ES3041621T3 - Tomato plant resistant to tomato brown rugose fruit virus - Google Patents

Tomato plant resistant to tomato brown rugose fruit virus

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Abstract

La presente invención se refiere a una planta de la especie *Solanum lycopersicum* resistente al tobamovirus, que comprende una o más secuencias genómicas. Más específicamente, la invención se refiere a plantas de tomate (*Solanum lycopersicum*) resistentes al virus del fruto rugoso marrón del tomate (TBRFV). La presente invención también se refiere a una secuencia o locus genómico que confiere resistencia al tobamovirus. Asimismo, la presente invención se refiere a métodos para obtener una planta de *Solanum lycopersicum* resistente al tobamovirus. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Planta de tomate resistente al virus de la fruta rugosa parda del tomate
En la presente memoria se describe una planta de la especie S.lycopersicumque es resistente al Tobamovirus, en donde la planta comprende una o más secuencias genómicas. Más específicamente, plantas de tomate (S.lycopersicum)que son resistentes al virus de la fruta rugosa parda del tomate (TBRFV). La presente invención se refiere a un gen de resistencia o a una secuencia genómica que proporciona resistencia al tobamovirus, en donde el tobamovirus es el TBRFV. Además, la presente invención se refiere a métodos para proporcionar una planta de S.lycopersicumque sea resistente al tobamovirus.
El Tobamovirus es un género de la especie viral Virgaviridae que infecta a las plantas, incluidas las plantas de la familia de lassolanáceas,como el tabaco, la papa, el tomate y la berenjena, y se encuentra entre las amenazas más graves para los cultivos de hortalizas del mundo. Los tobamovirus son particularmente problemáticos en los cultivos de tomate cultivados en ambientes protegidos y se transmiten a largas distancias a través de la contaminación externa de las semillas, y mecánicamente de una planta a otra mediante prácticas de cultivo comunes a través de las manos, la ropa y las herramientas de los trabajadores, y son capaces de preservar la infectividad de las semillas y el suelo contaminado. Además, las malas hierbas comunes, a menudo asintomáticas cuando se infectan por el virus, constituyen un reservorio críptico entre los ciclos de crecimiento.
Las infecciones por tobamovirus pueden tener efectos desastrosos en los cultivos cuando éstos se contaminan. La prevención de la infección, por ejemplo mediante el cultivo de plántulas en un ambiente libre de virus, suele ser costosa y/o perjudicial para el medio ambiente. Además, estos métodos no siempre proporcionan resultados satisfactorios.
Los tobamovirus no tienen envoltura, tienen geometrías de varillas helicoidales y simetría helicoidal. Las partículas virales tienen forma de varilla y tienen un diámetro de alrededor de 18 nm y una longitud de 300 a 310 nm. Sus genomas de ARN monocatenario de sentido positivo son lineales y no segmentados, y tienen una longitud de alrededor de 6,3 a 6,5 kb. Hay más de 35 especies de virus en este género, incluido el virus del mosaico del tomate (ToMV) o el virus del mosaico del tabaco (TMV), el virus del moteado leve del tomate (TomMV) y el recientemente descubierto virus de la fruta rugosa parda del tomate (TBRFV).
En el tomate, la denominación de las cuatro cepas de Tobamovirus (más específicamente el ToMV) actualmente reconocidas (Tm-0, Tm-1, Tm-2 y Tm-22) se basa en los genes de resistencia (R) introgresadosTm1, Tm2yTm22de especies silvestres relacionadas. El genTm1se introgresó deSolarium habrochaitesy es incompletamente dominante. Los genesTm2yTm22se introgresaron deSolarium peruvianumy confieren una resistencia completa dominante al ToMV. Sin embargo, han surgido nuevas cepas del virus del Tobamo a medida que se ha superado la resistencia y recientemente se han registrado especies del virus del Tobamo que rompen la resistencia en campos comerciales de México, Jordania e Israel.
A finales de 2014 y principios de 2015, se produjo un brote de una nueva enfermedad que infectó a los tomates en Israel y Jordania. Las plantas sintomáticas mostraron un patrón de mosaico en las hojas acompañado ocasionalmente por un estrechamiento de las hojas y frutos con manchas amarillas. Las investigaciones mostraron que esta nueva enfermedad era un nuevo tobamovirus, llamado TBRFV. La infección por el TBRFV se asocia con lesiones necróticas en las hojas y las plantas de tomate muestran síntomas foliares leves al final de la temporada, pero fuertes síntomas de rugosa parda en los frutos, lo que los hace inadecuados para el consumo. Además, con respecto a otros miembros de la familia de lassolanáceas,parece que el TBRFV también es capaz de infectar plantas de pimiento, por ejemplo, cuando se planta en suelo contaminado del ciclo de crecimiento anterior de plantas de tomate infectadas a temperaturas superiores a 30 °C.
En la batalla contra el Tobamovirus, la resistencia se introdujo en los tomates por la introgresión de los genes RTm2 y Tm22,lo que resultó en resistencia al ToMV. Sin embargo, estos genes R no proporcionan resistencia al nuevo TBRFV, ya que se requieren diferentes dominios en las proteínas virales compuestos por una estructura proteica diferente y un nuevo mecanismo de resistencia y/o genes resistentes para un mecanismo de resistencia diferente. Además, es muy probable que con el tiempo la resistencia se rompa, ya que el virus se adaptará y evolucionará, lo que provocará un avance viral. Por lo tanto, es necesario identificar y/o combinar nuevos genes de resistencia para proporcionar cultivos resistentes, especialmente contra el nuevo TBRFV.
El documento WO2018/219941A1 describió la tolerancia al tobamovirus TBRFV en plantas de Solanum lycopersicum comprendiendo en su genoma QTL caracterizados por alelos definidos de diferentes SNP en los cromosomas 6, 9 y 11 y que confieren a la planta un fenotipo mejorado correspondiente a la tolerancia foliar y/o frutal contra el TBRFV.
Teniendo en cuenta lo anterior, existe una necesidad en la técnica de plantas de tomate resistentes al TBRFV, más específicamente de S.lycopersicumresistentes al TBRFV. Además, existe la necesidad en la técnica de proporcionar métodos y medios para proporcionar plantas de S.lycopersicumresistentes al TBRFV.
Es un objeto de la presente invención, entre otros objetos, satisfacer la necesidad existente en este campo, arriba descrita. Este objeto de la presente invención, entre otros objetos, se logra mediante la presente invención como se describe en las reivindicaciones adjuntas.
Específicamente, el objeto anterior, entre otros objetos, se cumple, conforme a un primer aspecto, mediante la reivindicación 1. Se predice que el gen de resistencia al TBRFV codifica una proteína de resistencia NBS-LRR.
La presente invención se refiere al gen de resistencia al TBRFV comprendiendo una secuencia codificante que tiene al menos un 95 %, preferiblemente al menos un 98 %, más preferiblemente al menos un 99 %, lo más preferiblemente un 100 % de identidad de secuencia de nucleótidos con la Id. de sec. n.° 115.
En la presente memoria se describe una planta, en donde la planta comprende una o más secuencias genómicas seleccionadas del grupo que consiste en la Id. de sec. n.° 1, Id. de sec. n.° 2, Id. de sec. n.° 3, Id. de sec. n.° 4, Id. de sec. n.° 5, Id. de sec. n.° 6, Id. de sec. n.° 7, Id. de sec. n.° 8, Id. de sec. n.° 9, Id. de sec. n.° 10, Id. de sec. n.° 11, Id. de sec. n.° 12, Id. de sec. n.° 13, Id. de sec. n.° 14, Id. de sec. n.° 15, Id. de sec. n.° 16, Id. de sec. n.° 17 y la Id. de sec. n.° 18, o que tengan al menos un 95 % de identidad de secuencia con cualquiera de dichos números de la Id. de sec. Las secuencias genómicas codifican uno o más genes o elementos genéticos que proporcionan resistencia al tobamovirus. Se han examinado las secuencias para determinar la homología génica utilizando una base de datos pública del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI). Seis secuencias genómicas tienen homología con las secuencias que codifican las proteínas de resistencia al NBS-LRR (Id. de sec. n.° 7, 8, 9, 10, 11 y 14). Cuatro secuencias genómicas tienen homología con la proteína quinasa de serina/treonina similar al receptor LRR (Id. de sec. n.° 5, 6, 12 y 13).
El reconocimiento de patógenos por parte de las plantas se lleva a cabo a través de dos grupos relevantes de receptores del huésped que incluyen dos tipos principales de proteínas, a saber, las quinasas o proteínas similares a los receptores (RLK o r Lp ) y las proteínas repetidas ricas en leucina del sitio de unión a nucleótidos (proteínas de resistencia NBS-LRR). El primer grupo son los receptores de reconocimiento de patrones(Pattem Recognition Receptors,PRR) que se especializan en el reconocimiento de patrones moleculares asociados a patógenos(Pathogen Associated Molecular Patterns,PAMPS). Los RLP o RLK están unidos a la membrana celular y son receptores inmunitarios extracelulares. Los RLK de las plantas participan en la interacción y las respuestas de defensa entre las plantas y los patógenos, y las quinasas receptoras de las plantas(Plant ReceptorKinase,PRK) pueden definirse como proteínas que contienen un dominio extracelular, un dominio transmembrana de un solo paso y un dominio de la proteína quinasa de serina/treonina (ser/thr) citoplasmático. Los LRR-RLK vegetales (quinasa similar a un receptor de repetición rica en leucina) poseen un dominio quinasa citoplasmático funcional, y todos los LRR-RLK vegetales analizados hasta la fecha poseen actividad quinasa ser/thr. La resistencia a los patógenos que proporcionan estos receptores se denomina inmunidad provocada por PAMP(PAMP-Triggered Immunity,PTI). El otro grupo comprende principalmente receptores intracelulares denominados proteínas de resistencia (proteínas R). La mayoría de los genes de resistencia a enfermedades en las plantas codifican proteínas de repetición ricas en leucina en el sitio de unión a nucleótidos, también conocidas como proteínas NBS-LRr . Estas proteínas se caracterizan por sus dominios de sitio de unión a nucleótidos(Nucleotide-Binding Site,NBS) y de repetición rica en leucina(Leucine-Rich Repeat,LRR), así como por dominios variables amino y carboxiterminales, y participan en la detección de diversos patógenos, como bacterias, virus, hongos, nematodos, insectos y oomicetos. La mayoría de las secuencias genómicas identificadas que proporcionan resistencia al Tobamovirus comprenden múltiples dominios LRR. Se cree que estos dominios determinan el reconocimiento de los efectores y, por lo tanto, la susceptibilidad/resistencia a la enfermedad.
Los patógenos desarrollan estrategias de lucha para superar la PTI mediante la modificación o el cambio de los PAMP o m Am P. Luego, las plantas desarrollarán una forma de reconocer estos efectores y desencadenar una respuesta de defensa secundaria más rápida y fuerte conocida como inmunidad activada por efectores(Effector-Triggered Immunity,ETI). La ETI está mediada por proteínas R y acompañada de una muerte celular localizada alrededor del sitio de la infección. La presencia de estos genes de resistencia y/o regiones genómicas recientemente identificados que codifican las proteínas NBS-LRR y/o las quinasas receptoras vegetales disminuirá las posibilidades de que el patógeno supere la resistencia o, cuando se combina con otros genes de resistencia, la resistencia a la enfermedad puede incluso mejorar aún más.
En la presente memoria se describe una planta, en donde la planta comprende la secuencia genómica representada por la Id. de sec. n.°. 3. La secuencia genómica Id. de sec. n.°. 3 comprende múltiples secuencias que tienen homología con las secuencias que codifican las proteínas de resistencia al NBS-LRR y la proteína quinasa de serina/treonina similar al receptor LRR.
En la presente memoria se describe una planta, en donde la planta comprende la Id. de sec. n.° 8, la Id. de sec. n.° 9, la Id. de sec. n.° 10 y la Id. de sec. n.° 11.
Según la presente invención, la resistencia al tobamovirus de la planta puede verse afectada por una secuencia que codifica una proteína NBS-LRR del N.° 14.
En la presente memoria se describe una planta, en donde la planta comprende las secuencias genómicas de la Id. de sec. n.° 8, la Id. de sec. n.° 11 y la Id. de sec. n.° 14.
En la presente memoria se describe una planta, en donde la planta comprende la Id. de sec. n.° 8, la Id. de sec. n.° 9, la Id. de sec. n.° 10, la Id. de sec. n.° 11, la Id. de sec. n.° 12, la Id. de sec. n.° 13 y la Id. de sec. n.° 14.
En la presente memoria se describe una planta en donde la planta es resistente a las cepas Tm-0, Tm-1 y Tm-2 del virus del Tobamo. En el tomate, se han identificado cuatro cepas de Tobamovirus; Tm-0, Tm-1, Tm-2 y Tm-22. En la presente memoria se describe una planta en donde la planta es resistente al virus de la fruta rugosa parda del tomate (TBRFV).
En la presente memoria se describe una planta en donde el TBRFV es el virus aislado AE050.
En la presente memoria se describe una planta, en donde la planta es una planta de tomate(Solanum lycopersicum).En la presente memoria se describe una planta en donde una o más secuencias genómicas y/o el gen de resistencia al TBRFV son heterocigotos u homocigotos presentes en el genoma de dicha planta. A partir de los datos experimentales se puede concluir que la resistencia es dominante y que el gen de resistencia al TBRFV y/o la secuencia genómica deben ser al menos heterocigotos presentes en el genoma de la planta para proporcionar resistencia contra el virus del Tobamo.
En la presente memoria se describe una planta en donde dicho gen de resistencia al TBRFV y/o una o más secuencias genómicas son las que se encuentran en el número de acceso del depósito NCIMB 43279. NCIMB 43279, semillas deSolanum lycopersicumse depositaron el 16 de noviembre de 2018 en NCIMB Ltd, Ferguson Building, Craibstone Estate Bucksbum, AB21 9YA Aberdeen, Reino Unido.
La presente invención se refiere a un gen de resistencia (gen de resistencia al TBRFV) para proporcionar resistencia a un tobamovirus en una planta de S.lycopersicum,en donde dicho gen de resistencia está representado por una secuencia codificante que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia de nucleótidos con la Id. de sec. n.° 115, en donde el tobamovirus es el TBRFV.
La presente invención, según un aspecto adicional, se refiere a una secuencia genómica para proporcionar resistencia a un tobamovirus en una planta de S.lycopersicum,en donde la secuencia genómica es la Id. de sec. n.° 14, o que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la Id. de sec. n.° 14, en donde el tobamovirus es el TBRFV. En la presente memoria se describe un locus de resistencia para proporcionar resistencia a un Tobamovirus en una planta de S.lycopersicum,en donde el locus está representado por la Id. de sec. n.° 1, la Id. de sec. n.° 2, la Id. de sec. n.° 3 o la Id. de sec. n.° 4, preferiblemente la Id. de sec. n.° 3.
Según la presente invención, el gen de resistencia o la secuencia genómica proporcionan resistencia a un TBRFV. En la presente memoria se describe un método para proporcionar una planta de la especie S.lycopersicumque es resistente al Tobamovirus, en donde el método comprende las etapas de:
a) seleccionar una planta de S.habrochaitesque sea resistente al Tobamovirus, en donde dicha selección comprende establecer la presencia del gen de resistencia o secuencia genómica de la presente invención,
b) transferir la secuencia genómica identificada o el locus de la etapa a) a una planta de S.lycopersicum,lo que confiere resistencia al Tobamovirus a dicha planta de S.lycopersicum.
La transferencia se puede realizar cruzando la planta de S.habrochaitesseleccionada con una S.lycopersicum.Posteriormente, se puede seleccionar una planta de S.lycopersicumresistente al Tobamovirus.
Según otra realización preferida, la presente invención se refiere al método de la reivindicación 3, que consiste en seleccionar plantas de S.lycopersicumque sean resistentes al Tobamovirus.
Según una realización preferida, la presente invención se refiere al método en donde se establece la presencia del gen de resistencia (gen de resistencia al TBRFV); o la secuencia genómica que confiere resistencia se realiza mediante uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en la Id. de sec. n.°: 83, Id. de sec. n.°: 84, Id. de sec. n.°: 85, Id. de sec. n.°: 86, Id. de sec. n.°: 87, Id. de sec. n.°: 88, Id. de sec. n.°: 89, Id. de sec. n.°: 90, Id. de sec. n.°: 91, Id. de sec. n.°: 92, Id. de sec. n.°: 93, y la Id. de sec. n.°: 94, Id. de sec. n.° 105, Id. de sec. n.° 106, Id. de sec. n.° 107, Id. de sec. n.° 108, Id. de sec. n.° 109, Id. de sec. n.° 110, Id. de sec. n.° 111 y la Id. de sec. n.° 112, preferiblemente Id. de sec. n.° 105, Id. de sec. n.° 106, Id. de sec. n.° 107, Id. de sec. n.° 108, Id. de sec. n.° 109, Id. de sec. n.° 110, Id. de sec. n.° 111 y la Id. de sec. n.° 112.
La presente invención, según un aspecto adicional, se refiere al uso de un marcador para establecer la presencia del gen de resistencia al TBRFV; o la secuencia genómica que confiere resistencia al TBRFV en una planta de S.lycopersicum,en donde el marcador es uno o más seleccionados del grupo que consiste en la Id. de sec. n.°: 83, Id. de sec. n.°: 84, Id. de sec. n.°: 85, Id. de sec. n.°: 86, Id. de sec. n.°: 87, Id. de sec. n.°: 88, Id. de sec. n.°: 89, Id. de sec. n.°: 90, Id. de sec. n.°: 91, Id. de sec. n.°: 92, Id. de sec. n.°: 93, y la Id. de sec. n.°: 94, Id. de sec. n.° 105, Id. de sec. n.° 106, Id. de sec. n.° 107, Id. de sec. n.° 108, Id. de sec. n.° 109, Id. de sec. n.° 110, Id. de sec. n.° 111 y la Id. de sec. n.° 112, preferiblemente Id. de sec. n.° 105, Id. de sec. n.° 106, Id. de sec. n.° 107, Id. de sec. n.° 108, Id. de sec. n.° 109, Id. de sec. n.° 110, Id. de sec. n.° 111 y la Id. de sec. n.° 112.
La presente invención se detallará adicionalmente en los siguientes ejemplos y figuras, en donde:
Figura 1:Descripción general del mapeo del locus que proporciona resistencia contra el Tobamovirus, más específicamente el TRBFV en S.lycopersicum.Plantas F1 se crearon cruzando la línea 90479-3 de S.habrochaites,que se seleccionó por su fenotipo de resistencia, con las líneas OT9 y OT1317 de S.lycopersicumpara crear dos poblaciones para el mapeo. Se probaron más de 700 plantas para determinar la resistencia al TRBFV y se seleccionaron varias plantas recombinantes (21 plantas) y los resultados de la prueba de la enfermedad se combinaron con los datos de los marcadores. Se han utilizado varios marcadores moleculares (M1 a M42) para determinar la posición y el tamaño de la secuencia genómica que proporciona resistencia al TRBFV. Se observó una clara segregación entre las plantas resistentes (R) y las susceptibles (S). Los resultados indicaron que una región genómica ubicada entre los marcadores M16 y M17 proporcionaba la resistencia al TRBFV; el locus correspondiente (denominado Locus LYC4943 R) tiene una longitud de 133.515 bp y comprende varios genes putativos. Basándose en un mapeo fino adicional, se determina que el tamaño y la ubicación de la secuencia genómica que alberga la resistencia al TBRFV se encuentran entre los marcadores M33 y M38 y es aproximadamente 68.000 pares de bases más grandes en comparación con el genoma de referencia SL2.40 de S. lycopersicum (85.240 pares de bases frente a 17.328 pares de bases, respectivamente). Por lo tanto, lo más probable es que uno o más genes estén localizados dentro de esta región, indicada como “ región del TBRFV” , que proporcione la resistencia al TBRFV.
Figura 2:muestra los resultados de una qPCR para la detección del TBRFV en plantas de tomate infectadas y no infectadas(S. lycopersicum)y en plantas que no comprenden el locus de resistencia al TBRFV. Los valores bajos de Ct (es decir, por debajo de 30) indican la alta presencia de ARN viral presente en las muestras. OT9 es una planta de tomate que no comprende el locus de resistencia al TBRFV. La muestra de control (OT9 no infectada) mostró un valor de Ct de entre 35 y 40 ciclos y la muestra de control infectada (OT9 infectada) mostró un valor de Ct entre 20 y 25. Las plantas que muestran un valor de Ct superior a 30 ciclos, preferiblemente alrededor de 35 ciclos, se consideraron resistentes, mientras que las plantas que muestran un valor de Ct inferior a 30 se consideraron susceptibles. Todas las plantas de tomate comprendiendo el locus de resistencia al TBRFV, homocigotas (B) o heterocigotas (H) tienen un valor de Ct superior a 30 ciclos y pueden considerarse resistentes. Además, los resultados muestran que la resistencia es dominante. Las plantas que no formaban el locus de resistencia al TBRFV (A y OT9 infectadas) mostraron un valor de Ct de entre 20 y 25, lo que indica que la planta era susceptible a la infección por el TBRFV.
Figura 3:muestra una descripción general esquemática de las secuencias genómicas Id. de sec. n.° 1 a Id. de sec. n.° 18 que codifican uno o más genes o elementos genéticos que proporcionan resistencia al tobamovirus.
Figura 4:Descripción general de un mapeo adicional del locus que proporciona resistencia contra el tobamovirus además de la Figura 1. Se ha realizado una selección recombinante adicional genotipando plantas con M33 y M38 para identificar plantas recombinantes en la región del TBRFV identificada y limitar aún más esta región del TBRFV. Las plantas recombinantes se han genotipado además con marcadores (M-SEQ 10, M-SEQ 11-1, M-SEQ 11-2 y M-SEQ 14) que cubren el locus del TBRFV y se diseñaron específicamente para eliminar las regiones candidatas en el locus del TBRFV, es decir, las secuencias genómicas Id. de sec. n.° 1 a Id. de sec. n.° 18 que codifican uno o más genes o elementos genéticos que proporcionan resistencia al Tobamovirus. Plantas recombinantes 15321-02, 15321 03 y 15321-07 se examinaron para determinar su resistencia mediante inoculación con el aislado AE50 del TBRFV. Basándose en estas plantas recombinantes en combinación con datos de fenotipado, ELISA y qPCR para la determinación de la infección por el TBRFV, se concluyó que el gen que confiere resistencia forma parte de la Id. de sec. n.° 14 genómica. Las plantas 15321-02 y 15321-03 no comprenden la Id. de sec. n.° 14 y demostraron ser susceptibles al TBRFV, con puntuaciones de ELISA altas y valores de Ct de qPCR bajos que corresponden a los valores obtenidos con la línea de control sensible OT9, lo que indica una infección por el virus. La planta 15321-07 comprende la Id. de sec. n.° 14 y demostró ser resistente al TBRFV, con puntuaciones de ELISA bajas y valores de Ct de qPCR altos.
Figura 5:Muestra la infección por el TBRFV mediante ELISA en una línea homocigótica resistente al TBRFV (15322 04), así como en una línea de control susceptible (OT9). Las plantas se infectaron con TBRFV (+TRBFV) y se infiltraron con la construcción VIGS-01a que se dirige específicamente al gen de resistencia al TRBFV o con la construcción VIGS-01b que se dirige a una región diferente dentro de la región TRBFV identificada. La lectura de ELISA se realizó midiendo la absorción a 405 nm. Las plantas de control OT9 infectadas por el TBRFV dieron como resultado niveles de absorción de 2000 abs o más, mientras que las líneas de plantas resistentes infectadas con el TRBFV dieron como resultado niveles de absorción de aproximadamente 500 abs. En el caso de que el gen de resistencia al TRBFV fuera silenciado por el VIGS-01a en las líneas de plantas resistentes, se midieron niveles de absorción de entre 1500 y 2250 abs, lo que indica una infección viral. El silenciamiento por VIGS-01b en las líneas de plantas resistentes dio como resultado niveles de absorción similares a los observados en las líneas de plantas resistentes infectadas que no fueron silenciadas por VIGS.
Figura 6:Muestra la infección por el TBRFV mediante qPCR en una línea homocigótica resistente al TBRFV(15322-04), así como en una línea de control susceptible (OT9). Las plantas se infectaron con TBRFV (+TRBFV) y se infiltraron con la construcción VIGS-01a que se dirige específicamente al gen de resistencia al TRBFV o con la construcción VIGS-01b que se dirige a una región diferente dentro de la región TRBFV identificada. La muestra de control infectada mostró un valor de Ct de aproximadamente 12 o 13. Las líneas de plantas resistentes infectadas con TRBFV mostraron un valor de Ct de aproximadamente 30, lo que indica resistencia al TBRFV. En el caso de que el gen de resistencia al TRBFV fuera silenciado por el VIGS-01 a en las líneas de plantas resistentes, se observó que los valores de Ct cayeron hasta aproximadamente entre 12 y 20, valores superiores a los de las células de control infectadas, lo que indica claramente una infección viral. El silenciamiento por VIGS-01b en las líneas de plantas resistentes dio como resultado niveles de Ct similares (valor de Ct de ~30) a los observados en las líneas de plantas resistentes infectadas que no fueron silenciadas por el VIGS.
Ejemplos
Inoculación de una planta de tomate con TBRFV
Se usó el aislado AE050 del TBRFV (de origen Arabia Saudí) para realizar los ensayos de la enfermedad. Como material vegetal, se utilizó la línea OT9, que es una línea vegetal susceptible al TBRFV, para el mantenimiento de los virus. Las hojas sintomáticas recibidas de las muestras originales se utilizaron para la inoculación mecánica con savia en la línea OT9. El virus se mantuvo en plantas de tomate OT9 infectadas sistémicamente mediante inoculación mecánica de savia mensual en plántulas nuevas de 3 semanas de edad.
Se han analizado las plantas de tomate de las especiesSolanum pennellii, S. peruvianum, S. chítense, S. habrochaites, S. pimpinellifolium, S. neorickii, S. comeliomulleri, S. chmielewskii, S. cheesmaniae, S. galapagense(~800 de las 912 accesiones silvestres deSolanumen total). Doce plantas de cada accesión se infectaron con el aislado AE050 del TBRFV.
Las semillas se sembraron en vermiculita, las plántulas se trasplantaron en bloques de lana de roca y se inocularon 4 semanas después de la siembra. Como material de partida, se recolectaron hojas sintomáticas del OT9 infectado y se trituraron en un mortero y una maja en agua desmineralizada fría con carborundo (1 gr/100 ml). La hoja más vieja de las plántulas de 3 semanas de edad de cada planta de ensayo se inoculó mecánicamente con AE050 frotando suavemente la hoja una vez con un dedo.
Las plantas se fenotiparon mediante puntuación visual de las plantas y las hojas. Las plantas se puntúan en función de los síntomas visuales a intervalos de tiempo regulares. Los síntomas se evaluaron visualmente a las 2, 4y 6 semanas después de la inoculación, y las pruebas de ELISA en las plantas restantes se realizaron a partir de las 6 semanas, con intervalos de 1 mes. Más del 50 % de las plantas ya presentaban síntomas 2 semanas después de la inoculación.
La puntuación visual se realizó semanalmente. Las plantas se puntúan según los síntomas visuales. Semanalmente se registró la presencia de coloración amarillenta, patrón de mosaico en las hojas y deformación foliar (estrechamiento, moteado) a nivel de planta. Los primeros síntomas se observaron normalmente entre 12 y 14 días después de la inoculación. Las plantas se clasificaron como “ resistentes” cuando no se observaron tales síntomas en las hojas. Las plantas que presentaban cualquiera de los síntomas en las hojas se clasificaron como “ susceptibles” . Se recolectaron muestras de hojas de plantas asintomáticas (es decir, resistentes) para analizar la presencia del virus mediante ELISA. El cribado permitió seleccionar varios candidatos para el mejoramiento por resistencia, siendo el mejor candidato el LYC4943, una procedencia de S.habrochaitesoriginaria del Perú. El LYC4943 no presentó síntomas y se comprobó que estaba libre de virus mediante ELISA durante más de 15 semanas después de la inoculación.
Determinación de la infección por TBRFV mediante ELISA
La infección se determinó mediante ELISA. Se recolectó una hoja apical (completamente expandida) de cada planta. Las hojas se trituraron utilizando una máquina tipo R302 D63N-472 (VECTOR aandrijftechniek B.V., Rotterdam, Países Bajos) y la savia se recolectó añadiendo 2 ml de tampón PBS-Tween. Se utilizaron 100 pL del extracto para ELISA con anticuerpos contra el ToMV (proveedor Prime Diagnostics, Wageningen, Países Bajos). La lectura de ELISA se realizó midiendo la absorción a 405 nm con un aparato FluoStar Galaxy. Las plantas que dieron valores de absorción superiores a 1,5 veces los de las plantas de control limpias se consideraron infectadas (susceptibles).
Bioensayos y mapeo de la secuencia genómica de resistencia al TBRFV
El lote original de semillas LYC4943(S. habrochaites) sesegrega por su resistencia. Se sembraron nueve familias F1 diferentes para realizar un bioensayo con el fin de identificar las familias F1 que son completamente resistentes (la resistencia es fija) y que se utilizarán para futuros retrocruzamientos. Cuatro familias F1 germinaron y se probaron en un bioensayo. Las plantas F1 creadas con la planta 3 de LYC4943 (90479-3) se seleccionaron por su fenotipo de resistencia para crear dos poblaciones para el mapeo, eligiendo las líneas OT9 y OT1317 de S.lycopersicumcomo líneas retrocruzadas. Los marcadores M1 a M42 (respectivamente, Id. de sec. n.° 19 a Id. de sec. n.° 102) se han utilizado en el mapeo que se enumeran en la Tabla 1.
Se inocularon 298 plantas (OT9 x 90479-3) x OT9) y 484 plantas (OT1317 x 90479-3) = un total de 782 plantas con el aislado AE050 del TBRVF. Dos o tres semanas después de la inoculación, los síntomas del TBRFV estaban presentes y se realizó la fenotipificación ocular. Se observó una clara segregación entre las plantas resistentes (R) y las susceptibles (S) y los fenotipos resistentes pudieron vincularse con el marcador M1 (ver Tabla 1) ubicado en el cromosoma 8 a 2673609 bp en el genoma de referencia SL2.40 (S.lycopersicum).Se han genotipado 92 plantas con 26 marcadores para flanquear el QTL (M2 a M27, ver Tabla 1). Basándose en estos resultados, la resistencia podría mapearse entre 53118984 bp y 57038544 bp en el genoma de referencia SL2.40 (entre M8 y M20, véanse la Tabla 1 y la Figura 1).
Tabla 1.
La población total de 782 plantas se ha genotipado con los marcadores flanqueantes M8 y M20 con el fin de encontrar las plantas recombinantes para un mapeo más preciso. Esto dio como resultado 21 plantas recombinantes (véase la figura 1). Estas 21 plantas recombinantes se han seleccionado y genotipado con 11 marcadores M9 a M19 para mapear aún más la región (Tabla 1). La resistencia podría mapearse con precisión entre 56920720 y 56990004 (marcadores M16 y M17) en el genoma de referencia SL2.40.
La secuenciación de la región LYC4943 resistente utilizando la tecnología de secuenciación Oxford Nanopore dio como resultado un locus de 133.515 bp. Las 21 plantas recombinantes se han genotipado con marcadores adicionales en este locus específico (M28 a M42) de LYC4943. Basándose en las plantas recombinantes, las plantas 594 y 608, se determinó que la región resistente está ubicada entre las posiciones 56941043 y 56958371, basándose en el genoma de referencia SL2.40, que corresponde a las posiciones entre 15.893 y 101.133 en el locus LYC4943 (entre M33 y M38, véase la Figura 1).
Basándose en el mapeo fino, se determina que el tamaño y la ubicación de la secuencia genómica que alberga la resistencia al TBRFV se encuentran entre los marcadores M33 y M38 y es aproximadamente 68.000 bp más grandes en comparación con el genoma de referencia SL2.40 de S. lycopersicum (85.240 bp frente a 17.328 pares de bases, respectivamente). Por lo tanto, es muy probable que uno o más genes estén localizados dentro de esta región, indicada en la Figura 1 como “ región TBRFV” , que proporciona la resistencia al TBRFV y se indica como Id. de sec. n.° 3 en esta solicitud. Según el genoma de referencia SL2.40 y el análisis de predicciónin silico(ITAG 2.3), al menos un gen se encuentra en la región mapeada con precisión que codifica una proteína de resistencia al CC-NBS-LRR. Al comparar la región del TBRFV mapeada con precisión con la base de datos del Centro Nacional de Información Biotecnológica(National Center for Biotechnology Information,NCBI), se obtuvieron siete fragmentos genómicos, de los cuales cinco tienen homología con las proteínas de resistencia al NBS-LRR (Id. de sec. n.° 8, N.° 9, N.° 10, N.° 11 y N.° 14) y dos tienen homología con las quinasas proteicas de serina/treonina similares al receptor LRR (SEC IC N.° 12 y la Id. de sec. n.° 13).
A continuación, se realizó un mapeo fino adicional y se realizó una selección recombinante genotipando 668 plantas BC2 ((OT9 x 90479-3) x OT9 x Ot 9) con M33 y M38 para identificar plantas recombinantes en la región Tb RfV, lo que dio como resultado tres plantas 15321-02, 15321-03 y 15321-07 (véase la Figura 4). Se ensayó la resistencia de estas tres plantas mediante inoculación con el aislado AE50 del TBRFV. Aproximadamente tres semanas después de la inoculación del TBRFV, las plantas se fenotiparon mediante observación y se realizaron ELISA y qPCR para controlar la infección por el virus. Las plantas recombinantes se han genotipado con marcadores (M-SEQ 10, M-SEQ 11-1, M-SEQ 11-2 y M-SEQ 14, respectivamente de Id. de sec. n.° 105 a Id. de sec. n.° 112) que cubren el locus del TBRFV y se diseñaron específicamente para eliminar los genes candidatos en el locus del TBRFV. Este enfoque proporciona información sobre cuál de las secuencias genómicas candidatas (Id. de sec. n.° 1 a Id. de sec. n.° 18) proporciona específicamente resistencia al TBRFV. Basándonos en las plantas recombinantes y en el fenotipado mediante pruebas de enfermedades, ELISA y qPCR, llegamos a la conclusión de que el gen que confiere resistencia está codificado por la secuencia genómica de la Id. de sec. n.° 14, más específicamente por la secuencia de ADN codificante de la Id. de sec. n.° 115 que codifica la proteína de la Id. de sec. n.° 116.
Validación de la resistencia a las cepas Tm0, Tm1 y Tm2 en una planta comprendiendo el locus de resistencia a TBRFV
Se probó la resistencia de una planta de tomate(S. lycopersicum)comprendiendo el locus de resistencia al TBRFV (Id. de sec. n.°. 1) contra las cepas Tm0, 1 y 2. La presencia del locus de resistencia al TBRFV se determinó mediante los marcadores M16, M17 y M33. Además, se confirmó que la planta no contiene el genTm22(es un gen conocido que proporciona resistencia contra las cepas Tm0, 1 y 2). En algunos casos, la planta contenía el gen de resistencia aTm1.Como control se seleccionaron plantas que no contenían el locus de resistencia al TBRFV.
Ocho plantas (véase la Tabla 2, 1 a 8), de las cuales seis plantas comprenden el locus de resistencia al TBRFV (heterocigotas) y dos plantas (7 y 8) que no tienen el locus de resistencia al TBRFV, se han inoculado con el aislado Tm0. Ocho plantas (véase la Tabla 2, 9 a 16), de las cuales seis plantas comprenden el locus de resistencia al TBRFV (heterocigotas) y dos plantas (15 y 16) no tienen el locus de resistencia al TBRFV, se han inoculado con el aislado Tm-1. Se inocularon con el aislado Tm2 ocho plantas (véase la Tabla 2, 17 a 28), de las cuales cuatro plantas comprenden el locus de resistencia al TBRFV (dos homocigotas 17, 18 dos heterocigotas 19, 20) y cuatro plantas que no tienen el locus de resistencia al TBRFV. Como control, la línea OT95 de tomates cultivados susceptibles también se inoculó con las tres cepas.
Los primeros síntomas se observaron típicamente después de 12-14 días después de la inoculación. Las plantas se clasificaron como resistentes (R) cuando no se observaron síntomas de patrón de mosaico en las hojas; las plantas que presentaban cualquiera de los síntomas en las hojas se clasificaron como susceptibles (S). El fenotipo de cada planta se ha comparado con el genotipo TBRFV. Los resultados se resumen en la tabla 2 siguiente.
Tabla 2.
R = resistente, S = susceptible, a= no hay ningún locus de resistencia, h = heterocigoto, b = homocigoto Resultado Tm0
Todas las plantas que contienen el locus de resistencia al TBRFV son resistentes. Las plantas 7 y 8 no contenían el locus de resistencia al TBRFV, pero también eran resistentes. Una razón que podría explicar los resultados es que el gen Tm1 es el causante de la resistencia al aislado T m-0 del T oMV. Además, las plantas 1, 2 y 3 no contenían el genTm1,pero sí el locus de resistencia al TBRFV, que demostró ser resistente.
Resultado Tm1
Los fenotipos resistentes están relacionados con los genotipos del TBRFV, lo que proporciona resistencia contra el aislado Tm-1 del ToMV.
Resultado Tm2
Los fenotipos resistentes (hetero, homocigotos) están relacionados con los genotipos del TBRFV, lo que proporciona resistencia contra el aislado Tm-2 del ToMV.
Determinación de la infección por TBRFV en tomate (A. lycopersicum) mediante qPCR
Las plantas de tomate comprendiendo el locus de resistencia al TBRFV (heterocigotas u homocigotas) y las plantas que no contienen esta región se han seleccionado para el bioensayo del TBRFV utilizando marcadores (M16 y M17). Las plantas se infectaron con el TBRFV y se incluyó la línea OT9 de tomate susceptible como control (OT9 no infectada e infectada).
Después de 3 semanas de inoculación, se recogió una hoja de la parte superior de la planta de cada planta en un tubo de 2 ml que contenía una bala metálica de 6,35 mm. El tubo se congeló en nitrógeno líquido. Los tubos se agitaron a alta velocidad para pulverizar el material vegetal. Tras centrifugar el tubo, se llevó a cabo la extracción de ARN estándar utilizando la planta de ARN NucleoSpin™ de Macherey-Nagel™. La concentración de ARN se midió utilizando DropSense 96 (trinean) y se diluyó hasta una concentración de 100 ng/ul. Se han utilizado 900 ng para la síntesis de ADNc utilizando la transcriptasa inversa M-MLV (Invitrogen). Se utilizaron 10 ng de ADNc para la PCR en tiempo real utilizando LC Green como colorante intercalante. Se utilizaron dos combinaciones de cebadores para amplificar la cepa del TBRFV, véase la Tabla 3 (Id. de sec. n.° 103 y la Id. de sec. n.° 104, respectivamente).
Tabla 3.
Cuanto más ARN viral esté presente en las muestras, menor será el valor de Ct en la qPCR, ya que se requieren menos ciclos de PCR para amplificar el ADNc (del ARN viral) y captar una señal. La muestra de control (OT9 no infectada) mostró un valor de Ct de entre 35 y 40 ciclos y la muestra de control infectada (OT9 infectada) mostró un valor de Ct entre 20 y 25. Por lo tanto, las plantas que muestran un valor de Ct superior a 30 ciclos, preferiblemente alrededor de 35 ciclos, se consideraron resistentes, mientras que las plantas que muestran un valor de Ct inferior a 30 se consideraron susceptibles (ver Figura 2).
Todas las plantas de tomate comprendiendo el locus de resistencia al TBRFV, homocigotas (B) o heterocigotas (H) tienen un valor de Ct superior a 30 ciclos y pueden considerarse resistentes. Los resultados muestran que la resistencia es dominante. Las plantas que no formaban el locus de resistencia al TBRFV (A) mostraron un valor de Ct de entre 20 y 25, lo que indica que la planta era susceptible a la infección por el TBRFV.
Secuenciación de la secuencia genómica de una planta de tomate resistente
El ADN genómico se aisló de una planta resistente (S.lycopersicum)comprendiendo el locus de resistencia al TBRFV, según el protocolo publicado el 27 de abril de 2018 en Nature, Protocol Exchange (2018), Rachael Workman y col."High Molecular Weight DNA Extraction from Recalcitran Plant Species for Third Generation Sequencing” .Las bibliotecas de secuenciación se prepararon utilizando el kit de secuenciación por ligación de ADN Promethion sin PCR y sin multiplexación (SQK-LSK109). El procedimiento de aislamiento dio como resultado bibliotecas de secuenciación de alta calidad para su uso en el sistema Oxford Nanopore para la secuenciación (secuenciación ONT). Para la secuenciación se utilizaron paquetes Promethion Flowcell (3000 poros/celda de flujo) versión R9.4.1.
Además, para resolver aún más el locus del TBRFV e identificar el gen que proporciona la resistencia al TBRFV, realizamos la secuenciación de ONT en una línea resistente (LYC4943). La secuenciación de todas las isoformas de la transcripción de la línea resistente LYC4943 se realizó utilizando la aplicación de análisis Iso-Seq (Pacific Biosciences of California, PacBio). Esto dio como resultado solo un transcripto/gen de resistencia candidato ubicado en la región entre los marcadores M33 y M38, más específicamente el gen de resistencia al TBRFV de la Id. de sec. n.° 115. Este transcrito se predecitó para codificar una proteína resistente al CC-NBS-LRR de la Id. de sec. n.° 116. Validación genética mediante VIGS
Para confirmar que el gen de resistencia al TBRFV (Id. de sec. n.° 115) es de hecho el gen que confiere resistencia al TBRFV, se realizó un análisis de silenciamiento génico inducido por virus (VIGS). Se han descrito abundantemente vectores VIGS derivados del virus del cascabel del tabaco(Tobacco Rattle Virus,TRV) para estudiar la función génica en plantas como Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana, Lycopersicon esculentum y otras plantas (véanse, por ejemplo, Huang C, Qian Y, Li Z, Zhou X.: Virus-induced gene silencing and its application in plant functional genomics. Sci China Life Sci. 2012;55(2):99-108).
Como tal, se desarrollaron dos construcciones VIGS (Tabla 4), una construcción VIGS-01a para atacar específicamente la Id. de sec. n.° 115 y una construcción de control VIGS-01b que se dirige a la Id. de sec. n.° 7, es decir, una secuencia también ubicada dentro del locus del TBRFV previamente identificado.
Tabla 4.
Los fragmentos de VIGS se sintetizaron (IDT, gBlocks) y posteriormente se clonaron en un vector TRV. Las secuencias de ADN se confirmaron mediante secuenciación de Sanger. El vector contiene todas las secuencias que codifican las proteínas que se requieren para las partículas de TRV funcionales, incluidas las secuencias diana. Los vectores VIGS, incluidos las construcciones VIGS-01a y VIGS-01b, se transformaron en la cepa GV3101 de Agrobacterium tumefaciens y se utilizaron en experimentos de VIGS para reducir los niveles de ARNm endógeno en las plantas de tomate utilizadas en este experimento. En el experimento VIGS se utilizó una línea homocigótica resistente al TBRFV (15322-04) y una línea de control susceptible (OT9), en donde las plantas se infiltraron con agrobacterias en la fase de plántula (cotiledones) y después se inocularon con el aislado E50 del TBRFV tres semanas después de la infiltración del agrobacterium. Dos semanas después de la inoculación del TBRFV, las plantas individuales se fenotiparon mediante ELISA y qPCR y se reveló que la susceptibilidad se encontró en las plantas resistentes infiltradas con la construcción VIGS-01a, mientras que no se detectó susceptibilidad en las plantas resistentes infiltradas con la construcción VIGS-01b. Los resultados del ELISA y la qPCR se muestran en las Figuras 5 y 6, y los resultados se resumen en la Tabla 5.
Tabla 5.
Todas las plantas de la línea OT9 fueron susceptibles, como se esperaba. La línea R, que se demostró anteriormente que era completamente resistente, se volvió susceptible al TBRFV en caso de que el gen de la supuesta resistencia al TBRFV fuera silenciado utilizando la construcción VIGS-01a diseñado para atacar específicamente este gen, mientras que el silenciamiento utilizando la construcción VIGS-01b (construcción de control) no dio como resultado ninguna susceptibilidad de las plantas analizadas. Basándose en estos resultados, se puede concluir que el gen Id. de sec. n.° 115 es el que confiere resistencia al TBRFV.

Claims (5)

REIVINDICACIONES
1. Gen de resistencia para proporcionar resistencia a un tobamovirus en una planta de S.lycopersicum,en
donde dicho gen de resistencia está representado por una secuencia codificante que tiene al menos un 95 %
de identidad de secuencia de nucleótidos con la Id. de sec. n.° 115, en donde el tobamovirus es el TBRFV.
2. Secuencia genómica para proporcionar resistencia a un tobamovirus en una planta de S.lycopersicum,en
donde la secuencia genómica es la Id. de sec. n.° 14, o que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la Id. de sec. n.° 14, en donde el tobamovirus es TBRFV.
3. Un método para seleccionar una planta de la especie S. lycopersicum que es resistente al Tobamovirus, en
donde dicha selección comprende establecer la presencia de un gen de resistencia o secuencia genómica según la reivindicación 1 o 2, preferiblemente dicho gen de resistencia.
4. Método según la reivindicación 3, en donde el establecimiento de la presencia del gen de resistencia o la secuencia genómica que confiere la resistencia se realiza mediante uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en Id. de sec. n.°: 83, Id. de sec. n.°: 84, Id. de sec. n.°: 85, Id. de sec. n.°: 86, Id. de sec. n.°: 87, Id. de sec. n.°: 88, Id. de sec. n.°: 89, Id. de sec. n.°: 90, Id. de sec. n.°: 91, Id. de sec. n.°: 92, Id.
de sec. n.°: 93, y la Id. de sec. n.°: 94, Id. de sec. n.° 105, Id. de sec. n.° 106, Id. de sec. n.° 107, Id. de sec.
n.° 108, Id. de sec. n.° 109, Id. de sec. n.° 110, Id. de sec. n.° 111 y la Id. de sec. n.° 112, preferiblemente Id.
de sec. n.° 105, Id. de sec. n.° 106, Id. de sec. n.° 107, Id. de sec. n.° 108, Id. de sec. n.° 109, 110, Id. de sec. n.° 111 y la Id. de sec. n.° 112.
5. Uso de un marcador para establecer la presencia de un gen de resistencia al TBRFV o una secuencia genómica que confiere resistencia según la reivindicación 1 o 2 en una planta de S.lycopersicum, en donde el marcador es uno o más seleccionados del grupo que consiste en Id. de sec. n.°: 83, Id. de sec. n.°: 84, Id.
de sec. n.°: 85, Id. de sec. n.°: 86, Id. de sec. n.°: 87, Id. de sec. n.°: 88, Id. de sec. n.°: 89, Id. de sec. n.°: 90,
Id. de sec. n.°: 91, Id. de sec. n.°: 92, Id. de sec. n.°: 93, y la Id. de sec. n.°: 94, Id. de sec. n.° 105, Id. de sec. n.° 106, Id. de sec. n.° 107, Id. de sec. n.° 108, Id. de sec. n.° 109, Id. de sec. n.° 110, Id. de sec. n.° 11 Id. de sec. n.° 112, preferiblemente Id. de sec. n.° 105, Id. de sec. n.° 106, Id. de sec. n.° 107, Id. de sec. n.°
108, Id. de sec. n.° 109, Id. de sec. n.° 110, Id. de sec. n.° 111 y la Id. de sec. n.° 112.
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