ES3047085T3 - Combination treatment for hypertension - Google Patents

Abstract

Se describen en este documento materiales y métodos para tratar la hipertensión (incluida la hipertensión resistente) con una combinación de un péptido natriurético auricular M (MANP) y un agente diurético (por ejemplo, furosemida). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0003] Tratamiento combinado de la hipertensión

[0005] Declaración con respecto a la investigación con fondos federales

[0007] La presente invención se realizó con financiación del gobierno concedida por los Institutos de Salud de los EE. UU. mediante la beca HL136340. El gobierno posee determinados derechos sobre la invención.

[0009] Campo técnico

[0011] Este documento se refiere a materiales para tratar la hipertensión, y, más concretamente, a métodos para usar una combinación de un péptido natriurético auricular-M (" M-atrial natriuretic peptide", MANP) y un diurético (por ejemplo, furosemida) para tratar mamíferos con hipertensión resistente.

[0013] Antecedentes

[0015] La hipertensión (HT), también conocida como hipertensión arterial, es una afección médica de larga duración en la que la presión arterial en las arterias es persistentemente elevada. La hipertensión es cada vez más resistente al tratamiento con fármacos antihipertensivos. Los pacientes con hipertensión resistente (HR) presentan una presión arterial que se mantiene elevada a pesar del tratamiento simultáneo con tres agentes antihipertensivos de diferentes clases, incluidos (1) un diurético y, normalmente, (2) un inhibidor de la enzima convertidora de la angiotensina (IECA) o un antagonista de los receptores de la angiotensina II (ARA) y (3) un antagonista del calcio (AC). También se considera que padecen HR los pacientes cuya tensión arterial se controla con cuatro o más medicamentos. En la actualidad no existen fármacos ni dispositivos aprobados en Estados Unidos para el tratamiento de la HR.

[0017] Sumario

[0019] La presente invención se define por las reivindicaciones.

[0021] El presente documento se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que la combinación de un MANP y un diurético tiene una potente acción reductora de la presión arterial (PA) al tiempo que inhibe la estimulación de la aldosterona inducida por Fs. Este descubrimiento indicó que la HR puede tratarse eficazmente con una combinación de un MANP y un diurético, tal como la furosemida (Fs).

[0023] En un primer aspecto, el presente documento presenta un MANP y un agente diurético como se define en la reivindicación 1 para su uso en un método de tratamiento de un mamífero. El mamífero puede ser identificado como hipertenso (por ejemplo, HR). El MANP puede tener la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:3, o la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de SEQ ID NO:5 a 14. El agente diurético puede ser la furosemida. El mamífero puede ser un ser humano. El MANP puede administrarse por vía intravenosa (por ejemplo, en una dosis de aproximadamente 10 pmol/kg/minuto a aproximadamente 100 nmol/kg/minuto). El MANP puede administrarse por vía subcutánea (por ejemplo, en una dosis de aproximadamente 0,1 ng/kg a aproximadamente 10 mg/kg). El MANp puede administrarse por vía intravenosa y posteriormente por vía subcutánea. Por ejemplo, el MANP puede administrarse por vía intravenosa en una dosis de aproximadamente 10 pmol/kg/minuto a aproximadamente 100 nmol/kg/minuto, y posteriormente administrarse por vía subcutánea en una dosis de aproximadamente 0,1 ng/kg a aproximadamente 100 mg/kg. El agente diurético puede administrarse por vía oral, por vía intravenosa o por vía subcutánea. El MANP y el agente diurético pueden administrarse simultáneamente en la misma composición. El MANP y el agente diurético pueden administrarse por vía subcutánea. El método puede consistir en administrar el MANP y el agente diurético al mamífero. El MANP y el agente diurético pueden administrarse en una composición en la que los únicos principios activos sean el MANP y el agente diurético.

[0025] Las referencias a los métodos de tratamiento mediante la terapia de la presente descripción se deben interpretar como referencias a compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en esos métodos. En otro aspecto que no forma una parte de la invención, este documento presenta un método que potencia uno o más efectos beneficiosos de un agente diurético y reduce uno o más efectos perjudiciales del agente diurético en un mamífero, en donde el método incluye administrar al mamífero el agente diurético y un MANP. El mamífero puede ser identificado como hipertenso (por ejemplo, HR). El MANP puede tener la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:3 o la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de SEQ ID NO:5 a 14. El agente diurético puede ser la furosemida. El mamífero puede ser un ser humano. El MANP y el agente diurético pueden administrarse por vía intravenosa (por ejemplo, en donde el MANP se administra en una dosis de aproximadamente 10 pmol/kg/minuto a aproximadamente 100 nmol/kg/minuto). El MANP y el agente diurético pueden administrarse por vía subcutánea (por ejemplo, en donde el MANP se administra en una dosis de aproximadamente 1 |jg/kg a aproximadamente 10 jg/kg). El MANP y el agente diurético pueden administrarse por vía intravenosa y posteriormente por vía subcutánea. El MANP puede administrarse por vía intravenosa en una dosis de aproximadamente 10 pmol/kg/minuto a aproximadamente 100 nmol/kg/minuto, y posteriormente administrarse por vía subcutánea en una dosis de aproximadamente 1 jg/kg a aproximadamente 10 jg/kg. Dichos uno o más efectos beneficiosos pueden incluir una reducción de la presión arterial en el mamífero, y dichos uno o más efectos perjudiciales pueden incluir la activación de la aldosterona. El método puede consistir en administrar una composición en la que los únicos principios activos sean el diurético y el MANP. El MANP y el agente diurético pueden administrarse en una composición en la que los únicos principios activos sean el MANP y el agente diurético.

[0027] A menos que se definan de otro modo, todos los términos y las expresiones técnicas y científicas utilizadas en el presente documento tienen el mismo significado que entiende normalmente un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invención. Aunque pueden utilizarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento para poner en práctica la invención, siempre que entren dentro del alcance de las reivindicaciones, los métodos y materiales adecuados se describen a continuación. En caso de conflicto, la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones, prevalecerá. Además, los materiales, métodos y ejemplos son únicamente ilustrativos y no tienen por objeto ser limitantes.

[0029] Los detalles de una o más realizaciones de la invención se exponen en los dibujos adjuntos y la descripción a continuación. Otras características, objetos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción y dibujos detallada y de las reivindicaciones.

[0031] Descripción de los dibujos

[0033] LaFIG. 1es un diagrama que muestra la secuencia y la estructura general del péptido natriurético auricular (ANP; SEQ ID NO:1), así como la secuencia y estructura general de un MANP (SEQ ID NO:3).

[0034] LasFIGS. 2A-2Cson gráficos que representan la presión arterial media (PAM) en ratas tratadas con vehículo, MANP 100 pmol/kg/min, MANP 300 pmol/kg/min o MANP 600 pmol/kg/min (FIG. 2A); vehículo, Fs 1 mg/kg, Fs 5 mg/kg o Fs 10 mg/kg (FIG. 2B), y vehículo, MANP 300 pmol/kg/min Fs 5 mg/kg,<m>A<n>P 600 pmol/kg/min Fs 5 mg/kg, o MANP 600 pmol/kg/min Fs 10 mg/kg (FIG. 2C), durante un periodo de tiempo de 60 minutos. El MANP comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3. Los datos se presentan como la media ± DE. *p < 0,05 frente al vehículo, #p < 0,05 frente a Fs10.

[0035] LasFIGS. 3A-3Cson gráficos que representan los niveles de GMPc plasmático en ratas tratadas con vehículo, MANP 100 pmol/kg/min, MANP 300 pmol/kg/min o MANP 600 pmol/kg/min (FIG. 3A); vehículo, Fs 1 mg/kg, Fs 5 mg/kg o Fs 10 mg/kg (FIG. 3B), y vehículo, MANP 300 pmol/kg/min Fs 5 mg/kg, m An P 600 pmol/kg/min Fs 5 mg/kg, o MANP 600 pmol/kg/min Fs 10 mg/kg (FIG. 3C), durante un periodo de tiempo de 60 minutos. El MANP comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3. Los datos se presentan como la media ± DE. *p < 0,05 frente al vehículo @p< 0,05 frente a MANP100.

[0036] LaFIG.4es un gráfico que representa los niveles de aldosterona plasmática en ratas tratadas con vehículo, MANP 100 pmol/kg/min, MA<n>P 300 pmol/kg/min, MANP 600 pmol/kg/min, Fs 1 mg/kg, Fs 5 mg/kg, Fs 10 mg/kg, MANP 300 pmol/kg/min Fs 5 mg/kg, MANP 600 pmol/kg/min Fs 5 mg/kg, o MANP 600 pmol/kg/min Fs 10 mg/kg, durante 60 minutos. El MANP comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3. Los datos se presentan como la media ± DE. $p< 0,05 frente a Fs5, #p< 0,05 frente a Fs10.

[0037] LaFIG. 5es un gráfico que representa el cambio en la PAM frente al cambio en los niveles de GMPc tras el tratamiento de ratas con vehículo, MANP 100, 300 o 600 pmol/kg/min, Fs 1, 5 o 10 mg/kg, o MANP 300 pmol/kg/min Fs 5 mg/kg, MANP 300 pmol/kg/min Fs 10 mg/kg, o Ma NP 600 pmol/kg/min Fs 10 mg/kg durante 60 minutos. El MANP comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3.

[0038] LasFIGS. 6A-6Cson gráficos que representan los niveles de GMPc generados en células de riñón embrionario humano 293 (HEK293) que sobreexpresan receptores de guanilil ciclasa A particulada (pGC-A) (FIG. 6A), células endoteliales aórticas humanas primarias (HAEC) (FIG. 6B), y células musculares lisas aórticas humanas primarias (HASMC) (FIG. 6C) estimuladas por MANP (Se Q ID NO:3). Los valores mostrados son la media ± EEM. *p< 0,05 frente al control.

[0039] LasFIGS. 7A-7Cson gráficos que representan la PA en ratas al inicio (I), un rodaje de 15 minutos, y 15, 30, 45 y 60 minutos después de la infusión de MANP o vehículo (control) (FIG. 7A), después de la inyección en embolada de Fs o vehículo (control) (FIG.7B), y después de una combinación de infusión de MANP e inyección en embolada de Fs o infusión de vehículo e inyección en embolada de vehículo (control) (FIG. 7C). Los valores mostrados son la media ± EEM. #p< 0,05 M<a>N<p>300 frente al vehículo; *p< 0,05 MANP600 frente al vehículo; §p< 0,05 Fs1 frente al vehículo; @p< 0,05 Fs5 frente al vehículo; &p< 0,05 Fs10 frente al vehículo; £p<0,05 mAn P300+Fs5 frente al vehículo; ®p< 0,05 MANP300+Fs10 frente al vehículo; ©p< 0,05 MANP600+Fs10 frente al vehículo. El MANP comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3.

[0040] LaFIG. 8es un gráfico que representa la PA en ratas tras 60 minutos de infusión de vehículo (control), infusión de MANP, inyección en embolada de Fs, o una combinación de infusión de MANP e inyección en embolada de Fs. Los valores representados son la media ± EEM. *p< 0,05 frente al vehículo; ¥p< 0,05 frente a MANP100; ®p< 0,05 MANP300 frente a MANP300+Fs10; #p< 0,05 frente a MANP600; §p< 0,05 frente a Fs1; @p< 0,05 frente a Fs5; &p< 0,05 frente a Fs10. El MANP comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3.

[0041] LasFIGS. 9A-9Cson gráficos que representan el GMPc plasmático en ratas en el I, 30 y 60 minutos después de la infusión de MANP o vehículo (control) (FIG. 9A), después de una inyección en embolada de Fs o vehículo (control) (FIG. 9B), y después de una combinación de infusión de MANP e inyección en embolada de Fs o infusión de vehículo e inyección en embolada de vehículo (control) (FIG. 9C). Los valores representados son la media ± EEM. *p< 0,05 frente al vehículo. El MANP comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3.

[0042] LaFIG. 10es un gráfico que representa la excreción urinaria de GMPc en ratas 60 minutos después de la administración de MANP (SEQ ID NO:3), Fs, una combinación MANP+Fs, o vehículo. Los valores representados son la media ± EEM. *p< 0,05 frente al vehículo (control).

[0043] LaFIG. 11es un gráfico que representa los niveles de aldosterona en ratas 60 minutos después de la administración de MANP (SEQ ID NO:3), Fs, una combinación de MANP+Fs, o vehículo. Los valores mostrados son la media ± EEM. *p< 0,05 frente al vehículo (control); @p< 0,05 frente a Fs5; &p< 0,05 frente a Fs10. LaFIG. 12es un gráfico que muestra la correlación positiva entre ANP plasmático y GMPc plasmático en ratas tras la administración de MANP (SEQ ID NO:3), Fs, una combinación de MANP+Fs, o vehículo. Coeficiente de correlación de Pearson (r) = 0,7479,p< 0,01.

[0044] LaFIG. 13es un gráfico que representa la correlación negativa entre el GMPc plasmático y la presión arterial media en ratas tras la administración de MANP (SEQ ID NO:3), Fs, una combinación de MANP+Fs, o vehículo. Coeficiente de correlación de Pearson (r) = -0,6510,p< 0,01.

[0045] LasFIGS. 14A-14Cson gráficos que representan la TFG (FIG. 14A), la excreción urinaria de sodio (FIG. 14B) y el flujo urinario (FIG. 14C) 60 minutos después de la administración de MANP (SEQ ID NO:3), Fs, una combinación de MANP+Fs, o vehículo. Los valores mostrados son la media ± EEM. *p< 0,05 frente al vehículo (control); ¥p< 0,05 frente a MANP100; ®p< 0,05 frente a MANP300; @p< 0,05 frente a MANP600; #p< 0,05 frente a Fs1; &p< 0,05 frente a MANP300+Fs5.

[0047] Descripción detallada

[0049] El presente documento proporciona combinaciones para el tratamiento de la hipertensión, incluida la HR, con una combinación de un MANP y el diurético reivindicado (por ejemplo, Fs). El presente documento proporciona la administración de un MANP y el diurético reivindicado a un mamífero (por ejemplo, un ser humano, un primate no humano, perro, gato, rata, ratón, vaca, caballo, oveja o cerdo) de forma que la Pa del mamífero se reduzca tras la administración. En algunos casos, la aldosterona no se eleva en el mamífero tras la administración. En algunos casos, el mamífero puede ser identificado como hipertenso (por ejemplo, RT).

[0051] Los diuréticos son fármacos que ayudan a los riñones a eliminar el exceso de agua y sal del organismo, reduciendo así el nivel de líquido en los vasos sanguíneos, lo que reduce la presión arterial. Los diuréticos suelen ser el primer tipo de medicación que se prescribe a los pacientes que presentan hipertensión arterial. Entre los diuréticos que pueden utilizarse para tratar a pacientes con hipertensión arterial se incluyen, sin limitación, diuréticos de tiazida [por ejemplo, clortalidona (Hygroton), clorotiazida (Diuril), hidroclorotiazida (Esidrix, Hydrodiuril o Microzide), indapamida (Lozol) y metolazona (Mykrox, Zaroxolyn)], y otros, tales como amilorida (Midamor), bumetanida (Bumex)], furosemida (Lasix), espironolactona (Aldactone) y triamtereno (Dyrenium). La furosemida (abreviada en el presente documento como "Fs") puede aumentar la eficacia de otros agentes antihipertensivos, pero la Fs también activa el sistema reninaangiotensina-aldosterona.

[0053] Los polipéptidos natriuréticos son polipéptidos que pueden provocar natriuresis, es decir, un aumento de la excreción de sodio en la orina. Los polipéptidos natriuréticos pueden ser producidos por el cerebro, el corazón, el riñón y/o el tejido vascular. La familia de los polipéptidos natriuréticos en seres humanos incluye las hormonas cardíacas péptido natriurético auricular (ANP, por sus siglas en inglés), péptido natriurético de tipo B (BNP, por sus siglas en inglés), péptido natriurético de tipo C (CNP, por sus siglas en inglés) y urodilatina (URO). Los polipéptidos natriuréticos actúan a través de dos receptores de guanilil ciclasa bien caracterizados (NPR-A para ANP, BNP y URO; y NPR-B para CNP) y el segundo mensajero guanosina monofosfato 3'5' cíclica (GMPc) (Kuhn (2003),Circ. Res.93:700-709; Tawaragiet al.(1991)Biochem. Biophys. Res. Commun.175:645-651; y Komatsuet al.(1991)Endocrinol.129:1104-1106). Los polipéptidos natriuréticos pueden ser eficaces para, por ejemplo, aumentar los niveles plasmáticos de GMPc, aumentar la excreción urinaria de GMPc, aumentar la generación renal neta de GMPc, aumentar el flujo de orina, aumentar la excreción urinaria de sodio, aumentar la excreción urinaria de potasio, aumentar el hematocrito, aumentar la inmunorreactividad plasmática del BNP, aumentar el flujo sanguíneo renal, aumentar la inmunorreactividad plasmática del ANP, disminuir la resistencia vascular renal, disminuir la reabsorción fraccional proximal y distal de sodio, disminuir la presión arterial media, disminuir la presión de enclavamiento capilar pulmonar, disminuir la presión de la aurícula derecha, disminuir la presión arterial pulmonar, disminuir la actividad de la renina en plasma, disminuir los niveles de angiotensina II en plasma, disminuir los niveles de aldosterona en plasma, disminuir la presión de perfusión renal y/o disminuir la resistencia vascular sistémica.

[0055] El MANP es un activador de pGC-A/GMPc que puede reducir significativamente la presión arterial y la resistencia vascular. Los métodos proporcionados en el presente documento pueden incluir, en parte, tratar a un mamífero con un MANP. Como se representa en laFIG. 1,el MANP es un péptido basado en ANP que tiene una secuencia de aminoácidos que incluye la secuencia humana madura de 28 aminoácidos de ANP (SLRRSSCFG<g>R<m>DRIGAQSGLGCNSFRY; SEQ ID NO:1) con un extremo carboxilo adicional de 12 aminoácidos (RITAREDKQGWA; SEQ ID NO: 2). La secuencia de longitud completa de MANP es SLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRYRIT AREDKQGWA (SEQ ID NO:3). Una secuencia representativa del ácido nucleico que codifica MANP es 5'-agcctgcggagatccagctgcttcgggggcaggatggacaggattggagcccagagcggactggg ctgtaacagcttccggtaccggataacagccagggaggacaagcagggctgggcctag-3' (SEQ ID NO:4).

[0057] Como se usa en el presente documento, "un MANP" puede tener la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:3, o puede ser una variante de la secuencia expuesta en SEQ ID NO:3. Por lo tanto, en algunos casos, un MANP utilizada en los métodos proporcionados en el presente documento puede contener toda la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:3. En algunos casos, un MANP puede contener la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:3, con la condición de que la secuencia de aminoácidos contenga uno o entre uno y diez (por ejemplo, diez, entre uno y nueve, entre dos y nueve, entre uno y ocho, entre dos y ocho, entre uno y siete, entre uno y seis, entre uno y cinco, entre uno y cuatro, entre uno y tres, dos o una) adiciones, sustracciones y/o sustituciones de aminoácidos. Por ejemplo, un MANP puede contener la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:3 con una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones, sustracciones o sustituciones de restos de aminoácidos individuales. En algunos casos, un MANP puede tener una o varias adiciones, sustracciones y/o sustituciones dentro de la porción C-terminal de SEQ ID NO:3 (por ejemplo, los últimos 12 aminoácidos de SEQ ID NO:3). Los ejemplos de dicho dispositivo incluyen, sin limitación, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:3 en donde la treonina está delecionada (S<l>R<r>S<s>C<f>GGRMDRIGAQSGLGCNSFRYRIA REDKQGWA; SEQ ID NO:5), el triptófano se sustituye por una tirosina (SLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRY RITAREDKQGYA; SEQ ID N<o>:6), se añade una serina entre la lisina y la glutamina (SLRRSSCFGGRMDRIGAQS GLGCNSFRYRITAREDKSQG<w>A; SEQ ID NO:7), o cualquier combinación de los mismos. En otro ejemplo, un MANP puede carecer de los tres últimos restos de SEQ ID NO:3 (es decir, los restos glicina, triptófano y alanina de SEQ ID NO:3, como se expone en SEQ ID NO:8 (SLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRY RITAREDKQ). En algunos casos, un MANP puede tener una o varias adiciones, sustracciones y/o sustituciones dentro de la porción N-terminal de SEQ ID NO:3 (por ejemplo, los primeros seis aminoácidos de SEQ ID NO:3). Los ejemplos de dichos polipéptidos incluyen, sin limitación, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:3 en donde se añaden cuatro aminoácidos de urodilatina al N-terminal (TAPRSLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRYRITAREDKQGWA; SEQ ID NO:9), los restos arginina en las posiciones 3 y 4 se sustituyen por restos lisina (SLKKSSCFGGRMD RIGAQSGLGCNSFRYRITAREDKQGWA; SEQ ID NO:10), se sustituye la isoforma D de la serina en la sexta posición (SLRRSSCFGGRM DRIGAQs GlGCNSFRYRITA REDKQGWA; SEQ ID NO:11), se sustituye la isoforma D de arginina en la cuarta posición y se deleciona la serina en la quinta posición (SLRRSCFGGR<m>D<r>IGAQSGL GCNSFRYRITAREDKQGWA; SEQ ID NO:12), los restos serina en las posiciones 1, 5 y 6 se sustituyen por restos treonina (TLRRTTCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFR YRITAREDKQGWA; SEQ ID NO:13), se sustituye una leucina por el triptófano en la posición 2 (SWRRSSCFGGRMDR IGAQSGLGCNSFRY RITAREDKQGWA; SEQ ID NO:14), o cualquier combinación de los mismos.

[0059] Puede sustraerse cualquier resto de aminoácido expuesto en SEQ ID NO: 3 y puede añadirse cualquier resto de aminoácido (por ejemplo, cualquiera de los 20 restos de aminoácidos convencionales o cualquier otro tipo de aminoácido, tal como ornitina o citrulina) a la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 3. En algunos casos, un MANP puede contener una o varias estructuras químicas, tales como ácido £-aminohexanoico; aminoácidos hidroxilados tales como 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina, (5R)-5-hidroxi-L-lisina, alohidroxilisina y 5-hidroxi-L-norvalina; y/o aminoácidos glucosilados, tales como los aminoácidos que contienen monosacáridos (por ejemplo, D-glucosa, D-galactosa, D-manosa, D-glucosamina y D-galactosamina) o combinaciones de monosacáridos.

[0061] Los MANP con una o más adiciones, sustracciones o sustituciones de aminoácidos con relación a la secuencia de MANP representativa expuesta en SEQ ID NO:3, también denominados en el presente documento "variantes" de MANP, pueden generarse utilizando cualquier método adecuado. En algunos casos, las sustituciones de aminoácidos pueden realizarse seleccionando sustituciones que no difieran significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura de la cadena principal del péptido en el área de la sustitución, (b) la carga o la hidrofobia de la molécula en el sitio diana o (c) el volumen de la cadena lateral. Por ejemplo, los restos de origen natural pueden dividirse en grupos basándose en las propiedades de la cadena lateral: (1) aminoácidos hidrófobos (norleucina, metionina, alanina, valina, leucina e isoleucina); (2) aminoácidos hidrófilos neutros (cisteína, serina y treonina); (3) aminoácidos ácidos (ácido aspártico y ácido glutámico); (4) aminoácidos básicos (asparagina, glutamina, histidina, lisina y arginina); (5) aminoácidos que influyen en la orientación de la cadena (glicina y prolina); y (6) aminoácidos aromáticos (triptófano, tirosina y fenilalanina). Las sustituciones realizadas dentro de estos grupos pueden considerarse sustituciones conservadoras. Los ejemplos no limitantes de sustituciones conservadoras útiles pueden incluir, sin limitación, sustitución de alanina por valina, arginina por lisina, asparagina por glutamina, ácido aspártico por ácido glutámico, cisteína por serina, glutamina por asparagina, ácido glutámico por ácido aspártico, glicina por prolina, histidina por arginina, isoleucina por leucina, leucina por isoleucina, lisina por arginina, metionina por leucina, fenilalanina por leucina, prolina por glicina, serina por treonina, treonina por serina, triptófano por tirosina, tirosina por fenilalanina y/o valina por leucina.

[0063] En laTABLA 1se exponen ejemplos adicionales de sustituciones conservadoras que pueden realizarse en cualquier posición dentro de un MANP, útiles en los métodos descritos en el presente documento.

[0065] En algunas realizaciones, un MANP puede incluir una o más sustituciones no conservadoras. Las sustituciones no conservadoras normalmente implican el intercambio de un miembro de una de las clases descritas anteriormente por un miembro de otra clase. Dicha producción puede ser deseable para proporcionar grandes cantidades o realizaciones alternativas de dichos compuestos. Puede determinarse fácilmente si un cambio de aminoácido da como resultado un polipéptido funcional sometiendo a ensayo la actividad específica de la variante de polipéptido usando, por ejemplo, métodos divulgados en el presente documento.

[0066] En algunas realizaciones, un MANP puede tener una longitud de, por ejemplo, 35 a 45 restos de aminoácidos (por ejemplo, de 35 a 40, de 40 a 45, de 35 a 37, de 36 a 38, de 37 a 39, de 38 a 40, de 39 a 41, de 40 a 42, de 41 a 43, de 42 a 44, de o 43 a 45 restos de aminoácidos). En algunas realizaciones, un polipéptido natriurético puede comprender una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 3, pero con un número particular de sustituciones de aminoácidos. Por ejemplo, un polipéptido natriurético puede tener la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, pero con una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones de aminoácidos. Los ejemplos de dichas secuencias de aminoácidos incluyen, sin limitación, MANP con un aminoácido D que reemplaza uno o más aminoácidos L dentro de la región N-terminal del polipéptido (por ejemplo, con un resto D-serina en la posición 6, como se expone en SEQ ID NO: 11, o con una D-arginina en la posición 4, como se expone en SEQ ID NO: 12).

[0069] TABLA 1

[0072]

[0075] En algunas realizaciones, un MANP puede incluir una secuencia de aminoácidos con al menos un 90 % (por ejemplo, al menos un 90 %, al menos un 92,5 %, al menos un 95 %, al menos un 97,5 % o al menos un 100 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de referencia expuesta en SEQ ID NO: 3. El porcentaje de identidad de secuencia se calcula determinando el número de posiciones coincidentes en las secuencias de aminoácidos alineadas, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de aminoácidos alineados, y multiplicando por 100. Una posición coincidente es aquella en la que hay aminoácidos idénticos en la misma posición en las secuencias de aminoácidos alineadas. El porcentaje de identidad de secuencia también puede determinarse para cualquier secuencia de ácido nucleico.

[0077] El porcentaje de identidad de secuencia entre una secuencia particular de ácido nucleico o aminoácido y una secuencia referenciada por un número de identificación de secuencia particular se determina de la siguiente manera. En primer lugar, una secuencia de ácido nucleico o aminoácido se compara con la secuencia expuesta en un número de identificación de secuencia particular usando el programa BLAST 2 Sequences (Bl2seq) de la versión independiente de BLASTZ que contiene BLASTN versión 2.0.14 y BLASTP versión 2.0.14. Esta versión independiente de BLASTZ puede obtenerse en línea en fr.com/blast o en ncbi.nlm.nih.gov. Pueden encontrarse instrucciones sobre cómo usar el programa Bl2seq en el archivo Léame que acompaña a BLASTZ. Bl2seq realiza una comparación entre dos secuencias usando el algoritmo BLASTN o BLASTP. BLASTN se usa para comparar secuencias de ácido nucleico, mientras que BLASTP se usa para comparar secuencias de aminoácidos. Para comparar dos secuencias de ácido nucleico, las opciones se establecen de la siguiente manera: -i se establece como un archivo que contiene la primera secuencia de ácido nucleico que se ha de comparar (por ejemplo, C:\seq1.txt); -j se establece como un archivo que contiene la segunda secuencia de ácido nucleico que se ha de comparar (por ejemplo, C:\seq2.txt); -p se establece como blastn; -o se establece como cualquier nombre de archivo deseado (por ejemplo, C:\output.txt); -q se establece como -1; -r se establece como 2; y todas las demás opciones se dejan en su configuración predeterminada. Por ejemplo, puede usarse el siguiente comando para generar un archivo de salida que contenga una comparación entre dos secuencias: C:\Bl2seq -i c:\seq1.txt -j c:\seq2.txt -p blastn -o c:\output.txt -q -1 -r 2. Para comparar dos secuencias de aminoácidos, las opciones de Bl2seq se establecen de la siguiente manera: -i se establece como un archivo que contiene la primera secuencia de aminoácidos que se ha de comparar (por ejemplo, C:\seq1.txt); -j se establece como un archivo que contiene la segunda secuencia de aminoácidos que se ha de comparar (por ejemplo, C:\seq2.txt); -p se establece como blastp; -o se establece como cualquier nombre de archivo deseado (por ejemplo, C:\output.txt); y todas las demás opciones se dejan en su configuración predeterminada. Por ejemplo, puede usarse el siguiente comando para generar un archivo de salida que contenga una comparación entre dos secuencias de aminoácidos: C:\Bl2seq -i c:\seq1.txt -j c:\seq2.txt -p blastp -o c:\output.txt. Si las dos secuencias comparadas comparten homología, entonces el archivo de salida designado presentará esas regiones de homología como secuencias alineadas. Si las dos secuencias comparadas no comparten homología, entonces el archivo de salida designado no presentará secuencias alineadas.

[0079] Una vez alineadas, el número de coincidencias se determina contando el número de posiciones donde se presenta un resto de nucleótido o aminoácido idéntico en ambas secuencias. El porcentaje de identidad de secuencia se determina dividiendo el número de coincidencias, ya sea entre la longitud de la secuencia expuesta en las secuencias identificadas (por ejemplo: SEQ ID NO: 3), o entre una longitud articulada (tal como 20 nucleótidos o restos de aminoácidos consecutivos de una secuencia expuesta en una secuencia identificada), y después multiplicado el valor resultante por 100. Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos que tiene 37 coincidencias cuando se alinea con la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 3 es un 92,5 por ciento idéntica a la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 3 (es decir, 37 40 x 100 = 92,5). Cabe señalar que el valor del porcentaje de identidad de secuencia se redondea a la décima más próxima. Por ejemplo, 75,11,75,12, 75,13 y 75,14 se redondean a 75,1, mientras que 75,15, 75,16, 75,17, 75,18 y 75,19 se redondean a 75,2. También se observa que el valor de la longitud siempre será un número entero.

[0080] Los MANP aislados pueden producirse usando cualquier método adecuado, incluyendo la síntesis en fase sólida, y pueden generarse usando técnicas manuales o técnicas automatizadas (por ejemplo, usando un sintetizador de péptidos de Applied BioSystems (Foster City, CA) o un sintetizador de péptidos automático de Biosearch Inc. (San Rafael, CA)). Los enlaces disulfuro entre restos cisteína pueden introducirse mediante oxidación suave de los polipéptidos lineales usando KCN como se ha enseñado, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 4.757.048. Los polipéptidos natriuréticos también pueden producirse de forma recombinante u pueden obtenerse en el mercado.

[0081] Los MANP descritas en el presente documento suelen ser cíclicos debido a enlaces disulfuro entre los restos cisteína (véase,FIG. 1). En algunas realizaciones, un grupo sulfhidrilo en un resto cisteína puede reemplazarse por un grupo alternativo (por ejemplo, -CH<2>CH<2>-). Para reemplazar un grupo sulfhidrilo por un grupo -CH<2>-, por ejemplo, un resto cisteína puede reemplazarse por ácido alfa-aminobutírico. Dichos polipéptidos análogos cíclicos pueden generarse, por ejemplo, de acuerdo con la metodología de Lebl y Hruby ((1984)Tetrahedron Lett.25: 2067-2068) o empleando el procedimiento divulgado en la patente de los EE. UU. n.° 4.161.521.

[0083] Además, pueden formarse puentes éster haciendo reaccionar el OH de la serina o treonina con el grupo carboxilo del ácido aspártico o ácido glutámico para producir un puente que tenga la estructura -CH<2>CO<2>CH<2>-. De forma similar, puede obtenerse una amida haciendo reaccionar la cadena lateral de la lisina con ácido aspártico o ácido glutámico para producir un puente que tenga la estructura -CH2C(O)NH(CH)4-. Se conocen en la técnica métodos para la síntesis de estos puentes (véanse, por ejemplo, Schilleret al.(1985)Biochem. Biophys. Res. Comm.127: 558, y Schilleret al.(1985)Int. J. Peptide Protein Res.25:171). Por ejemplo, un método para preparar ésteres de los presentes polipéptidos, cuando se usa la técnica de síntesis de Merrifield, es escindir el polipéptido completado de la resina en presencia del alcohol deseado en condiciones básicas o ácidas, dependiendo de la resina. Después, el extremo C-terminal del polipéptido puede esterificarse directamente cuando se libera de la resina, sin aislamiento del ácido libre. Las amidas de polipéptidos también pueden prepararse usando técnicas (por ejemplo, las conocidas en la técnica) para convertir un grupo o precursor de ácido carboxílico en una amida. Un método para la formación de amidas en el grupo carboxilo C-terminal incluye escindir el polipéptido de un soporte sólido con una amina apropiada, o escindirlo en presencia de un alcohol, produciendo un éster, seguido de aminólisis con la amina deseada. Otros restos de aminoácidos formadores de puentes y reacciones se proporcionan en, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 4.935.492. También se conoce en la técnica la preparación de análogos peptídicos que incluyen enlaces no peptídicos para unir restos de aminoácidos. Véanse, por ejemplo, Spatolaet al.(1986)Life Sci.38:1243; Spatola (1983)Vega Data1(3); Morley (1980)Trends Pharm. Sci.463-468; Hudsonet al.(1979)Int. J. Pept. Prot. Res.14:177; Spatola, enChemistry and Biochemistry of Amino Acid Peptides and Proteins,B. Weinstein, ed., Marcel Dekker, Nueva York, pág. 267 (1983); Hann (1982)J. Chem. Soc.Perkin Trans. 1:307; Almquistet al.(1980)J. Med. Chem.23:1392; Jennings-Whiteet al.(1982)Tetrahedron Lett.23:2533; solicitud de patente europea EP 45665; Holladayet al.(1983)Tetrahedron Lett.24:4401; y Hruby (1982)Life Sci.31:189.

[0084] Pueden prepararse derivados N-acilo de un grupo amino de un polipéptido usando un N-acil aminoácido protegido para la condensación final, o mediante acilación de un péptido protegido o no protegido. Por ejemplo, pueden prepararse derivados de O-acilo, mediante acilación de un hidroxipéptido libre o de una resina peptídica. Cualquiera de las dos acilaciones puede realizarse usando reactivos de acilación convencionales, tales como halogenuros de acilo, anhídridos, acil imidazoles y similares. Tanto la N como la O-acilación pueden realizarse conjuntamente, si se desea.

[0086] En algunos casos, un MANP puede estar pegilado, acetilarse o ambas cosas. En algunos casos, un polipéptido puede unirse covalentemente a oligómeros, tales como oligómeros cortos anfífilos que permiten la administración o mejoran el perfil farmacocinético o farmacodinámico del polipéptido conjugado. Los oligómeros pueden comprender polietilenglicol (PEG) soluble en agua y/o alquilos solubles en lípidos (polímeros de ácidos grasos de cadena corta, media o larga, tales como, sin limitación, ácido palmítico, ácido mirístico, ácido láurico, ácido cáprico o ácido estérico). La molécula de ácido graso puede unirse al extremo amino libre o a cualquier cadena lateral de lisina (un grupo amino épsilon), y puede colocarse un resto lisina para esta unión en el extremo C-terminal o N-terminal del péptido. La unión a PEG u otro polímero adecuado, o la fusión a albúmina u otro polipéptido adecuado puede dar como resultado un polipéptido natriurético modificado que tenga una semivida mayor en comparación con un polipéptido natriurético no modificado. Sin quedar ligados a mecanismo particular alguno, una semivida sérica mayor puede ser el resultado de la degradación proteolítica, el reconocimiento inmunitario o la eliminación celular reducidos del polipéptido natriurético modificado. Se conocen en la técnica métodos para modificar un polipéptido por unión a PEG (también denominada "PEGilación") u otros polímeros, e incluyen aquellos expuestos en la patente de los EE. UU. n.° 6.884.780; la publicación P<c>T n.°<w>O 2004/047871; Cataliottiet al.((2007)Trends Cardiovasc. Med.17:10-14; Veronese y Mero (2008)BioDrugs22:315-329; Milleret al.(2006)Bioconjugate Chem.17:267-274; y Veronese y Pasut (2005)Drug Discov. Today10:1451-1458, todos los cuales se incorporan en el presente documento como referencia en su totalidad. También se conocen en la técnica métodos para modificar un polipéptido mediante fusión con albúmina, e incluyen aquellos expuestos en la publicación de patente de EE. UU. n.° 20040086976 y Wanget al.(2004)Pharm. Res.21:2105-2111, ambas de las cuales se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad.

[0087] En algunos casos, un polipéptido proporcionado en el presente documento puede fusionarse con el dominio Fc de una molécula de inmunoglobulina (por ejemplo, una molécula de IgG1) de manera que el transporte activo del polipéptido de fusión a través de las barreras de las células epiteliales se produzca a través del receptor de Fc. En algunos casos, un polipéptido puede ser un polipéptido cíclico. Un polipéptido cíclico puede obtenerse mediante el enlace de restos cisteína, sin embargo, también se contempla el reemplazo de un grupo sulfhidrilo en el resto cisteína por un grupo alternativo, por ejemplo, -CH<2>-CH<2>-. Por ejemplo, para reemplazar los grupos sulfhidrilo por un grupo -CH<2>-, los restos cisteína pueden reemplazarse por el ácido alfa-aminobutírico análogo. Estos péptidos análogos cíclicos pueden formarse, por ejemplo, de acuerdo con la metodología de Lebl y Hruby (Tetrahedron Lett., 25:2067-2068, 1984), o empleando el procedimiento descrito en la patente de EE. UU. n.° 4.161.521.

[0089] Pueden prepararse sales de los grupos carboxilo de los MANP poniendo en contacto un polipéptido con uno o más equivalentes de una base deseada, tal como, por ejemplo, una base de hidróxido de metal (por ejemplo, hidróxido de sodio), una base de carbonato o bicarbonato de metal (por ejemplo, carbonato de sodio o bicarbonato de sodio), o una base de amina (por ejemplo, trietilamina, trietanolamina y similares). Pueden prepararse sales de adición de ácido de polipéptidos poniendo en contacto el polipéptido con uno o más equivalentes de un ácido inorgánico u orgánico (por ejemplo, ácido clorhídrico).

[0091] El término "polipéptido", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un compuesto de dos o más subunidades de aminoácidos, independientemente de la modificación postraduccional (por ejemplo, fosforilación o glucosilación). Las subunidades pueden unirse mediante enlaces peptídicos u otros enlaces, tales como, por ejemplo, enlaces éster o éter. El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos naturales y/o no naturales o sintéticos, incluidos los isómeros ópticos D/L.

[0093] El término "aislado", como se usa en el presente documento con referencia a un polipéptido, significa que el polipéptido (1) no se asocia a proteínas que se encuentran en la naturaleza, (2) está libre de otras proteínas de la misma fuente (por ejemplo, libre de proteínas humanas), (3) es expresado por una célula de una especie diferente o (4) no se encuentra en la naturaleza. Un polipéptido aislado puede estar codificado, por ejemplo, por ADN o ARN, incluyendo ADN o ARN sintéticos, o alguna combinación de los mismos.

[0095] La expresión "sustancialmente puro", como se usa en el presente documento con referencia a un polipéptido, significa que el polipéptido está sustancialmente libre de otros polipéptidos, lípidos, hidratos de carbono y ácido nucleico a los que se asocia de forma natural. Un polipéptido sustancialmente puro puede ser cualquier polipéptido extraído de su entorno natural y con una pureza mínima del 60 por ciento. Un polipéptido sustancialmente puro puede tener una pureza de al menos el 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99 por ciento, o del 65 al 75, del 75 al 80, del 80 al 85, del 85 al 90, del 90 al 95 o del 95 al 99 por ciento. Normalmente, un polipéptido sustancialmente puro producirá una única banda principal en un gel de poliacrilamida no reductor. En algunas realizaciones, un polipéptido sustancialmente puro puede ser un polipéptido sintetizado químicamente.

[0096] Puede usarse cualquier método para obtener un polipéptido sustancialmente puro. Por ejemplo, pueden utilizarse técnicas habituales de purificación de polipéptidos, tales como la cromatografía de afinidad y la HPLC, así como técnicas de síntesis de polipéptidos. Además, como fuente para obtener un polipéptido sustancialmente puro puede usarse cualquier material. Por ejemplo, como material de origen puede usarse tejido de animales de tipo silvestre o transgénicos. Además, para obtener un polipéptido sustancialmente puro, pueden usarse células de cultivo tisular modificadas por ingeniería genética para sobreexpresar un polipéptido particular. Adicionalmente, un polipéptido puede modificarse por ingeniería genética para que contenga una secuencia de aminoácidos que permita capturar el polipéptido en una matriz de afinidad. Por ejemplo, un marcador, tal como un marcador c-myc, hemaglutinina, polihistidina o Flag™ (Kodak) para facilitar la purificación del polipéptido. Dichos marcadores pueden insertarse en cualquier lugar dentro del polipéptido, incluyendo en los extremos carboxilo o amino, o entre ambos. Otras fusiones que pueden usarse incluyen enzimas que ayudan a la detección del polipéptido, tales como fosfatasa alcalina.

[0098] Los MANP (por ejemplo, variantes de MANP con sustituciones conservativas y/o no conservativas con respecto a SEQ ID NO:3), así como fragmentos de la SEQ ID NO:3 o variantes de MANP (por ejemplo, fragmentos de cualquiera de SEQ ID NO:3 a 14), pueden someterse a un cribado de actividad biológica utilizando cualquiera de una serie de ensayos. Por ejemplo, la actividad de un MANP puede evaluarsein vitrocomprobando su efecto sobre la producción de GMPc en células cultivadas (por ejemplo, fibroblastos cardíacos cultivados, células endoteliales aórticas o células glomerulares). Las células pueden exponerse a un MANP (por ejemplo, un MANP de 10-10 a 10-4 M) y las muestras pueden someterse a ensayo para evaluar los efectos del polipéptido sobre la generación de GMPc. La generación de GMPc puede detectarse y medirse usando, por ejemplo, un kit de GMPc de RIA competitivo (Perkin-Elmer, Boston, MA).

[0100] La actividad de un MANP también puede evaluarsein vivomediante, por ejemplo, ensayos de sus efectos sobre factores tales como los niveles plasmáticos de GMPc, la excreción urinaria de GMPc, la generación renal neta de GMPc, la tasa de filtración glomerular, la presión sanguínea, la frecuencia cardíaca, la función hemodinámica tal como el gasto cardíaco, la presión de enclavamiento pulmonar, la resistencia vascular sistémica y la función renal, tal como el flujo sanguíneo renal, el volumen de orina y la tasa de excreción de sodio tras su administración a un mamífero (por ejemplo, un ser humano, un primate no humano, roedor, perro, gato, cerdo, ovejas, caballo o vaca). En algunos casos, estos parámetros pueden evaluarse tras inducir la hipertensión en el mamífero.

[0102] La expresión "ácido nucleico", como se usa en el presente documento, abarca tanto el ARN como el ADN, incluyendo el ADNc, el ADN genómico y el ADN sintético (por ejemplo, sintetizado químicamente). El ácido nucleico puede ser bicatenario o monocatenario. Cuando es monocatenario, el ácido nucleico puede ser la cadena sentido o la cadena antisentido. Además, el ácido nucleico puede ser circular o lineal.

[0104] El término "aislado", como se usa en el presente documento con referencia a ácido nucleico se refiere a un ácido nucleico que se produce de manera natural que no está inmediatamente contiguo a ambas secuencias con las que está inmediatamente contiguo (una en el extremo 5' y otra en el extremo 3') en el genoma de origen natural del organismo del que deriva. Por ejemplo, un ácido nucleico aislado puede ser, sin limitación, una molécula de ADN recombinante de cualquier longitud, a condición de que esté ausente o se elimine una de las secuencias de ácido nucleico normalmente encontradas inmediatamente flanqueantes a dicha molécula de ADN recombinante en un genoma de origen natural. Por lo tanto, un ácido nucleico aislado incluye, sin limitación, un ADN recombinante que existe como molécula separada (por ejemplo, un ADNc o un fragmento de ADN genómico producido por PCR o tratamiento con endonucleasas de restricción) independiente de otras secuencias, así como el ADN recombinante que se incorpora a un vector, un plásmido de replicación autónoma, un virus (por ejemplo, un retrovirus, adenovirus o herpes virus) o en el ADN genómico de un procariota o eucariota. Además, un ácido nucleico aislado puede incluir una molécula de ADN recombinante que forme parte de una secuencia de ácido nucleico híbrida o de fusión.

[0106] El término "aislado", como se usa en el presente documento con referencia a ácido nucleico también incluye cualquier ácido nucleico de origen no natural, puesto que no se encuentran secuencias de ácidos nucleicos no naturales en la naturaleza y no tienen secuencias inmediatamente contiguas en un genoma natural. Por ejemplo, un ácido nucleico no natural, tal como un ácido nucleico manipulado, se considera un ácido nucleico aislado. El ácido nucleico modificado por ingeniería genética puede fabricarse usando técnicas comunes de clonación molecular o de síntesis química de ácido nucleico. El ácido nucleico aislado de origen no natural puede ser independiente de otras secuencias o incorporarse en un vector, un plásmido de replicación autónoma, un virus (por ejemplo, un retrovirus, adenovirus o herpes virus) o el ADN genómico de un procariota o eucariota. Además, un ácido nucleico de origen no natural puede incluir una molécula de ácido nucleico que sea parte de una secuencia de ácido nucleico híbrida o de fusión.

[0108] Será evidente para los expertos en la materia que un ácido nucleico existente entre cientos a millones de otras moléculas de ácido nucleico dentro de, por ejemplo, bibliotecas de ADNc o genómicas, o los cortes de gel que contengan una digestión de restricción de ADN genómico no se considerará un ácido nucleico aislado.

[0110] En algunos casos, una molécula aislada de ácido nucleico puede tener al menos aproximadamente 12 bases de longitud (por ejemplo, al menos aproximadamente 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 100, 120, 130, 140, 150, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000 o 5000 bases de longitud) y puede hibridarse, en condiciones de hibridación, a la cadena sentido o antisentido de un ácido nucleico que tenga una secuencia que codifica un MANP (por ejemplo, un MANP que tenga la secuencia expuesta en SEQ ID NO:3, o una variante de la misma). Las condiciones de hibridación pueden ser condiciones de hibridación moderadamente o muy estrictas.

[0112] Para los fines del presente documento, las condiciones de hibridación moderadamente estrictas significan que la hibridación se realiza a aproximadamente 42 °C en una solución de hibridación que contiene KPO425 mM (pH 7,4), SSC 5X, solución de Denhardt 5X, ADN de esperma de salmón sonicado y desnauralizado 50 pg/ml, formamida al 50 %, sulfato de dextrano al 10 % y sonda 1-l5 ng/ml (aproximadamente 5 * 107 rpm/pg), mientras que los lavados se realizan a aproximadamente 50 °C con una solución de lavado que contenía SSC 2X y dodecilsulfato de sodio al 0,1 %.

[0114] Las condiciones de hibridación muy estrictas significan que la hibridación se realiza a aproximadamente 42 °C en una solución de hibridación que contiene KPO425 mM (pH 7,4), SSC 5X, solución de Denhardt 5X, ADN de esperma de salmón sonicado y desnauralizado 50 pg/ml, formamida al 50 %, sulfato de dextrano al 10 % y sonda 1-15 ng/ml (aproximadamente 5 * 107 rpm/pg), mientras que los lavados se realizan a aproximadamente 65 °C con una solución de lavado que contenía SSC 0.2X y dodecilsulfato de sodio al 0,1 %.

[0116] Las moléculas aisladas de ácido nucleico que codifican los MANP pueden producirse mediante técnicas convencionales, incluyendo, sin limitación, técnicas habituales de clonación molecular y síntesis química de ácido nucleico. Por ejemplo, pueden usarse técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para obtener un ácido nucleico aislado que contenga una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido natriurético como se proporciona en el presente documento. PCR se refiere a un procedimiento o técnica en el que los ácidos nucleicos diana se amplifican enzimáticamente. Normalmente se emplea la información de secuencia de los extremos de la región de interés o más allá para diseñar cebadores de oligonucleótidos que son idénticos en secuencia a las cadenas opuestas del molde que ha de amplificarse. La PCR puede usarse para amplificar secuencias específicas de ADN, así como de ARN, incluyendo secuencias de ADN genómico total o<a>R<n>celular total. Los cebadores normalmente tienen de 14 a 40 nucleótidos de longitud, pero pueden variar de 10 nucleótidos a cientos de nucleótidos de longitud. Se describen técnicas de PCR generales, por ejemplo, enPCR Primer: A Laboratory Manual,ed. de Dieffenbach y Dveksler, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995. Cuando se usa ARN como fuente de molde, puede usarse transcriptasa inversa para sintetizar cadenas de ADN complementario (ADNc). También puede usarse reacción en cadena de la ligasa, amplificación por desplazamiento de cadena, replicación autosostenida de secuencias o amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos para obtener ácidos nucleicos aislados. Véanse, por ejemplo, Lewis (1992)Genetic Engineering News12:1; Guatelliet al.(1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA87:1874-1878; y Weiss (1991)Science254:1292.

[0118] Los ácidos nucleicos aislados que codifican los MANP también pueden sintetizarse químicamente, ya sea como una molécula de ácido nucleico individual (por ejemplo, usando la síntesis automatizada de ADN en la dirección 3' a 5' usando la tecnología de fosforamidita) o como una serie de oligonucleótidos. Por ejemplo, pueden sintetizarse uno o más pares de oligonucleótidos largos (por ejemplo, > 100 nucleótidos) que contengan la secuencia deseada, conteniendo cada par un segmento corto de complementariedad (por ejemplo, aproximadamente 15 nucleótidos) de manera que se forme un dúplex cuando se hibride el par de oligonucleótidos. Se usa ADN polimerasa para prolongar los oligonucleótidos, dando como resultado una única molécula de ácido nucleico bicatenaria por cada par de oligonucleótidos, que después puede ligarse en un vector.

[0120] Además, los ácidos nucleicos aislados que codifican los MANP pueden obtenerse por mutagénesis. Por ejemplo, una secuencia de referencia puede mutarse mediante técnicas convencionales, incluyendo la mutagénesis dirigida por oligonucleótidos y la mutagénesis dirigida al sitio a través de PCR. VéaseShort Protocols in Molecular Biology,Capítulo 8, Greene Publishing Associates y John Wiley & Sons, editado por Ausubelet al.,1992. En el presente documento se proporcionan ejemplos no limitantes de polipéptidos natriuréticos variantes.

[0122] También se proporcionan vectores que contienen ácidos nucleicos tales como los descritos en el presente documento. Un "vector" es un replicón, tal como un plásmido, fago o cósmido, en el que se puede insertar otro segmento de ADN para lograr la replicación del segmento insertado. Un "vector de expresión" es un vector que incluye una o más secuencias de control de la expresión, y una "secuencia de control de la expresión" es una secuencia de ADN que controla y regula la transcripción y/o traducción de otra secuencia de ADN.

[0124] En un vector de expresión, un ácido nucleico (por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un polipéptido natriurético) puede unirse operativamente a una o más secuencias de control de la expresión. Como se usa en el presente documento, "unido operativamente" significa incorporado a una construcción genética de manera que las secuencias de control de la expresión controlen eficazmente la expresión de una secuencia codificante de interés. Los ejemplos de secuencias de control de la expresión incluyen promotores, potenciadores y regiones de terminación de la transcripción. Un promotor es una secuencia de control de la expresión compuesta por una región de una molécula de ADN, normalmente entre 100 y 500 nucleótidos en dirección 5' del punto de inicio de la transcripción (generalmente cerca del sitio de inicio de la ARN polimerasa II). Para poner una secuencia codificante bajo el control de un promotor, es necesario situar el sitio de inicio de la traducción del marco de lectura de traducción del polipéptido entre uno y aproximadamente cincuenta nucleótidos en dirección 3' del promotor. Los potenciadores proporcionan especificidad de expresión en términos de tiempo, ubicación y nivel. A diferencia de los promotores, los potenciadores pueden actuar cuando están ubicados a diversas distancias del sitio de transcripción. Un potenciador también puede ubicarse en dirección 3' del sitio de inicio de la transcripción. Una secuencia codificante está "unida operativamente" y "bajo el control" de secuencias de control de la expresión en una célula cuando la ARN polimerasa es capaz de transcribir la secuencia codificante en ARNm, que después puede traducirse en la proteína codificada por la secuencia codificante. Por lo tanto, los vectores de expresión pueden ser útiles para producir anticuerpos, así como otras moléculas multivalentes.

[0126] Los vectores de expresión adecuados incluyen, sin limitación, plásmidos y vectores víricos derivados de, por ejemplo, bacteriófago, baculovirus, virus del mosaico del tabaco, herpesvirus, citomegalovirus, retrovirus, virus vaccinia, adenovirus y virus adenoasociados. Existen numerosos vectores y sistemas de expresión disponibles en el mercado de empresas tales como Novagen (Madison, WI), Clontech (Palo Alto, CA), Stratagene (La Jolla, CA) e Invitrogen/Life Technologies (Carlsbad, CA).

[0128] Un vector de expresión puede incluir una secuencia marcadora diseñada para facilitar la manipulación posterior de la secuencia de ácido nucleico expresada (por ejemplo, purificación o localización). Las secuencias marcadoras, tales como proteína verde fluorescente (GFP), glutatión S-transferasa (GST), polihistidina, c-myc, hemaglutinina o marcador Flag<™>(Kodak, New Haven, CT) se expresan normalmente en forma de una fusión con el polipéptido codificado. Dichos marcadores pueden insertarse en cualquier parte dentro del polipéptido, incluyendo en uno cualquiera de los extremos carboxilo o amino.

[0130] También se proporcionan células hospedadoras que contienen vectores. Se pretende que la expresión "célula hospedadora" incluya células procariotas y eucariotas en las que se puede introducir un vector de expresión recombinante (por ejemplo, un vector que codifica un MANP). Como se usa en el presente documento, "transformado" y "transfectado" abarcan la introducción de una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, un vector) en una célula mediante una de una serie de técnicas. Aunque no se limitan a una técnica particular, un número de estas técnicas están bien establecidas en la técnica. Pueden encontrarse métodos adecuados para transformar o transfectar células hospedadoras, por ejemplo, en Sambrooket al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2.a edición), Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York (1989). Por ejemplo, puede utilizarse precipitación con fosfato de calcio, electroporación, choque térmico, lipofección, microinyección y transferencia de ácidos nucleicos mediada por virus para introducir un ácido nucleico en las células. Además, puede suministrarse directamente ADN desnudo a las célulasin vivocomo se describe en cualquier otro sitio (patentes de EE. UU. n.<os>5.580.859 y 5.589.466). Las células hospedadoras pueden expresar el polipéptido codificado, pero se señala que no se requiere que las células que contienen una molécula aislada de ácido nucleico proporcionada en el presente documento expresen un polipéptido. La molécula aislada de ácido nucleico transformada en una célula hospedadora puede integrarse en el genoma de la célula o mantenerse en estado episómico. Por lo tanto, las células hospedadoras pueden transfectarse de forma estable o transitoria con una construcción que contenga una molécula de ácido nucleico aislada proporcionada en el presente documento.

[0132] Puede usarse cualquier método adecuado para introducir una molécula de ácido nucleico aislada en una célulain vivooin vitro.Por ejemplo, puede utilizarse precipitación con fosfato de calcio, electroporación, choque térmico, lipofección, la microinyección y la transferencia de ácidos nucleicos mediada por virus son métodos que pueden utilizarse para introducir una molécula de ácido nucleico aislada en una célula. Además, puede administrarse directamente ADN desnudo a las célulasin vivocomo se describe en cualquier otro sitio (patentes de EE. UU. n.<os>5.580.859 y 5.589.466, y continuaciones de las mismas). Adicionalmente, pueden introducirse moléculas de ácido nucleico aisladas en las células generando animales transgénicos.

[0134] Puede utilizarse cualquier método apropiado para identificar células que contengan una molécula de ácido nucleico aislada que codifique un MANP. Dichos métodos incluyen, sin limitación, PCR y técnicas de hibridación de ácido nucleico tales como análisis Northern y Southern. En algunos casos, pueden usarse técnicas inmunohistoquímicas y bioquímicas para determinar si una célula contiene una molécula de ácido nucleico aislada en particular mediante la detección de la expresión de un polipéptido codificado por esa molécula de ácido nucleico.

[0136] Pueden utilizarse MANP aislados, ácidos nucleicos que codifican MANP y agentes diuréticos como los descritos en el presente documento para tratar mamíferos identificados con afecciones como la hipertensión (por ejemplo, HR). Por lo tanto, uno o más agentes diuréticos y uno o más MANP (o ácidos nucleicos que codifican uno o más MANP) pueden incorporarse a una composición para su administración a un mamífero (por ejemplo, un mamífero que padece, o está en riesgo de padecer, hipertensión, HR y/o enfermedad cardiorrenal). Puede utilizarse cualquier método adecuado para formular y posteriormente administrar una composición. Las dosis suelen depender de la capacidad de respuesta del mamífero al agente o agentes administrados, y la tanda de tratamiento dura de varios días a varios meses, o hasta que se consigue una respuesta adecuada. Las personas con conocimientos habituales en la materia pueden determinar rutinariamente las dosis óptimas, las metodologías de dosificación y las tasas de repetición. Las dosis óptimas pueden variar en función de la potencia relativa de cada agente (por ejemplo, un MANP y Fs), y generalmente pueden estimarse basándose en la CE<50>que ha resultado eficaz en modelos animalesin vitroy/oin vivo.Las composiciones que contienen uno o más MANP y uno o más agentes diuréticos como los descritos en el presente documento pueden administrarse una o más veces al día, semanalmente, mensualmente o incluso con menor frecuencia, o pueden administrarse de forma continua durante un período de tiempo (por ejemplo, horas, días o semanas). Por ejemplo, un MANP o una composición que contiene un MANP puede administrarse a un paciente en una dosis de al menos aproximadamente 0,01 ng de MANP/kg a aproximadamente 100 mg de MANP/kg de masa corporal. En algunos casos, un MANP o una composición que contiene un MANP puede administrarse en forma de infusión durante uno a 30 días o más (por ejemplo, en una dosis de aproximadamente 1 pmol de MANP/kg/minuto a aproximadamente 500 nmol de MANP/kg/minuto).

[0138] Pueden mezclarse uno o más MANP o ácidos nucleicos que codifican uno o más MANP, y uno o más diuréticos, encapsularse, conjugarse o asociarse de otro modo entre sí y/o con otras moléculas, estructuras moleculares o mezclas de compuestos tales como, por ejemplo, liposomas, moléculas dirigidas a receptores o células, u otras formulaciones orales, tópicas o de otro tipo para facilitar la captación, distribución y/o absorción.

[0140] En algunas realizaciones, una composición puede contener un MANP (o un ácido nucleico que codifica el MANP), un agente diurético, o ambos, junto con un portador farmacéuticamente aceptable. Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, disolventes farmacéuticamente aceptables, agentes de suspensión, o cualquier otro vehículo farmacológicamente inerte para administrar polipéptidos y/u otros compuestos a un sujeto. Los portadores farmacéuticamente aceptables pueden ser líquidos o sólidos, y pueden seleccionarse teniendo en cuenta la forma de administración prevista para proporcionar el volumen deseado, la consistencia y otras propiedades químicas y de transporte pertinentes, cuando se combinan con uno o más compuestos terapéuticos y cualquier otro componente de una composición farmacéutica dada. Los portadores farmacéuticamente aceptables útiles incluyen, sin limitación: agua; solución salina; agentes aglutinantes (por ejemplo, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa); cargas (por ejemplo, lactosa o dextrosa y otros azúcares, gelatina o sulfato de calcio); lubricantes (por ejemplo, almidón, polietilenglicol o acetato de sodio); disgregantes (por ejemplo, almidón de patata o glicolato de almidón de sodio); y agentes humectantes (por ejemplo, lauril sulfato de sodio).

[0142] Un MANP o un ácido nucleico y un agente diurético pueden estar presentes dentro de la misma composición, o pueden estar presentes en composiciones separadas que se administran al mismo tiempo o en momentos diferentes, y se administran por la misma vía o por vías separadas. Las composiciones farmacéuticas que contienen MANP y agentes diuréticos como los descritos en el presente documento pueden administrarse por varios métodos, dependiendo de si se desea un tratamiento local o sistémico. La administración puede ser, por ejemplo, por vía oral o parenteral (por ejemplo, por inyección subcutánea, intratecal, intraventricular, intramuscular o intraperitoneal, o por goteo intravenoso (i.v.)). La administración puede ser rápida (por ejemplo, mediante inyección) o puede producirse a lo largo de un período de tiempo (por ejemplo, mediante infusión lenta o administración de formulaciones de liberación lenta).

[0143] Las composiciones y formulaciones para la administración parenteral, intratecal o intraventricular incluyen soluciones acuosas estériles (por ejemplo, solución salina fisiológica estéril), que también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados (por ejemplo, potenciadores de la penetración, compuestos portadores y otros portadores farmacéuticamente aceptables). Las composiciones y formulaciones para la administración oral incluyen, por ejemplo, polvos o gránulos, suspensiones o soluciones en agua o medios no acuosos, cápsulas, sobrecitos o comprimidos. Dichas composiciones también pueden incorporar espesantes, agentes aromatizantes, diluyentes, emulsionantes, adyuvantes de dispersión o aglutinantes.

[0145] Las composiciones farmacéuticas incluyen, pero sin limitación, soluciones, emulsiones, suspensiones acuosas y formulaciones que contienen liposomas. Estas composiciones pueden generarse a partir de diversos componentes que incluyen, por ejemplo, líquidos preformados, sólidos autoemulsionantes y semisólidos autoemulsionantes. Las formulaciones en emulsión son particularmente útiles para el suministro oral de composiciones terapéuticas debido a su facilidad de formulación y eficacia de solubilización, absorción y biodisponibilidad. Los liposomas pueden ser especialmente útiles por su especificidad y la duración de acción que ofrecen desde el punto de vista del suministro de fármacos.

[0147] Las composiciones pueden contener sales farmacéuticamente aceptables, ésteres, o sales de dichos ésteres, o cualquier otro compuesto que, tras la administración a un sujeto, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito biológicamente activo o el resto del mismo para el compuesto en cuestión (por ejemplo, un MANP o un agente diurético). En consecuencia, por ejemplo, el presente documento proporciona sales farmacéuticamente aceptables de MANP y diuréticos, profármacos y sales farmacéuticamente aceptables de dichos profármacos, y otros bioequivalentes. Un profármaco es un agente terapéutico que se prepara en una forma inactiva y se convierte en una forma activa (es decir, fármaco) dentro del organismo o de las células del mismo por la acción de enzimas endógenas u otras sustancias químicas y/o condiciones. La expresión "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a las sales fisiológica y farmacéuticamente aceptables de los MANP y los agentes diuréticos útiles en los métodos proporcionados en el presente documento (es decir, sales que conservan la actividad biológica deseada de los compuestos precursores sin transmitir efectos toxicológicos no deseados). Los ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero sin limitación, sales formadas con cationes (por ejemplo, sodio, potasio, calcio, o poliaminas tales como espermina); sales de adición de ácidos formadas con ácidos inorgánicos (por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico o ácido nítrico); sales formadas con ácidos orgánicos (por ejemplo, ácido acético, ácido cítrico, ácido oxálico, ácido palmítico o ácido fumárico); y sales formadas con aniones elementales (por ejemplo, bromo, yodo o cloro).

[0148] Las composiciones pueden contener adicionalmente otros componentes adjuntos que se encuentran convencionalmente en las composiciones farmacéuticas. Por lo tanto, las composiciones también pueden incluir materiales compatibles y farmacéuticamente activos tales como, por ejemplo, agentes antipruriginosos, astringentes, anestésicos locales o antiinflamatorios, o materiales adicionales útiles en la formulación física de diversas formas farmacéuticas de las composiciones, tales como colorantes, agentes aromatizantes, conservantes, antioxidantes, opacificantes, agentes espesantes y estabilizantes. Además, la composición puede mezclarse con agentes auxiliares, por ejemplo, lubricantes, conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, sales para influir en la presión osmótica, tampones, colorantes, aromatizantes, potenciadores de la penetración y sustancias aromáticas. Cuando se añaden, sin embargo, dichos materiales no deben interferir indebidamente con las actividades biológicas de los demás componentes de las composiciones.

[0150] En algunos casos, un MANP puede formularse como una forma farmacéutica de liberación sostenida. Por ejemplo, un MANP o un agente diurético pueden formularse en una formulación de liberación controlada. En algunos casos, pueden formularse recubrimientos, envolturas o matrices protectoras para contener uno o más de los MANP descritos en el presente documento. Dichos recubrimientos, envolturas y matrices protectoras pueden usarse para recubrir dispositivos permanentes tales comostents,catéteres y tubos de diálisis peritoneal. En algunos casos, un polipéptido puede incorporarse a sustancias poliméricas, liposomas, microemulsiones, micropartículas, nanopartículas o ceras.

[0151] Las formulaciones farmacéuticas como se divulgan en el presente documento, que pueden presentarse convenientemente en forma farmacéutica unitaria, pueden prepararse según cualquier método adecuado, incluidas las técnicas convencionales conocidas en la industria farmacéutica. Dichas técnicas incluyen la etapa de asociar el principio o principios activos con el portador o portadores farmacéuticos deseados. Normalmente, las formulaciones pueden prepararse asociando de manera uniforme e íntima los principios activos con portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos, o ambos, y después, si es necesario, conformando el producto. Las formulaciones pueden esterilizarse si se desea, a condición de que el método de esterilización no interfiera con la eficacia de la molécula o moléculas contenidas en la formulación.

[0153] En algunas realizaciones, un MANP y/o un agente diurético, tal como la Fs, pueden formularse para su administración subcutánea mediante inyección, polímeros de liberación prolongada, parche farmacológico, bomba o micropartícula/nano partícula. A modo de ejemplo y no de limitación, la publicación PCT n.° WO 2008/061355 divulga materiales y métodos para formular un polipéptido para su suministro en un tubo de hidrogel. El polipéptido puede mezclarse con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables y compatibles con el polipéptido en cantidades adecuadas para su uso en los métodos descritos en el presente documento. Por ejemplo, un polipéptido puede combinarse con uno o más excipientes tales como, sin limitación, celulosa microcristalina, dióxido de silicio coloidal, lactosa, almidón, sorbitol, ciclodextrina y combinaciones de los mismos. El excipiente puede ser un material sólido, semisólido o líquido que actúa como vehículo, portador o medio para el polipéptido. En algunas realizaciones, el polipéptido puede comprimirse, compactarse o extruirse con uno o más excipientes antes de introducirlo en un tubo de hidrogel. Dichas formulaciones pueden dar como resultado una composición farmacéutica con propiedades de liberación deseables, estabilidad mejorada y/u otras propiedades deseables.

[0155] Las composiciones farmacéuticas también pueden incluir agentes auxiliares o excipientes, tales como agentes de deslizamiento, agentes de disolución, tensioactivos, diluyentes, aglutinantes, disgregantes y/o lubricantes. Por ejemplo, los agentes de disolución pueden aumentar la velocidad de disolución del polipéptido a partir de la formulación de dosificación, y pueden incluir, por ejemplo, ácidos orgánicos y/o sales de ácidos orgánicos (por ejemplo, citrato de sodio con ácido cítrico). Otros ejemplos de excipientes útiles en dichas formulaciones incluyen polímeros sintéticos, semisintéticos, modificados y naturales (por ejemplo, lactosa, dextrosa, sacarosa, trehalosa, sorbitol, manitol, almidones, goma arábiga, silicato de calcio, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, celulosa, agua, jarabe, PEG, ciclodextrina, ciclodextrinas modificadas con alcoxi, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, celulosa microcristalina, albúmina, dextrano, maltitol, xilitol, caolín y metilcelulosa). El polipéptido también puede mezclarse con un agente lubricante (por ejemplo, talco, estearato de magnesio, ácido esteárico o aceite mineral, estearato de calcio, aceites vegetales hidrogenados, benzoato de sodio, cloruro de sodio, leucina carbowax, lauril sulfato de magnesio o monoestearato de glicerilo), un agente humectante, un agente emulsionante y de suspensión, o un agente conservante (por ejemplo, hidroxibenzoato de metilo o de propilo).

[0157] Otros agentes que pueden añadirse a una composición farmacéutica pueden alterar el pH del microambiente en la disolución y el establecimiento de un perfil de concentración plasmática terapéuticamente eficaz de un MANP o un compuesto diurético. Dichos agentes incluyen sales de ácidos inorgánicos e hidróxido de magnesio. Otros agentes que pueden usarse incluyen tensioactivos y otros materiales solubilizantes.

[0159] Los diluyentes útiles incluyen, por ejemplo, cargas inertes farmacéuticamente aceptables tales como celulosa microcristalina, lactosa, sacarosa, fructosa, glucosa dextrosa u otros azúcares, fosfato de calcio dibásico, sulfato de calcio, celulosa, etilcelulosa, derivados de celulosa, caolín, manitol, lactitol, maltitol, xilitol, sorbitol u otros alcoholes de azúcar, almidón seco, sacáridos, dextrina, maltodextrina u otros polisacáridos, inositol o combinaciones de los mismos. En algunos casos, los diluyentes hidrosolubles pueden ser especialmente útiles.

[0161] Los agentes de deslizamiento pueden usarse para mejorar el flujo y la compresibilidad de los ingredientes de la composición durante el procesamiento. Los agentes de deslizamiento útiles incluyen, por ejemplo, dióxido de silicio coloidal (también denominado sílice coloidal, sílice pirógena, ácido silícico anhidro ligero, anhídrido silícico y dióxido de silicio pirógeno).

[0163] Los tensioactivos que son adecuados para su uso en las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento incluyen, sin limitación, laurilsulfato de sodio, estearatos de polietileno, ésteres de ácido graso de polietilen sorbitán, derivados de aceite de ricino de polioxietileno, polioxietilen alquil éteres, benzoato de bencilo, cetrimida, alcohol cetílico, docusato de sodio, monooleato de glicerilo, monoestearato de glicerilo, palmitoestearato de glicerilo, lecitina, triglicéridos de cadena media, monoetanolamina, ácido oleico, poloxámeros, alcohol polivinílico y ésteres de ácidos grasos de sorbitán.

[0165] Los disgregantes adecuados incluyen, por ejemplo, almidones, glicolato de almidón de sodio, crospovidona, croscarmelosa, celulosa microcristalina, hidroxipropilcelulosa de baja sustitución, pectinas, copolímero de metacrilato de potasio-divinilbenceno, alcohol polivinílico), tilamida, bicarbonato de sodio, carbonato de sodio, derivados de almidón, dextrina, beta ciclodextrina, derivados de dextrina, óxido de magnesio, arcillas, bentonita y combinaciones de los mismos.

[0167] En algunas realizaciones, un MANP y/o un agente diurético pueden incorporarse a un sistema de administración de hidrogel. Por ejemplo, un MANP puede formularse para su administración por vía subcutánea a un paciente a través de un sistema de xerogel-hidrogel que puede liberar el polipéptido de forma continua y sostenida durante un período de tiempo prolongado. Véanse, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.226.325 y la publicación PCT n.° WO 2004/071736.

[0169] Los materiales polimerizables líquidos útiles en la preparación de tubos de hidrogel incluyen una amplia diversidad de compuestos polimerizables hidrófilos y etilénicamente insaturados. Véanse, por ejemplo, los compuestos enumerados en la publicación PCT n.° WO 2008/061355. En la reacción de polimerización normalmente se usan mezclas de dichos monómeros hidrófilos. El tipo y la proporción de monómeros se seleccionan para obtener un polímero (por ejemplo, un polímero reticulado homogéneo) que al hidratarse posea las características deseadas (por ejemplo, valor de contenido de agua en equilibrio (EWC, por sus siglas en inglés) y/o tamaño de poro) para la aplicación o el uso contemplados.

[0171] En algunos casos, la polimerización de mezclas monoméricas hidrófilas puede dar como resultado copolímeros hidrófilos homogéneos que se disuelven, en mayor o menor medida, en un medio acuoso. En dichos casos, puede incluirse en la mezcla monomérica una pequeña cantidad (por ejemplo, hasta aproximadamente el 3 por ciento) de un agente reticulante polietilénicamente insaturado copolimerizable para obtener copolímeros reticulados homogéneos que sean insolubles en agua, así como hinchables en agua. Un homopolímero ligeramente reticulado de (hidroxietil)metacrilato (HEMA) tiene un valor de EWC de aproximadamente el 38 %. Los copolímeros reticulados de HEMA y N-(2-hidroxipropil) metacrilamida (HPMA) tienen valores de EWC inferiores al 38 %, mientras que los copolímeros reticulados de HEMA y acrilamida presentan valores de EWC superiores al 38 % p/v. Por lo tanto, dependiendo de la velocidad de elución útil o eficaz del polipéptido, los hidrogeles de copolímero pueden personalizarse para eluir el polipéptido a la velocidad deseada. Normalmente, los copolímeros contienen de aproximadamente el 15 % a aproximadamente el 70 % en peso de unidades HEMA y de aproximadamente el 85 % al 30 % en peso de un segundo monómero etilénico, y, por lo tanto, poseen valores de EWC en el intervalo de aproximadamente el 20 % a aproximadamente el 75 %. En algunas realizaciones, una mezcla de copolímeros puede contener además una pequeña cantidad de un agente reticulante polietilénicamente insaturado [por ejemplo, dimetacrilato de etilenglicol ("EDMA") o trimetacrilato de trimetilolpropano ("TMPTMA")].

[0173] En algunas realizaciones, una composición farmacéutica para el suministro de liberación controlada de un MANP en un sujeto puede incluir (a) un complejo del polipéptido (en donde el polipéptido tiene al menos un grupo funcional básico) y un polianión derivado de hexahidroxiciclohexano (en donde el polianión tiene al menos dos grupos funcionales con carga negativa); y (b) un portador farmacéuticamente aceptable que contiene un polímero biodegradable e insoluble en agua. Dichas composiciones se describen en, por ejemplo, la publicación PCT n.° WO 2006/017852, y pueden prepararse en forma de soluciones, suspensiones, dispersiones, emulsiones, gotas, aerosoles, cremas, semisólidos, pastas, cápsulas, comprimidos, implantes sólidos o micropartículas, por ejemplo. La expresión "suministro de liberación controlada", como se usa en el presente documento, se refiere al suministro continuo de un agente farmacéuticoin vivodurante un período de tiempo (por ejemplo, de varios días a semanas o meses) después de su administración. El suministro de liberación controlada y sostenida de un MANP puede demostrarse mediante, por ejemplo, efectos terapéuticos continuados del polipéptido a lo largo del tiempo (por ejemplo, reducciones continuadas de los síntomas a lo largo del tiempo). El suministro sostenido del polipéptido también puede demostrarse detectando la presencia del polipéptidoin vivoa lo largo del tiempo. Las composiciones pueden proporcionar un suministro de estallido inicial bajo, seguido de una liberación estable y controlada del polipéptidoin vivodurante períodos prolongados (por ejemplo, de días a meses).

[0175] En dichas realizaciones, puede formarse un complejo física y químicamente estable tras la combinación adecuada de un polipéptido y un polianión. El complejo puede adoptar la forma de un precipitado que se produce tras combinar una preparación acuosa del polipéptido y el polianión. Opcionalmente, pueden incorporarse uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables al complejo. Dichos excipientes pueden actuar como estabilizantes del polipéptido y/o del complejo. Los ejemplos no limitantes de excipientes adecuados incluyen bisulfito de sodio, ácido p-aminobenzoico, tiourea, glicina, metionina, manitol, sacarosa y PEG.

[0177] Un complejo estable entre un polipéptido y un polianión pueden incorporarse en un portador farmacéuticamente aceptable que contenga un polímero biodegradable insoluble en agua, opcionalmente con uno o más excipientes. La expresión "polímero insoluble en agua biodegradable" se refiere a polímeros sintéticos y naturales biocompatibles y/o biodegradables que pueden usarsein vivo.La expresión también tiene por objeto incluir polímeros que son insolubles o se vuelven insolubles en agua o fluido biológico a 37 °C. Los polímeros pueden purificarse (por ejemplo, para retirar monómeros y oligómeros) usando técnicas conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 4.728.721. Los ejemplos de polímeros útiles incluyen, sin limitación, polilactidas, poliglicolidas, poli(lactida-coglicólida)s, policaprolactonas, polidioxanonas, policarbonatos, polihidroxibutiratos, oxalatos de polialquileno, polianhídridos, poliamidas, poliesteramidas, poliuretanos, poliacetales, poliortocarbonatos, polifosfacenos, polihidroxivaleratos, succinatos de polialquileno y poliortoésteres, y copolímeros, copolímeros de bloque, copolímeros ramificados, terpolímeros y combinaciones de los mismos.

[0179] Los polímeros biodegradables insolubles en agua también pueden incluir polímeros con protección terminal, sin protección terminal o mezclas de polímeros con protección terminal y sin protección terminal. Un polímero con protección terminal se define generalmente como aquel que tiene grupos terminales carboxilo con protección terminal, mientras que un polímero sin protección terminal tiene grupos terminales carboxilo libres.

[0181] Los factores que han de tenerse en cuenta al determinar los pesos moleculares adecuados para el polímero pueden incluir la velocidad de degradación del polímero, la resistencia mecánica y la velocidad de disolución del polímero en el disolvente deseadas. Los pesos moleculares útiles de los polímeros pueden ser de aproximadamente 2.000 Dalton a aproximadamente 150.000 Dalton, por ejemplo, con una polidispersidad de 1,1 a 2,8, dependiendo del polímero que se seleccione para su uso.

[0183] El portador farmacéuticamente aceptable puede ser un portador con propiedades de respuesta al entorno (por ejemplo, termosensible, sensible al pH o sensible a la electricidad), en forma de una solución o suspensión inyectable, partícula, película, microgránulo, cilindro, disco, microcápsula, microesfera, nanoesfera, micropartícula, oblea, micela, liposoma o cualquier otra configuración polimérica útil para el suministro de fármacos.

[0185] Los métodos de formación de diversos portadores poliméricos farmacéuticamente aceptables incluyen aquellos conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.os 6.410.044; 5.698.213; 6.312.679; 5.410.016; 5.529.914; 5.501.863; 4.938.763; 5.278.201; y 5.278.202; y la publicación PCT n.° WO 93/16687.

[0187] Las composiciones pueden producirse cuando un complejo polipéptido/polianión se dispersa en una matriz polimérica para formar un implante sólido, que puede inyectarse o implantarse en un sujeto. Dichos implantes pueden prepararse usando técnicas de procesamiento por fusión de polímeros convencionales, tales como extrusión, moldeo por compresión y moldeo por inyección, por ejemplo. La preparación de dichos implantes puede realizarse en condiciones asépticas o, como alternativa, mediante esterilización terminal por irradiación (por ejemplo, usando irradiación gamma o esterilización por haz de electrones).

[0189] En algunas realizaciones, las composiciones en forma de microesferas pueden producirse encapsulando un complejo polipéptido/polianión en un portador polimérico, usando diversos polímeros biocompatibles y/o biodegradables que tengan propiedades adecuadas para su suministro en diferentes entornos biológicos o para efectuar funciones específicas. La velocidad de disolución y, por lo tanto, el suministro de polipéptido, se determina por factores tales como la técnica de encapsulación, la composición polimérica, la reticulación polimérica, el espesor del polímero, la solubilidad del polímero, y el tamaño y la solubilidad del complejo polipéptido/polianión.

[0191] Para preparar dichas microesferas, un complejo polipéptido/polianión que ha de encapsularse puede suspenderse en una solución polimérica en un disolvente orgánico, de manera que la solución polimérica recubra totalmente el complejo polipéptido/polianión. Después, la suspensión puede someterse a una técnica de microencapsulación, tal como el secado por pulverización, la congelación por pulverización, la emulsión o la emulsión por evaporación de disolvente. Por ejemplo, los complejos o micropartículas suspendidos junto con el polímero en un disolvente orgánico pueden transferirse a un volumen mayor de una solución acuosa que contenga un emulsionante, de manera que el disolvente orgánico se evapore o difunda fuera del polímero y el polímero solidificado encapsule el complejo polipéptido/polianión.

[0193] Los emulsionantes útiles para preparar complejos encapsulados de polipéptido/polianión incluyen los poloxámeros y el alcohol polivinílico, por ejemplo. Los disolventes orgánicos útiles en dichos métodos incluyen ácido acético, acetona, cloruro de metileno, acetato de etilo, cloroformo y otros disolventes no tóxicos que dependerán de las propiedades del polímero. Normalmente se eligen disolventes que solubilicen el polímero y que, en última instancia, sean atóxicos.

[0194] En algunas realizaciones, un polipéptido puede formularse en un depósito de liberación prolongada, que puede proporcionar niveles de exposición constantemente altos y puede alcanzar niveles de exposición altos rápidamente (con una fase de retraso corta o nula). Véase, por ejemplo, la publicación de EE. UU. n.° 2010/0266704. Las formulaciones de depósito de liberación prolongada pueden incluir un polipéptido de MANP o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo (por ejemplo, una sal de adición de ácidos con un ácido inorgánico, ácido polimérico o ácido orgánico). Las sales de adición de ácido pueden existir como sales mono o divalentes, dependiendo de si se añaden uno o dos equivalentes de ácido.

[0196] Como se describe en la publicación de EE. UU. n.° 2010/0266704, las formulaciones de depósito pueden contener dos polímeros de poli(ácido láctico-co-glicólica) lineales (PLGA) diferentes que tengan una relación molar de comonómero de lactida:glicolida (L:G) de 85:15 a 65:35, donde al menos uno de los polímeros tiene una viscosidad inherente baja. Dichas formulaciones pueden proporcionar niveles plasmáticos altos sostenidos del polipéptido durante períodos de tiempo largos. Los ejemplos de polímeros adecuados incluyen los polímeros de poli(D,L-lactida) y poli(D,L-lactida-co-glicolida) lineales comercializados con los nombres comerciales<r>E<s>OMER®,<l>A<c>TEL® y MEDlSORB® de Boehringer Ingelheim Pharma GmBH & Co. KG (Ingelheim, Alemania), Absorbable Polymers International (Pelham, AL), y Alkermes, Inc. (Cambridge, MA), respectivamente.

[0198] Las formulaciones de depósito de alta exposición para la administración subcutánea pueden mostrar una acción inmediata o, al menos, muy rápida, de manera que se alcancen concentraciones plasmáticas terapéuticas en poco tiempo (por ejemplo, una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete días después de la inyección subcutánea), y pueden mostrar niveles de exposición constantemente altos durante un mes o más.

[0200] En algunas realizaciones, las formulaciones de depósito de liberación prolongada proporcionadas en el presente documento pueden contener dos polímeros de PLGA diferentes mezclados o combinados en una relación de porcentaje de peso de 95:5 a 50:50 (por ejemplo, de 85:15 a 50:50, de 80:20 a 60:40, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 65:35, 60:40, 55:45 o 50:50 % en peso). En algunas realizaciones, el polímero con la viscosidad inherente más alta puede tener un % en peso más alto que el polímero con la viscosidad inherente más baja. En algunas realizaciones, el polímero con la viscosidad inherente más alta puede tener un grupo terminal éster. Las formulaciones de depósito pueden contener polímeros adicionales, incluyendo otros polímeros de PLGA lineales o en forma de estrella, o polímeros de poli(D,L-lactida-co-glicolida) (PLG) o ácido poliláctico (PLA), a condición de que se conserven las propiedades PK favorables.

[0202] El contenido de polipéptidos de la formulación de depósito de liberación prolongada (la carga) puede estar en un intervalo del 1 % al 30 % (por ejemplo, del 10 % al 25 %, más preferentemente del 15 % al 20 %. La carga se define como la relación en peso del polipéptido con respecto a la masa total de la formulación de PLGA.

[0204] Las composiciones de depósito pueden fabricarse de forma aséptica o pueden fabricarse de forma no aséptica y esterilizarse terminalmente (por ejemplo, usando irradiación gamma). La esterilización terminal puede dar como resultado un producto con la mayor garantía de esterilidad posible.

[0206] Las composiciones de depósito también pueden contener uno o más excipientes farmacéuticos que pueden modular el comportamiento de liberación del polipéptido. Dichos excipientes pueden estar presentes en la composición en una cantidad de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 50 %. Los excipientes adecuados incluyen, sin limitación, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, carboximetilcelulosa de sodio, dextrina, PEG, tensioactivos tales como poloxámeros (también conocidos como poli(oxietileno-bloque-oxipropileno), ésteres de ácidos grasos de poli(oxietilen)-sorbitán disponibles en el mercado con el nombre comercial TWEEN®, ésteres de ácidos grasos de sorbitán, lecitinas, sales inorgánicas tales como carbonato de calcio, hidróxido de magnesio, carbonato de magnesio, protamina y polímeros naturales o sintéticos que portan restos amina, tales como polilisina.

[0208] Las composiciones de depósito pueden contener una mezcla o combinación de diferentes polímeros en términos de composiciones, peso molecular y/o arquitecturas poliméricas. Una combinación de polímeros se define en el presente documento como una solución sólida o suspensión de dos polímeros lineales diferentes en un implante o micropartícula. Una mezcla de depósitos se define en el presente documento como una mezcla de dos implantes de tipo depósito o micropartículas o formulaciones semisólidas de diferente composición con uno o más PLGA en cada depósito. Las composiciones de depósito farmacéuticas en las que hay presentes dos PLGA en forma de una combinación de polímeros pueden ser particularmente útiles.

[0210] Las composiciones de depósito farmacéuticas pueden estar en forma de implantes, semisólidos (geles), soluciones líquidas, micropartículas o suspensiones que se solidificanin situuna vez inyectadas. Los siguientes párrafos se centran en las micropartículas poliméricas, aunque las descripciones también son aplicables a implantes, semisólidos y líquidos.

[0212] Las micropartículas pueden tener un diámetro de unos pocos submicrómetros a unos pocos milímetros (por ejemplo, de aproximadamente 0,01 micrómetro a aproximadamente 2 mm, de aproximadamente 0,1 micrómetro a aproximadamente 500 micrómetros, de aproximadamente 10 a aproximadamente 200 micrómetros, de aproximadamente 10 a aproximadamente 130 micrómetros, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 90 micrómetros).

[0213] En algunas realizaciones, las micropartículas pueden mezclarse o recubrirse con un agente antiaglomerante. Los agentes antiaglomerantes adecuados incluyen, por ejemplo, manitol, glucosa, dextrosa, sacarosa, cloruro de sodio y polímeros solubles en agua tales como alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona y PEG.

[0215] Las micropartículas pueden fabricarse mediante procesos conocidos en la técnica, tales como coacervación o separación de fases, secado por pulverización o métodos de emulsión/suspensión de agua en aceite (W/O), agua en aceite en agua (W/O/W) o sólidos en aceite en agua (S/O/W), seguidos de extracción con disolvente o evaporación de disolvente. Los métodos de emulsión/suspensión pueden ser particularmente útiles y pueden incluir las siguientes etapas:

[0217] (i) preparar una fase orgánica interna, que comprende

[0219] (a) disolver un polímero o polímeros en un disolvente orgánico adecuado (por ejemplo, acetato de etilo, acetona, THF, acetonitrilo o un hidrocarburo halogenado tal como cloruro de metileno, cloroformo o hexafluoroisopropanol) o mezcla de disolventes, y opcionalmente disolver/dispersar aditivos adecuados; (b) disolver/suspender/emulsionar un polipéptido en la solución polimérica obtenida en la etapa (a);

[0221] (ii) preparar una fase acuosa externa que contiene uno o más estabilizantes (por ejemplo, poli(alcohol vinílico), hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, poli(vinil pirrolidona) o gelatina) y opcionalmente una sal tampón;

[0222] (iii) mezclar la fase orgánica interna con la fase acuosa externa para formar una emulsión; y

[0223] (iv) endurecer las micropartículas mediante evaporación de disolventes o extracción con disolvente, lavar las micropartículas (por ejemplo, con agua), recoger y secar las micropartículas (por ejemplo, mediante liofilización o secado al vacío) y tamizar las micropartículas (por ejemplo, a través de 140 pm).

[0225] Una composición de micropartículas seca puede esterilizarse de forma terminal mediante irradiación gamma, ya sea a granel o después de dosificarla en el recipiente final. En algunas realizaciones, las micropartículas esterilizadas a granel pueden resuspenderse en un vehículo adecuado y dispensarse en un dispositivo adecuado, tal como una jeringa de doble cámara, con posterior liofilización.

[0227] En algunas realizaciones, las composiciones de depósito de micropartículas pueden incluir un vehículo para facilitar la reconstitución. Además, antes de la administración, las micropartículas pueden suspenderse en un vehículo adecuado para inyección (por ejemplo, un vehículo de base acuosa que contenga uno o más excipientes farmacéuticos tales como manitol, cloruro de sodio, glucosa, dextrosa, sacarosa o glicerina, y/o uno o más tensioactivos no iónicos tales como un poloxámero, éster de ácido graso de poli(oxietilen)-sorbitán, carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol, poli(vinilpirrolidona) o monoestearato de aluminio).

[0229] El presente documento también proporciona métodos para tratar a un mamífero que padece un trastorno cardiovascular (por ejemplo, hipertensión, hipertensión resistente o infarto de miocardio). Los métodos pueden incluir la administración (por ejemplo, oral, parenteral, o una combinación de métodos orales y parenterales) un MANP y un agente diurético como se proporciona en el presente documento. El tratamiento puede afectar beneficiosamente o aliviar uno o más síntomas asociados con el trastorno, o una o más causas subyacentes del trastorno. Por ejemplo, el tratamiento puede reducir la presión arterial en el mamífero.

[0231] Antes de administrar un MANP o ácido nucleico y un agente diurético a un mamífero, o una o más composiciones que contienen un MANP y un agente diurético, un mamífero puede ser evaluado para determinar si el mamífero tiene o no necesidad de tratamiento de un trastorno cardiovascular, tal como la hipertensión (por ejemplo, HR). Tras identificar que el mamífero necesita dicho tratamiento, el mamífero puede ser tratado con una composición como se describe en el presente documento. Por ejemplo, una composición que contiene un MANP puede administrarse al mamífero en cualquier cantidad, con cualquier frecuencia y durante cualquier duración eficaz para lograr un resultado deseado (por ejemplo, reducir la presión sanguínea en el mamífero, o prevenir o retrasar una mayor elevación de la presión sanguínea en el mamífero).

[0233] En algunas realizaciones, una composición que contiene un MANP puede administrarse por vía parenteral (por ejemplo, por inyección, tal como inyección subcutánea, o por ingestión oral) en una dosis de aproximadamente 0,01 ng de polipéptido/kg a aproximadamente 100 mg de polipéptido/kg de masa corporal (por ejemplo, de aproximadamente 10 ng de polipéptido/kg a aproximadamente 50 mg de polipéptido/kg, de aproximadamente 20 ng de polipéptido/kg a aproximadamente 10 mg de polipéptido/kg, de aproximadamente 0,1 ng de polipéptido/kg a aproximadamente 20 ng de polipéptido/kg, de aproximadamente 3 ng de polipéptido/kg a aproximadamente 10 ng de polipéptido/kg, de aproximadamente 10 ng de polipéptido/kg a aproximadamente 50 ng de polipéptido/kg, de aproximadamente 50 ng de polipéptido/kg a aproximadamente 100 pg de polipéptido/kg, de aproximadamente 1 pg de polipéptido/kg a aproximadamente 10 pg de polipéptido/kg, de aproximadamente 1 pg de polipéptido/kg a aproximadamente 5 pg de polipéptido/kg, de aproximadamente 3 pg de polipéptido/kg a aproximadamente 7 pg de polipéptido/kg, de aproximadamente 5 pg de polipéptido/kg a aproximadamente 10 pg de polipéptido/kg, de aproximadamente 10 pg de polipéptido/kg a aproximadamente 20 pg de polipéptido/kg, o de aproximadamente 20 pg de polipéptido/kg a aproximadamente 100 pg de polipéptido/kg) de masa corporal, aunque otras dosis también pueden proporcionar resultados beneficiosos. En algunos casos, un MANP puede administrarse por infusión en una dosis de, por ejemplo, aproximadamente 1 pmol/kg/minuto a aproximadamente 500 nmol/kg/minuto (por ejemplo, de aproximadamente 1 a 10 pmol/kg/minuto, de aproximadamente 10 a 100 pmol/kg/minuto, de aproximadamente 100 a 300 pmol/kg/minuto, de aproximadamente 250 a 500 pmol/ kg/minuto, de aproximadamente 500 pmol/kg/minuto a aproximadamente 1 nmol/kg/minuto, de aproximadamente 1 a 10 nmol/kg/minuto, de aproximadamente 10 a 100 nmol/kg/minuto, de aproximadamente 100 a 300 nmol/kg/minuto, o de aproximadamente 250 a 500 nmol/kg/minuto).

[0235] Un agente diurético puede administrarse en una dosis de al menos aproximadamente 1 pg/kg a aproximadamente 500 mg/kg de masa corporal (por ejemplo, de aproximadamente 1 a 10 pg/kg, de aproximadamente 10 a 50 pg/kg, de aproximadamente 50 a 100 pg/kg, de aproximadamente 100 a 500 pg/kg, de aproximadamente 500 pg/kg a aproximadamente 1 mg/kg, de aproximadamente 1 a 5 mg/kg, de aproximadamente 5 a 10 mg/kg, de aproximadamente 10 a 50 mg/kg, de aproximadamente 50 a 100 mg/kg, o de aproximadamente 100 a 500 mg/kg) de masa corporal, aunque otras dosis también pueden proporcionar resultados beneficiosos. Cabe señalar que la dosis de diurético puede reducirse con el tiempo, dado el efecto potenciador del MANP. Por lo tanto, mientras que un diurético puede administrarse inicialmente en una dosis de aproximadamente 1 a 5 mg/kg, la dosis puede reducirse con el paso del tiempo.

[0237] Un MANP y un agente diurético pueden administrarse una vez (por ejemplo, mediante implantación o inyección de una composición de depósito de liberación prolongada), o más de una vez (por ejemplo, mediante inyecciones o administraciones orales repetidas). Cuando se administra más de una vez, la frecuencia de administración puede variar desde una o más veces al día (por ejemplo, una, dos, tres, cuatro o más veces al día) a aproximadamente una vez cada dos meses (por ejemplo, de tres a cinco veces por semana, aproximadamente una vez a la semana, aproximadamente dos veces al mes, aproximadamente una vez al mes o aproximadamente una vez cada dos meses). Además, la frecuencia de administración puede permanecer constante o ser variable durante la duración del tratamiento. Diversos factores pueden influir en la frecuencia real de administración utilizada para una aplicación particular. Por ejemplo, la cantidad eficaz, la duración del tratamiento, la vía de administración y la gravedad de la afección pueden requerir un aumento o una disminución de la frecuencia de administración.

[0239] En algunas realizaciones, un polipéptido natriurético MANP o una composición que contiene un MANP natriurético puede administrarse a través de una primera vía (por ejemplo, por vía intravenosa) durante un primer período de tiempo, y después puede administrarse a través de otra vía (por ejemplo, por vía subcutánea) durante un segundo período de tiempo. Por ejemplo, una composición que contiene un MANp puede administrarse por vía intravenosa a un mamífero (por ejemplo, un ser humano) en una dosis de aproximadamente 1 pmol/kg/minuto a aproximadamente 500 nmol/kg/minuto durante una hora a siete días (por ejemplo, de una a dos horas, de dos a cuatro horas, de cuatro a seis horas, de seis a ocho horas, de ocho a doce horas, de 12 a 24 horas, de 24 a 48 horas, de 48 a 36 horas, de tres a cuatro días, de cuatro a cinco días, de cinco a seis días, o de seis a siete días), y posteriormente puede administrarse por vía subcutánea al mamífero en una dosis de aproximadamente 0,01 ng/kg a aproximadamente 100 mg/kg, de una a tres veces al día, durante cinco a treinta días o más (por ejemplo, de cinco a siete, de siete a diez, de diez a catorce, de catorce a veintiuno, de veintiuno a veintiocho, de veintiocho a treinta o más de treinta días).

[0241] Una cantidad eficaz de un MANP (o un ácido nucleico que codifica un MANP) y un agente diurético administrados a un mamífero es una cantidad suficiente para alterar un parámetro seleccionado (por ejemplo, la presión arterial) en al menos un 10 %. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una "cantidad eficaz" de un MANP y de un agente diurético es una cantidad suficiente para aumentar la natriuresis y/o la diuresis (o para aumentar o disminuir una característica de la natriuresis y/o la diuresis, tal como los niveles plasmáticos de GMPc, la excreción urinaria de GMPc, la generación renal neta de GMPc, el flujo de orina, la excreción urinaria de sodio, la excreción urinaria de potasio, el hematocrito, la inmunorreactividad plasmática del BNP, el flujo sanguíneo renal, la inmunorreactividad plasmática del ANP, la resistencia vascular renal, la reabsorción fraccional proximal y distal de sodio, la presión arterial media, la presión de enclavamiento capilar pulmonar, la presión auricular derecha, la presión arterial pulmonar, la actividad de la renina en plasma, los niveles plasmáticos de angiotensina II, los niveles plasmáticos de aldosterona, la presión de perfusión renal y la resistencia vascular sistémica) en al menos un 10 % (por ejemplo, al menos un 10 %, al menos un 15 %, al menos un 20 %, al menos un 25 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 99 % o al menos el 100 %), en comparación con el nivel del mismo parámetro antes del tratamiento, o en comparación con el nivel del parámetro en un mamífero de control, no tratado. Por lo tanto, en algunos casos, una cantidad eficaz de un MANP y un agente diurético es una cantidad que reduce la presión arterial en un mamífero identificado como hipertenso (por ejemplo, HR) en al menos un 10 % (por ejemplo, al menos un 15 %, al menos un 20 %, al menos un 25 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, o al menos un 50 %), en comparación con la presión arterial en el mamífero antes de la administración del MANP y el agente diurético, o sin la administración del MANP y el agente diurético, o en comparación con la presión arterial "normal" en un mamífero no tratado de control. Una cantidad eficaz de un MANP también puede ser una cantidad suficiente para potenciar la eficacia de un agente diurético, de forma que se incremente el efecto beneficioso del diurético (por ejemplo, la reducción de la presión arterial) (por ejemplo, en al menos un 5 %, al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 15 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 40 %, o al menos aproximadamente un 50 %) por encima del efecto observado cuando se administra la misma cantidad del agente diurético sin el MANP. Una cantidad eficaz de un MANP también puede reducir un efecto perjudicial de un agente diurético (por ejemplo, la activación de la renina-angiotensina-aldosterona) en al menos un 5%(por ejemplo, al menos un 10 %), al menos aproximadamente un 15 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 40 %, o al menos aproximadamente un 50 %), en comparación con el efecto perjudicial observado cuando el diurético se administra sin el MANP.

[0243] En algunas realizaciones, la cantidad y frecuencia de administración de MANP y el agente diurético a un mamífero puede valorarse con el fin de, por ejemplo, identificar la dosis más eficaz para tratar la hipertensión con el menor número de reacciones adversas. Si un mamífero no responde a una dosis particular, entonces la cantidad puede aumentarse, por ejemplo, dos veces, tres veces, cinco veces o diez veces. Después de recibir esta concentración más alta, el mamífero puede ser controlado tanto para la respuesta al tratamiento como para los síntomas de toxicidad, y los ajustes en la dosis y/o frecuencia de administración pueden hacerse en consecuencia. La cantidad eficaz puede permanecer constante o ajustarse como una escala móvil o dosis variable en función de la respuesta del mamífero al tratamiento.

[0245] La frecuencia de administración puede ser cualquier frecuencia que reduzca un síntoma, por ejemplo, de enfermedad cardiovascular o cardiorrenal en un mamífero, sin producir toxicidad significativa en el mamífero. Por ejemplo, la frecuencia de administración puede ser de aproximadamente cuatro veces al día a aproximadamente una vez cada dos meses, o de aproximadamente una vez al día a aproximadamente una vez al mes, o de aproximadamente una vez cada dos días a aproximadamente una vez a la semana. Además, la frecuencia de administración puede permanecer constante o ser variable durante la duración del tratamiento. Al igual que con la cantidad eficaz, diversos factores pueden influir en la frecuencia real de administración utilizada para una aplicación particular. Por ejemplo, la cantidad eficaz, la duración del tratamiento, la vía de administración y la gravedad de la afección renal pueden requerir un aumento o una disminución de la frecuencia de administración.

[0247] Una duración eficaz de la administración puede ser cualquier duración que reduzca la hipertensión o un síntoma de enfermedad cardiorrenal en un mamífero sin producir toxicidad significativa en el mamífero. La duración eficaz puede variar de uno a varios días, a varias semanas, meses o años. En general, la duración eficaz puede variar en duración de varios días a varios meses. Por ejemplo, una duración eficaz puede oscilar entre una o dos semanas y aproximadamente 36 meses, o incluso más. En algunos casos, el tratamiento puede durar toda la vida de un mamífero. Múltiples factores pueden influir en la duración eficaz real utilizada para una pauta de tratamiento concreta. Por ejemplo, la duración eficaz puede variar con la frecuencia de administración, la cantidad administrada, la vía de administración y la gravedad de una afección.

[0249] Tras administrar a un mamífero un MANP y un agente diurético según se describe en el presente documento, el mamífero puede ser controlado para determinar si el trastorno ha mejorado o no. Por ejemplo, un mamífero puede ser evaluado después del tratamiento para determinar si uno o más síntomas del trastorno del mamífero se han reducido o no (por ejemplo, si la presión sanguínea del mamífero ha disminuido). Si un mamífero no responde a determinadas dosis de un MANP y un agente diurético, entonces las cantidades de uno o ambos pueden incrementarse en, por ejemplo, dos veces, tres veces, cinco veces o diez veces. Después de recibir esta concentración más alta, el mamífero puede controlarse tanto para determinar la respuesta al tratamiento como para determinar los síntomas de toxicidad, y se realizan ajustes en consecuencia. La cantidad eficaz puede permanecer constante o ajustarse como una escala móvil o dosis variable en función de la respuesta del mamífero al tratamiento.

[0251] En algunos casos, un método como se proporciona en el presente documento puede incluir la administración, a un mamífero, de una o más composiciones en las que los únicos principios activos son un agente diurético y un MANP. En dichos casos, por ejemplo, la administración puede consistir en administrar una composición en la que los únicos principios activos son un MANP y un diurético, o la administración puede consistir en administrar una primera composición en la que el único principio activo es un MANP y una segunda composición en la que el único principio activo es un agente diurético.

[0253] En algunos casos, un método como se proporciona en el presente documento puede incluir la administración, a un mamífero, de una o más composiciones en las que los únicos principios activos son un agente diurético, un MANP y un inhibidor de la ECA, un ARA o un AC. En dichos casos, por ejemplo, la administración puede consistir en administrar una composición en la que los únicos principios activos son un MANP, un diurético y un inhibidor de la ECA; o un MANP, un diurético y un ARA; o un MANP, un diurético y un AC, o la administración puede consistir en administrar una primera composición en la que el único principio activo es un MANP, una segunda composición en la que el único principio activo es un agente diurético, y una tercera composición en la que el único principio activo es un inhibidor de la ECA, un ARA o un AC. Cabe destacar que, en algunos casos, dos de los tres principios activos (por ejemplo, el inhibidor de MANP y el diurético, el MANP y el inhibidor de la ECA, el ARA o el AC, o el diurético y el inhibidor de la ECA, el ARA o el AC) pueden administrarse en una composición y el tercer principio activo puede administrarse en una composición separada.

[0255] En algunos casos, un método como se proporciona en el presente documento puede incluir la administración, a un mamífero, de una o más composiciones en las que los únicos principios activos son un agente diurético, un MANP, un inhibidor de la ECA o un ARA, y un AC. En dichos casos, por ejemplo, la administración puede consistir en administrar una composición en la que los únicos principios activos son un MANP, un diurético, un inhibidor de la ECA o un ARA, y un AC, o la administración puede consistir en administrar una primera composición en la que el único principio activo es un MANP, una segunda composición en la que el único principio activo es un agente diurético, una tercera composición en la que el único principio activo es un inhibidor de la ECA o un ARA, y una cuarta composición en la que el único principio activo es un AC. Cabe destacar que, en algunos casos, dos de los principios activos (por ejemplo, el MANP y el diurético, el MANP y el inhibidor de la e Ca o ARA, el MANP y el AC, el diurético y el inhibidor de la ECA o el ARA, el diurético y el AC, o el inhibidor de la ECA o el ARA y el AC) pueden administrarse en una composición y los otros dos principios activos pueden administrarse en una composición separada. Adicionalmente, en algunos casos, tres de los principios activos (por ejemplo, el MANP, el diurético y el inhibidor de la ECA o el ARA; el MANP, el diurético y el AC; el MANP, el inhibidor de la ECA o el ARA, y el AC; o el diurético, el inhibidor de la ECA o el ARA, y el AC) pueden administrarse en una composición y el principio activo restante puede administrarse en una composición separada.

[0257] En algunos casos, los métodos proporcionados en el presente documento pueden incluir la identificación de un mamífero como hipertenso (por ejemplo, HR) y, a continuación, la administración de un MANP y un agente diurético (por ejemplo, Fs) al mamífero. Tener la capacidad de identificar a los mamíferos como hipertensos o con HR puede permitir que esos mamíferos sean adecuadamente identificados y tratados de manera eficaz y fiable con una combinación de un MANP y un agente diurético. Por ejemplo, los tratamientos de la HR descritos en el presente documento (por ejemplo, una combinación de un MANP y Fs) pueden utilizarse para tratar a los pacientes hipertensos identificados con HR.

[0259] La invención se describirá con más detalle en el siguiente ejemplo, que no limitan el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones.

[0261] Ejemplos

[0263] Ejemplo 1 - Efectos de MANP y Fs en ratas

[0265] Se realizaron estudios para examinar los efectos individuales y combinados de MANP (SEQ ID NO:3) y Fs sobre la PA y la estimulación de aldosterona en ratas espontáneamente hipertensas (REH), el modelo genético de hipertensión esencial humana más estudiado y utilizado (Lermanet al.(2019)Hypertension73(6):e87-e120). Las REH (n = 32) se distribuyeron aleatoriamente en diez grupos:

[0267] Grupo 1 - tratado con vehículo de solución salina (Veh);

[0268] Grupo 2 - tratado sólo con Fs 1 mg/kg (Fs1);

[0269] Grupo 3 - tratado sólo con Fs 5 mg/kg (Fs5);

[0270] Grupo 4 - tratado sólo con Fs 10 mg/kg (Fs10);

[0271] Grupo 5 - tratado sólo con MANP 100 pmol/kg/min de MANP (MANP100);

[0272] Grupo 6 - tratado sólo con MANP 300 pmol/kg/min de MANP (MANP300);

[0273] Grupo 7 - tratado sólo con MANP 600 pmol/kg/min de MANP (MANP600);

[0274] Grupo 8 - tratado con Fs5+MANP300;

[0275] Grupo 9 - tratado con Fs10+MANP300; y

[0276] Grupo 10 - tratado con Fs10+MANP600.

[0278] La Fs se administró como una sola embolada que, en los grupos 8. 9 y 10, fue seguida de una infusión de MANP durante 60 minutos.

[0280] La presión arterial media (PAM, mmHg) se redujo con el tratamiento sólo con Fs1 (A = -40 ± 9*), Fs5 (A = -55 ± 8*), Fs10 (A = -63 11 %*), MANP 300 (A = -70 ± 19*), y MANP600 (A = -93+20*&#); se observó un efecto mayor en los grupos de tratamiento combinado de F<s>5+M<a>N<p>300 (A = -90 ± 15*&#), Fs10+MANP300 (A = -93 ± 6*&#), y Fs10+MANP600 (A = -95 ± 9*&#) (FIGS. 2A-2C). Las reducciones de la PA en los grupos de Fs, Ma NP, y Fs m An P se asociaron con una mayor excreción de sodio y flujo urinario (*p < 0,05), pero no se observaron diferencias significativas en la natriuresis o diuresis entre los grupos de Fs y Fs+MANP. El GMPc plasmático aumentó significativamente en los grupos de MANP y MANP+Fs, pero no se modificó sólo con Fs (FIGS.3A-3C). La aldosterona plasmática tendió a aumentar con dosis bajas y altas de Fs, y el aumento se atenuó significativamente en los grupos de Fs+MANP(p< 0,05) (FIG. 4). En particular, para los grupos de MANP+Fs, los mayores descensos de la PA se correlacionaron con mayores aumentos del GMPc (FIG. 5).

[0282] Por lo tanto, MANP+Fs tuvo efectos reductores de la PA más potentes que la Fs sola, y también inhibió la activación de la aldosterona inducida por Fs. Tanto Fs como MANP inducen diuresis y natriuresis, mientras que el MANP también puede mediar en la vasorrelajación, proporcionando una posible explicación para la acción antihipertensiva más potente de Fs+MANP. Por lo tanto, estos estudios sugieren que MANP es un fármaco complementario eficaz para el tratamiento de la HR, para potenciar las acciones antihipertensivas de la Fs.

[0284] Ejemplo 2 - Efectos de MANP y Fs en células HEK293 y ratas

[0286] Los estudios de MANP se ampliaron para investigar más a fondo sus acciones cardiorrenales y neurohumorales agudas dependientes de la dosis en REH, para confirmar sus acciones activadoras directas del GMPc en células HEK293 que sobreexpresan pGC-A, y para examinar la activación del GMPc mediada por MANP en células vasculares primarias humanas, que son importantes dianas orgánicas que resultan dañadas por la hipertensión. Entre ellas, se incluyen las células del músculo liso aórtico humanas y las células endoteliales aórticas humanas, que expresan pGC-A de modo natural.

[0288] Métodos

[0290] Cultivo celular:Las células HEK293 se transfectaron con pGC-A (clones de ADNc de Origene, Rockville, MD) utilizando Lipofectamine (Invitrogen, Grand Island, NY). Las células transfectadas se mantuvieron en medio de Eagle modificado de Dulbecco suplementado con suero bovino fetal ("fetal bovine serum", FBS) al 10 %, penicilina 100 U/ml, estreptomicina l0o U/ml y antibiótico G418250 pg/ml (Geneticin). Se cultivaron HAEC (Lonza, Walkersville, MD) en medio EBM-2 (Lonza) que contenía factores de crecimiento y suplementos EGM-2 (Lonza) y FBS al 10 % (Gibco). Las HASMC (ScienCell, San Diego, CA) se cultivaron en medio de células de músculo liso (SMCM) (ScienCell) que contenía suplemento de crecimiento de células del músculo liso (SMCGS), penicilina/estreptomicina (ScienCell) y FBS (ScienCell).

[0292] GMPc intracelular.Las células se trataron entre el 80 % y el 90 % de confluencia. En resumen, se incubaron en un tampón que contenía N-[2-hidroxietil]piperazin-N'-[ácido 2-etanosulfónico] 20 mmol/l, albúmina sérica bovina al 0,1 % y 3-isobutil-1-metilzantina 0,5 mmol/l (Sigma, St. Louis, MO). Las células tratadas no recibieron ningún tratamiento (control) o MANP (SEQ ID NO.3; 10-8 M, 10-7 M o 10-6 M) durante 10 minutos. Los experimentos se realizaron por triplicado para cada concentración de MANP o control y, a continuación, se recogieron los lisados celulares. Las muestras se analizaron con el kit ELISA de GMPc directo (Enzo Life Sciences, Germantown, NY) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La concentración total de proteínas en las muestras se cuantificó mediante un kit de ensayo de proteínas BCA (Thermo Scientific, Rockford, IL). Los resultados se expresan en picomoles de GMPc por miligramo de proteína total.

[0294] Protocolo de estudio agudo en REH.Las acciones cardiorrenales y neurohumorales del MANP, la Fs o su combinación se investigaron en el modelo genético de hipertensión en REH macho (n = 6 en cada grupo). Se anestesió a las ratas en una cámara de inducción con isoflurano inhalado al 2,5%. Durante este breve estado de anestesia, se administró a las ratas Inactin IP 100 mg/kg para mantener la anestesia. Se utilizó una mascarilla de oxígeno hasta el final del experimento. Se canuló la arteria carótida para medir la presión arterial y la vena yugular derecha para las infusiones. Las presiones se registraron y analizaron digitalmente (Sonometrics, Londres, Ontario, Canadá). Mediante una pequeña incisión en la pared abdominal inferior, se canuló la vejiga para la toma de muestras de orina.

[0296] Inmediatamente después de la preparación, se inició un período de equilibrio de 30 minutos con infusión intravenosa de inulina. Se realizó un aclaramiento inicial de 15 minutos que consistió en mediciones hemodinámicas y toma de muestras de sangre arterial. Después de las mediciones iniciales, las ratas se distribuyeron aleatoriamente en diez grupos.

[0298] Grupo 1 - tratado con MANP100;

[0299] Grupo 2 - tratado con MANP300;

[0300] Grupo 3 - tratado con MANP600;

[0301] Grupo 4 - tratado con Fs1;

[0302] Grupo 5 - tratado con Fs5;

[0303] Grupo 6 - tratado con Fs10;

[0304] Grupo 7 - tratado con MANP300 Fs5;

[0305] Grupo 8 - tratado con MANP300 Fs10;

[0306] Grupo 9 - tratado con MANP600 Fs10; y

[0307] Grupo 10 - tratado con inulina, solución salina normal, o inulina y solución salina normal.

[0309] Para los grupos 1-3, tras 15 minutos de rodaje con infusión de MANP, se infundió MANP de forma continua durante un total de 60 minutos. Los animales de los grupos 4-6 recibieron una única administración intravenosa (IV) en embolada de Fs. MANP+Fs Los grupos 7-9 recibieron una única inyección IV en embolada de Fs, seguida de una infusión de rodaje de 15 minutos de MANP con otra infusión continua de 60 minutos de MANP a la misma dosis. Los animales de control (grupo 10) recibieron una infusión continua de inulina como control de MANP, una única inyección IV en embolada de solución salina normal al 0,9 % como control de Fs, o la combinación de una única inyección IV en embolada de solución salina normal al 0,9 % y una infusión continua de inulina como control del tratamiento MANP+Fs.

[0310] Análisis neurohormonal y de electrolitos.El ANP plasmático se midió mediante radioinmunoanálisis (Phoenix Pharmaceuticals) como evaluación del MANP, ya que el RIA de ANP detecta completamente el MANP (Burnettet al.(1986)Science231(4742).1145-1147). Se determinaron el GMPc plasmático y urinario (Enzo Life Sciences) y la aldosterona (DRG International, Springfield, NJ) mediante ELISA. Las concentraciones de inulina se midieron mediante el método de la antrona, como se describe en otro sitio (Fuhret al.(1955)Klin. Wochenschr33.729-730). La TFG se calculó mediante el aclaramiento de inulina. Los electrolitos se midieron por fotometría de llama (IL943, Instrumentation Laboratory, Reino Unido). Todas las mediciones se realizaron siguiendo las instrucciones del fabricante.

[0311] Análisis estadístico:Los datos se expresaron como media ± error estándar de la media (EEM). La comparación de grupos independientes se realizó mediante la prueba de latde Student. Para las comparaciones dentro de los grupos se utilizó la prueba ANOVA unidireccional, seguida de la pruebaa posterioride Dunnett. Se utilizó la prueba ANOVA bidireccional para las comparaciones entre grupos, seguida de una pruebaa posterioride Bonferroni (Statistica 8.0). La significación estadística se definió como un valor dep< 0,05.

[0313] Resultados

[0315] Activación in vitro del GMPc en HEK293 con sobreexpresión de pGC-A humana y en células endoteliales aórticas y células musculares lisas aórticas humanas primarias:LaFIG. 6Apresenta los resultados de la mediciónin vitrode la producción de GMPc tras el tratamiento con MANP de células HEK293 transfectadas con el receptor de pGC-A humano. El nivel de GMPc aumentó con el incremento gradual de las concentraciones de MANP. El MANP aumentó significativamente los niveles de GMPc, en comparación con el grupo de control sin tratamiento. El aumento de las dosis de MANP también dio lugar a aumentos significativos en los niveles de GMPc en HAEC y HASMC(FIGS. 6B y 6C).Similar a las células HEK 293, no hubo ningún efecto significativo de la ausencia de tratamiento.

[0317] Estudio in vivo - Hemodinámica sistémica: La PA arterial en REH para los grupos de MANP, Fs, MANP+Fs y de control al inicio se presentan en laTABLA 2.Los efectos sobre la<p>A se ilustran en lasFIGS. 7A-7C y 8. MANP300 y MANP600 disminuyeron significativamente la PA en comparación con los grupos de control(FlG. 7A). A los 60 minutos, la mayor disminución de la PA se produjo en el grupo de dosis alta (MANP600)(FIG. 8).Las tres dosis de Fs redujeron significativamente la PA en comparación con los controles(FIGS.7B y 8).Sin embargo, MANP600 solo tuvo un efecto antihipertensivo significativamente mayor que Fs1 o Fs5 solas(FIG. 8).En los grupos de terapia combinada, la adición de MANP300 a Fs5 o Fs10, así como la adición de MANP600 a Fs10, redujo significativamente la PA en comparación con Fs sola (tratamiento con un solo fármaco) (p < 0,05 para MANp300+Fs5 frente a Fs5 sola, MANP300+Fs10 frente a Fs10 sola, y MANP600+Fs10 frente a Fs10 sola)(FIGS. 7C y 8). Por lo tanto, la terapia combinada de MANP+Fs potenció significativamente los efectos antihipertensivos de Fs.

[0319] Estudio in vivo - Análisis neurohumoral:Los datos de los niveles plasmáticos de GMPc en los grupos de MANP, Fs, MANP+Fs y de control al inicio se resumen en laTABLA 2.El GMPc plasmático se determinó en 3 puntos temporales (inicio, 30 minutos y 60 minutos), y aumentó de forma dependiente de la dosis tras el tratamiento con MANP300 y MANP600, en comparación con los grupos de control(FIG.9A).En comparación, la Fs no modificó el GMPc plasmático(FIG. 9B),pero el GMPc plasmático aumentó notablemente en el grupo de MANP+Fs(FIG. 9C).

[0322] TABLA 2

[0325]

[0328] La excreción urinaria de GMPc aumentó significativamente tras la administración de MANP300 y MANP600, de forma dependiente de la dosis, y también aumentó significativamente tras la administración de MANP300+Fs5, MANP300+Fs10 y MANP600+Fs10, en comparación con los controles(FIG. 10). No hubo un aumento significativo en los grupos de Fs, que no difirieron de los grupos con vehículo (control)(FIG. 10).

[0330] La evaluación de la aldosterona se ilustra en laFIG. 11. El MANP redujo la aldosterona en dosis de 100 pmol/kg/minuto y 300 pmol/kg/minuto, pero no en 600 pmol/kg/minuto. Los niveles de aldosterona fueron significativamente superiores en los grupos de Fs5 y Fs10, en comparación con los grupos de control, MANP100 y MANP300. En el grupo de combinación, la aldosterona disminuyó significativamente en el grupo MANP300+Fs5 en comparación con Fs5 sola, así como en los grupos MANP300+Fs10 y MANP600+Fs10 en comparación con Fs10 sola. Por lo tanto, el tratamiento con MANP+Fs fue capaz de inhibir la activación de la aldosterona inducida por Fs.

[0331] La infusión de MANP solo o en combinación con Fs produjo aumentos significativos de la inmunorreactividad plasmática de ANP como medida de la inmunorreactividad de MANP (TABLA 3). Entre los factores neurohumorales, los niveles plasmáticos de ANP se correlacionaron significativamente con el GMPc plasmático (r = 0,75,p< 0,001)(FIG. 12).Entre los parámetros hemodinámicos, las concentraciones plasmáticas de GMPc se correlacionaron significativamente con la PA (r = -0,65,p< 0,001)(FIG. 13).

[0332] Estudio in vivo - Función renal: Los efectos sobre la TFG, la excreción urinaria de sodio (UNaV) y la excreción de agua (UV) se representan en lasFIGS. 14A-14C. La TFG fue significativamente inferior en los grupos de Fs en comparación con los grupos de control sin tratamiento, pero la TFG aumentó en los grupos de MANP300+Fs10 y MANP600+Fs10 en comparación con los grupos de Fs(FlG. 14A). Se produjo un aumento significativo tanto de la excreción urinaria de sodio(FIG. 14B)como de la excreción de agua(FIG. 14C)tras la administración de MANP solo, así como en combinación con Fs.

[0334] TABLA 3

[0337]

[0339] OTRAS REALIZACIONES

[0340] Debe entenderse que aunque la invención se ha descrito junto con la descripción detallada de la misma, se pretende que la descripción anterior ilustre, y no limite, el alcance de la invención, que se define por el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Otros aspectos, ventajas y modificaciones están comprendidos en el alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

1. Un péptido natriurético auricular-M (MANP) y un agente diurético para su uso en un método de tratamiento de un mamífero, que comprende:

administrar a dicho mamífero dicho MANP, y

administrar a dicho mamífero dicho agente diurético,

en donde el agente diurético se selecciona del grupo que consiste en: clortalidona, clorotiazida, hidroclorotiazida, indapamida, metolazona, amilorida, bumetanida, espironolactona, triamtereno y furosemida.

2. El MANP y el agente diurético para el uso de la reivindicación 1, en donde se identifica que dicho mamífero padece hipertensión, opcionalmente, en donde dicha hipertensión es hipertensión resistente (HR).

3. El MANP y el agente diurético para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde dicho MANP tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:3 o la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de SEQ ID NO:5 a 14.

4. El MANP y el agente diurético para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho agente diurético es la furosemida.

5. El MANP y el agente diurético para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho mamífero es un ser humano.

6. El MANP y el agente diurético para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho MANP se administra por vía subcutánea en una dosis de aproximadamente 0,1 ng/kg a aproximadamente 10 mg/kg.

7. El MANP y el agente diurético para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho MANP se administra por vía intravenosa en una dosis de aproximadamente 10 pmol/kg/minuto a aproximadamente 100 nmol/kg/minuto.

8. El MANP y el agente diurético para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho MANP se administra por vía intravenosa en una dosis de aproximadamente 10 pmol/kg/minuto a aproximadamente 100 nmol/kg/minuto, y posteriormente se administra por vía subcutánea en una dosis de aproximadamente 0,1 ng/kg a aproximadamente 100 mg/kg.

9. El MANP y el agente diurético para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho MANP y dicho agente diurético se administran por vía intravenosa, y en donde dicho MANP se administra por vía intravenosa en una dosis de aproximadamente 10 pmol/kg/minuto a aproximadamente 100 nmol/kg/minuto.

10. El MANP y el agente diurético para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho MANP y dicho agente diurético se administran por vía subcutánea, y en donde dicho MANP se administra por vía subcutánea en una dosis de aproximadamente 1 pg/kg a aproximadamente 10 pg/kg.

11. El MANP y el agente diurético para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho MANP y dicho agente diurético se administran por vía intravenosa, y posteriormente se administran por vía subcutánea, y en donde dicho MANP se administra por vía intravenosa en una dosis de aproximadamente 10 pmol/kg/minuto a aproximadamente 100 nmol/kg/minuto, y posteriormente se administra por vía subcutánea en una dosis de aproximadamente 1 pg/kg a aproximadamente 10 pg/kg.

12. El MANP y el agente diurético para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicho agente diurético se administra por vía oral, por vía intravenosa o por vía subcutánea.

13. El MANP y el agente diurético para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicho MANP y dicho agente diurético se administran simultáneamente en la misma composición.