ES3044920T3 - Method for determining fibrinogen - Google Patents

Method for determining fibrinogen

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ES3044920T3 ES22216869T ES22216869T ES3044920T3 ES 3044920 T3 ES3044920 T3 ES 3044920T3 ES 22216869 T ES22216869 T ES 22216869T ES 22216869 T ES22216869 T ES 22216869T ES 3044920 T3 ES3044920 T3 ES 3044920T3
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Abstract

La presente invención se enmarca en el campo del diagnóstico de la coagulación sanguínea y se refiere a un método mejorado para la determinación cuantitativa de fibrinógeno en una muestra. El método comprende la adición de factor XIII a la mezcla de reacción. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0002] Procedimiento de determinación de fibrinógeno
[0003] La presente invención se encuentra en área del diagnóstico de la coagulación de la sangre y hace referencia a un procedimiento mejorado para la determinación cuantitativa de fibrinógeno en una muestra.
[0004] El fibrinógeno es el precursor soluble en agua de la fibrina, que conforma la matriz para la cicatrización de heridas. La trombina, proteasa de coagulación (factor IIa), escinde el fibrinógeno y activa así la conformación de fibrina, es decir, la conformación de coágulos. Los niveles bajos de fibrinógeno se asocian con una tendencia a las hemorragias. Los niveles de fibrinógeno agudamente elevados se encuentran a menudos en procesos inflamatorios, postoperatorios y en otras situaciones. Los niveles elevados de fibrinógeno a largo plazo se consideran un indicador de riesgo de enfermedades trombóticas.
[0005] En el estado de arte se conocen una serie de diferentes procedimientos para determinar la concentración de fibrinógeno.
[0006] La solicitud CA 1062501 describe un procedimiento de determinación de fibrinógeno basado en la medición del tiempo de trombina, aunque se sabe que el tiempo de trombina no permite una determinación precisa de la concentración de fibrinógeno porque, además del fibrinógeno, otros factores como los anticoagulantes como la heparina o los inhibidores directos de la trombina o la presencia de productos de degradación de la fibrina o del fibrinógeno pueden influir en el tiempo de trombina, y el tiempo de trombina por lo general solo resulta relevante en casos de deficiencia grave de fibrinógeno. En un procedimiento de tiempo de trombina, se suele mezclar una muestra de plasma sin diluir con una cantidad relativamente pequeña de trombina para activar la coagulación y se mide fotométricamente la conformación de fibrina, es decir, el cambio en la absorbancia de la mezcla de reacción, y a continuación se determina el tiempo de coagulación. Sin embargo, según la solicitud CA 1062501, no se determina el tiempo de coagulación; en su lugar, se determina el máximo de la primera derivada de la curva de reacción, es decir, el cambio máximo en la absorbancia de la curva de reacción. Se descubrió que el cambio máximo de absorbancia se correlaciona linealmente con la concentración de fibrinógeno, de modo que esta última puede determinarse utilizando una curva de calibración construida a partir de una correlación de concentraciones conocidas de fibrinógeno y cambios máximos de absorbancia.
[0007] Un procedimiento mucho más preciso y frecuente para determinar la concentración de fibrinógeno es el así denominado como método de Clauss (Clauss, A., Método fisiológico de coagulación rápida para la determinación de fibrinógeno. 1957, Acta haemat. 17: 237- 246). La prueba es una variante del tiempo de trombina, en la que se mezcla una muestra de plasma con trombina como activador de coagulación y se determina el tiempo de coagulación. En el método de Clauss, se combina una concentración relativamente baja de fibrinógeno con una concentración relativamente alta y estandarizada de trombina en la mezcla de reacción, por lo cual la velocidad de conformación de fibrina se correlaciona casi exclusivamente con la concentración de fibrinógeno. La concentración relativamente baja de fibrinógeno en la mezcla de reacción se suele lograr utilizando muestras de plasma prediluidas.
[0008] La conformación de fibrina, es decir, la conformación de coágulos, se determina fotométricamente en la mezcla de reacción. Debido a la conformación de fibrina, la mezcla de reacción se vuelve cada vez más turbia, de modo que la conformación de fibrina se puede medir cuantitativamente a través de una medición de absorción.
[0009] A continuación se suele determinar el tiempo de coagulación de la muestra. El tiempo de coagulación de una muestra es proporcional a la cantidad de fibrinógeno. El tiempo de coagulación de una muestra es el tiempo transcurrido desde que se añade trombina a la muestra hasta que se mide la conformación detectable de fibrina, es decir, la turbidez de la mezcla de reacción. La "conformación detectable de fibrina" se define como un valor umbral específico de la prueba y del dispositivo, que, cuando se supera, indica el tiempo de coagulación. Alternativamente, la «formación de fibrina detectable» puede definirse como un valor de diferencia de señal porcentual específico de la prueba y del dispositivo basado en la diferencia de señal antes del inicio y después de la finalización de la reacción de coagulación, que -si se consigue- indica el tiempo de coagulación. La cinética de reacción de la conformación de fibrina en una prueba de Clauss difiere significativamente de la cinética de reacción de la conformación de fibrina en una prueba de tiempo de trombina. En la prueba de Clauss, dependiendo de la concentración de fibrinógeno, la conformación de fibrina comienza a los 3 segundos de la adición del reactivo de trombina, es decir, mucho antes que en la prueba del tiempo de trombina, en la que la conformación de fibrina comienza como muy pronto a los 10 segundos. Además, la velocidad de conformación de fibrina en la prueba de Clauss es mayor que en la prueba del tiempo de trombina, al menos en muestras con concentraciones relativamente altas. Las curvas de reacción de las muestras con una concentración elevada de fibrinógeno en la prueba de Clauss se caracterizan, por lo tanto, por una fase de retardo corta, una subida pronunciada y una fase de meseta alcanzada con relativa rapidez en comparación con la prueba del tiempo de trombina. En comparación con la prueba del tiempo de trombina, las curvas de reacción de las muestras con baja concentración de fibrinógeno en la prueba de Clauss también muestran una fase de retardo corta, una pendiente plana y una fase de meseta tan tardía que suele ocurrir sólo después de finalizar la medición. Por el contrario, la fase de meseta en la prueba del tiempo de trombina es significativamente menos pronunciada o incluso inexistente.
[0010] Otro procedimiento para determinar el fibrinógeno es la determinación del así denominado como "fibrinógeno derivado", es decir, la determinación del fibrinógeno derivado de la determinación del tiempo de tromboplastina. Para ello, se mezcla una muestra de plasma con una tromboplastina (por ejemplo, factor tisular lipidado) como activador de la coagulación, y la concentración de fibrinógeno (fibrinógeno derivado) se calcula a partir de la curva de conformación de fibrina medida nefelométrica o turbidimétricamente.
[0011] Sin embargo, los procedimientos conocidos descritos, especialmente el método de Clauss, presentan la desventaja de que su rango de medición es muy limitado. Debido a que el método de Clauss requiere que la muestra se exponga a una concentración de trombina relativamente alta, de modo que la velocidad de conformación de fibrina se correlacione casi exclusivamente con la concentración de fibrinógeno, presenta la desventaja de que incluso las muestras con un contenido de fibrinógeno ligeramente elevado presentan una coagulación extremadamente rápida. Por ejemplo, las muestras con un contenido de fibrinógeno de aproximadamente 5 g/L (rango normal: 1,8-3,5 g/L) pueden presentar un tiempo de coagulación de sólo 3,8 segundos, un intervalo de tiempo que es difícil de detectar incluso para los sistemas de análisis automatizados. Las muestras con concentraciones de fibrinógeno aún más altas solo se pueden analizar de forma fiable cuando se diluyen antes de la medición (p. ej., 1:10 o 1:100 en tampón). Sin embargo, cuando cada muestra se diluyera antes de la medición para ampliar el rango de medición en el rango superior de concentración de fibrinógeno, esto limitaría automáticamente el rango de medición en el rango inferior, ya que, en muestras con un contenido reducido de fibrinógeno, la mezcla de reacción contiene tan poco fibrinógeno que sólo puede producirse una conformación de coágulo insuficiente o nula. Por lo general, muchas muestras se deben medir varias veces porque, tras la medición inicial, es necesario realizar mediciones adicionales con diferentes diluciones de muestra. Este proceso es lento y costoso.
[0012] Por lo tanto, el objeto de la presente invención consiste en proporcionar un procedimiento para determinar la concentración de fibrinógeno que -en comparación con los procedimientos conocidos para determinar fibrinógeno, en los que se prepara una mezcla de reacción mezclando una muestra generalmente diluida con al menos un activador de coagulación y se mide la conformación de fibrina en la mezcla de reacción- cubra un rango de medición ampliado en una sola medición y, por lo tanto, reduzca significativamente el número de mediciones múltiples necesarias.
[0013] Se ha descubierto que la adición de factor XIII a la muestra o a la mezcla de reacción de la muestra y el activador de la coagulación amplía el rango de medición en el rango de concentración más baja de fibrinógeno. Esto, a su vez, significa que, en muchos casos, se puede prescindir de múltiples mediciones de una muestra con un contenido reducido de fibrinógeno.
[0014] El factor XIII es conocido como la enzima que desempeña la importante función de reticular las hebras de fibrina en la conformación de coágulos. Esta reticulación estabiliza el coágulo. El plasma de individuos sanos suele contener entre el 70 % y el 140 % de factor XIII.
[0015] Por lo tanto, el objeto de la presente invención consiste en un procedimiento para la determinación de fibrinógeno en una muestra, que comprende los siguientes pasos:
[0016] a) preparar una mezcla de reacción mezclando la muestra con al menos un activador de la coagulación; y b) medir la conformación de fibrina en la mezcla de reacción, a la que se añade adicionalmente factor XIII. Preferentemente, a la mezcla de reacción se añade una cantidad de factor XIII de modo que la concentración final del factor XIII añadido en la mezcla de reacción corresponde al 5 hasta 200% del valor normal. El 100 % de la norma corresponde a la actividad del factor XIII medida en un pool de plasma de varios donantes sanos. Por ejemplo, a la mezcla de reacción se puede añadir factor XIII humano aislado (purificado a partir de plasma humano o producido sintéticamente) o factor XIII recombinante (obtenido mediante ingeniería genética).
[0017] El factor XIII añadido se puede añadir en forma de proenzima (factor XIII) que se puede activar (mediante trombina) o como una enzima ya activada (factor XIIIa).
[0018] Preferentemente, el factor XIII se mezcla con la muestra antes de añadir posteriormente el activador de la coagulación a la mezcla de reacción. Alternativamente, el factor XIII y el activador de la coagulación se pueden mezclar con la muestra simultáneamente, por ejemplo, añadiendo a la muestra un reactivo que contenga factor XIII y el activador de la coagulación.
[0019] Como activador de la coagulación resulta adecuada cualquier sustancia o mezcla de sustancias que, al añadirse a una muestra de plasma humano, active la vía extrínseca o intrínseca del sistema de coagulación sanguínea. Los activadores de la coagulación preferidos son mezclas de factor tisular, fosfolípidos (tromboplastinas) y cloruro de calcio. El factor tisular puede proceder de tejido cerebral, pulmonar o del tejido placentario de un mamífero (por ejemplo, humano o conejo), o bien puede ser recombinante o producido sintéticamente. Otro activador de la coagulación preferido es la trombina, por ejemplo, humana o bovina. Alternativamente, se pueden utilizar como activadores venenos de serpiente que activan la coagulación o una proteasa activadora de la coagulación aislada del veneno de serpiente. Otros activadores de la coagulación son los fosfolípidos y las superficies con carga negativa, como el vidrio, la sílice, el caolín, el ácido elágico, la celita y el factor 3 plaquetario.
[0020] El término "muestra" significa una muestra de plasma o sangre completa, preferentemente una muestra de plasma o sangre completa humana o animal. Las muestras de plasma o de sangre completa pueden contener un anticoagulante como citrato o EDTA, que se añade a la muestra durante la recolección para prevenir la coagulación espontánea e incontrolada.
[0021] La conformación de fibrina en la mezcla de reacción se mide preferentemente midiendo los valores de absorbancia de la mezcla a lo largo del tiempo. Los valores de absorbancia se pueden medir fotométricamente, es decir, midiendo la atenuación luminosa de un haz de luz emitido por la mezcla de reacción, o nefelométricamente, es decir, midiendo los componentes de luz dispersa de un haz de luz emitido por la mezcla de reacción. Idealmente, la medición debería comenzar inmediatamente después de añadir el activador de la coagulación a la mezcla de reacción, y los valores de absorbancia deberían medirse continuamente hasta que se complete la conformación de fibrina.
[0022] La determinación cuantitativa de fibrina se realiza evaluando la curva de extinción determinada mediante un procedimiento de evaluación conocido por el experto, como, por ejemplo, la determinación del cambio máximo de extinción y su comparación con una curva de calibración generada a partir de una correlación entre las concentraciones conocidas de fibrinógeno y los cambios máximos de extinción.
[0023] La presente invención hace referencia además a un reactivo para su uso en un procedimiento de determinación de fibrinógeno en una muestra, que contiene al menos un activador de la coagulación y factor XIII. El reactivo permite una preparación especialmente sencilla de una mezcla de reacción para la determinación de fibrinógeno según la invención.
[0024] El activador de la coagulación contenido en el reactivo puede ser, como ya se ha descrito anteriormente, cualquier sustancia o mezcla de sustancias que al añadirse a una muestra de plasma humano active la vía extrínseca y/o intrínseca del sistema de coagulación sanguínea. Preferentemente el reactivo contiene un activador de coagulación del grupo de trombina y tromboplastina.
[0025] El factor XIII contenido también en el reactivo puede ser -como ya se ha descrito anteriormente- factor XIII humano aislado o factor XIII recombinante y se puede utilizar tanto en forma de proenzima activable (factor XIII) como enzima ya activada (factor XIIIa).
[0026] Otro objeto de la presente invención consiste en un kit de prueba para su uso en un procedimiento de determinación de fibrinógeno en una muestra. El kit de prueba, según la invención, comprende i) un primer reactivo que contiene al menos un activador de la coagulación y ii) un segundo reactivo que contiene factor XIII. El activador de la coagulación contenido en el primer reactivo y el factor XIII contenido en el segundo reactivo se pueden configurar en sus respectivas formas de ejecución como ya se describió antes.
[0027] DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
[0028] Figura 1A: muestra una curva de calibración para determinar la concentración de fibrinógeno, que se determinó según el estado del arte sin adición de factor XIII a la mezcla de reacción.
[0029] Figura 1B: muestra una curva de calibración para determinar la concentración de fibrinógeno, que conforme a la invención se determinó con la adición de factor XIII a la mezcla de reacción.
[0030] Figura 2A: muestra las concentraciones de fibrinógeno (g/L) determinadas según el estado del arte de muestras con concentración de fibrinógeno conocida, que se determinaron sin añadir factor XIII a la mezcla de reacción.
[0031] Figura 2B: muestra las concentraciones de fibrinógeno (g/L) determinadas según la invención de muestras con concentración de fibrinógeno conocida, que se determinaron añadiendo factor XIII a la mezcla de reacción.
[0032] EJEMPLOS EJEMPLO 1: Prueba de fibrinógeno según Clauss en presencia de factor XIII exógeno
[0033] El concentrado de factor XIII Fibrogammin 250 (CSL Behring, Marburgo, Alemania) se absorbió en una solución acuosa que contenía 9 g/L de albúmina, 8 g/L de NaCl y 5 g/L de glucosa. La concentración de factor XIII en esta solución fue del 7100 % de la normal.
[0034] Esta solución con factor XIII se mezcló con un reactivo que contenía trombina como activador de la coagulación (Dade Thrombin Reagent, Siemens Healthineers, Marburgo, Alemania). La solución acuosa anterior también se utilizó para preparar una mezcla sin factor XIII. Las proporciones de mezcla de los distintos componentes se muestran en la Tabla 1.
[0035] Tabla 1
[0038]
[0041] Para la determinación de fibrinógeno en muestras de plasma humano (plasma humano estándar), las mezclas reactivas se prepararon de la siguiente manera:
[0042] Muestra de 24 gL (prediluida 1:3 con tampón Veronal de Owren)
[0043] Incubación de 10 segundos a 37 °C
[0044] + 76 gL de tampón Veronal de Owren
[0045] Incubación de 180 segundos a 37 °C
[0046] + 50 gL de mezcla de reactivo de trombina con/sin factor XIII.
[0047] La concentración de factor XIII en las mezclas de reacción así preparadas fue del 77,8 % y del 0 % (sin añadir factor XIII).
[0048] En la mezcla de reacción se midió continuamente la absorbancia a 405 nm y se determinó la velocidad de reacción (mA/s) en un rango entre 0 y 70 segundos.
[0049] En primer lugar, se determinaron dos curvas de calibración. Para ello, se midieron 10 veces muestras estándar de plasma humano diluidas con tampón Veronal de Owren con concentraciones de fibrinógeno de 0,25, 0,37 y 0,49 g/L en una mezcla de prueba para la determinación de fibrinógeno sin adición de factor XIII (estado del arte, figura 1A) y en una mezcla de prueba para la determinación de fibrinógeno con adición de factor XIII (según la invención, figura 1B). Los niveles de concentración 0,25, 0,37 y 0,49 g/L de fibrinógeno se prepararon considerando el valor de fibrinógeno declarado en el plasma humano estándar. Los valores medios de las determinaciones por 10 veces sirven como puntos de referencia para las curvas de calibración (figuras 1A y 1B).
[0050] A continuación, se midieron 10 veces tres muestras de plasma con concentraciones conocidas de fibrinógeno (0,25, 0,37 y 0,49 g/L) en una mezcla de prueba de fibrinógeno sin adición de factor XIII (estado del arte, figura 2A) y en una mezcla de prueba para la determinación de fibrinógeno con adición de factor XIII (según la invención, figura 2B). Los valores brutos se analizaron utilizando las curvas de calibración de la figura 1 y se determinó el coeficiente de variación para cada determinación de 10 veces.
[0051] La figura 1A muestra que, sin la adición de factor XIII, el punto de calibración inferior de 0,25 g/L de fibrinógeno está muy próximo de la velocidad de reacción de 0 mA/s. Los valores individuales se encuentran en el rango negativo (absorbancia decreciente). Solamente al promediar 10 determinaciones se obtiene un valor positivo de 0,2 mA/s. Se puede observar que no es posible una diferenciación estadística clara del punto de calibración a 0,25 g/L y a 0,37 g/L de fibrinógeno, ya que los valores brutos muestran un rango de solapamiento. Sin embargo, al añadir el factor XIII, el nivel de los valores de la pendiente (mA/s) aumenta, y el punto de calibración a 0,37 g/L se puede diferenciar claramente del punto de calibración a 0,25 g/L, debido a que ya no hay superposición (figura 1B).
[0052] La figura 2 muestra la evaluación de los valores brutos medidos utilizando las curvas de calibración de la figura 1. La muestra con el valor objetivo de 0,25 g/L de fibrinógeno presenta un amplio rango de dispersión sin la adición de factor XIII, que se superpone con la dispersión de la muestra con el valor objetivo de 0,37 g/L de fibrinógeno (figura 2A). Cuando se añade el factor XIII, la dispersión de los valores es menor y la muestra con 0,25 g/L de fibrinógeno se puede diferenciar claramente de la muestra con 0,37 g/L de fibrinógeno (figura 2B). Los coeficientes de variación son significativamente menores con la adición de factor XIII que sin ella. En este ejemplo, la adición de factor XIII da como resultado un rango de medición inferior de 0,25 g/l de fibrinógeno, mientras que sin la adición de factor XIII, sólo sería posible un rango de medición inferior de 0,37 g/l de fibrinógeno. La adición de factor XIII a la mezcla de reacción permite, por lo tanto, ampliar el rango de medición, de modo que la concentración de fibrinógeno se puede determinar de forma fiable en más muestras con bajas concentraciones de fibrinógeno utilizando el procedimiento de la invención.

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES
1. Procedimiento para la determinación de fibrinógeno en una muestra, comprendiendo el procedimiento los pasos de
a) proporcionar una mezcla de reacción mezclando la muestra con al menos un activador de coagulación y
b) medir la conformación de fibrina en la mezcla de reacción,
caracterizado porque a la mezcla de reacción se le añade adicionalmente factor XIII.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en donde a la mezcla de reacción se añade una cantidad de factor XIII de modo que la concentración final del factor XIII añadido en la mezcla de reacción corresponde al 5 hasta 200% del valor normal.
3. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en donde el activador de coagulación se selecciona del grupo de trombina y tromboplastina.
4. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en donde el factor XIII adicional añadido es factor XIII humano aislado o factor XIII recombinante.
5. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en donde el factor XIII adicional es el factor XIIIa activado.
6. Reactivo para su uso en un procedimiento para determinar fibrinógeno en una muestra, conteniendo el reactivo al menos un activador de la coagulación y factor XIII.
7. Reactivo según la reivindicación 6, en donde el activador de coagulación se selecciona del grupo de trombina y tromboplastina.
8. Reactivo según una de las reivindicaciones 6 y 7, en donde el factor XIII es factor XIII humano aislado o factor XIII recombinante.
9. Reactivo según una de las reivindicaciones 6 a 8, en donde el factor XIII es el factor XIIIa activado.
10. Kit de prueba para su uso en un procedimiento para determinar fibrinógeno en una muestra, comprendiendo el kit de prueba
i) un primer reactivo que contiene al menos un activador de coagulación y
ii) un segundo reactivo que contiene factor XIII.
11. Kit de prueba según la reivindicación 10, en donde el primer reactivo contiene un activador de coagulación del grupo de trombina y tromboplastina.
12. Kit de prueba según una de las reivindicaciones 10 y 11, en donde el segundo reactivo contiene factor XIII humano aislado o factor XIII recombinante.
13. Kit de prueba según una de las reivindicaciones 10 a 12, en donde el factor XIII en el segundo reactivo es el factor XIIIa activado.
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