ES3046543T3 - Anti cd25 fc gamma receptor antibodies for tumor specific cell depletion in combination with pd-1 antagonists - Google Patents

Abstract

La presente divulgación se refiere a un método para el tratamiento de un tumor sólido, que implica el uso de un anticuerpo anti-CD25. En particular, el anticuerpo anti-CD25 está optimizado para la depleción de linfocitos T reguladores (Treg) en tumores. La presente invención también proporciona nuevos anticuerpos anti-CD25 y su combinación con otros fármacos anticancerígenos, como inhibidores de puntos de control inmunitario, compuestos dirigidos contra antígenos cancerosos o el receptor inhibidor de Fc, FcyRllb (CD32b). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0003] Anticuerpos anti-receptor de Fc gamma CD25 para la disminución de células específicas de tumor en combinación con antagonistas de PD-1

[0005] La presente invención está en el campo de la inmunoterapia del cáncer y se refiere a tratar un tumor sólido, en la que el tratamiento implica el uso de un anticuerpo para c D25.

[0007] Antecedentes de la invención

[0009] La inmunoterapia del cáncer implica el uso del propio sistema inmunitario de un sujeto para tratar o prevenir el cáncer. Las inmunoterapias aprovechan el hecho de que las células cancerosas a menudo tienen moléculas sutilmente diferentes en su superficie que se pueden detectar por el sistema inmunitario. Estas moléculas, o antígenos del cáncer, son comúnmente proteínas, pero también incluyen moléculas tales como carbohidratos. La inmunoterapia implica por tanto la provocación del sistema inmunitario para que ataque células tumorales por medio de estos antígenos diana. Sin embargo, los tumores malignos, en particular tumores sólidos, pueden escapar a la vigilancia inmunitaria por medio de diversos mecanismos tanto intrínsecos a la célula tumoral como mediados por componentes del microambiente tumoral. Entre estos últimos, se han propuesto como factores críticos la infiltración tumoral por linfocitos T reguladores (linfocitos Treg o Treg) y, más específicamente, un equilibrio desfavorable de linfocitos T efectores (Tef) frente a Treg (es decir, una baja proporción de Tef con respecto a Treg) (Smyth Met al.,2014, Immunol Cell Biol. 92, 473-4).

[0011] Desde su descubrimiento, se ha descubierto que los linfocitos Treg son fundamentales para mediar en la homeostasis inmunitaria y promover el establecimiento y mantenimiento de la tolerancia periférica. Sin embargo, en el contexto del cáncer su papel es más complejo. Como las células cancerosas expresan antígenos tanto propios como asociados a tumor, la presencia de Treg, que buscan amortiguar las respuestas de células efectoras, puede contribuir a la progresión tumoral. La infiltración de Treg en tumores establecidos representa por lo tanto uno de los principales obstáculos para las respuestas antitumorales eficaces y para el tratamiento de cánceres en general. Se cree que los mecanismos de supresión empleados por Treg contribuyen significativamente a la limitación o incluso al fracaso de los tratamientos actuales, en particular inmunoterapias que se basan en la inducción o potenciación de respuestas antitumorales (Onishi Het al;,2012 Anticanc. Res. 32, 997-1003).

[0013] La disminución de Treg como enfoque terapéutico para tratar el cáncer es un enfoque que está respaldado por estudios que han demostrado la contribución de Treg al establecimiento y progresión tumoral en modelos murinos. Además, la infiltración tumoral por Treg también se ha asociado con un peor pronóstico en varios cánceres humanos (Shang Bet al.,2015, Sci Rep. 5:15179). Sin embargo, la disminución de Treg en tumores es compleja y los resultados de estudios en esta área han sido discrepantes. Por tanto, existe una necesidad en la técnica de obtener un procedimiento para tratar el cáncer que implique la disminución de Treg.

[0015] Entre las dianas moleculares potenciales para lograr la disminución de Treg, la interacción IL-2/CD25 ha sido objeto de varios estudios en modelos murinos, implicando algunos de ellos el uso de PC61, un anticuerpo de rata anti-CD25 de ratón (Setiady Yet al.,2010. Eur J Immunol. 40: 780-6). La unión de CD25 y las actividades funcionales de este anticuerpo se han comparado con las de un panel de anticuerpos monoclonales generados por diferentes autores (Lowenthal J.Wet al.,1985. J. Immunol., 135, 3988-3994; Moreau, J.-Let al.,1987. Eur. J. Immunol.

[0016] 17,929-935; Volk HDet al.,1989 Clin. exp. Immunol. 76, 121-5; DantalJet al.,1991, Transplantation 52:110-5).

[0017] De esta manera, se han caracterizado tres epítopos para anti-CD25 de ratón dentro de dicha diana que son distintos o comunes al sitio de unión de IL-2 de ratón. PC61 (que tiene el isotipo IgG1 de ratón) bloquea o inhibe la unión de IL-2 a CD25, como muchos otros hibridomas para anticuerpos anti-CD25 de ratón (y la mayoría de los divulgados como anticuerpos anti-CD25 humano; véanse, por ejemplo, los documentos WO2004/045512, WO2006/108670, WO1993/011238 y WO1990/007861). Además, la unión de PC61 a CD25 de ratón no se ve afectada, como para otros anticuerpos anti-CD25 de ratón tales como 7D4, por ADP-ribosilación de CD25 en el sitio de unión de IL-2 (Teege Set al.,2015, Sci Rep 5: 8959).

[0019] Parte de la literatura se refiere al uso de anti-CD25, solo o en combinación, en el cáncer o en relación con la disminución de Treg (documentos WO2004/074437; WO2006/108670; WO2006/050172; WO2011/077245; WO2016/021720; WO2004/045512; Grauer Oet al.,2007 Int. J. Cancer: 121: 95-105). Sin embargo, cuando se sometió a prueba en modelos de ratón de cáncer, el anticuerpo de rata anti-CD25 PC61 no demostró actividad antitumoral cuando se suministró después del establecimiento del tumor.

[0021] Sutmuller RPet al,2001, J Exp Med 194(6):823 divulga el uso de un anticuerpo anti-CD25 (PC61) en combinación con un anticuerpo anti-CTLA-4. Mkrtichyan Met al,2011, Eur J Immunol, 41:2977, divulga el uso de un anticuerpo anti-PD-1 (CT-11) y ciclofosfamida en combinación con una vacuna peptídica.

[0023] En el contexto de un modelo murino de autoinmunidad, se regenomanipuló el anticuerpo anti-CD25 PC61 para evaluar el efecto de una función efectora Fc altamente divergente dentro de un anticuerpo anti-CD25 sobre el bloqueo del receptor de IL-2 y la disminución de Treg periférico (Huss Det al.,2016. Immunol. 148: 276-86). Sin embargo, la capacidad para disminuir Treg en tumores, o para mediar en la actividad terapéutica antitumoral, nunca se había evaluado para PC61 (como tal, como anticuerpo genomanipulado o como anti-CD25 humano diseñado o caracterizado por tener rasgos característicos de unión a CD25 similares a los de PC61 para CD25 de ratón), solo o en combinación con otros anticuerpos o compuestos antineoplásicos.

[0025] Sumario

[0027] La invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjunto.

[0029] La presente invención proporciona anticuerpos anti-CD25 y usos de anticuerpos anti-CD25 que se caracterizan por elementos estructurales que permiten disminuir eficazmente los Treg, en particular dentro de tumores. En este alcance, se han modificado los rasgos característicos estructurales y funcionales de IgG1 de rata PC-61 (como se describe con respecto a CD25 de ratón) para proporcionar anticuerpos que presentan rasgos característicos sorprendentemente mejorados en términos de uso como disminución de Treg y eficacia contra tumores, solos o en combinación con otros agentes antineoplásicos. Estos hallazgos se pueden usar para definir y generar anti-CD25 humano novedosos que proporcionan efectos comparables contra tumores en sujetos humanos.

[0031] Por lo tanto, un descubrimiento clave por los autores de la invención es el hallazgo inesperado de que el anticuerpo anti-CD25 de ratón PC61 solo puede disminuir Treg en los ganglios linfáticos y la circulación, pero no puede hacerlo dentro del tumor. La falta de disminución de Treg en el tumor se correlaciona con la falta de actividad antitumoral. Estos datos nuevos e inesperados impulsaron a los autores de la invención a incrementar la actividad de disminución de anti-CD25 de ratón por medio de la genomanipulación de Fc, lo que da lugar a una potente disminución de Treg intratumoral y de la actividad antitumoral.

[0033] Se describe un procedimiento para tratar a un sujeto humano que tiene cáncer que comprende la etapa de administrar un anticuerpo anti-CD25 a un sujeto, en el que dicho sujeto tiene un tumor (preferentemente un tumor sólido), en donde dicho anticuerpo anti-CD25 es un anticuerpo IgGl que se une a al menos un receptor de F<cy>activador (preferentemente seleccionado de F<cy>RI, F<cy>RII<c>y FcYRIIIa) con alta afinidad, y disminuye los linfocitos T reguladores infiltrantes del tumor.

[0035] Dicho anticuerpo tiene preferentemente una constante de disociación (Kd) para CD25 de menos de 10'8 M y/o una constante de disociación para al menos un receptor de F<cy>activador de menos de aproximadamente 10'6 M. Lo más preferentemente, el anticuerpo anti-CD25 se caracteriza por otros rasgos característicos relacionados con receptores de Fcy, en particular:

[0037] (a) se une a receptores de F<cy>con una proporción activadora con respecto a inhibidora (A/I) superior a 1; y/o

[0038] (b) se une a al menos uno de FcyRI, FcyRIIc y FcYRIIIa con mayor afinidad de la que se une a FcYRIlb.

[0040] Dado el uso del anticuerpo anti-CD25 en procedimientos terapéuticos, puede presentar otros rasgos característicos preferentes. El anticuerpo anti-CD25 es preferentemente un anticuerpo monoclonal, en particular un anticuerpo humano o humanizado. Además, en vista de sus interacciones con células inmunitarias y/u otros componentes del componente del sistema inmunitario para ejercer sus actividades, el anticuerpo anti-CD25 puede provocar además una respuesta CDC, ADCC y/o ADCP potenciada, preferentemente una respuesta ADCC y/o ADC<p>incrementada, más preferentemente una respuesta ADCC incrementada.

[0042] El anticuerpo anti-CD25 (como se define en general anteriormente y con más detalles en la descripción detallada) se puede usar en procedimientos para tratar un sujeto humano, en los que dicho anticuerpo anti-CD25 se administra a un sujeto que tiene un tumor sólido establecido (preferentemente en un procedimiento que comprende además la etapa de identificar a un sujeto que tiene un tumor sólido). Dichos procedimientos pueden comprender además administrar un inhibidor de punto de control inmunitario a dicho sujeto, por ejemplo en forma de un anticuerpo que se une e inhibe una proteína de punto de control inmunitario. Un inhibidor de punto de control inmunitario preferente es un antagonista de PD-1, que puede ser un anticuerpo anti-PD-1 o un anticuerpo anti-PD-L1. Más en general, un anticuerpo anti-CD25 se puede usar en procedimientos para disminuir linfocitos T reguladores en un tumor sólido en un sujeto, que comprende la etapa de administrar dicho anticuerpo anti-CD25 a dicho sujeto.

[0044] El anticuerpo anti-CD25 como se describe en el presente documento se puede usar para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer en un sujeto humano, en el que dicho sujeto tiene un tumor sólido. En este alcance, dicho anticuerpo es para su administración en combinación con un inhibidor de punto de control inmunitario, preferentemente un antagonista de PD-1.

[0046] También se describe una combinación de un anticuerpo anti-CD25 como se define anteriormente con otro compuesto antineoplásico (preferentemente un inhibidor de punto de control inmunitario u otros compuestos como se indica en la descripción detallada) para su uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto humano, en el que dicho sujeto tiene un tumor sólido y el anticuerpo anti-CD25 y el compuesto antineoplásico (por ejemplo, un inhibidor de punto de control inmunitario tal como un antagonista de PD-1) se administran simultáneamente, por separado o secuencialmente. En este alcance, también se describe un kit para su uso en el tratamiento del cáncer que comprende un anticuerpo anti-CD25, como se define anteriormente, y un compuesto antineoplásico (por ejemplo, un inhibidor de punto de control inmunitario, tal como un antagonista de PD-1).

[0047] También se describe una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-CD25 como se define anteriormente en un medio farmacéuticamente aceptable. Dicha composición también puede comprender un compuesto antineoplásico (por ejemplo, un inhibidor de punto de control inmunitario tal como un antagonista de PD-1).

[0048] Se describe además un anticuerpo biespecífico que comprende:

[0049] (a) un primer resto de unión a antígeno que se une a CD25; y

[0050] (b) un segundo resto de unión a antígeno que se une a otro antígeno;

[0051] en el que el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo IgG1 que se une a al menos un receptor de Fcy activador con alta afinidad y disminuye los linfocitos T reguladores infiltrantes del tumor. Preferentemente, dicho segundo resto de unión a antígeno se une a un antígeno seleccionado de una proteína de punto de control inmunitario, un antígeno asociado a tumor, o es (o se basa en) un anticuerpo anti-receptor de Fc activador humano (anticuerpo anti-FcYRI, anti-FcYRIIc o anti-FcYRIIIa) o es (o se basa en) un anticuerpo anti-FcYRIIb humano antagonista. Preferentemente, dicho anticuerpo biespecífico comprende un segundo resto de unión a antígeno que se une a una proteína de punto de control inmunitario que se selecciona del grupo que consiste en PD-1, CTLA-4, BTLA, KIR, LAG3, VISTA, TIGIT, TIM3, PD-L1, B7H3, B7H4, PD-L2, CD80, CD86, HVEM, LLT1, GAL9, GITR, OX40, CD137 e ICOS. Dicha proteína de punto de control inmunitario se expresa preferentemente en una célula tumoral y, lo más preferentemente, se selecciona de PD-1, PD-L1 y CTLA-4. El segundo resto de unión a antígeno que se une a una proteína de punto de control inmunitario puede estar comprendido en o basarse en un anticuerpo disponible comercialmente que actúa como un inhibidor de punto de control inmunitario, por ejemplo:

[0052] (a) En el caso de PD-1, el anticuerpo anti-PD-1 puede ser nivolumab o pembrolizumab.

[0053] (b) En el caso de PD-L1, el anti-PD-L1 es atezolizumab;

[0054] (c) En el caso de CTLA-4, el anti-CTLA-4 es ipilimumab.

[0055] Dicho anticuerpo biespecífico se puede proporcionar en cualquier formato disponible comercialmente, incluyendo Duobody, BiTE DART, CrossMab, botones en ojales, Triomab u otro formato molecular apropiado de anticuerpo biespecífico y fragmentos del mismo.

[0056] De forma alternativa, dicho anticuerpo biespecífico comprende un segundo resto de unión a antígeno que se une a un antígeno asociado a tumor. En este modo de realización alternativo, dichos antígenos y correspondientes anticuerpos incluyen, sin limitación CD22 (blinatumomab), CD20 (rituximab, tositumomab), CD56 (lorvotuzumab), CD66e/CEA (labetuzumab), CD152/CTLA-4 (ipilimumab), CD221/IGF1R (MK-0646), CD326/Epcam (edrecolomab), CD340/HER2 (trastuzumab, pertuzumab) y EGFR (cetuximab, panitumumab).

[0057] La combinación de anticuerpo anti-CD25 con otro compuesto antineoplásico, o los anticuerpos biespecíficos como se define anteriormente, se puede usar en un procedimiento para tratar el cáncer, que comprende la etapa de administrar dicha combinación o dicho anticuerpo biespecífico a un sujeto, en particular cuando el sujeto tiene un tumor sólido, y para su uso en el tratamiento de cáncer en un sujeto.

[0058] Otras definiciones del anticuerpo anti-CD25 humano de la invención y de sus usos en procedimientos para tratar el cáncer, en composiciones farmacéuticas, en combinaciones con otros compuestos antineoplásicos, en anticuerpos biespecíficos, se proporcionan en la descripción detallada y en los ejemplos.

[0059] Descripción detallada

[0060] Se describe en el presente documento un procedimiento para tratar o prevenir el cáncer, en particular un tumor sólido, en un sujeto, que comprende la etapa de administrar un anticuerpo que se une a CD25 a dicho sujeto, con lo que los anticuerpos anti-CD25 se caracterizan por elementos estructurales que permiten disminuir eficazmente los Treg, en particular dentro de tumores. También se describe un anticuerpo que se une a CD25, como se define en el presente documento, para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer, en particular un tumor sólido. De forma alternativa, también se describe el uso de un anticuerpo que se une a CD25 y que permite disminuir eficazmente Treg para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención del cáncer, en particular un tumor sólido. También se describe el uso de un anticuerpo que se une a CD25 y que permite disminuir eficazmente Treg en el tratamiento o prevención del cáncer, en particular un tumor sólido.

[0062] La presente invención divulga cómo el cambio del isotipo de un anticuerpo anti-CD25 (ejemplificado por el anticuerpo anti-CD25 de ratón PC61) a un isotipo de disminución (lgG2 de ratón para PC61, pero equivalente a IgG1 en seres humanos) da lugar a una disminución mejorada de linfocitos T reguladores en un contexto de tumor sólido. Además, los autores de la presente invención han descubierto por primera vez que el CD25 se puede dirigir para la disminución de linfocitos T reguladores en el contexto terapéutico, por ejemplo en un tumor sólido establecido, y que CD25 se expresa preferentemente en linfocitos T reguladores. Los autores de la presente invención han descubierto que un anticuerpo anti-CD25 genomanipulado con unión potenciada a los receptores de Fc gamma activadores da lugar a una disminución eficaz de linfocitos T reguladores infiltrantes del tumor, un enfoque terapéutico que, por ejemplo, se podría asociar (en combinación con o dentro de anticuerpos biespecíficos) con otros compuestos dirigidos al cáncer, tales como los que se dirigen a una proteína de punto de control inmunitario, un antígeno asociado a tumor o un receptor de Fcy inhibidor.

[0064] Los autores de la presente invención también han descubierto por primera vez que el receptor de Fc gamma inhibidor IIb se regula por incremento en el sitio del tumor, previniendo por tanto la disminución de linfocitos T reguladores intratumorales eficaz por el anticuerpo anti-CD25 de ratón original PC61. Como tal, se describen aplicaciones terapéuticas que implican un enfoque de combinación que implica dirigir CD25 y el receptor de Fc gamma IIb.

[0066] CD25 es la cadena alfa del receptor de IL-2 y se encuentra en linfocitos T activados, linfocitos T reguladores, linfocitos B activados, algunos timocitos, precursores mieloides y oligodendrocitos. CD25 se asocia con CD122 y CD132 para formar un complejo heterotrimérico que actúa como receptor de alta afinidad para IL-2. La secuencia consenso de CD25 humano se muestra a continuación en SEQ ID NO: 1 (número de acceso Uniprot P01589; el dominio extracelular de CD25 humano maduro, correspondiente a los aminoácidos 22-240, está subrayado y se presenta en SEQ ID NO: 2):

[0068] 10 20 30 40 50

[0070] MDSYLLMWGL LTFIM V PG CQ AELCDDDPPE IPHATFKAMA YKEGTMLJMCE

[0072] € 0 70 80 90 100

[0074] C K R G F R R IK S GSLYMLCTGN SSHSSWDNQC QCTSSATRMT TK QV TPGPEE

[0076] 110 12 0 130 140 150

[0078] QKERKTTEMQ SFMQFVDQAS L F G H C R E P P F WENEATERIY HFVVGQMVYY

[0080] 160 170 180 190 200

[0082] QCVQGYRALH RGPAESVCKM THGKTRWTQP QLIC TG EM ET 3Q FFG REK PÍ)

[0084] 210 220 230 240 250

[0086] A S P E G R P E S E TSC1,VTTTDF QIQTEMAATM E T S IF T T E Y Q VAVAGCVFLL

[0087] 2 fiü 27 0

[0089] IS V L L L S G L T WQRRQRKSRR T I

[0091] Como se usa en el presente documento, "un anticuerpo que se une a CD25" se refiere a un anticuerpo que se puede unir a la subunidad CD25 del receptor de IL-2. Esta subunidad también es conocida como subunidad alfa del receptor de IL-2. Dicho anticuerpo también se denomina en el presente documento "anticuerpo anti-CD25".

[0092] Un anticuerpo anti-CD25 es un anticuerpo que se puede unir específicamente a la subunidad CD25 (antígeno) del receptor de IL-2. Se entiende que "unión específica", "unir específicamente" y "se une específicamente" quieren decir que el anticuerpo tiene una constante de disociación (Kd) para el antígeno de interés de menos de aproximadamente 10'6 M, 10'7 M, 10'8 M, 10'9 M, 10'1° M, 10'11 M o 10'12 M. En un modo de realización preferente, la constante de disociación es menor que 10'8 M, por ejemplo en el intervalo de 10'9 M, 10'10 M, 10'11 M o 10'12 M.

[0093] Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" se refiere a moléculas de inmunoglobulina intactas e incluye formas policlonales, monoclonales, modificadas genéticamente y de otro modo de anticuerpos, incluyendo pero sin limitarse a, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos heteroconjugados y/o multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos, diacuerpos, tricuerpos y tetracuerpos). En algunos modos de realización, un anticuerpo puede carecer de una modificación covalente (por ejemplo, unión de un glucano) que tendría si se produjera de forma natural. En algunos modos de realización, un anticuerpo puede contener una modificación covalente (por ejemplo, la unión de un glucano, un resto detectable, un resto terapéutico, un resto catalítico u otro grupo químico que proporciona estabilidad o administración mejorada del anticuerpo, tal como polietilenglicol). En algunos modos de realización, un anticuerpo es policlonal u oligoclonal, es decir, se genera como un panel de anticuerpos, cada uno asociado a una única secuencia de anticuerpo y que se une a epítopos más o menos distintos dentro de un antígeno (tales como diferentes epítopos dentro del dominio extracelular CD25 humano que se asocian a diferentes anticuerpos anti-CD25 humano de referencia). Los anticuerpos policlonales u oligoclonales se pueden proporcionar en una única preparación para usos médicos como se describe en la literatura (Kearns JDet al.,2015. Mol Cancer Ther. 14:1625-36).

[0095] En un aspecto de la invención, el anticuerpo es monoclonal. El anticuerpo, adicionalmente o de forma alternativa, puede ser humanizado o humano. En otro aspecto, el anticuerpo es humano, o en cualquier caso un anticuerpo que tiene un formato y rasgos característicos que permiten su uso y administración en sujetos humanos.

[0097] Los anticuerpos (Ab) e inmunoglobulinas (Ig) son glucoproteínas que tienen las mismas características estructurales. Las inmunoglobulinas pueden ser de cualquier clase tales como IgA, IgD, IgG, IgE o IgM. Las inmunoglobulinas pueden ser de cualquier subclase tales como IgG-i, IgG<2>, IgG<3>o IgG<4>. El anticuerpo anti-CD25 puede ser de la clase IgG, preferentemente la subclase IgG1. El anticuerpo anti-CD25 es de la subclase IgG<1>humana.

[0099] La región Fc de anticuerpos IgG interactúa con varios receptores de Fcy celulares (FcyR) para estimular y regular los mecanismos efectores posteriores. Hay cinco receptores activadores, a saber, FcyRI (CD64), FcYRIIa (CD32a), FcyRIIc (CD32c), FcYRIIIa (CD16a) y FcYRlIlb (CD16b), y un receptor inhibidor, FcYRIIb (CD32b). La comunicación de anticuerpos IgG con el sistema inmunitario se controla y media por FcyR, que transmiten la información detectada y recopilada por anticuerpos al sistema inmunitario, proporcionando un vínculo entre los sistemas inmunitarios innato y adaptativo, en particular en el contexto de la bioterapia (Hayes Jet al.,2016. J Inflamm Res 9: 209-219).

[0101] Las subclases de IgG varían en su capacidad para unirse a F<cy>R y esta unión diferencial determina su capacidad para provocar un intervalo de respuestas funcionales. Por ejemplo, en seres humanos, FcYRIIIa es el principal receptor implicado en la activación de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) e IgG3, seguido de cerca por IgG1, muestra las mayores afinidades por este receptor, reflejando su capacidad para inducir potentemente ADCC.

[0103] El anticuerpo se une a un receptor de FcyR activador con alta afinidad. Preferentemente, el anticuerpo se une a F<cy>RI y/o FcYRIIa y/o FcYRIIIa con alta afinidad. En un modo de realización particular, el anticuerpo se une al F<cy>R con una constante de disociación de menos de aproximadamente 10'6 M, 10'7 M, 10'8 M, 10'9 M o 10'10 M.

[0105] El anticuerpo es un anticuerpo IgG<1>humano, que se puede unir a al menos un receptor activador Fc. Por ejemplo, el anticuerpo se puede unir a uno o más receptores seleccionados de F<cy>RI, FcYRIIa, F<cy>RII<c>, FcYRIIIa y FcYRNIb. En un aspecto, el anticuerpo se puede unir a FcYRIIIa. En un aspecto, el anticuerpo se puede unir a FcYRIIIa y FcYRIIa y opcionalmente a FcyRI. En un aspecto, el anticuerpo se puede unir a estos receptores con alta afinidad, por ejemplo, con una constante de disociación de menos de aproximadamente 10'7 M, 10'8 M, 10'9 M o 10'10 M,

[0106] En un aspecto, el anticuerpo se une a un receptor inhibidor, FcYRIIb, con baja afinidad. En un aspecto, el anticuerpo se une a FcYRIIb con una constante de disociación mayor que 10'7 M, mayor que 10'6 M o mayor que 10'5 M.

[0107] El anticuerpo anti-CD25 humano es de la subclase IgG<1>humana, y preferentemente tiene actividad ADCC y/o ADCP, como se analiza en el presente documento, en particular con respecto a células de origen humano. De hecho, como se describe previamente (Nimmerjahn Fet al.,2005. Science, 310:1510-2), el isotipo mIgG2a (que corresponde al isotipo IgG1 humano) se une a todos los subtipos de F<cy>R con una alta proporción activadora con respecto a inhibidora (A/I), que es al menos superior a 1. Por el contrario, otros isotipos (tal como el isotipo rlgG1) se unen con una afinidad similar a un solo F<cy>R activador (F<cy>RIII) individual, así como al FcYRIIb inhibidor, dando como resultado una proporción A/I baja (<1). Como se muestra en los ejemplos, esta proporción A/I menor se correlaciona con una disminución de Treg intratumoral menor y una actividad terapéutica antitumoral menor del isotipo.

[0109] En un modo de realización preferente, el anticuerpo anti-CD25 como se describe en el presente documento se une al CD25 humano, preferentemente con alta afinidad. Todavía preferentemente, el anticuerpo anti-CD25 se une a la región extracelular del CD25 humano, como se muestra anteriormente. En particular, los ejemplos proporcionan datos experimentales generados con el anticuerpo que se segrega por el hibridoma PC-61.5.3 y que en general se identifica como PC61 o bien PC-61. Los ensayos que implican PC-61 y CD25 de ratón en la literatura (por ejemplo, Setiady Yet al.,2010. Eur. J. Immunol. 40: 780-6; McNeill Aet al.,2007. Scand J Immunol. 65:63-9; Teege Set al.,2015, Sci Rep 5: 8959), conjuntamente con lo divulgado en los ejemplos (incluyendo anticuerpos recombinantes que comprenden el dominio de unión a CD25 de PC61), se pueden adaptar para caracterizar aquellos anticuerpos humanos que reconocen CD25 humano que tiene los mismos rasgos característicos funcionales de PC61 tanto a nivel de interacción con CD25 (en particular, bloqueando la unión de IL-2) como con receptores de F<cy>(en particular uniéndose preferentemente a receptores de F<cy>activadores humanos y disminuyendo eficazmente los Treg), cuando se asocia al isotipo apropiado, como se describe en los ejemplos. Los procedimientos adecuados se conocerán por el experto en la técnica para lograr los rasgos característicos funcionales requeridos del anticuerpo como se describe en el presente documento.

[0111] Se describe en el presente documento un procedimiento para tratar a un sujeto humano que tiene un cáncer que comprende la etapa de administrar un anticuerpo anti-CD25 a un sujeto, en el que dicho sujeto preferentemente tiene un tumor sólido, y en el que el anticuerpo anti-CD25 es preferentemente un anticuerpo IgG1 humano que se une a al menos un receptor de F<cy>activador seleccionado de F<cy>RI (CD64), F<cy>RII<c>(CD32c) y FcYRIIIa (CD16a) con alta afinidad, y disminuye los linfocitos T reguladores infiltrantes del tumor. Preferentemente, el anticuerpo anti-CD25 tiene una constante de disociación (Kd) para CD25 de menos de 10-8 M. Más preferentemente, el anticuerpo anti-CD25 se une a CD25 humano proporcionando efectos sobre la unión de IL-2 y la disminución de Treg similares a los de CD25 de ratón. En otro modo de realización, el anticuerpo anti-CD25 se une a receptores de Fcy con una proporción activadora con respecto a inhibidora (A/I) superior a 1 y/o se une a FcyRI (CD64), FcyRIIc (CD32c), FcYRIIIa (CD16a) con mayor afinidad de la que se une a FcYRIIb (CD32b).

[0113] El dominio de unión a CD25 del anticuerpo PC-61 se ha clonado y expresado como una proteína recombinante en fusión con una región constante apropiada. La secuencia del dominio de unión a CD25 del anticuerpo PC-61, así como su especificidad para epítopos distintos dentro del dominio extracelular de CD25 y/o sus otras actividades funcionales, se pueden usar para comparar anticuerpos anti-CD25 candidatos que se generan y criban por cualquier técnica apropiada (por ejemplo, planteando paneles de hibridomas a partir de roedores inmunizados con CD25 o generando colecciones de anticuerpos recombinantes y a continuación cribando estos repertorios de anticuerpos con fragmentos de CD25 para caracterizarlos funcionalmente como se describe en el presente documento). Los anticuerpos anti-CD25 que se identifican en consecuencia se pueden producir también como anticuerpos recombinantes, en particular como anticuerpos completos o como fragmentos o variantes que se describen en el presente documento.

[0115] Los anticuerpos e inmunoglobulinas naturales normalmente son glucoproteínas heterotetrámeras de aproximadamente 150.000 dalton, compuestas de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena pesada tiene en el extremo amínico un dominio variable (V<h>) seguido de una serie de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en el extremo amínico (V<l>) y un dominio constante en el extremo carboxílico.

[0117] Las regiones variables pueden interactuar con una diana antigénica estructuralmente complementaria y se caracterizan por diferencias en la secuencia de aminoácidos de anticuerpos de diferente especificidad antigénica. Las regiones variables de las cadenas H o bien L contienen las secuencias de aminoácidos que se pueden unir específicamente a dianas antigénicas. Dentro de estas secuencias hay secuencias más pequeñas denominadas "hipervariables" debido a su extrema variabilidad entre anticuerpos de diferente especificidad. Dichas regiones hipervariables también se denominan "regiones determinantes de la complementariedad" o regiones "CDR".

[0118] Estas regiones CDR representan la especificidad básica del anticuerpo para una estructura determinante antigénica particular. Las CDR representan tramos no contiguos de aminoácidos dentro de las regiones variables pero, independientemente de la especie, se ha descubierto que las localizaciones posicionales de estas secuencias de aminoácidos críticas dentro de las regiones de la cadena pesada y ligera variables tienen localizaciones similares dentro de las secuencias de aminoácidos de las cadenas variables. Las cadenas pesadas y ligeras variables de todos los anticuerpos tienen cada una 3 regiones CDR, cada una no contigua a las otras (denominadas L1, L2, L3, H1, H2, H3) para las respectivas cadenas ligeras (L) y pesadas (H). Las regiones CDR aceptadas se han descrito previamente (Kabatet al.,1977. J Biol Chem 252, 6609-6616).

[0120] Los anticuerpos de la presente invención pueden funcionar a través de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y/o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP), así como cualquier otro mecanismo que permite dirigir, bloquear la proliferación y/o disminuir linfocitos Treg.

[0122] "Citotoxicidad dependiente del complemento" (CDC) se refiere a la lisis de células que expresan antígeno por un anticuerpo de la invención en presencia de complemento.

[0124] "Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos" (ADCC) se refiere a una reacción celular en la que células citotóxicas inespecíficas que expresan receptores de Fc (FcR) (por ejemplo, linfocitos citolíticos naturales (NK), neutrófilos y macrófagos) reconocen el anticuerpo unido en una célula diana y de este modo dan lugar a la lisis de la célula diana.

[0126] "Fagocitosis celular dependiente de anticuerpos" (ADCP) se refiere a una reacción celular en la que los fagocitos (tales como macrófagos) que expresan receptores de Fc (FcR) reconocen el anticuerpo unido en una célula diana y de este modo dan lugar a la fagocitosis de la célula diana.

[0128] CDC, ADCC y ADCP se pueden medir usando ensayos que son conocidos y están disponibles en la técnica (Clyneset al.(1998) Proc Natl Acad Sci USA95,652-6).La región constante de un anticuerpo es importante para la capacidad de un anticuerpo para fijar el complemento y mediar en la citotoxicidad y fagocitosis celulares. Por tanto, como se analiza en el presente documento, el isotipo de un anticuerpo se puede seleccionar en base a si es deseable que el anticuerpo medie en la citotoxicidad/fagocitosis.

[0130] Como se analiza en el presente documento, en un modo de realización de la invención, se usa un anticuerpo anti-CD25 que da lugar a la disminución de linfocitos Treg. Por ejemplo, se puede usar un anticuerpo anti-CD25 que provoca una respuesta de CDC fuerte y/o una ADCC fuerte y/o una respuesta ADCP fuerte. Los procedimientos para incrementar CDC, ADCC y/o ADCP son conocidos en la técnica. Por ejemplo, la respuesta de CDC se puede incrementar con mutaciones en el anticuerpo que incrementan la afinidad de unión de C1q (Idusogieet al.(2001) J Immunol166,2571-5).

[0132] La ADCC se puede incrementar por procedimientos que eliminan el resto fucosa del glucano de anticuerpo, tal como por producción del anticuerpo en una línea celular YB2/0, o a través de la introducción de mutaciones específicas en la porción Fc de IgG<1>humana (por ejemplo, S298A/E333A/K334A, S239D/I332E/A330L, G236A/S239D/A330L/I332E) (Lazaret al.(2006) Proc Natl Acad Sci USA103,2005-2010,Smithet al.(2012) Proc Natl Acad Sci USA109,6181-6).La ADCP también se puede incrementar por la introducción de mutaciones específicas en la porción Fc de lgG1 humana (Richardset al.(2008) Mol Cancer Ther7,2517-27).

[0134] En un modo de realización preferente de la presente invención, el anticuerpo se optimiza para provocar una respuesta ADCC, es decir, la respuesta ADCC se potencia, incrementa o mejora en relación con otros anticuerpos anti-CD25, o por ejemplo, anticuerpos monoclonales anti-CD25 no modificados.

[0136] Como se usa en el presente documento, un "anticuerpo quimérico" se puede referir a un anticuerpo que tiene secuencias variables derivadas de una inmunoglobulina de una especie, tal como anticuerpo de rata o ratón, y regiones constantes de inmunoglobulina de otra especie, tal como de un anticuerpo humano. En algunos modos de realización, el anticuerpo quimérico puede tener una región constante que se potencia para inducir ADCC.

[0137] Los anticuerpos de acuerdo con la invención también pueden ser parcial o totalmente sintéticos, en los que al menos parte de las cadenas polipeptídicas de los anticuerpos se sintetizan y, posiblemente, se optimizan para la unión a su antígeno análogo. Dichos anticuerpos pueden ser anticuerpos quiméricos o humanizados y pueden ser de estructura totalmente tetramérica o pueden ser diméricos y comprender solo una única cadena pesada y una única ligera.

[0139] Los anticuerpos de la presente invención también pueden ser anticuerpos monoclonales. Como se usa en el presente documento, "anticuerpo monoclonal" no se limita a anticuerpos producidos a través de la tecnología de hibridoma. El término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que se deriva de un solo clon, incluyendo cualquier clon eucariota, procariota o fago, y no al procedimiento por el que se produce.

[0141] Los anticuerpos descritos en el presente documento también pueden ser anticuerpos humanos. Como se usa en el presente documento, "anticuerpo humano" se refiere a anticuerpos que tienen regiones variables en las que las regiones tanto estructurales como CDR se derivan de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Además, si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante también se deriva de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Los anticuerpos humanos pueden incluir residuos aminoacídicos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitioin vitroo por mutación somáticain vivo).

[0143] También se describen moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos anti-CD25 como se define en el presente documento. Dichas moléculas de ácido nucleico proporcionadas pueden contener secuencias de ácido nucleico optimizadas por codones, y/o se pueden incluir en casetes de expresión dentro de vectores de ácido nucleico apropiados para la expresión en células huésped tales como, por ejemplo, células bacterianas, de levadura, de insecto, de pez, murinas, de simio o humanas. También se describen células huésped que comprenden moléculas de ácido nucleico heterólogas (por ejemplo, vectores de ADN) que expresan el anticuerpo deseado.

[0145] También se describen procedimientos para preparar un anticuerpo anti-CD25 aislado como se define anteriormente. Dichos procedimientos pueden comprender cultivar una célula huésped que comprende ácidos nucleicos (por ejemplo, ácidos nucleicos heterólogos que pueden comprender y/o suministrarse a la célula huésped por medio de vectores). Preferentemente, la célula huésped (y/o las secuencias de ácido nucleico heterólogas) se dispone y construye de modo que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se segrega de la célula huésped y se aísla de los sobrenadantes de cultivo celular.

[0147] Los anticuerpos de la presente invención pueden ser monoespecíficos, biespecíficos o multiespecíficos. Los "anticuerpos multiespecíficos" pueden ser específicos para diferentes epítopos de un antígeno o polipéptido diana, o pueden contener dominios de unión a antígeno específicos para más de un antígeno o polipéptido diana (Kuferet al.(2004) Trends Biotechnol22,238-44).

[0148] En un aspecto de la invención, el anticuerpo es un anticuerpo monoespecífico. Como se analiza además a continuación, en un aspecto alternativo el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico.

[0150] Como se usa en el presente documento, "anticuerpo biespecífico" se refiere a un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a dos epítopos distintos, en un solo antígeno o polipéptido, o bien en dos antígenos o polipéptidos diferentes.

[0152] Los anticuerpos biespecíficos como se analiza en el presente documento se pueden producir por medio de procedimientos biológicos, tales como hibridación somática; o procedimientos genéticos, tales como la expresión de una secuencia de ADN no natural que codifica la estructura de anticuerpo deseada en una línea celular o en un organismo; procedimientos químicos (por ejemplo, por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo a una o más entidades moleculares tales como otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo); o una combinación de los mismos.

[0154] Las tecnologías y productos que permiten producir monoespecíficos o biespecíficos son conocidos en la técnica, como se revisa ampliamente en la literatura, también con respecto a formatos alternativos, conjugados anticuerpofármaco, procedimientos de diseño de anticuerpos, procedimientos de cribadoin vitro,regiones constantes, modificaciones postraduccionales y químicas, rasgo característico mejorado para desencadenar la muerte de células cancerosas tales como la genomanipulación de Fc (Tiller K y Tessier P, 2015 Annu Rev Biomed Eng. 17: 191-216; Speiss Cet al.,2015. Molecular Immunology 67: 95-106; Weiner G, 2015. Nat Rev Cancer, 15: 361-370; Fan Get al.,2015. J Hematol Oncol 8:130).

[0156] Como se usa en el presente documento, "epítopo" o "determinante antigénico" se refiere a un sitio en un antígeno al que se une un anticuerpo. Como es bien conocido en la técnica, los epítopos se pueden formar tanto a partir de aminoácidos contiguos (epítopo lineal) como de aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por plegamiento terciario de una proteína (epítopos conformacionales). Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos típicamente se conservan tras la exposición a disolventes desnaturalizantes, mientras que los epítopos formados por plegamiento terciario típicamente se pierden durante el tratamiento con disolventes desnaturalizantes. Un epítopo típicamente incluye al menos 3, y más normalmente, al menos 5 u 8-10 aminoácidos en una conformación espacial única. Los procedimientos para determinar la conformación espacial de epítopos son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear 2-D. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed (1996).

[0158] El anticuerpo anti-CD25 se puede incluir en un agente que comprende además una carga activa conjugada, tal como un agente terapéutico o de diagnóstico, en particular para tratamiento o diagnóstico del cáncer. Se pueden usar conjugados de anticuerpos anti-CD25 con radionúclidos o toxinas. Los ejemplos de radionucleidos comúnmente usados son, por ejemplo, 90Y, 131I y 67Cu, entre otros, y ejemplos de toxinas comúnmente usadas son doxorrubicina y calicheamicina. En otro modo de realización, el anticuerpo anti-CD25 se puede modificar para tener una semivida alterada. Los procedimientos para lograr una semivida alterada son conocidos en la técnica.

[0160] En un modo de realización, el anticuerpo puede bloquear la función de CD25 humano, preferentemente además de promover la disminución (a través de ADCC, ADCP y/o CDC) de células que expresan CD25. Preferentemente, también bloquea la unión de IL-2 humana a CD25 humano, y más preferentemente bloquea la señalización de IL-2 humana en células que expresan CD25.

[0162] Como se describe en el presente documento, el sujeto del tratamiento puede ser un mamífero, preferentemente un gato, perro, caballo, burro, oveja, cerdo, cabra, vaca, hámster, ratón, rata, conejo o cobaya, pero lo más preferentemente el sujeto es un ser humano. En todos los aspectos de la invención el sujeto es un ser humano.

[0163] Como se usa en el presente documento, los términos "cáncer", "canceroso" o "maligno" se refieren a o describen el estado fisiológico en mamíferos que típicamente se caracteriza por crecimiento celular desregulado.

[0165] Los ejemplos de cáncer incluyen pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, leucemia, blastoma y sarcoma. Los ejemplos más particulares de dichos cánceres incluyen carcinoma de células escamosas, mieloma, carcinoma de pulmón microcítico, carcinoma de pulmón no microcítico, glioma, carcinoma hepatocelular (CHC), linfoma hodgkiniano, linfoma no hodgkiniano, leucemia mielógena aguda (LMA), mieloma múltiple, cáncer (tubo) gastrointestinal, cáncer renal, cáncer de ovario, cáncer de hígado, leucemia linfoblástica, leucemia linfocítica, cáncer colorrectal, cáncer de endometrio, cáncer de riñón, cáncer de próstata, cáncer de tiroides, melanoma, condrosarcoma, neuroblastoma, cáncer de páncreas, glioblastoma multiforme, cáncer de cuello uterino, cáncer de cerebro, cáncer de estómago, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, carcinoma de colon y cáncer de cabeza y cuello.

[0167] En un aspecto, el cáncer implica un tumor sólido. Los ejemplos de tumores sólidos son sarcomas (incluyendo cánceres que surgen de células transformadas de origen mesenquimal en tejidos tales como hueso esponjoso, cartílago, grasa, músculo, tejido conectivo vascular, hematopoyético o fibroso), carcinomas (incluyendo tumores que surgen de células epiteliales), mesotelioma, neuroblastoma, retinoblastoma, etc. Los cánceres que implican tumores sólidos incluyen, sin limitaciones, cáncer de cerebro, cáncer de pulmón, cáncer de estómago, cáncer duodenal, cáncer de esófago, cáncer de mama, cáncer de colon y recto, cáncer renal, cáncer de vejiga, cáncer de riñón, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de ovario, melanoma, cáncer de boca, sarcoma, cáncer de ojo, cáncer de tiroides, cáncer uretral, cáncer vaginal, cáncer de cuello, linfoma y similares.

[0169] En un aspecto de la invención, el cáncer se selecciona de melanoma, carcinoma de pulmón no microcítico, cáncer renal, cáncer de ovario, cáncer de vejiga, sarcoma y cáncer de colon. En un aspecto preferente de la invención, el cáncer se selecciona de melanoma, cáncer de ovario, carcinoma de pulmón no microcítico y cáncer renal. En un modo de realización, el cáncer no es melanoma, cáncer de ovario o cáncer de mama. En un aspecto preferente, el cáncer es sarcoma, cáncer de colon, melanoma o cáncer colorrectal, o más en general cualquier cáncer humano para el que la línea celular MCA205, CT26, B16 o MC38 (como se identifica en los ejemplos) puede representar modelos preclínicos para validar compuestos como útiles para su gestión terapéutica.

[0171] Como se usa en el presente documento, el término "tumor" como se aplica a un sujeto diagnosticado con, o sospechoso de tener, un cáncer se refiere a una neoplasia maligna o potencialmente maligna o a masa tisular de cualquier tamaño, e incluye tumores primarios y neoplasias secundarias. Los términos "cáncer", "neoplasia maligna", "neoplasia", "tumor" y "carcinoma" también se pueden usar de manera intercambiable en el presente documento para referirse a tumores y células tumorales que presentan un crecimiento relativamente anómalo, descontrolado y/o autónomo, de modo que presentan un fenotipo de crecimiento anómalo caracterizado por una pérdida significativa del control de la proliferación celular. En general, las células de interés para la detección o tratamiento incluyen células precancerosas (por ejemplo, benignas), malignas, premetastásicas, metastásicas y no metastásicas. Las enseñanzas de la presente divulgación pueden ser pertinentes para cualquiera y todos los cánceres.

[0173] Como se usa en el presente documento, los "tumores sólidos" son un crecimiento anómalo o masa de tejido que normalmente no contiene quistes ni áreas líquidas, en particular, tumores y/o metástasis (donde sea que se localicen) distintos de leucemia o cánceres linfáticos no sólidos. Los tumores sólidos pueden ser benignos o malignos. Los diferentes tipos de tumores sólidos se denominan según el tipo de células que los forman y/o el tejido u órgano en el que se localizan. Los ejemplos de tumores sólidos son sarcomas (incluyendo cánceres que surgen de células transformadas de origen mesenquimal en tejidos tales como hueso esponjoso, cartílago, grasa, músculo, tejidos vasculares, hematopoyéticos o conectivos fibrosos), carcinomas (incluyendo tumores que surgen de células epiteliales), melanomas, linfomas, mesotelioma, neuroblastoma y retinoblastoma.

[0175] Los cánceres de acuerdo con la presente invención incluyen aquellos caracterizados por la presencia de un tumor sólido, es decir el sujeto no tiene un tumor no sólido. En todos los aspectos de la invención como se analiza en el presente documento, el cáncer es un tumor sólido, es decir, que el sujeto tiene un tumor sólido (y no tiene un tumor no sólido).

[0177] La referencia a "tratar" un cáncer como se usa en el presente documento define el logro de al menos un efecto terapéutico positivo, tal como por ejemplo, reducción en el número de células cancerosas, reducción en el tamaño tumoral, reducción en la tasa de infiltración de células cancerosas en órganos periféricos o reducción en la tasa de metástasis tumoral o crecimiento tumoral.

[0179] Los efectos terapéuticos positivos en el cáncer se pueden medir de varias maneras (por ejemplo, Weber (2009) J Nucl Med50,1S-10S).A modo de ejemplo, con respecto a la inhibición del crecimiento tumoral, de acuerdo con los estándares del Instituto Nacional del Cáncer de los Estados Unidos (NCI), T/C < 42 % es el nivel mínimo de actividad antitumoral. T/C < 10 % se considera un alto nivel de actividad antitumoral, con T/C (%) = Mediana del volumen tumoral del paciente tratado/mediana del volumen tumoral del control x 100. En algunos modos de realización, el tratamiento logrado por una cantidad terapéuticamente eficaz es cualquiera de supervivencia sin progresión (SSP), supervivencia sin enfermedad (SSE) o supervivencia global (SG).<s>S<p>, también conocida como "tiempo hasta la progresión del tumor", indica el período de tiempo durante y después del tratamiento en el que el cáncer no crece e incluye la cantidad de tiempo que los pacientes han experimentado una respuesta completa o una respuesta parcial, así como la cantidad de tiempo que los pacientes han experimentado una enfermedad estable. SSE se refiere al período de tiempo durante y después del tratamiento en el que el paciente permanece sin enfermedad. SG se refiere a una prolongación de la esperanza de vida en comparación con individuos o pacientes no tratados o sin tratamiento previo.

[0181] La referencia a "prevención" (o profilaxis) como se usa en el presente documento se refiere a retrasar o prevenir la aparición de los síntomas del cáncer. La prevención puede ser absoluta (de modo que no se produzca ninguna enfermedad) o puede ser eficaz solo en algunos individuos o durante un tiempo limitado.

[0183] En un aspecto preferente de la invención, el sujeto tiene un tumor establecido, es decir, el sujeto ya tiene un tumor, por ejemplo, que se clasifica como un tumor sólido. Como tal, la invención como se describe en el presente documento se puede usar cuando el sujeto ya tiene un tumor, tal como un tumor sólido. Como tal, la invención proporciona una opción terapéutica que puede usarse para tratar un tumor existente. En un aspecto de la invención, el sujeto tiene un tumor sólido existente. La invención se puede usar como prevención, o preferentemente como tratamiento en sujetos que ya tienen un tumor sólido. En un aspecto, la invención no se usa como preventiva o profiláctica.

[0185] En un aspecto, se puede potenciar la regresión tumoral, se puede deteriorar o reducir el crecimiento tumoral y/o se puede potenciar el tiempo de supervivencia usando la invención como se describe en el presente documento, por ejemplo en comparación con otros tratamientos contra el cáncer (por ejemplo, tratamientos de referencia para un cáncer dado).

[0187] El procedimiento para tratar o prevenir el cáncer como se describe en el presente documento comprende además la etapa de identificar a un sujeto que tiene cáncer, en particular identificar a un sujeto que tiene un tumor tal como un tumor sólido.

[0189] La pauta posológica de un tratamiento descrito en el presente documento que es eficaz para tratar a un paciente con cáncer puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de enfermedad, edad y peso del paciente, y la capacidad del tratamiento para provocar una respuesta antineoplásica en el sujeto. La selección de una dosificación apropiada estará dentro de la capacidad de un experto en la técnica. Por ejemplo, 0,01, 0,1, 0,3, 0,5, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40 o 50 mg/kg. En algunos modos de realización, dicha cantidad es una cantidad de dosificación unitaria (o una fracción entera de la misma) apropiada para la administración de acuerdo con un régimen de dosificación que se ha determinado que se correlaciona con un resultado deseado o beneficioso cuando se administra a una población pertinente (es decir, con un régimen de dosificación terapéutica).

[0191] El anticuerpo de acuerdo con cualquier aspecto de la invención como se describe en el presente documento puede estar en forma de una composición farmacéutica que comprende adicionalmente un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones incluyen, por ejemplo, formulaciones de dosificación líquidas, semisólidas y sólidas, tales como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infusibles), dispersiones o suspensiones, comprimidos, pastillas o liposomas. En algunos modos de realización, una forma preferente puede depender del modo de administración y/o aplicación terapéutica previstos. Las composiciones farmacéuticas que contienen el anticuerpo se pueden administrar por cualquier procedimiento apropiado conocido en la técnica, incluyendo, sin limitación, oral, mucosa, por inhalación, tópica, bucal, nasal, rectal o parenteral (por ejemplo, intravenosa, infusión, intratumoral, intranodal, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular, intradérmica, transdérmica u otros tipos de administración que implican la ruptura física de un tejido de un sujeto y la administración de la composición farmacéutica a través de la ruptura en el tejido). Dicha formulación, por ejemplo, puede estar en forma de una solución inyectable o infusible que es adecuada para administración intradérmica, intratumoral o subcutánea, o para infusión intravenosa. La administración puede implicar dosificación intermitente. De forma alternativa, la administración puede implicar dosificación continua (por ejemplo, perfusión) durante al menos un período de tiempo seleccionado, simultáneamente o entre la administración de otros compuestos.

[0193] En algunos modos de realización, el anticuerpo se puede preparar con vehículos que lo protegen contra la liberación y/o degradación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, tal como implantes, parches transdérmicos y sistemas de suministro microencapsulados. Se pueden usar polímeros biodegradables biocompatibles.

[0195] Los expertos en la técnica apreciarán, por ejemplo, que la vía de suministro (por ejemplo, oral frente a intravenosa frente a subcutánea frente a intratumoral, etc.) puede afectar a la cantidad de dosis y/o la cantidad de dosis requerida puede afectar a la vía de suministro. Por ejemplo, cuando son de interés concentraciones en particular altas de un agente dentro de un sitio o localización particular (por ejemplo, dentro de un tumor), puede ser deseable y/o útil un suministro focalizado (por ejemplo, en este ejemplo, suministro intratumoral). Otros factores a considerar cuando se optimizan las vías y/o pauta de dosificación para un régimen terapéutico dado pueden incluir, por ejemplo, el cáncer particular que se está tratando (por ejemplo, tipo, estadio, localización, etc.), el estado clínico de un sujeto (por ejemplo, edad, salud general, etc.), la presencia o ausencia de politerapia y otros factores conocidos por los médicos.

[0197] Las composiciones farmacéuticas típicamente deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición se puede formular como una solución, microemulsión, dispersión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentración de fármaco. Se pueden preparar soluciones inyectables estériles incorporando el anticuerpo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización filtrada. Las formulaciones para administración parenteral incluyen, pero no se limitan a, suspensiones, soluciones, emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos, pastas y formulaciones implantables de liberación mantenida o biodegradables como se analiza en el presente documento. Las formulaciones inyectables estériles se pueden preparar usando un diluyente o disolvente parenteralmente aceptable no tóxico. Cada composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la presente invención puede incluir agentes dispersantes, agentes humectantes, agentes de suspensión, agentes isotónicos, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, vehículos, excipientes, sales o estabilizantes farmacéuticamente aceptables que no son tóxicos para los sujetos en las dosificaciones y concentraciones empleadas. Preferentemente, dicha composición puede comprender además un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable para su uso en el tratamiento del cáncer que es compatible con un procedimiento y/o sitio de administración dado, por ejemplo para administración parenteral (por ejemplo, inyección subcutánea, intradérmica o intravenosa), intratumoral o peritumoral.

[0199] Aunque un modo de realización de las composiciones para su uso de acuerdo con la presente invención puede no ser eficaz para lograr un efecto terapéutico positivo en todos los sujetos, debería hacerlo en un uso de composiciones farmacéuticas y regímenes de dosificación que sean consistentes con las buena práctica médica y un número estadísticamente significativo de sujetos como se determina por cualquier prueba estadística conocida en la técnica, tal como la prueba de la t de Student, la prueba de la x2, la prueba de la U de acuerdo con Mann y Whitney, la prueba de Kruskal-Wallis (prueba H), prueba de Jonckheere-Terpstra y la prueba de Wilcoxon.

[0201] Cuando en el presente documento antes y posteriormente se menciona un tumor, una enfermedad tumoral, un carcinoma o un cáncer, también se implica, de forma alternativa o además, metástasis en el órgano o tejido original y/o en cualquier otra localización, cualquiera que sea la localización del tumor y/o la metástasis.

[0203] Como se analiza en el presente documento, la presente invención se refiere a la disminución de linfocitos T reguladores (Treg). Por tanto, en un aspecto de la invención, el anticuerpo anti-CD25 disminuye o reduce los linfocitos T reguladores infiltrantes del tumor. En un aspecto dicha disminución es por medio de ADCC. En otro aspecto, dicha disminución es por medio de ADCP. El anticuerpo anti-CD25 también puede disminuir o reducir los linfocitos T reguladores circulantes. En un aspecto dicha disminución es por medio de ADCC. En otro aspecto, dicha disminución es por medio de ADCP.

[0205] Como tal, también se describe un procedimiento para disminuir linfocitos T reguladores en un tumor en un sujeto, que comprende administrar a dicho sujeto un anticuerpo anti-CD25. En un modo de realización preferente, se disminuyen los Treg en un tumor sólido. Por "disminuido" se quiere decir que el número, proporción o porcentaje de Treg disminuye en relación con cuando no se administra un anticuerpo anti-CD25. En modos de realización particulares de la invención como se describe en el presente documento, se disminuye más de aproximadamente un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 99 % de los linfocitos T reguladores infiltrantes del tumor.

[0207] Como se usa en el presente documento, "linfocitos T reguladores" ("Treg" o "linfocitos Treg") se refieren a un linaje de linfocitos T CD4+ especializados en controlar la autoinmunidad, alergia e infección. Típicamente, regulan las actividades de las poblaciones de linfocitos T, pero también pueden influir en determinados tipos celulares del sistema inmunitario innato. Los Treg normalmente se identifican por la expresión de los biomarcadores CD4, CD25 y Foxp3. Los linfocitos Treg naturales normalmente constituyen aproximadamente un 5-10% de los linfocitos T CD4+ periféricos. Sin embargo, dentro de un microambiente tumoral (es decir, linfocitos Treg infiltrantes del tumor), pueden representar hasta un 20-30 % de la población de linfocitos T CD4+ total.

[0209] Los linfocitos Treg humanos activados pueden destruir directamente células diana tales como linfocitos T efectores y APC, a través de vías dependientes de perforina o granzima B; los linfocitos Treg del antígeno asociado a linfocitos T citotóxicos 4 (CTLA4+) inducen la expresión de indolamina 2,3-dioxigenasa (IDO) por APC, y estos, a su vez, suprimen la activación de linfocitos T reduciendo el triptófano; los linfocitos Treg pueden liberar interleucina-10 (IL-10) y factor de crecimiento transformante (TGFp)in vivo,y por tanto inhiben directamente la activación de linfocitos T y suprimen la función de APC inhibiendo la expresión de las moléculas MHC, CD80, CD86 e IL-12. Los linfocitos Treg también pueden suprimir la inmunidad expresando niveles altos de CTLA4, que se puede unir a CD80 y CD86 en células presentadoras de antígenos y prevenir la activación apropiada de linfocitos T efectores.

[0210] En un modo de realización preferente de la presente invención, se incrementa la proporción de linfocitos T efectores con respecto a linfocitos T reguladores en un tumor sólido. En algunos modos de realización, se incrementa la proporción de linfocitos T efectores con respecto a linfocitos T reguladores en un tumor sólido a más de 5, 10, 15, 20, 40 u 80.

[0212] Una célula efectora inmunitaria se refiere a una célula inmunitaria que está implicada en la fase efectora de una respuesta inmunitaria. Las células inmunitarias ejemplares incluyen una célula de origen mieloide o linfático, por ejemplo, linfocitos (por ejemplo, linfocitos B y linfocitos T, incluyendo linfocitos T citolíticos (CTL)), linfocitos citolíticos, linfocitos citolíticos naturales, macrófagos, monocitos, eosinófilos, neutrófilos, células polimorfonucleares, granulocitos, mastocitos y basófilos.

[0214] Las células efectoras inmunitarias implicadas en la fase efectora de una respuesta inmunitaria expresan receptores de Fc específicos y llevan a cabo funciones inmunitarias específicas. Una célula efectora puede inducir citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), por ejemplo, un neutrófilo que puede inducir ADCC. Por ejemplo, los monocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos y linfocitos que expresan FcaR están implicados en la destrucción específica de células diana y en la presentación de antígenos a otros componentes del sistema inmunitario, o en la unión a células que presentan antígenos. Una célula efectora también puede fagocitar un antígeno diana, una célula diana o un microorganismo. Como se analiza en el presente documento, los anticuerpos de acuerdo con la presente invención se pueden optimizar la capacidad de inducir ADCC.

[0216] En algunos modos de realización, se puede administrar un agente diferente contra el cáncer en combinación con el anticuerpo por medio de la misma o diferentes vías de suministro y/o de acuerdo con diferentes pautas. De forma alternativa o adicionalmente, en algunos modos de realización, una o más dosis de un primer agente activo se administran sustancialmente de manera simultánea con, y en algunos modos de realización por medio de una vía común y/o como parte de una única composición con, uno o más de otros agentes activos. Los expertos en la técnica apreciarán además que algunos modos de realización de politerapias proporcionadas de acuerdo con la presente invención logran efectos sinérgicos; en algunos de dichos modos de realización, la dosis de uno o más agentes utilizados en la combinación puede ser materialmente diferente (por ejemplo, menor) y/o se puede suministrar por una vía alternativa que la estándar, preferente o necesaria cuando ese agente se utiliza en un régimen terapéutico diferente (por ejemplo, como monoterapia y/o como parte de una politerapia diferente).

[0217] En algunos modos de realización, donde se utilizan dos o más agentes activos de acuerdo con la presente invención, dichos agentes se pueden administrar simultánea o secuencialmente. En algunos modos de realización, la administración de un agente se programa específicamente en relación con la administración de otro agente. Por ejemplo, en algunos modos de realización, se administra un primer agente de modo que se observa un efecto particular (o se espera que se observe, por ejemplo, en base a estudios de población que muestran una correlación entre un régimen de dosificación dado y el efecto particular de interés). En algunos modos de realización, los regímenes de dosificación relativos deseados para agentes administrados en combinación se pueden evaluar o determinar empíricamente, por ejemplo, usando modelosex vivo, in vivoy/oin vitro;en algunos modos de realización, dicha evaluación o determinación empírica se realizain vivo,en una población de pacientes (por ejemplo, de modo que se establece una correlación) o, de forma alternativa, en un paciente particular de interés.

[0218] Los autores de la presente invención han demostrado que un anticuerpo anti-CD25 muestra efectos terapéuticos mejorados cuando se combina con un inhibidor de punto de control inmunitario. Como se muestra en los presentes ejemplos, una politerapia con un anticuerpo anti-CD25 y un inhibidor de punto de control inmunitario puede tener efectos sinérgicos en el tratamiento de tumores establecidos. Los datos con respecto a PD-1/PD-L1 en los presentes ejemplos se refieren a la interferencia con la interacción PD-1/PD-L1. Como tal, la interacción entre el receptor PD-1 y el ligando PD-L1 se puede bloquear, dando como resultado un "bloqueo de PD-1". En un aspecto, la combinación puede dar lugar a una regresión tumoral potenciada, un deterioro o reducción potenciado del crecimiento tumoral y/o se puede potenciar el tiempo de supervivencia usando la invención como se describe en el presente documento, por ejemplo, en comparación con anticuerpos anti-CD25 o bien el bloqueo PD-1/PD-L1 solo (directamente, usando un anticuerpo anti-PD1, o indirectamente, usando un anticuerpo anti-PD-L1).

[0220] Como se usa en el presente documento, "punto de control inmunitario" o "proteína de punto de control inmunitario" se refieren a proteínas que pertenecen a vías inhibidoras en el sistema inmunitario, en particular para la modulación de respuestas de linfocitos T. En condiciones fisiológicas normales, los puntos de control inmunitarios son fundamentales para prevenir la autoinmunidad, especialmente durante una respuesta a un patógeno. Las células cancerosas pueden alterar la regulación de la expresión de las proteínas de punto de control inmunitario para evitar la vigilancia inmunitaria.

[0222] Los ejemplos de proteínas de punto de control inmunitario incluyen, pero no se limitan a, PD-1, CTLA-4, BTLA, KIR, LAG3, TIGIT, CD155, B7H3, B7H4, VISTA y TIM3, y también OX40, GITR, ICOS, 4-1BB y HVEM. Las proteínas de punto de control inmunitario también se pueden referir a proteínas que se unen a otras proteínas de punto de control inmunitario que modulan la respuesta inmunitaria de manera inhibidora. Dichas proteínas incluyen PD-L1, PD-L2, CD80, CD86, HVEM, LLT1 y GAL9.

[0224] Los "inhibidores de proteína de punto de control inmunitario" se refieren a cualquier proteína que puede interferir con la señalización y/o las interacciones proteína-proteína mediadas por una proteína de punto de control inmunitario. En un aspecto de la invención, la proteína del punto de control inmunitario es PD-1 o PD-L1. En un aspecto preferente de la invención como se describe en el presente documento, el inhibidor de punto de control inmunitario interfiere con las interacciones PD-1/PD-L1 por medio de los anticuerpos anti-PD-1 o anti PD-L1.

[0225] Como tal, también se describe un procedimiento para tratar el cáncer, que comprende administrar un anticuerpo anti-CD25 y un inhibidor de punto de control a un sujeto. La invención también proporciona un anticuerpo anti-CD25 y un inhibidor de punto de control inmunitario para su uso en el tratamiento del cáncer.

[0227] También se describe el uso de un anticuerpo anti-CD25 y un inhibidor de punto de control inmunitario para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer. La administración del anticuerpo anti-CD25 y el inhibidor de punto de control inmunitario puede ser simultánea, separada o secuencial.

[0229] La presente invención proporciona una combinación de un anticuerpo anti-CD25 y un inhibidor de punto de control inmunitario para su uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto, en el que el anticuerpo anti-CD25 y el inhibidor de punto de control inmunitario se administran simultáneamente, por separado o secuencialmente. Dicho anticuerpo anti-CD25 humano es una IgG1 humana y se puede usar específicamente en combinación con anticuerpos dirigidos a puntos de control inmunitarios que presentan o bien carecen de secuencias que permiten ADCC, ADCP y/o CDC.

[0231] También se describe un anticuerpo anti-CD25 para su uso en el tratamiento del cáncer, en el que dicho anticuerpo es para administración en combinación con un inhibidor de punto de control inmunitario. También se describe el uso de un anticuerpo anti-CD25 en la fabricación de un medicamento para tratar el cáncer, en el que dicho medicamento es para administración en combinación con un inhibidor de punto de control inmunitario.

[0233] También se describe una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-CD25 y un inhibidor de punto de control inmunitario en un medio farmacéuticamente aceptable. Como se analiza anteriormente, el inhibidor de punto de control inmunitario puede ser un inhibidor de PD-1, es decir, un antagonista de PD-1.

[0235] PD-1 (proteína de muerte celular programada 1), también conocida como CD279, es un receptor de superficie celular expresado en linfocitos B y linfocitos T activados. Se ha demostrado que la interacción con sus ligandos atenúa las respuestas de linfocitos T tantoin vitrocomoin vivo.PD-1 se une a dos ligandos, PD-L1 y PD-L2. PD-1 pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas. La señalización de PD-1 requiere la unión a un ligando de PD-1 en estrecha proximidad a un antígeno peptídico presentado por el complejo principal de histocompatibilidad (MHC) (Freeman (2008) Proc Natl Acad Sci u Sa105,10275-6).Por lo tanto, proteínas, anticuerpos o moléculas pequeñas que previenen la cofijación de PD-1 y TCR en la membrana de linfocitos T son antagonistas de PD-1 útiles.

[0237] En un modo de realización, el antagonista del receptor PD-1 es un anticuerpo anti-PD-1, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a PD-1 y bloquea la unión de PD-L1 a PD-1. El anticuerpo anti-PD-1 puede ser un anticuerpo monoclonal. El anticuerpo anti-PD-1 puede ser un anticuerpo humano o humanizado. Un anticuerpo anti-PD-1 es un anticuerpo que se puede unir específicamente al receptor PD-1. Los anticuerpos anti-PD-1 conocidos en la técnica incluyen nivolumab y pembrolizumab.

[0239] Los antagonistas de PD-1 también incluyen compuestos o agentes que se unen a y/o bloquean un ligando de PD-1 para interferir con o inhibir la unión del ligando al receptor PD-1, o se unen directamente a y bloquean el receptor PD-1 sin inducir la transducción de señal inhibidora a través del receptor PD-1. De forma alternativa, el antagonista del receptor PD-1 se puede unir directamente al receptor PD-1 sin desencadenar la transducción de señal inhibidora y también se une a un ligando del receptor PD-1 para reducir o inhibir que el ligando desencadene la transducción de señal a través del receptor PD-1. Al reducir el número y/o la cantidad de ligandos que se unen al receptor PD-1 y desencadenan la transducción de una señal inhibidora, menos células se atenúan por la señal negativa suministrada por la transducción de señal de PD-1 y se puede lograr una respuesta inmunitaria más sólida.

[0241] En un modo de realización, el antagonista del receptor PD-1 es un anticuerpo anti-PD-L1, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a PD-L1 y bloquea la unión de PD-L1 a PD-1. El anticuerpo anti-PD-L1 puede ser un anticuerpo monoclonal. El anticuerpo anti-PD-L1 puede ser un anticuerpo humano o humanizado, tal como atezolizumab (MPDL3280A).

[0243] También se describe un procedimiento para tratar el cáncer, que comprende administrar un anticuerpo anti-CD25 y un anticuerpo que es un agonista de una vía coestimuladora activadora de linfocitos T a un sujeto. Los agonistas de anticuerpos de una vía coestimuladora activadora de linfocitos T incluyen, sin limitación, anticuerpos agonistas contra ICOS, GITR, OX40, CD40, LIGHT y 4-1BB.

[0245] Los autores de la presente invención han identificado que, sorprendentemente, el nivel del receptor de Fc inhibidor, FcYRIIb (CD32b), se puede incrementar en tumores sólidos. Por tanto, otro procedimiento para tratar el cáncer comprende administrar un anticuerpo anti-CD25 y un compuesto que disminuye, bloquea, inhibe y/o antagoniza FcYRlIb (CD32b). Dicho antagonista de FcYRIIb puede ser una molécula pequeña que interfiere en la señalización intracelular inducida por FcYRIIb, anticuerpos modificados que no se acoplan al receptor de FcYRIIb inhibidor o un anti-FcYRIIb humano (anticuerpo anti-CD32b). Por ejemplo, los anticuerpos anti-FcYRIIb humano antagonistas también se han caracterizado por sus propiedades antitumorales (Roghanian Aet al.,2015, Cancer Cell. 27, 473­ 488; Rozan Cet al.,2013, Mol Cancer Ther. 12:1481-91; documentos WO2015173384; WO2008002933).

[0247] También se describe un anticuerpo biespecífico que comprende:

[0249] (a) un primer resto de unión a antígeno que se une a CD25; y

[0251] (b) un segundo resto de unión a antígeno que se une a una proteína de punto de control inmunitario, un antígeno asociado a tumor, es (o se basa en) un anticuerpo anti-receptor de Fc activador humano (por ejemplo, anti-FcgRI, anti-FcgRIIa, anti-FcgRIII), o es (o se basa en) un anticuerpo anti-FcYRIIb humano antagonista;

[0253] en el que el anticuerpo biespecífico es preferentemente un anticuerpo IgG1 que se une a al menos un receptor de F<cy>activador con alta afinidad y disminuye los linfocitos T reguladores infiltrantes del tumor.

[0254] Como se usa en el presente documento, "antígeno asociado a tumor" se refiere a antígenos expresados en células tumorales, lo que las hace distinguibles de las células no cancerosas contiguas a ellas, e incluyen, sin limitación, CD20, CD38, PD-L1, EGFR, EGFRV3, CEA, TYRP1 y HER2. Se han publicado diversos artículos de revisión que describen antígenos asociados a tumor pertinentes y los correspondientes agentes de anticuerpos antitumorales terapéuticamente útiles (véase, por ejemplo, Sliwkowski & Mellman (2013) Science341,192-8).Dichos antígenos y correspondientes anticuerpos incluyen, sin limitación, CD22 (blinatumomab), CD20 (rituximab, tositumomab), CD56 (lorvotuzumab), CD66e/CEA (labetuzumab), CD152/CTLA-4 (ipilimumab), CD221/IGF1R (MK-0646), CD326/Epcam (edrecolomab), CD340/HER2 (trastuzumab, pertuzumab) y EGFR (cetuximab, panitumumab).

[0255] En un aspecto, el anticuerpo biespecífico como se describe en el presente documento da lugar a ADCC o, en un aspecto, a ADCC potenciada.

[0257] El anticuerpo biespecífico se puede unir a un epítopo específico en CD25 y un epítopo específico en la proteína del punto de control inmunitario o antígeno asociado a tumor como se define en el presente documento. El segundo resto de unión a antígeno se puede unir a PD-L1. También se describe un anticuerpo biespecífico que comprende:

[0258] (a) un primer resto de unión a antígeno que se une a CD25; y

[0260] (b) un segundo resto de unión a antígeno que se une a una proteína de punto de control inmunitario expresada en una célula tumoral.

[0262] La proteína de punto de control inmunitario expresada en una célula tumoral puede ser PD-L1, VISTA, GAL9, B7H3 o B7H4. Todavía preferentemente, el anticuerpo anti-CD25 es un anticuerpo IgG1 que se une a los receptores de F<cy>con alta afinidad y disminuye los linfocitos T reguladores infiltrantes del tumor.

[0264] Un experto en la técnica sería capaz de producir un anticuerpo biespecífico usando procedimientos conocidos. El anticuerpo biespecífico descrito en el presente documento se puede usar en cualquiera de los aspectos descritos en el presente documento. Preferentemente, el segundo resto de unión a antígeno dentro del anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención se une a PD-1 humano, PD-L1 humano o CTLA-4 humano.

[0266] En un aspecto, el anticuerpo biespecífico se puede unir a CD25 y a receptores inmunomoduladores expresados en niveles altos en Treg infiltrantes del tumor, por ejemplo CTLA4, ICOS, GlTR, 4-1BB u OX40.

[0268] También se describe un kit que comprende un anticuerpo anti-CD25 como se describe en el presente documento, y un inhibidor de punto de control inmunitario, preferentemente un antagonista de PD-1 (directamente, usando un anticuerpo anti-PD1, o indirectamente, usando un anticuerpo anti-PD-LI) como se analiza en el presente documento. En un aspecto, el inhibidor de punto de control inmunitario es anti-PD-LI. De forma alternativa, el kit puede comprender un anticuerpo anti-CD25 como se describe en el presente documento, y un anticuerpo que es un agonista de una vía coestimuladora activadora de linfocitos T. El kit puede incluir instrucciones para su uso.

[0269] En otro aspecto, el kit puede comprender un anticuerpo anti-CD25 como se describe en el presente documento y un compuesto que disminuye, bloquea, inhibe y/o antagoniza FcYRIIb (CD32b), o de forma alternativa, un anticuerpo anti-CD25 como se describe en el presente documento y un anticuerpo anti-receptor de Fc activador humano (anti-FcYRI, anti-FcYRIIc o anti-FcYRIIIa).

[0271] Cualquier aspecto como se describe en el presente documento se puede realizar en combinación con tratamientos contra el cáncer adicionales. En particular, el anticuerpo anti-CD25 y el inhibidor de punto de control inmunitario (o cualquier otra politerapia) se pueden administrar en combinación con anticuerpos coestimuladores, quimioterapia y/o radioterapia, tratamiento dirigido o tratamiento con anticuerpos monoclonales.

[0273] Una entidad quimioterapéutica como se usa en el presente documento se refiere a una entidad que es destructiva para una célula, es decir, la entidad reduce la viabilidad de la célula. La entidad quimioterápica puede ser un fármaco citotóxico. Un agente quimioterápico contemplado incluye, sin limitación, agentes alquilantes, antraciclinas, epotilonas, nitrosoureas, etileniminas/metilmelamina, sulfonatos de alquilo, agentes alquilantes, antimetabolitos, análogos de pirimidina, epipodofilotoxinas, enzimas tales como L-asparaginasa; modificadores de la respuesta biológica tales como IFNa, IFN-y, IL-2, IL-12, G-CSF y GM-CSF; complejos de coordinación de platino tales como cisplatino, oxaliplatino y carboplatino, antracenodionas, urea sustituida tal como hidroxiurea, derivados de metilhidracina incluyendo N-metilhidracina (MIH) y procarbacina, supresores adrenocorticales tales como mitotano (o,p'-DDD) y aminoglutetimida; hormonas y antagonistas, incluyendo antagonistas de los adrenocorticoesteroides tales como prednisona y equivalentes, dexametasona y aminoglutetimida; progestinas tales como caproato de hidroxiprogesterona, acetato de medroxiprogesterona y acetato de megestrol; estrógeno tal como dietilestilbestrol y equivalentes de etinilestradiol; antiestrógeno tal como tamoxifeno; andrógenos, incluyendo propionato de testosterona y fluoximesterona/equivalentes; antiandrógenos tales como flutamida, análogos de la hormona liberadora de gonadotropina y leuprorrelina; y antiandrógenos no esteroideos tales como flutamida.

[0274] El tratamiento del cáncer adicional también puede incluir la administración de una vacuna contra el cáncer. El término "vacunas contra el cáncer" como se usa en el presente documento se refiere a vacunas contra el cáncer terapéuticas administradas a pacientes con cáncer y diseñadas para erradicar células cancerosas a través del fortalecimiento de las respuestas inmunitarias del propio paciente. Las vacunas contra el cáncer incluyen vacunas de células tumorales (autólogas y alogénicas), vacunas de células dendríticas (generadasex vivoy activadas por péptidos), vacunas contra el cáncer basadas en proteínas/péptidos y vacunas genéticas (vacunas basadas en ADN, ARN y virus). En consecuencia, las vacunas contra el cáncer terapéuticas, en principio, se pueden utilizar para inhibir el crecimiento adicional de cánceres avanzados y/o tumores recidivantes resistentes a tratamientos convencionales, tales como cirugía, radioterapia y quimioterapia. Las vacunas basadas en células tumorales (autólogas y alogénicas) incluyen aquellas modificadas genéticamente para segregar agentes inmunoestimuladores solubles tales como citocinas (IL2, IFN-g, IL12, GMCSF, FLT3L), anticuerpos Fv monocatenarios contra receptores inmunomoduladores (PD-1, CTLA-4, GITR, ICOS, OX40, 4-1BB) y/o para expresar en su membrana el ligando para receptores inmunoestimuladores tales como ligando ICOS, ligando 4-1BB, ligando GITR y/o ligando OX40, entre otros.

[0276] El tratamiento del cáncer puede ser otros anticuerpos o reactivos de moléculas pequeñas que reducen la regulación inmunitaria en la periferia y dentro del microambiente tumoral, por ejemplo, moléculas que se dirigen a las vías de TGFb, IDO (indolamina desoxigenasa), arginasa y/o CSF1R.

[0278] "En combinación" se puede referir a la administración del tratamiento adicional antes, al mismo tiempo que o después de la administración de cualquier aspecto de acuerdo con la presente invención.

[0280] La invención se describirá ahora además por medio de los siguientes ejemplos, que tienen como objetivo ayudar a un experto en la técnica en la realización de la invención, con referencia a los dibujos en los que:

[0282] Figura 1- muestra la expresión de linfocitos T reguladores CD25pos en sangre y ganglio linfático (A) Expresión de CD25 (clon de anticuerpo de detección 7D4; anti-CD25 de ratón, isotipo IgM) en la superficie de subconjuntos de linfocitos T que están presentes en ganglios linfáticos (LN) y linfocitos infiltrantes del tumor (TIL) de diferentes modelos tumorales. Los histogramas son representativos de un ratón para cada modelo tumoral. (B) Porcentaje de células positivas para CD25 y MFI de CD25 en subconjuntos de PBMC y linfocitos T a partir de datos agrupados (n = 10) de experimentos individuales usando el modelo tumoral MCA205. La misma evaluación (restringida a subconjuntos de linfocitos T) se ha realizado en modelos tumorales MC38, B16 y CT26 en (C) y (D). Las barras de error representan el error estándar (EE) de la media. Se indica la pertinencia estadística entre células positivas para<c>D4, positivas para Foxp3 y células positivas para CD8 o positivas para CD4/negativas para Foxp3.

[0284] Figura 2- muestra la restricción de la disminución mediada por anti-CD25 (aCD25) de linfocitos T reguladores positivos para CD25 a sangre y ganglio linfático en el modelo tumoral MCA205. (A) Expresión de CD25 (clon de anticuerpo de detección 7D4; anti-CD25 de ratón, isotipo IgM) y FoxP3 en linfocitos T positivos para CD4. (B) Intensidad de fluorescencia media de CD25 en Treg (seleccionada en linfocitos T positivos para CD4 y positivos para FoxP3). A los ratones que portan tumor se les inyectaron 200 |jg de anti-CD25-r1 (aCD25-r1; IgG1 de rata anti-CD25), anti-CD25-m2a (aCD25-m2a; IgG2a murina anti-CD25), anti-CTLA-4 (aCTLA-4; clon anti-CTLA4 B56), o no se los trató (sin tr.) los días 5 y 7 después de la inoculación s.c. con 5 x 105 células MCA205. Se obtuvieron células mononucleares de sangre periférica (PBMC), ganglios linfáticos (LN) y linfocitos infiltrantes del tumor (TIL) el día 9, se procesaron y se tiñeron para análisis de citometría de flujo.

[0286] Figura 3- muestra los efectos mediados por anti-CD25 (aCD25) en subpoblaciones de linfocitos T en el modelo tumoral MCA205 de la fig. 2. (A) Porcentaje de células positivas para FoxP3 de linfocitos T positivos para CD4 totales y (B) número absoluto de linfocitos T positivos para CD4, positivos para FoxP3 en PBMC (número de células/ml), LN (número total de células en tres ganglios linfáticos de drenaje) y TIL (número de células/g de tumor) se muestran en paralelo a linfocitos T positivos para CD4, negativos para FoxP3 (C) la proporción de linfocitos T efectores positivos para CD4, positivos para FoxP3 (linfocitos Treg) y (D) la proporción de linfocitos T efectores positivos para CD8) / linfocitos Treg, seleccionados en linfocitos T positivos para CD4, negativos para FoxP3 y positivos para CD8.

[0288] Figura 4- muestra histogramas representativos para la expresión de F<cy>R en linfocitos B (positivos para CD19), linfocitos T (positivos para CD3, positivos para CD5), linfocitos NK (positivos para NK1.1), granulocitos (CD11b+ Ly6G+), células dendríticas convencionales (cDC; CD11c alto positivas para MHCII) y monocitos/macrófagos (Mono/M$; positivos para CD11b, negativos para Ly6G, negativos para NK1.1, negativos para CD11c/bajo), como se evalúa por citometría de flujo en el modelo tumoral MCA205 no tratado (véase la fig. 2) 10 días después de la exposición tumoral. Las barras de error representan SEM (n=3); los datos corresponden a de uno de tres experimentos separados en los que los hallazgos fueron consecuentes.

[0290] Figura 5- muestra cómo la disminución de Treg depende de la expresión de receptores de Fc-gamma activadores. A los ratones naturales C57BL/6 (wt) y a los ratones Fcerlg-/- se les inyectó por vía subcutánea 5 x 105 células MCA205 el día 0 y a continuación se les inyectaron 200 jg de anti-CD25 los días 5 y 7. Se obtuvieron tumores, ganglios linfáticos drenantes y sangre el día 9, se procesaron y se tiñeron para análisis de citometría de flujo. Se identificaron linfocitos T reguladores por expresión de CD4 y FoxP3 en PBMc , LN y TIL. Se muestra el porcentaje de Foxp3+ de células CD4+ totales (A). Se aplicó el mismo enfoque en natural (wt), Fcgr3-/-, Fcgr4-/- o Fcgr2b-/-, demostrando la inhibición de la disminución de Treg mediada por aCD25-r1 en tumores por FcYRIlb. Los gráficos muestran la cuantificación del porcentaje de Treg (CD4+ Foxp3+) de linfocitos T CD4+ totales en TIL solo (B).

[0291] Figura 6- muestra el efecto sinérgico de la combinación de anti-CD25-m2a y anti-PD-1 que da como resultado la erradicación de tumores establecidos. Se muestran curvas de crecimiento de ratones individuales (A) y la media del volumen tumoral de MCA205 para cada grupo de tratamiento con el tiempo (B). En cada gráfico se indica el número de supervivientes sin tumor después de 100 días o la significación estadística. Las barras de error representan el EE de la media. También se muestran curvas de supervivencia de Kaplan-Meier con datos acumulativos de dos experimentos separados. También se muestran curvas de supervivencia de ratones inyectados con células tumorales MC38 (C) o CT26 (D) y tratados como se describe en el modelo MCA205 (n = 10 por condición). A los ratones se les inyectaron por vía subcutánea 5 x 105 células MCA205, MC38 o CT26 y a continuación se trataron con el anti-CD25 indicado (200 |jg i.p.) el día 5, seguido (o no) por la administración de anti-PD-1 (aPD-1, anti-PD1, clon RMP1-14; 100 jg i.p.) los días 6, 9 y 12. El tamaño tumoral se midió dos veces por semana y se sacrificó a los ratones cuando cualquier diámetro ortogonal alcanzó 150 mm.

[0293] Figura 7- muestra análisis funcionales del modelo tumoral MCA205 que se estableció como se describe en la fig.

[0294] 6, usando células inmunitarias que se obtuvieron el día 14. Proporción (%) de células Ki67+ en linfocitos T CD4+ Foxp3- infiltrantes del tumor y en linfocitos T CD8+ en tumores MCA205. (A) y se muestra la proporción Tef/Treg positivos para CD4, negativos para FoxP3 y la proporción positivos para CD8/Treg (B) en el tumor para cada grupo de tratamiento. También se muestra la tinción intracelular de linfocitos infiltrantes del tumor para la expresión de IFNg después de la reestimulaciónex vivocon PMA y ionomicina (C) y la frecuencia de linfocitos T efectores productores de interferón gamma (IFN<y>) (D) para los mismos grupos de tratamiento en células positivas para CD4 y positivas para CD8. Los histogramas en (B) corresponden a un ratón representativo por grupo de tratamiento. Los gráficos representativos de dos experimentos separados (n=10) y la significación estadística se proporcionan en (A), (B) y (D).

[0296] Figura 8- muestra que la eliminación tumoral por anti-CD25-m2a/anti-PD1 es dependiente de linfocitos T CD8+. Curvas de crecimiento tumoral MCA205 de ratones individuales no tratados (sin tr., A), tratados con una combinación de anti-CD25-m2a con anti-PD-1 (aPD-1 aCD25-m2a; B), o la misma combinación que incluye además anti-CD8 (aPD-1 aCD25-m2a aCD8; C). El número de supervivientes después de 40 días para cada grupo de tratamiento (n=7) se indica en cada gráfico. También se generaron las correspondientes curvas de supervivencia de Kaplan-Meier (D). A los ratones se les inyectaron s.c. 5 x 105 células MCA205 y se trataron con 200 jg de anti-CD25-m2a (aCD25-m2a, clon PC61, isotipo lgG2a de ratón) el día 5, seguido de 100 jg de anti-PD-1 (aPD-1, clon RMP1-14) i.p. los días 6, 9 y 12. En el grupo indicado de ratones, las células positivas para CD8 disminuyeron inyectando 200 jg de anti-CD8 (aCD8, clon 2.43) i.p. los días 4, 9, 12 y 17. El tamaño tumoral se midió dos veces por semana y se sacrificó a los ratones cuando cualquier diámetro ortogonal alcanzó 150 mm.

[0298] Figura 9- muestra que el tratamiento anti-CD25-m2a/anti-PD-1 induce al menos control tumoral parcial contra los tumores de melanoma B16. Curvas de crecimiento tumoral de B16 de ratones individuales tratados con Gvax solo o en combinación con los anticuerpos indicados, como se define en la figura 6 (A). También se generaron las correspondientes curvas de supervivencia de Kaplan-Meier (B). A los ratones se les inyectaron 5 x 104 células de melanoma B16 por vía intradérmica (id) y a continuación se trataron con 200 jg de anti-CD25 (aCD25-r1, clon PC61 isotipo IgG1 de rata o aCD25-m2a, clon PC61 isotipo IgG2a de ratón) el día 5, seguido de 200 jg de anti-PD-1 (aPD-1, clon RMP1-14) i.p. y 1 x 106 B16-Gvax irradiado (150 Gy) i.d. los días 6, 9 y 12. Se hizo un seguimiento del crecimiento tumoral y se sacrificaron los ratones cuando cualquier diámetro ortogonal alcanzó 150 mm o el día 80 del estudio, lo que pasara primero. La mediana de la supervivencia en días para los diferentes grupos (n, número de ratones) fue: 21 d para Gvax solo (n = 14), 27 d para Gvax aPD-1 (n = 15), 21 d para Gvax aCD25-r1 (n = 7), 33 d para Gvax aCD25-m2a (n = 8), 29 d para Gvax aPD-1 aCD25-r1 (n = 13) y 39 d para Gvax aPD-1 aCD25-m2a (n = 12).

[0300] Figura 10- muestra curvas de crecimiento tumoral CT26 de ratones individuales no tratados (PBS, solo vehículo), tratados con anti-CD25 de ratón que tiene lgG1 (PC61m1; isotipo IgG1 de ratón, por tanto con baja actividad de destrucción mediada por receptor de Fc, baja actividad de ADCC y CDC) o bien lgG2a (PC61m2; lgG2a de ratón, por tanto con alta actividad mediada por receptor de Fc, alta actividad de ADCC y CDC), y combinado además o no con anti-PD1 de ratón (aPD1 RMP1-14). Las células CT26 usadas para la implantación se obtuvieron durante el crecimiento en fase logarítmica y se resuspendieron en PBS frío. El día 1 del estudio, a cada ratón se le inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho 3 x 105 células en 0,1 ml de suspensión celular. El anti-CD25 de ratón se inyectó i.p. (10mg/kg) el día 6 (cuando se detectaron tumores palpables). El anti-PD1 de ratón se inyectó i.p. (100 jg/inyección) el día 7, día 10, día 14 y día 17. Los tumores se calibraron en dos dimensiones dos veces por semana para supervisar el crecimiento. Tamaño tumoral, en mm3, se calculó como sigue: Volumen tumoral = (w2 x l)/2 donde w = ancho y l = largo, en mm, del tumor. El criterio de valoración del estudio fue un volumen tumoral de 2000 mm3 o 60 días, lo que pasara primero.

[0301] Figura 11- muestra curvas de crecimiento tumoral de CT26 de ratones individuales no tratados (PBS, solo vehículo), tratados con anti-CD25 de ratón que tiene IgG1 o bien IgG2a (PC61m1 y PC61m2 con, respectivamente), y además combinados o no con anti-PD-L1 de ratón clon 10F.9G2 (aPDL1 10F.9G2). El modelo, régimen y análisis se realizaron como para el experimento de combinación basado en aPD1 de la fig. 10.

[0303] Figura 12- muestra curvas de crecimiento tumoral de MC38 de ratones individuales no tratados (PBS, solo vehículo), tratados con anti-CD25 de ratón que tiene IgG1 o bien IgG2a (PC61m1 y PC61m2, respectivamente), y además combinados o no con anti-PD1 de ratón clon RMP1-14 (aPD1 RMP1-14), como se describe para el modelo tumoral CT26 en la fig. 10. Las células de carcinoma de colon MC38 usadas para la implantación se obtuvieron durante el crecimiento en fase logarítmica y se resuspendieron en PBS frío. A cada ratón se le inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho 5 x 105 células tumorales en 0,1 ml de suspensión celular. Se supervisaron los tumores a medida que sus volúmenes se acercaron al intervalo diana de 100 a 150 mm3 Veintidós días después de la implantación tumoral, el día 1 del estudio, los animales con volúmenes tumorales individuales que varían de 63 - 196 mm3 se clasificaron en nueve grupos (n = 10) con volúmenes tumorales medios de grupo que varían de 104 - 108 mm3. Los tratamientos comenzaron el día D1 en ratones que portan tumor MC38 establecidos. Los efectos de cada tratamiento se compararon con un grupo de control tratado con vehículo que recibió PBS por vía intraperitoneal (i.p.) el día 1, día 2, día 5, día 9 y día 12. Se administró anti-PD1 i.p. a 100 pg/animal, dos veces por semana durante dos semanas, comenzando el día 2. PC61-m1 y PC61-m2a se administraron i.p. una vez el día 1 a 200 pg/animal. Se tomaron mediciones tumorales dos veces por semana hasta el día 45 y los animales individuales salieron del estudio al alcanzar el criterio de valoración de volumen tumoral de 1000 mm3.

[0305] Figura 13- muestra curvas de crecimiento tumoral de MC38 de ratones individuales no tratados (PBS, solo vehículo), tratados con anti-CD25 de ratón que tiene IgG1 o bien IgG2a (PC61m1 y PC61m2 con, respectivamente), y además combinados o no con anti-PD-L1 de ratón clon 10F.9G2 (aPDL1 10F.9G2). El modelo, régimen y análisis se realizaron como para el experimento de combinación basado en aPD1 de la fig. 12.

[0307] Figura 14- muestra la expresión de CD25 en células inmunitarias periféricas localizadas en tumores en muestras de distintos tipos de cánceres humanos. Los histogramas representativos demuestran la expresión de CD25 en subconjuntos de TIL de un carcinoma de ovario humano en estadio IV (metástasis peritoneal; A) y en un cáncer de vejiga humano (B). También se obtuvieron histogramas representativos para subconjuntos de linfocitos T positivos para CD8, positivos para CD4, negativos para FoxP3 y positivos para CD4, positivos para FoxP3 individuales dentro de PBMC y TIL que están aislados de otros tipos de cáncer (C). También se muestra la cuantificación de la expresión de CD25 como porcentaje (%) y la intensidad de fluorescencia media (MFI) en subconjuntos de linfocitos T individuales dentro de cada cohorte de pacientes estudiada para melanoma (panel superior), CPNM (panel central) y CCR (panel inferior) (D).

[0309] Figura 15- muestra datos sobre la expresión de CD25 en pacientes tratados con anti-PD-1. El análisis inmunohistoquímico (IHQ) múltiple de una metástasis de melanoma subcutáneo antes del tratamiento anti-PD-1 ("inicio") y después de dos infusiones ("semana 6") se muestra en paralelo a la cuantificación de tinción IHQ de CD8 y FoxP3 al inicio y en la semana 6 en dos pacientes, uno que responde y otro que no responde al tratamiento en la semana 6 (B; se muestra el recuento medio por campo de alto aumento x 40). Se muestra el porcentaje (%) de células positivas para CD8, positivas para<c>D25 y positivas para FoxP3, positivas para CD25, doblemente teñidas al inicio y durante el tratamiento (en la semana 6) para pacientes con melanoma y CCR tratados con anti-PD1 (C).

[0311] Figura 16- muestra la estructura y actividad de unión del Duobody biespecífico basado en anti-IgG1 y anti-PD-L1 (bs CD25/PD-L1) que se ha generado usando la región de unión a antígeno de anti-CD25 de ratón (PC61) y anti-PD-L1 de ratón/humano (clon S70), teniendo ambos un isotipo lgG1 humano y mutados en un aminoácido específico (K409R para PC61-IgG1 y F405L para S70-IgG1; A). La especificidad de bs CD25/PD-L1 para CD25 se ha sometido a prueba usando una línea celular (células SUP-T1, linfoblastos T humanos; SUP-T1 [VB] ATCC® CRL-1942™) que se ha transfectado con un vector que expresa CD25 de ratón (línea celular CD25+) o bien PD-L1 de ratón (línea celular PD-L1+). La línea celular original y las otras dos líneas celulares resultantes se han usado para comparar la capacidad de unión de bs CD25/PD-L1 con la unión del anticuerpo monoespecífico relacionado (aCD25, clon PC61; aPD-L1, clon S70). La línea celular CD25+ y las líneas celulares PD-L1+ se mezclan en una proporción de 1:1 entre sí (o cada una por separado con células de control no transfectadas) y a continuación se incuban con bs CD25/PD-L1, aCD25, aPD-L1 o sin ningún anticuerpo (SIN anticuerpo) durante 30 minutos. Después de la incubación, los tres grupos de muestras celulares se analizan en citometría de flujo para calcular el porcentaje de células positivas dobles en las diferentes muestras celulares (B). Se ha confirmado la especificidad de bs CD25/PD-L1 (BsAb) usando la línea celular CD25+ y las líneas celulares PD-L1+ por separado. Cada línea celular se ha marcado con el bs CD25/PDL1 o el respectivo Ab monoespecífico (MsAb, IgG1 anti-CD25 de ratón para células CD25+ y anti-PD-L1 de ratón para células PD-L1+) como anticuerpo primario, o solo con tampón. A continuación, las células se incubaron con aHuman AF647 (aHuman) como anticuerpo secundario en tampón FACS durante 30 min, así como también con tinte de viabilidad fijable. Las células incubadas con el anticuerpo secundario solo (aHuman AF647) o células incubadas sin anticuerpo primario ni secundario (no teñido) se usan como controles negativos. A continuación, las células se analizan por citometría de flujo para calcular el porcentaje de células positivas obtenidas con BsAb en comparación con MsAb (indicado a la derecha de cada panel; C).

[0312] Figura 17- muestra el impacto del Duobody basado en lgG1 biespecífico (Bs CD25 PD-L1), los anticuerpos monoespecíficos lgG1 anti-CD25 de ratón (aCD25) e lgG1 anti-PD-L1 de ratón (aPD-L1), por separado o mezclados entre sí (aCD25&aPD-L1), o el control lgG1 isotipo, como se describe en la fig. 16, sobre linfocitos T efectores y reguladores en LN y tumor en el modelo de ratón tumoral MCA205 (establecido como se describe en la fig. 3; con cuatro o cinco ratones para cada grupo). Las muestras se usaron para aislar linfocitos infiltrantes del tumor (TIL) o células de ganglios linfáticos (LN) se aislaron y se analizaron para detectar la presencia de linfocitos T efectores y reguladores en cada grupo de tratamiento sobre la base de la positividad de FoxP3, CD3 y CD4 (A) o de la proporción positividad de CD8 / Treg (positivo para FoxP3, positivo para CD4) (B). También se evaluó el efectoin vivode cada tratamiento sobre la capacidad de linfocitos T positivos para CD4 infiltrantes del tumor para responder a la estimulación. Los TIL se reestimularonin vitrousando PMA y ionomicina, en presencia de un inhibidor de proteínas GolgiPlug y a continuación se tiñeron extracelularmente para detectar CD5 y CD4 e intracelularmente después de la fijación para detectar interferón-Y (IFNg). El porcentaje de linfocitos T positivos para CD5 y positivos para CD4 también positivos para IFNg se analizó por citometría de flujo (C).

[0314] Ejemplos

[0316] Materiales y procedimientos

[0318] Ratones

[0320] Los ratones C57BL/6 y BALB/c se obtuvieron de Charles River Laboratories. Los ratonesFcer1g-/-yFcgr3-/-se proporcionaron amablemente por S. Beers (Universidad de Southampton, Reino Unido). Los ratonesFcgr4-/-yFcgr2b-/-fueron un obsequio de J.V. Ravetch (Universidad Rockefeller, Nueva York, EE. UU.). Todos los estudios con animales se realizaron bajo las regulaciones y aprobaciones éticas del University College de Londres y el Ministerio del Interior del Reino Unido.

[0322] Líneas celulares y cultivo tisular

[0324] Las células tumorales MC38, B16, CT26 y MCA205 (células de fibrosarcoma débilmente inmunogénicas inducidas por 3-metilcolantreno; de G. Kroemer, Gustave Roussy Cancer Institute) y las células 293T usadas para la producción retrovírica se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, Sigma) complementado con suero fetal bovino al 10 % (FCS, Sigma), 100 U/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina y L-glutamina 2 mM (todos de Gibco). Las células K562 usadas para la producción de anticuerpos se cultivaron en medio Dulbecco modificado de Iscove (IMDM) sin rojo fenol complementado con FCS con IgG disminuida al 10% (Life Technologies). Las células B16 (células de melanoma de piel de ratón) y CT26 (línea celular de carcinoma de colon indiferenciado inducido por N-nitroso-N-metiluretano) y las condiciones de cultivo relacionadas están disponibles a través de ATCC.

[0326] Producción de anticuerpos

[0328] La secuencia de las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras del anti-CD25 se resolvieron a partir del hibridoma PC-61.5.3 por amplificación rápida de extremos de ADNc (RACE) y a continuación se clonaron en las regiones constantes de cadenas<k>e lgG2a murinas obtenidas de plásmidos pFUSEss-CHIg-mG2A y pFUSE2ss-CLIg-mk (Invivogen). Anticuerpo, cada cadena de anticuerpo se subclonó en un vector retrovírico derivado del virus de la leucemia murina (MLV). Para experimentos preliminares, se produjo un anticuerpo usando células K562 transducidas con vectores que codifican tanto las cadenas pesadas como las ligeras.

[0330] La secuencia de ADN variable pesada anti-CD25 reclonada del anticuerpo PC-61.5.3 codifica la siguiente secuencia de proteína:

[0332] METDTLLLVWLLLWVPGSTGEVQLQQSGAELVRPGTSVKLSCKVSGDTITAYYIHFV

[0333] KQRPGQGLEWIGRIDPEDDSTEYAEKFKNKATITANTSSNTAHLKYSRLTSEDTATY

[0334] FCTTDNMGATEFVYWGQGTLVTVSS

[0336] La secuencia de ADN variable ligera anti-CD25 reclonada del anticuerpo PC-61.5.3 codifica la siguiente secuencia de proteína:

[0338] METDTLLLWVLLLWVPGSTGQWLTQPKSVSASLESTVKLSCKLNSGNIGSYYMHW

[0339] YQQREGRSPTNLIYRDDKRPDGAPDRFSGSIDISSNSAFLTINNVQTEDEAMYFCHS

[0340] YDGRMYIFGGGTKLTVL

[0341] El anticuerpo se purificó a partir de sobrenadantes usando una columna de proteína G HiTrap MabSelect (GE Healthcare), se dializó en solución salina tamponada con fosfato (PBS), se concentró y se esterilizó por filtración. Para otros experimentos, la producción de anticuerpo se subcontrató a Evitria AG. El anti-CD25 clon PC-61 comercial se adquirió de BioXcell.

[0343] Las secuencias de ADN pesada y ligera variables anti-PDL1 (MPDL3280A/RG7446) publicadas se han reclonado y expresado como anticuerpos recombinantes.

[0345] Experimentos tumoralesin vivo

[0347] Las células tumorales cultivadas se tripsinizaron, se lavaron y se resuspendieron en PBS y se inyectaron por vía subcutánea (s.c.) en el flanco (5 x 105 células para los modelos MCA205 y MC38 en ratones C57BL/6; 2,5 x 105 células para el modelo B16 en ratones C57BL/6, 5 x 105 células para modelos CT26 en ratones BALB/c)). Los anticuerpos se inyectaron por vía intraperitoneal (i.p.) en los puntos temporales descritos en las leyendas de las figuras. Para los experimentos funcionales, 10 días después se obtuvieron tumores, ganglios linfáticos drenantes y tejidos y se procesaron para su análisis por citometría de flujo, como se describe en Simpsonet al.(2013) J Exp Med210,1695-710.Para los experimentos terapéuticos, los tumores se midieron dos veces por semana y los volúmenes se calcularon como el producto de tres diámetros ortogonales. Se sacrificó compasivamente a los ratones cuando el diámetro alcanzó 150 mm. Los ratones que portan tumor se trataron con 200 |jg de anti-CD25-r1 (aCD25-r1), anti-CD25-m2a (aCD25-m2a) o anti-CTLA-4 (aCTLA-4) los días 5 y 7 y 100 jg de anti-PD-1 los días 6, 9 y 12. Para los experimentos terapéuticos, los ratones se trataron solo el día 5, y para el fenotipado y la disminución el día 5 y 7. Se midió el tamaño tumoral dos veces por semana y se sacrificó a los ratones cuando cualquier dimensión tumoral alcanzó 150 mm. Se obtuvieron células mononucleares de sangre periférica (PBMC), ganglios linfáticos (LN) y tumores (TIL) el día 9, se procesaron y se tiñeron para el análisis de citometría de flujo.

[0349] Citometría de flujo

[0351] La adquisición se realizó con un BD LSR II Fortessa (BD Biosciences). Se usaron los siguientes anticuerpos directamente conjugados: anti-CD25 (7D4)-FITC, CD4 (RM4-5)-v500 (BD Biosciences); anti-IFNY (XMG1.2)-AlexaFluor488, anti-PD-1 (J43)-PerCP-Cy5.5, anti-Foxp3 (FJK-16s)-PE, anti-CD3 (145-2C11)-PE-Cy7, anti-Ki67 (SolA15)-eFluor450, anti-CD5 (53-7.3)-eFluor450, colorante de viabilidad fijable-eFluor780 (eBioscience); anti-CD8 (53-6.7)-BrilliantViolet650 (BioLegend); y anti-granzima B (GB11)-APC (Invitrogen). Los siguientes anticuerpos se usaron para teñir células humanas: anti-CD25 (BC96)-BrilliantViolet650 (Biolegend), anti-CD4 (OKT4)-AlexaFluor700 (eBioscience), anti-CD8 (SK1)-V500, anti-Ki67 (B56)-FITC (BD Biosciences); anti-FoxP3 (PCH101)-PerCP-Cy5.5 (eBioscience); anti-CD3 (OKT3)-BrilliantViolet785 (Biolegend). La tinción intranuclear de Foxp3 se realizó usando el conjunto de tampón de tinción del factor de transcripción Foxp3 (eBioscience). Para la tinción intracelular de citocinas, las células se reestimularon con forbol 12-miristato 13-acetato (PMA, 20 ng/ml) e ionomicina (500 ng/ml) (Sigma Aldrich) durante 4 horas a 37 °C en presencia de GolgiPlug (BD Biosciences) y a continuación se tiñeron usando el conjunto de tampón Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences). Para cuantificar el número absoluto de células, se añadió un número definido de microesferas fluorescentes (microesferas de configuración de separación celular para láseres UV, ThermoFisher) a cada muestra antes de la adquisición y se usó como referencia de recuento.

[0353] Tejidos humanos

[0355] Se estudiaron la sangre periférica (PBMC) y los linfocitos infiltrantes del tumor (TIL) en tres cohortes separadas de pacientes con melanoma avanzado (n = 10, 12 lesiones), carcinoma de pulmón no microcítico (CPNM) en estadio temprano (n = 8) y carcinoma de células renales (CCR) (n = 5). Los datos humanos presentados derivan de tres estudios traslacionales separados y aprobados éticamente (melanoma REC n.° 11/LO/0003, CPNM - REC n.° 13/LO/1546, CCR-REC n.° 11/LO/1996). En todos los casos se obtuvo el consentimiento informado por escrito.

[0357] Aislamiento de linfocitos infiltrantes del tumor (TIL)

[0359] Se llevaron los tumores directamente del quirófano al departamento de patología, donde se aislaron áreas representativas tumorales. Posteriormente, las muestras se picaron en condiciones estériles y a continuación se realizó una digestión enzimática (RPMI-1640 (Sigma) con Liberase TL de calidad de investigación (Roche) y DNAsa I (Roche)) a 37 °C durante 30 minutos antes de la disociación mecánica usando gentleMACS (Miltenyi Biotech). Las suspensiones de células individuales resultantes se filtraron y se enriquecieron con leucocitos por el paso a través de un gradiente de Ficoll-paque (GE Healthcare). Las células vivas se contaron y se congelaron en suero AB humano (Sigma) con dimetilsulfóxido al 10 % a -80 °C antes de transferirse a nitrógeno líquido.

[0361] Análisis fenotípico de TIL y PBMC por citometría de flujo multiparamétrica

[0363] Las muestras tumorales y PBMC se descongelaron, se lavaron en RPMI completo, se resuspendieron en tampón FACS (500 ml de PBS, Fc S al 2 %, EDTA 2 nM) y se colocaron en placas de 96 pocillos de fondo redondo. Se preparó una mezcla maestra de anticuerpos de superficie a la dilución recomendada por el fabricante: CD8-V500, clon SK1 (BD Biosciences), PD-1-BV605, clon EH12.2H7 (Biolegend), CD3-BV785. También se incluyó en la mezcla maestra de superficie un tinte de viabilidad fijable (eFlour780, eBioscience). Después de la permeabilización durante 20 minutos con el uso de un conjunto de tampón de fijación y permeabilización intracelular (eBioscience), se aplicó un panel de tinción intracelular que consistió en los siguientes anticuerpos usados en la dilución recomendada por el fabricante: granzima B-V450, clon GB11 (BD Biosciences), FoxP3-PerCP-Cy5.5, clon PCH101 (eBioscience), Ki67-FITC, clon B56 (BD Biosciences) y CTLA-4 - APC, clon L3D10 (Biolegend).

[0365] Inmunohistoquímica múltiple

[0367] Las muestras tumorales se fijaron en formalina tamponada y se incluyeron en parafina. Se cortaron cortes histológicos de 2-5 pm y se tiñeron con los siguientes anticuerpos para inmunohistoquímica: anti-CD8 (SP239), anti-CD4 (SP35) (Spring Biosciences Inc.), anti-FoxP3 (236A/E7) (un obsequio del Dr. G. Roncador CNIO, Madrid, España) y anti-CD25 (4C9) (Leica Biosystems). Para la tinción múltiple, se incubaron los cortes histológicos incluidos en parafina con los anticuerpos primarios durante 30 min después de la recuperación de antígeno usando el reactivo de acondicionamiento celular 1 (Ventana Medical Systems, Inc.) y peróxido de hidrógeno para la inactivación de la peroxidasa endógena. La detección se realizó usando un reactivo de detección basado en peroxidasa (OptiView DAB IHC Detection Kit Ventana Medical Systems, Inc.) y un reactivo de detección de fosfatasa alcalina (UltraView Universal Alkaline Phosphatase Red Detection Kit, Ventana Medical Systems, Inc.). Se realizó otro ciclo de inmunofosfatasa alcalina usando un sustrato alternativo (Fast Blue si se había usado Fast Red previamente, o viceversa). Se evaluaron los patrones de inmunohistoquímica y reactividad de proteína. También se realizó puntuación de inmunotinción múltiple. La aprobación para este estudio se obtuvo del National Research Ethics Service, Research Ethics Committee 4 (número de referencia REC 09/H0715/64).

[0369] Construcción y validación de Duobody biespecífico basado en anti-CD25 y anti-PD-LI

[0371] El Duobody Bs CD25 PD-L1 se ha generado y producido de acuerdo con la tecnología descrita en la literatura a partir de dos IgG1 originales que contienen mutaciones puntuales coincidentes individuales en el dominio CH3 que permiten el intercambio de Fab (Labrijn AFet al.,Nat Protoc. 2014, 9:2450-63). En resumen, cada uno del anti-CD25 de ratón (PC61; isotipo lgG1 de ratón, como se describe anteriormente) y el anti-PD-LI de ratón/humano (clon S70, también conocido como atezolizumab, MPDL3280A, RG7446 o clon YW243.55.S70; véanse el documento WO2010077634 y Herbst Ret al.,2014, Nature 515:563-7) se clona en vectores de expresión de mamífero (504865 | UCOE® Expression Vector - Mouse 3.2 kb Puro Set - Novagen) con mutación K409R (para PC61-IgG1) y mutación F405L (para S70-lgG1) en el dominio CH3, mientras que las cadenas ligeras se mantienen idénticas y se producen como proteínas recombinantes separadas en células de mamífero. Estas lgG1 originales se mezclanin vitroen cantidades equimolares, en condiciones redox permisivas (por ejemplo, 2-MEA 75 mM; 5 h de incubación) para permitir la recombinación de semimoléculas. Después de la retirada del reductor para permitir la reoxidación de enlaces disulfuro intercatenarios, las proteínas heteroméricas resultantes se analizan para determinar la eficacia de intercambio usando procedimientos basados en cromatografía SDS-PAGE o basados en espectrometría de masas. En el caso de Bs CD25 PD-L1, la espectrometría de masas ha confirmado que el peso molecular de las proteínas heterodiméricas fue de 151 Kd, correspondiente a la adición del peso molecular de la cadena pesada y cadena ligera individual del clon S70 (74 Kd) y la cadena pesada y cadena ligera individual del PD61-IgG1 (77 Kd) y mostrando que la mitad de cada IgG1 original se han combinado en una sola molécula.

[0372] La especificidad de Bs CD25 PD-L1 se ha confirmado además por citometría de flujo como se describe en el ejemplo 5, usando los anticuerpos originales como control y anticuerpos de detección que reconocen IgG1 (aHuman, Alexa Fluor® 647, anti-IgG humana caprino AffiniPure, fragmento F<cy>específico; Jackson Labs 109­ 605-098), que se usan de acuerdo con la literatura y las instrucciones del fabricante diluidos en tampón FACS (PBS FCS al 2 % EDTA 2 mM). Los materiales adicionales para citometría de flujo y biología celular son el tinte de viabilidad fijable eFluor780 (Ebioscience 65086514), PMA (50 ng/ml; Santa Cruz Biotechnology, sc-3576) e ionomicina (400 ng/ml; Sigma I0634), y el inhibidor de proteínas GolgiPlug (BD Bioscience, 512301KZ).

[0374] La validación de Bs CD25 PD-L1 en modelos MCA205 se ha realizado usando el mismo enfoque mostrado en ejemplos previos, con control de isotipo, anticuerpos monoespecíficos (100 pg cada uno) o Duobody biespecífico (200 pg cada uno) administrados el día 7 después de inyección de MCA205 y tejido de ratón obtenido y preparado el día 10.

[0376] Ejemplo 1: la alta expresión de CD25 en Treg lo hace una diana adecuada para su disminución

[0378] El receptor de alta afinidad de interleucina-2 alfa (IL2Ra), CD25, se ha usado históricamente como un marcador de superficie genuino de Treg y, por lo tanto, una diana para la disminución de Treg mediada por anticuerpos. Debido a que ha habido controversia sobre si el anti-CD25 (aCD25) también puede dar como resultado la eliminación de linfocitos T efectores activados, se analizó la expresión de CD25 en subpoblaciones de linfocitos en tumores y órganos linfáticos periféricos.

[0380] A los ratones se les inyectó por vía subcutánea (s.c.) en el flanco MCA205 (5 x 105 células, ratones C57BL/6), B16 (2,5 x 105 células, ratones C7BL/6) o CT26 (5 x 105 células, ratones BALB/c) y 10 días después se obtuvieron los tumores (TIL) y ganglios linfáticos de drenaje y se procesaron para su análisis por citometría de flujo.

[0382] Se buscó evaluar la expresión relativa de CD25 por subpoblaciones de linfocitos T individuales dentro de tumores, ganglios linfáticos de drenaje y sangre de ratones que portan tumor 10 días después de la exposición tumoral. Los resultados se muestran en la figura 1. En diferentes modelos de líneas celulares tumorales trasplantables (incluyendo sarcoma MCA205, adenocarcinoma de colon MC38, melanoma B16 y carcinoma colorrectal CT26), la expresión de CD25 fue consistentemente alta en linfocitos T positivos para CD4 y positivos para Foxp3 (Treg) y mínima en linfocitos T CD4+Foxp3- y CD8+ (fig. 1 (A)), como se describe previamente (Sakaguchiet al.1995. J Immunol; Shimizuet al.1999. J Immunol). Debido a su inmunogenicidad y mayor infiltración de linfocitos T, se estudiaron con más detalle los efectos sobre la disminución de Treg en el modelo tumoral MCA205 (fig. 1 (B-C)). Al contrario de los estudiosin vitro,se observó expresión mínima de CD25 en el compartimento efector (linfocitos T CD4+FoxP3- y CD8+)in vivo.Aunque CD25 se reguló por incremento ligeramente linfocitos T efectores (Tef) CD8+ y CD4+FoxP3- infiltrantes del tumor. El porcentaje de células positivas para CD25 (células. 3,08 %-8,35 % CD8+, 14,11-26,87 % positivas para CD4, negativas para Foxp3) y los niveles de expresión por célula (intensidad de fluorescencia media (MFI) 166,6 en células positivas para CD8 y 134 en positivas para CD4, negativas para Foxp3) fueron considerablemente menores que en Treg (83,66-90,23 %, M<f>I 1051,9; p<0,001). Finalmente, también se expresó CD25 en los Treg presentes en ganglios linfáticos de drenaje y sangre, aunque el nivel de expresión basado en la intensidad de fluorescencia media (MFI) fue mayor en Treg infiltrantes del tumor. La expresión considerablemente menor de CD25 en linfocitos Tef en comparación con linfocitos Treg indica que CD25 es una diana adecuada y atractiva para la disminución de Treg en el tumor donde los niveles de expresión en Treg son significativamente mayores.

[0384] Ejemplo 2: el intercambio de isotipos es necesario para la disminución de Treg intratumoral eficaz y segura con anti-CD25

[0386] Tradicionalmente, el anticuerpo anti-CD25 (aCD25) clon PC-61 (IgG1,K de rata) (aCD25-r1) se ha usado para la disminución de Treg en modelos de ratón, en los que se ha demostrado repetidamente que da como resultado la eliminación de Treg en los órganos linfáticos periféricos. Para evitar las diferencias entre especies en el acoplamiento de F<cy>R, las regiones constantes de PC-61 se intercambiaron con la IgG2a murina,<k>(aCD25-m2a), el isotipo de disminución de ratón clásico, y se cuantificó el número de Treg tanto en la periferia como en el tumor y se comparó con el efecto de anti-CTLA4 (aCTLA4, clon 9H10), que es conocido porque da como resultado la disminución de Treg infiltrantes del tumor.

[0388] En base a pruebas previas que demuestra la importancia de la disminución de Treg intratumoral en la codefinición de la actividad de anticuerpos inmunomoduladores, se buscó comparar el efecto de aCD25-r1 sobre la frecuencia de Tef y Treg en la sangre, ganglios linfáticos de drenaje (LN) y linfocitos infiltrantes del tumor (TIL) en el modelo de ratón MCA205, debido a su mayor inmunogenicidad y para evaluar cualquier impacto negativo potencial de anti-CD25 en Tef activados dentro de tumores.

[0390] A los ratones que portan tumor se les inyectaron 200 |jg de anti-CD25-r1 (aCD25-r1), anti-CD25-m2a (aCD25-m2a) o anti-CTLA-4 (aCTLA-4) los días 5 y 7 después de la inoculación s.c. con 5 x 105 células MCA205. Se obtuvieron células mononucleares de sangre periférica (PBMC), ganglios linfáticos (LN) y tumores (TIL) el día 9, se procesaron y se tiñeron para análisis de citometría de flujo. Los resultados se muestran en las figuras 2 y 3.

[0391] La administraciónin vivode aCD25 disminuyó el número de células CD25+ en ganglios linfáticos y en particular en sangre, independientemente del isotipo de anticuerpo. Cuando se cuantifica el número de Treg por la expresión de su factor de transcripción característico, Foxp3, ambos isotipos fueron de nuevo igualmente eficaces en la periferia pero, sorprendentemente, solo el isotipo IgG2a de ratón dio como resultado una reducción significativa en la frecuencia y el número absoluto de Treg infiltrantes del tumor a niveles comparables a los observados con aCTLA4. Aunque la expresión de CD25 se regula por incremento en una pequeña proporción de linfocitos T efectores infiltrantes del tumor (véase el ejemplo 1), no se observó reducción significativa en el número de CD8+ y CD4+Foxp3- en la periferia o en el tumor.

[0393] Como consecuencia, ambos isotipos aCD25 dieron como resultado un incremento en la proporción Tef/Treg en la periferia. Sin embargo, solo aCD25-m2a incrementó esta proporción de forma similar a anti-CTLA4, que es conocido por disminuir preferentemente los Treg en el sitio del tumor pero no en la periferia. Esto explica potencialmente la falta de eficacia observada contra tumores establecidos en estudios previos. Por tanto, solo el anti-CD25 (IgG2a de ratón) reduce el número de Treg en ganglios linfáticos y la sangre y disminuye los Treg infiltrantes del tumor. De forma importante, a pesar de una reducción en el número de Treg circulantes y residentes en LN, no se observaron pruebas macroscópicas de toxicidad en la piel, pulmones e hígado después de múltiples dosis de aCD25-m2a. Este tipo de tratamiento anti-CD25 no se asoció con otros problemas importantes debido a su toxicidad en ratones durante dichos experimentos, ya que no se midieron diferencias estadísticamente pertinentes en el estado de salud general y el peso corporal total, así como en los niveles séricos de lactato deshidrogenasa (LDH) y enzimas hepáticas (AST, aspartato aminotransferasa; ALT, alanina aminotransferasa) entre los diferentes grupos de tratamiento.

[0394] También se determinaron los niveles de expresión de FcyR activadores e inhibidores en diferentes subpoblaciones de leucocitos en la sangre, bazo, ganglios linfáticos y tumor de ratones que portan tumores MCA205 subcutáneos (fig. 4). Los F<cy>R parecían más expresados en células mieloides infiltrantes del tumor (células granulocíticas, células dendríticas convencionales y monocitos/macrófagos), en relación con todos los demás órganos estudiados. La afinidad de unión de las dos variantes Fc de anti-CD25 a FcyR también se determinó por resonancia plasmónica de superficie (tabla 1).

[0396] Tabla 1

[0398]

[0401] Estos datos demuestran que el isotipo mIgG2a se une a todos los subtipos de F<cy>R con una alta proporción activadora con respecto a inhibidora (A/I). Por el contrario, el isotipo rIgGl se une con una afinidad similar a un solo FcyR activador, FcyRIII, así como al inhibidor FcYRIIb, dando como resultado una proporción A/I baja (<1).

[0402] Se estableció el número de Treg infiltrantes del tumor en ratones que carecen de expresión de diferentes F<cy>R en diferentes modelos de ratón para distinguir qué FcyR específicos estaban implicados en la disminución de Treg mediada por anti-CD25 (fig. 5). A los ratones de control C57BL/6 y ratones Fcerlg-/- se les inyectaron por vía subcutánea células MCA205 y se obtuvieron tumores, ganglios linfáticos drenantes y sangre, se procesaron y tiñeron para análisis de citometría de flujo. Los linfocitos T reguladores se identificaron por la expresión de CD4 y FoxP3. El porcentaje de células positivas para Foxp3 de células positivas para CD4 totales muestra cómo el efecto anti-CD25 se debe a la expresión del gen Fcerlg. El análisis de ratonesFcer1g-/-,que no expresan ninguno de los F<cy>R activadores (I, III y IV), demostró una ausencia completa de disminución de Treg. Por lo tanto, la eliminación de Treg por aCD25-r1 en la periferia y aCD25-m2a en la periferia y el tumor resulta de la ADCC mediada por FcyR y no del bloqueo de la unión de IL-2 a CD25. La disminución por aCD25-m2a no dependió de ningún F<cy>R activador individual, y la eliminación de Treg se mantuvo en ambos ratonesFcgr3-/-yFcgr4-/-.Por tanto, la disminución de Treg periférico por aCD25-r1 no disminuye en el tumor a pesar de la alta expresión intratumoral de este receptor. Sin embargo, la disminución de Treg intratumoral se restaura eficazmente en ratones que carecen de expresión del receptor inhibidor FcYRIIb. En este contexto, la disminución de Treg intratumoral es comparable entre aCD25-r1 y aCD25-m2a. Por lo tanto, la falta de disminución de Treg por aCD25-r1 en el tumor se puede explicar por su baja proporción de unión A/I y la alta expresión intratumoral de FcYRIIb, que inhibe la ADCC mediada por el único receptor activador acoplado por este isotipo.

[0404] Ejemplo 3: el tratamiento anti-CD25 se sinergiza con anti-PD-1, erradica tumores establecidos e incrementa la supervivencia de ratones que portan tumor

[0406] Debido a su mejor eficacia en la disminución de Treg intratumoral, se planteó la hipótesis de que aCD25-m2a podría tener un mejor resultado terapéutico en el tratamiento de tumores establecidos. La actividad antitumoral de aCD25-m2a y -r1 contra tumores establecidos se evaluó administrando una dosis única de aCD25 cinco días después de la implantación subcutánea de células MCA205, cuando se establecieron los tumores. Los resultados se muestran en la figura 6.

[0408] En consonancia con la falta de capacidad observada para disminuir los Treg intratumorales, una dosis única de aCD25 dada a ratones con tumores establecidos (día 5) no dio como resultado protección con aCD25-r1. Por otra parte, se observó retraso en el crecimiento y supervivencia a largo plazo de ratones que recibieron aCD25-m2a (15,4 %). Debido a la pertinencia clínica de los agentes que se dirigen al receptor coinhibidor PD-1 como diana inmunoterápica y el papel clave de PD-1 en el control de la regulación de linfocitos T dentro del microambiente tumoral, se plantea la hipótesis de que la disminución de linfocitos Treg CD25+ y el bloqueo de PD-1 podrían ser sinérgicos en combinación. En el mismo modelo, se sometió a prueba la combinación de aCD25 con bloqueo de PD-1 usando anti-PD-1 (aPD-1, clon RMP1-14; a una dosis de 100 |jg cada tres días). aPD-1 como monoterapia no es eficaz en el tratamiento del modelo tumoral MCA205 establecido y la combinación con aCD25-r1 no mejoró su efecto. Sin embargo, una dosis única de aCD25-m2a seguido de tratamiento con aPD-1 erradicó los tumores establecidos en un 78,5 % de los ratones dando como resultado una supervivencia a largo plazo de más de 100 días. Se observó un resultado similar en los modelos tumorales MC38 y CT26, donde aCD25-m2a tuvo un efecto terapéutico parcial que se sinergizó con el tratamiento con aPD-1, en contraste con la combinación con aCD25-r1 que no logró disminuir los Treg infiltrantes del tumor en estos tumores. Por tanto, esta administración combinada permitió una eliminación tumoral eficaz y mejoró drásticamente la supervivencia a largo plazo de diferentes modelos de ratones tumorales.

[0410] Para comprender el mecanismo de acción subyacente al sinergismo con la combinación de aCD25-m2a y aPD-1, se evalúa el fenotipo y función de los linfocitos infiltrantes del tumor (TIL) presentes en el microambiente tumoral de MCA205 al final del protocolo de tratamiento, 24 horas después de la tercera dosis de aPD-1 (figura 7). La monoterapia con aPD-1 no tuvo impacto en la proliferación de Tef ni en la magnitud de la infiltración de Tef en el tumor, donde también se observó una alta frecuencia persistente de Treg (datos no mostrados) y baja proporción Tef/Treg en consonancia con la falta de actividad terapéutica. A la inversa, la disminución de Treg intratumoral con aCD25-m2a dio como resultado una mayor proporción de linfocitos T CD4+FoxP3‘ proliferantes y productores de interferón-Y (IFN-<y>) en el tumor, correspondientes a una alta proporción Tef/Treg y respuesta antitumoral. Este efecto se potenció además en combinación con anti-PD-1, que proporcionó una proliferación incluso mayor y un incremento de 1,6 veces en el número de linfocitos T positivos para CD4 y negativos para FoxP3 productores de IFN-y en comparación con monoterapia con anti-CD25-m2a. Por el contrario, la falta observada de disminución de Treg con anti-CD25-r1 no dio como resultado ningún cambio en la proliferación de Tef o la producción de IFN-y, cuando se usó como monoterapia o en combinación con anti-PD-1.

[0412] Los datos que se han generado con PC61 que tiene el isotipo IgG1 de ratón original o bien el isotipo IgG2a de ratón que permiten una disminución eficaz de Treg sugieren que dicho anti-CD25, solo o en combinación con anticuerpos antineoplásicos, puede ser eficaz para rechazar tumores establecidos, en particular para aquellos tumores que requieren una disminución de Treg intratumoral eficaz.

[0414] Como se muestra anteriormente, la administración de una dosis única de aCD25-m2a, seguido de tratamiento con aPD-1, tuvo un efecto positivo tanto en el tamaño tumoral como en la supervivencia de ratones en el modelo murino MCA205. Este efecto terapéutico debido a anti-CD25-m2a/anti-PD1 depende de la actividad de linfocitos T positivos para CD8 ya que la administración adicional de un anticuerpo anti-CD8 llevó el tamaño tumoral y la supervivencia de ratones a los niveles observados en animales no tratados (fig. 8). Por tanto, la eliminación tumoral de MCA205 depende del impacto del sinergismo aPD-1/aCD25 en las poblaciones tanto linfocitos Treg como positivos para CD8, y las respuestas de linfocitos T efectores globales no se ven afectadas negativamente por una disminución del anticuerpo anti-CD25.

[0416] También se observó dicha sinergia contra el modelo tumoral de melanoma B16 poco inmunogénico cuando aCD25-m2a y aPD-1 se combinaron con Gvax, una vacuna de células tumorales completas que expresa GM-CSF (fig. 9). En este sistema, ni el tratamiento con Gvax solo ni la combinación de Gvax con aPD-1 o aCD25-r1 pueden bloquear el crecimiento tumoral o prolongar la supervivencia de ratones que portan tumor. En este contexto, solo la combinación de Gvax con aCD25-m2a (solo o conjuntamente con aPD-1). No se observó dicha mejora en ningún grupo de tratamiento donde se administró aCD25-r1.

[0418] Se observó un resultado similar sobre el sinergismo de un inhibidor de punto de control inmunitario con aCD25-m2a en el modelo tumoral de MC38 tanto cuando se administra un aPD-1 (fig. 10) como un aPD-L1 (fig. 11). También los modelos tumorales de CT26 confirmaron el efecto terapéutico de estas combinaciones (fig. 12 y 13). Por tanto, donde aCD25-m2a ya tenía un efecto terapéutico parcial debido al disminución de Treg, esta propiedad ventajosa da la posibilidad de mejorar sorprendentemente la respuesta a tratamientos basados en inhibidores de punto de control inmunitario.

[0420] Ejemplo 4: CD25 se expresa altamente en Treg infiltrantes de tumores humanos y el tratamiento con anti-PD-1 induce la infiltración de Treg que expresan CD25 en tumores humanos

[0422] CD25 parece una diana atractiva para la disminución de Treg y los enfoques inmunoterápicos de combinación basados en modelos de ratón. Para validar CD25 como una posible diana para la disminución de Treg en seres humanos, se compararon sus niveles de expresión en sangre periférica y linfocitos infiltrantes del tumor usando muestras biológicas obtenidas de pacientes con cáncer de ovario, cáncer de vejiga, melanoma, carcinoma no microcítico (CNM) y carcinoma de células renales (CCR) por citometría de flujo e inmunohistoquímica (IHQ). También se cuantificó el número de expresión de Treg y CD25 en muestras tumorales de pacientes con CCR antes y después de recibir tratamiento aPD-1 con pembrolizumab. Los resultados se muestran en las figuras 14 y 15.

[0423] Independientemente de la localización anatómica, tipo o estadio tumoral, se observó que la expresión de CD25 en Treg es significativamente mayor (50-85 %) que en linfocitos T CD4+Foxp3- (10-15 %) y CD8+ (<5 %). De manera similar a los modelos murinos, el nivel de expresión de CD25, como se evalúa por MFI, fue significativamente mayor en Treg CD4+FoxP3+ en relación con Tef CD4+FoxP3- y CD8+ en todos los subtipos tumorales estudiados.

[0424] Estas observaciones se respaldaron además por inmunohistoquímica múltiple (IHQ). El análisis de tumores de melanoma, CPNM y CCR de las mismas cohortes de pacientes demostró que incluso en áreas de denso infiltrado de linfocitos T positivos para CD8, la expresión de c D25 permaneció restringida a células positivas para FoxP3. Sorprendentemente, este perfil de expresión permaneció consecuente, independientemente del subtipo tumoral, estadio, sitio de resección, tratamiento actual o previo y coincide con los datos obtenidos en modelos de ratón.

[0425] Además, en contraste con la alta proporción de Treg observada en tumores murinos subcutáneos, las muestras de CCR mostraron un número escaso de Treg en tumores no tratados. Sin embargo, el tratamiento anti-PD-1 dio como resultado una infiltración significativa tanto de linfocitos T CD8+ como de Treg (células positivas para Foxp3). Además, los datos generados de muestras de melanoma y CCR confirman que el CD25 se expresó altamente por células positivas para Foxp3, mientras que su expresión fue mínima en células negativas para Foxp3 y positivas para CD8.

[0427] Cuando se evalúa la expresión de CD25 en el contexto de la inmunomodulación terapéutica. Se realizaron biopsias con aguja gruesa en la misma lesión al inicio y después de 4 ciclos de nivolumab o bien 2 ciclos de pembrolizumab) en pacientes con cáncer de riñón avanzado y melanoma respectivamente. A pesar de la inmunomodulación sistémica, la expresión de CD25 permaneció restringida a Treg positivos para FoxP3, incluso en áreas de infiltrado de linfocitos T positivos para CD8 denso evaluadas por IHQ múltiple.

[0429] Estos hallazgos confirman el valor traduccional de los datos preclínicos descritos y respaldan además el concepto de selección terapéutica selectiva de Treg por medio de CD25 en cánceres humanos. Además, los perfiles de expresión de CD25 en cánceres sólidos humanos en proporción con el tratamiento con anti-PD1 proporcionan una justificación para la combinación terapéutica de anticuerpos anti-CD25 humanos que tienen una unión a CD25 y una especificidad del receptor de Fc gamma comparable a las mostradas para el anti-CD25 de ratón PC61(IgG2a) con inhibidores de punto de control inmunitario tales como un antagonista de PD-1.

[0431] Ejemplo 5: los anticuerpos biespecíficos basados en anti-CD25 y anti-PD-LI y la combinación de anticuerpos presentan propiedades de disminución de Treg e inducción de citocinas eficaces

[0433] Los ejemplos previos han demostrado que las propiedades de disminución de Treg y de unión a CD25 de los anticuerpos basados en PC61 y con el isotipo apropiado se pueden aprovechar en combinación con otros compuestos antineoplásicos tales como anticuerpos dirigidos a proteínas de punto de control inmunitario tales como un antagonista de PD-1 (siendo un anticuerpo anti-PD-1 o anti-PD-L1). Estos hallazgos sugieren la construcción de anticuerpos biespecíficos que combinan las dos propiedades de unión a antígeno y el isotipo pertinente (por ejemplo, IgG1).

[0435] Este enfoque se ha validado usando la tecnología Duobody que permite la asociación eficaz de una única cadena pesada y ligera de dos anticuerpos monoespecíficos distintos que se producen por separado, dentro de una única proteína heteromérica que se denomina Bs CD25 PD-L1 (fig. 16A). La especificidad de unión de este anticuerpo se ha validado usando dos líneas celulares humanas modificadas genéticamente, expresando cada una CD25 de ratón o bien PD-L1 de ratón, y comparado con las de los anticuerpos monoespecíficos iniciales (fig. 16B y C). Estas líneas celulares se han sometido a prueba por citometría de flujo, por separado o mezcladas en cantidades equivalentes, mostrando que Bs CD25 PD-L1 conserva su especificidad CD25, PD-L1 doble, permitiendo incluso detectar complejos de células positivas dobles que se forman por la unión de Bs CD25 PD-L1 a células tanto positivas para CD25 como positivas para PD-L1 al mismo tiempo.

[0437] Las propiedades funcionales de BsAb CD25 PD-L1 se han evaluadoin vivousando modelos de interacción y disminución celular que se usaron para validar PC61 en ejemplos previos. Se usó el modelo MCA205 para evaluar el impacto del BsAb sobre linfocitos T efectores y reguladores en tumores y LN. En este modelo, BsAb CD25 PD-L1 puede reconocer y disminuir linfocitos T reguladores positivos para CD4, positivos para Foxp3 e incrementar la proporción de linfocitos T reguladores positivos para CD8, positivos para Foxp3 en tumores y L<n>con una eficacia equivalente a la de anti-CD25 (PC61-m2a) o combinación de anticuerpos anti-CD25 y anti-PD-L1 monoespecíficos (fig. 17 AB). Además, BsAb CD25 PD-L1 incrementa el número de células positivas para CD4, positivas para CD5 que expresan interferón gamma, a un nivel que es al menos similar a la combinación de anti-CD25 monoespecífico y anti-PD-L1, y posiblemente superior al del anticuerpo anti-CD25 m2a solo (fig. 17C).

[0439] Los datos muestran cómo el uso de un anticuerpo anti-CD25 humano que disminuye Treg basado en PC61 para tratar el cáncer no solo se puede mejorar seleccionando el isotipo apropiado, sino que también se puede combinar eficazmente con otros fármacos antineoplásicos, en particular con anticuerpos antineoplásicos que se unen a un antígeno de superficie celular diferente. Este enfoque se puede continuar produciendo y administrando los dos productos como una mezcla novedosa de anticuerpos monoespecíficos o como anticuerpos biespecíficos novedosos que se asocian y producen para mantener la disminución de Treg, unión de CD25 y otras propiedades de unión de los anticuerpos monoclonales originales.

Claims (6)

1. REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo anti-CD25 para su uso en el tratamiento de un tumor sólido en un sujeto humano, en combinación con un antagonista de PD-1, en el que el anticuerpo anti-CD25 es un anticuerpo IgG1 humano monoclonal que se une a al menos uno de FcyRI, FcyRIIc y FcYRIIIa con mayor afinidad de la que se une a FcYRIIIb, y disminuye los linfocitos T reguladores infiltrantes del tumor, y en el que el antagonista de PD-1 es un anticuerpo anti-PD-1 o un anticuerpo anti-PD-LI.

2. Un anticuerpo anti-CD25 para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el anticuerpo anti-CD25 provoca una respuesta de CDC, ADCC y/o ADCP.

3. Un anticuerpo anti-CD25 para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que dicho anticuerpo anti-CD25 se administra a un sujeto que tiene un tumor establecido.

4. Un anticuerpo anti-CD25 para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho uso comprende además la etapa de identificar a un sujeto que tiene un tumor sólido.

5. Una combinación de un anticuerpo anti-CD25 y un antagonista de PD-1 para su uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto humano, en el que el sujeto tiene un tumor sólido, en el que el anticuerpo anti-CD25 es un anticuerpo IgG1 humano monoclonal que se une a al menos uno de F<cy>RI, F<cy>RII<c>y FcYRIIIa con mayor afinidad de la que se une a FcYRIIIb, y disminuye los linfocitos T reguladores infiltrantes del tumor, en el que el anticuerpo anti-CD25 y un antagonista de PD-1 se administran simultáneamente, por separado o secuencialmente, y en el que el antagonista de PD-1 es un anticuerpo anti-PD-1 o un anticuerpo anti-PD-L1.

6. La combinación para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, en la que el anticuerpo anti-CD25 es como se define en la reivindicación 2.