ES3046235T3 - Sindbis control virus - Google Patents

Sindbis control virus

Info

Publication number
ES3046235T3
ES3046235T3 ES16812140T ES16812140T ES3046235T3 ES 3046235 T3 ES3046235 T3 ES 3046235T3 ES 16812140 T ES16812140 T ES 16812140T ES 16812140 T ES16812140 T ES 16812140T ES 3046235 T3 ES3046235 T3 ES 3046235T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
sequence
virus
seq
sindbis
rna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES16812140T
Other languages
English (en)
Inventor
Russell Garlick
Catherine Huang
Bharathi Anekella
Jonathan Li
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
LGC Clinical Diagnostics Inc
Original Assignee
Seracare Life Sciences Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Seracare Life Sciences Inc filed Critical Seracare Life Sciences Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES3046235T3 publication Critical patent/ES3046235T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16031—Uses of virus other than therapeutic or vaccine, e.g. disinfectant
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16031—Uses of virus other than therapeutic or vaccine, e.g. disinfectant
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/36011—Togaviridae
    • C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
    • C12N2770/36121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/36011—Togaviridae
    • C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
    • C12N2770/36141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2770/36143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Se describen composiciones y métodos relacionados con virus Sindbis deficientes en replicación que pueden funcionar como controles para ensayos de diagnóstico de ácidos nucleicos (por ejemplo, ensayos basados en secuenciación de ácidos nucleicos y/o ensayos basados en amplificación de ácidos nucleicos). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0002] Virus de control Sindbis
[0003] Antecedentes de la invención
[0004] Los organismos reguladores, tales como la FDA, CLIA y CAP (por sus siglas en inglés, respectivamente), generalmente requieren que los creadores de dispositivos de diagnósticoin vitrobasados en ácidos nucleicos para la detección de patógenos incluyan controles de calidad en sus presentaciones reglamentarias. Tales materiales de control de calidad son herramientas importantes para la detección de errores analíticos, la supervisión del rendimiento a largo plazo de los kits de pruebas de diagnóstico y la identificación de cambios en los errores aleatorios o sistemáticos. Un programa de control de calidad de laboratorio bien diseñado incorporará, por lo general, al menos alguna forma de control que proporcione una mayor confianza en la fiabilidad de los resultados obtenidos para muestras desconocidas.
[0005] Se necesitan controles de todo el proceso para supervisar todo el proceso analítico, incluida la lisis de la muestra, la extracción del ácido nucleico, la amplificación, la detección y la interpretación de los resultados. Tales controles pueden ser material natural derivado de pacientes infectados, que tienen la ventaja de comportarse de forma muy similar a una muestra clínica. Sin embargo, tales controles de fuentes naturales tienen a menudo una disponibilidad, concentración y estabilidad limitadas e impredecibles. Usar virus cultivados para generar controles positivos elimina algunos de estos problemas, pero a menudo el cultivo del virus no está disponible o es tecnológicamente difícil. Además, la preparación de grandes cantidades de patógenos humanos conlleva importantes riesgos de seguridad y es cara.
[0006] Los controles positivos de amplificación y detección a menudo forman están proporcionados como parte de los kits de pruebas de diagnóstico. Los materiales suelen tener un número de copias de entrada conocido y verifican la integridad de los componentes de la reacción y del instrumento. Sin embargo, tales controles no se realizan usualmente a lo largo del proceso de lisis de la muestra o de extracción del ácido nucleico y son, por lo tanto, incapaces de detectar errores derivados de estos pasos. Los ejemplos de este tipo de control incluyen un plásmido de ADN no infeccioso que contiene la secuencia de direccionamiento, transcritos de ARN purificados o materiales de ARN empaquetados tales como el ARN blindado. A menudo, estos materiales también adolecen de su limitada estabilidad a temperatura ambiente.
[0007] Los controles internos contienen una secuencia de nucleótidos no objetivo que se co-extrae y co-amplifica con el ácido nucleico objetivo. Los controles internos confirman la integridad de los reactivos (por ejemplo, polimerasa, cebadores, etc.), la funcionalidad del equipo (por ejemplo, termociclador) y la ausencia de inhibidores en la muestra. El control interno puede adoptar la forma de un organismo no objetivo que se añade a la muestra antes de la lisis y extracción de la misma. Alternativamente, podría ser una secuencia de ADN o ARN no infecciosa y no objetivo que se añade a la muestra antes o después de la lisis y extracción de la muestra.
[0008] Así, existe la necesidad de composiciones mejoradas capaces de servir como controles en ensayos de diagnóstico. Breve descripción de la invención
[0009] La invención se describe en las reivindicaciones.
[0010] En la presente se describen composiciones y métodos relacionados con el virus Sindbis de replicación deficiente que pueden funcionar como controles para ensayos de diagnóstico de ácidos nucleicos (por ejemplo, ensayos basados en la secuenciación de ácidos nucleicos y/o ensayos basados en la amplificación de ácidos nucleicos). Se usa en la presente un virus Sindbis recombinante de replicación deficiente que comprende un genoma de ARN que comprende: un marco abierto de lectura (ORF, por sus siglas en inglés) que codifica proteínas no estructurales funcionales de Sindbis; y una secuencia de ARN heteróloga (es decir, una secuencia de ARN heteróloga (es decir, no-Sindbis), en donde la secuencia de ARN heteróloga comprende al menos 50 pb (pares de bases) de una secuencia de un virus de ARN no-Sindbis con envoltura o una secuencia del retrovirus; como control en un ensayo de diagnóstico de ácidos nucleicos para la detección de un virus de ARN no-Sindbis con envoltura o un retrovirus. En algunas realizaciones, el ORF que codifica las proteínas no estructurales funcionales Sindbis está ubicado en 5' de la secuencia de ARN heteróloga.
[0011] En algunas realizaciones, el ORF que codifica las proteínas no estructurales Sindbis codifica una proteína nsP1, una proteína nsP2, una proteína nsP3 y una proteína nsP4 (por sus siglas en inglés). En algunas realizaciones, el ORF que codifica las proteínas no estructurales Sindbis tiene una secuencia de nucleótidos que es al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 % idéntica a los nucleótidos 1-7648 de la SEQ ID NO: 1. Estos nucleótidos codifican proteínas no estructurales de Sindbis.
[0012] En algunas realizaciones, el genoma de ARN del virus Sindbis de replicación deficiente carece de una secuencia que codifique una versión funcional de una o más de las proteínas estructurales de Sindbis (por ejemplo, la proteína de la cápside de Sindbis, la proteína E3, la proteína E2, la proteína 6k y/o la proteína E1). En algunas realizaciones, el genoma de ARN carece de una secuencia de ARN que codifique cualquier proteína estructural funcional de Sindbis. En algunas realizaciones, la secuencia de ARN heterólogo sustituye al ORF que codifica las proteínas estructurales de Sindbis en el genoma del ARN.
[0014] En algunas realizaciones, el virus Sindbis recombinante de replicación deficiente de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el genoma de ARN comprende un promotor subgenómico 26S en el extremo 3' del ORF que codifica las proteínas no estructurales de Sindbis.
[0016] En algunas realizaciones, la secuencia de ARN heteróloga en el genoma de ARN comprende una secuencia de virus de ARN no-Sindbis o una secuencia del retrovirus. En algunas realizaciones, la secuencia de ARN heterólogo incluye al menos 10, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 o 2000 pb de una secuencia de virus de ARN no-Sindbis o de una secuencia del retrovirus. En algunas realizaciones, la secuencia de ARN heterólogo incluye 100­ 300 pb de una secuencia de virus de ARN no-Sindbis o una secuencia del retrovirus. En algunas realizaciones, la secuencia de ARN heterólogo incluye 100-200 pb de una secuencia de virus de ARN no-Sindbis o una secuencia del retrovirus. En algunas realizaciones, la secuencia de ARN heterólogo es al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 % idéntica a una secuencia del virus de ARN no-Sindbis o a una secuencia del retrovirus. En algunas realizaciones, la secuencia del virus de ARN no-Sindbis o del retrovirus comprende una o más mutaciones que transmiten un fenotipo resistente a fármacos cuando están presentes en el virus de ARN no-Sindbis o en el retrovirus. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la secuencia del virus de ARN no-Sindbis o del retrovirus comprende al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 mutaciones que transmiten un fenotipo resistente a fármacos cuando están presentes en el virus de ARN no-Sindbis o en el retrovirus.
[0018] La secuencia de ARN heteróloga comprende al menos 50 pb de una secuencia de virus de ARN no-Sindbis. En algunas realizaciones, la secuencia del virus de ARN no-Sindbis es una secuencia del virus del Ébola, una secuencia del virus de la Influenza, una secuencia del virus del SARS (por sus siglas en inglés), una secuencia del virus de la hepatitis C, una secuencia del virus del Nilo Occidental, una secuencia del virus del Zika, una secuencia del virus de polio, o una secuencia del virus del sarampión.
[0020] En algunas realizaciones, la secuencia del virus de ARN no-Sindbis es una secuencia del virus del Ébola (por ejemplo, una secuencia del virus del Ébola Zaire, una secuencia del virus del Ébola Bundibugyo, una secuencia del virus del Ébola Reston, una secuencia del virus del Ébola Sudán, o una secuencia del virus del Ébola Tai Forest). En algunas realizaciones, la secuencia del virus del Ébola comprende al menos una porción de una secuencia génica GP de virus del Ébola, una secuencia génica NP de virus del Ébola, o una secuencia génica VP24 de virus del Ébola (por sus siglas en inglés, respectivamente). En algunas realizaciones, la secuencia de ARN heteróloga no codifica una proteína de Ébola funcional (por ejemplo, la secuencia de ARN heteróloga codifica proteínas de Ébola truncadas, proteínas de Ébola con mutaciones de desplazamiento de marco y/o secuencias de proteínas del ébola que carecen de un codón de inicio). En algunas realizaciones, la secuencia de ARN heterólogo comprende una secuencia al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 3. La SEQ ID NO: 2 es la secuencia de nucleótidos de una secuencia de direccionamiento de GP de Ébola usada en un virus de control Sindbis del Ébola ejemplar descrito en el Ejemplo 1. La SEQ ID NO: 3 es la secuencia de nucleótidos de una secuencia de direccionamiento NP/VP24 de Ébola usada en un virus de control Sindbis del Ébola ejemplar descrito en el Ejemplo 1. La porción del gen NP de Ébola consiste en los nucleótidos 1 a 1577 de la SEQ ID NO: 3, la porción del gen VP24 de Ébola consiste en los nucleótidos 1578 a 2127, y la secuencia del control interno ARNasa P humano consiste en los nucleótidos 2128 a 2217.
[0022] En algunas realizaciones, la secuencia de ARN heterólogo comprende una secuencia del retrovirus. En algunas realizaciones, la secuencia del retrovirus es una secuencia del HIV-1, una secuencia del HIV-2, una secuencia del HTLV-1 o una secuencia del HTLV-II (por sus siglas en inglés, respectivamente).
[0024] En algunas realizaciones, la secuencia de ARN heteróloga comprende una secuencia del HIV-1. En algunas realizaciones, la secuencia del HIV-1 comprende una o más mutaciones que, cuando están presentes en un virus HIV-1, transmiten un fenotipo de resistencia a fármacos (por ejemplo, resistencia a un inhibidor de la proteasa, un inhibidor de la transcriptasa inversa análogo de nucleósido y/o un inhibidor de la transcriptasa inversa no análogo de nucleósido). Por ejemplo, en algunas realizaciones la secuencia del virus HIV-1 comprende al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 mutaciones que transmiten un fenotipo resistente a fármacos. En algunas realizaciones, la una o más mutaciones, cuando están presentes en el virus HIV-1, transmiten resistencia a un fármaco seleccionado del grupo que consiste en: atazanavir, ritonavir, darunavir, fosamprenavir, indinavir, lopinavir, nelfinavir, saquinavir, tipranavir, abacavir, didanosina, emtricitabina, lamivudina, estavudina, tenofovir, zidovudina, efavirenz, etavirina, nevirapina o rilpivirina. En algunas realizaciones, la una o más mutaciones se seleccionan del grupo que consiste en L24I, D30N, V32I, M46I, I47V, G48V, I50V, I54M, G73S, L76V, V82A, I84V, N88D, L90M, M41L, K65R, D67N, T69S inserto SS, K70R, L74V, F77L, Y115F, F116Y, Q151M, M184V, L210W, T215Y, K219Q, L100I, K101E, K103N, V106A, V108I, Y181C, Y188L, G190A, P225H y M230L. En algunas realizaciones, la una o más mutaciones se seleccionan del grupo que consiste en L24I (TTA a ATA), D30N (GAT a AAT), V32I (GTA a ATA), M46I (ATG a ATA), I47V (ATA a CTA), G48V (GGG a GTG), I50V (ATT a GTT), I54M (ATC a ATG), G73S(GGT a GCT), L76V (TTA a GTA), V82A (GTC a GCC), I84V (ATA a GTA), N88D (AAT a GAT), L90M (TTG a ATG), M41L (ATG a TTG), K65R (AAA a AGA), D67N (GAC a AAC), T69S inserto SS (ACT a TCT e inserción de TCC y TCC), K70R (AAA a AGA), L74V (TTA a GTA), F77L (TTC a CTC), Y115F (TAT a TTT), F116Y (TTT a TAT), Q151M (CAG a ATG), M184V (ATG a GTG), L210W (TTG a TGG), T215Y (ACC a TAC), K219Q (AAA a CAA), L100I (TTA a ATA), K101E (AAA a GAA), K103N (AAA a AAC), V106A (GTA a GCA), V108I (GTA a ATA), Y181C (TAT a TGT), Y188L (TAT a TTA), G190A (GGA a GCA), P225H (CCT a CAT) y M230L (CCT a CAT). En algunas realizaciones, la secuencia del HIV-1 comprende al menos una porción de un gen de HIV-1 seleccionada de p7, p1, p6, proteasa de HIV, transcriptasa inversa, ARNasa p51, integrasa y gp120. En algunas realizaciones, la secuencia del HIV-1 comprende al menos una porción de p7, p1, p6, proteasa de HIV, transcriptasa inversa e integrasa. En ciertas realizaciones, la secuencia del HIV-1 comprende al menos una porción de 6p120, en donde la porción comprende los bucles variables V1-V5. En algunas realizaciones, la secuencia del HIV-1 comprende una secuencia que es al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 % idéntica a los nucleótidos 1900 a 5400 y/o 6300 a 7825 de la cepa HXB2 de HIV-1 (SEQ ID NO: 4). La SEQ ID NO: 4 es la secuencia de nucleótidos del genoma HXB2 de HIV-1. En algunas realizaciones, la secuencia del HIV-1 es idéntica a los nucleótidos 1900 a 5400 y/o 6300 a 7825de la cepa HXB2 de HIV-1 (SEQ ID NO: 4) excepto por la presencia de las mutaciones que transmiten un fenotipo de resistencia a fármacos.
[0026] En algunas realizaciones, la secuencia de ARN heterólogo comprende una secuencia al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 5 y/o la SEQ ID NO: 7. La SEQ ID NO: 5 es la secuencia de nucleótidos de una secuencia de direccionamiento 5' multimutante de HIV-1 que comprende una serie de mutaciones de resistencia a fármacos, usada en un virus de control multimutante de HIV-1 ejemplar descrito en el Ejemplo 2. La SEQ ID NO: 7 es la secuencia de nucleótidos de una secuencia de direccionamiento 3' mutante de HIV-1 usada en un virus de control multimutante de HIV-1 ejemplar descrito en el Ejemplo 2.
[0028] En algunas realizaciones, la secuencia de ARN heterólogo comprende una secuencia al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 6 y/o la SEQ ID NO: 8. La SEQ ID NO: 6 es la secuencia de nucleótidos de una secuencia de direccionamiento 5' de HIV-1 de tipo silvestre en un virus de control de HIV-1 ejemplar, descrito en el Ejemplo 2. La SEQ ID NO: 8 es la secuencia de nucleótidos de una secuencia de direccionamiento 3' de HIV-1 de tipo silvestre usada en un virus de control de HIV-1 ejemplar, descrito en el Ejemplo 2.
[0030] En algunas realizaciones, la secuencia de ARN heterólogo comprende una secuencia que es al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 % idéntica a los nucleótidos 1 -3446, a los nucleótidos 3294-5575, a los nucleótidos 5425-7722 o a los nucleótidos 7542-10272 de la SEQ ID NO: 15.
[0032] En algunas realizaciones, el genoma de ARN del virus Sindbis de replicación deficiente comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 9, la SEQ ID NO: 10, la SEQ ID NO: 11, la SEQ ID NO: 12, la SEQ ID NO: 13, la SEQ ID NO: 14 o la SEQ ID NO: 15.
[0034] En ciertos aspectos, se usa una composición en un ensayo de diagnóstico de ácido nucleico para la detección de un virus de ARN no-Sindbis con envoltura o un retrovirus, en donde la composición comprende un virus Sindbis de replicación deficiente descrito en la presente, y un fluido corporal humano. En ciertos aspectos, la composición comprende dos o más de los virus Sindbis deficientes en replicación descritos en la presente. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la composición comprende un virus Sindbis de replicación deficiente que comprende un genoma de ARN que comprende una secuencia que es al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 11, y un virus Sindbis de replicación deficiente que comprende un genoma de ARN que comprende una secuencia que es al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 13. En algunas realizaciones, la composición comprende un virus Sindbis de replicación deficiente que comprende un genoma de ARN que comprende una secuencia que es al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 12, y un virus Sindbis de replicación deficiente que comprende un genoma de ARN que comprende una secuencia que es al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 14. En algunas realizaciones, la composición comprende además ADN humano. En algunas realizaciones, el fluido corporal humano es plasma humano (por ejemplo, plasma humano desfibrinado). En algunas realizaciones, la composición comprende además un conservante, tal como azida de sodio.
[0036] En algunas realizaciones, la composición comprende un virus Sindbis de replicación deficiente que comprende un genoma de ARN que comprende una secuencia que es al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 % idéntica a los nucleótidos 1-3446, los nucleótidos 3294-5575, los nucleótidos 5425­ 7722, o los nucleótidos 7542-10272 de la SEQ ID NO: 15.
[0038] Por lo demás, se divulga en la presente una molécula de ácido nucleico que codifica el genoma de ARN del virus Sindbis de replicación deficiente descrito en la presente. Como se describe en la presente, en algunos casos la molécula de ácido nucleico es una molécula de ADN. Como se describe en la presente, en algunos casos la molécula de ácido nucleico es una molécula de ARN. Como se describe en la presente, en algunos casos la molécula de ácido nucleico es un plásmido (por ejemplo, un plásmido circular o un plásmido linealizado, tal como un plásmido de expresión circular o un plásmido de expresión linealizado). Como se describe en la presente, en algunos casos la molécula de ácido nucleico está aislada. De otro modo divulgado, en la presente está una célula que comprende un ácido nucleico descrito en la presente. Como se describe en la presente, en algunos casos la célula es una célula BHK (por sus siglas en inglés).
[0040] También se divulga en la presente un método para fabricar un virus Sindbis de replicación deficiente. Como se describe en la presente, en algunos casos el método incluye el paso de transfectar una célula (por ejemplo, una célula BHK) con una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ARN) que codifica el genoma de ARN de un virus Sindbis de replicación deficiente descrito en la presente y con un ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ARN) que codifica proteínas estructurales funcionales de Sindbis. Como se describe en la presente, en algunos casos la célula se cultiva posteriormente en condiciones tales que la célula produce el virus Sindbis de replicación deficiente en el medio de cultivo. Como se describe en la presente, en algunos casos el método comprende además recolectar el virus Sindbis de replicación deficiente (por ejemplo, al recolectar el sobrenadante del cultivo). Como se describe en la presente, en algunos casos el método comprende además filtrar y/o inactivar por calor el sobrenadante del cultivo. Como se describe en la presente, en algunos casos el método comprende además la determinación del título del virus (por ejemplo, usando PCR en tiempo real, por sus siglas en inglés).
[0041] También se proporciona en la presente un método de prueba de un ensayo de diagnóstico para la detección de un virus que contiene ARN de no-Sindbis con envoltura o un retrovirus, que comprende llevar a cabo el ensayo de diagnóstico en una composición que comprende el virus de Sindbis de replicación deficiente descrito en la presente, en donde el ensayo de diagnóstico es un ensayo de diagnóstico basado en amplificación de ácido nucleico o un ensayo de diagnóstico basado en secuenciación. En algunas realizaciones, el ensayo de diagnóstico es un ensayo para la detección de virus del Ébola, un virus de la Influenza, un virus del SARS, un virus de la hepatitis C, un virus del Nilo Occidental, un virus del Zika, un poliovirus, un virus del sarampión, un virus HIV-1, un virus HIV-2, un virus HTLV-I, y/o un virus HTLV-II. En ciertas realizaciones, la secuencia de ARN heteróloga en el genoma de ARN del virus Sindbis de replicación deficiente contiene la secuencia de direccionamiento detectada en el ensayo de diagnóstico. En algunas realizaciones, el método incluye llevar a cabo un paso de lisis de la muestra en la composición que comprende el virus Sindbis de replicación deficiente. En algunas realizaciones, el método comprende llevar a cabo un paso de extracción de ácido nucleico. En algunas realizaciones, el método comprende llevar a cabo un paso de amplificación de ácido nucleico (por ejemplo, la realización de un proceso de amplificación/detección de ácido nucleico en tiempo real). En algunas realizaciones, el método comprende llevar a cabo un paso de secuenciación de ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, el método comprende llevar a cabo un paso de detección de ácido nucleico.
[0043] Breve descripción de las figuras
[0045] La Figura 1 muestra una representación esquemática de la organización genómica del virus Sindbis. Algunos de los genes mostrados codifican proteínas no estructurales (nsP1-4), que incluyen la helicasa y la ARN polimerasa. Algunos de los genes son estructurales y codifican la cápside (C) y las proteínas que intervienen en la gemación.
[0046] La Figura 2 muestra una representación esquemática de la organización genómica de un vector de control Sindbis descrito en la presente.
[0048] La Figura 3 muestra un esquema ejemplar para la producción de virus recombinantes de control Sindbis.
[0050] La Figura 4 muestra los resultados de un ensayo TaqMan de cuantificación en tiempo real de muestras de control de Sindbis no estresadas (tiempo = 0) o estresadas por 1,3, 5, 11 o 22 días a 372C.
[0051] La Figura 5 muestra los resultados de un ensayo TaqMan de cuantificación en tiempo real de muestras de control Sindbis no estresadas o de muestras estresadas a través de uno, dos o tres ciclos de congelación/descongelación. La Figura 6 muestra los resultados de un ensayo TaqMan de cuantificación en tiempo real de un virus de control Sindbis almacenado congelado a -20 °C, almacenado en refrigeración a 2-8 °C o almacenado a temperatura ambiente de laboratorio a lo largo de siete meses.
[0052] La Figura 7 muestra un resumen del flujo de trabajo para la producción del virus de control Sindbis.
[0053] La Figura 8 muestra un mapa del vector SC de SinRep. La Figura divulga “His8” como la SEQ ID NO: 16.
[0054] La Figura 9 consiste en dos mapas del genoma del virus del Zika. El genoma se dividió en cuatro regiones para la constructo de cuatro materiales de referencia diferentes del virus del Zika, y cada región se representa con un rectángulo. Un primer material de referencia comprende los nucleótidos 1 a 3446 del virus del Zika del GenBank con número de acceso EU545988.1, denominado “Constructo Zika Env” (Constructo-1). Un segundo material de referencia comprende los nucleótidos 3294 a 5575, denominado “Constructo Zika NS2/NS3” (Constructo-2). Un tercer material de referencia comprende los nucleótidos 5425 a 7722, denominado “Constructo Zika NS4” (Constructo-3). Un cuarto material de referencia comprende los nucleótidos 7542 a 10272, denominado “Constructo Zika NS5” (Constructo-4).
[0055] La Figura 10A muestra los nucleótidos 1 a 3446 del virus del Zika del GenBank con número de acceso EU545988.1, denominado “Constructo Zika Env”, que incluye el gen NS1. Esta porción del genoma del virus del Zika se integró en un material de referencia del virus del Zika.
[0056] La Figura 10B muestra los nucleótidos 3294 a 5575 del virus del Zika del GenBank con número de acceso EU545988.1, denominado “Constructo Zika NS2/NS3”, que incluye los genes NS2 y NS3, así como una porción del gen NS1. Esta porción del genoma del virus del Zika se integró en un material de referencia del virus del Zika. La Figura 10C muestra los nucleótidos 5425 a 7722 del virus del Zika del GenBank con número de acceso EU545988.1, denominado “Constructo Zika NS4”, que incluye los genes NS4A y NS4B, así como una porción del gen NS3. Esta porción del genoma del virus del Zika se integró en un material de referencia del virus del Zika. La Figura 10D muestra los nucleótidos 7542 a 10272 del virus del Zika del GenBank con número de acceso EU545988.1, denominado “Constructo NS5 de Zika”, que incluye el gen NS5 y una porción del gen NS4B. Esta porción del genoma del virus del Zika se integró en un material de referencia del virus del Zika.
[0057] La Figura 11A muestra los resultados de estabilidad de la cuantificación TaqMan en tiempo real de un material de referencia de la Influenza H7N9 almacenado a -20 °C, 4 °C o temperatura ambiente (~25 °C) por diecisiete meses. Los resultados representados corresponden a materiales de referencia formulados con amortiguador.
[0058] La Figura 11B muestra los resultados de estabilidad de la cuantificación TaqMan en tiempo real de un material de referencia de la Influenza H7N9 almacenado a -20 °C, 4 °C o temperatura ambiente (~25 °C) por diecisiete meses. Los resultados representados corresponden a materiales de referencia formulados con plasma humano.
[0059] La Figura 12 muestra los resultados de estabilidad de la cuantificación TaqMan en tiempo real de un material de referencia de la Influenza H7N9 almacenado a temperatura ambiente por diecisiete meses. Cada barra de error corresponde a 1 desviación estándar de la media.
[0060] Descripción detallada de la invención
[0061] General
[0062] Se usan composiciones y métodos como se describe en la presente relacionados con el virus Sindbis de replicación deficiente que pueden funcionar como controles para ensayos de diagnóstico de ácidos nucleicos (por ejemplo, ensayos basados en secuenciación de ácidos nucleicos y/o ensayos basados en amplificación de ácidos nucleicos). En ciertos aspectos, se proporciona en la presente el uso de un virus de control Sindbis como se describe en la presente que son útiles como controles de todo el proceso, controles positivos y/o controles internos en ensayos de diagnóstico de ácidos nucleicos. Tal virus de control puede beneficiar a los fabricantes de diagnósticos al proporcionar una fuente menos costosa, consistente y segura de material de partida para los controles. El virus de control descrito en la presente usa el virus Sindbis, un virus con envoltura que contiene ARN y que puede modificarse para contener secuencias de ARN objetivo tales como secuencias de otro virus y/o una secuencia de control interno. El recubrimiento del virus Sindbis proporciona al genoma de ARN una mayor estabilidad. El sistema del virus Sindbis recombinante descrito en la presente resulta en partículas virales empaquetadas, por lo que puede usarse para evaluar los procesos de extracción de ácidos nucleicos que se usan antes de la detección de ácidos nucleicos. También se proporcionan en la presente usos de composiciones que comprenden tales virus, moléculas de ácido nucleico que codifican el genoma de ARN de tales virus de control, métodos para fabricar tales virus de control y métodos para usar tales virus de control.
[0064] Definiciones
[0066] Por comodidad, se reúnen en la presente ciertos términos empleados en la memoria descriptiva, los ejemplos y las reivindicaciones adjuntas.
[0068] Los artículos “un” y “una” se usan en la presente para referirse a uno o a más de uno (es decir, al menos a uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, “un elemento” significa un elemento o más de un elemento.
[0069] Los términos “muestra biológica”, “muestra de tejido” o simplemente “muestra” se refieren cada uno a una colección de células obtenidas de un tejido de un sujeto. La fuente de la muestra de tejido puede ser tejido sólido, como de un órgano fresco, congelado y/o conservado, muestra de tejido, biopsia o aspirado; sangre o cualquier componente sanguíneo, suero, sangre; fluidos corporales tales como líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico, líquido peritoneal o líquido intersticial, orina, saliva, heces, lágrimas; o células de cualquier momento de la gestación o desarrollo del sujeto.
[0071] El término “control” incluye cualquier porción de un sistema experimental diseñada para demostrar que el factor que se está probando es el responsable del efecto observado y, por lo tanto, es útil para aislar y cuantificar el efecto de una variable en un sistema.
[0073] El término “gen” se usa en sentido amplio para referirse a cualquier ácido nucleico asociado a una funcionalidad biológica. El término “gen” se aplica a una secuencia genómica específica, así como a un ADNc o a un ARNm codificado por dicha secuencia genómica.
[0075] Como se usa en la presente, el término “ARN heterólogo” se refiere al ARN presente en un virus Sindbis recombinante que no se deriva del virus Sindbis de tipo silvestre. Por ejemplo, el ARN heterólogo en un virus Sindbis puede ser una secuencia de ARN que normalmente se encuentra en un virus diferente (por ejemplo, un virus de ARN o retrovirus diferente), puede ser una secuencia de ARN que normalmente se encuentra en un organismo no viral, o puede ser una secuencia de ARN completamente artificial.
[0077] El término “ácido nucleico aislado” se refiere a un polinucleótido de origen natural o sintético, o alguna combinación de ambos, que (1) no está asociado a la célula en la que se encuentra el “ácido nucleico aislado” en la naturaleza, y/o (2) está enlazado operativamente a un polinucleótido al que no está enlazado en la naturaleza.
[0079] Los términos “polinucleótido” y “ácido nucleico” se usan indistintamente. Se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sean desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, o análogos de los mismos. Los polinucleótidos pueden tener cualquier estructura tridimensional y desempeñar cualquier función. Los siguientes son ejemplos no limitantes de polinucleótidos: regiones codificantes o no codificantes de un gen o fragmento de gen,loci (locus)definidos a partir del análisis de ligamiento, exones, intrones, ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia, ARN ribosómico, ribozimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácidos nucleicos y cebadores. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos. Si están presentes, las modificaciones de la estructura nucleotídica pueden impartirse antes o después del ensamblaje del polímero. Un polinucleótido puede modificarse aún más, tal como por conjugación con un componente de etiquetado. En todas las secuencias de nucleótidos proporcionadas en la presente, los nucleótidos U son intercambiables con los nucleótidos T.
[0081] Como se usa en la presente, el término “virus Sindbis” incluye partículas virales formadas por una cápside icosaédrica que comprende las proteínas de la cápside, E1 y E2 del virus Sindbis que abarcan un genoma de ARN de hebra única. El genoma de ARN puede incluir ARN no-Sindbis (es decir, ARN heterólogo) y no es necesario que incluya todas las partes del genoma de Sindbis de tipo silvestre. Por ejemplo, en algunas realizaciones el genoma de ARN no codifica una o más de las proteínas estructurales de Sindbis.
[0083] Virus de control Sindbis de replicación deficiente
[0085] Se usa en la presente un virus de control de Sindbis de replicación deficiente que comprende un genoma de ARN que incluye (a) un marco abierto de lectura (ORF) que codifica proteínas no estructurales funcionales de Sindbis y (b) una secuencia heteróloga (es decir, no-Sindbis) de ARN, en donde la secuencia heteróloga comprende al menos 50 pb de una secuencia de un virus de ARN no-Sindbis con envoltura o una secuencia del retrovirus; como control en un ensayo de diagnóstico de ácidos nucleicos para la detección de un virus de ARN no-Sindbis con envoltura o un retrovirus. En algunas realizaciones, el ORF que codifica las proteínas no estructurales funcionales Sindbis está ubicado en 5' de la secuencia de ARN heteróloga. En algunas realizaciones, la secuencia de ARN heteróloga es una secuencia de un virus de ARN diferente (por ejemplo, una secuencia del virus del Ébola, una secuencia del virus de la Influenza, una secuencia del virus del SARS, una secuencia del virus de la hepatitis C, una secuencia del virus del Nilo Occidental, una secuencia del virus del Zika, una secuencia del virus de polio o una secuencia del virus del sarampión) o una secuencia de un retrovirus (por ejemplo, una secuencia del HIV-1, una secuencia del HIV-2, una secuencia del HTLV-1, o una secuencia del HTLV-II).
[0087] El virus Sindbis de tipo silvestre pertenece al géneroAlphavirus,familia Togaviridae. El genoma viral tiene aproximadamente 11.700 nucleótidos. Como tal, el virus Sindbis tiene aproximadamente la misma complejidad genómica que muchos virus patógenos humanos, incluidos, por ejemplo, HIV-1 (9270 nucleótidos), HCV (por sus siglas en inglés, 9700 nucleótidos) y el Ébola Zaire (18959 nucleótidos). Esto ofrece una ventaja técnica sobre ciertas otras tecnologías usadas para empaquetar controles de ARN, tales como ARN blindado, que se basan en la tecnología de bacteriófagos MS2 y producen moléculas de ARN recombinante tan pequeñas como 900 bases de longitud, lo que en muchos casos no refleja adecuadamente la complejidad o la estructura secundaria del ARN de los virus patógenos encontrados en las muestras de los pacientes.
[0089] Como se muestra en la Figura 1, el virus Sindbis de tipo silvestre contiene un ARN genómico monocatenario de sentido positivo que codifica tanto las proteínas estructurales virales (para el ensamblaje de la cápside y la gemación viral) como las proteínas no estructurales (tales como las enzimas de replicación). Tras la entrada del virus en una célula, el ARN se libera en el citoplasma e impulsa la producción de las proteínas de la replicasa viral (proteínas no estructurales 1-4). Estas proteínas forman complejos de replicación y transcripción y son responsables de generar la hebra negativa del ARN genómico. Los promotores de la hebra negativa del ARN genómico impulsan la transcripción de dos especies de ARNm: El ARN genómico de longitud completa codifica las proteínas no estructurales y el ARN subgenómico más pequeño codifica las proteínas estructurales. Los extremos 5' de ambos transcritos están protegidos con una caperuza de 7-metilguanosina y los extremos 3' están poliadenilados.
[0091] Los virus recombinantes de control Sindbis descritos en la presente son deficientes en replicación. En algunas realizaciones, se puede usar cualquier método para hacer que la replicación del virus de control Sindbis recombinante sea deficiente. Por ejemplo, en algunas realizaciones el virus de control Sindbis no codifica una o más proteínas estructurales funcionales. En algunas realizaciones, el genoma recombinante del virus de control de Sindbis no codifica una o más proteínas no estructurales funcionales. En algunas realizaciones, el virus de control Sindbis no codifica una proteína nsP1 funcional, una proteína nsP2 funcional, una proteína nsP3 funcional, y/o una proteína nsP4 funcional.
[0093] Como se describe en la presente, la separación del genoma viral de Sindbis en dos ORF facilita la manipulación del genoma viral mediante la sustitución de los genes que codifican las proteínas estructurales por secuencias objetivo. Este ARN genómico modificado puede transcribirsein vitroe introducirse en las células junto con un ARN auxiliar (por ejemplo, que codifique proteínas estructurales no codificadas en el genoma del ARN modificado) para el virus defectuoso. En algunas realizaciones, el ARN auxiliar codifica las cuatro proteínas estructurales necesarias para el empaquetamiento del virus Sindbis. En algunas realizaciones, el ARN auxiliar no contiene una señal de empaquetamiento, por lo que no se incorpora a las partículas virales ensambladas. Así pues, en ciertas realizaciones, las partículas virales producidas contienen las secuencias de direccionamiento pero son defectuosas para la replicación porque no llevan la información genética para producir las proteínas estructurales. Los virus recombinantes producidos son materiales de control de calidad efectivos, ya que llevan las secuencias de direccionamiento seleccionadas, pero el diseño del sistema Sindbis recombinante proporcionado en la presente garantiza que las partículas virales son seguras y no son capaces de establecer una infección continua. Esto supone una clara ventaja para estos materiales frente a los materiales virales procedentes de pacientes o cultivados como controles. La Figura 2 ilustra los ARN transcritos usados para el ensamblaje de virus recombinantes con replicación defectuosa.
[0095] El ensamblaje de la partícula viral se produce en la membrana plasmática. Un heterodímero de las proteínas estructurales, E1 y E2, se inserta en la membrana plasmática y se cree que la cola citoplasmática de E2 proporciona el sitio de unión para la nucleocápside. Se cree que esta interacción entre E2 y la nucleocápside inicia la gemación real y la liberación del virus. Cuando se producen virus Sindbis recombinantes en células cultivadas, las partículas virales se recogen de los medios de cultivo, donde típicamente son mayores a 1x108 copias virales/mL. El proceso de gemación resulta en la envoltura del virus Sindbis recombinante en una bicapa lipídica. Esto es importante, ya que la estructura del virus recombinante es así similar a la de muchos otros virus generalmente clasificados como virus con envoltura que contienen ARN, tales como HIV-1, HCV, HTLV, Influenza y SARS. Por lo tanto, los vectores Sindbis deficientes en replicación descritos en la presente pueden ser un verdadero control de todo el proceso, ya que se someten a lisis de muestras y procesamiento de ácido nucleico similares a los virus patógenos humanos que pueden encontrarse en muestras de pacientes.
[0097] En los virus Sindbis recombinantes, las secuencias de direccionamiento sustituyen a los genes estructurales. Esto confiere al sistema una gran flexibilidad en cuanto al tamaño de las secuencias de direccionamiento que pueden acomodarse y empaquetarse eficientemente. Las secuencias objetivo de menos de 100 pb a más de 4000 pb pueden incorporarse eficientemente a los virus recombinantes. La capacidad de acomodar secuencias de gran tamaño es una clara ventaja, especialmente cuando se producen controles para ensayos multiplexados. Múltiples secuencias de direccionamiento (de diferentes patógenos o de diferentes genes dentro del mismo patógeno) pueden combinarse en un virus recombinante para formar un control multiplexado.
[0099] En algunas realizaciones, los virus de control Sindbis descritos en la presente comprenden la secuencia del HIV-1 y son por lo tanto útiles como control para ensayos de diagnóstico del HIV-1. En algunas realizaciones, la secuencia del HIV-1 en el virus de control Sindbis es distinta de la secuencia del virus HIV-1 de origen natural en el sentido de que contiene mutaciones de resistencia derivadas de múltiples clases de terapias actuales contra el HIV-1. Tales mutaciones multiplexadas no se dan en la naturaleza. En algunas realizaciones, el virus de control tiene las diversas mutaciones de resistencia a fármacos presentes en la misma relación alélica. De este modo, los usuarios tienen una expectativa clara de los resultados de sus pruebas. En ciertas realizaciones, se introducen codones de paro en las secuencias de HIV-1 para que no se produzcan proteínas funcionales del HIV-1.
[0101] En algunas realizaciones, el virus Sindbis recombinante es un virus de control Sindbis del HIV-1 que comprende una secuencia del HIV-1 en su genoma de ARN. En algunas realizaciones, la secuencia del HIV-1 comprende una o más mutaciones que, cuando están presentes en un virus HIV-1, transmiten un fenotipo de resistencia a fármacos (por ejemplo, resistencia a un inhibidor de la proteasa, un inhibidor de la transcriptasa inversa análogo de nucleósido y/o un inhibidor de la transcriptasa inversa no análogo de nucleósido). Por ejemplo, en algunas realizaciones la secuencia del virus HIV-1 comprende al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 mutaciones que transmiten un fenotipo resistente a fármacos. En algunas realizaciones, la una o más mutaciones, cuando están presentes en el virus HIV-1, transmiten resistencia a un fármaco seleccionado del grupo que consiste en: atazanavir, ritonavir, darunavir, fosamprenavir, indinavir, lopinavir, nelfinavir, saquinavir, tipranavir, abacavir, didanosina, emtricitabina, lamivudina, estavudina, tenofovir, zidovudina, efavirenz, etavirina, nevirapina o rilpivirina. En algunas realizaciones, la una o más mutaciones se seleccionan del grupo que consiste en L24I, D30N, V32I, M46I, I47V, G48V, I50V, I54M, G73S, L76V, V82A, I84V, N88D, L90M, M41L, K65R, D67N, T69S inserto SS, K70R, L74V, F77L, Y115F, F116Y, Q151M, M184V, L210W, T215Y, K219Q, L100I, K101E, K103N, V106A, V108I, Y181C, Y188L, G190A, P225H y M230L. En algunas realizaciones, la una o más mutaciones se seleccionan del grupo que consiste en L24I (TTA a ATA), D30N (GAT a AAT), V32I (GTA a ATA), M46I (ATG a ATA), I47V (ATA a CTA), G48V (GGG a GTG), I50V (ATT a GTT), I54M (ATC a ATG), G73S(GGT a GCT), L76V (TTA a GTA), V82A (GTC a GCC), I84V (ATA a GTA), N88D (AAT a GAT), L90M (TTG a ATG), M41L (ATG a TTG), K65R (AAA a AGA), D67N (GAC a AAC), T69S inserto SS (ACT a TCT e inserción de TCC y TCC), K70R (AAA a AGA), L74V (TTA a GTA), F77L (TTC a CTC), Y115F (TAT a TTT), F116Y (TTT a TAT), Q151M (CAG a ATG), M184V (ATG a GTG), L210W (TTG a TGG), T215Y (ACC a TAC), K219Q (AAA a CAA), L100I (TTA a ATA), K101 E (AAA a GAA), K103N (AAA a AAC), V106A (GTA a GCA), V108I (GTA a ATA), Y181C (TAT a TGT), Y188L (TAT a TTA), G190A (GGA a GCA), P225H (CCT a CAT) y M230L (CCT a CAT). En algunas realizaciones, la secuencia del HIV-1 comprende al menos una porción de un gen de HIV-1 seleccionada de p7, p1, p6, proteasa de HIV, transcriptasa inversa, ARNasa p51, integrasa y gp120. En algunas realizaciones, la secuencia del HIV-1 comprende al menos una porción de p7, p1, p6, proteasa de HIV, transcriptasa inversa e integrasa. En ciertas realizaciones, la secuencia del HIV-1 comprende al menos una porción de 6p120, en donde la porción comprende los bucles variables V1-V5. En algunas realizaciones, la secuencia del HIV-1 comprende una secuencia que es al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 % idéntica a los nucleótidos 1900 a 5400 y/o 6300 a 7825 de la cepa HXB2 de HIV-1 (SEQ ID NO: 4). En algunas realizaciones, la secuencia del HIV-1 es idéntica a los nucleótidos 1900 a 5400 y/o 6300 a 7825de la cepa HXB2 de HIV-1 (SEQ ID NO: 4) excepto por la presencia de las mutaciones que transmiten un fenotipo de resistencia a fármacos. En algunas realizaciones, la secuencia de ARN heterólogo comprende una secuencia al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 5 y/o la SEQ ID NO: 7. En algunas realizaciones, la secuencia de ARN heterólogo comprende una secuencia al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 6 y/o la SEQ ID NO: 8.
[0103] En algunas realizaciones, los virus de control Sindbis descritos en la presente comprenden la secuencia del virus del Ébola y por lo tanto son útiles como control para ensayos de diagnóstico del virus del Ébola. En algunas realizaciones, la secuencia del virus del Ébola comprende al menos una porción de una secuencia génica GP de virus del Ébola, una secuencia génica NP de virus del Ébola, o una secuencia génica VP24 de virus del Ébola. En algunas realizaciones, la secuencia de ARN heteróloga no codifica una proteína de Ébola funcional (por ejemplo, la secuencia de ARN heteróloga codifica proteínas de Ébola truncadas, proteínas de Ébola con mutaciones de desplazamiento de marco y/o secuencias de proteínas del ébola que carecen de un codón de inicio). En algunas realizaciones, la secuencia de ARN heterólogo comprende una secuencia al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 % idéntica a la SEQ ID<n>O: 2 o la SEQ ID NO: 3.
[0105] Los virus de control Sindbis descritos en la presente pueden generarse usando cualquier método conocido en la técnica. En la Figura 3 se ilustra un método ejemplar para generar los virus de control Sindbis descritos en la presente. En este método ejemplar, primero se sintetizan los transcritosin vitroprotegidos con una caperuza del ARN recombinante que contiene la secuencia de interés y el ARN auxiliar. Posteriormente, los ARN sintetizados se electroporan en una célula adecuada, tal como una célula BHK. Las proteínas estructurales de Sindbis se expresan, pero como el ARN no codifica las enzimas de la replicasa, no se transcribe nuevo ARN. El ARN recombinante es empaquetado por las proteínas de la cápside. Las glicoproteínas virales se asocian con la nucleocápside y las partículas virales se geman en el medio de cultivo. Posteriormente, se recolecta el sobrenadante del cultivo, se filtra y se inactiva por calor. Posteriormente, se puede determinar el título viral usando un método apropiado, tal como la PCR en tiempo real, y se pueden realizar pruebas de control de calidad apropiadas para garantizar que el ARN está completamente encapsulado y que no hay ADN molde contaminante.
[0106] Uso de vectores de control Sindbis en ensayos de diagnóstico de ácidos nucleicos
[0108] En ciertos aspectos, se proporcionan en la presente métodos para probar un ensayo de diagnóstico para la detección de un virus que contiene ARN de no-Sindbis con envoltura o un retrovirus que comprende realizar el ensayo de diagnóstico en una composición que comprende el virus de Sindbis de replicación deficiente descrito en la presente, en donde la prueba de diagnóstico es un ensayo de diagnóstico basado en la amplificación de ácidos nucleicos o un ensayo de diagnóstico basado en la secuenciación de ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, el ensayo de diagnóstico es un ensayo para la detección de virus del Ébola, un virus de la Influenza, un virus del SARS, un virus de la hepatitis C, un virus del Nilo Occidental, un virus del Zika, un virus de polio, un virus del sarampión, un virus HIV-1, un virus HIV-2, un virus HTLV-I, y/o un virus HTLV-II. En ciertas realizaciones, la secuencia de ARN heteróloga en el genoma de ARN del virus Sindbis de replicación deficiente contiene la secuencia de direccionamiento detectada en el ensayo de diagnóstico.
[0110] En algunas realizaciones, el ensayo de diagnóstico es un ensayo de diagnóstico basado en la amplificación de ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, el ensayo de diagnóstico basado en la amplificación de ácidos nucleicos incluye un paso de lisis de la muestra, un paso de extracción de ácidos nucleicos (por ejemplo, un paso de extracción de ácidos nucleicos basado en microesferas magnéticas), un paso de amplificación de ácidos nucleicos y/o un paso de detección de ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, los pasos de amplificación y detección del ácido nucleico se llevan a cabo simultáneamente (por ejemplo, mediante el uso de una tecnología de detección en tiempo real, tal como sondas TaqMan o balizas moleculares). Los ejemplos de procesos de amplificación de ácidos nucleicos incluyen, pero no se limitan a, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), LATE-PCR un método de amplificación por PCR no simétrica, reacción en cadena de la ligasa (LCR), amplificación por desplazamiento de hebra (SDA), amplificación mediada por transcripción (TMA), replicación de secuencia autosostenida (3SR), amplificación basada en replicasa Qp, amplificación basada en secuencia de ácido nucleico (NASBA), reacción en cadena de reparación (RCR), amplificación de ADN boomerang (BDA) y/o amplificación de círculo rodante (RCA); (por sus siglas en inglés, respectivamente).
[0112] En algunas realizaciones, el ensayo de diagnóstico es un ensayo de diagnóstico basado en la secuenciación de ácidos nucleicos (por ejemplo, un ensayo de diagnóstico basado en la secuenciación de próxima generación). En algunas realizaciones, el ensayo de diagnóstico basado en la secuenciación de ácidos nucleicos incluye un paso de lisis de la muestra, un paso de extracción de ácidos nucleicos (por ejemplo, un paso de extracción de ácidos nucleicos basado en microesferas magnéticas), un paso de amplificación de ácidos nucleicos y/o un paso de secuenciación de ácidos nucleicos. Los ejemplos de procesos de secuenciación de ácidos nucleicos son, pero no se limitan a, la secuenciación por terminación en cadena, la secuenciación por ligadura, la secuenciación por síntesis, la pirosecuenciación, la secuenciación por semiconductores iónicos, la secuenciación en tiempo real de una sola molécula, la secuenciación 454 y/o la secuenciación Dilute-'N'-Go (por su nombre en inglés).
[0114] Ejemplos
[0116] Ejemplo 1 - Producción de un virus de control Sindbis del Ébola
[0118] El Ébola es un Filovirus con un genoma de hebra única de ARN de sentido negativo. El genoma del virus del Ébola incluye el gen de la glicoproteína (GP) y el gen de la nucleoproteína (NP); estos dos genes eran los objetivos de ensayos de diagnóstico basados comúnmente en ácidos nucleicos.
[0120] El virus de control Sindbis del Ébola se generó para servir de control en tales ensayos de diagnóstico. Los constructos recombinantes de Sindbis se diseñaron al clonar aproximadamente 2 kb de la secuencia del gen GP del Ébola Zaire (SEQ ID NO: 9) o aproximadamente 1,5 kb de secuencia del gen NP y aproximadamente 0,5 kb de un tercer gen del Ébola, VP24 (SEQ ID NO: 10) en el sitio de restricción Xba I de un vector SinRep SC (SEQ ID NO: 1). Para garantizar que no se produjeran proteínas funcionales del Ébola, los constructos se diseñaron para codificar secuencias genéticas GP y NP severamente truncadas. Los constructos GP también carecían del codón de inicio AUG para la iniciación de la traducción y el constructo NP contenía una gran deleción interna que cambia el marco de lectura. En ambos constructos se introdujeron codones de paro modificados. Estas medidas aumentan la seguridad del producto, pero no interfieren con la detección del objetivo (unión del cebador y la sonda) de los ensayos de diagnóstico dirigidos.
[0122] La SEQ ID NO: 9 es un genoma completo ejemplar del virus de control de Sindbis de GP del Ébola. Los nucleótidos 1 a 7652 y 9708 a 10080 de la SEQ ID NO: 9 son secuencias del gen Sindbis, y los nucleótidos 7653 a 9707 de la SEQ ID NO: 9 son secuencias de inserción de GP del Ébola. La SEQ ID NO: 10 es un genoma completo ejemplar del virus de control Sindbis de NP/VP24 del Ébola. Los nucleótidos 1 a 7652 y 9976 a 10348 de la SEQ ID NO: 10 son secuencias del gen Sindbis, y los nucleótidos 7653 a 9975 de la SEQ ID NO: 10 son secuencias de inserción de NP/VP24 del virus del Ébola.
[0124] El ARN protegido con caperuza del virus de control Sindbis del Ébola se transcribióin vitrojunto con el ARN auxiliar y se introdujo en células de riñón de hámster bebé. A las 24 horas de la transfección, se recolectó el sobrenadante celular y se purificaron y concentraron las partículas virales. El tratamiento con calor se realizó usando un tiempo y una temperatura conocidos para inactivar virus de ARN similares como precaución de seguridad adicional. Después de titular los virus mediante un ensayo de PCR de transcripción inversa TaqMan, se combinaron los virus y se diluyeron en plasma humano desfibrinado que contenía ADN genómico humano y azida de sodio al 0,09 % como conservantes.
[0126] Se probaron tres lotes independientes del virus de control de Sindbis del Ébola en un ensayo de diagnóstico basado en la amplificación de ácidos nucleicos en tiempo real desarrollado para la detección del virus del Ébola Zaire. El material de control se procesó de forma idéntica a como se procesaría una muestra de un paciente desconocido. Los resultados representativos de este ensayo se muestran en la Tabla 1. En esta tabla, Ct es el valor umbral del ciclo y SAC (por sus siglas en inglés) s el control de adecuación de la muestra (que verifica el ADN de origen humano en la muestra).
[0128] T l 1. Vir nr l in i l É l r n n n i n i i n l É l .
[0130]
[0133] Ejemplo 2 - Estabilidad de un virus de control Sindbis del Ébola
[0135] La estabilidad de los materiales de control de calidad es fundamental, sobre todo si se tiene en cuenta que, en muchos sistemas automatizados, los reactivos se cargan en el instrumento y deben ser estables a temperatura ambiente por periodos prolongados. Así, se probó la estabilidad del virus de control Sindbis del Ébola producido como se describe en el Ejemplo 1 en diversas condiciones de almacenamiento.
[0137] Los viales del virus de control Sindbis del Ébola producidos como se describe en el Ejemplo 1 se sometieron a 37 °C. En los puntos temporales designados, los viales se retiraron de la condición de estrés y se extrajeron usando el kit Qiagen QIAamp Viral RNA Mini Kit. Las pruebas se realizaron mediante un ensayo de PCR cuantitativa en tiempo real TaqMan. Los resultados se muestran en la Figura 4 e indican que no hay pérdida de estabilidad después de 22 días a 37 °C. Usando un modelo basado en la ecuación de Arrhenius, esta estabilidad a 37 °C se correlaciona con una estabilidad a una temperatura de almacenamiento de 2-8 °C de al menos 2 años.
[0139] Los viales del virus de control Sindbis del Ébola producidos como se describe en el Ejemplo 1 se sometieron a múltiples rondas de congelación y descongelación (F/T, por sus siglas en inglés). Como se muestra en la Figura 5, someter el virus de control Sindbis a tres ciclos de congelación-descongelación no tuvo un efecto adverso sobre la estabilidad del virus.
[0141] Para probar la estabilidad prolongada de un vector de control Sindbis a varias temperaturas, se diluyó un virus Sindbis recombinante (con 0,8 Kb de secuencia de direccionamiento) en plasma humano desfibrinado a una concentración objetivo de 5x105 copias/mL. El material se dispensó en viales y los viales se almacenaron congelados a -20 °C, refrigerados a 2-8 °C o a temperatura ambiente de laboratorio (aproximadamente 25 °C) por un máximo de 200 días. Los viales se probaron periódicamente usando una prueba de PCR en tiempo real TaqMan. No se detectó ninguna pérdida de estabilidad a lo largo de los siete meses de almacenamiento, ni siquiera en las muestras almacenadas a temperatura ambiente. Esto demuestra que las proteínas de recubrimiento viral y la envoltura del virus Sindbis forman una barrera protectora estable que previene que las nucleasas en matrices clínicas complejas tales como el plasma degraden la secuencia de ARN objetivo.
[0143] Ejemplo 3 - Producción del virus de control Sindbis del HIV-1 de resistencia múltiple a fármacos
[0145] Se generó un virus de control Sindbis para usarlo en ensayos de diagnóstico para la detección de virus HIV-1 resistentes a fármacos. Se usó la base de datos de secuencias de HIV del Laboratorio Nacional de Los Álamos para generar una “secuencia de referencia” para el virus de control. Basado en esta base de datos, así como en la publicación Special Contribution Update of the Drug Resistance Mutations in HIV-1: marzo de 2013 por Victoria A. Johnsonet al.,enTopics in Antiviral Medicine,se identificaron mutaciones en el genoma de HIV-1 que confieren resistencia a qué fármacos terapéuticos. Estas mutaciones y fármacos se resumen en la Tabla 2.
[0146] Tabla 2. Mutaciones de HIV resistente a fármacos incluidas en el virus de control Sindbis de HIV-1 de resistencia múlti le a fármacos.
[0149]
[0152] Además de las mutaciones descritas anteriormente, los fármacos inhibidores de la entrada del virus tales como Miraviroc se bloquean por mutaciones en el gen de la envoltura. Este fármaco es un antagonista del receptor 5 de la quimiocina CC (CCR5, por sus siglas en inglés) y solamente es efectivo para pacientes con virus que usan el correceptor CCR5 para la entrada viral. Los virus que usan tanto el CCR5 como el receptor de quimiocina CXC 4 (CXCR4, por sus siglas en inglés) o solamente el CXCR4 no responderán al tratamiento con antagonistas del CCR5. La capacidad de un virus para usar el correceptor CXCR4 no viene definida por una única mutación, sino que viene determinada por la secuencia de varios “bucles” variables en el gen de la envoltura de la gp120.
[0154] La cepa HXB2 de HIV-1 es un virus que usa CXCR4. La secuencia de HXB2 está disponible en la base de datos de secuencias de HIV del Laboratorio Nacional de Los Álamos. Su secuencia se usó en el desarrollo del virus recombinante que representa el virus mutante CXCR4. La cepa BaL del HIV-1 usa exclusivamente el correceptor CCR5. Su secuencia se obtuvo de la base de datos del NCI (por sus siglas en inglés) y se usó en el desarrollo del virus Sindbis recombinante que representa al virus CCR5 de tipo silvestre.
[0156] Se sintetizaron químicamente cuatro secuencias de ADN y se clonaron en el sitio de restricción Xba I de un plásmido de expresión SinRep SC Sindbis (SEQ ID NO: 1), que contiene genes necesarios para la producción del virus Sindbis. Se generaron cuatro virus de control Sindbis, uno que contenía el extremo 5' de un genoma del HIV-1 de tipo silvestre, otro que contenía el extremo 5' de un genoma viral del HIV-1 resistente a múltiples fármacos, otro que contenía el extremo 3' de un genoma del HIV-1 de tipo silvestre, y otro que contenía el extremo 3' de un genoma viral del HIV-1 resistente a múltiples fármacos. Las secuencias de inserción de estos cuatro virus de control se describen en la Tabla 3.
[0158] Tabla 3. Descri ción de secuencias de virus recombinantes.
[0160]
[0163] La SEQ ID NO: 11 es la contraparte de ADN de un genoma completo 5' multimutante ejemplar del virus de control Sindbis de HIV-1. Los nucleótidos 1 a 7646 y 11167 a 11655 indican secuencias de genes de Sindbis, y los nucleótidos 7647 a 11166 indican secuencias de inserción multimutante de HIV-1. La SEQ ID NO: 12 es la contraparte de ADN de un genoma completo ejemplar 5' del virus de control Sindbis del HIV-1 de tipo silvestre. Los nucleótidos 1 a 7646 y 11161 a 11649 indican secuencias del gen Sindbis, y los nucleótidos 7647 a 11160 indican secuencias de inserción del HIV-1 de tipo silvestre. La SEQ ID NO: 13 es la contraparte de ADN de un genoma de control del virus HIV-1 Sindbis mutante 3' completo ejemplar. Los nucleótidos 1 a 7646 y 9187 a 9675 indican secuencias del gen Sindbis, y los nucleótidos 7647 a 9186 indican secuencias de inserción mutantes del HIV-1. La SEQ ID NO: 14 es la contraparte de ADN de un genoma completo ejemplar 3' del virus de control Sindbis del HIV-1 de tipo silvestre. Los nucleótidos 1 a 7646 y 9182 a 9670 indican secuencias del gen Sindbis, y los nucleótidos 7647 a 9181 indican secuencias de inserción del HIV-1 de tipo silvestre.
[0165] El proceso usado para producir los virus recombinantes de control Sindbis del HIV-1 se describe en la Figura 7. Brevemente, los plásmidos que contienen las secuencias de HIV-1 objetivo en el vector SinRep se linealizaron con la enzima de restricción Not I. Se analizó una alícuota mediante electroforesis en gel de agarosa para garantizar que el corte del ADN es completo.
[0167] El kit Ambion mMessage mMachine SP6 se usó para la transcripciónin vitrode grandes cantidades de ARN protegido con caperuza usando condiciones de reacción optimizadas para transcritos largos. El DHBB (por sus siglas en inglés) es un ARN auxiliar necesario para el empaquetamiento del virus Sindbis de replicación defectuosa; este ARN auxiliar también se transcribió a partir de un plásmido linealizado. La integridad e identidad del ARN transcrito se analizó por electroforesis en gel de agarosa desnaturalizante. El ARN se trató con ADNasa para eliminar el ADN plasmídico de plantilla y se purificó usando el kit Ambion MegaClear.
[0169] Para garantizar una viabilidad celular óptima, las células BHK-21 (células renales de hámster bebé) se amplificaron en cultivo por 2-4 pasajes después de la reactivación de la cepa congelada. Inmediatamente antes de la electroporación, se redujo el suero fetal bovino en los medios de cultivo, lo que ayuda a reducir la tendencia de esta célula a formar grumos. Prevenir la aglomeración celular es deseable para maximizar la eficiencia de la transfección durante la electroporación.
[0171] El ARN transcritoin vitrose introdujo en las células BHK-21 mediante electroporación. Las células se lavaron 6 horas después de la transfección para eliminar el ARN no incorporado.
[0173] Los ARN transcritosin vitro(secuencias del HIV-1 en el ARN SinRep y el ARN auxiliar DHBB) se tradujeron dentro de las células para producir las proteínas necesarias para el ensamblaje y la gemación del virus Sindbis recombinante. Los virus recombinantes se liberaron en los medios de cultivo. Los medios de cultivo se recolectaron 24 horas después de la transfección. El sobrenadante viral bruto y los virus purificados fueron titulados por la extracción de los ácidos nucleicos virales usando el kit Qiagen QIAamp Viral RNA mini kit y posteriormente usando el ensayo cuantitativo TaqMan de PCR en tiempo real que tiene como objetivo una porción del ARN del vector viral Sindbis.
[0175] Ejemplo 4 - Producción de un virus de control Sindbis del Zika
[0177] El virus del Zika es una molécula de ARN monocatenario de sentido positivo de aproximadamente 10794 bases de longitud, y codifica una única poliproteína que posteriormente se escinde en cápside (C), membrana precursora (prM), envoltura (E) y proteínas no estructurales (NS); (por sus siglas en inglés, respectivamente). Los materiales de referencia del virus del Zika se diseñaron basados en una cepa del virus del Zika de 2007 del GenBank con número de acceso EU545988.1 (SEQ ID NO: 15). Para los materiales de referencia del Zika, este genoma se dividió en cuatro constructos diferentes con un solapamiento mínimo de ~ 150 pb entre constructos y puntos de rotura en los extremos de los dominios conservados. El diseño del solapamiento se muestra en las Figuras 9 y 10.
[0178] Había un solapamiento de 152 pb entre el constructo “Zika Env” y “Zika NS2/NS3”, de 150 pb entre “Zika NS2/NS3” y “Zika NS4” y de 180 pb entre los constructos “Zika NS4” y “Zika NS5”. Estos solapamientos están diseñados para cubrir cualquier ensayo de diagnóstico que tenga como objetivo los extremos de los dominios conservados. Los cuatro constructos se sintetizaron e introdujeron en plásmidos Sindbis, que se usaron para preparar virus Sindbis recombinantes.
[0180] Se expresaron los virus Zika/Sindbis recombinantes y se prepararon soluciones madre de alto título de los virus. Las soluciones madre de título alto del virus Zika/Sindbis recombinante se diluyeron 1:100 en PBS, y el ARN se extrajo y eluyó en 120 pL de amortiguador AVE diluido 1:10 (por sus siglas en inglés, respectivamente). El ARN extraído se ensayó por PCR digital en gotitas usando una mezcla maestra RT-ddPCR de un paso (por sus siglas en inglés, Bio-Rad, 186-4021) en diluciones puras y 1:10. Para cuantificar los cuatro constructos se usaron conjuntos de cebadores/sondas específicos para cada vector, como se muestra en la Tabla 4.
[0182] Tabla 4. Cuantificación del número de copias de constructos del virus de Zika en materiales de referencia del virus de Zika.
[0184]
[0187] Basado en la concentración stock de título alto, se formuló un granel de 35 mL a 5,0E+05 copias/mL en plasma humano filtrado (Basematrix) que contiene 0,09 % de diluyente NaN3 y ADN genómico humano (ADN H9, 50 ng/mL). Para filtrar el plasma se usó una cápsula filtrante Pall Acropak 1000 (PES RM-1002220). A 900 mL de plasma filtrado, se añadieron 810 mg de azida de sodio y 45 pg de ADN genómico humano y se mezclaron por 15 minutos. Los cuatro constructos tenían como objetivo 5,0E+05 copias/mL en la masa preparada. El ARN se extrajo por triplicado y se ensayó por ddPCR con una mezcla maestra One-Step RT-PCR de Bio-Rad Laboratories (No. catálogo 186-4021). Se usaron cebadores/sondas específicos del ensayo para cuantificar cada constructo. Los datos se muestran en la Tabla 5.
[0189] Tabla 5. Cuantificación del número de copias de constructos del virus de Zika en materiales de referencia del virus
[0191]
[0192]
[0195] Se realizó un ensayo RT-PCR Altona Realstar Zika con el ARN extraído del granel preparado. El ensayo Altona Zika RT-PCR es un ensayo cualitativo que da un resultado Positivo o Negativo como se muestra en la Tabla 6. Los datos se muestran tanto para el Zika como para los analitos de control interno. El control interno (IC Zika (JOE, por sus siglas en inglés)) debe detectarse en todos los pozos negativos y positivos para obtener un resultado válido, mientras que la señal Zika (Zika (FAM, por sus siglas en inglés)) debe detectarse solamente en los pozos positivos. La prueba se realizó en cinco réplicas con valores de Ct alrededor de 28. El control negativo era indeterminado, como era de esperar, y el control positivo Ct era 32.
[0197] Tabla 6. Ensayo Altona Realstar Zika RT-PCR realizado con materiales de referencia del virus de Zika formulados n l m h m n .
[0199]
[0202] Se enviaron 6 mL del granel preparado a un laboratorio comercial para realizar pruebas de carga biológica. El resultado de la carga biológica fue de 0 UFC/mL para el crecimiento bacteriano y los materiales de referencia Zika superaron los criterios de aceptación (< 100 UFC/mL o Sin crecimiento).
[0204] El ARN viral extraído del virus Sindbis recombinante se verificó por una secuenciación Sanger. Los cuatro constructos se amplificaron por PCR al principio y al final del inserto, y cada secuencia de nucleótidos mostró una homología de secuencia de 100 % con la secuencia EU545988.1 usada para diseñar los constructos (SEQ ID NO: 15).
[0206] Ejemplo 5 - Estabilidad de un virus de control Sindbis de Influenza
[0208] Se construyó un material de referencia de la Influenza que comprendía una secuencia de 800 nucleótidos del virus de la Influenza H7N9 usando métodos similares a los descritos anteriormente. El material de referencia de la Influenza se diluyó en amortiguador acuoso o plasma humano desfibrinado a 5x105 copias/mL en una matriz conmutable. El material se dispensó en viales y se almacenó a -20 °C, 4 °C o temperatura ambiente (~25 °C). Los viales se sometieron a pruebas periódicas usando una prueba de PCR en tiempo real TaqMan para H7N9 desarrollada en el laboratorio. Como se muestra en las Figuras 11 y 12, el material de referencia de la Influenza almacenado a temperatura ambiente por 500 días fue estable, ya que sólo se observó una pérdida de señal de ~15 %. Este perfil de estabilidad sugiere que las proteínas de recubrimiento y envoltura virales forman una barrera protectora estable que previene que las nucleasas en matrices clínicas complejas (tales como el plasma) degraden la secuencia de ARN objetivo.
[0210] Equivalentes
[0212] Los expertos en la técnica reconocerán, o podrán determinar usando no mayor a la experimentación rutinaria, muchos equivalentes a las realizaciones específicas descritas en la presente.

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES
1. Uso de un virus Sindbis recombinante de replicación deficiente, que comprende un genoma de ARN:
un marco abierto de lectura (ORF) que codifica proteínas no estructurales funcionales de Sindbis; y
una secuencia de ARN heteróloga, en donde la secuencia de ARN heteróloga comprende al menos 50 pb de una secuencia del virus de ARN no-Sindbis con envoltura o una secuencia del retrovirus;
como control en un ensayo de diagnóstico de ácidos nucleicos para la detección de un virus que contiene ARN de no-Sindbis con envoltura o de un retrovirus.
2. El uso de un virus Sindbis recombinante de replicación deficiente de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el ORF codifica proteínas no estructurales funcionales de Sindbis:
(a) está ubicado en 5' de la secuencia de ARN heteróloga; y/o
(b) tiene una secuencia de nucleótidos que es al menos 90 % idéntica a los nucleótidos 1-7648 de la SEQ ID NO: 1 ; y/o
(c) tiene una secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 1-7648 de la SEQ ID NO: 1.
3. El uso de un virus Sindbis recombinante de replicación deficiente de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde:
(a) el genoma de ARN carece de una secuencia que codifique una versión funcional de una o más de las proteínas estructurales de Sindbis, opcionalmente en donde el genoma de ARN carece de una secuencia de ARN que codifique una proteína estructural funcional de Sindbis; o
(b) la secuencia de ARN heterólogo sustituye al ORF que codifica las proteínas estructurales de Sindbis en el genoma del ARN.
4. El uso de un virus Sindbis recombinante de replicación deficiente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde:
(a) el ORF de proteína no estructural codifica una proteína nsP1, una proteína nsP2, una proteína nsP3 y una proteína nsP4; y/o
(b) el genoma de ARN comprende un promotor subgenómico 26S en el extremo 3' del ORF que codifica las proteínas no estructurales de Sindbis.
5. El uso de un virus Sindbis recombinante de replicación deficiente de acuerdo con las reivindicaciones 1-4, en donde:
(a) la secuencia del virus de ARN no-Sindbis o una secuencia del retrovirus comprende una o más, o al menos 5, o al menos 10 mutaciones que transmiten resistencia a fármacos cuando se producen en el virus de ARN no-Sindbis o el retrovirus; y/o
(b) la secuencia de ARN heteróloga comprende al menos 100 pb, o 100-330 kb de una secuencia del virus de ARN no-Sindbis o una secuencia del retrovirus.
6. El uso del virus Sindbis recombinante de replicación deficiente de acuerdo con las reivindicaciones 1 -5, en donde la secuencia del virus de ARN no-Sindbis con envoltura es una secuencia del virus del Ébola, una secuencia del virus de la Influenza, una secuencia del virus del SARS, una secuencia del virus de la hepatitis C, una secuencia del virus del Nilo Occidental, una secuencia del virus del Zika, o una secuencia del virus del sarampión; opcionalmente:
(a) en donde la secuencia del virus del Ébola es una secuencia del virus del Ébola Zaire, una secuencia del virus del Ébola Bundibugyo, una secuencia del virus del Ébola Reston, una secuencia del virus del Ébola Sudán, o una secuencia del virus del Ébola Tai Foresb y/o
(b) en donde la secuencia del virus del Ébola comprende al menos una porción de una secuencia génica GP del virus del Ébola, una secuencia génica NP del virus del Ébola o una secuencia génica VP24 del virus del Ébola; y/o (c) en donde la secuencia de ARN heterólogo no codifica una proteína funcional del Ébola, opcionalmente en donde la secuencia de ARN heterólogo codifica proteínas del Ébola truncadas, proteínas del Ébola con mutaciones de desplazamiento de marco o secuencias de proteínas del Ébola que carecen de un codón de inicio; y/o
(d) en donde la secuencia del virus del Ébola es una secuencia del virus del Ébola Zaire, la secuencia de ARN heteróloga comprende una secuencia al menos 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 3, opcionalmente en donde la secuencia de ARN heterólogo comprende la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 3.
7. El uso de un virus Sindbis recombinante de replicación deficiente de acuerdo con la reivindicación 1-5 en donde la secuencia del retrovirus es una secuencia del HIV-1, una secuencia del HIV-2, una secuencia del HTLV-1, o una secuencia del HTLV-II.
8. El uso de un virus Sindbis recombinante de replicación deficiente de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la secuencia del retrovirus es una secuencia del HIV-1, opcionalmente:
(a) en donde la secuencia del HIV-1 comprende una o más mutaciones que, cuando están presentes en un virus HIV-1, transmiten un fenotipo de resistencia a fármacos,
opcionalmente, en donde la mutación, cuando está presente en el virus HIV-1, transmite resistencia a un inhibidor de la proteasa, a un inhibidor de la transcriptasa inversa análogo de nucleósido, o a un inhibidor de la transcriptasa
inversa no análogo de nucleósido,
opcionalmente, en donde la mutación, cuando está presente en el virus HIV-1, transmite resistencia a un fármaco seleccionado del grupo que consiste en: atazanavir, ritonavir, darunavir, fosamprenavir, indinavir, lopinavir, nelfinavir, saquinavir, tipranavir, abacavir, didanosina, emtricitabina, lamivudina, estavudina, tenofovir, zidovudina, efavirenz, etavirina, nevirapina o rilpivirina; y/o
(b) en donde la secuencia del HIV-1 codifica una o más mutaciones, al menos 5 mutaciones, o al menos 10 mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en L24I, D30N, V32I, M46I, I47V, G48V, I50V, I54M, G73S, L76V, V82A, I84V, N88D, L90M, M41L, K65R, D67N, T69S insertar SS, K70R, L74V, F77L, Y115F, F116Y, Q151M, M184V, L210W, T215Y, K219Q, L100I, K101E, K103N, V106A, V108I, Y181C, Y188L, G190A, P225H y M230L; y/o
(c) en donde la secuencia del HIV-1 codifica una o más mutaciones, al menos 5 mutaciones, o al menos 10 mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en L24I (TTA a ATA), D30N (GAT a AAT), V32I (GTA a ATA), M46I (ATG a ATA), I47V (ATA a CTA), G48V (GGG a GTG), I50V (ATT a GTT), I54M (ATC a ATG), G73S(GGT a GCT), L76V (TTA a GTA), V82A (GTC a GCC), I84V (ATA a GTA), N88D (AAT a GAT), L90M (TTG a ATG), M41L (ATG a TTG), K65R (AAA a AGA), D67N (GAC a AAC), T69S inserto SS (ACT a TCT e inserción de TCC y TCC), K70R (AAA a AGA), L74V (TTA a GTA), F77L (TTC a CTC), Y115F (TAT a TTT), F116Y (TTT a TAT), Q151M (CAG a ATG), M184V (ATG a GTG), L210W (TTG a TGG), T215Y (ACC a TAC), K219Q (AAA a CAA), L100I (TTA a ATA), K101E (AAA a GAA), K103N (AAA a AAC), V106A (GTA a GCA), V108I (GTA a ATA), Y181C (TAT a TGT), Y188L (TAT a TTA), G190A (GGA a GCA), P225H (CCT a CAT) y M230L (CCT a CAT).
9. El uso de un virus Sindbis recombinante de replicación deficiente de acuerdo con la reivindicación 8, en donde: (a) la secuencia del HIV-1 comprende al menos una porción de:
- un gen de HIV-1 seleccionado de p7, p1, p6, proteasa de HIV, transcriptasa inversa, ARNasa p51, integrasa y gp120;o
- p7, p1, p6, proteasa de HIV, transcriptasa inversa e integrasa; o
- 6p120, en donde la porción comprende los bucles variables V1-V5;
(b) la secuencia del HIV-1 comprende una secuencia que es al menos 90 % idéntica a los nucleótidos 1900 a 5400 de la SEQ ID NO: 4;
(c) la secuencia del HIV-1 comprende una secuencia idéntica a los nucleótidos 1900 a 5400 de la SEQ ID NO: 4; (d) la secuencia del HIV-1 comprende una secuencia que es al menos 90 % idéntica a los nucleótidos 6300 a 7825 de la SEQ ID NO: 4;
(e) la secuencia del HIV-1 comprende una secuencia idéntica a los nucleótidos 6300 a 7825 de la SEQ ID NO: 4; en donde la SEQ ID NO: 4 es la secuencia de nucleótidos de la cepa HXB2 de HIV-1.
10. El uso de un virus Sindbis de replicación deficiente de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la secuencia de ARN heteróloga comprende:
(a) una secuencia al menos 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 5;
(b) la SEQ ID NO: 5;
(c) una secuencia 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 6;
(d) la SEQ ID NO: 6;
(e) una secuencia 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 7;
(f) la SEQ ID NO: 7;
(g) una secuencia 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 8;
(h) la SEQ ID NO: 8.
11. El uso de un virus Sindbis de replicación deficiente de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el genoma de ARN comprende:
(a) una secuencia de nucleótidos que es al menos 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10;
(b) la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10;
(c) una secuencia de nucleótidos que es al menos 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 11;
(d) la SEQ ID NO: 11;
(e) una secuencia de nucleótidos que es al menos 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 12;
(f) la SEQ ID NO: 12;
(g) una secuencia de nucleótidos que es al menos 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 13;
(h) la SEQ ID NO: 13;
(i) una secuencia de nucleótidos que es al menos 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 14;
(j) la SEQ ID NO: 14;
(k) una secuencia de nucleótidos que es al menos 90 % idéntica a los nucleótidos 1-3446 de la SEQ ID NO: 15; los nucleótidos 3294-5575 de la SEQ ID NO: 15; los nucleótidos 5425-7722 de la SEQ ID NO: 15; o los nucleótidos 7542-10272 de la SEQ ID NO: 15;
(l) los nucleótidos 1-3446 de la SEQ ID NO: 15; los nucleótidos 3294-5575 de la SEQ ID NO: 15; los nucleótidos 5425-7722 de la SEQ ID NO: 15; o los nucleótidos 7542-10272 de la SEQ ID NO: 15.
12. Uso de una composición como control en un ensayo de diagnóstico de ácidos nucleicos para la detección de un virus de ARN no-Sindbis con envoltura o un retrovirus, en donde la composición comprende un virus Sindbis de replicación deficiente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y un fluido corporal humano.
13. Uso de una composición como control en un ensayo de diagnóstico de ácidos nucleicos para la detección de un virus de ARN no-Sindbis con envoltura o un retrovirus, en donde el virus de ARN no-Sindbis con envoltura o un retrovirus es el HIV y la composición comprende:
(a) un virus Sindbis de replicación deficiente que comprende un genoma de ARN con una secuencia que es al menos 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 11; y un virus Sindbis de replicación deficiente que comprende un genoma de ARN con una secuencia que es al menos 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 13;
(b) un virus Sindbis de replicación deficiente que comprende un genoma de ARN que comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 11; y un virus Sindbis de replicación deficiente que comprende un genoma de ARN que comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 13;
(c) un virus Sindbis de replicación deficiente que comprende un genoma de ARN con una secuencia que es al menos 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 12; y un virus Sindbis de replicación deficiente que comprende un genoma de ARN con una secuencia que es al menos 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 14; o
(d) un virus Sindbis de replicación deficiente que comprende un genoma de ARN que comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 12; y un virus Sindbis de replicación deficiente que comprende un genoma de ARN que comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 14;
y en donde el virus Sindbis de replicación deficiente se encuentra en un fluido corporal humano.
14. El uso de una composición de acuerdo con la reivindicación 12 o la reivindicación 13, en donde el fluido corporal humano es;
(a) plasma humano; o
(b) plasma humano desfibrinado;
opcionalmente, en donde la composición comprende además azida de sodio;
opcionalmente, en donde la composición comprende además ADN humano.
15. Un método de prueba de un ensayo de diagnóstico para la detección de un virus que contiene ARN de no-Sindbis con envoltura o un retrovirus, que comprende realizar el ensayo de diagnóstico en una composición de acuerdo con las reivindicaciones 12-14, en donde el ensayo de diagnóstico es un ensayo de diagnóstico basado en la amplificación de ácidos nucleicos o un ensayo de diagnóstico basado en la secuenciación de ácidos nucleicos.
ES16812140T 2015-06-19 2016-06-03 Sindbis control virus Active ES3046235T3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562182104P 2015-06-19 2015-06-19
PCT/US2016/035751 WO2016204983A1 (en) 2015-06-19 2016-06-03 Sindbis control virus

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES3046235T3 true ES3046235T3 (en) 2025-12-01

Family

ID=57545622

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES16812140T Active ES3046235T3 (en) 2015-06-19 2016-06-03 Sindbis control virus

Country Status (5)

Country Link
US (2) US20190002838A1 (es)
EP (1) EP3310368B1 (es)
DK (1) DK3310368T3 (es)
ES (1) ES3046235T3 (es)
WO (1) WO2016204983A1 (es)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20230398200A1 (en) * 2020-07-31 2023-12-14 Replicate Bioscience, Inc. Modified chikungunya viruses and sindbis viruses and uses thereof

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6458560B1 (en) * 1996-04-05 2002-10-01 Chiron Corporation Recombinant alphavirus-based vectors with reduced inhibition of cellular macromolecular synthesis
US5811407A (en) * 1997-02-19 1998-09-22 The University Of North Carolina At Chapel Hill System for the in vivo delivery and expression of heterologous genes in the bone marrow
MXPA03001680A (es) * 2000-08-29 2004-11-01 Wyeth Corp Empaque de particulas de un replicon del virus de acido ribonucleico (arn) de hebra positiva.
WO2002074920A2 (en) * 2001-03-16 2002-09-26 Johns Hopkins University A replication-defective alphavirus vaccine linking antigen with an immunogenicity-potentiating polypeptide and a method of delivery the same
US20040219545A1 (en) * 2001-04-13 2004-11-04 Rando Robert F. Methods for identifying small molecules that bind specific rna structural motifs
CN1490056A (zh) * 2002-10-18 2004-04-21 ��¡���ɵ°��̲��о����� 针对hiv-1的免疫方法和组合物
CA2689108C (en) * 2007-06-01 2015-04-14 Universidad De Barcelona Control for virus detection assays based on reverse-transcription polymerase chain reaction
WO2009089040A1 (en) * 2008-01-11 2009-07-16 Jaffrey Samie R Methods for expressing proteins in axons
US20140234359A1 (en) * 2011-09-21 2014-08-21 Viral Genetics, Inc. Plant viral vaccines and therapeutics
AU2013240248B2 (en) * 2012-03-26 2018-12-20 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Delivery of packaged RNA to mammalian cells
CN104357581B (zh) * 2014-10-30 2016-08-24 薛芳 埃博拉病毒核酸分子特征标准样品及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP3310368B1 (en) 2025-07-16
EP3310368A4 (en) 2018-12-19
US20210254020A1 (en) 2021-08-19
DK3310368T3 (da) 2025-08-18
WO2016204983A1 (en) 2016-12-22
US20190002838A1 (en) 2019-01-03
US12338463B2 (en) 2025-06-24
EP3310368A1 (en) 2018-04-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Polo et al. Infectious RNA transcripts from full-length dengue virus type 2 cDNA clones made in yeast
Shimizu et al. Evidence for in vitro replication of hepatitis C virus genome in a human T-cell line.
Ávila-Pérez et al. Reverse genetic approaches for the generation of recombinant Zika virus
US7332322B2 (en) Venezuelan equine encephalitis virus replicons with adaptive mutations in the genome and uses thereof
CN110195093B (zh) 一种基于表达绿色荧光蛋白的重组寨卡病毒的药物筛选系统及其应用
Atasheva et al. Pseudoinfectious Venezuelan equine encephalitis virus: a new means of alphavirus attenuation
Ishikawa et al. Construction of an infectious molecular clone of Japanese encephalitis virus genotype V and its derivative subgenomic replicon capable of expressing a foreign gene
US20250057932A1 (en) Vaccines against infectious diseases caused by positive stranded rna viruses
US8986673B2 (en) Replication stable and RNase resistant chimeras of pestivirus with insertion in 3′ nontranslated region (3′NTR)
Tzeng et al. Rubella virus DI RNAs and replicons: requirement for nonstructural proteins acting in cis for amplification by helper virus
Li et al. Novel reverse genetics of genotype I and III Japanese encephalitis viruses assembled through transformation associated recombination in yeast: The reporter viruses expressing a green fluorescent protein for the antiviral screening assay
CN103328647B (zh) 黄病毒重组体及其应用
ES3046235T3 (en) Sindbis control virus
EP1930416A1 (en) Novel recombinant human hepatitis c virus-like particle and method for producing the same
Yun et al. Bacterial artificial chromosomes: A functional genomics tool for the study of positive-strand RNA viruses
CN117106735B (zh) 一种尼巴病毒的重组病毒载体、假病毒及其制备方法和应用
JP2004537279A (ja) 感染性ｃ型肝炎ウイルス合成のための細胞培養システム
ES2376094B1 (es) Método de detección precoz de resistencias al tratamiento antirretroviral en vih.
CN111918669A (zh) 适应在vero细胞上生长的减毒活黄热病病毒株及包含它的疫苗组合物
Liu CCR5 gene knock-out mediated TALEN technique and its effects against HIV infection on lymphocytes and macrophages
Louis Pseudo-Dumbbell and Dumbbell RNA Structures: Modulators of Zika Virus Translation and Replication
CN121801963A (zh) 恩杜牧病毒全长感染性克隆、复制子系统及其制备和应用
Gontu Broad-Spectrum RNA Prophylactic and Therapeutic Interventions for Sars-CoV-2
Lemos et al. Intracellular delivery of HCV NS3p gene using vectored particles
CN102268412B (zh) 一种丙型肝炎病毒的非结构蛋白与gb病毒b的嵌合病毒