ES3046008T3 - Plant regulatory elements and uses thereof - Google Patents

Plant regulatory elements and uses thereof

Info

Publication number
ES3046008T3
ES3046008T3 ES19197938T ES19197938T ES3046008T3 ES 3046008 T3 ES3046008 T3 ES 3046008T3 ES 19197938 T ES19197938 T ES 19197938T ES 19197938 T ES19197938 T ES 19197938T ES 3046008 T3 ES3046008 T3 ES 3046008T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
expression
plant
dna molecule
seq
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES19197938T
Other languages
English (en)
Inventor
Stanislaw Flasinski
Junhua Zhang
Suling Zhao
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Monsanto Technology LLC
Original Assignee
Monsanto Technology LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Monsanto Technology LLC filed Critical Monsanto Technology LLC
Application granted granted Critical
Publication of ES3046008T3 publication Critical patent/ES3046008T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
    • C12N15/821—Non-antibiotic resistance markers, e.g. morphogenetic, metabolic markers
    • C12N15/8212—Colour markers, e.g. beta-glucoronidase [GUS], green fluorescent protein [GFP], carotenoid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C12N15/8223—Vegetative tissue-specific promoters
    • C12N15/8225—Leaf-specific, e.g. including petioles, stomata
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C12N15/8223—Vegetative tissue-specific promoters
    • C12N15/8227—Root-specific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01056—Glucuronosyl-disulfoglucosamine glucuronidase (3.2.1.56), i.e. glycuronidase
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pretreatment Of Seeds And Plants (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

La invención proporciona moléculas y construcciones de ADN recombinante, y sus secuencias de nucleótidos, útiles para modular la expresión génica en plantas. La invención también proporciona plantas transgénicas, células vegetales, partes de plantas y semillas que comprenden una molécula de ADN recombinante que comprende una molécula de ADN operativamente unida a una molécula de ADN heteróloga transcribible, así como métodos para su uso. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0003] Elementos reguladores de las plantas y usos de los mismos
[0005] Campo de la invención
[0007] La invención está relacionada con el campo de la biología molecular vegetal, la ingeniería genética vegetal y las moléculas de ADN útiles para modular la expresión génica en plantas.
[0009] ANTECEDENTES
[0011] Los elementos reguladores son elementos genéticos que regulan la actividad de los genes modulando la transcripción de una molécula de ADN transcribible unida de forma operativa. Tales elementos incluyen promotores, líderes, intrones y regiones 3' no traducidas, y son útiles en el campo de la biología molecular vegetal y la ingeniería genética de plantas.
[0013] Sumario de la invención
[0015] La invención proporciona nuevos elementos reguladores de genes para su uso en plantas y construcciones que comprenden los elementos reguladores. La invención también proporciona plantas transgénicas, células vegetales, partes de plantas y semillas que comprenden los elementos reguladores. En una realización, la invención proporciona los elementos reguladores aquí desvelados enlazados operablemente a una molécula de ADN transcribible. En ciertas realizaciones, la molécula de ADN transcribible es heteróloga con respecto a una secuencia reguladora proporcionada en la presente memoria descriptiva También se proporcionan procedimientos para fabricar y utilizar los elementos reguladores aquí desvelados, incluyendo construcciones que comprenden los elementos reguladores, y plantas transgénicas, células vegetales, partes de plantas y semillas que comprenden los elementos reguladores enlazados operablemente a una molécula de ADN transcribible que es heteróloga con respecto al elemento regulador.
[0017] Así, en un aspecto, la invención proporciona una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en: (a) una secuencia de ADN con al menos un 95 por ciento de identidad de secuencia con la longitud completa de cualquiera de los SEQ ID NO: 19, en el que la secuencia de ADN tiene la actividad promotora de SEQ<i>D NO: 19; b) una secuencia de ADN que comprende SEQ ID NO: 19; y c) un fragmento que comprenda al menos 300 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 19, en el que el fragmento tiene la actividad promotora de SEQ ID NO: 19; en el que la secuencia de ADN está operablemente unida a una molécula polinucleotídica transcribible heteróloga. Por "molécula de ADN transcribible heteróloga" se entiende que la molécula de ADN transcribible es heteróloga con respecto a la secuencia de ADN. En realizaciones específicas, la molécula de ADN recombinante comprende una secuencia de ADN que tiene al menos aproximadamente un 95 por ciento, al menos aproximadamente un 96 por ciento, al menos aproximadamente un 97 por ciento, al menos aproximadamente un 98 por ciento o al menos aproximadamente un 99 por ciento de identidad de secuencia con la secuencia de ADN de SEQ ID NO: 19. En determinadas realizaciones, la molécula de ADN transcribible heteróloga comprende un gen de interés agronómico, como un gen capaz de proporcionar resistencia a herbicidas o resistencia a plagas en plantas. En otras realizaciones, la invención proporciona una construcción que comprende una molécula de ADN recombinante tal como se proporciona en la presente memoria descriptiva
[0019] En otro aspecto, se proporcionan en la presente memoria descriptiva células vegetales transgénicas que comprenden una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en: (a) una secuencia de ADN con al menos un 95 por ciento de identidad de secuencia con la longitud completa de SEQ ID NO: 19, en el que la secuencia de ADN tiene la actividad promotora de SEQ ID NO: 19; b) una secuencia de ADN que comprenda cualquiera de los SEQ ID NO: 1; y c) un fragmento que comprenda al menos 300 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 19, en el que el fragmento tiene la actividad promotora de SEQ ID NO: 19; en el que la secuencia de ADN está operablemente unida a un ADNpolinucleótido transcribible heterólogo. En ciertas realizaciones, la célula vegetal transgénica es una célula vegetal monocotiledónea. En otras realizaciones, la célula vegetal transgénica es una célula vegetal dicotiledónea.
[0021] En otro aspecto más, se proporciona además en la presente memoria descriptiva una planta transgénica, o parte de la misma, que comprende una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en: (a) una secuencia de ADN con al menos aproximadamente un 95 por ciento de identidad de secuencia con la longitud completa de SEQ ID NO:19, en la que la secuencia de ADN tiene la actividad promotora de SEQ ID NO: 19; b) una secuencia de ADN que comprende SEQ ID NO: 19; y c) un fragmento que comprenda al menos 300 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 19, en el que el fragmento tiene la actividad promotora de SEQ ID NO: 19; en el que la secuencia de ADN está operablemente unida a un polinucleótido de ADN transcribible heterólogo. En realizaciones específicas, la planta transgénica es una planta progenie de cualquier generación relativa a una planta transgénica de partida y comprende la molécula de ADN recombinante. La invención también proporciona una semilla transgénica que comprende la molécula de ADN recombinante que produce dicha planta transgénica cuando se cultiva.
[0022] También se proporciona en la presente memoria descriptiva un procedimiento para proporcionar una planta transgénica transformando una célula vegetal con una molécula de ADN recombinante de la invención para producir una célula vegetal transformada, y regenerando la célula vegetal transformada para producir una planta transgénica.
[0023] La planta transgénica puede ser una planta monocotiledónea. En una realización, la planta monocotiledónea se selecciona del grupo que consiste en Maíz(Zea mays),Arroz(Oryza sativa),Trigo(Triticum),Cebada(Hordeum vulgare),Sorgo(Sorghumspp.), mijo, mijo perla(Pennisetum glaucum),mijo de dedo(Eleusine coracana),mijo forrajero(Panicum miliaceum),mijo cola de zorra(Setaria italica),Avena(Avena sativa),Triticale, Centeno(Secale cereale),Fonio(Digitaria),Cebolla(Alliumspp.), Piña(Ananasspp.), Césped, Caña de azúcar(Saccharumspp.), Palmera(Arecaceae),Bambú(Bambuseae),Plátano(Musaceae),Familia del jengibre(Zingiberaceae),Lirios(Lilium),Narcisos(Narcissus),Iris(Iris),Amarilis, Orquídeas(Orchidaceae),Cannas, Campanillas(Hyacinthoides),y Tulipanes(Tulipa).La planta transgénica también puede ser una dicotiledónea. En una realización, la planta dicotiledónea se selecciona del grupo que consiste en Soja(Glycine max),Soja silvestre(Glycine soja),Algodón(Gossypium),Tomate(Solanum lycopersicum),Pimiento(Piper),Calabaza(Cucurbita),Guisante(Pisum sativum),Alfalfa(Medicago sativa), Medicago truncatula,Judías(Phaseolus),Garbanzos(Cicer arietinum),Girasol(Helianthus annuus),Patata(Solanum tuberosum),Cacahuete(Arachis hypogaea),Quinoa, trigo sarraceno(Fagopyrum esculentum),algarroba(onia siliqua),remolacha(Beta vulgaris),espinaca(Spinacia oleracea),y pepino(Cucumis sativus).
[0024] BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
[0025] Las figuras1a-1cmuestran una alineación entre la secuencia codificante nativa deE. colip-glucuronidasa (GUS) (CR-Ec.uidA-1:1:4, SEQ ID NO: 31) y la secuencia codón-rediseñadaE. colicodificante de GUS (CR-Ec.uidA_nno-1:1:1, SEQ ID NO:30). Los nucleótidos idénticos en el alineamiento se indican con un asterisco.
[0026] Breve descripción de las secuencias
[0027] SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 y 23 son secuencias promotoras.
[0028] SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24 son secuencias líderes.
[0029] SEQ ID NOs: 25-28 son secuencias de cebadores de amplificación.
[0030] SEQ ID NOs: 29 y 30 son secuencias codificadoras de GUS rediseñadas por codones. SEQ ID NO: 29 comprende un intrón procesable, mientras que SEQ ID NO: 30 es una secuencia de codificación contigua.
[0031] SEQ ID NO: 31 es la secuencia codificante nativa de la p-glucuronidasa deEscherichia co li.
[0032] SEQ ID NO: 32 es una secuencia codificadora de GUS con un intrón procesable basado en la p-glucuronidasa nativa deE. colide SEQ ID NO: 31.
[0033] SEQ ID NOs: 33, 39 y 40 son secuencias 3' UTR.
[0034] SEQ ID NOs: 34-37, 41 y 44 son secuencias de grupos de elementos de expresión reguladores transcripcionales (EXP) que comprenden o bien una secuencia promotora unida de forma operable 5' a una secuencia líder que está unida de forma operable 5' a una secuencia intrón, o en el caso de SEQ ID 44, una secuencia promotora unida de forma operable 5' a una secuencia líder.
[0035] SEQ ID NO: 38 es una secuencia de intrones.
[0036] SEQ ID NOs: 42 y 44 son secuencias codificantes para proteínas luciferasa derivadas dePhotinus pyralisyRenilla reniformis,respectivamente.
[0037] Descripción detallada de la invención
[0038] La invención proporciona moléculas de ADN con actividad reguladora de genes en plantas. Las secuencias de nucleótidos de estas moléculas de ADN se proporcionan como SEQ ID NO: 19. Estas moléculas de ADN son, por ejemplo, capaces de afectar a la expresión de una molécula de ADN transcribible enlazada operablemente en tejidos vegetales y, por tanto, de regular la expresión génica de un transgén enlazado operablemente en plantas transgénicas. La invención también proporciona procedimientos de modificación, producción y uso de los mismos. La invención también proporciona composiciones que incluyen células vegetales transgénicas, plantas, partes de plantas y semillas que contienen moléculas de ADN recombinante de la invención, y procedimientos para preparar y utilizar las mismas.
[0039] Las siguientes definiciones y procedimientos se proporcionan para definir mejor la presente invención y para guiar a aquellos con habilidades ordinarias en la técnica en la práctica de la presente invención. A menos que se indique lo contrario, los términos deben entenderse de acuerdo con el uso convencional por parte de los expertos en la técnica.
[0041] Moléculas de ADN
[0043] Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva el término "ADN" o "molécula de ADN" se relaciona con una molécula de ADN de doble cadena de origen genómico o sintético,es decir,un polímero de bases desoxirribonucleotídicas. En la presente memoria descriptiva el término "secuencia de ADN" se relaciona con la secuencia de nucleótidos de una molécula de ADN. La nomenclatura utilizada en la presente memoria descriptiva corresponde a la del Título 37 del Código de Reglamentos Federales de los Estados Unidos § 1.822, y a la establecida en los cuadros de la Norma ST25 (1998) de la OMPI, Apéndice 2, Cuadros 1 y 3.
[0045] Tal y como se utiliza aquí, una "molécula de ADN recombinante" es una molécula de ADN que comprende una combinación de moléculas de ADN que no se producirían juntas de forma natural sin la intervención humana. Por ejemplo, una molécula de ADN recombinante puede ser una molécula de ADN compuesta por al menos dos moléculas de ADN heterólogas entre sí, una molécula de ADN que comprende una secuencia de ADN que se desvía de las secuencias de ADN que existen en la naturaleza, o una molécula de ADN que se ha incorporado al ADN de una célula huésped mediante transformación genética.
[0047] Tal y como se utiliza aquí, el término "identidad de secuencia" se relaciona con la medida en que dos secuencias polinucleotídicas óptimamente alineadas o dos secuencias polipeptídicas óptimamente alineadas son idénticas. Una alineación óptima de secuencias se crea alineando manualmente dos secuencias,por ejemplo,una secuencia de referencia y otra secuencia de ADN, para maximizar el número de coincidencias de nucleótidos en la alineación de secuencias con inserciones, deleciones o huecos de nucleótidos internos apropiados. Tal y como se utiliza en la presente memoria descriptiva el término "secuencia de referencia" se relaciona con una secuencia de ADN proporcionada como SEQ ID NOs: 1-20.
[0049] Tal y como se utiliza aquí, el término "porcentaje de identidad de secuencia" o "porcentaje de identidad" o "% de identidad" es la fracción de identidad multiplicada por 100. La "fracción de identidad" de una secuencia alineada óptimamente con una secuencia de referencia es el número de coincidencias de nucleótidos en la alineación óptima, dividido por el número total de nucleótidos de la secuencia de referencia, por ejemplo, el número total de nucleótidos en toda la longitud de la secuencia de referencia completa. Así, una realización de la invención proporciona una molécula de ADN que comprende una secuencia que cuando se alinea óptimamente con una secuencia de referencia, proporcionada en el presente documento como SEQ ID NO: 19, tiene al menos un 95 por ciento de identidad, al menos un 96 por ciento de identidad, al menos un 97 por ciento de identidad, al menos un 98 por ciento de identidad, al menos un 99 por ciento de identidad o al menos un 100 por ciento de identidad con la secuencia de referencia.
[0051] Elementos reglamentarios
[0053] Elementos reguladores tales como promotores, líderes, potenciadores, intrones y regiones de terminación de la transcripción (o 3' UTR) desempeñan un papel integral en la expresión global de los genes en las células vivas. El término "elemento regulador", tal y como se utiliza aquí, se relaciona con una molécula de ADN con actividad reguladora de genes. El término "actividad reguladora de genes", tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva se relaciona con la capacidad de afectar a la expresión de una molécula de ADN transcribible enlazada operablemente, por ejemplo, afectando a la transcripción y/o traducción de la molécula de ADN transcribible enlazada operablemente. Los elementos reguladores, tales como promotores, líderes, potenciadores, intrones y 3' UTR que funcionan en las plantas son, por tanto, útiles para modificar los fenotipos vegetales mediante ingeniería genética.
[0055] Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva un "grupo de elementos reguladores de la expresión" o secuencia "EXP" puede referirse a un grupo de elementos reguladores enlazados de forma operable, como potenciadores, promotores, líderes e intrones. Así, un grupo de elementos reguladores de la expresión puede estar compuesto, por ejemplo, por un promotor enlazado operablemente 5' a una secuencia líder, que a su vez está enlazada operablemente 5' a una secuencia intrón.
[0057] Los elementos reguladores pueden caracterizarse por su patrón de expresión génica,por ejemplo,efectos positivos y/o negativos tales como expresión constitutiva o expresión temporal, espacial, de desarrollo, tisular, ambiental, fisiológica, patológica, de ciclo celular, y/o de respuesta química, y cualquier combinación de las mismas, así como por indicaciones cuantitativas o cualitativas. Tal y como se utiliza en la presente memoria descriptiva un "patrón de expresión génica" es cualquier patrón de transcripción de una molécula de ADN enlazada operablemente en una molécula de ARN transcrita. La molécula de ARN transcrita puede traducirse para producir una molécula proteica o puede proporcionar un antisentido u otra molécula de ARN reguladora, tal como un ARN de doble cadena (ARNd), un ARN de transferencia (ARNt), un ARN ribosómico (ARNr), un microARN (miARN) y similares.
[0059] Tal y como se utiliza aquí, el término "expresión proteica" es cualquier patrón de traducción de una molécula de ARN transcrita a una molécula proteica. La expresión de proteínas puede caracterizarse por sus cualidades temporales, espaciales, de desarrollo o morfológicas, así como por indicaciones cuantitativas o cualitativas.
[0060] Un promotor es útil como elemento regulador para modular la expresión de una molécula de ADN transcribible enlazada operablemente. Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva el término "promotor" se relaciona en general con una molécula de ADN que participa en el reconocimiento y la unión de la ARN polimerasa II y otras proteínas, como los factores de transcripción de acción trans, para iniciar la transcripción. Un promotor puede originarse en la región 5' no traducida (5' UTR) de un gen. Alternativamente, los promotores pueden ser moléculas de ADN producidas sintéticamente o manipuladas. Los promotores también pueden ser quiméricos. Los promotores quiméricos se producen mediante la fusión de dos o más moléculas de ADN heterólogas. Los promotores útiles en la práctica de la presente invención incluyen SEQ ID NO: 19, incluidos sus fragmentos o variantes. En realizaciones específicas de la invención, tales moléculas de ADN y cualesquiera variantes o derivados de las mismas como se describen en la presente memoria descriptiva pueden definirse además como que comprenden actividad promotora,es decir,son capaces de actuar como promotor en una célula huésped, tal como en una planta transgénica. En realizaciones aún más específicas, un fragmento puede definirse como aquel que exhibe la actividad promotora que posee la molécula promotora de partida de la que se deriva, o un fragmento puede comprender un "promotor mínimo" que proporciona un nivel basal de transcripción y está compuesto por una caja TATA o una secuencia de ADN equivalente para el reconocimiento y la unión del complejo ARN polimerasa II para el inicio de la transcripción.
[0062] En una realización, se proporcionan fragmentos de una secuencia promotora desvelada en la presente memoria descriptiva Los fragmentos de promotor pueden comprender actividad promotora, como se ha descrito anteriormente, y pueden ser útiles solos o en combinación con otros promotores y fragmentos de promotor, tal como en la construcción de promotores quiméricos. En realizaciones específicas, se proporcionan fragmentos de un promotor que comprenden al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 75, al menos aproximadamente 95, al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 125, al menos aproximadamente 150, al menos aproximadamente 175, al menos aproximadamente 200, al menos aproximadamente 225, al menos aproximadamente 250, al menos aproximadamente 275, al menos aproximadamente 300, al menos aproximadamente 500, al menos aproximadamente 600, al menos aproximadamente 700, al menos aproximadamente 750, al menos aproximadamente 800, al menos aproximadamente 900, o al menos aproximadamente 1000 nucleótidos contiguos, al menos aproximadamente 275, al menos aproximadamente 300, al menos aproximadamente 500, al menos aproximadamente 600, al menos aproximadamente 700, al menos aproximadamente 750, al menos aproximadamente 800, al menos aproximadamente 900, o al menos aproximadamente 1000 nucleótidos contiguos, o más largos, de una molécula polinucleotídica con actividad promotora desvelada en la presente memoria descriptiva Los procedimientos para producir tales fragmentos a partir de una molécula promotora de partida son bien conocidos en la técnica.
[0064] Composiciones derivadas de cualquiera de los promotores presentados como SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, y 19, tales como deleciones internas o 5', por ejemplo, pueden producirse utilizando procedimientos conocidos en la técnica para mejorar o alterar la expresión, incluyendo la eliminación de elementos que tienen efectos positivos o negativos sobre la expresión, la duplicación de elementos que tienen efectos positivos o negativos sobre la expresión, y/o la duplicación o eliminación de elementos que tienen efectos específicos de tejido o célula sobre la expresión. Composiciones derivadas de cualquiera de los promotores presentados como SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 y 19 compuestos por deleciones 3' en las que se elimina el elemento caja TATA o una secuencia equivalente del mismo y la secuencia corriente abajo pueden utilizarse, por ejemplo, para fabricar elementos potenciadores. Se pueden realizar otras supresiones para eliminar cualquier elemento que tenga efectos positivos o negativos, específicos de tejido, específicos de célula o específicos de tiempo (tal como, por ejemplo, el ritmo circadiano) sobre la expresión. Cualquiera de los promotores presentados como SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 y 19 y los fragmentos o potenciadores derivados de los mismos pueden utilizarse para fabricar composiciones quiméricas de elementos reguladores transcripcionales formadas por cualquiera de los promotores presentados como SEQ ID NOs:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 y 19 y los fragmentos o potenciadores derivados de los mismos enlazados operablemente a otros potenciadores y promotores.
[0066] De acuerdo con la invención, un promotor o fragmento de promotor puede analizarse para detectar la presencia de elementos promotores conocidos,es decir,características de secuencia de ADN, tales como una caja TATA y otros motivos de sitio de unión a factor de transcripción conocidos. Un experto en la materia puede utilizar la identificación de estos elementos promotores conocidos para diseñar variantes del promotor que tengan un patrón de expresión similar al del promotor original.
[0068] Como se utiliza aquí, el término "líder" se relaciona con una molécula de ADN de la región 5' no traducida (5' UTR) de un gen y se define generalmente como un segmento de nucleótidos entre el sitio de inicio de la transcripción (SIT) y el sitio de inicio de la secuencia codificante de proteínas. Alternativamente, los líderes pueden ser elementos de ADN producidos sintéticamente o manipulados. Un líder puede utilizarse como elemento regulador 5' para modular la expresión de una molécula de a Dn transcribible enlazada operablemente. Las moléculas líder pueden utilizarse con un promotor heterólogo o con su promotor nativo. Así pues, las moléculas promotoras de la presente invención pueden estar unidas de forma operable a su líder nativo o a un líder heterólogo. Los líderes útiles en la práctica de la invención incluyen SEQ ID NO: 20 o fragmentos o variantes de los mismos. En realizaciones específicas, tales secuencias de ADN pueden definirse como capaces de actuar como líder en una célula huésped, incluyendo, por ejemplo, una célula vegetal transgénica. En una realización, tales secuencias de ADN se descodifican como que comprenden actividad líder.
[0070] Las secuencias líder (5' UTR) se presentan como SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 y 20 pueden estar compuestos de elementos reguladores o pueden adoptar estructuras secundarias que pueden tener un efecto sobre la transcripción o traducción de una molécula de ADN enlazada operablemente. Las secuencias líder presentadas como SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 y 20 pueden utilizarse de acuerdo con la invención para fabricar elementos reguladores quiméricos que afecten a la transcripción o traducción de una molécula de ADN operablemente unida. Además, las secuencias líder presentadas como SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 y 20 pueden utilizarse para fabricar secuencias líder quiméricas que afecten a la transcripción o traducción de una molécula de ADN enlazada operablemente.
[0072] Tal y como se utiliza aquí, el término "intrón" se relaciona con una molécula de ADN que puede identificarse a partir de un gen y puede definirse generalmente como una región empalmada durante el procesamiento del ARN mensajero (ARNm) antes de la traducción. Alternativamente, un intrón puede ser un elemento de ADN producido o manipulado sintéticamente. Un intrón puede contener elementos potenciadores que afectan a la transcripción de genes operablemente ligados. Un intrón puede utilizarse como elemento regulador para modular la expresión de una molécula de ADN transcribible enlazada operablemente. Una construcción puede comprender un intrón, y el intrón puede o no ser heterólogo con respecto a la molécula de ADN transcribible. Ejemplos de intrones en la técnica incluyen el intrón de actina del arroz y el intrón HSP70 del maíz.
[0074] En las plantas, la inclusión de algunos intrones en construcciones génicas conduce a una mayor acumulación de ARNm y proteínas en relación con las construcciones que carecen del intrón. Este efecto se ha denominado "potenciación mediada por intrones" (PMI) de la expresión génica (Mascarenhas et al., Plant Mol. Biol. 15:913-920, 1990). Los intrones conocidos por estimular la expresión en plantas se han identificado en genes de maíz(por ejemplo,tubA1, Adh1, Sh1 y Ubi1), en genes de arroz(por ejemplo,tpi) y en genes de plantas dicotiledóneas como los de petunia(por ejemplo,rbcS), patata(por ejemplo,st-ls1) y deArabidopsis thaliana (por ejemplo,ubq3 y pat1). Se ha demostrado que las deleciones o mutaciones dentro de los sitios de empalme de un intrón reducen la expresión génica, lo que indica que el empalme podría ser necesario para la PMI. Sin embargo, el empalme per se podría no ser necesario, como ha demostrado la PMI en plantas dicotiledóneas mediante mutaciones puntuales dentro de los sitios de empalme del gen pat1 de A. thaliana. Se ha demostrado que el uso múltiple del mismo intrón en una planta presenta desventajas. En esos casos, es necesario disponer de una colección de elementos de control básicos para la construcción de elementos de ADN recombinante adecuados.
[0076] Tal y como se utiliza en la presente memoria descriptiva el término "molécula de terminación de la transcripción 3'", "región no traducida 3'" o "3' UTR" se relaciona con una molécula de ADN que se utiliza durante la transcripción en la región no traducida de la porción 3' de una molécula de ARNm. La región no traducida 3' de una molécula de ARNm puede generarse mediante un corte específico y una poliadenilación 3', también conocida como cola poliA. Una UTR 3' puede estar unida de forma operativa a una molécula de ADN transcribible y situada aguas abajo de la misma, y puede incluir una señal de poliadenilación y otras señales reguladoras capaces de afectar a la transcripción, el procesamiento del ARNm o la expresión génica. Se cree que las colas de poliA intervienen en la estabilidad del ARNm y en el inicio de la traducción. Ejemplos de moléculas de terminación de la transcripción 3' en la técnica son la región 3' de la nopalina sintasa; la región 3' de la hsp17 del trigo, la región 3' de la subunidad pequeña de la rubisco del guisante, la región 3' de la E6 del algodón y la UTR 3' de la coixina.
[0078] Los 3' UTR suelen utilizarse para la expresión recombinante de moléculas de ADN específicas. Un UTR 3' débil tiene el potencial de generar lectura, lo que puede afectar a la expresión de la molécula de ADN situada en los casetes de expresión vecinos. Un control adecuado de la terminación de la transcripción puede evitar la lectura de secuencias de ADN (por ejemplo, otros casetes de expresión) localizadas aguas abajo y, además, puede permitir un reciclaje eficiente de la ARN polimerasa para mejorar la expresión génica. La terminación eficiente de la transcripción (liberación de la ARN polimerasa II del ADN) es un requisito previo para el reinicio de la transcripción y, por tanto, afecta directamente al nivel global de transcripción. Tras la terminación de la transcripción, el ARNm maduro se libera del lugar de síntesis y el molde se transporta al citoplasma. Los ARNm eucariotas se acumulan como formas poli(A)in vivo,lo que dificulta la detección de los sitios de terminación transcripcional mediante procedimientos convencionales. Además, la predicción de UTRs 3' funcionales y eficientes mediante procedimientos bioinformáticos es difícil, ya que no existen secuencias de ADN conservadas que permitan predecir fácilmente una UTR 3' eficaz.
[0080] Desde un punto de vista práctico, suele ser beneficioso que una UTR 3' utilizada en un casete de expresión posea las siguientes características. La UTR 3' debe ser capaz de terminar de forma eficiente y eficaz la transcripción de la molécula de ADN transcribible y evitar la lectura de la transcripción en cualquier secuencia de ADN vecina, que puede estar compuesta por otro casete de expresión como en el caso de múltiples casetes de expresión que residen en un ADN de transferencia (ADN-T), o el ADN cromosómico vecino en el que se ha insertado el ADN-T. La 3' UTR no debe causar una reducción de la actividad transcripcional impartida por el promotor, el líder, los potenciadores y los intrones que se utilizan para impulsar la expresión de la molécula de ADN. En biotecnología vegetal, la UTR 3' se utiliza a menudo para cebar reacciones de amplificación de ARN transcrito inversamente extraído de la planta transformada y utilizado para: (1) evaluar la actividad transcripcional o la expresión del casete de expresión una vez integrado en el cromosoma de la planta; (2) evaluar el número de copias de las inserciones dentro del ADN de la planta; y (3) evaluar la cigosidad de la semilla resultante tras la reproducción. La UTR 3' también se utiliza en reacciones de amplificación del ADN extraído de la planta transformada para caracterizar la integridad del casete insertado.
[0082] Tal y como se utiliza aquí, el término "potenciador" o "elemento potenciador" se relaciona con un elemento regulador de acción cis, también conocido como elemento cis, que confiere un aspecto del patrón de expresión global, pero que normalmente es insuficiente por sí solo para impulsar la transcripción de una secuencia de ADN enlazada operablemente. A diferencia de los promotores, los elementos potenciadores no suelen incluir un sitio de inicio de la transcripción (SIT) ni una caja TATA o secuencia de ADN equivalente. Un promotor o fragmento de promotor puede comprender de forma natural uno o más elementos potenciadores que afectan a la transcripción de una secuencia de ADN operablemente unida. Un elemento potenciador también puede fusionarse a un promotor para producir un cis-elemento promotor quimérico, que confiere un aspecto de la modulación global de la expresión génica.
[0084] Se cree que muchos elementos potenciadores del promotor se unen a proteínas de unión al ADN y/o afectan a la topología del ADN, produciendo conformaciones locales que permiten o restringen selectivamente el acceso de la a R<n>polimerasa al molde de ADN o que facilitan la apertura selectiva de la doble hélice en el lugar de inicio transcripcional. Un elemento potenciador puede funcionar para unir factores de transcripción que regulan la transcripción. Algunos elementos potenciadores se unen a más de un factor de transcripción, y los factores de transcripción pueden interactuar con diferentes afinidades con más de un dominio potenciador. Los elementos potenciadores pueden identificarse mediante un número de técnicas, incluyendo el análisis de deleción,es decir,deleción de uno o más nucleótidos del extremo 5' o interno de un promotor; análisis de proteínas de unión al ADN mediante huella de DNasa I, interferencia de metilación, ensayos de desplazamiento de movilidad por electroforesis,huella genómica in vivomediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediada por ligación, y otros ensayos convencionales; o mediante análisis de similitud de secuencias de ADN utilizando motivos de elementos cis o elementos potenciadores conocidos como secuencia diana o motivo diana con métodos convencionales de comparación de secuencias de ADN, tal como BLAST. La estructura fina de un dominio potenciador puede estudiarse más a fondo mediante mutagénesis (o sustitución) de uno o más nucleótidos o por otros procedimientos convencionales conocidos en la técnica. Los elementos potenciadores pueden obtenerse por síntesis química o por aislamiento a partir de elementos reguladores que incluyan tales elementos, y pueden sintetizarse con nucleótidos flanqueantes adicionales que contengan sitios útiles de enzimas de restricción para facilitar la manipulación de la subsecuencia. Así pues, la invención abarca el diseño, la construcción y el uso de elementos potenciadores de acuerdo con los procedimientos aquí descritos para modular la expresión de moléculas de ADN transcribibles enlazadas operablemente.
[0086] Tal y como se utiliza en la presente memoria descriptiva el término "quimérico" se relaciona con una molécula de ADN única producida mediante la fusión de una primera molécula de ADN con una segunda molécula de ADN, en la que ni la primera ni la segunda molécula de ADN se encontrarían normalmente en esa configuración,es decir,fundidas la una con la otra. La molécula de ADN quimérico es, por tanto, una nueva molécula de ADN que no se encuentra normalmente en la naturaleza. Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva el término "promotor quimérico" se relaciona con un promotor producido mediante dicha manipulación de moléculas de ADN. Un promotor quimérico puede combinar dos o más fragmentos de ADN, por ejemplo, la fusión de un promotor con un elemento potenciador. Por lo tanto, el diseño, la construcción y el uso de promotores quiméricos de acuerdo con los procedimientos desvelados en la presente memoria descriptiva para modular la expresión de moléculas de polinucleótidos transcribibles enlazadas operablemente están comprendidos en la invención.
[0088] Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva el término "variante" se relaciona con una segunda molécula de ADN, tal como un elemento regulador, que es similar en composición, pero no idéntica, a una primera molécula de ADN, y en la que la segunda molécula de ADN aún mantiene la funcionalidad general,es decir,el mismo o similar patrón de expresión, de la primera molécula de ADN. Una variante puede ser una versión acortada o truncada de la primera molécula de ADN y/o una versión alterada de la secuencia de ADN de la primera molécula de ADN, como una con diferentes sitios de enzimas de restricción y/o deleciones, sustituciones y/o inserciones internas. Las "variantes" de elementos reguladores también engloban las variantes derivadas de mutaciones que se producen de forma natural en la transformación de células bacterianas y vegetales. En la invención, una secuencia de ADN como la descrita anteriormente puede usarse para crear variantes que son similares en composición, pero no idénticas, a la secuencia de a Dn del elemento regulador original, manteniendo al mismo tiempo la funcionalidad general,es decir,el mismo o similar patrón de expresión, del elemento regulador original.
[0089] La producción de tales variantes de la invención está bien dentro de la habilidad ordinaria del arte a la luz de la divulgación y se abarca dentro del alcance de la invención.
[0091] Los elementos reguladores quiméricos pueden diseñarse para que comprendan varios elementos constituyentes que pueden unirse operativamente mediante varios procedimientos conocidos en la técnica, como la digestión y ligadura con enzimas de restricción, la clonación independiente de la ligadura, el ensamblaje modular de productos de RCP durante la amplificación, o la síntesis química directa del elemento regulador, así como otros procedimientos conocidos en la técnica. Los diversos elementos reguladores quiméricos resultantes pueden estar compuestos por los mismos elementos constituyentes, o por variantes de los mismos, pero diferir en la secuencia o secuencias de ADN que comprenden la secuencia o secuencias de ADN de enlace que permiten que las partes constituyentes se unan operativamente. En la invención, una secuencia de ADN como la descrita anteriormente puede proporcionar una secuencia de referencia de elementos reguladores, en la que los elementos constituyentes que comprenden la secuencia de referencia pueden unirse mediante procedimientos conocidos en la técnica y pueden comprender sustituciones, deleciones y/o inserciones de uno o más nucleótidos o mutaciones que se producen de forma natural en la transformación de células bacterianas y vegetales.
[0093] La eficacia de las modificaciones, duplicaciones o supresiones descritas en la presente memoria descriptiva sobre los aspectos de expresión deseados de un transgén concreto puede probarse empíricamente en ensayos de plantas estables y transitorias, tales como los descritos en los ejemplos de trabajo de la presente memoria descriptiva con el fin de validar los resultados, que pueden variar en función de los cambios realizados y del objetivo del cambio en la molécula de ADN de partida.
[0095] Constructo
[0097] Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, el término "constructo" significa cualquier molécula de ADN recombinante tal como un plásmido, cósmido, virus, fago o molécula de ADN o ARN lineal o circular, derivado de cualquier fuente, capaz de integración genómica o replicación autónoma, que comprende una molécula de ADN en la que al menos una molécula de ADN se ha unido a otra molécula de ADN de una manera funcionalmente operativa,es decir,unida operablemente. Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva el término "vector" se relaciona con cualquier construcción que pueda utilizarse para la transformación, es decir, la introducción de ADN o ARN heterólogo en una célula huésped. Una construcción suele incluir uno o más casetes de expresión. Como se utiliza en la presente memoria descriptiva un "casete de expresión" se relaciona con una molécula de ADN que comprende al menos una molécula de ADN transcribible unida operablemente a uno o más elementos reguladores, típicamente al menos un promotor y un 3' UTR.
[0099] Tal y como se utiliza en la presente memoria descriptiva el término "unido de forma operable" se relaciona con una primera molécula de ADN unida a una segunda molécula de ADN, en la que la primera y la segunda moléculas de ADN están dispuestas de tal forma que la primera molécula de ADN afecta a la función de la segunda molécula de ADN. Las dos moléculas de ADN pueden o no formar parte de una única molécula de ADN contigua y pueden o no ser adyacentes. Por ejemplo, un promotor está operativamente ligado a una molécula de ADN transcribible si el promotor modula la transcripción de la molécula de ADN transcribible de interés en una célula. Un líder, por ejemplo, está operativamente ligado a la secuencia de ADN cuando es capaz de afectar a la transcripción o traducción de la secuencia de ADN.
[0101] Las construcciones de la invención pueden proporcionarse, en una realización, como construcciones de doble borde de plásmido inductor de tumores (Ti) que tienen el borde derecho (RB o AGRtu.RB) y el borde izquierdo (LB o AGRtu.LB) del plásmido Ti aislado deAgrobacterium tumefaciensque comprenden un ADN-T que, junto con moléculas de transferencia proporcionadas por las células deA. tumefaciens,permiten la integración del ADN-T en el genoma de una célula vegetal(véase, por ejemplo,patente estadounidense 6.603.061). Las construcciones también pueden contener los segmentos de ADN de la columna vertebral del plásmido que proporcionan la función de replicación y la selección de antibióticos en células bacterianas,por ejemplo,un origen de replicación deEscherichia colital como ori322, un origen de replicación de amplio intervalo de hospedador tal como oriV u oriRi, y una región codificante para un marcador seleccionable como Spec/Strp que codifica para Tn7 aminoglucósido adeniltransferasa(aadA)que confiere resistencia a la espectinomicina o estreptomicina, o un gen marcador seleccionable de gentamicina (Gm, Gent). Para la transformación de plantas, la cepa bacteriana huésped suele serA. tumefaciensABI, C58, o LBA4404; sin embargo, otras cepas conocidas por los expertos en el arte de la transformación de plantas pueden funcionar en la invención.
[0103] Se conocen procedimientos en la técnica para ensamblar e introducir construcciones en una célula de tal manera que la molécula de ADN transcribible se transcriba en una molécula de ARNm funcional que se traduzca y se exprese como una proteína. Para la práctica de la invención, los expertos en la materia conocen bien las composiciones y procedimientos convencionales para preparar y utilizar construcciones y células huésped. Los vectores típicos útiles para la expresión de ácidos nucleicos en plantas superiores son bien conocidos en la técnica e incluyen vectores derivados del plásmido Ti deAgrobacterium tumefaciensy el vector de control de transferencia pCaMVCN.
[0104] En una construcción pueden incluirse varios elementos reguladores, incluyendo cualquiera de los aquí previstos. Cualquiera de estos elementos reguladores puede proporcionarse en combinación con otros elementos reguladores. Tales combinaciones pueden diseñarse o modificarse para producir características reguladoras deseables. En una realización, las construcciones de la invención comprenden al menos un elemento regulador unido de forma operable a una molécula de ADN transcribible unida de forma operable a una 3' UTR.
[0106] Las construcciones de la invención pueden incluir cualquier promotor o líder proporcionado en la presente memoria descriptiva o conocido en la técnica. Por ejemplo, un promotor de la invención puede vincularse operablemente a un líder 5' no traducido heterólogo, tal como uno derivado de un gen de proteína de choque térmico. Alternativamente, un líder de la invención puede estar operablemente unido a un promotor heterólogo tal como el promotor de transcripción 35S del virus del mosaico de la coliflor.
[0108] Los casetes de expresión también pueden incluir una secuencia codificante de péptido de tránsito que codifica un péptido útil para la orientación subcelular de una proteína enlazada operablemente, en particular a un cloroplasto, leucoplasto u otro orgánulo plastidial; mitocondria; peroxisoma; vacuola; o una localización extracelular. Muchas proteínas localizadas en el cloroplasto se expresan a partir de genes nucleares como precursores y se dirigen al cloroplasto mediante un péptido de tránsito del cloroplasto (CTP). Ejemplos de tales proteínas aisladas del cloroplasto incluyen, pero no se limitan a, las asociadas con la subunidad pequeña (SSU) de la ribulosa-1,5,-bisfosfato carboxilasa, ferredoxina, ferredoxina oxidorreductasa, la proteína I y la proteína II del complejo recolector de luz, tiorredoxina F y enolpiruvil shikimato fosfato sintasa (EPSPS). Los péptidos de tránsito del cloroplasto se describen, por ejemplo, en la patente estadounidense Núm. 7.193.133. Se ha demostrado que las proteínas no cloroplásticas pueden dirigirse al cloroplasto mediante la expresión de una CTP heteróloga unida operablemente al transgén que codifica las proteínas no cloroplásticas.
[0110] Moléculas de ADN transcribibles
[0112] Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva el término "molécula de ADN transcribible" se relaciona con cualquier molécula de<a>D<n>capaz de transcribirse en una molécula de ARN, incluidas, entre otras, las que tienen secuencias de codificación de proteínas y las que producen moléculas de ARN con secuencias útiles para la supresión de genes. El tipo de molécula de ADN puede incluir, entre otras, una molécula de ADN de la misma planta, una molécula de ADN de otra planta, una molécula de ADN de un organismo diferente, o una molécula de ADN sintética, como una molécula de ADN que contenga un mensaje antisentido de un gen, o una molécula de ADN que codifique una versión artificial, sintética o modificada de otro modo de un transgén. Las moléculas de ADN transcribibles ejemplares para su incorporación en construcciones de la invención incluyen,por ejemplo,moléculas de ADN o genes de una especie distinta de la especie a la que se incorpora la molécula de ADN o genes que se originan en, o están presentes en, la misma especie pero que se incorporan a células receptoras mediante procedimientos de ingeniería genética en lugar de técnicas de reproducción clásicas.
[0114] Un "transgén" se relaciona con una molécula de ADN transcribible heteróloga a una célula huésped al menos en lo que respecta a su localización en el genoma de la célula huésped y/o a una molécula de ADN transcribible incorporada artificialmente al genoma de una célula huésped en la generación actual o en cualquier generación anterior de la célula.
[0116] Un elemento regulador, como un promotor de la invención, puede estar unido de forma operable a una molécula de ADN transcribible que sea heteróloga con respecto al elemento regulador. Tal y como se utiliza aquí, el término "heterólogo" se relaciona con la combinación de dos o más moléculas de ADN cuando dicha combinación no se encuentra normalmente en la naturaleza. Por ejemplo, las dos moléculas de ADN pueden derivar de especies diferentes y/o las dos moléculas de ADN pueden derivar de genes diferentes,por ejemplo,genes diferentes de la misma especie o los mismos genes de especies diferentes. Por lo tanto, un elemento regulador es heterólogo con respecto a una molécula de ADN transcribible unida operablemente si tal combinación no se encuentra normalmente en la naturaleza,es decir,la molécula de ADN transcribible no se encuentra naturalmente unida operablemente al elemento regulador.
[0118] La molécula de ADN transcribible puede ser, en general, cualquier molécula de ADN para la que se desee la expresión de un transcrito. Dicha expresión de un transcrito puede dar lugar a la traducción de la molécula de ARNm resultante y, por tanto, a la expresión de proteínas. Alternativamente, por ejemplo, una molécula de ADN transcribible puede diseñarse para causar en última instancia la disminución de la expresión de un gen o proteína específicos. En una realización, esto puede lograrse utilizando una molécula de ADN transcribible que esté orientada en la dirección antisentido. Un experto en la materia está familiarizado con el uso de esta tecnología antisentido. Cualquier gen puede ser regulado negativamente de esta manera, y, en una realización, una molécula de ADN transcribible puede ser diseñada para la supresión de un gen específico a través de la expresión de una molécula de dsRNA, siRNA o miRNA.
[0120] Por lo tanto, una realización de la invención es una molécula de ADN recombinante que comprende un elemento regulador de la invención como se ha descrito anteriormente operativamente unido a una molécula de ADN transcribible heteróloga con el fin de modular la transcripción de la molécula de ADN transcribible a un nivel deseado o en un patrón deseado cuando la construcción se integra en el genoma de una célula vegetal transgénica. En una realización, la molécula de ADN transcribible comprende una región codificante de proteínas de un gen y en otra realización la molécula de ADN transcribible comprende una región antisentido de un gen.
[0121] Genes de interés agronómico
[0123] Una molécula de ADN transcribible puede ser un gen de interés agronómico. Tal y como se utiliza aquí, el término "gen de interés agronómico" se relaciona con una molécula de ADN transcribible que, cuando se expresa en un tejido vegetal, célula o tipo celular concreto, confiere una característica deseable. El producto de un gen de interés agronómico puede actuar dentro de la planta para causar un efecto sobre la morfología, fisiología, crecimiento, desarrollo, rendimiento, composición del grano, perfil nutricional, resistencia a enfermedades o plagas, y/o tolerancia ambiental o química de la planta, o puede actuar como agente pesticida en la dieta de una plaga que se alimente de la planta. En una realización de la invención, un elemento regulador de la invención se incorpora en una construcción de tal manera que el elemento regulador está operativamente vinculado a una molécula de ADN transcribible que es un gen de interés agronómico. En una planta transgénica que contenga una construcción de este tipo, la expresión del gen de interés agronómico puede conferir un rasgo agronómico beneficioso. Un rasgo agronómico beneficioso puede incluir, pero no está limitado a, tolerancia a herbicidas, control de insectos, rendimiento modificado, resistencia a enfermedades, resistencia a patógenos, crecimiento y desarrollo modificados de la planta, contenido modificado de almidón, contenido modificado de aceite, contenido modificado de ácidos grasos, contenido modificado de proteínas, maduración modificada de la fruta, nutrición animal y humana mejorada, producciones de biopolímeros, resistencia al estrés ambiental, péptidos farmacéuticos, cualidades mejoradas de procesamiento, sabor mejorado, utilidad de producción de semillas híbridas, producción mejorada de fibras y producción deseable de biocombustibles.
[0125] Ejemplos de genes de interés agronómico conocidos en la técnica incluyen los de resistencia a herbicidas (Patentes de EE.UU. Núm. 6.803.501; 6.448.476; 6.248.876; 6.225.114; 6.107.549; 5.866.775; 5.804.425; 5.633.435; y 5.463.175), aumento del rendimiento (Patentes de EE.UU. Núm.USRE38.446; 6.716.474; 6.663.906; 6.476.295; 6.441.277; 6.423.828; 6.399.330; 6.372.211; 6.235.971; 6.222.098; y 5.716.837), control de insectos (Patentes de EE.UU. Núm. 6.809.078; 6.713.063; 6.686.452; 6.657.046; 6.645.497; 6.642.030; 6.639.054; 6.620.988; 6.593.293; 6.555.655; 6.538.109; 6.537.756; 6.521.442; 6.501.009; 6.468.523; 6.326.351; 6.313.378; 6.284.949; 6.281.016; 6.248.536; 6.242.241; 6.221.649; 6.177.615; 6.156.573; 6.153.814; 6.110.464; 6.093.695; 6.063.756; 6.063.597; 6.023.013; 5.959.091; 5.942.664; 5.942.658, 5.880.275; 5.763.245; y 5.763.241), resistencia a enfermedades fúngicas (U.S. Núm. de patente 6.653.280; 6.573.361; 6.506.962; 6.316.407; 6.215.048; 5.516.671; 5.773.696; 6.121.436; 6.316.407; y 6.506.962), resistencia a virus (Patentes de EE.UU Núm. 6,617,496; 6,608,241; 6,015,940; 6,013,864; 5,850,023; y 5,304,730), resistencia a nematodos (U.UU. Núm. 6.228.992), resistencia a enfermedades bacterianas (Patente de EE.UU. Núm. 5.516.671), crecimiento y desarrollo de plantas (Patentes de EE.UU. Núm. 6.723.897 y 6.518.488), producción de almidón (Patentes de EE.UU. nos. 6.538.181; 6.538.179; 6.538.178; 5.750.876; 6.476.295), producción de aceites modificados (Patentes de EE.UU. Núm.
[0126] 6.444.876; 6.426.447; y 6.380.462), producción de aceites de alto contenido en grasas (Patentes de EE.UU. Núm.
[0127] 6.495.739; 5.608.149; 6.483.008; y 6.476.295), contenido modificado de ácidos grasos (Patentes de EE.UU. Núm.
[0128] 6.828.475; 6.822.141; 6.770.465; 6.706.950; 6.660.849; 6.596.538; 6.589.767; 6.537.750; 6.489.461; y 6.459.018), alta producción de proteínas (Patentes de EE.UU. Núm.Patente estadounidense Núm. 6.380.466), maduración de frutas (Patente estadounidense Núm. 5.512.466), mejora de la nutrición animal y humana (Patentes estadounidenses nos.6.723.837; 6.653.530; 6.5412.59; 5.985.605; y 6.171.640), biopolímeros (Patente de EE.UU. Núm. USRE37.543; 6.228.623; y 5.958.745, y 6.946.588), resistencia al estrés medioambiental (Patente de EE.UU.
[0129] 6.072.103), péptidos farmacéuticos y péptidos secretables (Patente de EE.UU Núm. 6.812.379; 6,774.283; 6.140.075; y 6.080.560), rasgos de procesamiento mejorados (U.Patente de EE.UU. Núm. 6.476.295), digestibilidad mejorada (Patente de EE.UU. Núm. 6.531.648), bajo contenido en rafinosa (Patente de EE.UU. Núm.
[0130] 6.166.292), producción industrial de enzimas (Patente de EE.UU. Núm. 5.542.000), producción industrial de enzimas (Patente de EE.Patente de EE.UU. Núm. 5.543.576), mejora del sabor (Patente de EE.UU. Núm.
[0131] 6.011.199), fijación del nitrógeno (Patente de EE.UU. Núm. 5.229.114), producción de semillas híbridas (Patente de EE.UU. Núm. 5.689.041). 5.689.041), la producción de fibra (patentes estadounidenses Núm. 6.576.818; 6.271.443; 5.981.834; y 5.869.720) y la producción de biocombustible (patente estadounidense Núm. 5.998.700).
[0132] Alternativamente, un gen de interés agronómico puede afectar a las características o fenotipos de la planta antes mencionados mediante la codificación de una molécula de ARN que causa la modulación dirigida de la expresión génica de un gen endógeno, por ejemplo medianteantisentido (véase, por ejemplo,patente estadounidense 5.107.065); ARN inhibitorio ("ARNi", incluida la modulación de la expresión génica por mecanismos mediados por miARN-, ARNsi-, ARNsi de acción trans- y ARNs en fase, por ejemplo, como se describe en las solicitudes publicadas U.S. 2006/0200878 y U.S. 2008/0066206, y en la solicitud de patente U.S. 11/974,469); o mecanismos mediados por cosupresión. El ARN también podría ser una molécula de ARN catalítica(por ejemplo,una ribozima o un riboswitch;véase, por ejemplo,el documento U.S. 2006/0200878) diseñada para escindir un producto de ARNm endógeno deseado. Se conocen procedimientos en la técnica para construir e introducir construcciones en una célula de forma que la molécula de ADN transcribible se transcriba en una molécula capaz de causar la supresión de genes.
[0133] La expresión de una molécula de ADN transcribible en una célula vegetal también puede utilizarse para suprimir plagas vegetales que se alimentan de la célula vegetal, por ejemplo, composiciones aisladas de plagas de coleópteros y composiciones aisladas de plagas de nematodos. Las plagas de las plantas incluyen, entre otras, plagas de artrópodos, plagas de nematodos y plagas fúngicas o microbianas.
[0135] Marcadores seleccionables
[0137] También pueden utilizarse transgenes marcadores seleccionables con los elementos reguladores de la invención. Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva el término "transgén marcador seleccionable" se relaciona con cualquier molécula de ADN transcribible cuya expresión en una planta, tejido o célula transgénica, o la ausencia de la misma, se puede detectar o puntuar de alguna manera. Los genes marcadores seleccionables, y sus técnicas de selección y cribado asociadas, para su uso en la práctica de la invención son conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, moléculas de ADN transcribibles que codifican p-glucuronidasa (GUS), proteína verde fluorescente (GFP), proteínas que confieren resistencia a los antibióticos y proteínas que confieren tolerancia a los herbicidas.
[0139] B-Glucuronidasa
[0141] El gen de la p-glucuronidasa (GUS) aislado deEscherichia coliK-12 es uno de los genes informadores más utilizados en biotecnología vegetal. El gen GUS deE. coli,uidA, forma parte del operón GUS del cromosoma bacteriano. Es inducida por una amplia variedad de p-D-glucurónidos. La enzima g Us es una exohidrolasa que cataliza la hidrólisis de p-D-glucurónidos en ácido D-glucurónico y la aglicona.E. colivive en el tubo digestivo de los vertebrados, incluido el hombre. Los vertebrados utilizan la vía de la glucuronidación para desintoxicar xenobióticos y compuestos de desecho endógenos como esteroides, alcoholes alifáticos, fenol, ácidos carboxílicos, azúcares y otros metabolitos. La glucuronidación implica la conjugación con el ácido D-glucurónico. Esto ocurre principalmente en el hígado, pero también en otros tejidos y órganos tales como el riñón, las glándulas suprarrenales y el tracto alimentario. El ácido glucurónico puede ser utilizado porE. colicomo fuente principal de carbono y energía. Por lo tanto, la proteína GUS deE. coliproporciona un medio por el cual la bacteria puede degradar los productos de la vía de la glucuronidación en el tracto alimentario de los vertebrados para producir ácido glucurónico como fuente de carbono y energía. Las agliconas que también son liberadas por la enzima GUS no suelen ser degradadas por la bacteria, sino que se utilizan como lanzadera para el ácido D-glucurónico (Gilissen et al., Transgenic Research, 7: 157-163, 1998).
[0143] El uso del gen de la p-glucuronidasa deE. colicomo reportero fue descrito por primera vez por Jefferson et al. (Proc. Natl. Acad. Sci., 83: 8447-8451, 1986) y, desde su introducción, se ha utilizado de forma muy similar a la descrita en un principio. El gen GUS se utiliza para monitorizar la expresión génica de las plantas y se emplea con frecuencia para caracterizar promotores u otros elementos de expresión. Sin embargo, algunos promotores vegetales se expresan a niveles muy bajos y pueden ser indetectables mediante un ensayo basado en GUS. Estos promotores de menor expresión pueden ser valiosos para el desarrollo de cultivos transgénicos con fenotipos deseables, como la mejora del rendimiento.
[0145] Al principio del desarrollo de plantas de cultivo transgénicas, los promotores más deseados eran los que proporcionaban una alta expresión constitutiva. Estos promotores altamente constitutivos, derivados de genomas virales de plantas tales como el virus del mosaico de la coliflor y el virus del mosaico de la higuerilla, se utilizaron para impulsar transgenes que conferían tolerancia a herbicidas o resistencia a insectos. A medida que aumenta la complejidad del campo de la biotecnología vegetal, se desarrollan nuevos rasgos transgénicos que requieren patrones de expresión más específicos o niveles de expresión más bajos. La sobreexpresión o la expresión en los tejidos vegetales equivocados puede provocar efectos no deseados en la planta transformada. Por ejemplo, la expresión ectópica (expresión de un gen en un lugar anormal de un organismo) de genes enzimáticos en plantas puede dar lugar a una reducción del producto final deseado debido a la escasez de precursor en el punto de ramificación de una vía metabólica (Iwase et al., Plant Biotech. 26: 29-38, 2009).
[0147] Dado que los factores de transcripción (FT) actúan naturalmente como reguladores maestros de procesos celulares, se espera que sean excelentes candidatos para modificar rasgos complejos en plantas de cultivo, y es probable que las tecnologías basadas en FT sean una parte destacada de la próxima generación de cultivos biotecnológicos de éxito. Las tecnologías de FT suelen requerir optimización, ya sea para reducir efectos secundarios no deseados, como el retraso del crecimiento, o para potenciar el rasgo deseado hasta el nivel en que tenga valor comercial. La optimización se aborda frecuentemente modificando la expresión del transgén FT Se pueden utilizar promotores específicos de tejido, de desarrollo o inducibles, en lugar de los habituales promotores constitutivos, para limitar la expresión del transgén a los tejidos o las condiciones ambientales apropiados (Century et al., Plant Physiology, 147: 20-29, 2008).
[0149] Debido en parte a estos avances, existe la necesidad de un ensayo más sensible para la caracterización de los elementos de expresión con el fin de identificar los elementos de expresión que proporcionan un nivel y un patrón de expresión deseados. La presente invención proporciona una secuencia codificante de GUS mejorada y rediseñada mediante codones que, cuando se une operablemente a un promotor, se expresa mejor que la secuencia codificante de GUS nativa deE. coliutilizada habitualmente en la técnica. Esta secuencia codificadora de GUS mejorada y rediseñada con codones puede utilizarse para proporcionar una mayor sensibilidad de ensayo, tanto cuantitativa como cualitativamente, y permite la caracterización de promotores y otros elementos de expresión que de otro modo no sería posible con la secuencia codificadora de GUS nativa deE. coli.La secuencia codificadora de GUS, mejorada y rediseñada con codones, puede utilizarse para caracterizar elementos de expresión en plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas. Las plantas monocotiledóneas útiles para practicar la invención incluyen, pero no se limitan a, Maíz(Zea mays),Arroz(Oryza sativa),Trigo(Triticum),Cebada(Hordeum vulgare),Sorgo(Sorghumspp.), mijo, mijo perla(Pennisetum glaucum),mijo de dedo(Eleusine coracana),mijo forrajero(Panicum miliaceum),mijo cola de zorra(Setaria italica),Avena(Avena sativa),Triticale, Centeno(Secale cereale),Fonio(Digitaria),Cebolla(Alliumspp.), Piña(Ananasspp.), Césped, Caña de azúcar(Saccharumspp.), Palmera(Arecaceae),Bambú(Bambuseae),Plátano(Musaceae),Familia del jengibre(Zingiberaceae),Lirios(Lilium),Narcisos(Narcissus),Iris(Iris),Amarilis , Orquídeas(Orchidaceae),Cannas, Campanillas(Hyacinthoides)y Tulipanes(Tulipa).Las plantas dicotiledóneas útiles para practicar la invención incluyen, pero no se limitan a, Soja(Glycine max),Soja silvestre(Glycine soja),Algodón(Gossypium),Tomate(Solanum lycopersicum),Pimiento(Piper),Calabaza(Cucurbita),Guisante(Pisum sativum),Alfalfa(Medicago sativa), Medicago truncatula,Judías(Phaseolus),Garbanzos(Cicer arietinum),Girasol(Helianthus annuus),Patata(Solanum tuberosum),Cacahuete(Arachis hypogaea),quinoa, trigo sarraceno(Fagopyrum esculentum),algarroba(onia siliqua),remolacha(Beta vulgaris),espinaca(Spinacia oleracea),y pepino(Cucumis sativus).
[0151] Transformación celular
[0153] La invención también se dirige a un procedimiento de producción de células y plantas transformadas que comprenden uno o más elementos reguladores enlazados operablemente a una molécula de ADN transcribible.
[0154] El término "transformación" se relaciona con la introducción de una molécula de ADN en un huésped receptor. Tal y como se utiliza aquí, el término "huésped" se relaciona con bacterias, hongos o plantas, incluyendo cualquier célula, tejido, órgano o progenie de las bacterias, hongos o plantas. Los tejidos y células vegetales de especial interés son los protoplastos, los callos, las raíces, los tubérculos, las semillas, los tallos, las hojas, las plántulas, los embriones y el polen.
[0156] Tal y como se utiliza aquí, el término "transformado" se relaciona con una célula, tejido, órgano u organismo en el que se ha introducido una molécula de ADN extraña, como una construcción. La molécula de ADN introducida puede integrarse en el ADN genómico de la célula, tejido, órgano u organismo receptor de forma que la molécula de ADN introducida sea heredada por la progenie subsiguiente. Una célula u organismo "transgénico" o "transformado" también puede incluir la progenie de la célula u organismo y la progenie producida a partir de un programa de cría que emplee dicho organismo transgénico como progenitor en un cruce y que presente un fenotipo alterado como resultado de la presencia de una molécula de ADN extraña. La molécula de ADN introducida también puede introducirse transitoriamente en la célula receptora de forma que la molécula de ADN introducida no sea heredada por la progenie subsiguiente. El término "transgénico" se relaciona con una bacteria, hongo o planta que contiene una o más moléculas de ADN heterólogas.
[0158] Existen muchos procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia para introducir moléculas de ADN en células vegetales. El proceso comprende generalmente los pasos de seleccionar una célula huésped adecuada, transformar la célula huésped con un vector y obtener la célula huésped transformada. Los procedimientos y materiales para transformar células vegetales introduciendo una construcción en un genoma vegetal en la práctica de la presente invención pueden incluir cualquiera de los procedimientos conocidos y demostrados. Los procedimientos adecuados incluyen, pero no se limitan a, infección bacteriana (por ejemplo,Agrobacterium),vectores BAC binarios, administración directa de ADN(por ejemplo,por transformación mediada por PEG, captación de ADN mediada por desecación/inhibición, electroporación, agitación con fibras de carburo de silicio y aceleración de partículas recubiertas de ADN), entre otros.
[0160] Las células huésped pueden ser cualquier célula u organismo, tal como una célula vegetal, una célula algal, un alga, una célula fúngica, un hongo, una célula bacteriana o una célula de insecto. En determinadas realizaciones, las células huésped y las células transformadas pueden incluir células de plantas de cultivo.
[0162] Posteriormente, puede regenerarse una planta transgénica a partir de una célula vegetal transgénica de la invención. Mediante técnicas convencionales de reproducción o autopolinización, se pueden producir semillas de esta planta transgénica. Dicha semilla, y la planta progenie resultante cultivada a partir de dicha semilla, contendrá la molécula de ADN recombinante de la invención, y por lo tanto será transgénica.
[0164] Las plantas transgénicas de la invención pueden autopolinizarse para proporcionar semillas de plantas transgénicas homocigóticas de la invención (homocigóticas para la molécula de ADN recombinante) o cruzarse con plantas no transgénicas o plantas transgénicas diferentes para proporcionar semillas de plantas transgénicas heterocigóticas de la invención (heterocigóticas para la molécula de ADN recombinante). Tanto estas plantas transgénicas homocigóticas como heterocigóticas se denominan aquí "plantas progenie". Las plantas progenie son plantas transgénicas descendientes de la planta transgénica original que contienen la molécula de ADN recombinante de la invención. Las semillas producidas usando una planta transgénica de la invención pueden cosecharse y usarse para cultivar generaciones de plantas transgénicas,es decir,plantas progenie, de la invención, que comprenden la construcción de esta invención y expresan un gen de interés agronómico. Las descripciones de los procedimientos de fitomejoramiento que se utilizan habitualmente para diferentes cultivos pueden encontrarse en alguno de los diversos libros de referencia,véase, por ejemplo,Allard, Principles of Plant Breeding, John Wiley & Sons, NY, U. of CA, Davis, CA, 50-98 (1960); Simmonds, Principles of Crop Improvement, Longman, Inc, NY, 369-399 (1979); Sneep y Hendriksen, Plant breeding Perspectives, Wageningen (ed), Center for Agricultural Publishing and Documentation (1979); Fehr, Soybeans: Improvement, Production and Uses, 2a edición, Monografía, 16:249 (1987); Fehr, Principles of Variety Development, Theory and Technique, (Vol. 1) y Crop Species Soybean (Vol. 2), lowa State Univ., Macmillan Pub. Co., NY, 360-376 (1987).
[0166] Las plantas transformadas pueden analizarse para detectar la presencia del gen o genes de interés y el nivel y/o perfil de expresión conferido por los elementos reguladores de la invención. Los expertos en la materia conocen los numerosos procedimientos disponibles para el análisis de plantas transformadas. Por ejemplo, los procedimientos para el análisis de plantas incluyen, entre otros, Southern blots o northern blots, enfoques basados en RCP, análisis bioquímicos, procedimientos de cribado fenotípico, evaluaciones de campo y ensayos de inmunodiagnóstico. La expresión de una molécula de ADN transcribible puede medirse utilizando los reactivos y procedimientos TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City, CA) descritos por el fabricante y los tiempos de ciclo de RCP determinados utilizando la matriz de prueba TaqMan®. Como alternativa, pueden utilizarse los reactivos y procedimientos Invader® (Third Wave Technologies, Madison, WI) descritos por el fabricante para evaluar la expresión del transgén.
[0168] La invención también proporciona partes de una planta de la invención. Las partes de la planta incluyen, entre otras, las hojas, los tallos, las raíces, los tubérculos, las semillas, el endospermo, el óvulo y el polen. Las partes vegetales de la invención pueden ser viables, no viables, regenerables y/o no regenerables. La invención también incluye y proporciona células vegetales transformadas que comprenden una molécula de ADN de la invención. Las células vegetales transformadas o transgénicas de la invención incluyen células vegetales regenerables y/o no regenerables.
[0170] La invención puede comprenderse más fácilmente a través de los siguientes ejemplos, que se proporcionan a modo de ilustración y no pretenden limitar la invención, a menos que se especifique lo contrario. Los expertos en la materia deben comprender que las técnicas descritas en los siguientes ejemplos representan técnicas que los inventores han descubierto que funcionan bien en la práctica de la invención. Sin embargo, los expertos en la materia deben, a la luz de la presente divulgación, apreciar que se pueden hacer muchos cambios en las realizaciones específicas que se divulgan y seguir obteniendo un resultado igual o similar sin apartarse de la invención, por lo que toda la materia expuesta o mostrada en los dibujos adjuntos debe interpretarse como ilustrativa y no en un sentido limitativo.
[0172] Ejemplos
[0174] Ejemplo 1
[0176] Identificación y clonación de elementos reguladores
[0178] Se identificaron y clonaron nuevos promotores y líderes de RCc3 a partir de ADN genómico de las especies monocotiledóneas Coix(Coix lacryma-jobi),garranchuelo peludo(Digitada sanguinalis(L.)Scop.),Hierba de doncella(Miscanthus sinensis f. gracillimus),Hierba de Gama(Tripsacum dactyloides)y Caña de azúcar(Saccharum officinarum).La proteína RCc3 pertenece a la superfamilia de las prolaminas, cuyo nombre procede de las proteínas de almacenamiento de los cereales, ricas en prolina y glutamina. La superfamilia de la prolamina (también llamada familia de la albúmina 2S inhibidora de la proteasa/proteína de transferencia de lípidos/forraje de semillas; ID de Pfam: PF00234) representa una de las superfamilias de proteínas más extendidas en el genoma vegetal. Los miembros de la superfamilia de las prolaminas abundan en las frutas, frutos secos, semillas y verduras de diversas plantas. Se sabe que desempeñan diversas funciones, como el almacenamiento y la protección de semillas, la unión o transferencia de lípidos y la inhibición de enzimas. Las proteínas de transferencia lipídica (PTL) pertenecen a la superfamilia de las prolaminas y se expresan en diversos tejidos vegetales. La proteína RCc3 del arroz es una PTL que se expresa en las raíces del arroz, aunque no todas las proteínas LTPs son específicas de las raíces.
[0180] Cebadores de amplificación del ADN (presentados como SEQ ID NOs: 25-28) se diseñaron utilizando las secuencias codificantes de veinticuatro (24) proteínas PTL deZea mays, Oryza sativa, Sorghum bicoloryBrachypoium distachyon..Los cebadores de amplificación se utilizaron con bibliotecas GenomeWalker™ (Clontech Laboratories, Inc, Mountain View, CA) construidas siguiendo el protocolo del fabricante para clonar la región 5' de la secuencia de ADN genómico correspondiente.
[0182] Se realizó un análisis bioinformático para identificar elementos reguladores en el ADN amplificado. A partir de los resultados de este análisis, se definieron elementos reguladores dentro de las secuencias de ADN y se diseñaron cebadores para amplificar los elementos reguladores. La molécula de ADN correspondiente a cada elemento regulador se amplificó utilizando condiciones estándar de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores que contenían sitios únicos de enzimas de restricción y ADN genómico aislado deC. lacryma-jobi, .D. sanguinalis (L.) Scop., M. sinensis f. gracillimus, T. dactyloides,y S.officinarum..Los fragmentos de ADN resultantes se ligaron en vectores y se secuenciaron.
[0183] Las secuencias de ADN de los promotores y líderes RCc3 identificados se enumeran en la Tabla 1. Las secuencias promotoras se proporcionan en la presente memoria descriptiva como SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 y 19. Las secuencias líderes se proporcionan en la presente memoria descriptiva como SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 y 20.
[0184] Tabla 1. Promotores y líderes RCc3 aislados de varias especies de gramíneas.
[0187]
[0189] Ejemplo 2
[0190] Análisis de los elementos reguladores de GUS en maíz transgénico
[0191] Las plantas de maíz se transformaron con vectores, concretamente con construcciones de plásmidos binarios, que comprendían un promotor RCc3 operablemente unido a su líder RCc3 nativo que impulsaba la expresión del transgén p-glucuronidasa (GUS). Las plantas transformadas resultantes se analizaron para determinar la expresión de la proteína GUS.
[0192] Los vectores utilizados en estos experimentos se construyeron utilizando procedimientos de clonación conocidos en la técnica. Los vectores resultantes comprendían una región de borde derecho deA. tumefaciens;un primer casete de expresión de transgenes para ensayar la secuencia promotora/líder RCc3 unida operablemente a una secuencia codificadora rediseñada de codones para GUS que poseía un intrón procesable GOI-Ec.uidA+St.LS1.nno:3 (SEQ ID NO:29) unido operablemente 5' a la UTR 3' del gen de la S-adenosilmetionina sintetasa 1 del mijo cola de zorra (T-SETit.Ams1-1:1:1, SEQ ID NO:159); un segundo casete de expresión de transgenes utilizado para la selección de células vegetales transformadas que confiere resistencia al herbicida glifosato (dirigido por el promotor Actina 1 del arroz); y una región de borde izquierdo deA. tumefaciens.Los plásmidos resultantes se utilizaron para transformar plantas de maíz mediante procedimientos conocidos en la técnica. La expresión de GUS conferida por los nuevos promotores y líderes RCc3 se comparó con la expresión dirigida por los promotores y líderes homólogos RCc3 de la cola de zorra y el arroz. La Tabla 2 muestra las construcciones plasmídicas, el promotor RCc3 y las secuencias líder, así como los SEQ ID NOs.
[0194] Tabla 2. Plásmidos binarios de transformación de plantas y las secuencias promotoras/líderes RCc3 asociadas.
[0196]
[0199] En ciertos casos, las plantas se transformaron utilizando procedimientosde transformación mediados por Agrobacteriumconocidos en la técnica y como se describe en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos 2009/0138985.
[0201] El análisis histoquímico de GUS se utilizó para el análisis cualitativo de la expresión de las plantas transformadas. Las secciones de tejido entero se incubaron con la solución de tinción GUS X-Gluc (5-bromo-4-cloro-3-indolil-bglucurónido) (1 mg/ml) durante el tiempo adecuado, se enjuagaron y se inspeccionaron visualmente para ver si presentaban coloración azul. La actividad GUS se determinó cualitativamente mediante inspección visual directa o inspección al microscopio utilizando órganos y tejidos vegetales seleccionados. En las plantas R<0>se inspeccionó la expresión en las raíces y las hojas, así como en la antera, la seda y la semilla y el embrión en desarrollo 21 días después de la polinización (21 DAP).
[0203] Para el análisis cuantitativo, se extrajeron proteínas totales de tejidos seleccionados de las plantas de maíz transformadas. Se utilizó un microgramo de proteína total con el sustrato fluorogénico 4-metileumbeliferil-p-D-glucurónido (MUG) en un volumen de reacción total de 50 microlitros. El producto de reacción, la 4-metilumbeliferona (4-MU), es fluorescente al máximo a pH alto, en el que el grupo hidroxilo está ionizado. La adición de una solución básica de carbonato sódico detiene simultáneamente el ensayo y ajusta el pH para cuantificar el producto fluorescente. La fluorescencia se midió con excitación a 365 nm, emisión a 445 nm, utilizando un Fluoromax-3 (Horiba; Kyoto, Japón) con Micromax Reader, con anchura de hendidura fijada en excitación 2 nm, emisión 3nm. Los valores medios de expresión se expresaron en pmol 4MU/|jg de proteína/hora.
[0205] Se registró la expresión media de R<0>GUS observada en cada transformación y se determinó un nivel de expresión medio y un error estándar basados en las mediciones tomadas de muestras derivadas de múltiples eventos de transformación.
[0207] Ejemplo 3
[0209] Potenciadores derivados de los elementos reguladores
[0211] Los reforzadores pueden derivarse de los elementos promotores proporcionados en la presente memoria descriptiva como los presentados como SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 y 19. Estos elementos potenciadores pueden estar compuestos por uno o más elementos cis-reguladores que, cuando están enlazados operablemente 5' o 3' a un elemento promotor o enlazados operablemente 5' o 3' a elementos potenciadores adicionales que están enlazados operablemente a un promotor, pueden potenciar o modular la expresión de una molécula de ADN transcribible, o proporcionar la expresión de una molécula de ADN transcribible en un tipo celular u órgano vegetal específico, o en un momento concreto del desarrollo o del ritmo circadiano. Los potenciadores se fabrican eliminando la caja TATA o elementos funcionalmente similares y cualquier secuencia de ADN corriente abajo de los promotores que permiten iniciar la transcripción a partir de los promotores proporcionados en la presente memoria descriptiva como se ha descrito anteriormente, incluidos fragmentos de los mismos, en los que se eliminan la caja TATA o elementos funcionalmente similares y la secuencia de ADN corriente abajo de la caja TATA.
[0213] Los elementos potenciadores pueden derivarse de los elementos promotores que se proporcionan en la presente memoria descriptiva y clonarse utilizando procedimientos conocidos en la técnica para que estén unidos de forma operable 5' o 3' a un elemento promotor o unidos de forma operable 5' o 3' a elementos potenciadores adicionales que estén unidos de forma operable a un promotor. Los elementos potenciadores pueden clonarse para que estén unidos de forma operable 5' o 3' a un elemento promotor derivado de un organismo de género diferente o unidos de forma operable 5' o 3' a elementos potenciadores adicionales derivados de organismos de otros géneros o del mismo género que estén unidos de forma operable a un promotor derivado del mismo género o de géneros diferentes, dando lugar a un elemento regulador quimérico. Puede construirse un vector de expresión de GUS usando procedimientos conocidos en la técnica similares a las construcciones descritas en los Ejemplos anteriores en los que los vectores de expresión de planta resultantes contienen una región de borde derecho deA. tumefaciens;un primer casete de transgén para probar el elemento regulador o un elemento regulador quimérico que comprende un elemento regulador o regulador quimérico unido operablemente a un intrón derivado de la proteína de choque térmico HSP70 de Z.mays(I-Zm.DnaK-1:1:1, SEQ ID NO: 38) o cualquiera de los intrones presentados en la presente memoria descriptiva o cualquier otro intrón, unido de forma operable a una secuencia codificante para GUS que posea un intrón procesable (GUS-2, SEQ ID NO: 32) o sin intrón (CR-Ec.uidA-1:1:4 (GUS.nat), SEQ ID NO: 31) enlazado operablemente a la UTR 3' de la Nopalina sintasa de A.tumefaciens(T-AGRtu.nos-1:1:13, SEQ ID No : 39) o la 3' UTR del gen de la proteína de transferencia lipídica del arroz (T-Os.PTL-1:1:1, SEQ ID NO: 40); un segundo casete de selección de transgenes utilizado para la selección de células vegetales transformadas que confiere resistencia al herbicida glifosato (dirigido por el promotor Actina 1 del arroz), o alternativamente, al antibiótico kanamicina (dirigido por el promotor Actina 1 del arroz); y una región de borde izquierdo deA. tumefaciens..Los plásmidos resultantes pueden utilizarse para transformar plantas de maíz o de otros géneros mediante los procedimientos descritos anteriormente u otros procedimientos conocidos en la técnica. Alternativamente, las células protoplásticas derivadas del maíz u otras plantas del género pueden transformarse utilizando procedimientos conocidos en la técnica para realizar ensayos transitorios.
[0215] La expresión de GUS impulsada por elementos reguladores que comprenden uno o más potenciadores puede evaluarse en ensayos de plantas estables o transitorias para determinar los efectos del elemento potenciador en la expresión de un transgén. Las modificaciones de uno o más elementos potenciadores o la duplicación de uno o más elementos potenciadores pueden realizarse basándose en la experimentación empírica y en la regulación de la expresión génica resultante que se observa utilizando cada composición de elementos reguladores. La alteración de las posiciones relativas de uno o más potenciadores en el elemento regulador o regulador quimérico resultante puede afectar a la actividad o especificidad transcripcional del elemento regulador o regulador quimérico y se determina empíricamente para identificar los mejores potenciadores para el perfil de expresión del transgén deseado dentro de la planta de maíz u otra planta del género.
[0217] Ejemplo 4
[0219] Mayor sensibilidad del ensayo con una p-glucuronidasa (GUS) con codón rediseñado
[0221] Los promotores vegetales suelen expresarse a niveles inferiores al umbral de detección normal de muchos ensayos cuantitativos, pero sus características de expresión pueden ser muy valiosas para la expresión de determinados transgenes. En la biotecnología vegetal anterior, los promotores que impulsaban una alta expresión constitutiva eran deseables y se utilizaban para impulsar moléculas de ADN transcribibles que producían un fenotipo específico que requería una alta expresión constitutiva, como la tolerancia a los herbicidas o la resistencia a los insectos. Estos promotores altamente constitutivos se derivaban a menudo de genomas de virus de plantas y no de genomas de plantas, por ejemplo los promotores 35S derivados del virus del mosaico de la coliflor y del virus del mosaico de la higuerilla. En particular, en algunos casos, la expresión constitutiva elevada de determinadas moléculas de ADN transcribibles puede tener consecuencias negativas, como el silenciamiento de transgenes, la aparición de fenotipos erróneos o el arrastre de rendimientos. Por ejemplo, la alta expresión del gen GUS en plantas transgénicas de caña de azúcar utilizando dos promotores diferentes de ubiquitina derivados de la caña de azúcar, así como un promotor de ubiquitina de maíz, dio lugar al silenciamiento génico postranscripcional del gen GUS (Wei et al., J. Plant Physiol. 160: 1241-1251, 2003).
[0223] Además, últimamente hay demanda de promotores que muestren patrones específicos de expresión o que se expresen en mayor medida en tejidos concretos de la planta. Por ejemplo, la expresión ectópica de genes enzimáticos en plantas puede dar lugar a una reducción del producto final deseado debido a la escasez de precursor en el punto de ramificación de una ruta metabólica (Iwase et al., Plant Biotech. 26:29-38, 2009). En estos casos, es deseable utilizar un promotor que exprese la molécula de ADN transcribible enlazada operablemente en los tejidos o tipos celulares correctos, o en una ventana de desarrollo particular. Los promotores derivados del genoma de las plantas a menudo pueden demostrar características deseables de expresión tisular, celular o de desarrollo. Debido a los bajos niveles de expresión de estos promotores vegetales, los ensayos de expresión a menudo requieren el uso de potenciadores para aumentar el nivel de expresión y permitir la detección en un ensayo cuantitativo. Sin embargo, el uso de tales potenciadores suele cambiar el patrón de expresión global del promotor de la planta.
[0225] La mejora de la expresión del gen informador utilizado en el ensayo elimina la necesidad de mejorar el promotor derivado de la planta y, por tanto, proporciona una evaluación más precisa del patrón de expresión conferido por un promotor. Este ejemplo demuestra el uso de una secuencia codificante de GUS rediseñada para mejorar la sensibilidad del ensayo cuantitativo en la caracterización de varias EXP diferentes compuestas por una secuencia promotora, unida operablemente en 5' a una secuencia líder, unida operablemente en 5' a una secuencia intrón.
[0226] Las plantas de maíz se transformaron con vectores de expresión vegetal que contenían secuencias EXP que impulsaban la expresión de un transgén de p-glucuronidasa (GUS) nativo deEscherichia colio de un transgén de p-glucuronidasa rediseñado mediante codones (GUS.nno), y se analizó la expresión de la proteína GUS en las plantas resultantes. Las secuencias codificadoras EXP y GUS se clonaron en construcciones de plásmidos binarios utilizando procedimientos conocidos en la técnica.
[0228] Las construcciones de expresión vegetal resultantes contienen una región de borde derecho de A.tumefaciens;un primer casete de transgén que demuestra la sensibilidad de ensayo de las dos secuencias codificantes de GUS, compuesto por un EXP enlazado operablemente a una secuencia codificante de GUS nativa deE. coli(CR-Ec.uidA-1:1:4 (GUS.nat), SEQ ID NO: 31) o una secuencia codificante de GUS rediseñada con codones (CR-Ec.uidA_nno-1:1:1 (GUS.nno), SEQ ID<n>O: 30) enlazado operablemente 5' a la 3' UTR del gen de la proteína de transferencia lipídica del arroz (T-Os.PTL-1:1:1, SEQ ID NO: 40); un segundo casete de selección de transgenes utilizado para la selección de células vegetales transformadas que confiere resistencia al herbicida glifosato (dirigido por el promotor Actina 1 del arroz); y una región de borde izquierdo deA. tumefaciens..Las FIGs. 1a a 1c muestran una alineación entre la secuencia codificante de GUS nativa (CR-Ec.uidA-1:1:4) y la secuencia codificante de GUS rediseñada por codones (CR-Ec.uidA_nno-1:1:1). Los nucleótidos idénticos en el alineamiento se indican con un asterisco. La secuencia GUS rediseñada mediante codones es idéntica en un 77,9% a la secuencia codificante GUS nativa y ha sido diseñada para expresarse mejor en la planta.
[0230] Se utilizaron tres (3) clases deEXP diferentes, cada una de las cuales confiere un patrón de expresión específico. Las EXPs EXP-SETit.Cab3+Zm.DnaK:1:1 (SEQ ID NO: 34) y EXP-SETit.Cab3+Zm.DnaK:1:2 (SEQ ID NO: 35) confieren un perfil de expresión foliar en maíz y son esencialmente idénticas, con la excepción de una inserción de cinco nucleótidos de 5'-Cc GGA-3' en las posiciones nucleotídicas 1408 a 1412 de EXP-SETit.Cab3+Zm.DnaK:1:2. La secuencia EXP-CaMV.35S-enh+Os.Rcc3+Zm.DnaK:1:5 (SEQ ID NO: 36) proporciona un perfil de expresión radicular mejorado en maíz. La secuencia EXP-Zm.UbqM1:1:2 (SEQ ID NO: 37) proporciona un perfil de expresión altamente constitutivo en maíz. Los plásmidos resultantes se utilizaron para transformar plantas de maíz mediante procedimientos conocidos en la técnica. En la Tabla 3 figuran las designaciones de las construcciones plasmídicas y las correspondientes secuencias EXP y GUS.
[0232] Tabla 3. Construcciones plasmídicas, secuencias EXP y patrones de expresión utilizados para comparar GUS nativo frente a secuencias codificadoras de GUS rediseñadas con codones.
[0234]
[0237] En ciertos casos, las plantas se transformaron utilizando procedimientosde transformación mediados por Agrobacteriumconocidos en la técnica y como se describe en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos 2009/0138985.
[0238] El análisis histoquímico de GUS se utilizó para el análisis cualitativo de la expresión de las plantas transformadas. Se incubaron secciones enteras de tejido con la solución de tinción GUS X-Gluc (5-bromo-4-cloro-3-indolil-bglucurónido) (1 mg/ml) durante el tiempo adecuado, se enjuagaron y se inspeccionaron visualmente en busca de coloración azul. La actividad GUS se determinó cualitativamente mediante inspección visual directa o inspección al microscopio utilizando órganos y tejidos vegetales seleccionados. En las plantas R0 se inspeccionó la expresión en las raíces y las hojas, así como en la antera, la seda y la semilla y el embrión en desarrollo 21 días después de la polinización (21 DAP).
[0239] Para el análisis cuantitativo, se extrajeron proteínas totales de tejidos seleccionados de las plantas de maíz transformadas. Se utilizó un microgramo de proteína total con el sustrato fluorogénico 4-metileumbeliferil-p-D-glucurónido (MUG) en un volumen de reacción total de 50 pl. El producto de reacción, la 4-metilumbeliferona (4-MU), es fluorescente al máximo a pH alto, en el que el grupo hidroxilo está ionizado. La adición de una solución básica de carbonato sódico detiene simultáneamente el ensayo y ajusta el pH para cuantificar el producto fluorescente. La fluorescencia se midió con excitación a 365 nm, emisión a 445 nm, utilizando un Fluoromax-3 (Horiba; Kyoto, Japón) con Micromax Reader, con anchura de hendidura fijada en excitación 2 nm, emisión 3 nm. Los valores medios de expresión de GUS para los transformantes de la generación Ro figuran en las Tablas 4, 5 y 6.
[0240] Tabla 4. Expresión media de GUS por generación Ro de una secuencia codificadora de GUS nativa y rediseñada por codones mediante el uso de una EXP con un perfil de expresión foliar..
[0242]
[0244] Tabla 5. Expresión GUS media de la generación R0de una secuencia codificante GUS nativa y rediseñada mediante codones utilizando una EXP con un perfil de expresión radicular mejorado.
[0246]
[0247] Tabla 6. Expresión GUS media de la generación Ro de una secuencia codificante GUS nativa y rediseñada mediante codones utilizando una EXP con un perfil de expresión constitutivo.
[0249]
[0252] Como puede observarse en las Tablas 4 a 6, hay una mayor sensibilidad en los ensayos cuantitativos utilizando la secuencia codificadora de GUS rediseñada con codones en comparación con la secuencia codificadora de GUS nativa. Es de esperar cierta variabilidad entre las poblaciones GUS.nno y GUS.nat, ya que la expresión puede verse afectada por los sitios de inserción del ADN-T; sin embargo, la tendencia general de la sensibilidad demuestra una sensibilidad mucho mayor utilizando GUS.nno. GUS dirigido por EXP-SETit.Cab3+Zm.DnaK:1:1 (SEQ ID NO: 34) y EXP-SETit.Cab3+Zm.DnaK:1:2 (SEQ ID NO: 35) demostraron una sensibilidad entre 2,26 y 8,1 veces mayor utilizando GUS.nno en comparación con GUS.nat. Asimismo, el perfil radicular mejorado proporcionado por eXP-CaMV.35S-enh+Os.Rec3+Zm.DnaK:1:5 (SEQ ID NO: 36) fue de 16,06 a 19,06 veces mayor utilizando GUS.nno que GUS.nat, lo que hace que esta secuencia codificadora de GUS rediseñada con codones sea ideal para el cribado de promotores radiculares, especialmente aquellos promotores que se expresan a niveles bajos y pueden demostrar niveles de GUS iguales o inferiores a los niveles de fondo cuando se utiliza la secuencia codificadora de GUS nativa. El perfil de expresión altamente constitutivo conferido por EXP-Zm.UbqM1:1:2 (SEQ ID NO: 37) demostraron una sensibilidad cuantitativa entre 1,42 y 4,09 veces mayor al utilizar GUS.nno en comparación con GUS.nat.
[0254] Cualitativamente, la tinción de GUS fue más sensible y se observó de forma más consistente en las muestras de tejido que utilizaban la secuencia codificadora de GUS rediseñada con codones. Por lo general, las observaciones de tinción cualitativas tienden a ser menos sensibles que los ensayos cuantitativos. El uso de la secuencia codificadora de GUS rediseñada con codones proporciona inspecciones microscópicas mejores y más coherentes de los tejidos teñidos. Por ejemplo, en tejidos radiculares en los que GUS estaba dirigido por EXP-CaMV.35S-enh+Os.Rcc3+Zm.DnaK:1:5 (SEQ ID NO: 36), la tinción histoquímica de los tejidos transformados con la secuencia de codificación GUS rediseñada con codones fue más pronunciada y visible en todas las muestras de raíces V7 de la corteza, la epidermis, la endodermis, el pelo radicular y la punta de la raíz secundaria. Por el contrario, la tinción GUS no se observó cualitativamente en los correspondientes tejidos radiculares V7 cuando la secuencia codificante GUS nativa fue dirigida por EXP-CaMV.35S-enh+Os.Rcc3+Zm.DnaK:1:5. La secuencia codificante de GUS rediseñada con codones mejorados, (CR-Ec.uidA_nno-1:1:1, SEQ ID NO: 30), proporcionó una mayor sensibilidad al ensayo y resultó especialmente valioso para medir la expresión de promotores que se expresan a niveles bajos.
[0256] Ejemplo 5
[0258] Análisis de los elementos reguladores de GUS en protoplastos de hojas y raíces de maíz
[0260] Se transformaron protoplastos de hojas y raíces de maíz con vectores que comprendían un promotor RCc3 enlazado operablemente a su líder RCc3 nativo que impulsaba la expresión del transgén p-glucuronidasa (GUS), y se analizaron los protoplastos transformados resultantes para la expresión de la proteína GUS. El promotor RCc3 y las secuencias líder se clonaron en construcciones de plásmidos binarios utilizando procedimientos conocidos en la técnica y como se ha descrito previamente en el Ejemplo 2.
[0262] También se construyeron dos construcciones de plásmidos para su uso en la cotransformación y la normalización de los datos utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Cada una de estas construcciones plasmídicas contenía una secuencia codificadora específica de luciferasa controlada por un EXP constitutivo. El vector pMON19437 comprendía un casete de expresión con un promotor constitutivo unido operablemente 5' a un intrón, (EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1, SEQ ID NO: 41), operablemente unida 5' a una secuencia codificadora de luciferasa de luciérnaga(Photinus pyralis)(LUCIFERASE:1:3, SEQ ID NO: 42), unido operablemente 5' a un 3' UTR del gen de laAgrobacterium tumefaciensnopalina sintasa (T-AGRtu.nos-1:1:13, SEQ ID NO: 39). El vector pMON63934 comprendía un casete de expresión con una secuencia EXP constitutiva (EXP-CaMV.35S-enh-Lhcb1, SEQ ID NO: 44) enlazada operablemente en 5' a una secuencia codificadora de luciferasa(Renilla reniformis)de pensamiento marino (CR-Ren.hRenilla Lucife-0:0:1, SEQ ID NO: 43), unido operablemente 5' a un 3' UTR del gen de laAgrobacterium tumefaciensnopalina sintasa (T-AGRtu.nos-1:1:13, SEQ ID NO: 39).
[0263] Los protoplastos de raíces y hojas de maíz se transformaron utilizando un procedimiento de transformación basado en polietilenglicol (PEG), bien conocido en la técnica. Las células de protoplastos se transformaron con pMON19437, pMON63934 y uno de los plásmidos presentados en la Tabla 7. Tras la transformación, los protoplastos transformados se incubaron durante toda la noche en oscuridad total. A continuación, se realizaron mediciones tanto de GUS como de luciferasa colocando alícuotas de una preparación lisada de células transformadas como se ha indicado anteriormente en dos bandejas diferentes de pocillos pequeños. Se utilizó una bandeja para las mediciones de GUS y una segunda bandeja para realizar un ensayo de luciferasa dual utilizando el sistema de ensayo de luciferasa dual reporter (Promega Corp., Madison, WI; véase, por ejemplo, Promega Notes Magazine, No: 57, 1996, p.02).
[0264] Se realizaron cuatro transformaciones para cada secuencia EXP o promotor líder intrón. Los valores medios de expresión para cada secuencia EXP o promotor líder intrón se determinaron a partir de varias muestras de cada transformación. Las mediciones de las muestras se realizaron utilizando cuatro réplicas de cada transformación de plásmido EXP o promotor líder secuencia intrón. La expresión de GUS de fondo se determinó utilizando una construcción plasmídica de control negativo que carecía del transgén GUS. Los niveles medios de expresión de GUS y luciferasa figuran en las Tablas 7 (hoja) y 8 (raíz). En estas tablas, los valores de luciferasa de luciérnaga(por ejemplo,apartir de la expresión de pMON19437) se proporcionan en la columna denominada "FLUC" y los valores de luciferasa de mariquita(por ejemplo,a partir de la expresión de pMON63934) se proporcionan como en la columna denominada "RLU<c>." En las Tablas 7 y 8 también se presentan las relaciones medias GUS/FLUC y GUS/RLUC, que proporcionan una medida relativa de la fuerza de expresión en los ensayos con protoplastos.
[0265] Tabla 7. Valores medios de GUS, FLUC y RLUC derivados de protoplastos de hojas de maíz transformadas.
[0267]
[0268]
[0270] Tabla 8. Valores medios de GUS FLUC y RLUC derivados de protoplastos de raíz de maíz transformados.
[0271] Como se muestra en la Tabla 7, todos los promotores homólogos de RCc3 demostraron la capacidad de dirigir la expresión del transgén en protoplastos de hojas de maíz. Algunos de los promotores homólogos de RCc3 impulsaron la expresión más que otros en este ensayo basándose en las relaciones GUS/FLUC y GUS/RLUC. Además, como se demuestra en la Tabla 8, todos los promotores homólogos de RCc3 demostraron la capacidad de dirigir la expresión del transgén en protoplastos de raíz de maíz en diversos grados.
[0272] Ejemplo 6
[0273] Análisis de los elementos reguladores de GUS en maíz transgénico.
[0274] Las plantas de maíz se transformaron con vectores que comprendían un promotor RCc3 operablemente unido a su líder RCc3 nativo que impulsaba la expresión del transgén p-glucuronidasa (GUS). Las plantas transformadas resultantes se analizaron para determinar la expresión de la proteína GUS.
[0275] El promotor RCc3 y las secuencias líder se clonaron en construcciones de plásmidos binarios utilizando procedimientos conocidos en la técnica, como los descritos en el Ejemplo 2. Los plásmidos binarios resultantes fueron pMON264146, pMON264148, pMON264088, pMON264107, pMON264186, pMON264187, pMON264049, pMON264050, pMON264147 y pMoN264166. Las plantas de maíz también se transformaron de forma estable con pMON264108 y pMON264206. El análisis cualitativo y cuantitativo de la expresión de GUS se realizó como se describe en el Ejemplo 2. Las plantas se analizaron en los estadios de desarrollo V4, V7 y VT Se muestra el muestreo en R1 y R3. La Tabla 9 muestra la expresión cuantitativa media de GUS en plantas de maíz transformadas de forma estable.
[0276] Tabla 9. Expresión cuantitativa media de GUS en plantas de maíz transformadas de forma estable.
[0278]
[0279]
[0282] Como se demuestra en la Tabla 9, todos los homólogos del promotor RCc3 fueron capaces de impulsar la expresión del transgén GUS en plantas de maíz transformadas de forma estable. Además, cada promotor tenía un patrón de expresión que era exclusivo del promotor específico. Por ejemplo, la expresión en la flor VT/antera difería entre los homólogos del promotor RCc3. Expresión dirigida por P-Td.RCc3_3:1 (SEQ ID NO: 17) fue la expresión más alta observada para todos los promotores, mientras que la expresión dirigida por P-MISgr.RCc3-2:2 (SEQ ID NO: 11) fue la más baja. Con respecto a la expresión de R1 Cob/silk, P-Td.RCc3__3:1 (SEQ ID NO: 17) demostró la mayor expresión en estos tejidos y P-MISgr.RCc3-2:2 (SEQ ID NO: 11) expresaron lo mínimo. Expresión dirigida por P-Td.RCc3_3:1 (SEQ ID NO: 17) aumentaron en los tejidos de desarrollo posterior. La expresión aumentó en la raíz desde el estadio V4 al VT y fue aún mayor en las flores/anteras VT, el embrión y el endospermo R1 Cob/silk y R3 21DAP. La expresión impulsada por P-Td.RCc3_3:1 fue la más alta entre los homólogos del promotor RCc3 en flores/anteras VT, mazorca/seda R1, y embrión y endospermo 21DAP R3.
[0284] Con respecto a la expresión en hojas y raíces, algunos de los homólogos del promotor RCc3 demostraron una mayor expresión en la raíz en relación con la hoja. La Tabla 10 muestra las relaciones de expresión raíz-hoja para todos los promotores RCc3 ensayados.
[0286] Tabla 10. Relaciones de expresión raíz/hoja en plantas de maíz transformadas de forma estable.
[0289]
[0290]
[0293] Como se demuestra en la Tabla 10, cada homólogo del promotor RCc3 demostró diferentes proporciones de expresión raíz-hoja y diferentes patrones desde el estadio V4 al VT Por ejemplo, P-Cl.RCc3:3 (<s>E<q>ID NO: 1) mantuvieron una proporción similar de expresión desde V4 hasta VT, con un ligero descenso en la fase V7. La expresión en la raíz, como se observa en la Tabla 9, disminuyó ligeramente de V4 a V7 y después aumentó en la fase VT El promotor P-Ds.RCc3_3:1 (SEQ ID NO: 7) demostraron un cambio en las proporciones de expresión desde la fase V4 hasta la fase VT, con una mayor expresión en la raíz en relación con la hoja en las fases V4 y V7 y, a continuación, un cambio que se aproxima a una expresión igual en la hoja en relación con la raíz en la fase VT (1,25). Con este promotor, la expresión media mostrada en la Tabla 9 demuestra un aumento de la expresión en la hoja desde la fase V4 hasta la fase VT, mientras que la expresión en la raíz disminuyó desde la fase V7 hasta la fase VT. El promotor P-So.RCc3:2 (SEQ ID NO: 19) mantuvieron una relación de expresión raíz-hoja de 6,33 en la fase V4 y de 6,79 en la fase V7, pero después descendieron a 2,99 en la fase VT. Sin embargo, la expresión con este promotor aumentó 3,69 y 3,96 veces en la hoja y la raíz, respectivamente, de la fase V4 a la V7 y después disminuyó a 2,33 y 1,10 en relación con V4 en la fase VT.
[0295] En particular, no todos los promotores tenían una mayor proporción de raíces por hoja. Por ejemplo, los promotores P-Ds.RCc3_1:1 (SEQ ID NO: 3) y P-Td.RCc3_1:1 (SEQ ID NO: 13) tenían relaciones raíz/hoja inferiores a uno en la fase V4. Sin embargo, la expresión impulsada por P-Td.RCc3_1:1 fue 6,6 veces mayor que la de P-Ds.RCc3_1:1 en la raíz V4. La mayor proporción de raíz/hoja en la fase V4 se consiguió utilizando P-Td.RCc3_2:1 (SEQ ID NO: 15). La relación de expresión raíz/hoja impulsada por P-Ds.RCc3_1:1 aumentó de V4 (0,76) a V7 (2,95) y después volvió a una relación similar a la de V4 (0,79).
[0297] El promotor P-MISgr.RCc3-2:2 (SEQ ID NO: 11) demostraron un aumento de la expresión tanto en la hoja como en la raíz desde el estadio V4 al VT Este promotor tuvo una relación raíz-hoja superior a 6,9 en las tres etapas, pero la relación pasó de 7,46 en la etapa V4 a 6,92 en la etapa V7 y después subió a 11,44 en la etapa VT La expresión impulsada por P-MISgr.RCc3-2:2 aumentó en la hoja y la raíz desde el estadio V4 al VT.
[0299] Cada uno de los promotores homólogos de RCc3 mostró patrones de expresión en el maíz transformado de forma estable que no podían predecirse necesariamente por el hecho de derivar de genes homólogos, especialmente cuando se utilizan para transformar una especie heteróloga tal como el maíz. La mayoría de los promotores mostraron una mayor expresión en la raíz con respecto a la hoja en algún momento de la fase V4, V7 o VT, o en todas las fases ensayadas. En particular, la magnitud de la expresión difería ampliamente entre los promotores. Las propiedades de expresión únicas de cada uno de los homólogos del promotor RCc3 hacen que algunos sean más adecuados que otros para determinados tipos de expresión de moléculas de ADN transcribibles. Por ejemplo, la expresión de una molécula de ADN transcribible que puede ser crítica para la asimilación de un nutriente en el suelo y que se expresa mejor en una fase posterior del desarrollo, cuando la planta está a punto de iniciar la reproducción y producir semillas, puede beneficiarse mejor de un promotor tal como P-MISgr.RCc3-2:2 (SEQ ID NO: 11) que aumenta la expresión en la raíz alrededor de la fase VT.

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES
1. Una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en:
a) una secuencia de ADN con al menos un 95 por ciento de identidad de secuencia con la longitud completa de SEQ ID NO: 19, en el que la secuencia de ADN tiene la actividad promotora de SEQ ID NO: 19;
b) una secuencia de a Dn que comprende SEQ ID NO: 19;
c) un fragmento que comprenda al menos 300 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 19, en el que el fragmento tiene la actividad promotora de SEQ ID NO: 19;
en la que dicha secuencia está operablemente unida a una molécula polinucleotídica transcribible heteróloga.
2. La molécula de ADN recombinante de la reivindicación 1, en la que dicha secuencia de ADN está operablemente unida a otra secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en:
a) una secuencia de ADN con al menos un 95 por ciento de identidad de secuencia con la longitud completa de SEQ ID NO: 20, en el que la secuencia de ADN tiene la actividad líder de SEQ ID NO: 20;
b) una secuencia de a Dn que comprende SEQ ID NO: 20;
c) un fragmento que comprenda al menos 50 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 20, en el que el fragmento tiene la actividad líder de Se Q ID NO: 20;
en la que dicha secuencia adicional de ADN está operablemente unida a la molécula polinucleotídica transcribible heteróloga.
3. La molécula de ADN recombinante de las reivindicaciones 1 ó 2, en la que dicha secuencia de ADN o dicha secuencia de ADN adicional tiene al menos un 98 por ciento de identidad de secuencia con la secuencia de ADN de SEQ ID NOs: 19 o 20, respectivamente.
4. La molécula de ADN recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la molécula de ADN transcribible heteróloga comprende un gen de interés agronómico y en la que el gen de interés agronómico confiere tolerancia a herbicidas o resistencia a plagas en las plantas.
5. Una célula vegetal transgénica que comprende una molécula de ADN recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. La célula vegetal transgénica de la reivindicación 5, en la que dicha célula vegetal transgénica es una célula vegetal monocotiledónea o una célula vegetal dicotiledónea.
7. Una planta transgénica, o parte de ella, que comprende una molécula de ADN recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
8. Una planta progenie de la planta transgénica de la reivindicación 7, o una parte de la misma, en la que la planta progenie o parte de la misma comprende dicha molécula de ADN recombinante.
9. La planta transgénica de las reivindicaciones 7 u 8, en la que dicha planta transgénica es una planta monocotiledónea o una planta dicotiledónea.
10. La planta trangénica de la reivindicación 9, en la que:
(a) dicha planta es una monocotiledónea seleccionada del grupo que consiste en Maíz (Zeamays),Arroz(Oryza sativa),Trigo(Triticum),Cebada(Hordeum vulgare),Sorgo(Sorghum spp.),Mijo, Mijo perla(Pennisetum glaucum),Mijo dedo(Eleusine coracana),Mijo Proso(Panicum miliaceum),Mijo cola de zorra(Setaria italica),Avena(Avena sativa),Triticale, centeno(Secale cereale),Fonio(Digitaria),Cebollas(Allium spp.),Piña(Ananas spp.),Césped, Caña de azúcar(Saccharum spp.),Palmera(Arecaceae),Bambú(Bambuseae),Plátano(Musaceae),Familia del jengibre(Zingiberaceae),Lirios(Lilium),Narcisos(Narcissus),Lirios(Iris),Amarilis, Orquídeas(Orchidaceae),Cannas, Campanillas(Hyacinthoides)y Tulipanes(Tulipa);o
(b) dicha planta es una planta dicotiledónea seleccionada del grupo que consiste en Soja(Glycine max),Soja silvestre(Glycine soja),Algodón(Gossypium),Tomate(Solanum lycopersicum),Pimiento(Piper),Calabaza(Cucurbita),Guisante(Pisum sativum),Alfalfa(Medicago sativa), Medicago truncatula,Judía(Phaseolus),Garbanzos(Cicer arietinum),Girasol(Helianthus annuus),Patata(Solanum tuberosum),Cacahuete(Arachis hypogaea),Quinoa, Alforfón(Fagopyrum esculentum),Algarroba(onia siliqua),Remolacha(Beta vulgaris),Espinacas(Spinacia oleracea)y Pepino(Cucumis sativus).
11. Una semilla transgénica de la planta transgénica de la reivindicación 7 u 8, en la que la semilla comprende la molécula de ADN recombinante.
12. Un procedimiento de producción de una planta transgénica que comprende:
a) transformar una célula vegetal con la molécula de ADN recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para producir una célula vegetal transformada; y
b) regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal transformada.
ES19197938T 2013-03-14 2014-03-12 Plant regulatory elements and uses thereof Active ES3046008T3 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361785245P 2013-03-14 2013-03-14

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES3046008T3 true ES3046008T3 (en) 2025-12-01

Family

ID=51535221

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES14774111T Active ES2769898T3 (es) 2013-03-14 2014-03-12 Elementos reguladores en plantas y usos de los mismos
ES19197949T Active ES3042588T3 (en) 2013-03-14 2014-03-12 Plant regulatory elements and uses thereof
ES19197938T Active ES3046008T3 (en) 2013-03-14 2014-03-12 Plant regulatory elements and uses thereof

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES14774111T Active ES2769898T3 (es) 2013-03-14 2014-03-12 Elementos reguladores en plantas y usos de los mismos
ES19197949T Active ES3042588T3 (en) 2013-03-14 2014-03-12 Plant regulatory elements and uses thereof

Country Status (14)

Country Link
US (4) US9617553B2 (es)
EP (4) EP3613280B1 (es)
JP (6) JP2016514964A (es)
CN (3) CN105307480A (es)
AR (5) AR095463A1 (es)
CA (2) CA2905446C (es)
CL (5) CL2015002696A1 (es)
CR (4) CR20200121A (es)
ES (3) ES2769898T3 (es)
MX (5) MX370800B (es)
RU (1) RU2675524C2 (es)
UA (1) UA121457C2 (es)
WO (1) WO2014159632A1 (es)
ZA (1) ZA201506453B (es)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CR20240086A (es) * 2017-01-19 2024-09-30 Monsanto Technology Llc ELEMENTOS REGULATORIOS DE PLANTAS Y SUS USOS (Divisional 2019-0377)
JP6980853B2 (ja) * 2017-07-07 2021-12-15 Ｔｖｓ Ｒｅｇｚａ株式会社 受信装置
JP6980854B2 (ja) * 2017-07-07 2021-12-15 Ｔｖｓ Ｒｅｇｚａ株式会社 受信装置
JP6980855B2 (ja) * 2017-07-07 2021-12-15 Ｔｖｓ Ｒｅｇｚａ株式会社 受信装置
WO2019144083A1 (en) * 2018-01-21 2019-07-25 Whitehead Institute For Biomedical Research A biosynthetic approach for heterologous production and diversification of bioactive lyciumin cyclic peptides
CN112368389B (zh) * 2018-08-03 2024-09-03 孟山都技术公司 植物调控元件及其用途
US11499159B2 (en) 2019-01-10 2022-11-15 Monsanto Technology Llc Plant regulatory elements and uses thereof
CA3179211A1 (en) 2020-04-24 2021-10-28 Monsanto Technology Llc Transgenic corn event mon95275 and methods for detection and uses thereof
MX2022013551A (es) * 2020-04-28 2022-11-30 Monsanto Technology Llc Elementos reguladores de plantas y sus usos.
US20240011044A1 (en) * 2022-07-05 2024-01-11 University Of Freiburg Plant regulatory elements and uses thereof
CN119530241B (zh) * 2024-11-27 2025-10-28 吉林省农业科学院(中国农业科技东北创新中心) 一种改变玉米株高的核酸分子及应用

Family Cites Families (113)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US37543A (en) 1863-01-27 Improvement in machinery for cutting corks and bungs
US38446A (en) 1863-05-05 Improvement in the manufacture of sheet-iron hollow ware
JPH074232B2 (ja) 1984-12-10 1995-01-25 モンサントコンパニー バチルスチユウリンゲンシス結晶蛋白遺伝子の植物上での集落形成能を有する微生物への挿入及びその用途
US6774283B1 (en) 1985-07-29 2004-08-10 Calgene Llc Molecular farming
US6617496B1 (en) 1985-10-16 2003-09-09 Monsanto Company Effecting virus resistance in plants through the use of negative strand RNAs
US6608241B1 (en) 1985-10-29 2003-08-19 Monsanto Technology Llc Protection of plants against viral infection
US5107065A (en) 1986-03-28 1992-04-21 Calgene, Inc. Anti-sense regulation of gene expression in plant cells
TR27832A (tr) 1987-04-29 1995-08-31 Monsanto Co Zararli ucucu hasarata mukavim bitkiler.
US5229114A (en) 1987-08-20 1993-07-20 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Approaches useful for the control of root nodulation of leguminous plants
US5597718A (en) 1988-10-04 1997-01-28 Agracetus Genetically engineering cotton plants for altered fiber
AU638438B2 (en) 1989-02-24 1993-07-01 Monsanto Technology Llc Synthetic plant genes and method for preparation
US5689041A (en) 1989-08-10 1997-11-18 Plant Gentic Systems N.V. Plants modified with barstar for fertility restoration
US6426447B1 (en) 1990-11-14 2002-07-30 Monsanto Technology Llc Plant seed oils
US5543576A (en) 1990-03-23 1996-08-06 Mogen International Production of enzymes in seeds and their use
US5969214A (en) 1990-06-11 1999-10-19 Calgene, Inc. Glycogen biosynthetic enzymes in plants
EP0536293B1 (en) 1990-06-18 2002-01-30 Monsanto Technology LLC Increased starch content in plants
US5498830A (en) 1990-06-18 1996-03-12 Monsanto Company Decreased oil content in plant seeds
CA2083948C (en) 1990-06-25 2001-05-15 Ganesh M. Kishore Glyphosate tolerant plants
USRE38446E1 (en) 1990-07-20 2004-02-24 Calgene, Llc. Sucrose phosphate synthase (SPS), its process for preparation its cDNA, and utilization of cDNA to modify the expression of SPS in plant cells
US6483008B1 (en) 1990-08-15 2002-11-19 Calgene Llc Methods for producing plants with elevated oleic acid content
US5633435A (en) 1990-08-31 1997-05-27 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases
US5866775A (en) 1990-09-28 1999-02-02 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthases
BR9107191A (pt) 1990-12-26 1994-06-14 Monsanto Co Controle de amadurecimento de frutos e senescência em plantas
US5304730A (en) 1991-09-03 1994-04-19 Monsanto Company Virus resistant plants and method therefore
US5763245A (en) 1991-09-23 1998-06-09 Monsanto Company Method of controlling insects
US6015940A (en) 1992-04-07 2000-01-18 Monsanto Company Virus resistant potato plants
US5850023A (en) 1992-11-30 1998-12-15 Monsanto Company Modified plant viral replicase genes
US6011199A (en) 1992-12-15 2000-01-04 Commonwealth Scientific Method for producing fruiting plants with improved fruit flavour
US6013864A (en) 1993-02-03 2000-01-11 Monsanto Company Plants resistant to infection by luteoviruses
US5322687A (en) 1993-07-29 1994-06-21 Ecogen Inc. Bacillus thuringiensis cryet4 and cryet5 toxin genes and proteins toxic to lepidopteran insects
AU7925094A (en) 1993-09-30 1995-04-18 Agracetus, Inc. Transgenic cotton plants producing heterologous peroxidase
JPH09506249A (ja) 1993-11-24 1997-06-24 モンサント・カンパニー 植物病原体の抑制方法
US6828475B1 (en) 1994-06-23 2004-12-07 Calgene Llc Nucleic acid sequences encoding a plant cytoplasmic protein involved in fatty acyl-CoA metabolism
WO1998055632A1 (en) 1997-06-05 1998-12-10 Calgene Llc FATTY ACYL-CoA: FATTY ALCOHOL ACYLTRANSFERASES
US6080560A (en) 1994-07-25 2000-06-27 Monsanto Company Method for producing antibodies in plant cells
US6140075A (en) 1994-07-25 2000-10-31 Monsanto Company Method for producing antibodies and protein toxins in plant cells
US5750876A (en) 1994-07-28 1998-05-12 Monsanto Company Isoamylase gene, compositions containing it, and methods of using isoamylases
US5750866A (en) * 1994-09-08 1998-05-12 American Cyanamid Company AHAS promoter useful for expression of introduced genes in plants
US5716837A (en) 1995-02-10 1998-02-10 Monsanto Company Expression of sucrose phosphorylase in plants
US6946588B2 (en) 1996-03-13 2005-09-20 Monsanto Technology Llc Nucleic acid encoding a modified threonine deaminase and methods of use
US5958745A (en) 1996-03-13 1999-09-28 Monsanto Company Methods of optimizing substrate pools and biosynthesis of poly-β-hydroxybutyrate-co-poly-β-hydroxyvalerate in bacteria and plants
US6091002A (en) 1996-03-13 2000-07-18 Monsanto Company Polyhydroxyalkanoates of narrow molecular weight distribution prepared in transgenic plants
US5773696A (en) 1996-03-29 1998-06-30 Monsanto Company Antifungal polypeptide and methods for controlling plant pathogenic fungi
US6166292A (en) 1996-04-26 2000-12-26 Ajinomoto Co., Inc. Raffinose synthetase gene, method of producing raffinose and transgenic plant
US5985605A (en) 1996-06-14 1999-11-16 Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Dept. Of Agriculture & Agri-Food Canada DNA sequences encoding phytases of ruminal microorganisms
US5998700A (en) 1996-07-02 1999-12-07 The Board Of Trustees Of Southern Illinois University Plants containing a bacterial Gdha gene and methods of use thereof
US5750848A (en) 1996-08-13 1998-05-12 Monsanto Company DNA sequence useful for the production of polyhydroxyalkanoates
US6063756A (en) 1996-09-24 2000-05-16 Monsanto Company Bacillus thuringiensis cryET33 and cryET34 compositions and uses therefor
US6093695A (en) 1996-09-26 2000-07-25 Monsanto Company Bacillus thuringiensis CryET29 compositions toxic to coleopteran insects and ctenocephalides SPP
JP2002510961A (ja) 1996-10-29 2002-04-09 カルジーン エル エル シー 植物セルロースシンターゼおよびプロモーター配列
US6017534A (en) 1996-11-20 2000-01-25 Ecogen, Inc. Hybrid Bacillus thuringiensis δ-endotoxins with novel broad-spectrum insecticidal activity
US6713063B1 (en) 1996-11-20 2004-03-30 Monsanto Technology, Llc Broad-spectrum δ-endotoxins
AP9901541A0 (en) 1996-11-20 1999-06-30 Ecogen Inc Broad-spectrum delta-endotoxins.
US5942664A (en) 1996-11-27 1999-08-24 Ecogen, Inc. Bacillus thuringiensis Cry1C compositions toxic to lepidopteran insects and methods for making Cry1C mutants
US6121436A (en) 1996-12-13 2000-09-19 Monsanto Company Antifungal polypeptide and methods for controlling plant pathogenic fungi
US6171640B1 (en) 1997-04-04 2001-01-09 Monsanto Company High beta-conglycinin products and their use
AR013633A1 (es) 1997-04-11 2001-01-10 Calgene Llc METODO PARA LA ALTERACIoN DE LA COMPOSICIoN DE ÁCIDOS GRASOS DE CADENA MEDIA EN SEMILLAS VEGETALES QUE EXPRESAN UNA TIOESTERASA QUE PREFIERE CADENA MEDIA VEGETAL HETERoLOGA.
US5972664A (en) 1997-04-11 1999-10-26 Abbott Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids
US6372211B1 (en) 1997-04-21 2002-04-16 Monsanto Technolgy Llc Methods and compositions for controlling insects
US6380466B1 (en) 1997-05-08 2002-04-30 Calgene Llc Production of improved rapeseed exhibiting yellow-seed coat
US6716474B2 (en) 1997-06-17 2004-04-06 Monsanto Technology Llc Expression of fructose 1,6 bisphosphate aldolase in transgenic plants
US6441277B1 (en) 1997-06-17 2002-08-27 Monsanto Technology Llc Expression of fructose 1,6 bisphosphate aldolase in transgenic plants
US6072103A (en) 1997-11-21 2000-06-06 Calgene Llc Pathogen and stress-responsive promoter for gene expression
US6060594A (en) 1997-12-18 2000-05-09 Ecogen, Inc. Nucleic acid segments encoding modified bacillus thuringiensis coleopteran-toxic crystal proteins
US6063597A (en) 1997-12-18 2000-05-16 Monsanto Company Polypeptide compositions toxic to coleopteran insects
US6023013A (en) 1997-12-18 2000-02-08 Monsanto Company Insect-resistant transgenic plants
US6653530B1 (en) 1998-02-13 2003-11-25 Calgene Llc Methods for producing carotenoid compounds, tocopherol compounds, and specialty oils in plant seeds
US6107549A (en) 1998-03-10 2000-08-22 Monsanto Company Genetically engineered plant resistance to thiazopyr and other pyridine herbicides
US6635806B1 (en) * 1998-05-14 2003-10-21 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for expression of transgenes in plants
US6284948B1 (en) 1998-05-18 2001-09-04 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genes and methods for control of nematodes in plants
US6444876B1 (en) 1998-06-05 2002-09-03 Calgene Llc Acyl CoA: cholesterol acyltransferase related nucleic acid sequences
CA2330024C (en) 1998-06-12 2012-01-24 Calgene Llc Polyunsaturated fatty acids in plants
JP4514952B2 (ja) 1998-07-02 2010-07-28 カルジーン エルエルシー ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼタンパク質
JP2002520019A (ja) 1998-07-10 2002-07-09 カルジーン エルエルシー 植物色素体における真核性ペプチドの発現
US6476294B1 (en) 1998-07-24 2002-11-05 Calgene Llc Plant phosphatidic acid phosphatases
CN1219064C (zh) 1998-08-04 2005-09-14 嘉吉有限公司 植物脂肪酸去饱和酶启动子
AU5346099A (en) 1998-08-10 2000-03-06 Monsanto Company Methods for controlling gibberellin levels
US6365802B2 (en) 1998-08-14 2002-04-02 Calgene Llc Methods for increasing stearate content in soybean oil
US6468523B1 (en) 1998-11-02 2002-10-22 Monsanto Technology Llc Polypeptide compositions toxic to diabrotic insects, and methods of use
EP1135511B1 (en) 1998-11-17 2009-06-17 Monsanto Technology LLC Phosphonate metabolizing plants
US6531648B1 (en) 1998-12-17 2003-03-11 Syngenta Participations Ag Grain processing method and transgenic plants useful therein
JP2003527077A (ja) 1999-04-15 2003-09-16 カルジーン エルエルシー トコフェロール合成に関与するタンパク質の核酸配列
US6555655B1 (en) 1999-05-04 2003-04-29 Monsanto Technology, Llc Coleopteran-toxic polypeptide compositions and insect-resistant transgenic plants
CN1350587A (zh) 1999-05-13 2002-05-22 孟山都技术有限公司 植物的获得性抗性基因
EP1190078A2 (en) 1999-06-08 2002-03-27 Calgene LLC Nucleic acid sequences encoding proteins involved in fatty acid beta-oxidation and methods of use
US6770465B1 (en) 1999-06-09 2004-08-03 Calgene Llc Engineering B-ketoacyl ACP synthase for novel substrate specificity
WO2001004314A2 (en) 1999-07-12 2001-01-18 Monsanto Technology, Llc. Nucleic acid molecules and proteins associated with sterol synthesis and metabolism
US7547774B2 (en) * 1999-07-20 2009-06-16 Monsanto Technology Llc RCc3 regulatory elements for use in plants
US6603061B1 (en) 1999-07-29 2003-08-05 Monsanto Company Agrobacterium-mediated plant transformation method
US6501009B1 (en) 1999-08-19 2002-12-31 Monsanto Technology Llc Expression of Cry3B insecticidal protein in plants
US6593293B1 (en) 1999-09-15 2003-07-15 Monsanto Technology, Llc Lepidopteran-active Bacillus thuringiensis δ-endotoxin compositions and methods of use
US6573361B1 (en) 1999-12-06 2003-06-03 Monsanto Technology Llc Antifungal proteins and methods for their use
MXPA02006752A (es) 2000-01-06 2004-09-10 Monsanto Technology Llc Preparacion de proteinas y permutenias desalergenizadas.
US6657046B1 (en) 2000-01-06 2003-12-02 Monsanto Technology Llc Insect inhibitory lipid acyl hydrolases
EP1261695B1 (en) 2000-03-09 2005-06-22 Monsanto Technology LLC Methods for making plants tolerant to glyphosate and compositions thereof
US6518488B1 (en) 2000-07-21 2003-02-11 Monsanto Technology Llc Nucleic acid molecules and other molecules associated with the β-oxidation pathway
AU2001279007A1 (en) 2000-07-25 2002-02-05 Calgene Llc Nucleic acid sequences encoding beta-ketoacyl-acp synthase and uses thereof
ATE482281T1 (de) 2004-06-09 2010-10-15 Pioneer Hi Bred Int Plastiden transit peptide
US7750207B2 (en) * 2004-09-01 2010-07-06 Monsanto Technology Llc Zea mays ribulose bisphosphate carboxylase activase promoter
US20060200878A1 (en) 2004-12-21 2006-09-07 Linda Lutfiyya Recombinant DNA constructs and methods for controlling gene expression
ATE480629T1 (de) * 2005-03-16 2010-09-15 Athenix Corp Auf cis einwirkende regulierende elemente aus tripsacum-dactyloiden
MX338183B (es) 2005-10-24 2016-04-06 Evogene Ltd Polipeptidos aislados, polinucleotidos que los codifican, plantas transgenicas quie expresan los mismos y metodos para usarlos.
US7491813B2 (en) * 2005-12-07 2009-02-17 Monsanto Technology Llc Promoter polynucleotides identified from Zea mays for use in plants
CN101473037B (zh) * 2006-06-15 2015-08-19 克罗普迪塞恩股份有限公司 具有增强的产量相关性状的nac转录因子受调节表达的植物和用于产生该植物的方法
WO2008027592A2 (en) 2006-08-31 2008-03-06 Monsanto Technology, Llc Phased small rnas
EP2450448B1 (en) 2007-03-09 2014-09-17 Monsanto Technology LLC Methods for plant transformation using spectinomycin selection
AR066714A1 (es) * 2007-05-23 2009-09-09 Crop Functional Genomics Ct Metodo para mejorar en plantas los rasgos relacionados con el rendimiento
CN103333894B (zh) * 2008-04-07 2016-11-23 孟山都技术公司 植物调控元件及其应用
CN104745608A (zh) 2009-09-25 2015-07-01 巴斯夫植物科学有限公司 具有增强的产量相关性状的植物及其制备方法
CA3121068C (en) * 2010-01-14 2023-11-28 Monsanto Technology Llc Plant regulatory elements and uses thereof
EP2675900B1 (en) * 2011-02-15 2017-09-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Root-preferred promoter and methods of use
CA2835817C (en) * 2011-05-13 2020-07-07 Monsanto Technology Llc Plant regulatory elements and uses thereof
WO2013005152A1 (en) 2011-07-05 2013-01-10 Basf Plant Science Company Gmbh Regulatory nucleic acid molecules for enhancing constitutive gene expression in plants

Also Published As

Publication number Publication date
MX352666B (es) 2017-12-01
US9617553B2 (en) 2017-04-11
US10421974B2 (en) 2019-09-24
MX2019011817A (es) 2019-11-07
BR112015023189A2 (pt) 2017-11-21
MX2019011816A (es) 2019-11-07
AR118316A2 (es) 2021-09-29
JP2020110167A (ja) 2020-07-27
JP6679643B2 (ja) 2020-04-15
RU2015143455A (ru) 2017-04-17
JP2016514964A (ja) 2016-05-26
AR118315A2 (es) 2021-09-29
CL2018001365A1 (es) 2018-07-20
CN105307480A (zh) 2016-02-03
US20170183674A1 (en) 2017-06-29
EP3613278A1 (en) 2020-02-26
CL2015002696A1 (es) 2016-02-05
CN110066796B (zh) 2023-11-10
EP3613279A1 (en) 2020-02-26
ES3042588T3 (en) 2025-11-21
EP3613278B1 (en) 2025-07-02
CA2905446A1 (en) 2014-10-02
EP3613280A1 (en) 2020-02-26
MX2019011818A (es) 2019-11-07
CA3207141A1 (en) 2014-10-02
JP6889300B2 (ja) 2021-06-18
US20200063150A1 (en) 2020-02-27
CR20200120A (es) 2020-06-05
EP3613279B1 (en) 2025-07-02
US12305178B2 (en) 2025-05-20
CN107699563B (zh) 2022-02-22
JP6889302B2 (ja) 2021-06-18
JP2018113983A (ja) 2018-07-26
JP6889301B2 (ja) 2021-06-18
US11542516B2 (en) 2023-01-03
MX370800B (es) 2020-01-07
JP2020110168A (ja) 2020-07-27
CR20200122A (es) 2020-05-22
JP2020110169A (ja) 2020-07-27
WO2014159632A1 (en) 2014-10-02
EP3613280B1 (en) 2025-07-02
ES2769898T3 (es) 2020-06-29
EP2966981B1 (en) 2019-12-04
CL2018001364A1 (es) 2018-07-20
MX2015012557A (es) 2016-01-12
AR095463A1 (es) 2015-10-21
EP2966981A4 (en) 2017-03-29
RU2675524C2 (ru) 2018-12-19
JP2020110170A (ja) 2020-07-27
CL2018001366A1 (es) 2018-07-20
CR20150554A (es) 2015-11-20
UA121457C2 (uk) 2020-06-10
AR118318A2 (es) 2021-09-29
US20230141324A1 (en) 2023-05-11
US20140283201A1 (en) 2014-09-18
CR20200121A (es) 2020-07-03
CN110066796A (zh) 2019-07-30
JP6889303B2 (ja) 2021-06-18
EP2966981A1 (en) 2016-01-20
AR118317A2 (es) 2021-09-29
ZA201506453B (en) 2017-01-25
CN107699563A (zh) 2018-02-16
CL2018001357A1 (es) 2018-07-20
CA2905446C (en) 2023-09-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES3046008T3 (en) Plant regulatory elements and uses thereof
BR112015022046B1 (pt) Cassete de expressão compreendendo elemento regulador de planta e método para produzir uma planta transgênica
ES2986585T3 (es) Elementos reguladores de plantas y sus usos
ES2900300T3 (es) Elementos reguladores de las plantas y usos de los mismos
ES3010662T3 (en) Plant regulatory elements and uses thereof
BR122020000152B1 (pt) Molécula de dna recombinante e método para produzir uma planta de milho transgênica
BR112015023189B1 (pt) Molécula de dna recombinante e método para produzir uma planta de milho transgênica
BR122020000150B1 (pt) Molécula de dna recombinante e método para produzir uma planta de milho transgênica
BR122022011890B1 (pt) Molécula de dna recombinante e método para produzir uma planta de milho transgênica
BR122020000158B1 (pt) Molécula de dna recombinante e método para produzir uma planta de milho transgênica