ES3044007T3 - Nucleic acid carrier and method for administering nucleic acid - Google Patents

Nucleic acid carrier and method for administering nucleic acid

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ES3044007T3
ES3044007T3 ES20836641T ES20836641T ES3044007T3 ES 3044007 T3 ES3044007 T3 ES 3044007T3 ES 20836641 T ES20836641 T ES 20836641T ES 20836641 T ES20836641 T ES 20836641T ES 3044007 T3 ES3044007 T3 ES 3044007T3
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Masahiko Kuroda
Masakatsu Takanashi
Shin-ichiro OHNO
Tomohiro UMEZU
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Tokyo Medical University
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Abstract

Se proporciona un nuevo portador para introducir un ácido nucleico, por ejemplo, ARNi, en una célula. El portador de ácido nucleico, según la presente invención, se caracteriza por comprender una vesícula de una planta de la familia Malpighiaceae, preferiblemente una vesícula derivada de acerola. El método, según la presente invención, para administrar un ácido nucleico se caracteriza por comprender una etapa para formar un complejo entre un ácido nucleico y el portador de ácido nucleico, según la presente invención, y una etapa para administrar dicho complejo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0002] Portador de ácido nucleico y método para administrar ácido nucleico
[0003] Campo técnico
[0004] La presente invención se refiere a un portador para un ácido nucleico y a un método para administrar un ácido nucleico.
[0005] Antecedentes de la técnica
[0006] Recientemente se han realizado intentos de aplicación de reactivos de ácidos nucleicos en el campo de la medicina, tales como ARNip, ARN de horquilla corta (ARNhc) y microARN (miARN) que suprimen la expresión génica. Sin embargo, los sistemas de suministro de fármacos (DDS, por sus siglas en inglésDrug Delivery Systems)para permitir la absorción de los reactivos de ácido nucleico en las células están todavía en desarrollo, y todavía no se ha establecido un portador capaz de mantener un ácido nucleico y permitir de manera reproducible la absorción del ácido nucleico en las células. Wang et al. (2013,Nature Comm.,vol. 4, núm. 1867, págs. 1-11) enseñan el suministro de agentes terapéuticos mediante nanopartículas hechas de lípidos derivados del pomelo. El documento US2014/0308212 enseña composiciones que comprenden un agente terapéutico encapsulado por una microvesícula derivada de plantas comestibles y su uso en diversas indicaciones médicas. Los documentos WO2017/004526 y US2018/362974 enseñan el uso de composiciones de microvesículas derivadas de plantas para el suministro de miARN, tal como para tratar el cáncer.
[0007] Compendio de la invención
[0008] Problema técnico
[0009] Por lo tanto, un objeto de la presente invención es proporcionar un nuevo portador para introducir un ácido nucleico tal como un ARNip en una célula.
[0010] Solución al problema
[0011] Con el fin de lograr el objetivo anterior, un portador para un ácido nucleico de la presente invención incluye vesículas de un fruto de planta, en donde el fruto de planta es un fruto de una planta de la familia Malpighiaceae. Un reactivo de ácido nucleico de tipo suministro de la presente invención incluye el portador para un ácido nucleico de la presente invención y un ácido nucleico, en donde el portador para un ácido nucleico y el ácido nucleico forman un conjugado.
[0012] Un método para producir un reactivo de ácido nucleico de tipo suministro según la presente invención incluye dejar que el portador para un ácido nucleico de la presente invención y un ácido nucleico coexistan en un disolvente para formar así un conjugado del portador para un ácido nucleico y el ácido nucleico.
[0013] Un métodoin vitropara administrar un ácido nucleico según la presente invención incluye formar un conjugado del portador para un ácido nucleico de la presente invención y un ácido nucleico y administrar el conjugadoin vitro.
[0014] La invención también proporciona un conjugado, formado por el portador para un ácido nucleico de la presente invención y un ácido nucleico, para uso en terapia, tal como la terapia génica.
[0015] Efectos ventajosos de la invención
[0016] Por ejemplo, el portador para un ácido nucleico de la presente invención puede soportar fácilmente un ácido nucleico y, además, puede introducir el ácido nucleico así soportado en células. Por lo tanto, se puede decir que la presente invención es muy útil como DDS, por ejemplo, en el campo de la medicina, tal como la terapia génica.
[0017] Breve descripción de los dibujos
[0018] [FIG. 1] La FIG. 1 es un gráfico que muestra una distribución del tamaño de partículas de vesículas derivadas de la acerola del ejemplo 1.
[0019] [FIG. 2] La FIG. 2 es un gráfico que muestra la expresión de un reactivo de ácido nucleico del ejemplo 1. [FIG. 3] La FIG. 3 incluye fotografías que muestran la absorción del reactivo de ácido nucleico usando las vesículas del ejemplo 1.
[0020] [FIG. 4] La FIG. 4 es un gráfico que muestra la absorción del reactivo de ácido nucleico usando las vesículas del ejemplo 1 en células SiHa y la supresión de la expresión de un objetivo.
[0022] [FIG. 5] La FIG. 5 es un gráfico que muestra la absorción del reactivo de ácido nucleico usando las vesículas el ejemplo 1 en células NHDF y la supresión de la expresión de un objetivo.
[0024] [FIG. 6] La FIG. 6 es un gráfico que muestra los resultados de la confirmación de la formación de conjugado entre vesículas y un reactivo de ácido nucleico comparando los niveles de amplificación del reactivo de ácido nucleico en el ejemplo 2.
[0026] [FIG. 7] La FIG. 7 es un gráfico que muestra los resultados de la confirmación de los efectos del choque térmico y el enfriamiento sobre hielo en la formación del conjugado, basándose en los niveles de amplificación del reactivo de ácido nucleico en el ejemplo 2.
[0028] [FIG. 8] La FIG. 8 es un gráfico que muestra los resultados de la confirmación de los efectos de las condiciones de incubación en la formación del conjugado, basándose en los niveles de amplificación del reactivo de ácido nucleico en el ejemplo 2.
[0030] [FIG. 9] La FIG. 9 es un gráfico que muestra los resultados de la confirmación de las correlaciones entre la formación del conjugado y la cantidad de vesículas añadidas, basándose en los niveles de amplificación del reactivo de ácido nucleico en el ejemplo 2.
[0032] [FIG. 10] La FIG. 10 incluye gráficos que muestran los resultados de la confirmación de la supresión de la degradación de un reactivo de ácido nucleico por vesículas, basándose en los niveles de amplificación del reactivo de ácido nucleico en el ejemplo 3.
[0034] [FIG. 11] La FIG. 11 es un gráfico que muestra la introducción de un reactivo de ácido nucleico en células mediante la formación de conjugados en el ejemplo 4.
[0036] [FIG. 12] La FIG. 12 es un diagrama esquemático que muestra la introducción de un reactivo de ácido nucleico en ratones mediante la formación de conjugados en el ejemplo 5.
[0038] [FIG. 13] La FIG. 13 es un gráfico que muestra los niveles de amplificación de un reactivo de ácido nucleico en órganos cuando el reactivo de ácido nucleico se introducía (administraba) en ratones mediante la formación de conjugados en el ejemplo 5.
[0040] [FIG. 14] La FIG. 14 incluye gráficos que confirman la función de un reactivo de ácido nucleico introducido en ratones como conjugado en el ejemplo 5.
[0042] [FIG. 15] La FIG. 15 incluye gráficos que muestran los resultados de la confirmación de la supresión de la degradación de un reactivo de ácido nucleico por vesículas, basándose en los niveles de amplificación del reactivo de ácido nucleico en el ejemplo 6.
[0044] Descripción de realizaciones
[0046] A menos que se especifique lo contrario, los términos utilizados en el presente documento pueden entenderse en el sentido comúnmente utilizado en la técnica.
[0048] (1) Portador de ácido nucleico
[0050] Como se describió anteriormente, un portador para un ácido nucleico (en lo sucesivo también denominado "portador de ácido nucleico") de la presente invención incluye vesículas de un fruto de planta. Los autores de la presente invención descubrieron que las vesículas de un fruto de planta soportan un ácido nucleico, un conjugado (en lo sucesivo denominado también "complejo") del ácido nucleico y las vesículas es absorbido en las células, y el ácido nucleico así soportado es funcional en las células, y así establecieron la presente invención. La característica de la presente invención es que el portador de ácido nucleico incluye las vesículas, y no hay limitaciones particulares en cuanto a las otras configuraciones y condiciones, excepto como se establece a continuación.
[0052] La planta de la que se deriva el fruto de planta es una planta de la familia Malpighiaceae.
[0054] No hay ninguna limitación particular sobre el tipo de planta de la familia Malpighiaceae, y sus ejemplos incluyen plantas del género Malpighia, más específicamente, por ejemplo, especies de acerola (Malpighia sp.) y similares, y preferiblemente acerolas tales como M. emarginata DC., M. glabra y M. punicifolia.
[0056] Las vesículas se pueden obtener del fruto de cualquiera de las plantas descritas anteriormente. El fruto puede estar completamente maduro o inmaduro (no estar todavía completamente maduro), o puede ser una mezcla de los mismos, por ejemplo. Es preferible que las vesículas estén, por ejemplo, en forma de una fracción vesicular que se recoge del jugo del fruto y que se describirá más adelante.
[0058] Las vesículas se pueden preparar, por ejemplo, mediante extracción del jugo de planta descrita anteriormente. No hay limitación particular en el método de preparación y, por ejemplo, las vesículas se pueden obtener triturando el fruto, preparando un producto triturado o una suspensión del producto triturado y fraccionando las vesículas usando un método de ultrafiltración, un método de ultracentrifugación, un método de gradiente de concentración, un método de separación usando un sistema de microlíquidos u otros métodos. El método de preparación se puede realizar usando, por ejemplo, un kit disponible en el mercado, y se puede usar el kit ExoEasy Maxi (nombre comercial, disponible de QIAGEN), ExoQuick (nombre comercial, disponible de System Bioscience), un reactivo de aislamiento total de exosomas (nombre comercial, disponible de Invitrogen) y similares. Las vesículas también se pueden preparar, por ejemplo, obteniendo un jugo exprimiendo el fruto y sometiendo el jugo así obtenido a cualquiera de los diversos métodos de separación tales como los descritos anteriormente. El jugo puede ser, por ejemplo, cualquiera de un jugo obtenido de un fruto completamente maduro, un jugo obtenido de un fruto inmaduro y un jugo obtenido de un fruto congelado que puede estar completamente maduro o inmaduro.
[0060] Por ejemplo, se puede usar una fracción vesicular que contiene una pluralidad de vesículas en el portador de ácido nucleico de la presente invención. No hay ninguna limitación particular en cuanto al tamaño de las vesículas, y las vesículas pueden tener un tamaño de partículas de, por ejemplo, 30 a 400 nm, 80 a 300 nm, 150 a 300 nm, 100 a 200 nm o 80 a 200 nm. Las vesículas también pueden denominarse microvesículas o nanovesículas, por ejemplo. La fracción vesicular que contiene la pluralidad de vesículas tiene un tamaño de partículas máximo de, por ejemplo, 30 a 400 nm, 80 a 300 nm, 150 a 300 nm, 100 a 200 nm u 80 a 200 nm cuando se expresa usando una distribución del tamaño de partículas. Además, en la distribución del tamaño de partículas, cuando el total de las vesículas se toma como 100%, el límite inferior del porcentaje de vesículas en el máximo descrito anteriormente (p. ej., 200 ± 20 nm) es, por ejemplo, 30% o más, 50% o más, u 80% o más, y el límite superior es, por ejemplo, 100%, 80% o menos o 70% o menos. La fracción vesicular es, por ejemplo, una fracción extraída de un jugo del fruto para tener el tamaño de partículas y la distribución del tamaño de partículas descritos anteriormente. En el caso de que la fracción vesicular se use en el portador de ácido nucleico de la presente invención, por ejemplo, se puede usar una fracción que se haya extraído del fruto de la planta usando un método de extracción que logre el tamaño de partículas y la distribución del tamaño de partículas descritos anteriormente, y esta fracción puede contener otro componente derivado del jugo.
[0062] No hay ninguna limitación particular en cuanto al método para medir el tamaño de partículas de las vesículas; por ejemplo, se pueden adoptar el análisis de seguimiento de nanopartículas y otros métodos y, por ejemplo, se puede usar el equipo disponible en el mercado (nombres de los dispositivos: NanoSight y QNano) y similares. Las vesículas pueden ser vesículas extracelulares o vesículas intracelulares, por ejemplo. Las vesículas pueden ser, por ejemplo, vesículas similares a exosomas (que tienen el mismo tamaño que los exosomas de origen humano). Las vesículas que tienen el mismo tamaño que los exosomas de origen humano pueden ser, por ejemplo, vesículas obtenidas usando un método de aislamiento similar al de los exosomas de origen humano.
[0064] El portador de ácido nucleico de la presente invención puede formar un conjugado con un ácido nucleico. Específicamente, las vesículas pueden formar un conjugado con el ácido nucleico. La formación del conjugado entre el ácido nucleico y el portador de ácido nucleico permite el suministro del ácido nucleico y, por lo tanto, el conjugado también se denominará en lo sucesivo "reactivo de ácido nucleico de tipo suministro". No hay ninguna limitación particular sobre la forma del conjugado y, por ejemplo, el conjugado puede tener una forma en la que el ácido nucleico esté encapsulado en las vesículas o una forma en la que el ácido nucleico esté soportado por una pared exterior de las vesículas. No hay ninguna limitación particular sobre el método para formar un conjugado de las vesículas y el ácido nucleico y, por ejemplo, puede ser suficiente que simplemente se dejen coexistir las vesículas y el ácido nucleico en un disolvente, o se puede usar un método común para introducir un ácido nucleico en células. En el primer caso, se puede formar un conjugado de las vesículas y el ácido nucleico, por ejemplo, dejando que las vesículas y el ácido nucleico coexistan en un disolvente e incubándolos. No hay ninguna limitación particular sobre la temperatura de incubación y, por ejemplo, la temperatura de incubación puede estar dentro de un intervalo de temperatura ambiente (p. ej., 30±10°C) o en un intervalo de temperatura (p. ej., por encima de 0°C y por debajo de 20°C) inferior al intervalo de temperatura ambiente. Preferiblemente, la temperatura de incubación está dentro de un intervalo de temperatura bajo (p. ej., 4±5°C), y más preferiblemente en condiciones de enfriamiento con hielo (p. ej., de 1°C a 6°C), porque, cuando se mezcla la RNasa, se puede evitar la degradación del ácido nucleico antes de la formación del conjugado. No hay ninguna limitación particular en el tiempo de incubación; el límite inferior es, por ejemplo, 5 minutos o más, o 15 minutos o más, y el límite superior no está particularmente limitado. Por ejemplo, se puede alcanzar una meseta en la formación del conjugado mediante incubación durante aproximadamente 30 minutos. No hay ninguna limitación particular en el disolvente y, por ejemplo, se pueden usar líquidos tales como agua, solución salina, una solución tampón tal como PBS y similares. En este último caso, por ejemplo, se pueden usar la electroporación, lipofección y otros métodos.
[0065] Hasta ahora, por ejemplo, un método en el que se introduce (encapsula) un ácido nucleico en un portador mediante electroporación o similares se ha descrito como un DDS para un ácido nucleico. Sin embargo, todavía no se ha determinado un medio eficaz en términos de reproducibilidad y similares. Además, por esta razón, por ejemplo, en un método que usa exosomas de origen animal para un DDS, se ha adoptado una técnica para modificar las propias células productoras de exosomas. Por el contrario, con el portador de ácido nucleico de la presente invención, dado que las vesículas del fruto de planta pueden formar un conjugado con el ácido nucleico, por ejemplo, simplemente dejándolas coexistir con el ácido nucleico en el disolvente como se describió anteriormente, el ácido nucleico, que es un objetivo que debe ser suministrado por un DDS, puede mantenerse muy fácilmente en las vesículas. Además, con el portador de ácido nucleico de la presente invención, por ejemplo, debido a la formación de conjugados entre el portador de ácido nucleico y las vesículas, el ácido nucleico también puede introducirse en células desde fuera de las células mediante endocitosis de las vesículas.
[0067] Como se describe anteriormente, el conjugado se puede formar, por ejemplo, simplemente dejando que coexistan el ácido nucleico y las vesículas en el disolvente y, por lo tanto, con el fin de que el ácido nucleico esté soportado por las vesículas, se puede omitir un método de transfección convencional o similar. Los ejemplos del método de transfección incluyen un método de choque térmico en el que se añade cloruro de calcio. El método de choque térmico es un método para realizar un tratamiento térmico, por ejemplo, cambiando la temperatura en la coexistencia de un portador (p. ej., células) para soportar un ácido nucleico y el ácido nucleico, realizando la incubación durante un período de tiempo predeterminado y luego devolviendo la temperatura a la temperatura original. El cambio de temperatura es, por ejemplo, de una temperatura relativamente baja (temperatura de tratamiento antes del cambio) a una temperatura relativamente alta (temperatura de tratamiento después del cambio), y es preferible que, después de la incubación a la temperatura relativamente alta, la temperatura vuelva a la temperatura relativamente baja. La cantidad de cambio en la temperatura (diferencia de temperatura antes y después del cambio) es, por ejemplo, de 5°C a 45°C, la temperatura de tratamiento antes del cambio es, por ejemplo, una temperatura baja, específicamente de 1°C a 10°C, y la temperatura de tratamiento después del cambio es, por ejemplo, una temperatura alta, específicamente de 40°C a 46°C.
[0069] Además, el portador de ácido nucleico de la presente invención puede prevenir la degradación de un ácido nucleico por RNasa, ácido, álcali y similares, por ejemplo, formando un conjugado con el ácido nucleico. Por esta razón, se puede decir que el portador de ácido nucleico de la presente invención es un inhibidor de la degradación de ácidos nucleicos.
[0071] El ácido nucleico es, por ejemplo, un reactivo de ácido nucleico para suprimir la expresión. No hay limitación particular sobre el mecanismo por el cual el reactivo de ácido nucleico suprime la expresión y, por ejemplo, el mecanismo puede ser la supresión de la expresión génica o la supresión de la expresión de proteína e incluye específicamente la inhibición de la transcripción de genes, inhibición de la traducción en proteínas, degradación de transcritos y similares. No hay limitación en el tipo de reactivo de ácido nucleico, y sus ejemplos incluyen ARNip, antisentido, ARNhc, miARN, miméticos de miARN (véase la publicación internacional W<o>2015/099122, por ejemplo) y similares.
[0073] En la formación del conjugado, no hay limitación particular en la relación de la cantidad de vesículas añadidas a la cantidad de ácido nucleico y, por ejemplo, con respecto a 1 pmol del ácido nucleico, las vesículas se añaden en una cantidad de 5x104 a 8x104 partículas, de 2x105 a 5x105 partículas, o de 2x106 a 5x106 partículas.
[0074] No hay limitación particular en el sitio en el que el portador de ácido nucleico de la presente invención puede suministrar el ácido nucleico, y los ejemplos del mismo incluyen el hígado, los intestinos (recto, tracto intestinal, estómago, etc.), el cerebro, el bazo y similares.
[0076] El portador de ácido nucleico de la presente invención es útil, por ejemplo, como producto farmacéutico, de diagnóstico y agroquímico, además de como herramienta de investigación para la agricultura, medicina, ciencias de la vida y similares.
[0078] (2) Reactivo de ácido nucleico de tipo de suministro y método para producir el mismo de la presente invención
[0079] Como se describe anteriormente, el reactivo de ácido nucleico de tipo suministro (en lo sucesivo también denominado "fármaco" o "medicamento") de la presente invención incluye el portador de ácido nucleico de la presente invención y el ácido nucleico, en donde el portador de ácido nucleico y el ácido nucleico forman un conjugado. Específicamente, las vesículas del portador de ácido nucleico de la presente invención y el ácido nucleico forman un conjugado. Las descripciones de la sección (1) anterior se pueden aplicar al reactivo de ácido nucleico de tipo suministro (el conjugado) de la presente invención.
[0081] Como se describe anteriormente, el método para producir un reactivo de ácido nucleico de tipo suministro según la presente invención incluye dejar que el portador de ácido nucleico de la presente invención y el ácido nucleico coexistan en el disolvente para formar así un conjugado del portador de ácido nucleico y el ácido nucleico. Las descripciones de la sección (1) anterior se pueden aplicar al método de producción de la presente invención.
[0082] (3) Método de administración de ácido nucleico
[0084] Como se describe anteriormente, el métodoin vitropara administrar un ácido nucleico según la presente invención incluye formar un conjugado del portador de ácido nucleico de la presente invención y un ácido nucleico y administrar el conjugadoin vitro.También se proporciona un conjugado del portador de ácido nucleico de la presente invención y un ácido nucleico, para usar en terapia, tal como la terapia génica. La característica de la presente invención es el uso del portador de ácido nucleico de la presente invención, y no hay limitaciones particulares en las otras etapas, condiciones y similares.
[0086] No hay limitación particular en el método para formar el conjugado y, por ejemplo, como se describe anteriormente, puede ser suficiente que simplemente se deje que las vesículas y el ácido nucleico coexistan, o se puede usar un método de electroporación o similar. En la presente invención, por ejemplo, el primer método es preferible porque se puede formar fácilmente un conjugado.
[0088] Cuando se forma un conjugado, no hay limitación particular en la relación entre las vesículas y el ácido nucleico y, por ejemplo, la cantidad del ácido nucleico es de 50 a 100 pmol por 2x108 vesículas.
[0090] En el método descrito en lo que antecede, la administración es administración in vitro. En este caso, el objetivo de la administración puede ser, por ejemplo, células, tejidos, órganos o similares. En los conjugados para usar según la invención, los conjugados deben administrarse in vivo. En este caso, no hay limitación particular en la vía de administración, y los ejemplos de la misma incluyen administración oral y administración parenteral. Los ejemplos de la administración parenteral incluyen administración intravenosa, administración intraarterial, administración intramuscular, administración subcutánea, administración intraperitoneal, administración tópica y similares.
[0092] El objetivo de la administración puede ser, por ejemplo, un ser humano o un animal no humano. No hay limitación particular sobre el animal no humano, y los ejemplos de los mismos incluyen ratones, ratas, conejos, perros, camellos, vacas y similares.
[0094] En lo sucesivo, la presente invención se describirá con más detalle usando los ejemplos y similares. Sin embargo, la presente invención no se limita a los ejemplos y similares a continuación. El alcance de la invención está definido por las reivindicaciones adjuntas.
[0096] Ejemplos
[0098] Ejemplo 1
[0100] Se confirmó la función de las vesículas derivadas de acerola como portadores de ácidos nucleicos. Los kits, reactivos, aparatos y similares se usaron de acuerdo con sus manuales de instrucciones. A menos que se especifique lo contrario, las condiciones para cada procedimiento fueron las mismas en los siguientes ejemplos.
[0101] (1) Preparación de vesículas
[0103] Primero, se filtraron 8 mL del jugo de fruto de acerola completamente maduro de Okinawa utilizando un filtro de membrana (nombre comercial: Filtro de membrana de PVDF Durapore (marca registrada), disponible en Millipore) con un tamaño de poros de 0,45 pm. Después, 8 mL del filtrado obtenido se sometieron a un kit (nombre comercial: exoEasy Maxi Kit, disponible de QIAGEN), las vesículas se separaron (aislaron) mediante elución utilizando 400 pl de tampón XE del kit, y la fracción eluida se ultracentrifugó (100.000 x g, 49.000 rpm, 70 minutos, 4°C) para recoger los sedimentos de las vesículas. Los sedimentos de vesícula se suspendieron en 50 pl de PBS para obtener una fracción vesicular. La fracción vesicular se sometió a un sistema de análisis de nanopartículas (nombre comercial: NanoSight, disponible en Malvern), y se confirmó una distribución del tamaño de partículas de las vesículas contenidas en la fracción vesicular.
[0105] Los resultados de la distribución del tamaño de partículas se muestran en el gráfico de la FIG. 1. En la FIG. 1, el eje vertical representa la concentración de partículas (partículas/mL) y el eje horizontal representa el tamaño de partículas (nm). Como se muestra en la FIG. 1, la concentración de vesículas de la fracción vesicular era de 2,2x108 partículas/mL, y el tamaño de partículas era el siguiente: Promedio (media) 208 nm, Modo 155 nm, S D 108 nm.
[0107] (2) Formación de conjugados
[0109] La formación de un conjugado de un reactivo de ácido nucleico y vesículas se confirmó indirectamente.
[0110] Se usaron miméticos de miARN (nombre comercial: miméticos de miR-340 Ambion (marca registrada), disponibles en Thermo Fisher Scientific) dirigidos a la MMP2 como reactivo de ácido nucleico. Primero, se mezclaron 200 pmol de los miméticos de miR-340 y 1 mL de la fracción vesicular, se añadió cloruro de calcio a estos hasta una concentración de 0,1 mol/L, y la mezcla se dejó reposar en hielo durante 30 minutos. A continuación, se llevó a cabo un método de choque térmico en el que la mezcla se dejó reposar a 42°C durante 1 minuto y nuevamente en hielo durante 5 minutos. Después de eso, la mezcla resultante se ultracentrifugó para recoger una fracción precipitada. La ultracentrifugación se realizó en condiciones (100.000 x g, 49.000 rpm, 70 minutos, 4°C; lo mismo se aplica a continuación) en las que se dejaba que precipitaran las vesículas y no se dejaba que precipitaran solos los miméticos de miARN. Se preparó un sistema en el que se añadió RNasa a la fracción precipitada a una concentración de 5 pg/mL y un sistema en el que no se añadió RNasa y se trataron a 37°C durante 1 hora. A continuación, se extrajo el ARN usando un minikit miRNeasy (nombre comercial, disponible de QIAGEN) y los miméticos de miR-340 se midieron por qRT-PCR. Estos sistemas se indican porb.La qRT-PCR se realizó añadiendo un miARN sintético(spike)(ath-miR-159) como un control sintético a una cantidad específica (0,1 pmol/L), y el miARN sintético también se midió de la misma manera (lo mismo se aplica en lo sucesivo).
[0112] A 1 mL de la fracción vesicular a la que no se añadieron los miméticos de miR-340, se añadió cloruro de calcio en una concentración de 0,1 mol/L y la mezcla se dejó reposar en hielo durante 30 minutos. A continuación, se llevó a cabo un método de choque térmico en el que la mezcla se dejó reposar a 42°C durante 1 minuto y nuevamente en hielo durante 5 minutos. Después de eso, la mezcla resultante se ultracentrifugó para recoger una fracción precipitada, se preparó un sistema en el que se añadió RNasa y un sistema en el que no se añadió RNasa y se trataron de la misma manera que los sistemas b, y se realizó la medición. Estos sistemas se indican por a.
[0113] Se mezclaron 200 pmol de los miméticos de miR-340 y 1 mL de la fracción vesicular y se dejaron reposar en hielo durante 30 minutos. Después, la mezcla se ultracentrifugó para recoger una fracción precipitada. Se preparó un sistema en el que se añadió RNasa a la fracción precipitada y un sistema en el que no se añadió RNasa y se trataron de la misma manera que los sistemas b, y se realizó la medición. En estos sistemas, no se añadió cloruro de calcio y no se aplicó el tratamiento de choque térmico. Estos sistemas se indican porc.
[0114] Se mezclaron 200 pmol de los miméticos de miR-340 y 1 mL de PBS y se dejaron reposar en hielo durante 30 minutos. Después, se preparó un sistema en el que se añadió RNasa a la mezcla y un sistema en el que no se añadió RNasa y se trataron de la misma manera que los sistemas b, y se realizó la medición. En estos sistemas, no se añadió la fracción vesicular, no se añadió cloruro de calcio, no se aplicó el tratamiento de choque térmico y no se aplicó el tratamiento de ultracentrifugación. Estos sistemas se indican pord.
[0116] Se mezclaron 200 pmol de los miméticos de miR-340 y 1 mL de PBS y se dejaron reposar en hielo durante 30 minutos. Después, la mezcla se ultracentrifugó para eliminar una fracción líquida. Se preparó un sistema en el que se añadió RNasa al residuo y un sistema en el que no se añadió RNasa al residuo y se trataron de la misma manera que los sistemas b, y se realizó la medición. En estos sistemas, no se añadió la fracción vesicular, no se añadió cloruro de calcio y no se aplicó el tratamiento de choque térmico. Estos sistemas se indican pore.
[0118] La FIG. 2 muestra los resultados. La FIG.2 es un gráfico que muestra el nivel de amplificación (nivel de detección) de los miméticos de miR-340. El eje Y representa el valor relativo del nivel de amplificación de los miméticos de miR-340. Específicamente, para cada sistema, el nivel de amplificación de los miméticos de miR-340 se normalizó por el nivel de amplificación (nivel de detección) del control sintético, ath-miR-159, y se expresó como un valor relativo respecto al valor normalizado del sistemad(al que no se añadió RNasa), que se tomó como 1. En la FIG. 2, de a aeindican los resultados con respecto a los sistemas a a e, respectivamente, y las barras del lado izquierdo son los resultados con respecto a los sistemas no tratados con RNasa (RNasa-), mientras que las barras del lado derecho son los resultados con respecto a los sistemas tratados con RNasa (RNasa+).
[0120] Como se muestra en la FIG. 2, en los sistemas a, puesto que no se añadieron los miméticos de miR-340, no se confirmó amplificación en ninguno de los sistemas de RNasa- y RNasa+. En los sistemase, aunque la mezcla antes de la ultracentrifugación contenía miméticos de miR-340 libres, el residuo después de la ultracentrifugación no contenía miméticos de miR-340 porque no se añadió la fracción vesicular y no se confirmó la amplificación. En los sistemasd, puesto que no se realizó la ultracentrifugación, aunque estaban contenidos miméticos de miR-340 libres y se confirmó la amplificación en el sistema de RNasa-, no se confirmó la amplificación en el sistema de RNasa+ debido a la degradación de los miméticos de miR-340 libres por la RNasa. Por el contrario, en los sistemasbyc, puesto que se dejó que las vesículas y los miméticos de miR-340 coexistieran mediante la adición de la fracción vesicular, la amplificación de los miméticos de miR-340 se confirmó en los sistemas tanto de RNasa- como de RNasa+. En otras palabras, se puede decir que se evitó la degradación por la RNasa como resultado de la formación de conjugados entre las vesículas y los miméticos de miR-340. Además, puesto que los sistemascpresentaban un comportamiento similar al de los sistemas b, se descubrió que es posible formar un conjugado simplemente dejando que coexistan las vesículas y los miméticos de miR-340 sin la necesidad de usar, por ejemplo, un método de choque térmico o similar.
[0122] (3) Confirmación de la absorción intracelular
[0124] Primero, se mezclaron 50 pmol de miméticos de miR-340 que estaban marcados con FITC y 1 mL de la fracción vesicular y se dejaron reposar a 4°C durante 1 hora. La mezcla se ultracentrifugó para recoger una fracción precipitada y la fracción precipitada se suspendió en 50 pl de PBS (pH 7,2). Esta suspensión se diluyó adicionalmente con el PBS a 1/10 para preparar una solución diluida. Por otro lado, se cultivaron células derivadas de cáncer de cuello uterino, SiHa, en un medio DMEM suero bovino fetal al 10% (FBS), se añadieron 5 pl de la solución diluida a 500 pl de la solución de cultivo y la mezcla se incubó durante 24 horas en una incubadora de CO<2>a 37°C. Las células cultivadas se observaron bajo un microscopio de fluorescencia. Los núcleos celulares se tiñeron con DAPI. Como ejemplos comparativos, las células se cultivaron y observaron de la misma manera, excepto que se usó solo la fracción vesicular o solo los miméticos de miR-340 marcados. La FIG. 3 muestra los resultados.
[0126] La FIG. 3 incluye micrografías de fluorescencia ampliadas, y cada una de las líneas blancas indica el contorno de una sola célula. La micrografía de fluorescencia A muestra los resultados en el caso donde solo se usaron las vesículas, la micrografía de fluorescencia B muestra los resultados en el caso donde se usaron las vesículas y los miméticos de miR-340 marcados, y la micrografía de fluorescencia C muestra los resultados en el caso donde solo se usaron los miméticos de miR-340 marcados. En la FIG. 3, en la micrografía de fluorescencia A, aunque la fluorescencia del DAPI que indica los núcleos celulares se confirmó en el centro de las células, la fluorescencia del FITC no se confirmó en las células porque no se añadieron los miméticos de miR-340 marcados. En la micrografía de fluorescencia C, aunque se confirmó la fluorescencia del FITC porque se añadieron los miméticos de miR-340 marcados, la fluorescencia fue escasa porque los miméticos de miR-340 marcados no eran introducidos por las vesículas. Por el contrario, en la micrografía de fluorescencia B, se confirmó la fluorescencia del FITC en forma de vesícula en la célula. A partir de esto, se descubrió que los miméticos de miR-340 marcados y las vesículas eran absorbidos en las células en un estado en el que los miméticos de miR-340 marcados y las vesículas formaban un conjugado.
[0128] (4) Función in vitro en el objetivo: SiHa
[0130] Primero, se mezclaron 50 pmol de los miméticos de miR-340 y 1 mL de la fracción vesicular y se dejaron reposar a 4°C durante 1 hora. La mezcla se ultracentrifugó para recoger una fracción precipitada y la fracción precipitada se suspendió en 50 pl de PBS (pH 7,2). Esta suspensión se diluyó adicionalmente con el PBS a 1/10 para preparar una solución diluida. Por otro lado, se cultivaron células derivadas de cáncer de cuello uterino, SiHa, en un medio DMEM FBS al 10%, se añadieron 5 pl de la solución diluida a 500 pl de la solución de cultivo y la mezcla se incubó durante 24 horas en una incubadora de CO<2>a 37°C. Las células cultivadas se lavaron con PBS, se extrajo el ARN de las células y los miméticos de miR-340 se midieron por qRT-PCR. Además, también se midió la expresión del ARNm de la MMP2, que era el objetivo de los miméticos de miR-340.
[0132] A modo de comparación, también se analizaron los siguientes sistemas de la misma manera: un sistema en el que solo se usó la fracción vesicular sin añadir los miméticos de miR-340; un sistema en el que se usaron 50 pmol de un ácido nucleico (nega-miR, disponible de Thermo Fisher Scientific) que no tiene la capacidad de suprimir la expresión en lugar de los miméticos de miR-340; y un sistema en el que solo se usaron los miméticos de miR-340 sin añadir la fracción vesicular.
[0134] La FIG.4 muestra los resultados. La FIG.4 es un gráfico que muestra los valores relativos del nivel de expresión de la MMP2, y el eje Y representa el valor (valor relativo) obtenido por normalización del nivel de expresión de la MMP2 con el nivel de expresión de la beta-actina, que es un gen de mantenimiento. En la FIG. 4, Acerola MV significa la fracción vesicular (lo mismo se aplica a otras figuras a continuación). Al igual que con los resultados descritos en la sección (3) anterior, los miméticos de miR-340 se detectaron en las células (no se muestran) solo en el sistema en el que se usó el conjugado de las vesículas y los miméticos de miR-340. Además, como se muestra en la FIG. 4, la supresión de la expresión de la MMP2, que era el objetivo de los miméticos de miR-340, se confirmó solo en el sistema (Acelora MV mimético miR-340) en el que se usó el conjugado de las vesículas y los miméticos de miR-340. A partir de estos resultados se puede observar que las células absorbieron los miméticos de miR-340 formando el conjugado con las vesículas, y ejercieron su función de suprimir la expresión del objetivo.
[0136] (5) Funciónin vitroen el objetivo: NHDF
[0138] Primero, 50 pmol de un reactivo de ácido nucleico, miméticos de miR-146a (nombre comercial: miméticos de miR-146a Ambion (marca registrada), disponibles de Thermo Fisher Scientific) dirigidos a un gen NF-kB, y 1 mL de la fracción vesicular se mezclaron y se dejaron reposar a 4°C durante 1 hora. La mezcla se ultracentrifugó para recoger una fracción precipitada que contenía un conjugado de los miméticos de miR-146a y las vesículas, y la fracción precipitada se suspendió en 50 pl de PBS (pH 7,2). Esta suspensión se diluyó adicionalmente con el PBS a 1/10 para preparar una solución diluida. Por otro lado, se cultivaron fibroblastos dérmicos humanos normales, NHDF, en un medio DMEM FBS al 10% de la misma manera que en la sección (4) anterior, se añadieron 5 pl de la solución diluida a 500 pl de la solución de cultivo y la mezcla se incubó durante 24 horas en una incubadora de CO<2>a 37°C. Las células cultivadas se lavaron con PBS, se extrajo el ARN de las células y los miméticos de miR-146a se midieron por qRT-PCR (ADEN mimético miR-146a). Además, también se midió la expresión del ARNm de NF-kB, que era el objetivo de los miméticos de miR-340.
[0139] Además, los siguientes sistemas también se midieron de la misma manera: un sistema (ADEN) en el que solo se usó la fracción vesicular sin añadir los miméticos de miR-146a; un sistema (ADEN nega-miR) en el que se usó un ácido nucleico (nega-miR, disponible de Thermo Fisher Scientific) que no tiene la capacidad de suprimir la expresión en lugar de los miméticos de miR-146a; y un sistema (mimético del miR-146a) de los miméticos de miR-146a al que no se añadió la fracción vesicular.
[0141] La FIG. 5 muestra los resultados. La FIG. 5 es un gráfico que muestra los valores relativos del nivel de expresión de NF-kB, y el eje Y representa el valor (valor relativo) obtenido por normalización del nivel de expresión de NF-kB con el nivel de expresión de la beta-actina, que es un gen de mantenimiento. Al igual que con los resultados con respecto a SiHa descritos en la sección (4) anterior, los miméticos de miR-146a se detectaron en las células (no se muestran) solo en el sistema en el que se usó el conjugado de las vesículas y los miméticos de miR-146a. También, como se muestra en la FIG. 5, la supresión de la expresión de NF-kB, que era el objetivo de los miméticos de miR-146a, se confirmó solo en el sistema (ADEN mimético miR-146a) en el que se usó el conjugado de las vesículas y los miméticos de miR-146a. A partir de estos resultados se puede observar que las células absorbieron los miméticos de miR-146a formando el conjugado con las vesículas, y ejercieron su función de suprimir la expresión del objetivo. Además, a partir de los resultados de la sección (4) anterior y de esta sección (5), se confirmó que las vesículas descritas anteriormente pueden formar un conjugado con un reactivo de ácido nucleico e introducir el reactivo de ácido nucleico en las células independientemente del tipo de reactivo de ácido nucleico y del tipo de células.
[0143] Ejemplo 2
[0145] La fracción vesicular del ejemplo 1 anterior se usó como vesículas derivadas de acerola, y se confirmó la función de las vesículas como portadores de ácido nucleico. A menos que se especifique lo contrario, las condiciones fueron las mismas que las del ejemplo 1 anterior.
[0147] (1) Primero, se mezclaron 1 mL de la fracción vesicular y 200 pmol del reactivo de ácido nucleico (miméticos de miR-340), se añadió cloruro de calcio a estos y la mezcla se dejó reposar en hielo durante 30 minutos. A continuación, se llevó a cabo el método de choque térmico. Después de eso, la mezcla resultante se ultracentrifugó (100.000 x g, 49.000 rpm, 70 minutos, 4°C), se extrajo el ARN de la fracción precipitada obtenida y los miméticos de miR-340 se midieron por qRT-PCR. Además de este sistema (cloruro de calcio (+)/enfriamiento en hielo (+)/choque térmico (+)), se midieron de la misma manera los siguientes sistemas en los que se cambiaron las condiciones.
[0149] Cloruro de calcio (+)/Enfriamiento en hielo (+)/Choque térmico (+)
[0151] Cloruro de calcio (-)/Enfriamiento en hielo (+)/Choque térmico (+)
[0153] Cloruro de calcio (-)/Enfriamiento en hielo (+)/Choque térmico (-)
[0155] La FIG. 6 muestra los resultados. La FIG. 6 es un gráfico que muestra el nivel de amplificación (nivel de detección) de los miméticos de miR-340 para cada sistema. El eje Y representa el valor relativo del nivel de amplificación de los miméticos de miR-340. Específicamente, para cada sistema, el nivel de amplificación de los miméticos de miR-340 se normalizó de la misma manera que en el ejemplo 1 anterior y se expresó como un valor relativo respecto al valor normalizado del sistema de cloruro de calcio (+)/enfriamiento en hielo (+)/choque térmico (+), que se tomó como 1. Como se muestra en la FIG. 6, incluso en el caso en donde se realizó el tratamiento de choque térmico sin añadir cloruro de calcio, se observó la amplificación de los miméticos de miR-340 en el ARN recogido de la fracción precipitada después de la ultracentrifugación y, además, en el caso donde no se añadió cloruro de calcio y no se realizó el tratamiento de choque térmico, se obtuvo un valor relativo más alto. A partir de esto, se descubrió que la formación de conjugados entre los miméticos de miR-340 y las vesículas se puede realizar simplemente dejando que coexistan los miméticos de miR-340 y las vesículas.
[0157] (2) Primero, se mezclaron 200 pmol del reactivo de ácido nucleico descrito anteriormente, miméticos de miR-340, y 1 mL de la fracción vesicular, y la mezcla se dejó reposar en hielo durante 30 minutos (enfriando en hielo) y luego se ultracentrifugó (UC, 100.000 x g, 49.000 rpm, 70 minutos, 4°C) para recoger una fracción precipitada. Se extrajo el ARN de la fracción precipitada y los miméticos de miR-340 se midieron por qRT-PCR. Obsérvese que no se añadió cloruro de calcio y no se aplicó el tratamiento de choque térmico. Además de este sistema (vesícula (+)/mimético de miARN (+)/enfriamiento en hielo (+)/UC (+)), también se midieron los siguientes sistemas en los que se cambiaron las condiciones. "Vesícula (-)" significa que se usó 1 mL de PBS en lugar de la fracción vesicular, "mimético de miARN (-)" significa que solo se usó la fracción vesicular sin añadir los miméticos de miR-340, y "UC (-)" significa un sistema en el que el ARN se extrajo después del enfriamiento en hielo, sin realizar la ultracentrifugación.
[0159] Vesícula (+)/mimético de miARN (+)/Enfriamiento en hielo (+)/UC (+)
[0160] Vesícula (+)/mimético de miARN (+)/Enfriamiento en hielo (+)/UC (-)
[0162] Vesícula (+)/mimético de miARN (-)/Enfriamiento en hielo (+)/UC (+)
[0164] Vesícula (+)/mimético de miARN (-)/Enfriamiento en hielo (+)/UC (-)
[0166] Vesícula (-)/mimético de miARN (+)/Enfriamiento en hielo (+)/UC (+)
[0168] Vesícula (-)/mimético de miARN (+)/Enfriamiento en hielo (+)/UC (-)
[0170] La FIG. 7 muestra los resultados. La FIG. 7 es un gráfico que muestra el nivel de amplificación (nivel de detección) de los miméticos de miR-340 para cada sistema. El eje Y representa el valor relativo del nivel de amplificación de los miméticos de miR-340. Específicamente, para cada sistema, el nivel de amplificación de los miméticos de miR-340 se normalizó de la misma manera que en el ejemplo 1 anterior y se expresó como un valor relativo respecto al valor normalizado del sistema de vesícula (-)/mimético de miARN (+)/enfriamiento en hielo (+)/UC (-), que se tomó como 1. En la FIG. 7, "ADEN" significa la fracción vesicular en el ejemplo 1 anterior, es decir, vesículas similares a exosomas derivadas de acerola (nanopartículas similares a exosomas derivadas de acerola) (lo mismo se aplica a otras figuras a continuación). Como se muestra en la FIG. 7, en los sistemas (vesícula (+)/mimético de miARN (-)) en los que no se añadieron los miméticos de miARN, no se observó amplificación de los miméticos de miR-340 independientemente de si se realizó o no la ultracentrifugación (UC (+) o (-)). En los sistemas (vesícula (-)/mimético de miARN (+)) en los que no se añadió la fracción vesicular, se observó la amplificación de los miméticos de miR-340 en el caso donde no se aplicó la ultracentrifugación (UC (-)), pero no se observó amplificación de los miméticos de miR-340 en el caso donde que se aplicó la ultracentrifugación (UC (+)). Por otro lado, en los sistemas (vesícula (+)/mimético de miARN (+)) en los que se añadieron la fracción vesicular y los miméticos de miARN, se observó la amplificación de los miméticos de miR-340 incluso en el caso donde se realizó la ultracentrifugación (UC (+)), aunque el nivel de amplificación era ligeramente inferior que en el caso donde no se realizó la ultracentrifugación (UC (-)). Puesto que no se permitió que los miméticos de miARN precipitaran solos en las condiciones en las que se realizó la ultracentrifugación, el hecho de que, debido a la coexistencia con la fracción vesicular, se observara amplificación de los miméticos de miARN en la fracción precipitada obtenida por la ultracentrifugación significa que los miméticos de miARN y las vesículas formaron un conjugado.
[0172] (3) Con respecto al sistema de cloruro de calcio (-)/enfriamiento en hielo (+)/choque térmico (-) de la sección (1) anterior, se varió el tiempo de reposo del enfriamiento en hielo y la medición se realizó de la misma manera. Además, como sistema de cloruro de calcio (-)/enfriamiento en hielo (-)/choque térmico (-), la mezcla se dejó reposar a temperatura ambiente (25°C) en lugar de enfriarse en hielo, y se varió el tiempo de reposo. Después, la medición se realizó de la misma manera.
[0174] La FIG. 8 muestra los resultados. La FIG. 8 es un gráfico que muestra el nivel de amplificación (nivel de detección) de los miméticos de miR-340 para cada sistema. El eje Y representa el valor relativo del nivel de amplificación de los miméticos de miR-340. Específicamente, para cada sistema, el nivel de amplificación de los miméticos de miR-340 se normalizó de la misma manera que en el ejemplo 1 anterior y se expresó como un valor relativo respecto al valor normalizado del sistema de enfriamiento en hielo (+) durante 60 minutos, que se tomó como 1. Como se muestra en la FIG. 8, en el caso donde que se mezclaron el reactivo de ácido nucleico y la fracción vesicular, se observó la amplificación de los miméticos de miR-340 independientemente de si la mezcla se dejó reposar en hielo o a temperatura ambiente. Puesto que los niveles de amplificación en el caso donde la mezcla se dejó reposar en hielo eran ligeramente superiores a los del caso donde la mezcla se dejó reposar a temperatura ambiente, se puede considerar que, por ejemplo, como resultado de dejar reposar la mezcla en hielo, el reactivo de ácido nucleico estaba más protegido de la degradación hasta la formación del conjugado entre el reactivo de ácido nucleico y las vesículas de la fracción vesicular.
[0176] (4) Con respecto al sistema de cloruro de calcio (-)/enfriamiento en hielo (+)/choque térmico (-) de la sección (1) anterior, la medición se realizó de la misma manera, excepto que la fracción vesicular se añadió en cantidades de 1/2, 1/10 y 1/50 respecto a la cantidad añadida en la sección (1) anterior, que se tomó como un valor relativo de 1.
[0178] La FIG. 9 muestra los resultados. La FIG. 9 es un gráfico que muestra el nivel de amplificación (nivel de detección) de los miméticos de miR-340 para cada sistema. El eje Y representa el valor relativo del nivel de amplificación de los miméticos de miR-340. Específicamente, para cada sistema, el nivel de amplificación de los miméticos de miR-340 se normalizó de la misma manera que en el ejemplo 1 anterior y se expresó como un valor relativo respecto al valor normalizado del sistema en el que el valor relativo de la cantidad de la fracción vesicular añadida era 1, donde este valor normalizado se tomó como 1. Como se muestra en la FIG. 9, en términos de la cantidad de la fracción vesicular añadida, el nivel de amplificación aumentó de una manera dependiente de la concentración.
[0180] (5) En el presente ejemplo, se mezclaron 50 |ul de la fracción vesicular (2,2x108 partículas/mL) del Ejemplo 1 con 50 pmol de un reactivo de ácido nucleico (miméticos de miR-340) de modo que la concentración final de los miméticos de miR-340 en la solución mezclada era de 1 pmol/ql (1 qmol/L). La solución mezclada se incubó en hielo durante 30 minutos y después se ultracentrifugó (100.000 x g, 49.000 rpm, 70 minutos, 4°C) para recoger así una fracción precipitada como un conjugado de las vesículas y los miméticos de miR-340. Se extrajo el ARN de la fracción precipitada y los miméticos de miR-340 se midieron por qRT-PCR. Por otro lado, como control, se extrajo el ARN de la solución mezclada incubada de la misma manera, excepto que no se realizó la ultracentrifugación y se midieron los miméticos del miR-340. El nivel de amplificación medido se normalizó de la misma manera que en el ejemplo 1 anterior, y se obtuvo el valor relativo del nivel de amplificación del ejemplo con respecto al valor normalizado del control, que se tomó como 100%. Como resultado, el valor relativo del nivel de amplificación del ejemplo era 60%.
[0182] El control descrito anteriormente contenía todos los miméticos de miR-340. Por otro lado, en el ejemplo descrito anteriormente, puesto que los miméticos de miR-340 libres se eliminaron mediante la ultracentrifugación, el nivel de amplificación era un nivel de amplificación de los miméticos de miR-340 que formaban el conjugado. Por lo tanto, se descubrió que, en las condiciones del presente ejemplo, se pueden usar 30 pmol de miméticos de miR-340 como conjugado con 1,1 x 107 partículas de vesículas.
[0184] Ejemplo 3
[0186] Se confirmó el efecto de las vesículas derivadas de acerola en la resistencia de un reactivo de ácido nucleico. A menos que se especifique lo contrario, las condiciones fueron las mismas que las del ejemplo 1 o 2 anteriores.
[0187] En el ejemplo 3, de la misma manera que en la sección (2) del ejemplo 2 anterior, el reactivo de ácido nucleico, miméticos de miR-340, y la fracción vesicular se mezclaron y se dejaron reposar en hielo durante 30 minutos, y después la mezcla se ultracentrifugó para recoger una fracción precipitada sin realizar el tratamiento con cloruro de calcio y el tratamiento de choque térmico. La fracción precipitada se trató en condiciones predeterminadas añadiendo varios reactivos dañinos (RNasa, HCl y NaOH) que dañan los ácidos nucleicos. Después, se extrajo el ARN y se midieron los miméticos de miR-340 por qRT-PCR. Como control del ejemplo, se extrajo el ARN sin añadir los diversos reactivos dañinos, y la medición se realizó de la misma manera.
[0188] Se usaron RNasa, HCl y NaOH como reactivos. La RNasa se añadió a la fracción precipitada a una concentración de 5 pg/mL y el tratamiento se realizó a 37°C durante 1 hora. Después, se extrajo el ARN. El HCl se añadió a la fracción precipitada a una concentración de 1x10-2 mol/L (pH 2), y el tratamiento se realizó a 37°C durante 1 hora. Después, se extrajo el ARN. El NaOH se añadió a la fracción precipitada a una concentración de 1x10-2 mol/L (pH 10), y el tratamiento se realizó a 37°C durante 1 hora. Después, se extrajo el ARN.
[0190] Como ejemplo comparativo, el reactivo de ácido nucleico, mimético de miR-340, se trató en condiciones predeterminadas añadiendo los diversos reactivos dañinos (RNasa, HCl y NaOH) y sin añadir la fracción vesicular. Después, se extrajo el ARN y se midieron los miméticos de miR-340 por qRT-PCR. Los diversos reactivos descritos anteriormente se añadieron al reactivo de ácido nucleico en las mismas cantidades que las cantidades añadidas a la fracción precipitada en el ejemplo descrito anteriormente, y las condiciones de tratamiento fueron las mismas. Como control del ejemplo comparativo, se extrajo el ARN sin añadir los diversos reactivos dañinos, y la medición se realizó de la misma manera.
[0192] La FIG. 10 muestra los resultados. La FIG. 10 (A) es un gráfico que muestra los niveles de amplificación (niveles de detección) de los miméticos de miR-340 en el ejemplo, y la FlG. 10(B) es un gráfico que muestra los niveles de amplificación (niveles de detección) de los miméticos de miR-340 en el ejemplo comparativo. El eje Y de cada gráfica representa el valor relativo del nivel de amplificación de los miméticos de miR-340. En cada caso, el nivel de amplificación de los miméticos de miR-340 se normalizó de la misma manera que en el ejemplo 1 anterior y se expresó como un valor relativo respecto al valor normalizado del control, que se tomó como 1. Como se muestra en la FlG. 10(B), en el caso del ejemplo comparativo, en el que los miméticos de miR-340 se usaron solos, el nivel de amplificación de los miméticos de miR-340 disminuyó notablemente en todos los casos en los que los miméticos de miR-340 se trataron con los respectivos reactivos (RNasa, HCl y NaOH). Por otro lado, como se muestra en la FlG. 10(A), en el ejemplo, como resultado de dejar que coexistan los miméticos de miR-340 y la fracción vesicular, a diferencia del ejemplo comparativo, no se observó una disminución notable en el nivel de amplificación de los miméticos de miR-340 en ninguno de los casos donde el tratamiento se realizó con los respectivos reactivos, y se mantuvo un nivel de amplificación no inferior a la mitad de aquel del control. A partir de este resultado, se descubrió que, debido a la adición de la fracción vesicular, las vesículas y los miméticos de miR-340 forman un conjugado y, por lo tanto, se puede suprimir la degradación de los miméticos de miR-340 por varios reactivos dañinos.
[0194] Ejemplo 4
[0196] Primero, se mezclaron 50 pmol de un ARNip luc (nombre comercial: anti-luc siRNA (disponible de Gene Design) que se dirige a un gen de la luciferasa y 1 mL de la fracción vesicular del ejemplo 1 anterior, y la mezcla se dejó reposar a 4°C durante 1 hora. La mezcla se ultracentrifugó para recoger una fracción precipitada y la fracción precipitada se suspendió en 50 pl de PBS (pH 7,2). Por otro lado, las células que expresan luc de manera forzada (3LL-luc, que se obtuvieron del banco de células JCRB y en las que se introdujo un gen de luciferasa) se cultivaron en un medio DMEM FBS al 10% en una placa de pocillos, se añadieron 5 pl de la suspensión a 500 pl de la solución de cultivo y la mezcla se incubó durante 24 horas en una incubadora de CO<2>a 37°C. Se midió la actividad de la luciferasa en las células cultivadas. La medición de la actividad de la luciferasa en las células se realizó de la siguiente manera. Primero, se añadieron 100 pl de un reactivo Bio-Glo (nombre comercial, disponible de Promega) a la solución de cultivo después de la incubación, y la mezcla se dejó reposar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después, se midió la actividad de la luciferasa usando un luminómetro (disponible de Tecan). Además, con respecto a las células cultivadas en otra placa de pocillos en las mismas condiciones que las descritas anteriormente, el número de células se midió usando un ensayo CellTiter-Glo 2.0 (nombre comercial, disponible de Promega). Además, como controles, en un sistema ARNip luc (-)/vesícula (+) y un sistema ARNip luc (+)/vesícula (-), la actividad de la luciferasa y el número de células se midieron de la misma manera.
[0198] La FIG. 11 muestra los resultados. La FIG. 11 es un gráfico que muestra la actividad de la luciferasa, y el eje Y representa la actividad de la luciferasa normalizada por el número de células. En la FIG. 11, * indica P < 0,05. Como se muestra en la FIG. 11, la actividad de la luciferasa disminuyó significativamente cuando la fracción vesicular y el ARNip se usaron juntos.
[0200] Ejemplo 5
[0202] Se confirmó el efecto del DDSin vivode las vesículas derivadas de acerola.
[0204] (1) Administración de vesículas
[0206] Primero, se trataron 2 mL de la fracción vesicular (2,2x108 partículas/mL) del ejemplo 1 con un colorante fluorescente de tinción de membranas celulares, PKH26, para marcar con fluorescencia las vesículas contenidas en la fracción. La fracción vesicular tratada con PKH26 se ultracentrifugó (condiciones: 100.000 x g, 49.000 rpm, 70 minutos, 4°C) para recoger una fracción precipitada que contenía las vesículas marcadas con fluorescencia, y la cantidad total se suspendió en 200 pl de PBS. La cantidad total de la suspensión de las vesículas marcadas con fluorescencia se administró por vía oral a una pluralidad de ratones no manipulados genéticamente (hembras, de 8 semanas de edad, C57/BL) usando una sonda gástrica. Después, la detección de las señales de fluorescencia de los ratones individuales se realizó a lo largo del tiempo (a 1 hora, 3 horas y 6 horas) usando un dispositivo de detección de fluorescenciain vivo(nombre comercial: IVIS, disponible de Summit Pharmaceuticals International Corporation).
[0208] La FIG. 12 es un diagrama esquemático de imágenes que muestra señales de fluorescencia en varios órganos de los ratones, y la FIG. 12 muestra los sitios que presentaban señales de fluorescencia particularmente destacadas en las imágenes de la generación de imágenes de señales de fluorescencia. En la FIG. 12, cada estrella significa que se confirmó una señal de fluorescencia, y el tamaño de la estrella indica la magnitud relativa de la señal de fluorescencia, y el número de estrellas indica la extensión de la distribución de las señales de fluorescencia en cada órgano. La FIG. 12 muestra los resultados que se obtuvieron 1 hora después de la administración, y las regiones sombreadas son las regiones que presentaron fluorescencia. Como se muestra en la FIG. 12, las señales de fluorescencia se confirmaron en varias regiones (cerebro, hígado, estómago, tracto intestinal y vejiga) y, por lo tanto, se descubrió que las vesículas marcadas habían sido suministradas a las diversas regiones en el plazo de 1 hora después de la administración. A medida que pasaba el tiempo, las señales de fluorescencia se atenuaron, pero se confirmó una señal de fluorescencia localmente en el recto incluso 6 horas después de la administración.
[0210] (2) Suministro de reactivo de ácido nucleico por las vesículas
[0212] Primero, se mezclaron 200 pmol de miARN de Arabidopsis (ath-miR-159) como reactivo de ácido nucleico y 2 mL de la fracción vesicular, y la mezcla se dejó reposar en hielo durante 30 minutos (enfriamiento en hielo). Después, la cantidad total se administró por vía oral a los ratones de la misma manera que en la sección (1) anterior. Una hora después de la administración oral, se extrajeron los órganos de los ratones, se extrajo el ARN y se detectó el ath-miR-159 en los órganos por qRT-PCR. Como control, ratones a los que solo se administró el ath-miR-159 se sometieron a la detección de la misma manera.
[0214] La FIG. 13 muestra los resultados. La FIG. 13 es un gráfico que muestra los valores relativos del nivel de amplificación (nivel de detección) del ath-miR-159 en los órganos, y el eje Y representa el valor (valor relativo) del nivel de amplificación del ath-miR-159 normalizado por el nivel de amplificación de un ARN pequeño de control endógeno, RNU6B. Como se muestra en la FIG. 13, en los ratones a los que solo se administró el athmiR-159, el ath-miR-159 estaba por debajo del límite de detección en todos los órganos y no se detectó (no detectado, ND). Por otro lado, en los ratones a los que se administró el conjugado descrito anteriormente, en los órganos (hígado y tracto intestinal tal como el intestino delgado) en los que se confirmaron señales de fluorescencia fuertes en la sección (1) anterior, la expresión del ath-miR159 se confirmó de manera similar.
[0215] Además, el ath-miR159 también se confirmó en el riñón y el bazo.
[0217] (3) Expresión de la función del reactivo de ácido nucleico suministrado
[0219] En la sección (2) anterior, se confirmó que las vesículas eran capaces de suministrar el reactivo de ácido nucleicoin vivo.Por lo tanto, se confirmó si el reactivo de ácido nucleico suministrado era o no funcional en el sitio de suministro.
[0221] El reactivo de ácido nucleico y la fracción vesicular se mezclaron y se enfriaron en hielo durante 30 minutos, y la cantidad total se administró por vía oral a ratones, de la misma manera que en la sección (2) anterior, excepto que se usó el mismo reactivo de ácido nucleico, ARNip luc, que en el ejemplo 4 anterior como reactivo de ácido nucleico. Como ratones se usaron ratones transgénicos para la luciferasa (luc-Tg/C57BL/6J, 12 semanas de edad). Luego, 1 hora después de la administración, se midió la actividad de la luciferasa en los ratones individuales y en varios órganos después de la disección de la misma manera que en la sección (1) anterior usando un dispositivo de detección (nombre comercial: IVIS) (ADEN ARNip luc). Como controles, se administró solo PBS por vía oral y la actividad de la luciferasa se midió de la misma manera (Control).
[0223] La FIG. 14 muestra los resultados. La FIG. 14(A) es un gráfico que muestra la luminancia (flujo) de los ratones enteros individuales antes de la disección, y la FIG. 14(B) es un gráfico que muestra la luminancia total de los órganos extraídos (cerebro, pulmón, hígado, riñón, bazo, intestino y región ovárica, incluida la vejiga). En cada gráfico, el eje Y representa la luminancia (flujo, unidad: x108 p/s). Como se muestra en las FIGS. 14(A) y 14(B), la luminancia, que indica la actividad de la luciferasa, de los ratones a los que se administró el conjugado disminuyó significativamente, en comparación con la de los controles. La FIG. 14(B) muestra la luminancia total con respecto a los órganos en los que se confirmó el suministro del reactivo de ácido nucleico en la sección (2) anterior. Por lo tanto, con respecto a los resultados de la administración del conjugado (ADEN ARNip luc), cuando se hizo una comparación entre la luminancia de los ratones individuales en la FIG. 14(A) y la luminancia total de los órganos en la FIG. 14 (B), se confirmó una notable disminución en la luminancia en la FIG. 14(B) con respecto al control respectivo. A partir de este resultado, se descubrió que, debido a la formación del conjugado, el ácido nucleico era suministrado a los órganos respectivos y suprimía la expresión de la luciferasa.
[0224] Ejemplo 6 - Ejemplo comparativo
[0226] Se aislaron vesículas derivadas del fruto de limón y del fruto de pomelo.
[0228] De la misma manera que en el ejemplo 1 anterior, se usaron un jugo exprimido de fruto de limón completamente maduro y un jugo exprimido de fruto de pomelo completamente maduro para preparar las fracciones vesiculares respectivas, y se confirmó la distribución del tamaño de partículas de las vesículas contenidas en cada fracción vesicular. La concentración de vesículas de la fracción vesicular derivada del limón era de 1,84x10” partículas/mL, y su tamaño de partículas era el siguiente: Promedio (media) 113,7 nm, Modo 79,1 nm y SD 66,8 nm. La concentración de vesículas de la fracción vesicular derivada del pomelo era de 7,37x1012 partículas/mL, y su tamaño de partículas era el siguiente: Promedio (media) 95,7 nm, Modo 61,9 nm y SD 30,5 nm.
[0230] Se confirmó el efecto de las vesículas derivadas del limón o las vesículas derivadas del pomelo en la resistencia de un reactivo de ácido nucleico. Específicamente, la medición del reactivo de ácido nucleico, mimético de miR-340, se realizó de la misma manera que en el ejemplo 3 anterior, excepto que se usaron la fracción vesicular derivada del limón y la fracción vesicular derivada del pomelo en lugar de la fracción vesicular derivada de la acerola. Como controles del presente ejemplo, la medición se realizó de la misma manera, excepto que no se añadieron los diversos reactivos dañinos descritos anteriormente, como en el caso de los controles del ejemplo 3.
[0231] Además, el ejemplo comparativo (véase la FIG. 10(B)) para el ejemplo 3 anterior se usó como un ejemplo comparativo para el ejemplo en el que se usaron las vesículas derivadas de limón o las vesículas derivadas de pomelo.
[0233] La FIG. 15 muestra los resultados. La FIG. 15(A) es un gráfico que muestra los niveles de amplificación (niveles de detección) de los miméticos de miR-340 en el ejemplo en el que se usó la fracción vesicular derivada del limón, y la FIG. 15(B) es un gráfico que muestra los niveles de amplificación (niveles de detección) de los miméticos de miR-340 en el ejemplo en el que se usó la fracción vesicular derivada del pomelo. El eje Y de cada gráfica representa el valor relativo del nivel de amplificación de los miméticos de miR-340. En cada caso, el nivel de amplificación de los miméticos de miR-340 se normalizó de la misma manera que en el ejemplo 1 anterior y se expresó como un valor relativo respecto al valor normalizado del respectivo control, que se tomó como 1.
[0235] Como se muestra en la FIG. 10(B) descrita antes, en el caso del ejemplo comparativo, en el que los miméticos de miR-340 se usaron solos, el nivel de amplificación de los miméticos de miR-340 disminuyó notablemente en todos los casos donde los miméticos de miR-340 se trataron con los respectivos reactivos (RNasa, HCl y NaOH). Por otro lado, como se muestra en la FIG. 15(A), en el ejemplo, como resultado de dejar que coexistan los miméticos de miR-340 y la fracción vesicular derivada del limón, a diferencia del ejemplo comparativo, no se observó una disminución notable en el nivel de amplificación de los miméticos de miR-340 en ninguno de los casos donde el tratamiento se realizó con los respectivos reactivos, y se mantuvo un nivel de amplificación no inferior a la mitad de aquel del control. Además, como se muestra en la FIG. 15(B), lo mismo es válido para el ejemplo en el que se usó la fracción vesicular derivada de pomelo. A partir de estos resultado, se descubrió que, debido a la adición de la fracción vesicular, las vesículas y los miméticos de miR-340 forman un conjugado y, por lo tanto, se puede suprimir la degradación de los miméticos de miR-340 por varios reactivos dañinos.
[0236] Aunque la invención de la presente solicitud se ha descrito anteriormente con referencia a las realizaciones, la invención no está limitada a las realizaciones anteriores. Se pueden hacer diversos cambios que puede entender el experto en la técnica en la configuración y los detalles proporcionados por la presente solicitud sin apartarse del alcance de la invención. El alcance de la invención está definido por las reivindicaciones adjuntas.
[0237] Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud de patente japonesa n.° 2019-126172, presentada el 5 de julio de 2019.
[0239] Aplicabilidad industrial
[0241] Por ejemplo, el portador de ácido nucleico de la presente invención puede soportar fácilmente un ácido nucleico y, además, puede introducir el ácido nucleico así soportado en las células. Por lo tanto, se puede decir que la presente invención es muy útil, por ejemplo, en el campo de la medicina, tal como la terapia génica.

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES
1. Un portador para un ácido nucleico, comprendiendo el portador vesículas de un fruto de planta, en donde el fruto de planta es un fruto de una planta de la familia Malpighiaceae.
2. El portador para un ácido nucleico según la reivindicación 1, en donde la planta de la familia Malpighiaceae es una especie de planta de acerola (Malpighia sp.).
3. El portador para un ácido nucleico según la reivindicación 1 o 2, en donde las vesículas tienen un tamaño de partículas promedio de 30 a 400 nm.
4. El portador de un ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el ácido nucleico es un reactivo de ácido nucleico para suprimir la expresión.
5. El portador de un ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende además el ácido nucleico, en donde el ácido nucleico y las vesículas forman un conjugado.
6. Un reactivo de ácido nucleico de tipo suministro que comprende el portador para un ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y un ácido nucleico, en donde el portador para un ácido nucleico y el ácido nucleico forman un conjugado.
7. Un método para producir un reactivo de ácido nucleico de tipo suministro, comprendiendo el método: dejar que el portador para un ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y un ácido nucleico coexistan en un disolvente para formar así un conjugado del portador para un ácido nucleico y el ácido nucleico.
8. El método según la reivindicación 7, que comprende:
mezclar e incubar el portador para un ácido nucleico y el ácido nucleico en el disolvente.
9. Un métodoin vitropara administrar un ácido nucleico, comprendiendo el método:
formar un conjugado del portador para un ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un ácido nucleico; y
administrar el conjugadoin vitro.
10. El métodoin vitrosegún la reivindicación 9, en donde se deja que coexistan el portador para un ácido nucleico y el ácido nucleico para formar así un conjugado del portador para un ácido nucleico y el ácido nucleico.
11. El métodoin vitrosegún la reivindicación 9 o 10, en donde la administración es a células, tejidos u órganos.
12. Un conjugado para uso en terapia, en donde dicho conjugado está formado por el portador para un ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y un ácido nucleico.
13. Un conjugado para uso en terapia génica, en donde dicho conjugado está formado por el portador para un ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y un ácido nucleico.
14. El conjugado para uso según la reivindicación 12 o 13, en donde el conjugado se va a administrar a un ser humano o un animal no humano.
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