ES3045557T3

ES3045557T3 - Method for determining the presence or amount of testosterone in a sample

Info

Publication number: ES3045557T3
Application number: ES20167209T
Authority: ES
Inventors: Russell Philip Grant; Matthew Crawford; Donald Walt Chandler; William Curtin
Original assignee: Laboratory Corp of America Holdings
Current assignee: Labcorp Holdings Inc
Priority date: 2011-02-07
Filing date: 2012-02-07
Publication date: 2025-11-28
Anticipated expiration: 2032-02-07
Also published as: WO2012109275A1; JP6012635B2; EP2673631A4; EP3702774C0; CN103443621B; US20120270327A1; CA2826830C; EP2673631A1; WO2012109250A1; EP3702774B1; JP2014507657A; EP3702774A1; CA2826830A1; CN103443621A; SG192661A1; US8470602B2; US9029162B2; EP2673631B1; US20120238027A1

Abstract

Se describen métodos y sistemas para el análisis de testosterona en una muestra utilizando extracción líquida asistida y cromatografía líquida-espectrometría de masas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0003] Método para determinar la presencia o cantidad de testosterona en una muestra

[0005] Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

[0007] La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud de patente provisional de Estados Unidos N.° 61/440.282, presentada el 7 de febrero de 2011.

[0009] Campo de la invención

[0011] La presente invención proporciona métodos y sistemas para determinar la presencia o cantidad de un biomarcador en una muestra. En particular, la invención proporciona métodos y sistemas para analizar testosterona en una muestra utilizando cromatografía líquida y espectrometría de masas.

[0013] Antecedentes

[0015] Los biomarcadores, tales como las hormonas, las vitaminas y/o los metabolitos, pueden utilizarse para el diagnóstico clínico de múltiples trastornos y como biomarcadores endógenos en endocrinología. Las hormonas esteroides, tales como la testosterona, son una clase importante de hormonas. La testosterona desarrolla y mantiene las características sexuales secundarias masculinas y promueve el crecimiento y el desarrollo de los espermatozoides.

[0017] Las glándulas suprarrenales y las gónadas sintetizan testosterona. Los niveles pueden elevarse en pacientes con hiperplasia suprarrenal congénita debido al bloqueo enzimático, lo que disminuye la producción de cortisol y aumenta los niveles de precursores dirigidos hacia la vía androgénica. La testosterona también puede estar elevada en mujeres con hirsutismo. El ovario puede ser una fuente importante de esta hormona en estas pacientes. La testosterona es normalmente mucho más alta en los hombres adultos que en las mujeres y los niños debido a su producción en los testículos. Los niveles en los hombres pueden disminuir en estados hipogonadales.

[0019] Los requisitos para el ensayo de diagnóstico clínico de los biomarcadores endógenos en endocrinología pueden incluir ensayos altamente sensibles y específicos, la capacidad de analizar pequeños volúmenes de muestras (p. ej., los volúmenes de muestras pediátricas pueden limitarse a menos de aproximadamente 200 j l ) y la capacidad de identificar sistemáticamente múltiples analitos para diagnosticar con precisión un estado patológico, p. ej., un trastorno endocrino. Históricamente, los métodos de radioinmunoensayo (RIA) e inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA) se han utilizado en tal ensayo de diagnóstico clínico. Sin embargo, los métodos de inmunoensayo (IA), tales como RIA y EIA, pueden presentar un bajo rendimiento, una reactividad cruzada de los anticuerpos, lo que puede requerir una preparación adicional para su especificidad, y una escalabilidad deficiente. También, el análisis de biomarcadores endógenos mediante RlA puede requerir múltiples diluciones en serie para el análisis de cada marcador individual, lo que puede llevar a la necesidad de realizar múltiples ajustes para normalizar los volúmenes de muestra y/o a la necesidad de realizar múltiples pruebas por separado. También, el ensayo de inmunoensayo no es particularmente propicio para el análisis de múltiples biomarcadores en cada muestra. El análisis de múltiples analitos en un único ensayo puede permitir el uso de muestras de tamaño reducido, lo que da como resultado ensayos de mayor sensibilidad y eficiencia por muestra. El documento US-2006/040256 describe un método conocido para analizar testosterona en una muestra utilizando LC-MS después de una etapa de purificación.

[0021] Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar técnicas analíticas que puedan utilizarse para la medición de biomarcadores endógenos y para métodos que proporcionen más sensibilidad y un mayor rendimiento que el RIA. Sin embargo, hasta hace poco, solamente la GC-M<s>o la LC-MS/MS con derivatización había dado buenos resultados con volúmenes pequeños de muestras. Por lo tanto, existe una necesidad en la técnica de técnicas de LC-MS/MS para el análisis de biomarcadores endógenos para el diagnóstico clínico en endocrinología capaces de proporcionar límites de detección a niveles aceptables, sin la necesidad de engorrosos procesos de derivatización.

[0023] Resumen de la invención

[0025] La invención proporciona un método según la reivindicación 1 y un sistema según la reivindicación 15.

[0027] Aspectos adicionales de la invención se describen con detalle a continuación.

[0029] Breve descripción de los dibujos

[0031] No aplicable.

[0033] Descripción detallada

[0035] La siguiente descripción describe varios aspectos y realizaciones de la presente invención. Ninguna realización particular pretende definir el alcance de la invención. Más bien, las realizaciones simplemente proporcionan ejemplos no limitativos de diversos métodos y sistemas que están al menos incluidos dentro del alcance de la invención. La descripción debe leerse desde la perspectiva del

[0036] experto en la técnica; por lo tanto, no se incluye necesariamente información bien conocida por el experto en la técnica.

[0037] Se pueden utilizar varias abreviaturas en la solicitud. En la mayoría de los casos, si no en todos, los significados de tales abreviaturas son conocidos por los expertos en la técnica. Estas abreviaturas incluyen las siguientes abreviaturas, cuyos significados se proporcionan.

[0038] APCI = Ionización química a presión atmosférica

[0039] CBP = Proteína de unión competitiva

[0040] HTLC = Cromatografía líquida de alta turbulencia (alto rendimiento)

[0041] HPLC = Cromatografía líquida de alto rendimiento

[0042] LLE = Extracción líquido-líquido

[0043] LOQ = Límites de cuantificación

[0044] LLOQ = Límite inferior de cuantificación

[0045] IA = Inmunoensayo

[0046] ELISA = Inmunoensayo ligado a enzimas

[0047] RIA = Radioinmunoensayo

[0048] SST = Prueba de idoneidad del sistema

[0049] ULOQ = Límite superior de cuantificación

[0050] 2D-LC-MS/MS = Cromatografía líquida bidimensional hifenada a espectrometría de masas en tándem

[0051] (LC)-LC-MS/MS = Cromatografía líquida bidimensional hifenada a espectrometría de masas en tándem

[0052] (LC)-MS/MS = Cromatografía líquida hifenada a espectrometría de masas en tándem

[0053] SLE = Extracción de líquidos con soporte

[0054] Definiciones

[0055] Se entenderá que los siguientes términos, salvo que se indique lo contrario, tienen los siguientes significados:

[0056] Como se utilizan en la presente memoria, los términos “ un” , “ uno/una” y “ el/la” pueden referirse a uno o más a menos que se indique específicamente de cualquier otro modo.

[0057] Como se utiliza en la presente memoria, el término “ biomarcador” es cualquier biomolécula que pueda proporcionar información biológica sobre el estado fisiológico de un organismo. En ciertas realizaciones, la presencia o ausencia del biomarcador puede ser informativa. En otras realizaciones, el nivel del biomarcador puede ser informativo. Un biomarcador puede ser una hormona, tal como testosterona, o un metabolito de una hormona.

[0058] A lo largo de esta solicitud, el término “ aproximadamente” se utiliza para indicar que un valor incluye la variación inherente de error para el dispositivo, el método siendo empleado para determinar el valor o la variación que existe entre objetos de estudio.

[0059] Como se utiliza en la presente memoria, los términos “ sujeto” y “ paciente” se utilizan indistintamente. El uso de estos términos no implica ningún tipo de relación con un profesional médico, tal como un médico.

[0060] Como se utiliza en la presente memoria, la expresión “ cromatografía líquida” o “ LC” se utiliza para referirse a un proceso para la separación de una o más moléculas o analitos en una muestra de otros analitos en la muestra. La LC implica la ralentización de uno o más analitos de una solución de fluido a medida que el fluido se mueve uniformemente a través de una columna de una sustancia finamente dividida. La ralentización es resultado de la distribución de los componentes de la mezcla entre una o más fases fijas y la fase móvil. La LC incluye, por ejemplo, la cromatografía líquida de fase inversa (RPLC) y la cromatografía líquida de alta presión (HPLC).

[0061] Como se utiliza en la presente memoria, el término “ separar” o “ purificar” o similares no se utilizan necesariamente para referirse a la eliminación de todos los materiales distintos del analito de interés de una matriz de muestras. En cambio, en algunas realizaciones, los términos se utilizan para referirse a un procedimiento que enriquece la cantidad de uno o más analitos de interés en relación con uno o varios componentes más presentes en la matriz de muestras. En algunas realizaciones, se puede utilizar una “ separación” o una “ purificación” para eliminar o disminuir la cantidad de uno o más componentes de una muestra que podría interferir con la detección del analito, por ejemplo, mediante espectrometría de masas.

[0063] Como se utiliza en la presente memoria, la expresión análisis de “ espectrometría de masas” o “ MS” se refiere a una técnica para la identificación y/o cuantificación de moléculas en una muestra. La MS incluye ionizar las moléculas de una muestra, formando moléculas cargadas; separar las moléculas cargadas según su relación masa a carga; y detectar las moléculas cargadas. La MS permite tanto la detección cualitativa como cuantitativa de moléculas en una muestra. Las moléculas pueden ionizarse y detectarse mediante cualquier medio adecuado conocido por un experto en la técnica. La expresión “ espectrometría de masas en tándem” o “ MS/MS” se utiliza en la presente memoria para referirse a una técnica para la identificación y/o cuantificación de moléculas en una muestra, en donde se producen múltiples rondas de espectrometría de masas, ya sea simultáneamente utilizando más de un analizador de masas o secuencialmente utilizando un único analizador de masas. Como se utiliza en la presente memoria, un “ espectrómetro de masas” es un aparato que incluye un medio para ionizar moléculas y detectar moléculas cargadas.

[0065] Como se utiliza en la presente memoria, la “ ionización por electropulverización” o “ ESI” se refiere a una técnica utilizada en la espectrometría de masas para ionizar las moléculas de una muestra evitando al mismo tiempo la fragmentación de las moléculas.

[0067] La muestra se dispersa mediante electropulverización en un aerosol fino. La muestra se mezclará típicamente con un disolvente, usualmente un compuesto orgánico volátil(p. ej.,metanol o acetonitrilo) mezclado con agua. A continuación, el aerosol se transfiere al espectrómetro de masas a través de un capilar, que puede calentarse para facilitar la evaporación del disolvente adicional de las gotas cargadas.

[0069] Como se utiliza en la presente memoria, un “ analizador cuadrupolo” es un tipo de analizador de masas utilizado en MS. Consiste en cuatro varillas circulares (dos pares) que se colocan muy paralelas entre sí. El analizador cuadrupolo es el componente del instrumento que organiza las partículas cargadas de la muestra en función de su relación masa a carga. Un experto en la técnica entenderá que el uso de un analizador cuadrupolo puede dar lugar a una mayor especificidad de los resultados. Un par de varillas está ajustado a un potencial eléctrico positivo y el otro conjunto de varillas se encuentra en un potencial negativo. Para ser detectado, un ion debe pasar por el centro de una trayecto bordeado y paralelo a las varillas alineadas. Cuando los cuadrupolos funcionan a una amplitud dada de voltajes de corriente continua y radiofrecuencia, solamente los iones de una relación masa a carga dada resonarán y tendrán un trayecto estable para atravesar el cuadrupolo y ser detectados. Como se utiliza en la presente memoria, el “ modo de iones positivos” se refiere a un modo en donde el analizador de masas detecta iones con carga positiva y el “ modo de iones negativos” se refiere a un modo en donde el analizador de masas detecta iones con carga negativa. Para la “ monitorización de iones seleccionados” o “ SIM” , la amplitud de la corriente continua y los voltajes de radiofrecuencia se ajustan para observar solamente una masa específica.

[0071] Como se utiliza en la presente memoria, la expresión “ columna analítica” se refiere a una columna de cromatografía que tiene suficientes placas cromatográficas para efectuar una separación de los componentes de una matriz de muestras de prueba. Preferiblemente, los componentes eluidos de la columna analítica se separan de tal modo que se permita determinar la presencia o cantidad de uno o más analitos de interés. En algunas realizaciones, la columna analítica comprende partículas que tienen un diámetro promedio de aproximadamente 5 pm. En algunas realizaciones, la columna analítica es una sílice funcionalizada o un híbrido de polímero y sílice, o una partícula polimérica o una fase fija de sílice monolítica, tal como una columna analítica funcionalizada con fenil-hexilo.

[0073] Las columnas analíticas se pueden distinguir de las “ columnas de extracción” , que típicamente se utilizan para separar o extraer materiales retenidos de los materiales no retenidos para obtener una muestra “ purificada” para su posterior purificación o análisis. En algunas realizaciones, la columna de extracción es una sílice funcionalizada o un híbrido de polímero y sílice o una partícula polimérica o una fase fija de sílice monolítica, tal como una columna Poroshell SBC-18.

[0075] La expresión “ corte principal” se refiere a la selección de una región de interés en un cromatograma y a someter a los analitos que se eluyen dentro de esa región de interés a una segunda separación, p. ej., una separación en una segunda dimensión.

[0077] Como se utiliza en la presente memoria, el término “ hemolizado” se refiere a la ruptura de la membrana de los glóbulos rojos, lo que resulta en la liberación de hemoglobina y otros contenidos celulares en el plasma o el suero, y el término “ lipémico” se refiere a un exceso de grasas o lípidos en la sangre.

[0079] Métodos para determinar la presencia o cantidad de testosterona

[0080] En al menos un aspecto, la invención proporciona métodos para determinar la presencia o cantidad de testosterona en una muestra, comprendiendo los métodos: (a) proporcionar una muestra que contiene testosterona; (b) purificar parcialmente la muestra utilizando una extracción de líquidos con soporte, proporcionando de este modo una muestra parcialmente purificada que comprende testosterona; (c) separar cromatográficamente testosterona de los otros componentes en la muestra parcialmente purificada mediante el uso de cromatografía líquida; y (d) analizar la testosterona separada cromatográficamente mediante espectrometría de masas para determinar la presencia o cantidad de testosterona en la muestra.

[0082] Estos métodos comprenden proporcionar una muestra que contiene testosterona. En este contexto, el término “ proporcionar” debe interpretarse en sentido amplio. El término no pretende referirse exclusivamente a un sujeto que haya proporcionado una muestra biológica. Por ejemplo, se puede decir que un técnico de un laboratorio clínico externo “ proporciona” la muestra, por ejemplo, cuando la muestra se prepara para su purificación mediante extracción y/o cromatografía.

[0084] La muestra no se limita a ningún tipo de muestra particular. La muestra contiene testosterona, pero, en general, también incluye otros componentes. En algunas realizaciones, la muestra es una muestra que se ha procesado y preparado para su purificación mediante extracción y/o cromatografía. Tal procesamiento puede ser útil para optimizar la efectividad de las etapas de purificación posteriores. Tales métodos de procesamiento son bien conocidos por los expertos en la técnica.

[0086] La invención no se limita a ningún medio particular de manejo de muestras. En algunas realizaciones, puede ser útil separar la muestra en dos o más fracciones antes de la purificación mediante extracción y/o cromatografía. En algunas de tales realizaciones, dos o más de tales fracciones pueden prepararse de manera diferente, por ejemplo, para ayudar a mejorar la sensibilidad o selectividad de la separación para una química de columna particular. En algunas realizaciones, el método incluye preparar una única muestra para inyecciones repetidas en múltiples sistemas de cromatografía líquida.

[0088] La invención no se limita a ningún tamaño de muestra particular. En algunas realizaciones, la muestra comprende una muestra biológica. En tales realizaciones, la muestra también puede incluir otros componentes, tales como disolventes, tampones, agentes anticoagulantes y similares. En realizaciones donde la muestra comprende una muestra biológica, la muestra biológica puede ser una o más de sangre entera, plasma, suero, orina, líquido cefalorraquídeo, homogenado tisular, saliva, líquido amniótico, bilis, moco, líquido peritoneal o líquido linfático.

[0090] Además, la testosterona en la muestra no se limita a ninguna forma particular de testosterona. Por ejemplo, la testosterona incluye átomos de carbono, oxígeno e hidrógeno. Cada uno de estos átomos tiene isótopos de origen natural. Por lo tanto, cierta cantidad de testosterona en la muestra puede contener uno o más de tales isótopos de origen natural. El término también incluye formas catiónicas y aniónicas (p. ej., formas saladas), si están presentes. Por el contrario, esta memoria descriptiva se refiere específicamente a un ion de testosterona (o testosterona ionizada) en el análisis de la testosterona mediante espectrometría de masas. En tales casos, que se describen a continuación, solamente se hace referencia a la testosterona ionizada.

[0092] El método comprende además purificar parcialmente la muestra utilizando extracción de líquidos con soporte (SLE). Como se ha indicado anteriormente, la muestra puede contener, además de testosterona y uno o más disolventes, varios otros componentes. Por lo tanto, la purificación parcial de la muestra proporciona una muestra parcialmente purificada que comprende testosterona. En algunas realizaciones, se han eliminado las concentraciones de uno o más de los diversos otros componentes, lo que significa que sus concentraciones se han reducido en relación con la concentración de testosterona en la muestra parcialmente purificada. Por lo tanto, el término “ retirar” o “ eliminación” no implica necesariamente la eliminación completa de un componente. Cierta cantidad del componente eliminado todavía puede estar presente en la muestra parcialmente purificada, aunque su concentración en relación con la de la testosterona será menor que en la muestra previa a la extracción. En algunas realizaciones, la concentración relativa del componente eliminado con respecto a la de la testosterona en la muestra parcialmente purificada es de no más del 90 %, o no más del 75 %, o no más del 50 %, o no más del 33 %, o no más del 25 %, o no más del 10 %, o no más del 5 %, o no más del 1 %, de su concentración relativa con respecto a la testosterona en la muestra previa a la extracción.

[0094] La invención no se limita a ningún tipo particular de componente eliminado. En algunas realizaciones, uno o más de los componentes eliminados es un compuesto que puede interferir con el análisis de la testosterona mediante espectrometría de masas, por ejemplo, porque el compuesto puede tener una masa similar a la de la testosterona o porque, tras la fragmentación, genera uno o más iones fragmento que tienen la misma masa que uno o más fragmentos generados al fragmentar la testosterona. Tales compuestos incluyen, aunque no de forma limitativa, cortisona, cortisol, 21-desoxicortisol, corticosterona, 11-desoxicortisol, acetónido de triamcinolona, tetrahidrocortisol, tetrahidro-cortisona, DHEA, 17a-hidroxiprogesterona, epitesterona, dihidroandrosterona, 5a-androstan-3a-ol-17-ona, 5b-pregnano-3a-17a-20a-triol, etiocolan-3a-diol y pregnanodiol.

[0095] La invención se limita a una manera particular de realizar SLE. La muestra se absorbe en tierra de diatomeas. La muestra se pone a continuación en contacto con un sistema de disolvente orgánico inmiscible en agua. Tales sistemas de disolventes son bien conocidos en la técnica. El sistema de disolvente orgánico inmiscible en agua incluye acetato de etilo, hexano, tolueno, octanol, cloroformo, diclorometano, éter dietílico, ciclohexano, pentano, N-heptanos, benceno, cloruro de n-butilo, butanol, cloruro de metileno y mezclas de dos cualquiera o más de los anteriores. En algunas realizaciones, el sistema de disolvente orgánico inmiscible en agua también puede incluir cierta cantidad de uno o más disolventes polares. En tales realizaciones, la cantidad de disolvente polar debe ser de manera suficiente baja como para garantizar que el sistema de disolvente permanezca generalmente inmiscible en agua.

[0097] Los disolventes polares adecuados para utilizar en tales realizaciones incluyen, aunque no de forma limitativa, metanol, acetona, acetonitrilo, isopropanol, éter dietílico o éter metil-t-butílico. En algunas realizaciones, el disolvente orgánico inmiscible en agua utilizado en la SLE comprende una mezcla de diclorometano y hexano.

[0099] La SLE se puede llevar a cabo utilizando cualquier aparato adecuado diseñado para ello. Los aparatos adecuados incluyen, aunque no de forma limitativa, placas y columnas. En algunas realizaciones, la SLE emplea una o más placas. En algunas de tales realizaciones, la SLE emplea una placa que tiene múltiples pocillos, tal como una placa de 96 pocillos. Tales placas están disponibles en el mercado. Además, la SLE se puede llevar a cabo manualmente o de manera automatizada. Además, la etapa de purificación parcial puede, en algunas realizaciones, ir acompañada de la aplicación de una acción mecánica al aparato de SLE para facilitar la extracción. Tal acción mecánica puede incluir agitación, vibración y similares.

[0101] En algunas realizaciones de la invención, la muestra parcialmente purificada puede someterse a una o más etapas de procesamiento antes de la separación cromatográfica. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la muestra parcialmente purificada se evapora. A continuación, el residuo resultante se reconstituye en un sistema de disolvente. Se puede utilizar cualquier sistema de disolvente adecuado para reconstituir el residuo que contiene testosterona. En algunas realizaciones, el sistema de disolvente es un sistema de disolvente que es compatible con la separación cromatográfica. En algunas realizaciones, el sistema de disolvente para la reconstitución incluye, pero no se limita a, agua, metanol o mezclas de los mismos.

[0103] Los métodos comprenden separar cromatográficamente la testosterona mediante el uso de cromatografía líquida. La invención no se limita a ninguna manera particular de llevar a cabo cromatografía líquida. En general, la etapa de separación cromatográfica incluye el uso de al menos una columna de cromatografía líquida (LC). En algunas realizaciones, se utilizan múltiples columnas de LC, tales como dos o más, o tres o más, o cuatro o más columnas de LC. En algunas de tales realizaciones, se utilizan dos, tres, cuatro, cinco, seis, ocho o diez columnas de LC. En algunas de estas realizaciones, dos o más de estas columnas de LC están dispuestas en paralelo entre sí y están conectadas en línea al mismo espectrómetro de masas.

[0105] La invención no se limita a ningún tipo particular de columnas. Se puede utilizar cualquier columna adecuada para la separación de la testosterona. En algunas realizaciones, se utilizan una o más columnas analíticas. En algunas de tales realizaciones, se utilizan una o más columnas de fase inversa. En algunas realizaciones, el método emplea dos o más columnas de fase inversa en paralelo, que están conectadas en línea al mismo espectrómetro de masas.

[0106] Además, la invención no se limita a ninguna fase móvil particular. Se puede utilizar cualquier fase móvil adecuada, siempre que la fase móvil sea adecuada para utilizar con una columna de LC particular y para separar cromatográficamente la testosterona en la columna de LC. En algunas realizaciones, la fase móvil es un sistema de disolvente polar. El sistema de disolvente polar puede incluir uno o más disolventes polares, que incluyen, aunque no de forma limitativa, agua, metanol, acetonitrilo o una mezcla de dos o más de los anteriores. En algunas de tales realizaciones, la fase móvil emplea un gradiente, de tal modo que las relaciones relativas de dos o más disolventes varían con el tiempo.

[0108] Como se ha indicado anteriormente, se pueden utilizar dos o más columnas de LC (p. ej., columnas de fase inversa) en paralelo y conectadas en línea al mismo espectrómetro de masas, p. ej., para mejorar el rendimiento. En algunas de tales realizaciones, una muestra que contiene testosterona (es decir, la muestra parcialmente purificada, p. ej., después de la evaporación y la reconstitución) se introduce en las dos o más columnas de LC en momentos diferentes. En algunas realizaciones, la introducción de la muestra de prueba en las dos o más columnas de LC es escalonada, lo que significa que hay un intervalo de tiempo predeterminado que separa la introducción de la muestra en dos o más columnas de LC. Los intervalos de tiempo apropiados se pueden seleccionar en función de varios factores, incluyendo el tiempo de elución, la química de las columnas y la posible necesidad de evitar interferir con el análisis de la testosterona eluida de una o más de las otras columnas de LC.

[0110] En algunas realizaciones de la invención, se puede colocar otra columna de LC en serie con otra columna. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se pueden emplear precolumnas adecuadas. Los expertos en la técnica pueden seleccionar las precolumnas apropiadas para utilizar en los presentes métodos. En algunas realizaciones, una precolumna se coloca en paralelo con otra columna de LC y tanto la precolumna como la columna de LC son columnas de fase inversa. Tal serie de dos o más columnas también se puede disponer en paralelo, de tal modo que haya dos o más series de columnas que funcionen en paralelo, donde cada serie contiene dos o más columnas.

[0111] Los métodos comprenden analizar la testosterona separada cromatográficamente mediante espectrometría de masas para determinar la presencia o cantidad de testosterona. En algunas realizaciones, dos o más de las columnas de LC se introducen en el mismo espectrómetro de masas. En algunas realizaciones adicionales, tres o más de las columnas de LC se introducen en el mismo espectrómetro de masas. En algunas realizaciones, el espectrómetro de masas es parte de un sistema de LC-MS combinado.

[0113] La invención no se limita a ningún tipo particular de espectrómetro de masas. Se puede utilizar cualquier espectrómetro de masas adecuado. En algunas realizaciones, el método emplea un espectrómetro de masas en tándem. En algunas de tales realizaciones, el análisis de la testosterona puede incluir ionizar la testosterona, analizar la testosterona ionizada, fragmentar el ion de testosterona en dos o más iones fragmento y analizar los iones fragmento. La invención no se limita a un espectrómetro de masas que use cualquier método de ionización particular. Se puede utilizar cualquier ionización adecuada. Los métodos de ionización adecuados incluyen, aunque no de forma limitativa, la fotoionización, la ionización por electropulverización, la ionización química a presión atmosférica y la ionización por captura de electrones. Y en las realizaciones que emplean la fragmentación, se puede utilizar cualquier técnica de fragmentación adecuada. Las técnicas adecuadas incluyen, aunque no de forma limitativa, la disociación inducida por colisión, la disociación por captura de electrones, la disociación por transferencia de electrones, la disociación multifotónica infrarroja, la disociación por desprendimiento de electrones y la disociación inducida por la superficie.

[0114] En algunas realizaciones, el espectrómetro de masas en tándem es un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo MDS-Sciex API5000. En algunas realizaciones, el espectrómetro de masas en tándem tiene una fuente de ionización a presión atmosférica, y la etapa de análisis comprende un método de ionización seleccionado del grupo que consiste en fotoionización, ionización por electropulverización (ESI), ionización química a presión atmosférica (APCI), ionización por captura de electrones, ionización de electrones, bombardeo de átomos rápidos/ionización secundaria de líquidos (FAB/LSI), ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI), ionización de campo, desorción de campo, ionización por termopulverización/pulverización de plasma, e ionización por haz de partículas. El método de ionización puede estar en modo de iones positivos o en modo de iones negativos. La etapa de análisis también puede incluir la monitorización de reacciones múltiples o la monitorización de iones seleccionados (SIM), y las dos o más biomoléculas se analizan de forma simultánea o secuencial. En algunas realizaciones, la etapa de análisis utiliza un analizador cuadrupolo. En algunas realizaciones, el espectrómetro de masas es un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo.

[0116] Los métodos, en algunas realizaciones, incluyen el uso de un patrón interno. En tales realizaciones, el patrón interno se puede introducir en cualquier punto adecuado antes de la etapa de separación cromatográfica. Se puede utilizar cualquier patrón interno adecuado. En algunas realizaciones, el patrón interno es testosterona estable marcada isotópicamente. En algunas de tales realizaciones, el patrón interno está marcado con carbono-13 y/o deuterio. En algunas realizaciones, el patrón interno es testosterona marcada con 2,3,4-13C.

[0118] En algunas realizaciones, no es necesario determinar la cantidad de testosterona. En algunas realizaciones, el método se puede utilizar para determinar la presencia o ausencia de testosterona en una muestra. En otras realizaciones, el método se utiliza para determinar la cantidad de testosterona en una muestra. Por ejemplo, en algunas realizaciones y/o aspectos, la invención proporciona métodos para determinar la cantidad de testosterona en una muestra biológica, comprendiendo los métodos: (a) proporcionar una muestra, comprendiendo la muestra una muestra biológica que contiene testosterona; (b) purificar parcialmente la muestra utilizando una extracción de líquidos con soporte, proporcionando de este modo una muestra parcialmente purificada que comprende testosterona; (c) separar cromatográficamente testosterona de los otros componentes de la muestra parcialmente purificada mediante el uso de cromatografía líquida de fase inversa; y (d) analizar la testosterona separada cromatográficamente mediante espectrometría de masas para determinar la cantidad de testosterona en la muestra biológica.

[0120] En algunas realizaciones, el método no está limitado por ningún límite inferior y/o límite superior de detección. En algunas realizaciones, los métodos pueden utilizarse para medir la testosterona en una muestra (p. ej., una muestra que comprende una muestra biológica) a concentraciones que varían de 2,5 ng/dl a 5000 ng/dl, o de 5 ng/dl a 5000 ng/dl, o de 10 ng/dl a 5000 ng/dl, o de 2,5 ng/dl a 2000 ng/dl.

[0122] Métodos de generación de informes

[0124] En al menos un aspecto, la invención proporciona métodos para generar un informe para diagnosticar una enfermedad o afección asociada con un nivel anormal de testosterona en un sujeto, comprendiendo los métodos: (a) proporcionar una muestra, comprendiendo la muestra una muestra biológica que contiene testosterona; (b) purificar parcialmente la muestra utilizando una extracción de líquidos con soporte para proporcionar una muestra parcialmente purificada que comprende testosterona; (c) separar cromatográficamente testosterona de los otros componentes en la muestra parcialmente purificada mediante el uso de cromatografía líquida; (d) analizar la testosterona separada cromatográficamente mediante espectrometría de masas para determinar la cantidad de testosterona en la muestra biológica; y (e) generar un informe que mencione la concentración de testosterona en la muestra biológica.

[0125] Las características y realizaciones de todas las etapas, excepto la etapa (e), se describen inmediatamente más arriba. Como se ha indicado anteriormente, el método puede emplear más de una columna, p. ej., dos o más columnas en paralelo conectadas en línea al mismo espectrómetro de masas.

[0127] El método incluye además generar un informe que menciona la cantidad de al menos una testosterona en la muestra. En algunas realizaciones, esta información puede utilizarse para determinar la concentración de testosterona en una muestra biológica. A partir de tal información, se podría evaluar si un sujeto tiene una cantidad anormalmente alta o baja de testosterona.

[0129] Tal información puede ser útil para diagnosticar una o más enfermedades o trastornos que pueden estar asociados con niveles aberrantes de testosterona en un sujeto. Tales enfermedades o afecciones son bien conocidas en la técnica. Tales enfermedades o afecciones incluyen, aunque no de forma limitativa, hiperplasia suprarrenal congénita, hirsutismo y varios estados hipergonadales.

[0131] Sistemas para analizar biomoléculas

[0133] En otro aspecto, la invención proporciona sistemas para determinar la presencia o cantidad de testosterona en una muestra, comprendiendo los sistemas: (a) una estación para purificar parcialmente una muestra mediante el uso de extracción de líquidos con soporte, comprendiendo la muestra testosterona; (b) una estación para separar cromatográficamente testosterona de los otros componentes en la muestra parcialmente purificada mediante el uso de cromatografía líquida; y (c) una estación para analizar la testosterona separada cromatográficamente mediante espectrometría de masas para determinar la presencia o cantidad de testosterona en la muestra.

[0135] Tales sistemas pueden incluir diversas realizaciones y realizaciones secundarias análogas a las descritas anteriormente para los métodos de análisis de la testosterona.

[0137] Estos sistemas incluyen varias estaciones. Como se utiliza en la presente memoria, el término “ estación” se define ampliamente e incluye cualquier aparato adecuado o conjunto de aparatos adecuados para llevar a cabo el método mencionado. Las estaciones no necesitan estar conectadas o situadas de forma integral unas con respecto a otras de ninguna forma particular. La invención incluye cualquier disposición adecuada de las estaciones entre sí. Por ejemplo, no es necesario que las estaciones estén en la misma sala. Sin embargo, en algunas realizaciones, las estaciones están conectadas entre sí en una unidad integral.

[0139] Ejemplos

[0141] Los siguientes Ejemplos se han incluido para proporcionar orientación a un experto en la técnica para poner en práctica realizaciones representativas de la materia objeto descrita actualmente. A la luz de la presente descripción y del nivel general de los expertos en la técnica, los expertos pueden apreciar que los siguientes Ejemplos pretenden ser solamente ilustrativos y que se pueden emplear numerosos cambios, modificaciones y alteraciones sin apartarse del alcance de la materia objeto descrita actualmente.

[0143] Ejemplo 1: Análisis de testosterona

[0145] La testosterona 13C se adiciona a las alícuotas séricas para evaluar y corregir la recuperación de la testosterona de cada muestra. La testosterona se diluye 1:1 con un tampón y después se adiciona a una placa de SLE+. La testosterona se extrae de muestras de suero y plasma con una mezcla de hexano y diclorometano. Las muestras se evaporan y se reconstituyen con una solución de metanol/agua. A continuación, las muestras se inyectan en un sistema de LC-MS/MS. Para la detección se utiliza un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo MDS-Sciex API5000, que funciona en modo de ionización química a presión atmosférica de iones positivos. La cuantificación del analito y del patrón interno se realiza en el modo de monitorización de reacción seleccionada (SRM). La cantidad retrocalculada del analito individual en cada muestra se determina a partir de las curvas de calibración generadas al añadir cantidades conocidas de analito purificado en suero tratado con carbón de 2,5 a 5000 ng/dl.

[0147] Especímenes

[0149] Una muestra recomendada es de 0,3 a 0,8 ml de suero o plasma. El suero se recolecta utilizando tubos de muestreo de patrón o tubos que contienen gel de separación. El suero/plasma debe extraerse de las células en el plazo de una hora después de la recolección y transferirse a un tubo de transporte de plástico. El suero y el plasma deben almacenarse en un congelador a -20 °C hasta su uso.

[0151] Equipos y materiales

[0153] Se utilizaron los siguientes suministros e instrumentos.

[0155] Pipetas manuales con puntas; pipetas y matraces volumétricos de clase A; Botellas de reactivos de vidrio variadas; PARAFILM (Fisher Healthcare); Lámina de sellado térmico Easy Pierce (Fisher Healthcare); Vórtice multitubo (Fisher Scientific); Evaporador de placas Turbovap (Biotage, LLC); Sellador térmico manual Thermo ALPS25 o equivalente (Thermo Scientific); placas de polipropileno para pocillos profundos de 96 pocillos (SpeWare Corp.); placas de SLE+400 de 96 pocillos (Biotage, LLC); Agilent Zorbax XDB C-18 2,1 x 50, 5 um (Krackeler Scientific); y el sistema colector de procesamiento de muestras VacMaster-96 (Biotage, LLC).

[0156] centrífuga 5804R de placa de 96 pocillos o equiv. (Eppendorf); espectrómetro de masas en tándem API 5000 y fuente de iones Turbo V™ con APCI (Sciex, Toronto, Canadá); Sistema Aria Transcend TX4 que consiste en 8 bombas binarias de la serie 1200SL y 4 desgasificadores de vacío de la serie 1200 (Thermo-Fisher, MA, EE. UU.); automuestreador del sistema HTS Twin PAL (CTC Analytics AG, Suiza); Analyst versión 1.4 o superior (Applied Biosystems, CA, EE. UU.); Aria OS versión 1.6 o superior (Thermo-Fisher, MA, e E. UU.).

[0157] Reactivos

[0158] Se utilizaron los siguientes reactivos:

[0159] Testosterona (USP); [13C3] -Testosterona (Isosciences); Cloruro de metileno (Fisher Healthcare); Hexano (Fisher Healthcare); Metanol (Fisher Healthcare); Suero humano tratado con carbón (Golden West); Suero agrupado (recolección interna); Etanol (Sigma-Aldrich); Ácido fórmico (Sigma-Aldrich); Acetonitrilo (Fisher Healthcare).

[0160] Se utilizaron los siguientes disolventes como fases móviles para la cromatografía líquida:

[0161] Disolvente de extracción (50:50 Hexano: Cloruro de metileno): Medir 500 ml de hexano en un cilindro graduado y transferir a una botella de 1 l. Medir 500 ml de cloruro de metileno por separado en un cilindro graduado y adicionar a la botella de 1 l que contiene el hexano. Mezclar bien.

[0162] Fase A móvil de la bomba de elución (0,1 % de ácido fórmico en H<2>O de Millipore): Medir 999 ml de agua de Millipore de tipo 1 y verter en una botella de reactivo de 1 l. En una campana de extracción, adicionar lentamente 1 ml de ácido fórmico a H<2>O de Millipore. Mezclar bien.

[0163] Fase B móvil de la bomba de elución (0,1 % de ácido fórmico en acetonitrilo): Medir 999 ml de acetonitrilo y verter en una botella de reactivo de 1 l. En una campana de extracción, adicionar lentamente 1 ml de ácido fórmico al acetonitrilo. Mezclar bien.

[0164] Materia prima de patrón interno (1 mg/ml): Pesar aproximadamente 10 mg de [13C3]-testosterona en un vial de escintilación de vidrio colocado en una balanza analítica. Después de ajustar la pureza, adicionar la cantidad apropiada de metanol para llevar la solución a una concentración final de 1 mg/ml. Mezclar bien para que se disuelva. Almacenar a -20 °C; estable durante al menos un año en viales de escintilación de vidrio.

[0165] Solución madre de patrón interno (10000 ng/ml): Adicionar 1 ml de materia prima de patrón interno de [13C3]-testosterona (1 mg/ml) a un matraz volumétrico de clase A de 100 ml y C.S. al volumen con MeOH. Mezclar bien. La concentración final es de 10000 ng/dl. Almacenar congelado (-20 °C); estable durante al menos un año.

[0166] Solución de patrón interno de trabajo (120 ng/dl): Adicionar 0,12 ml de materia prima de patrón interno de [13C3]-testosterona (10000 ng/ml) a un matraz volumétrico de clase A de 1000 ml y C.S. al volumen con 50:50 MeOH: H<2>O de Millipore. Mezclar bien. La concentración final es de 120 ng/dl. Se pueden preparar volúmenes alternativos con la misma concentración y composición. Almacenar refrigerado (2-8 °C).

[0167] Solución de reconstitución (1:1 Metanol: Agua): Adicionar 500 ml de metanol de grado HPLC a una botella de reactivo de vidrio de 1 litro. Adicionar 500 ml de agua tipo I a la misma botella. Mezclar bien y almacenar a temperatura ambiente.

[0168] Solución de prueba de idoneidad (SST) del sistema de testosterona: Inyectar 35 pl de la solución de patrón interno de trabajo (120 ng/dl) para establecer la idoneidad del sistema antes de enviar el lote para su análisis. La inyección de idoneidad del sistema empleó una inyección de 35 pl de 120 ng/dl [13C3]-testosterona en 50:50 metanol:agua; criterios de aceptación: todos los analitos de 0,05-0,30 minutos; intensidad máxima > 12000 cps para la transición 292/100. Solución 1 de lavado de agujas (0,1 % de ácido fórmico en H<2>O de Millipore): Medir 999 ml de agua de Millipore tipo I y verter en una botella de reactivo de 1 l. En una campana de extracción, adicionar lentamente 1 ml de ácido fórmico a H<2>O de Millipore. Mezclar bien.

[0169] Solución 2 de lavado de agujas (Metanol): Transferir 1000 ml de metanol a una botella de vidrio. Almacenar a temperatura ambiente.

[0170] Calibración

[0171] Los calibradores se preparan y ensayo para garantizar su precisión en Esoterix Endocrinology, Calabasas, CA, EE. UU. El material a granel se envía a CET en hielo seco, donde después se subalicuotará y se almacenará. Las subalícuotas se almacenan a -20 °C durante 5,58 años.

[0172] Se debe incluir un conjunto completo de calibradores al principio de cada lote analítico. Se adicionará una muestra en blanco adicional IS, LLOQ y ULOQ como las tres últimas muestras de cada lote.

[0173] Control de calidad

[0174] Las muestras de control de calidad se preparan y analizan para establecer los intervalos en Esoterix Endocrinology, Calabasas CA, EE. UU. El material a granel se envía a CET en hielo seco, donde después se subalícuota y se almacena. Las subalícuotas se almacenan a -20 °C durante 5,58 años.

[0175] Procedimiento manual

[0176] Preparar el lote: Descongelar y mezclar los patrones, muestras y controles. Etiquetar un conjunto de tubos de prueba de vidrio de 12 x 75 mm para cada muestra, control y patrón.

[0177] Muestras de pipeta: Pipetear 200 pl de muestras en blanco, patrones, controles y muestras en el tubo debidamente etiquetado. Pipetear 200 pl de solución de patrón interno de trabajo en cada tubo, excepto las muestras en blanco dobles. Las muestras en blanco dobles reciben 400 pl de agua de Millipore. Mezclar la gradilla de tubos en un vórtice múltiple durante 1 minuto.

[0178] Transferir a una placa de 96 pocillos: Colocar una placa de pocillo profundo de 96 pocillo en la mitad inferior del colector de procesamiento de muestras VacMaster-96. Volver a colocar la sección superior del colector sobre la placa del pocillo profundo y colocar una placa SLE+400 en la parte superior del colector de modo que los pocillos estén alineados con la placa de recolección de pocillos profundos que se encuentra debajo. Transferir todas las muestras a la placa de 96 pocillos SLE+400 con una pipeta multicanal o equivalente.

[0179] Extracción de SLE: Colocar el colector (que contiene las placas) debajo de una campana de extracción y conectar el tubo a una fuente de vacío. Aplicar un ligero vacío (5 mmHg) para extraer la muestra en la placa SLE+ y, a continuación, esperar 5-10 minutos. utilizar una pipeta de 12 canales (o equivalente), aspirar y dispensar 50:50 Hexano: Cloruro de metileno 3 veces. A continuación, adicionar 900 pl del disolvente de extracción en cada fila. Aplicar un ligero vacío durante 15-20 segundos y, a continuación, esperar 10 minutos para permitir que el disolvente de extracción pase a la placa de pocillo profundo. Después de 10 minutos, aplicar una alta presión de vacío durante 30 segundos para extraer el disolvente de extracción restante en la placa de recolección de 96 pocillos.

[0180] Evaporación/Reconstitución: Colocar la placa de recolección de 96 pocillos en el evaporador de placas Turbovap. Evaporar las placas a aproximadamente 0,27 MPa (40 psi) y 40 °C durante aproximadamente 20 minutos o hasta que se sequen. Reconstituir cada pocillo con 100 pl de solución de reconstitución (1:1 MeOH: H<2>O de Millipore). Sellar la placa y mezclar brevemente durante 1 minuto. Centrifugar durante 5 minutos.

[0181] LC: Llenar todos los reactivos del sistema de LC. Cebar las bombas de LC para eliminar cualquier burbuja de las líneas de fase móvil o para eliminar la fase móvil de un ensayo/lote anterior (si se creó una nueva fase móvil). Cuando todos los sistemas y automuestreadores estén listos, hacer clic en “ Iniciar” . Inyectar 35 pl de muestra.

[0182] Procedimiento automatizado

[0183] Preparar el lote: Descongelar y mezclar los patrones, muestras y controles. Inicializar el instrumento TEC AN Freedom EVO según lo recomendado en el procedimiento operativo de patrón NOQS-SOP-13, sección 10 - Procedimientos. Muestras de pipeta: Colocar una etiqueta de código de barras generada por un ordenador/laboratorio en las muestras en blanco, patrones y tubos de CC correspondientes. En una gradilla fuente vacía, colocar los tubos con código de barras en el siguiente orden: Muestra en blanco doble, Muestra en blanco IS, Patrón 1-8 y Muestra en blanco doble. Adicionar muestras de pacientes comenzando en la posición 12 de la gradilla 1 fuente y continuando a través de la gradilla 12 fuente. Se colocarán aleatoriamente dos (2) conjuntos de muestras de control de calidad durante todo el ensayo. Nota: Solamente se pueden utilizar tubos de 12 x 75 mm como tubos fuente para las muestras de los pacientes. Los tubos de transferencia que no sean de este tamaño deben verterse en el tubo del tamaño correcto y con el código de barras correspondiente. Cargar las gradillas fuente en la plataforma TEC AN Freedom EVO.

[0184] Transferir a una placa de 96 pocillos: Colocar las placas de 96 pocillos profundos en la plataforma. Colocar ocho tubos de prueba de vidrio de 16 x 100 mm en la posición 1-8 de una gradilla fuente vacía y llenar cada una con una solución de patrón interno de trabajo. Colocar un tubo de prueba de vidrio de prueba de 16 x 100 mm en la posición 16 de la misma gradilla fuente que los tubos de patrón interno y llenar con agua de tipo I. Colocar la gradilla fuente que contenga el patrón interno y agua de tipo I en la posición adecuada de la plataforma. Asegurar que las puntas DiTi de 1000 pl estén cargadas en la plataforma TECAN Freedom EVO.

[0185] En el software de la aplicación, seleccionar script Testosterona. Hacer clic en Ejecutar para iniciar el script. El TECAN escaneará primero todos los tubos y creará el archivo scan.csv. Cuando se solicite, comprobar el archivo creado y corregir cualquier problema relacionado con el código de barras. A continuación, hacer clic en Aceptar para continuar con el script. El TECAN ahora adicionará 200 pl de muestras en blanco, patrón, muestra de paciente y muestra de control de calidad a las placas de 96 pocillos profundos. Cuando se solicite, confirmar visualmente que todas las muestras se han pipeteado correctamente. La muestra se puede adicionar manualmente con una pipeta adecuada en caso de que no se haya adicionado la muestra. Debe hacerse una anotación en la portada del lote. Si el volumen de una muestra no parece acorde con el de la otra muestra, se debe anotar en la portada del lote. Hacer clic en Aceptar para continuar.

[0187] El TECAN adicionará 200 pl de agua de tipo I a las posiciones A1 del vial de la 1a placa de 96 pocillos profundos y 200 pl de solución de patrón interno de trabajo al resto de las posiciones del vial. Mientras se adiciona el patrón interno a las placas de 96 pocillos profundos, inicializar el manipulador de líquidos BIOMEK FX. Retirar las placas de 96 pocillos profundos del instrumento de pipeteo automático TECAN Freedom EVO y colocar en el manipulador de líquidos automatizado BIOMEK FX.

[0189] Extracción de SLE: Colocar una placa de SLE+ sobre una parte superior de una placa de 96 pocillos profundos y colocar en la plataforma BIOMEK FX. Asegurar que las puntas de la pipeta AP200 se carguen en la posición adecuada. En el software de la aplicación, seleccionar el script de transferencia de SLE de 1 placa o de transferencia de SLE de 2 placas, según la cantidad de muestras del ensayo. Hacer clic en el botón de inicio verde de la barra de herramientas superior. El BIOMEK FX mezclará primero la muestra y el patrón interno antes de transferir el contenido de la placa de 96 pocillos profundos a la placa de SLE+ en un proceso de dos etapas. En el caso de que BIOMEK no transfiera la muestra, está permitido hacerlo manualmente, teniendo cuidado de transferir la muestra al pocillo apropiado.

[0191] Colocar una placa de pocillo profundo de 96 pocillo en la mitad inferior del colector de procesamiento de muestras VacMaster-96. Volver a colocar la sección superior del colector sobre la placa del pocillo profundo y colocar una placa SLE+400 en la parte superior del colector de modo que los pocillos estén alineados con la placa de recolección de pocillos profundos que se encuentra debajo. Colocar el colector (que contiene las placas) debajo de una campana de extracción y conectar el tubo a una fuente de vacío. Aplicar un ligero vacío (5 mm Hg) para eXtraer la muestra en la placa de s Le , después esperar 5-10 minutos.

[0193] Usar una pipeta de 12 canales (o equivalente), aspirar y dispensar 50:50 Hexano: Cloruro de metileno 3 veces. A continuación, adicionar 900 pl del disolvente de extracción en cada fila. Aplicar un ligero vacío durante 15-20 segundos y, a continuación, esperar 10 minutos para permitir que el disolvente de extracción pase a la placa de pocillo profundo. Después de 10 minutos, aplicar una alta presión de vacío durante 30 segundos para extraer el disolvente de extracción restante en la placa de recolección de pocillos profundos.

[0195] Evaporación/Reconstitución: Colocar la placa de recolección de 96 pocillos en el evaporador de placas Turbovap. Evaporar las placas a aproximadamente 0,27 MPa (40 psi) y 40 °C durante aproximadamente 20 minutos o hasta que se sequen. Reconstituir cada pocillo con 100 pl de solución de reconstitución (1:1 MeOH: H<2>O de Millipore). Sellar la placa y mezclar brevemente durante 1 minuto. Centrifugar durante 5 minutos.

[0197] LC: Llenar todos los reactivos del sistema de LC. Cebar las bombas de LC para eliminar cualquier burbuja de las líneas de fase móvil o para eliminar la fase móvil de un ensayo/lote anterior (si se creó una nueva fase móvil). Cuando todos los sistemas y automuestreadores estén listos, hacer clic en “ Iniciar” . Inyectar 35 pl de muestra.

[0199] Presentación de resultados

[0201] Las unidades para este ensayo en suero y plasma están en nanogramos por decilitro (ng/dl).

[0203] Los resultados se presentan con un decimal para las muestras de suero y plasma.

[0205] El límite inferior de cuantificación para este ensayo es de 2,5 ng/dl. Los valores inferiores a 2,5 ng/dl deben indicarse como <2,5 ng/dl. El límite superior de detección es de 5000 ng/dl. Los valores superiores a 5000 ng/dl deben diluirse hasta 50 veces con agua de tipo I. Con la inclusión de la dilución, el límite superior de cuantificación sería de 250.000 ng/dl. Si no se dispone de un espécimen suficiente para su repetición en una dilución, se introducirá >10.000 con la abreviatura “ QNSR” adjunta. Esta abreviatura notifica a la parte que no hay suficiente espécimen para verificar los resultados.

[0207] Intervalos de referencia provisionales

[0210]

[0211]

[0213] Varón 1-7 meses: Los niveles disminuyen rápidamente la primera semana a 20-50 ng/dl, después aumentan a 60 400 ng/dl (media = 190) entre 20-60 días. Los niveles disminuyen después hasta alcanzar el intervalo prepuberal de <2,5-10 a los siete meses.

[0214] Mujer 1-7 meses: Los niveles disminuyen durante el primer mes a <10 ng/dl y se mantienen así hasta la pubertad. Niños prepúberes

[0215] 1-10 años <2,5-10

[0216] Pubertad

[0217] Estadio de Edad Intervalo Medi Estadio de Edad Intervalo Media Tanner (años) (ng/dl) (ng/d Tanner (años) (ng/dl) (ng/dl) Hombres Mujeres

[0219] 1 <9,8 <2,5-10 4,9 1 <9,2 <2,5-10 4,9

[0220] 2 9,8-14,5 18-150 42 2 9,2-13,7 7-28 18

[0221] 3 10,7-15,4 100-320 190 3 10,0-14,4 15-35 25

[0222] 4 11,8-16,2 200-620 372 4 10,7-15,6 13-32 22

[0223] 5 12,8-17,3 350-970 546

5 11,8-18,6 20-38 28

[0224] Adultos 20-50 años Intervalo (ng/dl)

[0225] Hombres: 350-1030

[0226] Mujeres:

[0227] Premenopáusicas 10-55

[0228] Posmenopáusicas 7-40

[0229] Ejemplo 2: Resultados de las pruebas para los datos de los Centros para el Control de Enfermedades (CDC) El método de análisis descrito en el Ejemplo 1 se usó para determinar los niveles de testosterona en muestras obtenidas de los CDC que tenían niveles estandarizados de testosterona (denominados “ conjuntos de desafíos de los CDC” ). Se analizaron dos conjuntos de desafíos diferentes de los CDC. Para cada una de las diez muestras de los dos conjuntos, se realizaron cuatro réplicas en el transcurso de dos días. Por lo tanto, la media, la desviación estándar y el CV informados son para un n de 4.

[0230] Conjunto 1 de desafíos

[0233]

[0234] Conjunto 2 de desafíos

[0235]

Claims

1. REIVINDICACIONES

1. Un método para determinar la presencia o cantidad de testosterona en una muestra, comprendiendo el método:

(a) proporcionar una muestra que contiene testosterona;

(b) purificar parcialmente la muestra mediante el uso de extracción de líquidos con soporte con tierra de diatomeas y un sistema de disolvente orgánico inmiscible en agua; en donde el sistema de disolvente orgánico inmiscible en agua comprende: acetato de etilo, hexano, tolueno, octanol, cloroformo, diclorometano, éter dietílico, ciclohexano, pentano, N-heptanos, benceno, cloruro de n-butilo, butanol, cloruro de metileno o mezclas de dos o más de los anteriores, proporcionando de este modo una muestra parcialmente purificada que comprende testosterona;

(c) separar cromatográficamente testosterona de los otros componentes en la muestra parcialmente purificada mediante el uso de cromatografía líquida; y

(d) analizar la testosterona separada cromatográficamente mediante espectrometría de masas para determinar la presencia o cantidad de testosterona en la muestra.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la etapa (b) de purificación parcial incluye eliminar los componentes que interfieren con el análisis de la testosterona mediante espectrometría de masas; y opcionalmente en donde los componentes que interfieren con el análisis de testosterona mediante espectrometría de masas incluyen uno o más de: cortisona, cortisol, 21-desoxicortisol, corticosterona, 11-desoxicortisol, acetónido de triamcinolona, tetrahidrocortisol, tetrahidro-cortisona, DHEA, 17a-hidroxiprogesterona, epitesterona, dihidroandrosterona, 5a-androstan-3a-ol-17-ona, 5b-pregnano-3a-17a-20a-triol, etiocolan-3a-diol o pregnanodiol.

3. El método de la reivindicación 1, en donde, en la etapa (b) de purificación parcial, el sistema de disolvente orgánico inmiscible en agua comprende además una cantidad de un disolvente polar, donde el disolvente polar es metanol, acetona, acetonitrilo, isopropanol, éter dietílico o éter metil-terc-butílico.

4. El método de la reivindicación 1, en donde la etapa (b) de purificación parcial se lleva a cabo de forma automatizada.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el uso de cromatografía líquida incluye el uso de cromatografía líquida analítica; opcionalmente en donde el uso de cromatografía líquida incluye el uso de al menos una columna.

6. El método de la reivindicación 5, en donde el uso de cromatografía líquida analítica incluye el uso de una columna de fase inversa.

7. El método de la reivindicación 5 a 6, en donde el uso de cromatografía líquida incluye el uso de dos o más columnas de cromatografía líquida en paralelo, donde las dos o más columnas de cromatografía líquida están conectadas en línea a un único espectrómetro de masas.

8. El método de la reivindicación 7, en donde el uso de dos o más columnas de cromatografía líquida en paralelo incluye introducir la muestra parcialmente purificada en las dos o más columnas de cromatografía líquida en momentos escalonados.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la etapa (d) de análisis incluye ionizar testosterona mediante el uso de una técnica de ionización seleccionada del grupo que consiste en: ionización por electropulverización, ionización química a presión atmosférica y fotoionización a presión atmosférica.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la etapa (d) de análisis incluye detectar testosterona mediante el uso de un espectrómetro de masas cuadrupolar; y opcionalmente en donde el espectrómetro de masas cuadrupolar es un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo.

11. El método de la reivindicación 10, en donde la etapa (d) de análisis incluye: detectar el ion de testosterona intacto en el primer cuadrupolo; fragmentar el ion de testosterona intacto en el segundo cuadrupolo para producir uno o más iones fragmentos de testosterona; y detectar los uno o más iones fragmentos de testosterona en el tercer cuadrupolo.

12. El método de la reivindicación 1, en donde la etapa (d) de análisis incluye determinar la cantidad de testosterona en la muestra.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la muestra comprende un patrón interno; opcionalmente en donde el patrón interno es una testosterona estable marcada isotópicamente, opcionalmente en donde el patrón interno es una testosterona marcada con 13C y opcionalmente en donde el patrón interno es testosterona marcada con 2,3,4-13C.

14. El método de la reivindicación 1, que comprende además generar un informe útil para diagnosticar una enfermedad o afección asociada con niveles anormales de testosterona, en donde el informe menciona la concentración de testosterona en la muestra.

15. Un sistema para determinar la presencia o cantidad de testosterona en una muestra, comprendiendo el sistema:

(a) una estación para purificar parcialmente una muestra mediante el uso de extracción de líquidos con soporte con tierra de diatomeas y un sistema de disolvente orgánico inmiscible en agua; en donde el sistema de disolvente orgánico inmiscible en agua comprende: acetato de etilo, hexano, tolueno, octanol, cloroformo, diclorometano, éter dietílico, ciclohexano, pentano, N-heptanos, benceno, cloruro de n-butilo, butanol, cloruro de metileno o mezclas de dos o más de los anteriores, comprendiendo la muestra testosterona;

una estación para separar cromatográficamente testosterona de los otros componentes en la muestra parcialmente purificada mediante el uso de cromatografía líquida; y

(c) una estación para analizar la testosterona separada cromatográficamente mediante espectrometría de masas para determinar la presencia o cantidad de testosterona en la muestra.