ES3041307T3 - Method for assisting evaluation of condition of kidneys, system for evaluating condition of kidneys, and program for evaluating condition of kidneys - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona un método, un sistema y un programa para evaluar la función renal, utilizando como índice la relación entre la reabsorción y la excreción de D-serina y/o D-asparagina en los riñones afectados. Asimismo, proporciona un método para monitorizar la función renal y el efecto del tratamiento sobre la enfermedad renal. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Método para ayudar a la evaluación del estado renal, sistema para evaluar el estado renal y programa para evaluar el estado renal

Campo

La presente invención se refiere a un método para ayudar a la evaluación del estado renal, a un sistema para evaluar el estado renal y a un programa para evaluar el estado renal.

Antecedentes

Los riñones son órganos importantes para mantener la homeostasis en entornos biológicos mediante excreción y absorción de componentes corporales, y también realizan las importantes funciones de formar sangre y hueso, además de descargar productos de desecho, regular la tensión arterial y regular los líquidos corporales e iones. La tasa de filtración glomerular (GFR) es un marcador típico para la indicación de la función renal. La tasa de filtración glomerular representa el volumen de líquido filtrado por minuto a partir de la sangre por los glomérulos, considerándose que el aclaramiento de inulina es el criterio de referencia internacional. Sin embargo, la medición del aclaramiento de inulina requiere una infusión por goteo continua de inulina a lo largo de un periodo de 2 horas así como recogida de orina y sangre múltiples veces, lo cual crea una carga tanto para el paciente como para el profesional. Por tanto, para la práctica de rutina en la clínica, la medición del aclaramiento de inulina sólo se lleva a cabo para situaciones limitadas tales como donantes de trasplante de riñón vivo, sustituyéndose de lo contrario por medición de otros marcadores tales como creatinina. El aclaramiento de inulina también es escasamente aplicable en casos de cambios en el estado renal durante un corto periodo de tiempo, tal como en lesión renal aguda. Sin embargo, la mayoría de los valores de marcadores divergen significativamente de la tasa de filtración glomerular real según el criterio de referencia de aclaramiento de inulina, interfiriendo por tanto con un diagnóstico preciso de la enfermedad renal.

La creatinina se mide de manera rutinaria en la clínica como marcador para la función renal. La creatinina es el metabolito final de la creatina que se necesita para la contracción muscular. La creatina formada en el hígado se capta en células musculares y se metaboliza parcialmente para dar creatinina, se transporta a los riñones a través de la sangre, se filtra por los glomérulos y después se excreta en la orina en los túbulos renales sin reabsorberse. Se utiliza para la evaluación de la función renal porque puede servir como marcador ventajoso para uremia, dado que la capacidad de filtración glomerular reducida conduce a una alteración de la descarga y acumulación en la sangre provocando que su valor numérico aumente. Sin embargo, la cantidad de creatinina en sangre no aparece como un valor claramente anómalo hasta que la GFR se ha reducido en un 50 % o más, y por tanto no puede considerarse que sea un marcador sensible.

La cistatina C es una proteína con un peso molecular de 13,36 kDa que se produce en una proporción fija por células nucleadas sistémicas, y se elimina completamente por filtración por los glomérulos y posteriormente se descompone en los riñones mediante reabsorción en los túbulos renales, y dado que, por tanto, se piensa que se elimina de la sangre dependiendo de la tasa de filtración, su cantidad en sangre sirve como marcador de GFR. Sin embargo, cuando la función renal se reduce en gran medida, la cantidad de aumento de cistatina C en sangre alcanza una meseta, y en enfermedad renal en estadio terminal se vuelve difícil evaluar con precisión la función renal.

Por tanto, aún no existe ningún biomarcador que pueda cumplir de manera adecuada las demandas clínicas para medir con precisión el estado renal para pacientes individuales en un amplio intervalo desde fase temprana hasta terminal usando únicamente una muestra o sangre que pueda obtenerse de una manera no invasiva, sin una gran carga para sujetos o pacientes.

Convencionalmente, se ha considerado que los D-aminoácidos están ausentes de cuerpos de mamíferos, pero desde entonces se ha mostrado que están presentes en diversos tejidos y que llevan a cabo funciones fisiológicas. Se ha mostrado que las cantidades de D-serina, D-alanina, D-prolina, D-ácido glutámico y D-ácido aspártico en sangre pueden servir como marcadores de insuficiencia renal dado que varían en pacientes con insuficiencia renal y están correlacionados con la creatinina (NPL 1, NPL 2, NPL 3, NPL 4). También se ha dado a conocer que aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en D-serina, D-treonina, D-alanina, D-asparagina, D-alotreonina, D-glutamina, D-prolina y D-fenilalanina sirven como valores de marcador de patología para enfermedad renal (PTL 1). También se ha dado a conocer que D-serina, D-histidina, D-asparagina, D-arginina, D-alotreonina, D-ácido glutámico, D-alanina, D-prolina, D-valina, D-aloisoleucina, D-fenilalanina y D-lisina en orina experimentan una fluctuación sensible dependiendo de la nefropatía, y que parámetros basados en estos aminoácidos pueden usarse como valores de marcador para la patología en enfermedad renal (PTL 2). Con respecto a esto, aunque se han dado a conocer L-FABP en orina, NGAL en sangre y KIM-1 en orina como marcadores de enfermedad renal en los últimos años, no están asociados con la capacidad de filtración glomerular. Kimuraet al.(2016) Scientific Reports, vol. 6, n.° 1, se refiere a aminoácidos quirales como posibles biomarcadores en enfermedades renales. Sasabeet al.(2014), Plos One, vol. 9, n.° 1, se refiere a una detección temprana de disfunción renal usando la razón de enantiómeros de serina.

Lista de referencias

Bibliografía de patentes

[PTL 1] Publicación de patente internacional n.° 2013/140785.

[PTL 2] Publicación de patente japonesa n.° 5740523.

Bibliografía no de patentes

[NPL 1] Fukushima, T.et a l,Biol. Pharm. Bull. 18: 1130 (1995).

[NPL 2] Nagata Y. Viva Origino, vol. 18 (n.° 2) (1990), 15th Lecture Meeting Abstracts.

[NPL 3] Ishidaet a l,Kitasato Medical Journal, 23:51-62 (1993).

[NPL 4] Yong Huanget a l,Biol. Pharm. Bull. 21:(2)156-162 (1998).

Sumario

Problema técnico

Se desea proporcionar un método para una evaluación y valoración precisas del estado renal de pacientes a lo largo de un intervalo más amplio que los marcadores de enfermedad renal actualmente conocidos.

Solución al problema

Los presentes inventores se centraron en la dinámica de filtración, reabsorción y excreción de D-serina y D-asparagina en los riñones y, tras analizar la relación entre su tasa de excreción y el estado renal, se encontró que esto proporciona nueva información patológica para la evaluación y valoración del estado renal, y se completó la presente invención. Por tanto, la presente invención se refiere a lo siguiente:

[1] Método para ayudar a la evaluación del estado renal, usando la tasa de reabsorción y excreción de D-serina y/o D-asparagina en los riñones de un sujeto como marcador,

en el que el método comprende una etapa de medir el/los valor(es) de la tasa de reabsorción y excreción de D-serina y/o la tasa de reabsorción y excreción de D-asparagina en una muestra de sangre extraída de un sujeto;

en el que la tasa es la tasa de excreción de D-serina en orina del sujeto (tasa de excreción de D-serina de sujeto) y/o la tasa de excreción de D-asparagina en orina del sujeto (tasa de excreción de D-asparagina de sujeto), en el que la tasa de excreción de D-serina y/o la tasa de excreción de D-asparagina se calculan con corrección usando un factor de corrección a partir de sangre y/u orina, en el que el factor de corrección es uno o más factores de corrección seleccionados del grupo que consiste en tasa de filtración glomerular y volumen urinario; o

en el que el factor de corrección es uno o más factores de corrección seleccionados del grupo que consiste en aclaramiento de inulina y aclaramiento de creatinina; o

en el que el factor de corrección es uno o más factores de corrección seleccionados del grupo que consiste en nivel de creatinina y nivel de L-aminoácidos; o

en el que el factor de corrección es L-serina y/o L-asparagina.

[2] Método según el punto [1], en el que:

la tasa de excreción de D-serina se calcula mediante la siguiente fórmula:

Fórmula matemática 1

Tasa de excreción de D-serina (Fe_D-Ser) =<UD-Ser / PD-Ser>

UCre / PCre

donde

UD-Ser representa el nivel de D-serina en la orina,

PD-Ser representa el nivel de D-serina en la sangre,

Ucre representa el nivel de creatinina en la orina, y

Pcre representa el nivel de creatinina en la sangre, y/o

la tasa de excreción de D-asparagina se calcula mediante la siguiente fórmula:

Fórmula matemática 2

Tasa de excreción de D-asparagina (Fe_D-Asn) =<UD-Asn / PD-Asn>

UCre / PCre

donde

UD-Asn representa el nivel de D-asparagina en la orina,

PD-Asn representa el nivel de D-asparagina en la sangre,

UCre representa el nivel de creatinina en la orina, y

Pcre representa el nivel de creatinina en la sangre.

[3] Método según una cualquiera de las reivindicaciones [1] a [2], que comprende:

comparar la tasa de excreción de D-serina de sujeto y/o la tasa de excreción de D-asparagina de sujeto con una primera referencia calculada a partir de las tasas de excreción de D-serina en orina de múltiples sujetos sin enfermedad renal (tasas de excreción de D-serina de sujetos sin enfermedad renal) y/o las tasas de excreción de D-asparagina en orina de múltiples sujetos sin enfermedad renal (tasas de excreción de D-asparagina de sujetos sin enfermedad renal), y

evaluar el estado renal basándose en la relación entre la tasa de excreción de D-serina de sujeto y/o la tasa de excreción de D-asparagina de sujeto, y la primera referencia.

[4] Método según el punto [3], en el que la evaluación del estado renal es evaluar el riesgo de morbididad o enfermedad renal del sujeto o predecir la aparición o el pronóstico de enfermedad renal, cuando la tasa de excreción de D-serina de sujeto y/o la tasa de excreción de D-asparagina de sujeto no están dentro del intervalo de la primera referencia; en el que, preferiblemente, la enfermedad renal está provocada por enfermedad renal crónica, mieloma de riñón, nefropatía diabética, nefropatía por IgA, nefritis intersticial o riñón poliquístico, o lupus eritematoso sistémico, aldosteronismo primario, hipertrofia prostática, enfermedad de Fabry o síndrome nefrótico microvariable.

[5] Método según uno cualquiera de los puntos [3] a [4], en el que la primera referencia está en el intervalo de media ± DE x coeficiente Z de la tasa de excreción de D-serina de sujeto sin enfermedad renal y/o la tasa de excreción de D-asparagina de sujeto sin enfermedad renal; y/o en el que la primera referencia está en el intervalo de 0,4 a 0,9; en el que, preferiblemente, el coeficiente Z es un valor de 1,0 a 3,0;

en el que, más preferiblemente, el coeficiente Z es 1,96.

[6] Método según uno cualquiera de los puntos [1] a [2], que comprende:

comparar la tasa de excreción de D-serina de sujeto sometida a conversión logarítmica (tasa de excreción de LN de D-serina de sujeto) y/o la tasa de excreción de D-asparagina de sujeto sometida a conversión logarítmica (tasa de excreción de LN de D-asparagina de sujeto) con

una segunda referencia calculada a partir de los valores sometidos a conversión logarítmica de las tasas de excreción de D-serina en orina de múltiples sujetos sin enfermedad renal (tasas de excreción de LN de D-serina de sujetos sin enfermedad renal) y/o los valores sometidos a conversión logarítmica de las tasas de excreción de D-asparagina en orina de múltiples sujetos sin enfermedad renal (tasas de excreción de LN de D-asparagina de sujetos sin enfermedad renal), y

evaluar el estado renal basándose en la relación entre la tasa de excreción de LN de D-serina de sujeto y/o la tasa de excreción de LN de D-asparagina de sujeto, y la segunda referencia.

[7] Método según el punto [6], en el que la evaluación del estado renal es evaluar el riesgo de morbididad o enfermedad renal del sujeto o predecir la aparición o el pronóstico de enfermedad renal, cuando la tasa de excreción de LN de D-serina de sujeto y/o la tasa de excreción de LN de D-asparagina de sujeto no están dentro del intervalo de la segunda referencia;

en el que, preferiblemente, la enfermedad renal está provocada por enfermedad renal crónica, mieloma de riñón, nefropatía diabética, nefropatía por IgA, nefritis intersticial o riñón poliquístico, o lupus eritematoso sistémico, aldosteronismo primario, hipertrofia prostática, enfermedad de Fabry o síndrome nefrótico microvariable.

[8] Método según uno cualquiera de los puntos [6] a [7], en el que la segunda referencia está en el intervalo de media ± DE x coeficiente Z de la tasa de excreción de Ln de D-serina de sujeto sin enfermedad renal y/o la tasa de excreción de LN de D-asparagina de sujeto sin enfermedad renal; y/o en el que la segunda referencia está en el intervalo de 3,5 a 5,0;

en el que, preferiblemente, el coeficiente Z es un valor de 1,0 a 3,0;

en el que, más preferiblemente, el coeficiente Z es 1,96.

[9] Sistema para evaluar el estado renal que comprende una unidad de almacenamiento, una unidad de entrada, una unidad de medición analítica, una unidad de procesamiento de datos y una unidad de salida, en el que:

la unidad de almacenamiento almacena un valor umbral introducido a partir de la unidad de entrada, y una fórmula de cálculo para la tasa de excreción de D-serina en orina y/o una fórmula de cálculo para la tasa de excreción de D-asparagina en orina,

la unidad de medición analítica cuantifica el nivel de D-serina y/o el nivel de D-asparagina en una muestra de sangre y/o muestra de orina,

la unidad de procesamiento de datos calcula la tasa de excreción de D-serina y/o la tasa de excreción de D-asparagina en orina generada a partir de un elemento que contiene el nivel de D-serina y/o nivel de D-asparagina cuantificados en una muestra de sangre y/o muestra de orina, y la fórmula de cálculo para la tasa de excreción de D-serina y/o la fórmula de cálculo para la tasa de excreción de D-asparagina almacenadas en la unidad de almacenamiento, la unidad de procesamiento de datos evalúa el estado renal basándose en el valor umbral almacenado en la unidad de almacenamiento y la tasa de excreción de D-serina y/o la tasa de excreción de D-asparagina en la orina, y la unidad de salida emite los resultados de evaluación para el estado renal del sujeto, en el que la tasa de excreción de D-serina y/o la tasa de excreción de D-asparagina se calculan con corrección usando un factor de corrección a partir de sangre y/u orina; en el que el factor de corrección es uno o más factores de corrección seleccionados del grupo que consiste en tasa de filtración glomerular y volumen urinario; o

en el que el factor de corrección es uno o más factores de corrección seleccionados del grupo que consiste en aclaramiento de inulina y aclaramiento de creatinina; o

en el que el factor de corrección es uno o más factores de corrección seleccionados del grupo que consiste en nivel de creatinina y nivel de L-aminoácidos; o

en el que el factor de corrección es L-serina y/o L-asparagina.

[10] Sistema de evaluación según el punto [9], en el que:

la fórmula de cálculo para la tasa de excreción de D-serina es la siguiente fórmula:

Fórmula matemática 3

Tasa de excreción de D-serina (Fe_D-Ser) =<UD-Ser / PD-Ser>

UCre / PCre

donde

UD-Ser representa el nivel de D-serina en la orina,

PD-Ser representa el nivel de D-serina en la sangre,

Ucre representa el nivel de creatinina en la orina, y

Pcre representa el nivel de creatinina en la sangre, y/o

la fórmula de cálculo para la tasa de excreción de D-asparagina es la siguiente fórmula:

Fórmula matemática 4

Tasa de excreción de D-asparagina (Fe_D-Asn) =<UD-Asn / PD-Asn>

UCre / PCre

donde

UD-Asn representa el nivel de D-asparagina en la orina,

PD-Asn representa el nivel de D-asparagina en la sangre,

Uore representa el nivel de creatinina en la orina, y

Pcre representa el nivel de creatinina en la sangre.

[11] Programa que hace que un dispositivo de procesamiento de información que comprende una unidad de entrada, una unidad de salida, una unidad de procesamiento de datos y una unidad de almacenamiento evalúe el estado renal, en el que el programa incluye un comando para hacer que el dispositivo de procesamiento de información: almacene en la unidad de almacenamiento un valor umbral para la evaluación del estado renal introducido a partir de la unidad de entrada, una fórmula de cálculo para la tasa de excreción de D-serina y/o una fórmula de cálculo para la tasa de excreción de D-asparagina en orina, y variables necesarias para el cálculo,

almacene en la unidad de almacenamiento el nivel de D-serina y/o el nivel de D-asparagina en una muestra de sangre y/o muestra de orina y variables necesarias para el cálculo de la tasa de excreción de D-serina y/o la tasa de excreción de D-asparagina en orina, introducidas a partir de la unidad de entrada,

recurra a la fórmula de cálculo para la tasa de excreción de D-serina y/o la fórmula de cálculo para la tasa de excreción de D-asparagina en orina que están previamente almacenadas en la unidad de almacenamiento, y el nivel de D-serina y/o el nivel de D-asparagina en una muestra de sangre y/o muestra de orina y las variables, que están almacenados en la unidad de almacenamiento, y los sustituya en la fórmula de cálculo para la tasa de excreción de D-serina y/o la fórmula de cálculo para la tasa de excreción de D-asparagina en orina para calcular la tasa de excreción de D-serina y/o la tasa de excreción de D-asparagina, en la unidad de procesamiento de datos;

compare el umbral almacenado en la unidad de almacenamiento y la tasa de excreción de D-serina y/o la tasa de excreción de D-asparagina en la unidad de procesamiento de datos y evalúe el estado renal; y

emita los resultados de evaluación para el estado renal del sujeto a la unidad de salida;

en el que la tasa de excreción de D-serina y/o la tasa de excreción de D-asparagina se calculan con corrección usando un factor de corrección a partir de sangre y/u orina; en el que el factor de corrección es uno o más factores de corrección seleccionados del grupo que consiste en tasa de filtración glomerular y volumen urinario; o

en el que el factor de corrección es uno o más factores de corrección seleccionados del grupo que consiste en aclaramiento de inulina y aclaramiento de creatinina; o

en el que el factor de corrección es uno o más factores de corrección seleccionados del grupo que consiste en nivel de creatinina y nivel de L-aminoácidos; o

en el que el factor de corrección es L-serina y/o L-asparagina.

[12] Programa según el punto [11], en el que:

la fórmula de cálculo para la tasa de excreción de D-serina es la siguiente fórmula:

Fórmula matemática 5

Tasa de excreción de D-serina (Fe_D-Ser) =<UD-Ser / PD-Ser>

UCre / PCre

donde

UD-Ser representa el nivel de D-serina en la orina,

PD-Ser representa el nivel de D-serina en la sangre,

Ucre representa el nivel de creatinina en la orina, y

Pcre representa el nivel de creatinina en la sangre, y/o

la fórmula de cálculo para la tasa de excreción de D-asparagina es la siguiente fórmula:

Fórmula matemática 6

Tasa de excreción de D-asparagina (Fe_D-Asn) =<UD-Asn / PD-Asn>

UCre / PCre

donde

UD-Asn representa el nivel de D-asparagina en la orina,

PD-Asn representa el nivel de D-asparagina en la sangre,

UCre representa el nivel de creatinina en la orina, y

Pcre representa el nivel de creatinina en la sangre.

La invención se expone en las reivindicaciones adjuntas.

Efectos ventajosos de la invención

El método de analizar la dinámica (tasa de reabsorción y excreción) de D-serina y/o D-asparagina en los riñones según la invención permite una valoración precisa del estado renal de pacientes en un intervalo más amplio que usando los marcadores de enfermedad renal actualmente conocidos.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es una tabla que muestra valores logarítmicos para la tasa de excreción de D-serina y la tasa de excreción de D-asparagina en un sujeto sin enfermedad renal.

La figura 2 es una tabla que muestra valores logarítmicos para la tasa de excreción de D-serina y la tasa de excreción de D-asparagina en un sujeto con enfermedad renal.

La figura 3 es un histograma logarítmico para la tasa de excreción de D-serina calculada a partir de niveles de D-serina y niveles de creatinina en sangre y en orina, tal como se mide para un sujeto.

La figura 4 es un diagrama de gráfico logarítmico para el nivel de D-serina en sangre y la tasa de excreción de D-serina, medidos para un sujeto de prueba sin enfermedad renal y un paciente con enfermedad renal.

La figura 5 es un histograma logarítmico para la tasa de excreción de D-asparagina calculada a partir de niveles de D-asparagina y niveles de creatinina en sangre y en orina, tal como se mide para un sujeto.

La figura 6 es un diagrama de gráfico logarítmico para el nivel de D-asparagina en sangre y la tasa de excreción de D-asparagina, medidos para un sujeto de prueba sin enfermedad renal y un paciente con enfermedad renal.

La figura 7 es un diagrama de gráfico logarítmico para el nivel de D-serina en sangre y la tasa de excreción de D-serina, medidos para un sujeto de prueba sin enfermedad renal y un paciente con enfermedad renal.

La figura 8 es un diagrama de gráfico logarítmico para el nivel de D-asparagina en sangre y la tasa de excreción de D-asparagina, medidos para un sujeto de prueba sin enfermedad renal y un paciente con enfermedad renal.

La figura 9 es un diagrama que muestra el ciclo de tratamiento y la dosificación para un paciente con lupus eritematoso sistémico.

La figura 10 es un gráfico que representa gráficamente el nivel de D-serina en sangre y la tasa de excreción de D-serina, medidos periódicamente antes y después de la intervención terapéutica para un paciente con lupus eritematoso sistémico.

La figura 11 es un diagrama de bloques de un sistema para evaluar el estado renal según la invención.

La figura 12 es un diagrama de flujo que muestra un ejemplo de funcionamiento para evaluar el estado renal mediante el programa de la invención.

La figura 13 es un diagrama de gráfico para el nivel de D-serina en sangre y la tasa de excreción de D-serina, medidos para un paciente con diagnóstico de enfermedad renal.

Descripción de realizaciones

La invención se expone en las reivindicaciones adjuntas.

La presente invención se refiere a un método para evaluar el estado renal analizando la dinámica (reabsorción y excreción) de D-serina y/o D-asparagina en los riñones según las reivindicaciones adjuntas. Los presentes inventores han encontrado que la dinámica (reabsorción y excreción) tanto de D-serina como de D-asparagina en los riñones refleja el estado renal, y que puede usarse para la valoración del estado renal en un sujeto. Por tanto, la invención puede ser un método para valorar el estado renal mediante análisis de la dinámica (reabsorción y excreción) de D-serina en los riñones, un método para evaluar el estado renal mediante análisis de la dinámica (reabsorción y excreción) de D-asparagina en los riñones, o un método para valorar el estado renal mediante análisis de la dinámica (reabsorción y excreción) de D-serina y D-asparagina en los riñones. Los resultados de analizar la dinámica (reabsorción y excreción) o bien de D-serina o bien de D-asparagina en los riñones pueden usarse para la valoración del estado renal, pero usar los resultados de analizar la dinámica (reabsorción y excreción) tanto de D-serina como de D-asparagina en los riñones aumenta la precisión de la evaluación, permitiendo también determinar falsos negativos y falsos positivos.

Los términos “primero”, “segundo”, etc., usados a lo largo de la presente memoria descriptiva se usan para distinguir un elemento de otro, y un primer elemento puede denominarse “segundo elemento” o, de manera similar, un segundo elemento puede denominarse “primer elemento”, sin desviarse del concepto de la invención.

También a lo largo de la memoria descriptiva, la expresión “tasa de excreción de D-serina en la orina de un sujeto” puede denominarse “tasa de excreción de D-serina de sujeto”, y la expresión “tasa de excreción de D-serina en la orina de un sujeto sin enfermedad renal” puede denominarse “tasa de excreción de D-serina de sujeto sin enfermedad renal”, usándose cada una de manera intercambiable. También a lo largo de la memoria descriptiva, la expresión “tasa de excreción de D-asparagina en la orina de un sujeto” puede denominarse “tasa de excreción de D-asparagina de sujeto”, y la expresión “tasa de excreción de D-asparagina en la orina de un sujeto sin enfermedad renal” puede denominarse “tasa de excreción de D-asparagina de sujeto sin enfermedad renal”, usándose cada una de manera intercambiable.

También a lo largo de la memoria descriptiva, la expresión “tasa de excreción de D-serina de sujeto sometida a conversión logarítmica” puede denominarse “tasa de excreción de LN de D-serina de sujeto”, y la expresión “valor sometido a conversión logarítmica de la tasa de excreción de D-serina en la orina de un sujeto sin enfermedad renal” puede denominarse “tasa de excreción de LN de D-serina de sujeto sin enfermedad renal”, usándose cada una de manera intercambiable. También a lo largo de la memoria descriptiva, la expresión “tasa de excreción de D-asparagina de sujeto sometida a conversión logarítmica” puede denominarse “tasa de excreción de LN de D-asparagina de sujeto”, y la expresión “valor sometido a conversión logarítmica de la tasa de excreción de D-asparagina en la orina de un sujeto sin enfermedad renal” puede denominarse “tasa de excreción de LN de D-asparagina de sujeto sin enfermedad renal”, usándose cada una de manera intercambiable.

Tal como se usa en el presente documento, el término simple “sujeto” se refiere a cualquier mamífero, y preferiblemente un ser humano, independientemente de la presencia o ausencia de enfermedad renal. También tal como se usa en el presente documento, el término “sujeto sin enfermedad renal” se refiere a un sujeto sin enfermedad renal, o al que se le ha diagnosticado que no padece enfermedad renal, y, por ejemplo, es preferiblemente un sujeto que no padece enfermedad renal u otros estados que puedan provocar nefropatía.

Según una realización, la invención proporciona un método para ayudar a la evaluación del estado renal usando la tasa de reabsorción y excreción de D-serina y/o D-asparagina en los riñones de un sujeto como marcadores según las reivindicaciones adjuntas. La tasa de reabsorción y excreción de D-serina y D-asparagina pueden calcularse, cada una, cuantificando las cantidades de D-serina y D-asparagina en sangre, y las cantidades de D-serina y D-asparagina en orina, respectivamente. Por tanto, la “tasa de reabsorción y excreción de D-serina y/o D-asparagina en los riñones de un sujeto” de la invención es “ la tasa de excreción de D-serina en orina de un sujeto” (“tasa de excreción de D-serina de sujeto”) y/o la “tasa de excreción de D-asparagina en orina de un sujeto” (“tasa de excreción de D-asparagina de sujeto”).

Según la invención, la tasa de excreción (excreción) es un marcador que representa el grado de descarga en la orina de la cantidad de componentes objetivo que se han filtrado a través de los glomérulos mediante la función reguladora de los túbulos renales (reabsorción y secreción), y se expresa como una proporción o porcentaje, o en unidades arbitrarias. El valor puede calcularse después de excluir el efecto de reabsorción o concentración de agua mediante corrección usando un factor de corrección, y expresarse como excreción fraccional (FE). Dado que la orina tiene con frecuencia una tasa de concentración variable, la tasa de reabsorción y excreción de D-serina y/o D-asparagina en los riñones de un sujeto puede corregirse usando un “factor de corrección” que corrige para tener en cuenta la tasa de concentración de orina. Según la invención, la tasa de excreción de D-serina de sujeto y/o la tasa de excreción de D-asparagina de sujeto se corrige mediante un factor de corrección derivado de la sangre y/u orina. En su forma más sencilla, la tasa de excreción se expresa como una tasa de la cantidad de componente objetivo en orina dividida entre la tasa de filtración glomerular para los componentes objetivo, y también puede usarse para el cálculo la tasa de filtración glomerular obtenida mediante aclaramiento de inulina o el volumen urinario realmente medido, así como las cantidades de componentes objetivo en sangre y/o en orina. También pueden usarse los niveles de L-aminoácidos (preferiblemente los niveles de L-serina y/o L-asparagina) en orina como factores de corrección de volumen urinario para el cálculo de la tasa de excreción de D-aminoácidos. También puede usarse el aclaramiento de creatinina, calculado mediante el nivel de creatinina en orina o el nivel de creatinina en sangre, como factor de corrección, expresando la tasa de excreción de D-serina mediante la siguiente fórmula, por ejemplo. Después puede multiplicarse esto por 100 para obtener un porcentaje (%).

Fórmula matemática 7

Tasa de excreción de D-serina (Fe_D-Ser) =<UD-Ser / PD-Ser>

UCre / PCre

UD-Ser representa el nivel de D-serina en orina, PD-Ser representa el nivel de D-serina en sangre, Uore representa el nivel de creatinina en orina y Pore representa el nivel de creatinina en sangre.

La tasa de excreción de D-asparagina se representa mediante la siguiente fórmula, por ejemplo. Después puede multiplicarse esto por 100 para obtener un porcentaje (%).

Fórmula matemática 8

Tasa de excreción de D-asparagina (Fe_D-Asn) =<UD-Asn / PD-Asn>

UCre / PCre

UD-Asn representa el nivel de D-asparagina en orina, PD-Asn representa el nivel de D-asparagina en sangre, Ucre representa el nivel de creatinina en orina y Pcre representa el nivel de creatinina en sangre.

Se usa la excreción fraccional de sodio para distinguir entre enfermedad renal debida a deshidratación y debida a nefropatía. También se usan la excreción fraccional de potasio y la excreción fraccional de nitrógeno ureico en la clínica como marcadores para la valoración de la patología. Generalmente, se entiende que la tasa de excreción se basa en el principio de homeostasis, en el que el volumen de excreción en orina aumenta generalmente con una mayor captación o biosíntesis de componentes objetivo y disminuye con una menor captación y una mayor biodegradación. Por tanto, el daño o cambios patológicos en los riñones que llevan a cabo una homeostasis principal de componentes corporales afecta a los cambios en la tasa de excreción. La creatinina, como marcador convencional de enfermedad renal, se excreta completamente mientras que la cistatina C se reabsorbe completamente, pero la excreción y reabsorción de D-serina y D-asparagina se controlan estrictamente por los túbulos renales, de manera similar a los electrolitos, lo que sugiere que pueden servir como marcadores de patología más sensibles y altamente precisos.

Según la invención, D-serina y D-asparagina usadas para el análisis son los isómeros ópticos de L-serina y L-asparagina, que son aminoácidos constituyentes de proteínas. Los niveles de D-serina y los niveles de D-asparagina están estrictamente regulados en los tejidos y líquidos corporales mediante enzimas metabólicas tales como serina racemasa y D-aminoácido oxidasa, y mediante transportadores, pero los niveles de D-serina y los niveles de D-asparagina en la sangre y orina varían con la insuficiencia renal.

Según la invención, “el nivel de D-serina y/o el nivel de D-asparagina en la sangre y orina” pueden indicar el nivel de D-serina y/o el nivel de D-asparagina en un volumen de sangre o volumen urinario específico, y también pueden representarse como concentraciones. El nivel de D-serina y/o el nivel de D-asparagina en sangre u orina se miden como la cantidad en una muestra de sangre u orina que se ha tratado mediante separación centrífuga, separación por sedimentación u otro pretratamiento para su análisis. Por tanto, el nivel de D-serina y/o el nivel de D-asparagina en sangre u orina pueden medirse como la cantidad en una muestra de sangre, tal como sangre completa recogida, suero o plasma sanguíneo, o la cantidad en una muestra de orina tal como orina completa, u orina con los componentes sólidos y proteínas retirados. Para el análisis usando HPLC, por ejemplo, se representa el nivel de D-serina en una cantidad predeterminada de sangre u orina en un cromatograma, y pueden cuantificarse las alturas, áreas, formas y tamaños de picos mediante análisis basándose en una calibración y comparación de muestras convencionales. Comparando la concentración de D-serina y/o D-asparagina con una muestra conocida, es posible medir la concentración de D-serina y/o D-asparagina en sangre u orina, y puede usarse la concentración de D-serina y/o D-asparagina en sangre u orina como el nivel de D-serina y/o el nivel de D-asparagina en sangre u orina. Con un método enzimático, puede calcularse la concentración de aminoácidos mediante análisis cuantitativo usando una curva de calibración estándar.

Los niveles de D y L-aminoácidos, tales como niveles de D-serina y/o D-asparagina y niveles de L-serina y/o L-asparagina, pueden medirse mediante cualquier método, tal como cromatografía en columna quiral, o medición usando un método enzimático, o cuantificación mediante un método inmunológico usando un anticuerpo monoclonal que distingue entre isómeros ópticos de aminoácidos. La medición de los niveles de D-serina y L-serina en una muestra según la invención puede llevarse a cao usando cualquier método bien conocido por los expertos en la técnica. Los ejemplos incluyen métodos cromatográficos y enzimáticos (Y. Nagataet al.,Clinical Science, 73 (1987), 105. Analytical Biochemistry, 150 (1985), 238, A. D'Anielloet al.,Comparative Biochemistry and Physiology Part B, 66 (1980), 319, Journal of Neurochemistry, 29 (1977), 1053, A. Bernemanet al.,Journal of Microbial & Biochemical Technology, 2 (2010) , 139, W. G. Gutheilet al.,Analytical Biochemistry, 287 (2000), 196, G. Mollaet al.,Methods in Molecular Biology, 794 (2012), 273, T. Itoet al.,Analytical Biochemistry, 371 (2007), 167), métodos con anticuerpos (T. Ohgusuet al.,Analytical Biochemistry, 357 (2006), 15), cromatografía de gases (CG) (H. Hasegawaet al.,Journal of Mass Spectrometry, 46 (2011), 502, M. C. Waldhieret al.,Analytical and Bioanalytical Chemistry, 394 (2009), 695, A. Hashimoto, T. Nishikawaet al.,FEBS Letters, 296 (1992), 33, H. Bruckner y A. Schieber, Biomedical Chromatography, 15 (2001), 166, M. Jungeet al.,Chirality, 19 (2007), 228, M. C. Waldhieret al.,Journal of Chromatography A, 1218 (2011) , 4537), métodos de electroforesis capilar (C<e>) (H. Miaoet al.,Analytical Chemistry, 77 (2005), 7190, D. L. Kirschneret al.,Analytical Chemistry, 79 (2007), 736, F. Kitagawa, K. Otsuka, Journal of Chromatography B, 879 (2011), 3078, G. Thorsen y J. Bergquist, Journal of Chromatography B, 745 (2000), 389), y cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) (N. Nimura y T. Kinoshita, Journal of Chromatography, 352 (1986), 169, A. Hashimotoet al.,Journal of Chromatography, 582 (1992), 41, H. Bruckneret al.,Journal of Chromatography A, 666 (1994), 259, N. Nimuraet al.,Analytical Biochemistry, 315(2003), 262, C. Mulleret al.,Journal of Chromatography A, 1324 (2014), 109, S. Einarssonet al.,Analytical Chemistry, 59 (1987), 1191, E. Okuma y H. Abe, Journal of Chromatography B, 660 (1994) , 243, Y. Gogamiet al.,Journal of Chromatography B, 879 (2011), 3259, Y. Nagataet al.,Journal of Chromatography, 575 (1992), 147, S. A. Fuchset al.,Clinical Chemistry, 54 (2008), 1443, D. Gordeset al.,Amino Acids, 40 (2011), 553, D. Jinet al.,Analytical Biochemistry, 269 (1999), 124, J. Z. Minet al.,Journal of Chromatography B, 879 (2011), 3220, T. Sakamotoet al.,Analytical and Bioanalytical Chemistry, 408 (2016), 517, W. F. Visseret al.,Journal of Chromatography A, 1218 (2011), 7130, Y. Xinget al.,Analytical and Bioanalytical Chemistry, 408 (2016), 141, K. Imaiet al.,Biomedical Chromatography, 9 (1995), 106, T. Fukushimaet al.,Biomedical Chromatography, 9 (1995) , 10, R. J. Reischlet al.,Journal of Chromatography A, 1218 (2011), 8379, R. J. Reischl y W. Lindner, Journal of Chromatography A, 1269 (2012), 262, S. Karakawaet al.,Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 115 (2015), 123).

El sistema de análisis por separación para isómeros ópticos puede ser una combinación de múltiples métodos de análisis por separación. Más específicamente, el nivel de D/L-aminoácidos en una muestra puede medirse usando un método de análisis de isómeros ópticos que comprende una etapa de hacer pasar una muestra que contiene un componente con isómeros ópticos a través de un primer relleno de columna como fase estacionaria, junto con un primer líquido como fase móvil, para separar los componentes en la muestra, una etapa de contener por separado cada uno de los componentes en la muestra en una unidad de múltiples bucles, una etapa de hacer pasar cada uno de los componentes en la muestra que se han contenido por separado en la unidad de múltiples bucles a través de un canal de flujo en un segundo relleno de columna que tiene un centro ópticamente activo, como fase estacionaria, junto con un segundo líquido como fase móvil, para separar los isómeros ópticos entre cada uno de los componentes de muestra, y una etapa de detectar los isómeros ópticos en cada uno de los componentes de muestra (patente japonesa n.° 4291628). En el análisis por HPLC, algunas veces se derivatizan previamente los D y L-aminoácidos con un reactivo fluorescente tal como o-ftalaldehído (OPA) o 4-fluoro-7-nitro-2,1,3-benzooxadiazol (NBD-F), o se someten a diastereomerización usando un agente tal como N-terc-butiloxicarbonil-L-cisteína (Boc-L-Cys) (Hamase, K. y Zaitsu, K., Bunseki Kagaku, vol. 53, 677-690 (2004)). Alternativamente, los D-aminoácidos pueden medirse mediante un método inmunológico usando un anticuerpo monoclonal que distingue isómeros ópticos de aminoácidos, tal como un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a D-serina, L-serina, D-asparagina o L-asparagina. Cuando va a usarse el total de la forma D y la forma L como marcador, no es necesario separar la forma D y la forma L, permitiendo analizar los aminoácidos sin separar la forma D y la forma L. También en tales casos, la separación y cuantificación pueden llevarse a cabo usando un método enzimático, método de anticuerpos, CG, CE o HPLC.

Los niveles de D-serina y los niveles de D-asparagina en sangre se correlacionan más fuertemente con la tasa de filtración glomerular que el marcador convencional de creatinina. Esto se debe a que los niveles de creatinina en sangre se ven significativamente afectados por la masa muscular y, por tanto, atletas deportivos, pacientes con acromegalia y personas que han consumido grandes cantidades de carne mostrarán valores superiores, mientras que pacientes que padecen enfermedad neuromuscular (tal como distrofia muscular), emaciación, reposo en cama prolongado, debilidad, sarcopenia, síndrome locomotor o amputación, o personas que han restringido su ingesta de proteínas, mostrarán valores inferiores, haciendo que sea imposible reflejar con precisión la función renal. En personas sanas sin presencia de enfermedad, el nivel de D-serina en sangre se mantiene dentro de un intervalo muy estrecho de aproximadamente el 1 al 2 % de serina total, mientras que su presencia en orina alcanza del 30 al 60 %. De manera interesante, aunque aproximadamente el 99 % de la L-serina se reabsorbe en los túbulos renales, aproximadamente del 50 al 80 % de la D-serina se excreta. Además, en personas sanas sin presencia de enfermedad, el nivel de D-asparagina en sangre se mantiene dentro de un intervalo muy estrecho de aproximadamente el 0,1 al 0,6% de asparagina total, mientras que su presencia en orina alcanza del 20 al 50 %. De manera interesante, aunque aproximadamente el 99 % de la L-asparagina se reabsorbe en los túbulos renales, aproximadamente del 50 al 80 % de la D-asparagina se excreta.

A diferencia del nivel de D-serina en sangre y el nivel de D-asparagina, las tasas de excreción de D-serina y D-asparagina usadas para el propósito de la invención no se correlacionan con la tasa de filtración glomerular, tal como se ha mostrado mediante metabolómica de aminoácidos quirales y análisis de múltiples variables de parámetros relacionados (OPLS). Dado que se ha sugerido que la reabsorción de isómeros ópticos de serina y asparagina está estrictamente regulada en los túbulos renales de los riñones, se incluyeron 15 voluntarios sanos como población de estudio para el análisis de tasas de excreción de D-serina y D-asparagina en sujetos de prueba sin enfermedad renal, con el fin de examinar la significación fisiológica de D-serina y D-asparagina. El protocolo de prueba se aprobó por el comité ético de la Agencia de desarrollo e investigación nacional: Institutos nacionales de innovación biomédica, salud y nutrición, y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los sujetos de prueba. El grupo de sujetos de prueba sin enfermedad renal tenían una edad promedio de 44 años y el 80 % eran varones, con una estatura promedio de 1,70 m, un peso promedio de 68,9 kg, SC promedio de 1,80 m2, IMC medio de 22,6 kg/m2 y creatinina en suero media de 0,75 mg/dl.

Usando la siguiente fórmula con valores de análisis cuantitativo para D-serina y D-asparagina en la sangre y orina de los sujetos de prueba, la tasa de excreción media para D-serina era del 62,76 %, con un valor logarítmico medio que se calculó que era de 4,12, y la tasa de excreción media para D-asparagina era del 64,12 %, con un valor logarítmico medio que se calculó que era de 4,16 (figura 1).

Fórmula matemática 9

Tasa de excreción de D-serina (Fe_D-Ser) =<UD-Ser / PD-Ser>

UCre / PCre

UD-Ser representa el nivel de D-serina en orina, PD-Ser representa el nivel de D-serina en sangre, UCre representa el nivel de creatinina en orina y PCre representa el nivel de creatinina en sangre.

Fórmula matemática 10

Tasa de excreción de D-asparagina (Fe_D-Asn) =<UD-Asn / PD-Asn>

UCre / PCre

Para D-serina, dado que se observó una forma de tipo distribución normal en el histograma de los datos logarítmicos obtenidos preparados al 6° cuantil (figura 3), se analizaron los datos mediante una prueba de normalidad de Shapiro-Wilk, que dio como resultado un valor de P = 0,395, de tal manera que no pudo descartarse la hipótesis nula, respaldando por tanto la posibilidad de una distribución normal. Por tanto, los valores de referencia para los sujetos de prueba sin enfermedad renal eran del 42,46 al 89,66% como media con una desviación estándar de ±1,96, calculándose que el logaritmo era de 3,75 a 4,50, y esto puede ayudar a predecir si los sujetos fuera de este intervalo tienen enfermedad renal, estados nefropáticos o riesgo o pronóstico.

Para D-asparagina, dado que se observó una forma de tipo distribución normal en el histograma de los datos logarítmicos obtenidos preparados al 6° cuantil (figura 5), se analizaron los datos mediante una prueba de normalidad de Shapiro-Wilk, que dio como resultado un valor de P = 0,243, de tal manera que no pudo descartarse la hipótesis nula, respaldando por tanto la posibilidad de una distribución normal. Por tanto, los valores de referencia para los sujetos de prueba sin enfermedad renal eran del 51,65 al 78,74 % como media con una desviación estándar de ±1,96, calculándose que el logaritmo era de 3,95 a 4,37, y esto puede ayudar a predecir si los sujetos fuera de este intervalo tienen enfermedad renal, estados nefropáticos o riesgo o pronóstico.

Dado que el nivel de D-serina y el nivel de D-asparagina en sangre se correlacionan fuertemente con la tasa de filtración glomerular, sus análisis pueden aplicarse a clasificaciones de intensidad (de G1 a 5) para enfermedad renal crónica (CKD), definidas según las directrices de la Sociedad japonesa de nefrología, pero dado que la tasa de excreción de D-serina analizada con el nivel de D-serina en orina o la tasa de excreción de D-asparagina analizada con el nivel de D-asparagina en orina pueden ayudar a la evaluación del estado renal mediante un mecanismo completamente diferente no correlacionado con la tasa de filtración glomerular, son altamente útiles para la distinción clínica y el pronóstico y diagnóstico de patología, lo cual ha sido difícil con marcadores convencionales.

Según una realización, la invención puede proporcionar un método que comprende:

comparar la tasa de excreción de D-serina de sujeto y/o la tasa de excreción de D-asparagina de sujeto con una primera referencia calculada a partir de las tasas de excreción de D-serina en orina de múltiples sujetos sin enfermedad renal (tasas de excreción de D-serina de sujetos sin enfermedad renal) y/o las tasas de excreción de D-asparagina en orina de múltiples sujetos sin enfermedad renal (tasas de excreción de D-asparagina de sujetos sin enfermedad renal), y

evaluar el estado renal basándose en la relación entre la tasa de excreción de D-serina de sujeto y/o la tasa de excreción de D-asparagina de sujeto, y la primera referencia.

Según una primera realización de la invención, por ejemplo, la invención puede proporcionar un método que incluye una etapa de:

comparar la tasa de excreción de D-serina de sujeto con una primera referencia calculada a partir de las tasas de excreción de D-serina en orina de múltiples sujetos sin enfermedad renal (tasas de excreción de D-serina de sujetos sin enfermedad renal), y

evaluar el estado renal basándose en la relación entre la tasa de excreción de D-serina de sujeto y la primera referencia.

Según una segunda realización de la invención, por ejemplo, la invención puede proporcionar un método que incluye una etapa de:

comparar la tasa de excreción de D-asparagina de sujeto con una primera referencia calculada a partir de las tasas de excreción de D-asparagina en orina de múltiples sujetos sin enfermedad renal (tasa de excreción de D-asparagina de sujeto sin enfermedad renal), y

evaluar el estado renal basándose en la relación entre la tasa de excreción de D-asparagina de sujeto y la primera referencia.

El método de la primera realización y el método de la segunda realización también pueden combinarse para evaluar el estado renal, lo cual no sólo mejorará la precisión de la evaluación del estado renal sino que también permitirá valorar los falsos positivos y falsos negativos.

Tal como se usa en el presente documento, “primera referencia” significa una referencia calculada a partir de las tasas de excreción en orina de múltiples sujetos sin enfermedad renal (tasas de excreción de D-serina de sujetos sin enfermedad renal) y/o las tasas de excreción de D-asparagina en orina de múltiples sujetos sin enfermedad renal (tasa de excreción de D-asparagina de sujeto sin enfermedad renal), y usada para la evaluación del estado renal de un sujeto. Específicamente, el estado renal de un sujeto puede evaluarse comparando la tasa de excreción de D-serina de sujeto y/o la tasa de excreción de D-asparagina de sujeto con la primera referencia. El número de “sujetos sin enfermedad renal” usados para calcular la primera referencia es preferiblemente un número suficiente para calcular una referencia estadísticamente significativa, y para el propósito de la invención puede usarse un número de, por ejemplo, 3, 5, 10, 15, 20, 30, 50, 100 o mayor.

Según una realización, la primera referencia de la invención puede estar en el intervalo de media ± DE * coeficiente Z para las tasas de excreción de D-serina de sujetos sin enfermedad renal y/o las tasas de excreción de D-asparagina de sujetos sin enfermedad renal. Tal como se usa en el presente documento, el “coeficiente Z” es un coeficiente usado para calcular el intervalo de confianza usado para análisis estadístico, y es preferiblemente un valor de 1,0 a 3,0, por ejemplo, y más preferiblemente 1,96. Según una realización, la primera referencia está preferiblemente en el intervalo de 0,4 a 0,9.

Según una realización, la etapa de evaluar el estado renal puede evaluar el riesgo de morbididad o enfermedad renal del sujeto o predecir la aparición o el pronóstico de enfermedad renal, cuando la tasa de excreción de D-serina de sujeto y/o la tasa de excreción de D-asparagina de sujeto no están dentro del intervalo de la primera referencia. Según otra realización, la invención puede proporcionar un método que incluye una etapa de:

comparar la tasa de excreción de D-serina de sujeto sometida a conversión logarítmica (tasa de excreción de LN de D-serina de sujeto) y/o la tasa de excreción de D-asparagina de sujeto sometida a conversión logarítmica (tasa de excreción de LN de D-asparagina de sujeto) con

una segunda referencia calculada a partir de los valores sometidos a conversión logarítmica de las tasas de excreción de D-serina en orina de múltiples sujetos sin enfermedad renal (tasas de excreción de LN de D-serina de sujetos sin enfermedad renal) y/o los valores sometidos a conversión logarítmica de las tasas de excreción de D-asparagina en orina de múltiples sujetos sin enfermedad renal (tasas de excreción de LN de D-asparagina de sujetos sin enfermedad renal), y

evaluar el estado renal basándose en la relación entre la tasa de excreción de LN de D-serina de sujeto y/o la tasa de excreción de LN de D-asparagina de sujeto, y la segunda referencia.

Según la primera realización de la invención, la invención puede proporcionar un método que incluye una etapa de: comparar la tasa de excreción de D-serina de sujeto sometida a conversión logarítmica (tasa de excreción de LN de D-serina de sujeto) con

una segunda referencia calculada a partir de los valores sometidos a conversión logarítmica de la tasa de excreción de D-serina en orina de múltiples sujetos sin enfermedad renal (tasas de excreción de LN de D-serina de sujetos sin enfermedad renal), y

evaluar el estado renal basándose en la relación entre la tasa de excreción de LN de D-serina de sujeto y la segunda referencia.

Según la segunda realización de la invención, la invención puede proporcionar un método que incluye una etapa de:

comparar la tasa de excreción de D-asparagina de sujeto sometida a conversión logarítmica (tasa de excreción de LN de D-asparagina de sujeto) con

una segunda referencia calculada a partir de los valores sometidos a conversión logarítmica de las tasas de excreción de D-asparagina en orina de múltiples sujetos sin enfermedad renal (tasas de excreción de LN de D-asparagina de sujetos sin enfermedad renal), y

evaluar el estado renal basándose en la relación entre la tasa de excreción de LN de D-asparagina de sujeto y la segunda referencia.

El método de la primera realización y el método de la segunda realización también pueden combinarse para evaluar el estado renal, lo cual no sólo mejorará la precisión de la evaluación del estado renal sino que también permitirá valorar los falsos positivos y falsos negativos.

Tal como se usa en el presente documento, el “valor sometido a conversión logarítmica” es el valor obtenido sometiendo el valor de interés a conversión logarítmica, y puede ser el valor de interés que se ha convertido al logaritmo natural, o el valor de interés que se ha convertido a un logaritmo común usando cualquier base.

Tal como se usa en el presente documento, “segunda referencia” significa una referencia calculada a partir de las tasas de excreción de D-serina en orina sometidas a conversión logarítmica de múltiples sujetos sin enfermedad renal (tasas de excreción de LN de D-serina de sujetos sin enfermedad renal) y/o las tasas de excreción de D-asparagina en orina sometidas a conversión logarítmica de múltiples sujetos sin enfermedad renal (tasas de excreción de LN de D-asparagina de sujetos sin enfermedad renal), y usada para la evaluación del estado renal de un sujeto. Específicamente, estado renal de un sujeto puede evaluarse comparando la tasa de excreción de LN de D-serina de sujeto y/o la tasa de excreción de LN de D-asparagina de sujeto con la segunda referencia. El número de “sujetos sin enfermedad renal” usados para calcular la segunda referencia es preferiblemente un número suficiente para calcular una referencia estadísticamente significativa, y para el propósito de la invención puede usarse un número de, por ejemplo, 3, 5, 10, 15, 20, 30, 50, 100 o mayor.

Según una realización, la segunda referencia de la invención puede estar en el intervalo de media ± DE * coeficiente Z para las tasas de excreción de LN de D-serina de sujetos sin enfermedad renal y/o tasas de excreción de LN de D-asparagina de sujetos sin enfermedad renal. En este caso, el coeficiente Z es preferiblemente un valor de 1,0 a 3,0, y más preferiblemente 1,96. Según una realización, la segunda referencia está preferiblemente en el intervalo de 3,5 a 5,0.

Según una realización, la etapa de evaluar el estado renal puede evaluar el riesgo de morbididad o enfermedad renal del sujeto o predecir la aparición o el pronóstico de enfermedad renal, cuando la tasa de excreción de LN de D-serina de sujeto y/o la tasa de excreción de LN de D-asparagina de sujeto no están dentro del intervalo de la segunda referencia.

Cuando se valora una patología mediante el método de la invención, puede usarse como base para determinar una política de tratamiento. El método de tratamiento puede seleccionarse según sea apropiado para la patología, y las tasas de excreción de D-serina y/o D-asparagina pueden monitorizarse y controlarse periódicamente de modo que están dentro de los intervalos de referencia para sujetos sin enfermedad renal. La intervención terapéutica es una orientación para uno o una combinación de mejora de hábitos del estilo de vida, orientación alimentaria, tratamiento de tensión arterial, tratamiento de anemia, tratamiento de electrolito, tratamiento de uremia, tratamiento de nivel de glucemia, tratamiento inmunitario o tratamiento de lípidos. La mejora de hábitos del estilo de vida puede ser una recomendación de dejar de fumar o reducir el valor de IMC hasta por debajo de 25. La orientación alimentaria puede ser una restricción de sal o proteínas. Para el tratamiento de tensión arterial, tratamiento de anemia, tratamiento de electrolito, tratamiento de toxinas urémicas, tratamiento de nivel de glucemia, tratamiento inmunitario o tratamiento de lípidos en particular, el tratamiento puede implicar la administración de un fármaco. El tratamiento de tensión arterial puede implicar un tratamiento general o administración de un fármaco antihipertensor, para alcanzar menos de 130/80 mmHg. Los fármacos antihipertensores incluyen fármacos diuréticos (diuréticos de tiazida tales como triclormetiazida, bencilhidrodorotiazida e hidroclorotiazida, diuréticos de tipo tiazida tales como meticrano, indapamida, tribamida y meflusida, diuréticos de bucle tales como furosemida, y diuréticos ahorradores de potasio y antagonistas de aldosterona tales como triamtereno, espironolactona y eplerenona), antagonista de calcio (antagonistas basados en dihidropiridina tales como nifedipino, amlodipino, efonidipino, cilnidipino, nicardipino, nisoldipino, nitrendipino, nilvadipino, barnidipino, felodipino, benidipino, manidipino, azelnidipino y aranidipino, antagonistas basados en benzodiazepina, y diltiazem), inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (tales como captopril, enalapril, acelapril, delapril, cilazapril, lisinopril, benazepril, imidapril, temocapril, quinapril, trandolapril y perindopril-erbumina), antagonistas de receptor de angiotensina (antagonistas de receptor de angiotensina II tales como losartán, candesartán, valsartán, telmisartán, olmesartán, irbesartán y azilsartán), y fármacos simpaticolíticos (p-bloqueantes, tales como atenolol, bisoprolol, betaxolol, metoprolol, acebutolol, celiprolol, propranolol, nadolol, carteolol, pindolol, nipradilol, amosulalol, arotinolol, carvedilol, labetalol, bevantolol, urapidil, terazosina, prazosina, doxazosina y bunazosina). Las formulaciones de eritropoyetina, agentes de hierro e inhibidores de HIF-1 se usan como tratamientos de anemia. Los agonistas de receptor de calcio (tales como cinacalcet y etelcalcetida) y adsorbentes de fósforo se usan como reguladores de electrolito. El carbono activo se usa como adsorbente de toxina urémica. El nivel de glucemia se trata hasta Hbalc de <6,9 %, y en algunos casos se administra un agente hipoglucémico. Los agentes hipoglucémicos que se usan incluyen inhibidores de SGLT2 (tales como ipragliflozina, dapagliflozina, luseogliflozina, tofogliflozina, canagliflozina y empagliflozina), inhibidores de DPP4 (tales como fosfato de sitagliptina, vildagliptina, saxagliptina, alogliptina, linagliptina, teneligliptina, trelagliptina, anagliptina, omarigliptina), agentes de sulfonilurea (tales como tolbutamida, acetohexamida, clorpropamida, gliclopiramida, glibenclamida, gliclazida y glimepirida), agentes de tiazolidina (tales como pioglitazona), agentes de biguanida (tales como metformina y buformina), inhibidores de a-glucosidasa (tales como acarbosa, voglibosa y miglitol), agentes de glinida (tales como nateglinida, mitiglinida y repaglinida), formulaciones de insulina y activadores de NRF2 (tales como bardoxolonemetilo). Los agentes inmunosupresores (tales como esteroides, tacrolimus, anticuerpo anti-CD20, ciclohexamida y micofenolatomofetilo (MMF)) se usan para el tratamiento inmunitario. El tratamiento de lípidos incluye tratamiento para reducir LDL-C hasta por debajo de 120 mg/dl, o en algunos casos se usan tratamientos de dislipidemia, incluyendo estatinas (tales como rosuvastatina, pitavastatina, atorvastatina, cerivastatina, fluvastatina, simvastatina, pravastatina, lovastatina y mevastatina), fibratos (tales como clofibrato, bezafibrato, fenofibrato y clinofibrato), derivados de ácido nicotínico (tales como derivados de ácido nicotínico (nicotinato de tocoferol, nicomol y niceritrol), inhibidores de transportador de colesterol (tales como ezetimiba), inhibidores de PCSK9 (tales como evolocumab) y formulaciones de EPA. Todos estos fármacos pueden usarse como formas de dosificación individuales o mezclas. Dependiendo del grado de alteración de la función renal, también puede llevarse a cabo diálisis tal como diálisis peritoneal, hemodiálisis, filtración por hemodiálisis continua, aféresis de sangre (tal como plasmaféresis de sangre o adsorción de plasma sanguíneo) o trasplante de riñón.

También se da a conocer en el presente documento un método de monitorización del estado renal en el que la tasa de excreción de D-serina en orina de un sujeto (tasa de excreción de D-serina de sujeto) y/o la tasa de excreción de D-asparagina en orina de un sujeto (sujeto tasa de excreción de D-asparagina) se mide periódicamente, y se usa la fluctuación como marcador. También se da a conocer en el presente documento un método de monitorización del efecto terapéutico sobre la enfermedad renal, en el que la tasa de excreción de D-serina en orina de un sujeto con enfermedad renal (tasa de excreción de D-serina de sujeto) y/o la tasa de excreción de D-asparagina en orina de un sujeto con enfermedad renal (tasa de excreción de D-asparagina de sujeto) se mide periódicamente antes y después de la intervención terapéutica, y se usa la fluctuación como marcador.

El método de la invención puede usarse para evaluar la enfermedad renal en un sujeto, tal como enfermedad renal provocada por enfermedad renal crónica, mieloma de riñón, nefropatía diabética, nefropatía por IgA, nefritis intersticial o riñón poliquístico, o lupus eritematoso sistémico, aldosteronismo primario, hipertrofia prostática, enfermedad de Fabry o síndrome nefrótico microvariable.

Según otro aspecto, la invención se refiere a un sistema y a un programa para llevar a cabo el método anteriormente mencionado para ayudar a la evaluación del estado renal según las reivindicaciones adjuntas. La figura 11 es un diagrama de bloques de un sistema para evaluar el estado renal según la invención. El sistema de análisis de muestras 10 mostrado en la figura 11 está construido para permitir llevar a cabo el método para ayudar a la evaluación del estado renal de la invención. El sistema de análisis de muestras 10 comprende una unidad de almacenamiento 11, una unidad de entrada 12, una unidad de medición analítica 13, una unidad de procesamiento de datos 14 y una unidad de salida 15, y permite el análisis de muestras de sangre y/o muestras de orina, y la emisión de tasas de excreción calculadas e información patológica.

Más específicamente, en el sistema de análisis de muestras 10 de la invención, la unidad de almacenamiento 11 almacena una tasa de excreción calculada a partir de niveles de D-serina y/o de D-asparagina en una muestra de sangre o en una muestra de orina que se han introducido a través de la unidad de entrada 12, y también un valor de referencia y una tabla o gráfico correspondiente a información patológica, la unidad de medición analítica 13 separa y cuantifica D-serina y/o D-asparagina en una muestra de sangre y/o muestra de orina, la unidad de procesamiento de datos 14 sustituye los valores en una fórmula obtenida a partir de la tasa de excreción calculada a partir de los niveles de D-serina y/o de D-asparagina, y el valor de referencia y la información patológica, o los lee a partir de la tabla o gráfico correspondiente, para valorar la patología, y la unidad de salida 15 emite la información patológica.

Según un aspecto más preferido, el sistema para evaluar el estado renal de la invención puede incluir además una etapa en la que la unidad de almacenamiento 11 almacena un valor de referencia introducido a partir de la unidad de entrada 12, y una etapa en la que la unidad de procesamiento de datos 14 compara la tasa de excreción separada y cuantificada calculada a partir de los niveles de D-serina y/o de D-asparagina con el valor de referencia. En este caso, la unidad de salida 15 emite una señal que indica una posible enfermedad renal cuando la tasa de excreción de D-serina y/o la tasa de excreción de D-asparagina está fuera del intervalo de referencia.

La unidad de almacenamiento 11 tiene un dispositivo de almacenamiento portátil que puede ser un dispositivo de memoria tal como una RAM, ROM o memoria flash, un dispositivo de disco fijo tal como una unidad de disco duro, o un disco flexible o disco óptico. La unidad de almacenamiento almacena datos medidos por la unidad de medición analítica, datos e instrucciones introducidos a partir de la unidad de entrada, y resultados de procesamiento de cálculo por la unidad de procesamiento de datos, así como el programa informático y la base de datos que van a usarse para el procesamiento por el equipo de procesamiento de información. El programa informático puede ser un medio de grabación legible por ordenador tal como un CD-ROM o DVD-ROM, o puede instalarse a través de Internet. El programa informático se instala en la unidad de almacenamiento usando un programa de configuración conocido de manera habitual, por ejemplo. La unidad de almacenamiento almacena datos para la fórmula derivada a partir de la relación entre la tasa de excreción de D-serina y la patología, o para la tabla o gráfico correspondiente, que se han introducido previamente a través de la unidad de entrada 12. También pueden almacenarse clasificaciones de estado renal correspondientes a la tasa de excreción.

La unidad de entrada 12 es una interfaz y también incluye dispositivos de funcionamiento tales como un teclado y ratón. Esto permite a la unidad de entrada introducir datos medidos por la unidad de medición analítica 13 e instrucciones para el procesamiento de cálculo que va a llevarse a cabo por la unidad de procesamiento de datos 14. Cuando la unidad de medición analítica 13 es externa, por ejemplo, la unidad de entrada 12 también puede incluir una unidad de interfaz que permite la introducción de datos medidos a través de una red o medio de almacenamiento, de manera independiente del dispositivo de funcionamiento.

La unidad de medición analítica 13 lleva a cabo una etapa de medir D-serina y/o D-asparagina en una muestra de sangre y/o muestra de orina. Por tanto, la unidad de medición analítica 13 tiene una construcción que permite la separación y medición de las formas D y las formas L de aminoácidos. Los aminoácidos pueden analizarse de uno en uno, o algunos o la totalidad de los tipos de aminoácido pueden analizarse a la vez. Sin ninguna intención limitativa, la unidad de medición analítica 13 puede ser un sistema de cromatografía quiral que comprende una entrada de introducción de muestras, una columna de resolución óptica y un detector, por ejemplo, y es preferiblemente un sistema de cromatografía de líquidos de alto rendimiento. Desde el punto de vista de detectar los niveles tan sólo de aminoácidos específicos, la cuantificación puede llevarse a cabo mediante un método enzimático o método inmunológico. La unidad de medición analítica 13 puede construirse por separado del sistema para evaluar el estado renal, y pueden introducirse datos medidos a través de la unidad de entrada 12 usando una red o medio de almacenamiento.

La unidad de procesamiento de datos 14 calcula tasas de excreción a partir de la D-serina y/o D-asparagina medidas, y sustituye los valores en una fórmula derivada a partir de la relación con el volumen de excreción, o lee a partir de una tabla o gráfico correspondiente, para evaluar y valorar el estado renal. Cuando la fórmula derivada a partir de la relación entre la tasa de excreción de D-serina y/o la tasa de excreción de D-asparagina, o la tabla o gráfico correspondiente, requiere otros valores de corrección tales como edad, peso corporal, sexo o estatura corporal, también puede introducirse previamente esa información a través de la unidad de entrada y almacenarse en la unidad de almacenamiento. Durante el cálculo de la tasa de excreción y la información patológica, la unidad de procesamiento de datos puede acceder a la información e introducirla en la fórmula, o leer un valor a partir de la tabla o gráfico correspondiente, para calcular la tasa de excreción y la información patológica. La unidad de procesamiento de datos 14 también puede determinar una categoría de enfermedad renal o estado renal a partir de la tasa de excreción y la información patológica determinadas. La unidad de procesamiento de datos 14 lleva a cabo diversas operaciones de procesamiento de cálculo con los datos medidos por la unidad de medición analítica 13 y almacenados en la unidad de almacenamiento 11, basándose en un programa almacenado en la unidad de almacenamiento. El procesamiento de cálculo se lleva a cabo por una CPU en la unidad de procesamiento de datos. La CPU incluye un módulo funcional que controla la unidad de medición analítica 13, la unidad de entrada 12, la unidad de almacenamiento 11 y la unidad de salida 15, realizando el módulo funcional diversas operaciones de control. Cada una de las unidades puede estar construida por circuitos integrados, microprocesadores y firmware independientes.

La unidad de salida 15 está construida para emitir la tasa de excreción y la información patológica, como resultado de procesamiento de cálculo por la unidad de procesamiento de datos. La unidad de salida 15 puede ser medios de emisión tales como un dispositivo de visualización con un elemento de visualización de cristal líquido que visualiza directamente los resultados de procesamiento de computación, o una impresora, o puede ser una unidad de interfaz para emitir a una unidad de memoria externa o emitir a una red. También puede emitir la tasa de excreción de D-serina y/o la tasa de excreción de D-asparagina, y/o la categoría de estado renal, o bien en combinación con la capacidad de filtración glomerular, o bien de manera independiente.

La figura 12 es un diagrama de flujo que muestra un ejemplo de funcionamiento para determinar la tasa de excreción y la información patológica mediante el programa de la invención. Específicamente, el programa de la invención es un programa que evalúa el estado renal en un dispositivo de procesamiento de información que comprende una unidad de entrada, una unidad de salida, una unidad de procesamiento de datos y una unidad de almacenamiento. El programa de la invención incluye un comando para hacer que el dispositivo de procesamiento de información: almacene en la unidad de almacenamiento un valor umbral para la evaluación del estado renal introducido a partir de la unidad de entrada, una fórmula de cálculo para la tasa de excreción de D-serina y/o una fórmula de cálculo para la tasa de excreción de D-asparagina en orina, y variables necesarias para el cálculo,

almacene en la unidad de almacenamiento el nivel de D-serina y/o el nivel de D-asparagina en una muestra de sangre y/o muestra de orina y variables necesarias para el cálculo de la tasa de excreción de D-serina y/o la tasa de excreción de D-asparagina en orina, introducidas a partir de la unidad de entrada,

recurra a la fórmula de cálculo para la tasa de excreción de D-serina y/o la fórmula de cálculo para la tasa de excreción de D-asparagina en orina que están previamente almacenadas en la unidad de almacenamiento, y el nivel de D-serina y/o el nivel de D-asparagina en una muestra de sangre y/o muestra de orina y las variables, que están almacenados en la unidad de almacenamiento, y los sustituya en la fórmula de cálculo para la tasa de excreción de D-serina y/o la fórmula de cálculo para la tasa de excreción de D-asparagina en orina para calcular la tasa de excreción de D-serina y/o la tasa de excreción de D-asparagina, en la unidad de procesamiento de datos;

compare el umbral almacenado en la unidad de almacenamiento y la tasa de excreción de D-serina y/o la tasa de excreción de D-asparagina en la unidad de procesamiento de datos y evalúe el estado renal; y

emita los resultados de evaluación para el estado renal del sujeto a la unidad de salida. El programa de la invención puede estar almacenado en un medio de almacenamiento, o puede proporcionarse mediante transmisión electrónica tal como Internet o una LAN.

Cuando el dispositivo de procesamiento de información comprende una unidad de medición analítica, puede incluir un comando para hacer que el dispositivo de procesamiento de información tome el valor para la muestra de sangre y/o muestra de orina medido por la unidad de medición analítica y lo almacene en la unidad de almacenamiento, en lugar de introducir los valores de nivel de D-serina y/o de nivel de D-asparagina a partir de la unidad de entrada.

Se pretende que los ejemplos de la invención descritos a continuación sirvan simplemente como ilustración y no limiten el alcance técnico de la invención. El alcance técnico de la invención está limitado únicamente por la descripción en las reivindicaciones.

Ejemplo 1

Población de estudio

Se usó un estudio retrospectivo para aldosteronismo primario (PA), mieloma de riñón (IGAN), nefropatía diabética (DM) y nefropatía por IgA (IGAN), a partir de una cohorte de pacientes con enfermedad renal ingresados en el departamento de nefrología, Hospital universitario de Osaka, para su diagnóstico y/o tratamiento desde 2016 hasta 2017. Dado que los sujetos de prueba con nefropatía por IgA tenían una tensión arterial por encima del intervalo de referencia, se les administró un antagonista de receptor de angiotensina II (ARB) como fármaco antihipertensor. De manera independiente, se incluyeron 15 voluntarios sanos como sujetos sin enfermedad renal por los Institutos nacionales de innovación biomédica, salud y nutrición. El protocolo de prueba se aprobó por el comité ético de cada instalación y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes.

Medición de D-serina y D-asparagina en sangre y orina

Preparación de muestras

La preparación demuestras a partir de plasma sanguíneo y orina humanos se llevó a cabo de la siguiente manera: en primer lugar, se añadió un volumen de 20 veces de metanol a, y se mezcló completamente con, el plasma sanguíneo. Tras la centrifugación, se transfirieron 10 pl de sobrenadante obtenido a partir del homogeneizado de metanol a un tubo marrón y se secaron a presión reducida. Al residuo se le añadieron 20 pl de tampón de borato de sodio 200 mM (pH 8,0) y 5 pl de reactivo de marcado fluorescente (4-fluoro-7-nitro-2,1,3-benzooxadiazol (NBD-F) 40 mM en MeCN anhidro) y después se calentó la mezcla a 60°C durante 2 minutos. Se suspendió la reacción mediante adición de 75 pl de TFA al 0,1 % acuoso (v/v) y se suministraron 2 pl de la mezcla de reacción a HPLC en dos dimensiones.

Cuantificación de isómeros ópticos de aminoácidos mediante HPLC en dos dimensiones

Se cuantificaron los isómeros ópticos de aminoácido usando el siguiente sistema de HPLC en dos dimensiones. Se separaron derivados de NBD de los aminoácidos y se eluyeron usando una columna de fase inversa (KSAA RP, 1,0 mm de d.i. * 400 mm; Shiseido Corp.), en la fase móvil (del 5 al 35 % de MeCN, del 0 al 20 % de THF, TFA al 0,05 %). La temperatura de columna era de 45°C y la velocidad de flujo de fase móvil era de 25 pl/min. Se separó la fracción de aminoácidos separados usando una válvula de múltiples bucles y se sometió a resolución óptica de una manera continua con una columna quiral (KSAACSP-001S, 1,5 mm de d.i. * 250 mm; Shiseido Corp.). La fase móvil usada fue una disolución mixta de MeOH/MeCN que contenía ácido cítrico (de 0 a 10 mM) o ácido fórmico (del 0 al 4 %), según la retención de aminoácido. Se detectaron NBD-aminoácidos mediante detección de fluorescencia a 530 nm usando luz de excitación de 470 nm. El tiempo de retención de NBD-aminoácidos se determinó a partir de isómeros ópticos de aminoácidos convencionales y se cuantificó mediante una curva de calibración.

Cálculo de la tasa de excreción de D-serina y la tasa de excreción de D-asparagina

El nivel de D-serina en sangre y orina y el nivel de D-asparagina en sangre y orina y el nivel de creatinina se calcularon mediante sustitución en las siguientes fórmulas.

Fórmula matemática 11

donde

UD-Ser representa el nivel de D-serina en la orina,

PD-Ser representa el nivel de D-serina en la sangre,

UCre representa el nivel de creatinina en la orina, y

PCre representa el nivel de creatinina en la sangre

Fórmula matemática 12

donde

UD-Asn representa el nivel de D-asparagina en la orina,

PD-Asn representa el nivel de D-asparagina en la sangre,

UCre representa el nivel de creatinina en la orina, y

PCre representa el nivel de creatinina en la sangre

Evaluación y valoración de patología

Tal como se mencionó anteriormente, se calculó que el valor de referencia para la tasa de excreción de D-serina en los sujetos de prueba sin enfermedad renal ere del 42,46 al 89,66 % como media con ± 1,96 de desviación estándar, y se calculó que el logaritmo era de 3,75 a 4,50. Tal como también se mencionó anteriormente, se calculó que el valor de referencia para la tasa de excreción de D-asparagina en los sujetos de prueba sin enfermedad renal era del 51,65 al 78,74 % como con ± 1,96 de desviación estándar, y se calculó que el logaritmo era de 3,95 a 4,37. Las tasas de excreción de D-serina para los pacientes con enfermedad renal eran para PA del 117,24%, lo cual superaba el intervalo de referencia, para IGAN del 64,56 %, lo cual estaba dentro del intervalo de referencia, para DM del 42,58 %, lo cual estaba por debajo del intervalo de referencia (por debajo de los valores medidos para sujetos de prueba sin enfermedad renal) y para MGRS del 107,01 %, lo cual estaba por encima del intervalo de referencia, y por tanto la patología estaba claramente presente con valores distintos del intervalo de referencia (figura 2). Las tasas de excreción de D-asparagina para los pacientes con enfermedad renal eran para PA del 150,78 %, lo cual superaba el intervalo de referencia, para IGAN del 45,71 %, lo cual estaba dentro del intervalo de referencia, para DM del 53,75 %, lo cual estaba por debajo del intervalo de referencia (por debajo de los valores medidos para sujetos de prueba sin enfermedad renal) y para MGRS del 105,25%, lo cual estaba por encima del intervalo de referencia, y por tanto la patología estaba claramente presente con valores distintos del intervalo de referencia (figura 2).

Un requisito futuro será aumentar la variación de patología y el número de sujetos de prueba para mejorar la precisión de análisis, pero esta prueba ha confirmado la utilidad de la tasa de excreción de D-serina y la tasa de excreción de D-asparagina en la investigación para esclarecer mecanismos de patología o para un desarrollo o tratamiento de fármacos innovadores, en los que la tasa de excreción superó el 100% lo cual es teóricamente imposible sin biosíntesis o secreción de D-serina y D-asparagina, y también para ayudar a la valoración clínica de la patología y el diagnóstico diferencial. También se obtuvieron resultados equivalentes usando los valores sometidos a conversión logarítmica.

Monitorización del efecto terapéutico

La tasa de excreción de D-serina para IGAN tras la administración de ARB debido a hipertensión disminuyó desde el 64,56 % hasta un valor del 25,73 %, lo cual estaba por debajo del valor de referencia (figura 2). La tasa de excreción de D-asparagina para IGAN tras la administración de ARB también disminuyó desde el 45,71 % hasta un valor del 35,39 %, lo cual estaba por debajo del valor de referencia (figura 2). Esto sugiere que la tasa de excreción se ve afectada por cambios en el estado patológico, tales como reducción de la tensión arterial, debido a intervención terapéutica tal como administración de un fármaco, y que la tasa de excreción de D-serina y la tasa de excreción de D-asparagina son útiles para ayudar a determinar una política tal como continuación o suspensión de tratamiento, en investigación realizada con el fin de esclarecer mecanismos farmacológicos o para desarrollo de fármaco innovadores, y en el transcurso de la monitorización de efectos durante la intervención terapéutica.

Ejemplo 2

Información de sujetos de prueba

Tras obtener el consentimiento informado por escrito de una mujer de 36 años de edad ingresada en el Hospital universitario de Osaka con lupus eritematoso sistémico, con aprobación ética de la misma universidad, se tomaron muestras periódicas de su sangre y orina. Los valores empeoraron rápidamente, aumentando la creatinina en suero desde un nivel de 0,57 mg/dl 90 días antes del ingreso hasta 11,68 mg/dl y aumentando la concentración de proteína en orina desde Cre 0,5 g/g hasta Cre 4,0 g/g, mientras que la tensión arterial era de 122/65 mmHg, la FC era de 64 lpm, la saturación de oxígeno arterial percutáneo era del 100 % (aire de interior) y la temperatura corporal era de 36,5°C. También se observaron úlceras en la boca, alopecia y hemorragia retiniana, pero no se observaron ruidos pulmonares, ruidos cardíacos o edema en las extremidades inferiores anómalos. Se sospechaba glomerulonefritis de rápida progresión en las pruebas clínicas, con hemoglobina en sangre de 4,6 g/dl, nivel normal de complemento de<c>3: 88 mg/dl y C4: 21 mg/dl, anticuerpos anti-ADNbc positivos de 13,0 UI/ml1, y P-ANCA de 182,0 U/ml, y por tanto se continuaron sesiones de plasmaféresis (PE), y se realizó una biopsia de riñón. Se encontraron células falciformes en el 79% de los glomérulos, se encontraron células falciformes fibrosas en el 13%, y los capilares glomerulares estaban engrosados con espuma y espículas, aunque no se observó glomeruloesclerosis. Las regiones intersticiales mostraron una infiltración difusa moderada de células inflamatorias, pero tan sólo una ligera fibrilación. La atrofia tubular estaba localizada y moderada. En tinción inmunofluorescente, las paredes de capilares glomerular granulares también eran positive de manera global para IgG, IgA, IgM, C3, C4 y C1q. El diagnóstico era nefritis glomerular falciforme relacionada con ANCA latente, con nefritis lúpica de clase V. El tratamiento se realizó mediante terapia pulsada con prednisolona (3 días, 1 g), seguido por prednisolona oral (40 mg/día), terapia con ciclofosfamida intravenosa pulsada intermitente (500 mg/m2) y micofenolato-mofetilo (MMF, 500 mg/día). También se llevaron a cabo ocho series de plasmaféresis. En respuesta a este tratamiento, el nivel de creatinina en suero disminuyó hasta 0,72 mg/dl, pero el nivel de proteína en orina persistió. Una biopsia de riñón de seguimiento mostró una retirada creciente de células glomerulares, pero con un endurecimiento global del 30 % de los glomérulos, y engrosamiento persistente de los capilares.

Tasa de excreción de D-serina

Se prepararon las muestras recogidas de sangre y de orina de la misma manera que en el ejemplo 1, y se cuantificó la D-serina mientras que también se calculaba la tasa de excreción de D-serina.

Evaluación y valoración de la patología, y monitorización del efecto terapéutico

La tasa de excreción de D-serina era de 0 (por debajo del intervalo de referencia) inmediatamente después del inicio del tratamiento, 0 (por debajo del intervalo de referencia) después de 8 días, 0 (por debajo del intervalo de referencia) después de días, 0 (por debajo del intervalo de referencia) después de 16 días, 0 (por debajo del intervalo de referencia) después de 22 días, el 58,9% (dentro del intervalo de referencia) después de 29 días, el 87,6% (por encima del intervalo de referencia) después de 34 días, y el 41,7 % (dentro del intervalo de referencia) después de 48 horas. Aunque el nivel de creatinina todavía estaba volviendo al intervalo normal mediante tratamiento, la tasa de excreción de D-serina aumentó temporalmente, ajustándose dentro del intervalo de referencia calculado en el ejemplo 1.

Durante el ciclo de tratamiento de nefropatía provocada por lupus eritematoso sistémico, se observó un fenómeno de aumento de tasa de excreción de D-serina. Esto sugiere que los riñones controlan la tasa de excreción frente al riesgo o daño por alguna causa, como respuesta de defensa biológica. Por tanto, se confirmó que resulta eficaz monitorizar la tasa de excreción de D-serina con el fin de ayudar a la investigación realizada con el fin de esclarecer los mecanismos de patología o farmacológicos, o el desarrollo y terapia con fármacos innovadores, o la valoración de clínica de la patología y el diagnóstico diferencial, o determinar la política de tratamiento.

Ejemplo 3

Se llevó a cabo un estudio retrospectivo con pacientes con nefritis intersticial (TIN), hipertrofia prostética (BPH), enfermedad de Fabry (Fabry) o síndrome nefrótico microvariable (MCNS) seleccionados de una cohorte que consistía en pacientes con enfermedad renal ingresados en el departamento de nefrología, Hospital universitario de Osaka desde 2016 hasta 2017 para su diagnóstico y/o tratamiento. El protocolo de prueba se aprobó por el comité ético de la Universidad de Osaka y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes.

Tasa de excreción de D-serina

Se prepararon las muestras recogidas de sangre y de orina y se cuantificaron de la misma manera que en el ejemplo 1, y se calcularon las tasas de excreción de D-serina.

Evaluación, valoración y distinción de la patología

Se representaron gráficamente los niveles de D-serina en sangre y las tasas de excreción de D-serina de los pacientes en un sistema de coordenadas de dos ejes, junto con los pacientes con enfermedad renal del ejemplo 1 (figura 13). El poder de separación del gráfico era superior a la información para los niveles de D-serina en sangre y las tasas de excreción de D-serina para cada patología, indicando su utilidad para ayudar en la distinción de la causa y la evaluación y valoración del estado patológico.

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para ayudar a la evaluación del estado renal, usando la tasa de reabsorción y excreción de D-serina y/o D-asparagina en los riñones de un sujeto como marcador, en el que el método comprende una etapa de medir el/los valor(es) de la tasa de reabsorción y excreción de D-serina y/o la tasa de reabsorción y excreción de D-asparagina en una muestra de sangre extraída de un sujeto; en el que la tasa es la tasa de excreción de D-serina en orina del sujeto (tasa de excreción de D-serina de sujeto) y/o la tasa de excreción de D-asparagina en orina del sujeto (tasa de excreción de D-asparagina de sujeto), en el que la tasa de excreción de D-serina y/o la tasa de excreción de D-asparagina se calculan con corrección usando un factor de corrección de sangre y/u orina, en el que el factor de corrección es uno o más factores de corrección seleccionados del grupo que consiste en tasa de filtración glomerular y volumen urinario; o en el que el factor de corrección es uno o más factores de corrección seleccionados del grupo que consiste en aclaramiento de inulina y aclaramiento de creatinina; o en el que el factor de corrección es uno o más factores de corrección seleccionados del grupo que consiste en nivel de creatinina y nivel de L-aminoácidos; o en el que el factor de corrección es L-serina y/o L-asparagina.
2. 2. El método según la reivindicación 1, en el que: la tasa de excreción de D-serina se calcula mediante la siguiente fórmula: Fórmula matemática 1

   donde UD-Ser representa el nivel de D-serina en la orina, PD-Ser representa el nivel de D-serina en la sangre, Uore representa el nivel de creatinina en la orina, y Pcre representa el nivel de creatinina en la sangre, y/o la tasa de excreción de D-asparagina se calcula mediante la siguiente fórmula: Fórmula matemática 2

   donde UD-Asn representa el nivel de D-asparagina en la orina, PD-Asn representa el nivel de D-asparagina en la sangre, Ucre representa el nivel de creatinina en la orina, y Pcre representa el nivel de creatinina en la sangre.
3. 3. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, que comprende: comparar la tasa de excreción de D-serina de sujeto y/o la tasa de excreción de D-asparagina de sujeto con una primera referencia calculada a partir de las tasas de excreción de D-serina en orina de múltiples sujetos sin enfermedad renal (tasas de excreción de D-serina de sujetos sin enfermedad renal) y/o las tasas de excreción de D-asparagina en orina de múltiples sujetos sin enfermedad renal (tasas de excreción de D-asparagina de sujetos sin enfermedad renal), y evaluar el estado renal basándose en la relación entre la tasa de excreción de D-serina de sujeto y/o la tasa de excreción de D-asparagina de sujeto, y la primera referencia.
4. 4. El método según la reivindicación 3, en el que la evaluación del estado renal es evaluar el riesgo de morbididad o enfermedad renal del sujeto o predecir la aparición o el pronóstico de enfermedad renal, cuando la tasa de excreción de D-serina de sujeto y/o la tasa de excreción de D-asparagina de sujeto no están dentro del intervalo de la primera referencia; en el que, preferiblemente, la enfermedad renal está provocada por enfermedad renal crónica, mieloma de riñón, nefropatía diabética, nefropatía por IgA, nefritis intersticial o riñón poliquístico, o lupus eritematoso sistémico, aldosteronismo primario, hipertrofia prostática, enfermedad de Fabry o síndrome nefrótico microvariable.
5. 5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 4, en el que la primera referencia está en el intervalo de media ± DE * coeficiente Z de la tasa de excreción de D-serina de sujeto sin enfermedad renal y/o la tasa de excreción de D-asparagina de sujeto sin enfermedad renal; y/o en el que la primera referencia está en el intervalo de 0,4 a 0,9; en el que, preferiblemente, el coeficiente Z es un valor de 1,0 a 3,0; en el que, más preferiblemente, el coeficiente Z es 1,96.
6. 6. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, que comprende: comparar la tasa de excreción de D-serina de sujeto sometida a conversión logarítmica (tasa de excreción de LN de D-serina de sujeto) y/o la tasa de excreción de D-asparagina de sujeto sometida a conversión logarítmica (tasa de excreción de LN de D-asparagina de sujeto) con una segunda referencia calculada a partir de los valores sometidos a conversión logarítmica de las tasas de excreción de D-serina en orina de múltiples sujetos sin enfermedad renal (tasas de excreción de LN de D-serina de sujetos sin enfermedad renal) y/o los valores sometidos a conversión logarítmica de las tasas de excreción de D-asparagina en orina de múltiples sujetos sin enfermedad renal (tasas de excreción de LN de D-asparagina de sujetos sin enfermedad renal), y evaluar el estado renal basándose en la relación entre la tasa de excreción de LN de D-serina de sujeto y/o la tasa de excreción de LN de D-asparagina de sujeto, y la segunda referencia.
7. 7. El método según la reivindicación 6, en el que la evaluación del estado renal es evaluar el riesgo de morbididad o enfermedad renal del sujeto o predecir la aparición o el pronóstico de enfermedad renal, cuando la tasa de excreción de LN de D-serina de sujeto y/o la tasa de excreción de LN de D-asparagina de sujeto no están dentro del intervalo de la segunda referencia; en el que, preferiblemente, la enfermedad renal está provocada por enfermedad renal crónica, mieloma de riñón, nefropatía diabética, nefropatía por IgA, nefritis intersticial o riñón poliquístico, o lupus eritematoso sistémico, aldosteronismo primario, hipertrofia prostática, enfermedad de Fabry o síndrome nefrótico microvariable.
8. 8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7, en el que la segunda referencia está en el intervalo de media ± DE * coeficiente Z de la tasa de excreción de LN de D-serina de sujeto sin enfermedad renal y/o la tasa de excreción de LN de D-asparagina de sujeto sin enfermedad renal; y/o en el que la segunda referencia está en el intervalo de 3,5 a 5,0; en el que, preferiblemente, el coeficiente Z es un valor de 1,0 a 3,0; en el que, más preferiblemente, el coeficiente Z es 1,96.
9. 9. Un sistema para evaluar el estado renal que comprende una unidad de almacenamiento, una unidad de entrada, una unidad de medición analítica, una unidad de procesamiento de datos y una unidad de salida, en el que: la unidad de almacenamiento almacena un valor umbral introducido a partir de la unidad de entrada, y una fórmula de cálculo para la tasa de excreción de D-serina en orina y/o una fórmula de cálculo para la tasa de excreción de D-asparagina en orina, la unidad de medición analítica cuantifica el nivel de D-serina y/o el nivel de D-asparagina en una muestra de sangre y/o muestra de orina, la unidad de procesamiento de datos calcula la tasa de excreción de D-serina y/o la tasa de excreción de D-asparagina en orina generada a partir de un elemento que contiene el nivel de D-serina y/o nivel de D-asparagina cuantificados en una muestra de sangre y/o muestra de orina, y la fórmula de cálculo para la tasa de excreción de D-serina y/o la fórmula de cálculo para la tasa de excreción de D-asparagina almacenadas en la unidad de almacenamiento, la unidad de procesamiento de datos evalúa el estado renal basándose en el valor umbral almacenado en la unidad de almacenamiento y la tasa de excreción de D-serina y/o la tasa de excreción de D-asparagina en la orina, y la unidad de salida emite los resultados de evaluación para el estado renal del sujeto, en el que la tasa de excreción de D-serina y/o la tasa de excreción de D-asparagina se calculan con corrección usando un factor de corrección a partir de sangre y/u orina; en el que el factor de corrección es uno o más factores de corrección seleccionados del grupo que consiste en tasa de filtración glomerular y volumen urinario; o en el que el factor de corrección es uno o más factores de corrección seleccionados del grupo que consiste en aclaramiento de inulina y aclaramiento de creatinina; o en el que el factor de corrección es uno o más factores de corrección seleccionados del grupo que consiste en nivel de creatinina y nivel de L-aminoácidos; o en el que el factor de corrección es L-serina y/o L-asparagina.
10. 10. El sistema de evaluación según la reivindicación 9, en el que: la fórmula de cálculo para la tasa de excreción de D-serina es la siguiente fórmula: Fórmula matemática 3 Tasa de excreción de D-serina (Fe_D-Ser) =<UD-Ser / PD-Ser> UCre / PCre donde UD-Ser representa el nivel de D-serina en la orina, PD-Ser representa el nivel de D-serina en la sangre, Uore representa el nivel de creatinina en la orina, y Pcre representa el nivel de creatinina en la sangre, y/o la fórmula de cálculo para la tasa de excreción de D-asparagina es la siguiente fórmula: Fórmula matemática 4 Tasa de excreción de D-asparagina (Fe_D-Asn) =<UD-Asn / PD-Asn> UCre / PCre donde UD-Asn representa el nivel de D-asparagina en la orina, PD-Asn representa el nivel de D-asparagina en la sangre, Ucre representa el nivel de creatinina en la orina, y Pcre representa el nivel de creatinina en la sangre.
11. 11. Un programa que hace que un dispositivo de procesamiento de información que comprende una unidad de entrada, una unidad de salida, una unidad de procesamiento de datos y una unidad de almacenamiento evalúe el estado renal, en el que el programa incluye un comando para hacer que el dispositivo de procesamiento de información: almacene en la unidad de almacenamiento un valor umbral para la evaluación del estado renal introducido a partir de la unidad de entrada, una fórmula de cálculo para la tasa de excreción de D-serina y/o una fórmula de cálculo para la tasa de excreción de D-asparagina en orina, y variables necesarias para el cálculo, almacene en la unidad de almacenamiento el nivel de D-serina y/o el nivel de D-asparagina en una muestra de sangre y/o muestra de orina y variables necesarias para el cálculo de la tasa de excreción de D-serina y/o la tasa de excreción de D-asparagina en orina, introducidas a partir de la unidad de entrada, recurra a la fórmula de cálculo para la tasa de excreción de D-serina y/o la fórmula de cálculo para la tasa de excreción de D-asparagina en orina que están previamente almacenadas en la unidad de almacenamiento, y el nivel de D-serina y/o el nivel de D-asparagina en una muestra de sangre y/o muestra de orina y las variables, que están almacenados en la unidad de almacenamiento, y los sustituya en la fórmula de cálculo para la tasa de excreción de D-serina y/o la fórmula de cálculo para la tasa de excreción de D-asparagina en orina para calcular la tasa de excreción de D-serina y/o la tasa de excreción de D-asparagina, en la unidad de procesamiento de datos; compare el umbral almacenado en la unidad de almacenamiento y la tasa de excreción de D-serina y/o la tasa de excreción de D-asparagina en la unidad de procesamiento de datos y evalúe el estado renal; y emita los resultados de evaluación para el estado renal del sujeto a la unidad de salida; en el que la tasa de excreción de D-serina y/o la tasa de excreción de D-asparagina se calculan con corrección usando un factor de corrección a partir de sangre y/u orina; en el que el factor de corrección es uno o más factores de corrección seleccionados del grupo que consiste en tasa de filtración glomerular y volumen urinario; o en el que el factor de corrección es uno o más factores de corrección seleccionados del grupo que consiste en aclaramiento de inulina y aclaramiento de creatinina; o en el que el factor de corrección es uno o más factores de corrección seleccionados del grupo que consiste en nivel de creatinina y nivel de L-aminoácidos; o en el que el factor de corrección es L-serina y/o L-asparagina.
12. 12. El programa según la reivindicación 11, en el que: la fórmula de cálculo para la tasa de excreción de D-serina es la siguiente fórmula: Fórmula matemática 5 Tasa de excreción de D-serina (Fe_D-Ser) =<UD-Ser / PD-Ser> UCre / PCre donde UD-Ser representa el nivel de D-serina en la orina, Pü-ser representa el nivel de D-serina en la sangre, Ucre representa el nivel de creatinina en la orina, y Pcre representa el nivel de creatinina en la sangre, y/o la fórmula de cálculo para la tasa de excreción de D-asparagina es la siguiente fórmula: Fórmula matemática 6 Tasa de excreción de D-asparagina (Fe_D-Asn) =<UD-Asn / PD-Asn> UCre / PCre donde UD-Asn representa el nivel de D-asparagina en la orina, PD-Asn representa el nivel de D-asparagina en la sangre, Ucre representa el nivel de creatinina en la orina, y Pcre representa el nivel de creatinina en la sangre.