ES3046884T3 - Use of aptamers in therapy and/or diagnosis of autoimmune diseases - Google Patents

Use of aptamers in therapy and/or diagnosis of autoimmune diseases

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ES3046884T3 ES16172486T ES16172486T ES3046884T3 ES 3046884 T3 ES3046884 T3 ES 3046884T3 ES 16172486 T ES16172486 T ES 16172486T ES 16172486 T ES16172486 T ES 16172486T ES 3046884 T3 ES3046884 T3 ES 3046884T3
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Annekathrin Haberland
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Charite Universitaetsmedizin Berlin
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Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft
Charite Universitaetsmedizin Berlin
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Abstract

La presente invención se refiere a un aptámero que comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 y/o una secuencia de ácido nucleico que es al menos 80% idéntica a una de las SEQ ID No. 1, 2 y 3 para su uso en terapia y/o diagnóstico de enfermedades autoinmunes, en donde la enfermedad autoinmune está asociada con la presencia de autoanticuerpos específicos para un receptor acoplado a proteína G. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0003] Uso de aptámeros en el tratamiento y/o el diagnóstico de enfermedades autoinmunitarias
[0005] El sistema inmunitario constituye una parte esencial de los animales. Los mamíferos utilizan su sistema inmunitario en la defensa frente a microorganismos, en la detección y eliminación de células aberrantes tales como, por ejemplo, células tumorales, y en la regeneración de tejido. De este modo, el organismo cuenta con dos mecanismos de defensa interconectados, inmunidad humoral e inmunidad celular.
[0007] Los anticuerpos, cuando se unen a su antígeno, son desencadenantes de la respuesta inmunitaria humoral. Los anticuerpos pueden actuar de múltiples maneras. Además de la neutralización del antígeno, los anticuerpos también activan el sistema del complemento. También existen anticuerpos que se dirigen a antígenos del propio cuerpo. Como motivos para la generación de dichos, así denominados, autoanticuerpos, se contemplan el mimetismo molecular y/o la activación inespecífica. La unión específica de los autoanticuerpos a los antígenos propios puede activar los linfocitos citolíticos naturales (células NK) que son capaces de facilitar la degradación de estos antígenos.
[0009] Las enfermedades autoinmunitarias se basan en dicho reconocimiento específico y en la unión de anticuerpos dirigidos a partes constituyentes propias del cuerpo, lo que desencadena una respuesta inmunitaria contra células o tejidos propios. Además de este efecto inmunoestimulante, los autoanticuerpos pueden contribuir al desarrollo de fenotipos patógenos también mediante otros mecanismos. Es bien conocido que también existen autoanticuerpos que pueden ser específicos de la parte extracelular de receptores acoplados a proteína G tales como: el receptor adrenérgico alfa-1, el receptor adrenérgico beta-1, el receptor adrenérgico beta-2, el receptor ETA de la endotelina 1, el receptor M<2>muscarínico, el receptor AT1 de la angiotensina II y/o los receptores activados por proteinasa (PAR) y, tras una unión específica, pueden activar o bloquear estos receptores. La presencia de dichos autoanticuerpos en un organismo puede dar lugar a efectos agonistas o antagonistas en el sentido de una activación o bloqueo permanente de los receptores respectivos que podría desempeñar un papel en el desarrollo de la enfermedad.
[0011] La cardiomiopatía dilatada (DCM) es una de las enfermedades en las que un alto porcentaje de los pacientes presenta dichos autoanticuerpos activadores que se unen a partes extracelulares del receptor adrenérgico beta-1, en particular al 1er o 2o bucle del receptor adrenérgico beta-1. En consecuencia, se sugirió una patogénesis autoinmunitaria de DCM en estos pacientes. Tras la unión de estos autoanticuerpos, los receptores se activan de forma continua (Jahns et al. (2004) Direct evidence for a beta-1-adrenergic receptor-directed autoimmune attack as a cause of idiopathic cardiomyopathy. J.Clin.Invest. 113, 1419 a 1429).
[0013] En estudios recientes, se pudo demostrar que la eliminación de estos autoanticuerpos de la sangre mediante la adsorción de inmunoglobulina contribuye a la regeneración del músculo cardiaco (Wallukat G, Reinke P, Dorffel WV, Luther HP, Bestvater K, Felix SB, Baumann G. (1996) Removal of autoantibodies in dilated cardiomyopathy by immunoadsortion. Int J Cardiol. 54:191-195;Müller J, Wallukat G, Dandel M, Bieda H, Brandes K, Spiegelsberger S, Nissen E, Kunze R, Hetzer R (2000) Immunoglobulin adsorption in patients with idiopathic dilated cardiomyopathy. Circulation. 101:385-391. W.V. Dorffel, S.B. Felix, G. Wallukat, S. Brehme, K. Bestvater, T Hofmann, F.K. Kleber, G. Baumann, P Reinke (1997) Short-term hemodynamic effects of immunoadsorption in dilated cardiomyopathy. Circulation 95, 1994-1997 y W.V. Dorffel, G. Wallukat, Y Dorffel, S.B. Felix, G. Baumann (2004) Immunoadsorption in idiopathic dilated cardiomyopathy, a 3-year follow-up. Int J. Cardiol. 97, 529-534).
[0014] Existen otras enfermedades del sistema cardiovascular para las que se ha sugerido una relación con la presencia de autoanticuerpos contra receptores acoplados a proteína G tales como cardiomiopatía de Chagas, cardiomiopatía periparto, miocarditis, hipertensión pulmonar e hipertensión maligna. También se encontraron autoanticuerpos contra receptores acoplados a proteína G en pacientes, por ejemplo, con glaucoma, diabetes mellitus, enfermedad de Alzheimer, hiperplasia prostática benigna, esclerodermia, síndrome de Raynaud, psoriasis y preeclamsia y en la enfermedad crónica de Chagas, así como en pacientes con rechazo de aloinjerto de riñón.
[0015] Un objeto de la presente invención es proporcionar modalidades novedosas para su uso en el tratamiento y/o el diagnóstico de enfermedades autoinmunitarias que están asociadas con la presencia de autoanticuerpos en el paciente.
[0017] La presente invención proporciona un aptámero que comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 y/o una secuencia de ácido nucleico que es al menos el 80% idéntica a una de SEQ ID No. 1, 2 y 3 para su uso en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias mediante interferencia con la interacción de autoanticuerpos específicos de receptores acoplados a proteína G asociados con enfermedades autoinmunitarias, en el que los autoanticuerpos son específicos del receptor adrenérgico alfa-1, el receptor adrenérgico beta-1, el receptor adrenérgico beta-2, el receptor ETA de la endotelina 1, el receptor M<2>muscarínico, el receptor AT1 de la angiotensina II y/o los receptores PAR, e inhibición de la interacción específica de estos autoanticuerpos con sus proteínas diana, en el que la enfermedad autoinmunitaria está asociada con la presencia de autoanticuerpos específicos de un receptor acoplado a proteína G.
[0018] Los aptámeros para su uso según la invención se caracterizan por que comprenden o consisten en una secuencia de ácido nucleico de 15 nucleótidos con la SEQ ID NO 1, la<s>E<q i>D NO 2, la SEQ ID NO 3 y/o una secuencia de ácido nucleico que es al menos el 80% idéntica a una de las SEQ ID NO 1, 2 y 3. El 15-mero: GGT TGG TGT GGT TGG (SEQ ID No. 1), el 26-mero: CGC CTA GGT TGG GTA GGG TGG TGG CG (SEQ ID No. 2) y el 12-mero: GGT TGG TGT GGT (SEQ ID No. 3) son todos independientemente entre sí capaces de, y responsables de, la especificidad diana del aptámero para su uso según la invención. Se pueden añadir moléculas o secuencias de ácido nucleico adicionales al extremo 5' y/o al extremo 3' de la secuencia de ácido nucleico con la SEQ ID No. 1, 2 y/o 3. Dicho 15-mero (SEC ID No 1) se ha aislado en primer lugar para su unión a trombina, véase el documento US 5.543.293, lo que también se aplica al 26-mero (SEC ID No 2), que se describió por primera vez en el documento WO/2010/033167. El primero mencionado ya se ha usado con el nombre ARC183 en ensayos en fase clínica I para la inhibición de trombina, es decir, como anticoagulante para su uso potencial en situaciones cardiovasculares agudas. El 26-mero se ha usado con el nombre NU172 (ARC 2172) en un ensayo en fase clínica II (identificador gubernamental del ensayo clínico: NCT 00808964). Sin embargo, resultó que para el 15-mero (SEQ. ID No. 1) la cantidad de aptámero necesaria para lograr la anticoagulación deseada dio como resultado un perfil de dosificación subóptimo.
[0020] Sorprendentemente, se ha descubierto que los aptámeros para su uso según la invención pueden usarse para interferir con la interacción de anticuerpos, en particular de autoanticuerpos, específicos de receptores acoplados a proteína G asociados con enfermedades autoinmunitarias. En particular, se pudo demostrar que los aptámeros para su uso según la invención son capaces de unirse a autoanticuerpos específicos del receptor adrenérgico alfa-1, el receptor adrenérgico beta-1, el receptor adrenérgico beta-2, el receptor ETA de la endotelina 1, el receptor M<2>muscarínico, el receptor AT1 de la angiotensina II y/o los receptores PAR y de inhibir la interacción específica de estos autoanticuerpos con sus proteínas diana. Mediante la inhibición de estas interacciones, los aptámeros para su uso según la invención disminuyen o incluso suprimen la activación permanente de los respectivos receptores acoplados a proteína G sin la necesidad de eliminar estos anticuerpos. Por lo tanto, la presente invención proporciona compuestos que se describen por primera vez por su idoneidad para su uso en el tratamiento y/o el diagnóstico de enfermedades autoinmunitarias, en particular de enfermedades autoinmunitarias asociadas con la presencia de autoanticuerpos que reconocen receptores acoplados a proteína G, concretamente enfermedades autoinmunitarias asociadas con la presencia de autoanticuerpos específicos del receptor adrenérgico alfa-1, el receptor adrenérgico beta-1, el receptor adrenérgico beta-2, el receptor ETA de la endotelina 1, el receptor M<2>muscarínico, el receptor AT1 de la angiotensina II y/o los receptores PAR. Además, después de la inmovilización, los aptámeros para su uso según la invención son capaces de capturar los autoanticuerpos indicados anteriormente. De esta manera, se proporciona una plataforma, en primer lugar para establecer una tecnología de aféresis para eliminar los autoanticuerpos del suero de un paciente y en segundo lugar para desarrollar una herramienta analítica para la medición de los autoanticuerpos. Esta última se puede usar en particular para el diagnóstico de enfermedades autoinmunitarias.
[0022] Para los fines de la presente invención, el término "aptámero" se refiere a un oligonucleótido que comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 y/o una secuencia de ácido nucleico que es al menos el 80% idéntica a una de SEQ ID No. 1, 2 y 3 y es capaz de unirse a una molécula diana particular, por ejemplo, a un autoanticuerpo dirigido contra un receptor acoplado a proteína G tal como, por ejemplo, el receptor adrenérgico alfa-1, el receptor adrenérgico beta-1, el receptor adrenérgico beta-2, el receptor ETA de la endotelina 1, el receptor M<2>muscarínico, el receptor AT1 de la angiotensina II y/o los receptores PAR.
[0023] El aptámero para su uso según la invención comprende o consiste en una secuencia de moléculas de ácido nucleico, los nucleótidos. El aptámero para su uso según la invención comprende preferentemente nucleótidos D y/o L no modificados y/o modificados. De acuerdo con el código común de una letra de las bases de ácido nucleico "C" significa citosina, "A" significa adenina, "G" significa guanina y "T" significa timina, mientras que "U" significa uracilo. Si no se indica a continuación lo contrario, el término "nucleótido" se referirá a ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos. Respectivamente, los términos "nucleótido modificado con 2'-flúor", "nucleótido modificado con 2'-metoxi" y/o "nucleótido modificado con 2-amino" se refieren a ribonucleótidos modificados y desoxirribonucleótidos modificados.
[0025] Se considera que un aptámero consiste o comprende una secuencia de ácido nucleico que es al menos el 80% idéntica a una de las SEQ ID No. 1, 2 y 3 si dicho aptámero comprende una secuencia contigua de nucleótidos que muestra al menos el 80% de identidad de secuencia a lo largo de toda la longitud de las SEQ ID No. 1, 2 o 3 con la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID No. 1, 2 o 3, respectivamente. Los medios para determinar la identidad de secuencia son bien conocidos en la técnica y pueden comprender, por ejemplo, el uso del algoritmo blastn.
[0027] El aptámero para su uso según la invención puede comprender una secuencia de ácido nucleico de > 15 nucleótidos a < 160 nucleótidos, preferentemente de > 15 nucleótidos a < 120 nucleótidos.
[0029] El aptámero para su uso según la invención puede comprender o consistir en una secuencia de nucleótidos de ADN o ARN y, por lo tanto, puede denominarse aptámero de ADN o aptámero de ARN, respectivamente. Se entiende que si el aptámero para su uso según la invención comprende una secuencia de nucleótidos de ARN, dentro de los motivos de secuencia especificados a lo largo de la presente invención, la timina se reemplaza por uracilo. Las secuencias de nucleótidos de ARN de la presente invención son idénticas a las secuencias de nucleótidos de ADN de la invención con la condición de que T se reemplace por U. En aras de la concisión, a lo largo de la presente invención se hace referencia únicamente a secuencias de nucleótidos de ADN explícitas. Sin embargo, se entiende que las secuencias de nucleótidos de ARN respectivas también están comprendidas por la presente invención.
[0031] Se prefiere particularmente el uso de aptámeros de ADN. Los aptámeros de ADN son generalmente más estables en plasma que los aptámeros de ARN.
[0033] Los aptámeros para su uso según la invención pueden comprender una secuencia de nucleótidos que contiene nucleótidos modificados en 2', por ejemplo nucleótidos modificados con 2'-flúor, 2'-metoxi y/o 2'-amino. El aptámero para su uso según la invención también puede comprender una mezcla de desoxirribonucleótidos, desoxirribonucleótidos modificados, ribonucleótidos y/o ribonucleótidos modificados.
[0035] El aptámero para su uso según la invención puede comprender modificaciones. Dichas modificaciones abarcan, por ejemplo, alquilación, es decir metilación, arilación o acetilación de al menos un nucleótido, la inclusión de enantiómeros y/o la fusión de aptámeros con uno o más nucleótidos o secuencias de ácido nucleico diferentes. Dichas modificaciones pueden comprender, por ejemplo, modificaciones con caperuza 5' y/o 3' (5'- y/o 3'-CAP) o estructuras 5'- y/o 3'-PEg . Como alternativa o adicionalmente, el aptámero para su uso según la invención puede comprender nucleótidos modificados, preferentemente seleccionados de entre ácidos nucleicos bloqueados, nucleótidos modificados con 2'-flúor, 2'-metoxi y/o 2'-amino.
[0037] Los ácidos nucleicos bloqueados (LNA) representan análogos de los nucleótidos de ARN respectivos en los que se ha fijado la conformación. Los oligonucleótidos de ácidos nucleicos bloqueados comprenden uno o más ribonucleósidos bicíclicos, en los que el grupo 2'-OH está conectado con el átomo de carbono C4 por medio de un grupo metileno. Los ácidos nucleicos bloqueados muestran una estabilidad mejorada frente a nucleasas en comparación con los respectivos homólogos de aptámeros de ARN no modificados. También están mejoradas las propiedades de hibridación, lo que permite una mejora de la afinidad y especificidad del aptámero.
[0039] Otra modificación preferida es la adición de las denominadas estructura 3-CAP, estructura 5'-CAP y/o de un nucleótido de guanosina modificado (por ejemplo, 7-metil-guanosina) al extremo 3' y/o 5' del aptámero. Dicha modificación del extremo 3' y/o 5' tiene el efecto de que el aptámero está protegido de una degradación rápida por nucleasas.
[0041] Como alternativa o adicionalmente, el aptámero para su uso según la invención puede presentar un extremo 5' y/o 3' pegilado. Una modificación 5'-PEG y/o 3'-PEG comprende la adición de al menos una unidad de polietilenglicol (PEG), preferentemente el grupo PEG comprende de 1 a 900 grupos etileno, de forma más preferida de 1 a 450 grupos etileno. En una forma de realización preferida, el aptámero comprende unidades de PEG lineales con HO-(CH<2>CH<2>O)n-H, en la que n es un número entero de 1 a 900, preferentemente n es un número entero de 1 a 450.
[0042] El aptámero para su uso según la invención puede comprender o consistir en una secuencia de ácido nucleico con un esqueleto de fosfotioato o puede estar configurado de forma total o parcial como un ácido nucleico peptídico (PNA).
[0044] Una ventaja de modificar el aptámero para su uso según la invención mediante una o más de las formas mencionadas anteriormente es que el aptámero puede estabilizarse contra influencias perjudiciales tales como, por ejemplo, nucleasas presentes en el entorno en el que se usa el aptámero. Dichas modificaciones también son adecuadas para adaptar las propiedades farmacológicas del aptámero. Las modificaciones preferentemente no alteran la afinidad o especificidad del aptámero.
[0046] El aptámero para su uso según la invención también puede conjugarse con una molécula portadora y/o con una molécula indicadora. Las moléculas portadoras comprenden las moléculas que, cuando se conjugan con el aptámero, prolongan la semivida en plasma del aptámero conjugado en plasma humano, por ejemplo, potenciando la estabilidad y/o afectando a la velocidad de excreción. Un ejemplo de una molécula portadora adecuada es PEG. Las moléculas indicadoras comprenden moléculas que permiten la detección del aptámero conjugado. Ejemplos de dichas moléculas indicadoras son GFP, biotina, colesterol, colorantes tales como, por ejemplo, colorantes fluorescentes, moléculas indicadoras electroquímicamente activas y/o compuestos que comprenden residuos radiactivos, en particular radionucleidos adecuados para la detección por PET (tomografía por emisión de positrones) tales como, por ejemplo 18F, 11C, 13N, 18O, 82Rb o 68Ga. El experto es bien consciente de las moléculas portadoras e indicadoras adecuadas y de los medios para conjugarlas al aptámero para su uso según la invención.
[0047] El aptámero para su uso según la invención inhibe el efecto agonista o bloqueante de un anticuerpo. Para los fines de la presente invención, el término "anticuerpo" se refiere a anticuerpos de origen natural, incluidos, por ejemplo, autoanticuerpos, en particular autoanticuerpos de un paciente que padece una enfermedad autoinmunitaria relacionada con la presencia de autoanticuerpos específicos de un receptor acoplado a proteína G tal como, por ejemplo, el receptor adrenérgico alfa-1, el receptor adrenérgico beta-1, el receptor adrenérgico beta-2, el receptor ETA de la endotelina 1, el receptor M<2>muscarínico, el receptor AT1 de la angiotensina II y/o los receptores PAR, y anticuerpos modificados o manipulados genéticamente. Un autoanticuerpo es un anticuerpo producido por el sistema inmunitario de un individuo que se dirige contra una o más de las propias proteínas del individuo. Sin embargo, el término anticuerpo no se limita a un anticuerpo con la arquitectura clásica de cadena pesada y ligera. Los términos "anticuerpo" o "anticuerpos", tal como se utilizan en el presente documento, son términos reconocidos en la técnica y se entiende que se refieren a moléculas o fragmentos activos de moléculas que se unen a antígenos dados, particularmente los términos se refieren a moléculas de inmunoglobulina y a porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión que se une específicamente a un antígeno. Una inmunoglobulina es una proteína que comprende uno o más polipéptidos sustancialmente codificados por los genes de región constante kappa y lambda, alfa, gamma, delta, épsilon y mu de inmunoglobulina, así como la miriada de genes de región variable de inmunoglobulina. Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, que a su vez definen las clases de inmunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. También se conocen subclases de la cadena pesada. Por ejemplo, las cadenas pesadas de IgG en seres humanos pueden ser cualquiera de las subclases IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. El anticuerpo puede ser preferentemente de la clase IgM y/o IgG o cualquier subclase de la misma (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4).
[0049] Se pretende que los "anticuerpos" incluyan dentro del alcance de la presente invención autoanticuerpos, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos quiméricos, monocatenarios, biespecíficos, simianizados, humanos y humanizados, así como fragmentos activos de los mismos. Los ejemplos de fragmentos activos de moléculas que se unen a antígenos conocidos incluyen cadenas ligeras y pesadas separadas, fragmentos Fab, Fab/c, Fv, Fab' y F(ab')2, incluidos los productos de una biblioteca de expresión de inmunoglobulina Fab y fragmentos de unión a epítopo de cualquiera de los anticuerpos y fragmentos mencionados anteriormente.
[0051] Los aptámeros para su uso según la invención se usan en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias. Tal como se utiliza para los fines de la presente invención, el término "enfermedad autoinmunitaria" o "enfermedades autoinmunitarias" se refiere a enfermedades autoinmunitarias, en particular a enfermedades autoinmunitarias en un ser humano, en las que las enfermedades autoinmunitarias están asociadas con la presencia de autoanticuerpos específicos de un receptor acoplado a proteína G. Dichos autoanticuerpos pueden estar involucrados preferentemente en la patogénesis de la enfermedad autoinmunitaria y, como tales, pueden estar presentes en el suero de un paciente que padece dicha enfermedad autoinmunitaria. Según la invención, las enfermedades autoinmunitarias son enfermedades autoinmunitarias asociadas con la presencia en el suero del paciente de autoanticuerpos específicos del receptor adrenérgico alfa-1, el receptor adrenérgico beta-1, el receptor adrenérgico beta-2, el receptor ETA de la endotelina 1, el receptor M<2>muscarínico, el receptor AT1 de la angiotensina II y/o los receptores PAR. En una forma de realización preferida, la enfermedad autoinmunitaria es cardiomiopatía, cardiomiopatía dilatada (DCM), cardiomiopatía periparto (PPCM), cardiomiopatía idiopática, cardiomiopatía de Chagas, megacolon de Chagas, megaesófago de Chagas, neuropatía de Chagas, hiperplasia prostática benigna, esclerodermia, psoriasis, síndrome de Raynaud, preeclamsia, rechazo de aloinjerto de riñón, miocarditis, glaucoma, hipertensión, hipertensión pulmonar, hipertensión maligna y/o enfermedad de Alzheimer. De la forma más preferida, el término "enfermedad autoinmunitaria" o "enfermedades autoinmunitarias" se refiere a las enfermedades autoinmunitarias cardiomiopatía dilatada (DCM), cardiomiopatía periparto (PPCM), cardiomiopatía de Chagas, megacolon de Chagas, glaucoma, hipertensión, hipertensión pulmonar, hipertensión maligna, rechazo de aloinjerto de riñón, síndrome de Raynaud y/o enfermedad de Alzheimer.
[0053] La fabricación o producción en masa de aptámeros para su uso según la invención es bien conocida en la técnica y representa una mera actividad rutinaria.
[0055] La presente invención también se refiere a un aptámero para su uso tal como se describe en el presente documento que puede estar comprendido en una composición farmacéutica que comprende al menos dicho aptámero para su uso según la invención y, opcionalmente, al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. La invención también se refiere a un aptámero para su uso tal como se describe en el presente documento que puede estar comprendido en una composición farmacéutica que comprende dicho aptámero para su uso según la invención o una mezcla de diferentes aptámeros para su uso según la invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable tal como, por ejemplo, un vehículo o diluyente adecuado.
[0057] Preferentemente, el aptámero para su uso según la invención constituye un principio activo de la composición farmacéutica y/o está presente en una cantidad eficaz.
[0059] El término "cantidad eficaz" denota una cantidad del aptámero para su uso según la invención que tiene un efecto profiláctico, diagnóstico o terapéutico relevante sobre una enfermedad o afecciones patológicas. Un efecto profiláctico previene la aparición de una enfermedad. Un efecto terapéuticamente relevante alivia en una determinada medida uno o más síntomas de una enfermedad o vuelve normales, de forma parcial o completa, uno o más parámetros fisiológicos o bioquímicos asociados con, o causantes de, la enfermedad o afecciones patológicas. La cantidad respectiva para administrar el aptámero para su uso según la invención es lo suficientemente alta como para lograr el efecto profiláctico, diagnóstico o terapéutico deseado. El experto entenderá que el nivel de dosis específico, la frecuencia y el periodo de administración a cualquier mamífero particular dependerán de una diversidad de factores que incluyen la actividad de los componentes específicos empleados, la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo, la dieta, el tiempo de administración, la vía de administración, la combinación de fármacos y la gravedad del tratamiento específico. Usando medios y procedimientos bien conocidos, la cantidad exacta puede determinarse por un experto en la técnica como cuestión de experimentación rutinaria.
[0061] En una composición farmacéutica, al menos el 20% del contenido total de aptámero puede estar constituido por un aptámero para su uso según la invención, preferentemente al menos el 50%, de forma más preferida al menos el 75%, de la forma más preferida al menos el 95%.
[0063] Cuando se usa para tratamiento, dicha composición farmacéutica generalmente se administrará como una formulación en asociación con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. El término "excipiente" se utiliza en el presente documento para describir cualquier ingrediente distinto del aptámero para su uso según la invención. La elección del excipiente dependerá en gran medida del modo particular de administración. Los excipientes pueden ser vehículos y/o diluyentes adecuados.
[0065] Dicha composición farmacéutica puede administrarse por vía oral. La administración oral puede implicar tragar, de modo que la composición penetre en el tubo gastrointestinal, o puede emplearse la administración bucal o sublingual mediante la cual la composición penetra en el torrente sanguíneo directamente desde la boca.
[0067] Las formulaciones adecuadas para administración oral incluyen: formulaciones sólidas tales como comprimidos; comprimidos recubiertos, cápsulas que contienen partículas, líquidos o polvos; pastillas para chupar (incluidas las rellenas de líquido); y gomas de mascar; multipartículas y nanopartículas; geles; soluciones sólidas; liposomas; películas, óvulos, pulverizaciones y formulaciones líquidas.
[0069] Las formulaciones líquidas incluyen suspensiones, soluciones, jarabes y elixires. Dichas formulaciones pueden emplearse como cargas en cápsulas blandas o duras y comprenden normalmente un vehículo, por ejemplo, agua, etanol, polietilenglicol, propilenglicol, metilcelulosa o un aceite adecuado, y uno o más agentes emulsionantes y/o agentes de suspensión. Las formulaciones líquidas también se pueden preparar mediante la reconstitución de un sólido, por ejemplo, a partir de un sobre.
[0071] Para formas de dosificación en comprimidos, dependiendo de la dosis, el aptámero para su uso según la invención puede constituir del 0,1% en peso al 80% en peso de la forma de dosificación, más normalmente del 5% en peso al 60% en peso de la forma de dosificación. Además del aptámero para su uso según la invención, los comprimidos generalmente contienen un disgregante. Los ejemplos de disgregantes incluyen glicolato de almidón sódico, carboximetilcelulosa sódica, carboximetilcelulosa cálcica, croscarmelosa sódica, crospovidona, polivinilpirrolidona, metilcelulosa, celulosa microcristalina, hidroxipropilcelulosa sustituida con alquilo inferior, almidón, almidón pregelatinizado y alginato sódico. Generalmente, el disgregante comprenderá del 1% en peso al 25% en peso, preferentemente del 5% en peso al 20% en peso de la forma de dosificación.
[0073] Los comprimidos pueden comprender excipientes adicionales tales como, por ejemplo, aglutinantes, agentes tensioactivos, lubricantes y/u otros posibles ingredientes, tales como, por ejemplo, antioxidantes, colorantes, aromatizantes, conservantes y/o agentes enmascaradores del sabor.
[0075] Las mezclas para comprimidos pueden comprimirse directamente o mediante rodillo para formar comprimidos. Las mezclas o porciones de mezclas para comprimidos pueden alternativamente granularse en húmedo, en seco o en estado fundido, gelificarse en estado fundido o extruirse antes de la formación de comprimidos. La formulación final puede comprender una o más capas y puede estar recubierta o no recubierta; incluso puede estar encapsulada.
[0077] Las formulaciones sólidas para administración oral pueden formularse para que sean de liberación inmediata y/o modificada. Las formulaciones de liberación modificada incluyen la liberación retardada, mantenida, pulsada, controlada, dirigida y programada.
[0079] La composición farmacéutica divulgada en el presente documento también se puede administrar directamente en el torrente sanguíneo, en el músculo o en un órgano interno. Los medios adecuados para la administración parenteral incluyen medios para la administración intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, intrauretral, intraesternal, intracraneal, intramuscular y subcutánea. Los dispositivos adecuados para la administración parenteral incluyen inyectores de aguja (incluidas microagujas), inyectores sin aguja y técnicas de infusión.
[0081] Las formulaciones de uso parenteral son normalmente soluciones acuosas que pueden contener excipientes tales como sales, carbohidratos y agentes tampón (preferentemente a un pH de 3 a 9), pero, para algunas aplicaciones, pueden formularse más adecuadamente como una solución no acuosa estéril o como una forma seca para su uso junto con un vehículo adecuado tal como agua estéril exenta de pirógenos.
[0083] La preparación de formulaciones de uso parenteral en condiciones estériles, por ejemplo, mediante liofilización, puede realizarse fácilmente usando técnicas farmacéuticas convencionales bien conocidas por los expertos en la técnica.
[0085] La solubilidad de la composición farmacéutica divulgada en el presente documento que se utiliza en la preparación de soluciones de uso parenteral puede aumentarse mediante el uso de técnicas de formulación apropiadas, tales como la incorporación de agentes potenciadores de la solubilidad.
[0087] Las formulaciones para administración parenteral pueden formularse para que sean de liberación inmediata y/o modificada. Las formulaciones de liberación modificada incluyen la liberación retardada, mantenida, pulsada, controlada, dirigida y programada. Por lo tanto, los compuestos para su uso según la invención pueden formularse como un sólido, semisólido o líquido tixotrópico para su administración como un depósito implantado que proporciona una liberación modificada del principio activo. Los ejemplos de dichas formulaciones incluyen endoprótesis vasculares revestidas con fármaco y microesferas de ácido poli(dl-láctico-coglicólico) (PGLA).
[0088] La composición farmacéutica divulgada en el presente documento también se puede administrar por vía tópica a la piel o mucosa, es decir, de forma dérmica o transdérmica. Las formulaciones típicas para este fin incluyen geles, hidrogeles, lociones, soluciones, cremas, pomadas, polvos espolvoreables, apósitos, espumas, películas, parches dérmicos, obleas, implantes, esponjas, fibras, vendajes y microemulsiones. También se pueden usar liposomas. Los vehículos típicos incluyen alcohol, agua, aceite mineral, vaselina líquida, vaselina blanca, glicerina, polietilenglicol y propilenglicol. Se pueden incorporar potenciadores de la penetración. Otros medios de administración tópica incluyen la administración por electroporación, iontoforesis, fonoforesis, sonoforesis y inyección con microaguja o sin aguja (por ejemplo, Powderject(TM), Bioject(TM), etc.) Las formulaciones para administración tópica pueden formularse para que sean de liberación inmediata y/o modificada. Las formulaciones de liberación modificada incluyen la liberación retardada, mantenida, pulsada, controlada, dirigida y programada.
[0089] Para la administración a pacientes humanos, la dosis diaria total del aptámero para su uso según la invención y/o la composición farmacéutica divulgada en el presente documento se encuentra normalmente en el intervalo de 0,001 mg a 5000 mg dependiendo, por supuesto, del modo de administración. Por ejemplo, una dosis diaria intravenosa puede requerir solo de 0,001 mg a 40 mg. La dosis diaria total puede administrarse en dosis únicas o divididas y puede, a juicio del médico, encontrarse fuera del intervalo típico indicado en el presente documento.
[0090] Estas dosificaciones se basan en un sujeto humano promedio que tiene un peso de aproximadamente 65 kg a 70 kg. El médico podrá determinar fácilmente las dosis para sujetos cuyo peso se encuentra fuera de este intervalo, tales como niños y personas de edad avanzada.
[0092] Como aspecto de referencia, se divulga un kit que comprende un aptámero para su uso según la invención, una composición farmacéutica, un recipiente y opcionalmente instrucciones escritas para su uso y/o con medios de administración.
[0094] El aptámero para su uso según la invención, la composición farmacéutica y/o el kit se usan en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias, en particular de enfermedades autoinmunitarias en un ser humano. Las enfermedades autoinmunitarias son enfermedades autoinmunitarias asociadas con la presencia de autoanticuerpos específicos de un receptor acoplado a proteína G, en las que los autoanticuerpos están presentes en el suero de un paciente que padece dicha enfermedad autoinmunitaria. Según la presente invención, las enfermedades autoinmunitarias son enfermedades autoinmunitarias asociadas con la presencia en el suero del paciente de autoanticuerpos específicos del receptor adrenérgico alfa-1, el receptor adrenérgico beta-1, el receptor adrenérgico beta-2, el receptor ETA de la endotelina 1, el receptor M<2>muscarínico, el receptor AT1 de la angiotensina II y/o los receptores PAR. Preferentemente, la enfermedad autoinmunitaria es cardiomiopatía, cardiomiopatía dilatada (DCM), cardiomiopatía periparto (PPCM), cardiomiopatía idiopática, cardiomiopatía de Chagas, megacolon de Chagas, megaesófago de Chagas, neuropatía de Chagas, hiperplasia prostática benigna, esclerodermia, psoriasis, síndrome de Raynaud, preeclamsia, rechazo de aloinjerto de riñón, miocarditis, glaucoma, hipertensión, hipertensión pulmonar, hipertensión maligna y/o enfermedad de Alzheimer. De forma más preferida, el término "enfermedad autoinmunitaria" o "enfermedades autoinmunitarias" se refiere a las enfermedades autoinmunitarias cardiomiopatía dilatada (DCM), cardiomiopatía periparto (PPCM), cardiomiopatía de Chagas, megacolon de Chagas, glaucoma, hipertensión, hipertensión pulmonar, hipertensión maligna, rechazo de aloinjerto de riñón, síndrome de Raynaud y/o enfermedad de Alzheimer.
[0096] Los términos "terapia", "tratamiento" y "terapéuticamente", tal como se utilizan en el presente documento, se refieren al acto de tratar, tal como se define "tratar" a continuación. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "tratar" se refiere a revertir, aliviar o inhibir el progreso de una enfermedad, trastorno o afección, o uno o más síntomas de dicha enfermedad, trastorno o afección, a la que se aplica dicho término. Tal como se utiliza en el presente documento, "tratar" también puede referirse a disminuir la probabilidad o incidencia de la aparición de una enfermedad, trastorno o afección en un mamífero en comparación con una población de control no tratada, o en comparación con el mismo mamífero antes del tratamiento. Por ejemplo, tal como se utiliza en el presente documento, "tratar" puede referirse a prevenir una enfermedad, trastorno o afección, y puede incluir retrasar o prevenir la aparición de una enfermedad, trastorno o afección, o retrasar o prevenir los síntomas asociados con una enfermedad, trastorno o afección. Como se usa en el presente documento, "tratar" también puede referirse a reducir la gravedad de una enfermedad, trastorno o afección o síntomas asociados con dicha enfermedad, trastorno o afección antes del padecimiento de un mamífero de la enfermedad, trastorno o afección. Tal prevención o reducción de la gravedad de una enfermedad, trastorno o afección antes de padecerla se refiere a la administración de la composición que comprende un aptámero para su uso según la presente invención, tal como se describe en el presente documento, a un sujeto que no está en el momento de la administración afectado por la enfermedad, trastorno o afección. Tal como se utiliza en el presente documento, "tratar" también puede referirse a prevenir la recurrencia de una enfermedad, trastorno o afección o de uno o más síntomas asociados con dicha enfermedad, trastorno o afección.
[0098] Para el tratamiento de una enfermedad, independientemente de la vía de administración, el aptámero para su uso según la invención se administra a una dosis diaria por ciclo de tratamiento de no más de 20 mg/kg de peso corporal, preferentemente de no más de 10 mg/kg de peso corporal, de forma más preferida seleccionada del intervalo de 1 pg/kg a 20 mg/kg de peso corporal, de la forma más preferida seleccionado de un intervalo de 0,01 a 10 mg/kg de peso corporal.
[0100] Como otro aspecto de referencia, también se divulga el uso de un aptámero para su uso según la invención o composición farmacéutica en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o diagnóstico de una enfermedad autoinmunitaria. Preferentemente, la enfermedad autoinmunitaria es cardiomiopatía, cardiomiopatía dilatada (DCM), cardiomiopatía periparto (PPCM), cardiomiopatía idiopática, cardiomiopatía de Chagas, megacolon de Chagas, megaesófago de Chagas, neuropatía de Chagas, hiperplasia prostática benigna, esclerodermia, psoriasis, síndrome de Raynaud, preeclamsia, rechazo de aloinjerto de riñón, miocarditis, glaucoma, hipertensión, hipertensión pulmonar, hipertensión maligna y/o enfermedad de Alzheimer. De forma incluso más preferida, el término "enfermedad autoinmunitaria" o "enfermedades autoinmunitarias" se refiere a las enfermedades autoinmunitarias cardiomiopatía dilatada (DCM), cardiomiopatía periparto (PPCM), cardiomiopatía de Chagas, megacolon de Chagas, glaucoma, hipertensión, hipertensión pulmonar, hipertensión maligna, rechazo de aloinjerto de riñón, síndrome de Raynaud y/o enfermedad de Alzheimer.
[0102] En otro aspecto de referencia, se divulga adicionalmente un procedimiento de tratamiento o de diagnóstico de una enfermedad autoinmunitaria, en el que a un individuo que necesita dicho tratamiento se le administra una cantidad eficaz de un aptámero para su uso según la invención o una composición farmacéutica. Preferentemente, la enfermedad autoinmunitaria es cardiomiopatía, cardiomiopatía dilatada (DCM), cardiomiopatía periparto (PPCM), cardiomiopatía idiopática, cardiomiopatía de Chagas, megacolon de Chagas, megaesófago de Chagas, neuropatía de Chagas, hiperplasia prostática benigna, esclerodermia, psoriasis, síndrome de Raynaud, preeclamsia, rechazo de aloinjerto de riñón, miocarditis, glaucoma, hipertensión, hipertensión pulmonar, hipertensión maligna y/o enfermedad de Alzheimer. De forma incluso más preferida, el término "enfermedad autoinmunitaria" o "enfermedades autoinmunitarias" se refiere a las enfermedades autoinmunitarias cardiomiopatía dilatada (DCM), cardiomiopatía periparto (PPCM), cardiomiopatía de Chagas, megacolon de Chagas, glaucoma, hipertensión, hipertensión pulmonar, hipertensión maligna, rechazo de aloinjerto de riñón, síndrome de Raynaud y/o enfermedad de Alzheimer.
[0104] El aptámero para su uso según la invención, cuando se usa para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria no precisa necesariamente administrarse a un individuo o paciente. El efecto terapéutico o diagnóstico también se puede lograr mediante el uso del aptámero para su uso según la invención para la eliminación de anticuerpos, tales como, por ejemplo, autoanticuerpos, del cuerpo o de fluidos corporales. Dicha eliminación puede comprender la aplicación del aptámero para su uso según la invención en una situación en la que el aptámero para su uso según la invención se pone en contacto con un fluido corporal exclusivamenteex vivo,por ejemplo durante la adsorción inmunitaria y/o aféresis, de modo que el aptámero para su uso según la invención no penetre en el cuerpo del individuo o paciente que se va a tratar. Por lo tanto, como aspecto de referencia, también se divulga una columna de aféresis que comprende un aptámero para su uso según la invención.
[0106] La aféresis es una tecnología médica en la que la sangre de un donante o paciente se hace pasar a través de un aparato que separa un constituyente particular y se hace retornar el resto a la circulación del donante o paciente. El aptámero para su uso según la invención se puede usar como ingrediente selectivo durante la aféresis. El ingrediente selectivo es responsable de separar específicamente los constituyentes particulares deseados, concretamente los anticuerpos o autoanticuerpos presentes en la muestra o sangre a los que se dirige específicamente el aptámero para su uso según la invención. Preferentemente, el aptámero para su uso según la invención se usa como ingrediente selectivo en aféresis terapéutica de sangre o partes de la misma derivadas de un paciente que padece una enfermedad autoinmunitaria. De forma más preferida, la enfermedad autoinmunitaria es cardiomiopatía, cardiomiopatía dilatada (DCM), cardiomiopatía periparto (PPCM), cardiomiopatía idiopática, cardiomiopatía de Chagas, megacolon de Chagas, megaesófago de Chagas, neuropatía de Chagas, hiperplasia prostática benigna, esclerodermia, psoriasis, síndrome de Raynaud, preeclamsia, rechazo de aloinjerto de riñón, miocarditis, glaucoma, hipertensión, hipertensión pulmonar, hipertensión maligna y/o enfermedad de Alzheimer. De forma incluso más preferida, el término "enfermedad autoinmunitaria" o "enfermedades autoinmunitarias" se refiere a las enfermedades autoinmunitarias cardiomiopatía dilatada (DCM), cardiomiopatía periparto (PPCM), cardiomiopatía de Chagas, megacolon de Chagas, glaucoma, hipertensión, hipertensión pulmonar, hipertensión maligna, rechazo de aloinjerto de riñón, síndrome de Raynaud y/o enfermedad de Alzheimer.
[0108] La presente divulgación también se refiere a un aptámero acoplado a un soporte sólido. El experto conoce bien las técnicas y materiales que pueden usarse para producir dichos aptámeros acoplados a un soporte sólido. En una forma de realización preferida, el soporte sólido comprende un material sólido que puede aplicarse en ensayos médicos, bioquímicos o biológicos, tal como, por ejemplo, materiales usados en aféresis o ensayos ELISA. Dicho material sólido comprende polímeros que se usan habitualmente como soporte en ensayos médicos, bioquímicos o biológicos. En particular, el aptámero para su uso según la invención puede acoplarse a un soporte sólido que permite el uso del producto resultante en la fabricación de una columna adecuada para aféresis, preferentemente una columna que es adecuada para su uso en una aféresis para eliminar anticuerpos a los que puede unirse específicamente el aptámero para su uso según la invención de una muestra líquida, preferentemente de un fluido corporal.
[0110] En un aspecto de referencia adicional, se divulga el uso de un aptámero para su uso según la invención para la detecciónin vitroy/o la caracterización de anticuerpos, tales como, por ejemplo, autoanticuerpos que son específicos de un receptor acoplado a proteína G, preferentemente los receptores acoplados a proteína G receptor adrenérgico alfa-1, receptor adrenérgico beta-1, receptor adrenérgico beta-2, receptor ETA de la endotelina 1, receptor M<2>muscarínico, receptor AT1 de la angiotensina II y/o receptores PAR.
[0112] Dicho uso puede comprender el análisis de una muestra en un ensayo de frecuencia de latido de cardiomiocitos de rata en presencia y ausencia de una cantidad eficaz de un aptámero para su uso según la invención. Dependiendo del efecto de la muestra y del aptámero para su uso según la invención sobre la frecuencia de latido, el experto puede concluir que hay presencia de los anticuerpos respectivos. También se pueden obtener datos sobre la cantidad total o relativa de dichos anticuerpos en la muestra, así como sobre otras propiedades de dichos anticuerpos.
[0114] El denominado ensayo de frecuencia de latido de cardiomiocitos de rata es un ensayo bien establecido para la detección y caracterización de anticuerpos, por ejemplo, autoanticuerpos derivados de pacientes, específicos de una serie de receptores acoplados a proteína G humana tales como, por ejemplo, el receptor adrenérgico alfa-1, el receptor adrenérgico beta-1, el receptor adrenérgico beta-2, el receptor ETA de la endotelina 1, el receptor M<2>muscarínico, el receptor AT1 de la angiotensina II y/o los receptores PAR. El ensayo se describe en detalle por Wallukat et al. (1987) Effects of the serum gamma globulin fraction of patients with allergic asthma and dilated cardiomyopathy on chromotropic beta adrenoceptor function in cultured neonatal rat heart myocytes, Biomed. Biochim. Acta 46, 634 - 639; Wallukat et al. (1988) Cultivated cardiac muscle cells - a functional test system for the detection of autoantibodies against the beta adrenergic receptor, Acta Histochem. Suppl. 35, 145 - 149; y Wallukat et al. (2010) Distinct patterns of autoantibodies against G-protein coupled receptors in Chagas' cardiomyopathy and megacolon. Their potential impact for early risk assessment in asymptomatic Chagas' patients, J. Am. Coll. Cardiol. 55, 463 - 468. Por lo tanto, el experto es bien consciente de la naturaleza de este ensayo y sabe cómo aplicarlo.
[0116] El aptámero descrito en el presente documento puede usarse particularmente en la detección y/o la caracterización de los anticuerpos respectivos, en el que los anticuerpos se presentan en, o derivan de, un fluido corporal, preferentemente un fluido del cuerpo humano, de forma más preferida de sangre, plasma, suero, orina, heces, líquido sinovial, líquido intersticial, linfa, saliva, sudor, líquido cefalorraquídeo y/o líquido lagrimal humanos. En una forma de realización preferida, el fluido corporal se toma de un individuo que padece, o se sospecha que padece, una enfermedad autoinmunitaria. Preferentemente, la enfermedad autoinmunitaria es cardiomiopatía, cardiomiopatía dilatada (DCM), cardiomiopatía periparto (PPCM), cardiomiopatía idiopática, cardiomiopatía de Chagas, megacolon de Chagas, megaesófago de Chagas, neuropatía de Chagas, hiperplasia prostática benigna, esclerodermia, psoriasis, síndrome de Raynaud, preeclamsia, rechazo de aloinjerto de riñón, miocarditis, glaucoma, hipertensión, hipertensión pulmonar, hipertensión maligna y/o enfermedad de Alzheimer. De forma incluso más preferida, el término "enfermedad autoinmunitaria" o "enfermedades autoinmunitarias" se refiere a las enfermedades autoinmunitarias cardiomiopatía dilatada (DCM), cardiomiopatía periparto (PPCM), cardiomiopatía de Chagas, megacolon de Chagas, glaucoma, hipertensión, hipertensión pulmonar, hipertensión maligna, rechazo de aloinjerto de riñón, síndrome de Raynaud y/o enfermedad de Alzheimer.
[0118] Para la detección y/o caracterización de dichos anticuerpos, el aptámero descrito en el presente documento puede usarse en solución o en una forma inmovilizada.
[0120] El aptámero puede usarse para la detección directa o indirecta
[0122] y/o la caracterización de dichos anticuerpos.
[0123] A continuación se explicará y se ejemplificará adicionalmente la invención por medio de ejemplos.Figuras:
[0124] Figura 1
[0125] muestra las curvas de dosis-respuesta de la neutralización de la actividad funcional de diferentes AAB tal como se indica en la figura.
[0126] Figura 2
[0127] muestra la influencia de la presencia de IgG-3 humana [73 nM] sobre la curva de dosis-respuesta de neutralización de la actividad funcional de AAB del receptor beta1 por medio del aptámero de trombina.
[0128] Figura 3
[0129] muestra la influencia del aptámero de trombina sobre la disminución mediada por el AB de ETAde la frecuencia de latido de cardiomiocitos de neonatos.
[0130] Figura 4
[0131] muestra la unión del aptámero de trombina (SEQ. ID No. 1) al AB de ETA inmovilizado, la IgG de conejo inmovilizada y las subclases de IgG humana inmovilizada para control. A y C: 25 nM de cada proteína inmovilizada, B y D: 250 nM de las proteínas inmovilizadas. A y B: unión del aptámero de trombina de s Eq . ID No. 1 y C y D: unión de su secuencia de control revuelta. Se usó el aptámero de trombina biotinilado y el resto de biotina sirvió para la detección. La cantidad de biotina unida se cuantificó mediante neutravidina-POD y la reacción TMB/H<2>O<2>. Figura 5
[0132] muestra la unión del AB de ETA (SP 4122P) a aptámero de trombina inmovilizado (SEQ. ID No. 1) A: 1 pM de B: 0,1 pM de aptámero de trombina para la inmovilización. Para la detección se usó el anticuerpo secundario anti-IgG de conejo-POD (1:10.000) y la reacción TMB/H<2>O<2>. La placa no recubierta y la placa recubierta con neutravidina se usaron como control. (Neutravidina = NA).
[0133] Figura 6
[0134] muestra la unión del AB de ETA (SP 4122P) a aptámero de trombina inmovilizado (SEQ. ID No. 1) y el aptámero de trombina revuelto inmovilizado para el control.
[0135] Figura 7
[0136] muestra la recuperación del AB de ETA unido después de la elución de la columna de aptámero de trombina y el experimento de control correspondiente (columna de control). La actividad de AB de ETA se midió en el bioensayo. Figura 8
[0137] muestra la recuperación del AB de ETA del suero enriquecido en el experimento ELISA. A: muestra la curva patrón de AB de ETA que se trató en comparación con las muestras de eluato (diálisis). B: muestra la cantidad de AB de ETA recuperado en los flujos, la solución de lavado y los eluatos después de la elución de la columna de aptámero de trombina (columna ARC183) y la columna de control correspondiente (aptámero de trombina revuelto). Para la detección se usó un anticuerpo anti-IgG de conejo-POD (1:10.000) y la detección TMB/H<2>O<2>.
[0138] Figura 9
[0139] muestra el ensayo de capacidad de neutralización de AAB del aptámero de trombina marcado con 5'-FITC usando el bioensayo de cardiomiocitos de rata neonata que laten espontáneamente. El aumento de la frecuencia de latido provocado por los AAB del receptor beta1 se redujo en aproximadamente el 50% cuando había presencia de 100 nM de FITC-aptámero de trombina. Las barras son la media de dos experimentos independientes (n=2).
[0140] Figura 10
[0141] muestra la detección de AAB de ETAde una muestra de paciente usando un ensayo de tipo sándwich de aptámero de trombina // FITC-aptámero de trombina. Para el control se usó una muestra de IgG de control y aptámero de trombina revuelto. Los datos son de un experimento. (FITC-a-trom = FITC-aptámero de trombina, apta-tromb = aptámero de trombina).
[0142] Figura 11
[0143] muestra la neutralización de la actividad de AAB (AAB del receptor betal, AAB del receptor alfal AAB del receptor beta2, AAB del receptor beta2 purificado por afinidad, cada AAB n=1) por dT-aptámero de trombina 100 nM, medida en el bioensayo de cardiomiocitos de neonato que laten espontáneamente.
[0144] Figura 12
[0145] muestra el ensayo de la funcionalidad de la secuencia truncada de aptámero de trombina (secuencia de 12 unidades, SEQ ID No. 3, Throm K1) en comparación con la secuencia original de 15 unidades (ARC183, SEQ ID No. 1) y la secuencia de 26 unidades (NU172, SEQ ID No. 2) que neutraliza la actividad cronotrópica positiva de los AAB del receptor beta1 en el bioensayo de cardiomiocitos de rata que laten espontáneamente.
[0146] EJEMPLOS:
[0147] Sumario
[0148] Los aptámeros que consisten en una secuencia de ácido nucleico con la SEQ. ID No. 1 y 2, respectivamente, son ligantes afines y específicos de autoanticuerpos que se dirigen a los receptores acoplados a proteína G. Los aptámeros son capaces de neutralizar la función de AAB (autoanticuerpo) en el estado soluble. Inmovilizados sobre superficies, los aptámeros fueron capaces de capturar AAB. Una elución siguiente eliminará los AAB capturados. Por lo tanto, se ha demostrado que los aptámeros para su uso según la presente invención son moléculas apropiadas para fines terapéuticos para el tratamiento de enfermedades que están asociadas a AAB activos funcionales contra receptores acoplados a proteína G.
[0149] Material y procedimientos
[0150] Preparación y cultivo de cardiomiocitos
[0151] Se extrajeron corazones de ratas de 1 a 3 días de edad en condiciones estériles y se transfirieron a solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía penicilina/estreptomicina. El tejido del ventrículo se separó, se diseccionó en trozos y se lavó dos veces con 10 ml de PBS que contenía penicilina/estreptomicina y finalmente una vez con PBS solo. Los trozos de ventrículo se suspendieron en 30 ml de PBS que contenía el 0,2% de tripsina. Después de una incubación durante 20 min a 37 °C, se detuvo la tripsinización con 10 ml de suero de ternera inactivado por calor enfriado con hielo. La suspensión resultante se centrifugó a 130 x g durante 6 min y el sedimento se transfirió a 20 ml de medio SM20-I. Para la estimación del recuento celular, se añadieron 100 pl de esta suspensión a 100 pl de solución de azul de tripano. Para el cultivo celular, se suspendieron 2,4 x 106 células en 2,5 ml de medio SM 20-I que contenía glucosa, que se equilibró con aire húmedo y se complementó con el 10% de suero de ternero inactivado por calor, 0,1 mU de insulina y 2 pM de fluorodesoxiuridina (que impide el crecimiento en exceso de los miocitos por no miocitos), se transfirieron a matraces Falcon de 12,5 cm2 y se cultivaron como monocapas durante 4 días a 37 °C. El medio se renovó después de dos días
[0152] Principio del bioensayo
[0153] Para la identificación y cuantificación del AAB, se usó un bioensayo que se estableció en primer lugar para la medición de AAB contra receptores acoplados a proteína G por Wallukat y Wollenberger (Wallukat G, Wollenberger A. Effects of the serum gamma globulin fraction of patients with allergic asthma and dilated cardiomyopathy on chromotropic beta adrenoceptor function in cultured neonatal rat heart myocytes. Biomed Biochim Acta 1987; 46: S634-9) y que los inventores describieron recientemente en detalle para la medición de AAB contra los receptores beta1 y beta2 adrenérgicos y los receptores M2 muscarínicos en la enfermedad crónica de Chagas (Wallukat G, Muñoz Saravia SG, Haberland A, Bartel S, Araujo R, Valda G, Duchen D, Diaz Ramirez I, Borges AC, Schimke I. Distinct patterns of autoantibodies against G-protein-coupled receptors in Chagas' cardiomyopathy and megacolon. Their potential impact for early risk assessment in asymptomatic Chagas' patients. J Am Coll Cardiol. 2010;55:463-8.).
[0154] En este bioensayo, se registró la respuesta cronotrópica de cardiomiocitos de rata neonatales cultivados que laten espontáneamente, que es la suma de la cronotropía positiva provocada por la estimulación de AAB, tales como los que se dirigen a receptores beta1 y beta2 adrenérgicos o el receptor alfa1 adrenérgico y la cronotropía negativa provocada por la inhibición de AAB, tales como los que se dirigen a receptores M2 muscarínicos o el receptor de la endotelina tipo A (receptor ETA) (1 unidad de actividad de AAB = 1 latido/min de cambio de frecuencia).
[0155] Para diferenciar las especies de AAB con respecto a su contribución a la respuesta cronotrópica (cronotropía positiva o negativa), se realizó un análisis en presencia de antagonistas específicos tales como ICI-118.551 para AAB del receptor beta2, atropina para AAB de M2, propanolol para el AAB de receptor beta1/beta2, BQ 610 o BQ 123 para el receptor ETA, prazosina para el receptor adrenérgico alfa1 e Ibesartano o Losarían para el receptor ATI. El cambio de actividad restante está provocado por AAB excepto una vez que se bloqueó específicamente. Se realizó una caracterización adicional de diferentes AAB de receptores mostrados anteriormente usando los péptidos que representan el epítopo de AAB correspondientes a los bucles extracelulares de los receptores. El bioensayo puede detectar y cuantificar todos los AAB séricos humanos y otras moléculas que se dirigen a receptores en la superficie celular cuyas secuencias son homólogas a los receptores humanos (en el caso del direccionamiento a AAB) y que se unen a una maquinaria que regula la frecuencia de latido (contractilidad, cronotropía) de las células tales como el sistema de proteína G.
[0156] Preparación de muestras de suero para la identificación y diferenciación de AAB y medición de la actividad de AAB
[0157] Se mezclaron 1 ml de suero de control y de paciente y 660 pl de solución saturada de sulfato de amonio (concentración final de sulfato de amonio: 40%) y se incubaron durante 18 horas a 4 °C.
[0158] Después de una centrifugación durante 15 min a 6.000 x g, el sedimento se resuspendió en 750 pl de PBS, se mezcló con 750 pl de solución saturada de sulfato de amonio (concentración final de sulfato de amonio: 50%) y se centrifugó de nuevo. Después de esto, el sedimento se suspendió en 700 pl de PBS y se dializó contra el volumen de 100 veces de PBS. La fracción de IgG resultante se puede almacenar a -20 °C hasta la medición.
[0159] Resultados
[0160] Inhibición de la funcionalidad de AAB de diferentes AAB contra receptores acoplados a proteína G mediante aptámeros específicos
[0161] A continuación, se investigó la neutralización de la actividad de anticuerpos (autoanticuerpos del suero del paciente) por el aptámero de SEQ. ID No. 1 (también conocido como aptámero de trombina de SEQ ID No. 1, o ARC 183, descrito en el documento US 5.543.293) y por el aptámero de SEQ. ID No 2 (también conocido como aptámero de trombina de SEQ ID No 2, o ARC 2172 o NU 172, descrito en el documento W<o>/2007/025049) (Tabla 1).
[0162] De esta forma se investigaron los siguientes anticuerpos (autoanticuerpos = AAB): AAB del receptor alfa1 adrenérgico, AAB del receptor beta1 adrenérgico, AAB del receptor beta2, AAB del receptor muscarínico M<2>, AAB del receptor ETA de la endotelina 1 (AAB de ETA), AAB del receptor AT1 de la angiotensina II y AAB del receptor PAR.
[0163] La aparición de dicho AAB se ha descrito en las siguientes situaciones patológicas, sin excluir otras situaciones patológicas que también podrían ser portadores de los mismos o similares AAB: DCM, cardiomiopatía de Chagas, enfermedad crónica de Chagas, megacolon de Chagas, cardiomiopatía de periparto, glaucoma, hipertensión pulmonar, hipertensión, hipertensión maligna, diabetes mellitus, enfermedad de Alzheimer, rechazo de aloinjerto de riñón, síndrome de Raynaud. La tabla 1 muestra que la actividad funcional de todos los autoanticuerpos evaluados dirigidos contra receptores acoplados a proteína G se neutralizó usando el aptámero con la SEQ. ID No. 1 o se neutralizó parcialmente usando el aptámero con la SEQ ID No. 2.
[0164]
[0167] Curvas de dosis-respuesta de la neutralización de AAB mediada por aptámero de trombinaA continuación, se midieron las curvas de dosis-respuesta de las incubaciones individuales de aptámero de trombina (figura 1). Al hacer esto, no solo se neutralizaron los AAB humanos contra los receptores acoplados a proteína G, sino también los AAB del receptor beta1 de sangre de ratas SHR. De hecho, se neutralizaron los AAB humanos contra el primer o segundo bucle del receptor beta1, los AAB contra el receptor AT1 y el receptor alfa1 adrenérgico. El AAB del receptor beta1 en ratas es un AAB formado espontáneamente.
[0168] Resultó bastante obvio que las diferentes curvas de dosis-respuesta mostraron ligeramente diferencias. Aunque el efecto de neutralización fue más eficaz para el AAB de receptor alfa 1 humano, mostró la menor eficacia para el AAB de receptor beta1 de rata. Si la concentración de AAB pudiera ser de aproximadamente el 0,1% de la fracción de IgG (información personal Dr. Wallukat) entonces las diferentes concentraciones de aptámero se enfrentarían a una concentración final de AAB aproximadamente 1,4 nM (concentración de IgG normal de aproximadamente 10 g/l = 68,5 |<j>M, dilución de AAB en el medio de cultivo celular 1:50). De esta manera, resulta muy lógico que el efecto de neutralización comience en algún AAB, tal como el AAB del receptor alfa 1, a una concentración de aptámero de aproximadamente 1 nM, mientras que en general son necesarios 100 nM de aptámero para una inhibición completa de la funcionalidad de AAB.
[0169] Afinidad por AAB del aptámero en presencia de IgG-3 humana competitiva
[0170] Los experimentos anteriores que evalúan la afinidad del aptámero de trombina de SEQ ID No. 1 hacia los subtipos de IgG humana han mostrado que el aptámero de trombina de SEQ ID No. 1 tiene una mayor afinidad hacia IgG-3, seguida de IgG-4, IgG-2 e IgG1. Aunque las diferencias entre los últimos tres subtipos fueron solo marginales, la afinidad hacia el subtipo IgG-3 era sorprendente (datos no mostrados).
[0171] Ahora, a fin de evaluar si la afinidad del aptámero de trombina de SEQ ID No. 1 hacia el AAB es mayor en comparación con su afinidad común hacia la subclase IgG-3, se llevó a cabo el siguiente experimento de competición: mientras se mide la curva de dosis-respuesta del aptámero de trombina de SEQ ID No. 1 frente a un AAB de suero de paciente humano (AAB de receptor beta 1, segundo bucle, dilución 1:50), en un conjunto experimental se añadió IgG-3 humana 73 nM permitiendo que compitiera con el AAB de receptor beta 1 sobre la unión a aptámero de trombina (figura 2). Especialmente a la baja concentración del aptámero de trombina de SEQ ID No.1 (aptámero de trombina 1, 5 y 10 nM) a la que la concentración de IgG-3 está claramente en el exceso molar con respecto al aptámero de trombina, no se observaron diferencias entre los efectos de neutralización de AAB, con y sin la presencia de IgG-3.
[0172] Demostración de la unión entre el aptámero de trombina y el autoanticuerpo usando un modelo de autoanticuerpo: anticuerpo anti-receptor de endotelina humano de conejo contra el segundo bucle extracelular del receptor (anticuerpos acris, SP 41222P)
[0173] 1. Prueba de funcionalidad de AB de ETA en el bioensayo y neutralización por el aptámero de trombina de SEQ ID No.1
[0174] El anticuerpo del receptor de endotelina de conejo (AB de ETA) se generó contra el segundo bucle extracelular del receptor de endotelina humano. El anticuerpo mostró actividad funcional en el bioensayo. El AB de ETA provocó una reducción de la frecuencia de latido de cardiomiocitos de rata neonatales que laten espontáneamente (figura 3). La adición de 100 nM de aptámero de trombina provocó la neutralización completa de este AB de ETA, lo que provocó un cambio en la frecuencia de latido (figura 3). La adición del aptámero de trombina (SEQ. No. 1) solo sobre los cardiomiocitos de rata neonatales ni provocó ningún efecto visual sobre las células ni influyó sobre la frecuencia de latido basal (datos no mostrados).
[0175] 2. Ensayo de la unión directa entre el aptámero de trombina de SEQ ID No.1 y el AB de ETA
[0176] En el ensayo de la unión directa entre el aptámero de trombina y el AB de ETA en el experimento ELISA se evaluaron dos configuraciones experimentales diferentes. En primer lugar, el AB de ETA se inmovilizó sobre la placa de ELISA y se evaluó su capacidad para unirse al aptámero de trombina de SEQ ID No.1 (figura 4). En un segundo conjunto de experimentos, el aptámero de trombina de SEQ ID No. 1 se inmovilizó y el AB de ETA se ofreció para la unión (figura 5).
[0177] Para el primer conjunto de experimentos se eligieron dos concentraciones de proteína diferentes para la inmovilización en la placa de ELISA: 25 nM (figura 4A) y 250 nM (figura 4B). Para el control se utilizó IgG de conejo, subclases de IgG humana (IgG-1, 2, 3 y 4) a las mismas concentraciones, y la placa de plástico sin recubrir. Otro control fue la secuencia de aptámero de trombina revuelta que se ofreció para la unión (figura 4C,D).
[0178] Un segundo conjunto de experimentos evaluó la unión entre el AB de ETA y el aptámero de trombina de SEQ. ID No. 1 en un experimento inverso. Ahora el aptámero de trombina biotinilado se inmovilizó sobre las placas de ELISA mediante preinmovilización de neutravidina. A continuación, se ofreció el AB de ETA para la unión (figura 5 A,B).
[0180] La comparación de la extinción entre la figura 5B y la figura 5A muestra que un recubrimiento de 0,1 pM de aptámero de trombina (SEQ. ID No. 1) ya alcanzó la saturación en el experimento dado.
[0182] Otro control fue la unión del AB de ETA al aptámero de trombina revuelto inmovilizado (figura 6).
[0184] La afinidad del AB de ETA hacia el aptámero de trombina revuelto fue aproximadamente el 50% de la afinidad alcanzada si el aptámero de trombina (SEQ. ID No. 1) se ofreció para la unión.
[0186] Columna de aptámero de trombina para la eliminación de AAB del suero
[0188] 1. Suero humano enriquecido con AB de ETA de conejo
[0190] A continuación se preparó una columna de aptámero de trombina que sirvió para la eliminación de AAB del suero. Para el control se utilizó una columna que portaba el aptámero de trombina revuelto. Los aptámeros (aptámero de trombina de SEQ. ID No. 1) y la secuencia de control revuelta se unieron sobre material de columna (sefarosa activada con NHS, GE healthcare) a una concentración de 0,1 pmol.
[0192] En un primer conjunto de experimentos, se enriqueció suero con el AB de ETA de conejo (50 nM) con el fin de obtener la oportunidad de no solo medir la actividad de AB de ETA mediante el bioensayo (figura 7) sino también mediante un ELISA (figura 8). Los sueros enriquecidos se administraron sobre la columna y la columna de control. El flujo se tomó y se almacenó. Los AB de ETA unidos se eluyeron usando una solución de KSCN 3 M. Antes de medir la actividad de AAB en los eluatos, las muestras se dializaron contra tampón fisiológico durante 3 días a 4 °C.
[0194] En el bioensayo se midieron los eluatos, que se tomaron en dos fracciones (figura 7). Mientras que la columna de aptámero de trombina mostró la actividad de AB de ETA después de la elución, la columna de control no lo hizo. La fracción principal de AB de ETA estaba en la segunda fracción de eluato que fue acreedora de los volúmenes usados. El volumen de la columna fue de 500 pl, mientras que para todas las etapas de manipulación se eligieron 250 pl.
[0196] Para la detección del AB de ETA en el flujo o el eluato de las columnas en el ELISA, la curva patrón de AB de ETA del ELISA también tuvo que someterse al procedimiento de diálisis, comparable al material de muestra de eluato (figura 8A). Usando este material estándar, las muestras se sometieron a ensayo para determinar la presencia de AB de ETA (figura 8B).
[0198] Se muestra que solo la columna específica de aptámero de trombina fue capaz de unirse al AB de ETA del suero de control enriquecido, mientras que el aptámero de control revuelto no se unió al AB de ETA. En este caso, el AB de ETA se encontró en el flujo, mientras que con la columna específica las fracciones eluidas contenían el AB de ETA.
[0200] Simplemente para excluir que la IgG humana unida del suero de control pudiera mediante reacción cruzada con el anticuerpo secundario imitar la presencia de AB de ETA, también se aplicó suero (40% y 100%) sobre la placa de ELISA. Se midió la cantidad máxima posible de reacción cruzada, que fue inferior a la detección específica de AB anti-conejo. Además, se demostró en experimentos independientes que los eluatos contenían menos de 1/10 de IgG humana en comparación con las muestras de flujo (datos no mostrados), excluyendo una enorme influencia de la reactividad cruzada de anticuerpos secundarios.
[0202] 2. Suero que contiene AAB humano
[0204] En una segunda serie de experimentos, la columna de aptámero de trombina se usó para la eliminación de AAB sérico. Para el control se usó la columna de aptámero de trombina revuelto.
[0206] Para este fin, se administraron 250 pl de AAB de ETA y suero que contenía AAB del receptor alfa 1 sobre las columnas. Los flujos y los eluatos se capturaron y se estimaron para determinar la actividad de AAB usando el bioensayo (tabla2).La elución se realizó con KSCN 3 M. Las muestras se dializaron contra un tampón fisiológico durante 3 días antes de llevar a cabo la medición de la actividad de AAB.
[0208] Tabla 2: medición de la actividad del AAB de ETA y del AAB del receptor alfa1 de suero humano en las fracciones individuales del experimento de columna
[0209]
[0211] n.d. = no determinado
[0212] Posible kit para la purificación de suero de AAB a través de perlas magnéticas con aptámero
[0213] Un kit para la purificación de suero de AAB o para el enriquecimiento de AAB mediante perlas magnéticas de aptámero de trombina.
[0214] Tabla 3Unión de AAB sérico (humano y de rata) a aptámero de trombina inmovilizado (SEQ. ID No. 1; perlas magnéticas de estreptavidina y aptámero de trombina biotinilado)
[0216]
[0218] Introducción de protección de exonucleasa
[0219] A continuación, se evaluó la influencia en la introducción de una caperuza 3'-dT sobre la actividad funcional del aptámero de SEQ. ID No. 1. Se cree que una caperuza 3'-dT protege la secuencia de nucleótidos de la actividad de exonucleasa y aumenta su estabilidad en fluidos biológicos. Ensayo del efecto de la caperuza 3'-dT sobre la funcionalidad del aptámero del AAB de receptor beta1 (2. bucle) de un paciente con DCM y el AAB de receptor beta2 de un paciente con Alzheimer (tabla 4). La actividad funcional de ambos AAB se neutralizó cuando se incubó con 100 nM del aptámero modificado con la caperuza 3'-dT. La modificación con caperuza 3' no influyó en la actividad funcional del aptámero de SEQ ID No. 1.
[0220] El aptámero protegido con caperuza solo no influyó en la velocidad de latido basal de los cardiomiocitos neonatales.
[0221] Tabla 4Medición por bioensayo de la actividad cronotrópica de AAB en suero [perlas delta/15 s] de AAB tratados con aptámero de trombina modificado con caperuza 3'-dT de SEQ. ID No. 1 o no (sin aptámero).
[0224]
[0226] Aptámero de trombina marcado con FITC para la detección de AAB
[0227] Uso de aptámero de trombina marcado con marcador de fluorescencia directamente para la detección de AAB séricos
[0228] El objetivo de estos experimentos es la generación de un aptámero directamente marcado que se dirige a autoanticuerpos contra receptores acoplados a proteína G que, al final, se aprovecharán para la detección de tales AAB.
[0230] Para este fin, el aptámero de trombina se marcó en el extremo 5' con FITC.
[0232] En los primeros experimentos se analizó, si el aptámero de trombina marcado con FITC mostró la funcionalidad/actividad completa para neutralizar autoanticuerpos en comparación con su versión sin marcar. Esto se analizó usando el bioensayo.
[0234] La figura 9 muestra la capacidad de 100 nM del 5'-FITC-aptámero de trombina para neutralizar los AAB del receptor beta1. El marcador FITC redujo la actividad del aptámero de trombina, pero el 50% de la actividad del AAB del receptor beta 1 aún se neutralizó a esta concentración elegida de 100 nM. Se observó una inhibición parcial de la actividad de AAB a esta concentración de aptámero.
[0236] Puesto que el aptámero de trombina marcado con FITC mostró, si se comparaba con el aptámero sin marcar a la misma concentración, una inhibición parcial de la actividad de AAB, la molécula se tomó para el ensayo, si fuera una posible estrategia el uso de este aptámero de trombina marcado para un ensayo de tipo sándwich. Por esta razón, el aptámero de trombina biotinilado no marcado se inmovilizó en la placa de ELISA por medio de neutravidina y se usó para capturar los AAB mientras que se suponía que el anti.-aptámero de trombina marcado con FITC sirvió al final para la detección del material de AAB adsorbido.
[0238] Las muestras se retiraron de los pocillos, los duplicados se unificaron (volumen final: 200 j l ) y se diluyeron con 300 j l de PBS y se midió la fluorescencia relativa usando el espectrofluorofotómetro RF-5001PC (Shimadzu, Japón) usando la longitud de onda de excitación y emisión de 494 nm y 519 nm, respectivamente.
[0240] Tal como se observa en la figura 10, fue posible detectar una muestra de paciente (fracción de IgG que contenía AAB de ETA) en comparación con la muestra de IgG de control. El uso del aptámero de trombina revuelto como control adicional tampoco mostró fluorescencia.
[0242] Influencia de la caperuza dT sobre la funcionalidad del aptámero de trombina
[0244] En los siguientes experimentos se evaluó si la introducción de un grupo protector tal como la caperuza dT para la protección de la actividad de exonuleasa sería posible, sin influir en la actividad de aptámero de trombina que neutraliza autoanticuerpos contra receptores acoplados a proteína G. La introducción de una caperuza dT fue posible sin influir en la funcionalidad de aptámero de trombina para neutralizar los AAB contra receptores acoplados a proteína G (figura 11).
[0246] Truncamiento del aptámero de trombina que da como resultado la secuencia 12-mérica
[0248] En un siguiente conjunto de experimentos se evaluó si un truncamiento del aptámero de trombina daría como resultado productos que todavía son capaces de neutralizar autoanticuerpos contra receptores acoplados a proteína G.
[0250] La secuencia original 15-mérica del aptámero de trombina (ARC183) se truncó, por lo tanto, en una secuencia 12-mérica con la SEQ D No. 3, denominada Throm-K1. La secuencia truncada se sometió a ensayo para determinar su capacidad para neutralizar los AAB en el bioensayo (demostrado para los AAB del receptor beta 1, figura 12).
[0251] La secuencia 12-mérica mostró actividad completa.

Claims (6)

1. REIVINDICACIONES
1. Aptámero que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 y/o una secuencia de ácido nucleico que es al menos el 80% idéntica a una de SEQ ID No. 1, 2 y 3 para su uso en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias mediante interferencia con la interacción de autoanticuerpos específicos de receptores acoplados a proteína G asociados con enfermedades autoinmunitarias, en el que los autoanticuerpos son específicos del receptor adrenérgico alfa-1, el receptor adrenérgico beta-1, el receptor adrenérgico beta-2, el receptor ETA de la endotelina 1, el receptor M<2>muscarínico, el receptor AT1 de la angiotensina II y/o los receptores PAR, e inhibición de la interacción específica de estos autoanticuerpos con sus proteínas diana, en el que la enfermedad autoinmunitaria está asociada con la presencia de autoanticuerpos específicos de un receptor acoplado a proteína G.
2. Aptámero que comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 y/o una secuencia de ácido nucleico que es al menos el 80% idéntica a una de SEQ ID No. 1, 2 y 3 para su uso según la reivindicación 1, en el que el aptámero es para su uso como ingrediente selectivo durante la aféresis terapéutica de la sangre o constituyentes de la misma de un paciente que padece una enfermedad autoinmunitaria, en el que la enfermedad autoinmunitaria está asociada con la presencia de autoanticuerpos específicos de un receptor acoplado a proteína G, en el que los autoanticuerpos están presentes en el suero de un paciente que padece dicha enfermedad autoinmunitaria, en el que el ingrediente selectivo es responsable de separar específicamente los autoanticuerpos presentes en la sangre que están específicamente dirigidos por el aptámero.
3. Aptámero según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 para su uso según una de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el aptámero se usa en el tratamiento de un ser humano.
4. Aptámero según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 para su uso según una de las reivindicaciones anteriores, en el que el aptámero es un aptámero de ADN.
5. Aptámero según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 4 para su uso según una de las reivindicaciones anteriores, en el que el aptámero consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3 o una secuencia de ácido nucleico que es al menos el 80% idéntica a una de SEQ ID NO 1, 2 y 3.
6. Aptámero según una de las reivindicaciones 1,2, 4 o 5 para su uso según una de las reivindicaciones anteriores, en el que la enfermedad autoinmunitaria es cardiomiopatía, cardiomiopatía dilatada (DCM), cardiomiopatía periparto (PPCM), cardiomiopatía idiopática, cardiomiopatía de Chagas, megacolon de Chagas, megaesófago de Chagas, neuropatía de Chagas, hiperplasia prostática benigna, esclerodermia, psoriasis, síndrome de Raynaud, preeclamsia, rechazo de aloinjerto de riñón, miocarditis, glaucoma, diabetes mellitus, hipertensión, hipertensión pulmonar, hipertensión maligna y/o enfermedad de Alzheimer.
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