente dos o tres veces. De esta forma se introducen varias copias de la secuencia de ADN exógena adicional y se aumenta el rendimiento de expresión de esa proteína. La región promotora deMhyo,que controla las secuencias comprendidas en el plásmido replicativo, puede ser la misma para todas las secuencias o puede ser diferente.
La secuencia de ADN exógena adicional puede seleccionarse del grupo formado por la secuencia que codifica la proteína de la cápside del circovirus porcino de tipo 2 (PCV2) y la secuencia de ADN exógena que codifica una proteína que comprende la proteína de la cápside del circovirus porcino de tipo 2 (PCV2) que lleva adicionalmente los aminoácidos MetSerGlySer en el extremo aminoterminal de dicha proteína, en donde dicha proteína de la cápside está descrita en la base de datos GenBank con el número de registro AAC61864 (SEQ ID NO: 6).
La secuencia de ADN exógena adicional puede codificar la proteína de la cápside del PCV2 utilizando el codón más común en el genoma deMhyopara cada uno de los aminoácidos correspondientes a dicha proteína seleccionada del grupo formado por SEQ ID N<o>: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5.
La SEQ ID NO: 3 tiene 699 pares de bases, la SEQ ID NO: 4 tiene 702 pares de bases y la SEQ ID NO: 5 tiene 992 pares de bases, una secuencia de ADN con una longitud sustancialmente mayor que las otras dos porque también incorpora la región promotora del gen de la proteína P97, correspondiente a la secuencia de ADN comprendida entre las bases 214293 y 214557 de la cepa J deMhyo,para simplificar así las etapas de clonación. En esta descripción, la SEQ ID NO: 5 también se denomina ORF2v2.
La secuencia de ADN exógena adicional comprende el gen de la proteína de la cápside del virus PCV2 (ORF2) fusionado a la última base que codifica el gen de una proteína de membrana deMhyo,preferentemente la proteína de membrana deMhyose selecciona del grupo que consiste en la proteína P46 y la proteína P97, más preferentemente es la proteína P46, más preferentemente bajo el control del promotor de los genes de las proteínas P46 o P97 deMhyoy aún más preferentemente bajo el promotor del gen de la proteína P46 deMhyo.
En el caso de la proteína P46, la fusión tiene lugar en el extremo 3' del gen que codifica dicha proteína de membrana (bases 7648-8904). Este plásmido dirige la síntesis de una proteína híbrida que se caracteriza por que los aminoácidos 1 a 419 son de la proteína P46 y los aminoácidos 420 a 652 corresponden a la proteína de la cápside del virus PCV2, versión ORF2 (bases 6946-7647).
La secuencia de ADN exógena adicional puede comprender el gen que codifica la proteína de la cápside del PCV2 insertado en la secuencia de ADN que codifica un bucle de una proteína de membrana deMhyo,preferentemente la proteína de membrana deMhyose selecciona del grupo que consiste en la proteína P46 y la proteína P97, más preferentemente es la proteína P46, más preferentemente bajo el control del promotor de los genes de las proteínas P46 o P97 deMhyoy aún más preferentemente bajo el promotor del gen de la proteína P46 deMhyo.
En el caso de la proteína P46, el plásmido dirige la síntesis de una proteína híbrida que se caracteriza por que los aminoácidos 1 a 92 son del extremo aminoterminal de la proteína P46, los aminoácidos 95 a 327 corresponden a la proteína de la cápside del virus PCV2 y los aminoácidos 330-656 son del extremo carboxiterminal de la proteína P46 deMhyo.
Los bucles se identifican en secuencias de aminoácidos mediante métodos bien conocidos por el experto en la materia, de modo que sea posible predecir su ubicación con una eficacia razonable.
Dichos bucles presentan generalmente una gran flexibilidad y tienen una buena tolerancia a la inserción de secuencias de aminoácidos procedentes de otras proteínas. Además, dado que están expuestos en la superficie de la bacteria, permiten generar una buena respuesta inmunogénica.
El plásmido replicativo puede comprender una secuencia de ADN exógena adicional que es un gen deMhyoorientado inversamente con respecto a la región promotora deMhyo,preferentemente el gen deMhyocodifica un factor de virulencia deMhyo,preferentemente bajo el control del promotor de la proteína P46 o p 97 deMhyoy aún más preferentemente bajo el promotor de la proteína P46 deMhyo.
Dicha secuencia de ADN puede producir un ARN antisentido, que puede bloquear la traducción de dicho gen deMhyo.Si se trata de un gen que codifica un factor de virulencia deMhyo,la transformación puede reducir el grado de virulencia del microorganismo.
El plásmido replicativo puede comprender la secuencia comprendida entre las bases 194.535 y 194.654 del genoma de la cepa J deMhyoorientada inversamente con respecto a la región promotora deMhyo.
Dicha secuencia produce un ARN antisentido que puede bloquear la traducción del gentlyAde dicha cepa, que corresponde a una hemolisina deMhyo.
En los Ejemplos se describe la preparación de los plásmidos pOG, pOGCRE, pOGA159, pOGC, pOGL y pOGT. El primero incorpora el genaac(6’)- aph(2")que confiere resistencia a la gentamicina. Además, el plásmido pOGCRE incorpora el gencredel ORF, que codifica la recombinasa Cre del fago P1; el plásmido pOGA159 incorpora una secuencia inhibidora de la traducción del gen a159 de la hemolisina deMhyo;mientras que los plásmidos pOGC, pOGL y pOGT incorporan además genes que codifican diferentes versiones de proteínas de la proteína de la cápside del circovirus porcino de tipo 2 (PCV2).
Vectores transposónicos
En el presente documento se divulga un vector transposónico, en particular un plásmido, que comprende:
1) una secuencia de ADN que codifica una transposasa,
2) una secuencia de ADN exógena que comprende un gen marcador y,
3) opcionalmente, una secuencia de ADN exógena adicional,
en donde la secuencia de ADN que codifica una transposasa y al menos una de las secuencias de ADN exógenas, están bajo el control de una secuencia de ADN que tiene un grado de identidad de al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % con una región promotora deMhyo.
La secuencia de ADN, que inicia o promueve la transcripción de las secuencias de ADN, puede comprender entre 200 y 300 pares de bases y tiene un grado de identidad del 100 % con una región promotora deMhyo.
El gen que codifica una transposasa contiene una secuencia de ADN que codifica una enzima, que se une a una secuencia específica del transposón y cataliza el movimiento de dicho transposón a otra parte del genoma. La selección del gen que codifica una transposasa no es determinante. Los genes que codifican una transposasa incluyen el transposónTN4001Tincorporado en el plásmido plVT-1, mencionado anteriormente, o el transposón Tn916 incorporado en el plásmido pAM120, descrito, por ejemplo, en Caoet al.,J. Bacteriol., 1994, 176(14), 4459-4462. El gen marcador o gen para la selección fenotípica puede ser un gen de resistencia a un antibiótico, tal como, por ejemplo, el genTetMo el genaac(6’)-aph(2"),mencionados anteriormente. El gen para la selección fenotípica es preferentemente el genTetM.
El gen marcador está flanqueado por dos repeticiones invertidas, tales como las del transposón presente en el plásmido plVT-1, mencionado anteriormente. Dichas secuencias son reconocidas por la transposasa, y sin ellas el gen de selección fenotípica no podría desplazarse al cromosoma bacteriano y no se llevaría a cabo la modificación genética. A medida que la modificación genética se integra en el genoma, se mantendrá de forma estable en las siguientes generaciones de la célula transformada.
Las repeticiones invertidas presentan preferentemente las secuencias SEQ ID NO: 7 para IRO y SEQ ID NO: 8 para IRI.
Una región promotora deMhyoseleccionada del grupo que comprende la región promotora del gen de la proteína P97 deMhyoy la región promotora del gen de la proteína P46 deMhyo,como se ha descrito anteriormente, puede usarse en el vector transposónico. La región promotora deMhyopuede comprender la región promotora del gen de la proteína P97 deMhyoo alternativamente la región promotora del gen de la proteína P46 deMhyo.
La región promotora deMhyo,que controla las secuencias comprendidas en el vector transposónico, puede ser la misma para todas las secuencias o puede ser diferente. Preferentemente es la misma.
Similar a lo explicado en el caso de un plásmido replicativo, en una realización preferida, el vector transposónico comprende además una secuencia de ADN exógena adicional que codifica una proteína recombinante de interés. Dicha proteína puede inducir o contribuir a la inducción de una respuesta protectora contra enfermedades o procesos patológicos que puedan afectar a los cerdos.
En una realización preferida, el vector transposónico comprende al menos dos veces la secuencia de ADN exógena adicional que codifica una proteína recombinante de interés terapéutico o preventivo, preferentemente dos veces, y más preferentemente dos o tres veces. De esta forma se introducen varias copias de la secuencia de ADN exógena adicional y se aumenta el rendimiento de expresión de esa proteína. La región promotora deMhyo,que controla las secuencias comprendidas en el vector transposónico, puede ser la misma para todas las secuencias o puede ser diferente.
En una realización aún más preferida, la secuencia de ADN exógena adicional se selecciona de la secuencia que codifica la proteína de la cápside del circovirus porcino (PCV2) y una secuencia de ADN exógena que codifica una proteína que comprende la proteína de la cápside del circovirus porcino (PCV2), y que lleva adicionalmente los aminoácidos MetSerGlySer en el extremo aminoterminal de dicha proteína, en donde la proteína de la cápside del circovirus porcino (PCV2) se describe en la base de datos GenBank con el número de registro AAC61864 (SEQ ID NO: 6).
En una realización incluso más preferida, la secuencia de ADN exógena adicional codifica la proteína de la cápside del PCV2 utilizando el codón más común en el genoma deMhyopara cada uno de los aminoácidos correspondientes a dicha proteína seleccionados del grupo formado por SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5, en donde cada una de las secuencias de ADN está bajo el control de una región promotora deMhyo.La SEQ ID NO: 5, que ya incluye la región promotora del gen que codifica la proteína P97 deMhyose usa más preferentemente.
En una realización preferida, la secuencia de ADN exógena adicional comprende la secuencia de ADN que codifica la proteína de la cápside del PCV2 fusionada a la última base que codifica el gen de una proteína de membrana deMhyo,preferentemente, la proteína de membrana se selecciona del grupo que consiste en la proteína P46 y la proteína P97, más preferentemente es la proteína P46. La cepa transformada con este plásmido expresa la proteína deMhyoen la que los aminoácidos correspondientes a la proteína de la cápside del PCV2 están situados inmediatamente después de su último aminoácido, es decir, expresa una proteína híbrida formada por la proteína P46 o P97 deMhyoy la proteína de la cápside del PCV2. Teniendo en cuenta que es una proteína de membrana, la cepa deMhyotransformada con dicho plásmido expresa la fusión de ambas proteínas en la membrana de la bacteria. La proteína de la cápside del PCV2 se selecciona del grupo formado por SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5, más preferentemente es SEQ ID NO: 4. La región promotora deMhyoes preferentemente la región promotora del gen que codifica la proteína P97 o P46 deMhyoy aún más preferentemente el promotor de la proteína P46 deMhyo.
En otra realización preferida, la secuencia de ADN adicional comprende el gen que codifica la proteína de la cápside del PCV2 insertado en la secuencia de ADN que codifica un bucle de una proteína de membrana deMhyo,la proteína de membrana se selecciona preferentemente del grupo que consiste en la proteína P46 y la proteína<p>97, más preferentemente es la proteína P46. La cepa transformada con este plásmido expresa la proteína de la cápside del PCV2 insertada entre la proteína P46 o P97 deMhyo,es decir, expresa una proteína híbrida formada por la proteína P46 o P97 deMhyoy la proteína de la cápside del PCV2. La proteína de la cápside del PCV2 se selecciona del grupo formado por SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5, más preferentemente es SEQ ID NO: 3.
En una realización preferida, la proteína de la cápside del PCV2 se inserta entre los aminoácidos 92 y 93 de la proteína P46.
Los siguientes vectores transposónicos, preferentemente plásmidos, son especialmente preferidos:
1) Un vector que comprende la secuencia de ADN que codifica una transposasa, preferentemente el transposónTN4001T,una secuencia de ADN que codifica un gen marcador, preferentemente el gentetM,opcionalmente flanqueada por secuencias de tipoloxP,y una secuencia de ADN que codifica la proteína de la cápside del PCV2, preferentemente definida por SEQ ID NO: 5, en donde cada una de las secuencias de ADN está bajo el control de una región promotora deMhyoseleccionada entre la región promotora de la proteína P97 o la proteína P46 deMhyo,preferentemente la región promotora de la proteína P97. Un ejemplo de este tipo de plásmido es el denominado pTC3C, descrito en el apartado de Ejemplos.
2) Un vector que comprende la secuencia de ADN que codifica una transposasa, preferentemente el transposónTN4001T,una secuencia de ADN que codifica un gen marcador, preferentemente el gentetM,opcionalmente flanqueada por secuenciasloxP, y una secuencia de ADN que codifica la proteína de la cápside del PCV2, preferentemente definida por SEQ ID NO: 4, que se fusiona con la última base que codifica el gen de una proteína de membrana deMhyo,preferentemente, la proteína de membrana se selecciona del grupo que consiste en la proteína P46 y la proteína P97, más preferentemente es la proteína P46, en donde cada una de las secuencias de ADN está bajo el control de una región promotora deMhyoseleccionada entre la región promotora de la proteína P97 o P46 deMhyo,preferentemente la región promotora de la proteína P46. Un ejemplo de este tipo de plásmido es el denominado pTC3T, descrito en la sección de Ejemplos.
3) Un vector que comprende la secuencia de ADN que codifica una transposasa, preferentemente el transposónTN4001T,una secuencia de ADN que codifica un gen marcador, preferentemente el gentetM,opcionalmente flanqueada por secuencias de tipoloxP, y una secuencia de ADN que codifica la proteína de la cápside del PCV2, preferentemente definida por s Eq ID NO: 3, que se fusiona en un bucle de una proteína de membrana deMhyo,preferentemente, la proteína de membrana se selecciona del grupo que consiste en la proteína P46 y la proteína P97, más preferentemente es la proteína P46, preferentemente insertada entre los aminoácidos 92 y 93 de la proteína p46, en donde cada una de las secuencias de ADN está bajo el control de una región promotora deMhyoseleccionada entre la región promotora de la proteína P97 o de la proteína P46 deMhyo,preferentemente la región promotora de la proteína P46. Un ejemplo de este tipo de plásmido es el denominado pTC3L, descrito en la sección de Ejemplos.
En estos tres vectores preferidos, el grupo de secuencias de ADN exógenas, a excepción de las secuencias codificantes de la transposasa, está flanqueado por dos repeticiones invertidas que permiten la incorporación de dicho grupo en el genoma de la bacteriaMhyoque se va a transformar. Las repeticiones invertidas presentan preferentemente las secuencias SEQ ID NO: 7 para IRO y SEQ ID NO: 8 para IRI.
Otro objeto de la invención es el uso del vector transposónico para preparar una cepa mutante deMhyo.
Cepa de Mhyo
Cualquier cepa deMhyopuede usarse en el método de la invención, es decir, la cepa puede seleccionarse, entre otras, de cepas de campo, cepas de colección (por ejemplo, la cepa J o la cepa 232) o cepas modificadas genéticamente.
La cepa deMhyoadecuada para aplicar el método de la invención puede aislarse de casos clínicos o subclínicos de acuerdo con los métodos habituales utilizados por el experto en la materia, o puede seleccionarse de las cepas que están depositadas en Colecciones de Cultivos Tipo. En casos clínicos, la cepa presenta la patología habitual de la NEP, mientras que en los casos subclínicos la cepa está colonizando las membranas mucosas animales pero no presenta ninguna patología. La cepa deMhyoque puede utilizarse para aplicar el método de la invención puede mostrar diversos grados de virulencia. En el método de la invención se usa preferentemente una cepa virulenta o una cepa que expresa los principales determinantes inmunogénicos deMhyo.Las cepas que pueden usarse en el método de la invención incluyen la cepa 232, cuyo genoma se describió en el artículo de Minionet al.,J. Bacteriol., 2004, 186(21), 7123-7133 y se depositó en la base de datos GenBank con el número AE017332; la cepa J, cuyo genoma se describió en el artículo de Vasconceloset al.,J. Bacteriol., 2005, 187(16), 5568-5577 y se depositó en la base de datos GenBank con el número AE017243; o una cepa de referencia tal como la 6314, que corresponde a un aislado virulento deMhyoperteneciente a los Laboratorios Hipra, S.A. (Amer-Girona-España).
Transformación de la cepa
En el contexto de la invención, la expresión "transformar una cepa deMhyo"tiene el significado habitual que entiende un experto en biología molecular y se refiere a un método mediante el cual una bacteria, en este caso una bacteria deMhyo,incorpora una secuencia de ADN exógena y dicha secuencia desempeña una función específica.
Las funciones que puede desempeñar la secuencia de ADN exógena incorporada en la bacteria deMhyoincluyen, por ejemplo, transcripción del ARN, expresión de proteínas, recombinación con otras secuencias de ADN o interrupción de la secuencia que codifica un gen en el genoma del organismo hospedador.
El método de transformación es uno de los tres medios por los que se puede introducir una secuencia de ADN exógena en una bacteria. Los otros dos son, la conjugación, que consiste en transferir material genético entre dos bacterias en contacto directo, y la transducción, que consiste en inyectar una secuencia de ADN exógena en la bacteria mediante un virus bacteriófago.
La transformación de una bacteria puede llevarse a cabo en el método de la invención por medios de tratamientos bioquímicos conocidos por el experto en la materia tales como, por ejemplo, incubación de las bacterias en presencia de una sal que contenga iones divalentes, tal como, por ejemplo, cloruro cálcico o fosfato cálcico, exposición a una mezcla de polietilenglicol, incubación en presencia de alcohol polivinílico, uso de liposomas en los que la secuencia de ADN exógena está recubierta de un lípido, transfección mediada por dietilaminoetildextrano, o mediante tratamientos físicos tales como la electroporación, también denominada electrotransformación, o por biolística. En el método de la invención, la bacteria se transforma preferentemente incubándola en presencia de una sal que contenga iones divalentes, exponiéndola a una mezcla de polietilenglicol, o sometiéndola a electroporación; y se realiza más preferentemente por electroporación.
La electroporación es un método bien conocido por el experto en la materia, cuyo protocolo experimental se describe, por ejemplo, en el manual de Sambrook y Russell, mencionado anteriormente.
En el proceso de electroporación, una suspensión de la bacteria en un tampón de electroporación que comprende el vector portador de la secuencia de ADN exógena se somete a un pulso eléctrico que provoca un cambio en la estructura de la membrana bacteriana con el fin de facilitar la entrada de dicha secuencia en la bacteria.
El tampón de electroporación puede ser, por ejemplo, un tampón con pH 7,2 formado por sacarosa y ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico (HEPES), aunque puede utilizarse cualquier tampón adecuado para la electroporación que sea bien conocido por el experto en la materia, tales como los descritos en el manual de Sambrook y Russell mencionado anteriormente.
El vector portador que lleva la secuencia de ADN exógena se utiliza generalmente a una concentración comprendida entre 0,1 y 5 pg/ml, preferentemente entre 0,5 y 2 pg/ml. Normalmente se usa un tampón de electroporación como vehículo de dicho vector portador.
La suspensión de bacterias comprende generalmente entre 106 y 1012 ufc/ml.
La electroporación puede realizarse generalmente a una tensión comprendida entre 1 y 3 kV, a una resistencia comprendida entre 75 y 300 O y a una capacitancia comprendida entre 10 y 40 pF. En el método de la invención, la electroporación se realiza preferentemente a una tensión comprendida entre 2 y 3 kV, a una resistencia comprendida entre 100 y 175 O y a una capacitancia comprendida entre 20 y 30 pF.
En una realización preferida, antes de realizar la electroporación, la suspensión de bacteriasMhyose somete a incubación en un tampón de electroporación con un agente quelante de iones divalentes. Aunque dicha etapa no es fundamental en el método de la invención, se ha observado que aumenta considerablemente la eficacia de la transformación.
Los agentes quelantes que pueden usarse para dicha incubación incluyen, por ejemplo, ácidos aminocarboxílicos tales como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido nitrilotriacético (NTA), ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA), o sus sales alcalinas; ácidos hidroxicarboxílicos tales como ácido cítrico, ácido glucónico, o sus sales alcalinas; ácidos fosfónicos, tales como ácido 2-aminoetilfosfónico, ácido 1-hidroxietilideno-1,1-difosfónico (HEDP), amino tris(ácido metilenofosfónico) (ATMP), ácido etilendiaminotetra (metilenfosfónico) (EDTMP), o sus sales alcalinas. El agente quelante es preferentemente EDTA.
Una vez realizada la electroporación, es decir, una vez emitido el pulso eléctrico, la suspensión de bacterias se incuba preferentemente con una cantidad adicional del vector portador que comprende la secuencia de ADN exógena. Normalmente se utiliza la misma cantidad de vector portador que se añade antes de emitir el pulso eléctrico.
Dicha incubación se lleva a cabo incubando la suspensión de bacterias y vector portador con hielo durante un período de tiempo inferior a 1 hora aproximadamente, y manteniéndola después durante un período de tiempo comprendido entre 2 y 5 horas a una temperatura de 37 °C y bajo una atmósfera de dióxido de carbono al 5 %.
En una realización más preferida, antes de realizar la electroporación, la suspensión de bacteriasMhyose somete a incubación en un tampón de electroporación con un agente quelante de iones divalentes, y después de la electroporación, la suspensión de bacterias se incuba con una cantidad adicional del vector portador que comprende la secuencia de ADN exógena.
En el método de la invención, la transformación se lleva a cabo usando un vector transposónico, preferentemente un plásmido, en donde al menos una parte del misma se incorpora por transposición.
Por lo tanto, la transformación de la cepa deMhyode acuerdo con el método de la invención permite obtener una cepa deMhyoque comprende al menos una secuencia de ADN exógena insertada en su genoma si la transformación ha tenido lugar mediante transposición.
Obtención de cepas mutantes
Un objeto de la invención es una cepa mutante deMhyoobtenible por el método de la invención.
Otro objeto de la invención es una cepa mutante deMhyoque comprende al menos una secuencia de ADN exógena incorporada de forma estable en el genoma de la misma. La secuencia de ADN exógena puede estar controlada por una secuencia de ADN, que tiene un grado de identidad de al menos 80 %, preferentemente de al menos 85 %, más preferentemente de al menos 90 %, aún más preferentemente de al menos 95 %, más preferentemente de al menos 99 % y aún más preferentemente del 100 %, con una región promotora deMhyo.
En otra realización preferida, la secuencia de ADN exógena está comprendida entre las repeticiones de secuencia invertida IRI e IRO del vector transposónico de la invención.
La cepa mutante deMhyode la invención comprende una parte sustancial del vector transposónico de la invención. Cuando se usa un vector plasmídico replicativo, la cepa mutante deMhyocomprende dicho vector en el citosol de la misma. En el caso de usar un vector transposónico, la cepa mutante deMhyoincorpora una parte sustancial del vector, que es la parte comprendida entre las repeticiones de secuencia invertida IRI e IRO, y comprende al menos una secuencia de ADN exógena.
Otro objeto de la invención es una cepa deMhyotransformada por el vector portador de la invención.
En el contexto de la invención, "cepa mutante deMycoplasma hyopneumoniae"se entiende como una cepa deMhyoque se ha modificado genéticamente utilizando herramientas de genomodificación.
Una cepa mutante deMhyo,que incorpora de forma estable una secuencia de ADN exógena, que es funcional en dicha cepa mutante, puede obtenerse mediante el método de la invención.
En el contexto de la invención, se entiende que una secuencia de ADN exógena es funcional en una cepa mutante deMhyocuando, por ejemplo, expresa la proteína codificada por dicha secuencia, transcribe ARN o modifica genéticamente dicha cepa.
En el método de la invención, para obtener cepas transformadas deMhyo,el material de partida es preferentemente un cultivo deMhyoen fase de crecimiento exponencial.
Dicho cultivo se obtiene preferentemente utilizando un medio de cultivo que comprende medio FriisHS (suero de caballo, extracto de levadura, caldo de infusión de corazón, solución salina equilibrada de Hank y caldo PPLO(Pleuro-Pneumonia Like Organisms,organismos similares a la pleuroneumonía)).
El cultivo se mantiene preferentemente entre 48 y 144 horas a una temperatura de aproximadamente 37 °C con agitación entre 100 y 200 rpm hasta alcanzar la fase de crecimiento exponencial.
A continuación, se aíslan las bacterias, preferentemente por centrifugación y se someten al método de transformación. Después de la transformación, la suspensión de bacterias se extiende preferentemente en placas de medio FriisHS suplementado con agar y el antibiótico selectivo deseado.
Las colonias transformadas que muestren resistencia al antibiótico del medio pueden recuperarse después de 2 o 3 semanas de incubación a una temperatura de 37 °C y bajo una atmósfera con dióxido de carbono al 5 %. Dichas colonias transformadas se inoculan después preferentemente en medio FriisHS suplementado con el antibiótico selectivo y al cabo de aproximadamente 10 o 20 días se estudia el genotipo y/o fenotipo de los mutantes obtenidos mediante la obtención de su ADN genómico o extractos proteicos por métodos bien conocidos por el experto en la materia.
Mediante el método de la invención, pueden obtenerse cepas mutantes transformadas deMhyoque expresen una proteína recombinante.
En una realización preferida, la cepa mutante deMhyode la invención expresa el contenido codificado por la secuencia de ADN exógena, por ejemplo, una proteína. La secuencia de ADN exógena puede ser, por ejemplo, una proteína de la cápside de circovirus (PCV2) o una proteína deMhyo,por ejemplo, la proteína P46, para lograr su sobreexpresión. Ejemplos de ellas son las cepas 232Cc6, 6314Cc1, 232Lc2 y 232Tc2, que incorporan la secuencia de ADN exógena en el genoma de la bacteria.
Un objeto de la invención es la cepa mutante deMhyoque fue depositada por Laboratorios Hipra, S.A. (Amer, Girona, España) en el Instituto Leibniz - DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares S.R.L.), InhoffenstralJe 7 B, 38124 Braunschweig, Alemania) con el número de registro DSM 26027 el 29 de mayo de 2012. Dicha cepa, denominada 232Cc6, incorpora el transposón presente en el plásmido pTC3C en la cepa 232 deMhyo.Esta cepa expresa la proteína de la cápside del PCV2 en el citoplasma y en cantidades que pueden detectarse mediante transferencia de Western y ensayo ELISA.
Un objeto de la invención es la cepa mutante deMhyoque fue depositada por Laboratorios Hipra, S.A. (Amer, Girona, España) en el Instituto Leibniz - DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,InhoffenstralJe 7 B, 38124 Braunschweig, Alemania) con el número de registro DSM 26020 el 29 de mayo de 2012. Dicha cepa, denominada 6314Cc1, incorpora el transposón presente en el plásmido pTC3C en la cepa de referencia 6314 deMhyo.Esta cepa expresa la proteína de la cápside del PCV2 en el citoplasma y en cantidades que pueden detectarse mediante transferencia de Western y ensayo ELISA.
Un objeto de la invención es la cepa mutante deMhyoque fue depositada por Laboratorios Hipra S.A. (Amer, Girona, España) en el Instituto Leibniz - DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,InhoffenstralJe 7 B, 38124 Braunschweig, Alemania) con el número de registro DSM 26033 el 29 de mayo de 2012. Dicha cepa, denominada 232Lc2, incorpora el transposón presente en el plásmido pTC3L en la cepa de referencia 232 deMhyo.Esta cepa expresa la proteína de la cápside del PCV2 en cantidades que pueden detectarse mediante ensayo ELISA.
Un objeto de la invención es la cepa mutante deMhyoque fue depositada por Laboratorios Hipra, S.A. (Amer, Girona, España) en el Instituto Leibniz - DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,InhoffenstralJe 7 B, 38124 Braunschweig, Alemania) con el número de registro DSM 26034 el 29 de mayo de 2012.
Dicha cepa, denominada 232Tc2, incorpora el transposón presente en el plásmido pTC3T en la cepa de referencia 232 deMhyo.Esta cepa expresa la proteína de la cápside del PCV2 en cantidades que pueden detectarse mediante ensayo ELISA.
Las siguientes cepas también expresan la proteína codificada por la secuencia de ADN exógena, en ese caso incorporada en el citosol de la bacteria como elemento episomal:
- la cepa 232POGc9 transformada deMhyoque incorpora el plásmido replicativo pOG en la cepa 232 de referencia deMhyo.Dicha incorporación se ha detectado digiriendo el ADN total de esta cepa deMhyocon enzimas de restricción y analizando los fragmentos resultantes mediante electroforesis en gel de agarosa.
- la cepa 232POGCREc1 transformada deMhyoque incorpora el plásmido replicativo pOGCRE en la cepa 232 de referencia deMhyo.La expresión de la recombinasa Cre se detecta mediante transferencia de Western e inmunodetección.
Las cepas mutantes deMhyo,en las que la secuencia de ADN exógena incorporada por transposición produce un ARN antisentido, que puede bloquear la traducción de un gen responsable de la virulencia de dicha cepa, por ejemplo, un gen que corresponde a una hemolisina deMhyo,pueden obtenerse mediante el método de la invención.
En una realización preferida, la cepa mutante deMhyoincorpora una secuencia de ADN exógena en el genoma de tal manera que dicha cepa produce un ARN antisentido con respecto a un gen responsable de la virulencia de dicha cepa.
Las cepas mutantes deMhyo,en las que la secuencia de ADN exógena incorporada por transposición en el genoma de la cepa interrumpe un gen que codifica un factor de virulencia deMhyo, pueden obtenerse mediante el método de la invención y presentan una virulencia atenuada.
En una realización preferida, la cepa mutante deMhyoincorpora una secuencia exógena de ADN que interrumpe un gen que codifica un factor de virulencia deMhyo,por ejemplo una hemolisina. Un ejemplo es la cepa denominada 232TC3hlyC.
Las cepas mutantes portadoras de un gen interrumpido que codifica un factor de virulencia deMhyopueden seleccionarse mediante medios bien conocidos por el experto en la materia, tal como la secuenciación del genoma de dichos mutantes.
Un objeto de la invención es la cepa mutante deMhyoque fue depositada por Laboratorios Hipra, S.A. (Amer, Girona, España) en el Instituto Leibniz - DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,InhoffenstralJe 7 B, 38124 Braunschweig, Alemania) con el número de registro DSM 26049 el 29 de mayo de 2012. Dicha cepa, denominada 232TC3hlyC, incorpora el transposón presente en el plásmido TC3 en la cepa de referencia 232 deMhyo.Esta cepa tiene una interrupción del ORF que codifica el factor de virulencia hlyC deMhyo,por lo que es una buena candidata para su uso como cepa vacunal atenuada. La inserción en el genoma se detecta mediante transferencia de Southern y por secuenciación directa.
A partir de la información contenida en esta descripción, el experto en la materia puede preparar otras cepas transformadas deMhyoutilizando el método de la invención y seleccionando secuencias de a Dn exógenas distintas de las descritas específicamente.
Un objeto de la invención es el uso de una cepa mutante deMhyoque comprende una secuencia de ADN exógena en el genoma de la misma como hospedador para la expresión de la misma. La secuencia de ADN exógena puede codificar proteínas recombinantes u otras secuencias de interés como se explica en esta descripción.
Cabe señalar que a través del método de la invención pueden obtenerse cepas mutantes deMhyocon características muy diversas, de modo que el experto en la materia tenga a su disposición un método para modificar genéticamente cepas deMhyoy obtener cepas portadoras de diversas funcionalidades.
Los ejemplos 5 (que no forman parte de la invención) y 6 muestran que las cepas mutantes deMhyoobtenidas de acuerdo con el método de la invención incorporan sorprendentemente de forma estable la secuencia de ADN exógena incluida en el vector portador y expresan su contenido tal como, por ejemplo, mediante la producción de proteínas recombinantes.
La cepa obtenida por el método de la invención puede atenuarse o inactivarse mediante procedimientos estándar bien conocidos por el experto. De este modo, puede utilizarse en la preparación de vacunas. Se prefiere utilizar en forma inactivada.
Con el método de la invención, se obtienen nuevas cepas deMhyohasta ahora no divulgadas. Sus características permiten preparar nuevas vacunas contraMhyoy al mismo tiempo contra otros patógenos porcinos. Es decir, las cepas mutantes de la invención permiten preparar vacunas polivalentes utilizando una sola cepa transformada de acuerdo con el método de la invención.
Vacunas
Un objeto de la invención es una vacuna para proteger a los cerdos contra la neumonía enzoótica porcina causada porMhyo,y opcionalmente contra otra enfermedad o procesos patológicos causados por microorganismos que afectan a los cerdos, que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de la cepa mutanteMhyode la invención. En una realización preferida, la vacuna comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente, un agente adyuvante.
La cepa de la vacuna de la invención está inactivada o atenuada, preferentemente inactivada.
Una vacuna inactivada puede obtenerse inactivando un agente patógeno, en este caso una bacteria, normalmente utilizando calor; compuestos químicos tales como formaldehído, BEI (etilenimina binaria) o tensioactivos; fuerza mecánica utilizando un homogeneizador, etc. La inactivación del agente patógeno puede conducir al mantenimiento de su estructura, aunque sin capacidad de replicarse, o bien a la destrucción o desintegración de la estructura. En el contexto de la invención, la expresión "vacuna inactivada" incluye una composición que comprende bacterias inactivadas, pero que conservan su estructura, así como una composición en la que la estructura de la bacteria se ha destruido o desintegrado.
Otro objeto de la invención es el uso de la cepa deMhyomutante de la invención para preparar una vacuna contra la neumonía enzoótica porcina causada porMhyo,y opcionalmente contra otra enfermedad o procesos patológicos adicionales que afectan a los cerdos.
La expresión "inmunológicamente eficaz" significa que la cantidad de bacterias administrada en el proceso de vacunación es suficiente para inducir una respuesta inmunológica eficaz en el hospedador contra una infección por las formas virulentas deMhyoy, en el caso de que la cepa transformada deMhyoexprese una proteína recombinante que pueda inducir o contribuir a la inducción de una respuesta protectora contra enfermedades o procesos patológicos que puedan afectar a los cerdos, es también suficiente para inducir una respuesta inmunológica eficaz en el hospedador contra una infección causada por dicho microorganismo.
La vacuna está preferentemente destinada a conferir protección a los cerdos contra enfermedades o procesos patológicos tales como, por ejemplo, los causados por los microorganismosActinobacillus sp., Brachyspira sp., Pasteurella multocida, Salmonella sp., Streptococcus sp., Isospora sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Leptospira sp., Staphylococcus sp., Haemophilus parasuis, Bordetella bronchiseptica, Clostridium sp., Mycoplasma sp., Lawsonia intracellularis, Escherichia coli,virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino, virus de la gripe porcina, virus de la gastroenteritis contagiosa, parvovirus porcino, virus de la encefalomiocarditis, coronavirus, rotavirus, circovirus porcino, agente causante del síndrome del fracaso en el desarrollo peri-destete porcino, virus de la peste porcina clásica, virus de la peste porcina africana, calicivirus y torque teno virus (TTV).
En una realización más preferida, la enfermedad adicional es la conocida como PCVAD(Porcine Circovirus Associated Diseases,enfermedades asociadas al circovirus porcino) causada por el circovirus porcino (PCV2) tanto si se presenta como agente único o con la presencia de otros patógenos o microorganismos asociados.
La vacuna de la invención también puede combinarse, en un mismo o en diferentes recipientes, con una vacuna o composición antigénica adicional. La vacuna o vacuna de composición antigénica adicional, está destinada preferentemente a conferir protección a los cerdos contra enfermedades o procesos patológicos tales como, por ejemplo, los causados por los microorganismosActinobacillus sp., Brachyspira sp., Pasteurella multocida, Salmonella sp., Streptococcus sp., Isospora sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Leptospira sp., Staphylococcus sp., Haemophilus parasuis, Bordetella bronchiseptica, Clostridium sp., Mycoplasma sp., Lawsonia intracellularis, Escherichia coli,virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino, virus de la gripe porcina, virus de la gastroenteritis contagiosa, parvovirus porcino, virus de la encefalomiocarditis, coronavirus, rotavirus, circovirus porcino, agente causante del síndrome del fracaso en el desarrollo peri-destete porcino, virus de la peste porcina clásica, virus de la peste porcina africana, calicivirus y torque teno virus (TTV).
La vacuna de la invención comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de bacterias de una cepa inactivada o viva deMhyoque puede obtenerse de acuerdo con el método descrito en la presente invención.
Se sabe que la dosis a utilizar depende de la edad y el peso del animal a vacunar, así como de la vía de administración. Las dosis adecuadas se encuentran generalmente en un intervalo comprendido entre 103 y 1010 unidades de cambio de color (ucc), preferentemente entre 106 y 1010 ucc y más preferentemente entre 108 y 109 ucc.
Los animales pueden recibir la vacuna en cualquier momento adecuado. Una dosis de la vacuna de la invención se administra preferentemente entre 1 y 12 semanas de vida, y más preferentemente la vacuna se administra a partir de las 3 semanas de vida. En casos específicos puede ser necesaria la administración de dosis complementarias para lograr una protección satisfactoria. En estas circunstancias, una segunda dosis se administra preferentemente entre 1 y 5 semanas después de la primera dosis, más preferentemente a las 3 semanas de la primera dosis. Preferentemente, la vacuna una vacuna de administración única.
La vacuna de la invención está destinada a especies porcinas, incluidas, entre otras, cerdos, jabalíes, cerdas y lechones de cualquier edad o en cualquier fase de su ciclo productivo; está destinada preferentemente para cerdos en fase de engorde, y más preferentemente para cerdos de 1 a 12 semanas de vida.
La vacuna puede administrarse por vía intranasal, intradérmica, mucosa o submucosa, subcutánea, mediante aerosol, por vía intramuscular u oral. Preferentemente se administra por vía intradérmica o intramuscular.
Dicha vacuna puede prepararse de acuerdo con los métodos habituales utilizados por el experto en la materia para preparar formulaciones farmacéuticas adecuadas para las diferentes formas farmacéuticas, tal como se describe, por ejemplo, en el manualRemington The Science and Practice of Pharmacy,20a edición, Lippincott Williams & Wilkins, Filadelfia, 2000 [ISBN: 0-683-306472].
Las vacunas se preparan normalmente como vacunas inyectables en forma de soluciones, emulsiones o suspensiones líquidas. También pueden prepararse en una forma sólida adecuada para disolverse o suspenderse en un vehículo líquido antes de la inyección.
El volumen habitual de una dosis de vacuna inyectable está entre 0,1 ml y 5 ml, preferentemente entre 0,15 ml y 3 ml, y más preferentemente entre 0,2 ml y 2 ml. Normalmente, en la administración intradérmica se utilizan entre 0,1 ml y 0,5 ml, preferentemente entre 0,15 ml y 0,4 ml, y más preferentemente 0,2 ml. En la administración intramuscular, generalmente se utilizan entre 0,5 ml y 5 ml, preferentemente entre 1 ml y 3 ml, y más preferentemente entre 1 ml y 2 ml.
Para inmunizar a un animal con la vacuna de la invención la cepa mutante deMhyose mezcla comúnmente con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Los vehículos líquidos que pueden usarse para preparar la vacuna incluyen, por ejemplo, agua, solución salina con una concentración salina fisiológica, o el líquido de cultivo en el que se cultivan las bacterias.
Adicionalmente, si se desea, el vehículo puede contener excipientes o sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables, tales como, por ejemplo, agentes humectantes, agentes dispersantes, agentes emulsionantes, agentes tamponadores (por ejemplo, tampón fosfato), agentes estabilizadores tales como hidratos de carbono (por ejemplo, glucosa, sacarosa, manitol, sorbitol, almidón o dextranos), o proteínas (por ejemplo, albúmina, caseína, suero bovino o leche desnatada).
Las características fisicoquímicas de los excipientes, así como el nombre de los productos comerciales con los que se comercializan, pueden consultarse en el libro de R.C. Roweet al., Handbook of Pharmaceutical Excipients,4a edición, Pharmaceutical Press, Londres, 2003 [ISBN: 0-85369-472-9].
Opcionalmente, también pueden incorporarse adyuvantes a la vacuna para aumentar su eficacia. Preferentemente, la vacuna de la invención comprende además un adyuvante.
Los adyuvantes son estimulantes inespecíficos del sistema inmunitario que aumentan la respuesta inmunológica del hospedador frente al patógeno invasor. Algunos ejemplos de adyuvantes son: hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, óxido de aluminio, vitamina E, escualeno, aceite vegetal, saponinas, ginseng, cimosano, glucanos, dimetilaminoetildextrano, dextranos, polímeros en bloque no iónicos, poliacrilato (carbómero), adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund, muramil dipéptidos, emulsiones de tipo agua en aceite, aceite en agua, agua en aceite en agua, y mezclas de los mismos.
En una realización preferida, la vacuna es una vacuna inyectable y comprende la cepa mutante de la invención inactivada por un tensioactivo no iónico. Preferentemente se utiliza un tensioactivo no iónico seleccionado del grupo formado por etoxilatos de alquilfenol, ésteres de sorbitán etoxilados, alcoholes grasos etoxilados, ácidos grasos etoxilados, alcanolamidas de ácidos grasos, alcanolamidas de ácidos grasos etoxilados, aminas grasas etoxiladas, óxidos de aminas grasas, óxidos de amidoamina grasos, glicéridos de ácidos grasos, ésteres de sacarosa, poliglucósidos de alquilo, copolímeros de óxido de etileno y óxido de propileno, y alcoholes grasos etoxilados y propoxilados; más preferentemente se selecciona de etoxilatos de alquilfenol y ésteres de sorbitán etoxilados, y aún más preferentemente es un etoxilato de alquilfenol, tal como Triton® X-100 comercializado por Dow, por ejemplo.
En una realización más preferida, la vacuna es una vacuna inyectable y comprende la cepa mutante de la invención inactivada por un tensioactivo no iónico y como adyuvante, una emulsión de tipo A/A/A (agua en aceite en agua), tal como el producto Montanide® ISA 201 comercializado por la empresa SEPPIC (Francia), por ejemplo.
En una realización preferida, la vacuna puede comprender la cepa de la invención en forma liofilizada. El proceso de liofilización se lleva a cabo mediante medios bien conocidos por el experto en la materia.
Kit de vacunación
El objeto de la presente invención también incluye un kit de vacunación para vacunar a cerdos contra una infección o una enfermedad causada porMhyoy opcionalmente contra otra enfermedad o procesos patológicos causados por microorganismos que afectan a los cerdos.
Dicho kit de vacunación comprende un recipiente que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de la cepa mutante de la invención o de una vacuna de la invención.
En otra realización, el kit de vacunación comprende una combinación de la vacuna de la invención con una composición antigénica adicional, que están contenidas en un único recipiente o en diferentes recipientes. Dicha composición antigénica adicional está destinada a conferir protección a los cerdos contra enfermedades o procesos patológicos tales como los mencionados en el apartado de Vacunas.
La aplicación industrial de la invención se deduce claramente a partir de la descripción. Cabe señalar que la NEP es una enfermedad respiratoria crónica muy extendida a nivel mundial y responsable de grandes pérdidas económicas en el sector porcino, y que la posibilidad de modificar genéticamente cepas deMhyode forma dirigida y estable permite preparar vacunas con propiedades superiores a las de las bacterinas convencionales. Mediante el método de la invención pueden prepararse cepas mutantes atenuadas deMhyo,cepas mutantes que sobreexpresan un factor de virulencia específico, cepas que inhiben un factor de virulencia específico, o cepas que además expresan componentes antigénicos de microorganismos responsables de enfermedades que afectan a los cerdos, por ejemplo, adecuadas para la preparación de vacunas eficaces contra la NEP y otras patologías porcinas.
La modificación genética dirigida deMhyoen forma estable por primera vez, ha permitido a los inventores, entre otras cosas, el uso de estas cepas transformadas como vector de expresión de secuencias de ADN exógenas como, por ejemplo, secuencias de nucleótidos que codifican proteínas de interés terapéutico o preventivo tales como la proteína de la cápside del PCV2, entre otras. Mediante la tecnología divulgada en la presente invención, se han diseñado y preparado nuevas vacunas polivalentes candidatas, que puede utilizarse para prevenir diferentes enfermedades simultáneamente mediante la administración de una única cepa.
Ensayo para la producción de proteínas recombinantes por cepas transformadas de Mhyo de acuerdo con el método de la invención
El método ELISA puede usarse para identificar la presencia de la proteína expresada por la secuencia de ADN exógena en las cepas mutantes deMhyode la invención.
En particular, para detectar la presencia de la proteína de la cápside del PCV2 y cuantificarla en las cepas deMhyoobtenidas, se utilizó un kit comercial, que permitía detectar y estimar de forma aproximada la cantidad de dicho antígeno mediante inmunodetección en placas (ELISA).
Los extractos de proteínas se obtuvieron después de concentrarlos en cultivos en fase exponencial de cada cepa y someter a lisis las células obtenidas.
Los resultados fueron positivos, lo que indicaba que las proteínas codificadas por ORF2 u ORF2v2 se expresan en mayor o menor cantidad en todas las cepas y plásmidos ensayados (Figura 5B).
Las cepas con la versión procedente del plásmido pTC3C también se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante y transferencia de Western (Figura 5C). Se detectaron bandas con el mismo peso molecular que la proteína de la cápside del PCV2.
Puede observarse que las bandas de degradación proteolítica, un problema común en la expresión de proteínas recombinantes, no aparecieron en los geles de electroforesis.
Para ello, la proteína de la cápside del PCV2 expresada de forma recombinante enMhyopuede ser un buen antígeno para formular una vacuna polivalente. Del mismo modo,Mhyoes un buen hospedador para la producción recombinante de proteínas.
Ensayos de vacunación
Se comprobó la eficacia de las vacunas que contenían las cepas mutantes deMhyoobtenidas de acuerdo con el método de la invención, en donde dichas cepas comprendían la secuencia de ADN exógena que codifica la proteína de la cápside del PCV2 en el genoma de la bacteria, y expresaban dicha proteína en el citosol de la bacteria.
Para ello, se probaron vacunas que contenían las cepas 6314Cc1 o 232Cc6, y los animales se vacunaron con una dosis única o se revacunaron con una segunda dosis, como se describe en el apartado de Ejemplos. Adicionalmente, se incorporaron al estudio dos grupos de animales: un grupo no vacunado, pero infectado (grupo 5), y un grupo no vacunado y no infectado (grupo 6).
Se evaluaron las siguientes respuestas: la respuesta inmunológica contraMhyo,la respuesta inmunológica contra el PCV2 y la carga de ADN vírico del PCV2 en el suero de los animales.
Observando los resultados de los ensayos de vacunación realizados con las vacunas que comprenden cepas mutantes deMhyoobtenidas de acuerdo con el método de la invención que se muestra en las Figuras 6, 7 y 8, puede concluirse que las cepas transformadas deMhyoque expresan la proteína de la cápside del PCV2 generan una respuesta inmunológica significativa contraMhyoy, sorprendentemente, también contra el PCV2, reduciendo significativamente la carga vírica del PCV2 de tal manera que pueden utilizarse en vacunas contra infecciones causadas porMhyoy por el PCV2 al mismo tiempo.
También se probó una vacuna que contenía una cepa mutante deMhyoobtenida de acuerdo con el método de la invención contra una infección por PCV2 y Mhyo, en donde dicha cepa comprendía la secuencia de ADN exógena que codificaba la proteína de la cápside del PCV2 en el genoma de la bacteria, y expresaba dicha proteína en el citosol de la bacteria.
Se probó una vacuna que contenía la cepa 6314Cc1, se vacunó a los animales con una dosis única y se expusieron a un aislado del PCV2 y a una cepa patógena deMhyo,como se describe en los Ejemplos.
Adicionalmente, se incorporaron dos grupos de animales al ensayo: un grupo no vacunado pero infectado (grupo 2) y un grupo no vacunado y no infectado (grupo 3).
Las respuestas evaluadas fueron: la respuesta inmunológica contraMhyo,la respuesta inmunológica contra el PCV2, la carga de ADN vírico del PCV2 en el suero de los animales, y las lesiones similares a las causadas porMhyoen los pulmones de los animales.
Se observó que la cepa deMhyo,modificada genéticamente de acuerdo con el método de la invención, que expresa la proteína de la cápside del PCV2, genera una reducción significativa de la carga de ADN vírico del PCV2 y de las lesiones similares a las causadas porMhyoen los pulmones de los animales en comparación con los animales no vacunados.
También se probó una vacuna que contenía una cepa mutante deMhyoobtenida de acuerdo con el método de la invención, en donde dicha cepa comprendía un vector plasmídico replicativo que comprendía la secuencia de ADN exógena que codificaba la proteína de la cápside del PCV2 y expresaba dicha proteína en el citosol de la bacteria. Como en las pruebas anteriores, se observó que la cepa deMhyo,modificada genéticamente de acuerdo con el método de la invención mediante plásmidos replicativos, que expresa la proteína de la cápside del PCV2, genera una reducción significativa de la carga vírica del PCV2.
Comprobación del grado de atenuación de las cepas mutantes
Los mutantes obtenidos al poner en práctica el método de la invención para transformar cepas deMhyoincluyen la cepa 232TC3hlyC que contiene el plásmido pTC3 incorporado por transposición en la región del genoma que codifica un factor de virulencia deMhyo:la hemolisina C, codificada por el genhlyC.
Para evaluar el grado de atenuación de dicha cepa, se seleccionaron cerdos de 8 semanas de vida y se dividieron en dos grupos de 8 animales por grupo. El primer grupo se infectó por vía intratraqueal con una dosis de la cepa 232TC3hlyC, y el segundo grupo con una dosis de la cepa de referencia deMhyo,la cepa 232 deMhyo,antes de modificarse.
Los animales se sacrificaron 28 días después de la infección y se observó que no se produjo colonización en la zona nasal en ninguno de los dos grupos de animales, mientras que el 25 % de los animales del grupo infectado con la cepa de referencia mostraron colonización bronquial.
Ninguno de los animales infectados con la cepa transformada deMhyomostró colonización bronquial.
Por lo tanto, la cepa 232TC3hlyC transformada deMhyo,muestra atenuación en relación con la cepa progenitora de referencia y puede utilizarse, como tal, como candidata a vacuna en una vacuna viva atenuada.
La cepa 6314POGAc4 mutante deMhyo,inhibe la expresión del gen de la hemolisina 159 deMhyo,ya que la secuencia de ADN exógena incorporada mediante un plásmido replicativo (pOGA159) producía un ARN antisentido correspondiente a un gen que codifica una hemolisina deMhyo. Cuando los animales se infectaron con esta cepa, se observó que la cepa mostraba atenuación con respecto a la cepa progenitora de referencia. Dicha cepa mutante se caracterizó por una capacidad reducida para colonizar las vías respiratorias altas y bajas, así como por capacidad reducida para causar lesiones habituales de la NEP.
Los siguientes Ejemplos 1, 3 (3.1 a 3.5), 4 (4,1 a 4,5), 6, 7 y 8.1, se exponen para proporcionar al experto en la materia una explicación suficientemente clara y completa de la presente invención, pero no deben considerarse como limitantes de los aspectos esenciales del objeto de la misma que se describen en los apartados anteriores de esta descripción.
Ejemplos
Las técnicas y métodos de ADN recombinante que se aplican a continuación se describen detalladamente en los manuales de Sambrook y Russell,Molecular Cloning3a Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor New York 5 (2001) y en Ausubelet al., Current Protocols In Molecular Biology,John Wiley and Sons, Inc. (1998). Como hospedador de los vectores basados en los plásmidos pMTn4001 o pBluescript II SK, se ha utilizado la cepa XL1-blue (Stratagene) deE. coli.
Salvo que se indique lo contrario, todas las secuencias de ADN descritas en las construcciones de plásmidos descritas en este apartado proceden de la secuencia depositada en la base de datos GenBank con el número AE017243. Esta secuencia genómica corresponde a la de la cepa J deMhyodescrita por Vasconceloset al.,J. Bacteriol., 2005, 187(16), 5568-5577.
Todas las secuencias de oligonucleótidos descritas a continuación están escritas en dirección 5' a 3' salvo que se indique lo contrario. En todas las reacciones de la PCR se utilizó la termopolimerasa Phusion (Finnzymes) que tiene actividad de corrección de errores.
Las secuencias de oligonucleótidos subrayadas indican la presencia de un sitio de restricción enzimático que se especifica en el nombre de cada una de las secuencias.
Ejemplo 1.- Elección de una cepa de Mhyo
Las cepas de referencia deMhyoutilizadas fueron la cepa 6314 correspondiente a un aislado virulento deMhyode Laboratorios Hipra S.A. (Amer-Girona-España) y la cepa 232 de la Universidad Estatal de lowa (Ames-Iowa-EE.UU.).
Ejemplo 2.- Construcción de plásmidos replicativos
El ejemplo 2 (2.1 a 2.6) no forma parte de la invención, se presenta únicamente con fines ilustrativos.
Ejemplo 2.1.- Construcción del plásmido replicativo pOG
Para obtener un plásmido replicativo enMhyo,la regiónoriCdeMhyoamplificada mediante PCR se introdujo en un<plásmido pBluescript II SK. Los oligonucleótidos 5OriCNotI (ATG>C<g>C G<g>C<CGC TTA TTT ATC AGA AAC a>G<t TAG)>(SEQ ID NO: 9) y 3OriCXbaI (AGT CGG GCC CAG CTT GCG CAT CAT TGG ATG ATG GAT TC) (SEQ ID NO: 10) se utilizaron para esta amplificación y el ADN genómico de la cepa J deMhyose usó como molde. El fragmento de 1,96 kb obtenido se digirió después con las enzimas de restricciónNotIyXbaI.Por otro lado, el gen de resistencia a la gentamicina(aac(6)-aph(2")se amplificó por PCR mediante los oligonucleótidos 5GmORF (ACT GGGG ATC CAT GAA TAT AGT TGA AA ATG) (SEQ ID NO: 11) y 3GmApa (GGA TGG GCC CAG CTT GCG CAT TGG) (SEQ ID NO: 12) y usando el plásmido pIV-T como molde. A continuación, el producto de la PCR de 1,8 kb se digirió con las enzimas de restricción correspondientes. La región promotora del gen de la proteína P97 se amplificó por PCR mediante los oligonucleótidos 5'p97Xbal (G ATC TCT AGA TCG AGG AAG ACT GAT TAG AAA TTT AGA ACT) (SEQ ID NO: 13) y 3'p97BamHI (GAT CGG ATC CAC TCA TAT TTT AAA CCT CAA TTA T) (SEQ ID NO: 14) utilizando ADN de la cepa J deMhyocomo molde. A continuación, el producto de la PCR (266 pb) se digirió con las enzimas de restricción correspondientes. Por último, los tres fragmentos obtenidos se ligaron en el plásmido pBluescript II SK previamente digerido con las enzimas de restricción XbaI yBamHIy la mezcla de ligamiento se transformó en células deEscherichia coliXL1-blue. Las colonias portadoras de la construcción deseada se identificaron entre las colonias resultantes de la transformación mediante análisis de patrón de restricción y secuenciación. Uno de los clones positivos se denominó pOG y se seleccionó para las siguientes etapas (Figura 1).
Ejemplo 2.2.- Construcción del plásmido replicativo pOGCRE
El plásmido replicativo pOGCRE se obtuvo digiriendo el plásmido pOG con las enzimas de restricción BamHI yApaIy recuperando un fragmento de 5,1 kb. Por otro lado, el gen de resistencia a la gentamicina(aac(6)- aph(2")se amplificó mediante PCR a partir del plásmido pIV-T utilizando los oligonucleótidos 5GmORF y 3GmORFSpel (ACT<GAC TAG TAG CTT GCG CAT CAT TGG)>(<s>E<q ID NO: 15) obteniéndose un fragmento de 1,8 kb que después se>digirió con las enzimas de restricción BamHI y SpeI. El gen correspondiente a la recombinasa Cre se amplificó mediante PCR utilizando el plásmido pSH62 (Euroscarf) y los oligonucleótidos 5CreBgIII (ATG CAG ATC TAT GTC CAA TTT ACT GAC CGT ACA CCA AAA TTT G) (SEQ ID NO: 16) y 3CreApal (ATG CGG GCC CTTA ATC GCC ATC TTC CAG CAG GCG CAC) (SEQ ID NO: 17) como molde. El producto de la PCR (1,0 kb) se escindió con las enzimasBglIIyApaI.Finalmente, el plásmido pOG se digirió de nuevo, esta vez con las enzimas de restricciónBamHIyXbaI,y se recuperó una banda de 266 pb correspondiente al promotor del gen de la proteína P97. Los cuatro fragmentos obtenidos se ligaron mediante ADN ligasa T4 y la reacción de ligamiento se transformó en células deE. co liXL1-blue. De las colonias resultantes de la transformación, se identificaron las que portaban la construcción deseada mediante análisis de patrón de restricción. Uno de los clones positivos, denominado pOGCRE, se seleccionó para las siguientes etapas (Figura 1).
Ejemplo 2.3.- Construcción del plásmido replicativo pOGC
Para obtener el plásmido pOGC, el plásmido pBluescript II SK se digirió con la enzimaNotl,y una vez purificado se desfosforiló con la enzima fosfatasa alcalina. Al mismo tiempo, se obtuvo un fragmento de 992 pb digiriendo el gen sintético ORF2v2 (SEQ ID NO: 5) con las enzimas de restricción Spel y Notl. Usando el plásmido pOGCRE como molde, se amplificó un segmento de ADN con los oligonucleótidos 3gmORFSpel y 5OriCNotl mediante PCR y una vez purificado, el producto de la PCR se digirió con las enzimas Spel y NotI. Los tres fragmentos obtenidos se ligaron mediante ADN ligasa T4 y la reacción de ligamiento se transformó en células deE. coliXL1-blue. Los clones positivos se identificaron mediante mapeo de restricción y secuenciación (Figura 2).
Ejemplo 2.4.- Construcción del plásmido replicativo pOGL
Para obtener el plásmido pOGL, el plásmido pOGC se digirió con las enzimasNotIy Spel y se recuperaron bandas de 2,8 kb y 4 kb. El fragmento de ADN correspondiente a la banda de 2,8 kb se desfosforiló con fosfatasa alcalina. Al mismo tiempo, se obtuvo un fragmento de 2,25 kb digiriendo el plásmido pTC3L (véase el Ejemplo 3.4) con las enzimas<de restricción Spel y NotI. Los tres fragmentos obtenidos se ligaron mediante ADN ligasa t>4<y la reacción de ligamiento>se transformó en células deE. coliXL1-blue. Los clones positivos se identificaron mediante mapeo de restricción y secuenciación (Figura 2).
Ejemplo 2.5.- Construcción del plásmido replicativo pOGT
Para obtener el plásmido pOGT, el plásmido pOGC se digirió con las enzimasNotIy Spel y se recuperaron bandas<de 2,8 kb y 4 kb. El fragmento de a>D<n correspondiente a la banda de 2,8 kb se desfosforiló con fosfatasa alcalina. Al>mismo tiempo, se obtuvo un fragmento de 2,23 kb a partir de la digestión del plásmido pTC3T (véase el Ejemplo 3.5) con las enzimas de restricción SpeI y NotI. Los tres fragmentos obtenidos se ligaron mediante ADN ligasa T4 y la reacción de ligamiento se transformó en células deE. coliXL1-blue. Los clones positivos se identificaron mediante mapeo de restricción y secuenciación (Figura 2).
Ejemplo 2.6.- Construcción del plásmido replicativo pOGA159
El plásmido replicativo pOGA159 se construyó en dos etapas de clonación consecutivas. Mediante una reacción de PCR con los oligonucleótidos 5'p97Apal y 3TetMCIal (TGT TAT CGA TACC GTC GAT GCA CCT CGA GCT AAG TTA TTT TAT TG) (SEQ ID NO: 18) y usando el plásmido pMTn4001 como molde, se amplificó un fragmento de 2,2 kb correspondiente al promotor del gen de la proteína P97. Este producto de PCR se digirió con las enzimas de restricciónClaIy Apal. Por otra parte, y utilizando el plásmido pOG como molde, se amplificó un fragmento de 1,9 kb con los oligonucleótidos 5OriCCIal (AGA CAT CGA AAG CTT GAT TAT GCT GAT TGC ATT CTT TCA ATT TG) (SEQ ID NO: 19) y 5OriCEcoRI (AGA GGA AT CC GAT TTA TTT ATC AGA AAC AGT TAG TCT TTT CC) (SEQ ID NO: 20) correspondientes aloriCdeMhyo.Este producto de PCR se digirió con las enzimas de restricción EcoRI yClaI.Posteriormente, mediante PCR se amplificó un fragmento de 316 pb correspondiente al promotor del gen de la proteína P97 con los oligonucleótidos 5Xbalpp97 (AGA CTC TAG AAC TAG TGG ATC CCC CGG GCC CCT CGA GGA AGA CTG ATT AGA AAT TTA G) (SEQ ID NO: 21) y 3EcoRlpp97 (AGA CGA ATT CGA ATT CCT GCA GGG ATC CAC<TCA TAT TTT AAA CCT C)>(S<e>Q<ID NO: 22). Una vez purificado, este fragmento se digirió con las enzimas EcoRI y>BamHI. La última etapa de este primer proceso de clonación fue digerir el plásmido pBluescript II SK con las enzimas de restricción XbaI y ApaI. Estos cuatro fragmentos de ADN se ligaron mediante ADN ligasa T4 y la reacción de ligamiento se transformó en células deE. coliXL1-blue. Las colonias portadoras de la construcción deseada se identificaron entre las colonias resultantes de la transformación mediante análisis del patrón de restricción. El nuevo plásmido así obtenido se digirió con la enzima de restricción EcoRI. Por último, el ADN diseñado para el silenciamiento se amplificó mediante PCR con los oligonucleótidos 5ahlycEcoRI (CAT CGA ATT CAC GAA TTA GTG ATT CTG CCT TTT C) (SEQ ID NO: 23) y 3ahlycEcoRI (CAT CGA ATT CAT TAA AGT TGA TTC GGT GTT TAA TC) (SEQ ID NO: 24). Una vez digeridos con la enzima de restricción EcoRI y desfosforilados mediante fosfatasa alcalina, los fragmentos de ADN obtenidos se ligaron mediante ADN ligasa T4 y la reacción de ligamiento se transformó en células deE. coliXL1-blue. Las colonias portadoras de la construcción deseada se identificaron entre las colonias resultantes de la transformación mediante secuenciación (Figura 1).
Ejemplo 3.- Construcción de plásmidos para transformación por transposición
Ejemplo 3.1.- Construcción del plásmido pTC3 para transformación por transposición
El plásmido pMTn4001 (Pichet al.,Microbiology 152:519-527 (2006)) se amplificó mediante PCR con los oligonucleótidos 5pMTn4001Pstl (CAT GCT GCA GCC CGG GGG ATC CAC TAG TTC TAG AG) (SEQ ID NO: 25) y 3pMTn4001 (GTA CCC AAT TCG CCC TAT AGT GAG TCG) (SEQ ID NO: 26). El oligo 3pMTn4001 se fosforiló en su extremo 5'. El producto de esta reacción de PCR (2,98 kb) se digirió con la enzima de restricciónPstl.Por otro lado, el promotor del gen de la proteína P97 se amplificó mediante PCR con los oligonucleótidos 5'p97 (TCG AGG AAG ACT GAT TAG AAA TTT AGA ACT) (SEQ ID NO: 27) y 3'p97BamHI utilizando el ADN de la cepa J deMhyocomo molde. Este producto de PCR (280 pb) se digirió con la enzima de restricciónBamHIy se desfosforiló con fosfatasa alcalina. También se amplificó el mismo promotor mediante un segundo par de oligonucleótidos: 5'p97Apal (GAT CGG GCC CTC GAG GAA GAC TGA TTA GAA ATT TAG AAC T) (SEQ ID NO: 28) y 3'p97BamHI y se digirió con las enzimas de restricciónApalyBamHI.El gen de la transposasa se amplificó mediante PCR utilizando el plásmido<pMTn4001 como molde y los oligonucleótidos 5'TnpBamHI (GAT CGG ATC CAT GAC CCA AGT ACA TTT>T<ac ACT>GAA AAG) (SEQ ID NO: 29) y 3'TnpApaI (GAT CCT CGA GGG GGG GCC CTT TTA CAC AAT TAT ACG GAC) (SEQ ID NO: 30). La banda obtenida de 978 pb se digirió después con las enzimas de restricciónBamHIyApal.Finalmente, el fragmento correspondiente al gentetMde resistencia a la tetraciclina, se amplificó a partir del plásmido pMTnTetM438 (Pichet al.,Microbiology 152:519-527 (2006)) utilizando los oligonucleótidos 5'TetMBamHI (GAT CGG ATC CAT GAA AAT TAT TAA TAT TGG AGT T) (SEQ ID NO: 31) y 3' TetMPstl (GAT CGC TGC AGG AAT TCG ATA TCA AGC TTA TCG ATA CCG TCG ATG CAC CT) (SEQ ID NO: 32). El fragmento de 1,9 kb obtenido se digirió con las enzimas de restricciónSallyBamHIy se desfosforiló con fosfatasa alcalina. Los cinco fragmentos resultantes se ligaron mediante ADN ligasa T4 y la reacción de ligamiento se transformó en células deE. coliXL1-blue. De las colonias resultantes de la transformación, se identificaron las que portaban la construcción deseada mediante análisis de patrón de restricción y secuenciación. Uno de los clones positivos, denominado pTC3, se seleccionó para las siguientes etapas (Figura 3).
Ejemplo 3.2.- Construcción del plásmido pTC366 para transformación por transposición
Este plásmido procede directamente de pTC3 mediante la inclusión de dos secuenciasIox66de 34 pb (ATA ACT TCG<TAT AGC ATA CAT TAT ACG AAC g>G<t A) (SEQ ID NO: 33) que flanquean el gen de resistencia a la tetraciclina.>Para ello, la secuencia del gen de resistencia a la tetraciclina TetMp97 del plásmido TC3 se amplificó mediante PCR con los oligonucleótidos 5loxp66Tetp97 (GAT TAA GGG CCC ATA ACT TCG TAT AGG ATA CTT TAT ACG AAG TTA TGT CGA CCC CCT CGA GGA AGA CTG) (SEC ID NO: 34) y 3loxp66Tetp97 (GGG ACT AGT TAC GGT TCG TAT AAT GTA TGC TAT ACG AAG TTA TCT GCA GGA TAT CAA GCT TAT CGA TAC CGT CG) (SEQ ID NO: 35), obteniéndose un fragmento de PCR de 2.2 kb que se digirió con las enzimas de restricciónApaly SpeI. Al mismo tiempo, el plásmido TC3 se digirió con las mismas enzimas de restricción y se recuperó la banda de 4,4 kb. Los dos fragmentos se ligaron utilizando ADN ligasa T4 y la mezcla de ligamiento se transformó en células deE. coliXL1-blue. Un clon positivo, que tenía incorporadas correctamente secuenciasIox66y que se denominó pTC366 (Figura 3), se identificó mediante secuenciación entre las colonias resultantes de la transformación.
Ejemplo 3.3.- Construcción del plásmido pTC3C para transformación por transposición
Para obtener el plásmido pTC3C, el plásmido pTC366 se digirió con las enzimas SpeI yNotl.En este plásmido se<clonó un fragmento de 992 pb procedente de la digestión del gen sintético ORF2v2>(<se>Q<ID NO: 5) con las mismas>enzimas de restricción. Los clones positivos se identificaron mediante mapeo de restricción (Figura 3).
Ejemplo 3.4.- Construcción del plásmido pTC3L para transformación por transposición
Mediante una reacción de PCR con los oligonucleótidos P46CtFdHindlll (GTG TAA GCT TAA AAA CCA GGA TGC ACA AAA TAA C) (SEQ ID NO: 36) y P46CtRv-Notl (TGT TGC GGC CGC TTT AGG CAT CAG GAT TAT CAA C) (SEQ ID NO: 37) y usando el ADN genómico de la cepa 232 como molde, se amplificó un fragmento de 1,0 kb correspondiente al extremo 3' del gen de la proteína P46. Este producto de PCR se digirió con las enzimas de restricciónHindIIIy NotI. Por otro lado, y utilizando el mismo ADN genómico como molde, se amplificó un fragmento de 276 pb con los oligos P46NtFdSpel (AGA CAC TAG TTT GAA TTT GTA TTT TCC ATA ATC) (SEQ ID NO: 38) y P46NtRvBamHI (AGA GGG ATC CTG TAA TTG TTG AAG TTG CTG CCT) (SEQ ID NO: 39). Este fragmento correspondiente al promotor y al extremo 5' del gen de la proteína P46, se digirió después con las enzimas de restricción Spel y BamHI. Por último, y utilizando como molde el plásmido pTC3C junto con los oligonucleótidos CircRv-Notl (TGT TGC GGC CGC TTA TGG TTC TAA 55 TGG TGG ATC) (SEQ ID NO: 40) y Circ2Fd-BamHI (GTG TGG ATC CAT GAC ATA TCC AAG AAG AT) (SEQ ID NO: 41), se amplificó el gen correspondiente a la proteína de la cápside del PCV2. Este fragmento de ADN de 712 pb se digirió después con las enzimas de restricciónNotly BamHI. Todos los fragmentos obtenidos se clonaron en el plásmido pTC366 previamente digerido con las enzimas Spel y NotI. Los clones positivos se identificaron mediante mapeo de restricción (Figura 3).
Ejemplo 3.5.- Construcción del plásmido pTC3T para transformación por transposición
En este ejemplo, se usaron los oligonucleótidos P46NtFdSpel y P46CIRCRv (ATC TTC TTC TTG GAT ATG TCA TGG<CAT>C<a>G<GAT TAT CAA CAT TA) (SEQ ID NO: 42) para la amplificación por PCR de la región promotora y del>extremo 5' de la región codificante del gen de la proteína P46 a partir del ADN genómico de la cepa 232. La banda de 1,25 kb obtenida se escindió con la enzima de restricción SpeI. Al mismo tiempo, se realizó una segunda reacción de PCR con los oligonucleótidos P46CIRCFd (TAA TGT TGA TAA TCC TGA TGC CAT GAC ATA TCC AAG AAG AT) (SEQ ID NO: 43) y CircRv-Notl en pTC3C obteniéndose un fragmento de ADN de 732 pb. Mediante una reacción de PCR recombinante en la que se utilizaron los fragmentos anteriores como molde y usando los oligonucleótidos P46NtFdSpel y CircRv-Notl, se obtuvo un fragmento de 2,2 kb. Este fragmento se digirió con las enzimas de restricción SpeI yNotIy se ligó con el plásmido pTC366 previamente digerido con las enzimas SpeI y NotI. Los clones positivos se identificaron mediante mapeo de restricción y secuenciación (Figura 3).
Ejemplo 4.- Obtención de bacterias transformantes
Los ejemplos 4.6 a 4.8 no forman parte de la presente invención y se presentan únicamente con fines ilustrativos.
Todos los productos y reactivos utilizados en este método se esterilizaron mediante autoclave, filtración o irradiación. El material de partida fue un cultivo deMhyoen fase de crecimiento exponencial. Esta fase de crecimiento se obtiene preferentemente utilizando una dilución 1/100 del inóculo y dejando crecer el cultivo durante aproximadamente 48-144 horas en medio FriisHS (suero de caballo irradiado al 20 % (v/v), extracto de levadura al 2,4 % (v/v), rojo de fenol al 0,1 % (v/v), "solución salina equilibrada de Hank" al 0,4 %, "infusión de caldo de corazón" al 0,058 % (p/v), PPLO al 0,054 % (p/v) y ampicilina a una concentración final de 100 pg/ml). Una vez obtenidos aproximadamente 40 ml de cultivo deMhyoen fase estacionaria, para separar las células, el contenido de los matraces de cultivo se pipeteó 10 veces, y después, para terminar de separar las células, el cultivo se filtró con un filtro de 0,45 pm. A continuación, las células se centrifugaron durante 20 minutos a 20.000xg, se resuspendieron en un tampón de electroporación (sacarosa 272 mM, Hepes 200 mM a pH 7,2) suplementado con EDTA 1 mM y se incubaron en hielo durante 10 minutos. Después de 10 minutos de incubación con EDTA, se repitió la centrifugación a 20.000xg durante 20 minutos y las células se resuspendieron en un volumen entre 100 y 300 pl de tampón de electroporación. En una cubeta de electroporación de 0,2 cm, se añadieron 20 pg de plásmido previamente disuelto en tampón de electroporación a una concentración entre 0,5 y 2 p g m l'1 y la suspensión celular hasta un volumen final de 100 pl. Al realizar la electroporación, las variables del equipo de electroporación se ajustaron a una tensión de 2,5 kV, a una resistencia entre 100 y 175 O y a una capacitancia de 25 pF. Los valores habituales de la "constante de tiempo" obtenidos estuvieron entre 2,3 y 3 ms. Una vez emitido el pulso eléctrico, se añadieron 900 pl de medio FriisFBS (exactamente la misma formulación que la del medio FriisHS, pero sustituyendo el suero de caballo por suero bovino fetal) y 20 pg adicionales de plásmido. La suspensión resultante se incubó durante 20 minutos en hielo y después durante 3 horas a 37 °C y con CO2 al 5 %. Transcurridas las 3 horas, la suspensión obtenida se distribuyó (aproximadamente 200 pl por placa) en placas con FriisHS suplementadas con agar de bajo punto de fusión al 0,7 % (p/v) y el antibiótico selectivo deseado (tetraciclina 0,5 pg/ml y/o gentamicina 10 pg/ml).
Después de 2 o 3 semanas de incubación a 37 °C y con CO2 al 5 %, las colonias transformantes en las placas con Friis HS se recuperaron y se inocularon en matraces de 50 ml que contenían 10 ml de medio FriisHS suplementado con el antibiótico selectivo a las concentraciones indicadas anteriormente. Una vez que el medio cambió de color (entre 10 y 20 días después de la incubación a 37 °C y 150 rpm) se realizaron estudios genotípicos y/o fenotípicos de los mutantes obtenidos obteniendo ADN genómicos o extractos de proteínas como sabe hacer cualquier experto en la materia.
Ejemplos 4.1. a 4.8. - Obtención de cepas mutantes transformadas de Mhyo
(Los ejemplos 4.6 a 4.8 no forman parte de la invención y se presentan únicamente con fines ilustrativos)
Siguiendo sustancialmente el método descrito en el Ejemplo 4, las cepas mutantes transformadas deMhyoque se muestran en la Tabla I se prepararon utilizando los plásmidos que también se indican en la misma tabla.
Tabla I
Las cepas mutantes mostradas en la tabla se seleccionaron de entre diferentes mutantes obtenidos en la transformación llevada a cabo de acuerdo con el método de la invención (Ejemplos 4.1 a 4.5) o como se describe en el presente documento (Ejemplos 4.6 a 4.8). Estas cepas se utilizaron en diferentes ensayos de vacunación y grado de atenuación.
Ejemplo 5.-Análisis de las cepas mutantes obtenidas por transformación con plásmidos replicativos(Los ejemplos 5.1 a 5.3 no forman parte de la presente invención y se presentan únicamente con fines ilustrativos).
Ejemplo 5.1.-Análisis de las cepas mutantes obtenidas por transformación con el plásmido replicativo pOGLa cepa transformada del Ejemplo 4.6, 232POGc9, se utilizó para confirmar la presencia del plásmido en las células recuperadas de la transformación de placas con agar Friis y cultivadas en medio FriisHS con l0 pg/ml de gentamicina. Para ello, se purificó el ADN total de las células. El ADN obtenido se digirió con la enzima de restricción Seal, que en este caso da lugar a la aparición de bandas fácilmente identificables en un gel de agarosa (Figura 4A).
La aparición de las bandas correspondientes al plásmido, que destacan claramente sobre el fondo de ADN genómico, indica que el clon analizado contiene el plásmido y que este plásmido se replica de forma estable dando lugar a 25 30 copias de plásmido por célula.
El análisis de los resultados muestra que los plásmidos replicativos de la invención se propagan de forma estable a la descendencia de las bacterias transformadas.
Ejemplo 5.2.- Análisis de las cepas mutantes obtenidas por transformación con el plásmido replicativo pOGCRE
La cepa transformada del Ejemplo 4.7, 232POGCREc1, incluye el gen que codifica la proteína Cre.
Para comprobar si la introducción de genes heterólogos mediante plásmidos replicativos daba lugar a la expresión de las proteínas correspondientes de forma detectable enMhyo,se analizó una extracción total de proteínas de los clones recuperados en los ensayos de transformación con el plásmido pOGCRE mediante electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante y, posteriormente, se realizó una transferencia de Western para detectar la presencia de la recombinasa Cre mediante métodos inmunológicos (Figura 4B).
En este caso, la proteína Cre solo se detectó en la cepa que se había transformado con el plásmido pOGCRE, mostrando así la utilidad de los plásmidos replicativos para la expresión heteróloga de proteínas enMhyo.
Ejemplo 5.3.- Análisis de las cepas mutantes obtenidas por transformación con el plásmido replicativo pOGA159
La cepa transformada del Ejemplo 4.8, 6314pOGAc4, se utilizó para confirmar la presencia del plásmido en las células recuperadas de la transformación de placas con agar Friis y cultivadas en medio FriisHS con 0,5 pg/ml de tetraciclina. Para ello, se purificó el ADN total de las células. El ADN obtenido se analizó mediante un gel de agarosa, que en este caso, produjo la aparición de bandas fácilmente identificables al compararlas con la preparación de ADN obtenida de la cepa progenitora 6314 (Figura 4C).
Ejemplo 6.- Análisis de las cepas mutantes obtenidas por transformación mediante transposición Ejemplo 6.1.- Análisis de las cepas mutantes obtenidas por transformación mediante transposición del plásmido pTC3
Diferentes clones transformantes obtenidos por electroporación con el plásmido TC3, se analizaron tanto por transferencia de Southern como por secuenciación directa del ADN genómico para demostrar que los mutantes resistentes a la tetraciclina eran el resultado de la presencia de la inserción del transposón en el cromosoma bacteriano.
Para garantizar que todos los clones obtenidos portaban una única inserción del transposón y que estas inserciones no se removilizaron después de varias generaciones, se realizó una transferencia de Southern del ADN genómico de un clon obtenido mediante el plásmido pTC3 denominado 232TC3hlyC. Este clon se denominó así porque los resultados de la secuenciación indicaron que el transposón se había insertado en la secuencia codificante del genhlyC(base 843448 del genoma de la cepa 232, GenBank AE017332.1). Para ello, tanto el ADN genómico de la cepa 232 como el de la cepa 232TC3hlyC se digirieron con las enzimas de restricción EcoRI y EcoRV. Los fragmentos resultantes se separaron en un gel de agarosa al 0,7 % y se transfirieron a una membrana de nailon. Se generó una sonda con oligonucleótidos, SondaTet-5 (ATG AGT GGA TCC ATG AAA ATT ATT AAT ATT G) (SEQ ID NO: 44) y SondaTet-3 (CTA AGT TAT TTT ATT GAA CAT ATA TCG TAC TTT ATC) (SEQ ID NO: 45), mediante una reacción de PCR con dUTP(desoxiuridina trifosfato) marcado con digoxigenina utilizando como molde el plásmido pTC3. La sonda reconoce la secuencia del genTetMde resistencia a la tetraciclina, de modo que las regiones del genoma donde se produjo la inserción del transposón (Figura 5A) se detectaron en la transferencia de Southern. El número y el tamaño de las bandas coincidían con los esperados teóricamente, lo que indicaba que los mutantes obtenidos mediante este método y dichos vectores tienen una sola copia de inserción de transposón y que dicha inserción se mantiene estable después de varias generaciones.
Ejemplo 6.2.- Análisis de las cepas mutantes obtenidas por transformación mediante transposición del plásmido pTC3C, pTC3L y pTC3T
Se seleccionaron varios mutantes originados de cada transposón y se denominaron 6314Cc1, 232Cc6, 232Lc2, 232Tc2. Como se ha mencionado anteriormente, se seleccionaron dos mutantes con el plásmido diseñado para la expresión citosólica (uno, 6314Cc1, para la cepa 6314 y el otro, 232Cc6, para la cepa 232) mientras que las versiones diseñadas para ubicarse en la membrana solo se han ilustrado en la cepa 232 como el mutante 232Lc2 del plásmido pTC3L y como el mutante 232Tc2 del plásmido pTC3T.
Los puntos de inserción de los transposones de la versión citosólica (pTC3C) en el cromosoma bacteriano se determinaron mediante secuenciación directa de ADN genómico. En referencia al genoma de la cepa 232 (GenBank AE017332.1), el transposón del clon 6314Cc1 se insertó en la base 224547, mientras que el transposón del clon 232Cc6 se insertó en la base 569253.
Para identificar la presencia de la proteína de la cápside del PCV2 y cuantificarla en las cepas deMhyoobtenidas (232Lc2, 232Cc6, 232Tc2 y 6314Cc1), se usó un kit comercial (Ingenasa) que permite detectar y cuantificar dicho antígeno mediante inmunodetección en placas (ELISA). Los extractos de proteínas se obtuvieron después de concentrar 100 veces los cultivos de cada cepa en fase exponencial y de someter a la lisis las células obtenidas en PBS y Triton® X-100 a una concentración final del 0,1 % (v/v). Los resultados fueron positivos, lo que indicaba que todas las cepas y plásmidos analizados expresaban las proteínas codificadas por ORF2 u ORF2v2 en mayor o menor cantidad (Figura 5B).
Las cepas con la versión del plásmido pTC3C también se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante y transferencia de Western (Figura 5C). Se detectaron bandas con el mismo peso molecular que el de la proteína de la cápside del PCV2. Es interesante destacar, que no había ninguna banda de degradación proteolítica, un problema común en la expresión de proteínas recombinantes. Todo esto sugiere que la proteína de la cápside del PCV2 expresada enMhyode forma recombinante, puede ser un buen antígeno para formular una vacuna polivalente. Del mismo modo, se confirma queMhyoes un buen hospedador para expresar proteínas recombinantes.
Ejemplo 7.- Ensayos de vacunación
Ejemplo 7.1.- Vacunación y exposición a PCV2
Se probó la eficacia de vacunas que contenían cepas transformadas deMhyopreparadas de acuerdo con el método de la invención, en donde dichas cepas expresaban la proteína de la cápside del circovirus PCV2 en su citosol, y los animales se expusieron a una cepa patógena del PCV2.
Las respuestas evaluadas fueron la respuesta inmunológica contraMhyoy contra el PCV2 determinadas mediante ELISA y la carga de ADN vírico del PCV2 en el suero de los animales.
Para la prueba se seleccionaron 72 cerdos de 28 días de vida, se dividieron al azar en 6 grupos de 12 animales cada uno.
Dicha eficacia se probó según un diseño factorial 22 (diseño experimental con dos factores, cada uno con dos niveles) con cuatro grupos de animales, en el que los factores a evaluar eran las cepas transformadas deMhyoy el programa de vacunación. Con esa finalidad, se probaron vacunas que contenían las cepas 6314Cc1 o 232Cc6, y los animales se vacunaron siguiendo un programa de dosis única o de revacunación con una dosis adicional.
Los grupos de ensayo realizados se muestran en la Tabla II:
Adicionalmente, se incorporaron al estudio dos grupos de animales: un grupo no vacunado pero infectado (grupo 5), y un grupo no vacunado y no infectado (grupo 6).
Las vacunas comprendían las cepas mutantes deMhyoinactivadas mediante un tensioactivo no iónico y una emulsión de tipo A/A/A como adyuvante, y se administraron por vía intramuscular en el cuello del animal.
El programa de vacunación consistía en administrar una dosis de 2 ml de vacuna el día 0 del estudio a todos los animales que no formaban parte de los grupos de control, y 14 días después de la primera dosis, se volvió a vacunar a la mitad de los animales.
Los animales de los grupos 5 y 6 recibieron 2 ml de PBS como placebo tanto el primer día como el día 14.
Para preparar los antígenos para las vacunas, las cepas deMhyotransformadas se cultivaron en medio Friis con 0,5 |jg/ml de tetraciclina a una temperatura de 37 °C con agitación entre 100 y 200 rpm hasta que se observó un cambio de color debido a un cambio en el pH del medio de cultivo.
Los cultivos se centrifugaron y se lavaron dos veces con PBS para obtener un cultivo 30 veces concentrado. El antígeno correspondiente a la cepa deMhyotransformada 6314Cc1, tenía un título de 9,2 unidades de cambio de color/ml (logi0 UCC/ml) y el antígeno correspondiente a la cepaMhyotransformada, 232Cc6, tenía un título de 9,45 logi0 UCC/ml. La producción de la proteína de la cápside del PCV2 se confirmó mediante ELISA (Ingezim PCV DAS, Ingenasa, España). La proteína total de cada antígeno era de 373 mg/l y 350,2 mg/l, respectivamente, determinada mediante el método del azul de Coomassie.
Los antígenos se inactivaron con un tensioactivo no iónico y como adyuvante se utilizó una emulsión de tipo A/A/A, tal como el producto Montanide® ISA 201 (SEPPIC, Francia), en una proporción de 50:50 peso/peso, por ejemplo. Se extrajeron muestras de sangre de los animales el día anterior a la vacunación (día -1), el día 13 (el día anterior a la revacunación), el día 27 (antes de la infección) y los días 7, 14 y 21 después de la infección, que correspondían, respectivamente, a los días 35, 42 y 49 del estudio.
Se obtuvo suero para determinar la respuesta inmunológica contra el PCV2 mediante el kit de ensayo ELISA para detectar anticuerpos contra el PCV2 (Biocheck, Países Bajos) y contraMhyomediante CIVTEST SUIS Myo (Hipra, Girona-Amer, España); y también para el análisis de la viremia por PCV2.
Las muestras de suero se obtuvieron los días -1, 13 y 27 y, dado que se esperaba que fueran negativas, se analizaron mediante PCR estándar, tal como se describe, por ejemplo, en Quintanaet al.,Veterinary Record, 2001, 149, 357 361, mientras que las muestras recogidas los días 7 y 14 después de la infección, se analizaron mediante PCR cuantitativa, como se describe, por ejemplo, en Olveraet al.,J. Virol. Meth., 2004, 10117, 75-80.
Los animales de los grupos 1 a 5 se infectaron por vía intranasal con 2 ml (5,66 log10 CCID50/ml) (dosis infecciosa que puede infectar al 50 % de las células en cultivo en ml y expresado en escala logarítmica en base 10) de una cepa virulenta de referencia del PCV2 (Sp-107-54-13 PCV2, Fortet al.,Vet. Immunol. Immunopathol., 2010, 137, 226-234) 28 días después de la administración de la primera dosis de la vacuna. Los animales del grupo 6 recibieron 2 ml de PBS por vía intranasal como placebo. Los animales se sacrificaron el día 49 del estudio, es decir, 21 días después de la infección.
Durante el ensayo de infección-vacunación completamente oculto y aleatorizado, los animales se instalaron en salas con nivel de bioseguridad 3. El grupo 6 se llevó a una sala distinta para impedir que se produjeran infecciones cruzadas y, por lo tanto, fue el único grupo cuyo tratamiento no se ocultó al personal responsable del cuidado de los animales. Teniendo en cuenta que los animales tenían anticuerpos maternos anti-PCV2, los grupos se trataron en bloques en relación a este parámetro para impedir diferencias iniciales entre los grupos.
El parámetro principal para evaluar la eficacia de la infección por PCV2 fue la reducción de la viremia por PCV2 determinada mediante PCR cuantitativa.
El parámetro principal para determinar la eficacia en relación conMhyofue la seroconversión analizada mediante ELISA.
La respuesta serológica aMhyose muestra en la Figura 6. Las cuatro vacunas de prueba promovieron una seroconversión significativa en comparación con los grupos no vacunados (grupos 5 y 6) a partir del día 13 del estudio. Después de la infección por PCV2, los grupos vacunados mostraron una mayor respuesta inmunológica en relación con el grupo no vacunado pero infectado el día 14 después de la infección y también el día 21 después de la infección, con la excepción del grupo 4.
El grupo no vacunado y no infectado mostró la disminución normal de anticuerpos maternos anti-PCV2 con una diferencia significativa respecto al grupo no vacunado e infectado el día 21 después de la infección.
No se observaron signos clínicos asociados a las infecciones por PCV2. Los modelos de ensayo de PCV2 son normalmente modelos subclínicos, y el parámetro clave para determinar la eficacia de la vacuna es la reducción de la viremia.
Todos los animales resultaron ser negativos con respecto al PCV2 de acuerdo con el análisis realizado mediante PCR estándar antes de la infección. La figura 8 muestra las copias genómicas de PCV2 que se cuantificaron en tiempo real por PCR, 7 y 14 días después de la infección. No se detectaron copias genómicas de PCV2 en las muestras de suero del grupo no vacunado y no infectado.
La viremia de PCV2 fue significativamente menor en los grupos vacunados en comparación con el grupo no vacunado pero infectado el día 14 después de la infección.
Los resultados de este estudio indican que las cepas deMhyotransformadas mediante el método de la invención y que expresan la proteína de la cápside del PCV2, generan al mismo tiempo una respuesta inmunológica significativa contraMhyoy un circovirus porcino de tipo 2 (PCV2).
La respuesta inmunológica diferencial contra el PCV2 en los animales vacunados fue clara el día 14 después de la infección, una vez establecida la infección por PCV2, como se deduce de la viremia de PCV2 observada en el grupo no vacunado e infectado (grupo 5).
Al contrario de lo que ocurrió conMhyo,la presencia de anticuerpos maternos anti-PCV2 impidió la evaluación de la inmunogenicidad de la vacuna en ausencia de una infección experimental.
Dado que los signos clínicos correspondientes a las lesiones macroscópicas debidas a la infección por PCV2 no pueden reproducirse en un modelo experimental, el resultado de la infección por PCV2 se evaluó en términos de viremia mediante PCR cuantitativa y la eficacia de la vacuna se demostró mediante la reducción de la viremia. Esta reducción se observó para las cuatro vacunas de prueba 14 días después de la infección, una vez que la viremia alcanzó su nivel máximo.
Por lo tanto, las cepas deMhyotransformadas que expresan la cápside de la proteína del PCV2 pueden usarse en vacunas contra infecciones causadas porMhyoy por circovirus porcino tipo 2 (PCV2) al mismo tiempo.
Ejemplo 7.2.- Vacunación e infección con PCV2 y Mhyo
Se probó la eficacia de una vacuna que contenía una cepa deMhyotransformada, preparada de acuerdo con el método de la invención, en donde dicha cepa expresaba la proteína de la cápside del circovirus PCV2 en su citosol. Los animales se expusieron a cepas patógenas de PCV2 yMhyo.
Las respuestas evaluadas fueron la carga de ADN vírico del PCV2 en el suero de los animales, el número de animales con viremia por PCV2 y las lesiones similares a las causadas porMhyoen los pulmones de los animales.
Para la prueba se seleccionaron 36 cerdos de 28 días de vida, se dividieron al azar en 3 grupos de 12 animales cada uno.
Dicha eficacia se probó con una vacuna que contenía la cepa 6314Cc1. Los animales del grupo 1 se vacunaron siguiendo un programa de dosis única. Adicionalmente, se incorporaron al estudio dos grupos de animales: un grupo no vacunado pero infectado (grupo 2) y un grupo no vacunado y no infectado (grupo 3).
La vacuna comprendía la cepa mutante deMhyoinactivada mediante un tensioactivo no iónico y una emulsión de tipo A/A/A como adyuvante, y se administró por vía intramuscular en el cuello del animal.
El programa de vacunación consistía en administrar una dosis de 2 ml de vacuna el día 0 del estudio a todos los animales que no formaban parte de los grupos de control.
Los animales de los grupos 2 y 3 recibieron 2 ml de PBS como placebo.
Para preparar los antígenos para la vacuna, la cepa deMhyotransformada se cultivó en medio Friis con 0,5 pg/ml de tetraciclina a una temperatura de 37 °C con agitación entre 100 y 200 rpm hasta que se observó un cambio de color debido a un cambio en el pH del medio de cultivo.
Los cultivos se centrifugaron y se resuspendieron en PBS para obtener un cultivo 25 veces concentrado. El antígeno correspondiente a la cepa deMhyotransformada, 6314Cc1, tenía un título de 9.325 unidades de cambio de color/ml (log-10 UCC/ml). La producción de la proteína de la cápside del PCV2 se confirmó mediante ELISA (Ingezim PCV DAS, Ingenasa, España).
Los antígenos se inactivaron con un tensioactivo no iónico, y como adyuvante se utilizó una emulsión de tipo A/A/A, por ejemplo, el producto Montanide® ISA 201 (SEPPIC, Francia) en una proporción de 50:50 peso/peso.
Se extrajeron muestras de sangre de los animales el día anterior a la vacunación (día -1), los días 13, 21 y 27 después de la vacunación, y los días 7, 14, 21 y 28 después de la infección, que corresponden, respectivamente, a los días 35, 42, 49 y 56 del estudio.
Se obtuvo suero para determinar la viremia por PCV2 mediante PCR cuantitativa, como se describe, por ejemplo, en Olveraet al.,ya citados.
Los animales de los grupos 1 y 2 se infectaron por vía intranasal con 2 ml/animal (5,33 log-10 CCID50/ml) de una cepa virulenta de referencia del PCV2 (Sp-107-54-13 PCV2, Fortet al.,Vet. Immunol. Immunopathol., 2010, 137, 226-234), y por vía intratraqueal con 10 ml/animal de la cepa patógenaMhyo3371 (7,325 log-10 UCC/ml) 28 días después de la administración de la vacuna. Los animales del grupo 3 recibieron 2 ml de PBS por vía intranasal y 10 ml de PBS/animal por vía intratraqueal como placebo. Los animales se sacrificaron el día 56 del estudio, es decir, 28 días después de la infección, momento en el que evaluó la presencia de lesiones similares a las causadas porMhyoen los pulmones de los animales.
Durante el ensayo de infección-vacunación completamente oculto y aleatorizado, los animales se instalaron en salas con nivel de bioseguridad 3. El grupo 3 se llevó a una sala distinta para impedir que se produjeran infecciones cruzadas y, por lo tanto, fue el único grupo cuyo tratamiento no se ocultó al personal responsable del cuidado de los animales. Teniendo en cuenta que los animales tenían anticuerpos maternos anti-PCV2, los grupos se trataron en bloques en relación a este parámetro para impedir diferencias iniciales entre los grupos.
El parámetro principal para evaluar la eficacia de la infección por PCV2 fue la reducción de la viremia por PCV2 determinada mediante PCR cuantitativa. El parámetro principal para determinar la eficacia en relación conMhyofue la superficie pulmonar afectada por lesiones similares a las causadas porMhyo.
Todos los animales resultaron ser negativos con respecto al PCV2 de acuerdo con el análisis realizado mediante PCR estándar antes de la infección experimental. La figura 12 muestra las copias genómicas de PCV2 que se cuantificaron en tiempo real por PCR, 7, 14, 21 y 28 días después de la infección. No se detectaron copias genómicas de PCV2 en las muestras de suero del grupo no vacunado y no infectado. La viremia de PCV2 fue significativamente menor en el grupo vacunado en comparación con el grupo no vacunado pero infectado los días 14 y 21 después de la infección. En la figura 13 se muestran los mismos resultados expresados como porcentaje de animales con viremia (positivos en la PCR cuantitativa).
En la figura 14 se muestra la mediana del porcentaje de la superficie pulmonar afectada por lesiones similares a las causadas porMhyo.Se observó que la superficie pulmonar afectada en los animales vacunados era significativamente inferior a la de los animales no vacunados pero infectados (grupo 2).
Los resultados de este estudio llevaron a la conclusión de que la cepa deMhyotransformada genéticamente de acuerdo con el método de la invención y que expresa la proteína de la cápside del PCV2, generó al mismo tiempo una reducción significativa de la viremia por PCV2 y de las lesiones similares a las causadas porMhyoen comparación con los animales no vacunados.
En consecuencia, las cepas deMhyotransformadas que expresan la cápside de la proteína del PCV2 pueden usarse en vacunas contra infecciones causadas porMhyoy por circovirus porcino tipo 2 (PCV2) al mismo tiempo.
Ejemplo 8.- Pruebas del grado de atenuación de cepas mutantes transformadas
Ejemplo 8.1.-Prueba del grado de atenuación de una cepa mutante transformada portadora de una inserción transposónica en el gen de la hemolisina C de Mhyo
En esta prueba, el grado de atenuación de una cepa mutante deMhyoobtenida por transposición se determinó evaluando la capacidad de dicha cepa para colonizar las vías respiratorias altas y bajas de cerdos.
La cepa mutante probada, 232TC3hlyC, obtenida en el Ejemplo 4.5, muestra inserción transposónica en el gen de la hemolisina C(hlyC)deMhyo.
Se seleccionaron cerdos de 8 semanas de vida, se dividieron al azar en 2 grupos de 8 animales cada uno, y cada grupo se mantuvo en salas distintas para impedir que se produjeran infecciones cruzadas.
Los animales se sedaron antes de la infección. Un grupo de animales se infectó por vía intratraqueal el día 0 con 10 ml de la cepa mutante 232TC3hlyC, y el otro grupo con 10 ml de la cepa progenitora 232 deMhyo.Los inóculos tenían un título de 7 log 10 UCC/ml. Los animales se sacrificaron el día 28 del estudio.
Se recogieron muestras nasales los días -1 (el día anterior a la infección), 8, 15, 21 y 28 para realizar un análisisMhyomediante PCR anidada.
El día 28, se recogieron muestras bronquiales de los animales sacrificados para realizar un análisis deMhyotambién mediante PCR anidada.
No se detectaron animales portadores del ADN genómico deMhyoen las muestras nasales recogidas a lo largo del estudio. Sin embargo, la cepa 232 de referencia deMhyose detectó en el 25 % de las muestras bronquiales de los animales, mientras que la tasa de detección fue del 0 % para la cepa mutante transformada.
Este resultado sugiere que la cepa mutante 232TC3hlyC muestra un comportamiento atenuado en comparación con la cepa progenitora de la que procede, en relación con la colonización de las vías respiratorias inferiores; por lo que puede usarse como candidato atenuado en una vacuna contraMhyo.
Ejemplo 8.2.- Prueba del grado de atenuación de una cepa mutante transformada que muestra inhibición de la expresión del gen de la hemolisina 159 de Mhyo
El Ejemplo 8.2 no forma parte de la invención, se presenta únicamente con fines ilustrativos.
El grado de atenuación de la cepa 6314POGAc4 obtenida en el Ejemplo 4.8, que muestra inhibición de la expresión del gen de la hemolisina 159 deMhyo,se determinó en otro ensayo.
Se seleccionaron cerdos de 8 semanas de vida, se dividieron al azar en 3 grupos de 8 animales cada uno y se mantuvieron en salas distintas para impedir que se produjeran infecciones cruzadas.
El día 0 de la prueba, los animales del grupo 1 se inocularon por vía intratraqueal con 10 ml de la cepa 6314POGAc4 a una concentración de 8 log-10 UCC/ml y la misma cantidad de la cepa progenitora de referencia 6314 se administró a los animales del grupo 2. Los animales se sedaron antes de la infección. El grupo 3 era el grupo de control no infectado. Los animales se sacrificaron el día 28 del estudio.
Se extrajeron muestras de sangre el día anterior a la infección (día -1) y los días 15 y 28. La serología deMhyose analizó mediante CIVTEST SUIS Mhyo (Hipra-Amer-Girona-España). Se recogieron muestras nasales los días -1, 8, 15, 21 y 28 para realizar un análisis deMhyomediante PCR anidada.
El día 28 se recogieron muestras bronquiales de los animales sacrificados para realizar un análisis deMhyotambién mediante PCR anidada.
Se calificaron las lesiones pulmonares macroscópicas de bronconeumonía catarral compatibles con infección porMhyo.Cada lóbulo pulmonar recibió una puntuación de 0 a 5 según la proporción de tejido afectado por lesiones causadas porMhyo.
La contribución de cada lóbulo pulmonar a la superficie pulmonar total afectada se calculó aplicando el método descrito por Christensenet al., Diseases of the respiratory system.En:Diseases of Swine.8a edición. Straw B.E., D'Allaire S., Mengeling W.L. y Taylor D.J. Iowa State University Press, Ames (IA) 1999, página 914.
La figura 9 muestra la respuesta serológica contra la infección porMhyo.Se puede observar que solo la cepa progenitora de referencia (grupo 2 ) mostró seroconversión 28 días después de la infección, con una diferencia significativa con respecto al grupo 1, infectado con la cepa mutante transformada 6314POGAc4, y al grupo de control.
La figura 10 muestra queMhyosolo se detectó en las muestras nasales del grupo 2, 21 y 28 días después de la infección. En los 8 animales del grupo 2,Mhyose detectó en las muestras bronquiales recogidas el día 28 , mientras que el número fue significativamente menor en el grupo al que se administró la cepa mutante transformada de la invención.
En la figura 11 puede observarse que las lesiones pulmonares macroscópicas causadas porMhyofueron significativamente mayores en el grupo 2 , infectado con la cepa progenitora de referencia, mientras que los animales infectados con la cepa mutante de la invención mostraron lesiones más pequeñas comparables a las observadas en el grupo no infectado.
Por lo tanto, puede concluirse que la cepa mutante transformada de la invención, probada en este ejemplo, muestra una capacidad reducida para colonizar las vías respiratorias altas y bajas y también una capacidad reducida para causar lesiones pulmonares asociadas a la NEP.
Todo esto sugiere que dicha cepa mutante transformada puede usarse para preparar vacunas atenuadas contra la NEP y patologías asociadas aMhyo.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un método para preparar una cepa mutante deMycoplasma hyopneumoniae (Mhyo),caracterizado por que comprende la etapa de transformar una cepa deMhyoutilizando un vector transposónico que comprende al menos una secuencia de ADN exógena, estando dicha secuencia bajo el control de una secuencia de ADN de una región promotora deMhyo,en donde el vector transposónico comprende:
1) una secuencia de ADN que codifica una transposasa,
2) una secuencia de ADN exógena que comprende un gen marcador, y
3) opcionalmente, una secuencia de ADN exógena adicional,
en donde la secuencia de ADN que codifica una transposasa y al menos una de las secuencias de ADN exógenas están bajo el control de una secuencia de ADN de una región promotora deMhyo,en donde la región promotora deMhyocorresponde a un segmento de ADN que comprende entre 50 pares de bases y 300 pares de bases situado en el lado 5' del gen de una proteína deMhyoseleccionada del grupo formado por las proteínas P36, P46, P65, P76, P97, P102, P146 y P216, en donde la región promotora deMhyoinicia o promueve la transcripción de una secuencia de ADN deMhyo,y
en donde la secuencia de ADN exógena se introduce de forma estable en el genoma de la cepa deMhyo.
2.El método de la reivindicación 1, caracterizado por que la secuencia de ADN exógena se selecciona del grupo que comprende un gen de resistencia a un antibiótico, un gen que codifica una recombinasa, un gen que codifica una transposasa, una secuencia diana de la transposasa, un fragmento de ADN deMhyo,un gen que codifica un componente antigénico de un microorganismo causante de enfermedades porcinas, y combinaciones de los mismos.
3. El método de la reivindicación 1 o 2, caracterizado por que el vector transposónico comprende una secuencia de ADN exógena adicional, que se selecciona del grupo formado por la secuencia de ADN que codifica la proteína de la cápside del circovirus porcino de tipo 2 (PCV2) y la secuencia de ADN que codifica una proteína que comprende la proteína de la cápside del circovirus porcino de tipo 2 (PCV2) que lleva adicionalmente los aminoácidos MetSerGlySer en el extremo aminoterminal de dicha proteína, preferentemente en donde dicha secuencia de ADN exógena adicional que codifica la proteína de la cápside del PCV2 se selecciona del grupo formado por SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5.
4. Un vector transposónico que comprende:
1) una secuencia de ADN que codifica una transposasa,
2) una secuencia de ADN exógena que comprende un gen marcador, y
3) opcionalmente, una secuencia de ADN exógena adicional,
en donde la secuencia de ADN que codifica una transposasa y al menos una de las secuencias de ADN exógenas están bajo el control de una secuencia de ADN de una región promotora deMycoplasma hyopneumoniae (Mhyo),en donde la región promotora deMhyocorresponde a un segmento de ADN que comprende entre 50 pares de bases y 300 pares de bases situado en el lado 5' del gen de una proteína deMhyoseleccionada del grupo formado por las proteínas P36, P46, P65, P76, P97, P102, P146 y P216, en donde la región promotora deMhyoinicia o promueve la transcripción de una secuencia de ADN deMhyo.
5. El vector transposónico de la reivindicación 4, caracterizado por que la secuencia de ADN exógena adicional se selecciona del grupo formado por la secuencia que codifica la proteína de la cápside del circovirus porcino de tipo 2 (PCV2) y la secuencia que codifica una proteína que comprende la proteína de la cápside del circovirus porcino de tipo 2 (PCV2) que lleva adicionalmente los aminoácidos MetSerGlySer en el extremo aminoterminal de dicha proteína, preferentemente en donde dicha secuencia de ADN exógena adicional que codifica la proteína de la cápside del PCV2 se selecciona del grupo formado por SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y<s>E<q>ID NO: 5.
6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o el vector transposónico de las reivindicaciones 4 o 5, caracterizado por que el vector transposónico es un plásmido.
7. Uso del vector transposónico como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, para preparar una cepa mutante deMycoplasma hyopneumoniae (Mhyo).
8. Una cepa mutante deMycoplasma hyopneumoniae (Mhyo),caracterizada por que comprende el vector transposónico como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.
9. La cepa mutante deMycoplasma hyopneumoniae (Mhyo)de la reivindicación 8, que se selecciona del grupo formado por una cepa mutante deMhyodepositada en el Instituto Leibniz - DSMZ con el número de registro DSM 26020; una cepa mutante deMhyocon el número de registro DSM 26027; una cepa mutante deMhyocon el número de registro DSM 26033; una cepa mutante deMhyocon el número de registro DSM 26034; y una cepa mutante deMhyocon el número de registro DSM 26049.
10. Uso de una cepa mutante deMycoplasma hyopneumoniae (Mhyo)como ha definido en la reivindicación 8 o 9, o preparada de acuerdo con el método de la reivindicación 1, para preparar una vacuna contra la neumonía enzoótica porcina causada porMhyo,y opcionalmente contra otra enfermedad o procesos patológicos adicionales que afecten a los cerdos.
11. Una vacuna para proteger a los cerdos contra la neumonía enzoótica porcina causada porMycoplasma hyopneumoniae (Mhyo),y opcionalmente contra otra enfermedad o procesos patológicos adicionales que afectan a los cerdos, que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de la cepa mutante deMhyocomo ha definido en la reivindicación 8 o 9, o preparada de acuerdo con el método de la reivindicación 1.
12. La vacuna de la reivindicación 11, caracterizada por que la otra enfermedad o procesos patológicos adicionales que afectan a los cerdos, están causados por un microorganismo, que se selecciona del grupo formado porActinobacillus sp., Brachyspira sp., Pasteurella multocida, Salmonella sp., Streptococcus sp., Isospora sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Leptospira sp., Staphylococcus sp., Haemophilus parasuis, Bordetella bronchiseptica, Clostridium sp., Mycoplasma sp., Lawsonia intracellularis, Escherichia coli,virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino, virus de la gripe porcina, virus de la gastroenteritis contagiosa, parvovirus porcino, virus de la encefalomiocarditis, coronavirus, rotavirus, circovirus porcino, agente causante del síndrome del fracaso en el desarrollo peri-destete porcino, virus de la peste porcina clásica, virus de la peste porcina africana, calicivirus y torque teno virus (TTV).
13. Un kit de vacunación para vacunar a cerdos contra una infección o enfermedad causada porMycoplasma hyopneumoniae (Mhyo),y opcionalmente contra otra enfermedad o procesos patológicos causados por microorganismos que afectan a los cerdos, que comprende un recipiente que contiene una cantidad inmunológicamente eficaz de la cepa mutante deMhyocomo ha definido en la reivindicación 8 o 9.
14. La vacuna de la reivindicación 11 o 12, o el kit de vacunación de la reivindicación 13, que es para administración intradérmica o intramuscular.
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Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2684959A1 (en) * 2012-07-10 2014-01-15 Laboratorios Hipra, S.A. Vectors for transforming Mycoplasma hyopneumoniae, transformed M.hyopneumoniae strains, and use thereof
WO2014174257A2 (en) * 2013-04-22 2014-10-30 The Royal Veterinary College Methods
US9649370B2 (en) 2013-05-08 2017-05-16 Protatek International, Inc. Vaccine for PCV2 and mycoplasma
US11744883B2 (en) 2017-12-22 2023-09-05 Hipra Scientific, S.L.U. Intradermal combination vaccine against mycoplasma and porcine circovirus
CN110093324B (zh) * 2019-04-26 2020-02-18 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） 基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒及其作为疫苗的应用
RU2743593C1 (ru) * 2020-12-09 2021-02-20 Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) Пептидные иммуногены и вакцинная композиция против коронавирусной инфекции COVID-19 с использованием пептидных иммуногенов
RU2743595C1 (ru) * 2020-12-09 2021-02-20 Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) Вакцинная композиция против коронавирусной инфекции COVID-19
RU2743594C1 (ru) * 2020-12-09 2021-02-20 Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) Пептидные иммуногены, используемые в качестве компонентов вакцинной композиции против коронавирусной инфекции COVID-19
RU2752858C1 (ru) * 2021-02-04 2021-08-11 Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) Интегративный плазмидный вектор pVEAL2-S-RBD, обеспечивающий экспрессию и секрецию рекомбинантного рецепторсвязывающего домена (RBD) коронавируса SARS-CoV-2 в клетках млекопитающих, рекомбинантный штамм клеточной линии CHO-K1-RBD и рекомбинантный белок RBD SARS-CoV-2, продуцируемый указанным штаммом клеточной линии CHO-K1-RBD
JP2024539752A (ja) * 2021-03-04 2024-10-29 イノバック 豚マイコプラズマ菌および豚サーコウイルス感染予防のための多価ワクチン組成物
KR102640730B1 (ko) * 2023-08-01 2024-02-29 주식회사 케어사이드 돼지 소모성 질병 관련 재조합 항원 제조용 신규한 벡터, 및 이를 이용한 백신 조성물
CN120366347B (zh) * 2025-03-17 2026-02-10 华南农业大学 一种质粒、副猪嗜血杆菌表面展示载体及其构建方法和应用

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2005054467A1 (ja) * 2003-12-03 2007-12-06 中外製薬株式会社 哺乳類βアクチンプロモーターを利用した発現系
WO2009061798A1 (en) * 2007-11-06 2009-05-14 Wyeth Mycoplasma hyopneumoniae avirulent -adjuvanted live vaccine
KR20090061798A (ko) * 2007-12-12 2009-06-17 기아자동차주식회사 차량 시트용 시트 백의 허리 지지구조
TWI449533B (zh) * 2008-04-18 2014-08-21 Intervet Int Bv 防備胞內勞森菌（Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）、豬肺炎黴漿菌（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）及豬環狀病毒（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏ ｖｉｒｕｓ）用疫苗
JP2010136627A (ja) * 2008-12-09 2010-06-24 Nippon Oil Corp 酵母にガラクトースを利用させる方法
JP5257939B2 (ja) * 2009-02-24 2013-08-07 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 豚丹毒・豚マイコプラズマ肺炎経口投与型多価ワクチン
WO2010132932A1 (en) * 2009-05-19 2010-11-25 Bioproperties Pty Ltd A temperature sensitive vaccine strain of mycoplasma hyopneumoniae and uses thereof
JP2013526866A (ja) * 2010-05-19 2013-06-27 バイオプロパティーズ ピーティーワイ リミテッド 弱毒化マイコプラズマに関する方法
EP2684959A1 (en) * 2012-07-10 2014-01-15 Laboratorios Hipra, S.A. Vectors for transforming Mycoplasma hyopneumoniae, transformed M.hyopneumoniae strains, and use thereof
WO2014174257A2 (en) * 2013-04-22 2014-10-30 The Royal Veterinary College Methods

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