ES3042684T3 - Immunodominant proteins and fragments in multiple sclerosis - Google Patents

Immunodominant proteins and fragments in multiple sclerosis

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ES3042684T3
ES3042684T3 ES19737683T ES19737683T ES3042684T3 ES 3042684 T3 ES3042684 T3 ES 3042684T3 ES 19737683 T ES19737683 T ES 19737683T ES 19737683 T ES19737683 T ES 19737683T ES 3042684 T3 ES3042684 T3 ES 3042684T3
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Ramos Mireia Sospedra
Roland Martin
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Zurich Universitaet Institut fuer Medizinische Virologie
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Abstract

La presente divulgación se refiere al tratamiento, diagnóstico y/o prevención de la esclerosis múltiple (EM) mediante el uso de una proteína o péptido inmunodominante. Más concretamente, la invención se refiere al campo de las inmunoterapias específicas de antígeno, como la inducción de tolerancia. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0003] P ro te ín a s y fra g m e n to s in m u n o d o m in a n te s en la e sc le ro s is m ú ltip le
[0005] C a m p o de la inve nc ión
[0007] La d ivu lga c ió n se re fie re al tra ta m ie n to , d ia g n ó s tico y /o p reve nc ión de la e sc le ro s is m ú ltip le m e d ia n te el uso de una p ro te ína o p é p tid o in m u n o d o m in a n te . M ás p a rticu la rm e n te , la inve nc ión se re fie re al cam p o de las in m u n o te ra p ia s e sp e c ífica s de a n tíg e n o s, ta le s com o la ind u cc ión de to le ra n c ia .
[0009] A n te c e d e n te s de la inve nc ión
[0011] La e sc le ro s is m ú ltip le (M S ) es una e n fe rm e d a d in fla m a to ria a u to in m u n ita r ia d e va s ta d o ra que a fec ta p rin c ip a lm e n te a a d u lto s jó v e n e s . La M S es un e je m p lo p ro to típ ico de una e n fe rm e d a d a u to in m u n ita r ia e sp e c ífica de un ó rga n o (A ID ), ya que la re spu es ta a u to in m u n ita r ia so lo a fe c ta al s is te m a n e rv io so cen tra l (C N S ), q ue co n s is te en el ce re b ro y la m é d u la e sp ina l. La A ID e sp e c ífica de ó rga n o s ig n ifica que el s is te m a in m u n ita rio de l p ac ien te daña un te jid o o tip o de cé lu la e sp e c ífico m e d ia n te cé lu la s T a u to rre a c tiva s y /o a n ticue rp os .
[0013] La M S a fe c ta p re fe re n te m e n te a a d u lto s jó v e n e s e n tre 20 y 40 años, pero los n iños y las p e rso n a s m a yo re s ta m b ié n p ueden d e s a rro lla r MS. La e n fe rm e d a d es a p ro x im a d a m e n te 2 -3 ve ce s m ás fre cu en te en m u je res que en h om b re s. La M S g e n e ra lm e n te se m a n ifie s ta c lín ic a m e n te p o r p ro b le m a s te m p o ra le s con la v is ió n (n eu ritis ó p tica a gu da ), la se n s ib ilid a d o la fun c ión m o to ra y a u tó n o m a , pero p uede p ro vo ca r una a m p lia g am a de s ín to m a s n eu ro ló g ico s .
[0015] En el m o m e n to de la p rim e ra m a n ife s ta c ió n , cu a n d o se han e xc lu id o los d ia g n ó s tico s d ife re n c ia le s , la e n fe rm e d a d se d e n o m in a s ín d ro m e c lín ica m e n te a is la do (C IS ) s ie m p re q ue los h a lla zg o s en el líqu ido ce fa lo rra q u íd e o (C S F ) y en la re so n a n c ia m a gn é tica (M R I) sean co m p a tib le s con el d ia g nó stico . La M RI d ivu lga le s io n e s en lu g a res típ ico s de la M S, es decir, yu x ta co rtica le s , p e rive n tricu la re s , en el tro n co e n ce fá lico o la m é d u la e sp ina l. S i se cum p len d e te rm in a d o s c rite r io s q ue p ueden re su m irse en d ise m in a c ió n en el e sp a c io (m ás de una les ión o s ín to m a /s ig n o c lín ico ) y en el t ie m p o (m á s de un e ve n to ) e n to n ce s se p ue de re a liz a r el d ia g n ó s tico de e sc le ro s is m ú ltip le re m ite n te -re cu rre n te (R R M S ). Un e sce n a rio e sp e c ia l es el d e scu b rim ie n to a cc id e n ta l de les io ne s en la M RI co m p a tib le s con M S sin s ín to m a s c lín icos . Esto se co n o ce com o s ín d rom e ra d io ló g ica m e n te a is la d o (R IS ) y p uede co n s id e ra rse una e ta pa p rev ia al C IS y la R R M S . M ás del 80 % de los p a c ie n te s p ad ecen a lg u n a de e stas e n fe rm e d a d e s y la m a yo ría de los p a c ie n te s d e sa rro lla n p o s te rio rm e n te lo q ue se d e n o m in a M S p ro g re s iva se cu n d a ria (S P M S ). En e ste m o m en to , las re ca íd a s /e xa ce rb a c io n e s se vu e lve n m e no s fre cu e n te s o cesan p or co m p le to y la d is ca p a c id a d n e u ro ló g ica a u m e n ta de m a n e ra con s ta n te , ya sea e n tre re ca íd a s o sin e llas.
[0017] U na fo rm a e sp ec ia l de M S es la M S p rim a ria p ro g re s iva (P P M S ), que nunca p rese n ta reca ídas , s ino que co m ie n za con un e m p e o ra m ie n to con s ta n te de los s ín to m a s n eu ro ló g ico s , p o r e je m p lo , de la cap ac id ad para cam inar. La P P M S a fe c ta a p ro x im a d a m e n te al 10 % de los p a c ie n te s con M S y a h o m b re s y m u je re s con la m ism a fre cu e n c ia . Su a p a ric ió n sue le se r m ás ta rd ía que la del C IS o la R R M S . R esp e c to a las ca u sas y m e ca n ism o s de la e n fe rm e d a d , la P P M S se co n s id e ra s im ila r a la R IS -C IS -R R M S -S P M S m e n c io n a d a a n te rio rm e n te .
[0019] P o r lo g e n e ra l, la M S se d ia g n o s tic a seg ún los c rite r io s re v isa d o s de M cD o n a ld o, re c ie n te m e n te , los c rite r io s de Lub lin . E s to s c rite r io s ta m b ié n p e rm ite n d is t in g u ir e n tre las d ife re n te s fo rm a s y a c tiv id a d de la e n fe rm e d a d de la M S (T h o m p so n e t al., 2018 , L a n ce t N eu ro l, 17 (2 ):162 -173 ).
[0021] La M S es una e n fe rm e d a d con un tra s fo n d o g en é tico com p le jo . En la ú ltim a d é ca d a se han id e n tifica d o m ás de 200 a le lo s de riesgo de M S o ra sgo s cu a n tita tivo s (va ria n te s co m u n e s de g en es d e te c ta d o s com o p o lim o rfism o s de un so lo n u c le ó tid o , S N P ), sin e m b a rg o , el m á s im p o rta n te con d ife re n c ia es el h a p lo tip o de l a n tíg e n o le u co c ita rio hum a no (H L A )-D R 15. A d e m á s, se han e n co n tra d o va r io s fa c to re s de riesgo a m b ie n ta le s /e s tilo de v ida . E ntre e lla s se e n cu e n tra n la in fe cc ió n p o r el v iru s de E ps te in B a rr (E B V ), el ta b a q u ism o , los n ive les b a jos de v ita m in a D 3 y la o b e s id a d com o las m ás im p orta n te s .
[0023] T odos los fa c to re s de rie sgo g e n é tico s y a m b ie n ta le s son co m u n e s y co m p a rtid o s p o r m u ch o s in d iv id u o s de la p ob la c ió n sana. Las ra zo n e s e xa c ta s p o r las que la e n fe rm e d a d co m ie n za en in d iv id u o s con d e te rm in a d o s fa c to re s de riesgo g e n é tico s y a m b ie n ta le s no e s tán c la ras , pero se su p o n e que las in fe cc io n e s v ira le s y b a c te ria n a s , p o r e je m p lo p o r ca m b io s en la m ic ro b io ta in te s tin a l, p ueden s e r d e se n ca d e n a n te s . La ta sa de co n co rd a n c ia de los g e m e lo s m o n o c ig ó tico s de l 10 -30 % y el rie sgo de los fa m ilia re s de p rim e r g ra d o de un p a c ie n te con M S de a p ro x im a d a m e n te el 2 -4 %, en com p a ra c ió n con un riesgo de 1 /1000 en la p ob lac ión gen e ra l, p ro p o rc io n a n una e s tim a c ió n del rie sgo g en é tico v e rsu s el a m b ie n ta l, a u n q u e la in te ra cc ió n entre a m b o s ta m b ié n es com p le ja .
[0025] P ara id e n tifica r los co m p o n e n te s del C N S con tra los cua les se d irige la re spu es ta a u to in m u n ita ria en la MS, los in ve s tig a d o re s o rien ta ron sus e s fu e rzo s h ac ia las cé lu las y e s tru c tu ra s que se ven a fe c ta d a s en MS, p a rticu la rm e n te la m ie lina y los a xo n e s /n e u ro n a s y las p ro te ína s e sp e c ífica s de e stas c é lu la s /e s tru c tu ra s . D u ra n te los ú ltim o s tre in ta años, v a r ia s p ro te ín a s de la m ie lina ta le s com o la p ro te ína b ás ica de la m ie lina (M B P ), la p ro te ín a p ro te o lip íd ica (P L P ) y la g lico p ro te ín a de la o lig o d e n d ro g lia de la m ie lin a (M O G ) han s ido id e n tif ica d a s com o e n ce fa lito g é n ica s en m o d e lo s a n im a le s (e n ce fa lo m ie lit is a u to in m u n ita r ia e xp e rim e n ta l; EAE), es decir, su inyecc ión en cep as de ro ed o res su sce p tib le s con d u ce a una e n fe rm e d a d con s im ilitu d e s con la M S, pero ta m b ié n e xa m in a n d o cé lu la s in m u n ita ria s de p a c ie n te s con M S (S o sp e d ra and M artín , 2005 , A nn u R e v Im m u no l, 23 :683 -747 ). Los a u to a n tíg e n o s m e n c io n a d o s a n te r io rm e n te son e sp e c ífico s del C N S y se e xp re sa n e xc lu s iva m e n te (P L P y M O G ) o cas i e xc lu s iv a m e n te (M B P ) en el ce reb ro . En la M S, ta m b ié n se han d escrito com o o b je tivo s p o ten c ia le s a lg u no s a u to a n tíg e n o s que no son e sp e c ífico s del C N S , ta le s com o la a lfa -B c ris ta lin a y la tra n sa ld o la sa -H .
[0027] La e v id e n c ia a c tu a l sug ie re que las cé lu la s T a u to rre a c tiva s C D 4+ son un fa c to r cen tra l para la p a to g é n e s is a u to in m u n ita ria de la MS, p ro b a b le m e n te re leva n te no só lo para la inducc ión y el m a n ten im ie n to de la respuesta a u to in m u n ita r ia , s ino ta m b ié n d u ra n te el d añ o t is u la r (S o sp e d ra and M artin , 2005 ). La fre cu e n c ia de cé lu la s T C D 4 de a lta a v id e z re a c tiva s a los p rin c ip a le s co m p o n e n te s de la v a in a de m ie lina , ta le s co m o MBP, P LP y<M O G , a u m e n ta en p ac ie n te s con>M<s (B ie le ko va e t al., 2004, J Im m uno l, 172 :3893 -3904 ). D eb ido a su>p a rtic ip a c ió n en la p a to g é n e s is de la e n fe rm e d a d , las cé lu las T C D 4+ son un o b je tivo de las in te rve n c io n e s te ra p é u tica s .
[0029] U na in ve s tig a c ió n d e ta lla d a de la re sp u e s ta inm un ita ria con tra las p ro te ína s e sp e c ífica s del C N S m o s tró que d e te rm in a d o s p é p tid o s de las m ism a s son re co n o c id o s p o r una g ran fra cc ió n de p a c ie n te s y en el co n te x to de las m o lé cu la s H LA -D R a so c ia d a s a la e n fe rm e d a d . E stos p é p tid o s se d e n o m in a n in m u n o m o d o m in a n te s (B ie le ko va e t al., 2004).
[0031] Las s ig u ie n te s ca ra c te rís tic a s ind ican q ue un d e te rm in a d o p é p tid o de una p ro te ín a es in m u n o d o m in a n te en el co n te x to de la MS:
[0033] a) el re co n o c im ie n to fre cu e n te de este p ép tid o p o r las cé lu las T, es decir, p o r a p ro x im a d a m e n te 10 % o m ás de los p a c ie n te s con M S, a m e n u d o en el co n te x to de un a le lo o h ap lo tip o H L A a so c ia d o a la e n fe rm e d a d (S o sp e d ra and M artin , 2005), y
[0035] b) el re con oc im ie n to de e ste pép tid o p or cé lu las T re levan tes para la en fe rm ed ad , ta le s co m o las que re spo nd en a p ép tid os en ba jas c o n c e n tra c io n e s (cé lu la s T de a lta a v id e z ) (B ie le ko va et al., 2004 ) y, p o r lo tan to , se c o n s id e ra n p a rtic u la rm e n te p e lig rosa s, y /o tie n e n un fe n o tip o p ro in fla m a to r io , y /o e s tá n a is la d a s d e l ó rg a n o o c o m p a rtim e n to d ia n a (C N S ), en el ca so de la M S, c é lu la s T q ue se in filtra n en el ce re b ro , la m é d u la e sp in a l o el CSF.
[0037] S in em ba rg o , el re co n o c im ie n to de a lta a v id ez no es un re qu is ito p revio , ya que ta m b ié n se ha d e m o stra d o que las cé lu la s T e sp e c ífica s de la m ie lina de baja a v id ez son p a tó g e n a s en m o d e lo s de ra ton es tra n s g é n ico s h u m a n iza d o s (Q u a n d t e t al. 2012 , J Im m uno l, 189(6 ): 2897 -2908 ).
[0039] R e c ie n te m e n te se ha d e m o s tra d o que las cé lu la s T de los p a c ie n te s con M S m u es tra n un a u m e n toin v itrode la p ro life ra c ió n en a use n c ia de un a n tíg e n o e xó g e n o (M o h m e et al., 2013, Bra in, 136 :1783 -1798 ). E s tas cé lu las T "a u to p ro life ra tiv a s " están e n riq u e c id a s con cé lu la s que se a lo jan en el co m p a rtim e n to del C N S de los p a c ie n te s con M S y, de e sta m anera , p ue de n co n s id e ra rs e com o una fu e n te de sa n g re p e rifé rica de cé lu la s T q ue se in filtra n en el ce re b ro /C S F (Je lc ic e t al., 2018 , Cell, 175 (1 ):85 -100.e 23 ).
[0041] En el caso de que los d a tos de las p rue b as de cé lu las Tin v itrono estén d isp o n ib le s o a d e m á s de d ich as p rue b as , el re co n o c im ie n to in m u n ita rio de los p é p tid os ta m b ié n se p uede p re d e c ir /in fe r ir a p a rtir de a q u e llo s p ép tid os que se un irán b ien a los a le los H L A de c lase I o c lase II de l ind iv iduo y para las cé lu las T C D 8+ y C D 4+ re sp e c tiva m e n te . Las p re d icc io n e s de un ión de p ép tid os son b ien co n o c id a s para el e xp e rto en la té cn ica . P ue d en re a liza rse m e d ia n te a lg o ritm o s de p red icc ió n b ien e s ta b le c id o s (N e tM H C II -w w w .cb s .d tu .d k /s e rv ic e s /N e tM H C II/; IE D B - w w w .ie d b .o rg /) y a n á lis is de los m o tivo s de un ión a H LA (S Y F P E IT H I - w w w .sy fp e ith i.d e /).
[0043] Los p é p tid o s in m u n o d o m in a n te s se p ueden u sa r en in m u n o te ra p ia s e sp e c ífica s de a n tíg e n o s, com o la in d u cc ió n de to le ra n c ia . Un e je m p lo es el d o cu m e n to EP 2 205 273 B1, que d e sc rib e p ép tid os in m u n o d o m in a n te s de MBP, PLP y M O G y su a p licac ión para el tra ta m ie n to de la MS. En el e n fo q u e d ivu lg a d o en d ich o d o cu m e n to , los p é p tid o s se a co p la n a g ló b u lo s b la n co s o ro jos.
[0045] La ind u cc ión de to le ra n c ia es e sp e c ífica del a n tíg e n o y h ace que las cé lu las T a u to rre a c tiva s no sean fu n c io n a le s o a n é rg ica s o induce cé lu las T re g u la d o ra s (T re g ) que sup rim e n e sp e c ífica m e n te la a u to in m u n id a d a d ve rsa a d ich os a n tíg e n o s d iana. La ind u cc ión de to le ra n c ia a a u to a n tíg e n o s d iana es un o b je tivo te ra p é u tico m u y im p o rta n te en las e n fe rm e d a d e s a u to in m u n ita ria s . O fre ce la o p o rtu n id a d de a te n u a r e sp e c ífica m e n te la re sp u e s ta a u to in m u n ita r ia p a to g é n ica de fo rm a e ficaz y con pocos e fe c to s se cu n d a rio s . La ind u cc ión de to le ra n c ia ta m b ié n se p uede lo g ra r a p lica n d o una p ro te ína co m p le ta en lu g a r de o a d e m á s de un pép tido in m u n o d o m in a n te q ue es un fra g m e n to de la p ro te ín a (K e n n e d y M K e t al, 1990, J Im m uno l, 144 (3 ):909 -15 ).
[0046] A lg u n a s ca ra c te rís tic a s p a to ló g ica s de la M S se re fle ja n en el m o de lo EAE, un m o d e lo a n im a l p a ra d ig m á tico de e n fe rm e d a d a u to in m u n ita r ia im p u lsa d a p o r c é lu la s T h 1 /T h 17. Los e s tu d io s en E A E re cu rre n te (R -E A E ) en el ra tón S JL han d e m o stra d o c la ra m e n te q ue la d e sm ie lin iza c ió n c ró n ica im p lica la a c tiva c ió n de las re sp u e s ta s de las cé lu las T a un p ép tido de m ie lina in m u n o d o m in a n te , es d e c ir PLP 139-154 , al que se d irige la p rim era e xa ce rb a c ió n de la e n fe rm ed ad . P os te rio rm en te , la re spu es ta inm u n ita ria se a m p lía a o tros p ép tid os de m ie lina de PLP, M B P y M O G , un p ro ce d im ie n to c o n o c id o com o p ro p a g a c ió n de e p íto p o s . La fa lta de re sp u e s ta de las cé lu la s T, es dec ir, la to le ra n c ia , se p uede inducir, p o r e je m p lo , cu a n d o las cé lu la s p re se n ta d o ra s de a n tíge no s (A P C ) p u lsad as con p é p tid o s a n tig é n ico s se tra ta n , p o r e je m p lo , con el a ge n te re ticu la n te 1 -e til-3 -(3 -d im e tila m in o p ro p il) -c a rb o d iim id a (E C D I; ta m b ié n a b re v ia d o ED C).
[0047] Los e xp e rim e n to s p re c lín ico s han d e m o s tra d o q ue u na ú n ica in ye cc ió n i.v. de e sp le n o c ito s m u rin o s ing e n u o s p u lsa d o s con una m e zc la de p é p tid os de m ie lina e n c e fa lito g é n ico s y fija d o s con el re ticu la n te ED C es m uy e fica z para in d u c ir to le ra n c ia e sp e c ífica al pép tid o in v ivo . En la EAE, este p ro to co lo no so lo p rev in o a los a n im a le s de la e n fe rm ed ad , s ino q ue inc lu so re du jo e fica zm e n te la a pa ric ió n y la g rave da d de to d a s las re ca ída s p o s te rio re s cua nd o se a d m in is tró d e sp u é s de la ind u cc ión de la e n fe rm e d a d , lo que ind ica que la to le ra n c ia e sp e c ífica p ue de re g u la r n e g a tiv a m e n te una re sp u e s ta a u to in m u n ita r ia en cu rso (M ille r e t al, 1991, A ca d Sci, 636 :79 -94 ). M á s re le va n te para el tra ta m ie n to de la M S, los e s tu d io s en E A E han d e m o s tra d o q ue se puede in d u c ir s im u ltá n e a m e n te to le ra n c ia a m ú ltip le s e p íto p o s u sa nd o un cóc te l de p é p tid os de m ie lina e n ce fa lito g é n ico s , p ro p o rc io n a n d o de e sta m a n e ra la cap ac id ad de a p u n ta r a cé lu las T a u to rre a c tiva s con m ú ltip le s e sp e c ific id a d e s .
[0048] La to le riza c ió n de cé lu la s T h um a n a s p o r cé lu las a u tó lo g a s a co p la d a s a a n tíg e n o s, p o r e je m p lo , A P C (V a n d e n b a rk e t al, 2000, In t Im m uno l, 12 :57 -66 ) o cé lu las no nuc leadas, es decir, g ló b u lo s ro jos (R B C ), tra ta d os con E D C son e fic a ce sin v itroco m o lo d e m u e s tra la in ca p a c id a d de las c é lu la s T to le r iz a d a s para p ro life ra r o p ro d u c ir c ito c in a s Th1 y una e xp re s ió n re d u c id a de m o lé cu la s co e s tim u la d o ra s en e s ta s cé lu las .
[0049] H ay e v id e n c ia de que al m e no s dos m e ca n ism o s d is tin to s e stán in vo lu c ra d o s en la ind u cc ión de to le ra n c ia e sp e c ífica al a n tíg e n o p o r e ste rég im en :
[0050] 1) T o le ran c ia d irec ta d onde los c lo n e s Th1 que e n co n tra ro n co m p le jo s a n tíg e n o /M H C n om in a le s en las A P C a co p la d a s al a n tíg e n o se a n e rg iza ro n com o re su lta d o de la fa lta de re cep c ió n de una c o e s tim u la c ió n m e d ia da p o r C D 28 a de cu a d a , y
[0051] 2 ) m e ca n is m o s in d ire c to s co m o la to le ra n c ia c ru za da , d o n d e la to le ra n c ia es in d u c id a p o r el re p ro c e sa m ie n to y la re p re se n ta c ió n de a n tíg e n o s p o r las A P C del h o sp e d a d o r to le ro g é n ic a s y /o la e xp a n s ió n de cé lu la s T reg. E s ta ú ltim a to le ra n c ia c ru za d a p ro b a b le m e n te im p lica la ind u cc ión y /o e xp a n s ió n de cé lu la s T reg e sp e c ífica s de l an tíge no , su p o s ic ió n q ue ta m b ié n está re sp a ld a d a p o r d a tos o b te n id o s en un e n sa yo de fase Ib co m o se d ivu lg a en el p rese n te d o cu m e n to . A d e m á s, el tra ta m ie n to de cé lu las con ED C induce a p o p to s is en un p orce n ta je su s ta n c ia l de cé lu las tra ta d a s . De e sta m anera , es p rob a b le q ue e x is ta un m e ca n ism o ind ire c to que in vo lu c ra a las A P C fija s q ue su fre n a p o p to s is , las cu a le s luego son p ro ce sa d a s y re p re s e n ta d a s p o r las A P C del h ospe da do r. E s to se ve re sp a ld a d o a d e m á s p o r la ind u cc ión e fica z de to le ra n c ia en ra ton es d e fic ie n te s en M H C y a lo g én ico s . Las cé lu la s d e n d rítica s d e riva d a s de la m é d u la óse a in v itro fa g o c ita n y p rocesan e fica zm e n te las A P C fija d a s y p u lsa d a s p o r a n tígeno .
[0052] Las te ra p ia s a c tu a lm e n te a p ro b a d a s para la M S im p lica n d ive rsa s e s tra te g ia s in m u n o m o d u la d o ra s o in m u n o su p re so ra s no e sp ec ífica s del a n tígeno , que só lo son p a rc ia lm e n te e fica ce s. Todas las te ra p ia s a c tua les d eb en to m a rs e p o r v ía o ra l a d ia rio o in ye c ta rse /in fu n d irse en d is tin to s in te rva lo s de tie m p o y d u ra n te largos p e río d o s de tie m p o . A d e m á s, se a so c ia n a n u m e ro so s e fe c to s se cu n d a rio s , a v e ce s g raves.
[0053] Los d o cu m e n to s US 2014 /018245 A1 y US 2013 /244897 A1 A m b o s se re lac io na n con la id e n tifica c ió n de p os ib le s se cu e n c ia s m a rca d o ra s y su p os ib le uso en el d ia g n ó s tico de la MS. Las m u es tra s de p ac ien tes (C S F ) se a n a liza ro n en una b ib lio te ca de e xp re s ió n de A D N c y se c o m p a ra ro n con m u e s tra s san as . Los g enes e xp re sa d o s d ife re n c ia lm e n te fue ro n id e n tifica d o s m e d ia n te ch ips de p ro te ína s (vé ase la secc ión de e je m p los de a m bo s d ocu m e n to s ). N ing un o de los a n tíg e n o s id e n tifica d o s hasta el m o m en to ha d e m o s tra d o se r c la ra m e n te un m a rc a d o r d ia g n ó s tico po tenc ia l.
[0054] El d o cu m e n to US 2016 /201132 A1 Se basa en un a ná lis is de l tra n sc rip to m a de p ac ien tes que han s ido tra ta d o s con laq u in im o d . D eb ido a la e xp re s ió n d ife re n c ia l de g enes , se p uede p re d e c ir la re sp u e s ta al laq u in im o d. R A S G R P 2 se id e n tifica d e n tro de una la rga lis ta de genes, p o r e je m p lo , p á rra fo [0040 ], Tabla 6 o Tabla 7, que se e xp re sa n de m a nera d ife re nc ia l. S in e m ba rg o , no e x is te n ingún v ín cu lo q ue p erm ita a firm a r que e stos genes sean p o s ib le s a u to a n tíg e n o s o m a rca d o re s de d ia g nó stico .
[0055] El d o cu m e n to JP 2006 141297 A d ivu lga una co m p o s ic ió n fa rm a cé u tica que co m p re n d e R A S G R P 2 o un fra g m e n to de l m ism o en el tra ta m ie n to de l c á n c e r o e n fe rm e d a d vascu la r. No e x is te n in g ún v ín c u lo con MS. El d o c u m e n to U S 7 198 932 B1 se re la c io n a con un g en p ara una e n z im a in v o lu c ra d a en la s ín te s is de G D P -L -fucosa . No e x is te n ingún v ín cu lo con MS.
[0056] L u tte ro tti & M artin 2014 (E x p e rt O p in Investig D rugs, 23 (1 ):9 -20 ) es una re v is ió n sob re los e n fo q u e s de to le riza c ió n a a n tíg e n o s e sp e c ífico s en la MS. N ing un o de los a n tíg e n o s id e n tifica d o s hasta el m o m e n to ha s ido d ivu lga do .
[0058] M artín e t al. 2016 (E u r J Im m uno l, 46 :2078 -2090 ) es una re v is ión so b re los tra ta m ie n to s de la M S y la p a to g é n e s is de la M S. N in g u n o de los a n tíg e n o s id e n tifica d o s h as ta el m o m e n to ha s ido d ivu lga do .
[0060] U na te ra p ia q ue a b o rd e la p a to g é n e s is de la M S d esde sus ra íce s d e b e ría a p u n ta r a s u p rim ir e sp e c ífica m e n te o in h ib ir fu n c io n a lm e n te las cé lu la s a u to rre a c tiva s p a tó g e n a s sin a lte ra r el s is te m a in m u n ita rio "n o rm a l". Esto es im p o rta n te p o rq u e la in m u n o m o d u la c ió n y /o in m u n o su p re s ió n g lo b a l se p rod u ce n a cos ta de in h ib ir las cé lu la s re g u la d o ra s b e n e fic io sa s y las cé lu las in m u n ita ria s que cu m p le n fu n c io n e s p ro te c to ra s con tra los p a tóg en os . Ide a lm e n te , la to le ra n c ia in m u n ita ria e sp e c ífica de l p ép tid o , es decir, la co rre cc ió n e sp e c ífica de la re sp u e s ta a u to in m u n ita r ia m al d ir ig id a con tra el te jid o ce reb ra l y de la m é du la e sp ina l, d eb e ría log ra rse te m p ra n o en la fa se in fla m a to ria de la e n fe rm ed ad , cu a n d o el b lo q ue o de la re spu es ta inm un ita ria a u to rre a c tiva p uede in h ib ir la d ise m in a c ió n y p rop a ga c ió n de la e n fe rm e d a d y se p uede p re ve n ir la d isca p a c id a d irreve rs ib le . P o r lo tan to , el g ru p o de p a c ie n te s p re fe rid o al q ue se d ir ig e son los p a c ie n te s con M S re cu rre n te -re m ite n te en las p rim e ras e ta pa s de la e n fe rm e d a d o inc lu so los p ac ie n te s q ue p rese n ta n un p rim e r e ve n to c lín ico sug es tivo<de>M<s>,<es decir, C IS , o p a c ie n te s en q u ie n e s la e n fe rm e d a d se d e scu b re inc lu so antes, en la e ta pa de R IS . En>e ste m o m e n to , los p a c ie n te s con M S g e n e ra lm e n te t ie n e n un g rad o ba jo de d is c a p a c id a d n e u ro ló g ica , lo que les p e rm ite p a rtic ip a r en to d a s las a c tiv id a d e s de la v id a d ia ria y el tra b a jo sin c o m p ro m iso s ign ifica tivo .
[0062] S u m a rio de la inve nc ión
[0064] Un o b je to de la p re se n te inve nc ión es ide n tifica r a n tíg e n o s re le va n te s para la M S a d e cu a d o s para su uso en el tra ta m ie n to , d ia g n ó s tico y /o p reve n c ió n de la M S, en p a rticu la r en un e n fo q u e de to le riza c ió n . Un a sp ec to a d ic io n a l de la p rese n te inve nc ión es la id e n tifica c ió n de un su je to hum ano , que es a d e cu a d o para la to le riza c ió n .
[0066] La inve n c ió n e stá d e fin id a p o r las re iv in d ica c io n e s a d ju n tas .
[0068] La p re se n te inve nc ión se basa en un n uevo e n fo q u e para id e n tif ic a r a n tíg e n o s re le va n te s para la M S: Se e xa m in a ro n las c é lu la s T e xp a n d id a s c lo n a lm e n te en el ce re b ro de un pac ien te con M S (h o m o c ig o to p ara el h a p lo tip o H L A D R 15, que se sa b e que es el p rin c ip a l fa c to r de riesgo g e n é tico en la M S ), q ue m u rió de una fo rm a m u y a g re s iva de M S. De e s te m odo, p o r p rim e ra v e z se a n a liza ro n c é lu la s T o rig in a d a s y e xp a n d id a s c lo n a lm e n te en el ó rg a n o d ia n a con el fin de id e n tif ic a r a n tíg e n o s. En to d o s los e n fo q u e s a n te rio re s , se a n a liza ro n los lin fo c ito s de sa n g re p e rifé rica p ara id e n tif ic a r a n tíg e n o s in m u n o d o m in a n te s .
[0070] La e xp a n s ió n c lon a l de un c lon de c é lu la s T (T C C ) en le s io n e s c e re b ra le s de M S su g ie re q ue las c é lu la s son re le va n te s para la M S. En el p re se n te d ocum e n to , se d esc rib e n los a n tíg e n o s d iana de un T C C e sp e c ífico que se ha d e sc rito p re v ia m e n te en P lanas e t al. (P la n a s e t al., 2015 , A nn C lin T ran s l N eu ro l, 2 (9 ):875 -893 ), T C C 21.1. A d e m á s , se han id e n tifica d o los a n tíg e n o s d iana de o tro T C C (T C C 14 ) del m ism o p ac ien te . En el caso de T C C 14 , el c lon fu e a is la d o de una p o b la c ió n de c é lu la s T de sa n g re p e rifé rica q ue se id e n tificó com o re le va n te para la e n fe rm e d a d al d e m o s tra r una m a yo r p ro life ra c ió n e sp o n tá n e a (a u to p ro life ra c ió n ) y e n riq u e c im ie n to de cé lu la s T a u to rre a c tiva s q ue se d ir ige n al ce reb ro . En con c re to , ta m b ié n se d e scu b rió que T C C 14 se e xp a n d ía c lo n a lm e n te en las les io ne s ce re b ra le s de MS, a pesa r de h ab er s ido a is la d o de la sangre p e rifé rica . El a is la m ie n to y la id e n tifica c ió n de cé lu la s T re le va n te s para la e n fe rm e d a d , com o TC C 21.1 y T C C 14 , se re p re se n ta n e sq u e m á tic a m e n te en la Fig. 1.
[0072] L ue go se p ueden ide n tifica r los e p ítop os d iana q ue son re co n o c id o s por las cé lu las T b io ló g ica m e n te re leva n te s (p o r e je m p lo , las q ue se in filtra n en los te jid o s ) (F ig . 2).
[0074] E s te nue vo e n fo q u e reve ló las p ro te ín a s G D P -L -fu co sa s in ta sa (a b re v ia tu ra de l gen: TS TA 3; ta m b ié n con oc id o com o: G D P -L -fu co s a :N A D P 4 -o x id o rre d u c ta sa (3 ,5 -e p im e riza n te ) o G D P -4 -c e to -6 -d e s o x i-D -m a n o s a -3 ,5 -e p im e ra sa -4 -re d u c ta s a ) y p ro te ín a s de la fa m ilia R A S G R P (p ro te ín a lib e ra d o ra de g u a n ilo R AS), inc lu ida s R A S G R P 1 , R A S G R P 2, R A S G R P 3 y R A S G R P 4, a sí com o va r ia n te s de e m p a lm e e iso fo rm a s de las m ism as com o p a rticu la rm e n te re le va n te s en la MS. Se p re fie re e sp e c ia lm e n te R A S G R P 2. De e sta m anera , se ha d e scu b ie rto q ue e s ta s p ro te ín a s son in m u n o d o m in a n te s en la M S y son a u toa n tíg e n o s .
[0076] Tam bién se ha co m p ro b a d o su re leva nc ia en cé lu las T C D 4 in filtra da s en C S F de p ac ie n te s con C IS /M S para la G D P -L -fu co sa s in ta sa y en cé lu las m o n o n u c le a re s d e riva d a s de sa n g re p e rifé rica para R A S G R P 2. En un a ná lis is pos terio r, se p rob a ron ta n to la G D P -L -fu co sa s in ta sa com o R A S G R P 2 en cé lu las T C D 4 in filtra da s en C S F de p a c ie n te s con C IS /M S .
[0078] De e sta m anera , los a n tíg e n o s d e sc rito s en los e je m p lo s en el p rese n te d o cu m e n to son los p rim e ros a n tíge no s in m u n o d o m in a n te s en la M S, que se d e scu b rie ro n e xa m in a n d o la e sp e c ific id a d de las cé lu la s T que se e xp a n d e n c lo n a lm e n te en las les io ne s ce re b ra le s de la M S y, p o r lo tan to, se puede a su m ir que están im p licados en la re acc ión a u to in m u n ita r ia d añ ina en el ce reb ro . La m e to d o lo g ía que co n d u jo a su ide n tifica c ió n , las b ib lio te ca s de p é p tid o s co m b in a to rio s , no im p lica el e n fo q u e m e n c io n a d o a n te r io rm e n te sob re las p ro te ína s de m ie lin a /ce re b ro , s ino que está c o m p le ta m e n te libre de sesgos. H asta aho ra no se hab ía d e sc rito que e stos a n tíg e n o s e s tu v ie ra n im p lica d o s en la M S. A d e m á s, la secu e n c ia c ió n de A R N y la p ro te ó m ica han d e m o stra d o q ue a m bo s a u to a n tíg e n o s , G D P -L -fu co sa s in ta sa y R A S G R P 2 y las p ro te ína s re la c io n a d a s R A S G R P 1 y -3, se e xp re sa n en el te jid o ce re b ra l con MS.
[0079] Los a n tíg e n o s id e n tifica d o s se pueden usa r en el tra ta m ie n to , d ia g nó stico y /o p reve nc ión de la MS, en p a rticu la r en un e n fo q u e de to le riza c ió n , y para id e n tif ic a r a un su je to h u m a n o q ue sea a d e cu a d o para la to le riza c ió n . A l id e n tifica r a un su je to h um a no q ue es a d e cu a d o para la to le rizac ió n , el su je to h um a no p uede se r d ia g n o s tica d oin v itrocon M S. En o tra s p a la b ra s , los a u to a n tíg e n o s id e n tif ica d o s se p ue de n u sa r en el d ia g n ó s tico de M Sin vitro.E s ta p ru e b ain v itrop ue de co m p le m e n ta rs e con h a lla zg o s c lín ico s y de im a ge n , es dec ir, e l d ia g n ó s tico de M S según el e s ta d o de la técn ica , en p a rticu la r según los c rite r ios re v isa d o s de M cD o n a ld . De e sta m anera , los a u to a n tíg e n o s id e n tif ica d o s p ue de n s e rv ir para d ia g n o s tic a r la M S en un su je to h u m a n o con o sin p rue b as d ia g n ó s tica s a d ic ion a le s .
[0080] B re ve d e sc rip c ió n de las fig u ra s
[0081] F ig u ra 1 A is la m ie n to de cé lu las T re le va n te s para la e n fe rm e d a d
[0082] F ig u ra 2 D e scu b rim ie n to de l e p íto p o d iana
[0083] F ig ura 3 M e zc la s de e sca n e o p os ic io n a l de d e ca p é p tid o s s im p le s y d o b le m e n te d e fin id o s en co m b in a c ió n con a n á lis is b io m é trico para id e n tif ic a r la e sp e c ific id a d de T C C 21.1
[0084] F igura 4 S u m a rio de d e ca p é p tid o s h um a no s p red icho s con el e n fo q u e b iom é trico , s in te tiza d o s y p ro b a d o s para ca p a c id a d e s tim u la d o ra
[0085] F ig ura 5 T ra n sc rip c io n e s y p é p tid o s de G D P -L -fu co sa s in ta sa id e n tif ica d o s en te jid o ce reb ra l
[0086] F ig u ra 6 G D P -L -fu co sa s in tasa , m ie lina y p é p tid os C E F (p é p tid o s de co n tro l del c ito m e g a lo v iru s , v iru s de E p s te in -B a rr y v iru s de la g ripe )
[0087] F ig u ra 7 R e co n o c im ie n to de p é p tid o s de la G D P -L -fu co sa s in ta sa p o r c é lu la s T C D 4+ in filtra d a s en C S F de p a c ie n te s con C IS /M S
[0088] F ig u ra 8 A is la m ie n to de cé lu la s T a u to p ro life ra tiva s y cé lu las T a u to p ro life ra tiva s e n co n tra d a s en les iones c e re b ra le s de M S
[0089] F ig u ra 9 P ro ce d im ie n to de c rib a d o para la id e n tifica c ió n de l liga n do p ep tíd ico del gen T C C 14 a u to p ro life ra tivo , a is la d o en sa n g re p e rifé rica y lo ca liza d o en el ce reb ro , u sa n d o una b ib lio te ca de e sca n e o p os ic io n a l F ig ura 10 R e a c tiv id a d de R A S G R P 2 en cé lu la s T de m e m o ria d e riva d a s de sa n g re p e rifé rica
[0090] F ig u ra 11 E xp re s ió n de R A S G R P en cé lu las B de sa n g re p e rifé rica y ce reb ro
[0091] F ig ura 12 Id e n tifica c ió n de p é p tid o s de las p ro te ín a s R A S G R P 1 ,2 y 3 en el te jid o ce reb ra l
[0092] F ig ura 13 T in c ió n de cé lu las a co p la d a s a b io tina -P LP 1
[0093] F ig u ra 14 R e co n o c im ie n to de la G D P -L -fu co s a s in ta sa y de los p é p tid o s de m ie lina p o r los CD4+ in filtra d o s en el C S F C é lu la s T de 105 p a c ie n te s con M S
[0094] F ig u ra 15 R e co n o c im ie n to de R A S G R P 2 y p é p tid o s de m ie lina p o r c é lu la s T CD4+ in filtra d a s en C S F de 57 p a c ie n te s con M S
[0095] F ig ura 16 Ind ucc ión de la to le ra n c iain v ivocon g ló b u lo s ro jos a co p la d o s a p é p tid o s de m ie lina
[0096] D e sc rip c ió n d e ta lla d a de la inve nc ión
[0097] Las cé lu las T u sa da s para id e n tifica r p é p tid os in m u n o d o m in a n te s y la p ro te ína co rre sp o n d ie n te son ide a lm en te a q u e lla s cé lu las T que son p a to g é n ica m e n te re le va n te s para la e n fe rm e d a d . R esp e c to a e sta ú ltim a ca ra c te rís tica , las cé lu la s T que se e xp an de n c lo n a lm e n te en el te jid o d iana de la M S, el cereb ro , la m é du la e sp ina l y el CSF, son de m a yo r in te rés para la ide n tificac ión de a n tíge no s d iana re leva n te s para la en fe rm ed ad . S eg ú n un m é to d o d e sc rito p o r P lan a s e t al. (2015 ) La se cu e n c ia c ió n de p róx im a g e n e ra c ió n de s e cu e n c ia s de A D N g en óm ico o com p lem en ta rio de la cadena beta del re cep to r de cé lu las T (T C R ) se ha usado para ide n tifica r c é lu la s T e xp a n d id a s c lo n a lm e n te en les io ne s de a u to p s ia ce re b ra l de p a c ie n te s con M S y para a is la r estas cé lu la s T com o T C C de C S F y /o te jid o a u tó lo go (que co m p re n d e cé lu las v iva s y ob ten ido , p o r e jem p lo , m ed ian te b io p s ia o au top s ia te m p ra n a ) y ca ra c te r iza rla s con re spe cto al fe n o tip o fu n c io n a l y la e sp ec ific id ad de l an tígeno . De e ste m o do se han a is la do T C C re le va n te s para la e n fe rm e d a d . En con cre to , se ha id e n tifica d o y c a ra c te r iza d o T C C 21.1 : T C C 21.1 m o s tró un fe n o tip o T h 2 q u e libe ra p rin c ip a lm e n te c ito c in a s T h 2 y fu e cap az de p ro p o rc io n a r a yu da a las cé lu las B para la p rod u cc ión de a n ticu e rp o s . E s ta e s tra te g ia ha lleva do a la id e n tifica c ió n de la re le va n c ia de la p ro te ín a G D P -L -fu co sa s in tasa .
[0099] La e s tra te g ia anterior, es decir, la secu e n c ia c ió n p ro fu n d a de T C R de cé lu las T q ue se in filtran en el ce reb ro , la m é du la e sp ina l y el CSF, ta m b ié n se ha usado para a is la r cé lu las T re leva n te s para la e n fe rm ed ad de la sangre p e rifé rica y c lo n a r cé lu la s T id e n tifica d a s de cé lu las m o n o n u c le a re s de san g re p e rifé rica (P B M C ) a u to p ro life ra tiva s . E s ta e s tra te g ia ha lleva do a la id e n tifica c ió n de la re le va n c ia de la fa m ilia de p ro te ína s R A S G R P
[0101] Los e s tu d io s a c tu a le s con c é lu la s T q ue se in filtra n en el C S F (p a ra la G D P -L -fu co s a s in ta sa y en un a n á lis is p o s te rio r ta n to p ara la G D P -L -fu co s a s in ta sa com o para R A S G R P 2 ) y con cé lu las T de san g re p e rifé rica (para R A S G R P 2 ) d e m u e s tra n de esta m a ne ra que e stos son o b je tivo s in m u n o d o m in a n te s de la re spu es ta a u to in m u n ita r ia en la M S, y ta n to la G D P -L -fu co s a s in ta sa com o R A S G R P 2 (y o tros m ie m b ro s de la fa m ilia R A S G R P ) son re co n o c id o s p o r las c é lu la s T q ue se in filtra n en el ce re b ro en la M S, in c lu ye n d o C IS , R R M S y S P M S . Los a lg o ritm o s de p red icc ió n de un ión de p é p tid os in s ilico N e tM H C II y IE D B ta m b ié n se han usado para id e n tifica r re g io ne s in m u n o d o m in a n te s den tro de la p ro te ína re spe ctiva (co m o se d e sc rib e en "E je m p los").
[0102] La e nz im a c ito só lica G D P -L -fu co sa s in ta sa co n v ie rte la G D P -4 -c e to -6 -d e s o x i-D -m a n o s a en G D P -L -fu co sa , que luego es u sada p o r las fu c o s iltra n s fe ra s a s para fu c o s ila r to d o s los o lig o sa cá rid o s . En los m a m ífe ro s , los g lica n o s fu co s ila d o s d e se m p e ñ a n fu n c io n e s im p o rta n te s en m u ch os p ro ce so s b io ló g icos , inc lu ida s las re a cc io n e s de tra n s fu s ió n de san gre , las in te ra cc io n e s h o sp e d a d o r-m ic ro b io , la p a to g é n e s is del c á n c e r y el m a n te n im ie n to de un e n to rn o no in fla m a to rio en el cereb ro .
[0104] Las p ro te ín a s R A S G R e x is te n en al m e n o s cu a tro v a r ia n te s R A S G R P 1 , R A S G R P 2 , R A S G R P 3 y R A S G R P 4. En particu la r, se han im p lica do en la p re se n te inve nc ión R A S G R P 1, R A S G R P 2 y R A S G R P 3. La fa m ilia de p ro te ín a s se ca ra c te r iza p o r la p re se n c ia de un d o m in io de fa c to r de in te rca m b io de n u c le ó tid o s de g ua n in a (G E F ) de la su p e rfa m ilia R as que fu n c io n a com o un fa c to r de in te rca m b io de n u c le ó tid o s re g u la d o p o r d ia c ilg lice ro l (d A g ) que a c tiva e sp e c ífica m e n te R as a tra vé s del in te rca m b io de G D P un ido p o r GTP. Las p ro te ín a s de la fa m ilia de p ro te ín a s a c tivan la ca sca d a de c in a sa s E rk /M A P P a rtic ip a n en la re d u cc ió n de la a p o p to s is y la tu m o rig é n e s is de las cé lu las B in fe c ta d a s p o r EBV, la se ñ a liza c ió n de las cé lu las B y T, la adh es ión , la m o tilid a d y son c ru c ia les para m a n te n e r la h om e os tas is de las cé lu las B-T. E x isten al m enos cuatro iso fo rm a s, es decir, va r ia n te s de em pa lm e , de R A S G R P 2.
[0106] Los a n tíg e n o s id e n tifica d o s G D P -L -fu co sa s in ta sa y R A S G R P 2 (as í com o R A S G R P 1, R A S G R P 3 y R A S G R P 4 ) no se han im p lica d o a n te r io rm e n te en la e tio lo g ía o p a to g é n e s is de la M S ni en su m o d e lo a n im a l, la E AE . El p rese n te h a lla zg o de q ue a m ba s p ro te ína s o fra g m e n to s , d e riva d o s o v a r ia n te s de e m p a lm e de las m ism as son un o b je tivo in m u n o d o m in a n te de la re sp u e s ta a u to in m u n ita r ia en la M S p e rm ite su uso en el tra ta m ie n to , d ia g n ó s tico y /o p reve n c ió n de la MS.
[0108] P o r p ro te ín a se e n tie n d e n o lig o p é p tid o s , p o lip é p tid o s a s í co m o p ro te ín a s p ro p ia m e n te d ich as . U na se cu e n c ia de p ro te ína p uede d e fin irse m e d ia n te una e n tra da de G e n B an k. U na se cu e n c ia de p ro te ína ta m b ié n puede d e fin irse m e d ia n te una e n tra d a U n iP ro tK B /S w is s -P ro t y /o m e d ia n te una e n tra d a G e n P e p t. U na e n tra d a p uede d e fin irse m e d ia n te un n úm ero , p o r e je m p lo , un n úm e ro de a cce so . C u a n d o co rre sp o n d a , las e n tra d a s de la base de d a tos inc lu ye n el n úm e ro de a cce so re sp e c tivo (es decir, un núm e ro de e n tra da ) y el n ú m e ro de ve rs ió n . U na p ro te ína ta m b ié n puede d e fin irse m e d ia n te cu a lq u ie r o tra base de da tos con o c id a para el e xp e rto en la técn ica . P ueden e x is tir d ife re n te s iso fo rm as, d e riva do s y /o va ria n te s de e m p a lm e que ta m b ié n están a ba rca d o s p o r la p re se n te inve nc ión . De e ste m odo, la se cu e n c ia puede v a r ia r re sp e c to de la se cu e n c ia con o c id a , p o r e je m p lo , de la e n tra d a G e n B a n k o U n iP ro tK B /S w iss -P ro t.
[0110] "U n a " p ro te ín a o "la " p ro te ín a seg ún la p re se n te inve n c ió n se re fie re a una p ro te ín a G D P -L -fu co sa s in ta sa o a una p ro te ín a de la fa m ilia de p ro te ín a s R ASG R P, p re fe rib le m e n te R A S G R P 2, o se re fie re ta n to a una p ro te ína G D P -L -fu co sa s in ta sa com o a una p ro te ín a de la fa m ilia de p ro te ín a s R ASG R P, p re fe rib le m e n te R A S G R P 2, a m e no s q ue se ind iq ue e xp líc ita m e n te lo con tra rio .
[0112] U na va r ia n te de e m p a lm e su rge del e m p a lm e a lte rn a tivo d u ra n te la e xp re s ió n gén ica . La va r ia n te de e m p a lm e seg ún la inve n c ió n es in m u n o d o m in a n te .
[0114] Un fra g m e n to es p re fe rib le m e n te c u a lq u ie r p a rte de la p ro te ín a q ue sea m ás corta , es dec ir, q ue te n g a m enos a m in o á c id o s q ue la p ro te ín a o rig in a l. Un fra g m e n to p ue de s e r un pép tido . El fra g m e n to co m p re n d e de 5 a 50, p re fe rib le m e n te de 5 a 20, m ás p re fe rib le m e n te de 10 a 15 a m in o á c id o s , inc lu so m ás p re fe rib le m e n te 15 a m in o á c id o s . El fra g m e n to seg ún la inve nc ión es in m u n o d o m in a n te .
[0116] Ta m bié n es p o s ib le u sa r m ás de un fra g m e n to seg ún la inve nc ión . P re fe r ib le m e n te se usan m ás de tre s , m ás de c inco, m ás de 10, m ás de 15 o inc lu so m ás de 20 fra g m e n to s d ife re n te s . En una re a liza c ió n p re fe rid a , se usan e n tre c in co y 20, p re fe rib le m e n te e n tre c inco y 15 fra g m e n to s d ife re n te s . Un fra g m e n to es d ife re n te de o tro fra g m e n to si no co n s ta de la m ism a se cu e n c ia de a m in o á c id o s .
[0117] En o tra re a liza c ió n , se usa al m e no s un fra g m e n to de cada p ro te ína seg ún la p re se n te inve nc ión (una p ro te ína G D P -L -fu co sa s in ta sa o una p ro te ína de la fa m ilia de p ro te ín a s RASG R P, p re fe rib le m e n te R A S G R P 2 ) en co m b in a c ió n . Es p a rticu la rm e n te ve n ta jo so co m b in a r al m enos un fra g m e n to de cada p ro te ína según la p re se n te in ve n c ió n con al m e n o s un p é p tid o co n o c id o de l e s ta d o de la té cn ica , en p a rtic u la r con al m e no s un p é p tid o de m ie lina , en p a rticu la r con al m enos uno o to d o s los p é p tid o s de m ie lina com o se d e fine n p or las S E Q ID N O s: 261 a 267.
[0118] Un d e riva d o de una se cu e n c ia se d e fin e co m o una se cu e n c ia de a m in o á c id o s q ue co m p a rte una h o m o lo g ía o id e n tid a d en to d a su lon g itu d con una p arte co rre sp o n d ie n te de la se cu e n c ia de a m in o á c id o s de re fe re n c ia de al m e no s 75 %, m ás p re fe rib le m e n te al m e no s 80 %, al m e no s 85 %, al m e no s 90 %, al m enos 93 %, al m enos 95 %, al m e no s 97 %, al m e no s 98 % o al m e no s 99 %. La "p a rte co rre sp o n d ie n te " en el sen tido de la p rese n te inve nc ión se re fie re p re fe rib le m e n te al m ism o tra m o de a m in o á c id o s de la m ism a se cu e n c ia paren ta l. P o r e je m p lo , si un d e riva d o con una long itud de 100 a m in o á c id o s d ifie re de un tra m o de a m in o á c id o s de S E Q ID NO : 1 (a m in o á c id o s 1 a 100 de S E Q ID NO: 1) p o r 20 a m in o á c id o s , este d e riva d o p a rtic u la r co m p a rte una ide n tid ad del 80 % en to d a su long itud con la parte co rre sp o n d ie n te , es decir, los a m in o á c id o s 1 a 100, de la se cu e n c ia de a m in o á c id o s de re fe ren c ia , es decir, S E Q ID NO: 1. El d e riva d o según la inve nc ión es in m u n o d o m in a n te .
[0119] U na "h o m o lo g ía " o " id e n tid a d " de una se cu e n c ia de a m in o á c id o s se d e te rm in a p re fe rib le m e n te según la in ve n c ió n sob re to d a la lon g itu d de la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s de re fe re n c ia o sob re to d a la long itud de la p arte co rre sp o n d ie n te de la se cu e n c ia de a m in o á c id o s de re fe re n c ia que co rre sp o n d e a la se cu e n c ia cuya h o m o lo g ía o ide n tid ad se define .
[0120] U na " id e n tid a d " se d e fine com o a m in o á c id o s idé n tico s , una "h o m o lo g ía " co m p re n d e a m in o á c id o s idé n tico s a s í com o su s titu c io n e s con se rva tiva s . El e xp e rto en la té cn ica co n o ce las su s titu c io n e s con se rva d o ra s , ta le s com o - a ro m á tico s y a ro m á tico s F y W /Y
[0121] - ca rg a d o s p o s itiva m e n te y ca rg a d o s p o s itiva m e n te R y K/H
[0122] - E y D con ca rga n e g a tiva o
[0123] - a lifá tico s V y L/M /I, o A y S /T
[0124] La se cu e n c ia de n u c le ó tid o s q ue co d ifica cu a lq u ie ra de las p ro te ín a s de la p re se n te inve nc ión o fra g m e n to , d e riva d o o va r ia n te de e m p a lm e de la m ism a se re fie re a c u a lq u ie r se cu e n c ia de n u c le ó tid o s cod ifica n te , p o r e je m p lo A R N o A D N , en p a rtic u la r A R N m o A D N c . En una re a liza c ió n , la se cu e n c ia de n u c le ó tid o s es un p lá sm id o o c u a lq u ie r tip o de v e c to r co n o c id o para el e xp e rto en la té cn ica . En una re a liza c ió n p re fe rid a , las s e cu e n c ia s de n u c le ó tid o s no co m p re n d e n in tron es y las s e cu e n c ia s g é n ica s co m p re n d e n e xo n e s e in trones. En un a sp e c to de la inve nc ión , la p ro te ín a para su uso en el tra ta m ie n to , d ia g n ó s tico y /o p reve nc ión de la e sc le ro s is m ú ltip le (M S ) es la G D P -L -fu co sa s in ta sa o un fra g m e n to , d e riva d o o v a r ia n te de e m p a lm e de la m ism a. En o tro a sp ec to de la inve nc ión , la p ro te ína es un m ie m b ro de la fa m ilia R A S G R P o un fra g m e n to , d e riva d o o v a r ia n te de e m p a lm e de la m ism a. La inve n c ió n ta m b ié n se re fie re a una se cu e n c ia de n u c le ó tid o s q ue co d ifica c u a lq u ie ra de las p ro te ín a s o fra g m e n to , d e riva d o o v a r ia n te de e m p a lm e de las m ism as , p a ra su uso en el tra ta m ie n to , d ia g n ó s tico y /o p re ve n c ió n de la e sc le ro s is m ú ltip le (M S).
[0125] En una re a liza c ió n p re fe rid a , las p ro te ín a s son p ro te ína s h u m a n a s y /o las se cu e n c ia s de n u c le ó tid o s y /o s e cu e n c ia s g é n ica s son s e cu e n c ia s hum a na s .
[0126] En una re a liza c ió n , la G D P -L -fu co sa s in ta sa m u es tra a c tiv ida d e n z im á tica que co n v ie rte G D P -4 -c e to -6 -d e s o x i-D -m a n o sa en G D P -L -fu co sa .
[0127] En o tra re a liza c ió n , el m ie m b ro de la fa m ilia R A S G R P a ctiva R as a tra vé s del in te rca m b io de G D P un ido p o r G T P A d ic io n a l o a lte rn a tiva m e n te , la p ro te ín a a c tiva la ca sca d a de la c in a sa E rk /M A P
[0128] En una re a liza c ió n p re fe rid a , la p ro te ín a G D P -L -fu co sa s in ta sa
[0129] a) tie n e la se cu e n c ia de a m in o á c id o s com o se e s ta b le ce en S E Q ID NO: 1 o
[0130] b) tie n e una se cu e n c ia de a m in o á c id o s que es al m e no s 85 %, p re fe rib le m e n te al m e no s 90 %, m ás p re fe rib le m e n te al m e no s 95 % idé n tica a la se cu e n c ia de a m in o á c id o s com o se e s ta b le ce en S E Q ID NO: 1 o c) tie n e una se cu e n c ia de a m in o á c id o s que es al m e no s 70 %, p re fe rib le m e n te al m e no s 80 %, m ás p re fe rib le m e n te al m e no s 90 % h o m ó lo g a a la se cu e n c ia de a m in o á c id o s com o se e s ta b le ce en S E Q ID NO : 1 o
[0131] d) tie n e una se cu e n c ia de a m in o á c id o s que es al m e no s 60 %, p re fe rib le m e n te al m e no s 70 %, m ás p re fe rib le m e n te al m e no s 80 %, inc lu so m ás p re fe rib le m e n te al m e no s 90 % h om ó log a a la se cu e n c ia de a m in o á c id o s com o se e s ta b le ce en S E Q ID NO: 1 y la p ro te ína o fra g m e n to o va ria n te de e m p a lm e de la m ism a se une a un a le lo H L A a u tó lo g o , es re co n o c id o p o r una cé lu la T y /o es re c o n o c id o p o r un a n ticu e rp o que se une a o re con oce la se cu e n c ia de a m in o á c id o s co m o se e s ta b le ce en S E Q ID NO: 1 o un fra g m e n to del m ism o o
[0132] e) e stá co d ifica d o p o r un gen TSTA3, en p a rtic u la r p o r una se cu e n c ia g én ica de n u c le ó tid o s 143612618 a 143618048 de N C _ 000008.11 , o e stá co d ifica d o p o r un gen q ue es al m e n o s 80 %, p re fe rib le m e n te al m enos 90 %, inc lu so m ás p re fe rib le m e n te al m e no s 95 % idé n tico a la se cu e n c ia g é n ica de n u c le ó tid o s 143612618 a 143618048 de N C _ 000008.11.
[0133] En o tra re a liza c ió n p re fe rid a , el m ie m b ro de la fa m ilia de p ro te ín a s R A S G R P
[0134] f) tie n e la se cu e n c ia de a m in o á c id o s co m o se e s ta b le ce en cu a lq u ie ra de las S E Q ID NO: 2, S E Q ID NO: 3, S E Q ID NO: 4, S E Q ID NO: 5, S E Q ID NO: 6, S E Q ID NO : 7, S E Q ID NO : 8 o S E Q ID NO: 9 o
[0135] g) tie n e una se cu e n c ia de a m in o á c id o s que es al m e no s 85 %, p re fe rib le m e n te al m e no s 90 %, m ás p re fe rib le m e n te al m e n o s 95 % idé n tica a la se cu e n c ia de a m in o á c id o s com o se e s ta b le ce en cu a lq u ie ra de las S E Q ID NO: 2, S E Q ID NO: 3, S E Q ID NO : 4, S E Q ID NO: 5, S E Q ID NO: 6, S E Q ID NO : 7, S E Q ID NO : 8 o S E Q ID NO: 9 o
[0136] h) tie n e una se cu e n c ia de a m in o á c id o s que es al m e no s 70 %, p re fe rib le m e n te al m e no s 80 %, m ás p re fe rib le m e n te al m e no s 90 % h o m ó lo g a a la se cu e n c ia de a m in o á c id o s com o se e s ta b le ce en c u a lq u ie ra de las S E Q ID NO: 2, S E Q ID NO: 3, S E Q ID NO : 4, S E Q ID NO: 5, S E Q ID NO: 6, S E Q ID NO : 7, S E Q ID NO : 8 o S E Q ID NO: 9 o
[0137] i) tie n e una se cu e n c ia de a m in o á c id o s que es al m e no s 60 %, p re fe rib le m e n te al m e no s 70 %, m ás p re fe rib le m e n te al m e no s 80 %, inc lu so m ás p re fe rib le m e n te al m e no s 90 % h om ó log a a la se cu e n c ia de a m in o á c id o s com o se e s ta b le ce en c u a lq u ie ra de las S E Q ID NO: 2, S E Q ID NO: 3, S E Q ID NO: 4, S E Q ID NO : 5, S E Q ID NO : 6, S E Q ID NO : 7, S E Q ID NO : 8 o S E Q ID NO : 9 y la p ro te ín a o fra g m e n to o v a r ia n te de e m p a lm e de la m ism a se une a un a le lo H L A a u tó lo go , es re co n o c id o p or una cé lu la T y /o es re co n o c id o p o r un a n ticu e rp o que se une a o re co n o ce la se cu e n c ia de a m in o á c id o s re sp e c tiva co m o se e s ta b le ce en cua lqu ie ra de S E Q ID NO : 2, S E Q ID NO: 3, S E Q ID NO: 4, S E Q ID NO : 5, S E Q ID NO: 6, S E Q ID NO: 7, S E Q ID<n>O: 8 o S E Q ID NO : 9 o un fra g m e n to del m ism o o
[0138] j) e stá co d ifica d o p o r un gen RASG R P, en p a rtic u la r p o r una se cu e n c ia g én ica de n u c le ó tid o s
[0139] - 38488101 a 38565575 de N C _ 000015.10 ,
[0140] - 64726911 a 64745456 de N C _ 000011.10 ,
[0141] - 33436324 a 33564750 de N C _ 000002.12 , o
[0142] - 38409051 a 38426305 de N C _ 000019.10 ,
[0143] o e stá co d ifica d o p o r un gen q ue es al m e no s 80 %, p re fe rib le m e n te al m e no s 90 %, inc lu so m ás p re fe rib le m e n te al m e n o s 95 % idé n tico a la se cu e n c ia g é n ica de nuc leó tido s .
[0144] - 38488101 a 38565575 de N C _ 000015.10 ,
[0145] - 64726911 a 64745456 de N C _ 000011.10 ,
[0146] - 33436324 a 33564750 de N C _ 000002.12 , o
[0147] - 38409051 a 38426305 de N C _ 000019.10.
[0148] La u n ión a un a le lo H L A a u tó lo go , el re c o n o c im ie n to p o r una cé lu la T y /o el re c o n o c im ie n to p o r un a n ticu e rp o p ue de n in d ica r in m u n o d o m in a n c ia de la p ro te ín a o de un fra g m e n to o va r ia n te de e m p a lm e de la m ism a. La in m u n o d o m in a n c ia ta m b ié n se p ue de c o m p ro b a r com o se d ivu lg a a con tin u a c ió n .
[0149] En una re a liza c ió n p a rticu la rm e n te p re fe rid a , en la p rese n te inve nc ión se usa una p ro te ína G D P -L -fu co sa s in ta sa o R A S G R P 2 o una va ria n te de e m p a lm e de la m ism a, p re fe rib lem e n te la p ro te ína G D P -L -fu co sa s in ta sa o R A S G R P 2. La p ro te ín a G D P -L -fu co sa s in ta sa tien e , p o r e je m p lo , la s e c u e n c ia co m o se e s ta b le ce en S E Q ID NO: 1, la p ro te ína R A S G R P 2 tien e , p o r e je m p lo , la se cu e n c ia com o se e s ta b le ce en S E Q ID NO: 2, S E Q ID NO : 6, S E Q ID NO : 7, S E Q ID NO: 8 o S E Q ID NO : 9.
[0150] El fra g m e n to co m p re n d e de 5 a 50, p re fe rib le m e n te de 5 a 20, m ás p re fe rib le m e n te de 10 a 15, inc lu so m ás p re fe rib le m e n te 15 a m in o á c id o s .
[0151] En o tra re a liza c ió n , el fra g m e n to es
[0152] a) al m enos 85 %, p re fe rib lem e n te al m enos 90 %, m ás p re fe rib lem e n te al m enos 95%idén tico a una secuencia de a m in o á c id o s co rre sp o n d ie n te re sp e c tiva o
[0154] b) al m e no s 70 %, p re fe rib le m e n te al m e no s 80 %, m ás p re fe rib le m e n te al m e no s 90 % h om ó log o a una se cu e n c ia de a m in o á c id o s co rre sp o n d ie n te re sp e c tiva o
[0156] c) al m e n o s 60 %, p re fe rib le m e n te al m e no s 70 %, m ás p re fe rib le m e n te al m e no s 80 %, inc lu so m ás p re fe rib le m e n te al m e no s 90 % h o m ó lo g o a una se cu e n c ia de a m in o á c id o s co rre sp o n d ie n te re sp e c tiva y se une a un a le lo H L A au tó lo go , es re co n o c id o p o r una cé lu la T y /o es re co n o c id o p o r un a n ticu e rp o q ue se une a 0 re co n o ce la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s re spe ctiva .
[0158] La "s e cu e n c ia de a m in o á c id o s c o rre sp o n d ie n te re sp e c tiva " se re fie re al fra g m e n to re sp e c tivo de la se cu e n c ia de a m in o á c id o s co rre sp o n d ie n te (es decir, S E Q ID NO: 1) con la m ism a long itud que el fra g m e n to h om ó log o (vé a se ta m b ié n la d e fin ic ió n de "p a rte c o rre sp o n d ie n te "sup ra ).Un fra g m e n to con e stas id e n tid a d e s y/u h o m o lo g ía s co m p re n d e de 5 a 50, p re fe rib le m e n te de 5 a 20, m ás p re fe rib le m e n te de 10 a 15, inc lu so m ás p re fe rib le m e n te 15 a m in o á c id o s . La ide n tid ad y /o h o m o lo g ía se d e te rm in a en to d a la long itud de l fra g m e n to re sp e c tivo . En o tras p a la bra s , la "s e cu e n c ia de a m in o á c id o s co rre sp o n d ie n te " se re fie re a la se cu e n c ia ina lte rad a , es decir, cu a n d o un fra g m e n to de una se cu e n c ia com o se e s ta b le ce en S E Q ID NO: 1 es 85 % id é n tico a un a m in o á c id o co rre sp o n d ie n te re spe ctivo , el fra g m e n to es 85 % idé n tico (en to d a la lon g itu d del fra g m e n to ) al fra g m e n to ina lte rad o co m o "e x tirp a d o ", es decir, to m a d o o co p ia d o d ire c ta m e n te de S E Q ID NO: 1.
[0160] P o r lo tan to , en una re a liza c ió n , la p ro te ína (G D P -L -fu co sa s in ta sa o un m ie m b ro de la fa m ilia de p ro te ína s R A S G R P ) tie n e una se cu e n c ia de a m in o á c id o s con una d e te rm in a d a h o m o lo g ía (a l m e no s 60 %, p re fe rib le m e n te al m enos 70 %, m ás p re fe rib le m e n te al m e no s 80 %, inc lu so m ás p re fe rib le m e n te al m e no s 90 % ) con la se c u e n c ia re p re s e n ta d a re sp e c tiva co m o se e s ta b le ce en los S E Q ID N<o>con el re q u is ito a d ic io n a l de que la p ro te ína o fra g m e n to o va r ia n te de e m p a lm e de la m ism a se una a un a le lo H LA a u tó lo go , sea re co n o c id o p o r una cé lu la T y /o sea re co n o c id o p o r un a n ticu e rp o q ue se una o re co n o zca la se cu e n c ia de a m in o á c id o s com o se e s ta b le ce en el S E Q ID N O re sp e c tivo o un fra g m e n to de la m ism a. En o tra re a liza c ió n , la p ro te ína o fra g m e n to o va r ia n te de e m p a lm e de la m ism a se une a un a le lo H L A a u tó lo g o y es re co n o c id a p o r una cé lu la T que se une a o re co n o ce la se cu e n c ia de a m in o á c id o s com o se e s ta b le ce en la re spe ctiva S E Q ID N O o un fra g m e n to de la m ism a.
[0162] Los e n sa yo s p ara m e d ir y /o p re d e c ir la un ión a un a le lo H L A au tó lo g o , el re co n o c im ie n to p o r una cé lu la T o el re c o n o c im ie n to p o r un a n ticu e rp o son b ien c o n o c id o s p o r los e xp e rto s en la té cn ica . La un ión de un p é p tid o a un a le lo H L A se p uede p redecir, p o r e je m p lo , m e d ia n te el uso de los a lg o ritm o s de p red icc ió n de un ión de p é p tid o s in s ilico N e tM H C II (h ttp ://w w w .c b s .d tu .d k /s e rv ic e s /N e tM H C II/) o IED B (h ttp ://w w w .ie d b .o rg /). El re co n o c im ie n to de c é lu la s T se p ue de m edir, p o r e je m p lo , m e d ia n te un e n sa yo de p ro life ra c ió n de c é lu la s T, p o r e je m p lo m id ie n d o la ra d ia c tiv id a d inco rp o rad a . La un ión de un p ép tid o y /o una p ro te ín a a un a n ticu e rp o se p uede m e d ir m e d ia n te e nsa yo s e s tá n d a r co n o c id o s para el e xp e rto en la técn ica , p o r e je m p lo m e d ia n te E LISA . La un ión a un a le lo H LA au tó lo go , el re co n o c im ie n to p o r una cé lu la T o el re co n o c im ie n to p or un a n ticu e rp o p ue de n in d ica r in m u n o d o m in a n c ia de un p ép tido o p ro te ína . La in m u n o d o m in a n c ia ta m b ié n se puede c o m p ro b a r com o se d ivu lg a a con tin u a c ió n .
[0164] En una re a liza c ió n , el fra g m e n to re p re se n ta un tra m o de a m in o á c id o s c o n se cu tivo s (p o r e je m p lo , 20 a 30 a m in o á c id o s ) q ue son al m e no s 90 % idé n tico s u h o m ó lo g o s e n tre p ro te ín a s de la fa m ilia RASG R P.
[0166] En una re a liza c ió n p re fe rid a , los p é p tid o s u sa do s para el tra ta m ie n to seg ún la in ve n c ió n son fra g m e n to s de la G D P -L -fu co sa s in ta sa o de una p ro te ína de la fa m ilia de p ro te ín a s R A S G R P y co m p re n d e n una secu en c ia se le cc io n a d a del g rup o q ue co n s is te en S E Q ID NOs: 10 a 98. En re a liza c io n e s e sp e c ia lm e n te p re fe rid as , los p é p tid o s co n s is te n en se cu e n c ia s de a m in o á c id o s co m o las q ue se m u e s tra n en u no de los S E Q ID NO : 10 a 98. Se p re fie re n de las s e cu e n c ia s de S E Q ID N O s: 10 a 35.
[0168] Las se cu e n c ia s según S E Q ID NO s: 10 y 35 se han id e n tifica d o com o p é p tid o s in m u n o d o m in a n te s d eb ido a q ue son re co n o c id o s p or las cé lu la s T re leva n te s para la e n fe rm e d a d y a la p o s te rio r va lid a c ió n del re co n o c im ie n to p o r p arte de las cé lu la s T que se in filtra n en el C S F p ara la G D P -L -fu co sa s in ta sa y las P B M C para R A S G R P 2 (vé a n se "E je m p lo s "). Las se cu e n c ia s de a m in o á c id o s según S E Q ID N O s: 36 y 37 represen tan un tra m o de se cu e n c ia s idén ticas e n tre R A S G R P 2 y R A S G R P 3 (a line ac ió n de U n iP ro tK B /S w iss -P ro t Q 7 L D G 7 -1 y U n iP ro tK B /S w is s -P ro t Q 8 IV 61 ). Los a m in o á c id o s seg ún las S E Q ID N O s 38 a 98 e s tán c o m p re n d id o s en m e zc la s de p é p tid o s q ue d ie ro n lu g a r a re a c c io n e s de cé lu la s T de m e m o ria de p a c ie n te s con M S (vé a n se 9. de los E je m p lo s y la F ig u ra 10). Las s e cu e n c ia s con S E Q ID N O s: 12, 21 ,23 , 28 y 32 (G D P -L -fu co sa s in ta sa ) y con s E q ID NO : 46 (R A S G R P 2 ) se han va lid a d o en un a n á lis is p o s te rio r con cé lu las T CD4+ in filtra d a s en el C S F (vé a n se 13 de los « E je m p lo s» y las F igs. 14 y 15).
[0170] Las s e cu e n c ia s de S E Q ID N O s: 1 -98 ta m b ié n se e n u m e ra n en la s ig u ie n te ta b la 1:
[0171] Tabla 1: S e cu e n c ia s de p ro te ínas, pos ic ión y e n tra da a base de datos. La secu en c ia Q 7LD G 7-1 es la secu en cia can ón ica de la p ro te ína R A S G R P 2 y ta m b ié n se re fie re a la iso te rm a 1 de R A S G R P 2. Las p ro te ína s y p ép tid os q ue se re p re se n ta n a co n tin u a c ió n son re a liza c io n e s p a rticu la rm e n te p re fe rid a s de la invenc ión .
[0174]
[0175]
[0176]
[0177]
[0178]
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[0191]
[0192]
[0193]
[0194]
[0196] Las s ig u ie n te s s e cu e n c ia s g é n ica s (Tabla 2) re p rese n tan las se cu e n c ia s gén ica s de las p ro te ína s G D P -L fucosa s in ta sa (gen : T S T A 3 ), R A S G R P 1 , R A S G R P 2 , R A S G R P 3 y R A S G R P 4 (T ab la 2 ). L as p ro te ín a s o d e riv a d o s o va r ia n te s de e m p a lm e de las m ism a s e s tán c o d ifica d a s p re fe rib le m e n te p o r el gen re sp e c tivo .
[0197] T a b la 2 : S e c u e n c ia s g é n ica s y e n tra d a en la b ase de d a to s
[0199]
[0201] Las s ig u ie n te s s e cu e n c ia s de n u c le ó tid o s (Tab la 3) re p re se n ta n s e cu e n c ia s de n u c le ó tid o s p re fe rid a s que co d ifica n cu a lq u ie ra de las p ro te ín a s o fra g m e n to s , d e riva d o s o v a r ia n te s de e m p a lm e de las m ism a s de la p rese n te inve nc ión . La ta b la ta m b ié n inc lu ye se cu e n c ia s cod ifica n te s (C D S ), es dec ir, p ro te ína s o pép tid os , que ta m b ié n p ue de n u sa rse en el tra ta m ie n to , d ia g n ó s tico y /o p re ve n c ió n de la e sc le ro s is m ú ltip le (M S ).
[0202] Tabla 3: S e cu e n c ia s de nuc leó tido s y se cu e n c ia s de p ro te ína s y las re spe ctivas e n tra d a s en la base de d a tos (N o s de a cce so G e n b a n k )
[0204]
[0205]
[0206]
[0207]
[0209] T odas las s e cu e n c ia s se re cu p e ra ro n de las re sp e c tiva s b ases de d a tos en línea el 22 de ju n io de 2018. En una re a liza c ió n , la p ro te ína , fra g m e n to , d e riva d o o v a r ia n te de e m p a lm e seg ún la p re se n te inve nc ión se p uede usa r para id e n tifica r a un su je to h um a no que es a d e cu a d o para la to le riza c ió n a a u to a n tíg e n o s en la MS, p re fe rib le m e n te en la M S te m p ra n a . La ide n tificac ión de un su je to h um a no q ue sea a d e cu a d o para la to le ra n c ia a los a u to a n tíg e n o s en la M S, p re fe re n te m e n te en la M S tem p ra na , co m p re n d e m e d ir la re ac tiv ida d p os itiva de las c é lu la s T y /o los a n ticu e rp o s a los a u to a n tíg e n o s en el su je to hum ano . De e ste m odo, el su je to h um a no ta m b ié n p ue de se r d ia g n o s tica d oin v itrocon MS. En o tras p a la bra s , los a u to a n tíg e n o s id e n tifica d o s ta m b ié n se p ue de n u sa r en el d ia g n ó s ticoin v itrode MS.
[0211] El d ia g n ó s ticoIn v itrode M S co m p re n d e los s ig u ie n te s pasos: a is la r cé lu las T, p re fe rib le m e n te cé lu las T C D 4+, y /o a n ticu e rp o s de sangre , C S F u o tro flu id o co rpo ra l del su je to y m e d ir la re ac tiv ida d de las cé lu la s T y /o a n ticu e rp o s co n tra una p ro te ín a o fra g m e n to , d e riva d o o v a r ia n te de e m p a lm e de la m ism a seg ún la p re se n te inve nc ión . El e xp e rto en la té c n ica co n o ce m é to d o s para a is la r cé lu las T y /o a n ticu e rp o s de sangre , C S F u o tro flu id o co rp o ra l d e l su je to y m e d ir la re a c tiv id a d de las cé lu la s T y /o a n tic u e rp o s co n tra la p ro te ína , fra g m e n to , d e riva d o o va r ia n te de em pa lm e . U na re ac tiv ida d de las cé lu la s T, p re fe rib le m e n te cé lu la s T C D 4+, y /o a n ticu e rp o s a la p ro te ína p rob a da o fra g m e n to , d e riva d o o va r ia n te de e m p a lm e de la m ism a, p uede in d ica r q ue el su je to su fre de M S. El d ia g n ó s tic o ta m b ié n p ue de co m b in a rse con h a lla zg o s c lín ic o s y de im agen , es decir, el d ia g n ó s tico de M S según el e s ta do de la té cn ica , en p a rticu la r según los c rite r ios de M cD o n a ld re v isa do s .
[0213] En o tra re a liza c ió n , una p ro te ína , fra g m e n to , d e riva d o o v a r ia n te de e m p a lm e seg ún la p re se n te in ve n c ió n se p uede u sa r para d is tin g u ir e n tre su b g ru p o s de MS. En particu la r, la p ro te ína , fra gm e n to , d e riva d o o va r ia n te de e m p a lm e según la p re se n te inve n c ió n se p ue de u sa r para d ia g n o s tic a r M S de patrón II en un su je to hum ano .
[0214] Las s ig u ie n te s ca ra c te rís tica s ind ican q ue un d e te rm in a d o p ép tido de una p ro te ína es in m u n o d im in a n te en el co n te x to de la MS:
[0216] a) el re co n o c im ie n to fre cu e n te de este p ép tid o p o r las cé lu las T, es decir, p o r a p ro x im a d a m e n te 10 % o m ás de los p a c ie n te s con M S, a m e n u d o en el co n te x to de un a le lo o h ap lo tip o H L A a so c ia d o a la e n fe rm e d a d (S o sp e d ra and M artin , 2005), y
[0218] b) el re con oc im ie n to de e ste pép tid o p or cé lu las T re levan tes para la en fe rm ed ad , ta le s co m o las que re spo nd en a p ép tid os en ba jas c o n c e n tra c io n e s (cé lu la s T de a lta a v id e z ) (B ie le ko va et al., 2004 ) y, p o r lo tan to , se c o n s id e ra n p a rtic u la rm e n te p e lig ro sa s , y /o tie n e n un fe n o tip o p ro in fla m a to r io , y /o e s tá n a is la d a s de l ó rg a n o o c o m p a rtim e n to d ia n a (C N S ), en el ca so de la M S, c é lu la s T q ue se in filtra n en el ce re b ro , la m é d u la e sp in a l o el CSF.
[0220] S in em ba rg o , el re co n o c im ie n to de a lta a v id ez no es un re qu is ito p revio , ya que ta m b ié n se ha d e m o stra d o que las cé lu la s T e sp e c ífica s de la m ie lina de baja a v id ez son p a tó g e n a s en m o d e lo s de ra ton es tra n s g é n ico s h u m a n iza d o s (Q u a n d t e t al. 2012).
[0222] De e sta m a nera , se puede c o m p ro b a r si una p ro te ín a o un fra g m e n to , d e riva d o o va r ia n te de e m p a lm e de la m ism a es in m u n o d o m in a n te en el co n te x to de la MS. D icha p rueba es p re fe rib le m e n te una p ruebain vitro.P a rticu la rm e n te a d e cu a d o es una p rue b ain v itroque p e rm ite m e d ir la re a c tiv id a d de las cé lu la s T y /o a n ticu e rp o s o b te n id o s de la san gre , C S F u o tro flu id o co rp o ra l de un su je to h um a no al q ue se le ha d ia g n o s tic a d o M S, p re fe rib le m e n te cé lu la s T CD4+ in filtra da s en C S F , a la p ro te ína o fra g m e n to , d e riva d o o v a r ia n te de e m p a lm e p rob a do s. El e xp e rto en la té c n ica co n o ce m é to d o s que p rue b an la re a c tiv id a d de las c é lu la s T, p re fe rib le m e n te cé lu la s T<c>D4+. y /o a n ticu e rp o s . P o r e je m p lo , se p ueden p ro b a r la p ro life ra c ió n de las c é lu la s T CD4+ y /o su sec re c ión de IF N -<y>o su re ac tiv ida d en un e n sayo E L IS P O T /F L U O R O S P O T o su re a c tiv id a d co n tra te trá m e ro s de p é p tid o s H LA . Si la p ro te ín a p ro b a d a o su fra g m e n to , d e riva d o o v a r ia n te de e m p a lm e ind u ce re ac tiv ida d en un su je to h u m a n o al q ue se le ha d ia g n o s tica d o MS, en caso de re ac tiv ida d de cé lu la s T, en p a rtic u la r un índ ice de e s tim u la c ió n (S I) s u p e r io r a 2 y /o una sec re c ió n de IF N -y s u p e r io r a 20 pg/m l, la p ro te ína o su fra gm e n to , d e riva d o o va r ia n te de e m p a lm e p rob a do s puede d e n o m in a rse in m u n o d o m in a n te . Ta m b ié n es p os ib le s e le cc io n a r 10 p a c ie n te s a los q ue se les h aya d ia g n o s tic a d o M S para re a liz a r d ich a p rueba. Si se ind u ce re ac tiv ida d en al m e no s 2 pac ien tes , la p ro te ín a o el fra gm e n to , d e riva d o o va r ia n te de e m p a lm e p ro b a d o s pueden d e n o m in a rse in m u n o d o m in a n te s . P re fe rib le m e n te , los 10 p ac ien tes han s ido d ia g n o s tic a d o s con R R M S según los c rite r io s de M cD o n a ld re v isa d o s e s ta b le c id os .
[0224] R e c ie n te m e n te se ha d e m o s tra d o que las cé lu las T de los p a c ie n te s con M S m u es tra n un a u m e n to de la p ro life ra c ió nin v itroen a use n c ia de un a n tíg e n o e xó g e n o (M o h m e e t al., 2013; Je lc ic e t al., 2018). E s tas cé lu las T "a u to p ro life ra tiva s " están e n riq u e c id a s con cé lu la s q ue se e n cu e n tra n en el co m p a rtim e n to de l C N S de los p ac ie n te s con M S y, de e sta m anera , p ueden co n s id e ra rse una fu e n te de san g re p e rifé rica de cé lu las T q ue se in filtra n en el ce reb ro /C S F .
[0226] En el caso de que los da tos de las p rue b as de cé lu la s Tin v itrono esté d isp on ib le o a d e m á s de d ich as p ruebas, el re co n o c im ie n to in m u n ita rio de los p ép tid os ta m b ié n se p uede p re d e c ir /in fe r ir a p a rtir de a q u e llo s p ép tid os q ue se un irán b ien a los a le los H L A de c lase I o c lase II del ind iv id u o y para las cé lu la s T C D<8>+ y C D 4+ re sp e c tiva m e n te . Las p re d icc io n e s de un ión de p ép tid os son b ien co n o c id a s para el e xp e rto en la té cn ica . P ue d en re a liza rse m e d ia n te a lg o ritm o s de p red icc ió n b ien e s ta b le c id o s (N e tM H C II w w w .cb s .d tu .d k /s e rv ic e s /N e tM H C II/; IE D B - w w w .ie d b .o rg /) y a n á lis is de los m o tivo s de un ión a H LA (S Y F P E IT H I - w w w .sy fp e ith i.d e /), vé a se "E je m p lo s ", en el a p a rta d o 11.
[0228] S eg ú n la p rese n te inve nc ión , las p ro te ína s G D P -L -fu co sa s in ta sa y un m ie m b ro de la fa m ilia de p ro te ína s R ASG R P, en p a rtic u la r R A S G R P 2, han s ido id e n tifica d a s com o in m u n o d o m in a n te s en la M S , p o r lo que han s ido id e n tif ica d a s com o a u to a n tíg e n o s .
[0230] No es n ecesa rio q ue la un ión al a le lo H L A sea p a rticu la rm e n te fue rte . De hecho, la in m u n o d o m in a n c ia ta m b ié n p uede o cu rr ir para pép tidos que se unen p ob re m en te al a le lo H LA (M ura ro et al., 1997, J C lin Invest; 100 (2 ):339 -349).
[0232] La ind u cc ión de to le ra n c ia es e sp e c ífica del a n tíg e n o y h ace que las cé lu las T a u to rre a c tiva s no sean fu n c io n a le s o a n é rg ica s o ind u ce cé lu la s T reg que sup rim e n e sp e c ífica m e n te la a u to in m u n id a d a d ve rsa a d ich o s a n tíg e n o s d iana. La ind u cc ión de to le ra n c ia a a u to a n tíg e n o s d ia n a es un o b je tivo te ra p é u tico m uy im p o rta n te en las e n fe rm e d a d e s a u to in m u n ita ria s . O frece la o p o rtu n id a d de a te n u a r e sp e c ífica m e n te la re sp u e s ta a u to in m u n ita r ia p a to g é n ica de fo rm a e fica z y con pocos e fe c to s se cu n d a rio s . La ind u cc ión de to le ra n c ia ta m b ié n se p uede lo g ra r a p lica n d o una p ro te ína co m p le ta en lu g a r de o a d e m á s de un pép tido in m u n o d o m in a n te q ue sea un fra g m e n to de la p ro te ína (K e n n e d y M K e t al., 1990). Se ha d e m o s tra d o en el p re se n te d o cu m e n to q ue se p ueden in d u c ir ca m b io s in m u n o ló g ico s co m p a tib le s con la to le ra n c ia en p ac ien tes h um a n o s m e d ia n te la inyecc ión i.v. de p ép tid os in m u n o d o m in a n te s a co p la d o s a g ló b u lo s ro jos (14. de los e je m p lo s ). P o r co n s ig u ie n te , los p é p tid o s in m u n o m in a n te s p ue de n u sa rse para la ind u cc ión de to le ra n c ia .
[0233] La in m u n o d o m in a n c ia de las p ro te ín a s y /o fra g m e n to s p e rm ite de e sta m a ne ra u sa r la p ro te ína y /o un fra g m e n to , d e riva d o o v a r ia n te de e m p a lm e de la m ism a para in m u n o te ra p ia s e sp e c ífica s de an tíge no , ta le s com o la ind u cc ió n de to le ra n c ia .
[0235] S eg ú n la p re se n te inve nc ión , la to le riza c ió n e sp e c ífica de a n tíg e n o se p ue de u sa r en to d a s las fo rm a s de MS: En el m o m e n to de la p rim e ra m a n ife s ta c ió n , cu a n d o se han e xc lu id o los d ia g n ó s tico s d ife re n c ia le s , la e n fe rm ed ad se d e n o m in a C IS s iem p re q ue los h a lla zg os del C S F y la M RI sean co m p a tib le s con el d ia g nó stico . La M R I d ivu lg a les io ne s en lug a res típ ico s de la M S, es decir, yu x ta co rtica le s , p e rive n tricu la re s , en el tro n c o e n ce fá lico o la m é d u la e sp ina l. S i se c u m p le n d e te rm in a d o s c rite r io s que pueden re su m irse en d ise m in a c ió n en el e sp ac io (m ás de una les ión o s ín to m a /s ig n o c lín ico ) y en el t ie m p o (m ás de un e ve n to ) e n to n ce s se puede re a liza r el d ia g n ó s tico de R R M S . Un e sce n a rio e sp e c ia l es el d e s c u b rim ie n to a cc id e n ta l de le s io n e s en la M RI co m p a tib le s con M S sin s ín to m a s c lín icos . Esto se con oce com o R IS y p ue de c o n s id e ra rse una e ta pa p rev ia de C IS y R R M S . M ás del 80 % de los p ac ie n te s pad ecen a lguna de e stas e n fe rm e d a d e s y la m a yo ría de los p a c ie n te s d e sa rro lla n p o s te rio rm e n te lo q ue se d e n o m in a S P M S . En este m o m en to , las re ca íd a s /e x a c e rb a c io n e s se vu e lve n m e no s fre cu e n te s o cesan p o r co m p le to y la d is ca p a c id a d n e u ro ló g ica a u m e n ta de m a ne ra con s ta n te , ya sea e n tre re ca íd a s o sin e llas.
[0237] U na fo rm a e sp e c ia l de M S es la P P M S , que nun ca p rese n ta reca ídas , s ino que co m ie n za con un e m p e o ra m ie n to co n s ta n te de los s ín to m a s n eu ro ló g ico s , p o r e je m p lo , de la ca p a c id a d para cam inar. La P P M S a fe c ta a p ro x im a d a m e n te al 10 % de los p a c ie n te s con M S y a h o m b re s y m u je res con la m ism a fre cu e n c ia . Su a p a ric ió n sue le s e r m ás ta rd ía que la del C IS o la R R M S . R esp e c to a las ca u sas y m e ca n ism o s de la e n fe rm e d a d , la P P M S se co n s id e ra s im ila r a la R IS -C IS -R R M S -S P M S m e n c io n a d a a n te rio rm e n te .
[0239] P o r lo g en e ra l, la M S se d ia g n o s tica seg ún los c rite r io s de M cD o n a ld re v isa do s . E s to s c rite r io s ta m b ié n perm ite n d is tin g u ir e n tre las d ife re n te s fo rm a s y a c tiv ida d de la e n fe rm e d a d de la M S (T h o m p so n et al., 2018 , L a n ce t N eu ro l, 17 (2 ):162 -173 ).
[0241] P re fe r ib le m e n te , el e n fo q u e de to le riz a c ió n se a p lica en una e ta pa te m p ra n a , es d e c ir R IS , C IS y R R M S te m p ra n a , ya q ue se su p o n e q ue los p ro ce so s in m u n ita rio s en e s ta e ta pa e s tán m e d ia d o s p rin c ip a lm e n te p o r lin fo c ito s T a u to rre a c tivo s , m ie n tra s que el d añ o tisu la r, los llam ad os ca m b io s d e g e n e ra tivo s , se vu e lve n g ra d u a lm e n te m ás im p o rta n te s cu a n d o la e n fe rm e d a d a va nza . S in e m ba rg o , la to le riza c ió n es s ig n ifica tiva s ie m p re q ue h aya una re sp u e s ta de cé lu la s T a u to rre a c tiva s co n tra los a n tíg e n o s u sa d o s para la to le riza c ió n , lo q ue ta m b ié n p od ría o cu rr ir d u ra n te la S P M S y la P P M S .
[0243] En una re a liza c ió n p a rtic u la rm e n te p re fe rid a , una p ro te ín a G D P -L -fu co s a s in ta sa o R A S G R P 2 o una v a r ia n te de e m p a lm e de la m ism a, p re fe rib lem e n te la p ro te ína G D P -L -fu co sa s in ta sa o R A S G R P 2, se usa en un e n foq ue de to le riza c ió n en una e ta pa tem p ra na , es decir, RIS, C IS y R R M S tem p ra na . La p ro te ína G D P -L -fu co sa s in ta sa tiene, p o r e jem p lo , la secu en c ia com o se e s ta b le ce en S E Q ID NO: 1, la p ro te ína R A S G R P 2 tiene, p o r e jem p lo , la se cu e n c ia com o se e s ta b le ce en S E Q ID NO: 2, S E Q ID NO :<6>, S E Q ID NO: 7, S E Q ID NO:<8>o S E Q ID N o : 9.
[0245] En un a sp e c to de la inve nc ión , se usa al m e no s una p ro te ín a se le cc io n a d a de l g rup o q ue co n s is te en G D P -L -fu co sa s in ta sa y m ie m b ro s de la fa m ilia de p ro te ína s RASG RP, un fra g m e n to (p ép tido ), un d e riva d o y /o una va r ia n te de e m p a lm e de la m ism a, una se cu e n c ia de n u c le ó tid o s q ue co d ifica cu a lq u ie ra de las p ro te ín a s o un fra g m e n to , d e riv a d o o v a r ia n te de e m p a lm e de las m ism a s y /o una se c u e n c ia g é n ica com o se d e s c rib e en el p re se n te d o cu m e n to o al m e no s un p o rta d o r que co m p re n d e al m e no s una p ro te ína , fra g m e n to , d e riva do , v a ria n te de em pa lm e , se cu e n c ia de n u c le ó tid o s y /o se cu e n c ia g én ica com o se d e sc rib e en el p rese n te d o cu m e n to en un m é to d o para in d u c ir to le ra n c ia e sp e c ífica de a n tíg e n o a a u to a n tíg e n o s en un su je to h um a no q ue p ad ece o e stá en rie sgo de d e s a rro lla r M S. El m é to d o co m p re n d e la e ta pa de a p lic a r a un p ac ie n te q ue lo n eces ita , es d e c ir al su je to hum a no , la al m e no s una p ro te ín a s e le cc io n a d a de l g rup o que co n s is te en G D P -L -fu co sa s in ta sa y m ie m b ro s de la fa m ilia de p ro te ína s RASG RP, fra g m e n to (p é p tid o ), d e riva d o y/o va r ia n te de e m p a lm e de la m ism a, una se cu e n c ia de n u c le ó tid o s que co d ifica cu a lq u ie ra de las p ro te ína s o fra g m e n to , d e riva d o o v a r ia n te de e m p a lm e de las m ism a s y /o una se cu e n c ia g é n ica co m o se d e sc rib e en el p rese n te d o cu m e n to o a p lica r al m enos un p o rta do r que co m p re n d e al m enos una p rote ína , fra gm ento , d e rivado , va ria n te de e m p a lm e , se cu e n c ia de n u c le ó tid o s y /o se cu e n c ia g é n ica com o se d e sc rib e en el p re se n te d ocum e n to .
[0246] En una re a liza c ió n , la se cu e n c ia de n u c le ó tid o s o la se cu e n c ia g én ica se a p lica al p ac ien te a tra vé s de un portador, p o r e je m p lo una cé lu la . El a n tíg e n o p uede luego s e r e xp re sa d o p o r un portador, p o r e je m p lo una cé lu la . La tra n s fe re n c ia de A R N /A D N que co d ifica a u to a n tíg e n o a un portador, p o r e jem p lo , una cé lu la , y de e sta m a nera la cod ifica c ió n de los a u to a n tíg e n o s m e n c io n a d o s a n te rio rm e n te ta m b ié n es co n ce b ib le de m anera s im ila r a los e n fo q u e s de v a c u n a c ió n tu m o ra l q ue e m p le a n A R N que cod ifica n a n tíge no s.
[0248] Se p re fie re p a rticu la rm e n te u sa r la p ro te ína co m p le ta de la G D P -L -fu co sa s in ta sa (S E Q ID NO: 1) o la p ro te ína com p le ta de R A S G R P 2 (S E Q ID NO: 2 o S E Q iD NO:<6>, 7,<8>o 9 ) para in d u c ir to le ra n c ia e sp e c ífica al an tígeno . En o tra re a lizac ión p re fe rida , se usa un fra g m e n to de cua lqu ie ra de e stas p ro te ínas. S e p re fie re p a rticu la rm e n te u sa r un fra g m e n to com o se e s ta b le ce en cu a lq u ie ra de las S E Q ID NO s: 10 a 98. A ú n m á s p re fe rid o es un p é p tid o com o se e s ta b le ce en cu a lq u ie ra de las S E Q ID NO s: 10 a 35.
[0250] La al m e n o s una p ro te ína , fra g m e n to , d e riva do , va r ia n te de e m p a lm e , se cu e n c ia de n u c le ó tid o s y /o se cu e n c ia g é n ica se p ue de a p lic a r m e d ia n te a d m in is tra c ió n nasal, inh a lad a , o ra l, s u b cu tá n e a (s .c .), in tra ce ló m ica (i.c .), in tra m u s cu la r (i.m .), in tra d é rm ica (i.d .), tra n s d é rm ica (t.d .) o in tra ve n o sa (i.v.), p re fe rib le m e n te p o r v ía s de a d m in is tra c ió n q ue se c o n s id e ra n to le ro g é n ic a s , p o r e je m p lo , p o r v ía i.v., s.c., i.d., t.d ., o ra l, inh a la d a , n asa l o a co p la d a a un p o rta d o r to le ro g é n ico , p re fe rib le m e n te un RBC.
[0252] En p a rticu la r, el m é to do p ue de u sa rse para in d u c ir to le ra n c ia e sp e c ífica a a u to a n tíg e n o s en e ta p a s te m p ra n a s de la M S o inc lu so en e ta p a s p re c lín ica s de la e n fe rm e d a d .
[0254] El p ro to co lo de to le ra n c ia e sp e c ífica al a n tíg e n o p ro p o rc io n a d o en el p re se n te d o cu m e n to p uede d ir ig irse se le c tiva m e n te ta n to a cé lu las T a u to rre a c tiva s a c tiva d a s co m o a cé lu las T v írg e n e s e sp e c ífica s para m ú ltip les e p íto p o s e n ce fa lito g é n ic o s p o te n c ia le s q ue p e rp e tú an la e n fe rm ed ad .
[0256] El e n fo q u e de to le riz a c ió n ta m b ié n se p ue de u sa r para p re ve n ir la M S. E ste e n fo q u e p uede in c lu ir la id e n tifica c ió n de a q u e llo s in d iv id u o s (p o r e jem p lo , en una fa m ilia con un p ac ien te con M S ) q ue tie n e n un a lto riesgo de d e sa rro lla r MS. P o r e jem p lo , es pos ib le to le riz a r a los h ijos de una m a dre con M S o al g em e lo idén tico de un p ac ie n te con MS, en q u ie n e s el rie sgo de d e s a rro lla r M S se ría p a rticu la rm e n te alto.
[0258] El d ia g n ó s tico de M S o de una de sus fo rm a s se re a liza m e d ia n te la d e m o s tra c ió n de d é fic its n e u ro ló g ico s y /o le s io n e s en M R I co m p a tib le s con M S que e stén d ise m in a d a s en el e sp ac io y el t ie m p o . Las p rue b as de la b o ra to rio p o s itiva s para una re sp u e s ta a u to in m u n ita r ia con tra las nue va s p ro te ín a s d iana G D P -L -fu co sa s in ta sa y la fa m ilia R A S G R P y /o fra g m e n to s , d e riva d o s y /o v a r ia n te s de e m p a lm e de las m ism a s se pueden u sa r para id e n tif ic a r p ac ie n te s p a rticu la rm e n te p ro p e n so s a ben e fic ia rse de la ind u cc ión de to le ra n c ia e sp e c ífica de a n tígeno , es decir, p e rm itir la p e rso n a liza c ió n de e n fo q u e s de to le ra n c ia e sp e c ífica de a n tígeno . A l id e n tif ica r a los p a c ie n te s q ue tie n e n una p ro b a b ilid a d p a rtic u la r de b e n e fic ia rse de la ind u cc ió n de to le ra n c ia e sp e c ífica al a n tíg e n o , se p uede d ia g n o s tic a rin v itroa un pac ien te con M S. En o tras p a labras , los a u to a n tíg e n o s id e n tif ica d o s G D P -L -fu co sa s in ta sa y la fa m ilia R A S G R P (en p a rtic u la r R A S G R P 2 ) y /o fra g m e n to s , y /o d e riv a d o s y /o v a r ia n te s de e m p a lm e de los m ism o s se p u e d e n u sa r en el d ia g n ó s tic oin v itrode M S. D e e sta m a ne ra , e stas p rue b asin v itrop ueden co m p le m e n ta rse con h a lla zg os c lín icos y de im agen , es decir, el d ia g n ó s tico de M<s>seg ún el e s ta d o de la té cn ica , en p a rtic u la r según los c rite r io s de M cD o n a ld rev isados.
[0259] En o tro a sp e c to de la invenc ión , se p ro p o rc io n a un m é to d o p ara id e n tif ic a r un su je to h um a no a de cu ad o para la to le riza c ió n a a u to a n tíg e n o s en MS, p re fe rib le m e n te M S te m p ra n a . De e ste m o do se ide n tifica a un p ac ien te in d iv id u a l que se b e n e fic ia ría o es e le g ib le para el tra ta m ie n to . Este m é to do ta m b ié n se p uede u sa r para d ia g n ó s ticoin v itrode M S. Los p ac ie n te s con C IS , p ro b a b le m e n te ta m b ié n RIS, y R R M s son los m ás a d e cu a d o s p ara la to le riza c ió n , a u n q u e la to le riza c ió n p a re ce s ig n ifica tiva en c u a lq u ie r fo rm a de M S, inc lu ida s la S P M S y la P P M S , s ie m p re que el p ac ien te re sp o n d a al m e no s a uno de los p é p tid os a n tig é n ico s q ue se inc lu ye n en el tra ta m ie n to de to le riza c ió n . Los pasos de este m é to do co m p re n d e n a is la r cé lu la s T, p re fe rib le m e n te c é lu la s T C D 4 , y /o a n ticu e rp o s de sangre , C S F u o tro flu id o c o rp o ra l de l su je to y m e d ir la re ac tiv ida d de las cé lu las T y /o a n ticu e rp o s con tra la p ro te ína o fra g m e n to , d e riva d o o va r ia n te de e m p a lm e de la m ism a según la p re se n te inve nc ión . El e xp e rto en la té c n ica co n oce m é to d o s para a is la r cé lu las T y/o a n ticu e rp o s de san gre , C S F u o tro flu id o co rp o ra l de l su je to y m e d ir la re a c tiv id a d de las cé lu la s T y /o a n ticu e rp o s co n tra la p ro te ína , fra g m e n to , d e riva d o o v a r ia n te de em pa lm e .
[0260] Si un in d iv id u o tie n e una re sp u e s ta co n tra una de las p ro te ín a s o fra g m e n to s , e l/e lla p od ría s e r d ia g n o s tica d oin v itrocon M S y se ría e le g ib le y un buen ca n d id a to para el tra ta m ie n to . Un p aso de se le cc ió n a d ic io n a l pod ría s e r la tip if ic a c ió n de H L A -c la se II y la p re se n c ia de los a le lo s H L A -D R a so c ia d o s a la MS.
[0262] De e s ta m a ne ra , se p ue de n u sa r p ro te ín a s , en p a rtic u la r la p ro te ín a G D P -L -fu co s a s in ta sa o una p ro te ín a de la fa m ilia R A S G R P , en p a rtic u la r R A S G R P 2 , o fra g m e n to s , d e riv a d o s o v a r ia n te s de e m p a lm e de las m ism a s d e riva d a s de a n tíg e n o s re le va n te s para la e n fe rm e d a d , para id e n tif ic a r a a q u e llo s p a c ie n te s o su b g ru p o s de p a c ie n te s con una re sp u e s ta de cé lu las T o de a n ticu e rp o s p ro in fla m a to r ia (p o te n c ia lm e n te d a ñ in a ) e x is te n te y /o p a rticu la rm e n te fu e rte con tra el a u to a n tíg e n o re spe ctivo . A l id e n tif ica r a a q u e llo s p ac ie n te s o su b g ru p o s de p a c ie n te s con una re sp u e s ta de cé lu las T o de a n ticu e rp o s p ro in fla m a to r ia (p o te n c ia lm e n te d a ñ in a ) e x is te n te y /o p a rticu la rm e n te fue rte con tra el a u to a n tíg e n o re spe ctivo , el pac ien te puede de esta m a ne ra se r d ia g n o s tica d oin v itrocon MS.
[0264] En e sta s itu a c ió n , re a liz a r una p rue b a p rev ia al p ac ie n te con una p rue b a a d e cu a d a para e va lu a r la re ac tiv ida d co n tra el a u to a n tíg e n o ta m b ié n p e rm itir ía a d a p ta r el tra ta m ie n to de to le riz a c ió n (p o r e je m p lo , la co m p o s ic ió n de los p é p tid o s /p ro te ín a s u sa d o s p ara la to le r iz a c ió n ) al p a c ie n te in d iv id u a l o al s u b g ru p o de p a c ie n te s con el o b je tivo de h a c e r q ue la to le riza c ió n sea lo m ás e sp e c ífica p o s ib le y ta m b ié n e v ita r p o s ib le s e fe c to s a dve rso s . S in e m b a rg o , la to le riz a c ió n e sp e c ífica de l a n tíg e n o ta m b ié n se p ue de re a liz a r en p a c ie n te s en los q u e no se ha d e m o stra d o una re spu es ta de cé lu la s T al a n tíg e n o to le riza n te . De e sta m a nera , en una re a liza c ió n , la p ro te ína , fra gm e n to , d e riva d o y/o va r ia n te de e m pa lm e según la invenc ión se puede usa r en las p rue b as prev iasin v itroa un su je to h u m a n o d ia g n o s tica d o con M S o a un su je to h u m a n o en riesgo de d e s a rro lla r MS.
[0266] En un a sp e c to de la inve nc ión , se p ro p o rc io n a un portador, que co m p re n d e al m e no s una p ro te ína , fra g m e n to , d e riva d o , va r ia n te de em pa lm e , se cu e n c ia de n u c le ó tid o s y /o se cu e n c ia g én ica com o se d e sc rib e en el p re se n te d o cu m e n to . El p o rta d o r p uede e s ta r a co p la d o a al m e no s una p ro te ína , fra g m e n to , d e riva d o y/o v a r ia n te de e m p a lm e y /o el p o rta d o r p ue de c o n te n e r al m e n o s una p ro te ína , fra g m e n to , d e riva d o , v a r ia n te de e m p a lm e , se cu e n c ia de n u c le ó tid o s y /o se cu e n c ia gén ica . En una re a liza c ió n , el té rm in o "co n tie n e " s ign ifica que la pro te ína , el fra gm e n to , el d e riva do , la va r ia n te de e m pa lm e, la se cu e n c ia de n uc leó tido s y /o la secu en c ia g é n ica está den tro de l p o rta d o r y no en su sup e rfic ie . U na p ro te ína , fra g m e n to , d e riva d o y/o va r ia n te de e m p a lm e ta m b ié n p uede e s ta r a co p la d o y co n te n id o d e n tro de l portador, lo que s ig n ifica q ue una parte de la p ro te ína , fra g m e n to , d e riva d o y /o va r ia n te de e m p a lm e e stá a co p la d a al p o rta d o r y o tra parte de la p ro te ína , fra g m e n to , d e riva d o y /o v a r ia n te de e m p a lm e e stá co n te n id a d en tro de l portador.
[0268] El e xp e rto en la té cn ica está fa m ilia r iza d o con los p os ib les p o rta do re s . P o r e je m p lo , el p o rta d o r p uede se r c u a lq u ie r cé lu la , p ro te ína , líp ido, g lico líp ido , perla , n an o p a rtícu la , p a rtícu la s im ila r a un v iru s (V L P ) o m o lécu la , ta l com o una m o lécu la de azúcar, o cu a lq u ie r co m b in a c ió n de las m ism as q ue sea a de cu ad a para su ap licac ión en se res h u m a n o s y a la q ue la (s ) p ro te ín a (s ) y /o fra g m e n to (s ) se p ue da n a co p la r m e d ia n te un p ro ce d im ie n to de a co p la m ie n to , p o r e je m p lo m e d ia n te un p ro ce d im ie n to de a co p la m ie n to q u ím ico , p re fe rib le m e n te m e d ia n te E D C . El p o rta d o r p uede d e riv a r de uno e x is te n te en la n a tu ra le za o se r s in té tico . P re fe rib le m e n te , la cé lu la , m o lécu la , perla , n a n o p a rtícu la o V LP es b io d e g ra d a b le .in v ivoo al m e no s es a p lica b le a p e rso na s v iva s y d e sco m p o n e rsein v ivoo se e lim in a de l cu e rp o al q ue se a p lica el p o rta do r. E l té rm in o cé lu la ta m b ié n inc lu ye p re cu rso re s ce lu la res , p o r e je m p lo los p re cu rso re s R BC. P re fe rib le m en te , el p o rta d o r es una cé lu la san gu íne a , aún m ás p re fe rib le m e n te un g ló b u lo ro jo o b lanco . El g ló b u lo b la n co p ue de s e r un e sp le n o c ito o una P B M C o, en g en e ra l, una A PC .
[0270] En una re a liza c ió n , la p ro te ína , el fra g m e n to , el d e riva d o y /o la v a r ia n te de e m p a lm e se e xp re sa p o r la cé lu la , p re fe rib le m e n te la cé lu la san gu íne a . De este m odo, la in fo rm ac ión g én ica que cod ifica la p rote ína , el fra g m e n to , el d e riva d o y /o la va r ia n te de e m p a lm e se in tro d u ce en la cé lu la a n tes de que la p ro te ína , el fra g m e n to , el d e riva d o y /o la va r ia n te de e m p a lm e se e xp re se n en la cé lu la .
[0272] Se p u e d e u sa r c u a lq u ie r a g e n te de a co p la m ie n to o m é to d o p ara a c o p la r una p ro te ín a y /o un fra g m e n to de la m ism a a un portador. P o r e je m p lo , se p uede e m p le a r un e n la za n te s in té tico o n a tu ra l para el a co p la m ie n to . Un e je m p lo de d ich o e n la za n te es la g lico fo rin a A, p rese n te en la su p e rfic ie de R BC. En una re a liza c ió n , se rea liza la re ticu lac ión qu ím ica . En una re a lizac ión p refe rida, se usa el re ticu lan te qu ím ico E D C que ca ta liza la fo rm ac ión de e n la ce s p e p tíd ico s e n tre g ru p o s a m ino y ca rb o x ilo lib res. P a rticu la rm e n te en p re se n c ia de ED C, se pueden a co p la r m ú ltip le s p é p tid o s a la s u p e rfic ie de l portador, p e rm itie n d o de e ste m o do la fo ca liza c ió n s im u ltá n e a de m ú ltip le s e sp e c ific id a d e s de c é lu la s T P re fe rib le m e n te , m ás de tre s , m á s de c inco, m ás de 10, m ás de 15 o inc lu so m ás de 20 p é p tid o s d ife re n te s se a co p la n a la su p e rfic ie de l portador. En una re a liza c ió n p re fe rid a , se usan e n tre c inco y 20, p re fe rib le m e n te e n tre c inco y 15 p é p tid o s d ife re n te s . Un p ép tid o es d ife re n te de o tro p é p tid o si no con s ta de la m ism a se cu e n c ia de a m in o á c id o s . El p o rta d o r es p re fe re n te m e n te , pero no n e ce sa ria m e n te , una cé lu la . El E D C se p ue de u sa r para a co p la rse a c u a lq u ie r p o rta d o r s ie m p re q ue haya un g rup o a m in o lib re p resen te .
[0274] En o tra re a liza c ió n , a l m e n o s un p é p tid o de ca d a p ro te ín a se g ú n la p re se n te in ve n c ió n (u na p ro te ín a G D P -L -fu co sa s in ta sa o una p ro te ína de la fa m ilia de p ro te ín a s RASG R P, p re fe rib le m e n te R A S G R P 2 ) se usan en co m b in a c ió n y se a co p la n a un p orta do r. Es p a rticu la rm e n te v e n ta jo so c o m b in a r al m e no s un p é p tid o de cada p ro te ín a seg ún la p re se n te inve n c ió n con al m e no s un p ép tid o c o n o c id o de l e s ta d o de la té cn ica , en p a rticu la r con al m e n o s un p é p tid o de m ie lina , en p a rt ic u la r con al m e n o s u no o to d o s los p é p tid o s de m ie lin a ta l com o se d e fine n p o r las S E Q ID N O s: 261 a<267>.
[0276] En una re a liza c ió n p re fe rida , el p o rta d o r es una cé lu la san gu íne a , y la cé lu la sa n g u ín e a está a co p la d a q u ím ica m e n te m e d ia n te un a ge n te de a co p la m ie n to , p re fe rib le m e n te m e d ia n te ED C, a la al m e no s una p ro te ína , fra g m e n to , d e riva d o y /o va r ia n te de em pa lm e . Tam bién se p ro p o rc io n a un m é to do para fa b ric a r d icha cé lu la s a n g u ín e a q u ím ica m e n te aco p la da , es decir, cé lu la sa n g u ín e a a co p la d a a an tíge no , que co m p re n d e a is la r la cé lu la sa n g u ín e a de un su je to hum ano , a g re g a r la al m e no s una p ro te ína , fra g m e n to , d e riva d o y/o v a r ia n te de e m p a lm e , es decir, el an tíge no , y a g re g a r p o s te rio rm e n te el a ge n te de a co p la m ie n to , p re fe rib le m e n te ED C.
[0278] El m e ca n ism o de acc ión de las cé lu las a co p la d a s al p ép tid o p o r ED C no se e n tie n d e co m p le ta m e n te , pero im p lica la un ión co va le n te de g ru p o s a m ino y ca rbo x i de l p ép tid o y las m o lé cu la s de la su p e rfic ie ce lu lar, la p o s te rio r m u e rte c e lu la r p ro g ra m a d a (a p o p to s is en el caso de cé lu la s nuc lea da s ; e rip to s is en el caso de R B C ) de las cé lu las a co p la d a s al péptido, es decir, cé lu las a co p la da s al an tígeno , y luego la p rese n ta c ió n to le ro g é n ica de las cé lu la s m o rib u n d a s in v ivo .
[0280] La d os is de E D C u sa da p ara la re acc ión de a co p la m ie n to se p ue de a ju s ta r para o b te n e r la m á x im a seg u rida d con la m e jo r e fica c ia . En a lta s c o n ce n tra c io n e s , el E D C p ue de p ro v o ca r la lis is de las cé lu las , en p a rtic u la r de R B C . Para una e s ta b ilid a d ó p tim a de RBC, se puede u sa r una co n ce n tra c ió n fina l de ED C de m e no s de 15 m g /m l, p re fe rib le m e n te m e no s de 10 m g/m l, inc lu so m ás p re fe rib le m e n te m e no s de 5 m g/m l, inc lu so m ás p re fe rib le m e n te de a p ro x im a d a m e n te 3 m g/m l. La d os is ó p tim a ta m b ié n p ue de va ria r. El e xp e rto en la té cn ica sab e cóm o d e te rm in a r la e s ta b ilid a d ó p tim a de R B C y la d os is ó p tim a de EDC.
[0282] La p ro te ína , fra g m e n to , d e riva d o y/o va r ia n te de e m p a lm e a a co p la r se p uede a g re g a r en una can tida d que será fá c ilm e n te d e te rm in a d a p o r el e xp e rto en la té cn ica . La perso na ca p a c ita d a co n oce las m e d id as para d e te rm in a r la can tid a d ó p tim a en la in te ra cc ió n con una can tida d ó p tim a de EDC.
[0284] El t ie m p o de incu ba c ió n se p uede v a r ia r y a d a p ta r para cada re acc ión de a co p la m ie n to e sp e c ífica (p o r e jem p lo , 15 m in, 30 m in, 45 m in , 60 m in , 120 m in). La e fic ie n c ia de l a co p la m ie n to p uede s e r m e jo r con un tie m p o de incu b a c ió n m ás largo. En una re a liza c ió n , se a lca n za un m á x im o d e sp u é s de 60 m in.
[0286] La te m p e ra tu ra de in cu b a c ió n ta m b ié n p ue de varia r. P o r e je m p lo , se p u e d e n u sa r 15-25 °C o 2 -8 °C. En una re a liza c ió n , la e fic ie n c ia de a co p la m ie n to fue m a yo r cu a n d o la re acc ión de a co p la m ie n to se re a lizó a 15-25 °C.
[0287] Se pod rá u sa r c u a lq u ie r e xc ip ie n te q ue p e rm ita la re a cc ió n de a co p la m ie n to . En una re a liza c ió n , el e xc ip ie n te es e s té ril y lib re de e nd o to x in a s . En una re a liza c ió n p re fe rid a , el e xc ip ie n te es so lu c ió n sa lin a e s té ril libre de e n d o to x in a s (N a C l al 0.9 % ). La so lu c ió n sa lina está a p ro b a d a para su uso en h um a no s y p ro p o rc io n a la m á x im a seg u rida d .
[0289] El e xp e rto en la té c n ica sab e d e te rm in a r el tie m p o y la te m p e ra tu ra de incu ba c ió n ó p tim o s y d e te rm in a r los p o s ib le s e xc ip ie n te s .
[0291] En un a sp e c to de la inve nc ión , se p ro p o rc io n a una co m p o s ic ió n fa rm a cé u tica que co m p re n d e al m enos una p ro te ína , fra g m e n to , d e riva do , v a r ia n te de e m p a lm e , s e cu e n c ia de n u c le ó tid o s y /o se cu e n c ia g é n ica com o se d e sc rib e en el p re se n te d o cu m e n to y un p o rta d o r fa rm a c é u tic a m e n te ace p ta b le .
[0293] En o tro a sp e c to de la inve nc ión , se p ro p o rc io n a un m é to d o p ara el t ra ta m ie n to te ra p é u tico , la p re ve n c ió n o el d ia g n ó s tico de M S en un su je to h um a no que co m p re n d e a d m in is tra r a d icho su je to una can tida d te ra p é u tica m e n te e fica z de la p ro te ína , fra g m e n to , d e riva do , va r ia n te de em pa lm e , se cu e n c ia de n u c le ó tid o s y /o se cu e n c ia g én ica co m o se d e sc rib e en el p rese n te d o cu m e n to y /o el p o rta d o r com o se d e sc rib e en el p rese n te d ocum e n to . De e sta m anera , el p o rta d o r que co m p re n d e al m e no s una pro te ína , fra gm e n to , de rivado , va r ia n te de e m pa lm e, secu en c ia de n uc leó tido s y /o secu en c ia g én ica según la p rese n te invenc ión , en p a rticu la r el p o rta d o r a co p la do a al m enos una p ro te ína , fra g m e n to , d e riva d o y /o va r ia n te de e m p a lm e según la invención , y /o el p o rta d o r q ue c o n tie n e al m e n o s una p ro te ína , fra g m e n to , d e riva d o , v a r ia n te de e m p a lm e , se cu e n c ia de n u c le ó tid o s y /o secu en c ia g én ica según la inve nc ión p uede usa rse en el tra ta m ie n to , d ia g nó stico y /o p revenc ión de la MS.
[0295] C o m o a sp e c to a d ic io n a l, los m o tivo s p e p tíd ico s de la F ig u ra 3 (ii) E (S E Q ID NO: 99), los p é p tid o s de la G D P -L -fu co sa s in ta sa com o se m u e s tra en la F ig ura 5 (S E Q ID N O s: 199 -215 ), los p é p tid o s de la G D P -L -fu co sa s in ta sa de la ta b la de la F igura<6>(I y II) (S E Q ID N O s: 10-14 , 19-20, 22 -23 , 25 -32 y 216 -290 ) y los p ép tid os R A S G R P 1 , R A S G R P 2 y R A S G R P 3 de la ta b la de la F ig u ra 12 (S E Q ID N O s: 291 -309 ) son to d o s o b je to de la p re se n te inve n c ió n y p ue de n u sa rse según la p re se n te inve nc ión .
[0297] Ejemplos
[0299] E sp e c ific id a d de la G D P -L -fu co s a s in ta sa
[0300] 1. C a ra c te riza c ió n de TC C 21.1
[0302] El e n fo q u e de id e n tifica c ió n de a n tíg e n o s d iana im p arc ia l u sa nd o las b ib lio te ca s co m b in a to r ia s s in té tica s de e sca n e o p o s ic io n a l (p s -S C L ) se m u e s tra e sq u e m á tic a m e n te en la Fig. 2. El c lon T C C 21.1 ha s ido id e n tifica d o com o se d e sc rib e en P lanas e t al. (2015 ). T C C 21.1 es un T C C C D 4 a is la do de cé lu las in filtra d a s en C S F y e xp a n d id o c lo n a lm e n te en d os les io ne s de M S d e sm ie lin iza n te s de su s ta n c ia b la n ca a c tiva (LI y L III) de un p a c ie n te con S P M S (1154 S A ) con d e sm ie lin iza c ió n de patrón II. T C C 21.1 libe ra c ito c in a s T h2 y ayu da a la p ro life ra c ió n y p rod u cc ión de a n ticu e rp o s p o r parte de cé lu la s B a u tó lo g a s tra s una a c tivac ión ine spe c ífica . Con el fin de e s tu d ia r los p é p tid o s re co n o c id o s p o r e ste T C C de e sp e c ific id a d d e sco n o c id a u sando una b ib lio te ca de e sca n e o p o s ic io n a l de d e ca p é p tid o s , en p rim e r lu g a r se ide n tificó la m o lé cu la H L A de c lase II usada p o r T C C 21.1 para re c o n o c e r las m e zc la s de p ép tidos . E s te es un re q u is ito p rev io para u sa r el e n fo q u e de a ná lis is b io m é tr ico /b ib lio te ca de p é p tid o s para la id e n tifica c ió n im p arc ia l de a n tíg e n o s d iana (Z ha o e t al., 2001, J Im m u no l, 167 :2130 -2141 ; S o sp e d ra e t al., 2010 , J Im m u n o l M e th od s , 353 (1 -2 ):93 -101 ). D ad o q ue el p ac ie n te 1154S A era h o m o c ig o to para el h a p lo tip o D R15, TC C 21.1 se p robó in ic ia lm e n te con las m e zc la s con a m in o á c id o s (A A ) d e fin id o s en la p os ic ión 5, p re se n ta d a s p o r cé lu la s de la línea de cé lu la s B (B C L ) del s ín d ro m e del lin foc ito d e sn u d o in m o rta liza d o p o r E B V (B L S ) tra n s fe c ta d a s con d ife re n te s m o lécu la s H LA D R /D Q a u tó lo g a s in d iv id u a le s (D R A *01 :01 /D R B 5 *01 :01 = D R2a, D R A *01 :01 /D R B 1 *15 :01 = D R 2b y D Q A 1 *01 :02 /D Q B 1 *06 :02 ). C om o lec tu ra de la a c tivac ión de las cé lu las T se usó la p rod u cc ión de G M -C SF, ya q ue T C C 21.1 libe ra esta c ito c in a d e sp u é s de una e s tim u la c ió n no e sp e c ífica con a n ti-C D 3 y P M A (P la n a s et al., 2015). S ó lo las m e zc la s p re se n ta d a s p o r B C L que e xp re sa n m o lé cu la s de c lase II D R B 1*15 :01 (D R 2 b ) fue ro n e s tim u la d o re s (d a to s no m o strad os).
[0304] 2. B ib lio te ca c o m b in a to r ia s in té tica de e sca n e o p o s ic io n a l co m o m é to d o para id e n tif ic a r a n tíg e n o sIid e n tif ica r de la G D P -L -fu co sa s in ta sa
[0306] L ue go se p rob ó T C C 21.1 con la b ib lio te ca co m p le ta de e sca n e o p o s ic io n a l de d e ca p é p tid o s (200 m e zc la s ; es dec ir, m e zc la s q ue re p re se n ta n las<10>p os ic io ne s de un<10>-m e r y en cada una de las p os ic io n e s fijas uno de los 20 L -a m in o á c id o s ), p re se n ta d a p or B C L q ue e xp re sa m o lécu la s de c lase II D R B 1 *15 :01. La libe ra c ión de G M -C S F en re spu es ta a la b ib lio te ca com p le ta se m u e s tra en la Fig. 3A. Se o b tuvo un patrón de re spu es ta s im ila r con la libe ra c ión de IL-10. A con tin u a c ió n , se g en e ró una m a triz de p un tu ac ió n de a ná lis is b io m é trico a s ig n a n d o va lo re s n u m é rico s al p o ten c ia l e s tim u la to r io de cad a uno de los 20 A A d e fin id o s en cada una de las d iez p o s ic io n e s de la b ib lio te ca de d e c a p é p tid o s com o se d e s c rib ió p re v ia m e n te (Z h a o e t al., 2001 ). A qu í, los va lo re s se ca lcu la ro n com o el log a ritm o en base 10 de la sec re c ió n m e d ia de G M -C S F (p g /m l) de tres e xp e rim e n to s in d e p e n d ie n te s en p re se n c ia de m e zc la s , m e no s la se c re c ió n en a u se n c ia de m e zc la s (F ig . 3B). B a sa d o en un m o d e lo de co n trib u c ió n in d e p e n d ie n te de A A in d iv id u a le s al re co n o c im ie n to de a n tíg e n o s pep tíd ico s , la p u n tu a c ió n e s tim u la to r ia p rev is ta de un p ép tid o dado es la sum a de los v a lo re s de la m a triz de cad a A A co n te n id o en el p ép tid o en cada p o s ic ió n (Z h a o e t al., 2001). Este e n fo q u e de p un tu ac ió n se a p licó para c las ifica r, según su pun ta je e s tim u la to r io que p red ice su p o ten c ia e s tim u la to ria , to d o s los p ép tid os n a tu ra le s su p e rp u e s to s de<10>-m e r de las se cu e n c ia s de p ro te ín a s den tro de la base de d a tos de p ro te ína s h u m a n a s U n iP ro t. C on b ase en e s to s va lo re s p rev is tos , se s in te tiza ro n y a n a liza ro n los 50 p é p tid o s n a tu ra le s h u m a n o s p re v is to s con las p u n tu a c io n e s m ás a lta s a 5 p g /m l (F ig . 4). In e sp e ra d a m e n te , n in g un o de los p é p tid o s fu e c la ra m e n te e s tim u la d o r (F ig . 3C ). La ca p a c id a d p re d ic tiva de l e n fo q u e a n te rio r, que co m b in a una b ib lio te ca de e sca n e o p os ic io n a l y un a n á lis is b io m é trico , fue m e n o r para e ste T C C q ue para o tro s en e s tu d io s a n te rio res . Las m e zc la s m á s e s tim u la d o ra s , com o se m u e s tra en la Fig. 3B, tie n e n A A d e fin id o s idé n tico s en p o s ic io n e s co n se cu tiva s , lo q ue su g ie re un p os ib le re co n o c im ie n to de un m o tivo A A en m ú ltip le s m arcos. Para p o d e r a n a liza r los da tos u sa nd o el e n fo q u e d e sc rito en la Fig. 2, se d iseñó , s in te tizó y p robó un co n ju n to de 22 m e zc la s de d e fin ic ió n dua l (es decir, m e zc la s de e sc a n e o p os ic io na l con dos p o s ic io n e s d e fin id a s ) (F ig . 3D); los re su ltad o s co n firm a ro n la p re se n c ia de un m o tivo de re co n o c im ie n to ún ico (LH S X F E V , S E Q ID NO: 99) con d ife re n te s re s id u o s f la n q u e a n te s (F ig . 3E). P ara a p lic a r e ste m o tivo de re co n o c im ie n to en los d os m a rco s a la m a triz d e riva d a de G M -C S F orig ina l y re a liza r un a ná lis is b iom é trico , se usó el m o de lo de m e d ia a rm ó n ica (H M ) p ara in te g ra r las re sp u e s ta s e s tim u la to r ia s de a lg u n a s de las m e zc la s d ua les d e fin id a s (F ig . 3D, m e zc la s de m a rco 1 /2 -H M ) en la m a triz o rig ina l. U sa nd o las nue va s m a trices de m arco 1 y m arco 2 de "re fu e rzo a rm ón ico", to d o s los p é p tid o s su p e rp u e s to s n a tu ra le s de<10>-m e r d e riva d o s de la base de d a to s de p ro te ín a s h um a na s U n iP ro t se ca lifica ron y c las ifica ro n com o se m u es tra e sq u e m á tica m e n te en la Fig. 2. Los 50 p ép tid os n a tu ra les p re v is to s con las p u n tu a c io n e s m ás a lta s para a m b a s m a trice s se s in te tiza ro n y p rob a ron para la libe ra c ión de G M -C S F (F ig . 4). E s tas dos m a trice s p e rm itie ro n la id e n tifica c ió n de tre s p é p tid os c la ra m e n te e s tim u la d o re s (F ig . 3F). Los dos p é p tid os m ás e s tim u la d o re s , N V L H S A F E V G (S E Q ID NO: 16) p red icho con el m arco de re fu e rzo a rm ó n ico 1 y D N V L H S A F E V (S E Q ID NO: 15) p red icho s con el m a rco de re fue rzo a rm ó n ico 2, p e rte n e ce n a la G D P -L -fu co sa s in ta sa co d ifica d a p o r el gen T S T A 3 y se su p e rp o n e n en 9 AA.
[0308] En deta lle , la F igura 3 m u es tra : A. P ro du cc ió n de G M -C S F p or TC C 21.1 en re spu es ta a una b ib lio teca com p le ta de e sca n e o p os ic io n a l de d e ca p é p tid o s (200 m e zc la s ) p re se n ta d a p o r cé lu las BLS que e xp re sa n solo D R B 1 *15 :01. B. M a triz de p un tu ac ió n d ise ñ a d a con la m e d ia n a log10 de la p rod u cc ión de G M -C S F de tre s e xp e rim e n to s in d e p e n d ie n te s . Los b ordes en n eg rita m u es tra n m e zc la s se le cc io n a d a s para m e zc la s de d e fin ic ió n dua l. C. P ro d u cc ió n de G M -C S F p o r T C C 21.1 en re sp u e s ta a los 50 p é p tid o s con las p u n tu a c io n e s m á s a lta s p re d ich a s u sando la m a triz de p u n tu a c ió n b asada en G M -C S F. D. P ro du cc ió n de G M -C S F p o r T C C 21.1 en re sp u e s ta a 22 m e zc la s de d e fin ic ió n dua l. En gris, m e zc la s con A A d e fin id a s de l m o tivo T C R en el m arco 1 y en n eg ro en el m a rco 2. Las re sp u e s ta s e s tim u la to r ia s de las m e zc la s en n e g rita (M a rco 1 /2 -H M ) se in te g ra ro n en la m a triz o rig in a l u sa n d o el m o de lo de m e d ia a rm ó n ica . M o tivo E. T C R y va lo re s de ac tiv ida d de m e zc la d e fin id a dua l se le cc io n a d o s en base al m o de lo de m e d ia a rm ó n ica e in co rp o ra d o s en la m atriz o rig in a l, M a rco 1-H M en g ris y M a rco 2 -H M en neg ro . F. P ro d u cc ió n de G M -C S F p o r T C C 21.1 en re sp u e s ta a los 50 p é p tid os con p u n tu a c io n e s m ás a ltas p re d ich a s u sa nd o m a trice s de p un tu ac ió n de m a rco 1 y<2>de re fu e rzo a rm ó n ico . Las cé lu las BLS que e xp re sa n D R B 1*15 :01 p rese n ta ron una b ib lio te ca com p le ta de d e ca p é p tid o s , m e zc la s d e fin id a s d u a le s y d e ca p é p tid o s ind iv idu a le s . Las m e zc la s se p rob a ron a 200 p g /m l y los d e ca p é p tid o s ind iv idu a le s a 5 pg/m l. Los h is to g ra m a s m ues tran la m e d ia ± e rro r e s tá n d a r de la m e d ia (S E M ) y los g rá fico s de p u n to s de la m e d ia de tre s e xp e rim e n to s in d e p e n d ie n te s . La c ito c in a libe ra da s ie m p re se e xp re sa com o pg/m l libe ra do s p or T C C 21.1 en re spu es ta a e s tím u lo s m e no s pg/m l libe ra do s en a use n c ia de e s tím u lo s (co n tro l nega tivo ).
[0310] La figu ra 4 m u es tra un su m a rio de los d e ca p é p tid o s h um a n o s p red icho s con el e n fo q u e b io m é trico , que se han s in te tiza d o y luego p rob a do para d e te rm in a r su cap ac id ad e s tim u la to r ia a 5 m g /m l en base a la libe ra c ión de G M -C S F. Los p é p tid o s e stán c la s if ica d o s d e sd e 1 a 50 para m a rcos 1 y 2 de re fue rzo HM, re sp e c tiva m e n te .
[0312] 3. D a tos de R N A S e q /tra n sc rip to m a y p ro te o m a que d e m u e s tra n la e xp re s ió n de G D P -L -fu co s a -s in ta s a en el te jid o ce re b ra l
[0314] El n ive l de tra n sc rip c ió n , e xp re sa d o com o " le c tu ra s p o r kilo b ase del m o de lo de exón p o r m illón de lec tu ras m a p e a d a s" (R P K M ), de la G D P -L -fu co sa s in ta sa en el ce reb ro a u tó lo g o LI y LIII se m u es tra en la Fig. 5. Tam b ién se m u e s tra n los va lo re s de tra n s c rip c ió n de o tros g en es e sp e c ífico s de l ce re b ro com o con tro l de ca lid a d de las m u e s tra s y com o re fe re n c ia p ara los g e n e s e xp re sa d o s en n ive le s a lto s (M BP, P L P 1 ) y m e d io s (g lico p ro te ín a a so c ia d a a la m ie lina (M A G ), p ro te ína b ás ica de o lig o d e n d ro c ito s a so c ia d a a la m ie lina (M O B P ) y g lico p ro te ín a de m ie lina de o lig o d e n d ro c ito s (O M G )).
[0316] Se ide n tifica ron d ie c is ie te p é p tid o s de G D P -L -fu co sa s in ta sa en el te jid o ce reb ra l de la m a te ria b la n ca y g ris de o tros p ac ie n te s con M S y co n tro le s sin M S m e d ia n te a ná lis is p ro te óm ico . Las se cu e n c ia s de p é p tid o s se e n u m e ra n en la Fig. 5, a s í com o las c o in c id e n c ia s de l e sp e c tro de p é p tid o s (P S M ) en las d ife re n te s m u es tra s . El p o rce n ta je de la se cu e n c ia A A de la G D P -L -fu co s a s in ta sa cu b ie rta p o r p é p tid o s id e n tif ica d o s fue de 56 %. La p os ic ió n se re fie re a la se cu e n c ia de U n iP ro tK B /S w iss -P ro t: Q 13630.1. Tam bién se inc lu ye el a n á lis is de o tras p ro te ína s e sp e c ífica s de l ce re b ro com o re fe re n c ia (F ig . 5).
[0318] En re sum e n , se ha d e m o s tra d o q ue la G D P -L -fu co s a -s in ta s a se e xp re sa en el ce re b ro (A R N y p ro te ína ).
[0319] 4. La G D P -L -fu co sa s in ta sa co m o p rinc ip a l a u to a n tíg e n o p ara un T C C in filtra n te en el ce reb ro
[0321] P ara id e n tif ic a r los a u to a n tíg e n o s re co n o c id o s p or T C C 21.1 en las dos les io ne s ce re b ra le s au tó lo ga s , d en tro de las cua les se sab ía q ue T C C 21.1 e s ta b a e xp a n d id o c lo n a lm e n te (LI y III (P la n a s e t al., 2015 )), las m a trices de m a rco<1>y m a rco<2>de re fu e rzo a rm ó n ico se usa ron para p u n tu a r y c las ifica r, de a cu e rd o con su pun tu ac ió n e s tim u la to r ia , to d o s los p é p tid o s s u p e rp u e s to s n a tu ra le s de<10>-m e r en las s e c u e n c ia s de p ro te ín a s d e n tro de una su b b a se de d a tos de p ro te ín a s ce re b ra le s c re a d a con d a tos de l tra n s c rip to m a b a sad os en R N A S e q de e s ta s d os le s io n e s (G S E 60943 ). De los 40 p é p tid o s c e re b ra le s n a tu ra le s p re v is to s con las p u n tu a c io n e s m ás a ltas para la m a tr iz de l m arco 1, 38 p ép tid os ya se hab ían p rev is to a p a rtir de la base de datos hum a na im parcia l de U n iP ro t. P ara la m a tr iz de l m a rco 2, los 40 p é p tid o s p rin c ip a le s se p red ije ron p re v ia m e n te (F ig . 4). Se s in te tiza ro n y p rob a ron los dos nue vo s p ép tid os para el m arco 1. S e d e scu b rió que N V L H S A F E V G (G D P -L -fu co sa s in ta sa 96 -105 , S E Q ID NO : 16) y D N V L H S A F E V (95 -104 , S E Q ID NO : 15) e s tim u la b a n T C C 21.1 (F ig.
[0322] 4).
[0324] 5. C a ra c te riza c ió n de l re co n o c im ie n to de la G D P -L -fu co sa s in ta sa / ca ra c te r iza c ió n de la re spu es ta
[0326] C o m o se m e n c io n ó a n te r io rm e n te , los d os p é p tid o s de la G D P -L -fu co s a s in ta sa re co n o c id o s p o r T C C 21.1 se su p e rp o n e n en 9 A A . En las cé lu la s B C L q ue e xp re sa n D R B 1*15 :01 se s in te tiza ron y p rob a ron n ueve p ép tid os de 10 -m er a d ic io n a le s su p e rp u e s to s p o r 9 A A y se iden tificó un pép tid o ad ic iona l, V L H S A F E V G A (97-106 , S E Q ID NO : 18), q ue indu jo la libe ra c ión de G M -C S F. El p ép tido N V L H S A F E V G (96 -105 , S E Q ID NO: 16) d io la re sp u e s ta ó p tim a con una E C 50 de 0.2 p g /m l y fue p re se n ta d a p o r las m o lé cu la s D R B 1 *15 :01 y D Q B 1 *06 :02. LosA Aco m u n e s de los tre s p é p tid o s e s tim u la d o re s son V L H S A F E V (97 -104 ) (d a to s no m o strad os).
[0328] A con tinu ac ión , se ca rac te rizó la re spu es ta de TC C 21.1 a los p é p tid os de la G D P -L -fu co sa s in ta sa p rese n ta do s p o r P B M C y B C L irra d ia d o s au tó lo go s . Los p é p tid o s de la G D P -L -fu co sa s in ta sa p re se n ta d o s p o r los d os tipo s de A P C fu e ro n c a p a ce s de in d u c ir la p ro life ra c ió n . Tam b ién se a n a lizó el fe n o tip o fu n c io n a l de e sta re spu es ta . T C C 21.1 m o stró un fe n o tip o Th2, lib e ra n d o p rin c ip a lm e n te c ito c in a s T h2 y n ive les m ás b a jos de IL-22 e IL-10. In e sp e ra d a m e n te , cu a n d o los p é p tid o s fue ro n p re se n ta d o s p o r B C L au tó lo go , ind u je ro n n ive les m ás a ltos de IF N<y>. A d e m á s, T C C 21.1 ta m b ié n liberó G M -C S F e IL-3 en respuesta a los pép tidos de la G D P -L -fu co sa s in tasa . La libe ra c ión de e s ta s d os c ito c in a s p arece se r una ca ra c te rís tica e sp e c ífica de e ste T C C en co m p a ra c ió n con o tros T C C Th1, T h 1 * o T h 1 /2 q ue se g e n e ra ro n a p a rtir de p a c ie n te s con d ife re n te s a fe cc io n e s . La tin c ió n de c ito c in a s in tra ce lu la re s co n firm ó el fe n o tip o fu n c io n a l T h 2 de TC C 21.1 en re spu es ta a la G D P -L -fu co sa s in ta sa (96 -105 , S E Q ID NO : 16). M á s de l 60 % de las cé lu la s T C C 21.1 fu e ro n IL-4+ d e sp u é s de la e s tim u la c ió n con G D P -L -fu co sa s in ta sa (96 -105 , S E Q ID NO: 16), m ie n tra s q ue só lo a lre d e d o r de l 12% e ranIF N y . A lre d e d o r de l 60 % de las cé lu la s e ran G M -C S F y el 47.7 % de é s ta s ta m b ié n IL-4+. U na c a ra c te riza c ió n a d ic io n a l de T C C 21.1 d e m o stró la e xp re s ió n de C D 28 y de l re c e p to r de q u im io c in a C R T h 2 (d a to s no m o strad os).
[0330] <6>. R e co n o c im ie n to de la G D P -L -fu co sa s in ta sa p o r cé lu las T C D 4 in filtra d a s en C S F del p a c ie n te 1154S A
[0331] Se s in te tiza ro n se se n ta y d os p é p tid o s de 15 -m er su p e rp u e s to s p o r 10 A A y q ue cu b re n to d a la p ro te ína G D P -L -fu co sa s in ta sa (F ig u ra<6>) y se p rob a ron para d e te rm in a r su ca p a c id a d de in d u c ir la p ro life ra c ió n de TC C 21.1 cu a n d o son p re se n ta d o s p o r P B M C au tó lo ga s . Se p rob a ron en p ara le lo s ie te p é p tid os de m ie lina in m u n o d o m in a n te s /e n c e fa lito g é n ic o s (B ie le ko va e t al., 2004), una m e zc la de p é p tid o s C E F (c ito m e g a lo v iru s , EBV, v iru s de la in flu e n za y to x o id e te tá n ic o ) y p erlas de con tro l (F ig u ra<6>). T C C 21.1 re co n o c ió dos p ép tid os s u p e rp u e s to s de G D P -L -fu co sa s in tasa , 91 -105 (S E Q ID NO : 14) y 96 -110 (S E Q ID NO: 17), q ue c o n tie n e los tre s d e ca p é p tid o s e s tim u la d o re s (95 -104 (S E Q ID NO: 15), 96 -105 (S E Q ID NO: 16) y 97 -106 (S E Q ID NO: 18)) q ue fu e ro n id e n tifica d o s p rev ia m en te .
[0333] 7. R e co n o c im ie n to de la G D P -L -fu co sa s in ta sa p or cé lu las T C D 4+ in filtra da s en C S F de p ac ien tes con C IS /M S
[0334] P ara d e te rm in a r si se p rod u ce un re co n o c im ie n to e sp e c ífico de la G D P -L -fu co sa s in ta sa en las cé lu las T C D 4+ in filtra d a s en el C S F en p a c ie n te s con d ife re n te s fo rm a s de M S (la m a yo ría C IS y R R M S ), se d e sa rro lló un nuevo p ro to co lo para e xp a n d ir las cé lu las T C D 4 in filtra da s en el C S F a g ran d es ca n tid a d e s en una so la ronda para m in im iza r las v a r ia c io n e s en el re pe rto rio o rig in a l de cé lu las T Se a na liza ro n p o r cu a d ru p lica d o las cé lu las T C D 4+ in filtradas en C S F e xp an d id as con P H A en reposo, cé lu las T que tam b ién se derivan del com p artim en to del C N S , de 31 p ac ien tes con C IS /M S con los 62 p é p tid os su p e rp u e s to s de G D P -L -fu co sa s in ta sa p rese n ta do s p o r P B M C irra d ia d a s au tó lo ga s , a sí co m o con los s ie te p ép tid os de m ie lina , la m e zc la de p ép tid os C E F y las perlas de con tro l. S e a g ru p a ro n to d o s los índ ices de es tim u lac ión (Sl; e xce p to las perlas de con tro l) y los va lo re s de SI m e no re s a uno se tra ta ro n co m o si tu v ie ra n un v a lo r un itario . Se rea lizó un a ná lis is de k -m e d ia s del g rupo para d e te rm in a r el pun to de co rte ó p tim o para d ife re n c ia r los va lo re s de SI con re sp u e s ta de los que no la tie n e n en e sta p ob lac ión de p ac ien tes . La a g ru p a c ió n m e d ia n te K -m e d ia a rro jó un v a lo r de co rte de 1.455 para d ife re n c ia r las re sp u e s ta s p os itiva s de las neg a tivas . P os te rio rm e n te , para cad a p ac ien te , to d o s los p ép tid os q ue te n ía n una SI m e d ia na (de los p oc illos cu a d ru p lica d o s ) m a yo r a 1.455 se ide n tifica ron com o re sp u e s ta s p os itivas.
[0336] A co n tin u a c ió n , se co n s tru ye ro n las p u n tu a c io n e s de los p ac ie n te s ca lcu la n d o la sum a de la m e d ia n a SI de cada p ép tid o re spo ns ivo , p o n d e ra d a p o r el n úm e ro to ta l de p ac ie n te s que re sp o n d ie ro n a ese pép tido . De esta fo rm a , se tu v ie ro n en cu e n ta ta n to los p rop ios va lo re s de SI para cada pép tido , com o la in m u n o g e n ic id a d re la tiva de cad a pép tido , para e va lu a r la fre cu e n c ia y la fu e rza de la re sp u e s ta inm un ita ria con tra los a n tíge no s e sp e c ífico s . S e re a lizó un a n á lis is k -m e d ia de tre s g ru p o s sob re la base de 10 p u n tu a c io n e s de p a c ie n te s y se a g ru p ó c la ra m e n te a los p ac ie n te s en tre s ca te g o ría s : "no re sp o n d e d o re s ", "re sp o n d e d o re s m o d e ra d o s" y "re s p o n d e d o re s a ltos". P o r lo tan to , d ie c in u e ve p ac ie n te s (61.3 % ) fu e ro n c a ra c te r iza d o s com o no re s p o n d e d o re s a la G D P -L -fu co sa s in tasa , se is (19.35 % ) com o re s p o n d e d o re s m o d e ra d o s y se is (19.35 % ) com o re sp o n d e d o re s a ltos (d a to s no m o s tra d o s ). No se e n co n tra ro n d ife re n c ia s s ig n ifica tiva s e n tre los tre s g rup o s para las re spu es tas C E F o para los con tro le s p os itivo s o nega tivos . Los p é p tid os in m u n o d o m in a n te s se d e fin ie ro n co m o p é p tid o s c a p a ce s de in d u c ir re s p u e s ta s p o s itiva s en al m e n o s el 10 % de los p a c ie n te s . Los 14 p é p tid o s G D P -L -fu co s a que cu m p le n e s te c rite r io se m u e s tra n en la F igura 7. El a n á lis is fu n c io n a l de las re sp u e s ta s m ás fu e rte s a a lg u n o s p ép tid os in m u n o d o m in a n te s re ve ló un fe n o tip o Th1 con p rod u cc ión p rin c ip a lm e n te de IFN -<y>(d a to s no m o strad os).
[0338] En d e ta lle , la F ig u ra 7 m u es tra : N ú m e ro de p a c ie n te s con C IS /M S con cé lu la s T C D 4 in filtra d a s en C S F que re sp o n d ie ro n a los p ép tid os de la G D P -L -fu co sa s in tasa . Los p é p tid o s in m u n o d o m in a n te s que fu e ro n pos itivo s en al m e no s tre s p ac ie n te s se m ues tran en negro . Los cu a d ra d o s n e g ro s re p rese n tan p ac ie n te s con re spu es ta a lta y los c u a d ra d o s b la n co s re p re se n ta n p a c ie n te s con re sp u e s ta m o de ra da .
[0340] En co n c lu s ió n , a lre d e d o r de l 20 -25 % de los p a c ie n te s con M S (C IS , R R M S , S P M S ) m u e s tra n u na re sp u e s ta in m u n ita ria a d ife re n te s p é p tid o s in m u n o d o m in a n te s de la G D P -L -fu co s a s in ta sa ; la m a yo ría de e s ta s cé lu la s T e sp ec ífica s de la G D P -L -fu co sa s in ta sa tie n e n un fe n o tip o Th1 (fe no tip o m ás fre cu e n te en p ac ien tes con MS). U na co m p a ra c ió n con la re acc ión a 7 p é p tid o s de m ie lina (p é p tid o s E T IM S ) m u e s tra que s ig n ifica tiva m e n te m e no s p a c ie n te s re a cc io n a n a e s to s p é p tid o s en co m p a ra c ió n con la G D P -L -fu co sa s in tasa .
[0342] E sp e c ific id a d de R A S G R P 2
[0344] <8>. Ide n tifica c ió n de T C C 14 y p rue b a de p s -S C L con T C C 14 para id e n tif ica r R A S G R P 2
[0346] El T C C 14 se id e n tif icó con un e n fo q u e a n á lo g o a p a rtir de l p a c ie n te con M S 1 (h o m o c ig o to p ara H LA -D R 15 ), sin e m b a rg o , en e ste caso a p a rtir de la fra cc ió n de cé lu las T de sa n g re p e rifé rica a u to p ro life ra tiva s (p ro life ra c ió n sin e s tim u la c ió n ), que e stá e n riq u e c id a con cé lu las T que m ig ran al ce reb ro . La secu e n c ia c ió n p ro fu n d a del T C R de las cé lu la s q ue se in filtra n en las le s io n e s c e re b ra le s de l p ac ie n te ta m b ié n d e m o s tró que el T C C 14 se e xp a n d e c lo n a lm e n te en el cereb ro . T C C 14 se g e n e ró com o se m u es tra e sq u e m á tica m e n te en la Fig. 1 (p a rte d e re ch a ). E l a is la m ie n to de cé lu la s T a u to p ro life ra tiva s se m u e s tra con m ás d e ta lle en la Fig.<8>A.
[0347] En d e ta lle , las cé lu las m o n o n u c le a re s de sa n g re p e rifé rica se s ie m b ra n en p oc ilios re p lica d o s d e sp u é s de m a rca rla s con el co lo ra n te d ia ce ta to de ca rb o x iflu o re s c e ín a N -su cc in im id ilo é s te r (C F S E ) sin es tím u lo . D espu és de 7 d ía s de cu ltivo , las cé lu las p ro life ra tiva s (C F S E dim) y no p ro life ra tiva s (C F S E hi) se ide n tifican m e d ia n te c ito m e tría de flu jo y las cé lu las T a u to p ro life ra tiva s (C F S E dim) a is la do p o r c la s ifica c ió n ce lu lar. S e co m p a ra n las s e cu e n c ia s T C R p V e n tre las le s io n e s ce re b ra le s de M S y la p ob la c ió n C F S E dim (a u to p ro life ra tiva ). M ás del 20 % de las se cu e n c ia s T C R p V de la p o b la c ió n de C F S E dim ta m b ié n se e n cu e n tra en le s io n e s c e re b ra le s de M S (F ig .<8>B).
[0349] Luego , se e xp a n d ió y p robó T C C 14 com o se m u es tra en la Fig. 2, u sa nd o un e n fo q u e im p arc ia l para id e n tifica r e l/lo s a n tíg e n o /s d ia n a de T C C 14 u sa nd o b ib lio te ca s de p é p tid o s c o m b in a to r io s de e sca n e o p os ic io na l y a n á lis is b io m é trico com o se d e sc rib ió a n te rio rm e n te . T C C 14 se e xp a n d ió lo s u fic ie n te m e n te b ien com o para s e r p ro b a d o con el c o n ju n to co m p le to de 200 m e zc la s de b ib lio te ca s de e sca n e o p os ic io n a l. La re s tr ic c ió n de T C C 14 se p robó con cé lu las BLS tra n s fe c ta d a s con el hap lo tipo H L A -D R 15 que e xp re sa a le los H L A c lase II (D R 2a , D R 2 b o D Q w<6>), ya que los T C C se d e riva n de un pac ien te con M S h om o cig o to H LA -D R 15. D espu és de d e te rm in a r su re s tricc ió n H LA -c la se II (D R B 1 *15 :01 ), se p robó la reac tiv idad con tra las 200 m u es tra s u sando cé lu la s BLS tra n s fe c ta d a s con D R B 1*15 :01 y m o stró re sp u e s ta s p os itiva s con tra a m in o á c id o s (a a ) s im p le s o m ú ltip le s en ca d a u na de las 10 p o s ic io n e s . La p ro life ra c ió n (ín d ice e s tim u la to r io = Sl; lín e a p u n te a d a S i = 2 ) b a sa d a en el e n sa yo de in co rp o ra c ió n de t im id in a se usó d e s p u é s de 72 h co m o le c tu ra para la re sp u e s ta de T C C (F ig u ra 9, p an e l I). U sa n d o m a trice s de p un tu ac ió n p ara re su m ir la re ac tiv ida d de T C C 14 con tra los 20 L-aa en cada una de las<10>p o s ic io n e s de la b ib lio te ca de d e c a p é p tid o s d e sp u é s de p ro b a r m ú ltip le s d os is , se p re d ije ro n los p é p tid os que serían re co n o c id o s p o r T C C 14 (F ig u ra 9 pane l II) u sando el p ro ce d im ie n to de a n á lis is b io m é trico (Z h a o e t al., 2001). S e u sa ron las re sp u e s ta s m e d ia s de tre s e xp e rim e n to s re p e titivo s para g e n e ra r una m a triz de c o m b in a c io n e s ó p tim a s de a m in o á c id o s de un p o s ib le lig a n d o p ep tíd ico . Los d a to s de l tra n s c rip to m a c e re b ra l y las re sp e c tiva s p ro te ín a s del p ac ie n te 1, de qu ien se hab ía a is la d o el T C C , se usa ron com o base de d a tos de b úsqu ed a . Se s in te tiza ro n 92 se cu e n c ia s y se p rob a ron para su re co n o c im ie n to p o r T C C 14 en b ase a su a p a ric ió n e n tre los 50 p é p tid o s p rin c ip a le s p re d ich o s p ara al m e n o s u na de las m a trice s u sa d a s (re s p u e s ta e s tim u la d o ra con SI > 3) (F ig u ra 9, p an e l III). C o m o se ha d e m o s tra d o a n te r io rm e n te para o tros T C C , e x is te una b uena p rop o rc ió n e n tre la c la s ifica c ió n a lta p rev is ta y la re sp u e s ta de las cé lu la s T (S o sp e d ra e t al., 2010; Z h a o e t al., 2001 ) ya q ue T C C 14 re con oc ió m u ch os de los p é p tid os de a lta p un tu ac ió n . P ara e va lu a r la a v id ez fun c io n a l p o r estos, se rea liza ron e xp e rim e n to s de titu la c ió n de d os is con los 33 p ép tid os q ue d ie ron re sp u e s ta s p os itiva s . E ntre e s to s se e n co n tra b a n los p é p tid o s con S E Q ID N O s: 33 a 35. Los p é p tid os e s tim u la d o re s se p rob a ron en c o n c e n tra c io n e s d e c re c ie n te s para la re spu es ta p ro life ra tiva de T C C 14 usa nd o BLS D R 2 b d e sp u é s de 72 h. (F igu ra 9 panel IV). Se re con oc ió un pép tido de R A S G R P 2 con a lta av idez a n tig é n ica (E C 50 = 0.012 p M ) (S<e>Q ID NO: 33), pero los p é p tid o s de va ria s o tras iso fo rm a s de R A S G R P (R A S G R P 1 , -3, 4 ) y o tros p ép tid os ta m b ié n d ie ron re sp u e s ta s p o s itiva s (F ig u ra 9, p an e l IV). El re co n o c im ie n to de l p ép tid o R A S G R P 2 p o r T C C 14 resu ltó en la sec re c ión de c ito c in a s T h 2 y ta m b ié n de IF N -<y>(d a to s no m o strad os).
[0351] En co n c lu s ió n , el c lon T C C 14 re co n o ce m ú ltip le s v e rs io n e s de R ASG R P, s ie n d o R A S G R P 2 el q ue m u e s tra la m a yo r a v id ez (es dec ir, a c o n c e n tra c io n e s de a n tíg e n o m á s ba jas), lo que su b ra ya su re le va n c ia b io lóg ica .
[0352] 9. R e a c tiv id a d de R A S G R P 2 en cé lu la s sa n g u ín e a s p e rifé rica s
[0354] P ara p ro b a r la re ac tiv ida d a R A S G R P 2 en cé lu la s T de m e m o ria d e riva d a s de sa n g re p e rifé rica , se c rio p re se rva ro n P B M C (1 * 10<8>cé lu la s ) de p ac ie n te s con M S tra ta d o s con n a ta lizu m a b (NAT; n =<8>) se d e s c o n g e la ro n y lue g o se les su p rim ie ro n las c é lu la s q ue e xp re sa b a n C D 45 R A m e d ia n te c la s if ica c ió n ce lu la r m a g n é tica (M ilte n y i). 2 * 10<5>P B M C sin C D 45 R A se se m b ra ro n p o r poc illo (10 -15 p oc illos re p lica d o s p o r c o n d ic ió n ) en m e d io X -V ivo y se tra ta ro n con ve h ícu lo (D M S O ), con p erla s C D 2 /C D 3 /C D 28 o se p u lsa ro n con m e zc la s de p é p tid o s R A S G R P 2 (co n ce n tra c ió n fin a l de la m e zc la 10 pM ) o p ro te ín a R A S G R P 2 pu rificad a co m p le ta (O rig en e ; 0.3 pg /m l). Los p ép tid os s u p e rp u e s to s de 15m e r que cub ren to d a la p ro te ína R A S G R P 2 (S E Q ID N O :s 38 -98 ) se o rg a n iza ro n en 9 m e zc la s de p é p tid o s con 7 p é p tid os p o r m e zc la que cu b re n la se c u e n c ia de R A S G R P 2 d e sd e el e x tre m o N (m e z c la 1) h as ta el e x tre m o C (m e z c la 9). Se u só el e n s a y o de in co rp o ra c ió n de t im id in a p ara m e d ir las re sp u e s ta s de p ro life ra c ió n a R A S G R P 2. El d ía 7, las c é lu la s fu e ro n p u lsa d a s con 1 pC i de m e til-3 H -tim id in a p o r p oc illo (H a rtm a n n A n a ly tic ) y se re co le c ta ro n d e sp u é s de 15 h en una m e m b ra n a (Tom tec). La inco rp o rac ión se m id ió m e d ian te co n te o de cen te lle o p (W a lla c 1450, P erk inE lm er). Los re su lta d o s se m u e s tra n co m o p u n to s (m e d ia ± S E M ). El índ ice de e s tim u la c ió n (S I) se ca lcu ló co m o la p ro p o rc ió n e n tre la e s tim u la c ió n con p é p tid o s o p ro te ín a s vs con tro l de l v e h ícu lo . Los va lo re s de SI > 2 se co n s id e ra ro n p o s itivo s (F ig u ra 10).
[0356] En resum en, la F igura 10 m u es tra q ue las cé lu las T de m e m oria de p ac ien tes con M S con a lta a u top ro life ra c ión re a cc io n a n a R A S G R P 2. Los<8>d o n a n te s re sp o n d ie ro n a m e zc la s de p é p tid o s in d iv id u a le s o a v a r ia s m e zc la s de p é p tid os R A S G R P 2 (in c lu id o el g rup o 2, q ue co n tie n e el p ép tido con S E Q ID NO : 46 q ue se su p e rp o n e con un p ép tid o d ia n a de T C C 14 (S E Q ID NO: 33 )) y /o p ro te ín a com p le ta , lo q ue d e m u e s tra q ue R A S G R P 2 es un a u to a n tíg e n o a m p lia m e n te re co n o c id o p or p a c ie n te s con M S con un a lto g rad o de a u to p ro life ra c ió n .
[0358] 10. D a tos de R N A S e q /tra n sc rip to m a y p ro te o m a q ue d e m u e s tra n la e xp re s ió n de R A S G R P 2 en cé lu las B y en el ce re b ro
[0359] Se p robó la e xp re s ió n de R A S G R P 1 -4 a n ive l de A R N y p ro te ín a en cé lu las B p e rifé rica s y ce reb ro (F ig. 11). R A S G R P 1 -3 se e xp re sa ta n to en el ce reb ro del p ac ien te 1 com o en el tra n s c rip to m a de las cé lu las B de m e m o ria a u to p ro life ra tiva s (F ig. 11).
[0360] En d e ta lle , la F igura 11 m u es tra : (A ) N ive l de e xp re s ió n de las tra n s c rip c io n e s o rig in a d a s en p ép tid os e s tim u la d o re s en la les ión ce re b ra l a c tiva III del p ac ien te con M S 1 (R P K M ) y a u to p ro life ra c ió n (C F S E dim), cé lu la s B de sa n g re p e rifé rica (R P K M ) de<6>p a c ie n te s con R R M S (R E M ). Los n ive les de e xp re s ió n in fe rio re s a 0.1 o la a usen c ia de e xp re s ió n de tra n s c rip c ió n se e s ta b le c ie ro n com o 0.1. Tam bién se m u es tra la e xp re s ió n de tra n s c rip c io n e s de con tro l para el ce reb ro (M O B P ) y las cé lu las B (C D 19). (B ) A n á lis is de e sp e c tro m e tría de m a sa s de cé lu la s B de sa n g re p e rifé rica de p a c ie n te s con R R M S (R E M , nih il; n = 4 ) y te jid o ce re b ra l (m a te ria gris, a g ru p a d a , n =<6>) de p a c ie n te s con M S. La c o b e rtu ra de p ro te ín a s (co lu m n a s ) y los re cu e n to s e sp e c tra le s (n ú m e ro s ) de R A S G R P 1 -4 se re p re se n ta n com o m e d id a de la a b u n d a n c ia de p ro te ínas.
[0361] Tam bién se a n a lizó el te jid o ce reb ra l (m a te ria b la n ca y g ris ) de los con tro le s y de los p ac ien tes con M S m ediante p ro te ó m ica u sa n d o e sp e c tro m e tría de m asas. Se ide n tifica ron p é p tid os de las p ro te ína s R A S G R P 1, 2 y 3 en el te jid o ce re b ra l, en p a rtic u la r con una a lta a b u n d a n c ia de R A S G R P 2 (F ig u ra 12). La p o s ic ió n se re fie re a la se cu e n c ia de: G e n B a n k A A C 97349.1 (R A S G R P 1 ), G e n B a n k A A I10307.1 (R A S G R P 2 ) y G e n B a n k A A Y 15037.1 (R A S G R P 3 ).
[0362] A d e m á s , se re a liza ro n e s tu d io s de in m u n o h is to q u ím ica (IH C ) que m o stra ro n la e xp re s ió n de la p ro te ína R A S G R P 2 en la m a te ria gris del ce reb ro , e sp e c ífica m e n te en las n eu ro n a s co rtica le s y el bazo (da tos no m o strad os).
[0363] 11. Id e n tifica c ió n de o tros p é p tid o s in m u n o d o m in a n te s d e n tro de las s e cu e n c ia s de la G D P -L -fu co sa s in ta sa y R A S G R P 2
[0364] A d e m á s, se han id e n tifica d o p é p tid os b a sá n d o se en a lg o ritm o s de b úsqu ed a y su p o s ic io n e s co m ú n m e n te u sa d o s com o p o te n c ia lm e n te in m u n o g é n ico s . El e n fo q u e se ha a d o p ta d o del co n te x to de la va cu n a c ió n tum o ra l, d onde la b úsqu ed a de p ép tid os inm un o g é n ico s en p ro te ína s p rop ias (de un tu m o r) es un p roce d im ie n to estándar. En e s te e sce n a rio , se c rib a una se c u e n c ia de p ro te ín a s en b u sca de p é p tid o s q ue se p revé q u e se unan a los a le los H L A re le va n te s para la e n fe rm e d a d (o los a le los H L A de un p ac ien te con un tu m o r d e te rm in a d o ). P o r lo tan to , se to m a ro n las se cu e n c ia s de la G D P -L -fu co sa s in ta sa y de R A S G R P 2 y se p red ije ron p é p tid os de un ión fue rte (S B ) o déb il (W B ) u sa nd o los a lg o ritm o s de p red icc ió n de un ión de pép tidos in s ilico N e tM H C II (h ttp ://w w w .c b s .d tu .d k /s e rv ic e s /N e tM H C II/) e IE D B (h ttp ://w w w .ie d b .o rg /) b ien a ce p ta do s. Los d e ta lle s so b re cóm o re a liz a r las b ú sq u e d a s están d isp o n ib le s en los s itio s w e b de los dos a lg o ritm o s de b úsqu ed a . En resum en, la b úsqu ed a im p lica co p ia r la se cu e n c ia de la p ro te ína de in te rés en la h e rra m ie n ta w e b y e le g ir un a le lo H L A de c lase II (o c lase I, si es de in te ré s) de in te rés. El a lg o ritm o luego p rod u c irá las s e c u e n c ia s de p é p tid o s y su re sp e c tiva u n ión p re v is ta al a le lo H L A -c la se II. P ara los a le lo s en los q ue no fue p os ib le re a liz a r b úsq u e d a s en N e tM H C II, se usó IEDB. Se han usado a le los H L A que se sabe que están a so c ia d o s con la MS. S i a h o ra se co n s id e ra n to d a s las re g io n e s de las d o s p ro te ín a s q ue se p re d ice q u e son W B (e s ta s son de m á x im o in te rés en el con te x to de los a u to a n tíg e n o s ) o S B (b ú sq u e d a s N e tM H C II) o que tie n e n un rango de un ión p rev is to de l 25 % o in fe rio r (IE D B ), e stos tra m o s de a m in o á c id o s cub rirán cas i la to ta lid a d de las p ro te ín a s G D P -L -fu co sa s in ta sa y R A S G R P 2:
[0365] Se p red ijo que, para la p ro te ín a G D P -L -fu co sa s in tasa , los p é p tid o s q ue a b a rca n el á rea de los a m in o á c id o s 1 a 315 se un irían .
[0366] P ara la p ro te ína R A S G R P 2, se p red ijo q ue los p é p tid os que a b a rcan las á rea s de los a m in o á c id o s 9 a 449 y 457 a 659 se un irían .
[0367] Se u sa ron los s ig u ie n te s a le los:
[0368] - H LA -D R B 1*15 :01 (N e tM H C II)
[0369] - H LA -D R B 5*01 :01 (N e tM H C II)
[0370] - H LA -D R B 1*03 :01 (N e tM H C II)
[0371] - H L A -D R B 1 *13 :03 (IE D B )
[0372] - H LA -D R B 1*08 :01 (IE D B )
[0373] - H L A -D R B 3 *02 :02 (IE D B )
[0374] - H LA -D R B 1*04 :01 (N e tM H C II)
[0375] - H L A -D R B 1 *04 :04 (N e tM H C II)
[0376] - H L A -D Q w<6>(D Q A 1 *01 :01 ; D Q B 1 *06 :02 ) (IE D B )
[0377] Se u sa ron las s ig u ie n te s s e cu e n c ia s de p ro te ínas:
[0378] G D P -L -fu co sa s in tasa : G e n B a n k : A A H 93061.1
[0379] R A S G R P 2 : G e n B a n k : A A I10307.1
[0380] En co n c lu s ió n , las p ro te ína s co m p le ta s y los p ép tid os in m u n o d o m in a n te s son a d e cu a d o s para su uso en el tra ta m ie n to , d ia g n ó s tico y /o p re ve n c ió n de la MS.
[0381] 12. F a b rica c ió n de un g ló b u lo ro jo q u ím ica m e n te a co p la d o
[0382] E D C com o re ticu la n te q u ím ico
[0383] Se ha u sa do un p ép tido q u e se hab ía s in te tiza d o con un re s idu o de b io tina (b io tin a -P L P 1 ; PLP1 = PLP 139­ 154) para p e rm itir una d e te cc ió n a lta m e n te e sp e c ífica del p ép tid o u sa nd o e s tre p ta v id in a co n ju g a d a con flu o ró fo ro . B re ve m e n te , se p u lsa ron cé lu la s m o n o n u c le a re s de san g re p e rifé rica con b io tina -P LP 1 (c o n c e n tra c ió n fin a l de 0.05 m g /m l) o E D C (c o n c e n tra c ió n fin a l de 10 m g /m l), a m b a s en P B S d u ra n te 1 h a 4 °C. T ras dos lavados, las cé lu las se tiñ e ro n con e s tre p ta v id in a co n ju g a d a con f lu o ró fo ro y se a na liza ro n m e d ia n te c ito m e tría de flu jo (E s tre p ta v id in a -A P C ).
[0384] C o m o se m u e s tra en la F ig ura 13, so lo se o b se rvó una unión e fic ie n te de p é p tid o s en p re se n c ia de a m bo s (p é p tid o b io tin a -P L P y EDC).
[0385] 13. A n á lis is a d ic io n a l con 105 p a c ie n te s con M S (p a ra la G D P -L -fu co s a s in ta sa ) y 57 p a c ie n te s con M S (para R A S G R P 2 )
[0386] Se re a lizó un a ná lis is a d ic io n a l con 105 p ac ie n te s con M S (p a ra G D P -L -fu co sa s in ta sa ) y 57 p ac ie n te s con M S (p a ra R A S G R P 2 ) para v a lid a r la in m u n o d o m in a n c ia de los p é p tid o s de G D P -L -fu co sa s in ta sa 51-65 , 136-150 , 161 -175 , 246 -260 y 296 -310 (S E Q ID N O s: 12, 21, 23, 28 y 32) y el pép tido R A S G R P 2 78 -92 (S E Q ID NO: 46). Se co m p a ró la re ac tiv ida d de las cé lu la s T C D 4 in filtra d a s en el CSF, que son m u y re le va n te s para la p a to g e n ic id a d de la MS, con los p é p tid os a n a liza d o s con la re ac tiv ida d con los p é p tid os de re fe ren c ia in m u n o d o m in a n te s co n o c id o s M B P 13-32, M B P 83-99 , M B P 111-129, M B P 146-170 , M O G 1-20, M O G 35 -55 y P LP 139-154.
[0387] Los re su lta d o s se m u es tra n en las fig u ra s 14 y 15. Los d a tos m u es tra n que los p é p tid os p rob a do s, que son fra g m e n to s de las p ro te ín a s id e n tifica d a s en el p re se n te d o cu m e n to G D P -L -fu co sa s in ta sa y R A S G R P 2, son ta n re a c tivo s o inc lu so m á s re a c tivo s que los p é p tid o s de re fe re n c ia in m u n o d o m in a n te s con o c id o s . De esta m a n e ra se ha c o n firm a d o n u e va m e n te q u e los p é p tid o s e s tu d ia d o s son in m u n o d o m in a n te s . El e s tu d io de las cé lu la s T q ue se in filtran en el C S F y su re spu es ta a un su p u e s to a u to a n tíg e n o es p a rticu la rm e n te s ig n ifica tivo p o rq u e las c é lu la s T a u to rre a c tiva s que se han in filtra d o en el ó rg a n o d iana, es decir, el ce reb ro , la m é du la e sp in a l o el CSF, se co n s id e ra n p ro b a b le m e n te b io ló g ica m e n te re leva n te s.
[0388] Las re sp u e s ta s p ro life ra tiva s y la sec re c ió n de IFN -<y>se p rob a ron co m o se d e scribe a rrib a en 7. y m ás ade lan te en 15. M a te ria le s y m é todos , a m e no s que se e sp e c ifiq u e lo con tra rio .
[0389] En de ta lle , la F ig u ra 14 m u es tra : A. R e sp u e s ta s p ro life ra tiva s e xp re sa d a s co m o ín d ice s e s tim u la d o re s (S I) y se c re c ió n de IF N -y (p g /m l) de c é lu la s TC D 4+ in filtra d a s en CSF. (ro n d a ún ica de e xp an s ión de P H A ) a c inco p é p tid o s de G D P -L -fu co sa s in ta sa (51-65 , 136 -150 , 161 -175 , 246 -260 y 296 -310 ), cua tro p é p tid o s M<b>P (13 ­ 32, 83-99 , 111-129 y 146 -170 ), dos p é p tid o s M O G (1 -20 y 35-55 ), un p ép tido PLP (139 -154 ) y p é p tid os CEF, p re se n ta d o s p o r P B M C a u tó lo g a s . Todos los p é p tid o s se han p ro b a d o en cu a tro p oc illos p o r p ac ien te . C ada pun to re p re se n ta un p oc illo y cad a p ép tido se ha p robado en 420 p oc illos (4 p oc illos x 105 p ac ien tes ). Los p oc illos p os itivo s son p oc illos con Sl s u p e r io r a 2 (lín ea de p u n to s ) o con IF N -y s u p e r io r a 20 p g /m l (lín e a de pun tos). Ta m b ié n se m u e s tra el p o rce n ta je de p oc illos p os itivo s , a s í com o la p ro p o rc ió n e n tre el p o rce n ta je de p o c illo s p o s itivo s p ara IF N -y y SI. B. P o rce n ta je de p a c ie n te s p o s itivo s con c é lu la s T CD4+ in filtra d a s en C S F e sp e c ífica s para los d ife re n te s p é p tid os o sin e sp e c ific id a d ide n tificad a . Los p ac ie n te s p os itivo s se d e finen com o p ac ie n te s con m ás de 2 de los 4 p oc illos p os itivo s para SI (h is to g ra m a izqu ie rdo ), IF N -<y>(h is to g ra m a m e d io ) y SI o IFN -<y>(h is to g ra m a d ere cho ).
[0390] En de ta lle , la F ig u ra 15 m u es tra : A. R e sp u e s ta s p ro life ra tiva s e xp re sa d a s co m o ín d ice s e s tim u la d o re s (S I) y se c re c ió n de IF N -<y>(p g /m l) de cé lu las T CD4+ in filtra d a s en CSF. (ron da ú n ica de e xp an s ión de P H A ) a un p é p tid o R A S G R P 2 (78-92 ), cu a tro p é p tid o s M B P (13-32 , 83-99 , 111-129 y 146 -170 ), d os p é p tid o s M O G (1 -20 y 35 -55 ), un p é p tid o P LP (139 -154 ) y p é p tid o s CEF, p re se n ta d o s p o r P B M C a u tó lo g a s . Todos los p é p tid o s se han p ro b a d o en cu a tro p o c illo s p o r p a c ie n te . C a d a p un to re p re se n ta un p oc illo y cad a p é p tid o se ha p ro b a d o en 228 p oc illos (4 p oc illos x 57 p ac ie n te s ). Los p oc illos p os itivo s son p oc illos con Sl s u p e r io r a 2 (lín ea de p u n to s ) o con IF N -y s u p e r io r a 20 p g /m l (lín ea de pun tos). Tam b ién se m u e s tra el p o rce n ta je de p oc illos p os itivo s , a s í com o la p rop o rc ión e n tre el p o rce n ta je de poc illos p o s itivo s para IF N -y y SI. B. P o rce n ta je de p a c ie n te s p os itivo s con cé lu la s T CD4+ in filtra da s en C S F e sp e c ífica s para los d ife re n te s p ép tid os o sin e sp e c ific id a d ide n tificad a . Los p ac ie n te s p os itivo s se d e finen com o p ac ie n te s con m á s de 2 de los 4 p oc ilios p o s itivo s para SI (h is to g ra m a izqu ie rdo ), IFN -y (h is to g ra m a m e d io ) y SI o IF N -y (h is to g ra m a dere cho ).
[0391] 14. Ind ucc ión de la to le ra n c iain v ivocon p é p tid o s de m ie lina en un e n sa yo de fa se Ib
[0392] Se e va lu ó la in d u cc ió n de to le ra n c ia en 10 p a c ie n te s d ia g n o s tic a d o s con M S. En particu la r, se p ro b a ro n para la seg u rida d y to le ra b ilid a d de los g ló b u lo s ro jos fijad os con E D C y a co p la d o s a pép tidos, y para los ind icad ores de ind u cc ión de to le ra n c iain v ivom e d ia n te inye cc ió n i.v. de g ló b u lo s ro jos a u tó lo g o s q u ím ica m e n te a co p la d o s (p o r E D C ) a un c o n ju n to de p é p tid o s de m ie lin a (M B P 13-32, M B P 83-99 , M B P 111-129, M B P 146 -170 , M O G 1-20, M O G 35-55 y PLP 139 -154 ) (S E Q ID Nos: 261 -267 ) en el co n te x to de un e nsayo de fase Ib. En pocas p a la bra s , se e x trae san g re de cada p ac ien te y se sep a ran los g ló b u lo s ro jos. Luego , los g ló b u lo s ro jos se a co p la n q u ím ica m e n te a los p é p tid os de m ie linae x v ivoen co n d ic io n e s e s té riles y se inye cta p o r v ía i.v. al p ac ien te . 2 p a c ie n te s re c ib ie ro n 1 x10<10>cé lu las , 3 p a c ie n te s re c ib ie ro n 1 x10<11>c é lu la s y 5 p a c ie n te s re c ib ie ro n 3 x10<11>cé lu las . El d ía de la inye cc ió n se d e fin ió co m o el d ía 0.
[0393] Ta m bié n se e x tra jo sa n g re<6>se m a n a s a n te s de la in ye cc ió n (= P re to le r iz a c ió n ) y 12 s e m a n a s d e sp u é s de la inye cc ió n (= Pos to le rizac ió n ). En e stas fechas, se o b tuv ie ron los lin fo c ito s de san g re perifé rica y se e xa m ina ro n m e d ia n te c ito m e tría de flu jo con a n ticu e rp o s m a rca d o s con flu o re sc e n c ia para d e te c ta r la p rese nc ia de una a m p lia g am a de d ife re n te s tip o s de cé lu las , in c lu id a s v a r ia s su b p o b la c io n e s de cé lu la s T, cé lu la s B, m o no c ito s y cé lu la s d en d ríticas , cé lu las a se s in a s n a tu ra le s inc lu ida s las que e xp re sa n m a rca d o re s de cé lu las T re g u la d o ra s in d u c id a s (T r1 ) o cé lu la s T re g u la d o ra s n a tu ra le s (nT reg ). Los dos ú ltim o s tip o s de cé lu la s se p ueden ca ra c te r iza r m e d ia n te los s ig u ie n te s m a rcad o res :
[0394] - C é lu la s T re g u la d o ra s 1 (T r1 ) (C D 3 C D 4 C D 45 R A - C D 49b L A G 3 )
[0395] - C é lu la s T re g u la d o ra s n a tu ra le s (n T re g ) F o xP 3 (C D 4 C D 25 h i F O X P 3 )
[0396] A d e m á s , se m id ió la re ac tiv ida d de las cé lu la s T a los s ie te p é p tid o s in d iv id u a lm e n te para las cé lu las T de san g re p e rifé rica y para las cé lu las T in filtra da s en C S F com o se d e sc rib e a co n tin u a c ió n en "P ru e b a de cé lu las T d e riva d a s de C S F de p ac ie n te s con C IS y R R M S con tra G D P -L -fu co sa s in ta sa y p é p tid o s de m ie lina " y "E s tim u la c ió n de cé lu las T" en las m ism as fech as , es decir,<6>sem a n a s a n tes de la inyecc ión y 12 sem a n a s d e sp u é s de la inye cc ió n .
[0397] La fig u ra 16 m u e s tra que los s ig n o s de ind u cc ión de to le ra n c ia e sp e c ífica de a n tíg e n o tra s la inyecc ión de g ló b u lo s ro jos a co p la d o s fue ro n de tec tab les , m e d id o s p o r un a u m e n to en las cé lu las nTreg Tr1 y FoxP 3+ y una d ism in u c ió n de la re ac tiv ida d de las cé lu la s T e sp e c ífica s del p ép tid o . E s tos da tos ind ican que m e d ia n te la a d m in is tra c ió n de p ép tid os in m u n o d o m in a n te s se puede in d u c ir to le ra n c ia a los re sp e c tivo s p ép tid os in m u n o d o m in a n te s . En deta lle , la F ig u ra 16 m uestra :
[0398] A. P o rcen ta je de cé lu las Tr1 de cé lu las de m e m oria C D 4<6>sem a n a s a n tes de la inyecc ión (= P re T o le riza c ió n ) y 12 se m a n a s d e sp u é s de la inyecc ión (= P os t T o le rizac ión ). B. P o rce n ta je de cé lu las nT reg F o xP 3 de cé lu las de m e m o ria C D 4<6>se m a n a s a n tes de la inye cc ió n (= P re to le riza c ió n ) y 12 se m a n a s d e sp u é s de la inyecc ión (= Pos to le rizac ió n ). C. R ea ctiv ida d de las cé lu la s T en c inco p ac ien tes que rec ib ie ron 3 x10<11>cé lu las<6>sem a na s a n te s de la inye cc ió n y<12>se m a n a s d e sp u é s de la inyecc ión (p u n to s g rises : a n tes de la inye cc ió n ; p un tos n eg ro s: d e sp u é s de la inye cc ió n ). El g rá fico s u p e r io r m u e s tra el p o rce n ta je de c é lu la s q ue re sp o n d e n a to d o s los p ép tid os . El g rá fico in fe rio r m u e s tra la p ro life ra c ió n de ca d a m ic ro p o c illo in d iv id u a l (60 en to ta l).
[0399] 15. M a te ria le s y m é to do s
[0400] M a te ria l p a ra el p ac ien te
[0401] G D P -L -fu co sa s in ta sa
[0402] P a c ie n te 1154SA: Las cé lu las m o n o n u c le a re s d e riva d a s del C S F y las P B M C se ob tuv ie ro n de un p ac ien te con S P M S con les io ne s d e sm ie lin iza n te s de patrón II com o se d escrib ió p rev ia m en te (P la na s et al., 2015). Los tipo s H L A de c lase I y II de este p ac ien te fue ro n : A *32 :01 , A *33 :01 , B *14 :02 , B *51 :01 , D R B 1 *15 :01 , D R B 5 *01 :01 , D Q B 1 *06 :02 y D Q A 1 *01 :02.
[0403] Se re cog ie ron m u e s tra s de C S F de p u n c ió n lu m b a r d ia g n ó s tica y sa n g re p e rifé rica p a re a d a de 31 p a c ie n te s con M S no tra ta d o s :<8>p ac ie n te s con C IS , 20 p ac ie n te s con R R M S y 3 p ac ien tes con S P M S . Los p ac ien tes fu e ro n re c lu ta d o s en el c o n su lto r io a m b u la to rio n im s y en el h osp ita l de d ía de l C e n tro M é d ico U n ive rs ita rio de H a m b u rg o -E p p e n d o rf, y en la se cc ión n im s, de la C lín ica de N e u ro lo g ía de l H osp ita l U n ive rs ita rio de Z ú rich . El d ia g n ó s tico de M S se basó en los c rite r io s de M cD o n a ld re v isa do s . En to d o s los p ac ie n te s con C IS se d e te c ta ro n b a n d a s o lig o c lo n a le s e sp e c ífica s de l C S F m e d ia n te iso e le c tro e n fo q u e (IEF). Los p a c ie n te s q ue no h ab ían re c ib id o e s te ro id e s al m e no s 4 se m a n a s a n tes de la insc rip c ió n o cu a lq u ie r a ge n te in m u n o m o d u la d o r o in m u n o s u p re s o r d u ra n te los ú ltim o s 3 m e se s se co n s id e ra ro n no tra ta d o s y se inc lu ye ro n en el estud io . Se e xp a n d ie ro n c é lu la s fre sca s de C S F de e s to s p a c ie n te sin v itro(vé a se a c o n tin u a c ió n ). Las P B M C se a is la ron re c ie n te m e n te de tu b o s de sa n g re q ue co n te n ía n E D TA m e d ia n te ce n tr ifu g a c ió n en g ra d ie n te de d e n s id a d de F ico ll (PAA, P asch in g , A u s tr ia ) y se c rio p re se rva ro n . La C om is ión de É tica de la C á m a ra de C om e rc io de H am b urgo , p ro to co lo No. 2758 y el C om ité É tico C a n to n a l de Z ú rich , EC No. de l p ro ye c to de inve stig ac ión 2013 -0001 , a p ro b a ro n los p ro ce d im ie n to s del e s tud io . S e o b tuvo el c o n se n tim ie n to in fo rm a do de to d o s los p a c ie n te s o fam ilia re s .
[0405] Se o b tu v ie ro n te jid o s de a u to p s ia ce re b ra l de 13 p ac ie n te s con M S (7 S P M S , 5 P P M S y 1 M S re cu rre n te p rim a ria (P R )) y 7 con tro le s sin M S del B an co de Te jidos de E sc le ro s is M ú ltip le del R e ino U n ido (C o m ité de É tica de Inve s tig a c ió n M u lticé n trica del R e ino U nido, M R E C /02 /2 /39 ).
[0407] P ara el a ná lis is p o s te rio r de la G D P -L -fu co sa s in ta sa (13. de “ E je m p lo s ” ), se re co g ió C S F de 105 p ac ien tes . E n tre los 105 pac ien tes , la p ro p o rc ió n de m u je re s a h o m b re s fue de 1.9, la e dad m e d ia fue de 35.68 (in te rva lo 17-58), a 4 p ac ie n te s se les d ia g n o s ticó R IS, a 10 p ac ien tes se les d ia g n o s ticó C IS, a 82 p ac ien tes se les d ia g n o s ticó R<r>M S, a 4 p a c ie n te s se les d ia g n o s ticó S P M S y a 5 p a c ie n te s se les d ia g n o s ticó P P M S .
[0409] R A S G R P 2
[0411] Las P B M C se a is la ro n de l p ac ie n te 1154S A m e d ia n te ce n tr ifu g a c ió n de d en s id a d F icoll.
[0413] P ara el a n á lis is p o s te rio r de R A S G R P 2 (13. de “ E je m p lo s ” ), se recog ió C S F de 57 pac ien tes . Los 57 p ac ien tes e s ta b a n e n tre los 105 p ac ie n te s p ro b a d o s para d e te c ta r la G D P -L -fu co sa s in tasa . E ntre los 57 p ac ien tes , la p ro p o rc ió n de m u je re s a h o m b re s fu e de 2.5 , la e dad m e d ia fu e de 35.33 ( in te rva lo 17-55), 2 p a c ie n te s fue ro n d ia g n o s tica d o s con R IS ,<8>p a c ie n te s fu e ro n d ia g n o s tic a d o s con C IS, 43 p a c ie n te s fu e ro n d ia g n o s tica d o s con R R M S , 1 p ac ie n te fu e d ia g n o s tica d o con S P M S y 3 p a c ie n te s fu e ro n d ia g n o s tica d o s con P P M S .
[0415] E n sa yo s de a u to p ro life ra c ió n
[0417] Las P B M C se d e sco n g e la ro n con m e d io IM D M com p le to (G E H e a lth ca re ) que co n te n ía 100 U /m L de p e n ic ilin a /e s tre p to m ic in a (C o rn in g ), 50 u g /m L de g e n ta m ic in a (S ig m a -A ld r ich ), 2 m m o l/L de L -g lu ta m in a (P A A ) y 5 % de su e ro h u m a n o d e s c o m p le m e n ta d o p o r c a lo r (H S , PA A ) y p o s te rio rm e n te la va d o una ve z con m e d io A IM -V sin sue ro (G IB C O , T h e rm o F ish e r S c ie n tific ), que co n tie n e a lb ú m in a hum a na . Las cé lu la s se incu ba ro n d u ra n te 15 m in u to s en m e d io A IM -V q ue co n te n ía 50 U /m l de D N A sa (R o ch e ) a 37 °C para e v ita r la fo rm a c ió n de a g lo m e ra c io n e s ce lu la res . D espu és de dos p asos de lavado con P B S que co n te n ía 0.1 % de HS, las cé lu las se re su sp e n d ie ro n a una co n ce n tra c ió n de 10 * 10<6>c é lu la s /m l en PBS/0.1 % HS y luego se m a rca ron a una co n ce n tra c ió n fina l de 0.5 pM C F S E (S ig m a -A ld r ich ) d u ra n te 3 m in u tos a te m p e ra tu ra am b ie n te . El m a rca je se d e tuvo a p a g a n d o con un vo lu m e n 5x m a yo r de m e d io R PM I (P A N B io te ch ) co m p le to frío que co n te n ía 10 % de HS. D e sp u é s de un p aso de la va d o a d ic io n a l con A IM -V , las c é lu la s m a rca d a s con C F S E se se m b ra ro n a 2 * 10<5>P B M c /200 pl p o r p oc illo en A IM -V (10 -12 p oc illos re p lica d o s p o r d o n a n te y co n d ic ió n ) en p la cas de m ic ro titu la c ió n de fo n d o en U de 96 p oc illos (G re in e r B io -O n e ) a 37 °C, 5 % de C O<2>, en a u se n c ia de e s tím u lo s e xó g e n o s (= a u to p ro life ra c ió n ). P ara las re acc io n e s de cé lu las T co n ve n c io n a le s , para los m ism os d o n a n te s se usaron P H A (0.5 p g /m l) com o e s tím u lo in d e p e n d ie n te de TC R , to xo id e te tá n ic o (TTx, 5 pg/m l, N ova rtis B eh rin g ) com o e s tím u lo de a n tíge no e x tra ño y re acc ión de lin fo c ito s m ix to s (M LR ) com o e s tím u lo de a n tíge no a lo g én ico . D e sp u é s de 7 d ías, se re co g ie ro n las cé lu las m a rca d a s con C F S E y se a g ru p a ro n en p oc illos re p lica d o s , se lava ro n con PBS, se b lo q ue a ron con Fc con IgG h um a na (S ig m a -A ld r ich ) y se m a rca ron con L iv e /D e a d ® A qu a (In v itro g e n , T h e rm o F ish e r S c ie n tif ic ) a 4 °C. T ras la va r con P B S frío con 2 m M de E D TA y 2 % de FC S, las cé lu la s se tiñ e ro n d ire c ta m e n te para m a rca d o re s de su p e rfic ie usa nd o a n ticu e rp o s co n ju g a d o s con flu o ro c ro m o s (Tab la de re cu rso s c lave). Las m e d ic io n e s se re a liza ro n en un c itó m e tro de flu jo LSR Fo rtessa (B D B io sc ie n ce s ) y los d a tos se a n a liza ro n con F lo w Jo (T re e S tar). E s te e n sa yo se usó a d e m á s para p ro b a r la c o m p e te n c ia de a u to p ro life ra c ió n incu ba nd o P B M C m a rca d o s con C F S E en p re se n c ia de a n ticu e rp o s a n ti-H LA -D R , a n ti-C D 4 , an ti-IF N -Y y a n ti-G M -C S F (10 p g /m l) o con tro le s de iso tipo a p ro p ia d o s d u ra n te 7 días. Para el e n sa yo de inco rp o rac ión de tim id in a ,<2>*<105>P B M e /p o c illo (<10 -12>p oc illos re p lica d o s p o r d o n a n te y co n d ic ió n ) se cu ltiva ro n con m e d io A IM -V sin su e ro en p la ca s de m ic ro titu la c ió n de fo n d o en U de 96 p o c illo s a 37 °C, 5 % de C O<2>y el d ía 7 se pulsó con 1 pC i de m e til-<3>H -tim id in a p o r poc illo (H a rtm a n n A n a ly tic ) y cé lu la s co se ch a d a s d e sp u é s de 15 h (Tom tec). La inco rp o ra c ió n se m id ió m e d ia n te con teo de ce n te lle o p (W a lla c 1450, P e rk inE lm e r).
[0419] C lo n a c ió n de cé lu la s T
[0421] P ara g e n e ra r T C C a p a rtir de l co m p a rtim e n to a u to p ro life ra tivo , se re q u ie re n 500 cé lu la s C F S E dim de la m e zc la de c é lu la s c la s ifica d a s de las cé lu la s C F S E dim (20.000 c é lu la s ) del p ac ien te 1 con M S (para la se cu e n c ia c ió n de T C R V p , d e sc rita a n te r io rm e n te ) se d iv id ie ro n y se re a lizó una d ilu c ión lim ita n te co m o se d e sc rib ió p re v ia m e n te (A ly e t al., 2011). Los T C C se e n riq u e c ie ro n u sa n d o un p ro to co lo de e xp a n s ió n con P H A (S ig m a ) e IL -2 h um a na (A ly e t al., 2011). Se a na lizó la se cu e n c ia c ió n de los re o rd e n a m ie n to s de T C R de los T C C g e n e ra d o s , co m o se d e sc rib ió p re v ia m e n te (Y o u se f e t al., 2012). P ara e va lu a r la re sp u e s ta de c ito c in a s de los TC C , se usa ron p a rtícu la s M A C S ibe ad ca rg a d a s con a n ticu e rp o s a n ti-C D 2 /C D 3 /C D 28 (M ilte n y i) para e s tim u la r cad a T C C en 7 p o c illo s re p lic a d o s con 200.000 cé lu la s ca d a uno en m e d io X -V iv o (L on za ). D e sp u é s de 48 h se re co g ie ro n los s o b re n a d a n te s y se m id ie ron las re sp u e s ta s de las c ito c ina s , com o se d e sc rib ió a n te rio rm e n te . Para la e xp re s ió n del re ce p to r de q u im io c in as , los T C C se tiñ e ro n con L iv e /D e a d ® A q u a y a n ticu e rp o s co n tra C X C R 3 y C C R<6>d e sp u é s de d e s c o n g e la r y d e ja r re p o s a r las cé lu las d u ra n te la noche. A n á lis is tra n s c rip tó m ic o
[0422] El a n á lis is tra n s c r ip tó m ic o de las le s io n e s ce re b ra le s se re a lizó co m o se d e sc rib ió p re v ia m e n te (P la n a s e t al., 2015). Los d a tos a n a liza d o s se d ep os ita ron en G ene E xp ress ion O m n ib u s del N C B I y se p uede a cce d e r a e llos a tra vé s del n úm e ro de a cce so de la se rie G E O G S E 60943.
[0423] A n á lis is p ro te ó m ico
[0424] P ara el a ná lis is p ro te óm ico , se re a lizó la e x tra cc ió n y d ig e s tió n de p ro te ín a s a s is tid a p o r p res ión con un b a ro c ic la d o r (2320EX T , B ioS c ie nces , Inc, S ou th E aston, M A). Se a p licó re du cc ió n y a lq u ila c ió n al h o m o g e n e iza d o a n tes de d ig e rir las m u e s tra s con L ys -C y tr ip s in a . Los p é p tid o s se d e sa lin iza ro n en co lu m n a s de e xtra cc ió n en fa se só lida (C 18 F in is te rre , W ico m A le m a n ia ), se se ca ron al va c ío , se v o lv ie ro n a d is o lve r y se m id ie ro n (N a n o d ro p 1000, e sp e c tro fo tó m e tro (T h e rm o S c ien tific , W ilm in g to n , DE, EE. UU .). Los p ép tid os re su lta n te s se pu rifica ron y se p a ra ro n m e d ia n te c ro m a to g ra fía de in te ra cc ió n h id ro fílica (H IL IC , A g ile n t LC 1200 e q u ip a d a con una c o lu m n a P o lya m in II 250 x 3 ,0 m m 120 A , 5 p m ) a n te s de s e r in ye c ta d o s en un s is te m a de c ro m a to g ra fía líqu ida n ano E a sy -n L C co n e c ta d o a un in s tru m e n to O rb itra p Fusion (T h e rm o F ishe r). El a ná lis is de d a tos se re a lizó con el so ftw a re M A S C O T u sa nd o una base de d a tos de p ro te ín a s h um a na s U n iP ro tK B /S w is s -P ro t (22 de m arzo de 2016 con 40912 e n tra da s). Los p a rá m e tro s de b úsqu ed a fue ro n una to le ra n c ia de m asa de fra g m e n to de 0.05 Da y una m a sa de p re cu rso r de 10 ppm , un n úm e ro m ín im o de p é p tid o s de 2 y u na FD R (ta sa de d e s c u b rim ie n to fa lso ) de l 0.1 %, lo que p e rm itió 2 e sc is io n e s e rró n e a s en fra g m e n to s de trip s in a . La ca rb a m id o m e tila c ió n en c is te ín a se e s ta b le c ió com o una m o d ifica c ió n fija y la o x id a c ió n de la m e tio n in a , a ce tila c ió n n -te rm in a l com o m o d ifica c io n e s va ria b le s .
[0425] B ib lio te ca s de p é p tid o s de e sca n e o p o s ic io n a l y p é p tid o s in d iv id u a le s
[0426] G D P -L -fu co sa s in ta sa
[0427] Se p rep a ró una b ib lio te ca c o m b in a to r ia s in té tica de d e ca p é p tid o s de L -a m in o á c id o s (A A ) C -a m ida N -a ce tila d o s en un fo rm a to de e sca n e o p os ic io n a l (200 m e zc la s ) y ve in tid ó s m e zc la s d e fin id a s dua les . Los p ép tid os in d iv id u a le s (F ig . 4 y Fig.<6>) fue ro n s in te tiza d o s p o r P e p tid e s and E le p h a n ts G m bH (P o tsd am , A lem an ia ). R A S G R P 2
[0428] Se p rep a ró una b ib lio te ca de e sca n e o p o s ic io n a l de d e ca p é p tid o s L -aa (N -a ce tila d o y C -a m id a TP I 2040 ) m e d ia n te m é to d o s estándar. C ada una de las 200 m e zc la s de la b ib lio te ca fue p rob a da para d e te rm in a r su a c tiv id a d p ro life ra tiva m e d ia n te T C C 14 a 40, 120 y 200 p g /m l u sa n d o un e n sa yo de in co rp o ra c ió n de tim id in a . La re s tr icc ió n de T C C 14 se p robó con cé lu las BLS tra n s fe c ta d a s con el h ap lo tipo H L A -D R 15 que exp re sa a le los H L A c lase II (D R 2 a (= D R B 5 *01 :01 ), D R 2b (= D R B 1 *15 :01 ) o D Q w<6>(= D Q B 1 *0602 )), ya q ue el T C C se d eriva de un p ac ien te con M S h o m o c ig o to H LA -D R 15. La e xp re s ió n de H L A c la se II de las líne as c e lu la re s B LS se v e r if ic ó con a n tic u e rp o s e sp e c ífico s con tra D R 2a, D R 2 b y D Q y las cé lu la s d ie ro n re su lta d o s n eg a tivo s para m ico p la sm a . Los re su lta d o s se o rg a n iza ro n en cu a tro m a trice s (d a to s no m o s tra d o s ): tre s m a trices , ca d a una de las cua les re p rese n ta la a ctiv ida d en una de las d os is a n te rio res , y una m atriz que usa la con ce n tra c ió n para lo g ra r una p ro life ra c ió n de 3 v e ce s para c o m b in a r las tre s dos is en una so la activ idad . U sa nd o el p roce d im ie n to de a n á lis is b io m é tr ico (Z h a o e t al., 2001 ) con tra la base de d a tos de p ro te ín a s del tra n s c rip to m a de l ce reb ro de l p a c ie n te con M S 1154SA, se g e n e ra ro n lis tas de p é p tid o s p re d ich o s para cada una de las cua tro m a trices . D eb ido a la g ran co in c id en c ia en tre las lis tas p red ichas, un to ta l de 92 p é p tid os d e cá m e ro s d is tin to s apa re c ie ro n d en tro de los 50 p é p tid os p re d ich o s p rinc ip a le s en al m e no s una lista de p red icc ió n de la m atriz . E s tos pép tidos fu e ro n se le cc io n a d o s para s e r s in te tiza d o s (p o r P ep tide s and E lep h an ts G m bH , P o tsd am , A le m a n ia ) y p rob a do s.
[0429] C é lu la s y co n d ic io n e s de cu ltivo
[0430] Las cé lu las m o n o n u c le a re s d e riva d a s del C S F del p ac ien te 1154S A se e xp a n d ie ro n com o se in fo rm ó p re v ia m e n te (P la n a s et al., 2015). B re vem e n te , se se m b ra ro n 2000 cé lu las p o r poc illo en p la cas de m ic ro titu la c ió n de fo n d o en U de 96 p o c illo s ju n to con 2 x 10<5>P B M C irra d ia d a s a lo g é n ica s (45 G y), 1 p g /m l de P H A -L (S ig m a , S t Lou is, M O ) y so b re n a d a n te de IL-2 (500 U /m l). El m e d io co n s is tía en IM d M (P A A ) que co n te n ía 100 U /m l de p e n ic ilin a /e s tre p to m ic in a (PAA), 50 p g /m l de g e n ta m ic in a (B io W h itta ke r, C am b re x), L-g lu ta m in a 2 m M (G ibco , Inv itrogen , C a rlsb ad , C A ) y sue ro h um a no d e sco m p le m e n ta d o p o r c a lo r (P A A ) al 5 %. Se a g re g ó IL-2 a d ic io n a l cad a 3 -4 d ías. Las cé lu la s T C D 4 in filtra d a s en C S F se se le cc io n a ro n p o s itiva m e n te u sa nd o p erla s m a g n é tica s a n ti-C D 4 (C D 4 M ic ro B eads h um a n M A C S , M ilte n y i B io te c Inc, CA, EE. U U .) y se re e s tim u la ro n una ve z m ás con P H A -L , IL-2 y P B M C irra d ia d a s a lo g én ica s .
[0431] TC C 21.1 se e s ta b le c ió a p a rtir de cé lu las in filtra d a s en C S F y T C C 14 a p a rtir de cé lu la s T a u to p ro life ra tiva s d e riva d a s de P B M C com o se d e sc rib ió p re v ia m e n te (P la n a s e t al., 2015).
[0432] P ru e b a de c é lu la s T d e riva d a s de l C S F de p ac ien tes con C IS y R R M S co n tra la G D P -L -fu co sa s in ta sa y los p é p tid o s de m ie lina
[0433] Se m e zc la ro n cé lu la s m o n o n u c le a re s fre sca s d e riva d a s de l C S F a g ran e l de los 31 p ac ie n te s con C IS /M S con 5 x 10<6>P B M C irra d ia d a s a lo g é n ica s y las cé lu la s T C D 4+ se se le cc io n a ro n p o s itiva m e n te con perlas m a g n é tica s an ti-C D 4. L uego se se m b ra ro n fra cc io n e s C D 4+ a 1500 cé lu las p o r poc illo en p la cas de m ic ro titu la c ió n de fo n d o en U de 96 p oc illos ju n to con 1.5 x 10<5>P B M C irrad iad as a lo g én ica s , 1 p g /m l de so b re n a d a n te de P H A -L e IL-2. El m e d io co n s is tió en R PM I 1640 sin H epes (P a n -B io te ch , A id e n b a ch , A le m a n ia ) su p le m e n ta d o con 2 m M de g lu ta m in a (P a n -B io te ch ), 1 % (vo l/vo l) de a m in o á c id o s no e se n c ia le s (G ibco ), 1 % (vo l/vo l) de p iruva to de sod io (G ibco ), 50 p g /m l de p e n ic ilin a -e s tre p to m ic in a (C o rn in g , NY, EE. UU .), 0.00001 % de p -m e rca p to e ta n o l (G ibco ) y 5 % de sue ro h um a no (B lood B a n k Basel). Se a gregó IL-2 a d ic io n a l cada 4 días. Los p o c illo s de c re c im ie n to se tra n s fir ie ro n a p la ca s de 48 p o c illo s y fin a lm e n te a un m a tra z de 75 cm 3 h asta que las cé lu las se d e ja ron c o m p le ta m e n te en reposo (20 -25 d ías). Las cé lu las se e xp a n d ie ro n a lta m e n te en una so la ro nd a de e stim u lac ión .
[0434] P ara el a ná lis is p o s te rio r de los p é p tid os de la G D P -L -fu co sa s in ta sa y un p ép tid o R A S G R P 2 (13. de "E je m p lo s "), se re a lizó el m ism o m étodo .
[0435] Se g en e ró un B C L a u tó lo g o del pac ien te 1154S A m e d ia n te tra n s fo rm a c ió n EBV. Las cé lu las BLS fue ro n tra n s fe c ta d a s con m o lé cu la s H L A c lase II ind iv idu a le s , D R 2 a (D R A 1 *01 :01 , D R B 5 *01 :01 ), D R 2b (D R A 1*01 :01 , D R B 1 *15 :01 ) y D Q w<6>(D Q A 1 *01 :02 , D Q B 1 *06 :02 ).
[0436] E s tim u la c ió n de cé lu la s T
[0437] Las re sp u e s ta s de T C C a m e zc la s de p ép tid os d e fin id o s s im p le s o d ua les o d e ca p é p tid o s in d iv id u a le s se p rob a ron se m b ra n d o p o r d u p lica d o 2 x 10<4>cé lu las T y 5 x 10<4>líne as ce lu la re s B LS irra d ia d a s o B C L a u tó lo ga s o 1 x 10<5>P B M C irra d ia d a s (se gú n se ind ica ) con o sin m e zc la s de p é p tid o s co m b in a to r io s o d e ca p é p tid o s in d iv id u a le s . 2.5 p g /m l de P H A y 10<'7>co m o co n tro le s p o s itivo s s irv ie ro n M P M A (S ig m a ), 1 p g /m l de a n ti-C D 3 re cu b ie rto en su p e rfic ie (O K T3 , O rtho B io tech P ro du c ts , R aritan , N J) y 0.5 p g /m l de a n ti-C D 28 so lu b le (B io leg en d , S an D iego, CA), y un k it de a c tiva c ió n de cé lu las T (p e rlas an ti-C D 3 , an ti-C D 28 , a n ti-C D 2 ) (M ilte ny i B io tec), com o se ind ica.
[0438] La re sp u e s ta de las cé lu la s T C D 4+ in filtra d a s en C S F e xp a n d id a s con P H A a la G D P -L -fu co sa s in tasa , la m ie lina y los pép tid os C E F (F igu ra<6>) se a na lizó se m b ra n d o p o r c u a d ru p lica d o<6>x 10<4>cé lu las T y 2 x 10<5>P B M C a u tó lo ga s irrad iad as con o sin pép tidos. P ara los e xp e rim e n to s de EdU se usa ron B LS D R B 1*15 :01 com o AP C . El k it de a c tiva c ió n de cé lu la s T se usó com o co n tro l pos itivo .
[0439] P ara el a n á lis is a d ic io n a l de los p é p tid os de la G D P -L -fu co sa s in ta sa y un p ép tido R A S G R P 2 (13. de "E je m p lo s "), se re a lizó el m ism o m é to do que para la re sp u e s ta de las cé lu la s T C D 4 in filtra da s en C SF e xp a n d id a s con P H A a la G D P -L -fu co sa s in tasa .
[0440] M e d ic ión de c ito c in a s
[0441] G D P -L -fu co sa s in ta sa
[0442] Las c ito c in a s en el so b re n a d a n te de c é lu la s T C C 21.1 e s tim u la d a s y cé lu la s de C S F e xp a n d id a s se m id ie ron 48 h d e spu és de la es tim u lac ión usando el inm u n o e n sa yo b asado en perlas L E G E N D p le x de l panel de c itoc inas T c o la b o ra d o ra s h um a n a s (B io le g e n d ), E L IS A G M -<c>S<f>(B D B iosc ien ces , F rank lin Lakes, N J) y E L IS A IL-3 (B io le g e n d ) seg ún las in s tru cc io n e s de l fab rica n te .
[0443] P ara la tin c ió n de c ito c in a s in tra ce lu la re s , se a n a lizó T C C 21.1 48 h d e sp u é s de la e s tim u la c ió n . D e sp u é s de 5 h en p rese nc ia de l in h ib id o r de l tra n sp o rte de p ro te ín a s G o lg iS to p (B D B iosc ien ces ), las cé lu la s T se m a rcaron con L ive /D ead® A q u a (In v itro g e n ). D espu és de la fija c ió n y p e rm e a b iliza c ió n con C y to fix /C y to p e rm (BD B io sc ie n ce s ), las cé lu las se tiñ e ro n con a n ticu e rp o s con tra C D 4 (A P C -C y7 , B io le ge n d ), IF N -<y>(F ITC , B io le g e n d ), IL-4 (PE , BD B iosc ien ce ), G M -C S F (A P C , B io le g e n d ) e IL-3 (PE , B io le g e n d ) en p B s q ue co n te n ía s a p o n in a y BSA, y se a n a liza ro n m e d ia n te c ito m e tría de flu jo .
[0444] P ara el a n á lis is a d ic io n a l de los p é p tid os de la G D P -L -fu co sa s in ta sa y un p ép tido R A S G R P 2 (13. de "E je m p lo s "), se m id ió la sec re c ió n de IF N -y en el s o b re n a d a n te de c é lu la s T in filtra da s en C S F e xp an d id as , e s tim u la d a s y no e s tim u la d a s , d e sp u é s de 48 h de cu ltivo u sa nd o E L IS A de IF N -<y>(B io le g e n d ) p o r d up lica d o en to d o s los p oc illos in d iv id u a le s seg ún las in s tru cc io n e s de l fab rica n te .
[0445] R e sp u e s ta s p ro life ra tiva s
[0446] G D P -L -fu co sa s in ta sa
[0447] La p ro life ra c ió n se m id ió 72 h d e sp u é s de la e s tim u la c ió n m e d ia n te la in co rp o ra c ió n de 3 H -tim id in a (H a rtm a n n A n a ly tic , B ra u n sch w e ig , A le m a n ia ) en un c o n ta d o r de ce n te lle o (W a lla c 1450, P erk inE lm er, R o d g a u -Jü rg e sh e im , A le m a n ia ). El índ ice de e s tim u la c ió n (S I) se ca lcu ló de la s ig u ie n te m a ne ra : SI = M e d ia n a (rep lica cpm de p ép tid o ) / M e d ia na (rep lica cpm sin pép tido ). Tam b ién se m id ió la p ro life ra c ió n u sando un k it de ensayo de c ito m e tría de flu jo C lick -iT T M EdU (A P C , M o le c u la r P robes, In v itro g e n ) s ig u ie n d o las in s tru cc io n e s del fa b rica n te . Las cé lu la s se tiñ e ro n con los s ig u ie n te s a n ticu e rp o s a n ti-C D 3 (P E -C y-7 , e -B io sc ie n ce , S an D iego, C A ) y an ti-T R B V -21 (F ITC , B eckm a n C ou lte r, B rea, C A ) y se a n a liza ro n m e d ia n te c ito m e tría de flu jo .
[0448] R A S G R P 2
[0449] Las re sp u e s ta s p ro life ra tiva s se p rob a ron com o se d e sc rib e en 9.
[0450] P ara el a n á lis is a d ic io n a l de los p é p tid os de la G D P -L -fu co sa s in ta sa y un p ép tido R A S G R P 2 (13. de "E je m p lo s "), se m id ie ron las re sp u e s ta s p ro life ra tiva s com o se d e sc rib e para la G D P -L -fu co sa s in ta sa a n te rio rm e n te .
[0451] E xp re s ió n del re ce p to r de su p e rfic ie
[0452] El TC C 21.1 en reposo se tiñ ó con a n ticu e rp o s con tra C D 4 (P E -T exa s Red, T h e rm o F ischer, W a ltha m , M A), T R B V 21 (F IT C , B eckm an C ou lte r), C D 28 (P E -C y7 , B ioL e ge nd ), C C R 4 (A P C , B ioL e ge nd ), C C R<6>(B V 785 , B io L e g e n d ) y C R T h 2 (PE, B io L e g e n d ) y se a n a lizó m e d ia n te c ito m e tría de flu jo .
[0453] A n á lis is de c ito m e tría de flu jo
[0454] La adq u is ic ió n de m u es tra s se rea lizó u sando un c itó m e tro de flu jo LSR Fo rtessa (B D B io sc ie n ce s ) con so ftw a re D iva, y los d a tos se a na liza ro n con F lo w Jo (T re e S tar, A sh la n d , O R).
[0455] R T -P C R y secu e n c ia c ió n de re o rd e n a m ie n to s del T C R
[0456] Se e va lu ó la e x tra cc ió n de A R N , la tra n sc rip c ió n inve rsa y la se cu e n c ia c ió n de la ca d e n a T C R a /p (T R A /B V ) de TC C 21.1 com o se in fo rm ó p re v ia m e n te (P la n a s e t al., 2015). Las d e s ig n a c io n e s de los g enes T C R están según la n o m e n c la tu ra IM G T (Im M u n o G e n e T ics , w w w .IM G T .o rg ).
[0457] H LA
[0458] Los ind iv id u o s fu e ro n tip if ic a d o s para m o lé cu la s H L A de c lase I y II en H is to g e n e tic s LLC , NY, USA. El a is la m ie n to de A D N de san g re co m p le ta con una co n ce n tra c ió n fina l de 15 ng/p l se rea lizó con un p ro to co lo de a is la m ie n to de A D N e s tá n d a r u sando una so lu c ió n re g u la d o ra de lisis T riton y tra ta m ie n to con p ro te ina sa K. Las m u e s tra s fue ro n tip if ic a d a s para H L A c lase I (A * y B *) y H L A c lase II (D R B 1*, D R B 3*,<d>R<b>4*, D R B5*, D Q A 1 * y D Q B 1 *) u sa n d o tip if ic a c ió n b a sa d a en se cu e n c ia h La de a lta re so lu c ió n (S B T ). Las p re d ic c io n e s de un ión de H L A c lase II se re a liza ro n u sa nd o la h e rra m ie n ta de co n se n so de re cu rso s de a n á lis is IEDB.
[0459] A n á lis is e s ta d ís tico
[0460] Se re a lizó un a n á lis is k -m e d ia de tre s g ru p o s sob re las p u n tu a c io n e s de los p a c ie n te s para a g ru p a rlo s en tre s ca te g o ría s . Las a so c ia c io n e s e n tre los n ive les de re sp u e s ta de los p ép tid os , los p a c ie n te s y el e s ta d o de H LA se re a liza ro n u sa nd o la p rue b a e xa c ta de F ish e r con co rre cc ió n de B o n fe rro n i-H o lm a p lica d a según co rre sp o n d ie ra , con un 5 % de s ign ifica nc ia .

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES
1. U na p ro te ína G D P -L -fu co sa s in ta sa o una p ro te ína de la fa m ilia de p ro te ína s RASG R P, o un fra g m e n to in m u n o d o m in a n te , d e riva d o in m u n o d o m in a n te o va r ia n te de e m p a lm e in m u n o d o m in a n te de la m ism a, o una se cu e n c ia de n u c le ó tid o s que co d ifica cu a lq u ie ra de las p ro te ína s o fra g m e n to in m u n o d o m in a n te , d e riva do in m u n o d o m in a n te o va r ia n te de e m p a lm e in m u n o d o m in a n te de la m ism a, para su uso en el tra ta m ie n to y /o p re ve n c ió n de la e sc le ro s is m ú ltip le (M S ) o para su uso en un m é to d o para in d u c ir to le ra n c ia e sp e c ífica de a n tíg e n o a a u to a n tíg e n o s en un su je to h um a no que p a d e ce o e stá en rie sg o de d e s a rro lla r M S, en la q ue el fra g m e n to in m u n o d o m in a n te co m p re n d e de 5 a 50, p re fe rib le m e n te de 5 a 20, m ás p re fe rib le m e n te de 10 a 15 a m in o á c id o s , inc lu so m ás p re fe rib le m e n te 15 a m in o á c id o s o el d e riva d o in m u n o d o m in a n te com p arte una h om o log ía o ide n tid ad en to d a su long itud con una parte co rre sp o n d ie n te de una se cu e n c ia de a m in o á c id o s de re fe re n c ia de al m e n o s 75 %, m ás p re fe rib le m e n te al m e n o s 80 %, al m e n o s 85 %, al m e n o s 90 %, al m e no s 93 %, al m e no s 95 %, al m e no s 97 %, al m enos 98 % o al m enos 99 %, en la que la se cu e n c ia de a m in o á c id o s de re fe re n c ia es cu a lq u ie ra de las S E Q ID NO : 1, S E Q ID NO: 2, S E Q ID NO: 3, S E Q ID NO: 4, S E Q ID NO: 5, S E Q ID NO:<6>, S E Q ID NO: 7, S E Q ID NO :<8>o S E Q ID NO : 9.
2. La p ro te ína , fra g m e n to in m u n o d o m in a n te , d e riva d o in m u n o d o m in a n te o va r ia n te de e m p a lm e in m u n o d o m in a n te para su uso seg ún la re iv in d ica c ió n<1>,
en la q ue la p ro te ín a G D P -L -fu co s a s in ta sa
a) tie n e la se cu e n c ia de a m in o á c id o s com o se e s ta b le ce en S E Q ID NO: 1 o
b) tie n e una se cu e n c ia de a m in o á c id o s que es al m e no s 85 %, p re fe rib le m e n te al m e no s 90 %, m ás p re fe rib le m e n te al m e no s 95 % idé n tica a la se cu e n c ia de a m in o á c id o s com o se e s ta b le ce en S E Q ID NO: 1 o c) tie n e una se cu e n c ia de a m in o á c id o s que es al m e no s 70 %, p re fe rib le m e n te al m e no s 80 %, m ás p re fe rib le m e n te al m e no s 90 % h o m ó lo g a a la se cu e n c ia de a m in o á c id o s com o se e s ta b le ce en S E Q ID NO : 1 o
d) tie n e una se cu e n c ia de a m in o á c id o s que es al m e no s 60 %, p re fe rib le m e n te al m e no s 70 %, m ás p re fe rib le m e n te al m e no s 80 %, inc lu so m ás p re fe rib le m e n te al m e no s 90 % h om ó log a a la se cu e n c ia de a m in o á c id o s co m o se e s ta b le ce en S E Q ID NO: 1 y la p ro te ín a o el fra g m e n to in m u n o d o m in a n te o la va r ia n te de e m p a lm e in m u n o d o m in a n te de la m ism a se une a un a le lo H L A au tó lo go , es re co n o c id o p o r una cé lu la T y /o es re co n o c id o p or un a n ticu e rp o q ue se une a o re co n o ce la se cu e n c ia de a m in o á c id o s com o se e s ta b le ce en S E Q ID NO: 1 o un fra g m e n to in m u n o d o m in a n te de la m ism a o
e) e stá co d ifica d o p o r un gen TSTA3, en p a rtic u la r p o r una se cu e n c ia g én ica de n u c le ó tid o s 143612618 a 143618048 de N C _ 000008.11 , o e stá co d ifica d o p o r un gen q ue es al m e n o s 80 %, p re fe rib le m e n te al m enos 90 %, inc lu so m ás p re fe rib le m e n te al m e no s 95 % idé n tico a la se cu e n c ia g é n ica de n u c le ó tid o s 143612618 a 143618048 de N C _000008.11 y /o
en la que el m ie m b ro de la fa m ilia de p ro te ín a s R A S G R P
f) tie n e la se cu e n c ia de a m in o á c id o s co m o se e s ta b le ce en cu a lq u ie ra de las S E Q ID NO: 2, S E Q ID NO: 3, S E Q ID NO: 4, S E Q ID NO: 5, S E Q ID NO:<6>, S E Q ID NO : 7, S E Q ID NO :<8>o S E Q ID NO: 9 o
g) tie n e una se cu e n c ia de a m in o á c id o s que es al m e no s 85 %, p re fe rib le m e n te al m e no s 90 %, m ás p re fe rib le m e n te al m e n o s 95 % idé n tica a la se cu e n c ia de a m in o á c id o s com o se e s ta b le ce en cu a lq u ie ra de las S E Q ID NO: 2, S E Q ID NO: 3, S E Q ID NO : 4, S E Q ID NO: 5, S E Q ID NO:<6>, S E Q ID NO : 7, S E Q ID NO :<8>o S E Q ID NO: 9 o
h) tie n e una se cu e n c ia de a m in o á c id o s que es al m e no s 70 %, p re fe rib le m e n te al m e no s 80 %, m ás p re fe rib le m e n te al m e no s 90 % h o m ó lo g a a la se cu e n c ia de a m in o á c id o s com o se e s ta b le ce en c u a lq u ie ra de las S E Q ID NO: 2, S E Q ID NO: 3, S E Q ID NO : 4, S E Q ID NO: 5, S E Q ID NO:<6>, S E Q ID NO : 7, S E Q ID NO :<8>o S E Q ID NO: 9 o
i) tie n e una se cu e n c ia de a m in o á c id o s que es al m e no s 60 %, p re fe rib le m e n te al m e no s 70 %, m ás p re fe rib le m e n te al m e no s 80 %, inc lu so m ás p re fe rib le m e n te al m e no s 90 % h om ó log a a la se cu e n c ia de a m in o á c id o s com o se e s ta b le ce en c u a lq u ie ra de las S E Q ID NO: 2, S E Q ID NO: 3, S E Q ID NO: 4, S E Q ID NO : 5, S E Q ID NO:<6>, S E Q ID NO: 7, S E Q ID NO:<8>o S E Q ID NO: 9 y la p ro te ína o el fra g m e n to in m u n o d o m in a n te o la va r ia n te de e m p a lm e in m u n o d o m in a n te de la m ism a se une a un a le lo H L A a u tó logo , es re co n o c id o p o r una cé lu la T y /o es re co n o c id o p o r un a n ticu e rp o que se une a o re co n o ce la se cu e n c ia de a m in o á c id o s re spe ctiva com o se e s ta b le ce en cu a lq u ie ra de S<e>Q ID NO: 2, S E Q ID NO: 3, S E Q ID NO: 4, S E Q ID NO : 5, S E Q ID NO :<6>, S E Q ID NO: 7, S E Q ID NO:<8>o S E Q ID NO: 9 o un fra g m e n to in m u n o d o m in a n te de la m ism a o
j) e stá co d ifica d o p o r un gen RASG R P, en p a rtic u la r p o r una se cu e n c ia g én ica de n u c le ó tid o s
- 38488101 a 38565575 de N C _ 000015.10 ,
- 64726911 a 64745456 de N C _ 000011.10 ,
- 33436324 a 33564750 de N C _ 000002.12 , o
- 38409051 a 38426305 de N C _ 000019.10 ,
o e stá co d ifica d o p o r un gen q ue es al m e no s 80 %, p re fe rib le m e n te al m e no s 90 %, inc lu so m ás p re fe rib le m e n te al m e n o s 95 % idé n tico a la se cu e n c ia g é n ica de nuc leó tido s .
- 38488101 a 38565575 de N C _ 000015.10 ,
- 64726911 a 64745456 de N C _ 000011.10 ,
- 33436324 a 33564750 de N C _ 000002.12 , o
- 38409051 a 38426305 de N C _ 000019.10.
3. La p ro te ína , fra g m e n to in m u n o d o m in a n te , d e riva d o in m u n o d o m in a n te o va r ia n te de e m p a lm e in m u n o d o m in a n te para su uso seg ún la re iv in d ica c ió n<2>, en la q ue el fra g m e n to in m u n o d o m in a n te es a) al m enos 85 %, p re fe rib lem e n te al m enos 90 %, m ás p re fe rib lem e n te al m enos 95 % idén tico a una secuencia de a m in o á c id o s co rre sp o n d ie n te re sp e c tiva o
b) al m e no s 70 %, p re fe rib le m e n te al m e no s 80 %, m ás p re fe rib le m e n te al m e no s 90 % h om ó log o a una se cu e n c ia de a m in o á c id o s co rre sp o n d ie n te re sp e c tiva o
c) al m e n o s 60 %, p re fe rib le m e n te al m e no s 70 %, m ás p re fe rib le m e n te al m e no s 80 %, inc lu so m ás p re fe rib le m e n te al m e no s 90 % h o m ó lo g o a una se cu e n c ia de a m in o á c id o s co rre sp o n d ie n te re sp e c tiva y se une a un a le lo H L A au tó lo go , es re co n o c id o p o r una cé lu la T y /o es re co n o c id o p o r un a n ticu e rp o q ue se une a o re co n o ce la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s re spe ctiva .
4. La p ro te ína , fra g m e n to in m u n o d o m in a n te , d e riva d o in m u n o d o m in a n te o va r ia n te de e m p a lm e in m u n o d o m in a n te para su uso según cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1 a 3, en la que el fra g m e n to in m u n o d o m in a n te co m p re n d e una se cu e n c ia se le cc io n a d a del g rupo que co m p re n d e S E Q ID NOs: 10 a 98, p re fe rib le m e n te S E Q ID N O s: 10 a 35, p re fe rib le m e n te co n s is te en una se cu e n c ia s e le cc io n a d a de l g rup o que co m p re n d e S E Q ID NO: 10 a 98, p re fe rib le m e n te S E Q ID N O s: 10 a 35.
5. La p ro te ína , fra g m e n to in m u n o d o m in a n te , d e riva d o in m u n o d o m in a n te , va r ia n te de e m p a lm e in m u n o d o m in a n te , se cu e n c ia de n u c le ó tid o s y /o se cu e n c ia g én ica para su uso según cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1 a 4, en la que al m e no s una p ro te ína , fra g m e n to in m u n o d o m in a n te , d e riva d o in m u n o d o m in a n te y /o va r ia n te de e m p a lm e in m u n o d o m in a n te está a co p la d o a un p o rta d o r y /o el p o rta d o r co n tie n e al m e no s una p ro te ína , fra g m e n to in m u n o d o m in a n te , d e riva d o in m u n o d o m in a n te , va r ia n te de e m p a lm e in m u n o d o m in a n te , se cu e n c ia de n u c le ó tid o s y /o se cu e n c ia gén ica .
<6>. La p ro te ína , fra g m e n to in m u n o d o m in a n te , d e riva d o in m u n o d o m in a n te , va r ia n te de e m p a lm e in m u n o d o m in a n te , s e cu e n c ia de n u c le ó tid o s y /o se cu e n c ia g é n ica para su uso seg ún la re iv in d ica c ió n 5, en la q ue el p o rta d o r se se le cc io n a del g rup o q ue co m p re n d e una cé lu la , p re fe rib le m e n te una cé lu la san gu íne a , una p ro te ína , un líp ido, un g lico líp id o , una perla , una n a n o p a rtícu la , una p a rtícu la s im ila r a un v iru s (V L P ) y una m o lécu la , ta l co m o una m o lé cu la de azúcar, y cu a lq u ie r co m b in a c ió n de los m ism os.
7. La p ro te ína , fra g m e n to in m u n o d o m in a n te , d e riva d o in m u n o d o m in a n te , va r ia n te de e m p a lm e in m u n o d o m in a n te , s e cu e n c ia de n u c le ó tid o s y /o se cu e n c ia g é n ica para su uso seg ún la re iv in d ica c ió n<6>, en la q ue la p ro te ína , el fra g m e n to in m u n o d o m in a n te , el d e riva d o in m u n o d o m in a n te y /o la va r ia n te de e m p a lm e in m u n o d o m in a n te se e xp re sa p o r la cé lu la , p re fe rib le m e n te la cé lu la san gu íne a .
<8>. La p ro te ína , fra g m e n to in m u n o d o m in a n te , d e riva d o in m u n o d o m in a n te , va r ia n te de e m p a lm e in m u n o d o m in a n te , se cu e n c ia de n u c le ó tid o s y /o s e cu e n c ia g én ica para su uso según la re iv in d ica c ió n<6>o 7, en la q ue la cé lu la sa n g u ín e a es un g ló b u lo ro jo o b lanco .
9. La p ro te ína , fra g m e n to in m u n o d o m in a n te , d e riva d o in m u n o d o m in a n te , va r ia n te de e m p a lm e in m u n o d o m in a n te , se cu e n c ia de n u c le ó tid o s y /o se cu e n c ia g én ica para su uso según cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s<6>a<8>, en la que el p o rta d o r es una cé lu la sa n g u ín e a y la cé lu la sa n g u ín e a está a co p la d a q u ím ic a m e n te m e d ia n te un a g e n te de a co p la m ie n to , p re fe rib le m e n te m e d ia n te 1 -e til-3 -(3 -d im e tila m in o p ro p il) -ca rb o d iim id a (E C D I/E D C ), a la al m e no s una p ro te ína , fra g m e n to in m u n o d o m in a n te , d e riva d o in m u n o d o m in a n te y /o va r ia n te de e m p a lm e in m u n o d o m in a n te .
10. Un m é to do de fa b rica c ió n de la cé lu la sa n g u ín e a a co p la d a q u ím ica m e n te seg ún se d e fine en la re iv in d ica c ió n 9, que co m p re n d e a g re g a r al m enos una p ro te ína , fra g m e n to in m u n o d o m in a n te , d e riva d o in m u n o d o m in a n te y /o v a r ia n te de e m p a lm e in m u n o d o m in a n te a una cé lu la sa n g u ín e a , q ue ha s ido a is la d a de un su je to hum ano , y a g re g a r p o s te rio rm e n te el a g e n te de a co p la m ie n to , p re fe rib le m e n te ED C.
11. La p ro te ína , fra g m e n to in m u n o d o m in a n te , d e riva d o in m u n o d o m in a n te , va r ia n te de e m p a lm e in m u n o d o m in a n te , se cu e n c ia de n u c le ó tid o s y /o se cu e n c ia g én ica para su uso según cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1 a 4, en la que al m e no s una p ro te ína , fra g m e n to in m u n o d o m in a n te , d e riva d o in m u n o d o m in a n te , v a r ia n te de e m p a lm e in m u n o d o m in a n te , se cu e n c ia de n u c le ó tid o s y /o se cu e n c ia g é n ica y un p o rta d o r fa rm a c é u tic a m e n te a ce p ta b le e stán co m p re n d id o s en una co m p o s ic ió n fa rm a cé u tica .
12. La p ro te ína , fra g m e n to in m u n o d o m in a n te , d e riva d o in m u n o d o m in a n te , va r ia n te de e m p a lm e in m u n o d o m in a n te , se cu e n c ia de n u c le ó tid o s y /o se cu e n c ia g én ica para su uso según cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1 a 9 u 11, en la que al m e no s una p ro te ína , fra g m e n to in m u n o d o m in a n te , d e riva d o in m u n o d o m in a n te , va r ia n te de e m p a lm e in m u n o d o m in a n te , se cu e n c ia de n u c le ó tid o s y /o se cu e n c ia g é n ica se a p lica m e d ia n te a d m in is tra c ió n nasal, inha lada , oral, su b cu tá n e a (s.c.), in tra ce ló m ica (i.c.), in tra m u scu la r (i.m .), in tra d é rm ica (i.d .), tra n s d é rm ica (t.d .) o in tra ve n o sa (i.v.), p re fe rib le m e n te m e d ia n te a d m in is tra c ió n i.v., s.c., i.d., t.d ., oral, inh a lad a , nasa l o a co p la d a a un portador, p re fe rib le m e n te un g ló b u lo rojo.
13. La p ro te ína , fra g m e n to in m u n o d o m in a n te , d e riva d o in m u n o d o m in a n te , va r ia n te de e m p a lm e in m u n o d o m in a n te , se cu e n c ia de n u c le ó tid o s y /o se cu e n c ia g én ica para su uso según cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1 a 9 u 11 a 12, en la q ue M S es M S tem p ra na , s ín d rom e c lín ica m e n te a is la do (C IS ), s ín d rom e ra d io ló g ica m e n te a is la d o (R IS ) o e sc le ro s is m ú ltip le re cu rre n te -re m ite n te te m p ra n a (R R M S ).
14. Un m é to do in v itro para id e n tif ica r un su je to h um a no a d e cu a d o para la to le riza c ió n a a u to a n tíg e n o s en MS, p re fe rib le m e n te M S te m p ra n a , C IS , R IS o R R M S , o para d ia g n o s tic a r MS, en p a rtic u la r M S de p a tró n II, q ue co m p re n d e m e d ir la re ac tiv ida d de las cé lu las T o b te n id a s p re v ia m e n te de la sangre , C S F u o tro flu id o co rpo ra l de l su je to y /o a n ticu e rp o s co n tra la p ro te ína , fra g m e n to in m u n o d o m in a n te , d e riva d o in m u n o d o m in a n te y /o v a r ia n te de e m p a lm e in m u n o d o m in a n te según cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1 a 4 y /o co n tra el p o rta d o r com o se d e fin e en cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 5 a 9.
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