ES3042507T3 - System and method of applied radial technology chromatography - Google Patents

Abstract

Se divulga un sistema y método de cromatografía de flujo radial aplicada que utiliza múltiples microesferas. Cada microesfera comprende uno o más poros con un diámetro de entre 250 Å y 5000 Å, y un radio promedio de entre 100 μm y 250 μm. También se divulgan procesos para seleccionar las microesferas que se utilizarán en una columna de cromatografía de flujo radial y para purificar una corriente de alimentación sin clarificar mediante dicha columna. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0003] Sistema y método de cromatografía de tecnología radial aplicada

[0005] Campo de la invención

[0007] Esta divulgación se refiere a la cromatografía en columna de flujo radial y, más particularmente, a una columna de flujo radial que comprende perlas de tamaño y parámetros específicos para mejorar la filtración de las corrientes de alimentación no clarificadas, y a los métodos para seleccionar las perlas.

[0009] Antecedentes de la invención

[0011] La cromatografía, como se usa generalmente, es una técnica para la separación de varios componentes de una mezcla de muestra. En un sistema de cromatografía líquida, se inyecta una muestra seguida de un fluido de elución en una columna de separación cromatográfica. La columna de separación contiene un medio de relleno o matriz o material que interactúa con los diversos componentes de la muestra que se va a separar. La composición del medio de separación depende del fluido que se dirija a través del mismo para efectuar la separación deseada. A medida que la muestra y los fluidos de elución pasan a través del medio de separación, los diversos componentes de la muestra viajan a diferentes velocidades a través del medio de separación como resultado de interacciones diferenciales. Estos componentes emergen separados en la salida o efluente del medio de separación.

[0013] En la técnica se conocen varios tipos de columnas de separación de flujo verticales y horizontales. Con la necesidad de una cromatografía de alto rendimiento, se desarrollaron columnas cromatográficas de flujo horizontal. Dichas columnas de flujo horizontal o radial se describen, p. ej., en las patentes estadounidenses núms. 4,627,918 y 4,676,898. En las columnas de flujo horizontal o radial, los fluidos de muestra y elución se introducen a través de un distribuidor en la periferia exterior o pared o superficie circunferencial del medio o matriz de separación, y los fluidos pasan horizontal o radialmente hacia adentro a través del medio de separación hasta un puerto central o de recogida y luego se eluyen de la columna en diferentes momentos y a diferentes velocidades.

[0015] Posteriormente, se desarrollaron columnas y métodos cromatográficos para el procesamiento directo de alimentaciones en bruto para el aislamiento de materiales biológicamente activos, incluida la recogida de células/fermentación, extractos de tejidos, algas, células y materiales derivados de plantas y plasma/sangre. Los medios cromatográficos de perlas grandes se rellenan en una columna cromatográfica convencional de baja presión en la que los tamices de placa terminal se sustituyen por tamices de poros grandes (poros de 60­ 180 gm). Los poros grandes evitan la obstrucción de la columna. Debido a que los tamaños de partícula son grandes, el material celular fluye entre las perlas en el lumen entre partículas, mientras que el producto soluble es capturado por los grupos funcionales de las perlas.

[0017] Tradicionalmente, el procesamiento aguas abajo de productos biológicos procedentes de cultivos celulares o fermentaciones ha requerido dos operaciones principales: i) preparación de la corriente de alimentación y ii) recuperación y purificación. La muestra debe prepararse adecuadamente antes de aplicarla a una columna. Esto lleva mucho tiempo y puede resultar bastante costoso. Si es necesaria la preparación de la muestra, la corriente de alimentación generalmente se diluye para reducir la densidad celular, la viscosidad y la concentración de sal, todo lo cual es beneficioso para mejorar la recuperación y la purificación. La recuperación implica la eliminación de materiales celulares y otros materiales particulados mediante centrifugación y/o microfiltración, así como una etapa inicial de reducción de volumen, normalmente ultrafiltración. Dado que los medios cromatográficos convencionales se ensucian rápidamente con los restos celulares, se debe preparar una alimentación libre de partículas para la operación de purificación.

[0019] La centrifugación y la filtración no solo son operaciones largas y costosas, sino que comprometen la calidad. Las proteasas liberadas de las células rotas pueden degradar la proteína diana, lo que complica aún más la tarea de desarrollo del método de purificación y aumenta los costes de purificación. Cuanto mayor sea el tiempo de contacto con los residuos celulares concentrados, más producto se puede perder.

[0021] La captura del producto proteico directamente de la alimentación no clarificada minimizaría la degradación del producto y mejoraría la calidad del producto, el rendimiento y la economía del proceso. Además, la operación de recuperación, que requiere un gran capital, se simplificaría considerablemente si las etapas de captura del producto y de eliminación de las células se combinaran en una sola operación.

[0023] Existen dos enfoques para capturar directamente el producto a partir de una alimentación no clarificada, tal como el cultivo celular/fermentación u otra muestra biológica (p. ej. plasma sanguíneo). Un enfoque propone la fluidización de las partículas de resina de captura. Mediante la fluidización, las partículas individuales se separan de modo que los residuos puedan salir del lecho de la columna sin obstrucciones.

[0024] Este enfoque presenta varios problemas. El sistema de lecho fluidizado funciona a un caudal alta predeterminado, y no hay flexibilidad en la operación ni en los medios para cambiar el tamaño de la columna. El consumo de tampón del sistema es mayor que en los sistemas de lecho compacto, lo que es un factor de coste importante para los productos farmacéuticos de alto valor, muchos de los cuales requieren tampones especializados para su purificación. La razón entre el volumen de la columna y el volumen de partículas en fase sólida es muy alta. Esto afectará negativamente al tiempo de residencia y a la capacidad de unión dentro de la columna, ya que no hay tiempo suficiente para la difusión completa de la molécula diana en la fase sólida. Además, las partículas chocarán dentro del lecho de la columna y los fragmentos en fase sólida generarán los denominados "finos" y reducirán tanto el rendimiento como la reutilización de la columna. La operación en lecho fluidizado también requiere hardware y medios cromatográficos especializados y costosos.

[0026] El otro enfoque es el uso de columnas de lecho compacto para la eliminación de partículas. Esta vía ha permanecido en gran parte inexplorada por la siguiente razón. Para eliminar los residuos celulares en una columna de lecho compacto se requiere el uso de partículas grandes, preferiblemente esféricas. Estas partículas requieren suficiente espacio en el lumen entre partículas para permitir que las células u otras partículas de tamaño comparable salgan de la columna.

[0028] La desventaja de usar partículas grandes (perlas) es que la capacidad de unión a proteínas es una función de la superficie disponible por unidad de volumen del lecho de gel. Por lo tanto, al aumentar los diámetros de las partículas, se observa una pérdida de la capacidad de unión. Cuando el diámetro de partícula se incrementa de 0,1 mm a 1 mm, como se requiere para manipular suspensiones celulares densas, se pierde aproximadamente el 90% de la capacidad de unión a proteínas. Esto hizo que las columnas de lecho compacto no fueran prácticas para procesar las corrientes de alimentación de proceso en bruto.

[0030] Sin embargo, el funcionamiento con columnas de lecho compacto ofrece simplicidad, eficiencia y economía. Es flexible y relativamente fácil de cambiar de escala. No hay necesidad de partículas especializadas, equipos o formación de los operarios. El espacio de producción es relativamente pequeño para la cromatografía convencional, y no es necesario modificar la altura de la instalación de producción para acomodar el equipo de lecho fluidizado.

[0032] La tasa de aplicación del producto es otra cuestión importante en términos de rendimiento de la operación. Este está predeterminado para los sistemas de lecho fluidizado, pero para los sistemas de columnas compactas solo la cinética de unión a la reacción es el factor limitante de la velocidad. Esto permite un mayor rendimiento, hasta de 3 a 10 veces mayor que el de los sistemas de lecho fluidizado.

[0034] Tras la captura del producto, el material celular residual se elimina mediante breves pulsos de lavado a alta velocidad. El producto se eluye luego por métodos de elución típicos. Por lo tanto, las resinas de cromatografía de perlas grandes conocidas permiten el procesamiento directo del cultivo celular o el caldo de fermentación, así como otras alimentaciones no clarificadas en una columna de lecho compacto al combinar la eliminación de células con la captura simultánea del producto.

[0036] La patente estadounidense n.° 5,466,377 proponía un método y partículas de cromatografía de perlas grandes para la captura directa de un producto deseado del licor de proceso no clarificado en columnas cromatográficas de lecho compacto convencionales de baja presión. El documento GB 1430 951 A describe un aparato para efectuar separaciones cromatográficas. El documento WO 91/16116 A1 describe dispositivos y métodos para aislar o separar selectivamente partículas objetivo de una mezcla de partículas objetivo y partículas no objetivo.

[0037] Sigue existiendo la necesidad de materiales y métodos cromatográficos mejorados para lograr el procesamiento directo de alimentaciones en bruto, tal como cultivos celulares/fermentaciones, extractos de tejidos, fragmentos celulares, virus, plasma sanguíneo, corrientes de residuos derivados de extractos vegetales o de frutas o de corrientes de residuos derivados del procesamiento de la leche u otras fuentes de materiales naturales, en columnas de lecho compacto.

[0039] Compendio de la invención

[0041] Se describe una columna cromatográfica de flujo radial según la reivindicación 1 que incluye, entre otras cosas: una pluralidad de perlas, comprendiendo cada perla uno o más poros en su interior, y canales intersticiales formados entre las perlas. Cada poro tiene un diámetro de aproximadamente 250 Á a aproximadamente 5000 Á, al menos aproximadamente el 80% de la pluralidad de perlas tiene un diámetro de aproximadamente 200 pm a aproximadamente 500 pm y las perlas tienen un radio promedio R de entre aproximadamente 100 pm y aproximadamente 250 pm. Las perlas pueden ser monodispersas (es decir, todas las perlas tienen un radio de ± aproximadamente el 10% de un radio objetivo o marcado). A las perlas se les ha eliminado un r < 0,225 R.

[0042] También se describe un proceso según la reivindicación 8 para seleccionar perlas para su uso en una columna cromatográfica de flujo radial. Ese proceso comprende, entre otras cosas: a) identificar un intervalo estrecho y deseable de radio de perla R en función de los componentes (o partículas de interés) presentes en la corriente de alimentación; b) eliminar las perlas de un radio r definido, que están fuera del intervalo de perlas deseable; y c) definir el porcentaje de radio de perla R dentro del intervalo de perla deseable. Las perlas de radio r se pueden eliminar mediante tamizado y/o elutriación en húmedo o en seco. Las perlas que se eliminan son las que tienen un radio r < 0,225 R.

[0044] Además, en la presente memoria se describe un proceso según la reivindicación 13 para purificar una corriente de alimentación no clarificada usando una columna cromatográfica de flujo radial que incluye, entre otras cosas: una pluralidad de perlas, comprendiendo cada perla uno o más poros en su interior, y canales intersticiales formados entre las perlas, en donde cada poro tiene un diámetro de aproximadamente 250 Á a aproximadamente 5000 Á, al menos aproximadamente el 80% de la pluralidad de perlas tiene un diámetro de aproximadamente 200 pm a aproximadamente 500 pm y las perlas tienen un radio promedio R de entre aproximadamente 100 pm y aproximadamente 250 pm. El proceso comprende las etapas de: a) rellenar la columna de flujo radial con perlas; b) procesar una corriente de alimentación clarificada que contiene una partícula de interés para calibrar las condiciones de purificación; c) determinar la unión de la partícula de interés a partir de los resultados de la etapa b; y d) procesar una corriente de alimentación no clarificada que comprende la partícula de interés.

[0046] Descripción detallada

[0048] Se proporcionan columnas de flujo radial y métodos para fabricar y usar las mismas para la filtración directa, es decir, el procesamiento, de corrientes de alimentación biológica en bruto, p. ej., cultivos celulares sin clarificar (es decir, sin filtrar). La presente divulgación logra la purificación a un coste sustancialmente menor y con un procesamiento más rápido, especialmente en comparación con métodos tales como la cromatografía en lecho compacto y la cromatografía en lecho expandido. Las aplicaciones de ejemplo incluyen el fraccionamiento del plasma sanguíneo; el bioprocesamiento de cultivos celulares para aislar y purificar proteínas (específicamente productos farmacéuticos tales como herceptina, insulina, avastina, etc.); la captura y purificación de virus y partículas similares a virus; la purificación de corrientes de alimentación residuales derivadas de extractos vegetales o de frutas, y corrientes de alimentación residuales derivadas del procesamiento de la leche u otras fuentes de materiales naturales.

[0050] La cromatografía descrita en la presente memoria permite de manera sorprendente y beneficiosa que células enteras y otras partículas pasen sin daños alrededor y entre las perlas descritas sin obstruir el lecho de gel, y permite el paso directo de corrientes de alimentación no clarificadas (no filtradas) de cultivos celulares, que contienen células enteras, fragmentos celulares, homogeneizados de materiales vegetales nativos o recombinantes, disoluciones de nanopartículas y/u otras partículas (que normalmente obstruyen las columnas que tienen perlas pequeñas). También es capaz de unirse selectivamente a dianas moleculares de interés en la corriente de alimentación, que posteriormente pueden recuperarse. Por ejemplo, para la purificación de la IgG, las perlas pueden funcionalizarse uniendo covalentemente la proteína A o la proteína G a la superficie de la perla para permitir la unión reversible de la IgG seguida del lavado y posterior elución. Para la captura de virus y VLP, las perlas pueden modificarse para que tengan una alta área superficial exterior y una alta densidad de carga (positiva).

[0052] En la presente memoria se describe una columna cromatográfica de flujo radial que comprende una pluralidad de perlas, comprendiendo cada perla uno o más poros en su interior, y canales intersticiales formados entre las perlas.

[0054] La columna de flujo radial puede fabricarse de acuerdo con cualquier columna de flujo radial conocida, excepto por las diferencias analizadas en la presente memoria específicamente con respecto a las perlas, los lechos de gel, los poros y los canales. La columna de flujo radial tiene una longitud de lecho de aproximadamente 3 cm a aproximadamente 50 cm y el volumen del lecho (V) puede variar de aproximadamente 5 ml a aproximadamente 1000 litros. La columna de flujo radial puede tener la forma de una "rosquilla" (columna de flujo radial de tamaño completo, que tiene la forma de un cilindro hueco circular recto), una rebanada de "pastel" (que tiene la forma de un prisma trapezoidal, es decir, una sección pequeña de rosquilla, que tiene la misma longitud/radio y curvatura del lecho pero un volumen menor), o un "cono" truncado (que tiene la forma de un tronco o cono truncado, que surge de una pequeña sección central cilíndrica extraída de un pastel o rosquilla, que tiene la misma longitud/radio y curvatura del lecho, pero un volumen incluso menor que el del "pastel").

[0055] La columna puede incluir una o más fritas filtrantes porosas. A menudo hay una frita exterior y una frita interior. Cada frita puede diseñarse para tener un tamaño de poro de entre aproximadamente 40 pm y aproximadamente 300 pm, de aproximadamente 80 pm a aproximadamente 250 pm, o de aproximadamente 100 pm a aproximadamente 200 pm. La frita puede estar hecha de cualquier material conocido convencionalmente. Opcionalmente, puede estar hecha de acero inoxidable o acero inoxidable y uno o más polímeros, tales como, aunque no de forma limitativa, polietileno (PE) o polipropileno (PP).

[0056] Todas las columnas de flujo radial en forma de "rosquilla", "pastel" o "cono" tienen razones constantes entre el área de la frita exterior y el área de la frita interior. Esta razón puede estar en el intervalo de 1,5:1 a 10:1. El intervalo preferible es de 2:1 a 4:1. La dinámica de flujo de las tres formas diferentes que tienen longitudes de lecho idénticas y una razón entre el área de la frita exterior e interior es prácticamente idéntica.

[0058] Las perlas pueden ser esféricas o casi esféricas. Las perlas pueden estar hechas de un polímero, vidrio, alúmina, metal u otro material cristalino, semicristalino o amorfo, sílice, vidrio de poro controlado (CPG), celulosa, partículas de hierro encapsulado, CPG encapsulado, sílice encapsulada o cualquier combinación de los mismos. Las perlas de polímero pueden estar hechas de cualquier polímero conocido para su uso en la técnica, por ejemplo, un poliacrilato, p. ej., metacrilato, un poliestireno o un polisacárido, tal como dextrano, pululano, agarosa o polisilicatos nativos o unidos. Las perlas pueden consistir en dos o más polímeros mezclados de forma homogénea o heterogénea. Las perlas de polímero pueden ser perlas de polisacárido esféricas (o casi esféricas).

[0060] Las perlas pueden tener diámetros promedio de entre aproximadamente 200 pm y aproximadamente 1000 pm, o de aproximadamente 200 pm a aproximadamente 500 pm. Según la invención, al menos aproximadamente el 80% de las perlas de polímero tienen un diámetro de aproximadamente 200 pm a aproximadamente 500 pm, o al menos aproximadamente el 85%, o al menos aproximadamente el 90% de las perlas de polímero tienen un diámetro de aproximadamente 200 pm a aproximadamente 500 pm.

[0062] Las perlas pueden tener un radio promedio (R) de entre aproximadamente 100 pm y aproximadamente 500 pm o, según la invención, de aproximadamente 100 pm a aproximadamente 250 pm.

[0064] La mayoría de las perlas no son generalmente monodispersas (todas del mismo tamaño con el mismo diámetro) sino que tienen un intervalo de diámetros que se extienden más allá del intervalo dado. Por lo tanto, por ejemplo, esta medición significa que el 80% de la masa total (o volumen) de las perlas se encuentra entre 200 y 500 pm. El otro 20% (independientemente de cómo se defina el porcentaje) está fuera del intervalo, ya sea menor o mayor. Para que los canales intersticiales no se obstruyan, es importante que las perlas más pequeñas que se encuentran en el 20% fuera del intervalo dado se eliminen o al menos se agoten en algún momento antes de rellenar la columna. Si las perlas más pequeñas que tienen casi el mismo tamaño que el diámetro del canal no se agotan o eliminan, un lecho de gel de perlas de entre 200 y 500 pm puede contener suficientes perlas pequeñas para bloquear parcial o completamente los canales.

[0066] Algunas perlas para cromatografía están disponibles en el mercado y, a menudo, se venden por diámetro de perla. Sin embargo, el diámetro dado es un promedio de los diámetros de las perlas; no significa que todas las perlas tengan ese diámetro dado. Otras empresas pueden vender perlas enumerando una variedad de diámetros de perlas. Sin embargo, este es el intervalo en el que se encuentra un cierto porcentaje, a veces indefinido, de perlas. Por lo tanto, se desconoce el porcentaje total de perlas que tienen un diámetro que cae fuera del intervalo dado; rara vez hay un porcentaje dado de perlas que están por encima o por debajo del intervalo.

[0068] Las perlas pueden tener grupos funcionalizados (p. ej., grupos de intercambio iónico, grupos de interacción hidrófoba, etc.), lo que les permite unirse selectivamente a dianas moleculares de interés (para una posible recuperación posterior). Los objetivos potenciales incluyen virus, partículas similares a virus, proteínas (específicamente, aunque no de forma limitativa, IgG, IgM, IgY y proteínas sanguíneas), ADN, ARN, oligonucleótidos, polipéptidos y células.

[0070] Las perlas tienen uno o más poros en su interior. Cada poro tiene un diámetro de aproximadamente 250 Á a aproximadamente 5000 Á. Cada poro puede extenderse parcialmente a través de la perla, lo que da como resultado un callejón sin salida, o puede atravesar la perla hasta otro punto de salida.

[0072] Los canales intersticiales se forman entre las perlas compactadas y comprenden parcialmente el volumen vacío. Cuando estos canales son lo suficientemente anchos como para permitir que las células y los fragmentos celulares atraviesen el lecho de gel sin obstruirlo y cuando los canales están libres de perlas más pequeñas que, debido a su tamaño, podrían restringir o bloquear el ETAPA de las células y los fragmentos celulares, el usuario puede utilizar las perlas compactadas para evitar la filtración o centrifugación perjudiciales, la precipitación u otras etapas costosas, que requieren mucho tiempo y que pueden provocar la pérdida del producto antes de la etapa de purificación por cromatografía.

[0074] Las perlas esféricas monodispersas se compactarán idealmente en disposiciones de compactación cerrado hexagonal (HCP) o relleno cerrado cúbico (CCP). Ambas disposiciones de compactación tienen la misma densidad máxima de perlas (esferas) y ambas tienen energías de compactación similares, por lo que ninguna se ve claramente favorecida energéticamente sobre la otra. Aunque la disposición de compactación preferida de las perlas de polímero, p. ej., de polisacárido, no es predecible, ambas disposiciones de compactación forman canales (espacio o canales intersticiales) entre las perlas, cuyo tamaño más pequeño es importante para el éxito o el fracaso del dispositivo y el sistema descritos en la presente memoria.

[0075] Los canales intersticiales deben ser: 1) lo suficientemente grandes como para permitir que las células, los fragmentos celulares y otras partículas interferentes pasen a través de ellos sin obstruir el lecho de gel; 2) están libres de perlas más pequeñas que son de tamaño similar al propio canal intersticial y, por lo tanto, podrían obstruir los canales; y 3) se forman a partir de una población de perlas que tienen un intervalo de diámetros de perlas lo más estrecho posible, con perlas monodispersas que tienen un tamaño lo más cercano posible al ideal.

[0077] Además, los canales intersticiales no deben comprimirse demasiado, lo que podría obstruir los canales intersticiales, creando: i) un caudal demasiado alto, ii) una presión demasiado alta o iii) un relleno demasiado denso de las perlas. Los canales intersticiales deben estar abiertos (es decir, libres de obstrucciones) para proporcionar una trayectoria continua para procesar la corriente de alimentación. Además, un caudal demasiado alto estrechará los canales intersticiales de un lecho de gel no rígido. Por lo tanto, el lecho de gel debe tener suficiente rigidez para permitir caudales de 0,1 volúmenes de columna a 10 volúmenes de columna por minuto sin estrechar los canales intersticiales (mediante la compresión de perlas) para permitir que las células y los fragmentos de células pasen a través del lecho de gel.

[0079] La rigidez del lecho de gel también depende de la rigidez de las propias perlas. Para minimizar los cambios en el diámetro/tamaño de los canales intersticiales entre las perlas (suponiendo que todas las perlas sean esféricas o casi esféricas y con una distribución de tamaños determinada), es importante que la morfología de las perlas no cambie en condiciones de flujo.

[0081] Una opción es usar perlas muy rígidas que sean inertes a los tampones utilizados en las separaciones cromatográficas y, por lo tanto, no muestren ningún cambio en su tamaño o forma; sin embargo, las perlas hechas de sílice o CPG (vidrio de poro controlado), por ejemplo, que tienen una excelente rigidez mecánica y estabilidad, tienen poca o ninguna tolerancia al NaOH.

[0083] Las perlas de polímero tales como, aunque no de forma limitativa, las perlas de metacrilato o poliestireno, pueden hacerse más estables a los reactivos y retener la rigidez. Las perlas de polisacárido tales como, aunque no de forma limitativa, perlas de dextrano o agarosa, son menos rígidas pero son más estables frente a reactivos como el NaOH. Sin embargo, las perlas de polisacárido suelen ser "más blandas" que otras perlas de polímero y, por lo tanto, son más propensas a comprimirse. El grado en el que se produce la compresión dependerá de la presión aplicada a partir del líquido que fluye a través del lecho de gel compactado. Una compresión excesiva dará como resultado un lecho no poroso a través del cual no es posible el flujo (cierre tanto de la red de poros internos como de los espacios intersticiales). Los factores clave que normalmente conducen a este aumento de la presión y la compresión son el caudal del líquido aplicado (normalmente expresado como ml/min, CV/min o cm/h) y la viscosidad del líquido.

[0085] La estabilidad mecánica y la rigidez de las perlas de polisacárido más blandas pueden mejorarse mediante la aplicación de ciertos procedimientos. Por ejemplo, los siguientes enfoques mejorarán la estabilidad mecánica y la rigidez de las perlas:

[0087] 1. Reticulación dentro de la estructura del polisacárido. Esto hará que las perlas sean más resistentes a la presión y, por lo tanto, preservará la morfología de las perlas. Sin embargo, dependiendo de la química de reticulación aplicada, el tamaño de los poros internos dentro de la estructura de la perla puede verse afectado.

[0089] 2. Aumento de la densidad de la cantidad de polisacárido utilizada en la formulación de las perlas. Esto se hace a menudo con partículas basadas en agarosa. Las perlas de agarosa convencionales disponibles en el mercado tienen porcentajes de agarosa entre aproximadamente 2 y 10% (de 20 a 100 gramos de agarosa por litro de perlas formuladas). Una perla que tiene una densidad aumentada puede tener > aproximadamente 6% de agarosa. Sin embargo, este aumento de densidad puede reducir el tamaño de los poros internos de las perlas:

[0091] • un 4% de las perlas tienen un peso molecular promedio de corte de alrededor de 20 millones de Dalton

[0093] • un 6% de las perlas tienen un peso molecular promedio de corte de alrededor de 4 millones de Dalton

[0095] El tamaño óptimo del canal intersticial, que depende del tamaño de la perla, depende en última instancia de los componentes presentes en la corriente de alimentación. Específicamente, el tamaño óptimo de los canales intersticiales depende de las partículas que deseablemente pasen a través del lecho de gel. El proceso para determinar el mejor tamaño para los canales intersticiales puede ser el siguiente:

[0097] 1. Determinación del tamaño de la perla: A partir del radio de las células o fragmentos que van a atravesar el lecho de gel, calcular el radio requerido del canal formado por tres perlas (el "radio de canal más estrecho") y calcular el tamaño mínimo de perla necesario.

[0098] 2. Determinación de la fracción de tamaño que se va a eliminar del gel: A partir del radio de las perlas (radio de las perlas monodispersas o promedio de los radios de las perlas polidispersas), calcular la longitud de los radios de los sitios tetraédricos y octaédricos. Los radios de estos sitios son los de las perlas más grandes que deben eliminarse del gel.

[0099] Luego, se calculó el diámetro teóricamente más grande de una esfera pequeña que puede pasar por el canal más pequeño formado entre tres esferas idénticas perfectas. El diámetro del canal puede ser de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 veces mayor, o de aproximadamente 4 a aproximadamente 6 veces mayor que la partícula más grande (es decir, célula, fragmento de célula u otra partícula) que está presente en la corriente de alimentación no clarificada.

[0100] Para el empaquetamiento cúbico cerrado, hexagonal cerrado o de Barlow de partículas monodispersas, completamente sedimentadas, agitadas hasta que no se produzca ninguna medición de cambio en la densidad de empaquetamiento (conjetura de Kepler), se cumple lo siguiente:

[0101] • Radio del sitio del tetraedro r<tet>= 0,225 R (R es el radio de la perla, r<tet>es el radio del sitio Tet) • Radio del sitio del octaedro r<oct>= 0,414 R (R es el radio de la perla, r<oct>es el radio del sitio Oct) • Radio del canal más estrecho r<can>= 0,155 R (R es el radio de la perla, r<can>es el radio del canal) • Las perlas que tienen un radio de x, donde 0,155 R < x < 0,414 R tienen un tamaño que puede encajar en y ocupar permanentemente un sitio octaédrico.

[0102] • Las perlas que tienen un radio de x, donde 0,155 R < x < 0,225 R tienen un tamaño que puede encajar en y ocupar permanentemente un sitio tetraédrico.

[0103] Los "agujeros" tetraédricos y octaédricos siempre están presentes en un lecho de perlas compactadas. Los agujeros se denominan tetraedro u octaedro en función del número de perlas que rodean y forman el agujero. Para el empaquetamiento cerrado aleatorio de perlas polidispersas, los valores anteriores son mínimos y los valores reales pueden ser mayores. Los canales de radio r<can>= 0,155 R deben tener un radio mínimo de 1,1 veces (preferiblemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 veces) el radio de la célula, fragmento o partícula para pasar fácilmente a través del lecho de gel.

[0104] Las perlas monodispersas se pueden preparar:

[0105] a. fabricando perlas monodispersas con un radio óptimo y ausencia total de perlas más pequeñas; b. fabricando un intervalo estrecho de perlas polidispersas controlando cuidadosamente las condiciones durante un proceso de emulsión. Estas condiciones incluyen: adición de un tipo y cantidad óptimos de emulsionante, mantener una velocidad de agitación óptima, mantener una temperatura óptima, todo lo cual contribuye a reducir la distribución de tamaños de las perlas formadas;

[0106] c. tamizando en húmedo o en seco para eliminar la fracción de partículas más pequeñas (o más grandes) que un tamaño seleccionado; y/o

[0107] d. por elutriación para eliminar la fracción de partículas más pequeñas que un tamaño determinado. Para mejorar la filtración, las perlas más pequeñas que podrían obstruir los canales intersticiales se eliminan antes de compactar el lecho de gel.

[0108] Los canales intersticiales se pueden mejorar en forma y función realizando algunas o todas las etapas siguientes:

[0109] a. Calcular o determinar el radio promedio de perla R deseable para permitir el paso de células, fragmentos de células u otras partículas, por ejemplo, utilizando la información que se muestra en las Tablas 1-3 siguientes. b. Formar un lecho de gel en el que se hayan eliminado las perlas con un radio r < 0,414 R.

[0110] i. Eliminar todas las perlas que tengan un radio r < 0,414 R creará un lecho de gel con un flujo y una porosidad máximos y una trayectoria más corta. Una ventaja de esto es un procesamiento de purificación más rápido.

[0111] c. Formar un lecho de gel en el que se hayan eliminado las perlas con un radio r < 0,225 R.

[0112] i. Eliminar todas las perlas que tengan un radio r < 0,225 R creará un lecho de gel con una porosidad algo menor, una mayor longitud de trayectoria y un mayor tiempo de residencia. Una ventaja de esto es una purificación más eficiente.

[0113] d. Eliminar las perlas más pequeñas con un radio r < 0,225 R o r < 0,414 R evitará el bloqueo/obstrucción de los canales intersticiales en el lecho de gel. Esto también reducirá la cantidad de limpieza del lecho de gel requerida entre los ciclos de purificación.

[0114] e. Aumentar el radio r de las perlas que se van a eliminar hasta en un 25% (es decir, las perlas que se están eliminando tienen un radio r que es un 25% mayor que el indicado de otro modo).

[0115] f. Reducir al máximo la distribución del tamaño de las perlas tanto como sea posible para lograr una densidad de empaquetamiento cerrado aleatorio reducida y acercarse a la densidad de empaquetamiento cerrado cúbico o hexagonal.

[0116] Tabla 1

[0119]

[0121] Tabla 2

[0123]

[0125] Tabla 3

[0127]

[0128] Otra realización es un proceso para seleccionar perlas para su uso en un lecho de gel para cromatografía radial que incluye: a) identificar un intervalo estrecho de diámetros (o radios) de perla deseables en función de los componentes (o partículas de interés) presentes en la corriente de alimentación; b) eliminar perlas de un diámetro (o radios) definido fuera del intervalo de diámetro de perla deseable; y c) definir el porcentaje de diámetros de perla (radios) dentro del intervalo de diámetro de perla deseable.

[0130] Otra realización más es un proceso para filtrar una corriente de alimentación no clarificada usando una columna de flujo radial descrita anteriormente que comprende las etapas de:

[0132] a. rellenar la columna de flujo radial con perlas;

[0134] b. procesar una corriente de alimentación clarificada que contiene una partícula de interés para calibrar las condiciones de purificación;

[0136] c. determinar la unión de la partícula de interés a partir de los resultados de la etapa b; y

[0138] d. procesar una corriente de alimentación no clarificada que comprende la proteína seleccionada.

[0140] La partícula de interés puede ser una célula completa, un fragmento celular, un virus o una proteína. Puede ser una VLP, ADN, ARN, antígeno, liposoma, oligo- o polisacárido.

[0142] Después de rellenar la columna de flujo radial con las perlas, se usa una corriente de alimentación clarificada para calibrar las condiciones de purificación óptimas antes de la purificación rutinaria real de las corrientes de alimentación no clarificadas. Esto permite comprender cómo la partícula de interés, tales como una proteína, se une a la columna (RFC, Zetacell™). Para la purificación de corrientes no clarificadas, se pueden usar lavados tanto hacia adelante como hacia atrás para eliminar las trazas de células/fragmentos de células. Las formas de pastel o cono se pueden usar para la optimización a pequeña escala antes de ampliarlas o usar la forma de rosquilla. El proceso se puede utilizar junto con procesos continuos o de "lecho móvil simulado" ("SMB").

[0143] Dependiendo de los sistemas de reactivos utilizados durante la cromatografía, las perlas de polímero se encogerán y se hincharán, aumentando y disminuyendo así tanto los diámetros de los poros internos como los espacios intersticiales entre las perlas (esféricas). Esto no ocurre con las partículas de sílice y CPG, pero ocurre con todos los lechos de gel basados en partículas de polímeros y polisacáridos. Los efectos del hinchamiento y el encogimiento pueden controlarse, en su totalidad, casi en su totalidad, o al menos en parte, mediante la cuidadosa selección por parte de un experto en la técnica del sistema tampón utilizado para rellenar la columna y utilizado durante la operación de rutina.

[0145] Después de optimizar el proceso con corrientes de alimentación clarificadas directamente en una pequeña columna cromatográfica de flujo radial que contenga perlas de polímero como lecho de gel, se puede lograr una escala lineal hasta una escala de proceso mayor manteniendo la longitud del lecho, manteniendo la razón entre las áreas de frita exterior e interior y manteniendo todos los parámetros operativos (caudal, número de volúmenes de columna por unidad de tiempo, composición del tampón, tiempo de residencia, fase sólida, presión y temperatura) para cada etapa del proceso (carga de flujo de alimentación, lavado hacia adelante y hacia atrás instrucciones para eliminar las células, los restos celulares y los materiales no unidos, la elución para liberar el objetivo capturado directamente de la fase sólida, la regeneración para limpiar y preparar la columna y la fase sólida para su posterior reutilización). Si en algún momento es necesario recalibrar, volver a optimizar o cambiar de otro modo el sistema de purificación a gran escala, también se logra una escala lineal hasta una columna RFC pequeña y manejable manteniendo la longitud del lecho, manteniendo la razón entre las áreas de frita exterior e interior y manteniendo todos los parámetros operativos (caudal, número de volúmenes de columna por unidad de tiempo, composición del tampón, tiempo de residencia, fase sólida, presión y temperatura) para cada etapa del proceso (carga de corriente de alimentación clarificada o no clarificada, lavando en dirección directa e inversa para eliminar las células, los restos celulares y los materiales no unidos, la elución para liberar el objetivo capturado directamente de la fase sólida, la regeneración para limpiar y preparar la columna y la fase sólida para su posterior reutilización).

[0147] Lo anterior ilustra algunas de las posibilidades para poner en práctica la invención. Por lo tanto, aunque se han descrito ejemplos de realización específicos, será evidente que se pueden realizar diversas modificaciones y cambios en estas realizaciones sin alejarse del alcance más amplio de la invención; son posibles muchas otras realizaciones dentro del alcance de la invención. Varias características se agrupan en una única realización con el fin de simplificar la divulgación. Este método de divulgación no debe interpretarse en el sentido de que refleja que las realizaciones reivindicadas tienen más características de las que se enumeran expresamente en cada reivindicación. Más bien, como reflejan las siguientes reivindicaciones, el objeto de la invención radica en menos de todas las características de una única realización descrita. Por lo tanto, las siguientes reivindicaciones se incorporan a la descripción anterior de la invención, y cada reivindicación se presenta por sí sola como una realización de ejemplo separada.

[0148] Cabe señalar que se prevé que cualquier característica o elemento que se identifique positivamente en este documento también pueda excluirse específicamente como característica o elemento de una realización de la presente invención como se define en las reivindicaciones. También debe tenerse en cuenta que se prevé que cualquier característica o elemento que se identifique positivamente (o que se excluya, ya sea específicamente o por implicación) se pueda usar en combinación con cualquier otra característica o elemento que se identifique positivamente (o que se excluya, ya sea específicamente o por implicación). La invención se define en las reivindicaciones adjuntas.

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

1. Una columna cromatográfica de flujo radial que comprende:

una pluralidad de perlas compactadas en la columna cromatográfica de flujo radial, y

canales intersticiales formados entre las perlas,

en donde la columna cromatográfica de flujo radial tiene una longitud de lecho de 3 cm a 50 cm, en donde cada perla comprende uno o más poros, en donde cada poro tiene un diámetro de 250 Á a 5000 Á,

en donde al menos el 80% de la pluralidad de perlas tiene un diámetro de 200 gm a 500 gm, en donde las perlas tienen un radio promedio R de 100 gm a 250 gm; y

en donde ninguna de las perlas tiene un radio r < 0,225 R.

2. La columna cromatográfica de flujo radial de la reivindicación 1, en donde la perla está hecha de un polímero, vidrio, alúmina, sílice, vidrio de poro controlado (CPG), celulosa, partículas de hierro encapsuladas, CPG encapsulado o sílice encapsulada.

3. La columna cromatográfica de flujo radial de la reivindicación 2, en donde la perla es una perla de polímero.

4. La columna cromatográfica de flujo radial de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde ninguna de las perlas tiene un radio r < 0,414 R.

5. La columna cromatográfica de flujo radial de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde todas las perlas tienen un radio de ± 10% de un radio objetivo.

6. La columna cromatográfica de flujo radial de cualquier reivindicación anterior, que comprende una corriente de alimentación no clarificada que contiene una partícula de interés seleccionada de una proteína, virus, VLP, ADN, ARN, antígeno, liposoma, oligo- o polisacárido, o cualquier combinación de los mismos.

7. La columna cromatográfica de flujo radial de la reivindicación 6, en donde la partícula de interés es un virus o una proteína seleccionada de IgG e IgM.

8. Un proceso para seleccionar perlas para su uso en una columna cromatográfica de flujo radial que comprende: a) identificar un intervalo estrecho y deseable de radio de perla R en función de los componentes presentes en la corriente de alimentación; b) eliminar las perlas de un radio r definido, que están fuera del intervalo de perlas deseable; y c) definir el porcentaje de radio de perla R dentro del intervalo de perla deseable; en donde las perlas seleccionadas tienen las siguientes propiedades:

cada perla comprende uno o más poros, en donde cada poro tiene un diámetro de 250 Á a 5000 Á, al menos el 80% de la pluralidad de perlas tiene un diámetro de 200 gm a 500 gm,

las perlas tienen un radio promedio R de 100 gm a 250 gm; y

ninguna de las perlas tiene un radio r < 0,225 R.

9. El proceso de la reivindicación 8, en donde la perla está hecha de un polímero, vidrio, alúmina, metal u otro material cristalino, semicristalino o amorfo, sílice, vidrio de poro controlado (CPG), celulosa, partículas de hierro encapsulado, CPG encapsulado o sílice encapsulada.

10. El proceso de la reivindicación 8, en donde la perla es una perla de polímero.

11. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en donde las perlas de radio r se eliminan mediante tamizado en húmedo o en seco y/o elutriación.

12. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en donde se eliminan las perlas que tienen un radio r < 0,414 R.

13. Un proceso para purificar una corriente de alimentación no clarificada usando la columna cromatográfica de flujo radial de la reivindicación 1, que comprende las etapas de:

rellenar la columna de flujo radial con las perlas;

procesar una corriente de alimentación clarificada que contiene una partícula de interés para calibrar las condiciones de purificación;

determinar la unión de la partícula de interés a partir de los resultados de la etapa b;

procesar una corriente de alimentación no clarificada que comprende la partícula de interés.

14. El proceso de la reivindicación 13, en donde la partícula de interés es una proteína, un virus, una VLP, ADN, ARN, un antígeno, un liposoma, un oligo- o polisacárido, o cualquier combinación de los mismos.

15. El proceso de la reivindicación 14, en done la partícula de interés es un virus o una proteína seleccionada de IgG e IgM.